JPH10510700A

JPH10510700A - アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてカポジ肉腫を治療する方法

Info

Publication number: JPH10510700A
Application number: JP7501798A
Authority: JP
Inventors: バーバラインソリ; ロバートシーガロー
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1994-05-17
Publication date: 1998-10-20
Also published as: WO1994029444A1; CA2164288A1; ATE196313T1; EP0703979A1; EP0703979B1; AU693097B2; DE69425890D1; AU6951294A; US5990088A

Abstract

(57)【要約】本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）を治療する方法および薬剤に関するものである。特には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに関連するＫＳを、塩基性繊維芽細胞細胞成長因子ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によって治療する方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてカポジ肉腫を治療する方法発明の背景１．発明の分野本発明は、カポジ肉腫（Kaposi Sarcoma: ＫＳ）を治療する方法に関するものであり、特には、ヒト免疫不全ウイルスに関連するＫＳを、塩基性繊維芽細胞成長因子ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によって治療する方法に関するものである。２．本技術の背景カポジ肉腫（ＫＳ）は、しばしばヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）への感染に関連する血管起源の増殖性の疾患である。ＫＳおよび日和見感染についてのＣＤＣタスクフォース、「N．Engl．J．Med.」306:248頁、1982年; Safai等「Ann．Int．Med.」103、744頁、1985年;Havercos 等、「N．Engl．J．Med.」31 2:1518頁、1985年。カポジ肉腫はここでは「ＫＳ」として言及し、一方ＨＩＶ− １に関連するカポジ肉腫は、ここでは「ＡＩＤＳ−ＫＳ」として言及するであろう。ＫＳは、典型的には、ほとんどのＡＩＤＳ−ＫＳの患者において、皮膚中の疾患として生ずるけれども、内蔵性の疾患もまた存在している。ＫＳは、しばしば、多発性で散在性の皮膚疾患として生じ、その初期の段階では、良性の毛細血管腫または血管に侵入した慢性の炎症性の病巣に類似している。試験切除術の繰り返しによって、進行性の肉腫状の外見が見られる。一層進行した段階では、これらの疾患は、多発性の紫色から茶色の皮下のプラークまたはイボのように見え、しばしばイボ条の表面を備えている。ＫＳが有する特徴的な組織学上の特徴には、細胞シートとして、またはしばしば異常な（スリット状の空間の）赤血球を含む新しい血管を形成するものとしての（血管生成作用）、紡錘形細胞（ＫＳ細胞、腫瘍因子と考えられている）の増殖および内皮細胞の増殖が含まれている［ＣＤＣタスクフォース、「N．Engl．J．Med.」306:248 頁、1982年; Safai 等「Ann ．Int．Med.」103、744、1985年);Havercos等、「N．Engl．J．Med.」312:1518 頁、1985年;Friedman-Kein「J．Am．Acad．Dermathol．」５、468 頁、1981年;G ottlieb等、「Hum．Pathol.」13、882 頁、1982頁;Macnutt等、「Am．J．Pathol .」111、62頁、1983年］。ＫＳの他の組織学上の特徴は、ヘモジデジンの堆積を伴う血管外の出血、未分化の繊維芽細胞状の増殖、および肉芽状の炎症性の反応である。ロビンス等「Basic Pathology(基礎病理学)」第２８６頁（W．B．Saund ers Co．第２版、１９７６年）。以前の研究において、我々および他の研究者が示したところでは、ＡＩＤＳ患者のＫＳ疾患に由来する、培養された紡錘形細胞（ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞）は、自己分泌および傍分泌の化学走性およびＫＳ疾患を構成する細胞に対する成長作用を引き起こす因子を生産する。Nakamura等「Science」242:426頁、1988年; Sala huddin「Science」242:430 頁、1988年;Ensoli等「Science」243;223 頁、1989 年;Ensoli 等「Hematol．Oncol．Clin．North Am．」5:281 頁、1991年;Ensoli 等「lmmunol．Rev．」127:147 頁、1992年:Roth 等「Oncogene」4:483 頁、1989 年:Miles等「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」89:4068 頁、1990年;Sturzl「Proc ．Natl．Acad．Sci．USA」89:7046 頁、1992年;Thompson 等「Cancer Res.」54: 2670 頁、1991年。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞からの上澄み液は、正常な内皮細胞の増殖、劣化および基底膜の横断を引き起こし、つづいて移動および筒状構造への器官化を引き起こす。Ensoli等「Science」２４３：２２３頁、１９８９年;Ensoli 等「Hematol．On col．Clin．North Am．」5:281 頁、1991年;Ensoli 等「Immunol．Rev．」127:1 47頁、1992年;Thompson 等「Cancer Res．」54:2670頁、1991年。これらは、新しい血管の形成または血管生成に必要とされるのと同じ現象である。Folkman 等「Nature」288:551 頁、1980年;Folkman等「Science」235:442 頁、1987年。実際には、我々も報告したように、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を、９日齢の受精した鶏卵の絨毛尿膜中へと配置したときに、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞は新しい血管の形成を引き起こす。更には、ＫＳ細胞をヌードマウス中へと注入したときには、ＫＳ細胞は、ヒトのＫＳに類似しているマウス細胞に由来の血管疾患を引き起こす。Sala huddin等「Science」242:430 頁、1988年。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞によって生産された因子の分子的分析が明らかにしたところでは、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１β、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、成長因子に由来する血小板（ＰＤＧＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、幾つかの因子が生産されていた。しかし、ｂＦＧＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ− ８は、他の因子よりも相対的に多量に生産されている。特に、高い定常状態の水準の、ｂＦＧＦを暗号化するｍＲＮＡが、血管生成因子になる可能性があるが、これらの細胞によって形質発現し、細胞外の培地中へと生物学的に活性な形態で放出される。Ensoli等「Science」２４３：２２３頁、１９８９年;Ensoli 等「H ematol．Oncol．Clin．North Am．」5:281 頁、1991年;Ensoli 等「Immunol．Re v.」127:147 頁、1992年;Burgress 等「Annu．Rev．Biochem．」58:575頁、1989 年。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞は、１８、２３、および２５ｋＤの相異なるｂＦＧＦタンパク質のイソフォームの豊富な貯蔵源を、核および細胞質ゾルの分布の双方と共に、含有していることが見いだされた。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の上澄み液中のｂＦＧＦの容量および乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定によって確認されたところでは、ｂＦＧＦの放出が、細胞内のｂＦＧＦ分子の豊富さに直接に関連していた。ｂＦＧＦに対して向けられた特異的抗体を使用することによって、我々は、このサイトカインが、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞、正常な内皮細胞および他の間葉由来細胞の成長を引き起こすことを発見した〔 B.Ensoli等「science」２４３：２２３頁、１９８３年〕。従って、ｂＦＧＦは、自己分泌（腫瘍細胞特異的な）および傍分泌（正常な細胞に特異的な）成長因子の双方として作用する。Ensoli等「Science」２４３：２２３頁、１９８９年; Ensoli 等「Hematol．Oncol．Clin．North Am．」5:281 頁、1991年;Ensoli 等「Immunol．Rev．」127:147 頁、1992年。内皮細胞の成長は、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞によって刺激された、ｂＦＧＦによってブロックされた内皮細胞の成長に対する血管生成および抗体について必要とされる現象であり、これは、ｂＦＧＦがＫＳにおける血管生成の原因であることを示唆していた。B.Ensoli等「Science」２４３：２２３頁、１９８９年。また、ｂＦＧＦは、ＡＩＤＳ関連および古典的なＫＳの双方からのヒトＫＳ疾患中の紡錘形細胞によって、インビボで、過形質発現することが報告された。Xerri 等「 Am．J．Pathol.」138:9 頁、1991年。多大な時間、金銭および努力が、細胞成長因子のこの増殖作用を阻害する戦略に投資されてきた。主要な資源は、こうした成長因子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための戦略に対して、成長因子の増殖活性を阻害する努力の中で投資されてきた。インビトロの一つの実験においては、カポジ肉腫細胞を、このサイトカインＬＩ−６に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって処理した。Miles 等「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」87:4068-4072頁、1990 年を参照（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４５０９号、国際公開番号Ｗ０９２／２１３８０号（Miles 出願）中に実施されている）。この参照文献において、ＩＬ−６は、カポジ肉腫の細胞の増殖の主要な原因である自己分泌因子であることが示唆された。