JP2002524038A - Ｖｅｇｆ発現の抑制のための短鎖オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＶＥＧＦ（血管内皮生育因子）をコードする核酸配列の特定の部分に相当する配列を有し、最大１５ヌクレオチドの長さを有する短鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体に関し、本発明は更にそのようなオリゴヌクレオチドの製造方法およびその使用にも関する。１０〜１５ヌクレオチドの長さを有し、ＶＥＧＦコード配列の部分に相当する短鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、ここでオリゴヌクレオチドが相当するＶＥＧＦコード配列の部分は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の配列の１つまたはその部分を有し、ここで配列番号１は（ａｂｓ−１）、配列番号２は（ａｂｓ−２）、配列番号３は（ａｂｓ−３）、配列番号４は（ａｂｓ−４）、配列番号５は（ａｂｓ−５）そして配列番号６は（ａｂｓ−６）である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はＶＥＧＦ（血管内皮生育因子）をコードする核酸配列の特定の部分に
相当する配列を有し、そして、最大１５ヌクレオチドの長さを有する短鎖オリゴ
ヌクレオチドまたはその誘導体に関し、また、本発明は更にオリゴヌクレオチド
の製造方法およびその使用に関する。

【０００２】 血管形成は生育と発達において基本的な役割を演じる新しい毛細血管の生育と
して定義される。成熟したヒトにおいては血管形成応答を開始させる能力は全て
の組織に存在するが、厳密な制御下におかれている。血管形成は創傷の修復およ
び子宮内膜調節のような特定の状況において稼動するのみである。血管形成の調
節は多くの抑制因子と促進因子の間の精密な均衡に依存している。ＶＰＦ（血管
透過性因子）とも称されるＶＥＧＦは血管形成の重要な調節物質であり、その有
糸分裂促進作用は内皮細胞に特異的である（Ferrara, Trends Cardiovasc. Med.
(1993)3, 244）。ＶＥＧＦは同様の生物学的活性を示し、交互スプライシング
から生じる少なくとも４種の異なるイソフォーム（ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、
ＶＥＧＦ₁₈₉およびＶＥＧＦ₂₀₆）として存在する。ＶＥＧＦはヒトの腫瘍、およ
び、糖尿病性腎臓病、乾癬、加齢性黄斑変性、関節リューマチおよび他の炎症性
疾患のような、高度な血管化または血管透過性を特徴とする疾患の組織において
異常に高濃度で発現する。従って、ＶＥＧＦ濃度を選択的に低下させる薬剤は悪
性疾患および他の血管形成性の疾患の治療に使用される。

【０００３】 ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体はヌードマウスにおいて数種類の腫瘍の
生育を抑制することができることが解かっている（Kim et al., Nature (1993)
362, 841）。ＶＥＧＦ濃度を低下させる別の可能性はその性質を改良するために
場合により修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である（E. Uhlma
nn and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)；S. Agrawal, TIBTECH 1
996, 376）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの特定の配列に結合し
、これによりｍＲＮＡの分解および／または蛋白質合成の抑制をもたらすと考え
られている。

【０００４】 ＥＰ０７６９５５２ Ａ１はＶＥＧＦコード配列の種々の領域に対する８ヌク
レオチドより長いアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。これらのオ
リゴヌクレオチドの一部は３０％までＶＥＧＦの発現を抑制することができるこ
とが解かっている。オリゴヌクレオチドは（ホスホジエステルヌクレオシド間架
橋修飾のない）未修飾のオリゴヌクレオチドの形態で細胞非含有系において試験
されている。長さが１６〜２０ヌクレオチドの選択されたアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、全ホスホロチオエート（全ホスホジエステルヌクレオシド間架橋
がホスホロチオエートとして修飾されている)(オリゴヌクレオチドＡ０８５Ｒ−
Ｓ、Ａ０８７Ｐ−Ｓ、Ａ２２７−Ｓ、Ａ２８７−Ｓ、Ａ３１１−ＳおよびＡ４１
９−Ｓ）の形態でも試験されており、Ａ５４９細胞系アッセイにおいては全ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチド２０μＭでＶＥＧＦ発現を３０〜４６％抑制
している。最も効果的な全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ａ４１９−
Ｓ）は２０merであり、配列番号１００：５′−ＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴ
ＣＣＧＣＡＴ−３′の配列を有している。

【０００５】 本発明はＶＥＧＦコード配列の部分に相当する短鎖オリゴヌクレオチドまたは
その誘導体を提供し、ここでオリゴヌクレオチドが相当するＶＥＧＦコード配列
の部分は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または
配列番号６の配列の１つまたはその部分を有し、ここで、 配列番号１は 5′-CCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCG-3′であり、 配列番号２は 5′-CGGGCCTCCGAAACC-3′であり、 配列番号３は 5′-GCTCTACCTCCACCATGCCAA-3′であり、 配列番号４は 5′-GTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGC-3′であり、 配列番号５は 5′-CATCTTCAAGCCATCC-3′であり、そして 配列番号６は 5′-TGCGGGGGCTGCTGC-3′ である。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および
配列番号６の配列は「コア領域」であり、これは短鎖オリゴヌクレオチドの設計
に極めて適していることがわかっている。配列番号１、配列番号２、配列番号３
、配列番号４、配列番号５および配列番号６の配列はヌクレオチド３０〜５１（
コア領域１と称される配列番号１）、ヌクレオチド４２〜５６（コア領域２と称
される配列番号２）、ヌクレオチド１０１〜１２１（コア領域３と称される配列
番号３）、ヌクレオチド１２２〜１４５（コア領域４と称される配列番号４）、
ヌクレオチド２６８〜２８４（コア領域５と称される配列番号５）およびヌクレ
オチド３０３〜３１７（コア領域６と称される配列番号６）と等価である。番号
はヒトＶＥＧＦヌクレオチド配列である配列番号９３（表１）に対応している。
配列番号９３内のコア配列の位置は図１に示す。ヒトＶＥＧＦｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列はLeung等(1989)、Science 8, 1307において図１Ｂの通りとされてい
る。配列番号９３はLeung等によれば図１Ｂに示す配列の５′末端（ヌクレオチ
ド１〜４８０）に相当する。

【０００６】 オリゴヌクレオチドはＶＥＧＦをコードする核酸の部分に相当する配列を有す
る。「相当する」という表現はオリゴヌクレオチドの塩基配列がＶＥＧＦをコー
ドする核酸（例えば遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の配列の部分に対して相補的
であり、このため、オリゴヌクレオチドをＶＥＧＦコード核酸（好ましくはＶＥ
ＧＦｍＲＮＡ）のその「センス」部分にハイブリダイズ（結合）させることがで
きる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ばれるのはこのような理由から
である。従って、本発明の好ましい実施態様においてはオリゴヌクレオチドはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の別の好ましい実施態様において
は、オリゴヌクレオチドはリボザイムである。リボチームは触媒性の核酸であり
、ｍＲＮＡを分解する。好ましいリボザイムはハンマーヘッドリボザイムの群か
ら選択される（Uhlmann and Peyman, 1990）。

【０００７】 本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号７〜配列番号１２の配列の１つまたは
その部分と等価であり、ここで、 配列番号７は 3′-GGGCCGGGGCCAGCCCGGAGGC-5′； 5′-CGGAGGCCCGACCGGGGCCGGG-3′ （配列番号１に相当） であり、 配列番号８は 3′-GCCCGGAGGCTTTGG-5′； 5′-GGTTTCGGAGGCCCG-3′ （配列番号２に相当） であり、 配列番号９は 3′-CGAGATGGAGGTGGTACGGTT-5′； 5′-TTGGCATGGTGGAGGTAGAGC-3′ （配列番号３に相当） であり、 配列番号10は 3′-CACCAGGGTCCGACGTGGGTACCG-5′； 5′-GCCATGGGTGCAGCCTGGGCAACA-3′ （配列番号４に相当） であり、 配列番号11は 3′-GTAGAAGTTCGGTAGG-5′； 5′-GGATGGCTTGAAGATG-3′ （配列番号５に相当） であり、そして 配列番号12は 3′-ACGCCCCCGACGACG-5′； 5′-GCAGCAGCCCCCGCA-3′ （配列番号６に相当） である。

【０００８】 オリゴヌクレオチドが相当するＶＥＧＦコード核酸配列の部分は１０、１１、
１２、１３、１４または１５ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは、オリゴヌ
クレオチドはＶＥＧＦコード配列の１２ヌクレオチドの長さに相当する。従って
、本発明のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド１０個（１０mer）、１１個（１
１mer）、１２個（１２mer）、１３個（１３mer）、１４個（１４mer）または１
５個（１５mer）の長さを有する。

【０００９】 本発明の好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドは１２ヌクレオチ
ドの長さを有し、このようなヌクレオチドは例えば配列番号１４、配列番号１６
、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号５２、配
列番号５５および配列番号５６の配列の１つを有し、ここで、 配列番号14は 3′-CCAGCCCGGAGG-5′；5′-GGAGGCCCGACC-3′ （配列番号７の部分と等価） であり、 配列番号16は 3′-CGGAGGCTTTGG-5′；5′-GGTTTCGGAGGC-3′ （配列番号８の部分と等価） であり、 配列番号27は 3′-GATGGAGGTGGT-5′；5′-TGGTGGAGGTAG-3′ （配列番号９の部分と等価） であり、 配列番号28は 3′-GGAGGTGGTACG-5′；5′-GCATGGTGGAGG-3′ （配列番号９の部分と等価） であり、 配列番号29は 3′-GGTGGTACGGTT-5′；5′-TTGGCATGGTGG-3′ （配列番号９の部分と等価） であり、 配列番号33は 3′-CACCAGGGTCCG-5′；5′-GCCTGGACCAC-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号34は 3′-CCAGGGTCCGAC-5′；5′-CAGCCTGGGACC-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号35は 3′-AGGGTCCGACGT-5′；5′-TGCAGCCTGGGA-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号36は 3′-GGGTCCGACGTG-5′；5′-GTGCAGCCTGGG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号37は 3′-GGTCCGACGTGG-5′；5′-GGTGCAGCCTGG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号38は 3′-CCGACGTGGGTA-5′；5′-ATGGGTGCAGCC-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号52は 3′-GTAGAAGTTCGG-5′；5′-GGCTTGAAGATA-3′ （配列番号１１の部分と等価） であり、 配列番号55は 3′-ACGCCCCCGACG-5′；GCAGCCCCCGCA-3′ （配列番号１２の部分と等価） であり、そして 配列番号56は 3′-CCCCCGACGACG-5′；GCAGCAGCCCCC-3′ （配列番号１２の部分と等価） である。

【００１０】 本発明の別の実施態様においては、オリゴヌクレオチドは１３ヌクレオチドの
長さを有し、このようなオリゴヌクレオチドは例えば、配列番号７３、配列番号
７４または配列番号７５の配列を有し、ここで、 配列番号73は 3′-GGAGGTGGTACGG-5′；5′-GGCATGGTGGAGG （配列番号９の部分と等価） であり、 配列番号74は 3′-GGGTCCGACGTGG-5′；5′-GGTGCAGCCTGGG （配列番号１０の部分と等価） であり、そして 配列番号75は 3′-GCCCCCGACGACG-5′；5′-GCAGCAGCCCCCG （配列番号１２の部分と等価） である。

【００１１】 本発明の別の実施態様においては、オリゴヌクレオチドは１４ヌクレオチドの
長さを有し、このようなオリゴヌクレオチドは例えば、配列番号７６、配列番号
７７、配列番号７８または配列番号７９の配列の１つを有し、ここで、 配列番号76は 3′-CCCGGAGGCTTTGG-5′；5′-GGTTTCGGAGGCCC-3′ （配列番号８の部分と等価） であり、 配列番号77は 3′-CGAGATGGAGGTGG-5′；5′-GGTGGAGGTAGAGC-3′ （配列番号９の部分と等価） であり、 配列番号78は 3′-GGGTCCGACGTGGG-5′；5′-GGGTGCAGCCTGGG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、そして 配列番号79は 3′-CGCCCCCGACGACG-5′；5′-GCAGCAGCCCCCGC-3′ （配列番号１２の部分と等価） である。

【００１２】 本発明の別の実施態様においては、オリゴヌクレオチドは１５ヌクレオチドの
長さを有し、このようなオリゴヌクレオチドは例えば、配列番号８０〜配列番号
８８の配列の１つを有し、ここで、 配列番号80は 3′-GGGCCGGGGCCAGCC-5′；5′-CCGACCGGGGCCGGG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号81は 3′-CCGGGGCCAGCCCGG-5′；5′-GGCCCGACCGGGGCC-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号82は 3′-GGCCGGGGCCAGCCC-5′；5′-CCCGACCGGGGCCGG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号83は 3′-CCCCGGAGGCTTTGG-5′；5′-GGTTTCGGAGGCCCC-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号84は 3′-ATGGAGGTGGTACGG-5′；5′-GGCATGGTGGAGGTA-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号85は 3′-GGAGGTGGTACGGTT-5′；5′-TTGGCATGGTGGAGG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号86は 3′-CCAGGGTCCGACGTG-5′；5′-GTGCAGCCTGGACC-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、 配列番号87は 3′-GTAGAAGTTCGGTAG-5′；5′-GATGGCTTGAAGATG-3′ （配列番号１０の部分と等価） であり、そして 配列番号88は 3′-TAGAAGTTCGGTAGG-5′；5′-GGATGGCTTGAAGAT-3′ （配列番号１０の部分と等価） である。

【００１３】 配列番号１４、配列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配
列番号３８、配列番号５２、配列番号５５および配列番号５６および配列番号７
３〜配列番号８８はコア配列の１つまたはその部分に相当する（これらは配列番
号７〜配列番号１２の配列の１つまたはその部分と等価である）。配列番号１３
、配列番号１５、配列番号１７〜配列番号２６、配列番号３０〜配列番号３２、
配列番号３９〜配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７〜配
列番号７２については、配列はコア領域の１つに相当しない（実施例１のオリゴ
ヌクレオチド、図１）。全ての配列はヒトＶＥＧＦｃＤＮＡ配列番号９３または
例えばLeung等（Science（1989）246, 1306）の報告したＶＥＧＦ配列から誘導
される。

