KR20240082367A - 치료학적 물질로서 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커 분절을 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 ("CSO")로 지칭되는 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 이용 방법을 제공한다. 이러한 고리형 올리고뉴클레오티드의 설계는 표적화된 RNA의 존재 하에 이와 혼성화할 때까지 고리 형태를 유지한다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 의거하여 2021년 9월 23일자 미국 특허 가출원번호 63/247,556의 출원일에 대해 우선권을 주장한다. 이 가출원의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다.
표적화된 RNA의 프로세싱 및 번역은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 여러 기전들을 통해 조절할 수 있다. 이러한 것으로는 표적화된 RNA에 대한 RNase-H에 의한 절단, 비-정상적인 스플라이싱 조절, 표적화된 RNA의 프로세싱 및 번역 강화, 입체 간섭에 의한 번역 저해 등이 있다. 표적화되는 RNA는 mRNA이거나 또는 비-암호화 RNA일 수 있다. 다른 기전으로, 듀플렉스 siRNA의 안티센스 가닥이 AGO와 통합되어, siRNA 기전에 의해 번역을 저해할 수 있다. 또 다른 기전에서는, ADAR 또는 CRISPR에 기반한 모델과 마찬가지로, 안티센스에 의해 RNA 또는 DNA를 편집할 수 있으며, 이로써 번역 및 프로세싱을 조절할 수 있다.
수년에 걸쳐 안티센스 혼성화 및 친화성이 표적화된 RNA에 대한 선택성에 영향을 미친다는 것을 인지하게 되었다. 아울러, 안티센스 핵산을 약물로 이용하기 위해서는 뉴클레아제 안정성이 중요하며, 이는 뉴클레오티드 간 연결 (internucleotide linkage), 예를 들어 포스포로티오에이트를 변형함으로써 부여된 바 있다.
뉴클레아제 안정성이 효능의 핵심인 것으로 추정되었으며, 안티센스 분해가 3'-말단으로부터 이루어지는 것으로 밝혀져, 분해가 느리게 진행되도록 3'-말단을 변형하는 데 집중하였다. 이러한 설계로는 3'-말단 상의 캡핑, 및 3'-3' 연결을 포함한 2차 구조의 올리고를 형성하는 3'-말단 상의 헤어핀 루프, 또는 3' 말단에 안티센스 올리고뉴클레오티드 두(2)개를 부착하는 것을 포함한다. 이러한 안티센스 유형이 뉴클레아제 안정성을 증가시키는 것으로 확인되었지만, 안티센스 효능을 개선하진 못하였다. 공교롭게도, 이러한 변형이 또한 염증 반응을 증가시켜, 치료학적 지수를 제한하였다.
포스포로티오에이트를 함유한 2'-치환된 RNA 그리고 DNA 및 RNA는 안티센스 제제로서 연구되어 왔으며, 여러가지 특징들을 제공한다. DNA 포스포로티오에이트 안티센스는 RNA와 혼성화하였을 경우 RNase H를 활성화하는 반면, RNA 또는 2'-치환된 RNA 안티센스는 RNA에 더 높은 친화성으로 결합하고 RNase H를 활성화하진 않는다. 안티센스 특징을 추가로 개선하기 위해, 이들 2가지 변형을 조합하여 안티센스에 적용되었으며, 이를 일반적으로 하이브리드 또는 갭머 (gapmer) 안티센스라 한다. 가장 많이 연구된 갭머 안티센스의 경우, 변형된 RNA 분절이 3'-말단과 5'-말단 양쪽에 위치하고, 중앙에는 DNA가 위치한다. 갭머 안티센스가 가장 널리 연구된 안티센스이고, 이러한 화학을 채택한 약물들이 승인되어 임상 개발 중에 있다.
