CN116370491A - 反义寡核苷酸剂在治疗冠状病毒相关疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的药物中的用途，所述反义寡核苷酸剂为反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中的一种或多种；其中，所述反义寡核苷酸由10至30个连接的修饰或未修饰的核苷酸组成，并且具有一段长度至少为8个核苷酸的核苷酸序列A，所述核苷酸序列A与核苷酸序列B实质上反向互补或者完全反向互补，所述核苷酸序列B为AR基因或AR mRNA中的一段核苷酸序列，且核苷酸序列B与核苷酸序列A长度相等；并且，在LNCaP细胞系中，0.2μM浓度的所述反义寡核苷酸剂对AR mRNA显示出50％以上的最大抑制率。

Description

反义寡核苷酸剂在治疗冠状病毒相关疾病中的应用
技术领域
本公开涉及一种反义寡核苷酸剂在治疗冠状病毒相关疾病中的应用。本公开还涉及一种反义寡核苷酸剂治疗和/或预防冠状病毒相关疾病的方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与冠状病毒SARS-CoV-1和MERS-CoV高度相似，是一种有包膜的单链RNAβ属冠状病毒，可导致新冠感染，SARS-CoV-2病毒在近来的传播过程中不断变异。
因此，急需开发一种能够预防或治疗由冠状病毒、特别是SARS-CoV-2病毒的感染引起的疾病或生理状况的药物，尤其是针对COVID-19的药物。进一步地，需要开发一种对于各类冠状病毒、特别是多种SARS-CoV-2病毒变体均能显示出良好抑制效果的药物。
发明内容
本公开意外的发现，通过抑制雄激素受体(AR)基因的表达，可以同时下调TMPRSS2和ACE2的转录水平，降低或阻断SARS-CoV-2病毒进入细胞，随着病毒逐渐被机体清除，可以实现从源头上治疗和/或预防冠状病毒引发的疾病，特别是，例如SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19。由此，发明人作出了如下发明。
在一些实施方式中，本公开提供了抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的药物中的用途，所述反义寡核苷酸剂为反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中的一种或多种；所述反义寡核苷酸缀合物含有反义寡核苷酸和缀合连接至反义寡核苷酸的缀合基团；所述药物组合物含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物以及药学上可接受的载体；所述反义寡核苷酸由10至30个连接的修饰或未修饰的核苷酸组成，并且具有一段长度至少为8个核苷酸的核苷酸序列A，所述核苷酸序列A与核苷酸序列B实质上反向互补或者完全反向互补，所述核苷酸序列B为AR基因或AR mRNA中的一段核苷酸序列，且核苷酸序列B与核苷酸序列A长度相等；并且，在LNCaP细胞系中，0.2μM浓度的所述反义寡核苷酸剂对AR mRNA显示出50％以上的最大抑制率。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防冠状病毒所引起的疾病或生理状况的方法，该方法包括将有效量的抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂给予患有冠状病毒所引起的疾病或生理状况的受试者。
在一些实施方式中，本公开还提供了一种抑制冠状病毒进入细胞的方法，该方法包括将有效量的抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂与所述细胞接触。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
本公开提供的反义寡核苷酸剂具有较高的AR基因抑制活性，同时可以显著降低ACE2和TMPRSS2的转录水平，尤其是，本公开首次发现了本公开提供的靶向AR的反义寡核苷酸剂也能抑制ACE2 mRNA的表达水平。由此，本公开提供的反义寡核苷酸剂可以显著抑制宿主细胞表面SARS-CoV-2病毒的激活蛋白TMPRSS2及进入蛋白ACE2的表达量，从而切断冠状病毒，特别是SARS-CoV-2病毒，进入细胞的途径，进而治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况，例如COVID-19。
本公开提供的反义寡核苷酸剂在体外细胞实验中显示出优异的基因抑制活性。例如，在给药后72h时，0.2μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达90％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达40％，对ACE2 mRNA表达量的抑制率达65％；5μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率更是高达95％以上，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达55％，对ACE2 mRNA表达量的抑制率达80％。并且本公开的反义寡核苷酸剂对AR、TMPRSS2、ACE2 mRNA的抑制作用还显示出剂量依赖效应。
又例如，在二氢睾酮(DHT)作用48h的情况下，本公开的反义寡核苷酸剂可显著抑制AR及TMPRSS2基因的表达水平。DHT刺激条件下，0.2μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达61％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达64％；5μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达86％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达87％。相较于无DHT刺激的组别，添加了DHT的细胞中，本公开的反义寡核苷酸剂对AR，尤其是对TMPRSS2的表达抑制显著降低。
又例如，无论是否存在DHT，本公开的反义寡核苷酸剂可显著抑制雄激素非依赖性细胞C4-2B LNCaP中的AR及TMPRSS2基因的表达水平。不含DHT的情况下，本公开提供的反义寡核苷酸剂对C4-2B LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达66％-86％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达46％-75％。DHT刺激条件下，本公开提供的反义寡核苷酸剂对C4-2BLNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达45％-87％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达34％-76％。
更为令人意外的是，本公开提供的反义寡核苷酸剂对22RV1细胞中AR全长及其剪接变体(如AR-V7)的mRNA和蛋白均具有显著的抑制作用，对于AR同一细胞表达的TMPRSS2mRNA同样有强烈抑制。在DHT刺激条件下，本公开提供的反义寡核苷酸剂对AR全长形式的mRNA抑制率达65％-93％，对AR-V7 mRNA抑制率达63％-93％，对TMPRSS2 mRNA的抑制率达39％-59％。在不含DHT的情况下，本公开的反义寡核苷酸剂以剂量依赖性方式降低在完全培养基中培养的22RV1细胞中的全长和剪接变体形式的AR蛋白水平，二者均表现出显著的抑制作用，说明本公开的反义寡核苷酸剂可以治疗非雄激素依赖激活的AR-TMPRSS2/ACE2通路驱动的冠状病毒相关疾病的患者。
癌症患者，尤其是去势抵抗性前列腺癌患者，常检测到AR变异，本公开的反义寡核苷酸剂可以在治疗AR变异导致的癌症的同时，有效治疗或预防冠状病毒感染；或者在治疗AR变异且患有冠状病毒相关疾病的患者的同时，有效治疗AR变异导致的癌症。比如，本公开提供的反义寡核苷酸剂在恩杂鲁胺耐药的LMR细胞中，可以显著抑制AR及TMPRSS2基因的表达，其中，5μM的反义寡核苷酸剂对AR mRNA的抑制率达70％-90％，对TMPRSS2 mRNA的抑制率达40％-50％；并且可以剂量依赖性地抑制AR蛋白的表达。由此表明，对于恩杂鲁胺耐药的癌症患者且不幸患有冠状病毒相关疾病的人群，可以使用本公开的反义寡核苷酸剂，同时治疗所述癌症和冠状病毒感染。
最令人惊喜的是，本公开提供的反义寡核苷酸剂在感染了SARS-COV-2病毒的小鼠体内，能够强效抑制病毒表达，10mg/kg的反义寡核苷酸仅3次滴鼻给药，对染毒小鼠肺部组织中病毒RNA载量的抑制率高达87％以上，对气管组织中病毒RNA载量的抑制率高达98％以上，显示出良好的制药前景。
再者，本公开提供的反义寡核苷酸剂在患有转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者中的I期临床试验研究NCT02144051显示，月剂量900mg在5组29患者中表现出良好的耐受性表明本公开提供的反义寡核苷酸具有良好的安全性。
综上所述，本公开提供的反义寡核苷酸剂在不含或者含有DHT刺激的条件下，在雄激素依赖性细胞、雄激素非依赖性细胞、表达雄激素剪接变体的细胞、以及恩杂鲁胺耐药的细胞中均可以有效抑制TMPRSS2和ACE2基因的表达。宿主细胞表面SARS-CoV-2病毒的激活蛋白TMPRSS2及进入蛋白ACE2被显著抑制，从而切断冠状病毒，特别是SARS-CoV-2病毒进入细胞的途径，进而有效治疗和/或预防由SARS-CoV-2病毒引起的相关疾病症状，具有良好的医用前景。靶向AR的反义寡核苷酸已在染毒小鼠体内证实了其强大的抑制SARS-CoV-2病毒表达的能力。对于非雄激素依赖激活的AR-TMPRSS2/ACE2通路驱动的人群，包括过度表达、突变、剪接变体如AR-V7等，可以实现其在治疗冠状病毒相关疾病方面未被满足的医疗需求。
附图说明
图1是经不同浓度的ASO 1孵育后，LNCaP细胞中AR、TMPRSS2、ACE2mRNA相对表达水平的柱状图。
图2是在不含DHT的情况下，经不同浓度的ASO 1孵育后，LNCaP细胞中AR、TMPRSS2mRNA相对表达水平的柱状图。
图3是在DHT刺激条件下，经不同浓度的ASO 1孵育后，LNCaP细胞中AR、TMPRSS2mRNA相对表达水平的柱状图。
图4是经不同浓度的ASO 1处理后，在完全培养基中培养的22RV1细胞中的全长(AR-FL)和剪接变体(AR-V7)形式的雄激素受体蛋白以浓度依赖性降低的蛋白印迹图。
图5是经不同浓度的ASO和恩杂鲁胺处理后，LMR细胞中AR mRNA相对表达水平的柱状图。
图6是经不同浓度的ASO和恩杂鲁胺处理后，LMR细胞中TMPRSS2mRNA相对表达水平的柱状图。
图7是经不同浓度的ASO处理后，LMR细胞中的全长(AR-FL)形式的雄激素受体蛋白以浓度依赖性降低的蛋白印迹图。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，本公开提及的术语是本领域中熟知并且通常使用的术语。除非另外指明，以下术语具有如下含义：
“SARS-CoV-2病毒”，指引起COVID-19的新型冠状病毒及其变体中的一种，所述变体指SARS-CoV-2病毒基因突变后的病毒，包括但不限于目前已知的令人担忧的变异毒株(VOC，variant of concern)Alpha、Beta、Gamma、Delta以及值得关注的变异毒株(VOI，variant of interest)Eta、Lota、Kappa、Lambda，代表性世系(lineage)有SARS-CoV-2B.1.1.7、SARS-CoV-2B.1.351、SARS-CoV-2P.1、SARS-CoV-2B.1.617.2、SARS-CoV-2B.1.525、SARS-CoV-2B.1.526、SARS-CoV-2B.1.617.1、SARS-CoV-2C.37、SARS-CoV-2A.23.1、SARS-CoV-2B.1.427、或SARS-CoV-2B.1.429。这些已知的变异毒株以及尚未发现的变异毒株，与原始毒株相比，其刺突蛋白均能被人细胞膜表面的跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)激活，进而使病毒的刺突蛋白更容易与同在细胞膜表面的血管紧张素转移酶2(ACE2)结合。凡是具有上述特性的能引起COVID-19的新型冠状病毒及其变体均是本公开所述的SARS-CoV-2病毒。
“SARS-CoV-1病毒”，指引起SARS(严重急性呼吸综合征，非典型性肺炎)的冠状病毒及其变体中的一种。
“MERS-CoV病毒”，指引起MERS(中东呼吸综合征)的冠状病毒及其变体中的一种。
“冠状病毒”，指SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV中的一种或多种。
“反义寡核苷酸剂”，指能够通过氢键与靶核酸杂交的单链寡聚核苷酸链，包括反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物。
“靶核酸”，指能够被反义寡核苷酸靶向的核酸。
“靶基因”，指编码靶标的基因。
“靶标”，指其调节的是所希望的蛋白质。
“靶向”，指设计和选择反义寡核苷酸的过程，该反义寡核苷酸能与靶核酸特异性杂交并诱导希望的效应。
“杂交”，指互补的核酸分子的退火。在一些实施方式中，互补的核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸和靶核酸。
“设计”，指设计反义寡核苷酸与选择的核酸分子特异性杂交的过程。
“缀合”，指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接。
“缀合物”，指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。
“反义寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至反义寡核苷酸上而形成的化合物。
“缀合分子”，可通过反应缀合至反义寡核苷酸链，最终形成本公开的反义寡核苷酸缀合物的特定化合物。
“核苷酸”，含有磷酸基团、核糖基团和碱基。由核糖基团和碱基构成核苷。
“骨架”，又称磷酸骨架，在一个寡核苷酸链中，由糖基和核苷间连接(internucleoside linkage)构成了骨架。
“修饰的核苷酸”，包含核糖基经修饰的核苷酸和碱基经修饰的核苷酸。
“核苷间连接”，指两个连接的核苷(linked nucleoside)之间的化学键。
“核糖基经修饰的核苷酸”，指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氢基团取代形成的核苷酸。
“碱基经修饰的核苷酸”，指核苷酸的核糖基1'位的基团不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、或胸腺嘧啶的核苷酸。
“核苷酸类似物”，包含桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)、无环核苷酸、异核苷酸。
“双环核苷酸”，一种桥联的核苷酸，连接其5至7元环糖基(包括但不限于呋喃糖基)上任意两个非相邻原子形成的桥，构成了该核苷酸类似物的双环结构。在一些实施方式中，双环核苷酸是连接呋喃糖基2'-O,4'-C的BNA；在一些实施方式中，双环核苷酸是连接呋喃糖基非2'-O,4'-C的其他种类的BNA。
“异核苷酸”，指糖基和核苷间连接不同于自然存在的核糖基和磷酸二酯键连接的核苷酸类似物。包含异核苷酸反义寡核苷酸具有较好的反义活性。
“连接的核苷酸”，“连续核苷酸”，指彼此紧邻的核苷酸，紧邻的两个核苷酸之间不存在其他介入要素。