【００１４】 本発明はまたオリゴヌクレオチドの誘導体、例えばその塩、特にその生理学的
に忍容性のある塩に関する。塩および生理学的に忍容性のある塩は例えばReming
tons Pharmaceutical Science（1985）, Mack Publishing Company, Easton, PA
(p1418)に記載されている。誘導体はまた修飾部分１つ以上を（例えば特定のヌ
クレオシド位置において、および／または、特定のヌクレオシド間架橋、オリゴ
ヌクレオチド類縁体（例えばポリアミド−核酸（ＰＮＡ）、ホスホン酸モノエス
テル核酸（ＰＨＯＮＡ＝ＰＭＥＮＡ）、オリゴヌクレオチドキメラ（例えばＤＮ
Ａ−およびＰＮＡ−部よりなるもの、またはＤＮＡ−およびＰＨＯＮＡ−部より
なるもの）において）有する修飾オリゴヌクレオチドに関する。

【００１５】 本発明の好ましい主題は配列番号１〜配列番号６の配列の１つまたはその部分
（配列番号７〜配列番号１２の配列の１つまたはその部分と等価な配列）、好ま
しくは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号
２９、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３
７、配列番号３８、配列番号５２、配列番号５５および配列番号５６および配列
番号７３〜配列番号８８の配列の１つを有し、ある程度修飾されているオリゴヌ
クレオチドに関する。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドはその特性を改良す
るため、例えば、ヌクレアーゼに対するその耐性を増大させるため、または、ヌ
クレアーゼに対して耐性とするため、相補的ＶＥＧＦコード核酸例えばｍＲＮＡ
に対するその結合親和性を改良するため、または、細胞取り込みを促進するため
に、修飾される。

【００１６】 従って、本発明は好ましくは上記した特定の配列を有し、更に、ホスホジエス
テルヌクレオシド間架橋を介して連結した「天然の」ヌクレオシドデオキシアデ
ノシン（アデニン＋β−Ｄ−２′−デオキシリボース）、デオキシグアノシン（
グアニン＋β−Ｄ−２′−デオキシリボース）、デオキシシチジン（シトシン＋
β−Ｄ−２′−デオキシリボース）およびチミジン（チミン＋β−Ｄ−２′−デ
オキシリボース）よりなる「天然の」ＤＮＡと比較した場合に化学修飾１つ以上
を受けているオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは同じ種類の修
飾および／または異なる種類の修飾１つ以上を有することができ、修飾の各々の
種類はオリゴヌクレオチドを修飾するために使用されることがわかっている修飾
の種類から独立して選択することができる。

【００１７】 化学修飾の例は当業者の知る通りであり、例えば、E. Uhlmann and A. Peyman
, Chemical Reviews 90 (1990) 543 and“Protocols for Oligonucleotides and
Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques
, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993 and S.T. Crooke, F. Ben
net, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129；J. Hunziker and C.
Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417に記載されている。

【００１８】 例えば、天然のＤＮＡと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間架橋、β
−Ｄ−２′−デオキシリボース単位および／または天然のヌクレオシド塩基（ア
デニン、グアニン、シトシン、チミン）を各々修飾ないしは置き換えることがで
きる。本発明のオリゴヌクレオチドは修飾１つ以上を有し、ここで各修飾は、天
然のＤＮＡよりなる同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジ
エステルヌクレオシド間架橋に、および／または、特定のβ−Ｄ−２′−デオキ
シリボース単位に、および／または特定の天然のヌクレオシド塩基位置に存在す
る。

【００１９】 例えば、本発明は、修飾１つ以上を有するオリゴヌクレオチドに関し、そして
ここで各修飾は独立して、下記： ａ） 修飾されたヌクレオシド間架橋によるヌクレオシドの３′および／また
は５′末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置き換え、 ｂ） デホスホ架橋によるヌクレオシドの３′および／または５′末端に位置
するホスホジエステル架橋の置き換え、 ｃ） 別の単位による糖リン酸エステル骨格由来の糖リン酸エステル単位の置
き換え、 ｄ） 修飾糖単位によるβ−Ｄ−２′−デオキシリボース単位の置き換え、 ｅ） 修飾ヌクレオシド塩基による天然のヌクレオシド塩基の置き換え、 ｆ） オリゴヌクレオチドの性質に影響する分子へのコンジュゲート形成、 ｇ） 場合により適切なリンカーを介した２′５′−連結オリゴアデニレート
またはその誘導体へのコンジュゲート形成、および、 ｈ） オリゴヌクレオチドの３′および／または５′末端における３′−３′
および／または５′−５′逆位の導入 より選択される。

【００２０】 オリゴヌクレオチドの化学修飾のより詳細な例は、 ａ） 修飾されたヌクレオシド間架橋によるヌクレオシドの３′および／また
は５′末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置き換え、ただし
修飾されたヌクレオシド間架橋は例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエ
ート、ＮＲ¹Ｒ¹′−ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ホスフェート−
（Ｃ₁−Ｃ₂₁）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリー
ル−（（Ｃ₁−Ｃ₂₁）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキルホス
ホネート、および／または、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）−アリールホスホネート架橋、（Ｃ₇ −Ｃ₁₂）−α−ヒドロキシメチルアリール（例えばＷＯ ９５／０１３６３に開
示）から選択され、ここで（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₂₀）アリールおよ
び（Ｃ₆−Ｃ₁₄）アリールは場合によりハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニト
ロ、シアノで置換されており、そしてここでＲ¹およびＲ¹′は相互に独立して水
素、（Ｃ₁−Ｃ₁₈）−アルキル、（Ｃ₆−Ｃ₂₀）−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）−ア
リール−（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキル、好ましくは水素、（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキル、
好ましくは（Ｃ₁−Ｃ₄）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであるか、 または、 Ｒ¹およびＲ¹′はそれらを担持している窒素原子と一緒になってＯ、Ｓおよび
Ｎから選択される別のヘテロ原子を更に含むことのできる５−６員の複素環を形
成するもの；

【００２１】 ｂ） デホスホ架橋によるヌクレオシドの３′および／または５′末端に位置
するホスホジエステル架橋の置き換え（デホスホ架橋は例えばUhlmann, E. and
Peyman, A. in “Methods in Molecular Biology”, Vol. 20, “Protocols for
Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 19
93, Chapter 16, 355ffに記載されている）、ただし、デホスホ架橋は例えばデ
ホスホ架橋のホルムアセタール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキ
シルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび
／またはシリル基から選択されるもの；

【００２２】 ｃ） 別の単位による糖リン酸エステル骨格（糖リン酸エステル骨格は糖リン
酸エステル単位よりなる）由来の糖リン酸エステル単位（β−Ｄ−２′−デオキ
シリボースおよびホスホジエステルヌクレオシド間架橋は一緒になって糖リン酸
エステル単位を形成する）の置き換え、ただし、別の単位は例えば下記： − 「モルホリノ誘導体」オリゴマー（例えばE.P. Stirchak et al., Nuclei
c Acids Res. 17（1989）6129に記載）、即ち、例えばモルホリノ誘導体単位に
よる置き換え； − ポリアミド核酸（“ＰＮＡ”）（例えばP.E. Nielsen et al., Bioconj.
Chem. 5 (1994) 3およびＥＰ０６７２６７７ Ａ２に記載）、即ち例えばＰＮＡ
骨格単位、例えば２−アミノエチルグリシンによる置き換え； − ホスホン酸モノエステル核酸（“ＰＨＯＮＡ”）（例えばPeyman et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638およびＥＰ０７３９８９８
Ａ２に記載）、即ち、例えばＰＨＯＮＡ骨格単位による置き換え； のものを構築するのに適するもの；

【００２３】 ｄ） 修飾糖単位によるβ−Ｄ−２′−デオキシリボースの置き換え、ただし
、修飾糖単位は例えばβ−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２′−デオキシリボース、Ｌ
−２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′−Ｏ−（
Ｃ₁−Ｃ₆）−アルキル−リボース、好ましくは２′−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）−アルキ
ルリボースは２′−Ｏ−メチルリボース、２′−Ｏ−（Ｃ₂−Ｃ₆）−アルケニル
−リボース、２′−［Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル］
−リボース、２′−ＮＨ₂−２′−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノ
ース、α−アラビノフラノース、２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキ
ソ−ピラノース、炭素環類縁体（例えばFroehler, J. Am. Chem. Soc. 114（199
2）8320に記載）および／または開環糖類縁体（例えばVandendriessche et al.,
Tetrahedron 49 (1993) 7223）および／または２環糖類縁体（例えばM. Tarkov
et al., Helv. Chim. Acta 76（1993）481）から選択されるもの；

【００２４】 ｅ） 修飾ヌクレオシド塩基による天然のヌクレオシド塩基の置き換え、ただ
し、修飾ヌクレオシド塩基は例えばウラシル、ヒポキサンチン、５−（ヒドロキ
シメチル）ウラシル、Ｎ²−ジメチルグアノシン、シュードウラシル、５−（ヒ
ドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、ジヒドロウラシル、５−フル
オロウラシル、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシ
ン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、２,４−ジアミノプリン、８−
アザプリン、置換７−デアザプリン、好ましくは７−デアザ−７−置換および／
または７−デアザ−８−置換プリンまたは天然のヌクレオシド塩基の他の修飾物
（修飾ヌクレオシド塩基は例えばＥＰ ０ ７１０ ６６７ Ａ２およびＥＰ ０ ６
８０ ９６９ Ａ２に記載のもの）；

【００２５】 ｆ） オリゴヌクレオチドの性質に影響する分子へのコンジュゲート形成、こ
こでオリゴヌクレオチドの性質に対して（好都合な）影響（例えばオリゴヌクレ
オチドが細胞膜を貫通したり、細胞内に侵入できる能力、ヌクレアーゼに対する
耐性、ＶＥＧＦコード標的配列に対する親和性、オリゴヌクレオチドの薬物動態
、アンチセンスオリゴヌクレオチド／リボザイムまたはオリゴヌクレオチドにコ
ンジュゲートする分子がＶＥＧＦコード標的配列を攻撃する能力、例えば、ＶＥ
ＧＦコード標的配列とオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする際に結合および
／または交差結合する能力）を与える分子１つ以上のオリゴヌクレオチドのコン
ジュゲート形成であり、ここでオリゴヌクレオチドにコンジュゲートできる分子
の例はポリリジン、挿入介在剤、例えばピレン、アクリジン、フェナジンまたは
フェナントリジン、蛍光剤、例えばフルオレセイン、交差結合剤、例えばソラレ
ンまたはアジドプロフラビン、親油性分子、例えば（Ｃ₁₂−Ｃ₂₀）−アルキル、
脂質、例えば１,２−ジヘキサデシル−rac−グリセロール、ステロイド、例えば
コレステロールまたはテストステロン、ビタミン、例えばビタミンＥ、ポリ−ま
たはオリゴエチレングリコール、好ましくはホスフェート基を介してオリゴヌク
レオチドに連結したもの（例えばトリエチレングリコールホスフェート、ヘキサ
エチレングリコールホスフェート）、（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキルホスフェートジ
エステルおよび／またはＯ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキ
ルであり、これらの分子は５′末端および／または３′末端において、および／
または、配列内部において、例えばヌクレオシド塩基にコンジュゲートすること
により、オリゴヌクレオチドコンジュゲートを発生させ；オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲートを製造するための方法は当業者の知る通りであり、例えばUhlmann,
E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan in “Antisense
Research and Applications", Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Rat
on, 1993, Chapter 17, p. 303ff and EP-A- 0 552 766に記載されている；

【００２６】 ｇ） 好ましくは適切なリンカー分子を介した２′５′−連結オリゴアデニレ
ートへのコンジュゲート形成、ただし２′５′−連結オリゴアデニレートは例え
ば２′５′−連結トリアデニレート、２′５′−連結テトラアデニレート、２′
５′−連結ペンタアデニレート、２′５′−連結ヘキサアデニレートまたは２′
５′−連結ヘプタアデニレート分子およびその誘導体から選択され、ここで２′
５′−連結オリゴアデニレート誘導体は例えばコルディセピン（Cordycepin)(２
′５′−連結３′−デオキシアデニレート）であり、適切なリンカーの例はトリ
エチレングリコールであり、そして、２′５′−連結オリゴアデニレートの５′
−末端は酸素原子一個以上が例えばイオウ原子で置き換えられていることのでき
るホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート残基を有さなければな
らず、そして、ホスフェートまたはチオホスフェート残基による置換が好ましい
もの；および、

【００２７】 ｈ） オリゴヌクレオチドの３′および／または５′末端における３′−３′
および／または５′−５′逆位の導入、ただしこの種の化学修飾は当業者の知る
ものであり、例えばM. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757, EP 0 464
638およびEP 0 593 901に記載されている。

【００２８】 例えばＰＮＡ骨格単位またはＰＨＯＮＡ骨格単位である別の単位による糖リン
酸エステル骨格由来の糖リン酸エステル単位の置き換えは、好ましくは、例えば
、天然のヌクレオシド塩基および／または修飾ヌクレオシド塩基、例えばウラシ
ル、ヒポキサンチン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、Ｎ²−ジメチルグア
ノシン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、シュードウ
ラシル、ジヒドロウラシル、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５
−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシト
シン、２,４−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、好ま
しくは７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリンまたは
天然のヌクレオシド塩基の他の修飾物（修飾ヌクレオシド塩基は例えばＥＰ ０
７１０ ６６７ Ａ２およびＥＰ ０ ６８０ ９６９ Ａ２に記載されている）から
選択される修飾ヌクレオシド塩基の１つを既に有するＰＮＡ単位またはＰＨＯＮ
Ａ単位によるヌクレオチドの置き換えである。

【００２９】 ＥＰ ０ ７１０ ６６７ Ａ２、ＥＰ ０ ６８０ ９６９ Ａ２、ＥＰ ０ ４６４
６３８、ＥＰ ０ ５９３ ９０１、ＷＯ ９５／０１３６３、ＥＰ ０ ６７２ ６
７７ Ａ２、ＥＰ ０ ７３９ ８９８ Ａ２およびＥＰ ０ ５５２ ７６６に記載さ
れているオリゴヌクレオチド修飾は参考のため本明細書に組み込まれる。

