CN117660449A - 核酸、药物组合物与缀合物及用途 - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了核酸、药物组合物与缀合物及用途，属于生物医药领域。本发明的siRNA及其缀合物以及含有它们的药物组合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因表达，并且具有较低的脱靶效应和良好的稳定性，可以实现过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α表达相关疾病和/或病症的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及核酸、药物组合物与缀合物及用途，进一步涉及用于调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α)基因表达的siRNA和含有siRNA的药物组合物与siRNA缀合物，还公开了涉及这些siRNA、药物组合物与siRNA缀合物的制备方法和用途，属于生物医药领域。
背景技术
PGC-1α是一种位于人类染色体4p15.1上的多功能转录因子。PGC-1α在棕色脂肪组织、肝脏、胰腺、肾脏、骨骼和心肌以及大脑中表达，在控制肝脏和肌肉中葡萄糖稳态、脂肪酸β氧化、线粒体生物发生、胰岛素分泌和适应性产热等遗传途径中发挥关键作用。肝糖异生是内源性葡萄糖产生的主要来源，PGC-1α通过与核激素受体HNF4α和FoxO1结合来调节肝脏中的糖异生，从而控制糖异生途径中的三种关键酶-磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)，果糖-1,6-二磷酸酶(F1,6BPase)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表达来增加体外和体内肝细胞的葡萄糖输出。选择性抑制肝脏中的PGC-1α的表达可以潜在地减少肝糖形成并改善糖尿病。
2型糖尿病(T2D)是一种慢性代谢疾病，表现为胰岛素抵抗和β细胞功能障碍引起的胰岛素分泌不足。2型糖尿病作为当前最为常见的一种代谢疾病。此外，糖耐量受损人群是糖尿病的高危人群，2021年估计有5.41亿人糖耐量受损。在所有糖尿病病例中，>90％是2型糖尿病(T2D)在过去的50年间，患病人数持续增长。患者特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等，血糖浓度失控升高可导致长期并发症，包括心脏病、中风、糖尿病视网膜病变，这可能导致失明、肾脏衰竭、甚至四肢血流不畅而需要截肢，少见并发糖尿病酮症酸中毒。
治疗T2D可通过降低胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)水平或提高胰岛素敏感性来进行。目前有几种药物正在临床上用于治疗T2D；这些药物主要包括用于治疗T2D的一线药物二甲双胍，但也有磺脲类药物、胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类(TZDS)、胰岛素类似物和钠-葡萄糖共转运体2(SGLT2)抑制剂，然而，这些药物都有其局限性和副作用。例如，随着时间的推移，大多数患者对二甲双胍治疗产生抵抗力，同时二甲双胍会引起腹泻、恶心和其他肠道不良反应，以及维生素B12缺乏；TZDs可能导致液体潴留(水肿、心力衰竭)、体重增加、膀胱癌(主要是使用吡格列酮时引起的)和充血性心力衰竭。
因此，为了有效控制血糖，减少不良反应的发生，需要开发更多的药物来降低高血糖。反义技术正在成为降低某些基因产物表达的有效手段。本文的化合物和组合物提供了抑制人PGC-1α的新颖、高度有效且可耐受的化合物，并且适用于人类受试者。另外，通过使用将反义化合物递送至肝脏并限制其肾分布和活性的缀合物策略，预测本文公开的化合物可减少糖异生途径中肝糖形成来改善糖尿病。
发明内容
本发明提供的如下siRNA及其修饰序列能够特异性地抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达，含有siRNA的药物组合物或siRNA缀合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达，实现与高血糖或糖尿病相关联疾病和/或病症的治疗。
在一些实施例中，本发明提供了第一种能够抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5’-GCAAUAAAGCGAAGAGUAUUU-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-AUACUCUUCGCUUUAUUGCUC-3’(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，本发明提供了第二种能够抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5’-CAGUGAUUUCAGUAAUGAAUU-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-UUCAUUACUGAAAUCACUGUC-3’(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，本发明提供了第三种能够抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5’-CUACCUAUGUUUAUAAAUUUU-3’(SEQ ID NO:5)；
5’-AAUUUAUAAACAUAGGUAGUU-3’(SEQ ID NO:6)。
本发明提供了含有本发明的siRNA和/所述siRNA缀合物的质粒或宿主细胞。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明的siRNA和/或siRNA缀合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明提供了所述的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗由过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达引起的疾病和/或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达引起的疾病和/或病症的方法，所述方法包括将有效量的本发明的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予高血糖或糖尿病相关联的疾病和/或病症的受试者。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因表达的方法，该方法包括将有效量的本发明的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述肝细胞接触。
本发明提供了一种试剂盒，所述试刑盒含有本发明的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。
有益效果
本发明提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还具有较高的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1αmRNA抑制活性，较低的脱靶效应，和/或能显著治疗高血糖或糖尿病相关联的疾病和/或病症。
在一些实施方案中，本发明提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体外实验中显示出优异的靶基因抑制活性。在一些实施方案中，本发明提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在肝细胞中显示出至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的靶基因表达抑制率。
本发明提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。据认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。
由此说明，本发明提供的siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物能够抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因的表达，有效治疗高血糖或糖尿病相关联的疾病和/或病症，具有良好的应用前景。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在发明中，PGC-1αmRNA是指具有Genbank注册号为NM_001330751.2所示序列的mRNA。进一步地，若无其它说明，本发明中所使用的术语“靶基因”是指录上达PGC-1αmRNA的基因，术语“靶mRNA”是指上述PGC-1αmRNA。
定义
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明所述术语“连接”，当表示两个分子之间的联系时，指两个分子通过共价键连接或者两个分子经由非共价键(例如，氢键或离子键)关联。
本发明所述“寡核苷酸”是含有10-50个核苷酸或核苷酸碱基对的核苷酸序列。在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸具有这样的核碱基序列，其与细胞内表达的靶基因中的编码序列至少部分互补。所述核苷酸可以任选被修饰。在本发明一些实施方式中，在将寡核苷酸递送至表达基因的细胞后，寡核苷酸能够在体外或体内抑制或阻断基因的表达。
本发明所述，与术语“PGC-1α”可互换使用的“过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α”是指是一类核转录辅助激活因子，参与肝糖异生的调节。PGC-1αmRNA序列的其他实例可使用公共数据库例如GenBank、UniProt和OMIM容易地获得。
