JP2008504827A

JP2008504827A - 免疫賦活性ｓｉＲＮＡ分子およびその使用方法

Info

Publication number: JP2008504827A
Application number: JP2007519578A
Authority: JP
Inventors: イアンマクラクラン; アダムジャッジ
Original assignee: プロチババイオセラピューティクスインコーポレイティッド
Priority date: 2004-07-02
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2008-02-21
Also published as: AU2005259799A1; EP1773857A1; EP1773857A4; WO2006002538A1; CA2572439A1; US7807815B2; US20060025366A1

Abstract

本発明は、siRNA分子、ならびに免疫応答を調節するためおよび標的遺伝子の発現をサイレンシングするためにそのようなsiRNA分子を使用する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2005年3月25日出願の米国仮特許出願第60/665,297号；2004年11月12日出願の同第60/627,326号；2004年7月19日出願の同第60/589,363号；および2004年7月2日出願の同第60/585,301号の恩典を主張し、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
RNA干渉(RNAi)は、相補的な標的一本鎖mRNAの分解および対応する翻訳配列の「サイレンシング」を誘導する二本鎖RNA(dsRNA)によって誘発される、進化的に保存された配列特異的機構である(McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002)(非特許文献1))。RNAiは、長いdsRNA鎖を、生物活性のある約21〜23ヌクレオチド長の「低分子干渉RNA」(siRNA)配列になるよう酵素で切断することによって機能する(Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001)(非特許文献2))。siRNAは、関心対象の遺伝子産物、すなわち標的配列の転写および翻訳を下方制御またはサイレンシングするために使用し得る。

核酸は、他の高分子と同様に、生物学的応答調節物質として作用し得る、すなわちインビボ投与に際し、哺乳動物において免疫応答を誘導し得る。例えば、ポリ(I:C)-LCは、インターフェロン(IFN)の強力な誘導因子として、ならびにマクロファージ活性化因子およびナチュラルキラー(NK)活性の誘導因子として同定されている(Talmadge et al., Cancer Res. 45:1058 (1985)(非特許文献3)；Wiltrout et al., J. Biol. Resp. Mod. 4:512 (1985)(非特許文献4)；Krown, Sem. Oncol. 13:207 (1986)(非特許文献5)；およびEwel et al., Canc. Res. 52:3005 (1992)(非特許文献6))。残念なことに、これまで、ポリ(I:C)-LCおよび他の核酸は、毒性副作用があるために有用な治療薬となり得ていない。

いくつかのホスホロチオエート修飾オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、インビトロおよびインビボB細胞刺激を誘導することが報告されている(Tanaka et al., J. Exp. Med. 175:597 (1992)(非特許文献7)；Branda et al.,. Biochem. Pharmacol. 45:2037 (1993)(非特許文献8)；McIntyre et al., Antisense Res. Develop. 3:309 (1993)(非特許文献9)；およびPisetsky and Reich, Life Sciences 54:101 (1993)(非特許文献10))。しかし、これらの報告はいずれも、その効果を説明し得る、それらODN中の共通の構造モチーフまたは配列要素を示唆していない。

最近の報告により、陽イオン性脂質1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)(DOTAP)と複合化された、HIV-1 RNAのU5領域に由来するGUリッチ配列を含むホスホロチオエート保護一本鎖RNA配列が、サイトカインIL-6、IL-12p40、TNF-α、およびIFN-αの発現を誘導し得ることが示された(例えば、Heil et al., Science 303:1526-1529 (2004)(非特許文献11)を参照されたい)。さらに、米国特許公開公報第20030232074号(特許文献1)およびWO 03/086280(特許文献2)では、少なくとも1つのグアニンおよび少なくとも1つのウラシルを含む免疫賦活性RNA分子、すなわちrRNA、tRNA、mRNA、およびvRNAについて記載している。しかしながら、これらの報告は、siRNAも免疫賦活特性を有すること、またはsiRNAを用いて免疫応答を調節し得ることについて言及または示唆している。

したがって、その免疫賦活特性を調節する(すなわち、増加または減少させる)ために修飾し得る核酸組成物の必要性が存在する。本発明は、これらおよびその他の必要性に取り組むものである。

米国特許公開公報第20030232074号 WO 03/086280 McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002) Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001) Talmadge et al., Cancer Res. 45:1058 (1985) Wiltrout et al., J. Biol. Resp. Mod. 4:512 (1985) Krown, Sem. Oncol. 13:207 (1986) Ewel et al., Canc. Res. 52:3005 (1992) Tanaka et al., J. Exp. Med. 175:597 (1992) Branda et al.,. Biochem. Pharmacol. 45:2037 (1993) McIntyre et al., Antisense Res. Develop. 3:309 (1993) Pisetsky and Reich, Life Sciences 54:101 (1993) Heil et al., Science 303:1526-1529 (2004)

発明の概要
本発明は、siRNA分子、ならびに標的遺伝子発現をサイレンシングするために、および/またはsiRNA分子に付随する免疫応答を調節する(すなわち、増強または減少させる)ためにそのようなsiRNA分子を使用する方法を提供する。

本発明の1つの態様は、約15〜約30ヌクレオチド長の二本鎖領域、および標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA配列中の5'-GU-3'ジヌクレオチドに相当する5'-XX'-3'ジヌクレオチド(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGUでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)からなる非免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む、標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAを提供する。修飾siRNAは、非免疫賦活性ミスマッチモチーフを含まないsiRNAよりも免疫原性が低い。いくつかの態様において、siRNAは、標的配列に対する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のさらなる免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む。免疫賦活性ミスマッチモチーフは相互に隣接していてもよいし、または1、2、4、6、8、10、もしくは12、またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられていてもよい。

本発明の別の態様は、約15〜約30ヌクレオチド長の二本鎖領域、および標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA配列中の5'-XX'-3'ジヌクレオチドモチーフ(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGUでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)に相当する5'-GU-3'ジヌクレオチドからなる免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む、標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAを提供する。修飾siRNAは、免疫賦活性ミスマッチモチーフを含まないsiRNAよりも免疫原性が高い。いくつかの態様において、siRNAは、標的配列に対する1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のさらなる免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む。免疫賦活性ミスマッチモチーフは相互に隣接していてもよいし、または1、2、4、6、8、10、もしくは12、またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられていてもよい。

いくつかの態様において、本明細書に記載のsiRNAは、標的配列の発現をサイレンシングする方法において、および/またはsiRNAに付随する免疫応答を調節する(すなわち、増強または減少させる)方法において用いられる。有効量のsiRNAを哺乳動物対象に投与し、それによって、標的配列の発現をサイレンシングするか、またはsiRNAに付随する免疫応答を調節する。

本発明はまた、本明細書に記載のsiRNA分子を含む薬学的組成物を提供する。

本発明の別の態様は、本明細書に記載のsiRNA分子；陽イオン性脂質；非陽イオン性脂質；および粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む核酸-脂質粒子を提供する。陽イオン性脂質は、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチル塩化アンモニウム(DODAC)、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチル臭化アンモニウム(DDAB)、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTAP)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)、およびN,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLendMA)、またはこれらの混合物であってよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約2％〜約60％、約5％〜約45％、約5％〜約15％、または約40％〜約50％を構成し得る。

非陽イオン性脂質は、これらに限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、およびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、コレステロール、またはこれらの混合物をはじめとする陰イオン性脂質または中性脂質であってよい。陰イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約5％〜約90％または約20％〜約85％を構成する。

粒子の凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール(PEG)-脂質複合体、ポリアミド(ATTA)-脂質複合体、陽イオン性ポリマー-脂質複合体(CPL)、またはこれらの混合物であってよい。1つの好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、CPLと共にPEG-脂質複合体またはATTA-脂質複合体のいずれかを含む。粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)、PEGジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、またはこれらの混合物をはじめとするポリエチレングリコール-脂質を含み得る。PEG-DAA複合体は、PEG-ジラウリルオキシプロピル(C12)、PEG-ジミリストイルオキシプロピル(C14)、PEG-ジパルミチルオキシプロピル(C16)、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル(C18)であってよい。いくつかの態様において、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、式：A-W-Y(式中、Aは脂質部分であり；Wは親水性ポリマーであり；またYはポリカチオン性部分である)を有する。Wは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、約250〜約7000ダルトンの分子量を有するポリマーであってよい。いくつかの態様において、Yは、選択されたpHにおいて少なくとも4つの正電荷を有する。いくつかの態様において、Yは、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせであってよい。粒子の凝集を妨げる複合脂質は、粒子中に存在する総脂質の約0％〜約20％、約1％〜約15％、約4％〜約10％、または約約2％であってよい。

いくつかの態様において、核酸-脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の例えば約10％〜約60％または約20％〜約45％のコレステロールをさらに含む。

いくつかの態様において、核酸-脂質粒子中のsiRNAは、粒子をヌクレアーゼに37℃で少なくとも20、30、45、もしくは60分間曝露した後；または粒子を血清中、37℃で少なくとも35、45、もしくは60分間インキュベートした後、実質的に分解されない。

いくつかの態様において、siRNAは、核酸-脂質粒子中に完全に封入されている。いくつかの態様において、siRNAは、粒子の脂質部分と複合化されている。

本発明はさらに、本明細書に記載の核酸-脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

本発明のさらに別の態様は、免疫賦活特性を有するsiRNAを修飾する方法を提供する。その方法は、(a) 少なくとも1つのGUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'モチーフ)を含み、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA配列を提供する段階；および(b) 非修飾siRNA配列中の少なくとも1つのGUリッチモチーフに相当する5'-XX'-3'モチーフ(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)からなる、標的配列に対する非免疫賦活性ミスマッチモチーフで少なくとも1つのGUリッチモチーフを置換するように、siRNAを修飾する段階を含み；それによって、非修飾siRNA配列よりも免疫原性が低く、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAが作製される。

本発明の別の態様は、非免疫賦活特性を有するsiRNAを修飾する方法を提供する。その方法は、(a) GUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'モチーフ)を欠き、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNAを提供する段階；および(b) 非修飾siRNA中の5'-XX'-3'モチーフ(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)に相当するGUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'ジヌクレオチドモチーフ)からなる、標的配列に対する少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチモチーフを導入するように、siRNAを修飾する段階を含み；それによって非修飾siRNAよりも免疫原性が高く、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAが作製される。

本発明のさらなる態様は、免疫賦活特性を有するsiRNAを同定および/または修飾する方法を提供する。その方法は、(a) 標的核酸配列を提供する段階；(b) 標的配列に相補的であり、かつ少なくとも1つのGUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'モチーフ)を含むsiRNA配列を同定する段階であって、少なくとも1つのGUリッチモチーフの存在により免疫賦活性siRNAが同定される段階；および(c) 応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階を含む。いくつかの態様において、siRNAは、非修飾siRNA配列中の少なくとも1つのGUリッチモチーフに相当する5'-XX'-3'モチーフ(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)からなる、標的配列に対する非免疫賦活性ミスマッチモチーフで少なくとも1つのGUリッチモチーフを置換して修飾され、それによって、非修飾siRNA配列よりも免疫原性が低い修飾siRNAが作製される。いくつかの態様において、この方法は、応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、非修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞(例えば、末梢血単核細胞)と接触させる段階；および修飾siRNAによって生じる免疫応答(例えば、TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-12、およびそれらの組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生)を、非修飾siRNAによって生じる免疫応答と比較する段階をさらに含む。哺乳動物応答細胞は、未処置の哺乳動物(すなわち、標的核酸配列の遺伝子産物と以前に接触したことのない哺乳動物)に由来し得る。

本発明のさらに別の態様は、非免疫賦活特性を有するsiRNAを同定および/または修飾する方法を提供する。その方法は、(a) 標的核酸配列を提供する段階；(b) 標的配列に相補的であり、かつ5'-GU-3'モチーフを欠くsiRNA配列を同定する段階であって、5'-GU-3'モチーフの不在により非免疫賦活性siRNAが同定される段階；および(c) 応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階を含む。いくつかの態様において、この方法は、非修飾siRNA中の5'-XX'-3'ジヌクレオチドモチーフ(式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される)に相当する5'-GU-3'ジヌクレオチドからなる、標的配列に対する少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチモチーフを導入するように、siRNAを修飾する段階さらに含み、それによって非修飾siRNAよりも免疫原性が高い修飾siRNAが作製される。いくつかの態様において、この方法は、応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、非修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階；および修飾siRNAによって生じる免疫応答(例えば、TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-12、およびそれらの組み合わせなどのサイトカインまたは増殖因子の産生)を、非修飾siRNAによって生じる免疫応答と比較する段階をさらに含む。

本発明のさらに別の態様は、表1、2、3、または4に記載される配列を含む単離された核酸分子を提供する。

発明の詳細な説明
I. 序論
本発明は、siRNA分子が修飾され得る免疫賦活効果を有するという驚くべき発見に一部基づく。特に、本発明は、GUリッチモチーフを含むsiRNA分子(例えば、5'-GU-3'モチーフ、5'-UG-3'モチーフ、5'-UGU-3'モチーフ、5'-GUGU-3'モチーフ、または5'-UGUGU-3'モチーフを含むsiRNA分子)が、免疫賦活特性を有するという発見に基づく。この発見に基づき、本発明は、siRNA分子に付随する免疫応答を増強するまたは減少させる方法および組成物、ならびに免疫賦活特性または非免疫賦活特性を有するsiRNA分子を同定する方法を提供する。

例えば、GUリッチモチーフを含むsiRNA分子の免疫賦活特性は、1つもしくは複数のGまたは1つもしくは複数のUを別のヌクレオチドで置換することによって、減少させることができる。同様に、siRNA分子の免疫賦活特性は、GUリッチモチーフをsiRNA配列中に導入する1つまたは複数の置換によって、増加させることができる。さらに、GUリッチモチーフを含むsiRNA分子の免疫賦活特性は、さらなるGUリッチモチーフを配列中に導入する1つまたは複数の置換によって、増加させることができる。または、免疫賦活性でないsiRNAは、GUリッチモチーフをsiRNA配列中に導入する置換によって、免疫賦活性となるように修飾することができる。

理論によって縛られることはないが、siRNA分子の免疫賦活活性は、Toll様受容体媒介性シグナル伝達によって媒介されると仮定される。これらの知見は、新たな治療アプローチとしてのRNAiの臨床開発のために、およびsiRNAを用いる特定の遺伝子サイレンシング効果の解釈において、重要な意味を有する。例えば、GUリッチモチーフを破壊するように免疫賦活性siRNAを修飾して、標的遺伝子をサイレンシングする能力を保持しつつ、その免疫賦活特性を減少させることができる。または、免疫賦活性siRNAを用いて、制御された一過性のサイトカイン産生、活性化T細胞およびNK細胞増殖、腫瘍特異的CTL応答、非遺伝子特異的腫瘍退行、ならびにB細胞活性化(すなわち、抗体産生)をもたらすことができる。さらに、GUリッチモチーフを含むように非免疫賦活性siRNAを修飾して、標的遺伝子をサイレンシングする能力を保持しつつ、その免疫賦活特性を増強することができる。

II. 定義
「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、干渉RNAが標的遺伝子と同じ細胞内に存在する場合に、標的遺伝子の発現を減少させ得るかまたは阻害し得る(すなわち、干渉RNAの配列に相補的なmRNAの分解を媒介することによって)二本鎖RNA(すなわち、二重鎖RNA)を指す。したがって、干渉RNAは、2つの相補鎖によって、または自己相補的な一本鎖によって形成される二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子に対して実質的なまたは完全な同一性を有してもよいし、またはミスマッチ領域(すなわち、ミスマッチモチーフ)を含んでもよい。干渉RNAの配列は、全長標的遺伝子またはそのサブ配列に対応し得る。干渉RNAには、「低分子干渉RNA」または「siRNA」、すなわち、約15〜60、15〜50、15〜50、または15〜40(二重)ヌクレオチド長、より典型的には、約15〜30、15〜25、または19〜25(二重)ヌクレオチド長、および好ましくは約20〜24または約21〜22もしくは21〜23(二重)ヌクレオチド長の干渉RNAが含まれる(例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は、15〜60、15〜50、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25ヌクレオチド長、好ましくは約20〜24または約21〜22もしくは21〜23ヌクレオチド長であり、また二本鎖siRNAは、約15〜60、15〜50、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25、または19〜25、好ましくは約20〜24または約21〜22もしくは21〜23塩基対長である)。siRNA二重鎖は、約1〜約4ヌクレオチド、好ましくは約2〜約3ヌクレオチドの3'オーバーハング、および5'リン酸末端を含み得る。siRNAは化学合成することができ、またはプラスミドによってコードされ得る(例えば、ヘアピンループを有する二重鎖へと自動的に折りたたまれる配列として転写される)。siRNAはまた、より長いdsRNA(例えば、約25ヌクレオチド長よりも大きなdsRNA)を大腸菌(E. coli)RNase IIIまたはダイサーで切断することによって作製され得る。これらの酵素は、dsRNAを加工して生物活性のあるsiRNAにする(例えば、Yang et al., PNAS USA 99: 9942-7 (2002)；Calegari et al., PNAS USA 99: 14236 (2002)；Byrom et al., Ambion TechNotes 10(1): 4-6 (2003)；Kawasaki et al., Nucleic Acids Res. 31: 981-7 (2003)；Knight and Bass, Science 293: 2269-71 (2001)；およびRobertson et al., J. Biol. Chem. 243: 82 (1968)を参照されたい)。好ましくは、dsRNAは少なくとも50ヌクレオチド〜約100、200、300、400、または500ヌクレオチド長である。dsRNAは、1000、1500、2000、5000ヌクレオチド長、またはそれ以上の長さであってもよい。dsRNAは、遺伝子転写産物全体をコードしてもよいし、または部分的遺伝子転写産物をコードしてもよい。

本明細書で使用する「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列と100％の相補性をもたないsiRNA配列の部分を指す。siRNAは、少なくとも1、2、3、4、5、6、またはそれ以上のミスマッチ領域を有し得る。ミスマッチ領域は隣接していてもよいし、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、もしくはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられていてもよい。ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、単一のヌクレオチドを含み得るか、または2、3、4、5、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、免疫賦活性または非免疫賦活性であり得る。免疫賦活性ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、GUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'モチーフ、5'-UG-3'モチーフ、5'-UGU-3'モチーフ、5'-GUGU-3'モチーフ、または5'-UGUGU-3'モチーフ)である。非免疫賦活性ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、GUリッチモチーフを欠いている。

siRNAの「有効量」または「治療的有効量」とは、所望の効果、例えば、siRNAの不在下で検出される通常の発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害、または例えば、siRNAの不在下で検出される通常のレベルと比較した免疫応答の増加もしくは減少を生じるのに十分な量である。対照と比較して、構築物により得られる値が約90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、または0％である場合に、標的遺伝子または標的配列の発現の阻害が達成される。標的遺伝子または標的配列の発現を測定する適切なアッセイ法には、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション法、ELISA法、免疫沈降法、酵素機能法などの、当業者に周知の技法を用いるタンパク質もしくはmRNAレベルの試験、および当業者に周知である表現型アッセイ法が含まれる。

siRNAによる免疫応答の「増加(increaseまたはincreasing)」は、siRNA(例えば、GUリッチモチーフを含む修飾または非修飾siRNA)に対する免疫応答の検出可能な増加を意味することを意図する。GUリッチモチーフを含む修飾または非修飾siRNAによる免疫応答の増加量は、siRNAの不在下で検出される免疫応答のレベルに対して決定され得る。GUリッチモチーフを含む修飾siRNAによる免疫応答の増加量はまた、非修飾siRNA(例えば、GUリッチモチーフを欠く非修飾siRNA)の存在下における免疫応答レベルに対して決定され得る。検出可能な増加は、siRNA(例えば、GUリッチモチーフを含む修飾または非修飾siRNA)の不在下で検出される免疫応答よりも、約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％またはそれ以上高くあり得る。siRNAに対する免疫応答の増加は、典型的に、インビトロにおける応答細胞によるサイトカイン産生(例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6、またはIL-12)の増加により、またはsiRNA投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン産生の増加により測定される。

siRNAによる免疫応答の「減少(decreaseまたはdecreasing)」は、siRNA(例えば、GUリッチモチーフを欠く修飾siRNA)に対する免疫応答の検出可能な減少を意味することを意図する。GUリッチモチーフを欠く修飾siRNAによる免疫応答の減少量は、非修飾siRNA(例えば、GUリッチモチーフを含む非修飾siRNA)の存在下における免疫応答のレベルに対して決定され得る。検出可能な減少は、非修飾siRNA(例えば、GUリッチモチーフを含む非修飾siRNA)の不在下で検出される免疫応答よりも、約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％またはそれ以上低くあり得る。siRNAに対する免疫応答の増加は、典型的に、インビトロにおける応答細胞によるサイトカイン産生(例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6、またはIL-12)の増加により、またはsiRNA投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン産生の増加により測定される。