【００３０】 本発明の特定の実施態様においては、オリゴヌクレオチド配列内のホスホジエ
ステルヌクレオシド間架橋の１つ以上が修飾されており、好ましくは、ホスホジ
エステルヌクレオシド間架橋の１つ以上がホスホロチオエートヌクレオシド間架
橋および／または（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリールホスホネートヌクレオシド間架橋によ
り、好ましくはベンジル基が好ましくは例えばニトロ、メチル、ハロゲンにより
置換されているα−ヒドロキシベンジルホスホネート架橋により置き換えられて
いる。全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおいて、全ホスホジエステル
ヌクレオシド間架橋はホスホロチオエートにより修飾される。好ましくは、本発
明は、ホスホジエステルヌクレオシド間架橋の必ずしも全てがホスホロチオエー
トにより均一に修飾されている（ホスホロチオエートヌクレオシド間架橋）わけ
ではないオリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、少なくとも１つのヌクレオ
シド間架橋が異なる種類の修飾を有するか、または、修飾されていない。特に本
発明は別の種類の修飾少なくとも１つを更に有するオリゴヌクレオチドに関する
。

【００３１】 本発明の別の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチド配列内のヌクレオ
シド（β−Ｄ−２′−デオキシリボースおよび／またはヌクレオシド塩基）の１
つ以上は修飾されており、好ましくは、β−Ｄ−２′−デオキシリボースは２′
−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルリボースにより、好ましくは、２′−Ｏ−メチルリ
ボースにより置換されているか、そして／または、ヌクレオシド塩基は８−アザ
プリン、７−デアザ−７−置換プリンおよび／または７−デアザ−８−置換プリ
ン（プリン：オデニン、グアニン）により置換されている。好ましくは、本発明
は全ヌクレオシドが均一に修飾されているわけではないオリゴヌクレオチドに関
する。好ましくは、本発明は別の種類の修飾少なくとも１つを更に有するオリゴ
ヌクレオチドに関する。

【００３２】 本発明の別の特定の実施態様において、糖リン酸エステル骨格由来の糖リン酸
エステル単位の１つ以上はＰＮＡ骨格単位により、好ましくは２−アミノエチル
グリシン単位により置き換えられている。好ましくは、置き換えられている糖リ
ン酸エステル単位は少なくともある程度は相互に連結されている。好ましくは、
本発明は糖リン酸エステル単位の全てが均一に置き換えられているわけではない
オリゴヌクレオチドに関する。特に本発明は例えばＰＮＡ部分１つ以上およびＤ
ＮＡ部分１つ以上を有するキメラオリゴヌクレオチドに関する。このようなキメ
ラオリゴヌクレオチドについては、例えば以下に示す非限定的な修飾パターンの
例、即ち、ＤＮＡ−ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡ−ＤＮＡ、ＰＮＡ
−ＤＮＡ−ＰＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡ
−ＤＮＡが可能である。ＤＮＡ部分およびＰＨＯＮＡ部分を有するキメラ分子に
ついても匹敵するパターンが可能であり、例えば、ＤＮＡ−ＰＨＯＮＡ、ＰＨＯ
ＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＰＨＯＮＡ−ＤＮＡ、ＰＨＯＮＡ−ＤＮＡ−ＰＨＯＮＡ
、ＤＮＡ−ＰＨＯＮＡ−ＤＮＡ−ＰＨＯＮＡ、ＰＨＯＮＡ−ＤＮＡ−ＰＨＯＮＡ
−ＤＮＡが挙げられる。当然ながら、ＤＮＡ部分、ＰＨＯＮＡ部分およびＰＮＡ
部分のように３種の部分を有するキメラ分子も可能である。好ましくは、本発明
は別の種類の修飾少なくとも１つを更に有するオリゴヌクレオチドに関する。

【００３３】 本発明の別の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドはその３′末端お
よび／またはその５′末端において、（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキル残基、好ましくは
Ｃ₁₆アルキル残基、トリエチレングリコール残基またはヘキサエチレングリコー
ル残基に連結しており、これらの残基は好ましくはホスフェート基を介してオリ
ゴヌクレオチドに連結している。好ましくは、本発明は両末端（３′および５′
末端）ともが（均一に）修飾されているわけではないオリゴヌクレオチドに関す
る。好ましくは本発明は別の種類の修飾少なくとも１つを更に有するオリゴヌク
レオチドに関する。

【００３４】 本発明の好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチド配列内の特定の位置
のみが修飾されている（例えば部分修飾オリゴヌクレオチド）。部分修飾オリゴ
ヌクレオチドはまた一部の報告では最小修飾オリゴヌクレオチドと称される。配
列内で修飾は特定の位置（特定のヌクレオチド、特定のヌクレオシド、特定のヌ
クレオシド塩基、特定のヌクレオシド間架橋）に存在することができる。 本発明の特定の実施態様において、部分修飾オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレ
オシド間架橋、例えばホスホロチオエート架橋および／またはα−ヒドロキシベ
ンジルホスホネート架橋で一部のホスホジエステル架橋を置き換えることのみに
よって製造される。特に本発明は特定の範囲までのみ修飾されたオリゴヌクレオ
チドを包含する。

【００３５】 特に本発明は、オリゴヌクレオチドの５′未満および／または３′未満におけ
る末端１〜５ヌクレオチド単位が相当するヌクレオシドの５′および／または３
′末端に位置するヌクレオシド間架橋を修飾することにより、好ましくは、ホス
ホロチオエート架橋および／またはα−ヒドロキシベンジルホスホネート架橋に
よるホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置き換えにより保護されるオリゴヌ
クレオチドに関する。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの３′末端における
末端１〜５ヌクレオチドが、相当するヌクレオシドの５′および／または３′末
端に位置するヌクレオシド間架橋を修飾することにより保護される。場合により
、オリゴヌクレオチドの５′末端の末端１〜５ヌクレオチドは更に、相当するヌ
クレオシドの５′および／または３′末端に位置するヌクレオシド間架橋を修飾
することにより保護される。場合により、オリゴヌクレオチドは別の位置に別の
修飾を有していてもよい。

【００３６】 更にまた、本発明は内部ピリミジンヌクレオシドおよび／またはこのピリミジ
ンヌクレオシド（シトシン、ウラシル、チミンのようにピリミジン塩基を有する
ヌクレオシド）の５′末端および／または３′末端に位置するヌクレオシド間架
橋の少なくとも１つが、好ましくはホスホロチオエート架橋および／またはα−
ヒドロキシベンジルホスホネート架橋によるホスホジエステルヌクレオシド間架
橋の置き換えにより修飾されるオリゴヌクレオチドに関する。

【００３７】 本発明の好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドの５′末端および
／または３′末端の末端１〜５ヌクレオチドは、相当するヌクレオシドの５′お
よび／または３′末端に位置し、更に、内部ピリミジンヌクレオシドおよび／ま
たはこのピリミジンヌクレオシドの５′末端に位置する、および／またはこのピ
リミジンヌクレオシドの３′末端に位置するヌクレオシド間架橋の少なくとも１
つが修飾されているヌクレオシド間架橋を修飾することにより保護される。

【００３８】 部分修飾オリゴヌクレオチドの原理はA. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. H
oppe-Seyler, 377 (1996) 67-70およびＥＰ ０ ６５３ ４３９に記載されている
。これらの文献は参考のために本明細書に組み込まれる。この場合、５′末端お
よび／または３′末端の１〜５の末端ヌクレオチド単位が保護され、例えば、相
当するヌクレオシドの３′および／または５′末端に位置するホスホジエステル
ヌクレオシド間架橋が例えばホスホロチオエートヌクレオシド間架橋により置き
換えられる。更に、好ましくは少なくとも１つの内部ピリミジンヌクレオシド（
またはヌクレオチド）位置が修飾され；好ましくは、ピリミジンヌクレオシドの
３′および／または５′ヌクレオシド間架橋が例えばホスホロチオエートヌクレ
オシド間架橋により修飾され、そして／または置き換えられている。部分修飾オ
リゴヌクレオチドは特に好都合な性質を示し；例えば、これらは最小限の修飾で
特に高度なヌクレアーゼ安定性を示す。これらはまた、全ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチド使用に伴うことの多いノンアンチセンス作用の傾向をかなり低
減している（Stein and Krieg (1994), Antisense Res. Dev. 4, 67）。部分修
飾オリゴヌクレオチドもまた全ホスホロチオエートより高い結合親和性を示す。

【００３９】 本発明は特に部分的／最小限に修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。配列
番号１４、配列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番
号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号
３８、配列番号５２、配列番号５５および配列番号５６の配列の１つを有し、特
定のヌクレオシド間架橋が修飾されている上記オリゴヌクレオチドの例は、以下
に示すＯＮ１、ＯＮ４、ＯＮ１５、ＯＮ１６、ＯＮ１７、ＯＮ２１、ＯＮ２２、
ＯＮ２３、ＯＮ２４、ＯＮ２５、ＯＮ２６、ＯＮ２２、ＯＮ３９、ＯＮ４０、Ｏ
Ｎ５８およびＯＮ１００〜ＯＮ１１３： ON 2 3′-C^*C^*AGC^*C^*C^*GGAG^*G-5′ （配列番号14の例） ON 4 3′-C^*G^*GAGGC^*T^*T^*TG^*G-5′ （配列番号16の例） ON 15 3′-G^*A^*TGGAGG^*T^*GG^*T-5′ （配列番号27の例） ON 16 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例） ON100 3′-G^*G^*AGG^*T^*GG^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例） ON101 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TA^*C^*G-5′ （配列番号28の例） ON102 3′-G^*G^*AGG^*T^*GG^*TA^*C^*G-5′ （配列番号28の例） ON103 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*T^*AC^*G-5′ （配列番号28の例） ON 17 3′-G^*G^*T^*GGT^*AC^*GGT^*T-5′ （配列番号29の例） ON 21 3′-C^*A^*C^*CAGGGT^*C^*C^*G-5′ （配列番号33の例） ON 22 3′-C^*C^*AGGGT^*C^*CGA^*C-5′ （配列番号34の例） ON 23 3′-A^*G^*GGT^*C^*CGAC^*G^*T-5′ （配列番号35の例） ON 24 3′-G^*GG^*T^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ （配列番号36の例） ON104 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ （配列番号36の例） ON105 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*G^*T^*G-5′ （配列番号36の例） ON106 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*G^*TG-5′ （配列番号36の例） ON107 3′-G^*GG^*T^*C^*CGAC^*G^*T^*G-5′ （配列番号36の例） ON108 3′-G^*G^*G^*T^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ （配列番号36の例） ON109 3′-G^*G^*G^*T^*C^*CGAC^*G^*T^*G-5′（配列番号36の例） ON110 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*G^*T^*G-5′ （配列番号36の例） ON111 3′-G^*G^*GT^*C^*C^*GAC^*GT^*G-5′ （配列番号36の例） ON112 3′-G^*G^*G^*T^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ （配列番号36の例） ON113 3′-G^*G^*G^*T^*C^*CGAC^*G^*T^*G-5′（配列番号36の例） ON 25 3′-G^*G^*TC^*C^*GAC^*GT^*GG-5′ （配列番号37の例） ON 26 3′-C^*C^*GA^*CG^*TGGG^*T^*A-5′ （配列番号38の例） ON 58 3′-G^*T^*AGAAG^*TT^*C^*G^*G-5′ （配列番号52の例） ON 39 3′-A^*C^*GC^*C^*CC^*CGAC^*G-5′ （配列番号55の例）、および ON 40 3′-C^*C^*C^*CC^*GA^*CGAC^*G-5′ （配列番号56の例） ［式中“^*”はヌクレオシド間架橋修飾の局在化を示し；好ましくは“^*”はホス
ホロチオエートヌクレオシド間架橋である］の配列である。

【００４０】 本発明の特定の実施態様の別の例はヌクレオシドの修飾、例えばヌクレオシド
塩基の修飾および／またはβ−Ｄ−２′−デオキシリボース単位の修飾を有する
部分修飾オリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、β−Ｄ−２′−デオキシリ
ボースは２′−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルリボースにより置き換えられ、最も好
ましくは、２′−Ｏ−メチルリボースによる置き換え（２′−Ｏ−メチルリボヌ
クレオシドによるβ−Ｄ−２′−デオキシリボヌクレオシドの置き換え）である
。例えば配列番号１４、配列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号
２９、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３
７、配列番号３８、配列番号５２、配列番号５５および配列番号５６の配列の１
つを有する上記オリゴヌクレオチドの例は、オリゴヌクレオチドＯＮ１１４〜Ｏ
Ｎ１３８において示されるヌクレオシド修飾の後述するパターンを示す（“Ｎ”
修飾のみであり“^*”のヌクレオシド間修飾ではない）。 本発明によれば、オリゴヌクレオチドは１種の修飾のほかに、他の種の修飾も
有することができる。

【００４１】 従って、本発明の別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは特定の位置に
おける修飾ヌクレオシド間架橋および更に特定の位置における好ましくはβ−Ｄ
−２′−デオキシリボースの置き換えによるヌクレオシドの修飾を有する。本発
明の好ましい実施態様において、ヌクレオシド間修飾はホスホロチオエート架橋
によるホスホジエステル架橋の置き換えであり、β−Ｄ−２′−デオキシリボー
スの修飾は２′−Ｏ−メチルリボースによる置き換えであり；この場合、オリゴ
ヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドであり、これは修飾された、および、
未修飾のＤＮＡおよびＲＮＡ部分を有し、これは２′−Ｏ−メチルリボヌクレオ
シドおよびβ−Ｄ−２′−デオキシリボヌクレオシドおよびホスホロジエステル
およびホスホロチオエートヌクレオシド間架橋を有する。