Miles 出願の第４頁、２９〜３３行目を参照。しかし、ＩＬ−６は、カポジ肉腫の十分な増殖に対して必要な血管生成特性を有していることは示されてこなかった。更に、この参照文献が示すところでは、相対的に高い用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＩＬ−６によって引き起こされたカポジ肉腫の増殖を阻害するために必要である。Miles 出願の第４頁、１７〜２２行目を参照。従って、カポジ肉腫の血管生成（または発現）の主要な原因となる因子を決定し、その因子のインビボにおける増殖および血管生成作用を阻害する方法を提供することが、有用であろう。発明の要約本発明の一つの態様においては、患者のカポジ肉腫の進行を阻害する方法を提供する。この方法は、この患者へと、塩基性繊維芽細胞成長因子を暗号化するＲＮＡに対して結合親和力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カポジ肉腫の進行を阻害するのに有効な量、投与することを含んでいる。この目的のために有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ＳＥＤＩＤＮＯ：１、ＳＥＤＩＤＮＯ：２またはＳＥＤＩＤＮＯ：３を有するオリゴヌクレオチドである。これらの配列のＩＤ番号の各々は、下記で定義する。本発明の他の態様は、患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法に関するものである。この方法は、（ａ）第一の時点で、カポジ肉腫を有する患者から、塩基性繊維芽細胞成長因子を検出可能な量含有している体液からなる第一の試料を分離し、（ｂ）この第一の試料中の塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定し、（ｃ）前記第一の時点よりも後の第二の時点で、この患者から前記体液の第二の試料を分離し、および（ｄ）この第二の試料中の塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定する、各ステップを含んでいる。ステップ（ｄ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量が、ステップ（ｂ）で測定した量に対して減少していることは、カポジ肉腫の寛解を示している。好適な態様においては、ステップ（ｂ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量と比較した、ステップ（ｄ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量の増大は、カポジ肉腫の悪化を示している。本方法を使用することによって、患者のカポジ肉腫に対して治療作用を有する薬剤を使用したときのカポジ肉腫の治療の進行を監視できる。このように使用した場合には、更に本方法は、第一の時点と第二の時点との間で、この患者に、カポジ肉腫への治療降下を有する薬剤を投与することを含んでいる。本発明の更に他の態様は、カポジ肉腫の治療に使用する薬剤調製物である。この組成物は、塩基性繊維芽細胞成長因子を暗号化するＲＮＡに対する結合親和力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有している。この組成物における有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の例としては、ＳＥＤＩＤＮＯ：１、ＳＥＤＩＤＮＯ：２またはＳＥＤＩＤＮＯ：３の配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。図面の簡単な説明図１は、センス塩基性繊維芽細胞成長因子（ハッチングした棒）およびアンチセンス塩基性繊維芽細胞成長因子（塗りつぶした棒）ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの存在下における、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長に対する、用量に依存した関係を示す棒グラフであり、純粋な培地中におけるＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長（中空棒）を対照例として示す。図２は、センス塩基性繊維芽細胞成長因子（四辺形）およびアンチセンス塩基性繊維芽細胞成長因子（濡りつぶした円）ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの存在下における、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長の時間および用量への依存関係を示す線グラフであり、純粋な培地中におけるＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長（中空の円）を対照例として示す。図３Ａ〜図３Ｃは、センス塩基性繊維芽細胞成長因子（ハッチングした棒）およびアンチセンス塩基性繊維芽細胞成長因子（塗りつぶした棒）ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの存在下における、ＡＩＤＳ−ＫＳ３、ＫＳ４およびＫＳ６細胞の成長に対する、それぞれの用量に依存した関係を示す棒グラフであり、純粋な培地中におけるＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長（中空棒）を対照例として示す。図４は、ヒト臍静脈細胞（Ｈ−ＵＶＥ）に対する、センス塩基性繊維芽細胞成長因子（ハッチングした棒）およびアンチセンス塩基性繊維芽細胞成長因子（塗りつぶした棒）ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの存在の最小限の作用を示す棒グラフであり、純粋な成長培地中におけるＨ−ＵＶＥ細胞の成長（中空棒）を対照例として示す。図５Ａおよび図５Ｂは、アンチセンスホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳｂＦＧＦ／ＡＩＤＳ−ＫＳＣＭ）（塗りつぶした棒）、センスホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＳｂＦＧＦ／ＡＩＤＳ−ＫＳＣＭ）（ドットを入れた棒）、純粋な培地（ＡＩＤＳ−ＫＳＣＭ）（中空の棒）、または塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（ハッチングを入れた棒）の存在下に培養した、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞（クロスハッチングを入れた棒）からの、調製された培地のＨ−ＵＶＥ細胞の成長（図５Ａ）および侵入（図５Ｂ）に対する作用を示す、２つの棒グラフである。好適な態様の詳細な発明我々が発見したところでは、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、ＡＩＤＳ−カポジ肉腫細胞の増殖および血管生成活性において最重要な役割を果たしている。予期しなかったことに、ｂＦＧＦＲＮＡと相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＳ細胞の増殖および血管生成活性をほとんど全面的に阻害しうる。この結果は、培養されたＡＩＤＳ−ＫＳ細胞によって生産された極めて多数の成長関連因子（即ち、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびｂＦＧＦ）、およびインビボのアンチセンス実験を実施する際の一般的な予測不可能性に照らして、予測されていなかった。以前には、ＩＬ−６が、ＫＳ細胞の増殖の主要な活性因子であることが自明と見られてきた。前出のMiles 等、前出の Miles 出願を参照する。このｂＦＧＦアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、ＫＳ細胞の成長および血管生成活性を阻害する上で例外的に有効であった。これらは、成長の阻害が観察されなかった対照例に対して、約１０倍ものインビトロでのＫＳ細胞の抗増殖作用を示した。更には、この抗増殖作用を得るために必要な用量は、前記のMile出願において教示されている最適な用量（ＩＬ−６に対して１５〜２０μＭ）と比較して相対的に低く、即ち、細胞の増殖を阻害するのに０．５μＭ〜１．０μＭであった。これによって提供される利点は、ＩＬ −６のような他のサイトカインに対するアンチセンス分子と比較して、ＫＳを治療するために必要なアンチセンスｂＦＧＦオリゴヌクレオチドが少ないであろうことである。更に一層予測されなかったことに、このｂＦＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の血管生成活性を阻害する上で有効であった。カポジー肉腫（ＫＳ）のサイトカインによる成長刺激試験本発明者等は、種々のサイトカインのエイズーカポジー肉腫（ＡＩＤＳ−ＫＳ）細胞の成長を促進あるいは刺激する能力を立証した。この研究の事例を以下に提供する。実験例１：エイズーカポジー肉腫細胞のサイトカインによる刺激試験中村等、”Ｓｃｉｅｎｃｅ”、〔２４２〕Ｐ４２６（１９８８年）及びＢａｒｉｌｌａｒｉ等、”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、〔１４９〕Ｐ３７２７（１９９２年）に記載されているように、エイズーカポジー肉腫細胞の成長に対し活性化したＴ細胞からの条件培地に存在しているサイトカインによって刺激を与えることができる。これらの文献の開示内容は引用して本明細書に取り込むこととする。中村等、”Ｓｃｉｅｎｃｅ”、〔２４２〕Ｐ４２６（１９８８年）及びＢａｒｉｌｌａｒｉ等、”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ”、〔１４９〕Ｐ３７２７（１９９２年）に記載されているように、エイズーカポジー肉腫細胞の２つの培地を作り培養した。前述したように（（Ｅｎｓｏｌｉ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ”、〔２４３〕Ｐ２２３（１９８９年）及びＢａｒｉｌｌａｒi等、”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、〔１４９〕Ｐ３７２７（１９９２年））細胞成長測定のため、上記２つの培地は，細胞の成長を測定するためトリブシン処理し着床し、その後種々の量の１Ｌ−１α ，１Ｌ−１β，ＴＮＦα，ＴＮＦβ、１Ｌ−６及びオンコスタチンを細胞に添加した。細胞の成長はそれぞれのサイトカインを接種してから５−６日後に細胞の個数を数えることによって測定するか、あるいはＥｎｓｏｌｉ等、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、〔６７〕Ｐ２７７（１９９３年）に記載されているようにトリチウム含有チミジン組み込み測定法によって４８時間後に細胞の成長を測定した。Ｅｎｓｏｌｉ等、”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、〔６７〕Ｐ２７７（１９９３年）の開示内容は引用により本明細書に取り込むこととする。本試験の結果を第１表に示す。第１表に挙げた細胞の個数による測定結果は、Ｂａｒｉｌｌａｒｉ等、”Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．”、〔１４９〕Ｐ３７２７（１９９２年）にも見い出せる。この文献の開示内容も引用により本明細書に取り込むこととする。