本发明所述术语“糖尿病相关疾病和/或病症”或“PGC-1α相关疾病”是由PGC-1α过度复制引起的或与之相关的疾病或障碍。术语“PGC-1α相关疾病”包括从PGC-1α基因表达或复制减少中受益的疾病、障碍或病症。PGC-1α相关疾病的非限制性实例包括例如2型糖尿病、糖尿病肾病、肥胖、糖尿病性视网膜病变、冠状动脉粥样硬化性心脏病、非酒精性脂肪肝。
本发明所述术语“抑制”，表达给定基因时，表示与还没有经过处理的细胞、细胞群或组织相比，用本发明所述siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物处理该细胞、细胞群或组织时，基因表达降低。
本发明所述术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑止”和其他类似术语可互换使用，并且包括任何水平的抑制。优选地，抑制包括统计学上显著的抑制或临床上显著的抑制。
如本发明所用，短语“抑制PGC-1α的表达”或“抑制PGC-1α基因的表达”包括抑制任何PGC-1α基因(例如，在PGC-1α中由PGC-1α表达的PGC-1α基因、细胞中由表达构建体表达的PGC-1α基因)以及编码PGC-1α蛋白的PGC-1α基因的变体或突变体的表达。该术语包括编码一种或多种PGC-1α蛋白的任何PGC-1α转录无以及PGC-1α基因的变体和突变体的敲减。
所述正义链和反义链中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在本发明的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。在下文中，有时也将本发明的siRNA缀合物简称为“缀合物”。siRNA缀合物应根据上下文，理解为siRNA缀合物的总称，第一种siRNA缀合物或第二种siRNA缀合物，或siRNA正义链缀合物或siRNA反义链缀合物。
在一些实施例中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2’-位羟基、5’-位羟基或者碱基上。在一些实施例中，所述缀合基团还可以连接在3’-位羟基上，此时核苷酸之间采用2’-5’磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharanet.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalentN-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencingin vivo in hepatocytes.ACS Chemicalbiology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方案中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在上文及下文中，如无特别说明，通常，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指如下文进一步详述的修饰的核苷酸，核苷酸类似物(surrogatereplacement moiety)。
其中a、c、g和u分别为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸、2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸、2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸和2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸；
Af、Cf、Gf和Uf分别为2’-氟代腺苷-3’-磷酸、2’-氟代胞苷-3’-磷酸、2’-氟代鸟苷-3’-磷酸和2’-氟代尿苷-3’-磷酸；
dA、dC、dG和dT分别为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸、2’-脱氧胞苷-3’-磷酸、2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸和2’-脱氧胸苷-3’-磷酸；
(Agn)是腺苷-二醇核酸(GNA)；并且s是硫代磷酸酯连。
在本发明的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方案中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上文及下文中，特别是在描述本发明的siRNA、含siRNA的药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified ormodifiedRNAphosphoramidites,有时RNAphosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本发明所用的核苷单体均可通过商业化购买得到。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代”的“烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、牛、大鼠或任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”是指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
在一方面，本发明提供了第一种至第三种能够抑制PGC-1α基因表达的siRNA。以下依次对其进行详细描述。
本发明的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
第一种siRNA
按照本发明，所述siRNA可以是第一种siRNA。
所述第一种siRNA含有正义链和反义链，所述第一种siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5’-GCAAUAAAGCGAAGAGUAUUU-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-AUACUCUUCGCUUUAUUGCUC-3’(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。在一些实施方案中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施例中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
第二种siRNA
按照本发明，所述siRNA可以是第二种siRNA。
所述第二种siRNA含有正义链和反义链，所述第二种siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5’-CAGUGAUUUCAGUAAUGAAUU-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-UUCAUUACUGAAAUCACUGUC-3’(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。在一些实施方案中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施例中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
第三种siRNA
按照本发明，所述siRNA可以是第三种siRNA。
所述第三种siRNA含有正义链和反义链，所述第三种siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5’-CUACCUAUGUUUAUAAAUUUU-3’(SEQ ID NO:5)；
5’-AAUUUAUAAACAUAGGUAGUU-3’(SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。在一些实施方案中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施例中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
如前所述，本发明公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施例中，本发明的siRNA中的每个核苷酸均为未经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本发明的siRNA缀合物抑制PGC-1α基因表达的功能明显削弱或丧失。
在一些实施方案中，本发明的siRNA可以为表1列出的未修饰siRNA中的任意一种。
在一些实施方案中，本发明公开的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本发明公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2’位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供的siRNA的正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。换而言之，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。
在一些实施例中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施例中，本发明公开提供的siRNA的正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
