CN114929336A - 用于调节基因剪接的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节基因剪接的化合物，组合物和方法。在一些实施例中，调节基因剪接提高了靶蛋白或靶功能性RNA的表达。

Description

用于调节基因剪接的化合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月19日提交的序列号为62/902,603美国临时申请和于2019年12月4日提交的序列号为62/943,539美国临时申请的优先权。以上所述申请的全部内容特此以引用的方式并入本文。
背景技术
反义寡核苷酸治疗方法的开发潜力在1978年发表的文章(Zamecnik&Stephenson,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:280-284和285-288(1978))中被首次提出；其公开了与劳斯氏肉瘤病毒(RSV)基因组部分互补的13聚体合成寡核苷酸抑制RSV在感染的鸡成纤维细胞中的复制，并抑制RSV介导的原代鸡成纤维细胞向恶性肉瘤细胞的转化。
反义寡核苷酸方法利用基于DNA和/或RNA的寡核苷酸与选定的mRNA、微RNA、前体RNA或线粒体RNA靶标的序列特异性结合以及由此产生的翻译的抑制。这种基于寡核苷酸的翻译的抑制和最终的基因表达是一种或多种细胞机制的结果，这些机制可包括但不限于(i)翻译的直接(空间)阻断，(ii)核糖核酸酶H介导的抑制，和(iii)RNA干扰介导的抑制(例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、剪接调节、对非编码RNA和单链RNA干扰(ssRNAi)的抑制)。
反义技术的历史表明，虽然确定与mRNA结合的反义寡核苷酸相对简单，但优化具有抑制基因表达的真正潜力并因此成为良好临床候选物的反义寡核苷酸却并不简单。基于寡核苷酸，反义技术具有在活的有机体内不稳定且有可能产生脱靶效应的固有问题，例如非预期的免疫刺激(Agrawal&Kandimalla(2004)Nature Biotech.22:1533-1537)。
优化这些技术的方法都集中在设法解决生物稳定性、对RNA靶标的亲和力、细胞渗透性和在活的有机体内的活性。通常，这些都代表了竞争因素。例如，传统的反义寡核苷酸利用磷酸二酯核苷酸间连接，该技术被证明在生物学上太不稳定而无法起效。因此，优化这些技术的方法重点是修饰反义寡核苷酸以使其在生物学上更稳定。早期的方法集中在修饰核苷酸间连接以使其更耐细胞核酸酶的降解。然而，这些修饰可能会导致分子降低其靶特异性并产生不想要的生物活性。
此外，纵观寡核苷酸研究，人们已经认识到这些分子在活的有机体内容易被核酸外切酶降解，主要降解发生在分子的3’端(Temsamani等人，(1993)Analytical Bioc.215:54-58)。因此，避免这种核酸外切酶活性的方法已经被利用。
尽管有大量的研究，为了提高稳定性和维持RNA靶标的识别性且没有脱靶效应的努力，并没有通常地产生具有更高临床成功的概率的寡核苷酸。据此，如果基于寡核苷酸的下调基因表达的方法想要成功，则仍然需要能最有效地实现该结果的优化的反义寡核苷酸。反义活性主要有两种关键机制。第一种机制涉及与靶RNA杂交的反义寡核苷酸以及形成的s活化核糖核酸酶H，从而剪切靶RNA并抑制其表达。第二种机制是反义寡核苷酸与靶标杂交时阻断靶RNA的加工过程，加工包括剪接，从而抑制或提高基因表达。这种反义机制的结合也可能导致无义介导的衰变，从而抑制或提高基因表达。在使用这两种方法时，已经观察到脱靶效应，需要新的反义设计来减轻脱靶活性并提高效能。
为了调节剪接，反义寡核苷酸被设计用于以高亲和力和选择性结合靶RNA。至今，应用于该机制的反义候选物包括修饰的RNA寡核苷酸，例如2’-O-甲基寡核糖核苷，其在第一项研究中用于调节细胞中的剪接。(Sierakowska等人，(1996)Proc Natl Acad Sci USA，v93(23)：12840-4；Wilton等人，Neuromuscul Discord(1999)v9(5)：330-8)。自此，其他几种修饰的寡核苷酸已被评估，例如具有2’-甲氧基乙氧基、LNA、HNA、CeNa、ANA或这些修饰的混合物的寡核苷酸。
然而，还需要其他新设计。
发明内容
本发明提供一种调节RNA加工过程的方法，包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸、非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
本发明还提供一种在包含至少两个mRNA转录物的基因中选择第一mRNA转录物的方法，所述方法包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基；其中所述反义寡核苷酸靶向第二mRNA转录物的所述前体mRNA的剪接位点，从而阻断所述第二mRNA转录物的剪接位点，并指导所述前体mRNA的剪接至所述第一mRNA转录物；并且其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
本发明还提供一种治疗受试者的疾病或紊乱的方法，其中调节RNA加工过程将有利于治疗受试者，所述方法包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
本发明还提供一种诱发无义介导的靶RNA衰变的方法，包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
本发明还提供一种提高mRNA编码蛋白质水平或功能性mRNA水平和提高蛋白质或功能性mRNA表达的方法，包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
本发明还提供一种反义寡核苷酸，其包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与包含保留的内含子的靶前体RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
附图说明
图1A和图1B为本发明实施方式的示意图。
具体实施方式
本发明涉及用于调节基因剪接的化合物，组合物和方法。在一些实施方式中，调节基因剪接提高了靶蛋白的表达，抑制了不想要的蛋白或靶功能性RNA的表达。
按照惯例，除非另有说明，否则本发明讨论的序列从5’到3’列出。此外，除非另有说明，否则链包含编号为SEQ ID NO的序列，是从5’到3’的序列。
当术语“3’”定向使用时，通常是指来自相同的多核苷酸或寡核苷酸中的另一个区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸中的区域或位置3’(靠近核苷酸的3’端)。术语“3’端”通常是指组成的寡核苷酸的3’端核苷酸。
当术语“5’”定向使用时，通常是指来自相同的多核苷酸或寡核苷酸中的另一个区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸中的区域或位置5’(靠近核苷酸的5’端)。如本发明所用，术语“5’端”通常是指组成的寡核苷酸的5’端核苷酸。
术语“大约”通常意味着确切的数字并不重要。因此，具有少一个或两个的核苷残基，或一个至几个额外的核苷残基的寡核苷酸被认为是上述每个实施例的等效物。
“反义活性”是指由反义寡核苷酸化合物与其靶核酸杂交引起的任何可检测或可测量的活性。在一些实施方式中，反义活性是靶核酸或由此类靶核酸编码的蛋白质的量或表达的降低。在一些实施方式中，反义活性是调节剪接，从而抑制或增加由此类靶核酸编码的蛋白质的表达。
“反义抑制”是指与不存在反义寡核苷酸的情况下的靶核酸水平或靶蛋白水平相比，在存在与靶核酸互补的反义寡核苷酸的情况下靶核酸水平或靶蛋白水平的降低。
“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶核酸的相应区域或区段杂交的核酸碱基序列的单链寡核苷酸。
术语“共同施用(“co-administration”或“co-administered”)”通常是指施用至少两种不同的物质。共同施用是指同时施用，也指间隔数天的时间间隔顺序，至少两种不同的物质以任何顺序，在单次剂量或不同剂量中施用。
术语“组合”通常是指施用根据本发明的基于寡核苷酸的化合物和另一种对于治疗疾病或病症有用的药剂，该另一种药剂在治疗患者过程中不会消除本化合物的活性。此类施用可以任何顺序进行，包括同时施用，以及间隔几秒到几天的时间间隔顺序。此类组合治疗还可包括多于单次施用根据本发明的化合物和/或单独施用其他药剂。根据本发明的化合物和其他药剂可通过相同或不同的途径施用。
术语“个体”或“受试者”或“患者”通常是指哺乳动物，例如人。术语“哺乳动物”明确包括恒温脊椎动物，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛(cattle和cows)、猪、羊和兔。如本发明所用，“其中有需要的个体”是指被选为用于治疗或疗法的人类或非人动物，其需要此类治疗或疗法。
如本发明所用，“抑制表达或活性”是指减少或阻断RNA或蛋白质的表达或活性，并不一定表示完全消除表达或活性。
术语“核苷”通常是指由糖和嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物，其中糖通常指核糖、脱氧核糖、戊糖、阿拉伯糖或己糖。为了本发明的目的，如果碱基不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，则认为碱基是非天然的，如果糖不是β-呋喃核糖苷或2’-脱氧核糖呋喃糖苷，则认为糖是非天然的。
术语“核苷酸”通常是指包含连接到糖上的含磷基团的核苷。如本发明所用，“连接的核苷酸”可以通过或不通过磷酸键连接，因此核苷酸包括但不限于“连接的核苷酸”。如本发明所用，“连接的核苷酸”是在连续的序列中连接的核苷酸(即连接的核苷酸之间不存在额外的核苷酸)。
术语“核酸”包括基因组区域或从基因组区域转录的RNA分子。在一些实施方式中，核酸是mRNA。在一些实施方式中，核酸是微RNA。在一些实施方式中，核酸是非编码RNA。
如本发明所用，“核酸碱基”是指可以与糖部分连接以产生能够并入寡核苷酸的核苷的原子团，并且其中所述原子团能够与另一种寡核苷酸或核酸中天然存在的互补核酸碱基键合。核酸碱基可以是天然存在的或可以被修饰的。如本发明所用，“核酸碱基序列”是指独立于任何糖、键或核酸碱基修饰的连续的核酸碱基的顺序。
如本发明所用，术语“未修饰的核酸碱基”或“天然存在的核酸碱基”是指RNA或DNA中天然存在的杂环核酸碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶(U)。
如本发明所用，“修饰的核酸碱基”是指非天然存在的任何核酸碱基。
如本发明所用，“修饰的核苷”是指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一种化学修饰的核苷。修饰的核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核酸碱基。
如本发明所用，“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在一些实施方式中，寡核苷酸包含一种或多种未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)。在一些实施方式中，寡核苷酸仅包含未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)。在一些实施方式中，寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷。
