KR20010072312A - Ｖｅｇｆ 발현의 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

Ｖｅｇｆ 발현의 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 VEGF(혈관 내피세포 성장 인자)를 암호화하는 핵산의 부분에 상응하는 서열을 가지며 동물 종양 모델에서 종양 성장의 억제능을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체에 관한 것이고, 또한 본 발명은 이러한 올리고뉴클레오티드 의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체는 하기의 서열 4의 서열 또는 이의 부분을 포함한다.
서열 4:
3'-GTACCTACAGATAGTCGCGTCGATGACGGTAGG-5'
상기 서열에서, i) 올리고뉴클레오티드중의 모든 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지는 아니며, 모든 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지로 대체되는 것은 아니고/아니거나, ii) 올리고뉴클레오티드가 C5-프로피닐 우리딘, C5-프로피닐 시티딘, C5-헥시닐 우리딘, C5-헥시닐 시티딘, 6-아자 우리딘 및 6-아자 시티딘중에서 선택된 변형된 뉴클레오시드를 포함하지 않는다.

Description

ＶＥＧＦ 발현의 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드{Antisense oligonucleotides for the inhibition of VEGF expression}
본 발명은 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor; 혈관 내피세포 성장 인자)를 암호화하는 핵산의 부분에 상응하는 서열을 갖으며, 동물 종양 모델에서 종양 성장의 억제능을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체에 관한 것이고, 또한 이러한 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
혈관형성은 새로운 모세혈관의 성장으로 정의되며, 성장 및 발생에서 기초적인 역할을 수행한다. 성숙한 사람에서는 혈관형성 반응을 개시하는 능력이 모든 조직에 존재하지만 엄격한 통제하에 있다. 혈관형성은 상처 회복 및 자궁내막 조절과 같은 특별한 상황하에서만 집중적으로 이루어진다. 혈관형성의 조절은 다수의 억제 인자 및 자극 인자 사이의 미묘한 균형에 좌우된다. VPF(Vascular Permeability Factor; 혈관 투과 인자)라고도 또한 불리는 VEGF는 혈관형성의 주요 조절인자이고, 이의 분열유발 효과는 내피 세포에 대해 특이적이다[참조 문헌: Ferrara, Trends Cardiovasc. Med. (1993) 3, 244]. VEGF는, 유사한 생물학적 활성을 발휘하며 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 결과로 생성되는, 적어도 4개의 상이한 이소형(isoform)으로 존재한다. VEGF는 사람의 종양, 및 혈관화 또는 혈관 투과도가 높은 것이 특징인 질환(예: 당뇨성 망막병증, 건선, 노년기 황반변성, 류마티스성 관절염 및 기타 염증 질환)에 걸린 조직에서 비정상적인 높은 수준으로 발현된다. 따라서, VEGF 수준을 선택적으로 감소시키는 약제가 악성 종양 및 기타 혈관형성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
VEGF에 대한 모노클로날 항체가 누드 마우스에서 몇몇 종양의 성장을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Kim et al., Nature (1993) 362, 841]. VEGF 수준을 감소시킬 수 있는 또 다른 가능성은, 특성을 개선시키기 위해 임의로 변형시킨 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이다[참조 문헌: E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990); S. Agrawal, TIBTECH 1996, 376; EP 0653439 A2]. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 특정 서열에 결합하여 mRNA를 분해하고/하거나 단백질 합성을 억제하는 것으로 여겨진다.
EP 제0769 552 A1호에는, VEGF의 발현을 30% 이하로 억제할 수 있는 VEGF에 대한 8개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 기술되어 있다. 당해 올리고뉴클레오티드를, 생체내 조건하에서 안정하지 않은 포스포디에스테르의 형태로 무세포 시스템에서 시험한다. 선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, A549 세포계 분석하에서 모든-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 20μM에서 VEGF 발현의 30 내지 46%의 억제를 보여주는 모든-포스포로티오에이트의 형태(A085R-S, A087P-S, A227-S, A287-S, A311-S 및 A419-S)로 시험된다.
국제출원 제WO 97/39120호에는, 약 1μM 미만의 농도에서 처리된 세포중의 세포성 VEGF 생성을 감소시키는 VEGF mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 기술되어 있다. 특정 태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 1(5'-GCGCTGATAGACATCCATG-3')의 서열을 갖으며, 당해 올리고뉴클레오티드는 모든 뉴클레오시드간 브릿지 또는 특정 뉴클레오시드간 위치에 포스포로티오에이트 그룹을 포함하고, 후자의 경우에 추가로 특정 위치에서 변형된 뉴클레오시드 잔기가 C5-프로피닐 우리딘, C5-프로피닐 시티딘, C5-헥시닐 우리딘, C5-헥시닐 시티딘, 6-아자 우리딘, 및 6-아자 시티딘중에서 선택된다(국제출원 제WO 97/39120호의 표 1).
회의["American Association for Cancer Research 1988"]상에서, VEGF 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성에 관한 데이타가 밝혀졌다(단, 올리고뉴클레오티드의 서열은 기술되지 않았음)[참조 문헌: AACR book Vol. 39, p.95에 공표된 요약서]. 당해 올리고뉴클레오티드가 누드 마우스에서 교모세포종(glioblastoma) 이종이식편의 성장을 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 서열 2(5'-CATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCC-3')의 서열 또는 이의 부분에 상응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 제공한다. 서열 2의 서열은 VEGF를 암호화하는 핵산 서열의 일부이다. 당해 올리고뉴클레오티드(이후 "ON"으로 칭함)와 상응하는 핵산의 부분은 바람직하게는 10 내지 33개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 17 내지 20개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 10(10량체) 내지 33개 뉴클레오티드(33량체), 보다 바람직하게는 17 내지 20개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드(17량체, 18량체, 19량체, 20량체)의 길이를 갖는다. 본 발명의 특정 태양에서, 당해 올리고뉴클레오티드는 19개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
올리고뉴클레오티드는 VEGF를 암호화하는 핵산의 일부에 상응하는 서열을 갖는다. "상응한다"라는 문구는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열이 VEGF를 암호화하는 핵산 서열(예: 유전자, cDNA, mRNA)의 일부와 상보적이어서 올리고뉴클레오티드가 VEGF 암호화 핵산(바람직하게는 VEGF mRNA)의 "센스" 부분과 하이브리드를 형성(결합)할 수 있음을 의미한다. 이러한 연유로 "안티센스 올리고뉴클레오티드"로 불린다. 따라서, 본 발명의 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 다른 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 리보자임이다. 리보자임은 mRNA를 절단하는 촉매적 핵산이다. 바람직하게는 리보자임은 햄머헤드(hammerhead) 리보자임 그룹으로부터 선택된다[참조 문헌: Uhlmann and Peyman, 1990].
VEGF를 암호화하고 당해 올리고뉴클레오티드와 상응하는 핵산 서열은 서열 2 (5'-CATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCC-3')의 서열을 갖는다. 이 서열은 문헌[Figure 1B of Leung et al.(Science (1989) 246, 1306]에 기술된 사람 VEGF cDNA의 뉴클레오티드 185 내지 217과 동등하다. 서열 2의 서열은 또한, 뉴클레오티드를 문헌[Leung et al.(Science (1989) 246, 1306]에 기술된 바와 같이 번호를 매기는 경우, 사람 VEGF mRNA의 뉴클레오티드 185 내지 217과 동등하다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 당해 올리고뉴클레오티드는 사람 VEGF mRNA의 뉴클레오티드 185 내지 203과 동등하다. 사람 VEGF cDNA의 부분은 표 3(서열 19)에 제시되며; 서열 2는 또한 서열 19의 부분에 상응한다.
따라서, 본 발명은 하기의 서열 4의 서열 또는 이의 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
서열 4:
3'-GTACCTACAGATAGTCGCGTCGATGACGGTAGG-5'
5'-GGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATG-3'
상기 서열에서, i) 올리고뉴클레오티드중의 모든 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지는 아니며, 모든 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지로 대체되는 것은 아니고/아니거나, ii) 올리고뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오시드인 C5-프로피닐 우리딘, C5-프로피닐 시티딘, C5-헥시닐 우리딘, C5-헥시닐 시티딘, 6-아자 우리딘 및 6-아자 시티딘중에서 선택된 변형된 뉴클레오시드를 포함하지 않는다. 당해 올리고뉴클레오티드는 서열 2의 서열 또는 이의 부분에 상응한다. 바람직한 태양에서, 당해 올리고뉴클레오티드는 서열 3 또는 이의 부분에 상응한다. 바람직하게는, 서열 3(5'-CATGGATGTCTATCAGCGC-3')의 부분에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 17, 18 또는 19개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
따라서, 당해 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열 4 내지 서열 16중의 하나의 서열을 갖는다:
서열 4는 각각 서열 2에 상응하거나 서열 2에 상보적인 서열이다. 서열 5 내지 서열 16은 서열 2의 서열의 부분에 상응한다. 서열 5 내지 16의 서열은 서열 4의 서열의 부분과 동등하다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 당해 올리고뉴클레오티드는 서열 11(서열 3의 서열을 갖는 VEGF 암호화 서열의 부분에 상응함)의 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드의 유도체, 예를 들면 이의 염, 특히 생리학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다. 염 및 생리학적으로 허용되는 염은, 예를 들어 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Remingtons Pharmaceutical Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA(page 1418)]. 유도체는 또한 특정 뉴클레오시드 위치 및/또는 특정 뉴클레오시드간 브릿지에 하나 이상의 변형을 갖는, 변형된 올리고뉴클레오티드를 의미한다[예: 올리고뉴클레오티드 동족체(예: 폴리아미드-핵산(PNA), 포스폰산 모노에스테르 핵산(PHONA=PMENA) 또는 올리고뉴클레오티드 키메라(예: DNA- 및 PNA-부분으로 이루어지거나 DNA- 및 PHONA-부분으로 구성됨)].
본 발명의 바람직한 대상은 서열 2 또는 이의 부분(서열 4 또는 이의 부분으로 지칭되는 서열)에 상응하는 서열을 갖으며 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드를 변형시켜 올리고뉴클레오티드의 특성을 개선하거나, 즉 상보적인 핵산에 대한 결합 친화성을 개선하기 위해 각각 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키거나 뉴클레아제에 대한 내성을 부여하거나, 또는 세포내 흡수를 증가시킨 것이다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는, 상기한 바와 같은 특성 서열을 가지며, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지를 통해 연결되어 있는 "천연" 뉴클레오시드 데옥시아데노신(아데닌 + β-D-2'-데옥시리보스), 데옥시구아노신(구아닌 + β-D-2'-데옥시리보스), 데옥시시티딘(시토신 + β-D-2'-데옥시리보스) 및 티미딘(티민 + β-D-2'-데옥시리보스)으로 구성된 "천연" DNA와 비교시 하나 이상의 화학적 변형을 추가로 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드는 동일한 유형의 변형 및/또는 상이한 유형의 변형을 하나 이상 가질 수 있는데, 각각의 변형 유형은 올리고뉴클레오티드를 변형시키는데 사용되는 것으로 공지된 유형의 변형으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
화학적 변형의 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 다음의 참조 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 and "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, New Jersey, USA 1993 and S.T. Crooke, F. Bennet, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129; J. Hunziker and C. Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417].