DNA 및 RNA 포스포로티오에이트 둘다에 대한 하나의 부작용은 단백질, 특히 패턴 인지 수용체 (PRR) 계열과의 상호작용이 그 원인이다. 이러한 상호작용으로 면역 캐스케이드가 유도되고, 그래서 비-표적 작용 기전과 관련한 안전 신호가 유발된다. 면밀한 구조-활성 연관성 연구들에서, DNA 및 RNA 포스포로티오에이트 안티센스의 5'-말단 접근성이 면역 활성화에 필요한 것으로 밝혀졌다. 5'-말단이 2개인 DNA 및 RNA 포스포로티오에이트가 증가된 면역-자극 활성을 나타내었다. 이와는 대조적으로, 3'-말단을 2개 가진 (5' 말단 결핍) DNA 및 RNA 포스포로티오에이트는 최소한의 염증 반응을 보인 것으로 이전에 밝혀진 바 있다.
치료학적 물질로서 DNA 및 변형된 RNA 포스포로티오에이트 안티센스의 특성을 개선하기 위한 끊임없는 시도로, 올리고뉴클레오티드에 대한 구조적 변화가 고려되었다. 예를 들어, 초기 연구에서는 자가-안정화된 올리고뉴클레오티드들이 발표되었는데, 3'-말단에 헤어핀 루프 영역을 가진 올리고데옥시뉴클레오티드 포스포로티오에이트 ("PS-올리고뉴클레오티드")가 생체내 증가된 뉴클레아제 안정성 및 제한된 생물학적 활성을 나타내었다. 지금까지 갭머 안티센스에 포함되는 등의 다양한 변형을 통해 3'-말단을 변형함으로써 안티센스의 안정성을 개선하는데 집중하였다.
달성된 진보에도 불구하고, 치료학적 물질로서, 그리고 진단 용도로서 이용하기에 개선된 특성을 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개발하고자 하는 요구는 여전히 존재하고 있다.
본 발명은 "고리형 구조의 올리고뉴클레오티드" (CSO) 또는 동일한 의미로 "고리형 올리고"로 본원에서 지칭되는 올리고뉴클레오티드 구조 유형을 제공한다. CSO에서는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 (직접 또는 링커 분절을 통해) 연결되어 있다. "기능성 도메인"으로 지칭되는 올리고뉴클레오티드 하나는 CSO에 기능을 제공하고 (예를 들어, 기능성 분절은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드일 수 있음), "고리화 도메인"으로 지칭되는 2번째 올리고뉴클레오티드는 기능성 도메인의 말단부 (terminal end)에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (예를 들어, 도 1A-도 1C).
CSO는 기능성 도메인과 고리화 도메인 간의 상보성의 결과로서 분자내 고리 구조를 취하고, 그래서 분자내 듀플렉스를 형성한다. 이러한 분자내 듀플렉스 형성은 기능성 도메인의 형태와 올리고뉴클레오티드의 말단부에 대한 접근성을 모두 바꾼다. 이러한 구조는 최적의 안티센스 및 올리고뉴클레오티드 및 핵산 기반의 치료제를 구현하기 위한 핵심적인 속성을 겸비한다.
유전자 및 RNA 발현 조절에서, 이러한 구조는 5'-말단부를 은폐하여 PRR과의 상호작용을 감소시키고 엔도솜 탈출을 허용한다. 고리형 구조는 일단 세포질 또는 핵 안에서는 기능성 도메인과 표적 RNA 서열의 친화성이 기능성 도메인과 고리화 도메인 간의 친화성보다 더 높아, 표적 RNA의 존재시 열리게 될 것이다. CSO가 분자내 고리형 형태일 경우, 노출되는 포스포로티오에이트 연결이 거의 없어, PS-올리고뉴클레오티드에서 발생하는 것으로 알려진 다가음이온-관련 부작용 (예를 들어, 보체 활성화 및 부분 트롬보플라스틴 시간 연장)이 거의 발생하지 않을 수 있다. 또한, CSO는 단백질 결합성이 감소될 것이다.
본 발명에 따른 CSO는 구성하는 올리고뉴클레오티드에 대한 표준 합성 기법을 이용해 제조할 수 있으며, 기능성 올리고뉴클레오티드 및 핵산이 이용가능한 모든 목적들에 유용하다.
전술한 내용은 본 발명의 특정 측면만 요약한 것이며, 본 발명이 임의의 방식으로 제한되는 것으로 의도하는 것은 아니며, 그렇게 해석되어서도 안된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 기타 간행물들은 그 전체가 원용에 의해 본원에 통합된다.