【００４２】 配列番号１４、配列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配
列番号３８、配列番号５２、配列番号５５および配列番号５６の配列および特定
のヌクレオシド間架橋における、そして更に特定のヌクレオシド位置における修
飾を有する上記オリゴヌクレオチドの例は、以下に示すＯＮ１１４〜ＯＮ１３８
（修飾パターンの例）： ON114 3′-C ^* C ^* AGC ^* C ^* C ^*GGAG^*G-5′（配列番号14の例） ON115 3′-C ^* G ^* GAGGC ^*T^*T^*TG^*G-5′（配列番号16の例） ON116 3′-G ^* A ^* TGGAGG^*T^*GG^*T-5′ （配列番号27の例） ON117 3′-G ^* G ^* AGG ^* TGG^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例） ON118 3′-G ^* G ^* T ^* GGT ^* AC^*GGT^*T-5′（配列番号29の例） ON119 3′-C ^* A ^* C ^* CAGGGT^*C^*C^*G-5′（配列番号33の例） ON120 3′-C ^* C ^* AGGGT ^*C^*CGA^*C-5′ （配列番号34の例） ON121 3′-A ^* G ^* GGT ^* C ^* CGAC^*G^*T-5′（配列番号35の例） ON122 3′-G ^* GG ^* T ^* C ^* CGAC^*GT^*G-5′（配列番号36の例） 0N123 3′-G ^* G ^* TC ^* C ^* GAC^*GT^*GG-5′（配列番号37の例） ON124 3′-C ^* C ^* GA ^* CG ^* TGGG^*T^*A-5′（配列番号38の例） ON125 3′-C ^* C ^* C ^* CC ^* GA ^*CGAC^*G-5′（配列番号56の例） ON126 3′-G ^* G ^* GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′（配列番号36の例） ON127 3′-G ^* G ^* GT^*C^*CGAC^* GT ^* G-5′（配列番号36の例） 0N128 3′-G ^* G ^* GT ^*C^*CGAC^*GT ^* G-5′（配列番号36の例） ON130 3′-G ^* G ^*GT^*C^*CGAC^*GT ^* G-5′（配列番号36の例） 0N131 3′-G ^* G ^* GT ^*C^*CGAC ^* GT ^* G-5′（配列番号36の例） ON132 3′-G ^* G ^*AGG^*TGG^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例） ON133 3′-G ^* G ^* AGG ^*TGG^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例） ON134 3′-G ^* G ^*AGG^*TGG^*TAC ^* G-5′ （配列番号28の例） ON135 3′-G ^* G ^* AGG^*TGG^*TAC ^* G-5′ （配列番号28の例） ON136 3′-G ^* G ^* AGG^*TGG^*TAC ^* G-5′ （配列番号28の例） ON137 3′-G^*G^*AGG ^* TGG ^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例）、および ON138 3′-G ^* G ^* AGG ^*TGG^*TAC ^* G-5′ （配列番号28の例） ［式中“^*”はヌクレオシド間架橋修飾の位置を示し、下線“Ｎ”は修飾ヌクレ
オシド（例えばヌクレオシド塩基の修飾および／またはβ−Ｄ−２′−デオキシ
リボースの修飾を示す］である。好ましくは“^*”はホスホロチオエート架橋で
あり、“Ｎ”は２′−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルリボヌクレオシド、好ましくは
２′−Ｏ−メチルリボヌクレオシドの位置を示す。

【００４３】 別の例は各ヌクレオシドが２′−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドにより置き換
えられているオリゴヌクレオチド（２′−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドより全
体が構成される；２′−Ｏ−アルキルＲＮＡ）である。このようなオリゴヌクレ
オチドはホスホロチオエート架橋によるホスホジエステルヌクレオシド間架橋の
部分的置き換え： ON139 3′-C ^* C ^* AGC ^* C ^* C ^* GGAG ^* G-5′（配列番号14の例） ON140 3′-C ^* G ^* GAGGC ^* T ^* T ^* TG ^* G-5′（配列番号16の例） ON141 3′-G ^* A ^* TGGAGG ^* T ^* GG ^* T-5′（配列番号27の例） ON142 3′-G ^* G ^* AGG ^* TGG ^* TAC ^* G-5′（配列番号28の例） ON143 3′-G ^* G ^* T ^* GGT ^* AC ^* GGT ^* T-5′（配列番号29の例） ON144 3′-C ^* A ^* C ^* CAGGGT ^* C ^* C ^* G-5′（配列番号33の例） ON145 3′-C ^* C ^* AGGGT ^* C ^* CGA ^* C-5′（配列番号34の例） ON146 3′-A ^* G ^* GGT ^* C ^* CGAC ^* G ^* T-5′（配列番号35の例） ON147 3′-G ^* GG ^* T ^* C ^* CGAC ^* GT ^* G-5′（配列番号36の例） ON148 3′-G ^* G ^* TC ^* C ^* GAC ^* GT ^* GG-5′（配列番号37の例） ON149 3′-C ^* C ^* GA ^* CG ^* TGGG ^* T ^* A-5′（配列番号38の例） ON150 3′-A ^* C ^* GC ^* C ^* CC ^* CGAC ^* G-5′（配列番号55の例） ON151 3′-C ^* C ^* C ^* CC ^* GA ^* CGAC ^* G-5′（配列番号56の例）、および ON152 3′-G ^* T ^* AGAAG ^* TT ^* C ^* G ^* G-5′（配列番号52の例） ［式中“^*”はヌクレオシド間架橋修飾の位置を示し、そして下線“Ｎ”は修飾
ヌクレオシド（例えばヌクレオシド塩基の修飾および／またはβ−Ｄ−２′−デ
オキシリボースの修飾）を示す］によりヌクレアーゼに対して更に安定化される
。好ましくは“^*”はホスホロチオエート架橋であり“Ｎ”は２′−Ｏ−アルキ
ルリボヌクレオシド、好ましくは２′−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（この場合
“Ｔ”は２′−Ｏ−メチルウリジンである）の位置を示す。

【００４４】 本発明の更に好ましい実施態様はその３′および／または５′末端に１つ以上
の（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキル残基、好ましくはＣ₁₆−アルキル残基を有するオリ
ゴヌクレオチドを提供する。（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキル残基は例えばＥＰ ０ ５
５２ ７６６ Ａ２（ＥＰ ０ ５５２ ７６６ Ａ２は参考のために本明細書に組み
込まれる）に記載の通りホスホジエステルとして、またはＯ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ
)−Ｏ−（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキルの３′−ホスホジエステルとして結合するこ
とができる。好ましいものはその３′および／または５′末端に結合しているＣ ₁₆ −アルキル残基を有するオリゴヌクレオチドである。

【００４５】 このようなオリゴヌクレオチドの例はＯＮ１５３〜ＯＮ１６４（配列番号１４
、配列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配
列番号５２、配列番号５５および配列番号５６の配列の１つ、および例えばＯＮ
１、ＯＮ４、ＯＮ１５、ＯＮ１６、ＯＮ１７、ＯＮ２１、ＯＮ２２、ＯＮ２３、
ＯＮ２４、ＯＮ２５、ＯＮ２６、ＯＮ２２、ＯＮ３９、ＯＮ４０およびＯＮ５８
におけるもののような特定のヌクレオシド間架橋の修飾、および更に、その５′
末端またはその３′末端の何れかに連結したＣ₁₆−アルキル残基を有する)(この
ようなオリゴヌクレオチドは何れかの別の配列および修飾パターンを有する場合
がある）： ON153 3′-C^*C^*AGC^*C^*C^*GGAG^*G-C16-5′ ON154 3′-C^*G^*GAGGC^*T^*T^*TG^*G-C16-5′ ON155 3′-G^*A^*TGGAGG^*T^*GG^*T-C16-5′ ON156 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TAC^*G-C16-5′ ON157 3′-G^*G^*T^*GGT^*AC^*GGT^*T-C16-5′ ON158 3′-C^*A^*C^*CAGGGT^*C^*C^*G-C16-5′ ON159 3′-C^*C^*AGGGT^*C^*CGA^*C-C16-5′ ON160 3′-A^*G^*GGT^*C^*CGAC^*G^*T-C16-5′ ON161 3′-G^*GG^*T^*C^*CGAC^*GT^*G-C16-5′ ON162 3′-G^*G^*TC^*C^*GAC^*GT^*GG-C16-5′ ON163 3′-C^*C^*GA^*CG^*TGGG^*T^*A-C16-5′、および ON164 3′-C^*C^*C^*CC^*GA^*CGAC^*G-C16-5′ ［式中“^*”はヌクレオシド間架橋修飾の位置、好ましくはホスホロチオエート
ヌクレオシド間架橋の位置を示し、“−Ｃ１６”とはヘキサデシルホスフェート
による５′末端における修飾の位置を示す］である。

【００４６】 本発明はまた３′および／または５′末端がオリゴエチレングリコール残基、
好ましくはトリエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールに、最も好
ましくはホスホジエステルを介して結合した（トリまたはヘキサエチレングリコ
ールホスフェートエステル）オリゴヌクレオチドに関する。当然ながら、このよ
うなオリゴヌクレオチドは別の修飾を有してよい。配列番号３６の配列を有する
上記オリゴヌクレオチドの非限定的な例はＯＮ１６５、ＯＮ１６６およびＯＮ１
６７： ON165 3′-teg-G ^* G ^* GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ ON166 3′-teg-G ^* G ^* GT ^* C ^* CGAC^*GT^*G-5′ ON167 3′-teg-G ^* G ^* GT^*C^*CGAC^* GT ^* G-5′ ［式中“teg”はオリゴヌクレオチドにホスフェートエステルを介して連結した
オリゴエチレングリコール残基であり、好ましくは、“teg”はトリエチレング
リコールまたはヘキサエチレングリコールホスフェートエステルであり、“^*”
はヌクレオシド間架橋修飾の位置を示し、下線“Ｎ”は修飾ヌクレオシド（例え
ばヌクレオシド塩基の修飾および／またはβ−Ｄ−２′−デオキシリボースの修
飾を示す］である。好ましくは“^*”はホスホロチオエート架橋であり、“Ｎ”
は２′−Ｏ−アルキルリボヌクレオシド、好ましくは２′−Ｏ−メチルリボヌク
レオシド（この場合“Ｔ”は２′−Ｏ−メチルウリジンである）の位置を示す。

【００４７】 本発明の別の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドはリンカーを介し
て２′５′−連結オリゴアデニレート−５′−（チオ）ホスフェートに結合して
いる。リンカーは例えばオリゴエチレングリコールホスフェート、好ましくはト
リエチレングリコールホスフェート、テトラエチレングリコールホスフェート、
または、ヘキサエチレングリコールホスフェート残基であることができる。２′
５′−連結オリゴアデニレートは好ましくはその５′−ヒドロキシ官能基がホス
フェートまたはチオホスフェート残基により置換されているテトラまたはペンタ
アデニレートとしてその２′末端を介して結合している。２′５′−オリゴアデ
ニレートはＲＮａｓｅ Ｌを誘導して標的ｍＲＮＡを切断することが知られてい
る（Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 1300）。２
′５′−オリゴアデニレートはリボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅ Ｌ）の活性化
に寄与し、次にこれがＶＥＧＦ ｍＲＮＡを分解する。２′５′−連結アデニレ
ートの代わりに、例えばヌクレオシド類縁体コルディセピン（cordycepin）から
誘導した２′５′−連結３′−デオキシアデニレートもまた導入できる。この場
合、標的核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオチド部は好ましくは２′−Ｏ
−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルリボヌクレオシド（好ましくは２′−Ｏ−メチルリボヌ
クレオシド）またはＰＮＡにより特定の位置で修飾される。配列番号３６の配列
を有するこのようなオリゴヌクレオチドの例は下記のＯＮ１６８（このようなオ
リゴヌクレオチドは本発明のオリゴヌクレオチドの何れかの他の配列を有する場
合もある）： ON168 5′-p^*-(2′5′-rA^*rA^*rA^*rA)^*(teg)G^*TG^*CAGC^*C^*T^*GG^*G-3′ ［式中“teg”はオリゴエチレングリコール残基、好ましくはトリエチレングリ
コール残基であり、 “Ｎ”は２′−Ｏ−アルキル残基、好ましくは２′−Ｏ−ＣＨ₃で置換された
β−Ｄ−２′−デオキシリボヌクレオシド（“Ｔ”は２′−Ｏ−メチルウリジン
）であり、 “ｒＡ”はリボ−Ａ；“Ｃｏ”＝３′−デオキシ−Ａ（コルディセピン）であ
り、 “ｐ^*”は５′−チオホスフェートであり、 “^*”は修飾ヌクレオシド間架橋、好ましくはホスホロチオエートヌクレオシ
ド間架橋を示す］である。

【００４８】 本発明の別の好ましい実施態様は、例えばＥＰ ０ １７１ ０６６およびＥＰ
０ ６８０ ９６９に記載のもののような、非天然の、または、修飾されたヌクレ
オシド塩基による、好ましくは８−アザプリンおよび／または７−デアザ−７−
置換プリンおよび／または７−デアザ−８−置換プリンによる天然のヌクレオシ
ド塩基１つ以上の修飾を含む。このようなオリゴヌクレオチドの例はＯＮ１６９
およびＯＮ１７０（共に配列番号３６の配列およびヌクレオシド塩基修飾に加え
て別の種の修飾を有する）である。

【化１】

【００４９】 本発明の別の好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは例えばＥＰ
０ ４６４ ６３８およびＥＰ ０ ５９３ ９０１に記載のような３′および／ま
たは５′末端において３′３′および／または５′５′逆位を示すことができる
。このようなオリゴヌクレオチドの例はＯＮ１７１： ON171 3′-G(3′3′)G^*GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ ［式中“（３′３′）”は３′３′ホスホジエステル結合であり、そして、 “^*”は修飾ヌクレオシド間架橋、好ましくはホスホロチオエートヌクレオシ
ド間架橋を示す］であり、これは配列番号３６の配列、および、３′における３
′３′逆位に加えて更に別の種類の修飾を有する。

【００５０】 本発明の更に好ましい実施態様はＷＯ ９５／０１３６３に記載のもののよう
なα−ヒドロキシベンジルホスホネート架橋によるホスホジエステル架橋１つ以
上の置き換えに関する。このようなオリゴヌクレオチドの例はＯＮ１７２： ON172 3′-G(hbp)G^*GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ ［式中“（hbp）”はα−ヒドロキシベンジルホスホネート架橋、好ましくはα
−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート架橋であり、そして“ ^* ”はホスホロチオエート架橋である］であり、これは配列番号３６の配列、お
よび、α−ヒドロキシベンジルホスホネートヌクレオシド間架橋によるホスホジ
エステル架橋の置き換えに加えてホスホロチオエートヌクレオシド間架橋による
ホスホジエステル架橋の置き換えを有する。