本明細書で使用する「応答細胞」という用語は、免疫賦活性二本鎖RNAと接触させた場合に、検出可能な免疫応答を生じる細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。例示的な応答細胞には、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞、脾細胞などが含まれる。検出可能な免疫応答には、例えば、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、およびTGFなどのサイトカインの産生が含まれる。

「実質的同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする配列、または参照配列の特定領域にわたって特定のパーセント同一性を有する配列を指す。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、典型的に核酸の複合混合物中で、siRNAがその標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度 pHにおいて、特定の配列の融解温度(T_m)よりも約5〜10℃低く選択される。T_mとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの50％が標的配列にハイブリダイズする(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である(標的配列が過剰に存在する場合、T_mでは平衡状態で50％のプローブが占有される)。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。

例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りであってよい：50％ホルムアミド、5xSSC、および1％ SDSで42℃にてインキュベートするか、または5xSSC、1％ SDSで65℃にてインキュベートし、0.2xSSCおよび0.1％ SDSで65℃にて洗浄する。PCRでは、約36℃という温度が低ストリンジェンシーの増幅に典型的であるが、アニーリング温度はプライマーの長さに応じて約32℃〜48℃で変動し得る。高ストリンジェンシーのPCR増幅では、約62℃という温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて、約50℃〜約65℃であり得る。高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシー増幅の典型的なサイクル条件には、30秒〜2分間の90℃〜95℃の変性段階、30秒〜2分間続くアニーリング段階、および1〜2分間の約72℃の伸長段階が含まれる。低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシー増幅反応に関する手順および指針は、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.において提供される。

ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、やはり実質的に同一である。これは例えば、遺伝暗号により許容される最大限のコドン縮重を用いて核酸のコピーが作製された場合に起こる。このような場合、核酸は典型的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、37℃における40％ホルムアミド、1 M NaCl、1％ SDSの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および45℃での1X SSC中での洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して同様のストリンジェンシー条件を提供し得ることを容易に認識すると考えられる。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなる指針は、多くの参考文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.において提供される。

2つまたはそれ以上の核酸との関連における「実質的に同一」または「実質的同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いた、または手動アラインメントおよび目視検査による測定により、比較領域または指定の領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合に、同じであるか、または特定の割合で同じヌクレオチド(すなわち、特定の領域にわたって少なくとも約60％、好ましくは65％、70％、75％、好ましくは80％、85％、90％、または95％の同一性)を有する2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。この定義はまた、文脈が示す場合、同様に配列の相補体を指す。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、または100ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。

配列比較では、典型的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを用いることもできるし、別のパラメータを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性が計算される。

本明細書で用いる「比較領域」には、2つの配列が最適にアラインメントされた後に、配列が同じ数の連続位置の参照配列に対して比較され得る、20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される任意の数の連続位置の領域に対する言及が含まれる。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI)のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)により、または手動アラインメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい)により行うことができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本明細書に記載のパラメータとともに使用されて、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定する。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に利用可能である。

BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析を行う(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小総和確率(P(N))であり、これは2つの核酸またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小総和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合に、核酸は参照核酸に対して類似していると見なされる。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態である少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むポリマーを指し、これにはDNAおよびRNAが含まれる。DNAは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドDNA、あらかじめ凝縮されたDNA、PCR産物、ベクター(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体および組み合わせの形態であってよい。RNAは、siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、vRNA、およびこれらの組み合わせの形態であってよい。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された変種(例えば、縮重コドン置換物)、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補配列、ならびに明確に示される配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換物は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって得ることができる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびCassol et al.(1992)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース(DNA)またはリボース(RNA)、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介して相互に連結される。「塩基」にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに、天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびに、これらに限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボン酸、およびハロゲン化アルキルなどの新たな反応基を導入する修飾を含む、プリンおよびピリミジンの合成誘導体が含まれる。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長コード配列を含む核酸(例えば、DNAまたはRNA)配列を指す。

本明細書で使用する「遺伝子産物」とは、RNA転写産物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。

「脂質」という用語は、これに限定されるわけではないが脂肪酸エステルを含み、かつ水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする有機化合物群を指す。脂質は通常、少なくとも3つの種類：(1) 油脂類およびろうを含む「単純脂質」；(2) リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；(3) ステロイドなどの「誘導脂質」に分類される。

「脂質小胞」とは、これらに限定されないが、水性容積が両親媒性脂質二重層によって封入されているか；もしくは干渉RNA配列を含むプラスミドのような大きな分子成分を含む内部を脂質が被覆し、水性内部が縮小したリポソーム；または比較的不規則な脂質混合物内に封入成分が含まれている脂質凝集物もしくはミセルをはじめとする、化合物を送達するために使用され得る任意の脂質組成物を指す。

本明細書で使用する「脂質封入」とは、siRNAなどの化合物に完全封入、部分封入、またはその両方を提供する脂質製剤を指し得る。好ましい態様において、核酸は脂質製剤中に完全に封入される(例えば、SPLP、pSPLP、SNALP、または他の核酸-脂質粒子を形成するため)。

本発明の核酸-脂質粒子は、典型的に約50 nm〜約150 nm、より典型的には約100 nm〜約130 nm、最も典型的には約110 nm〜約115 nmの平均直径を有し、実質的に毒性がない。さらに、核酸は、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸-脂質粒子およびその調製方法は、米国特許第5,976,567号；同第5,981,501号；同第6,534,484号；同第6,586,410号；同第6,815,432号；およびWO 96/40964に開示されている。

本発明では、種々の適切な陽イオン性脂質を、単独で、または1つもしくは複数の他の陽イオン性脂質種もしくは非陽イオン性脂質種と共に使用することができる。

本発明に記載の陽イオン性脂質は、典型的に、生理的pHなどの選択されたpHにおいて正味の正電荷を有する。驚くべきことに、複数の不飽和部位、例えば少なくとも2つまたは3つの不飽和部位を有するアルキル鎖を含む陽イオン性脂質が、膜流動性の増加した核酸-脂質粒子の形成に特に有用であることが見出された。本発明においても有用である多くの陽イオン性脂質および関連類似体は、同時出願中の米国特許出願第60/578,075号および同第60/610,746号；米国特許第5,753,613号；同第5,208,036号、同第5,264,618号、同第5,279,833号、および同第5,283,185号、ならびにWO 96/10390に記載されている。

本発明において使用される非陽イオン性脂質は、安定した複合体を生成し得る種々の中性の無電荷脂質、双性イオン性脂質、または陰イオン性脂質のいずれかであってよい。それらは好ましくは中性であるが、または正もしくは負に荷電されていてもよい。本発明において有用な非陽イオン性脂質の例には、以下のものが含まれる：リン脂質関連物質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、リン脂質関連物質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、およびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)。コレステロールなどの非陽イオン性脂質またはステロールもまた存在し得る。さらなる非リン含有脂質は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル酸ポリマー、トリエタノールアミン-ラウリル硫酸、アルキル-アリール硫酸ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウムなど、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドである。リゾホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルエタノールアミンなどの他の脂質が存在してもよい。非陽イオン性脂質にはまた、ポリエチレングリコールに基づくポリマー、例えばPEG 2000、PEG 5000、および同時出願中の米国特許第5,820,873号に記載されるような、リン脂質またはセラミドに結合したポリエチレングリコール(PEG-Cerと称される)が含まれる。

好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン(例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリン)、ジアシルホスファチジルエタノールアミン(例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、C₁₀〜C₂₄の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、コレステロール、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、または卵スフィンゴミエリン(ESM)である。

陽イオン性脂質および非陽イオン性脂質に加えて、本発明のSPLPは、ATTA-脂質またはPEG-脂質、例えばジアルキルオキシプロピルに結合したPEG(PEG-DAA)(同時出願中の米国特許出願第10/942,379号を参照されたい)、ジアシルグリセロールに結合したPEG(PEG-DAG)(同時出願中の米国特許出願第10/136,707号を参照されたい)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)もしくはいくつかの他のリン脂質に結合したPEG(PEG-PE)、またはセラミドに結合したPEG(PEG-Cer)、またはそれらの混合物(米国特許第5,885,613号を参照されたい)などの二重層安定化成分(BSC)を含む。1つの好ましい態様において、BSCは、SPLPの凝集を阻害する複合脂質である。適切な複合脂質には、これらに限定されないが、PEG-脂質複合体、ATTA-脂質複合体、陽イオン性ポリマー-脂質複合体(CPL)、またはこれらの混合物が含まれる。1つの好ましい態様において、SPLPは、CPLと共にPEG-脂質複合体またはATTA-脂質複合体のいずれかを含む。

PEGとは、ポリエチレングリコール、2つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンPEG反復の線状水溶性ポリマーである。PEGはその分子量によって分類される；例えば、PEG 2000は約2,000ダルトンの平均分子量を有し、PEG 5000は約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGはSigma Chemical Co.および他の会社から市販されており、これには以下のものが含まれる：モノメトキシポリエチレングリコール(MePEG-OH)、モノメトキシポリエチレングリコール-コハク酸(MePEG-S)、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルコハク酸(MePEG-S-NHS)、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン(MePEG-NH₂)、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシレート(MePEG-TRES)、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル(MePEG-IM)が含まれる。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール-酢酸(MePEG-CH₂COOH)は、例えばPEG-DAA複合体をはじめとするPEG-脂質複合体の調製に有用である。

好ましい態様において、PEGは、約1000〜約5000ダルトン、より好ましくは約1,000〜約3,000ダルトン、さらにより好ましくは約2,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGは任意に、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基で置換され得る。PEGは、脂質に直接結合され得るか、またはリンカー部分を介して脂質に連結され得る。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分をはじめとする、PEGを脂質に結合するのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。

本明細書で使用する「非エステル含有リンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合(-OC(O)-)を含まないリンカー部分を指す。適切な非エステル含有リンカー部分には、これらに限定されないが、アミド(-C(O)NH-)、アミノ(-NR-)、カルボニル(-C(O)-)、カルバミン酸(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、ジスルフィド(-S-S-)、エーテル(-O-)、スクシニル(-(O)CCH₂CH₂C(O)-)、スクシンアミジル(-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-)、エーテル、ジスルフィドなど、およびこれらの組み合わせ(カルバミン酸リンカー部分およびアミドリンカー部分を両方含むリンカーなど)が含まれる。好ましい態様において、PEGを脂質に結合するためにカルバミン酸リンカーが用いられる。

他の態様において、PEGを脂質に結合するためにエステル含有リンカー部分が用いられる。適切なエステル含有リンカー部分には、例えば、炭酸(-OC(O)O-)、スクシノイル、リン酸エステル(-O-(O)POH-O-)、スルホン酸エステル、およびこれらの組み合わせが含まれる。

本明細書で使用する「SNALP」という用語は、SPLPをはじめとする安定した核酸-脂質粒子を指す。SNALPは、核酸(例えば、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、siRNA、または干渉RNAが転写されるプラスミドを含めたプラスミド)を封入している脂質小胞を表す。本明細書で使用する「SPLP」という用語は、脂質小胞内に封入された核酸(例えば、プラスミド)を含む核酸-脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは典型的に、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質(例えば、PEG-脂質複合体)を含む。SNALPおよびSPLPは、静脈内(i.v.)注射後に循環寿命の延長を示し、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位)に蓄積し、またこれらの遠位部位においてトランスフェクションされた遺伝子の発現を媒介し得るため、全身投与に極めて有用である。SPLPには、WO 00/03683に記載される、封入された凝縮剤-核酸複合体を含む「pSPLP」が含まれる。

「小胞形成脂質」という用語は、疎水性部分および極性頭部基を有し、大部分のリン脂質によって例証されるように、水中でそれ自体で二重層小胞を自発的に形成し得る、任意の両親媒性脂質を含むことが意図される。

「小胞構造をとる脂質」という用語は、その疎水性部分が二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、その極性頭部基部分が膜の外部の極性表面に向かって配向する、他の両親媒性脂質と組み合わせて脂質二重層に安定して取り込まれる任意の両親媒性脂質を含むことが意図される。小胞構造をとる脂質には、それ自体では非層状相をとる傾向があるが、二重層安定化成分の存在下では二重層構造をとり得る脂質が含まれる。典型的な例は、DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)である。二重層安定化成分には、これらに限定されないが、核酸-脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質、ポリアミドオリゴマー(例えば、ATTA-脂質誘導体)、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、例えばジアルキルオキシプロピルに結合したPEG、ジアシルグリセロールに結合したPEG、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG、セラミドに結合したPEG(米国特許第5,885,613号を参照されたい)などのPEG-脂質誘導体；陽イオン性PEG脂質、およびこれらの混合物が含まれる。

「両親媒性脂質」という用語は、一つには、脂質物質の疎水性部分が疎水性相内に配向し、親水性部分が水相に向かって配向する、任意の適切な物質を指す。両親媒性脂質は通常、脂質小胞の主成分である。親水性特性は、炭水化物基、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、およびその他の同様の基などの極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、および1つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環基により置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基の包含により付与され得る。両親媒性化合物の例には、これらに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれる。リン脂質の代表例には、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸などの、リンを欠くその他の化合物もまた、両親媒性脂質と称される群に含まれる。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。

「中性脂質」という用語は、選択されたpHにおいて無電荷の形態かまたは中性の双性イオン形態で存在する多くの脂質種のいずれかを指す。生理的pHにおいて、このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。

「非陽イオン性脂質」という用語は、上記の任意の中性脂質に加え、陰イオン性脂質を指す。

「陰イオン性脂質」という用語は、生理的pHにおいて負に荷電している任意の脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール(POPG)、および中性脂質と結合したその他の陰イオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。

「陽イオン性脂質」という用語は、生理的pHなどの選択されたpHにおいて正味の正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを指す。このような脂質には、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチル塩化アンモニウム(「DODAC」)；N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(「DOTMA」)；N,N-ジステアリル-N,N-ジメチル臭化アンモニウム(「DDAB」)；N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(「DOTAP」)；3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(「DC-Chol」)；N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(「DMRIE」)；1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)；および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)が含まれるが、これらに限定されない。以下の脂質は陽イオン性であり、生理的pHよりも低いpHで正電荷を有する：DODAP、DODMA、DMDMAなど。

「疎水性脂質」という用語は、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、および1つまたは複数の芳香族基、脂環式基、または複素環基により任意に置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。適切な例には、これらに限定されないが、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N,N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれる。

「融合性」という用語は、リポソーム、SNALP、または他の薬物送達システムが細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、形質膜、または例えばエンドソーム、核などの細胞小器官を囲む膜であってよい。

「ジアシルグリセロール」という用語は、2つの脂肪酸アシル鎖、R¹およびR²を有する化合物を指し、これらの脂肪酸アシル鎖はいずれも独立して、エステル結合によりグリセロールの1位および2位に結合した2〜30個の炭素を有する。アシル基は飽和していてもよいし、または様々な程度の不飽和を有してもよい。ジアシルグリセロールは、以下の一般式を有する。

「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、2つのアルキル鎖、R¹およびR²を有する化合物を指し、これらのアルキル鎖はいずれも独立して2〜30個の炭素を有する。アルキル基は飽和していてもよいし、または様々な程度の不飽和を有してもよい。ジアルキルオキシプロピルは、以下の一般式を有する。

「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、米国特許第6,320,017号および同第6,586,559号に開示される化合物を指すが、これらに限定されるものではない。これらの化合物には、以下の式を有する化合物が含まれる：

式中、Rは、水素、アルキル、およびアシルからなる群より選択されるメンバーであり；R¹は、水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであり；または任意に、RおよびR¹はそれらが結合している窒素と共にアジド部分を形成し；R²は、水素、任意に置換アルキル、任意に置換アリール、およびアミノ酸の側鎖から選択される基のメンバーであり；R³は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ、およびNR⁴R⁵(式中、R⁴およびR⁵は独立して水素またはアルキルである)からなる群より選択されるメンバーであり；nは4〜80であり；mは2〜6であり；pは1〜4であり；qは0または1である。本発明の化合物中に他のポリアミドも使用できることは、当業者に明らかであると考えられる。

本明細書で使用する「水溶液」という用語は、全体または一部において水を含む組成物を指す。

本明細書で使用する「有機脂質溶液」という用語は、全体または一部において、脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。

本明細書で使用する「遠位部位」とは、近接する毛細血管床に限定されず、生物体全体に広く分布した部位を含む、物理的に離れた部位を指す。

核酸-脂質粒子に関する「血清安定」とは、粒子が、遊離DNAを有意に分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに曝露された後にも、有意に分解されないことを意味する。適したアッセイ法には、例えば、以下の実施例に記載するような標準的な血清アッセイ法またはDNAseアッセイ法が含まれる。

本明細書で使用する「全身送達」とは、化合物の生体内での広範な体内分布をもたらす送達を指す。ある投与技法は特定の化合物を全身送達できるが、その他の化合物についてはできない。全身送達とは、有用な、好ましくは治療量の化合物を身体の大部分に曝露することを意味する。広範な生体分布を得るためには一般に、化合物が、投与部位から遠位にある疾患部位に到達する前に、速やかに分解または排除(初回通過器官(肝臓、肺など)による、または迅速な非特異的細胞結合によるなど)されないような血中寿命が必要である。核酸-脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内を含む、当技術分野において周知である任意の手段によるものであってよい。好ましい態様において、核酸-脂質粒子の送達は静脈内送達による。

本明細書で使用する「局所送達」とは、生体内の標的部位への、化合物の直接的な送達を指す。例えば、化合物は、腫瘍などの疾患部位、または炎症部位などの他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの標的器官への直接注入によって、局所送達され得る。

III. siRNA
本発明のsiRNAは、標的配列の発現をサイレンシングし得り、約15〜30ヌクレオチド長であり、標的核酸配列に対する少なくとも1つのミスマッチモチーフを含む。ミスマッチモチーフは、免疫賦活性(すなわち、GUリッチ)である場合もあれば、または非免疫賦活性である場合もある。免疫賦活性であるsiRNAは、1つまたは複数のGUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'モチーフ、5'-UG-3'モチーフ、5'-UGU-3'モチーフ、5'-GUGU-3'モチーフ、または5'-UGUGU-3'モチーフ)を含む。免疫賦活性でないかまたは免疫賦活性が低いsiRNAは、1つのGUリッチモチーフを含む場合もあるが、典型的にはそのようなモチーフを含まない。siRNA配列は、オーバーハング(例えば、(Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001)；Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001))に記載されるような3'または5'オーバーハング)を有してもよいし、またはオーバーハングを欠いて(すなわち、平滑末端を有して)もよい。

本発明の方法に従って、免疫賦活性であるsiRNAは、その免疫賦活特性を減少させるように修飾することができる。例えば、GUリッチモチーフを含む免疫賦活性siRNAは、そのモチーフを破壊または除去するように、すなわちGUリッチモチーフ中の1つもしくは複数のGまたは1つもしくは複数のUを別のヌクレオチドで置換することによって修飾することができ、それにより免疫賦活特性が減少したsiRNAが作製される。または、免疫賦活性でないsiRNAは、GUリッチモチーフを付加するように、すなわちヌクレオチドをGまたはUで置換することによって修飾することができ、それにより免疫賦活特性が増強されたsiRNAが作製される。好ましい態様において、免疫賦活性であるsiRNAは、その免疫賦活特性を減少させるように、例えばGUリッチモチーフを破壊するように修飾される。

本明細書に記載のsiRNAは、典型的に、その標的配列との少なくとも1つのミスマッチ領域(例えば、免疫賦活性ミスマッチ領域または非免疫賦活性ミスマッチ領域)を含む。siRNA分子は、その免疫賦活特性を増強するように、またはその免疫賦活特性を減少させるように修飾される。例えば、その免疫賦活特性を減少させるように修飾されるsiRNA分子は、典型的に、その標的配列に対する少なくとも1つの非免疫賦活性ミスマッチ領域を含むように修飾される。一方、その免疫賦活特性を増強するように修飾されるsiRNAは、典型的に、その標的配列に対する少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチ領域を含むように修飾される。

A. siRNA配列の選択
適切なsiRNA配列は、当技術分野において周知の任意の手段を用いて同定され得る。典型的には、Elbashir, et al., Nature 411:494-498 (2001)およびElbashir, et al., EMBO J 20: 6877-6888 (2001)に記載されている方法を、Reynolds et al., Nature Biotech. 22(3):326-330 (2004)に記載されている合理的設計法則と組み合わせる。