在本发明公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(1)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷基修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-经取代的氨基修饰的核苷酸、2’-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方案中，2’-烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基(2’-OMe)修饰的核苷酸，如式(2)所示。在一些实施方案中，2’-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，可以是2’-甲氧基乙基(2’-ΜΟΕ)修饰的核苷酸，如式(3)所示。在一些实施方案中，2’-氨基(2’-ΝΗ2)修饰的核苷酸如式(4)所示。在一些实施方案中，2’-脱氧核苷酸(DNA)如式(5)所示：
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方案中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸或无环核苷酸。
桥联的核苷酸(bridgednucleic acid，简称BNA)可以含有五无环、六元环或七元环的具有“固定的”C3’-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2’-、4’-位处以提供一个2’，4’-BNA核苷酸。在一些实施例中，BNA可以是LNA、ENA、cETBNA等，其中，LNA如式(6)所示，ENA如式(7)所示，cETBNA如式(8)所示。
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方案中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(9)所示，GNA如式(10)所示：
上述式(9)和式(10)中，Ra选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方案中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1’-位移动至2’-位或3’-位而形成的化合物，如式(11)或(12)所示：
上述式(11)、式(12)所示化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；Rb选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方案中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2’-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2’-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2’-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2’-羟基被氟取代，而形成的具有如式(1)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2’-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2’-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2’-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2’-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(2)所示结构的化合物。
在一些实施方案中，本发明提供的siRNA的正义链或所述反义链开可以包括碱基修饰或替换。
具有上述修饰的siRNA可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，从而增加核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，上述修饰的siRNA具有较高的抑制靶mRNA的活性。
在一些实施方案中，本发明提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方案中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方案中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(13)所示结构的硫代磷酸酯基：
这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方案中，本发明提供的siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方案中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5’末端以外的全部上述位置处。在一些实施方案中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3’末端以外的全部上述位置处。
在一些实施方案中，所述siRNA反义链的5’末端核苷酸为5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5’-磷酸核苷酸可具有如式(14)结构：
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolutionofoligonucleotide therapies ofclinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5’-磷酸类似物修饰的核苷酸：
其中，R选自Η、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方案中，5’-磷酸核苷酸为式(14)所示的含有5’-磷酸修饰的核苷酸，5’-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，如式(15)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(17)所示。
表2中显示了本文公开的修饰的核苷酸单体的缩写。
表2.本发明公开的核苷酸单体的缩写
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在一些实施方案中，本发明提供的siRNA为表3列出的siRNA中的任意一种。
本发明提供的上述siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还具有很高的靶mRNA抑制活性。
本发明提供的siRNA可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成)得到。其中，固相合成已经有商业化定制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本发明所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。
siRNA缀合物
本发明提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团和任选的接头(linker)，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方案中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3’端或5’端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方案中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3’末端或5’末端。
在一些实施方案中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2’-位羟基或者碱基上。在一些实施方案中，所述缀合基团还可以连接在3’-位羟基上，此时核苷酸之间采用2’-5’磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方案中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方案中，靶向基团包含脱唾液酸糖蛋白受体配体。在一些实施方案中，脱唾液酸糖蛋白受体配体包括一种或多种半乳糖衍生物或由其组成。如本发明所用，术语“半乳糖衍生物”包括半乳糖和对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力等于或大于半乳糖的亲和力的乳糖衍生物。半乳糖衍生物包括但不限于：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺(参见例如：Iobst,S.T.和Drickamer,K.J.B.C.1996年，第271卷，第6686页)。可用于寡核苷酸和其他分子在体内靶向肝脏的半乳糖衍生物和半乳糖衍生物簇是本领域已知的(参见，例如，Baenziger和Fiete，1980,Cell,22,611-620；Connolly et al.,1982,J.Biol.Chem.,257,939-945)。半乳糖衍生物已被用于通过其与肝细胞表面上表达的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)的结合而在体内将分子靶向肝细胞。ASGPr配体与ASGPr(s)的结合有利于细胞特异性靶向肝细胞以及内吞分子进入肝细胞。ASGPr配体可以是单体(例如，具有单个半乳糖衍生物)或多聚体(例如，具有多个半乳糖衍生物)。可使用本领域已知的方法将半乳糖衍生物或半乳糖衍生物簇连接至siRNA的3’端或5’端。
