JP2002501505A

JP2002501505A - ヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子断片に相補的な修飾アンチセンスヌクレオチド

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Publication number: JP2002501505A
Application number: JP54770498A
Authority: JP
Inventors: オイゲン、ユールマン; アヌシルバン、ペイマン; デイビッド、ウィリアム、ウィル; エスター、チャン; キャスリーン、ピローロ; アントニア、レイト
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2002-01-15
Also published as: CN1304572C; KR20010012238A; AU744417B2; AU7760298A; HUP0100044A1; US20050020523A1; KR100518108B1; BR9809242A; US6723706B2; CA2288946A1; CN1255164A; US20030064514A1; WO1998050540A1; HUP0100044A3; EP0979273A1

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子およびｍＲＮＡの断片に相補的な特異的修飾オリゴヌクレオチド、ならびに特に化学療法および放射線療法との併用における、Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発現を特異的に調節、調整または阻害するためのその使用、およびＨａ−ｒａｓ遺伝子の異常な発現から起こる症状の治療用医薬としてのその使用に関する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは次の配列を有する：５'−ＴｘＡｘＴｘＴｘＣｘＣｘＧｘＴｘＣｘＡｘＴ−３'−Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−Ｒ［式中、ｘはｏまたはｓであり（ただしｘは４〜９度数でｓに等しく、かつｏはホスホジエステルヌクレオシド内結合を意味し、ｓはホスホロチオエートヌクレオシド内結合を意味する）、ＲはＣ₈−Ｃ₂₁−アルキル基、−（ＣＨ₂−ＣＨ₂Ｏ）_n−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₃または−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ−（ＣＨ₂）_q−ＣＨ₃（ここで、ｎは１〜６の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、かつｑは７〜２０の整数である）、Ａは２'−デオキシアデノシンであり、Ｇは２'−デオキシグアノシンであり、Ｃは２'−デオキシシチジンであり、かつＴはチミジンである］。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子断片に相補的な修飾アンチセンスヌクレオチド本発明はヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子およびｍＲＮＡの断片に相補的な特異的修飾オリゴヌクレオチド、ならびにＨａ−ｒａｓ遺伝子の発現を特異的に調節、調整または阻害するためのその使用、およびＨａ−ｒａｓ遺伝子の異常な発現から生じる症状の治療用医薬としてのその使用に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）はin vivoおよびin vitroの双方の多数の系における遺伝子発現の特異的インヒビターであることがわかっている(U hlmann and Peyman，Chem．rev．1990，90，543)。ホスホジエステルヌクレオシド内結合（ＰＯ−オリゴヌクレオチド）のみを含有する非修飾オリゴヌクレオチドを用いる場合に遭遇する主な問題の１つには、ある範囲の核酸分解活性による、細胞ならびに例えば血清および脳脊髄液などの生物学的流体におけるこの種のオリゴヌクレオチドの急速な分解がある。それらの核酸分解の安定性を向上させるために、オリゴヌクレオチドに対する広範な化学修飾が行われてきた(Uhlmann and Peyman，Chem．Res．1990，90，543)。これらの修飾には、ホスホジエステルヌクレオシド内結合、糖質単位、核塩基、またはヌクレオチドの糖リン酸主鎖の修飾もしくは置換が含まれる。最も十分に検討された種の修飾としては、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート（ＭｅＰ）およびホスホロジチオエート（ＰＳＳ）結合をはじめとするヌクレオシド内結合の変更がある。オリゴヌクレオチドの修飾はそのヌクレアーゼ活性を変化させるだけでなく、例えばそれらの細胞の取り込み、ＲＮアーゼＨの活性化、ならびにそれらの標的核酸との結合の強度および特異性など、その他のオリゴヌクレオチド特性も変化させることが強調されるべきである。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を決定するためにしばしば用いられる血清中における修飾オリゴヌクレオチドの安定性が、細胞内活性の唯一の決定子ではないことに留意すべきである(P.D．Cook in“Antisense Research and Applications”，Crooke and Lebleu，Eds.，CRC Press，Boca Raton，1993，Chap.9，p149 et seq.)。ホスホロチオエート（ＰＳ）で修飾オリゴヌクレオチドは、最も広く用いられている種の修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるＰＳ結合の位置決定のために以下の方策が開発されている。（１）ホスホロチオエートおよびホスホジエステルヌクレオシド内結合の置換得られた全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＰＯ−オリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼに対してずっと安定であった(Monia et al．J．Biol．C hem．1996，271，14533)。例えばエンドヌクアーゼによる全ＰＳオリゴヌクレオチドの分解は、ＰＯオリゴヌクレオチドに対して２〜４５倍まで遅くなる(Stein et al．Nucleic Acids Res．1988，16，3209)。クセノプス・オオシテス(Xenop us oocytes)において、マイクロインジェクションされたＰＯオリゴヌクレオチドの分解は半減期３０分で進行するが、全ＰＳオリゴヌクレオチドは同条件下で３時間を越える半減期を有する(Woolf et al．Nucleic Acids Res．1990，18，1 763)。全ＰＳオリゴヌクレオチドはＲＮアーゼＨを活性化する能力を保持している。全ＰＳオリゴヌクレオチドの主な欠点は、それらの標的核酸と安定なハイブリッド形成する能力が要されること、さらにそれらはしばしば非特異的な「非アンチセンス」作用を起こすということことである(Monia et al．