第１表の試験結果から種々のサイトカインはエイズーカポジー肉腫細胞の成長に対して成長増殖効果を有することが分かる。しかししながら、血管形成を促進するサイトカインの能力いかんにかかわらずこの成長増殖効果が生ずる。上で論じたように、エイズーカポジー肉腫細胞の上澄みについてｂＦＧＦ含量及び乳酸脱水素酵素活性を測定して得た最近のデータによって、ｂＦＧＦの放出は細胞内ｂＦＧＦ分子が豊富にあるかどうかと直接関係していることが確認できた。ｂＦＧＦに対して特異性を有する抗体を用いて、本発明者はエイズーカポジー肉腫細胞によって放出されたｂＦＧＦはエイズーカポジー肉腫細胞自体と、正常な内皮細胞及び他の間葉由来細胞の成長を誘起するを示した。これらのデータは、ｂＦＧＦ自体は、移植されたエイズーカポジー肉腫細胞エイズーカポジー肉腫細胞によってヌードマウスに見られる組織的変化及び人のカポジー肉腫細胞疫病で見いだされる組織的変化を少なくとも部分的に誘起することができることを示唆したものである。この仮説を立証するために、本発明者等はヌードマウスに増量したｂＦＧＦを皮下注射する実験を行った。エイズーカポジー肉腫細胞は陽性コントロールとして用い、一方人臍静脈（ｈ−ＵＶＥ細胞）由来の正常の内皮細胞、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及びタンパク質あるいは細胞が再懸濁させた緩衝液あるいは培地を陰性コントロールとして用いた。マウスは注射して６−７日後に殺した。これらの結果及び実験のプロトコールを以下に詳述する。第２表に示す結果は以下の方法によって得られた。実験ＩＩ：カポジー肉腫における主要ファクタとしてのｂＦＧＦの役割本実験では、ｂＦＧＦ（ボヘリンガー・マンハイム”Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｈｅｉｍ”）（第２表に示すように０．１−９０μｇ）、ＢＳＡ（シグマ）（９０μｇ）、エイズーカポジー肉腫細胞あるいはＨ−ＵＶＥ細胞（３ｘ１０⁶ ）をＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスの背中の下方市（右側）に皮下注射した。さらに、それぞれタンパク質あるいは細胞を再懸濁させた緩衝液あるいは培地からなる陰性コントロールを同一マウスの左側に注射した。すべてのケースにおいて、注射を行う前に２００μｌ中のタンパク質あるいは細胞をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、”ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．”，〔５４〕Ｐ２６７０（１９９１））。マトリゲルは、血管形成ファクタの存在下に部位特異的血管の形成を助ける基底膜成分の混合物である。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、”Ｓｃｉｅｎｃｅ”，〔２４１〕Ｐ１３４９頁（１９８８年）。タンパク質あるいは細胞のいずれかを注射してから６−７日後に、マウスを殺した。このとき、血管疾患があるかどうかについて注射部位を巨視的に評価した。疾患の大きさは４ｘ５ｍｍから９ｘ１２ｍｍの範囲で、３−４日以内にさらに大きくなり、６−７日までに大きさが最大になった。組織サンプルをマウスの両方の部位から取り出し、フォルマリンで固定した。組織ブロックからスライドを作製し、コード化し、ヘマトキシリンーエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色後に顕微鏡によって分析した。評価は、盲検法によって行った。得られた数値を、注射部位で観察された組織変化、血管形成、紡錘細胞形成・増殖、急性（好中球）及び慢性（単球）炎症細胞浸潤及び水腫の強度に従って等級分けした。これらの組織検査の特徴を陰性コントロールとの対比で評価し、単位数値（強度値）を与えた。血管形成は陰性コントロールには見られることはないが、この血管形成に対し、観察された最小の変化について２の数値を与えた。また、血管疾患及び組織変化はマトリゲルが無い場合にも観察されたが、疾患を誘起するにはｂＦＧＦの濃度をより高くするか、あるいはエイズーカポジー肉腫細胞の数を増やすことが必要であった。さらに、マトリゲルが存在する場合に比べて疾患は少なくかつ範囲はより小さかった。巨視的には、ｂＦＧＦは、接種投与量と関連する頻度で注射部位に複数の血管疾患を誘起した（第１表）。これらの疾患は、エイズーカポジー肉腫細胞によって誘起される疾患から区別することはできなく、かつ２つの疾患は３−４日以内に成長し６−７日後に大きさが最大まで成長した。組織的には、ｂＦＧＦによって誘起された２つの疾患はエイズーカポジー肉腫細胞から誘起された疾患と非常に類似しており、２つの疾患とも血管形成、紡錘細胞形成・増殖等の人のカポジー肉腫と近似した変化を呈示した。これらの組織検査上の特徴を引き起こしたマウスのパーセンテージ及び変化の強さは、接種したｂＦＧＦの投与量に依存していた（第１表）。さらに、急性（好中球）及び慢性（単球）炎症細胞浸潤及び水腫はｂＦＧＦで誘起した疾患にも存在したが、これらのものはエイズーカポジー肉腫細胞を接種した細胞でさらに顕著及び／又は明瞭であった（第２表）。このことは、ｂＦＧＦを作製することに加え、エイズーカポジー肉腫細胞も、１Ｌ− １，１Ｌ−８及び血管浸透ファクタ等の炎症性効果を仲介する他のサイトカインを生み出すことを示すデータと符合するものである。一方、ＢＳＡ及びＨ−ＵＶＥ接種細胞は組織的な変化の兆候を何ら示さなかった。しかしながら、２−３の場合（３６のうち７−９のもの）にはｂＦＧＦが再度懸濁した緩衝液は若干小さな組織的変換を誘起した。これらの小さな変化は実際は注射工程それ自体によったものかも知れず、より多くのマウスがコントロール緩衝液で接種されたので検知可能であったかもしれない。これらの結果は、ｂＦＧＦは紡錘細胞形成（Ｗｅｉｎｄｅｌｅｔａｌ．等，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．”，〔１８３〕Ｐ１１６７（１９９２年）及びカポジー肉腫紡錘細胞の増殖並びに血管形成等（Ｅｎｓｏｌｉ等、”Ｓｃｉｅｎｃｅ”，〔２４３〕Ｐ２２３）のカポジー肉腫疾患を誘起することを示す上述の観察結果と符合している。さらに、人カポジー肉腫疾患の紡錘細胞によってｂＦＧＦが試験管内及び生体内で高いレベルで現出した。エンソリ等『サイエンス』２４３巻２２３頁（１９８９年）。これらのことを考え合わせ、本発明者等は、ｂＦＧＦサイトカインがカポジー肉腫の組織形成において重要な役割を演じることができると考えた。ｂＦＧＦアンチセンス型オリゴマーの非増殖効果及び非血管形成効果ｂＦＧＦはカポジー肉腫の発達及び進行に重要な役割を演じると思われるので、発明者等はｂＦＧＦ・ＲＮＡに対してアンチセンス・シークエンスがエイズーカポジー肉腫細胞の成長及び聴覚原性活性を抑制することに有効かどうか、そして究極的には生体内でのカポジー肉腫の進行を阻止するかどうかを決定することを決意した。これに関連して、ｂＦＧＦのＲＮＡのヌクレオチド・シークエンスに係るアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用することにした。設計考慮事項の特に貴重な考察事項及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用する点については、Ｕｈｌｍａｎｎ等、”ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ ”，〔９０〕Ｐ５４３−５８４（１９９０年）参照。この文献の開示内容は、本願明細書中引用によって本願明細書中に組み込む。原則的には、ｂＦＧＦ遺伝子の任意の領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドは本発明に利用性を見いだすが、翻訳開始コドンを含めｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写部分に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが特に好ましい。また、転写開始コドンの上流の約４０ヌクレオチド内（３’方向）あるいは下流の約４０ヌクレオチド内（３’方向）にあるｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写部分に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが特に好ましい。本願明細書で用いるように、特に異なって指摘する場合以外は、用語”オリゴデオキシヌクレオチド”はリボンヌクレオチドあるいはデオキシリボンヌクレオチドのいずれかのストランドを含む。用語”オリゴヌクレオチド”及び”オリゴデオキシヌクレオチド”は、一般的な生物学的に重要なヌクレオチド、すなわちヌクレオチドアデニン（”Ａ”），デオキシアデニン（”ｄＡ”），グアニン（”Ｇ”），デオキシグアニン（”ｄＧ”），シトシン（”Ｃ”），デオキシシトシン（”ｄＣ”），チミン（”Ｔ”）及びウラシル（”Ｕ”）のオリゴマー及びポリマーを含むのみならず、他のヌクレオチドを含むことが可能なｂＦＧＦのｍＲＮＧ転写に対しハイブリッドを形成可能なオリゴマー及びポリマーをも含む。同様に、用語”オリゴヌクレオチド”と”オリゴデオキシヌクレオチド”は、一個以上のプリンあるいはピリミジン部分、砂糖部分あるいはヌクレオチド結合が化学的に変成されているオリゴマーあるいはポリマーを含み得る。従って、用語”オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合に変更を加えいるので”オリゴヌクレオチド”と命名するのが適当であるオリゴマーをも含むと理解される。このような変更オリゴヌクレオチドには、例えば、後に論じるようにアルキルホスホネートオリゴヌクレオチドが挙げられる。用語”ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド”は，変更を加えていないオリゴヌクレオチドに特徴的な通常のホスホロジエステル基（２）に対し、一個以上のヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート基であるオリゴヌクレオチド（１）と定義される。用語”アルキルホスホネート・オリゴヌクレオサイド”は、Ｒはアルキル基、好ましくはメチル基あるいはエチル基である一個以上のヌクレオチド間の結合がアルキルホスホネート基であるオリゴヌクレオチド（３）と定義する。用語”ｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写”は、本明細書でｂＦＧＦタンパク質を高度化するｍＲＮＡの転写と定義する。遺伝子の表現レベルを決定する種々の方法が当業者には周知である。このような方法は、例えば、逆トランスクリプターゼポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析法がある。ｂＦＧＦ遺伝子の全体のシークエンスは知られている。Ａｂｒａｈａｍ等、” Ｓｃｉｅｎｃｅ”，〔２３３〕Ｐ５４５（１９８６年）参照。この文献の開示内容は、引用により本願明細書に組み込む。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、既知の化学的オリゴヌクレオチド合成方法のいずれかの方法によって合成することができる。このような既知の方法は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ”ＦｒｏｍＧｅｎｅｓｔｏＣｌｏｎｅｓ：ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＧｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＶＣＨＶｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔｍｈＨ”（Ｈ．