예를 들어, 천연 DNA와 비교시, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지, β-D-2'-데옥시리보스 단위 및/또는 천연 뉴클레오시드 염기(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민)을 각각 변형시키거나 치환시킬 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형을 가질 수 있으며, 천연 DNA로 구성된 동일 서열의 올리고뉴클레오티드와 비교시, 특정 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지 및/또는 특정 β-D-2'-데옥시리보스 단위 및/또는 특정 천연 뉴클레오시드 염기 위치에 각 변형이 위치할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 변형을 포함하며 각 변형이 하기의 변형중에서 독립적으로 선택되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
a) 뉴클레오시드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지의 변형된 뉴클레오시드 브릿지로의 대체;
b) 뉴클레오시드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 브릿지의 데포스포 브릿지로의 대체;
c) 당 인산염 주쇄 중의 당 인산염 단위의 또 다른 단위로의 대체;
d) β-D-2'-데옥시리보스 단위의 변형된 당 단위로의 대체;
e) 천연 뉴클레오시드 염기의 변형된 뉴클레오시드 염기로의 대체;
f) 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 주는 분자에의 접합;
g) 임의로 적절한 링커를 통해 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트 또는 이의 유도체에의 접합; 및
h) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 3'-3' 및/또는 5'-5' 역위의 도입.
올리고뉴클레오티드의 화학적 변형의 보다 상세한 예는 다음과 같다:
a) 뉴클레오시드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지의 변형된 뉴클레오시드간 브릿지로의 대체{여기서, 변형된 뉴클레오시드간 브릿지는, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR1R1'-포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬 에스테르, 포스페이트-[(C6-C12)아릴-((C1-C21)-O-알킬]에스테르, (C1-C8)알킬-포스포네이트 및/또는 (C6-C12)-아릴포스포네이트 브릿지, (C7-C12)-α-하이드록시메틸아릴(참조: WO 제95/01363호)중에서 선택되며, 상기에서, (C6-C12)아릴, (C6-C20)아릴 및 (C6-C14)아릴은 치환되지 않거나 할로겐, 알킬, 알콕시, 니트로 또는 시아노로 치환되고, R1과 R1'는 각각 독립적으로 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, (C6-C14)-아릴-(C1-C8)-알킬, 바람직하게는 수소, (C1-C8)-알킬, 및/또는 메톡시에틸, 바람직하게는 수소, 특히 (C1-C4)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, 또는 R1과 R1'은 이들을 연결하는 질소 원자와 함께, O, S 및 N으로 이루어진 그룹중의 헤테로원자를 추가로 포함할 수 있는 5 내지 6원의 헤테로사이클릭 환을 형성한다]};
b) 뉴클레오시드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 브릿지의 데포스포 브릿지[예를 들어, 데포스포 브릿지는 다음 문헌에 기술되어 있다; 참조 문헌: Uhlmann, E. and Peyman, A. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press. Totowa 1993, Chapter 16, 355ff]로의 대체(여기서, 데포스포 브릿지는, 예를 들어 데포스포 브릿지 포름아세탈, 3'-티오포름아세탈, 메틸하이드록실아민, 옥심, 메틸렌디메틸-하이드라조, 디메틸렌설폰 및/또는 실릴 그룹중에서 선택된다);
c) 당 인산염 주쇄(당 인산염 주쇄는 당 인산염 단위로 구성된다) 중의 당 인산염 단위(β-D-2'-데옥시리보스 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 함께 당 인산염 단위를 형성한다)의 또 다른 단위로의 대체{여기서, 또 다른 단위는, 예를 들면 "모르폴리노-유도체" 올리고머[참조 문헌: E.P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17(1989) 6129]를 형성하기에 적합하고(즉, 모르폴리노 유도체 단위로의 대체), 폴리아미드 핵산("PNA")[참조 문헌: P.E. Nielsen et al., Bloconj. Chem. 5(1994)3 및 EP 제0672677 A2호]을 형성하기에 적합하며(즉, PNA주쇄 단위(예: 2-아미노에틸글리신)로의 대체), 포스폰산 모노에스테르 핵산("PHONA")[참조 문헌: Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35(1996) 2632-2638 및 EP 제0 739898 A2호]를 형성하기에 적합하다(즉, PHONA 주쇄 단위로의 대체)};
d) β-D-2'-데옥시리보스 단위의 변형된 당 단위로의 대체{여기서, 변형된 당 단위는, 예를 들어 β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-O-(C1-C6)알킬-리보스(바람직하게는 2'-O-메틸리보스), 2'-O-(C2-C6)알케닐-리보스, 2'-[O-(C1-C6)알킬-O-(C1-C6)알킬]-리보스, 2'-NH2-2'-데옥시리보스, β-D-크실로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스 및 카보사이클릭[참조 문헌: Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114(1992) 8320)] 및/또는 개환 당 동족체[참조 문헌: Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223] 및/또는 바이사이클로 당 동족체[참조 문헌: M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481]중에서 선택된다};
e) 천연 뉴클레오시드 염기의 변형된 뉴클레오시드 염기로의 대체{여기서, 변형된 뉴클레오시드 염기는, 예를 들어 우라실, 하이포크산틴, 5-(하이드록시메틸)우라실, N2-디메틸구아노신, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 2,4-디아미노퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린(바람직하게는 7-데아자-7-치환된 및/또는 7-데아자-8-치환된퓨린) 또는 천연 뉴클레오시드 염기의 또 다른 변형(변형된 뉴클레오시드 염기는, 예를 들어 EP 제0 710 667 A2호 및 EP 제0 680 969 A2호에 기술되어 있다)중에서 선택된다};
f) 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 미치는 분자에의 접합{여기서, 올리고뉴클레오티드의 특성[예: 세포막을 투과하거나 세포내로 들어가는 올리고뉴클레오티드의 능력, 뉴클레아제에 대한 안정성, VEGF 암호화 표적 서열에 대한 친화성, 올리고뉴클레오티드의 약력학, VEGF 암호화 표적 서열을 공격하는 안티센스 올리고뉴클레오티드/리보자임의 능력, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 접합된 분자가 각각 VEGF 암호화 표적 서열과 하이브리드화하는 경우에 결합하고/하거나 가교결합하는 능력]에 (유리하게) 영향을 미치는 하나 이상의 분자에 올리고뉴클레오티드가 접합되며, 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있는 분자의 예로는 폴리리신, 개재제(intercalating agent)(예: 피렌, 아크리딘, 페나진 또는 페난트리딘), 형광제(예: 플루오레세인), 가교제(예: 프소랄렌 또는 아지도프로플라빈), 지질친화성 분자(예: (C12-C20)-알킬), 지질(예: 1,2-디헥사데실-락(rac)-글리세롤), 스테로이드(예: 콜레스테롤 또는 테스토스테론), 비타민(예: 비타민 E), 바람직하게는 인산염 그룹을 통해 올리고뉴클레오티드에 결합되어 있는 폴리- 또는 올리고에틸렌글리콜(예: 트리에틸렌글리콜포스페이트), (C12-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르 및/또는 O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)알킬이 있다. 이들 분자들은 5' 말단 및/또는 3' 말단 및/또는 서열내에, 예컨대 뉴클레오시드 염기에 접합될 수있다. 올리고뉴클레오티드를 a) 지질친화성 분자, 예를 들면 (C12-C20)-알킬, b) 스테로이드, 예를 들면 클레스테롤 및/또는 테스토스테론, c) 폴리- 및/또는 올리고에틸렌 글리콜, d) 비타민 E, e) 개재제, 예를 들면 피렌, f) (C14-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르, 및/또는 g) O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-알킬에 접합시키는 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되었으며, 이는 문헌[참조 문헌: Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan in "Antisense Research and Applications", Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Chapter 17, p. 303ff. 및 EP-A 제0 552 766호]에 기술되어 있다};
g) 바람직하게는 적절한 링커 분자를 통해 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트에의 접합{여기서, 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트는, 예를 들어 2'5'-연결된 트리아데닐레이트, 2'5'-연결된 테트라아데닐레이트, 2'5'-연결된 펜타아데닐레이트, 2'5'-연결된 헥사아데닐레이트 또는 2'5'-연결된 헵타아데닐레이트 분자 및 이의 유도체중에서 선택되고; 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트 유도체의 예는 코디세핀(2'5'-연결된 3'-데옥시 아데닐레이트)이고; 적절한 링커의 예는 트리에틸렌글리콜이며; 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트의 5' 말단은 하나 이상의 산소원자가, 예를 들어 황원자로 치환될 수 있는 포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트 잔기를 포함해야 하며, 포스페이트 또는 트리포스페이트 잔기로 치환되는 것이 바람직하다}; 및
h) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 3'-3' 및/또는 5'-5' 역위의 도입{여기서, 이런 유형의 화학적 변형은 당업자에게 공지되었으며, 예를 들면 문헌[참조 문헌: M. Koga et al., J. Org. Chem. 56(1991) 3757, EP 제0 464 638호 및 EP 제0 593 901호]에 기술되어 있다}.
당 인산염 주쇄 중의 당 인산염 단위를 또 다른 단위(즉, PNA 주쇄 단위 또는 PHONA 주쇄 단위)로 대체하는 것은 뉴클레오티드를, PNA 단위 또는 PHONA 단위로 대체하는 것이 바람직하며, 여기서 PNA 단위 또는 PHONA 단위는 천연 뉴클레오시드 염기 및/또는 변형된 뉴클레오시드 염기[예: 우라실, 하이포크산틴, 5-(하이드록시메틸)우라실, N2-디메틸구아노신, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 2,4-디아미노퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린(바람직하게는 7-데아자-7-치환된 및/또는 7-데아자-8-치환된 퓨린) 또는 천연 뉴클레오시드 염기의 또 다른 변형(변형된 뉴클레오시드 염기는, 예를 들어 EP 제0 710 667 A2호 및 EP 제0 680 969 A2호에 기술되어 있다) 중 하나]를 이미 포함하고 있다.
EP 제0 710 667 A2호, EP 제0 680 969 A2호, EP 제0 464 638호, EP 제0 593 901호, WO 제95/01363호, EP 제0 672 677 A2호, EP 제0 739 898 A2호 및 EP 제0 552 766호에 기술된 변형이 본원에서 참조로 인용된다.
서열 11의 서열, 변형된 뉴클레오시드간 브릿지 및 3'-말단에 3'-3'-역위를갖는 올리고뉴클레오티드의 예로는 ON 57: 5'-G*C*GC*TGA*T*A*GA*C*AT*C*C*A*T(3'3')G-3' [여기서, (3'3')는 EP 0 464 638에 기술된 바와 같은 3'3'-포스포디에스테르 연결이고, "*"는 변형된 뉴클레오시드간 브릿지이다]이 있다.
서열 11의 서열을 가지며, 포스포디에스테르 연결이 아릴포스포네이트 브릿지로 대체된 올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같다:
[여기서, "NBP"는 α-하이드록시벤질 포스포네이트 연결, 바람직하게는 국제출원 제WO 95/01363호에 기술된 바와 같은 α-하이드록시-2-니트로벤질 포스포네이트 연결이고, "N"은 2'-O-알킬리보뉴클레오시드, 바람직하게는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드이고, 이 경우에 "T"는 2'-O-알킬우리딘, 바람직하게는 2'-O-메틸우리딘이다].