如本发明所用，“修饰的寡核苷酸”是指包含至少一种修饰的核苷和/或至少一种修饰的糖的寡核苷酸。
如本发明所用，“核苷间连接”是指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价连接。如本发明所用，“天然存在的核苷间连接”是指3’至5’磷酸二酯键。如本发明所用，“修饰的核苷间连接”是指除天然存在的核苷间连接之外的任何核苷间连接。
短语“与单链RNA序列互补的寡核苷酸”等是指在生理条件下，所述寡核苷酸通过其核酸碱基与单链RNA序列的核酸碱基的沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用形成足够数量的氢键从而与单链RNA序列形成双螺旋。这与通过Hoogsteen氢键与双链DNA或RNA形成三螺旋的寡核苷酸形成对比。
如本发明所用，“化学修饰”是指当与天然存在的对应物相比时化合物中的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核酸碱基修饰)和核苷间连接修饰。关于寡核苷酸，化学修饰不仅仅包括核酸碱基序列的差异。
术语“互补”意指在生理条件下与核酸序列结合的寡核苷酸，例如通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对(寡核苷酸和单链核酸之间相互作用)或通过胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对(寡核苷酸和双链核酸之间相互作用)或通过任何其他方式，包括在寡核苷酸与RNA结合并导致假结形成的情况下结合。在生理条件下通过沃森-克里克(Watson-Crick)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对的结合是通过观察对核酸序列功能的干扰来测量的。
“完全互补”或“100％互补”是指第一核酸的每个核酸碱基在第二核酸中有互补的核酸碱基。在一些实施例中，第一核酸是反义化合物且靶核酸是第二核酸。
“杂交”是指互补的核酸分子退火。在一些实施方式中，互补的核酸分子包括反义化合物和靶核酸。
“无义介导的衰变”是指不依赖于核糖核酸酶H或降解mRNA或前体mRNA的RISC的任何数量的细胞机制。在一些实施方式中，无义介导的衰变消除和/或降解了包含过早终止密码子的mRNA转录物。在一些实施方式中，无义介导的衰变消除和/或降解了任何形式的异常mRNA和/或前体mRNA转录物。
术语“可药用”是指不干扰根据本发明的化合物的效果或根据本发明的化合物的生物活性的无毒材料。
“部分”是指核酸的限定数量的连续的(即连接的)核酸碱基。在一些实施方式中，部分是靶核酸的限定数量的连续的核酸碱基。在一些实施方式中，部分是限定数量的反义化合物的连续的核酸碱基。
术语“预防有效量”通常是指足以防止或减少不需要的生物效应发展的量。
如本发明所用，“糖部分”是指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。如本发明所用，“天然存在的糖部分”是指在天然存在的RNA中发现的呋喃糖基或在天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃糖基。如本发明所用，“修饰的糖部分”是指取代的糖部分或糖代替品，例如但不限于2’修饰的糖或限制性糖。
术语“治疗有效量”或“药学有效量”通常是指量足以影响需要的生物效应，例如有益结果，包括但不限于预防、减轻、改善或消除疾病或紊乱的体征或症状的量。因此，药物组合物或方法的每种活性成分的总量足以显示出有意义的患者益处，例如但不限于以免疫刺激为特征的慢性疾病的康复。因此，“药学有效量”将取决于给药的环境。药学有效量可在一次或多次预防性或治疗性给药中施用。当给个体施用活性成分时，单独施用，该术语是指施用该单独的成分。当应用于组合时，无论是组合施用、连续施用还是同时施用，该术语都是指引起治疗效果的活性成分的组合量。
术语“治疗”通常是指意在获得有益的或想要的结果的方法，其可包括缓解症状，或延迟或改善疾病进展。
术语“基因表达”通常是指来自基因的信息用于合成功能性基因产物的过程，该基因产物可以是蛋白质。所述过程可能涉及蛋白质的转录、RNA剪接、翻译和译后修饰，并且可包括mRNA、前体mRNA、非编码RNA、核仁小RNA、核糖体RNA和其他蛋白质合成模板。
“靶”("targeting"或"targeted")是指与靶核酸特异性杂交并诱导所需效果的反义寡核苷酸的设计和选择的过程。“靶基因”、“靶等位基因”、“靶核酸”、“靶RNA”、“靶mRNA”和“靶RNA转录物”都是指特异性杂交的核酸和反义寡核苷酸。“靶等位基因”是表达被选择性靶向的等位基因。“靶区段”、“靶区域”和“靶位点”都是指反义寡核苷酸所靶向的靶核酸的核苷酸序列。
靶区域是靶核酸结构定义的区域。例如，靶区域可以包括3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子连接点、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其他定义的核酸区域。
一些实施方式提供组合物和方法，包括向动物施用本发明公开的反义化合物或组合物。在一些实施方式中，施用反义化合物来预防、治疗、改善或减缓与基因表达或蛋白质活性相关的疾病或病症的进展。在一些实施方式中，所述动物是人类。
本发明提供了一种用于调节剪接的反义寡核苷酸的新设计。在这个设计中，反义寡核苷酸有两个结构域(见图1)。第一结构域由核糖核苷酸(RNA)、修饰的RNA或其组合组成，它们提供对靶RNA的亲和力。第二结构域由磷酸二酯或硫代磷酸寡脱氧核苷酸(DNA)组成，其允许招募核糖核酸酶H但不允许核糖核酸酶H切割反义寡核苷酸-靶RNA双连体。核糖核酸酶H的招募及其与寡核苷酸-靶RNA双连体的结合，在双连位点提供空间位阻并促进剪接。如本发明所用，修饰的RNA包括但不限于2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸。
本发明公开的任何方法包括施用本发明公开的反义寡核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供了一种调节剪接的方法。在一些实施方式中，本发明提供了一种调节RNA剪接的方法。在实施方式中，RNA包括但不限于前体mRNA、mRNA、非编码RNA。在实施方式中，RNA是前体mRNA。在实施方式中，RNA是mRNA。在实施方式中，RNA是非编码RNA。在一些实施方式中，靶RNA包含保留的内含子。
在一些实施方式中，靶前体mRNA包含保留的内含子。在一些实施方式中，保留的内含子的一侧或两侧为外显子。在一些实施方式中，保留内含子的5’剪接位点的侧面为外显子。在一些实施方式中，保留内含子的3’剪接位点的侧面为外显子。在一些实施方式中，保留内含子的5’剪接位点的侧面为外显子，并且保留内含子的3’剪接位点的侧面为外显子。
在一些实施方式中，保留的内含子被从靶RNA进行组成性剪接；从而提高mRNA编码蛋白质水平或功能性mRNA水平并提高蛋白质或功能性mRNA表达。在一些实施方式中，本发明提供提高mRNA编码蛋白质水平或功能性mRNA水平和提高蛋白质或功能性mRNA表达的方法。
在一些实施方式中，调节剪接的方法可用于治疗患有由蛋白质的量或活性不足或功能性mRNA的量或活性不足引起的病症的受试者；并且其中蛋白质或功能性mRNA的量或活性不足是由靶蛋白或靶功能性RNA的单倍剂量不足引起的。
在一些实施方式中，本发明提供治疗受试者的疾病或紊乱的方法，其中调节剪接将有利于治疗受试者。在实施方式中，疾病或紊乱由蛋白质的量或活性不足或功能性mRNA的量或活性不足引起。在实施方式中，蛋白质或功能性mRNA的量或活性不足是由靶蛋白或靶功能性RNA的单倍剂量不足引起的。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物包含与靶RNA区域互补的序列。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物包含与含有保留的内含子的靶RNA的区域互补的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在包含至少两个mRNA转录物的基因中选择第一mRNA转录物的方法，所述方法包括施用包含14-30个连接的核苷酸的反义寡核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基；其中所述反义寡核苷酸靶向第二mRNA转录物的前体mRNA的剪接位点，从而阻断第二mRNA转录物的剪接位点并指导前体mRNA剪接至第一mRNA转录物；并且其中所述反义寡核苷酸包含1到3个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2到5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在本发明的任何实施方式中，保留的内含子被从靶RNA进行组成性剪接；从而提高mRNA编码蛋白质水平或功能性mRNA水平并提高蛋白质或功能性mRNA表达。在一些实施方式中，本发明提供提高mRNA编码蛋白质水平或功能性mRNA水平和提高蛋白质或功能性mRNA表达的方法。
在实施方式中，反义寡核苷酸包含1个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，并且其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在实施方式中，反义寡核苷酸包含2个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，并且其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，所述2个核苷酸区域不邻接。
在实施方式中，反义寡核苷酸包含3个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，并且其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，所述脱氧核糖核苷酸区域不邻接。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在包含至少两个mRNA转录物的基因中选择第一mRNA转录物的方法，所述方法包括施用包含14-30个连接的核苷酸的反义寡核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基；其中反义寡核苷酸靶向第二mRNA转录物的前体mRNA的剪接位点，从而阻断第二mRNA转录物的剪接位点并指导所述前体mRNA的剪接至第一mRNA转录物；并且其中所述反义寡核苷酸包含1-3个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在实施方式中，反义寡核苷酸包含1个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在实施方式中，反义寡核苷酸包含2个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，所述2个核苷酸区域不邻接。