“反向互补”，可与“互补”互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
“实质上反向互补”，指两段核苷酸序列之间存在1个或2个的碱基错配；“完全反向互补”，指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
“核苷单体”，nucleoside monomer，指根据欲制备的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
“嵌合反义寡核苷酸”，指具有至少2个化学上不同的区域的反义寡核苷酸，每个区域都具有多个核苷酸。
“缺口区段”，指反义寡核苷酸内部的一个区域，该区域具有多个核苷酸，可供RNaseH切割，位于两个具有一个或多个核苷酸的外部区域之间。该内部区域的核苷酸在化学上不同于与外部区域的核苷酸。该内部区域称为“缺口区段”，外部区域称为“翼”。
“5'翼区段”，指反义寡核苷酸外部的一个区域，5'翼区段的3'末端与缺口区段的5'末端相连。
“3'翼区段”，指反义寡核苷酸外部的一个区域，3'翼区段的5'末端与缺口区段的3'末端相连。
“区域”，指具有至少一个可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的部分。
“区段”，指靶核酸内的区域的较小或亚部分。
“抗雄激素剂”，指作为雄激素合成抑制剂或雄激素受体阻断剂的治疗类小分子化合物。
“受试者”，指任何动物，包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、马、驴、牛、绵羊和任何种类的家禽。
“给予”、“施与”、或“给药”，指向受试者引入本公开提供的反义寡核苷酸剂以完成其预期功能的途径，可以使用的给予途径包括但不限于胃肠外给予，例如皮下、静脉内、或肌肉注射或输注。
“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将反义寡核苷酸剂给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
“反义活性”，指可归因于反义寡核苷酸与其靶核酸杂交的任何可检测或可测量活性，包括但不限于靶mRNA或靶标蛋白的表达量的下降。
“基因表达”，指基因的编码信息转化成在细胞中存在和运行的结构，包括但不限于转录和翻译产物。
“抑制表达或活性”，指表达或活性的降低、阻断并且未必指示表达或活性的完全消除。
“约”，指在某值的±7％内。例如，如果指明“这些反义寡核苷酸剂对AR mRNA的抑制率约为80％”，则意指AR mRNA抑制率在73％至87％的范围内被抑制。
“任选的”或“任选地”，指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代”的“烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
“烷基”，指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
“烯基”，指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
“羟基保护基团”，本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2d ed，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本公开可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本公开可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4″-三甲氧基三苯甲基)。
反义寡核苷酸剂的用途
在一个方面，本公开提供了一种抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的药物中的用途，所述反义寡核苷酸剂为反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中的一种或多种；所述反义寡核苷酸缀合物含有反义寡核苷酸和缀合连接至反义寡核苷酸的缀合基团；所述药物组合物含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物以及药学上可接受的载体；其中，所述反义寡核苷酸由10至30个连接的修饰或未修饰的核苷酸组成，并且具有一段长度至少为8个核苷酸的核苷酸序列A，所述核苷酸序列A与核苷酸序列B实质上反向互补或者完全反向互补，所述核苷酸序列B为AR基因或AR mRNA中的一段核苷酸序列，且核苷酸序列B与核苷酸序列A长度相等；并且，在LNCaP细胞系中，0.2μM浓度的所述反义寡核苷酸剂对AR mRNA显示出50％以上的最大抑制率。
在一些实施方式中，所述冠状病毒可以是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV中的一种或多种。在一些实施方式中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方式中，所述冠状病毒引起的疾病或生理状况可以是SARS、COVID-19、MERS中的一种或多种。在一些实施方式中，所述冠状病毒引起的疾病或生理状况是COVID-19。
以下，为方便起见，在本公开中也将能够适合用于本公开的用途的反义寡核苷酸剂称为“本公开的反义寡核苷酸剂”。
适合用于本公开的用途的反义寡核苷酸含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
在本公开的上下文中，“实质上反向互补”，指两段核苷酸序列之间存在1个或2个的碱基错配；“完全反向互补”，指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在本公开的上下文中，AR基因指人雄激素受体基因，具有Genbank登录号NG_009014.2取其4990-191588区域的核苷酸片段所示的序列或者具有Genbank登录号NT_011669.17取其5079000-5270000区域的核苷酸片段所示的序列。AR mRNA包括但不限于表1中所示的Genbank登录号代表的序列。
表1.AR mRNA
Figure SMS_1
上述Genbank登录号代表的序列可在NCBI网站上查询，例如NG_009014.2披露地址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/350606318。
AR基因编码的蛋白质具有3个主要功能域：N端域、DNA结合域和雄激素结合域。该蛋白质作为类固醇激素激活的转录因子起作用。在与激素配体结合后，受体与辅助蛋白分离，转移到细胞核中，二聚化，然后刺激雄激素应答基因的转录。该基因的突变与某些疾病相关，例如完全雄激素不敏感(complete androgen insensitivity，CAIS)。选择性剪接产生编码不同亚型的多个转录本变体，包括但不限于表1中所示的转录本变体。在剪接过程中，存在若干剪接变体，包括但不限于表1中所示的剪接变体。AR-V7是在癌症患者中检测到的主要的AR剪接变体。
反义寡核苷酸
在一些实施方式中，用于本公开的用途的反义寡核苷酸剂是反义寡核苷酸。通过本公开的反义寡核苷酸中所述核苷酸序列A与靶核酸中所述的核苷酸序列B实质上反向互补或完全反向互补，实现反义寡核苷酸与靶核酸的特异性结合，根据不同的通路特性，最终均可产生很高的反义活性。例如经RNaseH的靶核酸的切割，或将导致通过RISC通路的靶核酸的切割或翻译阻遏，或者通过空间位阻导致转录终止、剪接过程发生变化或终止，最终抑制AR基因表达，阻断冠状病毒进入细胞，实现治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况。因此，只要能够实现反义寡核苷酸中所述核苷酸序列A与靶核酸中所述核苷酸序列B的特异性结合，并抑制AR基因的表达，所述核苷酸序列B可以位于靶核酸的任何位置，例如可以位于内含子区，也可以位于外显子区。
因此，在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸与AR基因或AR mRNA中的一段核苷酸序列实质上反向互补或者完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列A的长度为12至22个核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列A的长度为16至20个核苷酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列A由表2中所示的SEQ ID NO:1-167中的任意一个序列中的连续16至20个核苷酸组成。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸由核苷酸序列A组成。由此，在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸的长度为12至22个核苷酸。在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸的长度为16至20个核苷酸。在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸的长度为16或20个核苷酸时，具有更高的反义活性。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸具有表2中所示的SEQ ID NO:1-167中任意一个所示的序列。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:24，28，32，113，139，144，158或164中任意一个所示的序列。
表2.反义寡核苷酸具有的核苷酸序列
Figure SMS_2
Figure SMS_3
Figure SMS_4
其中，a、t、g和c各自表示每个核苷酸的碱基组成，并且每个核苷酸独立地为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个核苷间连接为修饰的核苷间连接。这些修饰的核苷酸基团和/或修饰的核苷间连接(即，修饰的磷酸基团、修饰的核糖基团和修饰的碱基)不会导致所述反义寡核苷酸调节靶基因表达的功能明显削弱或丧失。另一方面，这些修饰可能使得本公开的反义寡核苷酸可以抵抗内源的核酸酶降解，增加寡核苷酸链在血浆、组织和细胞中的稳定性，使反义寡核苷酸足够稳定，能够到达并进入表达AR基因的目标细胞，接触靶核酸，并与之作用，使反义寡核苷酸保持较高的靶基因抑制活性。这些修饰还可以增加寡核苷酸链与靶核酸的亲和力，使二者结合得更强，进一步提高杂交双链的稳定性，实现较高的反义活性。
目前，本领域存在多种可用于修饰反义寡核苷酸的方式，例如骨架修饰(磷酸基团和核糖基团同时修饰)、磷酸基团修饰、核糖基团修饰、碱基修饰等(例如，请参见C.FrankBennett et.al,Pharmacology of Antisense Drugs.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol,2017,57:p15.1–15.25，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸至少一个核苷间连接为修饰的核苷间连接，所述修饰的核苷间连接可以选自硫代磷酸酯连接(phosphorothioate linkage)、氨基磷酸酯连接(phosphoramidate linkage)、硫代氨基磷酸酯连接(thiophosphoramidatelinkage)中的一种。这些修饰可以使得反义寡核苷酸中的磷酸二酯键连接对核酸酶的稳定性提高，增加反义寡核苷酸在体内的作用时间，提高利用率。
在一些实施方式中，所述硫代磷酸酯连接为两个核苷间的磷酸二酯键中的非桥磷酸氧原子被硫原子取代而形成的化学键；在一些实施方式中，所述硫代磷酸酯连接为具有如式(1)所示结构的核苷间连接：
Figure SMS_5
在一些实施方式中，所述氨基磷酸酯连接为两个核苷间的磷酸二酯键中位于核糖环3'位的氧原子被氨基原子取代而形成的化学键；在一些实施方式中，所述氨基磷酸酯连接为具有如式(2)所示结构的核苷间连接：
Figure SMS_6
在一些实施方式中，所述硫代氨基磷酸酯连接为两个核苷间的硫代磷酸酯键中位于核糖环3'位的氧原子被氨基原子取代而形成的化学键；在一些实施方式中，所述硫代氨基磷酸酯连接为具有如式(3)所示结构的核苷间连接：
Figure SMS_7
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的每一个核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的每一个核苷间连接均为氨基磷酸酯连接。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的每一个核苷间连接均为硫代氨基磷酸酯连接。
这些核苷间连接中非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，使得反义寡核苷酸全链带负电。含有硫代磷酸酯连接的反义寡核苷酸具有良好的水溶性和稳定性，且易于大量合成，半衰期也更长，从而满足临床治疗的需要。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述修饰的核苷酸为核糖基经修饰的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基经修饰的核苷酸指核苷酸中核糖环上的2'-OH被非氢基团取代的核苷酸，是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸中的一种。这些核糖环2'位的修饰可以极大地增强寡核苷酸的类药物特性(drug-like properties)。该位置的修饰使得糖基组织得更像RNA构型，增强了反义寡核苷酸与靶核酸的结合亲和力。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为2'-O-甲氧基修饰(2'-OMe)的核苷酸，如式(4)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰(2'-MOE)的核苷酸，如式(5)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰(2'-NH2)的核苷酸如式(6)所示。在一些实施方式中，2'-氟修饰(2'-F)的核苷酸如式(7)所示：
Figure SMS_8
核苷酸类似物指能够在核酸中代替天然核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是桥联的核苷酸(BNA)、无环核苷酸或异核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA(constrainedethyl BNA)或其他种类的双环核苷酸，其中，LNA如式(8)所示，ENA如式(9)所示，(S)-cETBNA如式(10)所示：
Figure SMS_9
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(11)所示，GNA如式(12)所示：
Figure SMS_10
上述式(11)和式(12)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸，是指糖基和核苷间连接不同于自然存在的核糖基和磷酸二酯键连接的核苷酸类似物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是肽核酸(Peptide nucleic acid，简称PNA)，如式(13)所示，或磷酰二胺吗啡啉(Phosphorodiamidate Morpholino，简称PMO)，如式(14)所示。