도 1A - 도 1C는 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 다양한 구현예들을 도시한다. 파선은 고리화 도메인을 나타낸다. 실선은 기능성 도메인을 나타낸다. L은 기능성 도메인과 고리화 도메인이 직접 또는 링커를 통해 연결되는 것을 나타낸다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA의 존재 하에 혼성화될 때까지 고리 형태를 유지한다. 이러한 구현예에서, 기능성 도메인은 표적 RNA에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 본원에서 추가적으로 기술된 바와 같이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 특성에 따라 다양한 작용 기전으로 작동할 수 있다. 도 1B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 본원에 기술된 바와 같이 스플리트머 (splitmer)인 본 발명에 따른 CSO의 일 구현예를 도시한다. 도 1C는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 본원에 기술된 바와 같이 스플라이싱 올리고뉴클레오티드인 본 발명에 따른 CSO에 대한 일 구현예를 도시한다.
도 2A 및 2B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA인, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 다양한 구현예들을 도시한다. 도 2A는 siRNA의 한쪽 가닥의 5'-말단부에 고리화 도메인이 부착된 일 구현예를 도시한다. 고리화 도메인은 siRNA의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 짧은 파선은 고리화 도메인을 나타낸다. 실선은 siRNA의 센스 가닥을 나타낸다. 파선은 siRNA의 안티센스 가닥을 나타낸다. L은 링커를 나타낸다. 도 2B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA의 안티센스 가닥 (파선)이고, 고리화 도메인 (실선)이 5'-말단부에 부착된, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 추가적인 구현예를 도시한다. 이 구현예에서, 센스 가닥이 안티센스 가닥에 부착되고, 또한 고리화 도메인으로서 작동한다. 대안적으로, 도 2B의 경우, 기능성 도메인은 siRNA의 센스 가닥 (파선)이고, 고리화 도메인 (실선)이 5'-말단부에서 부착된다. 이러한 구현예에서, 안티센스 가닥이 센스 가닥에 부착되어 또한 고리화 도메인으로서 작동한다.
도 3은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 유전자 조절 올리고뉴클레오티드인 본 발명에 따른 CSO의 전달 및 이의 엔도솜에서 세포질로의 방출 기전을 도시한 것이다.
도 4A 및 도 4B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 다양한 길이의 고리화 도메인이 3' 말단에 부착된. 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 예시적인 구현예를 도시한 것이다. 도 4B는 화합물 번호 53 및 54에 대한 고리 구조의 예들을 도시한다.
도 5는 Hepa1-6 세포에서 PCSK9의 넉다운을 도시한 것이다.
도 6A - 도 6C는 HepG2 세포에서 PNPLA3의 넉다운을 도시한 것이다.
도 7은 기능성 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO의 면역자극 활성을 비-고리형 TLR9 작용제와 비교하여 도시한 것이다.
도 8은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 여러가지 링커들이 (즉, 직접 결합 대 트리에틸렌 글리콜) 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 9는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 여러가지 길이의 고리화 도메인이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 10은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 여러가지 길이의 고리화 도메인 및 여러가지 링커들이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 11은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 기능성 도메인의 5' 또는 3'에의 고리화 도메인의 부착이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 12는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 13은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 길항제인 본 발명에 따른 CSO의 활성을 도시한 것이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 이들 화합물은 면역 반응을 유발하지 않는다.
도 14는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 길항제인 본 발명에 따른 CSO가 TLR9 작용제의 면역자극 활성을 차단하는 능력을 도시한 것이다.
도 2A 및 2B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA인, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 다양한 구현예들을 도시한다. 도 2A는 siRNA의 한쪽 가닥의 5'-말단부에 고리화 도메인이 부착된 일 구현예를 도시한다. 고리화 도메인은 siRNA의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 짧은 파선은 고리화 도메인을 나타낸다. 실선은 siRNA의 센스 가닥을 나타낸다. 파선은 siRNA의 안티센스 가닥을 나타낸다. L은 링커를 나타낸다. 도 2B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA의 안티센스 가닥 (파선)이고, 고리화 도메인 (실선)이 5'-말단부에 부착된, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 추가적인 구현예를 도시한다. 이 구현예에서, 센스 가닥이 안티센스 가닥에 부착되고, 또한 고리화 도메인으로서 작동한다. 대안적으로, 도 2B의 경우, 기능성 도메인은 siRNA의 센스 가닥 (파선)이고, 고리화 도메인 (실선)이 5'-말단부에서 부착된다. 이러한 구현예에서, 안티센스 가닥이 센스 가닥에 부착되어 또한 고리화 도메인으로서 작동한다.