在实施方式中，反义寡核苷酸包含3个核苷酸区域，所述核苷酸区域包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，所述脱氧核糖核苷酸区域不邻接。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在包含至少两个mRNA转录物的基因中选择第一mRNA转录物的方法，所述方法包括施用包含14-30个连接的核苷酸的反义寡核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基；其中反义寡核苷酸靶向第二mRNA转录物的前体mRNA的剪接位点，从而阻断第二mRNA转录物的剪接位点并指导所述前体mRNA的剪接至第一mRNA转录物；并且其中反义寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸区域，所述区域在反义寡核苷酸的3’端包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在实施方式中，脱氧核糖核苷酸区域在反义寡核苷酸的5’端包含4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在包含至少两个mRNA转录物的基因中选择第一mRNA转录物的方法，所述方法包括施用包含14-30个连接的核苷酸的反义寡核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基；其中反义寡核苷酸靶向第二mRNA转录物的前体mRNA的剪接位点，从而阻断第二mRNA转录物的剪接位点并指导所述前体mRNA的剪接至第一mRNA转录物；并且其中反义寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸区域，所述区域在反义寡核苷酸的5’端包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在实施方式中，脱氧核糖核苷酸区域在反义寡核苷酸的5’端包含4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供一种调节靶RNA加工过程的方法，所述方法包括将细胞与如本发明所述的反义寡核苷酸接触，其中对靶前体转录物的加工进行调节。在一些实施方式中，靶RNA的加工包括但不限于编码RNA和非编码RNA的剪接、切割、转运、翻译、降解。在一些实施方式中，RNA加工包括抑制RNA结合蛋白。在一些实施方式中，RNA加工包括编码RNA和非编码RNA的剪接。在一些实施方式中，RNA加工包括编码RNA和非编码RNA的切割。在一些实施方式中，RNA加工包括编码RNA和非编码RNA的转运。在一些实施方式中，RNA加工包括编码RNA和非编码RNA的翻译。在一些实施方式中，RNA加工包括编码RNA和非编码RNA的降解。
在一些实施方式中，一种通过调节靶前体转录物的加工过程来治疗疾病或病症的方法，包括施用如本发明所述的反义寡核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供了一种诱导无义介导的靶RNA衰变的方法，包括施用如本发明所述的反义寡核苷酸。
在一些实施方式中，本发明所述的反义寡核苷酸调节一种或多种靶核酸的剪接，并且此类调节通过无义介导的衰变引起靶核酸的降解和/或还原。
在一些实施方式中，本发明所述的与靶核酸互补的反义寡核苷酸可增加外显子的包含，该外显子的包含导致无义介导的衰变通路以识别和降解含有外显子的mRNA。
在一些实施方式中，本发明所述的与靶核酸互补的反义寡核苷酸可以提高外显子的排除，该外显子的排除导致无义介导的衰变通路以在没有外显子的情况下识别和降解mRNA。
无义介导的衰变是一种监视通路，其作用是通过消除和/或降解异常mRNA转录物来减少异常基因表达中的错误。在一些实施方式中，无义介导的衰变的机制选择性地降解由前体mRNA加工过程中的错误造成的mRNA。例如，许多前体mRNA转录物包含许多可交替剪接以产生任意数量的包含各种外显子组合的mRNA转录物的外显子和内含子。然后将mRNA转录物翻译成任意数量的蛋白异构体。在一些实施方式中，加工前体mRNA以包含一个或多个外显子，该一个或多个外显子的包含产生编码或将编码非功能性蛋白质或错误折叠蛋白质的mRNA。在一些实施方式中，加工前体mRNA以包含一个或多个外显子，该包含产生含有提前终止密码子的mRNA。在一些这样的实施方式中，无义介导的衰变的机制识别含有额外的外显子的mRNA转录物并在翻译前降解该mRNA转录物。在一些这样的实施方式中，无义介导的衰变的机制识别含有提前终止密码子的mRNA转录物并在翻译前降解该mRNA转录物。
在一些实施方式中，加工前体mRNA以排除一个或多个外显子，所述排除外显子产生编码非功能性蛋白质的mRNA。在一些实施方式中，加工前体mRNA以排除一个或多个外显子，该排除外显子产生包含提前终止密码子的mRNA。在一些这样的实施方式中，无义介导的衰变的机制识别缺失外显子的mRNA转录物并在翻译前降解mRNA转录物。在一些这样的实施方式中，无义介导的衰变的机制识别缺失外显子并含有提前终止密码子的mRNA转录物，并在翻译前降解mRNA转录物。
不希望受限于任何特定理论，本发明的反义寡核苷酸允许反义寡核苷酸结合靶RNA并与核糖核酸酶H复合；然而，反义寡核苷酸使核糖核酸酶H失活。换言之，反义寡核苷酸/靶RNA-核糖核酸酶H复合物不会被核糖核酸酶H切割。在一些实施方式中，反义寡核苷酸是局部施用的。
在一些实施方式中，反义化合物包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域。在一些实施方式中，靶核酸是内源性RNA分子。在一些实施方式中，靶核酸是前体mRNA。在一些实施方式中，反义寡核苷酸调节前体mRNA的剪接。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸与靶前体mRNA的核苷酸序列互补，其中反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中反义寡核苷酸包含1-3个核苷酸区域，所述区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸与靶前体mRNA的核苷酸序列互补，其中反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中反义寡核苷酸包含1-3个核苷酸区域，所述区域包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸与靶前体mRNA的核苷酸序列互补，其中反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中反义寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸区域，所述区域在反义寡核苷酸的3’端包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸与靶前体mRNA的核苷酸序列互补，其中反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中反义寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸区域，所述区域在反义寡核苷酸的5’端包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含1个区域，所述区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含2个脱氧核糖核苷酸区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含3个脱氧核糖核苷酸区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，脱氧核糖核苷酸区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，脱氧核糖核苷酸区域包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，脱氧核糖核苷酸区域包含4个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，2’-取代的核苷酸选自但不限于2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-O-甲氧基-乙基(2’-MOE)核糖核苷酸、2’-卤素(例如氟)核苷酸和吗啉代修饰的核酸。在一些实施方式中，限制性糖核苷酸包括双环核苷。在一些实施方式中，双环核苷包括锁核苷和桥接核苷。在一些实施方式中，限制性糖核苷酸选自但不限于锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、脱水己糖醇核酸(HNA)、环己烯基核酸(CeNA)、山梨糖醇核酸(ANA)、限制性MOE(cMOE)、限制性乙基(cEt)、乙烯桥接核酸(ENA)、丝氨醇核酸(SNA)和扭曲嵌入核酸(TINA)。在一些实施方式中，非离子包括但不限于甲基膦酸酯、磷酸三酯和吗啉代(PMO)。在一些实施方式中，核苷酸可以是2’-取代的并且具有限制性糖。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含1个脱氧核糖核苷酸区域，所述区域包含2、3、4或5个连续的脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含1个脱氧核糖核苷酸区域，所述区域包含2、3或4个连续的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含1个脱氧核糖核苷酸区域，所述区域包含2个连续的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含1个脱氧核糖核苷酸区域，所述区域包含3个连续的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含1个脱氧核糖核苷酸区域，所述区域包含4个连续的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸位于反义寡核苷酸的3’端。
在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸位于反义寡核苷酸的5’端。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含2个脱氧核糖核苷酸区域，每个区域独立地包含2、3或4个连续的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含3个脱氧核糖核苷酸区域，每个区域独立地包含2、3或4个连续的脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸位于反义寡核苷酸的5’端，位于反义寡核苷酸的3’端，侧面为2’-取代的寡核苷酸、非离子寡核苷酸或限制性糖寡核苷酸，或其组合。在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸位于反义寡核苷酸的5’端。在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸位于反义寡核苷酸的3’端。在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸的侧面为2’-取代的寡核糖核苷酸。
在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸是天然存在的核苷酸。在一些实施方式中，连续的脱氧核糖核苷酸是未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，一种或多种连续的脱氧核糖核苷酸被修饰。