서열 11의 서열을 갖으며 뉴클레오시드 염기가 문헌[EP 0710 667 및 EP 0 680 969]에 기술된 변형된 뉴클레오시드 염기로 치환된 올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같다:
[여기서, 소문자 "a"는 8-아자-데옥시아데노신이거나, 또는 비치환되거나 치환된 7-데아자-데옥시아데노신이고, 소문자 "g"는 8-아자-데옥시구아노신이거나,또는 비치환되거나 치환된 7-데아자-데옥시구아노신(EP 0 710 667 A2 및 EP 0 680 969 A2에 기술된 염기 변형의 예)이고, "N"은 2'-O-알킬리보뉴클레오시드, 바람직하게는 2'-O-메틸리보-뉴클레오시드이고, 이 경우에 "T"는 2'-O-알킬우리딘, 바람직하게는 2'-O-메틸우리딘이다].
본 발명의 특정 태양에서, 올리고뉴클레오티드 서열내의 하나 이상의 뉴클레오시드간 브릿지는, 바람직하게는 포스포로티오에이트로 변형된다. 모든-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에서, 모든 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지는 포스포로티오에이트로 변형된다. 바람직하게는, 본 발명은, 올리고뉴클레오티드중의 모든 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포로티오에이트(포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지)로 균일하게 변형되는 것은 아니며, 만일 올리고뉴클레오티드가 서열 11의 서열을 갖는다면 특히 그러하지 않은 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 뉴클레오시드간 브릿지는 상이한 유형의 변형을 갖거나, 변형되지 않는다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드 서열내에 있는 특정한 위치만이 변형된다(즉, 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드). 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 몇몇 문헌에서 최소 변형된 올리고뉴클레오티드로 명명되기도 한다. 서열내에서, 변형은 특정 위치(특정 뉴클레오티드, 특정 뉴클레오시드, 특정 뉴클레오시드 염기, 특정 뉴클레오시드간 브릿지)에 위치할 수 있다.
본 발명의 특정 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 몇몇 포스포디에스테르 브릿지를 변형된 뉴클레오시드간 브릿지(예: 포스포로티오에이트 브릿지)로 대체함으로써 제조된다. 특히, 본 발명은 단지 일정한 정도로 변형된, 상기한 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 ON 1 및 ON 62 내지 73은 서열 4 내지 서열 16에 대한 변형된 뉴클레오시드간 브릿지의 위치의 예이다:
[여기서, "*"는 서열내의 뉴클레오시드간 브릿지 변형의 위치를 보여준다]. 본 발명의 바람직한 태양에서, 변형의 유형은 포스포디에스테르 브릿지의 포스포로티오에이트 브릿지로의 대체이며, 이 경우에 "*"는 포스포로티오에이트 뉴클레로시드간 브릿지의 위치를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 태양은 ON 1 (3'-G*T*A*C*C*TA*C*AGA*T*AGT*CG*C*G-5')(여기서, "*"는 포스포로티오에이트 브릿지이다)이다.
특히, 본 발명은, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 있는 1 내지 5개의 말단 뉴클레오티드 단위를 상응하는 뉴클레오시드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드간 브릿지를 변형시켜 보호한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 1 내지 5개의 말단 뉴클레오티드 단위는, 상응하는 뉴클레오시드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드간 브릿지를 변형시켜 보호한다. 임의로, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있는 1 내지 5개의 말단 뉴클레오티드 단위는, 상응하는 뉴클레오시드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드간 브릿지를 변형시켜 또한 보호한다. 임의로, 올리고뉴클레오티드는 다른 위치에 추가의 변형을 포함할 수 있다. 서열 11의 서열 및 상기와 같은 변형 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드의 예는 ON 2 (5'-G*CG*C*T*G*A*T*AG*A*C*A*T*C*C*A*T*G-3')(여기서, "*"는 뉴클레오시드간 브릿지 변형의 위치를 가리키며, 바람직하게는 "*"는 포스포로티오에이트 브릿지이다)이다.
또한, 본 발명은, 하나 이상의 내부 피리미딘 뉴클레오시드 및/또는 이 피리미딘 뉴클레오시드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드간 브릿지가 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3'말단에 있는 1 내지 5개의 말단 단위는 상응하는 뉴클레오시드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드간 브릿지를 변형시켜 보호하고, 추가로 하나 이상의 내부 피리미딘 뉴클레오시드 및/또는 이 피리미딘 뉴클레오시드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치한 뉴클레오시드간 브릿지가 변형된다.
부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 특질은 다음 문헌에 기술되어 있다[ A. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 377 (1996) 67-70 및 EP 제0 653 439호]. 상기한 문헌은 본원에서 참조로 인용된다. 이러한 경우에는, 5' 말단 및/또는 3' 말단에 있는 1 내지 5개의 말단 뉴클레오티드 단위가 보호되는데, 즉 상응하는 뉴클레오시드의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 예를 들어 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지로 대체된다. 또한, 바람직하게는, 하나 이상의 내부 피리미딘 뉴클레오시드(또는 각각 뉴클레오티드) 위치가 변형되며; 바람직하게는 피리미딘 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 뉴클레오시드간 브릿지가 예를 들어 포스포로티오에이트에 의해 변형된다. 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 특히 유리한 특성을 나타내며; 예를 들어 이들은 최소한의 변형으로 특히 높은 뉴클레아제 안정도를 나타낸다. 이들은 또한 모든-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 사용과 종종 연관된 비-안티센스 효과에 대해 상당히 감소된 성향을 갖는다[참조 문헌: Stein and Krieg (1994) Antisense Res. Dev. 4. 67]. 또한, 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 모든-포스포로티오에이트의 것보다 높은 결합 친화성을 나타낸다.
본 발명은 특히 부분적으로/최소로 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 서열 11의 서열을 갖는 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 변형 패턴의 예는 다음과 같다:
(여기서, "*"는 뉴클레오시드간 브릿지 변형의 위치이고, 바람직하게는 "*"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지이다).
상이한 서열, 예를 들면 서열 4 내지 서열 16중의 하나의 서열을 갖는 본 발명에 따른 또 다른 올리고뉴클레오티드에 대한 유사한 패턴의 뉴클레오시드간 브릿지 변형도 또한 가능하다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 한가지 유형의 변형외에 다른 유형의 변형을 가질 수 있다. 예를 들면, 특정 뉴클레오시드간 브릿지에 변형체를 갖는 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 추가적 변형, 예를 들면 β-D-2'-데옥시리보스의 변형 또는 천연 뉴클레오시드 염기의 변형을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 태양에 대한 또 다른 예는, 뉴클레오시드의 변형, 예를 들면 뉴클레오시드 염기의 변형 및/또는 β-D-2'-데옥시리보스 단위의 변형을 갖는 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, β-D-2'-데옥시리보스는 2'-O-(C1-C6)알킬리보스로 대체되고, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸리보스로 대체(β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드의 2'-O-메틸리보뉴클레오시드로의 대체)된다. 예를 들어, 서열 11을 갖는 상기와 같은 올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같은 패턴의 뉴클레오시드 변형 패턴을 나타낼 수 있다:
[여기서, "N" 변형된 뉴클레오시드(예를 들면, 뉴클레오시드 염기의 변형 및/또는 β-D-2'-데옥시리보스, 바람직하게는 2'-O-알킬리보뉴클레오시드, 보다 바람직하게는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드의 변형)의 위치를 가리키며, 이 경우에 "T"는 2'-O-알킬우리딘, 바람직하게는 2'-O-메틸우리딘이다].
상이한 서열, 예를 들면 서열 4 내지 서열 16중의 하나의 서열을 갖는 본 발명에 따른 또 다른 올리고뉴클레오티드에 대한 유사한 패턴의 뉴클레오시드 변형도 또한 가능하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 위치(바람직하게는 포스포로티오에이트 브릿지)에 변형된 뉴클레오시드간 브릿지를 포함하고, 추가로 특정 위치에 뉴클레오시드의 변형(바람직하게는, β-D-2'-데옥시리보스의 2'-O-(C1-C6)알킬리보스로의 대체)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 뉴클레오시드간 변형은 포스포디에스테르 브릿지를 포스포로티오에이트 브릿지로 대체한 것이고, β-D-2'-데옥시리보스의 변형은 2'-O-메틸리보스로 대체한 것이며; 이 경우에 올리고뉴클레오티드는, 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지, 및 뉴클레오시드인 2'-O-메틸-리보뉴클레오시드 및 β-D-2'-데옥시리보뉴클레오시드를 포함하는, 변형 및 비변형된 DNA 및 RNA 부분으로 구성된 키메라 올리고뉴클레오티드이다. 서열 11의 서열을 가지며 특정 뉴클레오시드간 브릿지 및 특정 뉴클레오시드 위치에 변형을 갖는 상기한 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같다(변형 패턴의 예):
[여기서, "*"은 뉴클레오시드간 브릿지 변형의 위치를 나타내고, "N"은 변형된 뉴클레오시드(예: 뉴클레오시드 염기의 변형 및/또는 β-D-2'-데옥시리보스의 변형)이고, 바람직하게는, "*"는 포스포로티오에이트 브릿지이고, "N"은 2'-O-알킬리보뉴클레오시드, 바람직하게는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드의 위치를 가리키며, 이 경우에 "T"는 2'-O-알킬우리딘, 바람직하게는 2'-O-메틸우리딘이다].
또한, 상이한 서열, 예를 들면 서열 4 내지 서열 16중의 하나를 갖는 본 발명에 따른 다른 올리고뉴클레오티드에 대한 필적할만한 변형 패턴도 가능하다.
또한, 본 발명은, 3'-말단의 최종 뉴클레오티드가 2'-데옥시뉴클레오티드인 유도체, 예를 들면(여기서, "*" 및 "N"은 상기한 바와 동일한 의미를 갖는다)에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 PNA 단위에 의한 당 인산염 주쇄의 변형체를 포함한다. 서열 11의 서열을 갖는 이러한 PNA-DNA 키메라의 예는 하기의 변형 패턴을 나타낸다(이들의 일반적인 고안에대해서는 EP 0 672 677을 참조한다):
(여기서, 소문자는 PNA 단위를 의미한다)
또 다른 변형 패턴, 예를 들면 DNA-PNA-DNA, PNA-DNA도 가능하다. PHONA/DNA 키메라에 대한 필적할 만한 변형 패턴도 또한 가능하다. 이들 변형 패턴은 임의의 다른 변형 유형과 조합될 수 있으며, 또한 상이한 서열, 예를 들면 서열 4 또는 서열 16중의 하나를 갖는 본 발명에 따른 다른 올리고뉴클레오티드에 대한 유사한 변형 패턴도 가능하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 PNA 단위에 의한 치환과 데옥시리보뉴클레오시드, 예를 들어 2'-O-알킬-리보뉴클레오시드에 의한치환의 조합을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드에 대한 예는 모두 서열 11의 서열을 가지며, 다음과 같다:
(여기서, "N"은 예를 들면 2'-O-(C1-C6)알킬리보뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드(이 경우에 "T"는 2'-O-알킬우리딘, 바람직하게는 2'-O-메틸우리딘이다)의 변형된 뉴클레오시드의 위치를 표시하며, 소문자는 PNA 단위를표시한다).