Figure SMS_11
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为PNA。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的每一个核苷酸均为PNA。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为PMO。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的每一个核苷酸均为PMO。当每一个核苷酸为同一种本公开所述的异核苷酸时，反义寡核苷酸链呈电中性。
在一些实施方式中，含有2'-O-甲氧基乙基修饰(2'-MOE)的核苷酸、(S)-cET BNA的反义寡核苷酸具有更强的稳定性和靶向性，并且通常具有更低的毒性。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为碱基经修饰的核苷酸。包含碱基经修饰的反义寡核苷酸可能具有更高的与AR mRNA的亲和力。在一些实施方式中，所述碱基经修饰的核苷酸为5-甲基胞嘧啶核苷酸。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸中的每一个胞嘧啶核苷酸均为5-甲基胞嘧啶核苷酸。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸中的嘧啶碱基为5-甲基胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方式中，反义寡核苷酸链中还含有无碱基核糖核苷酸，所述无碱基核苷酸可降低反义寡核苷酸与AR mRNA的结合亲和力。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。具有这种修饰的反义寡核苷酸可以在循环系统中留存更长的时间，并且提高反义活性。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如式(15)所示结构：
Figure SMS_12
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolutionof oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
Figure SMS_13
其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(15)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(16)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(18)所示。
在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸包含DNA区域，即缺口(gapmer)区段，和连接在该区域外侧的一个或两个翼(wing)区段，该翼区段含有核糖环2'位修饰的核糖核苷酸。具有这种结构的反义寡核苷酸可更好地响应RNaseH对AR mRNA的切割。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸由缺口区段、5'翼区段和3'翼区段组成，所述缺口区段的5'末端与所述5'翼区段的3'末端相连，所述缺口区段的3'末端与所述3'翼区段的5'末端相连；所述缺口区段由7至15个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段和所述3'翼区段分别由2至7个连接的核糖核苷酸组成，且每个核糖核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为20个核苷酸长度，所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，所述3'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由9个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由8个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由8个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由8个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEtBNA和cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由7个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由2个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由6个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEtBNA和cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为16个核苷酸长度，所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEtBNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ IDNO:24，28，32，113，139，144，158或164中任意一个所示的序列；该反义寡核苷酸由缺口区段、5'翼区段和3'翼区段组成，所述缺口区段的5'末端与所述5'翼区段的3'末端相连，所述缺口区段的3'末端与所述3'翼区段的5'末端相连；所述缺口区段由7至10个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段由3至7个连接的核糖核苷酸组成，所述3'翼区段由2至5个连接的核糖核苷酸组成，且每个核糖核苷酸独立地选自2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸或cETBNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 1，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:24所示的序列；所述缺口区段由9个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 2，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:28所示的序列；所述缺口区段由9个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 3，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:28所示的序列；所述缺口区段由8个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 4，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:28所示的序列；所述缺口区段由8个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 5，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:28所示的序列；所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cET BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 6，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:24所示的序列；所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由6个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 7，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:32所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 8，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:113所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 9，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:139所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 10，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:144所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 11，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:158所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸为ASO 12，由16个连接的核苷酸组成，并具有SEQ ID NO:164所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方式中，在LNCaP细胞系中，0.2μM浓度的本公开的反义寡核苷酸剂对AR mRNA显示出至少50％、60％、70％、80％、90％、95％的最大抑制率。所述最大抑制率是指，给予本公开的反义寡核苷酸剂后，细胞内AR mRNA在显示出抑制效果的全部时间内能达到的最大抑制率。可以使用本领域技术人员已知的标准方法(例如本公开实验例1或实验例2中所述的方法)测量AR mRNA的抑制率。
本公开的反义寡核苷酸具有低毒、良好的安全性与动物的可耐受性。在一些实施方式中，通过与施予生理盐水的动物组相比，施予本公开的反义寡核苷酸的动物组血液中ALT或AST值的增加不高于4倍、3倍或2倍，或没有增加。在一些实施方式中，通过与施予生理盐水的动物组相比，施予本公开的反义寡核苷酸的动物组的肝重、脾重或肾脏的重量的增加不高于30％、20％、15％、10％、5％、2％，或没有增加。
靶向AR基因或AR mRNA的反义寡核苷酸还可以具有CN108300718A中所述的反义寡核苷酸，包括但不限于第0110-0237段所述的反义化合物或组合物，这些反义寡核苷酸及其效果(参见该公开实施例1-34)，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
本公开的反义寡核苷酸可以通过本领域常规的寡核苷酸链的制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，亚磷酰胺法固相合成已经有成熟的商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的反义寡核苷酸中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入反义寡核苷酸的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
反义寡核苷酸缀合物
在一些实施方式中，用于本公开的用途的反义寡核苷酸剂是反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物含有上述本公开的反义寡核苷酸以及缀合连接至该反义寡核苷酸的缀合基团。一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团和任选的接头(linker)，并且，所述反义寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述反义寡核苷酸分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。反义寡核苷酸与缀合基团的缀合位点可以在反义寡核苷酸链的3'端或5'端，还可以在反义寡核苷酸链的内部序列中。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸与缀合基团的缀合位点在反义寡核苷酸链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在反义寡核苷链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在反义寡核苷的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharanet.al.siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencingin vivo in hepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.使用相同的方法将缀合基团与反义寡核苷酸共价相连，只是用本公开的反义寡核苷酸链替代上述文献中的siRNA一条链即可。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使反义寡核苷酸成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在反义寡核苷酸的链，从而尽量降低缀合对反义寡核苷酸活性的影响。
在一些实施方式中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。通过将反义寡核苷酸缀合连接至所述能够与细胞表面受体结合的配体，可以实现反义寡核酸的药代动力学特性改变，和/或提高反义寡核苷酸在体内特定组织和细胞处的特异性递送，增加组织和细胞对反义寡核酸药物的吸收效率。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是反义寡核苷酸给药领域常规使用的配体。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是能够与冠状病毒在细胞表面的受体结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的反义寡核苷酸递送至靶细胞。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是靶向肺细胞表面的受体的配体，在一些实施方式中，至少一个靶向基团是能够靶向ACE2的配体。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是多肽，例如透膜肽；或者小分子配体，例如WO2019010274A1表6中列举的靶向基团，或WO2019089765A1中描述的各种靶向基团(如[0094]段中描述的编号为Structure 1-Structure 37的配体)，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
本公开的发明人意外发现，含有本公开的反义寡核苷酸的反义寡核苷酸缀合物表现出较高的反义活性，具有治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况、特别是新型冠状病毒感染(COVID-19)的潜在前景。