ｉｂｅｌｇａｕｆｔｔｒａｎｓ．１９８７年）。本願のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製する場合にいずれの既知のオリゴヌクレオチド合成方法を用いても良い。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、工業上入手可能かつ自動核酸合成装置のいずれかの装置を用いて最適に作製する。このような装置の一つ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０ＢＤＮＡ合成装置があり、このものはβ− シアノエチル・ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｌｄｉｔｅ）化学を利用している。ｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写に相補的なＤＮＡを完全にヌクレオチドによって合成する方法は既知であるので、ｂＦＧＦ転写の任意の部分に対しハイブリッドを形成できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に知られているオリゴヌクレオチド合成方法によって作製することができる。いずれの長さのオリゴヌクレオチドも本発明の実施に用いることができるが、１２個の塩基より短いシークエンスは目的とするｂＦＧＦのｍＲＮＡとハイブリッドを形成するのに特異性が劣ることがあり、また酵素的に消化されることによって容易に破壊される可能性があり、かつ酵素的消化によって不安定となる可能性がある。従って、１２以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが好ましい。長いシークエンス、特に約４０のヌクレオチドより長いシークエンスは、目的とする細胞の取り込みが減少するので、ｂＦＧＦ翻訳を阻止する効果が多少小さい可能性がある。従って、１２−４０のヌクレオチドのオリゴマーが好ましく、より好ましくは１５−３０のヌクレオチド、最も好ましくは１８−２４のヌクレオチドのオリゴマーが好ましい。特に、１８−２４のヌクレオチドのシークエンスが最も好ましい。ｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写の任意の部分に対して相補的でありかつハイブリッド形成が可能なオリゴヌクレオチドは、原則として転写の翻訳を阻止するのに効果的であり、本願明細書に記載した効果を誘起できる。開始コドンの部位あるいはその近傍のｍＲＮＡをブロックすることによってさらに効果的に翻訳を阻止されると思われる。従って、ｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写の５’一端部領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。ハイブリッドを形成するのを干渉する可能性のある第２級または第３級の構造が上記領域で最小となる。さらに、開始部位から３’一方向に遠すぎれば、シークエンスは読み合わせ現象によってｍＲＮＡ転写とハイブリッドを形成する効果が小さくなる可能性があり、それによってリポゾームはアンチセンス／センス二重線のラベルを除去し、メッセージの翻訳を可能とする必要があることが示唆されている。例えば、Ｓｈａｋｉｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，〔２６１〕Ｐ１６０１８（１９８６年）参照。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２個のスプライスドナー−アクセプター部位の内一つの部位あるいはその近傍、すなわちスプライスドナー−アクセプター部位１（コドン６０）あるいはスプライスドナー−アクセプター部位２（コドン９４−９５）の部位あるいはその近傍に指向させることができる。ｂＦＧＦ転写の２つのスプライスドナー−アクセプター部位の内の１つの部位に対し相補的なアンチセンスオリゴマーが好ましく、特に第１のスプライスドナー−アクセプター部位を含めた領域が好ましい。有益なアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡ転写の翻訳された部分に見いだせるシークエンスに相補的なオリゴマーに限定されず、開始コドンも含め５’及び３’−未翻訳領域に含まれるオリゴマーあるいは５’及び３’−未翻訳領域まで伸びるオリゴマーも含む。以下の２４−ｍｅｒオリゴマーは、転写の開始コドンから始まりその下流に伸びる（５’方向）ｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写に相補的である。５’ＧＡＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１）上記シークエンスに基づくより小さなオリゴマー、特に開始コドンを含んだｂＦＧＦメッセージのセグメントとハイブリッド形成が可能なオリゴマーもｂＦＧＦ翻訳を阻止するのに有効であることが予想される。また、以下のシークエンスを有するスプライスドナー−アクセプター部位１（コドン６０）から始まるｂＦＧＦのｍＲＮＡ転写に相補的な２４−ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドが好ましい。５’ＴＴＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２）用いられるオリゴヌクレオチドは、変更を加えないオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドアナログを表しえる。従って、本発明で利用可能なｂＦＧＦのｍＲＮＡとハイブリッド形成の可能なオリゴヌクレオチドには生物学的に重要な天然のヌクレオチド、すなわちＡ，ｄＡ，Ｇ，ＤＧ，Ｃ，ｄＣ，Ｔ及びＵのオリゴマーのみならず、変更を加えてより安定化した及び／又は脂質溶解性を上げたオリゴヌクレオチドスピーシーズも含む。例えば、アヌクレオチド間ホスホジエステル結合のホスホネートオキシジェンをアルキル基あるいはアルコキシ基で置換しアルキルホスホネートオリゴヌクレオチドあるいはアルコキシホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを形成して脂質溶解性を上げ及び／又は耐ヌクレアーゼ消化性が上げられることが知られている。特に、ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ分裂に対し安定であり、かつ脂質中に溶ける。ホスホロチオエートは既知の自動合成方法によって合成することができる。ホスホロチオエート等の非イオン性のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる加水分解に対しの抵抗及び／又は細胞取り込み率を上昇させるという特徴があり、また相補核酸シークエンスとの間で安定な複合体を形成する能力を保持している。特に、アルキルホスホネートは、ヌクレアーゼ分裂に対し安定であり、かつ脂質に可溶である。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドの作製方法が、米国特許Ｎｏ．４，４６９，８６３に記載されている。とくに、メチルホスホネートが好ましい。メチルホスホネートオリゴマーは、種々の方法で溶液中あるいは不溶性ポリマー支持体上で製造することができる（Ａｇｒａｗａｌ等．，”Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．”，〔６〕Ｐ３００９−３０２４（１９７９年））。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを作製する最も効率的な方法は、オリゴデオキシリボヌクレオチドを作る場合に用いるメトキシあるいはβ−シアノエチルホスポラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）試薬に類似した５’ −Ｑ−ジメチルオキシトリチルデオキシヌクレオチド−３’Ｑ−ジイソプロピルメチルホスホラミダイト中間体を用いる。メチルホスホネートオリゴマーは、自動化したＤＮＡ合成装置を用いて，条件付けした多孔質ガラスポリマー支持体上で作製することができる（Ｓａｒｉｎ等，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ”、〔８５〕Ｐ７４４８−７４５１（１９８８年）。Ｄａｇｌe等、”Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．”，〔１８〕Ｐ４７５１− ４７５７（１９９０年）の方法により，５’ｔｏ３’端子の両方位置でヌクレオチド間の結合に変更を加えることによって耐ヌクレアーゼ消化性を実現することもできる。本明細書に記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために適当なヌクレオチドアナログとしては、米国特許Ｎｏ．４，４６９，８６３に開示したエチル又はメチルホスホネートアナログがあるが、このアナログに限られるわけではない。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の酸素を硫黄で置き換えたものも含む。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、二重線形成に有効なハイブリダイゼーションの性質と実質的なヌクレアーゼ抵抗とを結合させたものであり、荷電したホスフェートアナログの水に対する溶解度を保持している。荷電することによって、レセプターを介して細胞に取り込まれる性質が付与される（Ｌｏｋｅ等，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ”、〔８６〕Ｐ３４７４−３４７８（１９８９年）。ホスホロチオエート変性オリゴヌクレオチドは、ＬａＰｌａｎｃｈｅ等，”ＮｕｃｌｅｌｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ”，〔１４〕Ｐ９０８１（１９８６）及びＳｔｅc等，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．”，〔１０６〕Ｐ６０７７（１９８４年）に記載されている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの一般的合成方法に対しＳｔｅｉｎ等，”Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．”，〔１６〕Ｐ３２０９−３２２１（１９８８年）で修正が加えられてあり、これらの化合物はホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を用いて自動合成装置で容易に合成することができる。また、Ｚｏｎ等によってさらに新たな変更が加えられた。Ｚｏｎ等、”Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ”，〔６〕Ｐ５３９−５６８（１９９１年）、Ｚｏｎ等，”ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），Ｐ８７−１０８頁（１９９１年）。また、Ｓｔｅｃ等の米国特許Ｎｏ．５，１５１，５１０参照。