물론, 이러한 올리고뉴클레오티드는 이들의 DNA 부분중에 뉴클레오시드간 브릿지를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 뉴클레오티드 ON40, ON41, ON42, ON43, ON44, ON45, ON46 및 ON47은 올리고뉴클레오티드 ON1, ON2, ON3, ON4, ON5, ON6, ON7, ON8, ON9, ON10, ON11, ON12, ON13, ON14 및 ON15에 제시된 뉴클레오시드간 브릿지 변형을 포함할 수 있다(올리고뉴클레오티드 ON40 내지 ON47의 변형 패턴과 ON1 내지 ON15의 변형 패턴중의 하나와의 조합). 상이한 서열, 예를 들면 서열 4 내지 서열 16의 서열중의 하나를 갖는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 대한 유사한 변형 패턴이 가능하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양은 3' 및/또는 5' 말단에 하나 이상의 (C12-C18)-알킬 잔기, 바람직하게는 C16-알킬 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. (C12-C18)-알킬 잔기는, 예를 들면 EP 0 552 766 A2에 기술된 바와 같이 포스포디에스테르로서 또는 O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-알킬의 3'-포스포디에스테르로서 결합될 수 있다. 바람직한 태양은 3'-말단 및/또는 5'-말단에 결합된 C16-알킬 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. EP 0 552 766 A2는 본원에 참조로서 인용된다.
이러한 올리고뉴클레오티드의 예로는 ON48 및 ON49이 있으며 (이들 둘 모두 서열 11의 서열을 가지며, ON1에서와 마찬가지로 특정 위치에 뉴클레오시드간 변형체외에 추가로 5' 말단 또는 3'말단에 연결된 C16-알킬을 갖는다)(이러한 올리고뉴클레오티드는 또한 임의의 다른 서열 및 변형 패턴을 가질 수 있다), 다음과 같다:
또한, 본 발명은, 3'-말단이 트리에틸렌글리콜(TEG) 포스포디에스테르로서 변형된 유도체에 관한 것이며, 이러한 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 11의 서열과 ON39의 변형 패턴을 가지며, 다음과 같다:
본 발명의 또 다른 구체적 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트-5'-(티오)포스페이트에 링커를 통해 연결된다. 당해 링커는, 예를 들면 올리고-에틸렌글리콜-포스페이트, 바람직하게는 트리에틸렌글리콜-포스페이트, 테트라-에틸렌글리콜-포스페이트 또는 헥사-에틸렌글리콜-포스페이트 잔기일 수 있다. 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트는, 바람직하게는 5'-하이드록시 작용기가 포스페이트 또는 티오포스페이트 잔기에 의해 치환된 테트라- 또는 펜타-아데닐레이트로서 2'-말단을 통해 결합된다. 2'5'-올리고뉴클레오티드는 RNase L를 유도하여 표적 mRNA를 절단하는 것으로 공지되어 있다[Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 1300]. 2'5'-올리고아데닐레이트는 리보뉴클리아제 L(RNase L)을 활성화시켜 이에 의해 VEGF mRNA를 분해하는 역할을 수행한다. 2'5'-연결된 아데닐레이트 대신, 뉴클레오시드 동족체 코르디세핀으로 부터 유도된 2'5'-연결된 3'-데옥시 아데닐레이트가 또한 도입될 수 있다. 이러한 경우에, 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드 부분은 2'-O-(C1-C6)알킬리보뉴클레오시드(바람직하게는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드) 또는 PNA에 의해 특정 위치에서 변형되는 것이 바람직하다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 예는 예컨대 서열 10의 서열을 가질 수 있으며, 다음과 같은 ON51 및 ON52이 있다(이러한 올리고뉴클레오티드는 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 임의의 다른 서열을 가질 수 있다):
[여기서, "teg"는 트리에틸렌글리콜 (링커)이며, "rA"는 리보-A (2'5'-연결된 아데닐레이트)이며, "Co"는 3'-데옥시-A (코르디세핀)(2'5'-연결된 3'-데옥시 아데닐레이트)이며, "p*"는 5'-티오포스페이트이다].
또한, 이러한 올리고뉴클레오티드는 또 다른 변형을 가질 수 있으며, 예를 들면 당해 올리고뉴클레오티드는 ON 38의 변형 패턴을 가질 수 있다(이러한 올리고뉴클레오티드는 또한 임의의 다른 변형 패턴을 가질 수 있다). 이의 예는 다음과 같다:
[여기서, "teg"는 트리에틸렌글리콜 (링커)이며, "N"은 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 2'-O-메틸리보뉴크레오시드이며(이 경우에, "T"는 2'-O-알킬우리딘, 바람직하게는 2'-O-메틸우리딘이다), "rA"는 리보-A (2'5'-연결된 아데닐레이트)이며, "Co"는 3'-데옥시-A (코르디세핀)(2'5'-연결된 3'-데옥시 아데닐레이트)이며, "p*"는 5'-티오포스페이트이며, "*"는 변형된 뉴클레오시드간 브릿지, 바람직하게는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지이다].
본 발명의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 표적 단백질(즉 VEGF) 또는 표적 서열(VEGF를 암호화하는 핵산, 바람직하게는 VEGF mRNA)의 발현을 각각 억제할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 VEGF의 발현을 억제한다. 이로써, 미처리된 발현에 비해 당해 VEGF 단잭질 수준이 감소된다. 특이성은, 예를 들면 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 VEGF 발현에 미치는 효과와 동일한 올리고뉴클레오티드가 베타 액틴 발현에 미치는 효과를 mRNA 및/또는 단백질 수준면에서 비교 측정함으로써 입증될 수 있다: 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드로 처리시, 단지 VEGF mRNA 및/또는 단백질 수준이 감소되는 반면, 예컨대 베타 액틴 (하우스-키핑(house-keeping) 단백질) mRNA 및/또는 단백질 수준은 변화되지 않고 유지된다. 특히, 올리고뉴클레오티드의 효과는 VEGF mRNA 및/또는 VEGF 단백질의 양을 (예를 들면, 당해 올리고뉴클레오티드의 부재하에 대조 실험과 비교하여) 측정함으로써 입증될 수 있다. 예를 들면, 당해 올리고뉴클레오티드의 억제 효과는 당해 올리고뉴클레오티드로 세포 배양물을 처리함으로써 시험관내에서 측정될 수 있다. 이어서, 예를 들면, mRNA 수준은 세포 용해물 제제내에서, 예컨대 실시예 6에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. VEGF 단백질 수준(예를 들면, VEGF 단백질의 절대량(g) 또는 미처리된 세포와 비교한 상대량(%))은 상층액(예: 배양 배지)(분비된 VEGF의 양) 및/또는 막 제제(막-결합된 VEGF의 양) 및/또는 세포 용해물로 부터 측정될 수 있다. 분비된 VEGF 단백질의 양은, 예를 들면 실시예 5에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 특정 태양에서, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 세포 배양물에서 각각 VEGF mRNA의 발현을 억제하고/하거나 VEGF 단백질 수준을 감소시킬 수 있다(IC50은 약 1μM 및/또는 500nM, 200nM, 100nM 이하이다).
본 발명의 또 다른 특정 태양에서, 상기 억제는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 대해 특이적이다; 이 경우에, 본 발명에 따른 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드만이 VEGF 단백질 및/또는 VEGF mRNA 수준을 감소시킨다. 이들 특이적 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 부정합(mismatch) 또는 혼동(scrambled) 서열이 사용되는 경우, 이들이 다소 상당히 변화된다면, 이들 수준은 동일한 정도로 변화되지 않는다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 ON 55 및 ON 56과 유사하게 대조용 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. ON 55는 서열 11에 대한 부정합 대조 표준이며; 이는 서열 17의 서열을 가지며 특정 위치("*")에 포스포로티오에이트 변형체를 갖는다. ON 56은 서열 11에 대한 혼동 대조 표준이며; 이는 서열18의 서열을 가지며 특정 위치("*")에 포스포로티오에이트 변형체를 갖는다. 이들 두 개의 올리고뉴클레오티드가, 예를 들면 ON 1과의 비교 실험에서 사용된다(표 1 및 도 2). 대조용 올리고뉴클레오티드는 1μM 이하의 농도하에서 세포 배양물중의 VEGF mRNA의 발현을 억제하지 않는다.
특정 위치에 포스포로티오에이트 변형체를 갖는 서열 17 (ON 55):
특정 위치에 포스포로티오에이트 변형체를 갖는 서열 18 (ON 56):
또한, 천연 뉴클레오시드 염기를 갖는 부분적 포스포로티오에이트화 올리고뉴클레오티드 ON 1은, C5-프로피닐 우라실 및 C-5-프로피닐 시토신 염기 치환체를 추가로 갖는 부분적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와 마찬가지로 상이한 약리학적 프로파일을 보여준다. 이러한 C5-프로피닐 우라실 및 C5-프로피닐 시토신 염기 동족체는 예컨대 국제출원 제WO97/39120호에 기술되어 있다:
(여기서, 밑줄친C는 5-프로피닐 dC이고,T는 5-프로피닐 dU이고, "*"는 포스포로티오에이트이다).
상이한 유형의 변형체를 갖는 여러 올리고뉴클레오티드를 시험한다(ON 1, ON28, ON 29, ON 53 및 ON 54). 표 1에 제시된 결과로 부터 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드(정상 서열 및 상이한 유형의 변형체)는 대조용올리고뉴클레오티드(ON 55, ON 56)에 비해 세포 배양물에서 VEGF 단백질 합성을 효율적으로 억제한다. 실시예 4에 기술된 바와 같이, 세포를 올리고뉴클레오티드 ON1, ON28, ON29, ON53, ON54, ON55 및 ON56으로 처리한 후, 상층액중의 분비된 VEGF 단백질의 양을 분석한다. 이러한 세포계 분석에서, 올리고뉴클레오티드 ON54는 최저의 IC50값(즉, 약 230nM)을 나타낸다. 또한, ON1은 매우 양호한 IC50값(즉, 약 300nM)을 나타내며, ON29 및 ON53의 IC50값은 각각 500nM 및 1500nM로 측정된다. 시험된 본 발명에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드는 모두 대조용 올리고뉴클레오티드 ON55 및 ON56(IC50> 3μM) 보다 훨씬 우수한 결과를 나타낸다. 추가로, ON1에 대해서는 mRNA 수준에 미치는 효과를 시험한다. ON1의 경우, mRNA 농도를 약 50% 감소시키는 IC50값이 약 100nM로 측정되었다. 대조적으로, 상이한 서열을 갖지만 동일한 유형의 변형과 유사한 변형 패턴을 갖는 ON55 및 ON56의 경우에, mRNA 수준에 미치는 효과가 관찰되지 않았다. 또한, 3개의 올리고뉴클레오티드(ON1, ON55 및 ON56)도 전부 β-액틴 mRNA 수준에 효과를 미치를 않았다. 따라서, ON1의 효과가 VEGF mRNA에 특이적이며, VEGF mRNA에 미치는 효과가 특정 올리고뉴클레오티드 서열에 특이적이다. 더우기, 이는 ON1이 작용하는 기작에 대한 암시를 준다. VEGF mRNA 수준이 ON1으로 처리시 특별히 감소되기 때문에, VEGF mRNA에 대한 ON1의 결합이 십중팔구 RNase H를 활성화시키거나 당해 결합이 RNase H에 대한 기질을 제공한다. 상이한 유형의 변형을 갖는 다른 유형의 올리고뉴클레오티드의 경우, 종국적으로 VEGF 단백질 수준의 감소를 유도하는 작용기작이 상이할 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는, 척추동물에 투여되는 경우, VEGF 발현을 억제한다. 따라서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 척추동물, 특히 사람 및 마우스에서 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있는 능력을 갖는다. VEGF 발현 억제의 특이성은, 예를 들면 미처리된 피검자와 비교하여 처리된 피검자의 종양중의 VEGF mRNA 및/또는 VEGF 단백질 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 종양 성장의 억제는, 예를 들면 처리된 동물 대 미처리된 동물의 종양 용적의 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다.
