JP4912510B2 - 粒子組成物及びこれを有する医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、薬物運搬システム（ＤＤＳ）の担体として適用し得る粒子組成物（例えば、高分子ミセル）と、当該粒子組成物およびこれに内包された薬物を有する医薬組成物（例えば、高分子ミセル製剤）とに関する。

タンパク質や核酸といった生体高分子を利用するバイオ医薬品は、低分子化合物を利用する従来型の医薬品に比べ、酵素で分解されたり免疫系によって排除されたりしやすい。特許文献１〜４は、生体内におけるバイオ医薬品の安定性を高める観点から、脂質二重膜からなるリポソームに生体高分子を内包させたＤＤＳを開示する。

国際公開第２００１／０３４１１５号パンフレット 国際公開第１９９８／５８６３０号パンフレット 国際公開第２００５／０９２３８９号パンフレット 特表２００１−５０４０９３

特許文献１〜３に記載の従来型のＤＤＳでは、薬物としての生体高分子を脂質二重膜で保護することによって、生体内における薬物の安定性を向上できるものの、薬物が担体から放出され難くなる。また、こうした従来型のＤＤＳは、その粒子径の大きさや脂質二重膜を構成する脂質が有する電荷に起因して、肺、肝臓および脾臓といった細網内皮系に捕捉されやすいため、投薬対象物に到達する以前に血中から除去されてしまう場合がある。特許文献４に記載のＤＤＳでは、リポソームをステルス化することによって、こうした細網内皮系への捕捉の防止が図られているが、やはり薬物が担体から放出されにくい傾向にある。

疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントによるブロックコポリマーユニットによって構成された高分子ミセルを担体とするＤＤＳは、リポソームを使用した従来型のＤＤＳに比べてＤＤＳ粒子を大幅に小型化（例えば、平均粒径１００ｎｍ以下）できる。しかし、こうした高分子ミセルを担体とするＤＤＳは、後述する比較例に示すように生体高分子をＤＤＳ粒子内に保持する作用が弱すぎることによって、やはり投薬対象物に薬物を適切に輸送し難くなる場合がある。また、こうしたＤＤＳでは、製造後のストック期間中に担体から薬物が脱離してしまう場合もある。

本発明は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットを含有し、複数の前記ブロックコポリマーユニットが前記疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に前記親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置された、粒子組成物であって、内包されるべき薬物の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質をさらに有し、当該荷電脂質との静電結合によって前記薬物を粒子内に保持する一方、当該荷電脂質が前記疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置されることによって、前記荷電脂質とは反対の電荷を帯びた帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子外周面が帯びることが防止された、粒子組成物を提供する。

本発明は、別の側面から、上記の粒子組成物と、当該粒子組成物に内包された荷電脂質とは反対の電荷を帯びた薬物と、を有する医薬組成物を提供する。

本発明によれば、薬物の保持性に優れると共に投薬対象物への薬物運搬の妨害に帰結し得る担体表面への生体分子の付着が防止された、ＤＤＳに好適な薬物担体および当該薬物担体を利用した医薬品を提供できる。これら薬物担体および医薬品は、従来型のＤＤＳに比べて投薬対象物により確実に薬物を輸送できる。

図１（ａ）〜（ｃ）は、本発明の粒子組成物及び医薬組成物の構造の一例を示す模式図である。 図２は、試験例１ｂで測定した粒子組成物のゼータ電位の絶対値と、試験例１ｃで測定した粒子組成物の血中凝集度との関係を示すグラフである。 図３は、試験例２ｂにおけるアルブミン−ＦＩＴＣの蛍光強度の測定結果を示すグラフである。 図４は、試験例５ａにおける電気泳動の結果を示す図である。 図５は、試験例５ｃで調べた粒子組成物の抗癌活性を説明するためのグラフである。 図６は、試験例５ｄで調べた粒子組成物の血清中での凝集性を説明するためのグラフである。 図７は、試験例５ｂで測定した粒子組成物のゼータ電位の絶対値と、試験例５ｄで測定した粒子組成物の血中凝集度との関係を示すグラフである。 図８は、試験例５ｆで調べた薬物の臓器移行性を説明するためのグラフである。

図１（ａ）は、本発明の粒子組成物（以降、単に「粒子組成物」という場合がある）の構造の一例を示す模式図であり、図１（ｂ）はその部分拡大図である。粒子組成物１は、ブロックコポリマーユニット２と、荷電脂質３とを含有する。ブロックコポリマーユニット２は、親水性ポリマー鎖セグメント２ａと疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂとを有し、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に向けると共に親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた状態で、粒子組成物１内に放射状に配置される。また、荷電脂質３は、内包させるべき薬物の電荷とは反対の電荷を帯び、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられた状態で配置される。図１（ｃ）は、本発明の粒子状医薬組成物（以降、単に「医薬組成物」という場合がある）の構造の一例を示す模式図である。医薬組成物１’は、粒子組成物１と、荷電脂質３とは反対の電荷を帯びた薬物４とを有し、薬物４は荷電脂質３と静電結合することによって、粒子組成物１内に保持される。

本明細書において「荷電脂質」とは、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性脂質、および当該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性脂質を意味する。このため、本明細書では、カチオン性基およびアニオン性基を有するいわゆる両性荷電脂質についても、上記の基準に基づいて取り扱うこととする。

荷電脂質３は、内包されるべき薬物４を静電結合によって粒子組成物１内に保持する。荷電脂質３は、少なくとも粒子組成物１から形成される医薬組成物１’のストック環境下において、内包される薬物４の電荷とは反対の電荷を帯びていればよい。これにより、製造後のストック期間中に薬物４をより確実に粒子組成物１内に保持できる。荷電脂質３および薬物４は、血中に代表される生理環境下（例えば、ｐＨ７．４）においても反対の電荷を帯びていることが好ましい。これにより、投薬対象物への輸送途中で薬物４が粒子組成物１から脱離してしまうことをより確実に防止できる。

荷電脂質３は、次のメカニズムによって、疎水性ポリマー鎖セグメント側２ｂに引き寄せられた状態で配置される。粒子組成物１は、ブロックコポリマーユニット２と荷電脂質３を水溶液中で懸濁する工程を含んで形成する。ブロックコポリマーユニット２の疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、疎水性であるために、水溶液中では拡散せず凝集して存在する。親水性ポリマー鎖セグメント２ａは、水溶液中で拡散し自由に運動し得る。このため、ブロックコポリマーユニット２は、水溶液中で、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂを内側に、親水性ポリマー鎖セグメント２ａを外側に向けた放射状に配置される。そして、荷電脂質３は、疎水性が強く、水や親水性ポリマー鎖セグメント２ａに比べて疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂとの親和性が高いため、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂ側に引き寄せられ、粒子組成物１の外周面から離れて配置されることとなる。これにより、荷電脂質３とは反対の電荷を帯びた帯電性物質（例えば、血中のタンパク質）を誘引し得る電荷を、粒子組成物１および医薬組成物１’の外周面が帯びることが防止される。

