JP2731630B2 - 細胞増殖のオリゴヌクレオチドの変調 - Google Patents

細胞増殖のオリゴヌクレオチドの変調

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、細胞増殖に関連した蛋白質の合成または代
謝の変調（modulation）に応答した疾患状態の診断、試
験試薬、および治療に関する。特定すれば、本発明は、
増殖細胞中で合成される蛋白質群の生成を阻害するオリ
ゴヌクレオチドに関する。p120をコードするmRNAにハイ
ブリダイズするようにデザインされたオリゴヌクレオチ
ドは、この目的への到達を提供する。これらのオリゴヌ
クレオチドは、細胞増殖に関連した蛋白質の合成および
代謝の変調と関連していることが見いだされた。緩和お
よび治療効果がもたらされる。
政府の権利 本研究の一部は、ナショナルキャンサーインスティチ
ュート、ヒューマンサービス部門、HSPHSにより提供さ
れた、キャンサーリサーチセンター、grant PHS−10893
により支持されている。
発明の背景 悪性新生物は、良性腫瘍および正常細胞とは異なる特
徴を幾つか有する。これらの特徴は、非制御細胞増殖、
侵入（invasiveness）および転移を含む。悪性腫瘍は形
態的特徴、例えば、未分化細胞、分裂指数の増加、異常
な有糸分裂細胞、可変サイズおよび形態、細胞質に対す
る核の占有体積の増加、および大きな突起した仁によ
り、良性腫瘍または正常細胞と区別される。多くの研究
が、悪性細胞の生化学および遺伝学的特徴に焦点をしぼ
り、これらの形態的変化に必要なちがいを見いだす努力
がなされた。幾つかの研究は、過剰発現、変異、細胞の
促進性悪性形質転換の場合の、いわゆるオンコジーンの
同定に通じた。
細胞の増殖に影響する現在の薬剤は、非特異的細胞毒
性薬剤、例えば、DNAアルキル化剤、DNAのインターカレ
ーターまたはマイクロチューブル脱重合剤である。これ
らすべての薬剤は、重大な毒性を及ぼし、悪性腫瘍への
特異性に欠ける。即ち、悪性細胞の増殖を効果的に阻害
する分子に対する長年の要求が存在する。増殖関連蛋白
質をコードする核酸にハイブリダイズするようにデザイ
ンされたオリゴヌクレオチドは遺伝子発現、特にp120の
発現を選択的に阻害する新規なアプローチを示す。
発明の目的 本発明の主要な目的は、増殖中の細胞の核小体抗原の
合成および発現における摂動（preturbation）を通し
て、細胞の過剰増殖、例えば、悪性、炎症疾患および心
臓血管疾患による成分を有する疾患の治療を提供するこ
とである。
本発明のさらなる目的は、増殖関連蛋白質をコードす
る核酸の機能を阻害することができるオリゴヌクレオチ
ドおよび他の組成物を提供することである。
さらなる目的は、メカニズムにかかわらず、悪性細
胞、特にヒト乳癌細胞の増殖または分化を阻害するオリ
ゴヌクレオチドを提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的は、明細書の記載から
明らかとなる。
図面の簡単な説明 図１は、本発明による、オリゴヌクレオチドを用いた
細胞の処理条件のスクリーニングを示す。パネルＡは、
アンチセンスオリゴヌクレオチドである配列番号３
（◇）、配列番号５（△）、配列番号９（●）、プラス
DOTMAを４時間処理された血清不含培地中のHeLa細胞の
代表的成長曲線を示す。パネルＢは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドである配列番号３、配列番号５、配列番
号９にDOTMAを加えずに24時間処理された完全培地中のH
eLa細胞の代表的成長曲線を示す。パネルＣは、血清含
有培地（■）または血清不含培地（●）中で４時間、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号９）およびDO
TMAを処理したHeLa細胞、または血清不含培地中でアン
チセンスオリゴヌクレオチドなしにDOTMAを処理したHeL
a細胞（▲）の代表的成長曲線を示す。
図２は、腫瘍の阻害を示す、本発明による特定の好ま
しいオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。パネ
ルＡは、0.1μＭの配列番号14＋DOTMA（○）、0.1μＭ
の配列番号９＋DOTMA（●）、およびオリゴヌクレオチ
ドを含まずにDOTMAを含む対照（▲）の、HeLa（ヒト上
皮様頚部癌腫（human epithelioid cervix carcinom
a））への処理を示し、パネルＢは、0.1μＭの配列番号
14＋DOTMA（○）、0.1μＭの配列番号９＋DOTMA
（●）、および対照（▲）の、LOX（ヒトメラニン欠乏
性黒色腫）への処理を示し、そしてパネルＣは、0.1μ
Ｍおよび1.0μＭの配列番号14＋DOTMA（○）、0.1μＭ
および1.0μＭの配列番号９＋DOTMA（●）、および対照
（▲）の、SN12A1（ヒト腎臓細胞腫）セルラインへの処
理を示す。
図３は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号
９）（●）の細胞成長への阻害効果を、異なるヒト腫瘍
セルラインにおいて、DOTMAを含みオリゴヌクレオチド
を含まない対照（▲）と比較して示す。パネルＡは、血
清不含培地中で４時間、DOTMAの存在下でオリゴヌクレ
オチドを処理したLOX細胞を示す。パネルＢは、血清不
含培地中で４時間、DOTMAの存在下でオリゴヌクレオチ
ドを処理したHRCC（SN12A1）細胞を示す。
図４は、HeLa（●）およびLOX（▲）細胞に対するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの用量応答曲線を示す。
細胞の計数は対照の成長のパーセントに変換され、そし
て、処理後２日間にわたる細胞成長対照実験のすべての
データをオリゴヌクレオチド（配列番号９）濃度に対し
てプロットした。プロットの各データポイントは３−９
の実験を含む。
図５は、HeLa細胞（図5A）およびLOX細胞（図5B）に
対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号９）
の細胞成長阻害効果を示す。１回の処理（●）は、接種
後１日目の４時間であった。繰り返しの処理（○）は、
接種後１日目および３日目の４時間であった。対照
（▲）はDOTMAを含みオリゴヌクレオチドを含まなかっ
た。
図６は、アンチセンスである配列番号９（●）、ラン
ダムな配列番号15（配列番号９のヌクレオチド組成であ
るが配列はランダ化されている；□）および配列番号16
（配列番号９の相補的な配列を有する；○）およびDOTM
Aを含みオリゴヌクレオチドを含まない対照（▲）のHeL
a細胞への細胞成長阻害効果を比較している。細胞はDOT
MAと複合化されたオリゴヌクレオチドで４時間処理され
た。