可以采用任意合理的合成路线制备本公开的反义寡核苷酸缀合物。例如，对于包含靶向基团和可与亚磷酰胺发生反应而形成共价连接的活性反应基团的缀合分子，可先将该缀合分子中的活性基团用保护剂保护后，连接至固相载体，随后通过亚磷酰胺固相合成方法，按照反义寡核苷酸链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向逐一连接核苷单体，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；分离出反义寡核苷酸链，从而获得本公开的反义寡核苷酸缀合物。
进一步地，反义寡核苷酸缀合物的制备也可参照已有文献的公开内容进行。例如，WO2015168514A1在实施例1-15中描述了将具有特定结构的接头和靶向配体经反应依次连接至核苷的方法，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
药物组合物
在一些实施方式中，用于本公开的用途的反义寡核苷酸剂是药物组合物，所述药物组合物含有上述本公开的反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物作为药物活性成分以及药学上可接受的载体。
所述药物组合物中，对反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物与药学上可接受的载体的含量没有特别要求。在一些实施方式中，反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)；在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
所述药学上可接受的载体可以是核酸药物领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbonnanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(2-氨基乙基乙烯磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylenephosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所示脂质体制剂中使用的药物上可接受的载体包含有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可以分别选自CN103380113A中所描述的含胺的转染化合物(包括但不限于化合物1-87)或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种，通过引用的方式将CN103380113A整体并入本文。
在一些实施方式中，所述含有本公开的反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。在一些实施方式中，所述药物组合物所制成的制剂在给药过程中的剂量会因给药方式的不同而发生调整。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺部、或通过喷雾经肺部给药到其它脏器组织(如肝脏)、或通过口咽吸入、或鼻腔给药等方式递送所述含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物用于喷雾给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开的反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物替代现有的药物活性成分即可。
药学上可接受的盐或酯
本公开的反义寡核苷酸包括单链的寡核苷酸链或其药学上可接受的盐或酯。本公开的反义寡核苷酸缀合物包括反义寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐或酯。含有本公开的反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物包括任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐。
所述药学上可接受的盐包括但不限于钠盐、钾盐和铵盐。本公开的反义寡核苷酸剂中，核苷间连接，例如磷酸二酯键连接、硫代磷酸酯连接、氨基磷酸酯连接、硫代氨基磷酸酯连接，其非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，可以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH4+，有机胺阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一种实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K+和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开的反义寡核苷酸剂可以至少部分以盐的形式存在。在一种实施方式中，核苷间连接中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开的反义寡核苷酸剂以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本公开的反义寡核苷酸剂在被施与受试者后，能够直接或间接提供生物上具有活性的代谢物或其残余物。因此，本公开也涉及反义寡核苷酸剂在药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐、以及其他生物等效物。所述前药可包括在一条反义寡核苷酸链的一端或两端掺入另外的核苷酸，经受试者体内的内源性核酸酶切割后，形成具有反义活性的药物活性成分。
治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的方法
在一个方面，本公开提供了一种治疗和/或预防冠状病毒所引起的疾病或生理状况的方法，其中，该方法包括将有效量的本公开的反义寡核苷酸剂给予患有冠状病毒所引起的疾病或生理状况的受试者。
在一些实施方式中，所述冠状病毒可以是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV中的一种或多种。在一些实施方式中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方式中，所述冠状病毒引起的疾病或生理状况可以是SARS、COVID-19、MERS中的一种或多种。在一些实施方式中，所述冠状病毒引起的疾病或生理状况是COVID-19。
通过将本公开的反义寡核苷酸剂给予有需要的受试者，可以通过其反义活性抑制AR基因表达，进而抑制受试者中ACE2和/或TMPRSS2基因的表达水平，从而阻断冠状病毒、特别是SARS-CoV-2进入细胞的途径，达到治疗和/或预防冠状病毒所引起的疾病或生理状况的目的。因此，本公开的反义寡核苷酸剂可用于治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况。换句话说，本公开的反义寡核苷酸剂可用于制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的药物。
本公开所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本公开的反义寡核苷酸剂定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将本公开的反义寡核苷酸剂放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多反义寡核苷酸剂递送至特定位点；而全身给药导致将本公开的反义寡核苷酸剂递送至受试者的基本体循环。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。考虑到本公开旨在提供治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的手段，在一些实施方式中采用能够将药物递送至肺部的给药方式。
本公开所述的反义寡核苷酸剂的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指能引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。在一些实施方式中，根据给药方式的不同对所述反义寡核苷酸剂所制成的制剂在给药过程中的剂量进行调整。
在给予本公开所述的反义寡核苷酸剂时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或30-45g的ob/ob小鼠，以反义寡核苷酸的量计：在一些实施方式中为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-15mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-10mg/kg体重。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为1-500mg/周，以寡核苷酸的量计。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为10-200mg/周。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为50-100mg/周。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为每周约1mg、约5mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约300mg、约400mg或约500mg。在一些实施方式中，在施用周期内，基于受试者的体重选取合适量的反义寡核苷酸剂施与受试者。在一些实施方式中，使用Devine公式将体重计算为理想体重(Manjunath PPai and Frank P Paloucek,The Origin of the“Ideal”Body Weight Equations.AnnPharmacother,2000,34:1066-1069)，根据受试者的体重换算出施用周期内应施与的反义寡核苷酸剂的量。在一些实施方式中，对一定体重范围内的受试者给予相同或相近的量的反义寡核苷酸剂。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的施用频率可以为每天、每三天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的施用频率为每周施用一次。所述施用频率是指给药的时间间隔，即两次给药之间所需的时间。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂施用周期可以为1天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂施用周期为1-4周。所述施用周期，即给药周期，是指为了达到某种治疗效果所需要的给药时长，即在一个疗程中，第一次给药与最后一次给药之间所需的时间。
在一些实施方式中，所述受试者的ACE2和/或TMPRSS2基因的表达水平被敲低。
在一些实施方式中，所述受试者为男性。在一些实施方式中，所述受试者还患有癌症。在一些实施方式中，所述受试者患有前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌或膀胱癌。在一些实施方式中，所述受试者患有去势抵抗性前列腺癌。“去势抵抗性前列腺癌”，指前列腺癌对雄激素剥夺疗法或抗雄激素剂的敏感性降低。
在一些实施方式中，所述受试者AR基因过度表达、突变、或为剪接变体，如AR-V7。在一些实施方式中，所述受试者对抗雄激素剂有抗性，所述“对抗雄激素剂有抗性”指对抗雄激素剂的敏感性降低，例如使用相同剂量的同一抗雄激素剂，雄激素的作用效果降低，或者为达到相同的雄激素作用效果，需要使用显著更高剂量的该抗雄激素剂。
所述抗雄激素剂可以选自氟他胺(Flutamide)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、尼鲁他胺(Nilutamide)、托吡鲁胺(Topilutamide)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、阿帕鲁胺(Apalutamide)、达洛鲁胺(Darolutamide)、普克鲁胺(Proxalutamide)、加来特龙(Galeterone)、阿比特龙(Abiraterone)、AZD3514、SHR-3680中的一种或多种。
联合治疗
为了在更短的时间内实现治疗目的，减少药物用量，进而减少毒副作用，可以向受试者施与联合药物，所述联合药物含有一种或多种本公开的反义寡核苷酸剂。
在一些实施方式中，所述联合药物中，含有一种或多种本公开的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，所述联合药物中，含有一种或多种本公开的反义寡核苷酸缀合物。在一些实施方式中，所述联合药物中，含有一种或多种本公开的药物组合物。在一些实施方式中，所述联合药物中，含有一种或多种本公开的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物和/或药物组合物。
在一些实施方式中，所述联合药物中还含有一种或多种第二药物活性成分，例如前述抗雄激素剂、furin抑制剂和/或类视黄醇X受体(retinoid X receptor)拮抗剂。所述第二药物活性成分能够增加本公开的反义寡核苷酸的抑制效果，或者与本公开的反义寡核苷酸共同阻止冠状病毒进入细胞。从而，本公开的反义寡核苷酸剂与第二药物活性成分制成联合药物，可用于治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况。即，本公开的反义寡核苷酸剂与第二药物活性成分可用于制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的药物。在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸剂是药物组合物，所述药物组合物还包含上述第二药物活性成分。
在一些实施方式中，所述本公开的反义寡核苷酸剂和所述第二药物活性成分能够协同地治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况，特别是COVID-19。在一些实施方式中，所述联合药物在治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况所需的治疗有效量小于单独一种药物活性成分的治疗有效量。在一些实施方式中，与单独的本公开的反义寡核苷酸剂以及单独的第二药物活性成分相比，所述联合药物在治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况，特别是治疗和/或预防COVID-19中，提供了大于单独一种药物活性成分治疗相应病症的加和作用。在一些实施方式中，所述联合药物可以降低单独一种药物活性成分带来的毒副作用。