도 3은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 유전자 조절 올리고뉴클레오티드인 본 발명에 따른 CSO의 전달 및 이의 엔도솜에서 세포질로의 방출 기전을 도시한 것이다.
도 4A 및 도 4B는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 다양한 길이의 고리화 도메인이 3' 말단에 부착된. 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 예시적인 구현예를 도시한 것이다. 도 4B는 화합물 번호 53 및 54에 대한 고리 구조의 예들을 도시한다.
도 5는 Hepa1-6 세포에서 PCSK9의 넉다운을 도시한 것이다.
도 6A - 도 6C는 HepG2 세포에서 PNPLA3의 넉다운을 도시한 것이다.
도 7은 기능성 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO의 면역자극 활성을 비-고리형 TLR9 작용제와 비교하여 도시한 것이다.
도 8은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 여러가지 링커들이 (즉, 직접 결합 대 트리에틸렌 글리콜) 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 9는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 여러가지 길이의 고리화 도메인이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 10은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 여러가지 길이의 고리화 도메인 및 여러가지 링커들이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 11은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 기능성 도메인의 5' 또는 3'에의 고리화 도메인의 부착이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 12는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 작용제인 본 발명에 따른 CSO에서 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결이 면역자극 활성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 13은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 길항제인 본 발명에 따른 CSO의 활성을 도시한 것이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 이들 화합물은 면역 반응을 유발하지 않는다.
도 14는 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 TLR9 길항제인 본 발명에 따른 CSO가 TLR9 작용제의 면역자극 활성을 차단하는 능력을 도시한 것이다.
전술한 일반적인 설명과 후술한 상세한 설명은 단순한 예이자 설명하기 위한 것일 뿐, 제한적이지 않은 것으로 이해되어야 한다.
본원에서, 단수형의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않은 한 복수를 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같이, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않은 한 "및/또는"을 의미한다. 아울러, 용어 "비롯하여" 뿐 아니라 "함유한다" 및 "함유한"과 같은 기타 형태들은 제한하는 것은 아니다. 또한, "요소" 또는 "구성성분"과 같은 용어들은 구체적으로 언급되지 않은 한 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 구성성분과, 하나보다 더 많은 서브유닛을 포함하는 요소 및 구성성분을 모두 망라한다.
본원에서 사용한 부문 제목은 단순히 구성상의 목적일 뿐이며, 기술하는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 비-제한적으로 특허, 특허 출원, 기사, 책 및 논문을 비롯하여 본원에 논의된 문헌의 내용에 대해서 뿐 아니라 그 전체 내용이 명시적으로 본원에 원용에 의해 통합된다.
본원에서는 특징들이 명확하게 하고 간결한 설명을 제공하기 위해 본 발명에 대한 동일한 또는 별개의 측면들 또는 구현예들의 일부로서 기술될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 범위에 동일하거나 또는 별개의 구현예들의 일부로서 본원에 기술된 특징들 전체 또는 그 일부가 조합된 구현예들이 망라될 수 있음을 이해할 것이다.
본원 전체에서 본 발명의 다양한 측면들이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 편의성 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하고, 본 발명의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로서 해석되어서는 안된다. 이에, 범위의 기술은 가능한 모든 하위 범위뿐 아니라 그 범위에 속하는 개개 수치 값들을 모두 명시적으로 개시한 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 1-3, 1-4, 1-5, 2-4, 2-6, 3-6 등과 같은 하위 범위뿐 아니라 그 범위에 속하는 개개 수치들, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 명시적으로 개시한 것으로 해석되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당해 기술 분야의 당업자에게 이해될 것이며, 이것이 사용된 문맥에서 어느 정도 달라질 것이다. 용어 "약"은 본원에 사용된 바와 같이, 양, 시간 기간 등과 같이 측정가능한 수치를 언급할 경우, 명시된 수치에서 ±5%, ±1% 및 ±0.1%를 비롯하여 ±20% 또는 ±10%의 편차를 망라하는 것을 의미하며, 이러한 편차는 기술된 방법을 수행하기에 적절한 것이다.