図７は、ヌードマウス中のヒトLOXへのアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号９）の腫瘍成長阻害効果
を示す用量応答曲線を示す。１日目、３日目、および５
日目に、オリゴヌクレオチド配列番号９に加えて、DOTM
A処理した場合（●）およびDOTMA処理しなかった場合
（○）を示す。
発明の概要 本発明によれば、増殖関連蛋白質をコードする核酸の
全部または一部に特異的にハイブリダイズするようにデ
ザインされたオリゴヌクレオチドが提供される。このオ
リゴヌクレオチドは増殖関連蛋白質の生産を阻害するこ
とができる。
これらオリゴヌクレオチドの作用機構は知られていな
い。これらオリゴヌクレオチドはmRNAの機能を妨害する
作用を有するが、それは、mRNAの蛋白質への翻訳、mRNA
の細胞質への移動、DNAからのmRNAへの転写またはその
他のmRNAのすべての生物学的機能に必要なあらゆる活性
の何れかが影響される。すべてまたは一部の機能の実行
におけるRNAの機能の欠如は、正確に発現されるべきゲ
ノム制御蛋白質合成の一部の機能欠如をもたらすはずで
ある。蛋白質p120をコードする遺伝子が特にこのアプロ
ーチに有用であることが見い出された。p120の発現の阻
害は癌および炎症性疾患の治療に有用である。本発明の
オリゴヌクレオチドの作用機構は、mRNAの作用、即ち、
それ自身の発現またはそれでもなお標的細胞に毒性な定
義されていない作用機構の何れかの妨害に関与しない可
能性もある。
増殖関連蛋白質をコードする核酸にハイブリダイズす
ることができる、有効量のオリゴヌクレオチドを用いて
細胞の増殖を変調する方法が提供される。p120をコード
する核酸とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが
好ましい。約12から50の核酸サブユニットを有するよう
なオリゴヌクレオチドも好ましい。機構にかかわらず、
増殖を変調するために細胞をそのようなオリゴヌクレオ
チドに接触させることも意図される。
発明の詳細な説明 特定の仁蛋白質が高増殖性疾患、特に特定の癌に関与
していることが見いだされた。悪性細胞の仁の特徴であ
る多形性および高反応性は、正常細胞と悪性細胞の違い
を特定することを目的とする研究を促進した。悪性細胞
においてのみ発現される仁蛋白質を特定するための初期
の実験は、悪性細胞から単離された仁および正常細胞か
ら単離された仁抽出物と血清を予め吸着させたもので免
疫されたウサギを利用した［Busch et al.,Cancer Res.
34:2362−2367（1974）;Busch et al.,Proc.Soc.Exp.Bi
ol.Med,160:185−191（1979）;Davis etal.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,76:892−896（1979）;Busch et al.,Canc
er Res.,39:3024−3030（1979）］。これらの研究は、
広範囲のヒトの癌と反応し、正常なヒトの組織とは反応
しないウサギ血清の同定をもたらした。この種のアプロ
ーチの主な問題は、動物間の再現性、変化する力価およ
び抗体のポリクローナル性の点で、ウサギ抗体に関連し
た困難である。
ポリクローナルなウサギ血清を用いた初期の陽性の結
果に基づいて、腫瘍特異的仁蛋白質を精製および特定す
る努力がなされた。54,000から68,000の範囲の分子量を
有する蛋白質が、試験された正常組織において見いださ
れたラットあるいはヒトの腫瘍から精製された［Chan e
t al.,Transplant.Proc.,8:1955−1957（1981）;Chan e
t al.,Cancer Res.,40:3194−3201（1980）;Chan et a
l.,J.Cancer Res.Clin.Oncol.,103:7−16（1982）;Taka
hashi et al.,Cancer Res.Clin.Oncol.,105:67−75（19
83）］。悪性および正常組織から単離された仁蛋白質の
二次元電気泳動分析も、悪性細胞に特有のいくつかの蛋
白質を同定した［Spohn et al.Cancer Invest.3:307−3
20（1985）］。
ポリクローナル抗血清の再現性の欠如から、ヒト腫瘍
仁抗原に対するモノクローナル抗体が開発された。これ
らの研究は増殖細胞に関連するが正常な休止細胞からは
検出されないいくつかの蛋白質の同定をもらした。これ
らのモノクローナル抗体は、145kDa、40kDaおよび120kD
a蛋白質と反応することが証明された［Freeman et al.,
Cancer Res.,46:3593−3598（1986）;Chatterjee et a
l.,Cancer Res.,47:1123−1129（1987）;Freeman et a
l.,Cancer Res.,48:1244−1251（1988）］。これらの抗
原は、Matthews et al.,Nature,3009:374−376（1983）
により示されるとおり、G1期からＳ期の間にサイクリン
と同様の様式で発現されることが見いだされた。
120kDa仁抗原（p120）は、さまざまなヒト悪性腫瘍に
おいて検出されるがほとんどの正常組織においては検出
されない点で特に興味がある。さらなる研究により、p1
20陰性腫瘍の患者は良好な予後であり、p120陽性腫瘍の
患者は良好ではない陽性である点から、p120が乳癌の予
後のマーカーになりうることが示唆された［Freeman et
al.,Cancer Res.,51:1973−1978（1991）］。p120抗原
は細胞の増殖状態および仁の高反応性と明らかに関連し
ている。この結論の根拠は、腫瘍細胞へのp120の注射に
より該細胞の増殖速度が低下し、そして仁の緊密化が誘
導されたという発見に基づく［Freeman and Bondada.A
m.Assoc.Cancer Res.,31:261（1990）］。しかしなが
ら、Freeman et al.,Cancer Res.,48:1244−1251（198
8）により示されるとおり、p120は正常増殖細胞におい
ても少量同定される。
p120の多重オーバーラッピングcDNAクローンが単離さ
れ配列決定され、そしてゲノミックのDNA配列も決定さ
れた［Busch et al.,Cancer Res.,50:4830−4838（199
0）;Fonagy et al.,Cancer Commun.,1:243−245（198
9）;Larson et al.,Cancer Commun.,2:63−71（199
0）］。p120において４つの主要ドメイン、即ち、塩基
性アミノ末端ドメイン、続く酸性ドメイン、疎水性ドメ
イン、そしてプロリンおよびシステインが豊富なドメイ
ンが同定された。コンピューターデータベースによるサ
ーチからは、他の仁蛋白質にも共通な酸性ドメイン以外
には、p120と他の公知の蛋白質との間で顕著な相同性は