さらに、オリゴリボヌクレオチドアナログの製造方法における最近の進歩により本明細書に記載する目的のために他の試薬、例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｖｅ等、”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．”，〔１５〕Ｐ６１３１（１９８７年）及び複合ＲＮＡ−ＤＮＡアナログであるキメラオリゴヌクレオチド（Ｉｎｏｖｅ等、”ＦＥＢＳＬｅｔｔ．”，〔２１５〕Ｐ３２７（１９８７年）も用いることができることを意味する。アンチセンスオリゴリボヌクレオチドあるいはオリゴデオキシリボヌクレオチドのいずれかを用いてｂＦＧＦのｍＲＮＡの翻訳を阻止することが可能であり、オリゴデオキシリボヌクレオチドに比較して自由オリゴリボヌクレオチドは、リボヌクレアーゼによってより酵素的な攻撃を受けやすい。従って、ｂＦＧＦのｍＲＮＡとの間でハイブリダイゼーションが起こると、生ずるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重線はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を特異的に攻撃するＲＮアーゼＨに対する基質となるということを考えるとオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。二重線のｍＲＮＡストランドが劣化するとさらに新たなｂＦＧＦメッセージとの間でハイブリダイゼーションを行うためのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドストランドが放出される。一般に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｂＦＧＦメッセージの目標部分に完全に相補的なシークエンスからなる。しかしながら、特にオリゴマーがより大きくなると、完全な相補性は要求されない。従って、ｂＦＧＦの『ｍＲＮＡ転写の少なくとも一部に相補なヌクレオチドシークエンス』とは、必ずしも転写に対し１００％の相補性を有するシークエンスを意味しない。一般に、ｂＦＧＦのｍＲＮＡとの間で安定な二重線を形成する為に十分な相補性を有するものであればいずれのオリゴヌクレオチドでも適合する。二重線が安定に形成されるかどうかは、ハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドのシークエンス及び長さ並びにｂＦＧＦメッセージの目標とする領域との相補性の度合いに依存する。一般に、ハイブリッドを形成するオリゴマーが大きくなれば、ミスマッチがより多くなることを許容しなければならないであろう。当業者であれば、得られる二重線の融点従って安定性をもとに、所定のアンチセンスオリゴマー及び目的とするｂＦＧＦメッセージのシークエンスとの間での許容できるミスマッチの程度を決定するのは容易かも知れない。所定の塩基対組成の二重線の融点は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、”ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２編、１９８９年）等の基本的テキストから容易に決定することができる。ｂＦＧＦメッセージの任意の領域との間でハイブリッドを安定に形成できるオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内であるが、第１のスプライスドナー−アクセプター部位を含めた領域に相補的なオリゴヌクレオチドが特に効果的であると思われる。特に、コドン６０の上流（５’の方向）の２４のヌクレオチドまでのｂＦＧＦのｍＲＮＡの領域との間でハイブリッド形成を行えるオリゴヌクレオチドが好ましい。従って、本発明者は、エイズーカポジー肉腫細胞の成長の評価をしまたエイズーカポジー肉腫細胞によって生ずる血管形成促進作用（内皮細胞成長、基底膜を通しての移動及び侵入）を抑制するためにＢｅｃｋｅｒ等、”ＥＭＢＯＪ．” ，〔８〕Ｐ３６８５頁（１９８９年）に記載されたようにｂＦＧＦのｍＲＮＡシークエンスの異なった複数の位置に対し相補性を有するホスホロチオエート・アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（２４ｍｅｒｓ）を合成した。選択したアンチセンスオリゴマーは、ｂＦＧＦのｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）、スプライスドナー−アクセプター部位１（コドン６０）及びスプライスドナー−アクセプター部位２（コドン９４−９５）に対し相補性を有した（図２Ａ）。コントロールとして、対応するセンスオリゴマーを用いた。実験例III ：アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製アンチセンス及びセンスｂＦＧＦホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドをＺｏｎ等、”ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ”：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＥｎｇｌａｎｄ）”，Ｐ８７−１０８に報告された方法を用いてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３８０ＢＤＮＡ合成装置により１μｍあるいは１０μｍのスケールで作製した。上記文献の開示内容にはヨウ素−水−ピリジンに対し（米国特許Ｎｏ．５，１５１，５１０に記載されているように）硫黄ドナー試薬で置換すること、各サイクル内の酸化後キャップする正常な順序を逆にすること、プレパラート逆相高性能液体クロマトグラフィー、脱トリチル化、ナトリウム塩形状での最終製品の分離及び毛細ゲル電気遊泳法による分析も含まれ、同開示内容は引用により本明細書に取り組む。ここに米国特許Ｎｏ．５，１５１，５１０の開示内容も引用により本明細書に取り組む。また、Ｚｏｎ等、” Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ”，〔６〕Ｐ５３９（１９９１年）参照。この文献の開示内容は引用により本明細書に取り組む。製品は、標準の大きさとの比較で最大長さの８５％以上の大きさで回収された。特定のシークエンスのＡＳオリゴマーを以下の方法によって合成した。ｂＦＧＦのｍＲＮＡの翻訳開始部位に相補的なアンチセンスシークエンス（ＡＵＧコドン）は、以下のものであった。５’ＧＡＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１）アンチセンススプライスドナー−アクセプター部位１（コドン６０）のシークエンスは、以下のものであった。５’ＴＴＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２）アンチセンススプライスドナー−アクセプター部位２（コドン９４−９５）のシークエンスは、以下のものであった。５’ＡＴＣＣＧＴＡＡＣＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３）対応するセンスオリゴマーは、コントロールとして合成され、以下のシークエンスをもっていた。５’ＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４）５’ＡＧＣＧＡＣＣＣＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５）５’ＣＴＧＧＣＴＴＣＴＡＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＧＧＡＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６）アンチセンスオリゴマーの調製に続いて、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞をアンチセンスオリゴマーと一緒に培養して、抗増殖効果の度合を測定した。実験例IV ：ｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーによる細胞の培着調製後、ｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーを１ｍＭの濃度で無菌のエンドトキシン無含有水中に再懸濁させた。細胞成長培地中ではさらに希釈した。Science 第２４２巻第４２６頁（１９８８年）の中村等の論文及びＪ．Ｖｉｒｏｌ．第６７巻第２７７頁（１９９３年）のエンソリ等の論文に記載されているように、細胞が成長した。第１図を見ると判るように、ＳＥＱＩＤ No．２に相応するｂＦＧＦｍＲＮＡの第１スプライスの供与−受容部位に対して処方されたｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーは、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長を特定的に且つ用量に応じた様式で阻害する。培地のみが存在する場合のＡＩＤＳ−ＫＳ４細胞の成長％を白棒で示し、アンチセンス（ＡＳ）又はセンス（Ｓ）ｂＦＧＦの濃度の種々に（０．１〜１０μＭ）増加した培地の場合のＡＩＤＳ−ＫＳ４細胞の成長％を夫々黒棒又は斜線棒で示してある。ＡＩＤＳ−ＫＳ４細胞は前述したようにして樹立され、培養された。培地（１０％ＦＣＳを含有）を完了するためオリゴマー添加の４８時間後に、細胞成長補剤の不在下で、（上述の実験１に記した）³〔Ｈ〕−チミジン混入測定法により細胞成長を評価した。オリゴマーを用いた結果を、オリゴマー不在下の結果（対照物の％）と比較した細胞成長％として表現している。同じオリゴマーの４ケの異なる調製物と非修整のオリゴマーの４ケの異なる調製物を用いた場合に、同様の又は同一の細胞成長阻害効果が得られた。ＳＥＱＩＤ No．２に相応するｂＦＧＦｍＲＮＡの第１スプライス供与− 受容部位に対して処方されたＡＳオリゴマーが、他のＡＳオリゴマーに比べて（データは示さないが）高い活性及び特異性と共にＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長を阻害したので、ＡＳオリゴマーを選定してさらに実験した。ＳＥＱＩＤ No．２に相応するｂＦＧＦｍＲＮＡの第１スプライス供与−受容部位に対して処方されたホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドアンチセンス配列を、以下ではＡＳｂＦＧＦと称する。ＡＳｂＦＧＦは第１図に示すように、用量に応じた様式で、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長を阻害した。特異性に関して、１μＭ濃度のＡＳｂＦＧＦのときに最適阻害効果が得られた。この濃度でＡＳｂＦＧＦオリゴマーはＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長を７０％以上阻害したが、センスオリゴマー（ＳｂＦＧＦ）は顕著な効果を示さなかった（第１図参照）。２．５μＭより多い濃度のオリゴマーは、Ｓオリゴマーを用いた場合の若干の細胞成長阻害度合の存在に示されるように、若干の非特定的効果を有した。このことがホスホロチオエート修整に帰因するか否かを知るために、非修整のオリゴマーを合成し、同様の実験に用いた。非修整のオリゴマーのＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長の阻害は修整したオリゴマーのそれと同様又は同一であり、この使用濃度ではホスホロチオエート修整は細胞の成長阻害に寄与しないが、ホスホロチオエートはこれ等の化合物の半減期寿命を増大する利点が有ることを示した。