そして、こうして水溶液中で懸濁すると、荷電脂質３とブロックコポリマーユニット２が入り混ざった状態で粒子化するため、荷電脂質３は、図１（ｂ）に示すように、粒子組成物１の周方向において連続する状態で配置されるのではなく、粒子組成物１の周方向において隣接するブロックコポリマーユニット２間に介在するように配置される。これにより、粒子組成物１では、粒子組成物１の周方向において隣接する荷電脂質３間の接触がブロックコポリマーユニット２によって分断されることとなる。このため、粒子組成物１では、粒子組成物１の周方向において隣接する荷電脂質３間に、ブロックコポリマーユニット２を収容できる程度の隙間Ｇが形成された状態にある、換言すれば、隣接する荷電脂質３間に隙間Ｇが形成され、当該隙間Ｇにブロックコポリマーユニット２が配置された状態にある。荷電脂質３とブロックコポリマーユニット２との間の結合力は、荷電脂質３同士の結合力に比べると小さい。このため、粒子組成物１では、脂質が周方向に連続して配置された状態にある従来型のＤＤＳ（リポソーム）に比べると、荷電脂質３の脱落に起因した粒子形状の崩壊が生じやすい結果、粒子（担体）内における内包させるべき薬物４の過剰な保持が防止される。特許文献４に記載のＤＤＳに代表されるステルスリポソームは、脂質二重膜からなるリポソーム本体を形成した後に、当該本体の表面にジブロックコポリマーを付着させることによって形成されるため、周方向において隣接する脂質間の接触はブロックコポリマー等によって分断されずに、あくまで脂質が周方向に連続して配置された状態にある。

帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子組成物１および医薬組成物１’の外周面が帯びることが防止された状態とは、例えば、粒子組成物１および医薬組成物１’から測定されるゼータ電位の絶対値が所定値以下の範囲にあることによって特定できる。より具体的には、医薬組成物１’については、ゼータ電位の絶対値が１０ｍＶ以下であることが望ましく、例えば５ｍＶ以下、また例えば３ｍＶ以下、であり、好ましくは２ｍＶ以下、さらに好ましくは１ｍＶ以下である。医薬組成物１’のゼータ電位の絶対値は、粒子組成物１に薬物４を含有させることによって、当該粒子組成物１に固有のゼータ電位の絶対値よりも低くなる傾向にある。このため、粒子組成物１については、ゼータ電位の絶対値が１５ｍＶ以下であることが望ましく、例えば１２ｍＶ以下、また例えば６ｍＶ以下、また例えば３ｍＶ以下、であり、好ましくは２ｍＶ以下、さらに好ましくは１ｍＶ以下である。ゼータ電位は、ｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液に、粒子組成物１または医薬組成物１’に含有される荷電脂質３の総量が当該バッファー溶液１ｍＬあたり０．１ｍｇになるように添加して測定することとする。

本明細書において、ゼータ電位の絶対値は、小数点以下を四捨五入して得られる数値として取り扱うこととする。例えば、ゼータ電位の絶対値が「２ｍＶ以下」である状態は、２．５ｍＶ未満である状態を含む。

なお、後述の実施例に示すように、粒子組成物１または医薬組成物１’のゼータ電位の絶対値が低くなるように制御することにより、粒子組成物１または医薬組成物１’の血中における凝集を防止できる。より具体的には、粒子組成物１のゼータ電位の絶対値を所定範囲以下に制御することにより、粒子組成物１の血中凝集度が、例えば０．２以下、また例えば０．１８以下、また例えば０．１５以下、さらには０．１以下、場合によっては０．０５以下になる程度にまで、血中における凝集を防止できる。また、医薬組成物１’のゼータ電位の絶対値を所定範囲以下に制御することにより、医薬組成物１’の血中凝集度が、例えば０．２以下、また例えば０．１６以下、さらには０．１以下、場合によっては０．０５以下になる程度にまで、血中における凝集を防止できる。

血中凝集度は、次のようにして算出する。
ｉ）ｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液に、荷電脂質３の総量が当該バッファー溶液１ｍＬあたり２．２ｍｇとなるように測定対象の組成物（粒子組成物１または医薬組成物１’）を添加し、更にＦＢＳ（ウシ血清）を当該バッファー溶液１ｍＬあたり９ｍＬとなるように添加して、測定サンプルＡを調製する。
ii）ＦＢＳ（ウシ血清）に代えてｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液を用いること以外は、上記ｉ）と同様にして、測定サンプルＢを調製する。
iii）測定サンプルＡおよびＢを、３７℃で２４時間静置した後、波長７００ｎｍの光線に対する吸光度をそれぞれから測定する。
iv）「測定サンプルＡより得た吸光度」から「測定サンプルＢより得た吸光度」を減算して得られる値を、血中凝集度とする。なお、当該値が小さいほど血中において測定対象組成物が凝集しにくい。

荷電脂質３に対するブロックコポリマーユニット２の割合は、質量比で表示して、１．０以上であることが望ましく、好ましくは１．５以上、より好ましくは２．０以上、また、５０以下であることが望ましく、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下である。当該割合を高めるほど、粒子組成物１および医薬組成物１’のゼータ電位の絶対値を低くできる。他方、荷電脂質３の割合が高くなるほど、薬物４をより積極的に粒子内に取り込むことができるため、上記のとおり当該割合は５０以下に制限することが望ましい。

荷電脂質３は、単純脂質、複合脂質および誘導脂質の何れであってもよく、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド類およびステロール類を例示できる。より具体的には、カチオン性脂質として、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が挙げられる。アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸が挙げられる。

親水性ポリマー鎖セグメント２ａは、ポリエチレングリコール又はポリオキシエチレンからなる水溶性ポリマー由来のセグメントであることが好ましい。親水性ポリマー鎖セグメント２ａの分子量は、２，５００Ｄａ以上であることが望ましく、好ましくは５，０００Ｄａ以上、より好ましくは８，０００Ｄａ以上であり、また、２００，０００Ｄａ以下であることが望ましく、好ましくは２０，０００Ｄａ以下、より好ましくは１５，０００Ｄａ以下である。疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、ポリアミノ酸鎖由来のセグメントであることが好ましい。疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂの反復単位数は、１０個以上であることが望ましく、好ましくは２０個以上であり、また、２００個以下であることが望ましく、好ましくは１００個以下、より好ましくは６０個以下である。粒子組成物１のゼータ電位の絶対値を低くする、換言すれば粒子組成物１の表面電荷を小さくする（中性に近づける）観点からは、ブロックコポリマーユニット２において、親水性ポリマー鎖セグメント２ａのサイズ（分子量）を、疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂのサイズ（反復単位数）に比べて大きくすることが好ましい。

親水性ポリマー鎖セグメント２ａ及び疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子組成物１および医薬組成物１’の粒子外周面が帯びることが防止される限り、アミノ基およびカルボキシル基に代表される荷電性の置換基を含有していても構わない。

親水性ポリマー鎖セグメント２ａと疎水性ポリマー鎖セグメント２ｂは、主鎖の末端同士を共有結合を介して結合させたものを用いることができる。より具体的には、ブロックコポリマーユニット２として、次の一般式（Ｉ）および一般式（II）で表示される化合物を例示できる。粒子組成物１は、２種類以上のブロックコポリマーユニット２によって形成されていてもよい。