본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커 분절을 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 ("CSO")로 언급되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 달리 언급되지 않은 한, 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 5' 말단부에서 5'-5' 연결을 통해 연결된다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 3' 말단부에서 3'-3' 연결을 통해 연결된다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 5'-말단부 상에 기능성 도메인과 5'-5' 연결을 통해 부착된다. 이러한 배열에서, 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화되어, 고리형 구조 (예를 들어, 도 1A-도 1C)를 형성한다. 이러한 고리형 올리고뉴클레오티드 설계는 기능성 도메인의 존재 하에 표적 RNA와 혼성화를 형성할 때까지 고리형 형태를 유지한다. 이러한 구조는 특이성 증가를 가능케한다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 3'-말단부 상에서 기능성 도메인과 3'-3' 연결을 통해 부착된다. 이러한 배열에서, 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단부와 혼성화되어 고리형 구조를 형성한다.
기능성 도메인은 CSO에 대해 요망되는 기능을 제공한다. 예를 들어, 유전자 발현을 조절하기 위해, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA에 대해 상보적이다.
구현예들에서, 기능성 도메인 및 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드들은 DNA 또는 RNA이거나, 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이거나, 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이거나, 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 기능성 도메인 및/또는 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 구현예들에서, 기능성 도메인 및 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드들은 변형되지 않는다.
구현예들에서, 기능성 도메인 및/또는 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드들 중 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형된다. 구현예들에서, 기능성 도메인 및/또는 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드들 중 2 이상의 뉴클레오티드가 변형된다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형된다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 간 연결의 변형, 당 (sugar) 변형, 헤테로사이클릭 염기의 변형 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 변형은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드 내 특정 위치에 적절하게 있을 수 있다. 본원에 따라 쉽게 이용할 수 있는 다른 화학 및 변형들은 올리고뉴클레오티드 분야에 공지되어 있으며, 본원의 올리고뉴클레오티드 맥락에서 사용된 바와 같이 용어 "변형된"에 의해 망라된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드" 또는 "기능성 도메인"은 상호 호환적으로 사용된다.
구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-500개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-300개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-200개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-100개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-50개 길이이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 50-250개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 50-150개 길이이다.
구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-50개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 17-40개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 17-25개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-22개 길이이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 17개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 18개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 19개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 20개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 21개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 22개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 23개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 24개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 25개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 26개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 27개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 28개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 29개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 30개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 31개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 32개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 33개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 34개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 35개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 36개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 37개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 38개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 39개 길이이다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 40개 길이이다.
구현예들에서, 기능성 도메인은 안티센스 올리고뉴클레오티드, microRNA (miRNA), siRNA, piRNA, hnRNA, ncRNA, snRNA, sgRNA, esiRNA, shRNA, lncRNA, CRISPR-기반의 시스템, RNA 시스템에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 또는 스플라이싱 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드를 망라하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 구현예들에서, 기능성 도메인은 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 면역 길항제 올리고뉴클레오티드로도 지칭되는 면역-저해성 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드를 망라하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 간 연결에 대한 유일한 제한은, (a) 고리화 도메인이 요망하는 조건에서 CSO의 기능성 도메인과 혼성화하여 듀플렉스를 형성하는 능력, 및 (b) 기능성 도메인이 이의 의도한 기능 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 기능성 도메인의 경우, 생리학적 조건 하에 상보적인 RNA 분절에 혼성화하여 듀플렉스 형성, 듀플렉스는 RNaseH에 대한 기질임)을 수행하는 능력을 없애지 않는다는 것이다. 바람직한 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 간 연결은 뉴클레아제 및 기타 화학적 분해 형태에 대한 CSO의 안정성을 강화하게 하거나, 및/또는 기능성 도메인이 의도한 기능을 수행하는 능력을 강화하게 할 것이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결, 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합이다.