本发明的反义寡核苷酸是可药用的。本发明的反义寡核苷酸是可注射的。在一些实施方式中，靶RNA可以是mRNA。一些实施方式提供了一种反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是单链的。
在一些实施方式中，本发明提供一种长度为17个核苷酸的反义寡核苷酸化合物，所述反义寡核苷酸化合物包含至少12个与靶序列的等长部分的互补连续的核酸碱基。
在一些实施方式中，本发明提供一种长度为18-25个核苷酸的反义寡核苷酸化合物，所述反义寡核苷酸化合物包含至少12个与靶序列的等长部分互补的连续的核酸碱基。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为18个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为19个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为20个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为21个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为22个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为23个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为24个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡核苷酸化合物的长度为25个核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供一种长度为20个核苷酸的反义寡核苷酸化合物，所述反义寡核苷酸化合物包含至少12个与靶序列的等长部分互补的连续的核酸碱基。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含在反义寡核苷酸的3’端包含2-4个连续的脱氧核糖核苷酸的核苷酸区域，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸、非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸的长度可以是至少14个核苷酸，例如长度在14-30个核苷酸之间。因此，本发明的反义寡核苷酸的长度可以是14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸的长度可以在14-25个核苷酸之间。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸的长度可以在17-22个核苷酸之间。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸的长度可以在19-28个核苷酸之间。
本发明的反义寡核苷酸的长度可以是17、18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸的长度可以是17个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是18个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是19个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是20个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是21个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是22个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是23个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是24个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是25个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是26个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是27个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是28个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是29个核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的长度可以是30个核苷酸。
RNA中天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，嘧啶碱基是胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)(DNA中有胸腺嘧啶(T))。相反，修饰的碱基，也称为杂环碱基部分，包括其他核酸碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤和鸟嘌呤以及腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物、2-丙基腺嘌呤和鸟嘌呤以及腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物、2-硫氧嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
在一些实施方式中，修饰的核酸酸碱基选自：如本发明定义的通用碱基、疏水碱基、混合碱基、尺寸延长的碱基和氟化碱基。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤和鸟嘌呤以及腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物、2-丙基腺嘌呤和鸟嘌呤以及腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物、2-硫氧嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。进一步修饰的核酸碱基包括三环嘧啶，例如吩恶嗪胞啶([5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(1H-嘧啶[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹子(G-clamps)，例如取代的吩恶嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H))-酮)、咔唑胞啶(2H-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞嘧啶(H-吡啶[3’,2’:4,5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的碱基也可能包括嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环化合物取代的碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在一些实施例中，修饰的核酸碱基是5-甲基胞嘧啶。
代表性的修饰的糖包括碳环糖或无环糖、在其2’、3’或4’位置中的一个或多个位置具有取代基的糖以及具有代替糖的一个或多个氢原子的取代基的糖。在一些实施方式中，通过在2’位置具有取代基来修饰糖。在另外的实施例中，通过在3’位置具有取代基来修饰糖。在其他的实施方式中，通过在4’位置具有取代基来修饰糖。还预设糖可以在这些位置中的一个以上位置具有修饰，或者反义寡核苷酸可具有在一个位置上具有糖修饰的一个或多个核苷酸以及在不同的位置上具有糖修饰的一个或多个核苷酸。
预设在反义寡核苷酸中的糖修饰包括但不限于选自以下的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。在一些实施方式中，这些基团可以选自：O(CH2)xOCH3、O((CH2)xO)yCH3、O(CH2)xNH2、O(CH2)xCH3、O(CH2)xONH2以及O(CH2)xON((CH2)xCH3)2，其中x和y分别为从1到10。
在一些实施方式中，修饰的糖包含选自以下的取代基：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、靶基团、嵌入剂、用于改善反义寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善反义寡核苷酸的药效动力学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。在一个实施例中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧乙基)或2’-MOE)(Martin等人，1995)，即烷氧基烷氧基。另一种修饰包括2’-二甲氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE和2’-二甲氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-O-二甲氨基-乙氧基-乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
额外的糖取代基包括烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)和氟(F)。在2’位置(2’-)上的糖取代基可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。一种2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。其他类似的修饰还可以在低聚化合物的其他位置进行，特别是3’端核苷或2’-5’连接的寡核苷酸中糖的3’位置和5’端核苷酸的5’位置。低聚化合物也可具有糖类似物，例如环丁基部分，代替呋喃戊糖。公开修饰的糖结构的制备方法的美国专利实施例包括但不限于美国专利第4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；以及5,700,920号，其全部内容特此以引用的方式并入。
代表性的糖取代基包括在美国专利申请公开2005/0261218中描述的基团，其特此以引用的方式并入。在特定的实施方式中，糖修饰是2’-O-Me修饰、2’F修饰、2’H修饰、2’氨基修饰、4’硫代核糖修饰或与6’位碳相连的羧基上的硫代磷酸酯修饰，或其组合。
在一些实施方式中，2’-取代非双环修饰的核苷包含糖部分，所述糖部分包含选自：F、OCH3、和OCH2CH2OCH3的非桥接2’-取代基。