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物中药学上可接受的靶向基团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价。应当理解的是，所述的一价、二价、三价、四价分别指siRNA分子与含有作为靶向基团的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的缀合基团形成siRNA缀合物后，该siRNA缀合物中siRNA分子与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的摩尔比为1:1、1:2、1:3或1:4。在一些实施方案中，所述药学上可接受的靶向基团是N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方案中，当本发明所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价或四价。在一些实施方案中，当本发明所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价。
靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式，可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本发明。
在一些实施方案中，当所述靶向基团为N-乙酰半乳糖胺时，合适的接头可以为如式(19)所示的结构：
其中，m为1-3的整数；
LA为具有如式(20)所示结构的包含酰胺键的链状部分，每个所述LA在其两端分别与一个所述靶向基团和所述LC部分通过醚键相连接：
LB为具有如式(21)所示结构的包含N-酰基吡咯烷的链状部分，所述链状部分在其一端具有羰基并与所述LC部分通过酰胺键相连接，在另一端具有氧原子并与所述siRNA通过磷酸酯键相连接：
LC为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的2-4价连接基团，所述LC经由氧原子与各个所述LA部分通过醚键相连接，并且经由氮原子与所述LB部分通过酰胺键相连接。
在一些实施方案中，作为接头的-(LA)3三羟甲基氨基甲烷-LB-连接N-乙酰半乳糖胺分子和siRNA分子所形成的siRNA缀合物，其结构如下式(22)所示：
式中，双螺旋结构表示siRNA。
同样，siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3’端或5’端，还可以在siRNA的内部序列中。
在一些实施方案中，本发明所述siRNA的正义链3’末端通过接头-(LA)3三羟甲基氨基甲烷-LB-与三个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)分子共价缀合，得到siRNA分子与GalNAc分子的摩尔比为1:3的siRNA缀合物，下文也可将其称为(GalNAc)3-siRNA，其结构如下式(23)所示：
其中，双螺旋结构表示所述siRNA，并且所述接头连接至所述siRNA的正义链3’末端。
在一些实施方案中，所述接头连接至所述siRNA的正义链5’末端。
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物具有如式(24)、(25)或(26)所示的结构
其中，R2为式(S1)所示结构的基团：
其中，E1为OH或SH，Nu为本发明的siRNA；
R1是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基或环状亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10)烷基(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10)烷基苯基)、氰基、-CO2H、C(O)O(C1-C10)烷基)、-CON(C1-C10)烷基(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10)烷基、-CONH2、-NH C(O)(C1-C10)烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10)烷基、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10)烷基)、-N(C1-C10)烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10)烷基、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10)卤代烷基)、-SO2NH2,-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10)烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C)卤代烷基)；
每个L1独立的是长度为1-40个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10)烷基(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10)烷基苯基)、氰基、-CO2H、C(O)O(C1-C10)烷基)、-CON(C1-C10)烷基(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10)烷基、-CONH2、-NH C(O)(C1-C10)烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10)烷基、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10)烷基)、-N(C1-C10)烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10)烷基、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10)卤代烷基)、-SO2NH2,-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10)烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10)卤代烷基)；
在一些实施方案中，L1可选自于由A1-A14基团或其任意连接组合所组成的组，其中A1-A14的结构和定义如下所示：
其中，每个k1独立地为1-20的整数；
每个k2独立地为1-20的整数；
每个Rc独立地为C1-C10烷基；
每个Rd选自于由A15-A19及其任意组合所组成的组：
每个Re独立地为C1-C10烷基；表示基团共价连接的位点。
技术人员应当理解的是，尽管为了方便起见，L1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或取代而产生的胺或烯基。为了本发明内容的目的，L1的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
M1表示靶向基团，其定义和可选择的范围与上述靶向基团相同。在一些实施方案中，每个M1独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。
R2为式(S1)所示结构的基团，其中，E1为OH或SH。
R1的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子与S1的连接。R1可以是任何能够以适当方式将S1基团连接至含氮骨架上的N原子的连接基团。在一些实施方案中，在通过固相合成的工艺制备式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物的情况下，R1基团中需要同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R2中的P原子相连接的连接位点。在一些实施方案中，R1中所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与N原子形成酰胺键，所述与R2上的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键。
在一些实施方案中，siRNA缀合物具有式(Z1-Nu)、(Z2-Nu)、(Z3-Nu)、(Z4-Nu)、(Z5-Nu)、(Z6-Nu)、(Z7-Nu)、(Z8-Nu)、(Z9-Nu)、(Z10-Nu)、(Z11-Nu)、(Z12-Nu)、(Z13-Nu)、(Z14-Nu)、(Z15-Nu)、(Z16-Nu)、(Z17-Nu)、(Z18-Nu)、(Z19-Nu)、(Z20-Nu)、(Z21-Nu)、(Z22-Nu)、(Z23-Nu)、(Z24-Nu)、(Z25-Nu)、(Z26-Nu)、(Z27-Nu)、(Z28-Nu)、(Z29-Nu)、(Z30-Nu)、(Z31-Nu)、(Z32-Nu)所示的结构，其中Z1-Z32为缀合基团，Nu为本发明的siRNA。