척추동물을 치료하기 위하여, 당해 올리고뉴클레오티드가 20mg/kg(체중)의 농도, 바람직하게는 12mg 이하/kg(체중)의 농도, 가장 바람직하게는 약 4mg 이하/kg(체중)의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적 조성물은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 피검자에게 4 또는 12 mg/kg(체중)의 농도로 투여한지 17일 후, 종양 용적을 미처리된 피검자에 비해 30% 이상, 바람직하게는 50% 초과로 감소시킬 수 있는 능력을 갖는다. 당해 올리고뉴클레오티드가 척추동물에서 성장한 사람 종양을 억제할 수 있는 능력을 측정하기 위하여, 사람을 제외한 척추동물(바람직하게는 마우스)를 이용한 연구를 수행할 수 있다. 이러한 연구에서, 종양 이종이식편은, 예를 들면 당해 올리고뉴클레오티드를 투여하기 전에 사람을 제외한 척추동물에서 1 내지 4일간 성장할 수 있다. 당해 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적 조성물은 이러한 사람을 제외한 척추동물에게 투여될 수 있다.
바람직하게는, 종양 용적에 미치는 올리고뉴클레오티드의 효과는, 2x106개의 사람 U87-MG 세포를 0일째에 이식함으로써 생산된, U87-MG 이종이식편을 갖는 누드 마우스를 사용하여 측정한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 제조 방법은 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성법을 포함한다. 바람직하게는, 화학적 합성법은 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용되는 것으로 공지된 표준 방법, 예를 들면 포스포르아미디트 법[참조: Caruthers (1983) Tetrahedron Letters 24, 245], H-포스포네이트 법[참조: Todd et al. (1957) J. Chem. Soc. 3291], 포스포트리에스테르 법[참조: Sonveaux (1986) Bioorg. Chem. 14,274; Gait, M.J. "Oligonucleotide Synthesis, A practical Approach", IRL Press, Oxford, 1984] 또는 이들 표준 방법으로 부터 파생된 개량법 또는 변형법에 의해 수행된다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 실시예 1, 2 및 3에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 고형 지지체상에 적당히 보호된 단량체(예: 뉴클레오시드)를 축합시켜 이들 단량체간에 뉴클레오시드간 브릿지가 형성되도록 함으로써 합성될 수 있다.
본 발명은, 예를 들면 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 방법에서는 3'- 또는 2'-말단 인(V) 그룹 및 유리 5'-하이드록실 또는 머캅토 그룹을 갖는 뉴클레오티드 단위를 3'위치에 인(III) 또는 인(V) 그룹을 갖는 뉴클레오티드 단위 또는 이의 활성 유도체와 반응시키는데, 이경우에 임의로, 다른 작용기를 보호하기 위해 당해 올리고뉴클레오티드중에 일시적으로 도입되고 합성후 제거될 수 있는 보호 그룹이 사용되며, 이후에 고형 지지체로 부터 절단되어진 당해 올리고뉴클레오티드는 임의로 생리학적으로 허용되는 염으로 전환될 수 있다.
변형을 도입하기 위하여, 표준 방법을 어느 정도 변형시킬 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Agrawal S. "Protocols for oligonucleotides and analogs" (1993, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA)]에 기재되어 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드의 제조법도 또한 문헌[EP 0 710 667, EP 0 680 969, EP 0 464 638, EP 0 593 901, WO95/01363, EP 0 672 677, EP 0 739 898 및 EP 0 552 766]에 기재되어 있다. 상기 문헌에 기재된 변형된 올리고뉴클레오티드의 제조법은 본원에 참조로써 인용된다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 VEGF 암호화 핵산(예: mRNA, cDNA)와 접촉시키고 당해 올리고뉴클레오티드가 이러한 VEGF 암호화 핵산과 하이브리드를 형성(결합)하도록 함으로써, VEGF의 발현을 억제하고/하거나 VEGF 암호화 핵산의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은, 공지된 방법, 예컨대 세포를 올리고뉴클레오티드 또는 이의 제형물(이러한 제형물은 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴 또는 다가양이온(예: 폴리리신)과 같은 흡수 증강제를 포함할 수 있다)과 함께 배양하는 방법으로 당해 올리고뉴클레오티드를 세포내로 도입하여, 당해 올리고뉴클레오티드를 VEGF 암호화 핵산(예: mRNA, cDNA)과 접촉시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 미리 셀펙틴과 예컨대 30분간 실온에서 배양한 후, 세포와 함께 약 5시간 이하로 배양하여 당해 올리고뉴클레오티드를 세포내로 도입시킨다.
또한, 본 발명은, 당해 올리고뉴클레오티드의 용도, 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서의 용도(VEGF 암호화 mRNA에 대한 당해 올리고뉴클레오티드의 결합) 또는 리보자임으로서의 용도(VEGF 암호화 mRNA에 결합하여 이 mRNA를 절단함)에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 특정 태양에서, 당해 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNAse H에 의한 VEGF 암호화 mRNA의 절단을 유도할 수 있으며, 이로써 VEGF 발현이 감소된다.
본 발명은, 예를 들면 VEGF 암호화 mRNA의 해독을 전체적 내지 부분적으로 억제하기 위하여, VEGF(예: VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206) 및/또는 이의 스플라이스(splice) 변이체 및/또는 이의 돌연변이체의 발현을 조절하여 전체적 내지 부분적으로 발현을 억제하기 위한 당해 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은, 특히 척추동물에서 혈관형성, 혈관신생, 종양 성장 및 전이를 억제, 예방 또는 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명은 VEGF가 과발현된 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. VEGF가 과발현된 이러한 질환의 예로는 암, 노년기 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염 및 기타 염증성 질환이 있다.
또한, 본 발명은 약제로서의 당해 올리고뉴클레오티드의 용도, 및 약제학적조성물을 제조하는데 있어서의 당해 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 당해 올리고뉴클레오티드는, VEGF의 발현 또는 과발현(증가된 발현)과 연관된 질환을 예방 및/또는 치료하고, VEGF 또는 이의 과발현이 원인 요소이거나 이와 연루된 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염외에 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 보조제를 추가로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 비정상 혈관 투과성, 세포 증식, 세포 투과, 혈관형성, 혈관신생, 종양 세포 성장 및 신생물성 세포의 전이와 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있는 하나 이상의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 하나 이상의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 생리학적으로 허용되는 부형제, 및 임의로 부가 물질, 예를 들면 경우에 따라 적당한 부가물 및/또는 보조제를 혼합함을 특징으로 하여, 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은, 암의 치료, 예컨대 종양 성장 및 종양 전이의 억제, 및 당뇨병성 망막병증, 노년기 황반변성, 건선, 류마티스성 관절염 및 기타 염증성 질환의 치료를 위한, 올리고뉴클레오티드 또는 이로 부터 제조된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드 또는 이로 부터 제조된 약제학적 조성물은 충실성 종양, 예를 들면, 유방암, 폐암, 두부 및 경부 암, 뇌암, 복부암, 결장암,직장암, 식도암, 위장암, 신경교종, 간암, 설암, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 윌름 종양, 다발성 골수종의 치료; 피부암, 예를 들면 흑색종의 치료; 및 림프종 및 혈액암의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 VEGF 발현을 억제하고/하고나, 상이한 유형의 암, 예를 들면 유방암, 폐암, 두부 암, 경부 암, 뇌암, 복부암, 결장암, 직장암, 식도암, 위장암, 신경교종, 간암, 설암, 신경모세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 윌름 종양, 다발성 골수종, 피부암, 흑색종, 림프종 및 혈액암에서의 흉막유출 및 복수액의 축적을 억제하기 위한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 이로부터 제조된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. VEGF 발현 및/또는 복수액 및 흉막 유출에 대한 억제효에 기인하여, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 이로부터 제조된 약제학적 조성물은 삶의 질을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 당해 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적 조성물은 난소암에서 복수액의 축적을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은, 다른 약제 및/또는 다른 치료 방법, 예컨대 현재 암의 치료 및/또는 종양 전이의 예방에 사용되는 것과 같은 공지된 약제 및/또는 공지된 치료 방법과 병용하여, 암의 치료, 종양 전이의 예방, 또는 노년기 황반변성, 류마티스성 관절염, 건선 및 당뇨병성 망막병증의 치료을 위한 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 방사선요법 및 화학요법제, 예를 들면 시스-플라틴, 사이클로포스프아미드, 5-플루오로우라실, 아드리아마이신, 다우노루비신 또는 타목시펜과 병용하는 것이 바람직하다.
당해 올리고뉴클레오티드 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 사람에게 그 자체로, 다른 올리고뉴클레오티드(또는 생리학적으로 허용되는 이의 염)와 혼합하여, 또는 약제학적 조성물의 형태(당해 약제학적 조성물은 국소, 경피, 비경구 또는 장내용으로 사용될 수 있으며, 활성 성분으로서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 유효량, 및 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제 및 보조제을 포함한다)로 투여될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 통상적으로 치료 활성의 올리고뉴클레오티드 약 0.1 내지 90중량%을 포함한다. 투여량은 넓은 범위내에서 달라질 수 있으며, 개개인의 증례에서 각각의 상황에 맞춰 조정될 것이다. 건선을 치료하기 위하여, 국소적으로 사용하는 것이 바람직하다. 암의 경우에, 주입, 경구 및 직장 투여가 바람직하거나, 폐암의 경우에 에어로졸에 의한 경비 적용이 바람직할 수 있는 반면에, 당료병성 망막병증의 경우에 국소적, 유리체내적 및 경구 투여가 바람직하다.
약제학적 조성물은 공지된 방법 그 자체[참조: Remingtons Pharmaceutical Science, Mack Publ. Co., Easton, PA (1985)]로, 약제학적으로 허용되는 불활성 무기 및/또는 유기 부형제를 함께 사용하여 제조할 수 있다. 락토스, 옥수수 전분 및/또는 이의 유도체, 활석, 스테이르산 및 이의 염, 등은, 예를 들면 환제, 정제, 피복 정제, 및 경질 젤라틴 캡슐제를 제조하는데 사용될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐제 및/또는 좌제용 부형제의 예로는 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 천연유 및/또는 경유, 등이 있다. 용제 및/또는 시럽제를 제조하는데 적합한 부형제의 예로는 물, 슈크로스, 전화 당류, 글루코스, 폴리올 등이 있다. 주사액제를 제조하는데 적합한 부형제로는 물, 알코올, 글리세롤, 폴리올, 식물성 기름, 등이 있다. 미세정제, 임플란트 및/또는 로드(rod)를 위한 적합한 부형제는 글리콜산과 락트산의 혼합 중합체이다. 또한, 리포좀 제형이 문헌[N. Weiner, (Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523), "Liposome Dermatics" (Springer Verlag 1992) and Hayashi (Gene Therapy 3 (1996) 878)]에 기술되어 있다. 약제학적 조성물은 장 투과 증가제, 예를 들면 만니톨, 요소, 담즙 염(예: CDCA(케노덱소이콜레이트)(2%)와 같은 올리고뉴클레오티드의 경구 이용가능성을 증가시키는 제형을 포함할 수 있다.