在一些实施方式中，所述第二药物活性成分是抗雄激素剂。在一些实施方式中，所述抗雄激素剂可以选自氟他胺(Flutamide)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、尼鲁他胺(Nilutamide)、托吡鲁胺(Topilutamide)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、阿帕鲁胺(Apalutamide)、达洛鲁胺(Darolutamide)、普克鲁胺(Proxalutamide)、加来特龙(Galeterone)、阿比特龙(Abiraterone)、AZD3514、SHR-3680中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述第二药物活性成分是furin抑制剂。在一些实施方式中，所述furin抑制剂可以选自αl-PDX、无环迷你PDX(Acyclic mini-PDX)、环化迷你PDX(Cyclic mini-PDX)、OMTKY3(变体A15R、T17K、L18R)、6R、D6R、D9R、H5N1衍生肽、Ac-RXXT-NH2、H2N-C8-RXXT、氯甲基酮(chloromethylketone)、癸酰基-精氨酸-缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-氯甲基酮(Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketone)、TACE抑制剂、萘基荧光素(Naphthofluorescein)、苯乙酰基-精氨酸-缬氨酸-精氨酸-4-脒基苄基酰胺(phenylacetyl-Arg-Val-Arg-4-amidinobenzylamide)中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述第二药物活性成分是类视黄醇X受体拮抗剂。在一些实施方式中，所述类视黄醇X受体拮抗剂可以选自LG100754、AGN195393、Ro26-5405、LG101506、PA451、PA452、BI-1003、BI-1005、SR11179、UV3003、Danthron、大黄酸(Rhein)、β-Αρο-13-胡萝卜素(β-Αρο-13-carotenone)、R-依托度酸(R-Etodolac)、硫化舒林酸(Sulindacsulfide)、K-80003、K-8008、雷公藤内酯(Triptolide)、TRC4、NSC-640358、氟伐他汀(Fluvastatin)、匹伐他汀(Pitavastatin)、ΗX531中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述联合药物中，反义寡核苷酸剂以固定剂量的形式存在，例如一支注射剂中，所述反义寡核苷酸剂的固定剂量为1-500mg、10-200mg或50-100mg。在一些实施方式中，此类联合药物中包含固定剂量约1mg、约5mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约300mg、约400mg或约500mg的任一种的本公开的反义寡核苷酸剂，所述反义寡核苷酸剂包括但不限于如下反义寡核苷酸ASO 1、ASO 2、ASO 3、ASO 4、ASO 5、ASO 6、ASO 7、ASO 8、ASO 9、ASO 10、ASO 11或ASO 12，含有这些反义寡核苷酸的缀合物、含有这些反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述第二药物活性成分，如抗雄激素剂、furin抑制剂、类视黄醇X受体拮抗剂，在联合药物中以固定剂量的形式存在，例如一支注射剂、一片口服片剂或一粒胶囊中，所述联合药物中含有固定重量的第二药物活性成分。在一些实施方式中，此类联合药物中所述第二药物活性成分的固定剂量为上述具体药物的常规剂量。在一些实施方式中，此类联合药物中所述第二药物活性成分的固定剂量为上述具体药物常规剂量的1/2、1/3、1/4、1/5或1/10。
在一些实施方式中，在施用周期内，选取含合适的固定剂量的反义寡核苷酸剂和含合适的固定剂量的第二药物活性成分的联合药物施与受试者，不限于受试者的体重。在一些实施方式中，使用Devine公式将体重计算为理想体重(Manjunath P Pai and Frank PPaloucek,The Origin of the“Ideal”Body Weight Equations.Ann Pharmacother,2000,34:1066-1069)，根据受试者体重换算出施用周期内应施与的联合药物的量。在一些实施方式中，所述第二药物活性成分是抗雄激素剂。所述合适的固定剂量为该药物活性成分的有效量。
在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂与所述第二药物活性成分的用量比(以重量计)为1:(1-1000)。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂与所述第二药物活性成分的用量比(以重量计)为1:(1-5)。
在一些实施方式中，在施与联合药物时，所述反义寡核苷酸剂的用量为1-500mg/周，以寡核苷酸的量计。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为10-200mg/周。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为50-100mg/周。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的用量为每周约1mg、约5mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约300mg、约400mg或约500mg。
在一些实施方式中，在施与联合药物时，所述反义寡核苷酸剂的施用频率可以为每天、每三天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂的施用频率为每周施用一次。
在一些实施方式中，在施与联合药物时，所述反义寡核苷酸剂施用周期可以为1天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年。在一些实施方式中，所述反义寡核苷酸剂施用周期为1-4周。
在一些实施方式中，在施与联合药物时，所述第二药物活性成分的用量为其常规剂量。在一些实施方式中，所述第二药物活性成分的用量为其常规剂量的1/2、1/3、1/4、1/5或1/10。
在一些实施方式中，在施与联合药物时，所述第二药物活性成分的施用频率可以为每天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。在一些实施方式中，所述第二药物活性成分的施用频率为每天施用一到四次。
在一些实施方式中，在施与联合药物时，所述第二药物活性成分施用周期可以为1天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年。在一些实施方式中，所述第二药物活性成分施用周期为2-4周。
在一些实施方式中，有效量的本公开的反义寡核苷酸剂和有效量的第二药物活性成分同时给予受试者。在一些实施方式中，有效量的本公开的反义寡核苷酸剂和有效量的第二药物活性成分在不同的时间给予受试者。在一些实施方式中，先给予有效量的第二药物活性成分，再给予有效量的本公开的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，先给予有效量的本公开的反义寡核苷酸，再给予有效量的第二药物活性成分。
在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸剂和第二药物活性成分在单一配制品中一起配置。在一些实施方式中，本公开的反义寡核苷酸剂和第二药物活性成分分开进行配制。在一些实施方式中，所述第二药物活性成分是抗雄激素剂。
抑制冠状病毒进入细胞的方法
在一个方面，本公开还提供了一种抑制冠状病毒进入细胞的方法，该方法包括将有效量的本公开的反义寡核苷酸剂与所述细胞接触，从而将本公开的反义寡核苷酸剂导入所述细胞，通过发挥反义寡核苷酸的反义活性达到抑制AR基因表达的目的，进而抑制所述细胞中ACE2和/或TMPRSS2基因的表达水平。通过降低ACE2和/或TMPRSS2基因的表达，切断冠状病毒进入细胞的途径，从而阻止病毒进入细胞。由于对冠状病毒进入细胞而言，上述途径是必需的，因此本公开的方法可以抑制各种冠状病毒进入细胞，特别是对于SARS-CoV-2病毒的各种变体均有同样优异的进入细胞的抑制作用。
在一些实施方式中，所述细胞可以选自鼻腔中分泌粘液的杯状细胞(secretorygoblet cells)、肺部的Ⅱ型肺泡细胞(type II pneumocytes)、吸收性肠上皮细胞(absorptive enterocyte)、转移性人前列腺癌细胞(LNCaP)的一种或多种。
在一些实施方式中，所述冠状病毒可以是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV中的一种或多种。在一些实施方式中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
采用本公开提供的方法抑制AR基因在细胞中表达，所需本公开的反义寡核苷酸剂的用量一般是这样的量：其足以减少靶基因AR的表达，进而足以降低所述细胞的ACE2和/或TMPRSS2基因的表达水平，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM、或0.05nM至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送途径(局部还是全身)等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
在一些实施方式中，为了加强抑制冠状病毒进入细胞，该方法包括将有效量的本公开的反义寡核苷酸剂和有效量的第二药物活性成分与所述细胞接触。在一些实施方式中，所述第二药物活性成分为抗雄激素剂。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR、蛋白印迹等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))所记载的方法进行。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
实验数据均以平均数±标准差
Figure SMS_14
表示，数据分析采用Graphpad prism8.0或5.0统计分析软件。
制备例1合成ASO 1、ASO 5和对照NC
ASO 1，靶向AR基因(NG_009014.2或NT_011669.17)内含子区，由16个连接的核苷酸组成，并具有TkTkGkATTTAATGGTkTkGkCe(SEQ ID NO:24)所示的序列；所述缺口区段由9个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
ASO 5，靶向AR基因(NG_009014.2或NT_011669.17)内含子区，由16个连接的核苷酸组成，并具有TeGkAkTkTTAATGGTkTkGkCeAe(SEQ ID NO:28)所示的序列；所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cET BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
对照NC，不具有已知的人类靶标序列，由16个连接的核苷酸组成，并具有GkGkCkTACTACGCCGTkCkAk(SEQ ID NO:168)所示的序列；所述缺口区段由10个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，所述3'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEt BNA；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
其中，大写字母C、G、A、T表示核苷酸的碱基组成；小写字母k表示该字母k左侧相邻的一个核苷酸为cEt BNA；小写字母e表示该字母e左侧相邻的一个核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；下划线表示该下划线上的核苷酸为核糖核苷酸；未加下划线显示的表示该核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
用于固相合成的各种核苷单体及原料均为市售商品。其中，2'-O-甲氧基乙基修饰的5-甲基胞嘧啶核苷单体(5-Me-DMT-2'-O-MOE-C(Ac)-CE-Phosphoramidite，目录号为PR3-017)、5-甲基胞嘧啶核苷单体(5-Me-DMT-dC(Ac)-CE-Phosphoramidite，目录号为PD3-009)、2'-O-甲氧基乙基修饰的胸腺嘧啶核苷单体(DMT-2'-O-MOE-T-CE-Phosphoramidite，目录号PR4-002)、2'-O-甲氧基乙基修饰的腺嘌呤核苷单体(DMT-2'-O-MOE-A(Bz)-CE-Phosphoramidite，目录号PR1-004)购自上海兆维科技发展有限公司；cET修饰的胸腺嘧啶核苷单体(cEt-T-0)、cET修饰的鸟嘌呤核苷单体(cEt-G-0)、cET修饰的腺嘌呤核苷单体(cEt-A-0)、cET修饰的5-甲基胞嘧啶核苷单体(cEt-MeC-0)来源于康龙化成(北京)新药技术股份有限公司的定制化服务。
通过固相亚磷酰胺法，利用通用固相载体(UnyLinkerTM loaded
Figure SMS_15
HLSolid Supports，Kinovate Life Sciences公司)起始合成，按照SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:168所示序列的核苷酸排布顺序自3'-5'方向逐一连接核苷单体，合成反义寡核苷酸链ASO 1或NC。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、硫化、盖帽四步反应。合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为100:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑(5-(Ethylthio)-1H-tetrazole，ETT)的0.5M乙腈溶液。
每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液，其中CapA为20体积％的N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；CapB为20体积％的乙酸酐的乙腈溶液。盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干获得反义寡核苷酸链，其中，
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，过滤去除剩余载体，将上清液真空浓缩至干。
纯化与脱盐条件如下：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，实现核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)，以去离子水洗脱。
检测方法如下：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测上述反义寡核苷酸链的纯度，使用液质联用(LC-MS)分析分子量。实测值与理论值相符，表明所合成的是ASO 1、ASO 5及NC。
实验例1ASO 1在LNCaP细胞中对AR、TMPRSS2、ACE2 mRNA的抑制检测
通过LNCaP前列腺癌细胞对不同浓度的反义寡核苷酸的自由摄取，检测ASO 1对AR、TMPRSS2和ACE2基因的表达抑制效果。