【００５１】 本発明の更に別の好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドは好まし
くはＰＮＡ単位による糖リン酸エステル骨格の修飾を有する。配列番号１４、配
列番号１６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、配列
番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番
号５２、配列番号５５および配列番号５６の配列の１つを有するこのようなＰＮ
Ａ−ＤＮＡキメラの例は、以下： ON173 (3′)-ccagcccGGAGG-5′（配列番号14の例） ON174 (3′)-cggaggcTTTGG-5′（配列番号16の例） ON175 (3′)-gatggaGGTGGT-5′（配列番号27の例） ON176 (3′)-ggaggtGGTACG-5′（配列番号28の例） ON177 (3′)-ggtggtaCGGTT-5′（配列番号29の例） ON178 (3′)-caccaggGTCCG-5′（配列番号33の例） ON179 (3′)-ccagggtCCGAC-5′（配列番号34の例） ON180 (3′)-agggtccGACGT-5′（配列番号35の例） ON181 (3′)-gggtccGACGTG-5′（配列番号36の例） ON182 (3′)-ggtccgaCGTGG-5′（配列番号37の例） ON183 (3′)-ccgacgtGGGTA-5′（配列番号38の例） ON184 (3′)-cccccgaCGACG-5′（配列番号56の例） ［式中小文字はＰＮＡ単位を示し、下線文字はヒドロキシエチルグリシン−ＰＮ
Ａ単位を示し、大文字はＤＮＡを示す］の修飾パターン（パターン：ＰＮＡ−Ｄ
ＮＡ）（ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成と性質に関してはＥＰ ０ ６７２ ６７７
参照）を有する。

【００５２】 更に別の修飾パターンは、例えばＤＮＡ−ＰＮＡ−ＤＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡが
可能である。これに匹敵する修飾パターンがＰＨＯＮＡ／ＤＮＡキメラについて
も可能である。このような修飾パターンは、他のどのような種類の修飾と組合せ
ることもでき、そして、当然ながら、同様のパターンの修飾もまた本発明の別の
オリゴヌクレオチドについて可能である。オリゴヌクレオチドＯＮ１７３〜ＯＮ
１８４から誘導されるがＰＮＡ骨格単位による糖リン酸エステル骨格の置き換え
に加えてオリゴヌクレオチドのＤＮＡ部分内の特定の位置におけるホスホジエス
テルヌクレオシド間修飾を有するオリゴヌクレオチドの例は下記： ON185 (3′)-ccagcccGG^*AG^*G-5′ （配列番号14の例） ON186 (3′)-cggaggcT^*T^*TG^*G-5′（配列番号16の例） ON187 (3′)-gatggaGG^*T^*GG^*T-5′（配列番号27の例） ON188 (3′)-ggaggtGG^*TAC^*G-5′ （配列番号28の例） ON189 (3′)-ggtggtaC^*GGT^*T-5′ （配列番号29の例） ON190 (3′)-caccaggGT^*C^*C^*G-5′（配列番号33の例） ON191 (3′)-ccagggtC^*C^*GA^*C-5′（配列番号34の例） ON192 (3′)-agggtccGAC^*G^*T-5′ （配列番号35の例） ON193 (3′)-gggtccGAC^*GT^*G-5′ （配列番号36の例） ON194 (3′)-ggtccgaC^*GT^*GG-5′ （配列番号37の例） ON195 (3′)-ccgacgtGGG^*T^*A-5′ （配列番号38の例） ON196 (3′)-cccccgaC^*GAC^*G-5′ （配列番号56の例） ［式中小文字はＰＮＡ単位を示し、下線文字はヒドロキシエチルグリシン−ＰＮ
Ａ単位を示し、大文字はＤＮＡを示し、“^*”は修飾ヌクレオシド間架橋、好ま
しくはホスホロチオエート架橋を示す］である。

【００５３】 上記した具体的なオリゴヌクレオチド、即ち特定の配列、特定の種類の修飾を
特定の位置に有する（特定の「修飾パターン」を有する）ものは、本発明の種々
の実施態様の例に過ぎない。本発明はこのような具体的なオリゴヌクレオチドに
限定されない。他の組合せの配列および修飾パターンも可能である。 本発明のオリゴヌクレオチドは各々標的蛋白質（これはＶＥＧＦである）また
は標的配列（ＶＥＧＦをコードする核酸、好ましくはＶＥＧＦ ｍＲＮＡ）の発
現を特異的に抑制することができる。好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドは
ＶＥＧＦの発現を特異的に抑制する。このことにより、未投与の発現と比較して
ＶＥＧＦ蛋白質の濃度が低下する。特異性は例えば、ｍＲＮＡおよび／または蛋
白質の濃度に対するＶＥＧＦ発現の際の本発明のオリゴヌクレオチドの作用をβ
アクチン発現の際の同じオリゴヌクレオチドの作用と比較して測定することによ
り明らかにすることができ；本発明のオリゴヌクレオチドの投与により、ＶＥＧ
Ｆ ｍＲＮＡおよび／またはＶＥＧＦ蛋白質の濃度のみが低下し、例えばβアク
チン（ハウスキーピング蛋白質）ｍＲＮＡおよび／またはβ−アクチン蛋白質の
濃度は未変化のままであった。特にオリゴヌクレオチドの作用はＶＥＧＦ ｍＲ
ＮＡおよび／またはＶＥＧＦ蛋白質の量を（例えばオリゴヌクレオチドを用いな
い平行実験との比較において）測定することにより明らかにすることができる。

【００５４】 例えば、オリゴヌクレオチドの抑制作用はオリゴヌクレオチドを培養細胞に投
与することによりin vitroで測定することができる。次に、例えばｍＲＮＡ濃度
を例えば実施例４に記載する通り、細胞融解物のプレパレーションにおいて測定
することができる。ＶＥＧＦ蛋白質濃度（例えばＶＥＧＦ蛋白質の絶対グラム数
または例えば未投与細胞と比較した％相対値）は上澄み（例えば培地）（分泌Ｖ
ＥＧＦ量）および／または膜プレパレーション（膜結合ＶＥＧＦ量）および／ま
たは細胞融解物から測定することができる。分泌ＶＥＧＦ蛋白質量は例えば実施
例３に記載の通りＥＬＩＳＡにより測定することができる。

【００５５】 本発明の特定の実施態様においては、オリゴヌクレオチドは、約１μＭ以下、
例えば５００nM、２００nM、１００nM以下のＩＣ₅₀値で、例えば培養細胞におい
てＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を抑制、および／またはＶＥＧＦ蛋白質濃度を低下
させることができる。

【００５６】 更にまた、特定の配列を有するオリゴヌクレオチドのみがＶＥＧＦ蛋白質およ
び／またはＶＥＧＦ ｍＲＮＡの濃度を低下させるため、抑制は本発明のオリゴ
ヌクレオチドに特異的である。この濃度はミスマッチまたはスクランブルドの配
列を有するオリゴヌクレオチドを使用した場合には有意に低下しない。このよう
なオリゴヌクレオチド、例えばＯＮ２００、ＯＮ２０１、ＯＮ２０３およびＯＮ
２０４のようなオリゴヌクレオチドは対照として使用される。ＯＮ２００および
ＯＮ２０１はそれぞれＯＮ１６の配列（配列番号２８）に対して２および４つの
ミスマッチを有するが、３種のオリゴヌクレオチドは全て同じパターンのホスホ
ロチオエート修飾を有する（位置は“^*”）。ＯＮ２０３およびＯＮ２０４はそ
れぞれＯＮ２４の配列（配列番号３６）に対して２および４つのミスマッチを有
するが、ここでも３種のオリゴヌクレオチド全てが同じパターンのホスホロチオ
エート修飾を有する（位置は“^*”）。これらの４種のオリゴヌクレオチドは例
えばそれぞれＯＮ１６およびＯＮ２４を用いた比較実験において使用される。対
照オリゴヌクレオチドは１μｍ以下の濃度では培養細胞においてＶＥＧＦ ｍＲ
ＮＡの発現を抑制しない（表３）。

【００５７】 ON 16 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TAC^*G-5′ アンチセンスオリゴヌクレオチド ON200 3′-G^*G^*AGT ^* GGG^*TAC^*G-5′ 2 ミスマッチ ON201 3′-G^*G^* CGT ^* GGG^*TAA ^*G-5′ 4 ミスマッチ ON 24 3′-G^*GG^*T^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ アンチセンスオリゴヌクレオチド ON203 3′-G^*GG^*T^*C^*CAGC^*GT^*G-5′ 2 ミスマッチ、および ON204 3′-G^*GG^* C ^*C^*CAGT ^*GT^*G-5′ 4 ミスマッチ ［式中、ＯＮ１６に対するＯＮ２００およびＯＮ２０１、そして、ＯＮ２４に対
するＯＮ２０３およびＯＮ２０４の「ミスマッチ」の位置は下線で示し、 ＯＮ２００は配列番号８９：3′-GGAGTGGGTACG-5′の配列を有し、 ＯＮ２０１は配列番号９０：3′-GGCGTGGGTAAG-5′の配列を有し、 ＯＮ２０３は配列番号９１：3′-GGGTCCAGCGTG-5′の配列を有し、 ＯＮ２０４は配列番号９２：3′-GGGCCCAGTGTG-5′の配列を有する。

【００５８】 本発明のオリゴヌクレオチドは、対照オリゴヌクレオチドと比較して培養細胞
においてＶＥＧＦ蛋白質の合成を効率的に抑制する。図２は５２種類の１２mer
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを各オリゴヌクレオチドにつき３μＭの濃度
で投与したＵ８７細胞によるＶＥＧＦ蛋白質分泌の抑制を示す。相当するアンチ
センスオリゴヌクレオチドの配列を一部のオリゴヌクレオチドのＩＣ₅₀値と共に
表２に示す。

【００５９】 本発明のオリゴヌクレオチドは対照細胞と比較して約５５％、好ましくは約６
５％以上、最も好ましくは約７５％以上、ＶＥＧＦ蛋白質の発現を抑制し、例え
ば、分泌されるＶＥＧＦの量は本発明のオリゴヌクレオチドを３μＭの濃度、好
ましくは１μＭ以下、好ましくは０.５μＭ以下のようなより低濃度で細胞に投
与した場合約５５％、６５％、７５％以上低減する（図２参照）。

【００６０】 好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドはヒト細胞においてＶＥＧＦ（イソフ
ォーム）の発現を効率的に抑制することができ、そして／または、脊椎動物にお
ける腫瘍の生育を抑制する能力を有する。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオ
チドは未投与の個体と比較して投与した個体の腫瘍においてＶＥＧＦ ｍＲＮＡ
および／または蛋白質濃度を低減する。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチ
ドは脊椎動物、例えばマウスにおいて、未投与のマウスと比較して、または、投
与前に測定した同じ動物の腫瘍体積に対して相対的に、腫瘍の体積を低減する。

【００６１】 本発明はまた本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。製造方法はオ
リゴヌクレオチドの化学合成を包含する。好ましくは、化学合成はオリゴヌクレ
オチド合成のために用いられることが知られている定法、例えばCaruthers（198
3）Tetrahedron Letters 24, 245に準じたホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネ
ート法（Todd et al. (1957), J. Chem. Soc. 3291）またはホスホトリエステル
法（Sonveaux (1986), Bioorg. Chem. 14, 274；Gait, M.J.“Oligonucleoside
Synthesis, A practical Approach”，IRL Press, Oxford, 1984）またはこのよ
うな定法の改良法または変法により行なう。本発明のオリゴヌクレオチドは例え
ば実施例１に記載の通り製造することができる。好ましくは、本発明のオリゴヌ
クレオチドは適当に保護された単量体（例えばヌクレオシド）を縮合してこれら
単量体の間にヌクレオシド間架橋を形成することにより、固相支持体上で合成す
る。本発明は例えばオリゴヌクレオチドまたはその誘導体の製造方法に関し、こ
こでは３′または２′末端リン（Ｖ）基および遊離の５′−ヒドロキシルまたは
メルカプト基を有するヌクレオチド単位を３′位にリン（III）またはリン（Ｖ
）の基を有する別のヌクレオチド単位またはその活性化した誘導体と反応させ、
そして、他の官能基を保護するために一次的にオリゴヌクレオチド内に導入する
ことができ、合成後には除去する任意の保護基を用い、そして、固相支持体から
脱離したオリゴヌクレオチドを場合により生理学的に忍容性のある塩に変換する
ことができる。修飾オリゴヌクレオチドを合成するためには、定法はある程度変
更して用いる。このような変更は当業者の知るとおりであり、例えばAgrawal S.
, “Protocols for oligonucleotides and analogs”(1993, Human Press Inc.,
Totowa, New Jersey）に記載されている。修飾オリゴヌクレオチドの製造はま
たＥＰ ０ ７１０ ６６７、ＥＰ ０ ６８０ ９６９、ＥＰ ０ ４６４ ６３８、
ＥＰ ０ ５９３ ９０１、ＷＯ ９５／０１３６３、ＥＰ ０ ６７２ ６７７、Ｅ
Ｐ ０ ７３９ ８９８およびＥＰ ０ ５５２ ７６６に記載されている。上記文献
に記載されている修飾オリゴヌクレオチドの製造方法は参考のために本明細書に
組み込まれる。

【００６２】 本発明は更にＶＥＧＦ発現の抑制、および／または、ＶＥＧＦコード核酸の発
現の調節の方法に関し、ここでは、本発明のオリゴヌクレオチドをＶＥＧＦコー
ド核酸（例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）に接触させ、オリゴヌクレオチドをこのＶ
ＥＧＦコード核酸にハイブリダイズ（結合）させる。

【００６３】 従って本発明は、例えば知られた方法で細胞にオリゴヌクレオチドを導入する
ことにより、例えば、オリゴヌクレオチドまたはその調製物とともに細胞をイン
キュベートすることによる、ＶＥＧＦコード核酸（例えばｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ）
にオリゴヌクレオチドを接触させる方法に関し、上記調製物は取り込み増強剤、
例えばリポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、または、ポリカチ
オン（例えばポリリジン）を含有してよい。例えば、室温で３０分間セルフェク
チンと共に予めインキュベートしておいたオリゴヌクレオチドを次に細胞と共に
約５時間以下インキュベートし、オリゴヌクレオチドを細胞に導入する。