一般式（Ｉ）及び一般式（II）において、Ｒ¹及びＲ³は、それぞれ独立して、水素原子又はＲ⁸（Ｒ⁹）ＣＨ（ＣＨ₂）_q−で表される基を表し（ただし、Ｒ⁸及びＲ⁹は、ｉ）それぞれ独立して、水素原子、Ｃ_1-6アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ_1-3オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ_2-7アシルアミド基、トリ−Ｃ_1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基である、ii）一緒になって、Ｃ_1-3アルキル基で置換されていている若しくは未置換のエチレンジオキシ基又はプロピレンジオキシ基を形成する、又はiii）それらが結合しているＣＨ基と一緒になってホルミル基を形成する）、ｑは０〜１０の整数であり、Ｒ²は水素原子、飽和若しくは不飽和のＣ₁〜Ｃ₂₉脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基であり、Ｒ⁴は水酸基、飽和若しくは不飽和のＣ₁〜Ｃ₃₀脂肪族オキシ基又はアリール−低級アルキルオキシ基であり、Ｒ⁵は−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ⁶は水素原子、フェニル基、ベンジル基、−（ＣＨ₂)₄−フェニル基、未置換の若しくはアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ₄〜Ｃ₁₆アルキル基、又は、ステロール誘導体の残基であり、Ｒ⁷はメチレン基であり、ｎは５５〜４，６００の範囲にある整数であり、ｘは１０〜２００の範囲にある整数であり、ｍは０〜２００の範囲にある整数であり（ただし、ｍが１以上である場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ⁷ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在し、ｍが２以上である場合、Ｒ⁶は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ⁶が水素原子である場合はＲ⁶全体の７５％以下である）、ｙは１又は２であり、Ｌ¹は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ₂−、及び−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ₁〜Ｃ₆アルキレン基である。）から選ばれる連結基であり、Ｌ²は−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、及び−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ただし、ＺはＣ₁〜Ｃ₆アルキレン基である）から選ばれる連結基である。

一般式（Ｉ）及び一般式（II）において、ｎは、好ましくは１１０以上、より好ましくは１８０以上、また、好ましくは４６０以下、より好ましくは３４０以下の整数であり、ｘは、好ましくは２０以上、また、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数であり、ｍは、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数である。

ブロックコポリマーユニット２は、アニオン性のポリマーであることが好ましい。ブロックコポリマーユニット２としてアニオン性のポリマーを用いることにより、荷電脂質３としてカチオン性脂質を使用した場合において、粒子組成物１や医薬組成物１’のゼータ電位の絶対値を３ｍＶ以下、さらには２ｍＶ以下、そして１ｍＶ以下に、制御しやすくなる。また、後述する実施例に示すように、ブロックコポリマーユニット２としてアニオン性のポリマーを用いることにより、中性のポリマーを用いた場合と比較して、ゼータ電位の絶対値が同程度であっても、血中における凝集をより顕著に防止できる。なお、本明細書では生理的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）の水性媒体中において、正電荷より多くの負電荷を有するポリマーをアニオン性、負電荷より多くの正電荷を有するポリマーをカチオン性、正電荷と負電荷との比率が同程度であるポリマーを中性として扱うものとする。

好ましいアニオン性のブロックコポリマーユニット２としては、一般式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ⁵が−Ｏ−であり、Ｒ⁶が、ベンジル基、−（ＣＨ₂)₄−フェニル基、又は、未置換の若しくはアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ₄〜Ｃ₁₆アルキル基であるものが挙げられる。

ブロックコポリマーユニット２は、例えば、親水性ポリマー鎖を有するポリマー及びポリアミノ酸鎖を有するポリマーをそのまま、又は必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって形成できる。一般式（Ｉ）のブロックコポリマーユニット２については、例えば、Ｒ¹を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンといった保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることによっても形成できる。

粒子組成物１は、例えば、次のようにして形成できる。まず、ブロックコポリマーユニット２と荷電脂質３、及び必要であれば中性の脂質を、有機溶媒を含有する形成溶液に溶解又は分散させ、十分に溶解又は分散した後に当該有機溶媒を蒸散除去する。有機溶媒としては、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォオキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノールを例示できる。形成溶液は、２種以上の有機溶媒を含有でき、少量の水をさらに含有してもよい。得られた固形物又はペーストに、水又は適当な塩若しくは安定化剤などの添加物を含んだ水溶液を加え、攪拌することによりブロックコポリマーユニットと脂質を懸濁させる。これを超音波照射、高圧乳化機又はエクストルーダーなどの手段を用いて分散・微小化することによって、粒子組成物１を形成できる。

本発明によれば、上記の粒子組成物１と、当該粒子組成物１に内包された荷電脂質３とは反対の電荷を帯びた薬物４と、を有する医薬組成物１’を提供することもできる。薬物４は、荷電脂質３との静電結合によって粒子組成物１内に保持される。このように、荷電脂質３と薬物４との結合状態は可逆的であり、化学的構造変化を伴わない。薬物４は、粒子組成物１の形成過程において形成溶液中に添加することによっても、薬物４の溶液に粒子組成物１を添加することによっても、粒子組成物に内包させることができる。

薬物４としては、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性化合物、および当該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性化合物が挙げられる。化合物は、高分子化合物が好ましい。

薬物４に適用できる高分子化合物としては、ペプチド、タンパク質、糖鎖、核酸等が挙げられる。

薬物４が血中等において粒子組成物１から早期に脱離してしまうことを抑制すると共に、薬物４が粒子組成物１内に過剰な期間保持され続けることを防止する観点からは、医薬組成物１’における荷電脂質３と薬物４との電荷比を、所定範囲に制御することが好ましい。当該電荷比は、例えば、薬物４として核酸を使用する場合、［粒子組成物に含有される荷電脂質３中のカチオン性基のモル濃度］／［核酸中のリン酸基のモル濃度］によって規定され、また例えば、タンパク質に代表される両性の荷電性基を有する薬物を使用する場合、［粒子組成物に含有される荷電脂質中の荷電性基のモル濃度］／（［荷電脂質の電荷と反対の電荷を有する、薬物中の荷電性基のモル濃度］−［荷電脂質の電荷と同じ電荷を有する、薬物中の荷電性基のモル濃度］）によって規定される。当該電荷比は、好ましくは０．５以上、より好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上、また、好ましくは５０以下、より好ましくは２０以下、さらに好ましくは１０以下である。

粒子組成物１及び医薬組成物１’の平均粒径は、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは３０ｎｍ以上、また、好ましくは３００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下である。

以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。なお、以降の説明における動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子組成物の平均粒径の測定には、光散乱粒子径測定装置Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments）を用いた。