예를 들면, 이온운반법 및/또는 전기천공법을 사용하여, 경피 투여를 수행할 수 있다. 또한, 예를 들면 유전자 치료에 사용되는 것들인 리포펙틴 및 다른 담체 시스템이 사용될 수 있다. 진핵 세포 또는 진핵 세포의 핵속으로 올리고뉴클레오티드를 고효율로 도입하는데 사용될 수 있는 시스템이 특히 적합하다. 또한, 약제학적 조성물은 둘 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염외에 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 하나 이상의 상이한 치료학적 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.
활성 성분 및 부형제이외에, 약제학적 조성물은 부가물, 예를 들면 충전제, 증량제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 방부제, 감미제, 염료, 향미료 또는 방향제, 농조화제, 희석제 또는 완충 물질을 추가로 포함할 수 있고, 또한 용매 및/또는 용해제 및/또는 서방성 효과를 달성하기 위한 제제, 및 삼투압을 변화시키기 위한 염, 피복제 및/또는 산화방지제를 포함할 수 있다.
상기 투여량은 폭 넓은 범위내에서 달라질 수 있으며, 개개인의 증례에서 각각의 상황에 맞춰 조정될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 장 투과 증가제, 예를 들면 만니톨, 요소, 담즙 염(예: CDCA(2%))와 같은 올리고뉴클레오티드의 경구 이용가능성을 향상시키는 제형을 포함할 수 있다.
본 발명은, 비정상적 세포 증식, 세포 투과, 혈관 투과성, 혈관형성, 종양 세포 성장, 및 신생물성 세포의 전이와 연관된 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 암 및 암의 전이의 치료 및 예방, 건선의 치료 및 예방, 및 당뇨병성 망막병증의 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 ON 1로 처리한 마우스에서 성장한 U87-MG 종양 이종이식편중의 VEGF mRNA의 정량화를 도시한다.
당일(0일)째에 각 마우스의 옆구리에 2x106개의 U87-MG 종양 세포를 피하(s.c.) 주사하여 종양을 이식시킨다. 4일째부터 ON 1을 매일 정맥내 투여하기 시작한다. 18일째에 종양을 수집한다. 종양 절편에서의 mRNA 발현 수준을,35S VEGF cRNA 프로브와의 원 위치(in situ) 하이브리드화를 통해 분석한다. VEGF mRNA 정량화를 위해, 각 종양의 대표적 절편에서 하이브리드를 형성한 방사성 프로브가 111dpm/mm2을 초과하는 영역의 퍼센트를 측정한다. 두개의 예외적인 경우를제외하고는, 처리된 동물로 부터의 종양에서 (대조군 동물에 비해) VEGF 발현의 감소가 명백히 나타난다.
도 2는 올리고뉴클레오티드 ON 1, ON 55(부정합) 및 ON 56(혼동)으로 처리한 세포내의 VEGF mRNA 수준에 미치는 상이한 올리고뉴클레오티드의 농도-의존적 효과의 결과를 요약하여 도시한다. VEGF mRNA를 ABI 프리즘 7700 서열 검출기를 사용하여 정량화한다. 올리고뉴클레오티드로 처리하지 않은 대조군 세포에 상대적인 VEGF mRNA 양에 미치는 농도 의존적 효과는 "1/폴드(Fold) 상이점( 미처리된 대조군에 상대적임)" 대 "올리고뉴클레오티드 농도[μM]"로 나타낸다(왼편으로 부터 오른편: ON1: 막대 1 내지 6; ON55: 막대 7 내지 12; ON56: 막대 13 내지 18; 대조군: 막대 19(올리고뉴클레오티드 부재) 및 20(단지 셀펙틴). 부정합(ON55) 및 혼동 대조군(ON56)은 낮거나 높은 올리고뉴클레오티드 농도에서 VEGF mRNA 수준에 상당한 영향을 주지 않는 반면, ON1은 VEGF mRNA 수준을 감소시킨다(즉, PCR 생성물의 검출을 위한 한계치에 도달하는데 요구되는 PCR의 사이클 수의 증가를 유도한다). VEGF mRNA 수준애 미치는 ON1의 효과는 농도 의존적이다. 각 데이타 포인트에 대한 n=4, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 종양 이종이식편에 대한 ON1의 생체내 효과를 도시한다. 당해 도면은 18일째(0일째에 U87-MG 이종이식편이 이식되었다)에 측정된 종양 중량(g)를 요약한다 - 당해 도면에서 각 포인트는 각각의 누드 마우스에서 측정된 종양 중량이다. 누드 마우스에 매일 0mg/kg, 4mg/kg 또는 12mg/kg(체중) 농도의 ON1을 정맥내 투여한다.
도 4는 24시간 후 ON50에 의한 HT-29 세포에서의 VEGF 분비 억제를 보여준다(실시예 9). 당해 도면은 처리한지 24시간 후 HT-29 세포에 의한 VEGF 분비에 미치는 ON50의 농도 의존적 효과를 보여준다( 대조군의 억제 % , Elisa/Cyquant에 의해 측정).
도 5는 ON38에 의한 종양 성장의 억제를 보여준다. U87-MG 이종이식편을 지닌 누드 마우스에 매일 ON39를 경구 투여한다. 당해 도면은 ON39를 경구 투여한지 27일 후 종양 용적(mm3)의 농도 의존적 감소를 보여준다. "●" 대조군(미처리); "○" 체중(kg)당 ON39 3mg 투여; "▼" 10mg/kg 투여; "▽" 30mg/kg 투여.
실시예 1: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드(ON)를 Applied Biosystems 394 DNA 합성기[Perkin Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA] 및 표준 포스포르아미디트 화학반응[참조 문헌: F. Eckstein, Ed "Oligonucleotide and Analogues A practical Approach", IRL Press, Oxford, 1991]을 사용하여 합성한다. 커플링 후, Beaucage 시약을 사용하여 황화시켜 포스포로티오에이트 연결을 형성시키고, 이어서 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸로 캡핑시킨다. 고형 지지체로 부터 잘라내고 농축 암모니아로 처리하여 최종적으로 탈보호한 후, ON을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제한다. 2'-O-메틸 변형된 ON을, 상응하는 사이클에서 표준 포스포르아미디트를 2'-O-메틸 리보뉴클레오시드 포스포르아미디트로 대체하여 제조한다. 모든 ON을 네가티브 이온 전기분무 질량 분광기(Fisons Bio-Q)로 분석하여, 모든 경우의 계산된 질량을 확인한다. C16-변형된 올리고뉴클레오티드를, 올리고뉴클레오티드 합성의 최종 단계에서 포스피틸화 시약으로서 표준 아미디트 대신 헥사데실옥시 (시아노에톡시) N,N-디이소프로필 아미노포스판을 사용하거나, 상응하게 유도화된 고형 지지체로 부터 개시하여 합성한다. 테트라에틸렌 글리콜 링커는 Glen Research Corporation으로 부터 시판되고 있다. 아데노신 또는 코디셉핀의 2'-포스포르아미디트는 Chem Genes Corporation 및 Chemogen Corporation으로 부터 각각 구입한다. 5'-포스페이트 또는 티오포스페이트 잔기의 도입을 앞서 기술한 바와 같이 수행한다[참조 문헌: Uhlmann and Engels (1996) Tetrahedron Lett. 27, 1023].
올리고뉴클레오티드 분석을 아래의 분석을 이용하여 수행한다:
a) 20% 아크릴아미드, 8M 요소, 45㎛ 트리스-붕산염 완충액, pH 7.0에서 분석용 겔 전기영동; 또는
b) HPLC 분석; Waters GenPak FAX 칼럼, 구배 CH3CN(400㎖), H2O(1.6ℓ), NaH2PO4(3.1g), NaCl(11.7g), CH3CN(400㎖) 첨가후 pH6.8(0.1M NaCl), H2O(1.6ℓ), NaH2PO4(3.1g), NaCl(175.3g), pH6.8(1.5M NaCl); 및/또는
c) Beckmann 모세관 eCAPTM, U100P Gel 칼럼, 길이 65㎝, 100㎜ I.D., 한쪽 말단으로 부터 윈도우 15㎝, 완충액[140㎛ Tris, 360mM 붕산염, 7M 요소]를 사용하여 모세관 전기영동;
d) 네가티브 이온 전기분무 질량 분광기(모든 경우에 예측된 질량 값을 확인한다).
a), b), c) 및 d)에 따른 올리고뉴클레오티드의 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이들 방법은 문헌[Schweitzer and Engel "Analysis of oligonucleotide" (in "Antisense- from technology to therapy", a laboratory mannual and textbook, Schlingensiepen et al. eds., Biol. Science Vol.6 (1997) p.78-103)]에 기술되어 있다.
하기의 올리고뉴클레오티드를 제조한다(명세서 참조):
(여기서, "teg"는 트리에틸렌글리콜(링커)이고, "N"은 2'-O-메틸리보뉴클레오시드이고, "rA"는 리보-A (2'5'-연결된 아데닐레이트)이고, "Co"는 3'-데옥시-A-(코르디세핀)(2'5'-연결된 3'-데옥시 아데닐레이트)이고, "p*"는 5'티오포스페이트이고, "*"는 포스포로티오에이트이다)
실시예 2: ON1 5'-G*C*GC*TGA*T*AGA*C*AT*C*C*A*T*G-3' ("*"는 포스포로티오에이트이다)합성에 대한 상세한 설명
12개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결로 부분적으로 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 ON1을 제어된 다공성 유리(CPG) 지지체를 사용하여 ABI 390Z DNA 합성기(Perkin Elmer - Applied Biosystems, Foster City, USA)상에서 합성한다. 아미노프로필레이트화 CPG에 디메톡시트리틸-N2-이소부티로일-데옥시구아노신-3'-O-석시네이트를 충전시킨다. 디클로로메탄중의 3% 트리클로로아세트산으로 5'-디메톡시트리틸 그룹을 제거한 후, 상기 공급업체(ABI)에 의해 제공된 바와 같은 합성 사이클을 사용하면서 상응하는 5'-O-디메톡시트리틸-티미딘-3'-O-(β-시아노에톡시)-N,N-디이소프로필아미노 포스포로아미디트을 사용하여 제2 염기(T)를 커플링시킨다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위하여, 요오드/피리딘/물(포스포로디에스테르 연결을 도입하기 위하여 사용) 대신에 3H-, 1.2-벤조디-티올-3-온 1.1-디옥사이드(0.075M Beaucage 시약)를 상기 사이클에서 사용한다. 아세트산 무수물에 의한 캡핑 반응을, 포스포디에스테르의 경우에는 커플링 반응 후에 직접 수행하나, 포스포로티오에이트 연결의 경우에는 Beaucage 황화 후에 수행한다. 쇄의 연장이 완결된 후, 올리고뉴클레오티드를 CPG로 부터 잘라내고 150ml 농축 암모니아로 16시간 동안 50℃에서 처리하여 탈보호시킨다. 조(粗) 올리고뉴클레오티드(19200 OD260)을, n-부탄올로 부터 침전시킨 후 Pharmacia Biopilot 시스템을 사용하여 Q 세파로스 R 고성능 칼럼(60/100; Pharmacia)상에서 FPLC를 수행하여 정제한다. 당해 올리고뉴클레오티드를 77분내에 pH12의 10mMNaOH에서 0.45 내지 1.0M NaCl 구배로 용출시킨다. 올리고뉴클레오티드-함유 분획을 Gen-Pak Fax 칼럼(Millipore-Waters)상에서 NaCl-구배(완충액 A: 10mM NaH2PO4, 아세토니트릴/물(1:4/v/v)중의 100mM NaCl, pH 6.8; 완충액 B: 10mM NaH2PO4, 아세토니트릴/물(1:4/v/v)중의 1.5M NaCl; 30분 경과시 B 5 내지 40%)을 사용하여 HPLC로 분석한다. 균일한 분획을 합하고(5660 OD260) 한외여과로 탈염시킨다. 에탄올/이소프로판올로 부터의 침전 및 동결건조에 의한 제2 탈염 단계 후, 올리고머가 백색 발포체로서 수득된다(165g). 당해 올리고뉴클레오티드의 특성을 네가티브 이온 전기분무 질량 분광기로 분석한다(계산치 6005.6; 측정치 6006.1). 또한, 화합물(1 OD/ml)에 4초간 10kV을 가하고 40분간 일정한 11kV하에서 일렉트로페로그램을 전개시키는 방법으로, 올리고머를 폴리아크릴아미드 겔에서 모세관 전기영동[Beckman Instruments로 부터의 U 100P 겔 모세관; ID 100μM; 완충액: 7M 요소, 140mM 트리스/붕산염)으로 분석한다.