典型的には、関心対象の標的遺伝子に由来する転写産物のAUG開始コドンの3'側にある約50〜約100ヌクレオチド内の配列を、ジヌクレオチド配列(例えば、AA、CC、GG、またはUU)について走査する(例えば、Elbashir, et al., EMBO J 20: 6877-6888 (2001)を参照されたい)。ジヌクレオチド配列のすぐ3'側のヌクレオチドを、潜在的siRNA標的配列と同定する。典型的には、ジヌクレオチド配列のすぐ3'側にある19、21、23、25、27、29、31、33、35、またはそれ以上のヌクレオチドを、潜在的siRNA標的部位と同定する。いくつかの態様において、ジヌクレオチド配列はAA配列であり、AAジヌクレオチドのすぐ3'側にある19ヌクレオチドが潜在的siRNA標的部位と同定される。典型的には、siRNA標的部位は、標的遺伝子の長さに沿った別の位置において、間隔をあけて存在する。siRNA配列のサイレンシング効果をさらに増強するには、潜在的siRNA標的部位をさらに解析して、他のコード配列に対する相同性領域を含まない部位を同定する。例えば、約21塩基対の適切なsiRNA標的部位は、他のコード配列に対して、16〜17を超える連続した塩基対の相同性を有さない。siRNA配列をRNA Pol IIIプロモーターから発現させようとする場合には、5つ以上の連続したAまたはTを欠くsiRNA標的配列を選択する。

潜在的siRNA標的部位が同定されたならば、siRNA標的部位に相補的なsiRNA配列を設計し得る。そのサイレンシング効率を増強するには、siRNA配列をまた合理的設計アルゴリズムにより解析して、以下の特徴の1つまたは複数を有する配列を同定する：(1) 約25％〜約60％ G/CのG/C含量である；(2) センス鎖の15〜19位に少なくとも3つのA/Uが存在する；(3) 内部反復が存在しない；(4) センス鎖の19位がAである；(5) センス鎖の3位がAである；(6) センス鎖の10位がUである；(7) センス鎖の19位がG/Cでない；および(8) センス鎖の13位がGでない。これらの特徴のそれぞれの適切な値を指定するアルゴリズムを組み入れ、siRNAの選択に有用であるsiRNA設計ツールは、例えば、http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNAに見出すことができる。

潜在的siRNA配列が同定されたならば、その配列をGUリッチモチーフ(例えば、5'-GU-3'、5'-UGU-3'、5'-GUGU-3'、または5'-UGUGU-3'モチーフの存在について解析し得る。GUリッチモチーフを含む潜在的siRNA標的配列は、免疫賦活性siRNAと同定される。GUリッチモチーフを欠く潜在的siRNA標的配列は、非免疫賦活性siRNAと同定される。いくつかの態様において、GUリッチモチーフを含む潜在的siRNA標的配列は、そのモチーフを除去して、配列の免疫賦活特性を減少させるように、本明細書に記載する通りに修飾される。他の態様において、GUリッチモチーフを欠く潜在的siRNA標的配列は、そのモチーフを導入して、配列の免疫賦活特性を増加させるように、本明細書に記載する通りに修飾される。潜在的siRNA標的配列の免疫賦活特性は、以下に詳述するアッセイ法を用いて確認し得る。

本発明の1つの態様は、免疫賦活性または非免疫賦活性であるsiRNA分子を同定する方法を提供する。同定された時点で、免疫賦活性siRNA分子を、その免疫賦活特性を増加または減少させるように修飾することができ、また非免疫賦活性分子を、免疫賦活特性を有するように修飾することができる。

この態様においては、標的核酸配列を、免疫賦活性モチーフ、例えばGUリッチモチーフの存在について解析する。免疫賦活性モチーフが存在する場合、免疫賦活特性を有する二本鎖RNA(すなわち、siRNA)配列が同定される。免疫賦活性モチーフが存在しない場合には、非免疫賦活特性を有する二本鎖RNA(すなわち、siRNA)配列が同定される。次いで、siRNAを選択し、細胞が検出可能な免疫応答を生じるような条件下でsiRNAを哺乳動物応答細胞と接触させ、siRNAが免疫賦活性または非免疫賦活性siRNAであることを確認する。哺乳動物応答細胞は、未処置の哺乳動物(すなわち、標的核酸配列の遺伝子産物と以前に接触したことのない哺乳動物)に由来し得る。応答細胞は、例えば、末梢血単核細胞、マクロファージなどであってよい。検出可能な免疫応答は、サイトカインまたは増殖因子、例えばTNF-α、IFN-α、IL-6、IL-12、およびこれらの組み合わせなどの産生を含み得る。

免疫賦活性siRNAによって誘導される免疫応答を検出するための適切なアッセイ法には、David et al.(米国特許第4,376.110号)の二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫測定技法；モノクローナル-ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法(Wide et al., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970))；Gordon et al.(米国特許第4,452,901号)の「ウェスタンブロット」法；標識リガンドの免疫沈降法(Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-4983)；例えば、Raines et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:5154-5160によって記載される酵素結合免疫吸着測定法(ELISA法)；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学技法(Brooks et al. (1980) Clin. Exp. Immunol. 39:477)；および活性の中和法(Bowen-Pope et al. (1984) Proc. Natl．Acad. Sci. USA 81:2396-2400)が含まれる。上記の免疫測定法に加えて、米国特許第3,817,827号；同第3,850,752号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；および同第4,098,876号に記載される免疫測定法を含む、多くの他の免疫測定法も利用できる。

サイトカインおよび増殖因子(例えば、Il-6、IL-12、TNF-α、IFN-α、およびIFN-γに特異的に結合するモノクローナル抗体は、多くの供給源から市販されており、また当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる(例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)およびHarlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York (1999)を参照されたい)。モノクローナル抗体の作製は以前に記載されており、当技術分野で周知の任意の手段によって達成され得る。(Buhring et al. in Hybridoma 1991, Vol. 10, No. 1, pp. 77-78)。いくつかの方法では、モノクローナル抗体は、検出を容易にするために標識(例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出され得る任意の組成物で)される。

B. siRNAの作製
siRNAは、例えば、1つまたは複数の単離された低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖、、より長い二本鎖RNA(dsRNA)、またはDNAプラスミド内の転写カセットから転写されるsiRNAもしくはdsRNAをはじめとする、いくつかの形態で提供され得る。siRNAはまた、化学合成され得る。好ましくは、合成または転写されたsiRNAは、約1〜約4ヌクレオチド、好ましくは約2〜約3ヌクレオチドの3'オーバーハング、および5'リン酸末端を有する。siRNA配列は、オーバーハング(例えば、(Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001)；Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001))に記載されるような3'または5'オーバーハング)を有してもよいし、またはオーバーハングを欠いて(すなわち、平滑末端を有して)もよい。

RNA集団を使用して、長い前駆体RNAを提供することができ、または選択された標的配列と実質的なまたは完全な同一性を有する長い前駆体RNAを用いて、siRNAを作製することができる。RNAは、当業者に周知の方法に従って、細胞もしくは組織から単離され得る、合成され得る、および/またはクローニングされ得る。RNAは混合集団(細胞もしくは組織から得られた、cDNAから転写された、差し引かれた、選択されたなど)であってもよいし、または単一の標的配列を示してもよい。RNAは、天然であっても(例えば、組織または細胞試料から単離された)、インビトロで合成されてもよく(例えば、T7またはSP6ポリメラーゼおよびPCR産物またはクローニングされたcDNAを使用して)；または化学合成され得る。

合成RNAに関して長いdsRNAを形成するには、相補体もまたインビトロで転写して、dsRNAを形成するようにハイブリダイズさせる。天然RNA集団を使用する場合には、例えば、RNA集団に対応するcDNAを転写することによって、またはRNAポリメラーゼを使用することによって、やはりRNA相補体を提供する(例えば、大腸菌RNAse IIIまたはダイサーによる切断のためのdsRNAを形成させるため)。次いで、前駆体RNAをハイブリダイズさせて、切断のための二本鎖RNAを形成させる。dsRNAは対象に直接投与することもできるし、投与前にインビトロで切断してもよい。

または、siRNAを提供するために、1つまたは複数のsiRNA鋳型をコードする1つまたは複数のDNAプラスミドが使用される。siRNAは、例えば、低分子核内RNA U6またはヒトRNase P RNA H1の天然転写単位に基づいた、RNAポリメラーゼIII転写単位を有するプラスミド中のDNA鋳型から、ヘアピンループを有する二重鎖へと自動的に折りたたまれる配列として転写され得る(例えば、Brummelkamp, et al., Science 296:550 (2002)；Donze, et al., Nucleic Acids Res. 30:e46 (2002)；Paddison, et al., Genes Dev. 16:948 (2002)；Yu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci 99:6047 (2002)；Lee, et al., Nat. Biotech. 20:500 (2002)；Miyagishi, et al., Nat. Biotech. 20:497 (2002)；Paul, et al., Nat. Biotech. 20:505 (2002)；およびSui, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:5515 (2002)を参照されたい)。典型的に、転写単位またはカセットは、所望のsiRNA配列の転写のための鋳型、ならびに2〜3個のウリジンおよびポリチミジン(T5)配列から構成される終結配列(ポリアデニル化シグナル)に機能的に連結された、H1-RNAまたはU6プロモーターなどのRNA転写産物プロモーター配列を含む(Brummelkamp, Science、前記)。選択されたプロモーターは、構成的または誘導性転写を提供し得る。RNA干渉分子のDNA依存性転写のための組成物および方法は、米国特許第6,573,099号に詳述されている。転写単位は、干渉RNAが転写されるプラスミドまたはDNAベクター中に組み入れられる。治療目的のための遺伝子物質のインビボ送達に適したプラスミドは、米国特許第5,962,428号および同第5,910,488号に記載されている。選択されたプラスミドは、標的細胞の一過性または安定な送達を提供し得る。所望の遺伝子配列を発現するように本来設計されたプラスミドを、siRNA転写のための転写単位カセットを含むように修飾し得ることは、当業者には明らかであると考えられる。

RNAを単離する方法、RNAを合成する方法、核酸をハイブリダイズさせる方法、cDNAライブラリーを作製およびスクリーニングする方法、ならびにPCRを行う方法は、当技術分野において周知であり(例えば、Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983)；Sambrook et al.、前記；Ausubel et al.、前記を参照されたい)、PCR法も周知である(米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)を参照されたい)。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明における使用の一般的方法を開示しているさらなる基本的な教科書には、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が含まれる。

1. 標的遺伝子
本明細書に記載のsiRNAを用いて、関心対象の遺伝子の転写(すなわち、発現)を下方制御またはサイレンシングすることができる。関心対象の遺伝子には、これらに限定されないが、ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子、代謝性疾患および代謝障害(例えば、肝疾患および肝障害)に関連する遺伝子、腫瘍形成および細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、免疫調節物質遺伝子(例えば、炎症反応および自己免疫応答に関連する遺伝子など)、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性疾患に関連する遺伝子が含まれる。

ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子には、細胞で結合、進入、および複製するためにウイルスによって発現される遺伝子が含まれる。特に関心が高いものは、慢性ウイルス性疾患に関連するウイルス配列である。特に関心が高いウイルス配列には、肝炎ウイルス(Hamasaki, et al., FEBS Lett. 543:51 (2003)；Yokota, et al., EMBO Rep. 4:602 (2003)；Schlomai, et al., Hepatology 37:764 (2003)；Wilson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci 100:2783 (2003)；Kapadia, et al., Proc. Natl. Acad. Sci 100:2014 (2003)；およびFIELDS VIROLOGY (Knipe et al. eds. 2001))、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Banerjea, et al., Mol. Ther. 8:62 (2003)；Song, et al., J. Virol. 77:7174 (2003)；Stephenson JAMA 289:1494 (2003)；Qin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci 100:183 (2003))、ヘルペスウイルス(Jia, et al., J. Virol. 77:3301 (2003))、およびヒトパピローマウイルス(HPV)(Hall, et al., J. Virol. 77:6066 (2003)；Jiang, et al., Oncogene 21:6041 (2002))の配列が含まれる。サイレンシングし得る例示的な肝炎ウイルス核酸配列には、これらに限定されないが、転写および翻訳に関与する核酸配列(例えば、En1、En2、X、P)、構造タンパク質をコードする核酸配列(例えば、CおよびC関連タンパク質をはじめとするコアタンパク質；S、M、および/もしくはLタンパク質をはじめとするキャプシドおよびエンベロープタンパク質、またはこれらの断片)が含まれる(例えば、FIELDS VIROLOGY, 2001、前記を参照されたい)。サイレンシングし得る例示的なC型肝炎核酸配列には、これらに限定されないが、セリンプロテアーゼ(例えば、NS3/NS4)、ヘリカーゼ(例えば、NS3)、ポリメラーゼ(例えば、NS5B)、およびエンベロープタンパク質(例えば、E1、E2、およびp7)が含まれる。A型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001489に記載されており；B型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_003977に記載されており；C型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_004102に記載されており；D型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001653に記載されており；E型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001434に記載されており；またG型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001710に記載されている。ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、ウイルス病態を治療するために使用される慣習的な薬剤の投与と組み合わせて簡便に使用され得る。

代謝性疾患または代謝障害(例えば、肝臓が標的である疾患、ならびに肝疾患および肝障害)に関連する遺伝子には、例えば、異脂肪血症(例えば、肝臓X受容体(例えば、LXRαおよびLXRβGenbackアクセッション番号NM_007121)、ファルネソイドX受容体(FXR)(Genbankアクセッション番号NM_005123)、ステロール調節エレメント結合タンパク質(SREBP)、Site-1プロテアーゼ(S1P)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGコエンザイムA還元酵素)、アポリポタンパク質(ApoB)、およびアポリポタンパク質(ApoE))、および糖尿病(例えば、グルコース6-ホスファターゼ)などで発現される遺伝子が含まれる(例えば、Forman et al., Cell 81:687 (1995)；Seol et al., Mol. Endocrinol. 9:72 (1995)、Zavacki et al., PNAS USA 94:7909 (1997)；Sakai, et al., Cell 85:1037-1046 (1996)；Duncan, et al., J. Biol. Chem. 272:12778-12785 (1997)；, Willy, et al., Genes Dev. 9(9):1033-45 (1995)；Lehmann, et al., J. Biol. Chem. 272(6):3137-3140 (1997)；Janowski, et al., Nature 383:728-731 (1996)；Peet, et al., Cell 93:693-704 (1998)を参照されたい)。当業者であれば、代謝性疾患または代謝障害(例えば、肝臓が標的である疾患、ならびに肝疾患および肝障害)に関連する遺伝子には、肝臓自体で発現される遺伝子、ならびに他の器官および組織で発現される遺伝子が含まれることを理解すると考えられる。代謝性疾患または代謝障害に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、この疾患または障害を治療するために使用される慣習的な薬剤の投与と組み合わせて簡便に使用され得る。

腫瘍形成および細胞形質転換に関連する遺伝子配列の例には、MLL融合遺伝子、BCR-ABL(Wilda, et al., Oncogene, 21:5716 (2002)；Scherr, et al., Blood 101：1566)、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO、およびAML1-MTG8(Heidenreich, et al., Blood 101:3157 (2003))などの転座配列；多剤耐性遺伝子(Nieth, et al., FEBS Lett. 545:144 (2003)；Wu, et al, Cancer Res. 63:1515 (2003))、サイクリン(Li, et al., Cancer Res. 63:3593 (2003)；Zou, et al., Genes Dev. 16:2923 (2002))、β-カテニン(Verma, et al., Clin Cancer Res. 9:1291 (2003))、テロメラーゼ遺伝子(Kosciolek, et al., MoI Cancer Ther. 2:209 (2003))、c-MYC、N-MYC、BCL-2、ERBB1、およびERBB2(Nagy, et al. Exp. Cell Res. 285:39 (2003))などの過剰発現配列；ならびにRASなどの変異配列が含まれる(Tuschl and Borkhardt, MoI. Interventions, 2:158 (2002)で概説されている)。DNA修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法薬の投与との併用に役立つ(Collis, et al., Cancer Res. 63:1550 (2003))。インテグリン、セレクチン、およびメタロプロテイナーゼなどの、腫瘍転移に関連するタンパク質をコードする遺伝子もまた、関心対象の標的配列である。上述の例は、これだけに限定されるものではない。腫瘍形成または細胞形質転換、腫瘍増殖または腫瘍転移を促すまたは促進する任意の全体のまたは部分的な遺伝子配列も、鋳型配列として含まれ得る。

血管新生遺伝子は、新たな血管の形成を促進し得る。特に関心が高いものは、血管内皮増殖因子(VEGF)(Reich, et al., Mol. Vis. 9:210 (2003))またはVEGFrである。VEGFrを標的するsiRNA配列は、例えば、GB 2396864；米国特許公開公報第20040142895号；およびCA2456444に記載されている。

免疫調節物質遺伝子とは、1つまたは複数の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節物質遺伝子の例には、増殖因子(例えば、TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCFなど)、インターロイキン(例えば、IL-2、IL-4、IL-12(Hill, et al., J. Immunol. 171:691 (2003))、IL-15、IL-18、IL-20など)、インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γなど)、およびTNFなどのサイトカインが含まれる。FasおよびFasリガンド遺伝子もまた、関心対象の免疫調節物質標的配列である(Song, et al., Nat. Med. 9:347 (2003))。例えば、ブルートンチロシンキナーゼ(Btk)(Heinonen, et al., FEBS Lett. 527:274 (2002))のようなTecファミリーキナーゼなど、造血細胞およびリンパ球における二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子もまた、本発明に含まれる。

細胞受容体リガンドには、細胞表面受容体(例えば、インスリン受容体、EPO受容体、Gタンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体など)に結合して、受容体が関与する生理的経路(例えば、グルコースレベルの調節、血液細胞の発達、有糸分裂誘発など)を調節(例えば、阻害、活性化など)し得るリガンドが含まれる。細胞受容体リガンドの例には、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、インスリン、グルカゴン、Gタンパク質共役受容体リガンドなど)が含まれる。トリヌクレオチド反復(例えば、CAG反復)の拡大をコードする鋳型は、球脊髄性筋萎縮症およびハンチントン病など、トリヌクレオチド反復の拡大によって起こる神経変性疾患の病原性配列のサイレンシングに役立つ(Caplen, et al., Hum. Mol. Genet. 11:175 (2002))。

IV. siRNAを含むSPLP
1つの態様において、本発明は、本明細書に記載のsiRNAを含む安定した核酸-脂質粒子(SPLPまたはSNALP)および他の脂質に基づく担体系を提供する。本明細書で使用する「SNALP」という用語は、SPLPをはじめとする安定した核酸-脂質粒子を指す。SNALPは、核酸(例えば、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、siRNA、または干渉RNAが転写されるプラスミドを含めたプラスミド)を含む、減少した水性内部を被覆している脂質小胞を表す。本明細書で使用する「SPLP」という用語は、脂質小胞内に封入された核酸(例えば、プラスミド)を含む核酸-脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは典型的に、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質(例えば、PEG-脂質複合体)を含む。SNALPおよびSPLPは、静脈内(i.v.)注射後に循環寿命の延長を示し、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位に蓄積し、またこれらの遠位部位においてトランスフェクションされた遺伝子の発現を媒介し得るため、全身適用を有する。SPLPには、WO 00/03683に記載される、封入された凝縮剤-核酸複合体を含む「pSPLP」が含まれる。

核酸-脂質粒子は典型的に、陽イオン性脂質および核酸を含む。核酸-脂質粒子はまた、好ましくは非陽イオン性脂質および二重層安定化成分、またはよりこのましくは核酸-脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。本発明の核酸-脂質粒子は、50 nm〜約150 nm、より典型的には約100 nm〜約130 nm、最も典型的には約110 nm〜約115 nmの平均直径を有し、実質的に毒性がない。さらに、核酸は、本発明の核酸-脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。このような核酸-脂質粒子は、米国特許第5,705,385号；同第5,976,576号；同第5,981,501号；同第6,534,484号；同第6,586,410号；同第6,815,432号；およびWO 96/40964に詳細に開示されている。

A. 陽イオン性脂質
本発明では、種々の適切な陽イオン性脂質を、単独で、または1つもしくは複数の他の陽イオン性脂質種もしくは中性脂質種と共に使用することができる。

本発明において有用な陽イオン性脂質は、生理的pHで正味の正電荷を有する多くの脂質種、例えば、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOSPA、DOGS、DC-Chol、およびDMRIE、またはこれらの組み合わせなどのいずれかであってよい。本発明においてやはり有用である多くのこれらの脂質および関連類似体は、米国特許第5,208,036号、同第5,264,618号、同第5,279,833号、同第5,283,185号、同第5,753,613号、および同第5,785,992号に記載されている。さらに、多くの陽イオン性脂質の市販調製物が入手可能であり、本発明において使用することができる。これらには、例えば、LIPOFECTIN(登録商標)(DOTMAおよびDOPEを含む市販の陽イオン性リポソーム、GIBCO/BRL製、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド）、LIPOFECTAMINE(登録商標)(DOSPAおよびDOPEを含む市販の陽イオン性リポソーム、GIBCO/BRL製）；およびTRANSFECTAM(登録商標)(DOGSを含む市販の陽イオン性リポソーム、Promega Corp.製、米国、ウィスコンシン州、マディソン)が含まれる。さらに、以下の構造を有し、かつ2004年6月7日に出願された米国特許出願第60/578,075号に記載されるような、式Iおよび式IIの陽イオン性脂質：