〔実施例・試験例群１：粒子組成物〕
［実施例１−１］
質量平均分子量（Ｍｗ）１００００のα−メトキシ−ω−アミノ−ポリエチレングリコール（以降、「ＰＥＧ」と表示する場合がある）（日油株式会社）５ｇをジメチルスルホキシド５０ｍＬに溶解し、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート（以降、「ＰＢＬＧ」と表示する場合がある）のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）５．５ｇ（ポリエチレングリコールに対し４２等量）を加え、４０℃で２４時間反応を行った。この反応溶液をヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（体積比１：１）１Ｌ中へ滴下することで、ポリマーを析出させた。減圧濾過によりポリマーを回収し、さらに乾燥させることで、８．６ｇの固形物を得た。これをＤＭＦ８６ｍＬに溶解し、無水酢酸４３２μＬを加え、４０℃で２４時間反応を行った。反応溶液をヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（体積比１：１）１Ｌ中へ滴下することで、ポリマーを析出させた。ポリマーは減圧濾過により回収し、さらに乾燥させることで、８．１ｇのポリエチレングリコール−ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）−Ａｃブロックコポリマー（以降、「ＰＥＧ−ＰＢＬＧ」と表示する場合がある）を得た。ＰＥＧ−ＰＢＬＧの構造式を下記に示す。¹Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＧブロックの重合度は４０であった。

ＰＥＧ−ＰＢＬＧのクロロホルム溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）４ｍＬと、カチオン性の荷電脂質である１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（以下「ＤＯＴＡＰ」とする）（Avanti Polar Lipid）のクロロホルム溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを混合した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、さらに一晩減圧乾燥した。得られた固形物に２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）１０ｍＬを加え、３時間室温で攪拌して懸濁させた。この懸濁液を超音波処理（１３０Ｗ、１秒パルス、２０分間）することで、粒子化を行った。この溶液を０．２μｍのフィルター（マイレクスＧＰ、ミリポア）でろ過し、粒子組成物１を得た。粒子組成物１は、親水性ポリマー鎖セグメントが外側に向けた状態で放射状に配置され、荷電脂質が疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられて配置された状態にある。後述する粒子組成物２〜６も、これと同様の状態にある。

［実施例１−２］
ＤＯＴＡＰに代えてアニオン性の荷電脂質であるホスファチジン酸（以降、「ＰＡ」と表示する場合がある）を用いたこと以外は、実施例１−１と同様にして粒子組成物２を得た。

［実施例１−３］
実施例１−１で得たＰＥＧ−ＰＢＬＧのクロロホルム溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）４ｍＬと、カチオン性の荷電脂質であるＤＯＴＡＰ（Avanti Polar Lipid）のクロロホルム溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ及び中性の脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（以降、「ＤＯＰＥ」と表示する場合がある）（Avanti Polar Lipid）のクロロホルム溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを混合した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、さらに一晩減圧乾燥した。得られた固形物に２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）５ｍＬを加え、３時間室温で攪拌して懸濁させた。この懸濁液を超音波処理（１３０Ｗ、１秒パルス、２０分間）することで、粒子化を行った。この溶液を０．２μｍのフィルター（マイレクスＧＰ、ミリポア）でろ過し、粒子組成物３を得た。

［実施例１−４］
ＰＥＧ−ＰＢＬＧのクロロホルム溶液の量を２ｍＬに変更したこと以外は、実施例１−３と同様にして粒子組成物４を得た。

［実施例１−５］
ＰＥＧ−ＰＢＬＧのクロロホルム溶液の量を１．３３ｍＬに変更したこと以外は、実施例１−３と同様にして粒子組成物５を得た。

［実施例１−６］
ＰＥＧ−ＰＢＬＧのクロロホルム溶液の量を１ｍＬに変更したこと以外は、実施例１−３と同様にして粒子組成物６を得た。

［実施例１−７］
実施例１−１で得られたＰＥＧ−ＰＢＬＧをアルカリ処理することで、グルタミン酸側鎖のベンジル基を脱保護し、ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−グルタミン酸）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ）を得た。このＰＥＧ−ｐＧｌｕのグルタミン酸側鎖に対し、オクチルアルコールを用いた縮合反応により部分的にオクチル基（Ｃ₈Ｈ₁₇）を導入することで、アニオン性ポリマーであるＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｃ８）ポリマーを得た。¹Ｈ−ＮＭＲによる解析から、オクチル基の導入数はポリマー当たり３３個であった。ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｃ８）の構造式を下記に示す。

ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｃ８）のメタノール溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬと、カチオン性の荷電脂質であるＤＯＴＡＰ（Avanti Polar Lipid）のメタノール溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ及び中性の脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（以降、「ＤＯＰＥ」と表示する場合がある）（Avanti Polar Lipid）のメタノール溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを混合した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、さらに一晩減圧乾燥した。得られた固形物に１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）２．５ｍＬを加え、３時間室温で攪拌して懸濁させた。この懸濁液を超音波処理（１３０Ｗ、１秒パルス、１０分間）することで、粒子化を行った。この溶液を０．２μｍのフィルター（マイレクスＧＰ、ミリポア）でろ過し、粒子組成物７を得た。

［実施例１−８］
ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｃ８）のメタノール溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）の量を０．５ｍＬに変更したこと以外は実施例１−７と同様にして、粒子組成物８を得た。

［実施例１−９］
実施例１−１で得られたＰＥＧ−ＰＢＬＧをアルカリ処理することで、グルタミン酸側鎖のベンジル基を脱保護し、ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−グルタミン酸）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ）を得た。このＰＥＧ−ｐＧｌｕのグルタミン酸側鎖に対し、ベンジルアルコールを用いた縮合反応により部分的にベンジル基（ＰｈＣＨ₂）を導入することで、アニオン性ポリマーである、ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｂｎ）ポリマーを得た。¹Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ベンジル基の導入数はポリマー当たり３４個であった。ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｂｎ）の構造式を下記に示す。

ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｂｎ）のアセトン溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬと、カチオン性の荷電脂質であるＤＯＴＡＰ（Avanti Polar Lipid）のメタノール溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ及び中性の脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（以降、「ＤＯＰＥ」と表示する場合がある）（Avanti Polar Lipid）のメタノール溶液（４０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを混合した後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、さらに一晩減圧乾燥した。得られた固形物に１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）２．５ｍＬを加え、３時間室温で攪拌して懸濁させた。この懸濁液を超音波処理（１３０Ｗ、１秒パルス、１０分間）することで、粒子化を行った。この溶液を０．２μｍのフィルター（マイレクスＧＰ、ミリポア）でろ過し、粒子組成物９を得た。

［実施例１−１０］
ＰＥＧ−ｐＧｌｕ（Ｃ８）のメタノール溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）の量を０．５ｍＬに変更したこと以外は実施例１−７と同様にして、粒子組成物１０を得た。

［比較例１−１］
ＤＯＴＡＰを添加しないこと以外は、実施例１−１と同様にして比較用粒子組成物Ｃ１を得た。

［比較例１−２］
ＤＯＴＡＰを添加しないこと以外は、実施例１−３と同様にして比較用粒子組成物Ｃ２を得た。

［比較例１−３］
ＰＥＧ−ＰＢＬＧを添加しないこと以外は、実施例１−３と同様にして比較用粒子組成物Ｃ３を得た。当該組成物Ｃ３は、ブロックコポリマーを含有せず、荷電脂質であるＤＯＴＡＰと中性脂質であるＤＯＰＥのみを含有する。