【００６４】 本発明は更に、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＶＥＧＦコード
ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合）として、または、リボザイム（ＶＥＧ
ＦコードｍＲＮＡへの結合およびこのｍＲＮＡの切断）としてのオリゴヌクレオ
チドの使用に関する。本発明の別の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチ
ドはＶＥＧＦコードｍＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断の誘導のために使用することが
でき、これによりＶＥＧＦ発現を低減させる。

【００６５】 本発明はＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉、ＶＥＧ
Ｆ₂₀₆）および／またはそのスプライス変異体および／またはその突然変異体の
発現の調節および完全および部分的な抑制のため、例えばＶＥＧＦコードｍＲＮ
Ａの翻訳の部分的または完全な抑制のための、オリゴヌクレオチドの使用に関す
る。

【００６６】 本発明は特に脊椎動物における、血管形成、血管新生、腫瘍の生育および転移
を抑制、防止または調節するためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明
は一般的にＶＥＧＦが過剰発現している疾患の治療または予防のための本発明の
オリゴヌクレオチドの使用に関する。ＶＥＧＦが過剰発現しているこのような疾
患は例えば癌、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、乾癬、関節リューマチおよび
他の炎症性疾患である。

【００６７】 本発明は更に、医薬としてのオリゴヌクレオチドの使用および医薬組成物を調
製するためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。特に、オリゴヌクレオチドは
ＶＥＧＦの発現または過剰発現（発現増大）に関連する疾患の予防および／また
は治療のため、および、ＶＥＧＦまたはその過剰発現が要因となっているか、関
与している疾患の治療のために用いられる医薬組成物において使用することがで
きる。

【００６８】 本発明は更に製薬上許容しうる賦形剤または補助物質のほかにオリゴヌクレオ
チドおよび／または生理学的に忍容性のあるその塩を含有する医薬組成物に関す
る。 本発明は異常な血管透過性、細胞増殖、細胞透過、血管形成、血管新生、腫瘍
細胞の生育および新生物性細胞の転移に関わる疾患の治療のために使用すること
のできる本発明のオリゴヌクレオチド少なくとも１種を含有する医薬組成物に関
する。

【００６９】 本発明は更に、本発明のオリゴヌクレオチド１つ以上を、例えば適切な場合に
は、適当な添加剤および／または補助剤と共に、生理学的に許容される賦形剤お
よび場合により他の物質と混合することを包含する医薬組成物の製造方法に関す
る。

【００７０】 本発明は特に癌の治療のため、例えば、腫瘍の生育および腫瘍の転移を抑制す
るため、および、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、乾癬、関節リューマチおよ
び他の炎症性疾患の治療のためのオリゴヌクレオチドまたはそれより調製した医
薬組成物の使用に関する。例えばオリゴヌクレオチドまたはこれより調製する医
薬組成物は、固形腫瘍、例えば乳癌、肺癌、頭部および頸部の癌、脳腫瘍、腹部
の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽
腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽腫、ウィルムス腫、多発性骨髄
腫の治療のため、および、皮膚癌、例えば黒色腫の治療のため、リンパ腫および
血液癌の治療のために使用してよい。本発明は更に、ＶＥＧＦ発現の抑制および
／または種々の癌、例えば乳癌、肺癌、頭部および頸部の癌、脳腫瘍、腹部の癌
、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽腫、
骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽腫、ウィルムス腫、多発性骨髄腫、
皮膚癌、黒色腫、リンパ腫および血液癌における腹水および胸水の貯留の抑制の
ための本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれより調製した医薬組成物の使用に
関する。ＶＥＧＦ発現および／または腹水および胸水に対する抑制作用のために
、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそれより調製した医薬組成物はクオリティ
ーオブライフを向上させることができる。本発明の好ましい実施態様において、
オリゴヌクレオチドまたはそれより調製した医薬組成物は卵巣癌における腹水の
貯留を抑制することができる。

【００７１】 本発明は更に、他の医薬および／または他の治療方法、例えば知られた医薬お
よび／または知られた治療方法、例えば癌の治療および／または腫瘍転移の予防
のために現在用いられているものと組合せた、例えば癌の治療のため、または、
腫瘍転移の予防のため、または、加齢性黄斑変性、関節リューマチ、乾癬および
糖尿病性網膜症の治療のためのオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物の使用
に関する。好ましくは放射線療法、および、化学療法、例えばシスプラチン、シ
クロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン
またはタモキシフェンと組合せる。

【００７２】 オリゴヌクレオチドおよび／または生理学的に忍容性のあるその塩は動物、好
ましくは哺乳類、特にヒトに対して、そのまま、他のオリゴヌクレオチド（また
は生理学的に忍容性のあるその塩）との混合物として、または、局所、経皮、非
経腸または経腸投与を可能とし、そして、慣用的な製薬上許容しうる賦形剤およ
び補助物質と共に活性成分として有効量のオリゴヌクレオチド少なくとも１種を
含有する医薬組成物の形態で、投与することができる。このような医薬組成物は
通常は治療活性オリゴヌクレオチド約０.１〜９０重量％を含有する。用量は広
範囲に変化でき、個々の症例において個体の状況に合わせることができる。乾癬
を治療する場合は、局所投与が好ましい。癌の場合は、注入、経口および直腸投
与、または肺癌で好ましいエアロゾルによる経鼻投与が好ましく、一方糖尿病性
網膜症の場合は、局所、硝子体内および経口投与が好ましい。

【００７３】 医薬組成物はそれ自体知られた方法（例えばRemingtons Pharmaceutical Scie
nces, Mack Publ. Co., Easton, PA (1985)）において、薬学的に不活性な無機
および／または有機の賦形剤を使用しながら調製される。例えば乳糖、コーンス
ターチ、および／またはこれらの誘導体、タルク、ステアリン酸および／または
その塩等を用いて丸薬、錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセル
を調製することができる。ソフトゼラチンカプセルおよび／または坐薬用の賦形
剤の例は、油脂、ワックス、半固体および液体のポリオール、天然油および／ま
たは硬化油等である。溶液および／またはシロップを調製するための適当な賦形
剤の例は水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオール等である。注射用溶
液を調製するための適当な賦形剤は水、アルコール、グリセロール、ポリオール
、植物油等である。マイクロカプセル、移植片および／またはロッド用の適当な
賦形剤は、グリコール酸と乳酸の混合重合体である。更に例えばN. Weiner, (Dr
ug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523), “Liposome Dermatics”(Springer Ve
rlag 1992) and Hayashi（Gene Therapy 3（1996）878）に記載されているリポ
ソーム処方も挙げられる。医薬組成物はまた腸通過性増強剤、例えばマンニトー
ル、尿素、胆汁酸塩、例えばＣＤＣＡ（ケノデオキシコレート）（２％）のよう
な、オリゴヌクレオチドの経口利用性を高める処方も包含する。経皮投与もまた
例えばイオノフォレティック法（ionophoretic method）および／またはエレク
トロポレーションを用いて行なうことができる。更に、リポフェクチン、および
、例えば遺伝子療法で使用されているもののような担体系を用いることもできる
。真核細胞内または真核細胞の核内に高い効率でオリゴヌクレオチドを導入する
ために使用することのできる系が特に適している。医薬組成物はまた、異なるオ
リゴヌクレオチドおよび／または生理学的に忍容性のあるその塩２種以上、およ
び、オリゴヌクレオチド少なくとも１種のほかに、異なる治療活性成分１種以上
を含有してもよい。

【００７４】 活性成分および賦形剤のほかに、医薬組成物は添加物、例えば充填剤、膨張剤
、錠剤崩壊剤、バインダー、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存料、甘味料
、染料、フレーバーまたは芳香剤、濃厚化剤、稀釈剤または緩衝物質、更に、溶
媒および／または可溶化剤および／または除放性付与剤、および浸透圧調節のた
めの塩類、コーティング剤および／または抗酸化剤を含有することができる。

【００７５】 図１：図１（パートＡ〜Ｅ）はＶＥＧＦクローン（両鎖）のｃＤＮＡ配列に関
する被験ＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３〜７２）の局
在化を示し、そのヌクレオチド配列は表１に示すとおりである。コア領域１〜６
および配列番号１〜１２の配列の局在化も示す（配列の下線部）。

【００７６】 図２：培養細胞におけるＶＥＧＦ蛋白質の分泌に対する種々のオリゴヌクレオ
チド（各々３μＭの濃度で使用）の抑制作用を要約したものである（ヒトＵ８７
−ＭＧ細胞による分泌）。オリゴヌクレオチドを投与しない対照細胞との相対値
（オリゴヌクレオチドを投与しない細胞から分泌されたＶＥＧＦの量に対するオ
リゴヌクレオチド投与細胞から分泌されたＶＥＧＦの量）として抑制作用を示す
。オリゴヌクレオチド：結果によればＯＮ２、ＯＮ４、ＯＮ１５、ＯＮ１６、Ｏ
Ｎ１７、ＯＮ２１、ＯＮ２２、ＯＮ２３、ＯＮ２４、ＯＮ２５、ＯＮ２６、ＯＮ
３９およびＯＮ４０は対照細胞と比較して最も明らかな抑制作用を示している。
略記法：１はＯＮ３００であり、２はＯＮ２であり、３はＯＮ３０１であり、４
はＯＮ４であり、５はＯＮ３０２であり、６はＯＮ３０３であり、７はＯＮ３０
４であり、８はＯＮ３０５であり、９はＯＮ３０６であり、１０はＯＮ３０７で
あり、１１はＯＮ３０８であり、１２はＯＮ３０９であり、１３はＯＮ３１０で
あり、１４はＯＮ３１１であり、１５はＯＮ１５であり、１６はＯＮ１６であり
、１７はＯＮ１７であり、１８はＯＮ３１２であり、１９はＯＮ３１３であり、
２０はＯＮ３１４であり、２１はＯＮ３３であり、２２はＯＮ２２であり、２３
はＯＮ２３であり、２４はＯＮ２４であり、２５はＯＮ２５であり、２６はＯＮ
２６であり、２７はＯＮ３１５であり、２８はＯＮ３１６であり、２９はＯＮ３
１７であり、３０はＯＮ３１８であり、３１はＯＮ３１９であり、３２はＯＮ３
２０であり、３３はＯＮ３２１であり、３４はＯＮ３２２であり、３５はＯＮ３
２３であり、３６はＯＮ３２４であり、３７はＯＮ３２５であり、３８はＯＮ３
２６であり、３９はＯＮ３９であり、４０はＯＮ４０であり、４１はＯＮ３２７
であり、４２はＯＮ３２８であり、４３はＯＮ３２９であり、４４はＯＮ３３０
であり、４５はＯＮ３３１であり、４６はＯＮ３３２であり、４７はＯＮ３３３
であり、４８はＯＮ３３４であり、４９はＯＮ３３５であり、５０はＯＮ３３６
であり、５１はＯＮ３３７であり、そして６０はＯＮ３４５である。

【００７７】 図３：ＯＮ２４による腫瘍生育の抑制。Ｕ８７−ＭＧ異種移植片を有するヌー
ドマウスに種々の濃度のＯＮ２４を投与した（白丸は１mg／kg、黒三角は４mg／
kg、白三角は１２mg／kg（mgオリゴヌクレオチド／kg体重）。第２７日に腫瘍の
体積（mm³）を分析した。比較のために未投与対照マウスの腫瘍体積も測定した
（黒丸）。

【００７８】

【実施例】

実施例１：オリゴヌクレオチドの合成 Applied Biosystems 394 DNA合成装置（Perkin Elmer Applied Biosystems, I
nc., Foster City, USA）および標準的なホスホロアミダイト化学を用いてオリ
ゴヌクレオチド（ＯＮ）を合成した。カップリング後、ホスホロチオエート結合
を導入するためにBeaucage試薬を用いてスルフリル化し、その後、無水酢酸およ
びＮ−メチルイミダゾールでキャッピングした。固相支持体から脱離させ、濃ア
ンモニアによる処理により最終脱保護した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によりＯＮを精製した。２′−Ｏ−メチル修飾ＯＮは２′−Ｏ−メチルリボヌク
レオシドホスホロアミダイトで相当するサイクルの標準的ホスホロアミダイトを
置き換えることにより製造した。全てのＯＮは陰イオン電子スプレー質量スペク
トル分析（Fisons Bio-Q）で分析したところ全て計算値と合致した。Ｃ１６−修
飾オリゴヌクレオチドの合成は標準的アミダイトの代わりにオリゴヌクレオチド
合成の最終段階でホスフィチル化試薬としてヘキサデシルオキシ（シアノエトキ
シ）Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノホスファンを用いるか、または、相応に誘導
した固相支持体から開始した。トリエチレングリコールリンカーはGlen Researc
h Corporationより販売されている。アデノシンまたはコルディセピンの２′−
ホスホロアミダイトはChem. Genes CorporationおよびChemogen Corporationか
らそれぞれ入手した。５′−ホスフェートまたはチオホスフェート残基の導入は
前述の通り行なった（Uhlmann and Engels (1986) Tetrahedron Lett. 27, 1023
）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラはＥＰ ０ ６７２ ６７７に記載の通り製造する。

【００７９】 オリゴヌクレオチドの分析は以下の工程： ａ）２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５μＭ tris−ホウ酸塩緩衝液、pH
７.０における分析的ゲル電気泳動、および／または、 ｂ）ＨＰＬＣ分析：Waters GenPak FAXcolumn, 勾配 CH₃CN(400ml), H₂O(1.6
Ｌ), NaH₂PO₄(3.1ｇ), NaCl(11.7ｇ), pH6.8(0.1Ｍ an NaCl) その後CH₃CN(400m
l), H₂O(1.6Ｌ), NaH₂PO₄(3.1ｇ), NaCl(175.3ｇ), pH6.8(1.5Ｍ an NaCl)およ
び／または、 ｃ）Beckmannキャピラリ−ｅＣＡＰ^TM, U100P Gel Column、長さ６５cm、内径
１００mm、ウインドウは一端から１５cm、緩衝液［１４０μＭ Tris, ３６０mM
ホウ酸塩、７Ｍ尿素］を用いたキャピラリー電気泳動および／または、 ｄ）陰イオン電子スプレー質量スペクトル分析、全て予測質量値を確認、 により行なった。