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在一些实施方案中，式S1中的P原子可以连接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式S1中的P原子可以连接到siRNA正义链或反义链的任何一个核苷酸上；在一些实施方案中，式S1中的P原子连接到siRNA正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方案中，式S1中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的末端；在一些实施方案中，式S1中的P原子连接到siRNA正义链的3’末端。在连接至siRNA的正义链的上述位置的情况下，(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的siRNA反义链，以阻断PGC-1αmRNA翻译蛋白质的过程，抑制PGC-1α基因表达。
在一些实施方案中，式S1中的P原子可以连接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5’位、核苷酸的2’位、核苷酸的3’位或核苷酸的碱基上。在一些实施方案中，式S1中的P原子可通过形成磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2’位、3’位或5’位。在一些实施方案中，式S1中的P原子连接在siRNA正义链3’末端核苷酸的3’羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，S1中的P原子也可以看作是siRNA中含有的磷酸基团中的P原子)，或者式S1中的P原子通过取代siRNA正义链中的一个核苷酸的2’-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式S1中的P原子通过取代siRNA正义链5’末端核苷酸的5’羟基中的氢与核苷酸连接。
本发明的siRNA缀合物在具有显著提高的血浆中稳定性、低脱靶效应的同时，还表现出较高的PGC-1αmRNA沉默活性。在一些实施方案中，本发明的siRNA可以为表1或表3示出的siRNA中的任意一种。含有这些siRNA的siRNA缀合物表现出更高的PGC-1αmRNA沉默活性。
本发明所述siRNA或siRNA缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子、铵离子NH4+、有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一种实施方案中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N，N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本发明所述siRNA或siRNA缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一种方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本发明所述siRNA或siRNA缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本领域技术人员知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本发明所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物的制备
可以采用任意合理的合成路线制备式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物。
在一些实施方案中，式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物可以采用如下方法制备，该方法包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照siRNA正义链和反义链的核苷酸种类和顺序，按照3’到5’的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；分离出siRNA的正义链和反义链，退火，其中，所述siRNA为上述本发明的siRNA；并且，该方法还包括在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(27)、(28)或(29)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，使式(27)、(28)或(29)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。下文中，式(27)、(28)或(29)所示的化合物也称作缀合分子。
其中：
R3为能够结合至式(24)、(25)或(26)所示的化合物中Nu代表的siRNA的基团。在一些实施方案中，R3为能够通过共价键结合至Nu代表的siRNA的基团。在一些实施方案中，R3为能够经反应而通过磷酸二酯键缀合至Nu代表的siRNA的任意官能团的基团；
每个T1独立地是M1中全部活性羟基被YCOO-基团取代而形成的基团，其中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；在一些实施方案中，Y为甲基。L1的定义和可选择的范围如前所述。
R3的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子的连接，并且为合成式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物提供合适的反应位点。在一些实施方案中，R3中包括R1连接基团或经保护的R1连接基团，以及可通过反应与siRNA形成S1所示结构的官能团。
在一些实施方案中，R3包含可与Nu代表的siRNA或核苷单体上的基团形成亚磷酸酯的第1官能团以及可与羟基或氨基反应形成共价键的第2官能团或者含有由所述共价键连接的固相载体。在一些实施方案中，所述第1官能团为亚磷酰胺、羟基或被保护的羟基。在一些实施方案中，所述第2官能团为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐。在一些实施方案中，所述第2官能团为经由共价键连接至分子其他部分的固相载体，所述共价键由羟基或氨基形成。在一些实施方案中，所述固相载体经由磷酸酯键、羧酸酯键或酰胺键连接。在一些实施方案中，所述固相载体为树脂。
在一些实施方案中，所述第1官能团含有羟基、-ORm或式(C3)所示的基团；所述第2官能团含有式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)所示的结构：
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rm为羟基保护基团，SPS表示固相载体，表示基团连接共价部分的位点。
在一些实施方案中，所述第1官能团含有亚磷酰胺基团，如式(C3)所示，该亚磷酰胺基团可以与核苷酸上的任意位置的羟基，如2’位羟基、3’位羟基或5’位羟基发生偶联反应形成亚磷酸酯，并经氧化或硫化形成式S1所示的磷酸二醋键或硫代磷酸酯键，将缀合分子缀合至siRNA。此时，即使所述第2官能团并不存在，式(27)、(28)或(29)所示化合物也能够缀合至核苷酸，不影响式(24)、(25)、(26)所示的siRNA缀合物的获得。在此情况下，在经由亚磷酰胺固相合成等方法获得siRNA的正义链或反义链后，使式(27)、(28)或(29)所示化合物与核苷酸序列中末端核苷酸上的羟基反应，并在后续的氧化或硫化过程中形成磷酸二酯键连接或硫代磷酸酯连接，将式(27)、(28)或(29)所示化合物缀合至siRNA。
在一些实施方案中，所述第1官能团含有被保护的羟基。在一些实施方案中，所述第2官能团包含可与固相载体反应的基团，所述反应提供包含固相载体的缀合分子。在一些实施方案中，所述第2官能团含有羧基、羧酸盐或亚磷酰胺，如式(C1)、(C2)或(C3)所示，当所述第2官能团包含羧基或羧酸盐时，式(27)、(28)或(29)所示化合物与固相载体，例如树脂上的羟基或氨基进行酯化反应或酰胺化反应，形成经羧酸酯键连接的包含固相载体的缀合分子。当所述第2官能团包含亚磷酰胺官能团时，式(27)、(28)或(29)所示化合物与通用固相载体，例如树脂上的羟基发生偶联反应，并经氧化形成经磷酸二酯键连接的包含固相载体的缀合分子。随后，以上述连接固相载体后的产物作为起始，按照亚磷酰胺固相合成方法依次连接核苷单体，获得连接有缀合基团的siRNA的正义链或反义链。在亚磷酰胺固相合成过程中，所述第1官能团发生脱保护，随后在偶联反应条件下与核苷单体上的亚磷酰胺基团发生偶联。
在一些实施方案中，所述第1官能团含有羟基或被保护的羟基；所述第2官能团含有经羧酸酯键连接的固相载体或经酰胺键连接的固相载体或者经磷酸酯键连接的固相载体，如式(C1’)或(C3’)所示。此时，由式(27)、(28)、(29)所示化合物代替固相载体作为起始，按照亚磷酰胺固相合成方法依次连接核苷单体，获得连接有缀合基团的siRNA的正义链或反义链。
在一些实施方案中，每个T1独立地是M1。在一些实施方案中，每个S1独立地M1中至少一个活性羟基被羟基保护基团保护而形成的基团。在一些实施方案中，被保护的羟基可以式YCOO-表示，其中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；在一些实施方案中，Y为甲基。
在一些实施方案中，Rm是MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-双甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)中的一种或多种。在一些实施方案中，Rm可以是DMTr，即4,4'-双甲氧基三苯甲基(4,4'-dimethoxytrityl)。
相应地，除非另有说明，以下涉及缀合物和/或缀合分子的制备的描述中，当提及“脱保护”、“偶联”、“盖帽”、“氧化”、“硫化”等反应时，应当理解为本领域公知的亚磷酰胺核酸固相合成方法中所涉及的反应条件和试剂也同样适用于这些反应。示例性的反应条件和试剂将在后文详细描述。