［試験例１ａ］
動的光散乱法により粒子組成物１〜１０及び比較用粒子組成物Ｃ１〜Ｃ３の平均粒径を測定した。結果を表１に示す。

［試験例１ｂ］
粒子組成物３〜１０及び比較用粒子組成物Ｃ３に１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を加え、荷電脂質の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにサンプルを調製した。光散乱粒子径測定装置Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments）を用い、各サンプル（８００μＬ）についてゼータ電位を測定した。測定にはディスポーサブルキャピラリセル（DTS1060、Malvern Instruments）を用い、測定時の温度は２５℃に設定した。

表２に示すように、ブロックコポリマーユニットを含まない比較用粒子組成物Ｃ３に比べ、粒子組成物３〜１０ではゼータ電位の絶対値が小さかった。そして、粒子組成物３〜１０において、荷電脂質に対するブロックコポリマーユニットの質量比が高くなるほど、ゼータ電位の絶対値が小さかった。この結果は、粒子組成物３〜１０の粒子外周面が、荷電脂質に起因する電荷を帯びることが防止された状態にあることを意味する。そして、粒子組成物における荷電脂質の含有量が一定であるとした場合、親水性ポリマー鎖セグメントによって構成される領域の密度が高くなるほど、荷電脂質に起因する電荷を粒子外周面が帯びにくくなることも意味する。

［試験例１ｃ：血清中での凝集性評価］
粒子組成物として粒子組成物３〜１０及び比較用粒子組成物Ｃ３を用い、上述のようにして調製した測定サンプルＡおよびＢから、波長７００ｎｍの光線に対する吸光度をプレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定し、血中凝集度を算出した。なお、得られた値が０以下であった場合、血中凝集度は０とした。この結果および試験例１ｂで測定したゼータ電位の絶対値を表３に示すと共に、図２にゼータ電位の絶対値と血中凝集度との関係を示す。

図２および表３に示すように、粒子組成物は、ゼータ電位の絶対値が１０ｍＶ以下、さらには６ｍＶ以下、特に３ｍＶ以下、の範囲にある場合、血中凝集度が低かった。

〔実施例・試験例群２：アルブミン（ｐＨ７．４）内包粒子組成物〕
［実施例２］
ウシ由来アルブミンがＦＩＴＣ（フルオレセイン５−イソチオシアネート）標識されたアルブミン−ＦＩＴＣ（Sigma Aldrich）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液を形成した。このアルブミン溶液０．２ｍＬと、粒子組成物１（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰとを含有する）０．５ｍＬと、２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）０．５ｍＬとを混合し、４℃で１晩静置することにより、アルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法で求めた当該粒子組成物の平均粒径は９８．７ｎｍであった。なお、アルブミンは、等電点（ＰＩ）が約４．８であり、ｐＨ７．４ではアニオン性を示す生体高分子である。

［比較例２−１］
粒子組成物１に代えて粒子組成物２（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＰＡとを含有する）を用いたこと以外は、実施例２と同様にしてアルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法で求めた当該粒子組成物の平均粒径は９１．６ｎｍであった。

［比較例２−２］
粒子組成物１に代えて比較用粒子組成物Ｃ１（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧを含有する）を用いたこと以外は、実施例２と同様にしてアルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法で求めた当該粒子組成物の平均粒径は１１８ｎｍであった。

［比較例２−３］
粒子組成物１に代えて比較用粒子組成物Ｃ２（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと２ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＥとを含有する）を用いたこと以外は、実施例２と同様にしてアルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法で求めた当該粒子組成物の平均粒径は１１９ｎｍであった。

［試験例２ａ：超遠心によるアルブミンの保持性の評価］
実施例２、比較例２−１〜比較例２−３で得たアルブミン内包粒子組成物の溶液各４０μＬを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）３６０μＬと混合した状態で、超遠心機（Optima MAX Ultracentrifuge、Beckman Coulter）により１０００００×ｇ、４℃で１時間超遠心処理した。上澄み液におけるアルブミン−ＦＩＴＣの蛍光強度を、プレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）し、下記式（１）に基づき、粒子組成物におけるアルブミンの保持率を算出した。

（保持率）＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ 式（１）
Ａ：粒子組成物に添加したアルブミン−ＦＩＴＣの蛍光強度
Ｂ：上澄み液におけるアルブミン−ＦＩＴＣの蛍光強度

表４に示すように、実施例２では遠心処理後も９４％ものアルブミンが粒子内に保持されていたが、比較例２−１〜比較例２−３では遠心処理後に粒子内にアルブミンが残存しなかった。

［試験例２ｂ：ゲルろ過クロマトグラフィーによるアルブミンの保持性評価］
実施例２及び比較例２−１で得たアルブミン内包粒子組成物の溶液各１ｍＬを、Sepharose CL-4Bを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより分析した。溶出液をフラクションに分けて回収し、各フラクションに含まれるアルブミン−ＦＩＴＣの蛍光強度をプレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定した（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）。なお、溶離液としては、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーに１５０ｍＭの塩化ナトリウムを添加した溶液（ｐＨ７．４）を用いた。

図３は、この測定結果を示すグラフである。図３に示すように、アルブミン単体および比較例２−１ではフラクション２０付近において溶出ピークが確認されたのに対し、実施例２ではフラクション１０付近において溶出ピークが確認された。これは、比較例２−１に比べて実施例２はアルブミンの粒子内への保持性に優れることを意味する。

〔実施例・試験例群３：デキストラン内包粒子組成物〕
［実施例３］
平均分子量２００００のデキストランをＦＩＴＣで標識したデキストラン−ＦＩＴＣ（Sigma Aldrich）を２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの溶液を形成した。このデキストラン溶液０．２ｍＬと、粒子組成物１（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰとを含有する）０．５ｍＬと、２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）０．５ｍＬとを混合し、４℃で１晩静置することにより、デキストラン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は７７．６ｎｍであった。なお、デキストランはｐＨ７．４においてアニオン性を示す生体高分子である。

［比較例３−１］
粒子組成物１に代えて粒子組成物２（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＰＡとを含有する）を用いたこと以外は、実施例３と同様にしてデキストラン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は９５．４ｎｍであった。

［比較例３−２］
粒子組成物１に代えて比較用粒子組成物Ｃ１（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧを含有する）を用いたこと以外は、実施例３と同様にしてデキストラン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は１１９ｎｍであった。

［比較例３−３］
粒子組成物１に代えて比較用粒子組成物Ｃ２（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＥとを含有する）を用いたこと以外は、実施例３と同様にしてデキストラン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は１１９ｎｍであった。

［試験例３：超遠心によるデキストランの保持性の評価］
実施例３、比較例３−１〜比較例３−３で得たデキストラン内包粒子組成物の溶液各４０μＬにつき、試験例２ａと同様にして上澄み液におけるデキストラン−ＦＩＴＣの蛍光強度を測定し、下記式（２）に基づき、粒子組成物におけるアルブミンの保持率を算出した。

（保持率）＝（Ａ’−Ｂ’）×１００／Ａ’ 式（２）
Ａ’：粒子組成物に添加したデキストラン−ＦＩＴＣの蛍光強度
Ｂ’：上澄み液におけるデキストラン−ＦＩＴＣの蛍光強度

表５に示すように、実施例３では遠心処理後も４０％近いデキストランが粒子内に保持されていたが、比較例３−１〜比較例３−３では遠心処理後に粒子内にアルブミンがほとんど残存していなかった。