見つからなかった。p120の遺伝子は続いて12kBの長さで
あり、15のエクソンおよび14のイントロンからなること
が分かった［Larson et al.,Cancer Comm.,2:63−71（1
990）］。
増殖細胞におけるp120の機能は現在未知である。この
蛋白質は20から30nmのビーズ化合フィブリルのネットワ
ークに関連した仁マトリックスの成分として同定された
［Ochs et al.,Cancer Res.,48:6523−6529（198
8）］。p120に関して提案された役割はリボソーマルRNA
の転写、リボソーマルDNAの複製、または仁マトリック
スにおける構造的役割を含む。p120に対するモノクロー
ナル抗体のマイクロインジェクションにより例示される
とおり［Freeman and Bondada,Am.Assoc.Cancer Res.,3
1:261（1990）］、p120の発現の阻害は悪性細胞の増殖
を低下させるはずである。
仁蛋白質p120をコードする遺伝子の全部または一部に
対してアンチセンスな構築物が、ヒト乳癌細胞の培養に
おいて該細胞の成長を阻害することが見いだされた［Sa
ijo et al.,Cancer Letters.in press］。他の高増殖性
疾患も、仁蛋白質をコードする遺伝子に相補的にデザイ
ンされたオリゴヌクレオチドで同様に治療されると信じ
られる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くのヒトの疾
患の治療のための治療剤として極めて有望である。概念
において、酸素の活性部位またはリセプターのリガンド
結合部位に相互作用する分子をデザインするよりは、塩
基対によりRNA分子のような一次構造に相互作用する化
合物をデザインすることの方が容易である。オリゴヌク
レオチドは、ワトソン−クリック塩基対により規定され
るように、mRNA前駆体または成熟mRNAの何れかの相補的
配列に特異的に結合することにより、DNAから蛋白質へ
の遺伝情報の流れを阻害する。標的配列に特異的となる
アンチセンスオリゴヌクレオチドの特性も、異常なほど
に該ヌクレオチドを融通のきくものとする。アンチセン
スオリゴヌクレオチドは４つのモノマーユニットの長い
鎖であるから、それらはあらゆる標的RNA配列に関して
容易に合成される。莫大な最近の研究は、標的蛋白質を
研究するための生化学の道具としてのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの利用に向けられている［Rothenberg e
t al.,J.Natl.Cancer Inst.,81:1539−1544（1989）;Zo
n,G.,Pharmaceutical Res.,5:539−549（1988）］。オ
リゴヌクレオチド化学、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレ
オチドの合成、および細胞への取り込みが高いオリゴヌ
クレオチド類似体における最近の進歩により、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの治療剤の形態としての使用を
考慮することが現在可能である。
オリゴヌクレオチドは、先行技術のアプローチにおい
て遭遇した問題に対して意味のある解決を提供する。オ
リゴヌクレオチドは酵素の生成を選択的に阻害するよう
にデザインすることができ、そして非特異的機構、例え
ばフリーラジカルの除去（scavenging）または複数のリ
セプターへの結合等を避ける。酵素の機構またはリセプ
ター−リガンドの相互作用の完全な理解は、特定の阻害
剤のデザインに必要ない。
治療のための、細胞増殖の変調法が提供される。本発
明によりデザインされたオリゴヌクレオチドは選択され
た細胞に接触する。当業者であれば、最適な投与量、投
与方法論および繰り返し頻度を容易に決定することがで
きる。そのような治療は、通常、治癒するかまはた疾患
状態の軽減が達成されるまで続けられる。長期間の治療
はいくつかの疾患において適当である。
治療組成物の処方および続くそれらの投与は当業者の
範囲内であると信じられる。通常、治療には、そのよう
な治療が必要であると思われる患者に、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、薬学的に受容可能なキャリアーを、特定
の疾患の性質、重病度および患者が耐え得る条件に依存
して変更された量および期間で投与する。本発明の薬学
組成物は、局所投与または全身性投与の何れか所望の方
法、および投与される場所等に依存して多くの方法によ
り投与される。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔
内）、経口、または非経口、例えば静脈持続点滴、皮
下、腹腔または筋肉注射による。
局所投与のための処方は、軟膏、ローション、クリー
ム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末
を含む。慣用的薬学キャリアー、水、粉末または油性基
剤、増粘剤等は、必要または所要でありうる。コートさ
れたコンドーム等も有用である。
経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、水中の
懸濁液または溶液、または非水性媒体、カプセル、香粉
（sachets）、タブレットを含む。増粘剤、風味剤、希
釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は所望である。
非経口投与のための処方は、緩衝液、希釈剤およびた
の適切な添加物も含む滅菌水溶液を含む。
投与量は治療される条件の重病度および応答性に依存
するが、通常は一日１回以上の投与量で数日から数カ月
続くか、または治癒するかもしくは疾患状態の軽減が達
成されるまで続けられる。当業者であれば、最適な投与
量、投与方法論および繰り返し頻度を容易に決定するこ
とができる。
本発明は、高増殖性疾患であると思われる患者の組織
または他のサンプルにおける高増殖性状態の診断にも適
している。即ち、本発明のオリゴヌクレオチドが細胞増
殖を阻害する能力はそのような状態の診断に用いられ
る。多くのアッセイが本発明を採用して公式化され、そ
のような阻害を検出および、通常は定量するのに選択さ
れた条件下で本発明のオリゴヌクレオチドを組織サンプ
ルに接触させることを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドはリサーチの目的にも用
いられる。即ち、オリゴヌクレオチドにより示される特
異的ハイブリダイゼーションは、アッセイ、精製、細胞
生成物の生成のために、そして当業者に認識される他の
方法論において用いられる。
本発明は、増殖関連蛋白質をコードする核酸に特異的
にハイブリダイズすることができるようにデザインされ
たオリゴヌクレオチドを用いる。そのようなオリゴヌク