一些修饰的糖部分包含桥接呋喃糖环的两个原子以形成第二个环的取代基，从而产生双环糖部分(也称为限制性糖)。在一些这样的实施方式中，双环糖部分包含4’呋喃糖环原子和2’呋喃糖环原子之间的桥。此类4’-2’桥接糖取代基的例子包括但不限于：4’-CH2-2’、4’-(CH2)2-2’、4’-(CH2)3-2’、4’-CH2-O-2’(“LNA”)、4’-CH2-S-2’、4’-(CH2)2-O-2’(“ENA”)、4’-CH(CH3)-O-2’(称为“限制性乙基”或“cEt”)、4’-CH2-O-CH2-2’、4’-CH2-N(R)-2’、4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(“限制性MOE”或“cMOE”)及其类似物(参见，例如，Seth等人，US 7,399,845；Bhat等人，US 7,569,686；Swayze等人，US 7,741,457和Swayze等人，US 8,022,193)，4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物(参见，例如，Seth等人，US8,278,283)，4’-CH2-N(OCH3)-2’及其类似物(参见，例如，Prakash等人，US 8,278,425)、4’-CH2-ON(CH3)-2’(参见，例如，Allerson等人，US 7,696,345和Allerson等人，US 8,124,745)，4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见例如Zhou等人，J.Org.Chem.，2009,74,118-134)，4’-CH2-C(＝CH2)-2’及其类似物(参见例如Seth等人，US 8,278,426)、4’-C(RaRb)-N(R)-O-2’、4,-C(RaRb)-ON(R)-2’、4’-CH2-ON(R)-2’和4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R、Ra和Rb各自独立为H、保护基或C1-C12烷基(参见例如Imanishi等人，U.S.7,427,672)。
在一些实施方式中，此类4’-2’桥独立地包含1-4个独立地选自：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
Ra和Rb各自独立为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；且J1和J2各自独立为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
额外的双环糖部分是本领域公知，例如参见：Freier等人，Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4429-4443；Albaek等人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740；Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人，J Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人J Am.Chem.Soc,20017,129,8362-8379；Wengel等人，U.S.7,053,207；Imanishi等人，U.S.6,268,490；Imanishi等人，U.S.6,770,748；Imanishi等人，U.S.RE44,779；Wengel等人，U.S.6,794,499；Wengel等人，U.S.6,670,461；Wengel等人，U.S.7,034,133；Wengel等人，U.S.8,080,644；Wengel等人，U.S.8,034,909；Wengel等人，U.S.8,153,365；Wengel等人，U.S.7,572,582；和Ramasamy等人，U.S.6,525,191；Torsten等人，WO 2004/106356；Wengel等人，WO 1999/014226；Seth等人WO 2007/134181；Seth等人，U.S.7,547,684；Seth等人，U.S.7,666,854；Seth等人，U.S.8,088,746；Seth等人，U.S.7,750,131；Seth等人，U.S.8,030,467；Seth等人，U.S.8,268,980；Seth等人，U.S.8,546,556；Seth等人，U.S.8,530,640；Migawa等人，U.S.9,012,421；Seth等人，U.S.8,501,805；和美国专利公开：Allerson等人，US2008/0039618和Migawa等人，US2015/0191727。
在一些实施方式中，同分异构构型进一步限定了双环糖部分和并入此类双环糖部分的核苷。例如，LNA核苷(本发明所述)可以是α-L构型或β-D构型。
Figure BDA0003648026430000111
α-L-亚甲氧基(4’-CH2-0-2’)或α-L-LNA双环核苷已并入到表现出反义活性的寡核苷酸(Frieden等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。本发明中，双环核苷的一般说明包括两种同分异构构型。除非另有说明，否则在本发明的示例性实施例中特定的双环核苷(例如，LNA或cEt)的位置均为β-D构型。
在一些实施方式中，修饰的糖部分包含一种或多种非桥接糖取代基和一种或多种桥接糖取代基(例如，5’-取代糖和4’-2’桥接糖)。
在一些实施方式中，修饰糖部分是糖代替品。在一些此类实施方式中，糖部分的氧原子被例如，用硫，碳或氮原子替代。在一些此类实施方式中，这种修饰糖部分还包括如本发明所述的桥接和/或非桥接取代基。例如，一些糖代替品包含4’-硫原子和2’-位置(参见，例如，Bhat等人，US 7,875,733和Bhat等人，US 7,939,677)和/或5’位置的取代物。
在一些实施方式中，糖代替品包括具有五元环以外的环。例如，在一些实施方式中，糖代替品包括六元四氢吡喃(“THP”)。此类四氢吡喃可以被进一步修饰或取代。包含此类修饰的四氢甲嘧吡喃的核苷包括但不限于及己醇核酸(“HNA”)、茴香醇核酸(“ANA”)、甘露醇核酸(“MNA”)(参见，例如Leumann，CJ.Bioorg.&Med.Chem.2002,10,841-854)、F-HNA：
Figure BDA0003648026430000112
(“F-HNA”，参见Swayze等人，U.S.8,088,904；Swayze等人，U.S.8,440,803；Swayze等人，U.S.8,796,437；和Swayze等人，U.S.9,005,906；F-HNA也可称为F-THP或3’-氟四氢吡喃)和包含额外修饰的THP化合物的核苷，所述核苷公式如下:
Figure BDA0003648026430000121
其中，所述修饰的THP核苷各自独立为：
Bx是碱基部分；
T3和T4各自独立为将修饰的THP核苷连接到寡核苷酸的剩余部分的核苷间连基团，或者T3和T4中的一个为将修饰的THP核苷连接到寡核苷酸的剩余部分的核苷间连基团，且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的共轭基或5’或3’-端基团；
q1,q2,q3,q4,q5,q6和q7各自独立为H、C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C2-C6烯基，取代的C2-C6烯基，C2-C6炔基，或取代的C2-C6炔基；R1、R2各自独立选自氢、卤、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1，且J1,J2,和J3分别为H或C1-C6烷基。
在一些实施方式中，提供了修饰的THP核苷，其中q1,q2,q3,q4,q5,q6和q7各自为H。在一些实施方式中，q1,q2,q3,q4,q5,q6和q7中的至少一个不是H。在一些实施方式中，q1,q2,q3,q4,q5,q6和q7中的至少一个为甲基。在一些实施方式中，提供了修饰的THP核苷，其中R1和R2中的一个为F。在一些实施方式中R1为F，R2为H，在一些实施方式中，R1为甲氧基，R2为H，以及在一些实施方式中，R1为甲氧基乙氧基，R2为H。
在一些实施方式中，糖代替品包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如，包含吗啉代糖部分的核苷及其在寡核苷酸中的用途已被报道(参见，例如，Braasch等人，Biochemistry,2002,41,4503-4510和Summerton等人，U.S.5,698,685；Summerton等人，U.S.5,166,315；Summerton等人，U.S.5,185,444；和Summerton等人，U.S.5,034,506)。如本发明所用，术语“吗啉代”是指具有以下结构的糖代替品：
Figure BDA0003648026430000122
在一些实施方式中，吗啉代可被修饰，例如通过添加或改变来自上述吗啉代结构的不同的取代基。此类糖代替品在本发明中称为“修饰的吗啉代”。
在一些实施方式中，糖代替品包含无环部分。包含此类无环糖代替品的核苷和寡核苷酸的例子包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、无环丁基核酸(参见，例如，Kumar等人，Org.Biomol.Chem.,2013,11,5853-5865)，以及在Manoharan等人，WO2011/133876中描述的核苷和寡核苷酸。
许多其他的双环和三环糖以及糖代替品环系是本领域已知的，其可用于修饰的核苷。
反义寡核苷酸的核苷残基可以通过许多已知的核苷间连接中的任何一个相互偶联。核苷间连接基团的两种主要类型由磷原子的存在或不存在限定。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于含有磷酸二酯键(“P＝O”)(也称为未修饰或天然存在的键)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(“P＝S”)和二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)的磷酸酯。代表性的不含磷的核苷间连基团包括但不限于亚甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫二酯、硫代氨基甲酸酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；和N,N’-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。含磷和不含磷的核苷间连接的制备方法为本领域技术人员所熟知。
此类核苷间连接包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、膦酸烷基酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、乙酰胺酸酯、氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷、硫醚、桥接的氨基磷酸酯、桥接的亚甲基膦酸酯、桥接的硫代磷酸酯、以及砜核苷间连接。在一些实施例中，本发明的合成反义寡核苷酸可包含核苷酸间连接的组合。在一些实施方式中，本发明的合成反义寡核苷酸可包含硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷酸间连接的组合。在一些实施方式中，多于一半但少于全部的核苷酸间连接是硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方式中，所有核苷酸间连接都是硫代磷酸酯核苷酸间连接。