〔実施例・試験例群４：アルブミン（ｐＨ３．３）内包粒子組成物〕
［実施例４］
アルブミン（ウシ由来、Sigma Aldrich）を５０ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ３）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの溶液を形成した。このアルブミン溶液２ｍＬと、粒子組成物２（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＰＡとを含有する）０．５ｍＬと、２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）０．５ｍＬとを混合し、ｐＨ３．３、４℃で１晩静置することにより、アルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は７８．８ｎｍであった。なお、アルブミンは、ｐＨ３．３ではカチオン性を示す。

［比較例４−１］
粒子組成物２に代えて粒子組成物１（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと４ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰとを含有する）を用いたこと以外は、実施例４と同様にしてアルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は９５．１ｎｍであった。

［比較例４−２］
粒子組成物２に代えて比較用粒子組成物Ｃ１（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧを含有する）を用いたこと以外は、実施例４と同様にしてアルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は１１５ｎｍであった。

［比較例４−３］
粒子組成物２に代えて比較用粒子組成物Ｃ２（４０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＢＬＧと１ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＥとを含有する）を用いたこと以外は、実施例４と同様にしてアルブミン内包粒子組成物を形成した。動的光散乱法により求めた当該粒子組成物の平均粒径は１２０ｎｍであった。

［試験例４：超遠心によるアルブミンの保持性の評価］
実施例４、比較例４−１〜比較例４−３で得たアルブミン内包粒子組成物の溶液各４００μＬを、超遠心機（Optima MAX Ultracentrifuge、Beckman Coulter）により１０００００×ｇ、４℃で１時間超遠心処理した。上澄み液におけるアルブミンの濃度を、タンパク質定量キットBCA Protein Assay（Pierce）により定量し、下記式（３）に基づき、粒子組成物におけるアルブミンの保持率を算出した。

（保持率）＝（Ａ”−Ｂ”）×１００／Ａ” 式（３）
Ａ”：粒子組成物に添加したアルブミンの濃度
Ｂ”：上澄み液におけるアルブミン濃度

表６に示すように、実施例４では遠心処理後も９４％を超えるアルブミンが粒子内に保持されていたが、比較例４−１〜比較例４−３では遠心処理後のアルブミンの保持率は実施例４に匹敵する程度には高くなかった。

〔実験例・試験例群５：ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物〕
［実験例５］
次に記載する手順に従って各粒子組成物へのｓｉＲＮＡの内包処理を行った。

粒子組成物３〜６及び比較用粒子組成物Ｃ３につき、次のようにして内包処理を行った。ｓｉＲＮＡを１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させ、２０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。このｓｉＲＮＡ溶液２５０μＬに、目的の電荷比（＋／−）を満たすように濃度を調整した粒子組成物２５０μＬを添加し、混合した後に４℃で２時間静置することにより、粒子組成物へのｓｉＲＮＡの内包処理を行った。なお、「電荷比（＋／−）」とは、［粒子組成物に含有されるカチオン性脂質のカチオン性基の濃度］／［核酸中のリン酸基濃度］である。粒子組成物７〜１０については、１００μＭのｓｉＲＮＡ水溶液１００μＬに、粒子組成物を２７９μＬ添加し、混合した後に４℃で２時間静置することにより、粒子組成物へのｓｉＲＮＡの内包処理を行った。こうして得たｓｉＲＮＡ内包粒子組成物の電荷比（＋／−）は８である。なお、粒子組成物７〜１０から得たｓｉＲＮＡ内包粒子組成物は、常法に従って凍結乾燥処理をしたストックを作成し、水中に再溶解させることによって、後述する各種試験に使用した。

以降の試験例で使用するｓｉＲＮＡにつき、次に説明する。これらｓｉＲＮＡは、株式会社日本イージーティーを通じて入手できる。
・ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ウミホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
・ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）：ヒトＰｌｋ１（Polo-like kinase 1）遺伝子を標的として設計され、センス鎖として５’−ＣＣＡＵＵＡＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖として５’−ＵＵＡＡＧＣＡＧＣＵＣＧＵＵＡＡＵＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号４）を用い、常法により２重鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。Ｐｌｋ１遺伝子は、細胞分裂のＭ期において重要なキナーゼである。ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）は、細胞内に導入された場合にアポトーシスを誘導する。
・Ｆ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）において、配列番号２のアンチセンス鎖の５’末端にＣｙ３標識を付したアンチセンス鎖（５’−Ｃｙ３−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’）を用いて形成したｓｉＲＮＡである。

［試験例５ａ］
試験例５ａでは、粒子組成物として粒子組成物４および粒子組成物６を、そしてｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用し、電荷比が０．５、１、２、４および８になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行った。内包処理後の各粒子組成物におけるｓｉＲＮＡの内包率を、次のようにして電気泳動法により分析した。ポリアクリルアミドゲル（Novex 20% TBE Gel、Invitrogen）に、１００ｎｇのｓｉＲＮＡを含有する各粒子組成物をロードし、ＴＢＥ溶液を泳動バッファーとして用い、引加電圧１００Ｖ、泳動時間１時間の条件で泳動を行った。また、対照として、１００ｎｇのｓｉＲＮＡを同時に泳動した。終了後、発色用試薬SYBR（登録商標）Green II（Invitrogen）により染色を行い、画像解析用イメージング装置Molecular Imager FX（Bio-Rad）により画像化した。

図４は、試験例５ａにおける電気泳動の結果を示す図である。図中、電荷比０とは対照を意味する。図４に示すように、電荷比が２以上である場合、フリーのｓｉＲＮＡ由来のバンドが確認されなかった。これは、粒子組成物４および粒子組成物６を使用した場合、電荷比が２以上であるとき、ほぼ全てのｓｉＲＮＡを粒子組成物に内包できたことを意味する。ｓｉＲＮＡを内包した粒子組成物はｓｉＲＮＡに比べて電気泳動での泳動度が小さくなるため、ｓｉＲＮＡが適切に内包されると、対応する泳動レーンにおいてフリーのｓｉＲＮＡに由来するバンドが検出されなくなる。

［試験例５ｂ］
試験例５ｂでは、粒子組成物として粒子組成物３〜１０及び比較用粒子組成物Ｃ３を、そしてｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用し、電荷比が８になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行った。内包処理後の粒子組成物に１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を加え、荷電脂質の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに調整した。これらのサンプル（８００μＬ）について、光散乱粒子径測定装置Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments）を用い、ゼータ電位を測定した。測定にはディスポーサブルキャピラリセル（DTS1060、Malvern Instruments）を用い、測定時の温度は２５℃に設定した。

表７に示すように、粒子組成物３〜１０を用いて得た内包処理粒子組成物は、ゼータ電位の絶対値が顕著に低下しており、多くのｓｉＲＮＡが内包されたと考えられる。そして、表７に示すように、ブロックコポリマーユニットに対する荷電脂質の添加割合が増えるほど、ｓｉＲＮＡ内包処理後のゼータ電位の低減幅が大きかった。これは、荷電脂質の添加割合が大きいほど、より多くのｓｉＲＮＡを内包できることを意味する。