【００８０】 ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）に準じたオリゴヌクレオチドの分析方法は当業者
の知る通りである。これらの方法は例えばSchweitzer and Engel“Analysis of
oligonucleotides”(in “Antisense-from technology to therapy", a laborat
rory manual and textbook, Schlingensiepen et al. eds., Biol. Science Vol
. 6 (1997) p. 78-103)に記載されている。

【００８１】 以下： ON300 3′-G^*G^*C^*CAGC^*C^*GG^*A-5′（配列番号13の配列） ON 2 3′-C^*C^*AGC^*C^*C^*GGAG^*G-5′（配列番号14の配列） ON301 3′-G^*C^*C^*CGGAGG^*C^*T^*T-5′（配列番号15の配列） ON 4 3′-C^*G^*GAGGC^*T^*T^*TG^*G-5′（配列番号16の配列） 0N302 3′-G^*G^*CT^*T^*TGGT^*AC^*T-5′（配列番号17の配列） ON303 3′-T^*T^*GG^*TAC^*T^*TGA^*A-5′（配列番号18の配列） ON304 3′-G^*G^*TAC^*T^*T^*GAAA^*G-5′（配列番号19の配列） ON305 3′-C^*T^*T^*GAAAGA^*C^*G^*A-5′（配列番号20の配列） ON306 3′-G^*A^*AAGA^*C^*GA^*CA^*G-5′（配列番号21の配列） ON307 3′-G^*A^*C^*GAC^*AGAA^*C^*C-5′（配列番号22の配列） ON308 3′-G^*A^*C^*AGAAC^*C^*CA^*C-5′（配列番号23の配列） ON309 3′-G^*AAC^*C^*CA^*CG^*TA^*A-5′（配列番号24の配列） ON310 3′-C^*G^*AC^*GAGA^*TGG^*A-5′（配列番号25の配列） ON311 3′-C^*G^*AGA^*T^*GGAGG^*T-5′（配列番号26の配列）

【００８２】 ON 15 3′-G^*A^*TGGAGG^*T^*GG^*T-5′（配列番号27の配列） ON 16 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TAC^*G-5′（配列番号28の配列） ON 17 3′-G^*G^*T^*GGT^*AC^*GGT^*T-5′（配列番号29の配列） ON312 3′-G^*G^*TA^*CGGT^*T^*CA^*C-5′（配列番号30の配列） ON313 3′-A^*C^*GGT^*T^*CAC^*CA^*G-5′（配列番号31の配列） ON314 3′-G^*G^*TT^*C^*AC^*CAGG^*G-5′（配列番号32の配列） ON 21 3′-C^*A^*C^*CAGGGT^*C^*C^*G-5′（配列番号33の配列） ON 22 3′-C^*C^*AGGGT^*C^*CGA^*C-5′（配列番号34の配列） ON 23 3′-A^*G^*GGT^*C^*CGAC^*G^*T-5′（配列番号35の配列） ON 24 3′-G^*GG^*T^*C^*CGAC*GT^*G-5′（配列番号36の配列） ON 25 3′-G^*G^*TC^*C^*GAC^*GT^*GG-5′（配列番号37の配列） ON 26 3′-C^*C^*GA^*CG^*TGGG^*T^*A-5′（配列番号38の配列） ON315 3′-C^*C^*AC^*T^*T^*CAAGT^*A-5′（配列番号39の配列） ON316 3′-C^*T^*T^*CAAG^*TAC^*C^*T-5′（配列番号40の配列） ON317 3′-C^*A^*AG^*TAC^*C^*TAC^*A-5′（配列番号41の配列） ON318 3′-G^*T^*AC^*C^*TAC^*AGA^*T-5′（配列番号42の配列） ON319 3′-A^*C^*C^*TA^*CAGA^*TA^*G-5′（配列番号43の配列） ON320 3′-C^*T^*A^*CAGA^*TAG^*T^*C-5′（配列番号44の配列） ON321 3′-C^*A^*GA^*TAG^*T^*CGC^*G-5′（配列番号45の配列） ON322 3′-G^*A^*TAGT^*CG^*C^*GT^*C-5′（配列番号46の配列） ON323 3′-G^*T^*CG^*CG^*T^*CGAT^*G-5′（配列番号47の配列） ON324 3′-C^*G^*C^*GT^*CGA^*TGA^*C-5′（配列番号48の配列） ON325 3′-C^*G^*T^*CGA^*TGA^*CG^*G-5′（配列番号49の配列） ON326 3′-C^*G^*A^*TGA^*CGG^*TA^*G-5′（配列番号50の配列） ON 39 3′-A^*C^*GC^*C^*CC^*CGAC^*G-5′（配列番号55の配列） ON 40 3′-C^*C^*C^*CC^*GA^*CGAC^*G-5′（配列番号56の配列） ON327 3′-C^*G^*ACGT^*TA^*C^*TG^*C-5′（配列番号57の配列） ON328 3′-C^*T^*CC^*CGGAC^*C^*T^*C-5′（配列番号58の配列） ON329 3′-C^*G^*GAC^*C^*T^*CACA^*C-5′（配列番号59の配列） ON330 3′-G^*A^*C^*CT^*CA^*CACA^*C-5′（配列番号60の配列） ON331 3′-G^*A^*TGT^*CGT^*GT^*T^*G-5′（配列番号67の配列）

【００８３】 ON332 3′-C^*G^*TGT^*TGT^*TT^*A^*C-5′（配列番号68の配列） ON333 3′-C^*A^*C^*TTA^*CGT^*CT^*G-5′（配列番号69の配列） ON334 3′-C^*T^*TA^*CGT^*C^*TGG^*T-5′（配列番号70の配列） ON335 3′-C^*G^*TC^*TGGT^*TT^*C^*T-5′（配列番号71の配列） ON336 3′-C^*T^*GGT^*TT^*CT^*TT^*C-5′（配列番号72の配列） ON337 3′-G^*T^*GG^*TA^*CGT^*C^*T^*A-5′（配列番号61の配列） ON338 3′-G^*G^*TA^*CGT^*C^*TAA^*T-5′（配列番号62の配列） ON339 3′-C^*G^*T^*CT^*AAT^*AC^*G^*C-5′（配列番号63の配列） ON340 3′-C^*T^*AA^*TA^*CGC^*C^*T^*A-5′（配列番号64の配列） ON341 3′-C^*G^*CC^*TAGT^*T^*TG^*G-5′（配列番号65の配列） ON342 3′-A^*G^*T^*T^*TGGAG^*TG^*G-5′（配列番号66の配列） ON343 3′-G^*C^*T^*CAT^*GT^*AGA^*A-5′（配列番号51の配列） ON 58 3′-G^*T^*AGAAG^*TT^*C^*G^*G-5′（配列番号52の配列） ON344 3′-G^*A^*AGT^*T^*C^*GG^*TA^*G-5′（配列番号53の配列） ON345 3′-C^*G^*G^*TAGGA^*CA^*C^*A-5′（配列番号54の配列） ON104 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ ON105 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*G^*T^*G-5′ ON106 3′-G^*G^*GT^*C^*CGAC^*G^*TG-5′

【００８４】 ON114 3′-C ^* C ^* AGC ^* C ^* C ^*GGAG^*G-5′ ON115 3′-C ^* G ^* GAGGC ^*T^*T^*TG^*G-5′ ON116 3′-G ^* A ^* TGGAGG^*T^*GG^*T-5′ ON117 3′-G ^* G ^* AGG ^* TGG^*TAC^*G-5′ ON118 3′-G ^* G ^* T ^* GGT ^* AC^*GGT^*T-5′ ON119 3′-C ^* A ^* C ^* CAGGGT^*C^*C^*G-5′ ON120 3′-C ^* C ^* AGGGT ^*C^*CGA^*C-5′ ON121 3′-A ^* G ^* GGT ^* C ^* CGAC^*G^*T-5′ ON122 3′-G ^* GG ^* T ^* C ^* CGAC^*GT^*G-5′ ON123 3′-G ^* G ^* TC ^* C ^* GAC^*GT^*GG-5′ ON124 3′-C ^* C ^* GA ^* CG ^* TGGG^*T^*A-5′ ON125 3′-C ^* C ^* C ^* CC ^* GA ^*CGAC^*G-5′ ON139 3′-C ^* C ^* AGC ^* C ^* C ^* GGAG ^* G-5′ ON140 3′-C ^* G ^* GAGGC ^* T ^* T ^* TG ^* G-5′ ON141 3′-G ^* A ^* TGGAGG ^* T ^* GG ^* T-5′ ON142 3′-G ^* G ^* AGG ^* TGG ^* TAC ^* G-5′ ON143 3′-G ^* G ^* T ^* GGT ^* AC ^* GGT ^* T-5′ ON144 3′-C ^* A ^* C ^* CAGGGT ^* C ^* C ^* G-5′ ON145 3′-C ^* C ^* AGGGT ^* C ^* CGA ^* C-5′ ON146 3′-A ^* G ^* GGT ^* C ^* CGAC ^* G ^* T-5′ ON147 3′-G ^* GG ^* T ^* C ^* CGAC*GT ^* G-5′ ON148 3′-G ^* G ^* TC ^* C ^* GAC ^* GT ^* GG-5′ ON149 3′-C ^* C ^* GA ^* CG ^* TGGG ^* T ^* A-5′ ON150 3′-A ^* C ^* GC ^* C ^* CC ^* CGAC ^* G-5′ ON151 3′-C ^* C ^* C ^* CC ^* GA ^* CGAC ^* G-5′ ON152 3′-G ^* T ^* AGAAG ^* TT ^* C ^* G ^* G-5′

【００８５】 ON153 3′-C^*C^*AGC^*C^*C^*GGAG^*G-C16-5′ ON154 3′-C^*G^*GAGGC^*T^*T^*TG^*G-C16-5′ ON155 3′-G^*A^*TGGAGG^*T^*GG^*T-C16-5′ ON156 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TAC^*G-C16-5′ ON157 3′-G^*G^*T^*GGT^*AC^*GGT^*T-C16-5′ ON158 3′-C^*A^*C^*CAGGGT^*C^*C^*G-C16-5′ ON159 3′-C^*C^*AGGGT^*C^*CGA^*C-C16-5′ ON160 3′-A^*G^*GGT^*C^*CGAC^*G^*T-C16-5′ ON161 3′-G^*GG^*T^*C^*CGAC^*GT^*G-C16-5′ ON162 3′-G^*G^*TC^*C^*GAC^*GT^*GG-C16-5′ ON163 3′-C^*C^*GA^*CG^*TGGG^*T^*A-C16-5′ ON164 3′-C^*C^*C^*CC^*GA^*CGAC^*G-C16-5′ ON165 3′-teg-G ^* G ^* GT^*C^*CGAC^*GT^*G-5′ ON166 3′-teg-G ^* G ^* GT ^* C ^* CGAC^*GT^*G-5′ ON167 3′-teg-G ^* G ^* GT^*C^*CGAC^* GT ^* G-5′ ON346 3′-C^*C^*AGC^*C^*C^*GGAG^*G-vitE-5′ ON347 3′-G^*A^*TGGAGG^*T^*GG^*T-vitE-5′ ON348 3′-G^*G^*AGG^*TGG^*TAC^*G-vitE-5′ ON349 3′-G^*G^*T^*GGT^*AC^*GGT^*T-vitE-5′ ON350 3′-C^*A^*C^*CAGGGT^*C^*C^*G-vitE-5′ ON351 3′-C^*C^*AGGGT^*C^*CGA^*C-vitE-5′ ［式中“^*”はホスホロチオエートヌクレオシド間架橋であり、 下線“Ｎ”は２′−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（この場合“Ｔ”は２′−Ｏ
−メチルウリジン）であり、 “teg”はトリエチレングリコールホスフェートリンカーであり、 “Ｃ₁₆”はヘキサデシルホスフェートであり、そして、 “vitE”はビタミンＥグリセロールホスフェートである。］のオリゴヌクレオ
チドを製造し（記載参照）試験した。

【００８６】 実施例２ アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への投与 細胞を３０,０００個／ウェルの密度で９６穴プレートに播種し、ウエル当た
りの培地は１５０μlとする（培地は細胞のタイプにより変えた）。翌日、セル
フェクチン（Gibco-BRL）を水中４０.０μg／mlに稀釈する（溶液Ａ）。オリゴ
ヌクレオチドを水中所望の最終濃度×４０となるまで稀釈する（溶液Ｂ）。等量
の溶液Ａと溶液Ｂを混合して２００μg／mlセルフェクチンおよび２０×オリゴ
ヌクレオチドの溶液の所望の容量とし、そして混合物を３０分間室温で放置する
。３０分後、１９容のOptimem（Gibco-BRL）を添加して溶液の最終濃度を１０μ
g／mlセルフェクチンおよび１ｘオリゴヌクレオチドとする（溶液Ｃ）。培地と
細胞を分離し、ウエルをOptimemで２回洗浄し、溶液Ｃ１ ５０μlを各ウェルに
添加する。次にプレートをインキュベーターに戻す。５時間後、セルフェクチン
／オリゴヌクレオチド溶液を除き、通常の生育培地１５０μlと交換する。ＶＥ
ＧＦ蛋白質およびｍＲＮＡのアッセイは１９時間後に開始する。