用含有10体积％胎牛血清(FBS，RMBIO公司)的RPMI 1640培养基(MACGENE公司)，于37℃在含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中培养LNCaP细胞(购自美国模式菌种收集中心)。
用1×PBS(pH 7.4)将制备例1中获得的ASO 1分别配置成5mM、1mM、0.2mM的工作液。
将LNCaP细胞以1×105细胞/孔接种于12孔板中，每孔含500μl RPMI1640培养基。
细胞贴壁生长16h后，分别从5mM、1mM及0.2mM的ASO 1工作液里吸取0.5μL加入12孔板的一个培养孔中，ASO 1的终浓度分别为5μM、1μM及0.2μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。
相同浓度的ASO 1分别加入2个不同的培养孔中，记为测试组1-3。在另外的2个培养孔中，不加ASO 1，只培养细胞，记为空白对照组。
将含有或不含ASO 1的细胞置于含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中继续培养72h，使细胞自由摄取ASO 1。
随后，使用Trizol(货号T9424，购自Sigma公司)根据说明书总RNA提取的操作步骤提取各孔细胞中的总RNA。
对于每孔细胞，取1μg总RNA作为反转录的模板，使用反转录试剂盒ReverseTranscription System(货号A3500，购自Promega公司)提供的试剂，其中选取Oligo(dT)15作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μl，对每孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：将反转录反应体系置于42℃孵育15min，然后95℃孵育5min，最后4℃孵育5min，反应结束后，向反转录反应体系加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，取上述含cDNA的溶液10μl作为qPCR的模板，使用上述Reverse Transcription System试剂盒提供的试剂配置qPCR反应体系100μl。以每一反转录反应体系获得的cDNA溶液作为模板配置4份qPCR反应体系，每一个qPCR反应体系扩增一种基因，其中，用于扩增目标基因AR、TMPRSS2、ACE2和内参基因β-actin的PCR引物序列如表3所示，每条引物的最终含量为50pmol。将qPCR反应体系置于ABI StepOnePlusTM Real-TimePCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因和内参基因的产物W。产物W随即依次经过95℃1min，55℃30s，95℃30s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因和内参基因的溶解曲线，得到各个目标基因和内参基因的Ct值。
表3：检测引物的序列
Figure SMS_16
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组和对照组中目标基因的表达量进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组均值)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组均值)
其中，ΔCt(对照组均值)是空白对照组2个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，每个测试组的每一个培养孔均对应一个ΔΔCt(测试组)，对照组的每一个培养孔均对应一个ΔΔCt(对照组)。
以对照组为基准，对测试组目标基因mRNA的表达水平进行归一化，定义对照组目标基因mRNA表达水平为100％，
测试组目标基因mRNA相对表达水平＝2^(-ΔΔCt(测试组))×100％，
测试组目标基因mRNA的抑制率＝1-测试组目标基因mRNA相对表达水平。
在不同浓度ASO 1的作用下，LNCaP细胞中三个目标基因AR、TMPRSS2、ACE2 mRNA的相对表达水平如图1所示。
由图1可以看出，给药后72h，三个目标基因AR、TMPRSS2、ACE2 mRNA呈现剂量依赖式地降低。0.2μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达90％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达40％，对ACE2 mRNA表达量的抑制率达65％；1μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达91％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达44％，对ACE2 mRNA表达量的抑制率达75％；5μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达95％以上，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达55％，对ACE2 mRNA表达量的抑制率达80％。本公开提供的反义寡核苷酸剂不仅能够有效抑制AR mRNA的表达水平，同时能够有效抑制TMPRSS2和ACE2的mRNA表达水平。由此，宿主细胞表面SARS-CoV-2病毒的激活蛋白TMPRSS2及进入蛋白ACE2的翻译被显著抑制，从而切断冠状病毒，特别是SARS-CoV-2病毒，进入细胞的途径，进而治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况。
实验例2ASO 1在不同试验条件下，对LNCaP细胞中AR、TMPRSS2mRNA的抑制检测
通过在不含和含有二氢睾酮(DHT)刺激条件下，LNCaP前列腺癌细胞(雄激素依赖性细胞)对不同浓度的反义寡核苷酸的自由摄取，检测ASO 1对AR及TMPRSS2基因的表达抑制效果。
用含有10体积％胎牛血清(FBS，货号10082-147，购自Invitrogen公司)的RPMI1640培养基(货号11875-092，购自Invitrogen公司)，于37℃在含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中培养LNCaP细胞(购自美国模式菌种收集中心)。
用DEPC化水将制备例1中获得的ASO 1及NC分别配置成0.5mM、0.1mM、0.02mM及0.004mM的工作液。
在不含DHT的情况下，将LNCaP细胞以5×103细胞/孔接种于I型胶原涂层96孔板(货号354407，购自BD公司)中，每孔含100μl RPMI 1640培养基(货号11875-092，购自Invitrogen公司)。细胞贴壁生长16h后，分别从0.5mM、0.1mM、0.02mM及0.004mM的ASO 1或NC工作液里吸取1μL加入96孔板的一个培养孔中，ASO 1或NC的终浓度分别为5μM、1μM、0.2μM及0.04μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。
对于DHT刺激条件，在不同浓度ASO孵育前，先在添加了10％活性炭处理FBS(货号12676011，购自Invitrogen公司)且不含酚红的RPMI 1640(货号11835-030，购自Invitrogen公司)中培养LNCaP细胞24小时，以去除培养基中任何的雄激素。与不含DHT条件的接种细胞密度一样，铺板，使细胞继续培养于10％活性炭处理FBS且不含酚红的RPMI1640培养基中，16h后，向各孔培养基中加入1nM DHT(货号A8380，购自Sigma公司)和上述不同浓度的ASO 1或NC工作液，使其终浓度分别为5μM、1μM、0.2μM及0.04μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。
相同浓度的ASO 1分别加入2个不同的培养孔中，记为测试组1-4；相同浓度的NC分别加入2个不同的培养孔中，记为对照组1-4；不含DHT的情况下，未给药的2个培养孔，记为空白组；DHT刺激条件下，未给药但给予DHT刺激的2个培养孔，记为空白组。
将含有不同浓度的ASO 1和不同浓度的NC的细胞置于含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中继续培养48h，使细胞在不含或含有DHT刺激条件下，自由摄取ASO 1或NC。
随后，使用RNeasy 96试剂盒(货号74182，购自Qiagen公司)根据说明书总RNA提取的操作步骤提取各孔细胞中的总RNA。使用EXPRESS One Step
Figure SMS_17
qRT-PCR试剂盒(货号11781-200，购自Life Technologies公司)按照说明书进行反转录，配置qPCR反应体系，并在ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR仪上，使用一步法进行实时PCR。使用表4中的Taqman引物/探针组检测目标基因AR、TMPRSS2与内参基因β-actin mRNA的Ct值，采用比较Ct(ΔΔCt)法，计算各测试组和对照组相对于空白组中目标基因mRNA的相对表达水平。在不同条件下，各测试组和对照组中目标基因mRNA的相对表达水平见图2和图3。
表4：检测引物/探针的序列
Figure SMS_18
由图2和图3可以看出，在不含和含有二氢睾酮(DHT)刺激条件下，本公开的反义寡核苷酸剂均可以剂量依赖性降低LNCaP前列腺癌细胞中的AR及TMPRSS2基因表达水平，特别是在DHT刺激条件下，本公开的反义寡核苷酸剂可显著抑制AR及TMPRSS2基因的表达水平。不含DHT的情况下，0.2μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达50％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率为25％；5μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达93％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达51％。DHT刺激条件下，AR TMPRSS2/ACE2通路被激活，0.2μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达61％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达64％；5μM浓度的本公开提供的反义寡核苷酸剂对LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率高达86％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达87％。由此说明本公开的反义寡核苷酸剂可以治疗雄性激素依赖激活的AR-TMPRSS2/ACE2通路驱动的新冠病毒感染患者。
实验例3ASO 1在不同试验条件下，对C4-2B细胞中AR、TMPRSS2 mRNA的抑制检测
通过在不含和含有二氢睾酮(DHT)刺激条件下，C4-2B LNCaP细胞(雄激素非依赖性细胞)对不同浓度的反义寡核苷酸的自由摄取，检测ASO 1对AR及TMPRSS2基因的表达抑制效果。
用含有10体积％胎牛血清(FBS，货号10082-147，购自Invitrogen公司)的T培养基(货号0020056DJ，购自Invitrogen公司)，于37℃在含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中培养C4-2B LNCaP细胞(购自MD Anderson Cancer Center,Houston,TX)。
用DEPC化水将制备例1中获得的ASO 1及NC分别配置成0.5mM、0.1mM、0.02mM及0.004mM的工作液。
不含DHT的情况下，将C4-2B LNCaP细胞以5×103细胞/孔接种于I型胶原涂层96孔板(货号354407，购自BD公司)中，每孔含100μl RPMI 1640培养基(货号11875-092，购自Invitrogen公司)。细胞贴壁生长16h后，分别从0.5mM、0.1mM、0.02mM及0.004mM的ASO 1或NC工作液里吸取1μL加入96孔板的一个培养孔中，ASO 1或NC的终浓度分别为5μM、1μM、0.2μM及0.04μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。
对于DHT刺激条件，在不同浓度ASO孵育前，先在添加了10％活性炭处理FBS(货号12676011，购自Invitrogen公司)且不含酚红的RPMI 1640(货号11835-030，购自Invitrogen公司)中培养C4-2B LNCaP细胞24小时，以去除培养基中任何的雄激素。与不含DHT条件的接种细胞密度一样，铺板，使细胞继续培养于10％活性炭处理FBS且不含酚红的RPMI 1640培养基中，16h后，向各孔培养基中加入1nM DHT(货号A8380，购自Sigma公司)和上述不同浓度的ASO 1或NC工作液，使其终浓度分别为5μM、1μM、0.2μM及0.04μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。
相同浓度的ASO 1分别加入2个不同的培养孔中，记为测试组1-4；相同浓度的NC分别加入2个不同的培养孔中，记为对照组1-4；不含DHT的情况下，未给药的2个培养孔，记为空白组；DHT刺激条件下，未给药但给予DHT刺激的2个培养孔，记为空白组。
将含有不同浓度的ASO 1和不同浓度的NC的细胞置于含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中继续培养48h，使细胞在不含或含有DHT刺激条件下，自由摄取ASO 1或NC。
随后，使用RNeasy 96试剂盒(货号74182，购自Qiagen公司)根据说明书总RNA提取的操作步骤提取各孔细胞中的总RNA。使用EXPRESS One Step
Figure SMS_19
qRT-PCR试剂盒(货号11781-200，购自Life Technologies公司)按照说明书进行反转录，配置qPCR反应体系，并在ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR仪上，使用一步法进行实时PCR。使用表4中的Taqman引物/探针组检测目标基因AR、TMPRSS2与内参基因β-actin mRNA的Ct值，采用比较Ct(ΔΔCt)法，计算各测试组和对照组相对于空白组中目标基因mRNA的相对表达水平。在不同条件下，通过GraphPad Prism 5软件计算不同浓度的ASO1或NC抑制目标基因表达的IC50值。各测试组和对照组中目标基因mRNA的相对表达水平及ASO 1或NC抑制目标基因表达的IC50值见表5和表6。
表5：ASO 1处理后在完全培养基中培养的C4-2B细胞中的AR及TMPRSS2 mRNA以浓度依赖性降低
Figure SMS_20
表6：ASO 1处理后在添加了DHT的活性碳处理培养基中培养的C4-2B细胞中的AR及TMPRSS2 mRNA以浓度依赖性降低
Figure SMS_21
Figure SMS_22