Biol．Chem．19 96，271，14533)。（２）ホスホチオエートおよびホスホジエステルヌクレオシド内結合の双方を含むオリゴヌクレオチド全ＰＳオリゴヌクレオチドで認められる非アンチセンス作用を解決する努力において、ホスホチオエートおよびホスホジエステルヌクレオシド内結合の双方を含むオリゴヌクレオチドが合成され、安定性および生物学的活性に関して試験された。 Ghosh et al．(Anticancer Drug Design 1993，8，15)は、種々のパーセンテージのＰＳ結合を含むＰＳ−ＰＯオリゴヌクレオチドを記載している。それらの構造は、例えばパターン（ＰＳ−ＰＯ−ＰＯ−ＰＯ）_n、（ＰＯ−ＰＯ−ＰＳ）_n 、（ＰＳ−ＰＯ）_n、［（ＰＯ）₂−（ＰＳ）₂］_n、［ＰＯ−ＰＳ−ＰＳ］_nに従う。彼らは、in vitroにおける選択的翻訳阻害には少なくとも５０％のＰＳ結合含量が要求されること、またＰＳ含量が５０％末満の場合は劇的に活性が低下することを教示している。より最近では、同じ配列の全ＰＳオリゴヌクレオチドおよび「末端がキャップされた」ＰＯ−ＰＳオリゴヌクレオチド（下記参照）が高い活性がある場合、パターン（ＰＳ−ＰＯ）_nで配置される５０％ＰＳ結合を含むオリゴヌクレオチドはアッセイ系で生物学的活性を示さないことが実証されている(Monia et al.，J．Biol．Chem．1996，271，14533)。（３）オリゴヌクレオチドの５'および／または３'末端における１、２もしくは３つのヌクレオシド架橋がホスホロチオエート修飾されている場合の「末端がキャップされた」オリゴヌクレオチド（「ギャップ技術」としても知られる）。この種の修飾は、主としてオリゴヌクレオチドをエンドヌクレアーゼによる分解から保護するよう設計されている。特にオリゴヌクレオチドの３'末端での修飾は、血清中に最も存在量の多いヌクレアーゼである３'エンドヌクレアーゼからの保護を付与するので望ましい(Uhlmann and Peyman，Chem．Rev．1990，90，543) 。方策間の興味深い類似がHoke et al.(Nucleic Acids Res．1991，19，5743)で見出されている。著者らは細胞培養におけるＨＳＶ−１に対するある範囲のアンチセンスＰＳ−オリゴヌクレオチドの活性を比較している。彼らの発見は、全ＰＳオリゴヌクレオチド同様、３'または３'＋５'末端がキャップされたオリゴヌクレオチド（各々の場合で最初の３つのヌクレオシド内結合が修飾されている）血清中のヌクレアーゼによる分解に対し十分に保護されることを確かなものとしている。これに対し、内部修飾された（３つのＰＳ架橋）オリゴヌクレオチドおよび５'末端だけがキャップされた（ここでも最初の３つのヌクレオシド内結合が修飾されている）オリゴヌクレオチドは急速に分解される。これに対し著者らは５'末端または３'末端のいずれか、またはいずれもがキャップされていないことが細胞内での活性化に十分であることを見出し、細胞中のヌクレアーゼに対する十分な安定性を達成するためには均一な修飾（全ＰＳ）が要求されるという結論を導いた。さらに最近では、ピリミジンヌクレオシドがオリゴヌクレオチドにおいてヌクレアーゼを最も感受する点であることが発見された(Peyman，A．and Uhlmann，E .，Biol．Chem．Hoppe-Seyler 1996，377，67;EP 0 653 439 A2)。オリゴヌクレオチドのピリミジン位の末端キャップおよびＰＳ保護の組み合わせ（いわゆる「最小修飾」アプローチ）は、それらをヌクレアーゼ分解に対して高度に耐性とするに十分であることが見出された。この種のＰＳ修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドの生物学的活性（単純ヘルペスウイルスに対する）が全ＰＳオリゴヌクレオチドのそれと比較された。それらが分解に対して安定であろうとなかろうと、ＡＯを用いる場合に遭遇する主な問題の１つとして、それらの細胞取り込みが低いことがある。この問題を改善するため多くのアプローチが試みられてきた。これらのアプローチのほとんどには、オリゴヌクレオチドに多様な物質を付着させることが含まれる。修飾としては、オリゴヌクレオチドへのペプチドの付着(Lemaitre，M，et al．Proc．N atl．Acad．Sci．USA 1987，84，648)およびオリゴヌクレオチドへのアルキル鎖またはコレステロールなどの親油残基の付着(Saison-Behmoaras，T．et al．EMB O J．1991，10，1111-1118;Will，D.W．and Brown，T．Tetrahedron Lett．199 2，33，2729)が挙げられる。しかしながら、多くの場合で親油基の導入が、オリゴヌクレオチド配列とは無関係の生物学的作用を引き起こすことが見出された。非特異的作用はコレステロール−オリゴヌクレオチド複合体に関して(Henderson ，G.B．and Stein，C.A．Nucleic Acids Res．1995，23，3726)、またアルキル鎖と結合したオリゴヌクレオチドに関して(Shea，R.G．et al．Nucleic Acids R es．1990，18，3777)報告されている。Saison-Behmoaras et al(EMBO J．1991， 10，1111−1118;WO96/34008)は、３'−ドデカノール部分および５'−アクリジン架橋剤で誘導体化した９量体全ＰＳオリゴヌクレオチド、ならびに変異型Ｈａ− ｒａｓに対するアンチセンスがＴ２４ヒト膀胱癌の細胞増殖を阻害したことを報告している。このオリゴヌクレオチドの増殖抑制活性の、ドデカノール複合体を有さない対応するオリゴヌクレオチドのそれとの比較はなされなかった。ドデカノールオリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、Ｔ２４細胞における非修飾オリゴヌクレオチドのそれの４倍とであると報告された。アクリジン−ドデカノールで修飾されたオリゴヌクレオチドは、非変異Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を有するヒト乳房細胞系統の増殖に影響を及ぼさなかった。この作用はアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列特異性のためか、または細胞取り込みが不十分なためかのいずれかである可能性がある。ヒト乳房細胞系統ではアクリジン−ドデジルオリゴヌクレオチドの取り込みが測定されなかったので、その作用は総てまたは少なくとも幾分かは、オリゴヌクレオチドがヒト乳房細胞系統により取り込まれなかったことによるものであり、かくして細胞増殖における非配列特異的な作用を示す機会がなかった可能性がある。約２０％のヒト腫瘍が３つのｒａｓ遺伝子（Ｈａ−ｒａｓ、Ｋｉ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ）のうちの１つに変異を有しており、これが形質転換された表現型で重要な役割を果たすｐ２１タンパク質の過剰発現をもたらす(bos，T.L．1988 Mutation Res．1988，195，255)。種々の細胞系統における種々のｒａｓ遺伝子の阻害は、ｒａｓ遺伝子が細胞増殖を制御しているということに依存して細胞増殖に作用がないか、または細胞を増殖を阻害するかのいずれかであり得ることが報告されている(Chen et al．J．Biol．Chem.