および

；ならびにこれらの混合物も、本発明において使用することができる。
R¹およびR²は独立して選択され、C₁〜C₃アルキルである。R³およびR⁴は独立して選択され、約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基であり；R³およびR⁴の少なくとも一方は少なくとも2つの不飽和部位を含む。1つの態様において、R³およびR⁴はいずれも同じであり、すなわちR³およびR⁴はいずれもリノレイル(C18)などである。別の態様において、R³とR⁴は異なり、すなわち、R³はミリスチル(C14)であり、R⁴はリノレイル(C18)である。好ましい態様において、本発明の陽イオン性脂質は対称的であり、すなわちR³およびR⁴はいずれも同じである。別の好ましい態様において、R³およびR⁴はいずれも少なくとも2つの不飽和部位を含む。いくつかの態様において、R³およびR⁴は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、およびイコサジエニルから独立して選択される。好ましい態様において、R³およびR⁴はいずれもリノレイルである。いくつかの態様において、R³およびR⁴は少なくとも3つの不飽和部位を含み、例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、およびイコサトリエニルから独立して選択される。

陽イオン性脂質は典型的に、粒子中に存在する総脂質の約2％〜約60％、好ましくは粒子中に存在する総脂質の約5％〜約45％を構成する。特定の好ましい態様において、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約5％〜約15％を構成する。他の好ましい態様において、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約40％〜約50％を構成する。核酸-脂質粒子の意図する用途に応じて成分の割合は変動し、特定の製剤の送達効率は、エンドソーム放出パラメータ(ERP)アッセイ法を用いて測定され得る。例えば、全身送達では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約5％〜約15％を構成し得り、局所または限局送達では、陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約40％〜約50％を構成する。

B. 非陽イオン性脂質
本発明において使用される非陽イオン性脂質は、安定した複合体を生成し得る種々の中性の無電荷脂質、双性イオン性脂質、または陰イオン性脂質のいずれかであってよい。それらは好ましくは中性であるが、または正もしくは負に荷電されていてもよい。本発明において有用な非陽イオン性脂質の例には、以下のものが含まれる：リン脂質関連物質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、リン脂質関連物質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルリン酸、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、およびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)。コレステロールなどの非陽イオン性脂質またはステロールもまた存在し得る。さらなる非リン含有脂質は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル酸ポリマー、トリエタノールアミン-ラウリル硫酸、アルキル-アリール硫酸ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウムなど、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドである。リゾホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルエタノールアミンなどの他の脂質が存在してもよい。非陽イオン性脂質にはまた、ポリエチレングリコールに基づくポリマー、例えばPEG 2000、PEG 5000、および米国特許第5,820,873号に記載されるような、リン脂質またはセラミドに結合したポリエチレングリコール(PEG-Cerと称される)が含まれる。

好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン(例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリン)、ジアシルホスファチジルエタノールアミン(例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、C₁₀〜C₂₄の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、コレステロール、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、または卵スフィンゴミエリン(ESM)の1つまたは複数を含む。

非陽イオン性脂質は典型的に、粒子中に存在する総脂質の約5％〜約90％、好ましくは粒子中に存在する総脂質の約20％〜約85％を構成する。本発明の核酸-脂質粒子は、ステロール(例えば、コレステロール)をさらに含み得る。コレステロールは、存在する場合、典型的には粒子中に存在する総脂質の約10％〜約60％を構成し、好ましくはコレステロールは粒子中に存在する総脂質の約20％〜約45％を構成する。

C. 二重層安定化成分
1つの態様において、核酸-脂質粒子(例えば、SPLPまたはSNLAP)は、二重層安定化成分(BSC)(すなわち、粒子の凝集を妨げる複合脂質)をさらに含む。二重層を安定化する適切なBSCには、これらに限定されないが、ポリアミドオリゴマー、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、PEG-脂質、例えば、ジアルキルオキシプロピルに結合したPEG(PEG-DAA)、ジアシルグリセロールに結合したPEG(PEG-DAG)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)に結合したPEG(PEG-PE)、もしくはセラミドに結合したPEG(PEG-Cer)、またはこれらの混合物などが含まれる(米国特許第5,885,613号を参照されたい)。1つの態様において、二重層安定化成分は、PEG-脂質またはATTA-脂質である。1つの好ましい態様において、BSCは、SNALPの凝集を阻害する複合脂質である。適切な複合脂質には、これらに限定されないが、PEG-脂質複合体、ATTA-脂質複合体、陽イオン性ポリマー-脂質複合体(CPL)、またはこれらの混合物が含まれる。1つの好ましい態様において、SNALPは、CPLと共にPEG-脂質複合体またはATTA-脂質複合体のいずれかを含む。

1つの態様において、二重層安定化成分は、ジアシルグリセロール-ポリエチレングリコール複合体、すなわちDAG-PEG複合体またはPEG-DAG複合体を含む。好ましい態様において、DAG-PEG複合体は、ジラウリルグリセロール(C₁₂)-PEG複合体、ジミリスチルグリセロール(C₁₄)-PEG複合体(DMG)、ジパルミトイルグリセロール(C₁₆)-PEG複合体、またはジステアリルグリセロール(C₁₈)-PEG複合体である。当業者は、本発明のDAG-PEG複合体において、他のジアシルグリセロールを使用できることを容易に理解するものと考えられる。本発明での使用に適したDAG-PEG複合体、ならびにその作製方法および使用方法は、米国特許公開公報第2003/0077829号およびPCT特許出願第CA 02/00669号に開示されている。

別の態様において、二重層安定化成分は、ジアルキルオキシプロピル複合体、すなわち、例えば2003年9月15日に出願された米国特許出願第60/503.329号、および2004年9月15日に出願された同第10/942,379号に記載されるPEG-DAA複合体を含む。1つの好ましい態様において、PEG-DAAは以下の式を有する。

上記の式IIIにおいて、「R¹およびR²」は独立して選択され、約10〜約20個の炭素原子を有する飽和または不飽和アルキル基であり；PEGはポリエチレングリコールであり；Lは上記のような非エステル含有リンカー部分である。適切なアルキル基には、これらに限定されないが、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)、およびイコシル(C20)が含まれる。好ましい態様において、R¹およびR²は同一であり、すなわち、それらはいずれもミリスチル(C14)であるか、またはいずれもパルミチル(C16)であるか、またはいずれもステアリル(C18)である。好ましい態様において、アルキル基は飽和している。

上記の式IIIにおいて、「PEG」は、平均分子量約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、さらにより好ましくは約2,000ダルトン、または約750ダルトンを有するポリエチレングリコールである。PEGは任意に、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリールで置換され得る。好ましい態様において、末端ヒドロキシル基はメトキシ基またはメチル基で置換される。

上記の式IIIにおいて、「L」は、非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。好ましい態様において、Lは非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカーには、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバミン酸リンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、非エステル含有リンカー部分はカルバミン酸リンカー部分(すなわち、PEG-C-DAA複合体)である。別の好ましい態様において、非エステル含有リンカー部分はアミドリンカー部分(すなわち、PEG-A-DAA複合体)である。好ましい態様において、非エステル含有リンカー部分はスクシンアミジルリンカー部分(すなわち、PEG-S-DAA複合体)である。

二重層安定化成分を形成するために、種々の鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをポリエチレングリコールに結合することができる。そのようなホスファチジルエタノールアミンは市販されており、または当業者に周知である従来の技法を用いて単離もしくは合成することができる。C₁₀〜C₂₀の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含むホスファチジルエタノールアミンが好ましい。一不飽和または二不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンを使用することも可能である。適切なホスファチジルエタノールアミンには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)。

ホスファチジルエタノールアミンと同様に、二重層安定化成分を形成するために、種々の鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有するセラミドをポリエチレングリコールに結合することができる。ホスファチジルエタノールアミンとは対照的に、セラミドは、鎖長および飽和度に関して容易に変更できるアシル基を1つしかもたないことは、当業者に明らかであると考えられる。本発明による使用に適したセラミドは市販されている。さらに、セラミドは、周知の単離技法を用いて例えば卵もしくは脳から単離することができ、または米国特許第5,820,873号に開示されている方法および技法を用いて合成することができる。前述の出願に記載されている合成経路を用いて、C₂〜C₃₁の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を有するセラミドを調製することができる。

本発明において有用な陽イオン性ポリマー脂質(CPL)は、以下の構造特性を有する：(1) 脂質二重層にCPLを取り込むための、疎水性脂質などの脂質アンカー；(2) 陽イオン性頭部基に脂質アンカーを連結するための、ポリエチレングリコールなどの親水性スペーサー；および(3) プロトン化可能な陽イオン性頭部基を生成するための、天然アミノ酸などのポリカチオン性部分。本発明における使用に適したCPL、ならびにCPLを含む核酸-脂質粒子の作製方法および使用方法は、例えば、米国特許第6,852,334号；米国特許公開公報第20020072121号；およびWO 00/62813に開示されている。

簡潔に説明すると、本発明での使用に適したCPLは、式IV：
A-W-Y (IV)
(式中、A、W、およびYは以下の通りである)の化合物を含む。

式IVに関して、「A」は、脂質アンカーとして作用する両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質などの脂質部分である。適切な脂質の例として、小胞形成脂質または小胞構造をとる脂質が挙げられ、これには、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。

「W」は、親水性ポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは、非免疫原性であるかまたは低い固有の免疫原性を有する生体適合性ポリマーである。または、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと共に使用した場合、抗原性が弱くなり得る。適切な非免疫原性ポリマーには、これらに限定されないが、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体、およびこれらの組み合わせが含まれる。好ましい態様において、ポリマーは約250〜約7000ダルトンの分子量を有する。

「Y」はポリカチオン性部分である。「ポリカチオン性部分」という用語は、選択されたpH、好ましくは生理的pHにおいて、正電荷、好ましくは少なくとも2つの正電荷を有する化合物、誘導体、または官能基を指す。適切なポリカチオン性部分として、塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体、例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびヒスチジンなど；スペルミン；スペルミジン；陽イオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；ならびにアミノ多糖が挙げられる。ポリカチオン性部分は、線状(線状テトラリジンなど)、分岐、またはデンドリマーの構造であってよい。ポリカチオン性部分は、選択されたpH値において、約2〜約15の正電荷、好ましくは約2〜約12の正電荷、より好ましくは約2〜8の正電荷を有する。どのポリカチオン性部分を使用するかという選択は、所望のリポソーム適用の種類によって決定され得る。

ポリカチオン性部分上の電荷は、リポソーム部分全体の周囲に分布されてもよいし、またはリポソーム部分の1つの特定領域における別個の濃度の電荷密度、例えば電荷スパイクであってもよい。電荷密度がリポソーム上に分布される場合、電荷密度は均等に分布され得るか、または不均等に分布され得る。ポリカチオン性部分の電荷分布の変形物はすべて、本発明によって包含される。

脂質「A」および非免疫原性ポリマー「W」は、種々の方法によって、好ましくは共有結合により結合され得る。「A」と「W」との共有結合には、当業者に周知である方法を用いることができる。適切な結合には、アミド結合、アミン結合、カルボキシル結合、カーボネート結合、カルバミン酸結合、エステル結合、およびヒドラゾン結合が含まれるが、これらに限定されない。「A」および「W」が、結合を達成するための相補的な官能基を有さなければならないことは、当業者にとって明らかであると考えられる。一方が脂質上に存在し、他方がポリマー上に存在するこれら2つの基の反応は、所望の結合を提供する。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、活性エステルを形成するために、末端ヒドロキシルを例えばNHSおよびDCCで活性化し、次いでアミノ基を含むポリマー、例えばポリアミドと反応させる場合(米国特許第6,320,017号および同第6,586,559号を参照されたい)、2つの基間にアミド結合が形成される。

場合によっては、ポリカチオン性部分には、標的化リガンドまたはカルシウムを複合化するためのキレート部分などのリガンドが結合され得る。好ましくは、リガンドが結合された後、陽イオン性部分は正電荷を維持する。場合によっては、結合されるリガンドは正電荷を有する。適切なリガンドには、これらに限定されないが、反応性官能基を有する化合物または装置が含まれ、例えば、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生体親和性化合物、医用材料、生体高分子、医用装置、分析検出可能な化合物、治療活性のある化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激物質、放射標識、蛍光発生物質、ビオチン、薬物、ハプテン、DNA、RNA、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的化成分、または毒素が含まれる。

典型的に、二重層安定化成分は、粒子中に存在する総脂質の約0.5％〜約50％の範囲で存在する。好ましい態様において、二重層安定化成分は、粒子中の総脂質の約0.5％〜約25％存在する。他の好ましい態様において、二重層安定化成分は、粒子中の総脂質の約1％〜約20％、または約3％〜約15％、または約4％〜約10％存在する。当業者であれば、二重層安定化成分の濃度は、使用する二重層安定化成分、およびリポソームが融合性となる速度に応じて変動し得ることを理解すると考えられる。

二重層安定化成分の組成および濃度を調節することによって、二重層安定化成分がリポソームから出てくる速度、およびひいてはリポソームが融合性になる速度を調節することができる。例えば、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン複合体またはポリエチレングリコール-セラミド複合体を二重層安定化成分として使用する場合、リポソームが融合性になる速度は、例えば、二重層安定化成分の濃度を変えることによって、ポリエチレングリコールの分子量を変えることによって、またはホスファチジルエタノールアミンもしくはセラミド上のアシル鎖基の鎖長および飽和度を変えることによって変更することができる。さらに、例えば、pH、温度、イオン強度などをはじめとする他の変数を用いて、リポソームが融合性になる速度を変更および/または調節することができる。リポソームが融合性になる速度を調節するために使用され得る他の方法は、本開示を読むことで当業者に明らかになると考えられる。

V. 核酸-脂質粒子の調製
本発明は、プラスミドまたは他の核酸が脂質二重層中に封入され、分解から保護されている血清安定性核酸-脂質粒子を調製する方法を提供する。本発明の方法によって作製される粒子は、典型的に約50 nm〜約150 nm、より典型的には約100 nm〜約130 nm、最も典型的には約110 nm〜約115 nmの大きさを有する。粒子は、連続混合法、界面活性剤透析法、または成分の混合中、単相を提供するために有機溶媒を使用する逆相法の変法を含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の任意の方法により形成され得る。

特に好ましい態様において、本発明は、連続混合法によって生成される核酸-脂質粒子を提供するが、その方法とは、例えば、siRNAまたはプラスミドなどの核酸を含む水溶液を第1容器中に提供する段階、および有機脂質溶液を第2容器中に提供する段階、および核酸(例えば、siRNA)を封入するリポソームが実質的に瞬時に生成されるよう、有機脂質溶液が水溶液と混合するように、水溶液と有機脂質溶液を混合する段階を含む工程である。この工程およびこの工程を行うための装置は、米国特許公開公報第20040142025号に詳述されている。

混合チャンバー中などの混合環境中へ脂質溶液および緩衝液を連続して導入する操作により、脂質溶液の緩衝液による連続的な希釈が起こり、それによって混合した際、実質的に瞬時にリポソームが生成される。本明細書で使用する「脂質溶液を緩衝液で連続して希釈する」という語句(およびその変形物)は、一般に、脂質溶液が水和工程において、小胞生成を達成するのに十分な力で十分迅速に希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液と有機脂質溶液を混合することにより、有機脂質溶液は緩衝液(すなわち、水溶液)の存在下で連続的な段階的希釈を起こし、核酸-脂質粒子が生成される。

いくつかの態様において、粒子は界面活性剤透析を用いて形成される。いずれか特定の形成機構によって縛られることを意図するものではないが、被覆された核酸複合体を形成するために、プラスミドまたは他の核酸(例えば、siRNA)を陽イオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させる。これらの被覆された核酸は、凝集して沈殿し得る。しかし、界面活性剤の存在によりこの凝集は減少し、被覆された核酸が過剰の脂質(典型的に、非陽イオン性脂質)と反応して、プラスミドまたは他の核酸が脂質二重層中に封入された粒子が形成されることになる。したがって、本発明は、以下の段階を含む、血清安定性核酸-脂質粒子を調製する方法を提供する：
(a) 界面活性剤溶液中で核酸と陽イオン性脂質を混合して、被覆された核酸-脂質複合体を形成させる段階；
(b) 非陽イオン性脂質を被覆された核酸-脂質複合体と接触させて、核酸-脂質複合体および非陽イオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成させる段階；および
(c) 段階(b)の界面活性剤溶液を透析して、核酸が脂質二重層中に封入され、粒子が血清安定性であって、かつ約50〜約150 nmの大きさを有する血清安定性核酸-脂質粒子の溶液を提供する段階。

被覆された核酸-脂質複合体の初期溶液は、界面活性剤溶液中で核酸と陽イオン性脂質を混合することによって形成される。

これらの態様において、界面活性剤溶液は好ましくは、15〜300 mM、より好ましくは20〜50 mMの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水溶液である。適切な界面活性剤の例には、例えば、N,N'-((オクタノイルイミノ)-ビス-(トリメチレン))-ビス-(D-グルコンアミド)(BIGCHAP)；BRIJ 35；デオキシ-BIGCHAP；ドデシルポリ(エチレングリコール)エーテル；Tween 20； Tween 40；Tween 60；Tween 80；Tween 85；Mega 8；Mega 9；Zwittergent(登録商標) 3-08；Zwittergent(登録商標) 3-10；Triton X-405 ；ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、およびノニル-β-D-グルコピラノシド；ならびにヘプチルチオグルコピラノシドが含まれ、オクチルβ-D-グルコピラノシドおよびTween-20が最も好ましい。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は、典型的には約 100 mM〜約2 M、好ましくは約 200 mM〜約 1.5 Mである。

陽イオン性脂質および核酸は典型的に、約1:1〜約20:1、好ましくは約1:1〜約12:1の比の、より好ましくは約2:1〜約6:1の比の電荷比(+/-)を生じるように混合される。さらに、溶液中の核酸の全体的な濃度は、典型的には約25μg/mL〜約1 mg/mL、好ましくは約25μg/mL〜約200μg/mL、より好ましくは約50μg/mL〜約100μg/mLである。界面活性剤溶液中での核酸と陽イオン性脂質の混合は、典型的には室温で、被覆された複合体が形成されるのに十分な時間維持される。または、核酸と陽イオン性脂質は界面活性剤溶液中で混合されて、約37℃まで加温され得る。特に温度感受性である核酸に関しては、被覆された複合体は、典型的には約4℃まで下げた低温で形成され得る。

好ましい態様において、形成される核酸-脂質粒子中の核酸-脂質比(質量/質量比)は約0.01〜約0.08である。精製段階によって典型的に、封入されなかった核酸および空のリポソームが除去されるため、出発材料の比もまたこの範囲内に入る。別の好ましい態様において、核酸-脂質粒子調製物は、総脂質10 mgに対して核酸約400μg、または約0.01〜約0.08という核酸-脂質比、より好ましくは核酸50μgに対して総脂質1.25 mgに相当する約0.04という核酸-脂質比を使用する。

次いで、被覆された核酸-脂質複合体の界面活性剤溶液を非陽イオン性脂質と接触させて、核酸-脂質複合体および非陽イオン性脂質の界面活性剤溶液を提供する。この段階で有用である非陽イオン性脂質には、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、およびセレブロシドが含まれる。好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、またはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはC₁₀〜C₂₄の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。特に好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、またはこれらの混合物である。最も好ましい態様において、核酸-脂質粒子は、インビボで増強された性質を有する融合性粒子であり、非陽イオン性脂質はDSPCまたはDOPEである。さらに、本発明の核酸-脂質粒子はコレステロールをさらに含み得る。他の好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、ポリエチレングリコールに基づくポリマー、例えばPEG 2000、PEG 5000、および米国特許第5,820,873号および米国特許公開公報第20030077829号に記載されるような、ジアシルグリセロール、セラミド、またはリン脂質に結合したポリエチレングリコールをさらに含む。さらなる好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、ポリエチレングリコールに基づくポリマー、例えばPEG 2000、PEG 5000、およびジアルキルオキシプロピルに結合したポリエチレングリコールをさらに含む。

本方法において用いられる非陽イオン性脂質の量は典型的に、核酸50μgに対して総脂質約2〜約20 mgである。好ましくは、総脂質の量は核酸50μg当たり約5〜約10 mgである。

核酸-脂質複合体および非陽イオン性脂質の界面活性剤溶液の形成後、界面活性剤を好ましくは透析により除去する。界面活性剤の除去により、核酸を取り囲む脂質二重層が形成され、約50 nm〜約150 nm、より典型的には約100 nm〜約130 nm、最も典型的には約110 nm〜約115 nmの大きさを有する血清安定性核酸-脂質粒子が提供される。このようにして形成された粒子は、凝集せず、任意には均一な粒径が得られるように一定の大きさに作製されている。