如前所述，式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物的制备方法还包括如下步骤：合成siRNA的另一链(例如，当上述步骤合成了连接有缀合分子的siRNA正义链时，还包括按照固相合成方法合成siRNA的反义链，反之亦然)，分离正义链和反义链，以及退火。具体地，在分离步骤中，连接至核苷酸序列和/或缀合分子的固相载体被切割下来，同时必要的保护基团被脱除(此时，式(27)、(28)或(29)所示化合物中的各S1基团转化为对应的M1靶向基团)，获得连接有缀合分子的siRNA正义链(或反义链)以及对应的反义链(或正义链)，正义链与反义链退火形成双链RNA结构，获得式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物。
在一些实施方案中，式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物的制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(27)、(28)或(29)所示的化合物与正义链或反义链的3’端的第一个核苷单体接触，使式(27)、(28)或(29)所示的化合物连接上序列中第一个核苷酸，在亚磷酰胺固相合成的条件下，按照预期的正义链或反义链核苷酸种类和顺序，以3’到5’的方向将核苷单体依次连接，合成siRNA的正义链或反义链；其中，式(27)、(28)或(29)所示化合物为R2中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有被保护的羟基，第2官能团具有如式(C1’)或(C3’)所示结构的化合物，与第一个核苷单体连接前，式(27)、(28)或(29)所示化合物经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；得到连接有缀合基团的核酸的正义链或反义链；在亚嶙酰胺固相合成的条件下，按照反义链或正义链核苷酸种类和顺序，按照3’到5’的方向将核苷单体依次连接，合成核酸的反义链或正义链；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得正义链和反义链，退火。
在一些实施方案中，式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物的制备方法包含以下步骤：按照该双链siRNA中正义链或反义链的核苷酸种类和顺序，按照3’到5’的方向将核苷单体依次连接，合成正义链和反义链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(27)、(28)或(29)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，将式(27)、(28)或(29)所示化合物连接至正义链或反义链，其中，式(27)、(28)或(29)所示化合物是R3中含有第1官能团，第1官能团为亚磷酰胺基团的式(27)、(28)或(29)所示化合物；脱除保护基并与固相载体切割，分别分离纯化，获得siRNA的正义链或反义链，退火，其中，所述siRNA的正义链或反义链上连接有缀合基团。
在一些实施方案中，式S1中的P原子连接至siRNA中的正义链的3’末端，式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)脱除式(27)、(28)或(29)所示化合物(其中，式(27)、(28)或(29)所示化合物为R3中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有被保护的羟基ORm，第2官能团具有如式(C1’)或(C3’)所示结构的化合物)中的羟基保护基团Rm；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将脱保护得到的产物与核苷单体接触，得到通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以该通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3’-5’的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物。
在获得所述缀合物后，在一些实施方案中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物进行表征，确定所合成的siRNA缀合物为目标设计的式(24)、(25)或(26)所示的siRNA缀合物，且所合成的siRNA的序列为期望的siRNA的序列。
在一些实施方案中，所述固相载体为本领域中公知的可用于核酸固相合成的固相载体。
药物组合物
本发明还包括包含本发明的siRNA缀合物的药物组合物和制剂。在一些实施方案中，本文提供了包含如本文所述的siRNA缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，本文中所述药物组合物还包括盐酸小檗碱或二甲双胍。
包含siRNA缀合物的药物组合物可用于治疗与PGC-1α基因的表达或活性相关的疾病或病症。此类药物组合物是基于递送方式配制的。一个实例是配制用于通过肠胃外递送(例如通过皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)递送)进行系统性施用的组合物。在某些实施方案中，本发明提供了配制用于器官特异性(例如，肝)动脉内、肿瘤内、真皮内、玻璃体内注射、眼外用、眼用(滴眼液)、雾化、眼局部或其他局部途径、栓剂或口服施用的组合物。在优选的实施方案中，组合物皮下施用。
本发明的药物组合物可以以足以抑制PGC-1α基因表达的剂量施用。在一些实施例中，以如下剂量施用siRNA缀合物：每剂约0.5mg/kg至50mg/kg，或0.3mg/kg至20mg/kg，或3mg/kg至10mg/kg，或优选每剂3mg/kg至10mg/kg。例如，siRNA缀合物可以以每单一剂量约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg的剂量施用。
组合物也可以制备并以不依赖于体重的对于受试者的固定剂量包装。可以通过将每公斤体重乘以平均受试者的体重来计算示例性剂量水平。例如，一般成年人的平均体重认为是约70公斤。
重复剂量方案可以包括定期施用治疗量的siRNA缀合物，例如每月一次、每隔一月一次或每三个月一次。在优选的实施方案中，以不超过每月一次的频率施用siRNA缀合物。在初始治疗方案后，可以较低频率施用治疗。
技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康状况或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。如本文其他地方所描述的，可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试，来估计本发明涵盖的单个siRNA缀合物的有效剂量和体内半衰期。
A.赋形剂
“药物载体”或“药物赋形剂”是用于将一种或多种核酸递送给动物的药学上可接受的溶剂、助悬剂或任何其他药学上惰性的媒介。这样的试剂是本领域众所周知的。
B.其他组分
本发明的组合物可以以本领域已确立的使用水平另外包含药物组合物中常规存在的其他辅助组分。因此，例如，该组合物可以包含另外的、相容的药物活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂，或者可以包含可用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的另外的物质，例如防腐剂、抗氧化剂和稳定剂。然而，当添加时，此类物质不应不适当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。可以对制剂进行灭菌，且如果需要，可以与不会有害地与制剂的核酸相互作用的助剂混合，例如是防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐或缓冲剂等。
在一些实施方案中，本发明中表征的药物组合物包括(a)一种或多种siRNA缀合物化合物和(b)一种或多种通过非RNAi机制发挥功能并且可用于治疗高血糖或糖尿病相关障碍的药剂。
如上所述，除了它们的施用之外，本文所表征的siRNA缀合物可以与有效治疗高血糖或糖尿病的其他已知药剂组合施用。无论如何，给药医师可以基于使用本领域已知或本文所述的标准功效测量法所观察到的结果来调整siRNA缀合物施用的量和时机。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))所记载的方法进行。所用如式(27)、(28)或(29)的缀合分子购自南京雷正医药科技有限公司。
实施例1siRNA的设计
采用oligowalk在线设计一组靶向人类PGC-1α基因的siRNA(人类：NCBI refseqIDNM_001330751.2；NCBI GeneID:10891)。人类NM_001330751REFSEQ mRNA，第二版具有6908个碱基长度。同时，为了避免任何序列产生的毒性，还需排除与人源基因相似的序列。
未修饰PGC-1α正义及反义链核苷酸序列的详细列表示于表1。修饰的PGC-1α正义及反义链核苷酸序列的详细列表示于表3。
实施例2siRNA或siRNA缀合物的制备
合成：按照亚磷酰胺固相合成技术合成正义链和反义链序列，在Mermade 192合成仪(BioAutomation)上使用固相载体介导的亚磷酰胺化学方法以1μmol规模合成。固相载体是加载有定制GalNAc配体分子的可控多孔玻璃(CPG，)或通用固相载体。辅助合成试剂，2’-F和2’-O-甲基RNA亚磷酰胺等均为商品化可得试剂。使用相应的亚磷酰胺引入2’-F、2’-O-甲基、GNA(二醇核酸)、5’-磷酸和无碱基修饰。在GalNAc修饰的CPG支持物上进行3’GalNAc缀合单链的合成。CPG通用固相载体用于合成反义单链，或5’GalNAc缀合单链的合成。使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT)作为活化剂(在乙腈中，0.6M)，所有亚磷酰胺(溶于无水乙腈中，100mM)的偶联时间为5分钟。使用50mM 3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)于无水乙腈/吡啶(vv＝1/1)中的溶液产生硫代磷酸酯键，反应时间3分钟。所有序列在最后脱除DMT基团后即合成。