실시예 3: ON28
("*"는 포스포로티오에이트이고,N은 2'-O-메틸리보뉴클레오시드이고,T는 2'-O-메틸-U이다)합성에 대한 상세한 설명
5'-O-디메톡시트리틸-N2-이소부티로일-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-석시네이트로 충전시킨 CPG 지지체로 부터 출발하여, 실시예 2에 기술된 바와 같이 부분적으로 2'-O-메틸 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 2'-0-메틸 리보뉴클레오시드의 도입을 위해, 상응하는 뉴클레오시드-2-'O-메틸-3'-포스포르아미디트를 통상의 데옥시뉴클레오시드-3'-포스포르아미디트 대신 커플링시킨다. 조(粗) 올리고뉴클레오티드(18700 OD260)을, n-부탄올로 부터 침전시킨다(594mg). 당해 올리고뉴클레오티드의 특성을 네가티브 이온 전기분무 질량 분광기로 분석한다(계산치 6293.9; 측정치 6292.9).
실시예 4: 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 세포의 처리
세포를 96-웰 플레이트에 30,000개 세포/웰로 플레이팅한다(여기서, 웰당 150㎕ 배지를 포함하며, 당해 배지는 세포 유형에 의존한다). 다음 날, 셀펙틴(Gibco-BRL)을 물(용액 A)중에 400㎍/ml로 희석한다. 올리고뉴클레오티드를 물(용액 B)중에 40배의 최종 목적하는 농도로 희석시킨다. 동일한 양의 용액 A와 B를 혼합하여, 200㎍/ml 셀펙틴 및 20X 올리고뉴클레오티드가 존재하는 용액의 목적 용적을 수득하고, 당해 혼합물을 실온에서 30분간 방치한다. 30분 후, 옵티멘(Optimen)(Gibco-BRL)의 19 용적을 가하여 10㎍/ml 셀펙틴 및 1X 올리고뉴클레오티드가 존재하는 최종 용액(용액 C)을 수득한다. 배지를 세포로 부터 제거하고, 웰을 옵티멘으로 2회 세척하고, 150㎕ 용액 C를 각각의 웰에 가한다. 이어서, 플레이트를 배양기(37℃, 5% CO2)에 다시 넣는다. 5시간 후, 셀펙틴/올리고뉴클레오티드 용액을 제거하고 정상 성장 배지 150㎕로 대체한다. VEGF 단백질 및 mRMA 분석을 19시간 후에 시작하여 수행한다.
실시예 5: VEGF 단백질 분석
조절 배지의 샘플(실시예 4로 부터 수득)을 목적하는 웰로 부터 취하고 사람 VEGF ELISA 키트(제조원: R & D 시스템)을 사용하여 사람 VEGF의 존재에 대해 분석한다. 분석 프로토콜은 상기 키트와 함께 제공된다.
실시예 6: VEGF mRNA 분석
실시예 4로 부터 수득된 세포에서, 배지를 상기한 96웰 플레이트로 부터 제거하고, 세포 용해물을 잔존 세포로 부터 수득하여 Applied Biosystems 7700 분석기로 VEGF mRNA를 정량화한다.
mRNA의 정량화 후, mRNA를 세포로 부터 정제하고, cDNA를 Promega의 PolyATract 시리즈 9600 mRNA 분리 및 cDNA 합성 시스템(카달로그 # Z3790)을 사용하여 제조한다. 상기 키트에 제공된 지침을 따른다.
VEGF cDNA의 양을 Perkin Elmer/Applied Biosystems ABI Prism 7700 서열 검출 시스템을 사용하여 측정한다. Perkin Elmer/Applied Biosystems TaqManTMPCR 시약 키트(카달로그 #N808-0230)를 사용하여 반응을 준비한다. Perkin Elmer/Applied Biosystems TaqManTM β-액틴 대조군 반응 시약 키트(카달로그 #401846)을 사용하여 β-액틴 대조군 반응을 준비한다. VEGF 데이타를 β-액틴 데이타에 대한 표준으로 삼는다. 형광성 태그-프로브의 서열, 및 VEGF 반응을 위해 고안된 프라이머는 다음과 같다:
서열 20:
프로브: 5'-6FAM-TCAGCGCAGCTACTGCCATCCAAT-TAMRA-3 (5'→3')
서열 21:
정방향 프라이머 1: 5'-GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA-3' (5'→3')
서열 22:
역방향 프라이머 1: 5'-AGG GTA CTC CTG GAA GAT GTC CAC-3' (5'→3')
실시예 7: IC(50) 값의 측정
IC50을, 셀펙틴으로는 처리하나 올리고뉴클레오티드로는 처리하지 않은 세포내의 VEGF 단백질 또는 mRNA의 양에 대한 100% 값을 기준으로하여 계산한다.
실시예 8: 생체내 연구
4 내지 6주령의 암컷 누드(nu/nu) 마우스를 이용하여 실험을 수행한다. 종양은 세포(U87-MG에 대한 200㎕중의 2,000,000개 세포)의 피하 이식에 의해 성장한다. 올리고뉴클레오티드를 인산염 완충 염수중에 용해시키고, 100㎕.2X106U87-MG의 용적으로 피하 또는 정맥내(꼬리 정맥)에 주사한다. 일부 올리고뉴클레오티드를 경구 투여하여 시험한다.
종양 세포를 0일째에 피하에 이식시킨다. 약물 치료제를 꼬리정맥에 매일 정맥내 주사로 투여한다. 각각의 처리 그룹은 6 내지 10마리의 동물로 구성된다. ON1을 마우스의 처리에 사용하는 경우, 마우스에서의 종양 성장은 체중(kg) 당 4 내지 12mg의 올리고뉴클레오티드 농도에서 억제/감소된다. ON1은 정맥내 또는 피하 주사로 매일 투여하는 경우 누드 마우스에서 피하 성장한 U87-MG 종양 이종이식편의 성장을 투여량 의존 방식으로 억제한다. 이는 표 2에 제시된 결과에 의해 명맥히 입증된다.
본 연구의 말엽에, 종양을 파라핀에 매몰시키고, 절개하여 원 위치 하이브리드화를 통해 VEGF mRNA 발현에 대해 평가한다. VEGF mRNA 발현의 양은 종양내에서도 달라서, 어떤 영역은 매우 높은 발현을 보여주고, 다른 영역은 검출가능한 발현이 나타나지 않는다. 따라서, 종양 절편내의 VEGF 발현을 고수준의 발현 부위 %를 정량화하여 분석한다. ON1으로 처리하여 이러한 방법으로 분석하는 경우 종양에서 VEGF mRNA 수준이 급격히 감소한다(도 1). 이러한 연구로 부터 종양내의 미세혈관 밀도를 인자 VIII 염색에 의해 평가한다. 처리된 동물의 경우 종양내의 혈관/부위의 수가 단지 약간 감소한다. 그러나, 약물-처리된 동물의 경우 종양내의 혈관의 크기가 크게 감소된다.
실시예 9: 시험관내 연구
세포 배양.HT-29 세포를 10% FBS, 10㎍/ml 겐타마이신 및 1mM L-글루타민을 보충한 RPMI-1640 배지에서 성장시킨다.
안티센스 올리고뉴클레오티드(ON)를 사용한 세포의 처리. 세포를 1일째에 96 웰 플레이트에 30,000개 세포/웰의 수준으로 플레이팅한다. 2일째에, 흡수 증강제로서 셀펙틴(GIBCO BRL) 10㎍/ml을 사용하여 ON으로 세포를 처리한다. 먼저 셀펙틴과 ON을 40배의 최종 목적하는 농도로 희석시킨 후, 이들 용액을 1:1 비로 혼합하여 20배의 목적하는 농도의 셀펙틴과 ON을 수득함으로써, 셀펙틴/ON 복합체가 형성된다. 상기 희석은 ddH2O중에서 수행한다. 상기 복합체가 실온에서 30분간 형성될수 있도록 한 후, 당해 혼합물에 Optimem-I(GIBCO BRL)의 19 용적을 가하여 1배로 희석시킨다. 세포를 옵티멘으로 2회 세척하고, 셀펙틴/ON 복합체를 세포에 가한다(150㎕/웰). 플레이트를 배양기에 5시간 동안 다시 넣는다. 5시간 후, 복합체를 제거하고, 배지를 상기한 표준 세포 성장 배지로 대체한다.
VEGF에 대한 ELISA 분석. 세포에 의해 배양 배지내로 분비된 VEGF를 R & D 시스템 Quantikine 사람 VEGF 면역분석 키트를 사용하여 정량화한다. HT-29 세포로 부터의 배지 100㎕를 사용하여 분석하고, 또한 U87-MG로 부터의 배지 25㎕를 사용하여 분석한다. ELISA를 위해 배지를 제거한 후, 배지의 나머지를 세포 플레이트로 부터 제거하고, 플레이트를 -80℃에서 동결시키고, 분자 프로브 CyQUANT 분석 키트를 사용하여 세포 수를 측정한다.
데이타 분석.ELISA로 부터의 A450판독치를, 동일한 ELISA 플레이트상에서 수행한 표준 곡선을 이용하여 pg/ml VEGF로 전환한다. 이들 값은, 각 웰중의 pg/ml VEGF를 CyQUANT 분석에 의한 웰 값으로 나눔으로써, 표준으로 정해진다. 수득한 값의 평균을 구하고(대조군의 경우(n=6)를 제외하고는 각각의 데이타 포인트의 경우 n=3), 표준 편차를 계산한다. 데이타를 대조군 %(대조군 = ODN 부재하의 셀펙틴)로서 그래프화한다(여기서, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다)
실시예 10: 생체내 연구
화합물 제제.화합물을 25 또는 50mg 분취량의 동결된 고체로서 -20℃에서 보관한다. 분취물을 Hanks 평형 염 용액(HBSS)중에 필요에 따라 1.25mg/ml으로 용해시킨다. 용해된 화합물을 7일 이상 동안 4℃에서 보관한다.