由表5和表6可以看出，在不含和含有二氢睾酮(DHT)刺激条件下，本公开的反义寡核苷酸剂均可以剂量依赖性降低C4-2B LNCaP前列腺癌细胞中的AR及TMPRSS2基因的表达水平。不含DHT的情况下，本公开提供的反义寡核苷酸剂对C4-2B LNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达66％-86％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达46％-75％，而对照NC对目标基因没有任何抑制作用。DHT刺激条件下，本公开提供的反义寡核苷酸剂对C4-2BLNCaP细胞中AR mRNA表达量的抑制率达45％-87％，对TMPRSS2 mRNA表达量的抑制率达34％-76％。在雄激素非依赖性细胞中，本公开的反义寡核苷酸剂同样可以显著抑制AR和TMPRSS2 mRNA的表达水平，说明本公开的反义寡核苷酸剂可以治疗更广泛的患者人群。
实验例4ASO 1在不同条件下，对22RV1细胞中AR、TMPRSS2表达抑制的检测
通过在不含或含有二氢睾酮(DHT)刺激条件下，借助脂质体向22RV1细胞(可同时表达全长和剪接变体形式的AR)转染不同浓度的反义寡核苷酸，检测ASO 1对靶基因AR全长及剪接变体mRNA与蛋白的抑制效果，以及ASO1对TMPRSS2 mRNA的抑制效果。
用含有10体积％胎牛血清(FBS，货号10082-147，购自Invitrogen公司)的RPMI1640培养基(货号11875-092，购自Invitrogen公司)，于37℃在含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中培养22RV1细胞(购自美国模式菌种收集中心)。
(1)DHT刺激条件下的mRNA实时PCR检测
在不同浓度ASO处理前，先在添加了10％活性炭处理FBS(货号12676011，购自Invitrogen公司)且不含酚红的RPMI 1640(货号11835-030，购自Invitrogen公司)中培养22RV1细胞24小时，以去除培养基中任何的雄激素。
以5×103细胞/孔接种于I型胶原涂层96孔板(货号354407，购自BD公司)中，每孔含100μl 10％活性炭处理FBS且不含酚红的RPMI 1640培养基。
细胞贴壁生长16h后，使用RNAiMax试剂(货号13778150，购自Invitrogen公司)按照供应商说明书将不同浓度的制备例1中获得的ASO 1或NC转染到22RV1细胞中。在96孔板的各孔中，取0.15μl RNAiMax与12.5μl OptiMEM(货号51985-091，购自Invitrogen公司)于室温下混合5分钟，随后分别加入12.5μl以OptiMEM稀释的134nM、40nM、13.4nM的ASO 1或NC，于室温下孵育ASO-脂质混合液15分钟，随后将上述各个ASO-脂质混合液25μl加到100μl细胞培养液中，使ASO终浓度分别为13.4nM、4nM及1.34nM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。转染ASO 4小时后，向各孔细胞加入1nM DHT(货号A8380，购自Sigma公司)。
相同浓度的ASO 1分别加入2个不同的培养孔中，记为测试组1-3；相同浓度的NC分别加入2个不同的培养孔中，记为对照组1-3；未给药但给予DHT刺激的2个培养孔，记为空白组。
将含有不同浓度的ASO 1和不同浓度的NC的细胞置于含5％CO2/95％空气的细胞培养箱中培养48h后，使用RNeasy 96试剂盒(货号74182，购自Qiagen公司)根据说明书总RNA提取的操作步骤提取各孔细胞中的总RNA。使用EXPRESS One Step
Figure SMS_23
qRT-PCR试剂盒(货号11781-200，购自Life Technologies公司)按照说明书进行反转录，配置qPCR反应体系，并在ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR仪上，使用一步法进行实时PCR。使用表4中的Taqman引物/探针组检测目标基因AR(全长、剪接变体)、TMPRSS2与内参基因β-actin mRNA的Ct值，采用比较Ct(ΔΔCt)法，计算各测试组和对照组相对于空白组中目标基因mRNA的相对表达水平。通过GraphPad Prism 5软件计算不同浓度的ASO 1或NC抑制目标基因表达的IC50值。各测试组和对照组中目标基因mRNA的相对表达水平及ASO 1或NC抑制目标基因表达的IC50值见表7。
表7：ASO 1处理后在添加了DHT的活性碳处理培养基中培养的22RV1细胞中的AR全长FL mRNA、剪接变体V7 mRNA及TMPRSS2 mRNA以浓度依赖性降低
Figure SMS_24
由表7可以看出，在二氢睾酮(DHT)刺激条件下，本公开的反义寡核苷酸剂可以剂量依赖性降低22RV1细胞中的AR全长、AR剪接变体及TMPRSS2的表达水平，其中，对AR全长形式的mRNA抑制率达65％-93％，对AR-V7mRNA抑制率达63％-93％，对TMPRSS2 mRNA的抑制率达39％-59％。
(2)不含DHT的情况下的蛋白印迹检测
以5×105细胞/孔接种于I型胶原涂层6孔板(货号354400，购自BD公司)中，每孔含2ml 10％FBS的RPMI 1640完全培养基。
细胞贴壁生长16h后，使用RNAiMax试剂(货号13778150，购自Invitrogen公司)按照供应商说明书将不同浓度的制备例1中获得的ASO 1或NC转染到22RV1细胞中。在6孔板的各孔中，取3μl RNAiMax与250μl OptiMEM(货号51985-091，购自Invitrogen公司)于室温下混合5分钟，随后分别加入250μl以OptiMEM稀释的400nM、134nM、40nM的ASO 1或NC，于室温下孵育ASO-脂质混合液15分钟，随后将上述各个ASO-脂质混合液500μl加到2ml细胞培养液中，使ASO终浓度分别为40nM、13.4nM及4nM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。
ASO 1记为测试组1-3；NC记为对照组1-3；未处理的记为UTC。
转染ASO 48小时后采集细胞，并在添加了复合蛋白酶抑制剂(货号11836170001，购自Roche公司)的RIPA缓冲液(货号R0278，购自Sigma公司)中进行裂解。目标基因AR和内参基因GAPDH抗体分别购自Santa Cruz Biotechnology公司(货号SC-816)和AdvancedImmunochemicals公司(货号06-1-G4-C5)。用
Figure SMS_25
4-12％Bis-Tris凝胶(货号NP0322，购自Life Technologies公司)电泳分离等量的蛋白(25μg/泳道)并转移至PVDF膜(货号LC2002，购自Invitrogen公司)中。膜以AR或GAPDH一抗孵育后，再以辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG(货号SC-2096，购自Santa Cruz Biotechnology)或抗兔IgG(货号SC-2077，Santa Cruz Biotechnology)孵育。使用增强化学发光试剂盒(货号RPN2232，购自Amersham公司)按照说明书描述步骤检测免疫反应性蛋白在膜上的显影情况。
蛋白印迹结果如图3所示，本公开的反义寡核苷酸剂以剂量依赖性方式降低在完全培养基中培养的22RV1细胞中的全长和剪接变体形式的AR蛋白水平，二者均表现出显著的抑制作用。
在表达AR剪接变体的细胞中，在不含DHT刺激和含有DHT刺激的条件下，本公开的反义寡核苷酸剂均可以有效抑制全长和剪接变体形式的AR mRNA，及TMPRSS2 mRNA的表达水平，说明本公开的反义寡核苷酸剂可以治疗非雄激素依赖激活的AR-TMPRSS2/ACE2通路驱动的新冠病毒感染患者。
实验例5ASO 1、ASO 5对LMR细胞中AR、TMPRSS2表达抑制的检测LMR细胞是人工诱导的对恩杂鲁胺耐药的LNCaP细胞，恩杂鲁胺是一种雄激素受体配体结合抑制剂，属于第二代抗雄激素剂，用于治疗去势抵抗性前列腺癌。将LNCaP细胞进行孵育，伴随着渐增浓度的恩杂鲁胺，持续大约6个月。在20μM恩杂鲁胺的存在下充分培养之后选择单克隆。克隆LMR维持了允许在没有脂质介导的转染的情况下自由摄取反义寡核苷酸的能力。
将LMR细胞以1.5×103细胞/孔接种于I型胶原涂层96孔板中，每孔含100μl 10％活性炭处理FBS且不含酚红的RPMI 1640培养基。细胞贴壁生长16h后，分别加入不同浓度的制备例1中获得的ASO 1、ASO 5、NC以及恩杂鲁胺，使得各药物的终浓度为0.04μM、0.2μM、1.0μM、或5.0μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。孵育72h后，使细胞充分地自由摄取各个药物。采用实验例4检测mRNA的方法检测经不同浓度的ASO或恩杂鲁胺处理后，LMR细胞中AR、TMPRSS2 mRNA的相对表达水平，结果如图5、图6所示。
图5、图6显示本公开的反义寡核苷酸剂在恩杂鲁胺耐药的细胞中，可以显著抑制AR及TMPRSS2基因的表达，其中，5μM的反义寡核苷酸剂对AR mRNA的抑制率达70％-90％，对TMPRSS2 mRNA的抑制率达40％-50％。
将LMR细胞以1.5×105细胞/孔接种于I型胶原涂层6孔板中，每孔含2ml 10％活性炭处理FBS且不含酚红的RPMI 1640培养基。细胞贴壁生长16h后，分别加入不同浓度的制备例1中获得的ASO 1、ASO 5、NC，使得各药物的终浓度为0.2μM、1.0μM、或5.0μM，轻轻前后摇动培养板以均匀混合。以未处理的LMR为对照，记为UTC；以未诱导的LNCaP为空白对照。孵育72h后，采用实验例4分析蛋白印迹的方法检测经不同浓度的ASO处理或未处理的细胞中AR蛋白的表达水平，结果如图7所示。
图7显示本公开的反义寡核苷酸剂在恩杂鲁胺耐药的细胞中，可以剂量依赖性地抑制AR蛋白(全长形式)的表达。
由此表明，对于恩杂鲁胺耐药的癌症患者且不幸患有冠状病毒相关疾病的人群，可以使用本公开的反义寡核苷酸剂，同时治疗所述癌症和冠状病毒感染。
实验例6ASO 1在感染SARS-COV-2病毒的人源化ACE2转基因小鼠体内(in vivo)对SARS-COV-2病毒RNA的抑制效果
本实验在生物安全3级(BSL3)密闭实验室中进行。
具体地，在12孔板中，分别使用依次10倍稀释的病毒株(BetaCoV/wuhan/AMMS01/2020)感染Vero细胞，在37℃下，在添加有2％FBS(PAN Biotech)、1％青链霉素双抗(GIBCO)以及1％HEPES缓冲液(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)中培养1小时，并在添加2％FBS和1％低熔点琼脂糖(Promega)的DMEM培养基中继续培养细胞2天，用4％甲醛水溶液固定细胞并使用0.2％结晶紫水溶液染色噬菌斑进行病毒滴定，确定病毒液的病毒滴度。使用生理盐水稀释病毒液，得到病毒稀释液。50μL病毒稀释液含有4×105pfu SARS-COV-2的病毒。
将人源化ACE2转基因小鼠人源化ACE2转基因小鼠(B6/JGpt-Ace2em1Cin(hACE2)/Gpt，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司)随机分成3组，每组4只小鼠，分别标记为测试组和对照组。通过腹腔注射向各个小鼠体内注射入50mg/kg戊巴比妥进行麻醉，通过滴鼻法施予50μL含有4×105pfu SARS-COV-2的病毒稀释液，使小鼠染毒。
根据小鼠体重和给药剂量，在实验前使用生理盐水将ASO 1和ASO 5配置成溶液。
分别在染毒2h、24h和48h后，通过滴鼻法向各测试组小鼠施予待测药物ASO 1或ASO 5溶液，向对照组小鼠施予生理盐水，给药体积均为10μL，ASO1或ASO 5给药剂量为10mg/kg。
在最后一次给药的6h后处死小鼠，收集小鼠体内肺部组织和气管组织。用RNAlater(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪分别匀浆肺部组织和气管组织，再用Trizol根据说明书总RNA提取的操作步骤提取各组织总RNA。
使用EXPRESS One Step
Figure SMS_26
qRT-PCR试剂盒(货号11781-200，购自LifeTechnologies公司)按照说明书进行反转录，得到cDNA，配置qPCR反应体系，并在ABIStepOnePlusTM Real-Time PCR仪上，使用一步法进行实时PCR。使用表8中的Taqman引物/探针组检测目标基因SARS-COV-2病毒的ORF1a与内参基因GAPDH mRNA的Ct值，换算肺部组织和气管组织中SARS-COV-2病毒RNA载量，并计算得到ASO 1或ASO 5对SARS-COV-2病毒RNA的相对抑制率，结果见表9。
病毒RNA载量相对抑制率＝1-(测试组病毒RNA载量/对照组病毒RNA载量)×100％。
表8检测引物/探针的序列
Figure SMS_27
Figure SMS_28
表9：施予ASO 1或ASO 5的染毒小鼠体内病毒载量显著降低
Figure SMS_29
由表9可以看出，1)在肺部组织中，对于对照组小鼠，给予生理盐水后，病毒RNA载量为4.08×109copies/mL；对于实验组小鼠，给予ASO 1后，病毒RNA载量为2.33×108copies/mL，仅为对照组病毒RNA载量的5.71％，病毒RNA载量相对抑制率为94.29％；给予ASO 5后，病毒RNA载量为5.12×108copies/mL，仅为对照组病毒RNA载量的12.55％，病毒RNA载量相对抑制率为87.45％；2)在气管组织中，对于对照组小鼠，给予生理盐水对照后，病毒RNA载量为5.88×108copies/mL；对于实验组小鼠，给予ASO 1后，病毒RNA载量为1.42×106copies/mL，仅为对照组病毒RNA载量的0.24％，病毒RNA载量相对抑制率为99.76％；给予ASO 5后，病毒RNA载量为9.88×106copies/mL，仅为对照组病毒RNA载量的1.68％，病毒RNA载量相对抑制率为98.32％。
可见，本公开提供的反义寡核苷酸剂在感染了SARS-COV-2病毒的小鼠体内，能够强效抑制病毒表达。
实验例7相关临床试验
研究表明，在SARS-CoV-2病毒感染发病率、患病率及死亡率方面男性患者均高于女性患者。癌症患者在感染中更易恶化，但正在接受雄激素剥夺治疗(ADT)的癌症患者中有一定的保护作用。有证据表明，人体细胞膜表面的跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)有助于激活新型冠状病毒的刺突蛋白，活化的棘突蛋白更容易与同在细胞膜表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，从而帮助SARS-CoV-2病毒进入宿主细胞。本公开证明了抑制AR表达的反义寡核苷酸，也能抑制TMPRSS2和ACE2的基因表达，因而可以抑制冠状病毒进入细胞，从而治疗和/或预防冠状病毒引发的疾病，特别是，例如SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19。
本公开的反义寡核苷酸ASO 1在转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者中的I期临床试验研究NCT02144051显示，月剂量900mg在5组29患者中表现出良好的耐受性，相关报道见Chowdhury,S.et al.,A phase I dose escalation,safety and pharmacokinetic(PK)study of AZD5312(IONIS-ARRx),a first-in-class Generation 2.5antisenseoligonucleotide targeting the androgen receptor(AR).European Journal ofCancer,2016,Volume 69,S145.