【００８７】 実施例３ 培養細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＶＥＧＦ発現の抑制（
ＶＥＧＦ蛋白質アッセイ） コンディショニングされた培地の試料を所望のウェルから取り、R&D systems
のヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットを用いてヒトＶＥＧＦの存在を調べる。アッ
セイプロトコルはキットに添付のものを使用する。種々の１２merのアンチセン
スオリゴヌクレオチドによるＵ８７−ＭＧ細胞におけるＶＥＧＦ発現の抑制を表
２および図２に示す。これらは幾つかのアンチセンスオリゴヌクレオチドであり
、部分ホスホロチオエートとして修飾されており、３μＭオリゴヌクレオチド濃
度で約８０％ＶＥＧＦ発現を抑制し（例えばＯＮ２、ＯＮ４、ＯＮ１５、ＯＮ１
６、ＯＮ１７、ＯＮ２４、ＯＮ４０）たのに対し、他のオリゴヌクレオチドは同
じ条件下で実質的に不活性であった（例えばＯＮ３１５およびＯＮ３１６）。１
２merのホスホロチオエートパターンは詳細な説明で記載した通り部分修飾オリ
ゴヌクレオチドの限度内で変更できる。即ち、ＯＮ２４、ＯＮ１０４、ＯＮ１０
５およびＯＮ１０６はほぼ同じ抑制作用を示すのに対し、ＯＮ１０４は同じ配列
の他の３種のオリゴヌクレオチドよりも幾分高活性であることがわかった。例え
ばＯＮ１１７の場合のような２′−Ｏ−メチルＲＮＡとしての部分誘導体化は同
じ配列のＤＮＡ化合物ＯＮ１６と比較して抑制活性を更に増強する。

【００８８】 実施例４ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡアッセイ 上記した９６穴プレートから培地を除き、細胞融解物を残存細胞から製造し、
Applied Biosystems 7700 AnalyserによるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの定量に付す。ｍ
ＲＮＡ濃度を測定するために、同じ試料で検出されたβ−アクチン濃度に対して
データを規格化する。

【００８９】 実施例５ ＩＣ(５０)値の測定 ＩＣ５０はオリゴヌクレオチドを用いることなくセルフェクチンを投与した細
胞におけるＶＥＧＦ蛋白質またはｍＲＮＡの量を１００％とし、これに基づいて
計算する。ＥＬＩＳＡについては、コンディショニングされた培地におけるＶＥ
ＧＦの量を各試料の細胞数に対して規格化する。細胞数はCYQuantアッセイ（Mol
ecular Probes, Inc.）を用いて測定する。

【００９０】 実施例６ in vivo試験 in vivoの実験は例えば４〜６週齢の雌性ヌード（nu／nu）マウスを用いて行
なうことができ、その際、腫瘍は予め細胞の皮下移植により生育させる（例えば
Ｕ８７−ＭＧでは２００μl中２,０００,０００個）。オリゴヌクレオチドをリ
ン酸塩緩衝食塩水に溶解し、１００μの容量でｌ.２×１０⁶個のＵ８７−ＭＧを
皮下または静脈内（尾静脈）に注射する。例えば腫瘍細胞を第０日に移植した場
合は、薬剤の投与は第１〜４日に開始することができ、オリゴヌクレオチドは毎
日尾静脈に注射する。

【００９１】

【表１】

【００９２】

【表２】

【００９３】

【表３】

【００９４】

【表４】

【００９５】

【表５】

【００９６】

【表６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＶＥＧＦクローン（両鎖）のｃＤＮＡ配列に関する被験ＶＥＧＦアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号１３〜７２）の局在化を示し、そのヌクレオチド
配列は表１に示すとおりである。コア領域１〜６および配列番号１〜１２の配列
の局在化も示す（配列の下線部)。

【図１Ｂ】 ＶＥＧＦクローン（両鎖）のｃＤＮＡ配列に関する被験ＶＥＧＦアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号１３〜７２）の局在化を示し、そのヌクレオチド
配列は表１に示すとおりである。コア領域１〜６および配列番号１〜１２の配列
の局在化も示す（配列の下線部)。

【図１Ｃ】 ＶＥＧＦクローン（両鎖）のｃＤＮＡ配列に関する被験ＶＥＧＦアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号１３〜７２）の局在化を示し、そのヌクレオチド
配列は表１に示すとおりである。コア領域１〜６および配列番号１〜１２の配列
の局在化も示す（配列の下線部)。

【図１Ｄ】 ＶＥＧＦクローン（両鎖）のｃＤＮＡ配列に関する被験ＶＥＧＦアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号１３〜７２）の局在化を示し、そのヌクレオチド
配列は表１に示すとおりである。コア領域１〜６および配列番号１〜１２の配列
の局在化も示す（配列の下線部)。

【図１Ｅ】 ＶＥＧＦクローン（両鎖）のｃＤＮＡ配列に関する被験ＶＥＧＦアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号１３〜７２）の局在化を示し、そのヌクレオチド
配列は表１に示すとおりである。コア領域１〜６および配列番号１〜１２の配列
の局在化も示す（配列の下線部)。

【図２】 培養細胞におけるＶＥＧＦ蛋白質の分泌に対する種々のオリゴヌクレオチド（
各々３μＭの濃度で使用）の抑制作用を要約したものである（ヒトＵ８７−ＭＧ
細胞による分泌）。

【図３】 ＯＮ２４による腫瘍生育の抑制を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 13/12 13/12 17/16 17/16 27/02 27/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 アラン・ビトーンティ アメリカ合衆国ニュージャージー州08551． リングース．ベックスブールバード99 (72)発明者 リチャード・ヴェスナー アメリカ合衆国ニュージャージー州08833． レバノン．チェスナットプレイス14 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 4C084 AA13 CA53 NA14 ZA33 ZA36 ZA81 ZA89 ZB15 ZB21 ZB26 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA36 ZA81 ZA89 ZB15 ZB21 ZB26

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １０〜１５ヌクレオチドの長さを有し、ＶＥＧＦコード配列
   の部分に相当する短鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、オリゴヌク
   レオチドが相当するＶＥＧＦコード配列の部分は配列番号１、配列番号２、配列
   番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の配列の１つまたはその部分
   を有し、ここで、 配列番号１は 5′-CCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCG-3′、 配列番号２は 5′-CGGGCCTCCGAAACC-3′、 配列番号３は 5′-GCTCTACCTCCACCATGCCAA-3′、 配列番号４は 5′-GTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGC-3′、 配列番号５は 5′-CATCTTCAAGCCATCC-3′、そして 配列番号６は 5′-TGCGGGGGCTGCTGC-3′ である上記短鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体。
2. 【請求項２】 配列番号７〜配列番号１２の配列の１つまたはその部分を有
   する請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであり、ここで、 配列番号７は 3′-GGGCCGGGGCCAGCCCGGAGGC-5′、 配列番号８は 3′-GCCCGGAGGCTTTGG-5′、 配列番号９は 3′-CGAGATGGAGGTGGTACGGTT-5′、 配列番号10は 3′-CACCAGGGTCCGACGTGGGTACCG-5′、 配列番号11は 3′-GTAGAAGTTCGGTAGG-5′、そして 配列番号12は 3′-ACGCCCCCGACGACG-5′ である上記オリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 オリゴヌクレオチドが１２ヌクレオチドの長さを有する請求
   項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 オリゴヌクレオチドが配列番号１４、配列番号１６、配列番
   号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３４、配列番号
   ３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号５２、配列番号５
   ５または配列番号５６の１つを有する請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌ
   クレオチドであり、ここで、 配列番号14 は3′-CCAGCCCGGAGG-5′、 配列番号16 は3′-CGGAGGCTTTGG-5′、 配列番号27 は3′-GATGGAGGTGGT-5′、 配列番号28 は3′-GGAGGTGGTACG-5′、 配列番号29 は3′-GGTGGTACGGTT-5′、 配列番号33 は3′-CACCAGGGTCCG-5′、 配列番号34 は3′-CCAGGGTCCGAC-5′、 配列番号35 は3′-AGGGTCCGACGT-5′、 配列番号36 は3′-GGGTCCGACGTG-5′、 配列番号37 は3′-GGTCCGACGTGG-5′、 配列番号38 は3′-CCGACGTGGGTA-5′、 配列番号52 は3′-GTAGAAGTTCGG-5′、 配列番号55 は3′-ACGCCCCCGACG-5′、そして 配列番号56 は3′-CCCCCGACGACG-5′ である上記オリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 オリゴヌクレオチドが１つ以上の修飾を有し、各修飾は、天
   然のＤＮＡよりなる同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジ
   エステルヌクレオシド間架橋および／または特定のβ−Ｄ−２′−デオキシリボ
   ース単位および／または特定の天然のヌクレオシド塩基位置に位置する請求項１
   〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 各修飾が独立して、下記： ａ） 修飾されたヌクレオシド間架橋によるヌクレオシドの３′および／また
   は５′末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置き換え、 ｂ） デホスホ架橋によるヌクレオシドの３′および／または５′末端に位置
   するホスホジエステル架橋の置き換え、 ｃ） 別の単位による糖リン酸エステル骨格由来の糖リン酸エステル単位の置
   き換え、 ｄ） 修飾糖単位によるβ−Ｄ−２′−デオキシリボースの置き換え、 ｅ） 修飾ヌクレオシド塩基による天然のヌクレオシド塩基の置き換え、 ｆ） オリゴヌクレオチドの性質に影響する分子へのコンジュゲート形成、 ｇ） 場合により適切なリンカーを介した２′５′−連結オリゴアデニレート
   またはその誘導体へのコンジュゲート形成、および、 ｈ） オリゴヌクレオチドの３′および／または５′末端における３′−３′
   および／または５′−５′逆位の導入、 より選択される請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 各修飾が独立して、下記： ａ） 修飾されたヌクレオシド間架橋によるヌクレオシドの３′および／また
   は５′末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置き換え、ただし
   修飾されたヌクレオシド間架橋はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
   ＮＲ¹Ｒ¹′−ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ホスフェート−（Ｃ₁
   −Ｃ₂₁）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ₆−Ｃ₁₂）アリール−
   （（Ｃ₁−Ｃ₂₁）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ₇−Ｃ₁₂）−α−ヒドロキシメ
   チルアリール、（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキルホスホネート、および／または、（Ｃ₆
   −Ｃ₁₂）−アリールホスホネート架橋から選択され、ここでＲ¹およびＲ¹′は相
   互に独立して水素、（Ｃ₁−Ｃ₁₈）−アルキル、（Ｃ₆−Ｃ₂₀）−アリール、（Ｃ ₆ −Ｃ₁₄）−アリール−（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキル、好ましくは水素、（Ｃ₁−Ｃ₈
   ）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであるか、 Ｒ¹およびＲ¹′はそれらを担持している窒素原子と一緒になって基Ｏ、Ｓおよ
   びＮから選択される別のヘテロ原子を更に含むことのできる５−６員の複素環を
   形成するもの； ｂ） デホスホ架橋によるヌクレオシドの３′および／または５′末端に位置
   するホスホジエステル架橋の置き換え、ただし、デホスホ架橋はデホスホ架橋ホ
   ルムアセタール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オ
   キシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよびシリル基から選
   択されるもの； ｃ） 別の単位による糖リン酸エステル骨格由来の糖リン酸エステル単位の置
   き換え、ただし、別の単位はモルホリノ誘導体単位、ポリアミド核酸骨格単位、
   および、ホスホン酸モノエステル核酸骨格単位から選択されるもの； ｄ） 修飾糖単位によるβ−Ｄ−２′−デオキシリボース単位の置き換え、た
   だし、修飾糖単位はβ−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２′−デオキシリボース、Ｌ−
   ２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′−Ｏ−（Ｃ ₁ −Ｃ₆）アルキル−リボース、２′−Ｏ−（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケニル−リボース、
   ２′−［Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル］−リボース、
   ２′−ＮＨ₂−２′−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−ア
   ラビノフラノース、２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノー
   ス、炭素環類縁体および／または開鎖糖類縁体および／または２環糖類縁体から
   選択されるもの； ｅ） 修飾ヌクレオシド塩基による天然のヌクレオシド塩基の置き換え、ただ
   し、修飾ヌクレオシド塩基はウラシル、ヒポキサンチン、５−（ヒドロキシメチ
   ル）ウラシル、Ｎ²−ジメチルグアノシン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル
   、５−アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５−フルオロウ
   ラシル、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５
   −ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、２,４−ジアミノプリン、８−アザ−
   プリン、７−デアザ−７−置換プリンおよび７−デアザ−８−置換プリンから選
   択されるもの； ｆ） オリゴヌクレオチドの性質に影響する分子へのコンジュゲート形成、た
   だし、オリゴヌクレオチドの性質に影響する分子は、ポリリジン、挿入介在剤、
   蛍光剤、交差結合剤、親油性物質、脂質、ステロイド、ビタミン、好ましくはホ
   スフェート基を介してオリゴヌクレオチドに連結したポリ−またはオリゴ−エチ
   レングリコール、（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキルホスフェートジエステルおよびＯ−
   ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）−アルキル基から選択されるもの； ｇ） 好ましくは適切なリンカー分子を介した２′５′−連結オリゴアデニレ
   ートへのコンジュゲート形成、ただし２′５′−連結オリゴアデニレートは２′
   ５′−連結トリアデニレート、２′５′−連結テトラアデニレート、２′５′−
   連結ペンタアデニレート、２′５′−連結ヘキサアデニレートおよび２′５′−
   連結ヘプタアデニレート分子およびその誘導体から選択されるもの；および、 ｈ） オリゴヌクレオチドの３′および／または５′末端における３′−３′
   および／または５′−５′逆位の導入、 より選択される請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 固相支持体上の適当に保護された単量体を縮合することによ
   る請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
9. 【請求項９】 ＶＥＧＦの発現を抑制するための請求項１〜７のいずれか
   に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
10. 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを
    ＶＥＧＦコード核酸と接触させるＶＥＧＦの発現を抑制する方法。
11. 【請求項１１】 医薬組成物の調製のための請求項１〜７のいずれかに記載
    のオリゴヌクレオチドの使用。
12. 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド１つ
    以上を生理学的に許容される賦形剤および場合により更に別の物質と混合するこ
    とによる医薬組成物の調製方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド少な
    くとも１種を含有する医薬組成物。
14. 【請求項１４】 異常な血管透過性、細胞増殖、細胞透過、血管形成、血管
    新生、腫瘍細胞の生育および／または転移に関わる疾患の治療のための請求項１
    〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド少なくとも１種を含有する医薬組成
    物の使用。
15. 【請求項１５】 他の医薬および／または他の治療方法と組合せた請求項１
    〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド少なくとも１種を含有する医薬組成
    物の使用。