レオチドは、コードしている側の核酸に相補的なことか
ら「アンチセンス」と呼ばれる。本発明によれば、その
ようなオリゴヌクレオチドは、アンチセンスの方法論に
従ってmRNAに結合したりmRNAを阻害する必要はなく、仁
蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的な
ようにデザインされているだけでよい。
仁蛋白質p120のDNAの一部のアンチセンスとなるよう
にデザインされた特定のオリゴヌクレオチドが細胞の高
増殖性の阻害に特に有用であることが今わかった。多く
のそのようなオリゴヌクレオチドが幾つかの活性を有す
ることが見いだされたが、３′非翻訳領域に対するオリ
ゴヌクレオチドが特定の活性を有することが見いだされ
た。これらのうち、オリゴヌクレオチド配列： CACCCGCCTT GGCCTCCCAC （配列番号９）、または CACCCGCCTT GGCCTCCCAG （配列番号14） が、多くのヒトの癌の成長の阻害において高い活性を有
することが示された。
本発明によれば、有用であると信じられるオリゴヌク
レオチドは、仁蛋白質、特に高増殖性疾患に関連した蛋
白質のすべてまたは一部をコードする核酸に特異的にハ
イブリダイズ可能なようにデザインされたものである。
この蛋白質p120は特定の標的である。p120に関して、p1
20をコードするDNAの３′非翻訳領域を標的とすること
が特に有用であることが見いだされ、前記のようなオリ
ゴヌクレオチドが生じた。
オリゴヌクレオチドは前記の一つと同一である必要は
ない。オリゴヌクレオチドの効果的な部分が用いられれ
ば十分である。好ましいオリゴヌクレオチドは、12から
50ヌクレオチドのサブユニットを有するものであり、好
ましいオリゴヌクレオチドの全20のサブユニットを含む
必要はない。オリゴヌクレオチドの効果的な部分が含ま
れていれば十分である。したがって、例えば、25のサブ
ユニットを有し、そのうちの15が前記の配列と同一であ
るオリゴヌクレオチドは、本発明の特定の態様の実施に
おいて良好な利用性を有する。さらに、配列中のひとつ
以上のサブユニットの交換も、オリゴヌクレオチドの効
果的な部分が保持される限り、本発明の精神を離れない
ならば可能である。
本発明の意味において、単語「オリゴヌクレオチド」
は、天然に生じる塩基および天然のホスホジエステル結
合により接続されたフラノシル基から形成されるポリヌ
クレオチドを意味する。この単語は、天然に生じるサブ
ユニットまたはそれらの密接な類似体から形成される、
天然に生じる種または合成種を効果的に意味する。単語
「オリゴヌクレオチド」は、天然に生じるオリゴヌクレ
オチドと同様な機能を有するが非天然部分も有するモイ
エティも意味する。即ち、オリゴヌクレオチドは、変成
された糖モイエティまたは糖内部結合を有してよい。こ
れらの例は、ホスホロチオエートおよび当業界の使用に
おいて公知の他のイオウ含有種である。
特に好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドの少
なくとも幾つかのホスホジエステル結合は、変調される
活性を有するRNAが位置する場所で細胞の領域に侵入す
るための組成物の能力を高めるために機能する構造によ
り置換される。そのような置換はホスホロチオエート結
合、メチルホスホネート結合または短鎖のアルキルまた
はシクロアルキル構造からなることが好ましい。他の好
ましい態様によれば、ホスホジエステル結合は、同時に
実質的に非イオン性であり且つ非対掌性である他の構
造、または対掌性であり且つ鏡像特異性の構造で置換さ
れる。当業者であれば、本発明の実施における使用のた
めに他の結合を選択することができるであろう。
オリゴヌクレオチドは少なくとも幾つかの修飾塩基の
形態を含む種も含む。即ち、天然に通常見いだされる塩
基以外のプリンおよびピリジンも用いられる。同様に、
ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分上の修飾
も、本発明の必須の主義が固守される限り行われる。そ
のような修飾の例は、２′−Ｏ−アルキル−および２′
−ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明に有用
な、糖モイエティの２′位における修飾の幾つかの特定
例は、OH,SH,SCH3,F,OCH3,OCN,O（CH2）nNH2または（CH
2）nCH3（但し、ｎは１から約10）、および同様の特性
を有する他の置換基である。
そのようなオリゴヌクレオチドは天然のオリゴヌクレ
オチド（または、天然物と同様に合成されたオリゴヌク
レオチド）と機能的に交換可能なものであるが天然構造
とはひとつ以上異なるものとして特筆される。そのよう
なオリゴヌクレオチドのすべては、選択されたRNAにハ
イブリダイズするために効果的に機能する限り、本発明
により理解される。本発明によるオリゴヌクレオチド
は、約12から50の核酸塩基ユニットからなることが好ま
しい。そのようなオリゴヌクレオチドは約12から25の核
酸塩基ユニットからなることがより好ましい。認識され
るとおり、核酸塩基ユニットは、ホスホジエステル結合
または他の結合により隣接する核酸塩基ユニットに適切
に結合した、塩基−糖の組み合わせである。
本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、固
相合成の公知技術により慣用的かつ日常的に製造され
る。そのような合成のための装置は、Applied Biosyste
ms社を含むいくつかの業者により販売されている。その
ような合成のための他のあらゆる手段も用いられるが、
しかし、オリゴヌクレオチドの実際の合成は当業者には
よく知られている。他のオリゴヌクレオチド、例えばホ
スホロチオエートおよびアルキル化誘導体を製造するた
めの同様な技術の使用もよく知られている。
本発明によれば、当業者は、メッセンジャーRNAが、
３文字の遺伝子コードによる蛋白質コード情報のみなら
ず、５′非翻訳領域、３′非翻訳領域、５′キャップ領
域およびイントロン／エクソンのジャンクションのリボ
ヌクレオチドのような、当業者には知られている領域を
形成するリボヌクレオチドにも関連した情報も含むこと
は理解されるであろう。即ち、オリゴヌクレオチドは、
本発明により、これらの関連リボヌクレオチド並びに情
報を有するリボヌクレオチドの全部または一部を標的と
するように公式化される。好ましい態様においては、オ
リゴヌクレオチドは、転写開始部位、翻訳開始部位、
５′キャップ領域、イントロン／エクソンのジャンクシ
ョン、コーディング配列または５′あるいは３′非翻訳
領域中の配列に特異的にハイブリダイズすることができ
る。
本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、細胞の増殖
に関与する蛋白質をコードする核酸にハイブリダイズす
ることができる。特異的にハイブリダイズ可能な対応配
列またはその一部からなるオリゴヌクレオチドは本発明