包含具有手性中心的核苷间连接的修饰的寡核苷酸可制备为包含立体随机核苷间连接的修饰的寡核苷酸群，或制备为包含特定立体化学构型的硫代磷酸酯键的修饰的寡核苷酸群。在一些实方式中，修饰的寡核苷酸群包含硫代磷酸酯核苷间连接，其中所有硫代磷酸酯核苷间连接都是立体随机的。此类修饰的寡核苷酸可以利用导致每个硫代磷酸酯键的立体化学构型随机选择的合成方法生成。然而，正如本领域技术人员所熟知的，每个单独寡核苷酸分子的每个单独硫代磷酸酯具有确定的立体构型。在一些实施方式中，修饰的寡核苷酸群富集修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸包含一个或多个特定的在特定的、独立选择的立体化学构型中的硫代磷酸酯核苷间连接。
在一些实施方式中，硫代磷酸酯键可以是混合的Rp和Sp对映体，或者它们可以被制为有规立构的或以Rp或Sp构型基本上有规立构的。在所述键是混合的Rp和Sp对映体的实施方式中，Rp和Sp构型可位于反义寡核苷酸内的限定位置或随机放置在整个寡核苷酸中。
在一些实施方式中，本发明提供如本文所述的反义寡核苷酸和任选的一个或多个共轭基和/或末端基。共轭基由一个或多个共轭部分和连接共轭部分与寡核苷酸的共轭键组成。共轭基可以连接到寡核苷酸的一端或两端和/或任何内部的位置。在一些实施方式中，共轭基连接到修饰寡核苷酸的核苷的2’-位置。在一些实施方式中，连接到寡核苷酸的一端或两端的共轭基是末端基。在一些此类实施方式中，共轭基或末端基连接在寡核苷酸的3’和/或5’-端。在一些此类实施方式中，共轭基(或末端基)连接在寡核苷酸的3’端。在一些此类实施方式中，共轭基连接在寡核苷酸的3’-端附近。在一些此类实施方式中，共轭基(或末端基)连接在寡核苷酸的5’端。在一些此类实施方式中，共轭基连接在寡核苷酸的5’-端附近。
末端基的例子包括但不限于共轭基、封端基、磷酸部分、保护基、脱碱基核苷、修饰或未修饰的核苷，以及独立为修饰或未修饰的两个或更多的核苷。
一些共轭基和共轭部分在本文之前已有描述，例如：胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053-1060)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett,1993,3,2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)，脂肪链，例如十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.,1991,10,1111-1118；Kabanov等人，FEBSLett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-丙三醇或三乙基-铵1,2-二-0-十六烷基-外消旋-丙三基-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，TetrahedronLett.,1995,36,3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、多元胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)，或金刚烷乙酸，十六基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，十八胺或己氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)，生育酚基团(Nishina等人，Molecular Therapy Nucleic Acids,2015,4,e220；和Nishina等人，Molecular Therapy,2008,16,734-740)，或GalNAc簇(例如，WO2014/179620)。
本发明的合成反义化合物可通过本领域公知的方法制备，例如亚磷酰胺或H-膦酸酯化学反应可以手动或通过自动合成器进行。本发明的合成反义化合物也可通过多种不损害它们与mRNA杂交的能力的方式来修饰。
在一些实施方式中，本发明的基于寡核苷酸的化合物通过线性合成方法来合成。
在依据线性合成或平行合成方案的合成结束时，如果插入了修饰的核苷，本发明的基于寡核苷酸的化合物可用浓氨溶液或如亚磷酰胺供应商所推荐的来便利地保护。产物基于寡核苷酸的化合物优选地通过反相HPLC纯化、去三苯甲基化、脱盐和透析。
本发明反义寡核苷酸的非限制性列表在表1中示出。表1中的反义寡核苷酸设计用于在小鼠肌营养不良蛋白基因转录物中诱导外显子23跳读。除非另有说明，否则反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯(PS)主链连接。然而，本领域技术人员将认识到，可包括基于磷酸二酯或非磷酸二酯部分的其他连接。
Table 1表1
化合物# 序列 SEQ ID NO:
1 5’-<u>GGC</u>CAAACCUCGGCUUACCU-3’ 1
2 5’-GGCC<u>AAA</u>CCUCGGCUUACCU-3’ 2
3 5’-GGCCAAAC<u>CTC</u>GGCUUACCU-3’ 3
4 5’-GGCCAAACCUCG<u>GCT</u>UACCU-3’ 4
5 5’-<u>GGC</u>CAAACCUCGGCUU<u>AC</u>CU-3’ 5
6 5’-GGCCAAACCUCGGCUUA<u>CCT</u>-3’ 6
7 5’-<u>GGCC</u>AAACCUCGGCUUACCU-3’ 7
8 5’-GGCC<u>AAAC</u>CUCGGCUUACCU-3’ 8
9 5’-GGCCAAAC<u>CTCG</u>GCUUACCU-3’ 9
10 5’-GGCCAAACCUCG<u>GCTT</u>ACCU-3’ 10
11 5’-GGCCAAACCUCGGCUU<u>ACCT</u>-3’ 11
12 5’-GGCCAAACCUCGG<u>CTTACCT</u>-3’ 12
13 5’-GGCCAAACCUCGGC<u>TTACCT</u>-3’ 13
14 5’-GGCCAAACCUCGGCU<u>TACCT</u>-3’ 14
15 5’-GGCCAAACCUCGGCUUA<u>CCT</u>-3’ 15
16 5’-GGCCAAACCUCGGCUUAC<u>CT</u>-3’ 16
下划线处＝脱氧核苷酸；非下划线处＝2’-O-甲基核苷酸
在一些实施方式中，靶核酸是靶标的小鼠序列。在一些实施方式中，靶核酸是靶标的人序列。
本发明提供了包含本文所述的反义寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。术语“载体”通常包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球、脂质体包囊或用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于用于特定用途的给药途径。含有这些材料的可药用制剂的制备于例如雷明顿,药物科学,第18版,A.Gennaro编辑,麦克出版公司,伊斯顿,1990年(Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Edition,ed.A.Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)中描述。
所述组合物还可包含一种或多种其他试剂。此类试剂可包括但不限于疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、化学治疗剂(传统化学疗法和现代靶向疗法)、激酶抑制剂、过敏原、抗生素、激动剂、拮抗剂、反义寡核苷酸、核酶、RNA干扰分子、小干扰RNA分子、微小RNA分子、寡核苷酸适配子、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子或其组合。
与根据本发明的寡核苷酸互补的核酸序列将依据待抑制的试剂而变化。例如，根据本发明的反义寡核苷酸可具有与细胞基因或基因转录物互补的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列的异常表达或产物导致疾病状态。几种此类细胞基因的核酸序列已经在本领域中描述。根据本发明的反义寡核苷酸可以具有任何寡核苷酸序列，只要该序列与靶RNA核苷酸序列部分或完全互补。
在一些实施方式中，反义寡核苷酸可在其整个长度上至少有90％与所述靶mRNA的一部分互补。在一些实施方式中，反义寡核苷酸可在其整个长度上至少有93％与靶RNA的一部分互补。在一些实施方式中，反义寡核苷酸可在其整个长度上至少有95％与靶RNA的一部分互补。在一些实施方式中，反义寡核苷酸可在其整个长度上至少有98％与靶RNA的一部分互补。在一些实施方式中，反义寡核苷酸可在其整个长度上至少有99％与靶RNA的一部分互补。在一些实施方式中，反义寡核苷酸可在其整个长度上至少有100％与靶RNA的一部分互补。
一些实施方式提供了靶向基因的化合物，其中所述化合物包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或22个与任何靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基。在一些实施方式中，反义寡核苷酸可包含至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基。
本发明的反义寡核苷酸可以单独施用或与任何其他的药剂或疗法组合施用。药剂或疗法可以共同施用或同时施用。此类药剂或疗法可用于治疗或预防疾病或病症且不降低根据本发明的反义寡核苷酸的基因表达调节作用。可用于治疗或预防疾病或病症的药剂包括但不限于疫苗、抗原、抗体，优选单克隆抗体、细胞毒素剂、激酶抑制剂、过敏原、抗生素、小干扰RNA分子、反义寡核苷酸、TLR拮抗剂(例如TLR3和/或TLR7拮抗剂和/或TLR8拮抗剂和/或TLR9拮抗剂)、化学治疗剂(传统化学疗法和现代靶向疗法)、靶向治疗剂、活化细胞、肽、蛋白质、基因治疗载体、肽疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗、佐剂和共刺激分子(例如细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式活化因子、肽或包含修饰的氨基酸的肽)或其组合。或者，根据本发明的反义寡核苷酸可以与其他化合物(例如脂质或脂质体)组合施用从而增强根据本发明的反义寡核苷酸的基因表达调节的特异性或量级。
本发明的反义寡核苷酸可通过任何合适的途径施用，包括但不限于，肠胃外、粘膜递送、口服、舌下、经皮、局部外用、吸入、瘤内、静脉内、皮下、鞘内、鼻内、喷雾、眼内、气管内、直肠内、阴道内、通过基因枪、皮肤贴片或滴眼液或漱口水的形式。在根据本发明的任何方法中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用可直接施用于组织或器官，例如但不限于膀胱、肝、肺、肾或肺。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用是通过肌肉内施用。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用是通过粘膜施用。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用是通过口服施用。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用是通过直肠内施用。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用是通过鞘内施用。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸单独或与任何其他的药剂组合施用是通过瘤内施用。