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞増殖阻害は、第２図に示すように、ＡＳオリゴマーの単独添加後９６時間以上継続した。第２図は、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞に対する単独添加後の時間の経過に伴なうＡＳｂＦＧＦの細胞成長阻害効果を示す。細胞に対する添加後２４，４８，７２及び９６時間に於けるＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長％を、培地単独の場合を○印で、０．５μＭ又は１μＭのＡＳｂＦＧＦを又はＳｂＦＧＦ含有する培地の場合を夫々●印又は■で示す。細胞成長は第１図について説明したと同様にして評価した。また、ＡＳｂＦＧＦの細胞成長阻害効果は時間の経過と共に増大し、添加後９６時間では０．５μＭと１μＭのオリゴマーは細胞成長阻害が夫々６８％と８６％に達したが、Ｓオリゴマーは顕著な効果を示さなかった（第２図参照）。ｂＦＧＦは細胞サイクルのＧ０−Ｇ１＞Ｓ変移を刺激する（フィオリ等の調剤に於いて）ので、この結果は時間の経過と共に次第に多くの比率の細胞が細胞サイクルに入り、且つｂＦＧＦの不在下で細胞がＧ０−Ｇ１中に拘束される事実により説明され、又はＡＳによる阻害効果が全体的に明瞭となる以前に細胞内のｂＦＧＦ貯蔵が空乏となるであろう事実により説明され、或いは両方の事実により説明されるであろう。実験例Ｖ：アンチセンスｂＦＧＦオリゴデオキシヌクレオチドを用いた場合のＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長阻害の比較例本発明者等はＡＳｂＦＧＦにより活性化したＴ細胞からの条件を整えた培地（ＣＭ）中に存在するサイトカインにより刺激したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長阻害を、他のサイトカインとも比較した。これ等の結果は次に掲げる第３表に示す。同表は実験例１と同様にして行なった本発明者等の³〔Ｈ〕−チミジン混入評価試験の結果を示す。本発明者等の評価試験では、ＩＬ−６は細胞成長を２５〜３０％以上には刺激しなかったので、これ等の実験には用いなかった。J.Immunol.第１４９巻第３７２７頁（１９９２年）に掲載されたバリラリ等の論文をも参照のこと。これ等の結果はｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーがＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長と増殖を阻害することを示している（下記の記述を参照のこと）。実験例VI ：アンチセンスｂＦＧＦが他のＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長プロモータ活性を阻止し、異なる患者に由来するが正常な内皮細胞ではないＡＩＤＳ −ＫＳ細胞を阻害すること。本発明者等は他のＡＩＤＳ−ＫＳ細胞細胞系列に対するＡＳｂＦＧＦの抗増殖効果と共に、他のサイトカインの成長促進活性を阻止するＡＳｂＦＧＦの能力をも試験した。試験は実験例IVと同様にして行ったが、活性化したＴ細胞で条件を整えた培地からの条件を整えた（１：５〜１：８希釈）培地を用いた細胞を刺激した点が相違した。興味を唆ることには、活性化したＴ細胞からの条件を整えた培地（ＣＭ）のようなこれ等の細胞の既知の成長誘起物質により誘起されたＡＩＤＳ−ＫＳ細胞増殖を、ＡＳｂＦＧＦが阻止した。ＣＭはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊疽要素、ＩＬ−６及び新たに発見されたＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長要素オンコスタチンＭ等のＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長を促進する数種のサイトカインを含有する。これ等のサイトカインの各々の効果は、実験例５に示したようにＡＳｂＦＧＦにより阻止される。このことと、これ等のサイトカインの若干のものが導管細胞内のｂＦＧＦ発現を誘起することが知られている事実とは、ｂＦＧＦがＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長の最終的媒介体として作用することを示唆している。ｂＦＧＦがＡＩＤＳ−ＫＳ経路における最終媒介体であるとの指示は、サイトカインに関連するＫＳ成長を阻止する他の試みに比べて本発明方法に多大の利点を与える。サイトカイン過程中の最終媒介体に対してアンチセンス分子を用いることにより、本発明方法はカポジ肉腫がどのように刺激されるかとは無関係に、殆んど全てのカポジ肉腫の治療に対して有効たり得る。他のサイトカインに対するアンチセンス分子は、カポジ肉腫生成を誘起する全ての種類の化合物の処理には有効でないであろう。ＡＳｂＦＧＦは異なる患者から由来するＡＩＤＳ−ＫＳ細胞（ＡＩＤＳ−ＫＳ３、ＡＩＤＳ−ＫＳ４及びＡＩＤＳ−ＫＳ６）の成長を阻害した。第３図に示すように、異なる患者から由来するＡＩＤＳ−ＫＳ細胞培養物の成長をアンチセンスｂＦＧＦオリゴマーが阻害する。細胞に添加２４時間後のＡＩＤＳ−ＫＳ３、ＫＳ４及びＫＳ６細胞成長の％を、培地のみの場合は白棒で示し、０．１，１及び１０μＭのＡＳｂＦＧＦオリゴマー又はＳｂＦＧＦオリゴマーを含有する培地の場合は夫々黒棒と斜線入り棒で示した。第３図ではこれ等の他の細胞系列に於いて明瞭な阻害が観察される。然し、第４図に示されるように、正常な内皮細胞（Ｈ−ＵＶＥ細胞）の阻害は見られなかった。このことは特異性とおそらくはインビボ治療時のＡＳｂＦＧＦの毒性の欠如を示すので重要である。第４図では、Ｈ−ＵＶＥ細胞成長の％を、媒地のみの存在の場合には白棒で示し、０．１，１及び１０μＭのＡＳｂＦＧＦ又はＳｂＦＧＦを含有する培地の場合には夫々黒棒又は斜線入り棒で示した。Ｈ−ＵＶＥ細胞は上述したように、内皮細胞成長補剤（ＥＣＧＳ．３０ｕｇ／ｍｌ．コラボラティブリサーチ社製）又は酸性ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＲアンドＤ社製又はベーリング−マンハイム社製）及びヘパリン（４５ｕｇ／ｍｌ．シグマ社製）の存在下で樹立され、培養された。例えば、Science 第２４３巻第２２３頁（１９８９年）のエンソリ等の論文、J.Immunol.第１４９巻第３７２７頁（１９９２年）のバリラリ等の論文を参照のこと。上述した如く、培地（１０％のＦＣＳ及びＥＣＧ又はａＦＧＦを含有）を完了するためのオリゴマー添加４８時間後に、³〔Ｈ〕チミジン混入を評価した。１ｄ．内皮細胞は、通常殆んど全くｂＦＧＦを生産しないで増殖によりサイトカインに反応するため、且つＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の起源の細胞種類を示し得るため、対照用細胞種類として選定した。これ等の結果は、高水準のｂＦＧＦを生産し且つＡＩＤＳ−ＫＳ細胞等の分子に反応して増殖する細胞に対して、ＡＳｂＦＧＦオリゴマーが特異の成長阻害活性を有することを示している。実験例VII ：親和性精製したアンチ−ｂＦＧＦモノクロナールを用いたＡＩＤＳ −ＫＳ細胞のインミュノペルオキシダーゼ染色ＡＳｂＦＧＦによる細胞成長阻害がｂＦＧＦ蛋白質生産の減少に関連が有るか否かを実証するために、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を０．５μＭのＡＳｂＦＧＦ又はＳｂＦＧＦ又は培地のみで２４時間処理し、次いで親和性を純粋化したアンチｂＦＧＦモノクロナール抗体（プロメガ）（実験例VII に於けると同様）を用いて二重間接インミュノペルオキシダーゼにより染色した。J.Virol.第６７巻第２７７頁（１９９３年）のエンソリ等の論文に記されているように、精製した牛の脳のｂＦＧＦ（プロメガ）に対して創成されたアンチ−ｂＦＧＦ精製マウスモノクロナール抗体（１：１５０希釈度）を用いて、二重間接インミュノペルオキシダーゼ法によりｂＦＧＦ蛋白質発展について細胞を分析した。ＡＳｂＦＧＦ処理の後、ｂＦＧＦ陽性細胞数と細胞質染色及び核染色の双方の強度は、ＳｂＦＧＦ処理細胞又は非処理細胞に比べて著しく減少していた。本発明者等はアンチセンスｂＦＧオリゴマーがＡＩＤＳ−ＫＳ細胞によるｂＦＧＦ蛋白質発展を阻害することを見出した。ＡＩＤＳ−ＫＳ４細胞は培地単独中で、又は０．５μｍのＡＳｂＦＧＦ又はＳｂＦＧＦの存在下の培地中で２４時間培養した。培地で処理した細胞の場合は染色が減少した。核のｂＦＧＦ染色も、アンチセンス処理した細胞の場合には（３６％±９陽性細胞から３％±１陽性細胞）に減少した。既知のｂＦＧＦ生産細胞系列の一つであるＳＫ−ＨＥＰ１細胞系列を陽性対照物（８４％±５ｂＦＧＦ陽性単位）として用い、Ｔ細胞の一系列（Ｈ９）を陰性対照物（０％）として用いた。これ等の結果は、核及び細胞質の双方の極地化（１５）の場合に、ＡＳオリゴマーがｂＦＧＦ蛋白質イソフォームの発現を特異的に阻害したことを示す。このことは、ホスホロチオエートオリゴマーを用いる以前の研究（１９）中で示唆されたように、ＲナーゼＨによるｂＦＧＦＲナーゼ／アンチセンス錯体の劣化に帰するものと考え得る。実験例VIII：アンチセンスｂＦＧＦオリゴマーによるＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の血管形成活性の阻止以上の記述から、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞が生物学的に活性なｂＦＧＦを開放して、細胞死亡の不存在下で細胞培養物上澄液中に入れることが評価されるであろう。また、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞からの条件を整えた培地は、内皮細胞を誘起して移動させ、基膜を劣化させ横断させ、且つ増殖させる。これ等の全ての行事は、血管形成増殖的な疾病であるＫＳの典型的特色である血管形成症に必要とされるものである。これ等の行事は何れもマウスへのｂＦＧＦの注射により誘起される。さらに、ＡＳオリゴマー又はオリゴマー又は培地のみを用いて２４時間処理され、Ｈ−ＵＶＥ細胞成長の刺激に用いられ、マトリゲルによる細胞侵入に用いられたＡＩＤＳ−ＫＳ細胞から調整した条件を整えた培地を用いた実験により示されるように、アンチセンスｂＦＧＦはＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の血管形成活性及び増殖活性を阻止した。これ等の実験の結果を第５Ａ図と第５Ｂ図に示す。第５Ａ図と第５Ｂ図では、アンチスセンスｂＦＧＦオリゴマーを用いて処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞からの条件を整えた培地は、Ｈ−ＵＶＥ細胞成長を刺激する能力を失い（第５Ａ図参照）、再構成した基膜を通じてのＨ−ＵＶＥ細胞の侵入を刺激する能力を失った（第５Ｂ図参照）。マトリゲルは細胞の侵入ポテンシァルの評価に用いた再構成した基膜である(Cancer Res.)第４７巻第３２３９頁（１９８７年）のアルビニ等の論文参照）。第５Ａ図はＨ−ＵＶＥ細胞成長％を示し、第５Ｂ図はｂＦＧＦの存在下で一視野当たりの侵入された細胞数（斜線を入れた棒）と、オリゴマーの不存在下で培養したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞から由来したＣＭの存在下で一視野当たりの侵入された細胞数（ＡＩＤＳ−ＫＳＣＭ）交差斜線を入れた棒）と、S ｂＦＧＦオリゴマーを用いて処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞から由来したＣＭの存在下で一視野当たりの侵入された細胞数（ＡＩＤＳ−ＫＳＣＭ／ＳｂＦＧＦ）半交差斜線を入れた棒）と、ＡＳｂＦＧＦオリゴマーを用いて処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞から由来したＣＭの存在下で一視野当たりの侵入された細胞数（ＡＩＤＳ−ＫＳＣＭ／ＡＳｂＦＧＦ、黒棒）と、培地のみの存在下で一視野当たりの侵入された細胞数（白棒）とを示す。