に有用である。
本発明の幾つかの好ましい態様は以下の実施例におい
て例示される。変調のための標的mRNA種は、p120に関す
る。当業者は、本発明が実施例に限定されないものであ
り、一般的に適用されるものであることを認識するであ
ろう。p120の生成の阻害または変調は、疾患の治療にお
いて顕著な治療的利益を有すると期待される。
本発明は、以下の非限定的実施例によりさらに説明さ
れる。
実施例１ オリゴヌクレオチドおよび類似体の合成および特徴 未修飾のDNAオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホル
アミダイト化学を用いたヨードの酸化により、自動DNA
合成機（Applied Biosystems モデル 380B）により合
成された。β−シアノエチルジイソプロピルホスホルア
ミドは、Applied Biosystems（Foster City,CA）から購
入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに関し
ては、亜リン酸結合の段階的チオエート化（thiation）
のために、標準酸化ボトルを、アセトニトリル中のＨ−
1,2−ベンゾジチオール−３−オン 1,1−ジオキシドの
0.2M溶液で置き換えた。チオエート化のサイクル待機工
程（wait step）は、68秒に増加し、キャッピング工程
に続いた。２′−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドは、２′−Ｏ−メチル β−シアノエチル
ジイソプロピルホスホルアミダイト（Chemgenes,Needha
m MA）を用いて、未修飾オリゴヌクレオチドの標準サイ
クルにより合成したが、テトラゾルおよび塩基のパルス
送達後の待機工程を360秒に延長した。合成を開始する
ために使用された３′塩基は２′−デオキシリボヌクレ
オチドであった。制御されたポアガラスカラム（Applie
d Biosystems）からの分離および濃縮水酸化アンモニウ
ム中の55℃における18時間の脱ブロック後、0.5M NaCl
および2.5倍容のエタノールを用いて２回沈殿させるこ
とによりオリゴヌクレオチドを精製した。分析用ゲル電
気泳動は、20％アクリルアミド、8M尿素、45mM Tris−
硼酸緩衝液（pH7.0）中で実施した。オリゴデオキシヌ
クレオチドおよびそれらのホスホロチオエート類似体
は、完全鎖長の80％より長いものを電気泳動により判定
した。
この合成により得られたホスホロチオエートおよびホ
スホジエステル結合の相対量は、31P NMR分光分析法に
より定期的にチェックした。スペクトルは、酸化デュー
テリウムまたはジメチルスルフォキシド−d6を溶剤とし
て用いて周囲温度において得られた。ホスホロチオエー
トサンプルは、１パーセント未満のホスホジエステル結
合を典型的に含んだ。
オリゴヌクレオチド濃度の測定に関しては、OD260の
吸光を、式:OD＝Ｅ×Ｃ（式中、Ｅは全オリゴヌクレオ
チドのmM吸光定数であり、そしてＣはmM濃度である）を
用いたODユニットにより計算した［Sambrook,et al.,19
89 Molecular Cloning.ALaboratory Manual,Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,第２
版］。オリゴヌクレオチド溶液は、0.2μｍ酢酸セルロ
ース遠心分離用マイクロフィルターユニット（Centrex
Schleicher ＆ Schuell）を用いた濾過、および1500gに
おける10分間、４℃の遠心分離により滅菌した。オリゴ
デオキシヌクレオチドの濃度は、上記のとおり濾過後に
測定し、濃度を100μＭに調節して溶液を４℃に保っ
た。表１の配列を有するオリゴヌクレオチドを製造し
た。
実施例２ セルライン HeLa S3（ATCC CCL 2.2,ヒト上皮様頚部癌腫（human
epithelioid cervix carcinoma））細胞をDulbecco修
飾イーグル培地（Ｄ−MEM）（GIBCO BRL）中にサブカル
チャーしたが、該培地には10％胎子ウシ血清（FBS）（G
IBCO BRL）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン
の液体（0.85％塩溶液中の100,000IU/mlペニシリンＧナ
トリウム、10mg/ml硫酸ストレプトマイシン:GIBCO BR
L）を加えた。LOX（IMVI,ヒトメラニン欠乏性黒色腫）
細胞（Dr.D.J.Dykes（Southern Research Institute,Bi
rmingham,AL）により提供された）をRPMI1640培地（RPM
I）（GIBCO BRL）にサブカルチャーしたが、該培地には
10％FBSおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンの
液体を加えた。HRCC−SN12A1（ヒト腎臓細胞腫）細胞
（腎臓移植されたHRCC生産ヌードマウスの腹水細胞から
確立され、Dr.I.J.Fidler.M.D.（Anderson Cancer Cent
er,Houston,TX）により提供された）（Naito et al.,19
86）をイーグル最小必須培地（MEM）（GIBCO BRL）にサ
ブカルチャーしたが、該培地には10％FBS、ビタミン、
Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ
酸および１％ペニシリン−ストレプトマイシンの液体を
加えた。すべての細胞は、DNA染色の測定からマイコプ
ラズムに関して陰性であった［McGarrity,Methods in E
nzymology:Cell Culture,Vol 63,p23（Academic Pres
s,San Diego;1979）;Freshney,Culture of Animal Cell
s:A Manual of Basic Techniques（Wiley−Liss,NY;198
7）］。
実施例３ 細胞の処理 プレーティングから24時間後（６ウエルの細胞培養皿
中の１×105細胞）、単層に成長した細胞は、HeLa S3、
LOXおよびHRCC−SN12A1細胞各々について、血清を含ま
ないＤ−MEM、RPMIおよびMEM培地5mlでそれぞれ１回、
穏やかに洗浄した。10μg/mlカチオン性脂質を含む新鮮
な血清不含培地（DOTMA）［Chiang,et al.,J.Biol.Che
m.,266:18162（1991）;Bennett,et al.,J.Liposome Res
earch,in press（1992）］をオリゴヌクレオチドと混合
し、そして、給湿加温器に37℃において15分間プリイン
キュベートしてオリゴヌクレオチド−カチオン性脂質複
合体を形成させた。オリゴヌクレオチドの濃度は0.001
から10μＭの間であったが、ほとんどの実験において、