血清安定性核酸-脂質粒子は、リポソームの定寸化に利用できる方法のいずれかによって、一定の大きさに作製され得る。定寸化は、所望する大きさの範囲および比較的狭い粒径分布が得られるように行われ得る。

粒子を所望の大きさになるよう作製するには、いくつかの技法が利用できる。リポソームについて使用され、また本粒子にも同様に適用できる1つの定寸化方法は、米国特許第 4,737,323号に記載されている。槽またはプローブ超音波処理により粒子懸濁液を超音波処理すると、約50 nm未満の大きさの粒子にまで大きさが徐々に減少する。ホモジナイズは、大きな粒子をより小さな粒子に断片化するために剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジナイズ手順では、典型的には約60〜80 nmの選択された粒径が認められるまで、粒子を標準のエマルジョンホモジナイザーにより再循環させる。両方法において、粒径分布は、慣用的なレーザービーム粒径識別またはQELSによりモニターされ得る。

小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通した粒子の押し出しもまた、粒径を比較的明確な大きさ分布に減じるための効果的な方法である。典型的には、所望の粒径分布が得られるまで1回または複数回、膜を通して懸濁液を循環させる。徐々に孔を小さくした小孔膜を通して粒子を押し出すことができ、大きさの段階的減少が達成される。

別の群の態様において、本発明は、以下の段階を含む、血清安定性核酸-脂質粒子を調製する方法を提供する：
(a) 有機溶媒中に陽イオン性脂質および非陽イオン性脂質を含む混合物を調製する段階；
(b) 核酸の水溶液を段階(a)の混合物と接触させて、透明の単相を提供する段階；および
(c) 有機溶媒を除去して、核酸が脂質二重層中に封入され、粒子が血清中で安定であって、かつ約50〜約150 nmの大きさを有する核酸-脂質粒子の懸濁液を提供する段階。

この群の態様において有用である核酸(またはプラスミド)、陽イオン性脂質、および非陽イオン性脂質は、上記の界面活性剤透析法について記載した通りである。

有機溶媒の選択は典型的に、溶媒極性、および粒子形成の後の段階で溶媒が除去され得る容易性の考慮を含む。可溶化剤としても使用される有機溶媒は、核酸および脂質の透明な単相混合物を提供するために十分な量存在する。適切な溶媒には、これらに限定されないが、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、または他の脂肪族アルコール、例えば、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、tert-ブタノール、イソ-ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールが含まれる。2種またはそれ以上の溶媒の組み合わせもまた、本発明において使用され得る。

核酸と陽イオン性脂質および非陽イオン性脂質の有機溶液との接触は、典型的に水溶液である核酸の第1溶液と脂質の第2有機溶液を共に混合することによって達成される。当業者は、この混合が、多くの方法のいずれかにより、例えばボルテックスミキサーを用いるなど機械的手段により行われ得ることを理解すると考えられる。

核酸を脂質の有機溶液と接触させた後、有機溶媒を除去し、それにより血清安定性核酸-脂質粒子の水性懸濁液が形成される。有機溶媒を除去するために用いられる方法は典型的に、減圧下での蒸発、または混合物を通した不活性ガス(例えば、窒素またはアルゴン)流の吹きつけを含む。

このようにして形成される血清安定性核酸-脂質粒子は、典型的に約50 nm〜約150 nm、より典型的には約100 nm〜約130 nm、最も典型的には約110 nm〜約115 nmの大きさに作製される。大きさのさらなる減少または粒径の均一性を達成するには、上記の通りに定寸化を行い得る。

他の態様において、本方法は、本組成物を用いて細胞への送達をもたらすのに有用である非脂質性ポリカチオンを添加する段階をさらに含む。適切な非脂質性ポリカチオンの例には、これらに限定されないが、臭化ヘキサジメトリン(商品名POLYBRENE(登録商標)で販売、Aldrich Chemical Co.、米国、ウィスコンシン州、ミルウォーキー)またはヘキサジメトリンの他の塩が含まれる。他の適切なポリカチオンには、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。

特定の態様において、核酸-脂質粒子の形成は、単相系(例えば、Bligh-Dyer単相、または水性溶媒および有機溶媒の同様の混合物)または適切な混合を伴う二相系のいずれかで行なわれ得る。

複合体の形成を単相系で行なう場合には、陽イオン性脂質および核酸をそれぞれ単相混合物の容積で溶解する。2つの溶液を混合することで、複合体を形成する単一混合物が提供される。または、複合体は、陽イオン性脂質が核酸(水相中に存在する)に結合し、有機相中にこれを「引き寄せる」二相混合物中で形成され得る。

別の態様において、本発明は、以下の段階を含む核酸-脂質粒子を調製する方法を提供する：
(a) 核酸を非陽イオン性脂質および界面活性剤を含む溶液と接触させて、核酸-脂質混合物を形成させる段階；
(b) 陽イオン性脂質を核酸-脂質混合物と接触させて、核酸の負電荷の一部を中和し、核酸および脂質の電荷中和混合物を形成させる段階；および
(c) 電荷中和混合物から界面活性剤を除去して、核酸が分解から保護される核酸-脂質粒子を提供する段階。

1つの群の態様において、非陽イオン性脂質および界面活性剤の溶液は水溶液である。核酸と非陽イオン性脂質および界面活性剤の溶液との接触は典型的に、核酸の第1溶液と脂質および界面活性剤の第2溶液を共に混合することによって達成される。当業者は、この混合が、多くの方法のいずれかにより、例えばボルテックスミキサーを用いるなど機械的手段により行われ得ることを理解すると考えられる。好ましくは、核酸溶液もまた界面活性剤溶液である。本方法で使用する非陽イオン性脂質の量は典型的に、使用する陽イオン性脂質の量に基づいて決定され、典型的には陽イオン性脂質の量の約0.2〜5倍、好ましくは使用する陽イオン性脂質の量の約0.5〜約2倍である。

いくつかの態様において、核酸は、例えば米国特許出願第09/744,103号に記載されるようにあらかじめ凝縮される。

このようにして形成された核酸-脂質混合物を陽イオン性脂質と接触させて、存在する核酸(または他のポリアニオン性物質)に付随する負電荷の一部を中和する。使用する陽イオン性脂質の量は典型的に、核酸の負電荷の少なくとも50％を中和するのに十分な量である。好ましくは、負電荷は少なくとも70％中和される、より好ましくは少なくとも90％中和される。本発明において有用である陽イオン性脂質には、例えば、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DC-Chol、およびDMRIEが含まれる。これらの脂質および関連類似体は、米国特許第5,208,036号、同第5,264,618号、同第5,279,833号、同第5,283,185号、同第5,753,613号、および同第5,785,992号に記載されている。

陽イオン性脂質と核酸-脂質混合物との接触は、多くの技法のいずれかにより、好ましくは陽イオン性脂質の溶液と核酸-脂質混合物を含む溶液を共に混合することによって達成され得る。2つの溶液の混合(または任意の他の様式での接触)時に、核酸に付随する負電荷の一部が中和される。それにもかかわらず、核酸は凝縮されない状態にあり、疎水性特性を獲得する。

陽イオン性脂質を核酸-脂質混合物と接触させた後、界面活性剤(または界面活性剤と有機溶媒の組み合わせ)を除去し、これにより核酸-脂質粒子が形成される。界面活性剤を除去するために用いられる方法は典型的に、透析を含む。有機溶媒が存在する場合、除去は典型的に、減圧下での蒸発、または混合物を通した不活性ガス(例えば、窒素またはアルゴン)流の吹きつけよって達成される。

このようにして形成される粒子は、典型的に約50 nm〜数ミクロン、より典型的に約50 nm〜約150 nm、さらにより典型的には約100 nm〜約130 nm、最も典型的には約110 nm〜約115 nmの大きさに作製される。大きさのさらなる減少または粒径の均一性を達成するには、核酸-脂質粒子を超音波処理、濾過し得るか、またはリポソーム形成において用いられ、当業者に周知である他の定寸化技法に供し得る。

他の態様において、本方法は、本組成物を用いて細胞のリポフェクションをもたらすのに有用である非脂質性ポリカチオンを添加する段階をさらに含む。適切な非脂質性ポリカチオンの例には、臭化ヘキサジメトリン(商品名POLYBRENE(登録商標)で販売、Aldrich Chemical Co.、米国、ウィスコンシン州、ミルウォーキー)またはヘキサジメトリンの他の塩が含まれる。他の適切なポリカチオンには、例えば、ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミン、およびポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩の添加は、好ましくは粒子が形成された後である。

別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、核酸-脂質粒子を調製する方法を提供する：
(a) 約15〜35％の水および約65〜85％の有機溶媒を含む溶液中で、約0.85〜約2.0の+/-電荷比を生じるのに十分である陽イオン性脂質量を核酸と接触させて、疎水性核酸-脂質複合体を提供する段階：
(b) 溶液中の疎水性核酸-脂質複合体を非陽イオン性脂質と接触させて、核酸-脂質混合物を提供する段階；および
(c) 核酸-脂質混合物から有機溶媒を除去して、核酸が分解から保護される核酸-脂質粒子を提供する段階。

本発明のこの局面において有用である核酸、非陽イオン性脂質、陽イオン性脂質、および有機溶媒は、界面活性剤を使用する上記の方法について記載したものと同様である。1つの群の態様において、段階(a)の溶液は単相である。別の群の態様において、段階(a)の溶液は二相である。

好ましい態様において、陽イオン性脂質は、DODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGS、またはこれらの組み合わせである。他の好ましい態様において、非陽イオン性脂質は、ESM、DOPE、DOPC、DSPC、ポリエチレングリコールに基づくポリマー(例えば、PEG 2000、PEG 5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、またはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、またはこれらの組み合わせである。さらなる他の好ましい態様において、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはそれらの組み合わせである。

1つの態様において、核酸は干渉RNAが転写されるプラスミドであり；陽イオン性脂質はDODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGS、またはこれらの組み合わせであり；非陽イオン性脂質はESM、DOPE、DAG-PEG、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、またはこれらの組み合わせ(例えば、DSPCおよびDAG-PEG)であり;有機溶媒はメタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはこれらの組み合わせである。

上記のように、核酸と陽イオン性脂質との接触は、典型的に核酸の第1溶液と脂質の第2溶液を共に、好ましくはボルテックスミキサーを用いるなどの機械的手段によって混合することにより達成される。得られる混合物は、上記のような複合体を含む。次いで、非陽イオン性脂質の添加および有機溶媒の除去により、これらの複合体を粒子に変換させる。非陽イオン性脂質の添加は典型的に、複合体を含む混合物に非陽イオン性脂質の溶液を単に添加することによって達成される。逆の添加もまた使用できる。続く有機溶媒の除去は、当業者に周知の方法およびまた上記した方法によって達成され得る。

本発明のこの局面で使用される非陽イオン性脂質の量は典型的に、電荷中和核酸-脂質複合体を提供するために使用された陽イオン性脂質の量(モル基準で)の約0.2〜約15倍の量である。好ましくは、その量は使用した陽イオン性脂質の量の約0.5〜約9倍である。

さらに別の局面において、本発明は、上記の方法によって調製される核酸-脂質粒子を提供する。これらの態様において、核酸-脂質粒子は、正味の電荷が中性であるか、またはより高い遺伝子リポフェクション活性を有する粒子を提供する全体的な電荷を有する。好ましくは、粒子の核酸成分は、望ましくないタンパク質の産生を妨げる核酸である。特に好ましい態様において、核酸は干渉RNAを含み、非陽イオン性脂質は卵スフィンゴミエリンであり、陽イオン性脂質はDODACである。好ましい態様において、核酸は干渉RNAを含み、非陽イオン性脂質はDSPCとコレステロールの混合物であり、陽イオン性脂質はDOTMAである。他の好ましい態様において、非陽イオン性脂質はコレステロールをさらに含み得る。

SNALP-CPL(CPL含有SNALP)を作製するための様々な一般的方法を、本明細書において考察する。2つの一般的技法として、「後挿入」技法(すなわち、例えばあらかじめ形成されたSNALPへのCPLの挿入)および「標準的」技法(例えばSNALP形成段階において、CPLを脂質混合物中に含める)が挙げられる。後挿入技法では、主にSNALP二重層膜の外面にCPLを有するSNALPが生じ、一方、標準的技法では、内面および外面の両方にCPLを有するSNALPが提供される。本方法は、リン脂質から作製される小胞(コレステロールを含み得る)に、またPEG-脂質(PEG-DAGなど)を含む小胞に特に有用である。SNALP-CPLを作製する方法は、例えば、米国特許第5,705,385号、同第6,586,410号、同第5,981,501号、同第6,534,484号；同第6,852,334号；米国特許公開公報第20020072121号、およびWO 00/62813において教示されている。

VI. キット
本発明はまた、キット形態の核酸-脂質粒子を提供する。キットは、核酸-脂質粒子の様々な要素(例えば、核酸および粒子の個々の脂質成分)を保持するために区画化された容器を含み得る。いくつかの態様において、キットは、好ましくは脱水形態の本発明の核酸-脂質粒子組成物、ならびにその再水和および投与に関する説明書を含む。

VII. 核酸-脂質粒子の投与
本発明の血清安定性核酸-脂質粒子は、核酸を細胞に導入するのに有用である。したがって、本発明はまた、核酸(例えば、干渉RNA)を細胞に導入する方法を提供する。5'-GU'3'ジヌクレオチドモチーフを導入(すなわち、増強)または除去(すなわち、減少)することにより、所望の効果に応じて、siRNAの免疫賦活効果を増強するかまたは減少させることができる。この方法は、まず上記の通りに粒子を形成し、次いで干渉RNAの送達が起こるのに十分な時間、粒子を細胞と接触させることによって、インビトロまたはインビボで行われる。

本発明の核酸-脂質粒子は、それらと混合したまたは接触させたほとんどすべての細胞種に吸着され得る。吸着した時点で、粒子は細胞の一部によって取り込まれ得るか、脂質を細胞膜と交換し得るか、または細胞と融合し得る。粒子の核酸部分の移行または取り込みは、これらの経路のいずれか1つを介して起こり得る。特に、融合が起こる場合、粒子膜は細胞膜中に組み込まれ、粒子の内容物は細胞内流体と混ざり合う。

A. インビトロ送達
インビトロ適用の場合、核酸の送達は、植物・動物起源にかかわらず、脊椎動物・無脊椎動物にかかわらず、および任意の組織または種類にかかわらず、培養で増殖した任意の細胞に対して行われ得る。好ましい態様において、細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、および最も好ましくはヒト細胞である。

細胞と核酸-脂質粒子との接触は、インビトロで行う場合、生物学的に適合する培地中で行われる。粒子の濃度は特定の適用に応じて大きく異なるが、一般的に約1μmol〜約10 mmolである。核酸-脂質粒子による細胞の処理は一般的に、生理的温度(約37℃)で約1〜48時間、好ましくは約2〜4時間行われる。

1つの群の好ましい態様において、約10³〜約10⁵細胞/mL、より好ましくは約2x10⁴細胞/mLの細胞密度を有する、60〜80％コンフルエントのプレーティングされた細胞に、核酸-脂質粒子懸濁液を添加する。細胞に添加する懸濁液の濃度は、好ましくは約0.01〜0.2μg/mL、より好ましくは約0.1μg/mLである。

エンドソーム放出パラメータ(ERP)アッセイ法を用いて、SNALPまたは脂質に基づくその他の担体系の送達効率を最適化することができる。ERPアッセイ法は、米国特許公開公報第20030077829号に詳述されている。より詳細には、ERPアッセイの目的は、結合/取り込みまたはエンドソーム膜との融合/エンドソーム膜の不安定化に及ぼす、SNALPの様々な陽イオン性脂質および補助脂質成分のそれらの相対効果に基づく効果を識別することにある。このアッセイ法により、SNALPまたは脂質に基づくその他の担体系の各成分がどのように送達効率に影響するかを定量的に決定することができ、それによってSNALPまたは脂質に基づくその他の担体系を最適化することができる。通常、ERPアッセイ法では、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質など)の発現を測定するが、場合によっては、発現プラスミドについて最適化されたSNALP製剤はまた、干渉RNAの封入にも適している。他の例では、干渉RNAの存在下または不在下で標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するように、ERPアッセイ法を適合化することができる。種々のSNALPまたは脂質に基づくその他の製剤それぞれについてERPを比較することにより、最適化された系、例えば、細胞での取り込みが最も高いSNALPまたは脂質に基づくその他の製剤を容易に決定することができる。

本発明のERPアッセイを行うために適切な標識には、これらに限定されないが、スペクトル標識、例えば蛍光色素(例えば、フルオレセインおよびその誘導体(フルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびOregon Green(商標)など)；ローダミンおよびその誘導体(テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート(TRITC)など)、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDye(商標)など；放射標識、例えば、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P、³³Pなど；酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど；スペクトル比色標識、例えば、コロイド金または色ガラスまたはプラスチックビーズ(ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)などが含まれる。標識は、当技術分野において周知の方法により、SNALPまたは脂質に基づくその他の担体系に直接または間接的に結合され得る。上記のように、必要な感度、SNALP成分との結合の
容易さ、安定性要件、ならびに利用できる計測手段および廃棄設備に応じて標識を選択して、多種多様な標識を使用することができる。

B. インビボ送達
本発明の核酸-脂質粒子は、単独で、または投与経路および標準的な薬務に従って選択された生理的に許容される担体(生理食塩水またはリン酸緩衝液など)と混合して、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、経口、鼻腔内、または局所投与をはじめとする、当技術分野において周知である任意の経路を介して投与され得る。

本発明の核酸-脂質粒子の薬学的調製物を調製する場合、空の脂質粒子または核酸部分が外表面と結合している粒子を減少させるかまたは排除するために精製された核酸-脂質粒子の量を使用することが好ましい。薬学的担体は一般的に、粒子形成後に添加する。したがって、粒子の形成後、粒子を薬学的に許容される担体中に稀釈し得る。

薬学的製剤中の粒子の濃度は、大きく、すなわち約0.05重量％未満、通常は約2.5％重量または少なくとも約2.5重量％から10〜30％程度まで異なり得り、選択された特定の投与方法に従って、主に液量、粘性などにより選択される。

1. 注射送達
特定の状況においては、本明細書に開示する薬学的組成物は、米国特許第5,543,158号；同第5,641,515号；および同第5,399,363号に記載されるように、非経口的に、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または腹腔内に送達することが望ましい。核酸-脂質粒子の溶液は、界面活性剤と適切に混合した水中で調製され得る。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中で、ならびに油中で、分散剤が調製され得る。典型的に、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。一般に、静脈内投与する場合、核酸-脂質粒子製剤は、適切な薬学的担体と共に製剤化する。一般的には、薬学的に許容される担体として通常の緩衝生理食塩水(135〜150 mM NaCl)を使用するが、他の適切な担体でも十分である。さらなる適切な担体は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)に記載されている。本明細書で使用する「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、媒体、被覆剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与しした場合に、アレルギー性または同様の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。タンパク質を有効成分として含む水性組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。典型的には、そのような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかで注射剤として調製する;注射に先立って液体に溶解するかまたは懸濁するのに適した固形物もまた調製され得る。調製物を乳化することも可能である。

これらの組成物は、濾過などの慣用的なリポソーム滅菌技法によって滅菌され得る。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など、生理的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質を含み得る。これらの組成物は、上記の技法を用いて滅菌され得るか、または滅菌条件下で作製され得る。得られる水溶液は使用用に包装するか、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は滅菌水溶液と混合してから投与する。

2. 経口送達
特定の適用において、本明細書に開示する核酸-脂質粒子は、経口投与により個体に送達され得る。活性化合物は賦形剤と共に取り込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、洗口剤、懸濁剤、経口噴霧剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用され得る(米国特許第5,641,515号；同第5,580,579号；および同第5,792,451号を参照されたい)。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセルなどは、以下のものをまた含み得る：結合剤、ゼラチン；賦形剤、潤滑剤、または着香剤。用量単位形態がカプセル剤である場合、これは、上記の種類の材料に加えて液体担体を含み得る。被覆剤として、または用量単位の物理的形態を別の方法で改変するために、種々の他の担体が存在してもよい。当然のことながら、用量単位形態を調製する際に使用するいかなる材料も、薬学的荷に純粋であり、かつ使用量において実質的に無毒であるべきである。

典型的に、これらの製剤は、少なくとも約0.1％またはそれ以上の活性化合物を含み得るが、有効成分の割合は当然のことながら変動し得り、慣用的には、全製剤の重量または体積の約1ないしは2％〜約60％ないしは70％またはそれ以上であってよい。当然ながら、治療的に有用な各組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が化合物の所与の単位用量において得られるような方法で調製され得る。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命などの要因、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的製剤を調製する分野の当業者によって意図され、そのようなものとして種々の投与量および治療計画が所望され得る。