条件を整えた培地は実験例IVで記したように、第１図について記したと同様の実験から、０．５μｍのＡＳｂＦＧＦオリゴマー又はＳｂＦＧＦオリゴマーを含有する無血清培地を用いて２４時間処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞から調製し、または非処理のＡＩＤＳ−ＫＳ細胞から調製した。ｂＦＧＦ（５ｍｇ／ｍｌ）と単独培地は夫々陽性及び陰性対照物として用いた。細胞成長の評価試験用に、条件を整えた培地を２０％の胎牛の血清（ＦＢＳ）を含有する成長培地中で１：２に希釈した後Ｈ−ＵＶＥ細胞に添加し、実験例１で記したように³［Ｈ］−チミジン混入評価試験（４８時間）により細胞成長を評価した。細胞侵入の評価試験用に、Ｈ−ＵＶＥ細胞（８×１０⁴）を８００μｌのＤ′ ＭＥＭ／０．０１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、ボイデン室の上部隔室内に置いた。下部隔室内には条件を整えた培地又は無血清培地を置いた。ボイデン室のこれ等の隔室は、マトリゲル（０．５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した）を用いて被覆した（５０μｌ／フィルター）１２Ｍ細孔ポリカーボネートフィルターにより分離し、評価試験を上述したようにして行った(Cancer Res.第４７巻第３２３９頁（1987年）に記されたアルビニ等の論文参照）。接種後、フィルターの上面の細胞を除去し、メタノール中に固定し、ＨアンドＥにより染色した。フィルターの下面に存在する侵入された細胞を光顕微鏡法により「盲目的に」定量試験した。評価試験は２回行い、１フィルター当たり５箇の視野について算定した。算定値は１０視野の平均値を記してある。ＡＳオリゴマーを用いて処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞からの条件を整えた培地は、内皮細胞の増殖を誘起せず、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を移動させず基膜を劣化及び横断させることも誘起しなかった。逆に、非処理細胞からの条件を整えた培地又はＳｂＦＧＦオリゴマーを用いて処理した細胞からの培地は、同様水準のＨ −ＵＶＥ細胞成長及び侵入を誘起した。このことは、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞によるｂＦＧＦの開放が、ＡＳ処理後減少した細胞内ｂＦＧＦ含量の豊富度に応じて異なることを示す、本発明者等の最近の実験データと首尾一貫する。本発明者の結果はｂＦＧＦを目標とするＡＳオリゴマーが、ＡＩＤＳ−ＫＳ障害から由来する紡錘細胞の成長作用及び血管形成作用を阻害することを示している。ｂＦＧＦは人のＫＳ障害で過大表現されるので、ｂＦＧＦ自体はＫＳの組織学的特色の殆どを誘起する。従って、本発明者等はＫＳ障害がＫＳ発達及び進行を阻止する上で最適の目標であると予期している。故に、本発明者等はこの分子を阻害するように特定的に処方された治療法が、全形式のＫＳについて恩恵であろうと予期している。さらに、これ等の結果は極めて将来性の有るものである。何となれば、ＡＳｂＦＧＦオリゴマーが正常な内皮（Ｈ−ＵＶＥ）細胞と交差反応するか又はこれに悪影響を及ぼすとの示現が全く無いからである。このことはＡＳｂＦＧＦオリゴマーを効果的な治療処理に使用できることを示す。他の治療的なアンチセンスオリゴマーの調製ｂＦＧＦ（ＳＥＱＩＤ No．１〜３以外の）への１ケ又は２ケ以上のアンチセンスオリゴマーは、優れた抗増殖効果を有するであろうとの予期の下に、その他のアンチセンスオリゴマーを製造することも可能である。ｂＦＧＦ遺伝子の全体配列は既知である。Science 第２３３巻第５４５頁（１９８６年）のエー・アブラハム等の論文を参照のこと。同論文の記載を参照の為、本明細書中に加入する。故に、その他のアンチセンスオリゴマーの調製は、当業技術者の容易に為し得ることである。実験例IIIに関連して用いた基本的技術及びその導入部分に記載の技術を用いる。かくて生成するアンチセンスオリゴマーを次に、ＳＥＱＩＤ No.．１〜３のアンチセンスオリゴマーよりも抗増殖活性がさらに効果的であるか否かを測定する為、試験した。そのような試験は次のような実験の形式をとることが好ましい。実験例IX ：高めた抗増殖効果についてのアンチセンスオリゴマーの試験ｂＦＧＦの遺伝子符号化のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の合成後、この新たに合成したアンチセンスオリゴマーを、人からの細胞の第１群に投与した。これ等の細胞の少くとも一部分はカポジ肉腫細胞であった。細胞の増殖速度を測定した。然る後、細胞の増殖速度を既知のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の増殖速度と比較した。若し、既知のアンチセンスオリゴマーで処理した細胞の増殖速度に対して、新たに合成したアンチセンスオリゴマーの細胞増殖効果が減少しているか或いは抗増殖効果が増進している場合には、ＫＳに対する優れた治療剤が予期される。例えば、既知のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤ No．１〜３の何れの一者であっても良い。最も好ましいのは、ＳＥＱＩＤ No．３に相応するオリゴデオキシヌクレオチドである。アンチセンスオリゴマーを用いるＫＳのインビボ処理インビボアンチセンス治療が最近行なわれた（Antisense Research and Devel opment 第２巻第１０９〜１１０頁（１９９２年のベイエバー等の論文参照）が、インビボアンチセンス治療は極めて将来性の有る疾病治療方法になることが予期される。次に記す実験は、ｂＦＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて患者のカポジ肉腫を治療する方法を提供する。ＫＳ治療にＡＳｂＦＧＦオリゴマーを用いることの他のやり方に比べての利点は幾つかあり、その中には次のようなものがある。（ｉ）前述したように、本発明者等はｂＦＧＦがＫＳ障害の発達に含まれる鍵分子であることを示すような数系列の証拠を示した。（ii）ｂＦＧＦＲＮＡ分子に対するアンチセンスｂＦＧＦオリゴマーの相対的特異性。（iii）ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞に対するアンチセンスｂＦＧＦオリゴマーの相対的特異性。（iv）他の目標に対して処方したホスホロチオエートオリゴマーを用いた動物実験の結果により示される如く、インビボで達成できる低い非毒性濃度でのインビトロ阻害。故に、本発明者等はアンチセンスｂＦＧＦオリゴマーを用いるＫＳ治療が効能の有る治療形式であると考える。容易に理解されるように、本発明のアンチセンスオリゴマーを用いてＫＳを効果的に処理するためには、オリゴマーが患部に到達できることが必要である。また、抗増殖効果を示す本発明により調製した全てのアンチセンスオリゴマーが治療に使用できることが高く評価されるであろう。然し、ＳＥＱＩＤ No．２のアンチセンスオリゴマーをその実証された有効性の故に使用することが好ましい。本発明者等は本発明のアンチセンスオリゴマーを静脈注射するか障害部へ直接注入することが、現在最も効率的で好便宜な給配形式であると予期する。然し、種々の現在の薬剤形式も同様な効能を示すことも予見される。ＫＳ疾病が通常一般化しているところでは、静脈内投与がＫＳの進行した事例に一般的に指示される。例えば、患者が１０以上の障害を有する場合には、ＫＳは内臓のＫＳであることが典型的である。また、患者が１０以上の障害を有する場合には、各障害部に直接注入されれば障害部は極めて不安になるであろう。何れの場合にしても、上述の第２表及び実験例２に関連して示したように、ちょうどｂＦＧＦがインビボで細胞により吸収されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドがインビトロで挙動したと同様にインビボで挙動することが断定できる。典型的には、本発明のアンチセンスオリゴマーを患部に対する給配を安定化及び／又は助力する薬剤の形式に調製する。全ての薬学の化学者に既知の薬剤形式に、多数の適当な薬剤形式を見出すことができる。郵便番号１８０４２ペンシルバニア州イーストン所在のマックパブリッシングカンパニーが１９７５年発行のRemington′ｓ Pharmaceutical Science 第１５版（第８７章ブラウク・セイモウル）を参照のこと。アンチセンスオリゴマーの障害部への直接注入又は静脈内投与のためには、常法により形成薬剤中に生理学的に許容される緩衝剤、賦形剤及び／又は他の給配剤を混入する。現在的な使用のための適当な薬剤形式には、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、無水吸収基剤、水中油又は油中水型乳液、乳液カルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形状ゲル及びカルボワックスを含有する半固形状混合物がある。現在的な用法は高度に効果的であり得る。例えば、或る研究者等は或るアンチセンスオリゴマーが容易に皮膚に吸収されることを示している。詳述すると、これ等の研究者等はメチルホスホネートを用いた。Chemienl Reviews第９０巻第５４３〜５８４頁（１９９０年）中の第５６８頁を参照のこと。また、リポソームは一般的にオリゴマーの給配、特にアンチセンスオリゴマーの給配を助ける上で、多大の将来性が有ることを示した。好適なリポソーム給配ビヒクルの高度に有利な一例は、ＭＤベセスダ所在のライフテクノロジー社製のリポフレクチンの商標名で入手できるカチオン系脂質から製造される。本発明のアンチセンスオリゴマーの濃度又は用量は、苦痛の重大度に応じて異なるが、０．１〜２０μＭの範囲内とすべきであり、さらに０．５〜５μＭの範囲が好ましい。用量はオリゴヌクレオチドの種類に依っても異なり、存在する場合にはオリゴヌクレオチドの化学的修整によっても異なる。容易に理解されるように、投与スケジュールは使用したオリゴマーの種類とオリゴマーの化学的修整に依っても異なる。これは異なる化学的修整はこれ等の化合物の半減期寿命を増加するからである。実験例Ｘ：ＡＳ−ｂＦＧＦにより前処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を用いてのＫＳ障害部生成の阻害ＡＳｂＦＧＦがインビボのＫＳ進行の抑止に有効であるか否かを定めるために、本発明者等はＡＳｂＦＧＦによりＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を前処理して、障害部の生成を阻止しようと試みた。第２表に記した実験に関連して検討したように、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞はマウスに注入するとＫＳ状障害を誘起する(Science su pra（１９８８年）のサラフッディン等の論文を参照のこと）。従って、本発明者等はＡＩＤＳ−ＫＳ細胞をＡＳｂＦＧＦで前処理すれば、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞からの障害部生成を阻止できると予期する。