HeLa S3細胞に関しては0.1μＭ、LOX細胞に関しては0.0
3−0.05−0.1μＭ、そしてHRCC細胞に関しては0.1μＭ
の濃度が用いられた。給湿CO2加温器中で37℃において
４時間のインキュベート後（処理時間）、培地を、10％
FBSおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンの液体
を含む完全培地に代えた。細胞は、給湿CO2加温器中で3
7℃において７日間、培養した。
実施例４ 細胞成長の測定 細胞成長に対するオリゴヌクレオチドの効果は、位相
差（phase contrast）倒立顕微鏡（Nikon Diaphot,10×
対物、10×接眼、４×倍率エクステンダー、総倍率量:4
00×）を用いて、６ウエルのプレート中の付着細胞を計
数することにより測定した。ランダムに選択された10の
視野中の付着細胞を計数し（10−200細胞／視野）、そ
して補正因子［ｆ（６ウエル）＝6028、ｆ（24ウエル）
＝1258、ｆ（10cm皿）＝35,670］により平均細胞数を加
算することにより、全細胞数を計算した。細胞数の測定
は幾つかの実験において検定および標準化した。死んだ
富裕細胞（生存はコロニー形成により決定）は加算しな
かった。各ウエル中の細胞数は、処理前、処理直後、お
よび処理後５−７日間毎日測定した。
実施例５ p120の生成を阻害する能力に関するオリゴヌクレオチド
のスクリーニング オリゴヌクレオチドの効果を評価するために、アッセ
イを実施した。平行実験として、単層で対数成長するHe
La細胞を、p120配列のさまざまな領域にハイブリダイズ
するようにデザインされたアンチセンスオリゴヌクレオ
チドで処理した［Fonagy,et al.,Cancer Communication
s,1:243（1989）;Larson,et al.,Cancer Communication
s,2:63（1990）（表１）］。オリゴヌクレオチドは、カ
チオン性脂質（0.1μＭオリゴヌクレオチド＋血清不含
培地中の10μg/ml DOTMA）と４時間結合させるか（図1
A）、または血清不含培地中のみで用いた（図1B）。細
胞成長は、実施例４に記載されているとおりに監視し
た。プロット（シグマプロット）およびデータ分析（Ep
istat）に関しては、ソフトウエアーパッケージが用い
られた。
図1Aは、DOTMAおよび／またはオリゴヌクレオチド存
在下のHeLa細胞の、代表的な成長曲線を示す。細胞成長
の阻害が、幾つかのp120アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドにおいて見いだされた。ほとんど一致している最高の
細胞成長阻害は、配列番号９（図1A、●）を有するオリ
ゴヌクレオチドを用いたときに観察され、該オリゴヌク
レオチドを次の実験に用いた。処理直後は、細胞の剥離
または直接的な細胞の殺傷はなかったが、24−48時間後
に、細胞致死性効果が観察された。細胞成長阻害速度お
よび生存細胞率は、個々のオリゴヌクレオチドで異なっ
た（図1A）。細胞増殖抑制性または致死性効果は、0.1
−１μＭの濃度のオリゴヌクレオチドのみでは観察され
ず、カチオン性脂質（血清含有培地中で24時間）（図1
B）の不在下で、オリゴヌクレオチド処理細胞およびDOT
MAのみを処理した細胞の成長速度は同じであった。完全
培地（10％FBS）中のDOTMA介在オリゴヌクレオチド処理
後の細胞成長の阻害は、血清不含条件（図1C）に比較し
て極めて低かった。血清不含培地においては、DOTMA
は、配列番号９を有するオリゴヌクレオチドによる成長
阻害に必須であった。
幾つかの予備実験において、血清不含培地におけるDO
TMA介在オリゴヌクレオチド処理は最適であることが見
いだされた。10％ FBSを含有する完全培地において時
間を20または60時間に延長しても［Bennet,et al.,Mole
cular Pharmacology,inpress,およびBennet,et al.,J.L
iposome Research,in press（1992）］、さらなる効果
はなかった。したがって、細胞は、血清不含培地におい
て４時間、オリゴヌクレオチド−DOTMA複合体と共にイ
ンキュベートした。
配列番号９および14の２つのオリゴヌクレオチドは阻
害活性を有することが見いだされた。これらのオリゴヌ
クレオチドはp120の３′非翻訳領域に相補的にデザイン
されたものであり、実施例６においてさらに試験され
た。他のオリゴヌクレオチドもいくらかの活性を有する
ことが見いだされた（データは示さない）。
実施例６ 好ましい態様のオリゴヌクレオチドスクリーニング ヒト腫瘍細胞成長阻害のためのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドのスクリーニングは、配列番号９および14に
関して実施された。このデータを図２のパネルA,Bおよ
びＣに示す。パネルＡはHeLa（ヒト上皮様頚部癌腫）細
胞、パネルＢはLOX（ヒトメラニン欠乏性黒色腫）細胞
の結果を示す。パネルＣぱSN12A1（ヒト腎臓細胞腫）細
胞に関するデータを示す。すべての試験プロトコルは慣
用的であり、実施例４において記載されたプロトコルと
同様である。単層の対数成長ヒト腫瘍細胞は、0.1およ
び１μＭのオリゴヌクレオチド＋10μg/mlのDOTMA（リ
ポフェクチン試薬）で４時間処理した。顕著な細胞成長
阻害および0.5から1.5の対数細胞死滅（log cell kil
l）が観察され、特に配列番号９で処理後３−４日後に
観察された。好ましいオリゴヌクレオチドの各々は、各
パネルにおいて腫瘍の顕著な阻害を示した。DOTMAの使
用は、オリゴヌクレオチドに付随して用いた場合に有用
であるらしい。
第２セットの実験において、配列番号９を有するオリ
ゴヌクレオチドの、LOX（図3A）およびHRCC（図3B）細
胞への効果が分析された。この比較研究においては、処
理の２日後、配列番号９を有するオリゴヌクレオチド
は、それぞれLOX（Ａ）およびSN12A1細胞において1.2お
よび0.7の対数細胞死滅を生じた。SN12A1細胞に対する
最大の細胞致死性効果（1.3対数細胞死滅）は処理４日
後であった。すべての細胞種は処理の最下点において回
収した（図３）。HeLaおよびLOX細胞に関する細胞成長
阻害に対する、配列番号９を有するオリゴヌクレオチド
濃度の関係は図４に示す。IC50値はHeLaに関しては0.02
μＭであり、LOXに関しては0.01μＭであった（図
４）。
図５は、DOTMA存在下における配列番号９を有するア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの繰り返し処理の、HeLa
（図5A）およびLOX細胞（図5B）に対する効果を示す。
細胞は、接種１日後１回の４時間処理（●）、または１
日目および３日目に２回の４時間処理（○）を行った。
オリゴヌクレオチドの濃度は、HeLaに関して0.1μＭで