［試験例５ｃ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する活性評価］
試験例５ｃでは、粒子組成物として粒子組成物３〜６を用い、ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）を使用し、電荷比が８になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行った。そして、ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する次のような活性評価を行った。なお、不活性なコントロール配列としてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、同様の実験を行った。

〔活性評価〕
ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物に１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）を加え、ｓｉＲＮＡ濃度を３μＭ／ｍＬに調整した。ヒト乳癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１ウェル当たり細胞２０００個の割合で９６ウェルのディッシュに播き、２４時間後に各ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物を培地に添加した。ｓｉＲＮＡの培地中での最終濃度は３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３ｎＭ及び１１ｎＭとなるように調整した。９６時間さらに培養した後、細胞の生存率を細胞数測定キットCell Counting Kit-8（同仁堂）を用いて評価した。

図５は、この活性評価の結果を説明するためのグラフである。図５に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）を内包する粒子組成物は、ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を内包する粒子組成物に比べて細胞数の減少が顕著であった。これは、ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物が正常に機能したことを意味する。

［試験例５ｄ：血清中での凝集性評価］
試験例５ｄでは、粒子組成物として粒子組成物３〜１０及び比較用粒子組成物Ｃ３を、そしてｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用して、電荷比が８になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行った。上述のようにして調製した測定サンプルＡおよびＢから、波長７００ｎｍの光線に対する吸光度をプレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定し、血中凝集度を算出した。なお、得られた値が０以下であった場合、血中凝集度は０とした。

図６は、粒子組成物４を用いた内包処理粒子組成物と、比較用粒子組成物Ｃ３を用いた内包処理粒子組成物における、測定サンプルＡ（ＦＢＳあり）および測定サンプルＢ（ＦＢＳなし）から得た吸光度を示すグラフである。図６に示すように、比較用粒子組成物Ｃ３を用いた内包処理粒子組成物では、ＦＢＳ処理によって吸光度が大きく増加した。これは、血清成分との相互作用による凝集が生じたことを意味する。粒子組成物４を用いた内包処理粒子組成物（ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物）では、ＦＢＳ処理による吸光度の増加がほとんどなかった。

図７および下記の表８は、試験例５ｂで測定した内包処理粒子組成物のゼータ電位の絶対値と、試験例５ｄで測定した内包処理粒子組成物の血中凝集度との関係を示すグラフおよび表である。

図７および表８に示すように、内包処理粒子組成物は、ゼータ電位の絶対値が５ｍＶ以下、３ｍＶ以下、さらには２ｍＶ以下、特に１ｍＶ以下、の範囲にある場合、血中凝集度が顕著に低かった。

［試験例５ｅ：血中滞留性の評価］
試験例５ｅでは、粒子組成物として粒子組成物３〜１０を、そしてｓｉＲＮＡとしてＦ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用して、電荷比が８になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行った。さらに、粒子組成物４については、電荷比が１、２および４になるようなｓｉＲＮＡの内包処理も行った。得られたｓｉＲＮＡ内包粒子組成物に対し、３Ｍの塩化ナトリウム水溶液を体積比１／２０で添加し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する等張液（ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物サンプル）を調製した。対照として、Ｆ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）をｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーに溶解して得た１０μＭのｓｉＲＮＡ溶液に、３Ｍの塩化ナトリウム水溶液を体積比１／２０で添加し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する等張液（ｓｉＲＮＡ単体サンプル）を調製した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー）の尾静脈にｓｉＲＮＡ内包粒子組成物サンプル及びｓｉＲＮＡ単体サンプルを投与し、その１時間後に下大静脈から血液２００μＬを採取した。各サンプルの投与量は、マウス体重に対するＦ−ｓｉＲＮＡの比率が１ｍｇ／ｋｇとなるように調整した。

粒子組成物３〜６由来のサンプルを投与した個体から採取した血液につき、４℃、２０００×ｇで１０分遠心し、上清から８０μＬの血漿を得た。この血漿の蛍光強度を、プレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）することによって、血中に残存するＦ−ｓｉＲＮＡを定量した。粒子組成物７〜１０由来のサンプルを投与した個体から採取した血液につき、４℃、２０００×ｇで１０分遠心し、上清から１００μＬの血漿を得た。この血漿にセパゾール ＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク）を１ｍＬ加え、ボルテックスにより撹拌し、５分静置した。これにクロロホルム２００μＬを加え、転倒混和した後、３分静置した。この溶液を５２００×ｇ、４℃で１０分遠心し、得られた上清３００μＬの蛍光強度をプレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）することによって、血中に残存するＦ−ｓｉＲＮＡを定量した。

表９に示すように、粒子組成物３〜１０を用いて調製したｓｉＲＮＡ内包粒子組成物では、０．９％以上のＦ−ｓｉＲＮＡの血中の残存が認められた。そして、ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物において、荷電脂質に対するブロックコポリマーユニットの質量比が高くなるほど、Ｆ−ｓｉＲＮＡの残存率が高かった。これは、粒子組成物における荷電脂質の含有量が一定であるとした場合、親水性ポリマー鎖セグメントによって構成される領域の密度が増加するほど、血中において薬剤を粒子内に維持できる期間が長くなることを意味する。また、ゼータ電位の絶対値が低いサンプルほどＦ−ｓｉＲＮＡの残存量は高く、ゼータ電位の絶対値が０．３７ｍＶである粒子組成物７を用いたサンプルでのＦ−ｓｉＲＮＡ残存量は３７．９％であり、ゼータ電位の絶対値が０．５７ｍＶである粒子組成物９を用いたサンプルでのＦ−ｓｉＲＮＡ残存量は１５．５％であった。そして、表１０に示すように、ｓｉＲＮＡ内包粒子組成物における電荷比が高くなるほど、Ｆ−ｓｉＲＮＡの残存率が高かった。これは、荷電脂質の添加割合が大きいほど、血中において薬剤を粒子内に維持できる期間が長くなることを意味する。

粒子組成物として粒子組成物６を、ｓｉＲＮＡとしてｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用して、電荷比が１．５になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行ったサンプルについて、試験例５ｂに記載した方法でゼータ電位を測定したところ、その絶対値は０．３６ｍＶであり粒子組成物７を用いたサンプルとほぼ同等であった。ところが、粒子組成物６について、試験例５ｅに示した方法で、ｓｉＲＮＡとしてＦ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用して内包処理を行ったサンプル（ゼータ電位：０．３６ｍＶ）について、血中滞留性の評価を行ったところ、Ｆ−ｓｉＲＮＡの残存量は０．９１％であった。すなわち、粒子組成物７を用いたサンプルは、粒子組成物６を用いたサンプルに比べて、ゼータ電位の絶対値は同程度でありながらも、内包薬物の血中滞留性が顕著に優れていた。このように、粒子組成物をアニオン性ポリマーで構成することによって、中性ポリマーによって粒子組成物を構成した場合に比べて、内包薬物の血中滞留性を大幅に向上できる。