一项在患有COVID-19人群中的II期临床试验正在筹措进行中。
以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (18)

1.抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂在制备治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病或生理状况的药物中的用途，所述反义寡核苷酸剂为反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中的一种或多种；
所述反义寡核苷酸缀合物含有反义寡核苷酸和缀合连接至反义寡核苷酸的缀合基团；
所述药物组合物含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物以及药学上可接受的载体；
其中，所述反义寡核苷酸由10至30个连接的修饰或未修饰的核苷酸组成，并且具有一段长度至少为8个核苷酸的核苷酸序列A，所述核苷酸序列A与核苷酸序列B实质上反向互补或者完全反向互补，所述核苷酸序列B为AR基因或AR mRNA中的一段核苷酸序列，且核苷酸序列B与核苷酸序列A长度相等；并且，
在LNCaP细胞系中，0.2μM浓度的所述反义寡核苷酸剂对AR mRNA显示出50％以上的最大抑制率。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述核苷酸序列A的长度为12至22个核苷酸；
或者，所述核苷酸序列A由SEQ ID NO:1-167中的任意一个序列中的连续16至20个核苷酸组成；
优选地，所述反义寡核苷酸由核苷酸序列A组成；
更优选地，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:24，28，32，113，139，144，158或164中任意一个所示的序列。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个核苷间连接为修饰的核苷间连接；
优选地，所述修饰的核苷间连接独立地选自硫代磷酸酯连接、氨基磷酸酯连接、硫代氨基磷酸酯连接中的一种；
更优选地，所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯连接；
优选地，所述修饰的核苷酸为核糖基经修饰的核苷酸或核苷酸类似物中的一种；每个所述核糖基经修饰的核苷酸独立地选自2'-O-甲氧基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸中的一种；核苷酸类似物选自桥联的核苷酸、无环核苷酸、异核苷酸中的一种；所述桥联的核苷酸独立地选自LNA、ENA、cET BNA中的一种；所述无环核苷酸独立地选自UNA、GNA中的一种；所述异核苷酸独立地选自肽核酸或磷酰二胺吗啡啉中的一种；
更优选地，所述修饰的核苷酸为碱基经修饰的核苷酸；所述碱基经修饰的核苷酸独立地选自5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸或无碱基核糖核苷酸。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中，所述反义寡核苷酸由缺口区段、5'翼区段和3'翼区段组成，所述缺口区段的5'末端与所述5'翼区段的3'末端相连，所述缺口区段的3'末端与所述3'翼区段的5'末端相连；所述缺口区段由7至15个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段和所述3'翼区段分别由2至7个连接的核糖核苷酸组成，且每个核糖核苷酸均为修饰的核苷酸；
优选地，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:24所示的序列；所述缺口区段由9个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEtBNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEtBNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸；
或者，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:28所示的序列；所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cET BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中，所述反义寡核苷酸缀合物中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述反义寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。
6.如权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中，所述药物组合物中，所述反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的用途，其中，所述药物组合物中还包含抗雄激素剂，所述抗雄激素剂选自氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁他胺、托吡鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、达洛鲁胺、普克鲁胺、加来特龙、阿比特龙、AZD3514、SHR-3680中的一种或多种；
或者，所述药物组合物中还包含furin抑制剂和/或类视黄醇X受体拮抗剂。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的用途，其中，以寡核苷酸的量计，所述反义寡核苷酸剂的用量为1-500mg/周；
或者，所述反义寡核苷酸剂每天、每三天或每周施用一次；
或者，所述反义寡核苷酸剂施用周期为1-4周。
9.如权利要求1-8中任意一项所述的用途，其中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV中的一种或多种；
或者，所述冠状病毒所引起的疾病或生理状况为SARS、COVID-19、MERS中的一种或多种。
10.一种抑制冠状病毒进入细胞的方法，其中，该方法包括将有效量的抑制雄激素受体(AR)基因表达的反义寡核苷酸剂与所述细胞接触，所述反义寡核苷酸剂为反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物的药物组合物中的一种或多种；
所述反义寡核苷酸缀合物含有反义寡核苷酸和缀合连接至反义寡核苷酸的缀合基团；
所述药物组合物含有反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物以及药学上可接受的载体；
所述反义寡核苷酸由10至30个连接的修饰或未修饰的核苷酸组成，并且具有一段长度至少为8个核苷酸的核苷酸序列A，所述核苷酸序列A与核苷酸序列B实质上反向互补或者完全反向互补，所述核苷酸序列B为AR基因或AR mRNA中的一段核苷酸序列，且核苷酸序列B与核苷酸序列A长度相等；并且，
在LNCaP细胞系中，0.2μM浓度的所述反义寡核苷酸剂对AR mRNA显示出50％以上的最大抑制率。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述细胞独立地选自鼻腔中分泌粘液的杯状细胞(goblet secretory cells)、肺部的Ⅱ型肺泡细胞(type II pneumocytes)、吸收性肠上皮细胞(absorptive enterocyte)、转移性人前列腺癌细胞(LNCaP)的一种或多种。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述核苷酸序列A的长度为12至22个核苷酸；
或者，所述核苷酸序列A由SEQ ID NO:1-167中的任意一个序列中的连续16至20个核苷酸组成；
优选地，所述反义寡核苷酸由核苷酸序列A组成；
更优选地，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:24，28，32，113，139，144，158或164中任意一个所示的序列。
13.如权利要求10-12中任意一项所述的方法，其中，所述反义寡核苷酸的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个核苷间连接为修饰的核苷间连接；
优选地，所述修饰的核苷间连接独立地选自硫代磷酸酯连接、氨基磷酸酯连接、硫代氨基磷酸酯连接中的一种；
更优选地，所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯连接；
优选地，所述修饰的核苷酸为核糖基经修饰的核苷酸或核苷酸类似物中的一种；每个所述核糖基经修饰的核苷酸独立地选自2'-O-甲氧基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸中的一种；核苷酸类似物选自桥联的核苷酸、无环核苷酸、异核苷酸中的一种；所述桥联的核苷酸独立地选自LNA、ENA、cET BNA中的一种；所述无环核苷酸独立地选自UNA、GNA中的一种；所述异核苷酸独立地选自肽核酸或磷酰二胺吗啡啉中的一种；
更优选地，所述修饰的核苷酸为碱基经修饰的核苷酸；所述碱基经修饰的核苷酸独立地选自5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸或无碱基核糖核苷酸。
14.如权利要求10-13中任意一项所述的方法，其中，所述反义寡核苷酸由缺口区段、5'翼区段和3'翼区段组成，所述缺口区段的5'末端与所述5'翼区段的3'末端相连，所述缺口区段的3'末端与所述3'翼区段的5'末端相连；所述缺口区段由7至15个连接的脱氧核苷酸组成，所述5'翼区段和所述3'翼区段分别由2至7个连接的核糖核苷酸组成，且每个核糖核苷酸均为修饰的核苷酸；
优选地，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:24所示的序列；所述缺口区段由9个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由3个连接的核糖核苷酸组成，每个核糖核苷酸均为cEtBNA；所述3'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEtBNA、cEt BNA、cEt BNA和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸；
或者，所述反义寡核苷酸具有SEQ ID NO:28所示的序列；所述缺口区段由7个连接的脱氧核苷酸组成；所述5'翼区段由4个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、cEt BNA、cET BNA和cEt BNA；所述3'翼区段由5个连接的核糖核苷酸组成，按照5'末端到3'末端的方向依次为cEt BNA、cEt BNA、cEt BNA、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸和2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；所述反义寡核苷酸的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯基连接，并且每个胞嘧啶核糖核苷酸是5-甲基胞嘧啶核糖核苷酸。
15.如权利要求10-14中任意一项所述的方法，其中，所述反义寡核苷酸缀合物中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述反义寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。
16.如权利要求10-14中任意一项所述的方法，其中，所述药物组合物中，所述反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)。
17.如权利要求10-16中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括将有效量的抗雄激素剂与所述细胞接触，所述抗雄激素剂独立地选自氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁他胺、托吡鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺、达洛鲁胺、普克鲁胺、加来特龙、阿比特龙、AZD3514、SHR-3680中的一种或多种；
或者，该方法还包括将有效量的furin抑制剂和/或类视黄醇X受体拮抗剂与所述细胞接触。
18.如权利要求47-64中任意一项所述的方法，其中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV中的一种或多种；
或者，所述细胞的ACE2和/或TMPRSS2基因的表达水平被敲低。
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