CPG上结合的低聚体的切割和去保护：在固相合成终止后，通过用含20％二乙胺的乙腈溶液处理30分钟去除保护基，而没有从CPG上切下寡核苷酸。随后，干燥的CPG在40℃下用浓氨水处理18小时。在离心之后，上清液被转移至新的管中并且用氨水洗涤CPG。浓缩合并的溶液得到固体混合物。
纯化：通过使用NanoQ阴离子交换HPLC纯化。缓冲液A是10mM高氯酸钠溶液，20mMTris，1mM EDTA，pH 7.4和含有乙腈20％，以及缓冲液B，500mM高氯酸钠，20mM Tris，1mMEDTA，pH7.4和含有乙腈20％。分离得到目标产物，并用反相C18柱脱盐。
寡核糖核苷酸的退火产生siRNA缀合物：把待退火的RNA寡聚体用无菌RNase FreeH2O(无RNA水解酶)配制成200μΜ的溶液。如下设置退火反应体系，将总体积为100μL的上述溶液(双链体浓度为10nmol)放置95℃水浴锅10分钟(≥100nmol需求量需要高温20分钟)→迅速放入60℃水浴自然降温→退火完成后的溶液在4℃保存。通过合并等摩尔的RNA溶液混合互补链。
表4显示了使用上述方法合成的PGC-1αsiRNA缀合物。
表4.修饰的PGC-1αsiRNA缀合物核苷酸序列
实施例3siRNA体外活性测试
通过qPCR定量检测HepG2细胞中PGC-1αmRNA含量，以化合物的IC50值为指标，来评价siRNA缀合物对PGC-1α的抑制活性；
实验材料及试剂：
细胞系：HepG2细胞(中国科学院干细胞库提供)
HepG2细胞培养基(DMEM，Invitrogen-11330032；10％血清，Invitrogen-10099141；100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素，Hyclone-SV30010；1％非必需氨基酸，Invitrogen-11140050；2mM L-谷氨酷胺，Invitrogen-25030081；1mM丙酮酸钠，Gibco-11360-070；500μg/mL Geneticin，Invitrogen-10131027)。
试剂：胰酶(Invitrogen-25300062)；DMSO(Sigma-D2650-100ML)；转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen-13778-150)；MEM Medium(HyClone-SH30024.01)；ULtraPure DistilledWater(DNAse,RNAse,Free)(Invitrogen-10977-015)；Opti-MEM I(1X)(Gibco-31985-070)；Phosphate Buffered Saline(PBS)(Gibco)；PrimeScriptTMRTreagentKit with gDNAEraser(takara-RR047A)；ChamQ Universal SYBRqPCRMaster Mix(vyzme-Q711-02)。
耗材与仪器：48孔细胞培养板(Coming-3599)；CO2培养箱(HERA-CELL-240)；Microplate(Axygen-PCR-96-FLT-C)；qPCR equipment(QIANGE)。
实验步骤：(看订购信息)
siRNA或siRNA缀合物通过转染进入HepG2细胞，过程如下所述：取HepG2细胞，先用PBS洗涤后，加入胰蛋白酶进行消化，调整细胞到合适的密度，24h后应用转染试剂Lipofectamine RNAiMax将siRNA转入PGC-1α细胞，以每孔10,000个细胞的密度接种到48孔板中，每孔HepG2细胞培养基为500μL。细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养48h。转染后48小时，收集细胞，提取RNA，RT-PCR检测细胞内总PGC-1α-RNA。
受试siRNA测试2个浓度点，3复孔。对照设置为NM_001330751.2，测试4个浓度点，2复孔。
检测PGC-1αRNA步骤简述如下：应用trizol法提取细胞中的总RNA，参照反转录试剂盒(takara)说明书，加入随机引物反转录成cDNA，然后qPCR检测样品中的PGC-1αcDNA。同时，GAPDH引物和探针特异性检测GAPDH cDNA。
PCR反应程序为：95℃ 2分钟，然后进入循环模式，95℃ 10秒，随后60℃，30秒，共40个循环。依据各样品的Ct值计算样品中的PGC-1αRNA含量。
PCR引物如下：
Human PGC-1α-Forward 5-ACCACAAACGATGACCCTCC-3；
Human PGC-1α-Reverse 5-GTGGAGTTAGGCCTGCAGTT-3。
Human GAPDH-Forward 5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3；
Human GAPDH-Reverse 5-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3。
每个样品目的基因PGC-1αmRNA的表达水平通过ΔΔCt相对定量法进行计算。目的基因相对表达量使用2-ΔΔCT表示，计算公式如下：
a)Ct值根据Quant Studio 7软件的默认设置自动计算。将Ct值导出为Excel文件。
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(目的基因)–Ct(gapdh)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品)-ΔCt(Mock)
相对于Mock的mRNA表达＝2-ΔΔCt
其中，Mock代表添加等浓度的Lipofectamine RNAiMax但是无siRNA的阴性对照。
抑制率如下计算：(1-(2-ΔΔCt))*100％。表5显示了本发明的siRNA对PGC-1α的抑制活性。
表5.本发明的siRNA对PGC-1αRNA的抑制率
利用上述相同的方法转染至HepG2细胞中，测定本发明的siRNA缀合物对PGC-1α的抑制活性(IC50)使用GraphPad进行数据拟合得出IC50数值。表6显示了本发明的siRNA缀合物对PGC-1α的抑制活性(IC50)。
表6.本发明的siRNA缀合物对PGC-1α的抑制活性(IC50)
| 双链体名称 | PGC-1αRNAIC50(nM) |
| JNL1 | 2.35 |
| JNL2 | 3.78 |
| JNL3 | 3.12 |
| JNL4 | 2.38 |
| JNL5 | 3.16 |
| JNL6 | 3.78 |
| JNL7 | 3.42 |
| JNL8 | 3.47 |
从表6可以看出，本发明提供的siRNA缀合物在HepG2细胞中具有较高的抑制活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (26)
1.一种siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有核苷酸序列I，反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下(i)-(iv)所示序列中的一组：
(i)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5’-GCAAUAAAGCGAAGAGUAUUU-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-AUACUCUUCGCUUUAUUGCUC-3’(SEQ ID NO:2)；
(ii)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：5’-CAGUGAUUUCAGUAAUGAAUU-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-UUCAUUACUGAAAUCACUGUC-3’(SEQ ID NO:4)；
(iii)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列长度相等，且任选具有不多于3个核苷酸差异：
5’-CUACCUAUGUUUAUAAAUUUU-3’(SEQ ID NO:5)；
5’-AAUUUAUAAACAUAGGUAGUU-3’(SEQ ID NO:6)；
优选地，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异；
或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异；
或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列之间任选具有不多于1个核苷酸差异。
2.如权利要求1所述的siRNA，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，优选地，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。
3.如权利要求1或2所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
4.如权利要求3所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
5.如权利要求4所述的siRNA，其中，所述核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-经取代的烷基修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-经取代的氨基修饰的核苷酸、2’-脱氧核苷酸中的一种；