，1996，271，28259-65)。個々のｒａｓ遺伝子の種々の修飾は、正常な細胞増殖に対する影響を最小にしつつ腫瘍増殖を阻害するための１つのアプローチであってよいことが示唆された。Ｈａ− ｒａｓにより誘導される腫瘍の首尾よい治療を考案するアプローチの１つは、Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発現を調節、調整または阻害することである。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、細胞を含まない系において、形質転換培養細胞において(T．Saison-Behmoaras et al．EMBO J．1991， 10，1111-1118;Monia et al．J．Biol．Chem．1996，271，14533)、およびin vi voでｒａｓにより活性化される腫瘍において(Gray，G.D．et al．Cancer Resear ch，1973，53，577)、ｍＲＮＡ発現の特異的インヒビターとして働くことが示されている。野生型においてまたは変異型においてｒａｓ遺伝子の発現を調整するために、 Brown et al.(Oncogene Res．1989，4，243-252)は、Ｂａｌｂ−ｒａｓＰ２１ｍＲＮＡ（ヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子のマウスバージョン）の開始コドン領域に相補的な抗ｒａｓオリゴデオキシリボヌクレオシドメチルホスホネートの使用を提案している。しかしながら、メチルホスホネートは、特にそれらの細胞取り込みの低さなどホスホロチオエートに匹敵するいくつかの主な欠点を示すことがよく知られている。 Monia et al.(J．Biol．Chem．267，19954-19962，1992;WO 92/22651)は、ヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位またはコドン１２までに向けられた全ＰＳアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび種々のパーセンテージのＰＳ結合を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示しているが、それらは細胞取り込みおよびそれらの安定性の低さに関する前記の欠点を有している。 Pirollo et al.(Biochem．Biophys．Research Comm．230，196-201，1997)は、癌細胞の放射線耐性を逆転させるために抗ｒａｓ全ＰＳオリゴデオキシヌクレオチドの使用を提案している。しかしながら、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは前記のような欠点（細胞取り込みの低さ、不安定性）。従って、本発明は、その野生型ならびに変異型のＨａ−ｒａｓ遺伝子の発現を特異的に調節、調整または阻害し、また癌細胞の放射線耐性を逆転させるため、およびＨａ−ｒａｓ遺伝子の異常な発現から起こる症状を治療するために癌細胞の増殖を阻害するために使用できる、その安定性および細胞取り込みを改良するために修飾された、Ｈａ−ｒａｓｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。本発明によればこの問題は、次の配列番号１の配列の修飾オリゴヌクレオチドを提供することにより解決される。［式中、ｘはｏまたはｓであり、Ａは２'−デオキシアデノシンであり、Ｇは２'−デオキシグアノシンであり、Ｃは２'−デオキシシチジンであり、かつＴはチミジンである］。本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは特に以下の配列の１つを有することを特徴とする：［式中、総ての変数ｏ、ｓ、Ｒ、ｍ、ｎおよびｑ、ならびにＡ、Ｇ、ＣおよびＴは前記の意味を有する］。本発明の修飾オリゴヌクレオチドはヒトＨａ−ｒａｓ遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡに相補的である。このオリゴヌクレオチドはＨａ−ｒａｓｍＲＮＡの翻訳開始領域に相補的である。従ってそれは野生型および変異型ｒａｓ発現の双方阻害し、腫瘍細胞の増殖阻害をもたらす。このオリゴヌクレオチドはその安定性および細胞取り込み特性を改良するために修飾されている。このオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる攻撃に対して特に傷つきやすい特定の部位に４〜９個のホスホロチオエート結合を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、３' 末端にて、ホスホジエステル架橋、オリゴエチレングリコールホスホジエステル結合、またはグリセリルエーテルホスホジエステル結合のいずれかを介して供給結合したＣ₈−Ｃ₂₁−アルキル、またはＣ₁−Ｃ₂₁−アルキル、好ましくはＣ₁₆− アルキル鎖で修飾されている。本発明の特に好ましい具体例は、６個のホスホロチオエート結合を含有する配列５'−ＴｓＡｓＴｏＴｏＣｓＣｏＧｏＴｓＣｓＡｓＴ−３'−Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−Ｒ［式中、変数ｏ、ｓ、Ｒ、ｎ、ｍおよびｑ、ならびにＡ、Ｇ、ＣおよびＴは前記の意味を有する］を有する修飾オリゴデオキシヌクレオチドである。Ｒは特に好ましくは、−ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃、−（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃または−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃［式中、ｎは１〜６の整数であり；好ましくはｎは１、２または３である］である。本発明はさらに、修飾オリゴヌクレオチドの製法に関する。好ましくはこのおロゴヌクレオチドは、例１および２で概略を示した標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成される。オスホルチオエート結合は例えばBeaucage試薬を用いる硫化により導入される。驚くべきことに、特にホスホジエステル結合によりオリゴヌクレオチドの３' 末端と結合したグリセロールアルキルエーテル、すなわち基−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ−（ＣＨ₂）_q−ＣＨ₃（ｑは７〜２０の整数である）、特に基−ＣＨ₂ ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃により、オリゴヌクレオチドは最適な生物学的活性のために取り込みエンハンサーとの混合に依存することがなくなることがわかった。オリゴヌクレオチドが取り込みエンハンサーの添加を伴う場合と伴わない場合で同様の生物学的活性を示すことが見出されたのはこれが最初であった。本発明はさらに、修飾オリゴヌクレオチドの製法に関する。好ましくはこのおロゴヌクレオチドは、例１および２で概略を示した標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成される。オスホルチオエート結合は例えばBeaucage試薬を用いる硫化により導入される。