동물의 처리.종양 이식을 위한 세포를 상기한 배지를 사용하여 조직 배양 플라스크에서 성장시킨다. HT-29 세포를 EDTA 처리로 수거하고, U87-MG 세포를 트립신/EDTA 처리로 수거한다. 종양을 피하 주사로 옆구리에 마우스당 5,000,000개 세포를 HBSS 100㎕의 용적으로 이식시킨다. 약물을 꼬리정맥내 주사 또는 경구 섭식에 의해 200㎕ 용량으로 투여한다. 이러한 처리를 종양 이식한 날로 부터 시작하여 매일 수행한다. 대조군의 동물은 처리하지 않는다. 동물을 미소절연 우리내에 수용한다(우리당 한가지로 처리한 그룹으로 구성되며, 그룹당 n=6이다). 종양이 궤양화되는 경우(통상적으로 종양 용적이 일단 500 내지 600mm3에 이르는 경우에 일어남)에 각각의 동물을 희생시킨다.
올리고뉴클레오티드 유형 VEGF 분비에 대한 IC50 VEGF mRNA에 대한 IC50 β-액틴 mRNA에 대한 IC50
ON 1 부분적 PS 300nM 100nM mRNA 수준에 영향을 주지 않음
ON 28 2'-O-메틸 리보뉴클레오시드 갭머, 부분적 PS 300nM
ON 29 2'-O-메틸 리보뉴클레오시드 키메라, 부분적 PS 500nM
ON 39 300nM
ON 53 2'5(CO)4-접합체 모든-2'-O-메틸 1500nM
ON 54 2'5'(rA)4-접합체 모든-2'-O-메틸 230nM
ON 55 ON1 대조군에 대한 4X 부정합, 부분적 PS > 3μM mRNA 수준에 영향을 주지 않음 mRNA 수준에 영향을 주지 않음
ON 56 (ON1에 대한)혼동된 서열 대조군, 부분적 PS > 3μM mRNA 수준에 영향을 주지 않음 mRNA 수준에 영향을 주지 않음
PS: 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지
ON 1으로 처리하는 동안의 종양 용적의 감소
일 매일 정맥내 주사 0mg/kg ± SE 용적 4mg/kg ± SE 용적 12mg/kg ± SE 용적
0 0 0 0 0 0 0
6 31 3 30 3 26 3
11 123 16 69 14 39 4
17 868 171 344 70 236 54
0일째에 2x 106U87-MG 세포를 마우스에 피하 주사하여 종양을 이식한다. 이 후 4일째에 약물 처리를 개시한다. 약물을 매일 꼬리정맥에 정맥내 주사한다.각 처리 그룹은 6 내지 10마리의 마우스로 구성된다. 데이타는 평균 ±SE(표준 오차)로서 제시된다.
·모든 경우에 있어서 약물 처리를 4일째에 개시한다.
·꼬리정맥에 정맥내 주사로 약물을 투여한다.
·종양 모델: 2,000,000개의 U87-MG 세포를 0일째에 피하로 이식한다.
·종양 용적을 17일째에 측정한다.
VEGF 안티센스 올리고뉴클레오티드 ON50을 매일 경구 투여한 후 누드 마우스에서 HT-29 성장의 억제
종양 이식 후의 일수 미처리 동물의 종양 용적[mm3] (표준 오차 ±) 3mg/kg ON 50으로 처리한동물의 종양 용적[mm3](표준 오차 ±) 10mg/kg ON 50으로 처리한 동물의 종양 용적[mm3](표준 오차 ±)
4 46 (5) 19 (4) 22 (3)
8 100 (11) 32 (6) 27 (3)
11 136 (20) 70 (9) 56 (5)
15 229 (29) 95 (14) 85 (5)
18 284 (41) 115 (18) 119 (11)
21 364 (61) 136 (12) 146 (18)

Claims (21)

  1. 하기 서열 4의 서열 또는 이의 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체.
    서열 4:
    3'-GTACCTACAGATAGTCGCGTCGATGACGGTAGG-5'
    상기 서열에서, i) 올리고뉴클레오티드중의 모든 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지는 아니며, 모든 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지로 대체되는 것은 아니거나, ii) 올리고뉴클레오티드가 C5-프로피닐 우리딘, C5-프로피닐 시티딘, C5-헥시닐 우리딘, C5-헥시닐 시티딘, 6-아자 우리딘 및 6-아자 시티딘중에서 선택된 변형된 뉴클레오시드를 포함하지 않거나, iii) 상기 i) 및 ii) 모두에 해당한다.
  2. 제1항에 있어서, 길이가 17 내지 33개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기의 서열 5 내지 16중의 하나의 서열을 갖는올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 천연 DNA로 구성된 동일한 서열의 올리고뉴클레오티드와 비교시, 하나 이상의 변형을 가지며, 각각의 변형이 특정 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지, 특정 β-D-2'-데옥시리보스 단위, 특정 천연 뉴클레오시드 염기 위치, 또는 이들중 2개 이상의 위치에 존재하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단, 3' 말단, 또는 이들 모두에 존재하는 1 내지 5개의 말단 뉴클레오티드 단위가 상응하는 뉴클레오시드의 5' 말단, 3' 말단, 또는 이들 모두에 위치하는 뉴클레오시드간 브릿지를 변형시킴으로써 보호되는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 내부 피리미딘 뉴클레오시드, 이러한 피리미딘 뉴클레오시드의 5'말단, 3'말단 또는 이들 모두에 위치하는 뉴클레오시드간 브릿지, 또는 이들 모두가 변형된 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 변형이,
    a) 뉴클레오시드의 3' 말단, 5' 말단, 또는 이들 모두에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지의 변형된 뉴클레오시드간 브릿지로의 대체;
    b) 뉴클레오시드의 3' 말단, 5' 말단 또는 이들 모두에 위치한 포스포디에스테르 브릿지의 데포스포 브릿지로의 대체;
    c) 당 인산염 주쇄 중의 당 인산염 단위의 또 다른 단위로의 대체;
    d) β-D-2'-데옥시리보스 단위의 변형된 당 단위로의 대체;
    e) 천연 뉴클레오시드 염기의 변형된 뉴클레오시드 염기로의 대체;
    f) 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 주는 분자에의 접합;
    g) 임의로 적절한 링커 분자를 통한 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트 분자 또는 이의 유도체에의 접합; 및
    h) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단, 5' 말단 또는 이들 모두에 3'-3' 역위, 5'-5' 역위, 또는 이들 역위 모두의 도입중에서 독립적으로 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 변형이,
    a) 뉴클레오시드의 3' 말단, 5' 말단 또는 이들 모두에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지의 변형된 뉴클레오시드간 브릿지로의 대체{여기서, 변형된 뉴클레오시드간 브릿지는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR1R1'-포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬 에스테르, 포스페이트-[(C6-C12)아릴-((C1-C21)-O-알킬]에스테르, (C7-C12)-α-하이드록시메틸아릴, (C1-C8)알킬-포스포네이트 및 (C6-C12)-아릴포스포네이트 브릿지중에서 선택되며, 상기에서, R1과 R1'는 각각 독립적으로 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, 또는 (C6-C14)-아릴-(C1-C8)-알킬이거나, R1과 R1'은 이들을 연결하는 질소 원자와 함께, O, S 및 N으로 이루어진 그룹중의 헤테로원자를 추가로 포함할 수 있는 5 내지 6원의 헤테로사이클릭 환을 형성한다};
    b) 뉴클레오시드의 3' 말단, 5' 말단 또는 이들 모두에 위치한 포스포디에스테르 브릿지의 데포스포 브릿지로의 대체(여기서, 데포스포 브릿지는 포름아세탈, 3'-티오포름아세탈, 메틸하이드록실아민, 옥심, 메틸렌디메틸-하이드라조, 디메틸렌설폰 및 실릴 그룹중에서 선택된다);
    c) 당 인산염 주쇄 중의 당 인산염 단위의 또 다른 단위로의 대체(여기서, 또다른 단위는 모르폴리노-유도체 단위, 폴리아미드 핵산 주쇄 단위 및 포스폰산모노에스테르 핵산 주쇄 단위중에서 선택된다);
    d) β-D-2'-데옥시리보스 단위의 변형된 당 단위로의 대체{여기서, 변형된 당 단위는 β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-O-(C1-C6)알킬-리보스, 2'-O-(C2-C6)알케닐-리보스, 2'-[O-(C1-C6)알킬-O-(C1-C6)알킬]-리보스, 2'-NH2-2'-데옥시리보스, β-D-크실로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스, 카보사이클릭 당 동족체, 개환 당 동족체 및 바이사이클로 당중에서 선택된다};
    e) 천연 뉴클레오시드 염기의 변형된 뉴클레오시드 염기로의 대체[여기서, 변형된 뉴클레오시드 염기는 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-아미노우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 2,4-디아미노퓨린, 7-데아자-7-치환된 퓨린, 7-데아자-8-치환된 퓨린 및 8-아자 퓨린중에서 선택된다];
    f) 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 주는 분자에의 접합[여기서, 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 주는 분자는 폴리리신, 개재제, 형광제, 가교제, 지질친화성 분자, 지질, 스테로이드, 비타민, 폴리- 또는 올리고-에틸렌 글리콜, (C12-C18)-알킬 포스페이트 디에스테르 및 O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-알킬 그룹중에서 선택된다];
    g) 임의로 적절한 링커 분자를 통한 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트 분자 또는 이의 유도체에의 접합[여기서, 2'5'-연결된 올리고아데닐레이트 분자는 트리아데닐레이트, 테트라아데닐레이트, 펜타아데닐레이트, 헥사아데닐레이트, 헵타아데닐레이트 분자 및 이의 유도체중에서 선택된다]; 및
    h) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단, 5' 말단 또는 이들 모두에 3'-3' 역위, 5'-5' 역위, 또는 이들 역위 모두의 도입중에서 독립적으로 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 11의 서열 및 하기와 같은 뉴클레오시드간 브릿지 변형 패턴중의 하나를 갖는 올리고뉴클레오티드.
    (여기서, "*"는 변형된 뉴클레오시드간 브릿지의 위치를 가리킨다)
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 11의 서열 및 하기와 같은 뉴클레오시드 변형중의 하나를 갖는 올리고뉴클레오티드.
    (여기서, "N"은 변형된 뉴클레오시드의 위치를 가리킨다)
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 브릿지가 포스포로티오에이트 브릿지로 대체되고, "*"는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 브릿지의 위치를 가리키는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 β-D-2'-데옥시리보스 단위가 2'-O-메틸리보스로 대체되고, "N"는 2'-O-메틸리보-뉴클레로시드의 위치를 가리키고, 이 경우에 "T"는 2'-O-메틸우리딘인 올리고뉴클레오티드.
  13. 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, C16-알킬 그룹이 이의 5' 말단, 3' 말단, 또는 이들 모두에 연결되는 올리고뉴클레오티드.
  14. 고형 지지체상에 적절하게 보호된 단량체를 축합시켜, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법.
  15. VEGF 발현을 억제하기 위한, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.
  16. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 VEGF 암호화 핵산과 접촉시켜 VEGF 발현을 억제시키는 방법.
  17. 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.
  18. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 생리학적으로 허용되는 부형제, 및 임의의 부가 물질을 혼합하여 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  19. 제1항 내제 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 비정상적 혈관 투과성, 세포 증식, 세포 투과, 혈관형성, 혈관신생, 종양 세포 성장 및 전이중의 하나 이상과 관련된 질환을 치료하기 위한, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도.
  21. 다른 약제 및/또는 다른 치료 방법과 병용되는, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도.
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