用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；络合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节紧张性的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH值可以用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可封装在安瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
根据本发明的反义寡核苷酸的施用可使用已知的程序来进行，使用有效量，给药时间为能够有效减轻疾病症状或替代标记物。例如，用于治疗疾病和/或病症的根据本发明的反义寡核苷酸的有效量可以是减轻或减少症状、或延迟或减轻肿瘤、癌症或细菌、病毒或真菌感染所必需的量。在施用调节基因表达的组合物的情况下，与不存在根据本发明的反义寡核苷酸的情况下的基因表达相比，根据本发明的反义寡核苷酸的有效量是足够实现所需调节的量。任何特定应用的有效量可以依据此类所治疗的疾病或病症、所施用的特定寡核苷酸、受试者的大小或疾病或病症的严重程度等因素而变化。本领域普通的技术人员可以凭经验确定特定反义寡核苷酸的有效量，而无需过度的实验。
当全身施用时，治疗组合物优选为以足够的剂量施用，以使本发明化合物的血液水平达到约0.0001微摩尔至约10微摩尔。对于局部施用，低于这个浓度可能有效，高于这个浓度可能耐受。优选地，根据本发明的化合物的总剂量范围为每名患者每天约0.001mg至每天每kg体重约200mg。在一些实施方式中，总剂量可以是每天、每周两次或每周施用0.08、0.16、0.32、0.48、0.32、0.64、1、10或30mg/kg体重。可能希望将治疗有效量的一种或多种作为单次治疗事件同时或顺序地给予个体。作为个体的单个治疗阶段，可能希望同时或循序施用一种或多种治疗有效量的本发明的治疗性组合物。
根据本发明这个方面的方法可用于基因表达的模型研究。该方法也可用于预防或治疗人类或动物疾病。例如，该方法可用于基因表达应用的儿科和兽医的抑制。
一些实施方式提供了用于治疗、预防或改善如本发明所述的疾病、紊乱或病症的试剂盒，其中所述试剂盒包含：(i)如本发明所述的反义寡核苷酸；和可选地(ii)如本发明所述的第二药剂或疗法。本发明的试剂盒还可包括使用该试剂盒治疗、预防或改善本发明所述的疾病、紊乱或病症的说明书。
细胞培养和反义化合物处理
反义化合物对靶核酸水平、活性或表达的影响可在多种细胞类型中体外测试。用于此类分析的细胞类型可从商业供应商处获得(例如美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection)，马纳萨斯，弗吉尼亚州；Zen生物公司(Zen-Bio,Inc.)，三角研究园区，北卡罗莱纳州；培养基公司(Clonetics Corporation)，沃克斯维尔，马里兰州)并根据供应商的说明，使用市售试剂(例如英杰公司生活技术，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)对它们进行培养。示例性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞和原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外测试
本发明描述了用反义寡核苷酸处理细胞的方法，可以适当地修饰所述方法来用其他反义化合物进行处理。
当细胞在培养中达到大约60-80％的汇合度时，可用反义寡核苷酸处理细胞。
一种常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的试剂包括阳离子脂质转染试剂LIPOFECTIN(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。反义寡核苷酸可在OPTI-MEM 1(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中与LIPOFECTIN混合，以达到所需的反义寡核苷酸的最终浓度和范围为每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的LIPOFECTIN的浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞的另一种试剂包括LIPOFECTAMINE(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1减少血清培养基(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中混合，以达到所需的反义寡核苷酸的浓度和范围为每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的LIPOFECTAMINE的浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞的技术包括电穿孔。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可以在反义寡核苷酸处理后16-24小时收获细胞，此时通过本领域已知方法和本发明描述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。通常当在多次重复进行处理时，数据显示为重复处理的平均值。
所用反义寡核苷酸的浓度因细胞系的不同而不同。确定特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法是本领域熟知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，反义寡核苷酸通常以1nM至300nM的浓度使用。当用电穿孔转染时，反义寡核苷酸的使用浓度范围从625到20,000nM。
RNA分离
RNA分析可以在细胞总RNA或poly(A)+mRNA上进行。RNA分离的方法是本领域熟知的。使用本领域熟知的方法制备RNA，例如，根据制造商推荐的方案使用TRIZOL试剂(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。
靶水平或表达的抑制分析
靶核酸的水平或表达的抑制可以以本领域已知的多种方法分析。例如，靶核酸水平可以通过例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或定量实时PCR来定量。RNA分析可以在细胞总RNA或poly(A)+mRNA上进行。RNA分离的方法是本领域熟知的。Northern印迹分析也是本领域中常规的。定量实时PCR可以使用市售的ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统便利地完成，可从加利福尼亚州福斯特市的PE-应用生物系统(PE-Applied Biosystems)获得并根据制造商的说明来使用。
靶RNA水平的定量实时PCR分析
RNA水平的定量可以根据制造商的说明使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州)通过定量实时PCR来完成。定量实时PCR的方法是本领域熟知的。
在实时PCR之前，分离的RNA经过逆转录酶(RT)反应，其产生互补DNA(cDNA)，然后将互补DNA用作实时PCR扩增的基质。RT和实时PCR反应在同一样品槽中依次进行。RT和实时PCR试剂可以从英杰公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)获得。RT和实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)目标量，要么使用表达恒定的基因(例如亲环素A)的表达水平进行归一化，要么通过使用RIBOGREEN(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)量化总RNA来进行归一化。亲环素A表达通过实时PCR，与靶标同时运行、多路技术或单独运行来量化。使用RIBOGREEN RNA定量试剂(英杰公司，尤金，俄勒冈)对总RNA进行定量。Jones,L.J.等人(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中教导了通过RIBOGREEN进行RNA定量的方法。CYTOFLUOR 4000仪器(PE应用生物系统)用于测量RIBOGREEN荧光。
设计探针和引物用于与靶核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法在本领域中是熟知的并且可包括使用软件，例如PRIMER EXPRESS软件(应用生物系统，福斯特，加利福尼亚州)。
蛋白质水平分析
蛋白质水平可以以本领域公知的多种方法评估或定量，例如免疫沉淀、蛋白质印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如，半胱天冬酶活性测定)、免疫组织化学反应、免疫细胞化学反应或荧光激活细胞分选(FACS)。指向靶标的抗体可以从多种来源鉴定和获得，例如抗体的MSRS目录(Aerie公司，伯明翰，密歇根州)，或者可通过本领域熟知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。
反义化合物的体内测试
测试可以在正常动物或实验性疾病模型中进行。为了对动物给药，将反义寡核苷酸配制成可药用的稀释剂，例如磷酸盐缓冲盐水。给药包括肠胃外给药途径，例如腹膜内、静脉内和皮下。反义寡核苷酸剂量和给药频率的计算在本领域技术人员的能力范围内并且取决于例如给药途径和动物体重等因素。在用反义寡核苷酸处理一段时间后，分离RNA并测量核酸表达的变化。
一些适应症
在一些实施方式中，本发明提供了治疗个体的方法，包括施用本发明所述的一种或多种药物组合物。一些实施方式包括通过向个体施用治疗有效量的本发明所述的反义化合物来治疗有需要的个体。
在一个实施方式中，施用治疗有效量的靶向核酸的反义化合物伴随着监测个体中相应的靶水平，从而确定个体对施用反义化合物的反应。个体对反义化合物的施用的反应可以被医生用来确定治疗性干预的量和持续时间。
实施例
反义寡核苷酸的合成
根据本发明的反义寡核苷酸可以通过本领域熟知的程序合成，例如可以手动或通过自动合成器进行的氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学反应。例如，本发明的反义寡核苷酸可以通过线性合成方法来合成。
研究中使用的ARNA化合物是使用亚磷酰胺化学反应合成的。例如在https://pubs.rsc.org/en/content/chapter/bk9781788012096-00453/978-1-78801-209-6中详细描述了这些方案，其通过引用并入本文。
细胞培养和转染