前記のような本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、特に医薬としての使用に適している。従って本発明のさらなる目的は、医薬、特に少なくとも１種の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を含有する医薬製剤として使用するための前記のような修飾オリゴヌクレオチドにある。さらに詳しくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の過剰発現および／または突然変異から起こる疾病、または過剰増殖障害から起こる疾病の治療用医薬の製造のために適している。かかる疾病には特に、癌、再狭窄または乾癬がある。ｒａｓ活性化の形質転換は、ＤＮＡレベルでのｒａｓ遺伝子の増幅によるか、またはｍＲＮＡレベルでのｒａｓタンパタ質の過剰発現によりヒトの腫瘍のおよそ１０〜２０％で起こる。ｒａｓ遺伝子はコドン１２、１３または６１での点突然変異より活性化され得る(Barbacid，M．Ann，Rev．Biochem．1987，56，779-8 27);Bos，supra;Lowy，supra)。Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２での点突然変異は、正常に調節されているタンパク質を持続的に活性があるものに変換する。正常なｒａｓタンパタ質機能の調節が失われることは正常型から悪性型の細胞増殖への形質転換にあずかると考えられる。本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、Ｈａ−ｒａｓ遺伝子発現の調節、調整または阻害に特に適している。このオリゴデオキシヌクレオチドはＨａ− ｒａｓｍＲＮＡの翻訳開始領域に相補的である。従ってそれは、野生型と変異型双方のｒａｓ発現を阻害し、その結果、腫瘍細胞の増殖を阻害する。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、その安定性および細胞取り込み特性を改良するためさらに修飾される。このオリゴデオキシヌクレオチドは、特にヌクレアーゼによる攻撃に対して特に傷つきやすい特定の部位に４〜９個、好ましくは６個のホスホロチオエート結合を含む。オリゴデオキシヌクレオチドの細胞取り込みはさらにホスホジエステル架橋、オリゴエチレングリコールホスホジエステル結合、またはグリセリルエーテルホスホジエステル結合のいずれかを介して共有結合したＣ₈−Ｃ₂₁−アルキル基により、またはＣ₁−Ｃ₂₁−アルキル基により改良される。安定性に改良と細胞取り込みの改良により、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドはもはや取り込みエンハンサーとの混合に依存することなく、最適な生物学的活性のために与えられる。従って、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｈａ−ｒａｓ野生型遺伝子とその変異体双方のＨａ−ｒａｓ遺伝子発現の調節、調整または阻害に向けられる医薬の製造に特に適している。Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の突然変異から生じる疾病が癌である場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、癌細胞の増殖を阻害する医薬の製造に特に適している。しかしながら他方、オリゴデオキシヌクレオチドは、特に癌細胞が化学療法に耐性を持つようになった場合、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは癌細胞における化学耐性を逆転させるので、化学療法と併用される抗癌医薬の製造に有利に使用される。従って、本発明のさらなる目的は、癌細胞において化学耐性を逆転させる医薬の製造のための、前記のような修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用にある。特にこの特定の作用のために本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤の有効量を含有する医薬製剤の製造に適している。かかる化学療法として有効な薬剤としては、例えばシス−白金およびその誘導体、好ましくはシス−白金、Ｎ−欠損誘導体、好ましくはシクロホスファミド、トロホスファミドおよびイホスファミド、アジリジン誘導体、好ましくはチオセパ、Ｎ−ニトロソウレア誘導体、葉酸アンタゴニスト、好ましくはメトトレキセート、プリンおよびピリミジン塩基の類似体、好ましくは５−フルオロ− ウラシル、細胞増殖抑制的に有効な抗生物質、好ましくはアドリアマイシン、マイトマイシンおよびダウノルビシン、エストロゲンアンタゴニスト、好ましくはタモシキフェン、ならびにヌクレオシド誘導体、好ましくはＭＤＬ１０１，７３１（（Ｅ）−２'−デオキシ−２'−（フルオロメチレン）シチジン；Cancer Res earch 54，1485−1490，1994）がある。ｒａｓ遺伝子は増殖、分化および腫瘍形成に関する種々の因子のシグナル変換に関与することが知られている。最近の研究は、放射線耐性表現型の発現のシグナル変換経路におけるｒａｓから下流にあるｒａｆ−１癌遺伝子を巻き込んでいる。Ｈａ−ｒａｓの開始コドンに向けられた本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは癌細胞の放射線耐性レベルを逆転させることがわかっている。従って本発明のさらなる目的は、放射線療法と併用する癌治療用医薬の製造のための本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用にある。特に本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、癌細胞の放射線耐性を逆転させる医薬の製造に適している。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、それぞれEP 0 552 767 A2およびEP 0 55 2 766 A2に記載の３'-誘導体化法と組み合わせた１−アルカノールおよびオリゴエチレングリコールモノアルキルエーテル、または例１に記載の固形支持体を用いるグリセリルエーテルホスホジエステル結合を用いて製造される。実施例：例１ホスホジエステル結合により結合したグリセロールヘキサデシルエーテルにより３'末端で機能化されたオリゴヌクレオチドの合成のための固形支持体の合成ＤＬ−ａ−ヘキサデシルグリセロール（１ｍｍｏｌ）を３ｘ５ｍｌの無水ピリジンとの共蒸発により乾燥させ、次いで無水ピリジン（３ｍｌ）に溶かした。この溶液を０℃まで冷却し、４，４'−ジメトキシトリチルクロリド（１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩攪拌した。この反応物を水（１００ｍｌ）の添加によりクエンチし、蒸発乾燥した。残留物をジクロロメタン（２０ｍｌ）に取り、１０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７で３回抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残留物を２ｘ５ｍｌの無水ピリジンとの共蒸発により乾燥させ、次いで無水ピリジン（２ｍｌ）に溶かした。４，４− ジメチルアミノピリジン（１．