3. 経鼻送達
特定の態様において、薬学的組成物は、点鼻薬、吸入、および/または他のエアロゾル送達媒体によって送達され得る。核酸組成物を経鼻エアロゾルスプレーにより肺に直線送達する方法は、例えば、米国特許第5,756,353号および同第5,804,212号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂およびリゾホスファチジル-グリセロール化合物(米国特許第5,725,871号)を使用する薬物の送達もまた、薬学分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第5,780,045号に記載されている。

4. 局所送達
これらの使用の別の例においては、核酸-脂質粒子は、これらに限定されないが、ゲル剤、油、乳剤などをはじめとする広範囲の局所性剤に取り込まれ得る。例えば、核酸-脂質粒子を含む懸濁液を製剤化し、局所クリーム剤、ペースト剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤などとして投与することができる。

実施例
以下の実施例は説明のために提供するものであって、主張する発明を制限するものではない。

実施例1: 材料および方法
背景：
RNA干渉(RNAi)を介した特定遺伝子のサイレンシングは、生物学的研究において広く使用される手段となっており、臨床応用に向けて急速に開発が進められている。RNAiでは18〜22 bp長の短い二本鎖RNA(siRNA)を利用するが、これは大きさが小さいことから非炎症性であり、哺乳動物細胞においてインターフェロン応答を活性化し得ないと見なされている。しかし、免疫系における研究で、これらの主張を支持することが報告されているものはほとんどない。このことに直接取り組むため、本発明者らは一連のsiRNAの免疫賦活特性を調査した。より詳細には、リポソーム封入された、脂質複合化された(Oligofectamine)、または裸の化学合成siRNAを、ヒト血液細胞サブセットによるサイトカイン応答を刺激する能力について試験した。インビボでのsiRNAによる先天性免疫系の活性化もまた、マウス試験で評価した。

siRNA：
これらの研究で使用したsiRNAはすべて、Dharmacon(コロラド州、ラファイエット)により化学合成され、標準型またはPAGE精製型の、脱塩してあらかじめアニーリングさせた二重鎖として受領した。β-ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、BP120、および細菌テトラサイクリン耐性遺伝子(TetR)をコードするmRNAに相同的なsiRNAを、対応する非標的化配列対照siRNAと共に作製した。これらのヌクレオチド配列を図16に列挙する。β-gal対照配列およびBP1対照配列は、図12Aに詳述するように、選択的塩基置換によって修飾した。

マウス：
6〜8週齢CD1 ICRマウスをHarlan(インディアナ州、インディアナポリス)から入手し、使用する前に3週間の隔離および順化に供した。siRNAおよび脂質製剤は、0.2 ml PBS中で、側部尾静脈に単回静脈内注射として投与した。注射は、3〜5秒間かけて行った。心臓穿刺により血液を採取し、サイトカイン解析用の血漿として加工した。血球計数は、Central Laboratory For Veterinarians(ブリティッシュコロンビア州、ラングレー)で行った。

siRNAの脂質封入：
siRNAは、Wheeler et al., Gene Ther. 6, 271-281 (1999)によって開発された方法を、脂質成分の可溶化および透析のための界面活性剤をエタノールに置き換えて適応させることによってリポソーム中に封入した。リポソームは、それぞれモル比55:20:10:15または48:20:2:30で、以下の脂質から構成された；合成コレステロール(Sigma、ミズーリ州、セントルイス)、リン脂質DSPC(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン；Avanti Polar Lipids、アラバマ州、アラバスター)、PEG-脂質であるPEG-cDMA(3-N-[(-メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]-1,2-ジミレスチルオキシ-プロピルアミン)、および陽イオン性脂質DODMA(1,2-ジ-o-オクタデセニル-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン)またはDLinDMA(1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N,N-ジメチル)アミノプロパン)。脂質PEG-cDMA、DODMA、およびDLinDMAは、Protiva Biotherapeuticsで社内合成した。得られた安定化脂質粒子は、使用前にPBS中で透析した。媒体対照として、同一の脂質組成を有する空のリポソームをsiRNAの不在下で形成させた。

siRNA複合体の形成：
いくつかの実験では、製造業者の説明書に従って、siRNAをoligofectamineまたはLipofectamine(Invitrogen；カリフォルニア州、カールズバッド)と複合化させた。siRNAは、ボルテックスしながらポリカチオン溶液中に核酸を1滴ずつ添加することによって、蒸留水に希釈した10 KDa PEI(Polysciences Inc.、ペンシルバニア州、ウォーリントン)またはポリ-L-リジン(Sigma；英国、プール)と複合化させた。PEIポリプレックスは10.5:1というおよそのN:P比で、PLLポリプレックスは3:1(+:-)という電荷比で形成された。得られたポリプレックスは、それぞれ直径約140 nmおよび> 500 nmであった。

細胞の単離および培養：
標準的なFicoll-Hypaque密度遠心分離技法により、健常ドナーの全血からヒトPBMCを単離した。ヒトPBMCからのCD14⁺単球およびBDCA4⁺ pDCの単離は、製造業者の説明書に従って、MiniMacsカラム(Miltenyi；カリフォルニア州、オーバーン)を用いてMACS磁気ビーズで陽性選択することにより行った。pDC濃縮細胞の収率は典型的に、全PBMC集団の0.3〜0.5％であった。刺激アッセイでは、2x10⁵個の新たに単離した細胞を96ウェルプレートに三つ組で播種し、10％ FCS、2 mMグルタミン、100 U/mLペニシリン、および100 ug/mLストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地で培養した。siRNAはリポソームに封入するか、またはOligofectamine(Invitrogen；カリフォルニア州、カールズバッド)と複合化させ、次いで表示の最終核酸濃度で細胞に添加した。空のリポソームまたはOligofectamineのみを、脂質媒体対照として使用した。いくつかの実験では、培養の開始時に、培養物に20％自己ヒト血漿または様々な濃度のクロロキン(Sigma、ミズーリ州、セントルイス)を添加した。16〜20時間培養した後、上清を回収し、サンドイッチELISA法によりIFN-α、IL-6、およびTNF-αについてアッセイした。

サイトカインELISA：
サイトカインはすべて、サンドイッチELISAキットを用いて定量化した。これらは、マウスおよびヒトインターフェロン-α(PBL Biomedical、ニュージャージ州、ピスカタウェイ)、ヒトIL-6およびTNF-α(eBioscience、カリフォルニア州、サンディエゴ)、ならびにマウスIL-6、TNF-α、およびIFN-α(BD Biosciences、カリフォルニア州、サンディエゴ)であった。

インビトロRNA干渉アッセイ：
neuro2a細胞にpcDNA5/LacZ構築物(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)を脂質トランスフェクションして、β-galを安定して発現するマウスNeuro2a-LacZ細胞株を作製した。安定したトランスフェクタントを選択し、ハイグロマイシンを用いて維持した。LacZ-Neuro2a細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、β-galを標的する脂質封入siRNAまたは非標的化配列対照二重鎖で処理した。次いで、細胞をさらに48時間培養し、その後洗浄して、0.1％ Triton-X100を含む250 mMリン酸ナトリウムで溶解した。β-ガラクトシダーゼ酵素活性は、製造業者の説明書に従い、CPRGアッセイ法(Gene Therapy Systems、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いて細胞溶解物中で定量化した。CPRGアッセイの結果は、固定細胞単層のXgal染色および顕微鏡解析による平行実験で確認した。

実施例2：PEG-脂質によって調節される血液循環時間の延長を示すSNALP封入siRNA
後腹部に皮下Neuro2a腫瘍を有する雄A/Jマウスを、PEG-c-DSAまたはPEG-c-DMA(それぞれC18またはC14アルキル鎖長)を含む、非置換性脂質マーカー³H-コレステリルへキサデシルエーテルで標識したSNALP(100μg siRNA)の単回静脈内注射により処理した。SNALPを静脈内注射してから24時間、全血試料を³H-コレステリルへキサデシルエーテルについてモニターした。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す(n = 5)。PEG-c-DSAまたはPEG-c-DMAを含むSNALPでは、それぞれ16時間後および3時間後の血中に注射用量の50％が残存する。結果を図1に示す。

この実験から、血液循環時間がPEG-脂質の脂質アルキル鎖長に影響を受けること、すなわち、PEG-C-DMA製剤は肝臓中に優先的蓄積するのに対し、PEG-C-DSA製剤は遠位の腫瘍部位に蓄積することがが実証される。この特性を用いて、脂質封入siRNAを異なる部位に標的することができると考えられる。

実施例3：肝臓および遠位の腫瘍をはじめとする特定の疾患部位を標的するよう設計され得るSNALP
実施例2に記載した腫瘍保有マウスにおいて、放射標識SNALPの体内分布を24時間後に評価した。PEG-c-DMA SNALP(35％)は、PEG-c-DSA SNALP(13％)と比較して、肝臓における優先的な蓄積を示す。一方、PEG-c-DSA SNALPは、腫瘍部位への標的化の増強を示す。結果を図2に示す。

実施例4：ヒト細胞においてI型インターフェロンおよび炎症性サイトカインの産生を促進するsiRNA二重鎖
ヒト免疫細胞が合成siRNAによって活性化されるかどうかを判定するため、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、リポソーム中に封入したまたはトランスフェクション試薬Oligofectamineと複合化したsiRNAの存在下で培養した。

Ficoll遠心分離によって単離したヒトPBMCを、SNALP中に封入した、Oligofectamineと複合化した(リポプレックス)3μg/ml B-Gal siRNA(Dharmacon)、または裸のsiRNAと共に一晩培養した。培養上清中のインターフェロン-α(IFNα)、IL-6、およびTNF-αのレベルを、ELISA法によりアッセイした。封入siRNAが顕著なIFNa応答を促進したのに対して、複合化siRNAは主に炎症性サイトカインを誘発した。裸のsiRNAまたは脂質成分のみでは、この濃度で非促進性であった。(三つ組培養物の平均値 + S.D.)。細胞内送達をいずれかのトランスフェクション法によって促進した場合、マウスにおいて免疫賦活性であったsiRNA二重鎖はまた、ヒトPBMCからの顕著なIFN-αおよび炎症性サイトカイン放出を誘導した。結果を図3Aに示す。

β-gal siRNA(2 mg/kg、約40 mg)を封入しているSNALPまたは同じ用量の裸のsiRNAまたは脂質のみを、ICRマウスに静脈内投与した。投与から6時間後に、血漿サイトカインについてアッセイした。siRNA SNALPにより、IFNα、IL-6、およびTNFαの顕著な誘導が誘発された。(平均値 + SD、n = 4)。結果を図3B〜3Cに示す。

異なる用量のB-Gal siRNAに対するIFNα応答を、ICRマウスにおいてインビボで、またはヒトPBMCを用いてインビトロで評価した。(1μg/ml siRNA = 約75 nM)。結果を図3D〜3Eに示す。

脂質のみまたは裸のsiRNAによる処理では、検出可能なサイトカイン放出は生じなかった。IFN-αの最適な刺激はsiRNAの封入リポソーム送達に付随し、脂質複合化siRNAでは主に炎症性サイトカイン応答が誘導された。

siRNAによるヒトPBMCの刺激はまた、ヌクレオチド配列に依存した。βgal 728 siRNA二重鎖は、IFN-α(図9)、IL-6、およびTNF-αの誘導において、BP1二重鎖よりも顕著に強力であった。ヒトPBMCにおけるサイトカイン応答の誘導における様々なsiRNAの相対的効力は、マウスで認められる効力と類似しており、siRNA認識の機構が広く保存され得ることが示唆される。初期の実験から、siRNAによる免疫刺激が全血培養物中で増強されることが示唆された。この効果は、PBMC培養物において自己血漿の添加により再構成された(図9)。これらの培養条件下においてさえ、高濃度のBP1 siRNAしかIFN-α放出を誘導し得なかった。自己血漿がsiRNAに対する炎症反応を増強する機構は、サイトカイン産生細胞に対する増殖因子の供給、またはその同族受容体によるsiRNAの認識における可溶性補助因子の関与を反映し得る。

実施例5：Toll様受容体媒介性免疫応答に特有であるsiRNAの免疫賦活特性
漸増濃度のクロロキンの存在下において、ヒトPBMCをsiRNA SNALP(3μg/ml)で一晩刺激した。培養上清中のIFNαおよびIL-6のレベルを、ELISA法により評価した。siRNA誘導性のサイトカイン放出は、2μMクロロキン濃度において>90％まで阻害された。(三つ組培養物の平均値 + S.D.)。結果を図4A〜Bに示す。これらの結果から、siRNA SNALPによる免疫刺激がクロロキンによる阻害に高い感受性があることが実証され、よってこの免疫刺激がtoll様受容体を介して媒介されることが示唆される。

磁気ビーズ分離(Miltenyi)により、ヒト単球および形質細胞様樹状細胞(pDC)をPBMCから分画した。PBMC、単球枯渇PBMC、単球濃縮画分、およびpDC濃縮画分を、漸増用量のsiRNA SNALPで一晩刺激した。脂質のみまたは裸のsiRNAによる処理では、検出可能なサイトカイン放出は生じなかった。IFNaの誘導にはpDCの存在が必要である。IFN-αの最適な刺激はsiRNAの封入リポソーム送達に付随し、脂質複合化siRNAでは主に炎症性サイトカイン応答が誘導された。磁気ビーズ分離を用いた細胞分画研究から、BDCA4⁺形質細胞様樹状細胞(pDC)が、脂質封入siRNAへのIFN-α応答に関与する主なPBMC細胞種であることが明らかになった。一方、精製CD14⁺単球は、刺激性siRNAと共に培養した場合にIFN-αをほとんど産生せず、単球枯渇PBMCは応答する全能力を保持した。IFNαレベルは、プールした三つ組培養物の平均値を表す。データは、3回の別個の実験の代表例である。結果を図4Cに示す。これらの結果から、形質細胞様樹状細胞が、siRNAへのインターフェロン応答に関与する主なPBMC細胞種であることが実証され、さらに免疫刺激がtoll様受容体を介して媒介されるという可能性が支持される。

実施例6：免疫応答を誘導するsiRNA-陽イオン性脂質複合体
本実施例では、siRNA-陽イオン性脂質複合体による免疫応答のインビトロ誘導を実証する実験について記載する。

ICRマウス脾臓からマウス脾細胞懸濁液を調製し、Oligofectamine(商標)と複合化した1μg/mlまたは3μg/ml siRNAで刺激した。一晩培養した後、培養上清中のIFN-αレベルを測定した。

具体的には、以下のsiRNA分子を使用した。
1. βGal siRNA(免疫賦活性配列)

2. βGal Mod-1(U→C置換)

3. βGal Mod-2(U→C；U→C置換)

4. BP1 siRNA(低免疫賦活性)

5. BP1 Mod-1(G→U置換)

6. BP1 Mod-2(G→U、C→G置換)

結果を図5に示す。これらの結果から、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'または5'-UGUGU-3')が、siRNA二重鎖の免疫賦活活性に関与するという支持が提供される。

実施例7：免疫応答を誘導する核酸-脂質粒子中に封入されたsiRNA
本実施例では、PEG-ジミリスチルオキシプロピル複合体を含む核酸-脂質粒子中に封入されたsiRNAよる、免疫応答のインビボ誘導を実証する実験について記載する。

上記の実施例7において記載したsiRNA分子を合成し、本明細書に記載する方法を用いて核酸-脂質粒子中に封入した。封入siRNA(すなわち、BP-1、BP-1 Mod-1、BP-1 Mod-2、βgal、βgal Mod-1、またはβgal Mod-2)を、マウスに静脈内投与した。siRNAの投与から6時間後に、血漿IL-6、TFN-α、およびIFN-αレベルを測定した。結果を図6〜8に示す。

B-Gal siRNA配列中の5'-UGUGU-3'モチーフを破壊するよう一塩基置換することで、得られたsiRNA二重鎖(B-Gal Mod1)の免疫賦活活性は顕著に減少した。逆に、BP-1対照siRNA配列中に5'-UGUGU-3'モチーフを段階的に導入することで、免疫賦活活性が上昇した二重鎖が作製された。(データは平均値 + SDを表す、n = 4)。結果を図6〜8に示す。これらの結果から、5'-UGU-3'モチーフを修飾することによって、siRNA二重鎖の免疫賦活性をより高くまたはより低くできることが実証される。また、これらの結果から、塩基配列モチーフ5'-UGU-3'または5'-UGUGU-3'が、siRNA二重鎖の免疫賦活活性に関与するというさらなる支持が提供される。

実施例8：インビトロにおいてsiRNAの配列特異的免疫賦活効果を増強する血漿由来因子
10％自己血漿の存在下または不在下において、ヒトPBMCを、上記の実施例6に記載した高刺激性B-Gal siRNAまたは低刺激性BP-1対照siRNAを含むSNALPと共に一晩培養した。IFN-αレベルは、三つ組培養物の平均値 +/- SDとして表す。ヒト血漿はBgal siRNAの刺激効果を増強し、高用量のBP-1対照siRNAによる低レベルのIFNα誘導を促進する。

siRNAによるヒトPBMCの刺激は、ヌクレオチド配列に依存した。βgal siRNA二重鎖は、IFN-α)、IL-6、およびTNF-αの誘導において、BP1二重鎖よりも顕著に強力であった。初期の実験から、siRNA媒介性免疫刺激が全血培養物中で増強されることが実証された。この効果は、PBMC培養物において自己血漿の添加により再構成された。これらの培養条件下においてさえ、BP1 siRNAは低レベルのIFN-αしか誘導し得なかった。これらの結果を図9A〜9Bに示す。

様々なsiRNAの相対的効力は、マウスで認められる効力と類似しており、ヒトおよびマウスにおけるsiRNA認識の機構が、類似したヌクレオチド配列パターンに広く基づき得ることが示唆される。

実施例9：免疫応答を誘導するsiRNA-陽イオン性脂質複合体および核酸-脂質粒子中に封入されたsiRNA
さらなるsiRNA配列を陽イオン性脂質と複合化させるか、または本明細書に記載の核酸-脂質粒子中に封入した。複合体を実施例6と同様のマウス脾細胞と接触させ、封入siRNAを実施例7と同様のマウスに投与した。インビトロおよびインビボ実験の結果を図10に要約する。

実施例10：全身投与したsiRNAによるサイトカインの配列依存的誘導
合成siRNAが先天性免疫応答を活性化し得るかどうかを試験するため、一連のsiRNA二重鎖を、マウスにおいてサイトカイン応答を誘発する能力について試験した。インビボにおいて標的細胞へのsiRNAの効率的な全身送達を達成するため、実施例1に記載する通りに合成siRNAをリポソーム内に完全に封入した。得られた100〜120 nm直径の脂質粒子は、封入したsiRNAをヌクレアーゼ分解から保護し、血液循環時間の延長を示し、RNAiを媒介する点で効果的である(図1および13)。β-ガラクトシダーゼ(β-gal 728)、ホタルルシフェラーゼ(Luc)を標的する脂質封入siRNA、または脂質に封入されたそれぞれの非標的化配列対照二重鎖の静脈内投与により、ICRマウスにおいて顕著な用量依存的IFN-α応答が誘導された(図11Aおよび11B)。

合成siRNAが先天性サイトカイン応答の強力な刺激物質になり得るというこの一般的知見は、別のリポソーム製剤中に封入された、β-galまたはTetRを標的するsiRNA二重鎖でマウスを静脈内処理する第2の実験で確認された(図11C)。A/J系統およびC57Bl/6系統のマウスにおいても、質的に同様の応答が認められた。siRNAによる処理は、TNF-αおよびIL-6をはじめとする炎症性サイトカインの同時産生も伴った(図11C)。最大サイトカインレベルは、siRNA投与の6〜10時間後に達成され、24時間以内にバックグラウンドレベルに完全に回復した。このサイトカイン応答はsiRNAに依存し、脂質担体も同用量の裸のsiRNA二重鎖も検出可能なサイトカイン上昇を誘導しないことから、その効果的な細胞内送達を必要とした(図11A、11C、および11D)。顕著なことには、特定のsiRNA、例えば乳癌関連BP1タンパク質(例えば、Fu et al., Breast Cancer Res. 5, 82-87 (2003)を参照のことを標的するように設計された二重鎖、またはその非標的化配列対照による処理では、封入形態で投与した場合でさえも、マウスにおいてサイトカイン応答をほとんど誘導しなかった(図11Aおよび11D)。これらの合成siRNA二重鎖は同様の化学的性質を有するため、この知見から、siRNA二重鎖の免疫賦活活性がそのヌクレオチド配列に依存することが示唆される。

実施例11：GUリッチモチーフによって調節されるsirnaの免疫刺激活性
はっきりと定義はされていないものの、ssRNAオリゴヌクレオチド内のポリUまたはUおよびGリッチモチーフはその免疫賦活効果に寄与すると見なされている(例えば、Heil et al., Science 303, 1526-1529 (2004)、およびDiebold et al., Science 303, 1529-1531 (2004)を参照されたい)。本発明者らのインビボおよびインビトロ研究から、siRNAの免疫刺激活性がGUリッチモチーフによって調節されることが実証される。