［試験例５ｆ：臓器移行性の評価］
試験例５ｆでは、粒子組成物として粒子組成物３及び比較用粒子組成物Ｃ３を、そしてｓｉＲＮＡとしてＦ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を使用して、電荷比が８になるように、実験例５に示した方法でｓｉＲＮＡの内包処理を行った。内包処理後の粒子組成物に対し、３Ｍの塩化ナトリウム水溶液を体積比１／２０で添加し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する等張液（内包処理粒子組成物サンプル）を調製した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雌、５週齢、日本チャールズリバー）にヒト乳癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移植した。４週間後に腫瘍サイズが２００ｍｍ³以上となったマウスに対し、内包処理粒子組成物サンプルを投与した。投与したＦ−ｓｉＲＮＡの量は、マウスの体重に対し１ｍｇ／ｋｇとなるようにした。投与から１０分後、６０分後、及び１８０分後に各臓器５０〜１００μｇを採取し、それぞれＲＮＡ抽出試薬セパゾール ＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク）１ｍＬを加え、ホモジナイズした。各ホモジネート５００μＬに対しクロロホルム１００μＬを加え、４℃、５２００Ｇで１０分遠心した後、上澄み２００μＬの蛍光強度を、プレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬）により測定（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍ）し、各臓器中に移行したＦ−ｓｉＲＮＡを定量した。

図８は、試験例５ｆで調べた薬物の臓器移行性を説明するためのグラフである。図７および表１１に示すように、比較用粒子組成物Ｃ３を用いて得た内包処理粒子組成物の場合は、速やかに血中から消失し、肺への顕著な集積が認められた。他方、粒子組成物４を用いて得たｓｉＲＮＡ内包粒子組成物の場合は、より長く血中に滞留すると共に、腫瘍への移行も認められた。

本発明の粒子組成物を薬物担体として用い、薬物を内包させて医薬組成物とすることで、薬物（特に高分子化合物）を生体内でより有効に保持することができ、分解や排泄から保護できる。また、活性を保ったままで薬物を患部に送達することができる。さらに、血中成分との相互作用による薬物担体の凝集を回避することができる。これにより薬物の有効利用率が格段に改善され、投与量の大幅な低減による医療経済上の改善や効果的な薬理作用の発現が期待される。投与量の低減は、タンパク質や核酸等に対する免疫応答の惹起や血液凝固系への影響などの副作用の抑制などの観点でも有用である。

Claims (12)

1. 疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーユニットを含有し、複数の前記ブロックコポリマーユニットが前記疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に前記親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置された、薬物を内包するための粒子組成物であって、
   内包されるべき薬物の電荷とは反対の電荷を帯びた荷電脂質をさらに有し、当該荷電脂質との静電結合によって前記薬物を粒子内に保持する一方、当該荷電脂質が前記疎水性ポリマー鎖セグメント側に引き寄せられた状態で配置されることによって、前記荷電脂質とは反対の電荷を帯びた帯電性物質を誘引し得る電荷を粒子外周面が帯びることが防止され、
   前記薬物として、タンパク質及び核酸からなる群より選択される生体高分子に適用される、粒子組成物。
2. 前記荷電脂質が粒子組成物の周方向において連続する状態で配置されておらず、粒子組成物の周方向において隣接する前記ブロックコポリマーユニット間に介在するように配置されることによって、粒子組成物の周方向において隣接する荷電脂質間の接触が前記ブロックコポリマーユニットによって分断された状態にある、請求項１に記載の粒子組成物。
3. 前記親水性ポリマー鎖セグメントがポリエチレングリコール鎖であり、前記疎水性ポリマー鎖セグメントがポリアミノ酸鎖である、請求項１又は２に記載の粒子組成物。
4. 前記疎水性ポリマー鎖セグメントがアニオン性ポリマー鎖セグメントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子組成物。
5. 前記疎水性ポリマー鎖セグメントが、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される
   （式中、Ｒ^１及びＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子又はＲ^８（Ｒ^９）ＣＨ（ＣＨ_２）_ｑ−で表される基を表し（ただし、Ｒ^８及びＲ^９は、ｉ）それぞれ独立して、水素原子、Ｃ_１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ_１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ_２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ_１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基であるか、ｉｉ）一緒になって、Ｃ_１−３アルキル基で置換されていている若しくは未置換のエチレンジオキシ基又はプロピレンジオキシ基を形成するか、又はｉｉｉ）それらが結合しているＣＨ基と一緒になってホルミル基を形成し、ｑは、０〜１０の整数である）、Ｒ^２は水素原子、飽和若しくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_２９脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基であり、Ｒ^４は水酸基、飽和若しくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_３０脂肪族オキシ基又はアリール−低級アルキルオキシ基であり、Ｒ^５は−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ^６は水素原子、フェニル基、ベンジル基、−（ＣＨ_２）_４−フェニル基、未置換の若しくはアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ_４〜Ｃ_１６アルキル基、又は、ステロール誘導体の残基であり、Ｒ^７はメチレン基であり、ｎは５５〜４，６００の範囲にある整数であり、ｘは１０〜２００の範囲にある整数であり、ｍは０〜２００の範囲にある整数であり、ただし、ｍが１以上である場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ^７ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在し、ｍが２以上である場合、Ｒ^６は１つのブロックコポリマーユニット２内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ^６が水素原子である場合はＲ^６全体の７５％以下であり、ｙは１又は２であり、Ｌ^１は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ_２−、及び−Ｏ−Ｚ−Ｓ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ_１〜Ｃ_６アルキレン基である。）から選ばれる連結基であり、Ｌ^２は−ＯＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、及び−ＮＨＣＯ−Ｚ−ＣＯ−（ただし、ＺはＣ_１〜Ｃ_６アルキレン基である）から選ばれる連結基である）、請求項１〜４の何れか１項に記載の粒子組成物。
6. 前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、Ｒ^５が−Ｏ−であり、Ｒ^６が、ベンジル基、−（ＣＨ_２）_４−フェニル基、又は、未置換の若しくはアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ_４〜Ｃ_１６アルキル基である、請求項５に記載の粒子組成物。
7. ｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液に、前記粒子組成物に含有される前記荷電脂質の総量が１ミリリットルの当該バッファー溶液あたり０．１ｍｇになるように添加した場合に測定されるゼータ電位の絶対値が、１５ｍＶ以下の範囲に制御された状態にあることによって、血中における凝集が防止された、請求項１〜６のいずれか１項に記載の粒子組成物。
8. 前記ゼータ電位の絶対値が３ｍＶ以下の範囲に制御された状態にあることによって、血中における凝集が更に防止された、請求項７に記載の粒子組成物。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子組成物と、当該粒子組成物に内包された、前記荷電脂質とは反対の電荷を帯びた薬物と、を有し、前記薬物が、タンパク質及び核酸からなる群より選択される生体高分子を含む、医薬組成物。
10. ｐＨが７．４である１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液に、前記粒子組成物に含有される前記荷電脂質の総量が１ミリリットルの当該バッファー溶液あたり０．１ｍｇになるように添加した場合に測定されるゼータ電位の絶対値が、１０ｍＶ以下の範囲に制御された状態にあることによって、血中における凝集が防止された、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記ゼータ電位の絶対値が２ｍＶ以下の範囲に制御された状態にあることによって、血中における凝集が更に防止された、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記疎水性ポリマー鎖セグメントがアニオン性ポリマー鎖セグメントで構成されていることによって、薬物の血中滞留性が向上した状態にある、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。