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を上述したようにして生成させた。０．５〜１０μＭに亘る種々な量のＡＳｂＦＧＦ又はＳｂＦＧＦを用いて、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞に接着した。２〜３日後、培養物の若干部分を引出し、上述したように（Science （１９８８年）のサラフッディン等の論文を参照のこと）してアシムマウスに（１サイズ当り２〜３百万細胞の割合で）注入した。ＡＳｂＦＧＦにより接着したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を注入したマウスは、ＫＳ様障害又は同様の障害を生成しなかったが、ＡＳｂＦＧＦで処理しなかったＡＩＤＳ−ＫＳ細胞又はＳｂＦＧＦで処理したＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を注入したマウスは障害を生成した。実験例XI ：ＡＩＤＳ−ＫＳによるＫＳ障害の誘起と引続くＡＳｂＦＧＦの直接注入実験例（第２表）に記したようにして、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を用いて（サラフッディン等の論文を参照のこと）アシムマウスにＫＳ様障害を発生させた。０〜１０μＭ又は０〜６００μｇ微生物の範囲に亘る濃度のホスフェート緩衝の塩水中に溶解したＡＳｂＦＧＦ又はＳｂＦＧＦを、直接マウスの障害部に注入した。ＡＳｂＦＧＦを注入しなかったマウスは障害部が発達し続けた。然し、ＡＳｂＦＧＦを注入したマウスは障害部が小さくなるか又は発達しなかった。実験例XII ：ＡＩＤＳ−ＫＳによるＫＳ障害の誘起と引続くＡＳｂＦＧＦの静脈内投与実験例（第２表）に記したようにして、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞を用いてアシムマウスにＫＳ様障害を発生させた。これ等のマウスに、０．１〜１０μＭの血清濃度を達成するような濃度でホスフェート緩衝の塩水中に溶解したＡＳｂＦＧＦ又はＳｂＦＧＦを静脈注射した。ＡＳｂＦＧＦを注入しなかったマウスは障害部が発達し続けた。然し、ＡＳｂＦＧＦで処理したマウスは障害部が小さくなるか又は発達しなかった。実験例XIII ：直接注入によるＫＳのインビボ処理生理学的に適合性の緩衝液中に溶解したＳＥＱＩＤ No．２のアンチセンスオリゴマーの直接注入により、比較的早期段階のＨＩＶ関連ＡＳを有する患者を治療した。患者は約１０ケの障害を有していた。１日に各障害中に約０．５〜１ μＭに相当する量を直接投入することから処方用量を開始した。１〜３週間に亘り各３〜４日づつ処方用量を継続した。治療開始から３０日後に、障害部の寸法は減少し始めた。６０日後、障害部が存在していた箇所に正常な皮膚の色が戻った。戻らない場合は第２の治療サイクルを行なった。実験例XIV ：静脈投与によるＫＳのインビトロ処理比較的進行した段階のＨＩＶ関連ＫＳを有する患者を、生理学的に適応できる緩衝剤中に溶解したＳＥＱＩＤ No．２のアンチセンスオリゴマーの静脈投与により治療した。患者は約２５ケの皮膚障害と内臓障害を有していた。０．１〜１μＭの血清水準を達成するのに相当する量の１日当りの当初静脈投与から処方用量を開始した。１〜３週間に亘り各３〜４日づつ処方用量を継続した。治療開始から３０日後に、障害部の寸法が減少し始めた。６０日後、障害部が存在していた箇所に正常な皮膚の色が戻った。戻らない場合は第２の治療サイクルを行なった。アンチセンスオリゴマーによる組合せ治療最近の薬剤に基づく治療法がＫＳの処理用に提案され、その中の若干のものは現在臨床的に試みられている。それ等の薬剤は例えばフマギリンとＳＰ−ＰＧ（プロトグリカンの一種）である。Nature第３４８巻第５５５頁（１９９０年）のイングベル等の論文と、Science 第２５５巻第１４３７頁（１９９２年）の中村等の論文を参照のこと。両薬剤は血管形成を阻害し、ＫＳを含む腫瘍の成長を減少するのに有効であることが示された。ＡＳｂＦＧＦと種々な機構により血管形成又は腫瘍成長を阻害する薬剤との組合せ治療も、癌の治療用にフマギリンとα−インターフェロンを組合せることについてフォルクマンとイングベルが最近提案したように、ＫＳ治療に実行できる。Seminars in Cancer Biology第３巻第８９頁（１９９２年）のフォルクマン等の論文を参照のこと。本発明者等は以前に、ｂＦＧＦに対する抗体はＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長を減少し血管形成効果を減少するのに有効であることを示した。Science 第２４３巻第２２３頁（１９８９年）のエンソリ等の論文を参照のこと。同論文では、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞からの条件を整えた培地にｂＦＧＦ抗血清を接種すると、Ｈ−ＵＶＥ細胞の誘起は特定的に阻止された。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞成長はｂＦＧＦ抗血清により同様に阻害された。また、野性の牛の脳のｂＦＧＦに対する親和性精製中性化抗体は、ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の成長を阻害した。従って、ｂＦＧＦに対する抗体又は抗血清と関連するｂＦＧＦアンチセンスオリゴマーは、インビボのＫＳの進行を減少するのに効能が有ることが期待される。血管形成は多くの腫瘍の成長に不可欠であり、数種の薬剤により阻止できる。然し、血管形成要因の生産を特定時に阻止する化合物が欠如している。本発明者等のデータは血管形成要因に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが癌治療に広汎な用途を有することを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月１３日【補正内容】請求の範囲１．患者のカポジ肉腫を阻害するために使用する、薬剤学上許容される担体と組み合わされた、塩基性繊維芽細胞成長因子を暗号化するＲＮＡに対して結合親和力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。２．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、次の配列：ＳＥＤＩＤＮＯ：１、ＳＥＤＩＤＮＯ：２またはＳＥＤＩＤＮＯ：３のうちの一つを有している、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。３．患者のカポジ肉腫を阻害する薬剤を調製する際の、塩基性繊維芽細胞成長因子を暗号化するＲＮＡに対して結合親和力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。４．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、次の配列：ＳＥＤＩＤＮＯ：１、ＳＥＤＩＤＮＯ：２またはＳＥＤＩＤＮＯ：３のうちの一つを有している、請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。５．患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法であって、（ａ）第一の時点で、カポジ肉腫を有する前記患者から、塩基性繊維芽細胞成長因子を検出可能な量含有している体液からなる第一の試料を分離し；（ｂ）この第一の試料中の塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定し；（ｃ）前記第一の時点よりも後の第二の時点で、この患者から前記体液の第二の試料を分離し；および（ｄ）この第二の試料中の塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定する各工程を有しており、ステップ（ｄ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量の、ステップ（ｂ）で測定した量に対する減少によって、カポジ肉腫の寛解を示す、患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法。６．ステップ（ｄ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量の、ステップ（ｂ）で測定した量に対する増大によって、カポジ肉腫の悪化を示す、請求項５記載の患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法。７．前記方法を、患者にカポジ肉腫への治療効果を有する薬剤を使用する際に、カポジ肉腫の治療の進行を監視するのに使用し、ここでこの方法が、更にステップ（ａ）とステップ（ｃ）との間で前記患者へとカポジ肉腫への治療効果を有する前記薬剤を投与することを含んでいる、請求項５記載の患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ガローロバートシーアメリカ合衆国メリーランド州 20817 ベセスダソーンデンテラス 8513

Claims

【特許請求の範囲】１．塩基性繊維芽細胞成長因子を暗号化するＲＮＡに対して結合親和力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。２．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、次の配列：ＳＥＤＩＤＮＯ：１、ＳＥＤＩＤＮＯ：２またはＳＥＤＩＤＮＯ：３のうちの一つを有している、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。３．患者のカポジ肉腫の阻害に使用するための、薬剤学上許容される担体と組み合わされている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。４．患者のカポジ肉腫を阻害する薬剤を調製する際の、請求項１記載のオリゴヌクレオチドの使用。５．患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法であって、（ａ）第一の時点で、カポジ肉腫を有する前記患者から、塩基性繊維芽細胞成長因子を検出可能な量含有している体液からなる第一の試料を分離し；（ｂ）この第一の試料中の塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定し；（ｃ）前記第一の時点よりも後の第二の時点で、この患者から前記体液の第二の試料を分離し；および（ｄ）この第二の試料中の塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定する、各ステップを有しており、ステップ（ｄ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量の、ステップ（ｂ）で測定した量に対する減少によって、カポジ肉腫の寛解を示す、患者のカポジ肉腫の進行を監視する方法。６．ステップ（ｄ）で測定した塩基性繊維芽細胞成長因子の量の、ステップ（ｂ）で測定した量に対する増大によって、カポジ肉腫の悪化を示す、請求項４記載の方法。７．前記方法を、患者にカポジ肉腫への治療効果を有する薬剤を使用する際に、カポジ肉腫の治療の進行を監視するのに使用し、ここでこの方法が、更にステップ（ａ）とステップ（ｃ）との間で前記患者へとカポジ肉腫への治療効果を有する前記薬剤を投与することを含んでいる、請求項４記載の方法。