所述核苷酸类似物选自异核苷酸、桥联的核苷酸或无环核苷酸；
特别地，异核苷酸是碱基从核糖环的1’-位移动至2’-位或3’-位而形成的化合物；
桥联的核苷酸为选自式(6)所示的LNA、式(7)所示的ENA、式(8)所示的cET中的一种，
无环核苷酸为选自式(9)所示的UNA和式(10)所示的GNA中的一种，
其中，上述式(6)至式(10)中，Base表示核酸碱基，Ra选自H、OH或C1-C10烷氧基(O-烷基)。
6.如权利要求3-5中任一项所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，优选地，所述甲氧基修饰的核苷酸为核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
7.如权利要求2所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；
优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(13)所示结构的硫代磷酸酯基：
8.如权利要求7所述siRNA，其中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合；
或者，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5’末端以外的全部上述位置处，
或者，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3’末端以外的全部上述位置处。
9.如权利要求1所述siRNA，其中，反义链的5’末端核苷酸为5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸类似物修饰的核苷酸；特别地，5’-磷酸核苷酸为式(14)所示的含有5’-磷酸修饰的核苷酸，
5’-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，如式(15)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(17)所示，
其中，R选自Η、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
10.如权利要求1-9中任一项所述siRNA，其选自下表中：
11.一种siRNA缀合物，其中，所述siRNA缀合物含有权利要求1-10中任一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
12.如权利要求11所述的siRNA缀合物，其中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
进一步的，所述接头连接至所述siRNA的正义链3’末端或正义链5’末端；
优选的，所述接头具有如式(19)所示的结构：
其中，m为1-3的整数；
LA是具有如式(20)所示结构的包含酰胺键的链状部分，每个所述LA在其两端分别与一个所述靶向基团和所述LC部分通过醚键相连接：
LB是具有如式(21)所示结构的包含N-酰基吡咯烷的链状部分，所述链状部分在其一端具有羰基并与所述LC部分通过酰胺键相连接，在另一端具有氧原子并与所述siRNA通过磷酸酯键相连接：
LC是基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的2-4价连接基团，所述LC经由氧原子与各个所述LA部分通过醚键相连接，并且经由氮原子与所述LB部分通过酰胺键相连接；
所述缀合物具有式(24)、(25)或(26)所示的结构：
其中，R2为式(S1)所示结构的基团：
其中，E1为OH或SH；
Nu为权利要求1-12中任一项所述的siRNA；
R1是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基或环状亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R1任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、-CO2H、C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立的是长度为1-40个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中R1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、-CO2H、C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
M1表示靶向基团；
表示基团共价连接的位点。
13.如权利要求12所述的siRNA缀合物，其中，每个L1独立地选自于由基团A1-A14及任意组合所组成的组：
其中，每个k1独立地为1-20的整数；
每个k2独立地为1-20的整数；
每个Rc独立地为C1-C10烷基；
每个Rd选自于由A15-A19及其任意组合所组成的组：
每个Re独立地为C1-C10烷基；表示基团共价连接的位点。
14.如权利要求13所述的siRNA缀合物，其中，L1为基团A1、A4、A8、A10、A11中至少2个的连接组合。
15.如权利要求12-14中任一项所述的siRNA缀合物，其中，L1的长度为3-20个原子。
16.如权利要求12-15中任一项所述的siRNA缀合物，其中，k1为3-5的整数，k2为3-5的整数，Rc为甲基、乙基和异丙基中的一种，Rd为A15或A16，Re为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。
17.如权利要求12-16中任一项所述的siRNA缀合物，其中，每个所述靶向基团独立地为选自D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺中的一种。
18.如权利要求13-17中任一项所述的siRNA缀合物，其中，R1上同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R2中的P原子连接的连接位点；
优选地，R1上同时与含氮骨架上的N原子连接的连接位点与N形成酰胺键，所述与R2上的P原子连接的位点与P形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键。
19.如权利要求12-18中任一项所述的siRNA缀合物，其中，式(S1)中的P原子连接到所述siRNA正义链或反义链的末端；
优选地，式(S1)中的P原子通过磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2’位、3’位或5’位。
20.如权利要求11所述的siRNA缀合物，其中，所述siRNA缀合物具有式(Z1-Nu)、(Z2-Nu)、(Z3-Nu)、(Z4-Nu)、(Z5-Nu)、(Z6-Nu)、(Z7-Nu)、(Z8-Nu)、(Z9-Nu)、(Z10-Nu)、(Z11-Nu)、(Z12-Nu)、(Z13-Nu)、(Z14-Nu)、(Z15-Nu)、(Z16-Nu)、(Z17-Nu)、(Z18-Nu)、(Z19-Nu)、(Z20-Nu)、(Z21-Nu)、(Z22-Nu)、(Z23-Nu)、(Z24-Nu)、(Z25-Nu)、(Z26-Nu)、(Z27-Nu)、(Z28-Nu)、(Z29-Nu)、(Z30-Nu)、(Z31-Nu)或(Z32-Nu)所示的结构，
/>
/>
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其中Nu为权利要求1-10中任一项所述的siRNA。
21.如权利要求11所述的siRNA缀合物，其中，所述siRNA缀合物具有如式(23)所示的结构：
其中，双螺旋结构表示权利要求1-10中任一项所述的siRNA。
22.权利要求1-10中任一项所述的siRNA和/或权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物在制备抑制细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因表达的药物中的用途。
23.含有权利要求1-10中任一项所述的siRNA和/或权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物的质粒或宿主细胞。
24.一种药物组合物，其中，其包含权利要求1-10中任一项所述的siRNA、权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物和/或权利要求23所述的质粒或宿主细胞；所述药物组合物中还含有任选的药学上可接受的载体；可选的，所述组合物中含有盐酸小檗碱或二甲双胍。
25.权利要求1-10中任一项所述的siRNA、权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物和/或权利要求24所述的药物组合物在制备用于治疗过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因表达相关疾病和/或病症的药物中的用途；
所述过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因表达相关疾病和/或病症是与高血糖或糖尿病相关联疾病和/或病症。
26.一种抑制细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因表达的方法，其特征在于，将权利要求1-10中任一项所述的siRNA、权利要求11-21中任一项所述的siRNA缀合物和/或权利要求24中所述的药物组合物与细胞接触。
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