本発明者らの研究で最初に使用した、図16に示す6種のsiRNA配列の解析から、高刺激性βgalおよび非標的化対照二重鎖が5'-UGUGU-3'内部モチーフを含むことが明らかになる。このGUリッチモチーフは低刺激性BP-1またはBP-1対照二重鎖中に存在しないため、本発明者らは、これがsiRNAの免疫賦活活性に寄与し得ると仮定した。この仮説について試験するため、βgal対照配列中の5'-UGUGU-3'モチーフを徐々に破壊する、またはBP-1対照配列中に同様のモチーフを徐々に導入する一塩基置換または二塩基置換を含むRNA二重鎖を設計した(図12A)。系列1；β-gal対照(高刺激性)、β-gal Mod1(一塩基置換)、およびβ-gal Mod2(二塩基置換)。系列2；BP1対照(低刺激性)、BP1 Mod1(一塩基置換)、およびBP1 Mod2(二塩基置換)。塩基置換を下線で示す。

インビボ
脂質に封入された配列修飾siRNA二重鎖(50μg)を、マウスに静脈内投与した。投与の6時間後に、マウス血清中のIFN-αおよびIL-6を評価した。β-gal siRNA配列中のUからCへの一塩基置換(β-gal Mod1)では、これらの二重鎖をマウスに注射した場合に、IFN-αおよび炎症性サイトカイン応答の両方がほぼ完全に消失した(図12B)。元の5'-UGUGU-3'モチーフをさらに破壊する第2のUからCへの塩基置換(βgal Mod2)は、全身性サイトカイン応答を完全に抑制した(図12B)。逆に、5'-UGU-3'モチーフを生じる、BP1対照配列中のGからUへの一塩基置換により、修飾RNA二重鎖は免疫賦活性となった(BP1 Mod1)。この活性は、5'-UGUGU-3'モチーフを完全に再構成する第2の塩基置換(BP1 Mod2)によりさらに増強された(図12B)。

インビトロ
配列を修飾したBP1およびβ-gal RNA二重鎖によるヒトPBMCの処理により、ヒト免疫細胞に対するこれらsiRNAの免疫賦活活性が、siRNA配列中の同様のモチーフの存在によって制御されることが実証された(図12Cおよび12D)。これらの知見から、ヒトおよびマウスの免疫細胞が、GUリッチ配列に基づく同様のsiRNA配列モチーフを広く認識し得るという主張が支持される。また、このsiRNA認識機構の特異性が、推定免疫賦活性モチーフ内の一塩基対置換によって破壊され得るのに十分なほど厳密であることが示される。

全身性炎症反応は、血液学的パラメータの撹乱を伴う場合が多い。これらの影響には白血球数および血小板数の一次的減少が含まれ得るが、その減少は末梢血からのこれら細胞の辺縁趨向に起因する。β-galおよび他の免疫賦活性siRNAでマウスを静脈内処理すると、末梢血からの白血球の選択的消失に起因し得る、血小板および白血球の急速な減少が起こった(図12E)。この反応は一過性であり；血球数は、siRNA投与の72時間以内に基礎レベルにまで回復した。これらの毒性の程度は、それぞれのsiRNA二重鎖よって誘導されるサイトカイン放出の程度と相関した。最小のサイトカイン放出を誘導する配列修飾β-gal RNA二重鎖で処理した場合には、血小板数にも白血球数にもほとんど影響はなかった(図12DおよびE)。BP-1系列の修飾siRNAを用いても、質的に同様の結果が得られた(図12Cおよび12F)。これらの知見から、非刺激性配列を有する合成siRNAを使用することで、その全身投与に伴う潜在的毒性が軽減され得ることが実証される。

図12Cおよび12Dは、同様の配列モチーフがヒト細胞に対する免疫刺激活性を制御することを実証するデータを例証する。(c) 封入された配列修飾BP1または(d) β-gal siRNAと共に一晩培養した後の、ヒトPBMCからのIFN-α誘導。値は三つ組培養物の平均値 + SDであり、2回の別個の実験の代表例である。図12Dは、免疫賦活性siRNAの投与に伴って末梢白血球数および血小板数が減少し、これがRNA配列の修飾によって軽減されることを実証するデータを例証する。マウスを封入siRNA 50μgで処理し、投与の48時間後にその末梢WBC数および血小板数を記録した。免疫賦活性β-gal siRNAによって、血小板数およびWBC数の両方で実質的な減少が生じた。これらの影響は、β-gal Mod1およびMod2配列中の選択的塩基置換によって軽減された。

実施例12：脂質封入siRNAのインビトロ特性
ホタルルシフェラーゼを安定して発現するマウスNeuro2a細胞を、脂質小胞中に封入されたルシフェラーゼsiRNAまたは非標的化対照siRNAで処理した。siRNA配列を図16に提供する。siRNAはすべて、各鎖上に3'-UUオーバーハングを付加して合成した。免疫賦活性GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)を下線で示す。siRNAのリポソーム封入は、上記の実施例1に記載した通りに行った。培養48時間後のルシフェラーゼ発現を、培地のみの対照培養物の割合として表す。値は三つ組培養物の平均値 + SDである。結果を図13に示すが、この結果から、脂質封入siRNAがインビトロでのRNAiの媒介において効果的であることが実証される。

実施例13：炎症性サイトカイン応答を誘導する脂質複合化siRNAおよびポリカチオン複合化siRNA
インビトロ実験から、脂質複合化siRNAおよびポリカチオン複合化siRNAがいずれも免疫賦活性であることが実証される。

脂質複合化siRNA
ヒトPBMC、単球、または単球枯渇PBMC画分を、Oligofectamine複合化β-gal siRNAと共に一晩培養した。培養上清中の炎症性サイトカイン、IL-6およびTNF-αを測定した。図14Aは、TNF-αレベルを示すデータを例証する。図14Bは、IL-6レベルを示すデータを例証する。値は三つ組培養物の平均値 +/- SDである。別個の実験において、比較的高用量の脂質複合化siRNAは、精製単球からIL-6およびTNF-α産生を誘導し得た。図14Aおよび14Bは、新たに単離された単球が高用量の脂質複合化siRNAにより刺激を受けて、炎症性サイトカインを産生し得ることを実証するデータを例証する。

ポリカチオン複合化siRNA
ポリカチオンであるポリエチレンイミンまたはポリ-L-リジンと複合化したsiRNAもまた、ヒトPBMCからの強力なサイトカイン応答を活性化する。実施例1に記載する通りに、β-gal 728またはβ-gal対照siRNAを10 kDaポリエチレンイミン(PEI)またはポリ-L-リジン(PLL)と混合して、ポリプレックスを形成した。ヒトPBMCを、3μg/mL siRNAのポリプレックスまたは同等の濃度のポリカチオンのみで刺激した。24時間後に、培養上清中のIFN-α、IL-6、およびTNF-αを測定した。値は三つ組培養物の平均値 + SDである。データはすべて、少なくとも3回行った別個の実験の代表例である。図14Cは、新たに単離された単球が高用量のポリカチオン複合化siRNAにより刺激を受けて、炎症性サイトカインを産生し得ることを実証するデータを例証する。

実施例14：全身毒性を改善するsiRNAの配列修飾
全身性炎症反応は、血液学的パラメータの撹乱を伴う場合が多い。これらの影響には白血球数および血小板数の一次的減少が含まれ得るが、その減少は末梢血からのこれら細胞の辺縁趨向に起因する。β galおよび他の免疫賦活性siRNAでマウスを静脈内処理すると、末梢血からの白血球の選択的消失に起因し得る、血小板および白血球の急速な減少が起こった(図12E)。この反応は一過性であり；血球数は、siRNA投与の72時間以内に基礎レベルにまで回復した。高いsiRNA用量(5〜10 mg/kg；単回投与)において、体重減少、せむし姿勢、および立毛をはじめとする、より明らかな毒性が認められた。これらの毒性は封入siRNAに依存し、その程度はそれぞれのsiRNA二重鎖によって誘導されるサイトカイン放出の程度と相関した。最小のサイトカイン放出を誘導する配列修飾β-gal RNA二重鎖で処理した場合には、血小板数にも白血球数にもほとんど影響はなく(図12Dおよび12E)、動物の全身状態にも明らかな影響はなかった。BP-1系列の修飾siRNAを用いても、質的に同様の結果が得られた(図12F)。これらの知見から、非刺激性配列を有する合成siRNAを使用することで、その全身投与に伴う潜在的毒性が軽減され得ることが実証される。

実施例15：ssRNAなどの混入物に起因しないsiRNAの免疫賦活活性
siRNA二重鎖の免疫賦活活性がssRNAなどの混入物に起因しないことを確認するため、siRNA二重鎖をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製、ならびにPAGE精製およびその後のRNAse処理に供した。このようにして精製および処理したsiRNAをインビトロでヒトPBMCと共に培養するか、またはインビボでマウスに投与し、免疫賦活特性の保持を確認した。

PAGE精製したβ-gal対照siRNA二重鎖またはその構成成分であるセンスおよびアンチセンスssRNAオリゴヌクレオチドを、ssRNAを選択的に分解させるために、高塩濃度緩衝液中で0.5μg/mL RNase Aで10分間処理した(300 mM NaCl中の2 mg/mL RNA)。RNase A処理前および処理後のRNA試料を20％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動して(500 ng/レーン)、ssRNAの選択的分解を確認した。

β-gal対照二重鎖、GUリッチセンスssRNA、および相補的なアンチセンスssRNAを、高塩濃度緩衝液中でRNase Aで5分間または15分間消化した(300 mM NaCl中の2 mg/mL RNA)。次いで、RNAを10 kDa PEIで複合化した。200 nM RNAをヒトPBMC培養物に添加し、一晩培養した後にIFN-α誘導についてアッセイした。図15Bは、GUリッチセンスssRNAが、RNase A処理後に検出可能なIFN-αを誘導しないこと、およびRNase A処理が、siRNA二重鎖によるIFN-αの誘導に対して、未処理試料と比較して最小限の効果しか及ぼさないことを実証するデータを例証する。値は三つ組培養物の平均値 + SDである。データは、3回の別個の実験の代表例である。

図15Aは、siRNA二重鎖のPAGE精製が、その免疫賦活活性に影響を及ぼさないことを実証するデータを例証する。リポソーム中に封入した標準的なまたはPAGE精製したルシフェラーゼsiRNA 50μgで、マウスを静脈内処理した。6時間後に、血清IFN-αおよびIL-6を測定した。siRNA二重鎖のPAGE精製は、Dharmacon(コロラド州、ラファイエット)により行われた。値は平均値 + SDである(n = マウス4匹)。

実施例16：エンドソーム酸性化を必要とするsiRNAによるpDCの刺激
ヒトおよびマウスpDCは、それぞれTLR9およびTLR7の選択的発現に起因して、CpG DNA(例えば、Hornung et al., J. Immunol. 168, 4531-4537 (2002)；Kadowaki et al., J. Exp. Med. 194, 863-869 (2001)；およびAsselin-Paturel et al., J. Immunol. 171, 6466-6477 (2003)を参照されたい)およびssRNA(例えば、Diebold et al., 2004、前記、およびHeil et al., Science 303, 1526-1529 (2004)を参照されたい)に応答したIFN-αの主な産生細胞として同定されている。磁気ビーズ分離を用いた細胞分画研究から、BDCA4+ pDC(例えば、Dzionek et al., J. Immunol. 165, 6037-6046 (2000)、およびJego et al., Immunity 19, 225-234 (2003)を参照されたい)が、脂質封入siRNAへのIFN-α応答に関与する主なヒトPBMC細胞種であることが明らかになった(図9)。一方、精製CD14+単球は、刺激性siRNAと共に培養した場合にIFN-αをほとんど産生せず、単球枯渇PBMCは応答する全能力を保持した(図9)。別の実験では、比較的高濃度の脂質複合化siRNAが、精製単球からIL-6およびTNF-α産生を誘導し得た(図14)。封入siRNAまたは複合化siRNAに対する免疫応答におけるこれらの偏りは、荷電したsiRNA複合体および中性リポソームがいかにしてインビトロで細胞内に取り込まれるかの相違、ならびにsiRNAがその後提示される状況の相違を反映し得る。

TLRによる核酸の認識は典型的に、細胞のエンドソーム/リソソーム区画内で起こる。このことは、それぞれのリガンド；dsRNA、ssRNA、およびCpG DNAによるTLR3(例えば、Matsumoto et al,, J. Immunol. 171, 3154-3162 (2003)を参照されたい)、TLR-7/8(例えば、Diebold et al., Science 303, 1529-1531 (2004)；Lund et al., PNAS USA 101, 5598-5603 (2004)；およびHeil, F. et al., Eur. J. Immunol. 33, 2987-2997 (2003)を参照されたい)、およびTLR9(例えば、Ahamad-Nejad et al., Eur. J. Immunol. 32, 1958-1968 (2002)、およびLatz et al., Nature Immunol. 5, 190-198 (2004)を参照されたい)の刺激に関して実証されている。エンドソームTLRシグナル伝達は、エンドソーム酸性化を阻害するように作用するリソソーム変性剤クロロキンによって阻止され得る(例えば、Yi et al., J. Immunol. 160, 4755-4761 (1998)、およびHacker et al., Embo J. 17, 6230-6240 (1998)を参照されたい)。クロロキンは、用量依存的様式で、ヒトPBMCからのIFN-αおよびIL-6のsiRNA媒介性放出を阻害した(図4Aおよび4B)。クロロキンに対するこの感受性の程度(IC90 約2μM)は、明確な核酸に基づくTLRリガンドを用いた他の研究と一致し(例えば、Diebold et al., Science 303, 1529-1531 (2004)；Latz et al., 2004、前記；およびLeadbetter et al., Nature 416, 603-607 (2002)を参照されたい)、合成siRNAもまたエンドソームに局在するTLRによって認識され得ることが示唆される。

実施例17：配列依存的様式でRAW 264細胞からの炎症性サイトカイン放出を刺激する脂質封入siRNA
インビボにおけるsiRNAに対するサイトカイン応答が、複数の細胞種の活性化を反映するものであって、pDCによるIFN-α産生が顕著ではあるが独占的ではない役割を担うことを確認するため、マウス単球細胞株RAW 264を用いた研究を行った。RAW 264細胞は、機能的なTLR7をはじめとする一連の免疫受容体を発現する。RAW 264細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、一晩接着させ、次いで脂質封入β-gal 728 siRNA、β-gal 2891 siRNA、または空のリポソームで48時間処理した。培養上清中のTNF-αについてアッセイした。値は三つ組培養物の平均値 +/- SDである。データは、3回の別個の実験の代表例である。結果から、siRNAに対するサイトカイン応答がpDC細胞に限定されないことが実証されるが、この結果を図18に示す。

実施例18：RNAi活性を有する非刺激性siRNAの合理的設計
本発明者らの知見を機能的、非免疫賦活性siRNAの開発に適用できることを実証するため、GUGUまたはポリUモチーフを回避した、β-galを標的する一連の新規なsiRNA配列を設計した(図17A)。これらの新規siRNAの免疫賦活活性は、最初の実験で使用したβ-gal 728二重鎖と比較して顕著に減少した。ヒトPBMC培養物における脂質封入β-gal 478 siRNAによるIFN-α誘導は約10倍減少し、β-gal 924および2891二重鎖は、高濃度でさえも検出可能なIFN-α応答を誘導しなかった(図17B)。静脈内投与後のマウスにおいても、サイトカイン誘導レベルの同様の減少が認められた。これらの新規β-gal siRNAは、機能的なRNAi活性を有した。脂質封入β-gal 478 siRNAおよびβ-gal 728 siRNAは、安定にトランスフェクションしたNeuro2a(図17Cおよび17D)およびCT-26細胞株において、β-galタンパク質発現の阻害の点で同様に効果的であった。これと比較して、β-gal 924 siRNAおよびβ-gal 2891 siRNAでは、高い核酸濃度においてある程度の標的ノックダウンは達成されるものの、RNAiの媒介において効力は低かった(図17C)。

非標的化配列対照二重鎖は、免疫系におけるサイトカイン応答の強力な誘導にもかかわらず、これらのインビトロ研究で使用した神経芽細胞腫(図17Cおよび17D)または癌腫細胞株においてβ-gal発現に影響を及ぼさなかった。

図17は、RNAiの媒介において活性があり、かつ先天性免疫応答を活性化する能力が最低限であるsiRNAを設計できることを実証するデータを例証する。図17Aは、推定免疫賦活性モチーフを欠く、β-galを標的化するように設計されたsiRNA配列(コドン開始部位、478、924、および2891)を示す。図17Bは、新規β-gal siRNAの免疫賦活活性を示すデータを例証する。脂質封入したβgal 728、481、478、924、または2891 siRNA二重鎖と共に一晩培養したヒトPBMCからのインターフェロン-α誘導。値は、それぞれの核酸濃度でのプールした三つ組培養物による。データは、2回の別個の実験の代表例である。図17Cは、新規β-gal標的化siRNAによるβ-gal活性の阻害を示すデータを例証する。β-galタンパク質を安定して発現するNeuro2a-LacZ細胞を、脂質封入したβ-gal siRNAまたは非標的化対照siRNAと共に48時間培養した。細胞溶解物中のβ-gal酵素活性をアッセイし、培地のみの対照培養物の割合として表した。nd = β-gal活性検出不可。値は三つ組培養物の平均値 +/- SDを表す。データは、3回の別個の実験の代表例である。図17Dは、GUリッチβ-gal標的化siRNAによるβ-gal活性の阻害を示すデータを例証する。脂質に封入したβ-gal siRNAまたは非標的化β-gal対照sirRNA(100 nM)を、それぞれ2534 +/- 334および1030 +/- 118 mU β-gal/mgタンパク質を発現するNeuro2a LacZクローン1またはクローン3細胞と共に48時間培養した。細胞溶解物中のβ-gal酵素活性をアッセイし、培地のみの対照培養物の割合として表した。nd = β-gal活性検出不可。値は三つ組培養物の平均値 +/- SDを表す。データは、3回の別個の実験の代表例である。

これらの知見から、推定免疫賦活性モチーフを欠くmRNA標的配列を選択することで、強力なRNAi活性および最小限の免疫系刺激を有するsiRNA二重鎖が作製され得ることが実証される。本発明者らは、siRNAのそのようなスクリーニングおよび解析が、インビボおよび治療用途のためにsiRNAを開発する際の重要な選択基準になることを示唆する。

本発明者らは、先天性免疫系の細胞への合成siRNAの細胞内送達によって誘発される免疫刺激の強力な機構を同定した。siRNA分子に対するこの応答は、炎症性サイトカインの放出およびI型インターフェロンの高レベル産生をもたらす。顕著なことには、高刺激性siRNAは、標的タンパク質の効果的なノックダウンを達成するためにRNAi研究において日常的に用いられる濃度で、インビトロにおいて新たに単離されたヒトPBMCを(<0.1μg/mL；約7.5 nM)、およびインビボにおいてマウス免疫系を(<1μg；約0.05mg/kg)活性化することが認められた。これらの知見は、炎症反応およびサイトカインの誘導に関連した、標的遺伝子からはずれた影響および毒性の可能性を背景として、インビボ用のsiRNAの開発する上で重要な意義を有する。

ウイルス感染の顕著な特徴として、dsRNAは、TLR3依存的機構(例えば、Alexopoulou et al., Nature 413, 732-738 (2001)を参照されたい)、PKR依存的機構(例えば、Saunders and Barber FASEB J. 17, 961-983 (2003)を参照されたい)、およびこれまでに明らかにされたその他のTLR依存的機構(例えば、Diebold et al., Nature 424, 324-328 (2003)；Hoebe et al., Nat. Immunol. 4, 1223-1229 (2003)；およびAkira and Takeda, Nature Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004)を参照されたい)をはじめとするいくつかの宿主防御機構を活性化し得る。最近の証拠から、特に高い核酸濃度において、合成およびベクター由来siRNA分子が、インビトロでPKR(例えば、Sledz et al., Nature Cell Biol. 5, 834-839 (2003)；Bridge et al., Nature genetics 34, 263-264 (2003)；およびKim et al., Nat. Biotechnol. 22, 321-325 (2004)を参照されたい)またはTLR3媒介性経路(例えば参照されたい(例えば、Kariko et al., J. Immunol. 172, 6545-6549 (2004)を参照されたい)を活性化する可能性を有することが示唆される。しかし、これらの経路の活性化は、RNAの特定のヌクレオチド配列に依存すると見なされていない。このことは、siRNA二重鎖のヌクレオチド配列に厳密に依存し、比較的低用量の核酸によって誘発され得る、本発明者らの研究における合成siRNAによって誘発される免疫応答とは著しく対照的である。