４ｍｍｏｌ）および無水スクシン（２．１ｍｍｏ１）を加えた。反応物は一晩攪拌した。この反応溶液を蒸発乾燥し、トルエン：ジクロロメタン／１：１で２回共蒸発した。残留物をジクロロメタン（２０ｍｌ）に取り、１０％クエン酸（１１ｍｌ）で抽出し、水（１１ｍｌ）で３回洗浄した。この有機相に２滴のトリエチルアミンを加え、次いでこれを硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。生成物はジクロロメタン中の１−４％メタノール、１％トリエチルアミンの勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物は５１０ｍｇの収量（６２％）で清澄な油状物質として得られた。生成物（０．０５６ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（０．０７ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（０．０５６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かし、アミノプロピル制御多孔質ガラス（ＣＰＧ；５００ｍｇ；５００Å、Ｆｌｕｋａ）に添加した。混合物を４時間振盪し、ＣＰＧを濾去し、次いでメタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。ＣＰＧをＴＨＦ中の無水酢酸／Ｎ−メチルイミダゾールを用い１時間キャップし、濾過し、メタノール、ジクロロメタン、ＴＨＦおよびいえチルエーテルで洗浄した。真空乾燥した後、ジメトキシトリチル基の付加量は８０ｍｍｏｌｇ^-1であるとして測定された。例２オリゴヌクレオチドの合成 Applied Biosystems 394ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystems，Inc.，F oster City，USA)および標準的なホスホルアミダイト化学を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。カップリング後、必要であればBeaucage試薬を用いる硫化によりホスホロチオエート結合を導入し(Iyer et al.，1990)、次いでテトラヒドロフラン中の無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールでキャップした。固形支持体から切断した後、農アンモニアで処理することにより最終的な脱保護をし、オリゴヌクレオチドをゲル電気泳動により精製した。ヘキサデシルで修飾されたオリゴヌクレオチドの合成に関しては、前記例１に記載した固形支持体を用いた。オリゴヌクレオチドは総て陰イオン電子噴霧質量スペクトル法(Fisons Bio-Q)により分析し、総ての場合で計算質量を確認した。例３Ｈａ−ｒａｓｍＲＮＡのin vitro翻訳の阻害９０℃で２分間ともに１0ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、２５ｍＭＫＣｌおよび１ｍＭＤＴＴ中で加熱し、次いで徐々に室温まで冷却することにより、０．０６ｍｇのＲＮＡを適当なオリゴヌクレオチドとアニーリングさせた。翻訳反応混合物（１０μｌ）は、０．０６ｍｇのＲＮＡ、種々の量の（１、５、１０または２０μＭ）のオリゴヌクレオチド、８ＵのＲＮアジンリボヌクレアーゼインヒビター（４０Ｕ／μｌ）(Promega Biotec)、２０μＭのアミノ酸混合物（メチオニンは除く）(Promega Biotec)、０．８ｍＣｉの³⁵Ｓ−メチオニン（＞１０００ｍＣｉ／μＭ、Amersham）、３〜６μｌのヌクレアーゼで処理したウサギ網状細胞溶解物(Primega Biotec)、および１μＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなった。翻訳は３０℃で１時間進行させた。翻訳後、新鮮なインヒビター（０．１ｍｇ／μｌＰＭＳＦ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、３０ｍｌ／μｌアプロチニン、Sigma，Cat.#A6279）を含む１０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を各サンプルに加え、混合物を氷上で２０分間インキュベートした。１．２５ＭトリスＨＣｌｐＨ６．８、６％ＳＤＳ、４０％グリセロール、１２％２−メルカプトエタノールおよび０．００１％ブロムフェノールブルーを含有する７μｌの４ｘＳＤＳサンプル緩衝液を加え、サンプルを５分間煮沸した。各サンプル１０μｌを５〜１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧＥ）における電気泳動に付した。完了したゲルを固定、乾燥し、−８０℃でスクリーンを補強してKodak XAR-5フィルムに露光した。結果：請求のアンチセンスオリゴヌクレオチド５'−ＴｓＡｓＴＴＣｓＣＧＴｓＣｓＡｓＴ−（ＰＯ₂−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃）−３'（ＰＰＳ−Ｃ１６）は、１、５、１０および２０μＭの濃度でそれぞれおよそ１０、４０、５０および８０％までｒａｓｐ２１タンパク質の翻訳を阻害した。センスオリゴヌクレオチド５'−ＡｓＴｓＡｓＧＡＣｓＧＧＡｓＡｓＴｓＡ−（ＰＯ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃）−３'（ＰＰＳ−Ｃ１６− Ｓ）を用いた対照は、その時点で１１％阻害が観察された２０μＭまでは翻訳阻害は示さなかった。このことはＣ１６アルキル鎖がこの系では非配列特異的な作用は示さないことを強く示唆している。例４細胞培養におけるｐ２１ｒａｓタンパク質発現の阻害細胞系統：ヒトＨａ−ｒａｓ（ＲＳ４８５）により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞(Chang et al．Biochemistry 30（1991）8283-86)を試験細胞系統として使用し、Ｈａ−ｒａｓｍＲＮＡの開始コドン領域の最初の１１のヌクレオチドに向けられるオリゴヌクレオチドによる細胞増殖およびｐ２１ｒａｓタンパク質発現の配列特異的阻害を評価した。ＲＳ４８５細胞は熱で失活させた（６５℃で３０分）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびネオマイシン各５０Ｕ／μ ｌ）、およびＬ−グルタミン４ｍＭを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＦｌｏｗＬａｂｓ）で増殖させた。ＲＳ４８５培養細胞のオリゴヌクレオチド処理ＲＳ４８５細胞を６ウェルプレートに播種（ウェルにつき１０５細胞）し、２０〜２４時間後（４０〜６０％集密）、オリゴヌクレオチドで処理した。培地をウェルから除去し、種々の濃度のオリゴヌクレオチドを含む新鮮培地１ｍｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ₂／９５％大気を含む加湿雰囲気中、３７ ℃で２４〜４８時間インキュベートした。ＲＳ４８５培養細胞のオリゴヌクレオチドリポフェクションＲＳ４８５細胞（４０〜６０％集密）をリポフェクチン（商標）試薬および製造者のプロトコール（Life Technologies製）を用い、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。