あり、LOXに関して0.05μＭであった。繰り返し処理はH
eLa細胞には効果があり、最下点後に細胞を回収した。L
OX細胞の繰り返し処理はHeLa細胞の場合よりも阻害し、
LOXに関して、１回の処理により1.4対数細胞死滅を生じ
た。繰り返し処理はほとんどのLOX細胞を殺傷し、８日
後には回復しなかった。
実施例７ オリゴヌクレオチドの比較 細胞成長へのオリゴヌクレオチドの相対的効果の分析
のために、前記配列番号２、３、４、５、６、７、９、
10、11、12および13の配列を有する、オリゴヌクレオチ
ドp120アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドホスホ
ロチオエートを、血清不含培地中の0.1−0.5μＭオリゴ
ヌクレオチドおよび10μg/ml DOTMAを４時間用いてスク
リーニングした。最初のスクリーニング後（データは示
さない）、さらなる研究のために選択されたオリゴヌク
レオチド：配列番号２、５、６および９は50％の細胞成
長阻害を示した（表１）。最大の細胞成長阻害効果（図
1A）は、配列番号９（87.6±11.3％；±SD、ｎ＝22実
験）および配列番号６（70.7±24.8％；±SD、ｎ＝12実
験）のオリゴヌクレオチドを用いた場合に見られた。配
列番号９のオリゴヌクレオチドの細胞成長阻害効果は、
配列番号６のオリゴヌクレオチドよりも顕著に大きかっ
た（Ｐ＜0.02）。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号９）のHe
La細胞への生物学的効果の特異性を確認するために、セ
ンスオリゴヌクレオチド（配列番号16:配列番号９のオ
リゴヌクレオチドに相補的）、またはランダム配列のオ
リゴヌクレオチド（配列番号15:ヌクレオチドの組成は
配列番号９と同じであるが配列がランダム化されてい
る）と比較した（表１、図６）。処理２日後、0.2logの
HeLa細胞死滅がランダムな配列番号15を用いて観察さ
れ、0.7logのHeLa細胞死滅が配列番号９のアンチセンス
オリゴヌクレオチドにおいて観察された。配列番号16の
センスオリゴヌクレオチドには阻害効果が観察されなか
った。
実施例８ p120アンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエー
トの薬理学 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ32P］ATPに
より、配列番号９のホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドを標識して、細胞取り込み、流出および安定性をDO
TMAの存在または不在下で分析した。細胞取り込みは処
理１時間後に平衡に達した。５−15倍以上の配列番号９
のオリゴヌクレオチドが、DOTMA不在の場合に比較し
て、DOTMAが存在していた場合に細胞に結合した。60％
のオリゴヌクレオチドがDOTMA存在下で処理４時間後に
核に局在し、処理20時間後に約50％が細胞内に残った。
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの安定性はホス
ホジエステルオリゴヌクレオチドよりもはるかに高かっ
た。10％血清含有培地中で24時間後に、わずか40％のホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドの分解しか見られ
なかった。50％以上のホスホジエステルオリゴヌクレオ
チドは１時間以内に分解された。DOTMAはアンチセンス
オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの活性を高め
た。
実施例９ ヌードマウスにおけるインビトロの研究 腹腔内（i.p.）に移植され、対数成長するLOX腹水腫
瘍細胞をヌードマウスから取り出し、洗浄し、そして血
清不含RPMI培地に懸濁した。全部で２×106のRPMI培地
0.5ml中の生細胞（トリパンブルー除去により測定）を
同型接合変異体、Hsd:胸腺欠損ヌードマウスのオスの腹
腔内に注射した（Sambrook et al.,1989）。処理は腫瘍
細胞の腹腔内注射１日後に開始し、DOTMA存在下でオリ
ゴヌクレオチドを１、３および５日後に腹腔内に投与し
た。腫瘍の成長は、毎日の動物の検査によった。対照お
よび処理動物の何れにも腹水腫瘍が観察されたら実験を
停止したが、通常は14日であった。すべての動物実験は
バイラー医科大学およびニューヨークアカデミーオブサ
イエンスのガイドラインに従った。
実施例10 配列番号９のオリゴヌクレオチドのインビボにおける腫
瘍成長阻害 配列番号９のアンチセンスオリゴヌクレオチドの腫瘍
成長阻害効果は、腹腔内注射されたLOX腫瘍細胞を用い
て研究された。図７は、処理１、３および５日後の用量
応答曲線を示すが、DOTMAを用いずに配列番号９のオリ
ゴヌクレオチドのみの場合（○）と、DOTMAと共に配列
番号９のオリゴヌクレオチドを用いた場合（●）とを示
す。PBSのみまたはPBS中のDOTMAのみ（１−10mg/kg体
重）を用いた場合には腫瘍成長阻害または他の毒性効果
は生じなかった。DOTMAと共に配列番号９のオリゴヌク
レオチドを用いた場合、0.65mg/kg体重で80％、および
6.5mg/kg体重で90％のインビボにおける細胞成長阻害を
示し、IC50は0.26mg/kg体重であった。
実施例11 配列番号９のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理によ
るヒト腫瘍細胞中の核異常 HeLaおよびLOXヒト腫瘍セルラインを、0.2または0.4
μＭアンチセンス（配列番号９）またはセンス（配列番
号16）オリゴヌクレオチドとDOTMAで処理して、４時間
後に光学顕微鏡および蛍光顕微鏡により分析した。メチ
レンブルー（RNA）、抗p120モノクローナル抗体（p12
0）、またはヘキスト（Hoeschst）染料33258（DNA）の
染色により、有糸分裂細胞が、処理４時間後に50％に減
少し、８〜72時間後に70％に減少したことが示された。
仁の非崩壊（unraveling）および断片化およびクロマチ
ンの変化が観察された。幾つかのLOX細胞においては、
前期停止細胞（prophase arrest）のようにクロマチン
が凝縮した。HeLa細胞においては、クロマチンが凝縮お
よび縮小化した。有糸分裂の低下は3Hチミジンの取り込