H-2Kb-tsA58 mdx成肌细胞42,43(H2K mdx细胞)可以如本领域先前所述进行培养和分化。简而言之，用50μg/mL的聚-D-赖氨酸(Merck Millipore)预处理24孔板，随后用100μg/ml的基质胶(细胞透镜，由体外技术提供)处理。用胰蛋白酶(Thermo FisherScientific)处理60％–80％汇合的成肌细胞培养物并接种到上述预处理后的24孔板上，接种密度为2×104个细胞/孔。在含有5％马血清的DMEM(Thermo Fisher Scientific)中在37℃于5％CO2中孵育24小时，细胞可分化成肌管。AO可与脂质体(赛默飞世尔科技)以2:1(w/w)(脂质体/AO)的比例复合，并按照制造商的说明在24孔板中以500μL/孔的最终转染量使用。
RNA提取和RT-PCR
可根据制造商的说明使用Direct-zol RNAMiniPrep Plus和TRI试剂(试剂盒，通过综合科学提供)从转染的细胞中提取RNA。然后可以使用跨外显子20-26的SuperScriptIII逆转录酶(赛默飞世尔科技)通过RT-PCR分析肌营养不良蛋白转录物。PCR产物可以乙酸盐-EDTA缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上分离，并在Fusion Fx凝胶记录系统(凝胶成像仪，马恩拉瓦莱，法国)上捕获图像。密度测量可以通过ImageJ软件进行。实际的外显子跳读效率可以通过将外显子23跳读的RT-PCR产物的量表示为总抗肌萎缩蛋白转录物的百分比来确定。结果如下表所示。
SEQ ID NO: 序列 外显子23跳读％
7 5’-<u>GGCC</u>AAACCUCGGCUUACCU-3’ 34
8 5’-GGCC<u>AAAC</u>CUCGGCUUACCU-3’ 30
9 5’-GGCCAAAC<u>CTCG</u>GCUUACCU-3’ 0
10 5’-GGCCAAACCUCG<u>GCTT</u>ACCU-3’ 32
11 5’-GGCCAAACCUCGGCUU<u>ACCT</u>-3’ 42
12 5’-GGCCAAACCUCGG<u>CTTACCT</u>-3’ 25
13 5’-GGCCAAACCUCGGC<u>TTACCT</u>-3’ 25
14 5’-GGCCAAACCUCGGCU<u>TACCT</u>-3’ 29
15 5’-GGCCAAACCUCGGCUUA<u>CCT</u>-3’ 34
16 5’-GGCCAAACCUCGGCUUAC<u>CT</u>-3’ 34
虽然本发明已根据其优选实施例进行了具体展示和描述，但本领域技术人员将理解，在不背离所附权利要求所包含的本发明范围的情况下，可以对其中的形式和细节进行各种改变。

Claims (50)

1.一种调节RNA加工过程的方法，包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
2.一种在包含至少两个mRNA转录物的基因中选择第一mRNA转录物的方法，所述方法包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶前体mRNA的等长部分互补的连续的核酸碱基；其中所述反义寡核苷酸靶向第二mRNA转录物的所述前体mRNA的剪接位点，从而阻断所述第二mRNA转录物的剪接位点，并指导所述前体mRNA的剪接至所述第一mRNA转录物；并且其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
3.一种治疗受试者的疾病或紊乱的方法，其中调节RNA加工过程将有利于治疗受试者，所述方法包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
4.一种诱发无义介导的靶RNA衰变的方法，包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
5.一种提高mRNA编码蛋白质水平或功能性mRNA水平和提高蛋白质或功能性mRNA表达的方法，包括施用反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与靶RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶RNA包含保留的内含子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述2’-取代的核苷酸选自2'O-甲基核糖核苷酸或2'-MOE。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含1个区域，所述区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸位于所述反义寡核苷酸的5’端，位于所述反义寡核苷酸的3’端，侧面为2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸位于所述反义寡核苷酸的5’端。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸位于所述反义寡核苷酸的3’端。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸的长度为2-4个核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸的长度为4个核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述保留内含子的5'剪接位点的侧面为外显子。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述保留内含子的3'剪接位点的侧面为外显子。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述保留内含子的5'剪接位点的侧面为外显子，并且所述保留内含子的3'剪接位点的侧面为外显子。
17.根据权利要求2和权利要求6-16引用权利要求2时任一项所述的方法，其中所述第二mRNA转录物的剪接位点的5'侧为外显子。
18.根据权利要求2和权利要求6-16引用权利要求2时任一项所述的方法，其中所述第二mRNA转录物的剪接位点的3'侧为外显子。
19.根据权利要求2和权利要求6-16引用权利要求2时任一项所述的方法，其中所述第二mRNA转录物的剪接位点的5'侧为外显子，并且所述第二mRNA转录物的剪接位点的3'侧为外显子。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述方法可用于治疗患有由蛋白质的量或活性不足或所述前体mRNA表达的功能性mRNA的量或活性不足引起的病症的受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述靶蛋白或功能性mRNA的量或活性不足是由蛋白质或功能性RNA的单倍剂量不足引起的。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是包含可药用载体的组合物的一部分。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是局部施用的。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
25.根据权利要求24所述的方法，其中至少一半的所述核苷酸间连接是硫代磷酸酯。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述核苷酸间连接全部是硫代磷酸酯。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是单链的。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸在其整个长度上至少有90％与所述靶mRNA的一部分互补。
29.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述RNA选自前体mRNA，mRNA，非编码RNA。
30.一种反义寡核苷酸，其包含14-30个连接的核苷酸，所述连接的核苷酸具有至少12个与包含保留内含子的靶前体RNA的等长部分互补的连续的核酸碱基，其中所述反义寡核苷酸包含1-3个区域，每个区域独立地包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸，其余的核苷酸是2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
31.根据权利要求30所述的寡核苷酸，其中所述2’-取代的核苷酸选自2'O-甲基核糖核苷酸或2'-MOE。
32.根据权利要求30或31所述的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含1个区域，所述区域包含2-5个连续的脱氧核糖核苷酸。
33.根据权利要求32所述的寡核苷酸，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸位于所述反义寡核苷酸的5’端，位于所述反义寡核苷酸的3’端，侧面为2’-取代的核苷酸，非离子核苷酸或限制性糖核苷酸，或其组合。
34.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸位于所述反义寡核苷酸的5’端。
35.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸位于所述反义寡核苷酸的3’端。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的寡核苷酸，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸的长度为2-4个核苷酸。
37.根据权利要求36所述的寡核苷酸，其中所述连续的脱氧核糖核苷酸的长度为4个核苷酸。
38.根据权利要求30-37中任一项所述的寡核苷酸，其中所述保留内含子的5'剪接位点的侧面为外显子。
39.根据权利要求30-37中任一项所述的寡核苷酸，其中所述保留内含子的3'剪接位点的侧面为外显子。
40.根据权利要求30-37中任一项所述的寡核苷酸，其中所述保留内含子的5'剪接位点的侧面为外显子，并且所述保留内含子的3'剪接位点的侧面为外显子。
41.根据权利要求30-40中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是局部施用的。
42.根据权利要求30-41中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
43.根据权利要求42所述的寡核苷酸，其中至少一半的所述核苷酸间连接是硫代磷酸酯。
44.根据权利要求42所述的寡核苷酸，其中所述核苷酸间连接全部是硫代磷酸酯。
45.根据权利要求30-44中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是单链的。
46.根据权利要求30-45中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸在其整个长度上至少有90％与所述靶mRNA的一部分互补。
47.根据权利要求30-46中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA选自前体mRNA，mRNA，非编码RNA。
48.一种药物组合物，其包含如权利要求30-47中任一项所述的寡核苷酸和可药用载体。
49.根据权利要求1所述的方法，其中RNA加工过程包括剪接。
50.根据权利要求3所述的方法，其中RNA加工过程包括剪接。
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