便宜には、種々の濃度のオリゴヌクレオチドを血清フリー培地１００μｌに希釈した。別の管で、リポフェクチンを７μｌ／１００μｌの濃度で血清フリー培地に添加した。室温で３０分後、リポフェクチン溶液１００ μｌをオリゴヌクレオチド溶液１００μｌと混合し、室温でさらに１５分間インキュベートし、血清フリー培地８００μｌと混合した。細胞を血清フリー培地で２回洗浄し、オリゴヌクレオチド−リポフェクチン複合体を含む全溶液（１ｍｌ）で細胞を覆った。６時間後、Ｌ−グルタミン８ｍＭおよび２０％ウシ血清を含有する新鮮培地１ｍｌを添加し、その細胞をさらに３８時間インキュベートした。処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで回収し、細胞タンパク質を抽出した。結果：ＲＳ４８５細胞のｐ２１発現におけるＰＰＳおよびＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドの作用を、リポフェクチンの不在または存在下で比較した（前記）。処理後、全タンパク質を抽出し、ｐ２１レベルをウエスタンブロット解析によって求めた（下記）。リポフェクチン単独ではｐ２１発現に対する作用はなかった。ＰＰＳ−およびＰＰＳ−Ｃ１６リポフェクチン複合体の双方では、１μＭ濃度でほとんど完全にＲＳ４８５細胞のｐ２１発現を阻害した。驚くべきことに、リポフェクチンを含まないＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドは５μＭ濃度で完全にｐ２１発現を阻害した。Ｃ１６修飾されてないないＰＰＳオリゴヌクレオチドは同一濃度で５０％までｐ２１発現を阻害した。次いで、ＲＳ４８５細胞のｐ２１発現に対するＰＰＳ−リポフェクチン複合体およびＰＰＳ−Ｃ１６単独の作用について比較した。ｐ２１レベルは０．２５μ Ｍおよび０．５μＭＰＰＳ−リポフェクチン濃度でそれぞれ、３０％および４３％低下した。顕著なことに、いずれのリポフェクチンも添加しないＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドでは、およそ同レベルの阻害を示し、すなわち０．２５ μＭでは３３％および０．５μＭでは４０％の阻害であった。ｐ２１発現の完全な（１００％）阻害は１μＭ濃度で見られ、このことはリポフェクチン送達によりＰＰＳ−Ｃ１６が介在する阻害が増大しないことを示している。最後に、リポフェクチンの不在下でのＰＰＳおよびＰＰＳ−Ｃ１６によるＲＳ４８５細胞のｐ２１発現の阻害を比較した。ＰＰＳ単独では、５μＭでおよそ５０％阻害を示した。しかしながら、わずか０．７５μＭの濃度で、ＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドはＲＳ４８５細胞のｐ２１発現の６０％近い阻害を示した。例５細胞培養における細胞増殖およびｐ２１ｒａｓタンパク質合成の阻害細胞増殖阻害研究アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞、またはオリゴヌクレオチド −リポフェクチン複合体でトランスフェクトした細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。各ウェルの全タンパク質レベルは分光測光法で測定した。細胞増殖の阻害は、対照のものと比較したオリゴヌクレオチド処理細胞のタンパク質（ｍｇ）比率として評価した。対照はリポフェクチンのみで処理された細胞由来のタンパク質または未処理細胞由来のタンパク質のいずれかであった。ｒａｓタンパク質のウエスタンブロット解析全細胞タンパク質を、新たに添加したインヒビター（ＰＭＳＦ、アプロチニン、オルトバナジウム酸ナトリウム）とともにＲＩＰＡ緩衝液中に細胞を溶解させ、次いでSanta Cruz Biotechnology，Inc.により提供されるプロトコールに従い、２１ゲージの針でホモジナイズすることにより調製した。この抽出物を４℃で２０分間１５，０００ｘｇでの遠心分離により清澄化し、上清のタンパク質濃度を測定した。タンパク質４０μｇを５〜１２．５％ＰＡＧＥでサイズ分画し、ニトロセルロース膜へ電気ブロットした。この膜をＨａ−Ｒａｓ（Ｃ−２０）(San ta Cruz Biotechnology，Inc.)に対する一次抗体とともに、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧとともにインキュベートした。ＥＣＬ化学発光ウエスタンシステム(Amersham，Arlington，Heights，III)を使用して二次プローブを検出した。結果：一連の試験を行い、ＲＳ４８５細胞におけるＰＰＳおよびＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドの配列−配列毒性作用を研究した。図６Ａはリポフェクチン（前記）の存在下でのＰＰＳおよびＰＰＳ−Ｃ１６１〜５μＭでのＲＳ４８５細胞の処理により、細胞増殖が２日間にわたっておよそ３５〜５０％低下することを示している。リポフェクチン単独では、細胞においてわずかな毒性作用（約１５％）がある。ＲＳ４８５細胞（前記）内のｐ２１発現についてのウエスタンブロット解析のＰＰＳおよびＰＰＳ−Ｃ１６による細胞増殖阻害の比較により、オリゴヌクレオチド／リポフェクチン複合体濃度１μＭは、ｐ２１発現を完全に阻害するが、細胞増殖は３５％しか阻害しないことが実証される。図６Ｂはリポフェクチンを含まないＰＰＳ−Ｃ１６がｐ２１発現を６０％まで阻害し、細胞増殖を１１％阻害することを示す（前記）。ＰＰＳは５μＭ濃度で細胞増殖を２２％まで阻害し、その濃度ではｐ２１発現を５０％まで阻害する。図６ＣはＰＰＳを１μＭより高い濃度で使用する場合、リポフェクチンが毒性作用を示し、リポフェクチンを含まないＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドは、０．２５〜１μＭの濃度範囲で、リポフェクチンを含むＰＰＳオリゴヌクレオチドとほぼ同じくらい効果的であることを示している。例６放射線抵抗性の逆転−動物研究アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo抗腫瘍作用ＲＳ５０４細胞は、ＥＪ／Ｔ２４、ヒト膀胱癌から単離したＨａ−ｒａｓ癌遺伝子により形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。５ｘ１０⁵ＲＳ５０４細胞を雌の無胸腺ＮＣｒ−ｎｕマウスに皮下注射することにより腫瘍を誘導した。４８時間後、腫瘍が明確になったとき（〜６ｍｍ³）、部分的にホスホロチオエート化したＣ１６修飾[ＰＰＳ−Ｃ１６］アンチセンス［ＡＳ］またはセンス［Ｓ］オリゴヌクレオチドを直接腫瘍に、腫瘍につき５μＭ溶液（２５０ｐｍｏｌ）５０μｌの濃度で注入した。２４時間後、腫瘍を２．０Ｇｙ線量で照射した（細い矢印、図１を参照）。照射は、集積線量が２０Ｇｙに達するまで、４８時間毎に繰り返した。最初の注入の後、オリゴヌクレオチド注入を４８時間［５０μｌ］、１９２時間［５Oμｌ］、および２４０時間［１００μｌ］で繰り返した（太い矢印、図１を参照）。腫瘍体積をｍｍ³で記録した。対照はオリゴヌクレオチドも注入されず照射もされなかった腫瘍、オリゴヌクレオチドは注入されなかったが照射された腫瘍、およびアンチセンスＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドが注入され照射されなかった腫瘍からなった。