みの低下に関係した。細胞成長は70−80％低下した。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:2 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:3 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:5 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:6 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:8 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:9 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:10 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:11 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:12 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:13 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:14 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:15 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列 配列番号:16 配列の長さ:20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス:Yes 配列
フロントページの続き (72)発明者 ベネット・クラレンス・フランク アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールスバッド，コート・シスコ 6553 (72)発明者 ペルラキ，ラスロ アメリカ合衆国テキサス州77025，ヒュ ーストン，ノース・ブレースウッド 3822，アパートメント 72 (72)発明者 西條 康夫 アメリカ合衆国テキサス州77096，ヒュ ーストン，ノース・ブレースウッド 5410，アパートメント 884 (72)発明者 ブッシュ，ローズ・ケイ アメリカ合衆国テキサス州77096，ヒュ ーストン，ダムフライド 4966 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ, Ｖｏｌ．32（1991）ｐ．277，ａｂｓ, 1942 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃｕｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．266，Ｎｏ．27（1991）ｐ. 18162−71 Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．６ （1991）ｐ．647−61 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏ ｌ．２，Ｎｏ．２（1990）ｐ．63−71

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞増殖を変調（modulate）するのに効果
    的であり、かつ、CACCCGCCTT GGCCTCCCAC（配列番号
    ９）またはCACCCGCCTT GGCCTCCCAG（配列番号14）の少
    なくとも12ヌクレオチドからなる一部の配列を有する、
    12から50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】薬学的に受容可能なキャリアー中に含まれ
    る、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合基
    がイオウ含有基である、請求項１記載のオリゴヌクレオ
    チド。
  4. 【請求項４】ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合基
    がホスホロチオエートモイエティである、請求項１記載
    のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】仁蛋白質をコードする核酸の３′非翻訳領
    域に特異的にハイブリダイズすることができ、かつ、CA
    CCCGCCTT GGCCTCCCAC（配列番号９）またはCACCCGCCTT
    GGCCTCCCAG（配列番号14）の少なくとも12ヌクレオチド
    からなる一部の配列を有する、12から50ヌクレオチドの
    オリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】上記蛋白質が細胞増殖に関連していること
    を特徴とする、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】p120をコードする遺伝子に特異的にハイブ
    リダイズすることができる、請求項５記載のオリゴヌク
    レオチド。
  8. 【請求項８】薬学的に受容可能なキャリアー中に含まれ
    る、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合基
    がイオウ含有基である、請求項５記載のオリゴヌクレオ
    チド。
  10. 【請求項１０】ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合
    基がホスホロチオエートモイエティである、請求項９記
    載のオリゴヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】配列:TCCCAGTCCC ACCTCCCATC（配列番号
    ６）の少なくとも12ヌクレオチドからなる一部の配列を
    含む、12から50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】薬学的に受容可能なキャリアー中に含ま
    れる、請求項11記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合
    基がイオウ含有基である、請求項11記載のオリゴヌクレ
    オチド。
  14. 【請求項１４】ヌクレオチド中の少なくとも一つの結合
    基がホスホロチオエートモイエティである、請求項11記
    載のオリゴヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】配列:CACCCGCCTT GGCCTCCCAC（配列番号
    ９）、または CACCCGCCTT GGCCTCCCAG（配列番号14） の少なくとも12ヌクレオチドからなる一部の配列を含
    む、12から50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
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