本発明者らは、選択的塩基置換により、siRNA二重鎖内の推定免疫賦活性配列を明確にした。これらは、β-gal 728、β-gal対照、およびBP1 Mod2 RNA二重鎖中に同定された5'-UGUGU-3'モチーフによって例証されるGおよびUリッチ領域に基づく。このモチーフを破壊する一塩基置換(β-gal Mod 1 RNA）により、顕著に低い免疫賦活能を有する二重鎖が得られ、siRNAを取り込む免疫細胞の活性化におけるこのモチーフの役割が強調される。一塩基置換によって非免疫賦活性BP-1対照siRNAを修飾した結果から(図12を参照のこと)、単一のGUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'モチーフ)をsiRNA内に含めることで、二重鎖を免疫賦活性にするのに十分であり得ることが示唆される。中程度のサイトカイン産生を誘導する2つのLuc siRNA配列もまた、5'-UGU-3'モチーフを含むことに留意されたい(図16)。mRNA標的配列が19塩基のうち16塩基が重複している(図17A、図16)β-gal 478とβ-gal 481を比較することにより(図17B)、siRNAの免疫賦活活性に及ぼす比較的軽微な配列修飾の影響がさらに実証される。得られたsiRNA配列は3つの末端塩基対が異なるにすぎないが、β-gal 481はβ-gal 478よりも顕著に強力なサイトカイン誘導物質である。本発明者らは、ポリU RNA種が免疫賦活性であり得るという以前の知見に基づいて(例えば、Diebold et al., Science 303, 1529-1531 (2004)を参照されたい)、この相違がβ-gal 481二重鎖へのUリッチ3'末端の導入に起因すると推測する。

総合すると、慣用的に設計された合成siRNAでは、siRNA中に免疫賦活性配列モチーフが比較的高い頻度で存在する可能性が高いことが、本発明者らの知見によって示唆される。このことは、16のRNA二重鎖について本明細書で報告したデータ、および多様な標的に対する20を超えるさらなるsiRNAの本発明者らの解析により支持され、その解析では、siRNAによるある程度の免疫活性化は、特に高い核酸濃度においては例外的ではなくむしろ標準的なことである。本発明者らはこれらの研究において、RNAiの媒介において活性があり、かつ先天性免疫応答を活性化する能力が最低限であるかまたは検出不可能であるsiRNA二重鎖の設計が、標的配列の選択に基づいて実現可能であることを実証した。

合成siRNAによって誘導される免疫応答の性質は、核酸のTLR媒介性認識に付随する特徴の多くを共有する。これらには、エンドソーム酸性化の必要性(Diebold et al., Science 303, 1529-1531 (2004)；Lund et al., PNAS USA 101, 5598-5603 (2004)；Yi et al., J. Immunol. 160, 4755-4761 (1998)；およびHacker et al., Embo J. 17, 6230-6240 (1998)を参照されたい)および高レベルのIFN-αを産生するためのpDCの速やかな活性化が含まれる。ヒトおよびマウスpDCは、TLR9およびTLR7の選択的発現に起因して、CpG DNA(例えば、Hornung, et al., J. Immunol. 168, 4531-4537 (2002)；Kadowaki et al., J. Exp. Med. 194, 863-869 (2001)；およびAsselin-Paturel et al., J. Immunol. 171, 6466-6477 (2003)を参照されたい)およびssRNA(例えば、Heil et al., Science 303, 1526-1529 (2004)；Diebold et al., Science 303, 1529-1531 (2004)；およびLund et al., PNAS USA 101, 5598-5603 (2004)を参照されたい)に応答したIFN-αの主な産生細胞として同定されている。ssRNAはまた、TLR8を介してヒト免疫細胞を活性化することが実証されているが(例えば、Heil et al., Science 303, 1526- 1529 (2004)を参照されたい)、この受容体はヒトpDCによって構成的に発現されていないと考えられている(例えば、Hornung, et al., J. Immunol. 168, 4531-4537 (2002)、およびKadowaki et al., J. Exp. Med. 194, 863-869 (2001)を参照されたい)。siRNAに対する免疫応答の特徴および配列必要性における広範な類似性を考えて、本発明者らは、ssRNAオリゴヌクレオチドと同様にsiRNAなどの二本鎖RNA分子もまた、エンドソーム区画内のTLR7のリガンドであり得ると仮定する。このシナリオは、一本鎖および二本鎖DNA状況におけるCpGモチーフのTLR9による認識(例えば、Krieg, Annu. Rev. Immunol. 20, 709-760 (2002)を参照されたい)に類似している。先天性免疫系によるsiRNA認識の分子基盤を確認することは、siRNA二重鎖の修飾によりこのような応答をいかにして制御し得るかをさらに理解する上で非常に有益である。

インビボ適用にsiRNAを利用する場合には、合成siRNA二重鎖が免疫賦活性である可能性を考慮しなければならない。本発明者らがsiRNA内の推定免疫賦活性配列モチーフを同定したことで、先天性免疫応答の活性化を回避し、ひいては適切でない影響および免疫毒性の可能性を最小限に抑えた合成siRNAの合理的設計の基礎が提供される。そのような応答を制御できるとすれば、siRNAの刺激特性を治療的に利用し得ることもまた想定され得り、例えば抗ウイルス適応症では、インターフェロンの局所的誘導と併用したsiRNA媒介性ウイルス抑制が有益であると考えられる。

このように、これらのデータから、siRNA分子が先天性免疫の強力な活性化物質であり得ることが実証される。siRNA媒介性免疫刺激の機構は完全には解明されていないが、本明細書に記載した実験によりToll様受容体と関係づけられる。これらの知見は、新規な治療アプローチとしてのRNAiの臨床開発、およびsiRNAを用いた特定の遺伝子サイレンシング効果の解釈において大きな意義を有する。

上記の記載は説明を意図するものであって、限定的ではないことが理解されるべきである。上記の記載を読むことで、多くの態様が当業者にとって明らかになると考えられる。したがって、本発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を参照して、そのような特許請求の範囲の権利が与えられる同等物の全範囲と共に決定されるべきである。特許出願、特許、PCT公開、およびアクセッション番号をはじめとするすべての論文および参考文献の開示は、すべての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

SNALP封入siRNAが血液循環時間の延長を示すことを実証するデータを例証する。 SNALP封入siRNAが特定の疾患部位を標的するように設計され得ることを実証するデータを例証する。図2Aは肝臓へのSNALPの標的化を実証するデータを例証し、図2Bは腫瘍へのSNALPの標的化を実証するデータを例証する。 siRNA二重鎖が、インビトロおよびインビボでI型インターフェロンおよび炎症性サイトカインの産生を刺激することを実証するデータを例証する。図3Aは、脂質封入siRNAがヒトPBMCにおいてIFN-α産生を誘導し、脂質複合化siRNAがヒトPBMCにおいてIL-6およびTNF-α産生を誘導することを実証するデータを例証する。図3Bは、脂質封入siRNAがマウスにおいてIFN-α産生を誘導することを実証するデータを例証する。図3Cは、脂質封入siRNAがマウスにおいてIL-6およびTNF-α産生を誘導することを実証するデータを例証する。図3Dは、マウスにおけるINF-α産生が用量依存的であることを実証するデータを例証する。図3Eは、ヒトPBMCにおけるIFN-α産生が用量依存的であることを実証するデータを例証する。 siRNAの免疫賦活特性がtoll様受容体媒介性免疫応答に特有であること、および樹状細胞が脂質封入siRNAへのIFN-α応答に関与する1つの細胞種であることを実証するデータを例証する。図4Aは、脂質封入siRNAに対するIFN-α応答がクロロキンによって阻害されることを実証するデータを例証する。図4Bは、脂質封入siRNAに対するIL-6応答がクロロキンによって阻害されることを実証するデータを例証する。図4Cは、樹状細胞が、脂質封入siRNAへのIFN-α応答に関与する主な細胞種であることを実証するデータを例証する siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。 siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。 siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。 siRNA二重鎖による免疫刺激が、GUリッチモチーフ(例えば、5'-UGU-3'および5'-UGUGU-3'モチーフ)によって誘導されることを実証するデータを例証する。血漿由来因子がインビトロにおいてsiRNAの免疫賦活効果を増強すること、およびsiRNAによるヒトPBMCの刺激もまたヌクレオチド配列に依存することを実証するデータを例証する。図9Aはβgal siRNA二重鎖の免疫賦活効果を示す。図9BはBP1 siRNA二重鎖の免疫賦活効果を示す。選択されたsiRNA分子の免疫賦活効果を測定するインビトロおよびインビボ実験によるデータを要約する表1である。全身投与したsiRNAによる、サイトカインの配列依存的誘導を実証するデータを例証する。図11Aは、ルシフェラーゼ(Luc)、β-ガラクトシダーゼ(β-gal)、BP1を標的する封入siRNA、または封入されたそれぞれの非標的化配列対照 siRNA 50μg(約2 mg/kg)をICRマウスに投与してから6時間後の血清IFN-αレベルを示す。空のリポソームまたは裸のβ-gal siRNAのみの注射では、検出可能なIFN-αは誘導されなかった。図11Bは、6時間の時点で血清IFN-αを測定する、封入β-gal 728 siRNAに対する用量反応を示す。図11Dは、脂質二重層中にDLinDMAを含むリポソーム中に封入されたβ-gal 728、β-gal 481、TetR 57、またはTetR対照siRNA 50μgを静脈内投与してから6時間後の血清IFN-αレベルを実証するデータを例証する。図11Dは、TNF-α、IL-6、およびIFN-γもまた刺激性siRNAによって誘導されることを実証するデータを例証する。 siRNAの免疫刺激活性がGUリッチモチーフによって制御されることを実証するデータを例証する。図12Aは、この実験系列で使用した修飾siRNA配列を記載する表2である。系列1；β-gal対照(高刺激性)、β-gal Mod1(一塩基置換)、およびβ-gal Mod2(二塩基置換)。系列2；BP1対照(低刺激性)、BP1 Mod1(一塩基置換)、およびBP1 Mod2(二塩基置換)。塩基置換を下線で示す。図12Bは、それぞれ5'-UGUGU-3'モチーフの導入および破壊により、siRNAの刺激性をより高くまたはより低くできることを実証するデータを例証する。図12Cは、GUリッチモチーフを取り込むように修飾したBP-1 siRNAが、増強された免疫刺激活性を有することを実証するデータを例証する。図12Dは、GUリッチモチーフを除去するように修飾したβ-gal siRNAが、減少した免疫刺激活性を有することを実証するデータを例証する。図12Eは、免疫賦活性siRNAの投与に伴って末梢白血球数および血小板数が減少し、これがRNA配列の修飾によって軽減されることを実証するデータを例証する。図12Fは、免疫賦活性修飾BP-1 siRNAの投与に伴って末梢白血球数および血小板数が減少することを実証するデータを例証する。脂質封入siRNAがインビトロでのRNAiの媒介において効果的であることを実証するデータを例証する。新たに単離された単球が脂質複合化siRNAまたはポリカチオン複合化siRNAにより刺激を受けて、炎症性サイトカインを産生し得ることを実証するデータを例証する。図14Aは、脂質-siRNA複合体に応答して産生されたTNF-αのレベルを示すデータを例証する。図14Bは、脂質-siRNA複合体に応答して産生されたIL-6のレベルを示すデータを例証する。図14Cは、ポリカチオン-siRNA複合体に応答して産生されたIFN-α、IL-6、およびTNF-αのレベルを示すデータを例証する siRNA二重鎖の免疫賦活活性が、ssRNAなどの混入物に起因しないことを実証するデータを例証する。図15Aは、siRNA二重鎖のPAGE精製がその免疫賦活活性に影響しないことを実証するデータを例証する。図15Bは、GUリッチセンスssRNAが、RNase A処理後に検出可能なIFN-αを誘導しないこと、およびRNase A処理が、siRNA二重鎖によるIFN-αの誘導に対して、未処理試料と比較して最小限の効果しか及ぼさないことを実証するデータを例証する。本明細書に記載した実験で使用した特定のsiRNA配列を記載する表3である。 RNAiの媒介において活性があり、かつ先天性免疫応答を活性化する能力が最低限であるsiRNAを設計できることを実証するデータを例証する。図17Aは、推定免疫賦活性モチーフを欠く、β-galを標的化するように設計されたsiRNA配列(コドン開始部位、478、924、および2891)を示す表4である。図17Bは、ヒトPBMCにおける、新規β-gal siRNAの免疫賦活活性を示すデータを例証する。図17Cは、Neuro 2A細胞における、新規β-gal標的化siRNAによるβ-gal活性の阻害を示すデータを例証する。図17Dは、Neuro 2A細胞における、GUリッチβ-gal標的化siRNAによるβ-gal活性の阻害を示すデータを例証する。インビボでのsiRNAに対するサイトカイン応答がpDC細胞に限定されないことを実証するデータを例証する。

Claims

標的配列に対する非免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む、約15〜約30ヌクレオチド長の二本鎖配列を含む修飾siRNAであって、ミスマッチモチーフは、標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA配列中の5'-GU-3'ジヌクレオチドに相当する5'-XX'-3'ジヌクレオチドからなり、式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される修飾siRNAであり；
非修飾siRNA配列よりも免疫原性が低く；かつ
標的配列の発現をサイレンシングし得る、修飾siRNA。
第2の非免疫賦活性ミスマッチモチーフをさらに含む、請求項1記載の修飾siRNA。
第3の非免疫賦活性ミスマッチモチーフをさらに含む、請求項2記載の修飾siRNA。
請求項1記載のsiRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
標的配列に対する免疫賦活性ミスマッチモチーフを含む、約15〜約30ヌクレオチド長の二本鎖配列を含む修飾siRNAであって、免疫賦活性ミスマッチモチーフは、標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA中の5'-XX'-3'ジヌクレオチドモチーフに相当する5'-GU-3'ジヌクレオチドからなり、式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される修飾siRNAであり；
非修飾siRNAよりも免疫原性が高く；かつ
標的配列の発現をサイレンシングし得る、修飾siRNA。
第2の免疫賦活性ミスマッチモチーフをさらに含む、請求項5記載のsiRNA。
第3の免疫賦活性ミスマッチモチーフをさらに含む、請求項6記載のsiRNA。
第1免疫賦活性ミスマッチモチーフおよび第2免疫賦活性ミスマッチモチーフが、5'-GUGU-3'モチーフを形成するように位置する、請求項6記載のsiRNA。
請求項5記載のsiRNAおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
請求項1記載のsiRNA；
陽イオン性脂質；
非陽イオン性脂質；および
粒子の凝集を阻害する複合脂質
を含む核酸脂質粒子。
核酸-脂質粒子中に存在しないsiRNAと比較してsiRNAが低い毒性を有する、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
陽イオン性脂質が、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチル塩化アンモニウム(DODAC)、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチル臭化アンモニウム(DDAB)、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTAP)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)、およびN,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
陽イオン性脂質がDLinDMAである、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
非陽イオン性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、およびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、コレステロール、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
非陽イオン性脂質がDSPCである、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
粒子の凝集を阻害する複合脂質がポリエチレングリコール(PEG)-脂質を含み、PEG-脂質が、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEG-リン脂質、PEG-セラミド、およびこれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
粒子の凝集を阻害する複合脂質がPEG-ジアルキルオキシプロピル(DAA)複合体を含む、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
PEG-DAA複合体が、PEG-ジラウリルオキシプロピル(C₁₂)、PEG-ジミリストイルオキシプロピル(C₁₄)、PEG-ジパルミチルオキシプロピル(C₁₆)、およびPEG-ジステアリルオキシプロピル(C₁₈)からなる群より選択されるメンバーである、請求項17記載の核酸-脂質粒子。
PEG-DAA複合体がPEG-ジミリストイルオキシプロピル(C₁₄)である、請求項17記載の核酸-脂質粒子。
陽イオン性脂質が、粒子中に存在する総脂質の約15％〜約35％を含む、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
非陽イオン性脂質が、粒子中に存在する総脂質の約15％〜約25％を含む、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
PEG-DAA複合体が、粒子中に存在する総脂質の約1％〜約10％を含む、請求項17記載の核酸-脂質粒子。
PEG-DAA複合体が、粒子中に存在する総脂質の約2％を含む、請求項17記載の核酸-脂質粒子。
コレステロールをさらに含む、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
コレステロールが、粒子中に存在する総脂質の約40％〜約60％を含む、請求項24記載の核酸-脂質粒子。
核酸が核酸-脂質粒子中に完全に封入されている、請求項10記載の核酸-脂質粒子。
請求項10記載の核酸-脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
請求項1記載の修飾siRNAの有効量を哺乳動物対象に投与する段階を含む、標的配列の発現をサイレンシングする方法。
siRNA；
陽イオン性脂質；
非陽イオン性脂質；および
粒子の凝集を阻害する複合脂質
を含む核酸脂質粒子中にsiRNAが存在する、請求項28記載の方法。
請求項5記載の修飾siRNAの有効量を哺乳動物対象に投与する段階を含む、標的配列の発現をサイレンシングする方法。
siRNA；
陽イオン性脂質；
非陽イオン性脂質；および
粒子の凝集を阻害する複合脂質
を含む核酸脂質粒子中にsiRNAが存在する、請求項30記載の方法。
以下の段階を含む、免疫賦活特性を有するsiRNAを同定および修飾する方法：
(a) 標的核酸配列を提供する段階；
(b) 標的配列に相補的であり、かつ少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを含むsiRNA配列を同定する段階であって、少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフの存在により免疫賦活性siRNAが同定される段階；
(c) 標的配列に対する非免疫賦活性ミスマッチモチーフで少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを置換することにより、siRNAを修飾する段階であって、非免疫賦活性ミスマッチモチーフは、非修飾siRNA配列中の少なくとも1つの5'-GU-3'ジヌクレオチドに相当する5'-XX'-3'ジヌクレオチドからなり、式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択され、それにより非修飾siRNA配列よりも免疫原性が低い修飾siRNAを作製する段階；および
(d) 応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階。
以下の段階をさらに含む、請求項32記載の方法：
(e) 応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、非修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階；および
(f) 段階(d)の免疫応答と段階(e)の免疫応答を比較する段階。
哺乳動物応答細胞が未処置の哺乳動物に由来する、請求項32記載の方法。
哺乳動物応答細胞が末梢血単核細胞である、請求項32記載の方法。
検出可能な免疫応答がサイトカインまたは増殖因子の産生を含む、請求項32記載の方法。
サイトカインまたは増殖因子が、TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-12、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項36記載の方法。
以下の段階を含む、非免疫賦活特性を有するsiRNAを同定および修飾する方法：
(a) 標的核酸配列を提供する段階；
(b) 標的配列に相補的であり、かつ5'-GU-3'モチーフを欠くsiRNA配列を同定する段階であって、5'-GU-3'モチーフの不在により非免疫賦活性siRNAが同定される段階；
(c) 標的配列に対する少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチモチーフを導入するように、siRNAを修飾する段階であって、少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチモチーフは、非修飾siRNA中の5'-XX'-3'ジヌクレオチドモチーフに相当する5'-GU-3'ジヌクレオチドからなり、式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択され、それにより非修飾siRNAよりも免疫原性が高い修飾siRNAを作製する段階；および
(d) 応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階。
以下の段階をさらに含む、請求項38記載の方法：
(e) 応答細胞が検出可能な免疫応答を生じるのに適した条件下で、非修飾siRNA配列を哺乳動物応答細胞と接触させる段階；および
(f) 段階(d)の免疫応答と段階(e)の免疫応答を比較する段階。
(a) 少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを含み、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNA配列を提供する段階；および
(b) 標的配列に対する非免疫賦活性ミスマッチモチーフで少なくとも1つの5'-GU-3'モチーフを置換するように、siRNAを修飾する段階であって、非免疫賦活性ミスマッチモチーフは、非修飾siRNA配列中の少なくとも1つの5'-GU-3'ジヌクレオチドに相当する5'-XX'-3'ジヌクレオチドからなり、式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される、段階；
を含み；
それによって、非修飾siRNA配列よりも免疫原性が低く、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAが作製される、
免疫賦活特性を有するsiRNAを修飾する方法。
(a) 5'-GU-3'モチーフを欠き、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る非修飾siRNAを提供する段階；および
(b) 標的配列に対する少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチモチーフを導入するように、siRNAを修飾する段階であって、少なくとも1つの免疫賦活性ミスマッチモチーフは、非修飾siRNA中の5'-XX'-3'ジヌクレオチドモチーフに相当する5'-GU-3'ジヌクレオチドからなり、式中、XおよびX'は、XがGである場合X'はUではなく、X'がUである場合XはGでないという条件で、A、U、C、およびGからなる群より独立して選択される、段階；
を含み；
それによって、非修飾siRNAよりも免疫原性が高く、かつ標的配列の発現をサイレンシングし得る修飾siRNAが作製される、
非免疫賦活特性を有するsiRNAを修飾する方法。
表1、表2、表3、または表4に記載の配列を含む、単離された核酸分子。