腫瘍の増殖ｒａｓ遺伝子は増殖、分化および腫瘍形成に関する種々の因子のシグナル変換に関与することが知られている。最近の研究は、放射線耐性表現型の発現のシグナル変換経路におけるｒａｓから下流にあるｒａｆ−１癌遺伝子を巻き込んでいる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞の放射線耐性レベルを逆転させることがわかっている。オリゴヌクレオチド処理の後、ｒａｓにより誘導された腫瘍における放射線の作用に違いがあるかどうかを決定するため、ヌードマウスにおいてＲＳ５０４により誘導された腫瘍をアンチセンスおよびセンスＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチドで処理した。図１は、観察および処理の１７日間において、放射線と組み合わせたアンチセンスＰＰＳ−Ｃ１６オリゴヌクレオチド処理が腫瘍増殖の阻害に最も効果的であったことを示している。例７細胞培養における放射線耐性の逆転ＰＰＳ−Ｃ１６膀胱（Ｔ２４）癌細胞系統（ＡＴＣＣから入手、Rockville,MD ）での処理による細胞培養における放射線耐性表現型の逆転を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびネオマイシン各５０μｇ／ｍｌ、およびＬ−グルタミン２ｍＭを添加したマッコイの５Ａ培地で維持した。オリゴヌクレオチド処理に関しては、細胞を６ウェルの組織培養プレートに１ｘ１０⁵細胞／ウェルを平板培養した。２４時間後、細胞を約４０〜６０％集密で本質的に製造業者、Life Technologies，Inc.によって提供されるプロトコールを用いて、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、リポフェクチン試薬により促進させた。６時間後、リポフェクチン溶液を除去し、単層をＬ−グルタミン８ｍＭおよび２０％血清を含有する新鮮培地で洗浄した。次いでこの細胞をさらに１６〜１８時間この培地１ｍｌ中でインキュベートした。放射線に対する細胞応答はコロニー生存アッセイにより評価した。各細胞系統の指数増殖単層培養物を前記のようにオリゴヌクレオチドで処理し、その細胞を２４〜４８時間後に回収し、新鮮培地に懸濁し、J.L．Shephard and Associates Mark I照射装置で約３６Ｇｙ／分の線量で¹³⁷Ｃｓγ線の段階的線量を室温で照射した。その後、細胞を希釈し、６ウェルの組織培養プレートにウェルにつき３００〜５０００細胞の濃度で平板培養した。平板培養２〜３日後、細胞に血清０．５ｍｌおよびヒドロコルチゾン５μｇ／ｍｌを添加した。およそ７〜１４日後、細胞を１％クリスタルバイオレットで染色し、コロニー（５０細胞以上の正常な外観の細胞を含んでなる）を計数する。アンチセンス処理した（ＰＰＳ−Ｃ１６）Ｔ２４細胞についてのＤ₁₀値（生存細胞を１０％まで減少させるのに必要な放射線量）は高い抵抗性レベルの５．５（未処理またはセンスで処理したＰＰＳ−Ｃ１６−Ｓ）から放射線感受性であると考えられる線量数値４．５Ｇｙまで下がる。これらの結果は図２に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/519 Ａ６１Ｋ 31/519 31/664 31/664 31/675 31/675 31/704 31/704 33/24 33/24 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者デイビッド、ウィリアム、ウィルドイツ連邦共和国シュバルバッハ、タウヌスシュトラーセ、９アー (72)発明者エスター、チャンアメリカ合衆国メリーランド州、チェビー、チェイス、ベイル、ストリート、7508 (72)発明者キャスリーン、ピローロアメリカ合衆国バージニア州、アーリントン、エヌ．アダムス、ストリート、2001、ナンバー1031 (72)発明者アントニア、レイトアメリカ合衆国バージニア州、アーリントン、エヌ．ロルフ、ストリート、202、アパートメント、ナンバー４

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１の下記配列で示される修飾オリゴデオキシヌクレオチド。［式中、ｘはｏまたはｓであり（ただしｘは４〜９度数でｓに等しく、かつｏはホスホジエステルヌクレオシド内結合を意味し、ｓはホスホロチオエートヌクレオシド内結合を意味する）ＲはＣ₈−Ｃ₂₁−アルキル基、−（ＣＨ₂−ＣＨ₂Ｏ）_n−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₃または−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ−（ＣＨ₂）_q−ＣＨ₃（ここで、ｎは１〜６の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、かつｑは７〜２０の整数である）Ａは２'−デオキシアデノシンであり、Ｇは２'−デオキシグアノシンであり、Ｃは２'−デオキシシチジンであり、かつＴはチミジンである］。２．以下の配列の１つを有する、請求項１記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。［式中、ｏはホスホジエステルヌクレオシド内結合を意味し、ｓはホスホロチオエートヌクレオシド内結合を意味し、ＲはＣ₈−Ｃ₂₁−アルキル基、−（ＣＨ₂−ＣＨ₂Ｏ）_n−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₃または−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ−（ＣＨ₂）_q−ＣＨ₃（ここで、ｎは１〜６の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、かつｑは７〜２０の整数である）Ａは２'−デオキシアデノシンであり、Ｇは２'−デオキシグアノシンであり、Ｃは２'−デオキシシチジンであり、かつＴはチミジンである］。３．下記配列を有する、請求項１または２記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。［式中、ｏはホスホジエステルヌクレオシド内結合を意味し、ｓはホスホロチオエートヌクレオシド内結合を意味し、ＲはＣ₈−Ｃ₂₁−アルキル基、−（ＣＨ₂−ＣＨ₂Ｏ）_n−（ＣＨ₂）_m−ＣＨ₃または−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ−（ＣＨ₂）_q−ＣＨ₃（ここで、ｎは１〜６の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、かつｑは７〜２０の整数である）Ａは２'−デオキシアデノシンであり、Ｇは２'−デオキシグアノシンであり、Ｃは２'−デオキシシチジンであり、かつＴはチミジンである］。４．Ｒが−ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。５．Ｒが−（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。６．Ｒが−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃であり、かつ、ｎが１〜６の整数である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。７．ｎが１である、請求項６記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。８．ｎが２である、請求項６記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。９．ｎが３である、請求項６記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。１０．医薬として使用するための請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。１１．少なくとも１種の請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの有効量を含む医薬製剤。１２．Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の過剰発現および／または突然変異から起こる疾病の治療用医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用。１３．過剰増殖障害から起こる疾病の治療用医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用。１４．疾病が癌である請求項１３記載の使用。１５．放射線療法と併用する請求項１４記載の使用。１６．化学療法と併用する請求項１４記載の使用。１７．疾病が再狭窄である請求項１３記載の使用。１８．疾病が乾癬である請求項１３記載の使用。１９．Ｈａ−ｒａｓ遺伝子発現の調節、調整または阻害に向けられる医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用。２０．癌細胞の増殖を阻害する医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用。２１．癌細胞における放射線耐性を逆転させる医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用。２２．癌細胞における化学耐性を逆転させる医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの使用。２３．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤の有効量を含む、請求項１１記載の医薬製剤。２４．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がシス−白金およびその誘導体からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。２５．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がシス−白金である、請求項２４記載の医薬製剤。２６．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がＮ−欠損誘導体からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。２７．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がシクロホスファミドである、請求項２６記載の医薬製剤。２８．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がトロホスファミドである、請求項２６記載の医薬製剤。２９．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がイホスファミドである、請求項２６記載の医薬製剤。３０．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がアジリジン誘導体からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。３１．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がチオセパである、請求項３０記載の医薬製剤。３２．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がＮ−ニトロソ −ウレア誘導体からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。３３．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤が葉酸アンタゴニストからなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。３４．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がメトトレキセートである、請求項３３記載の医薬製剤。３５．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がプリンおよびピリミジン塩基の類似体からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。３６．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤が５−フルオロ −ウラシルである、請求項３５記載の医薬製剤。３７．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤が細胞増殖抑制的に有効な抗生物質からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。３８．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がアドリアマイシンである、請求項３７記載の医薬製剤。３９．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がマイトマイシンである、請求項３７記載の医薬製剤。４０．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がダウノルビシンである、請求項３７記載の医薬製剤。４１．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がエストロゲンアンタゴニストからなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。４２．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がタモキシフェンである、請求項４１記載の医薬製剤。４３．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がヌクレオシド誘導体からなる群より選択される、請求項２３記載の医薬製剤。４４．少なくとも１種のさらなる化学療法として有効な薬剤がＭＤ１０１，７３１である、請求項４３記載の医薬製剤。４５．ホスホロチオエート結合がBeaucage試薬を用いる硫化によって導入される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。