고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성의 것이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형된다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 간 연결의 변형, 당 변형, 헤테로사이클릭 염기의 변형 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 변형은 또한 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드 내 특정 위치에서 있을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드" 또는 "고리화 도메인"은 상호 호환적으로 사용된다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결, 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-100개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-75개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-50개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-40개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-30개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-25개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-10개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-6개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 5-8개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 4개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 5개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 6개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 7개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 8개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 9개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 10개 길이이다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 15-40개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 17-30개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 15개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 16개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 18개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 19개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 20개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 21개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 22개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 23개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 24개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 25개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 26개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 27개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 28개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 29개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 30개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 31개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 32개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 33개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 34개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 35개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 36개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 37개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 38개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 39개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 40개 길이이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "극성"은 일차 구조에서 방향성 개념에 대한 것이다 (예를 들어, DNA 및 RNA의 경우 3'→5' 및 5'→3', 또는 PNA의 경우 N-말단→C-말단 (또는 반대)). 본 발명의 CSO가, 예를 들어, 역-병렬 (anti-parallel) 방식으로 왓슨-클릭 염기 쌍 형성에 의해 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우, 고리화 도메인은 5'→3' (또는 2') 배열로 놓일 것이고, 기능성 도메인의 이에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열은 3' (또는 2')→5' 배열로 놓일 것이다. CSO에서 극성의 변동은 고리화 도메인 이외의 CSO 내 다른 임의 위치에서, 그리고 고리화 도메인에 대해 상보적인 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에서 발생할 수 있다. CSO가 올리고뉴클레오티드를 포함하는 바람직한 구현예에서, 기능성 도메인은 3'→5' 배열로 배치되고 고리화 도메인은 5'→3' 배열로 배치되어, 기능성 도메인과 고리화 도메인은 5'-5' 연결을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 5'→3' 배열로 배치되고 고리화 도메인은 3'→5' 배열로 배치되어, 기능성 도메인과 고리화 도메인은 3'-3' 연결을 통해 연결된다.
구현예들에서, 기능성 도메인과 고리화 도메인은 링커 분절을 통해 서로 공유적으로 연결된다. 구현예들에서, 링커 분절은 직접 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드, 또는 기타 화학적 모이어티, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 링커 분절은 절단가능할 수 있다.
링커 분절에 대한 유일한 제한은, CSO의 기본적인 기능, 즉 (a) CSO가 대상 조건 (예를 들어, 생리학적 조건)에서 분자내 고리형 구조를 형성하는 능력 및 (b) 기능성 도메인이 이의 의도한 기능을 수행하는 능력을, 해치지 않는다는 것이다. 바람직한 "기타 화학적 모이어티" 링커로는 C2-C6 알킬, 에틸렌 글리콜, 트리 (에틸렌 글리콜), 테트라 (에틸렌 글리콜), 펜타 (에틸렌 글리콜), 헥사 (에틸렌 글리콜) 및 -NH(CH2)nNH- (n = 2, 3, 4, 5 또는 6) 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 대안적으로, 링커 분절은 전술한 것들의 조합일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커는 기능성 도메인과 고리화 도메인이 직접 결합된 경우 직접 결합이다. 구현예에서, 링커는 에틸렌 글리콜이다. 구현예들에서, 링커는 C2-C6 알킬이다. 구현예들에서, 링커는 C2 알킬이다. 구현예들에서, 링커는 C3 알킬이다. 구현예들에서, 링커는 C4 알킬이다. 구현예들에서, 링커는 C5 알킬이다. 구현예들에서, 링커는 C6 알킬이다.
기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 말단부와 링커 말단 (linker end)을 가진다. 명칭에 내포된 바와 같이, 링커 말단은 링커 분절을 통해 고리화 도메인과 연결되는 올리고뉴클레오티드의 말단이다. 일반적으로, CSO는 기능성 도메인의 말단부가 고리화 도메인과 듀플렉스를 형성하도록 것으로 구성되며, 즉, 고리화 도메인은 기능성 도메인의 말단부에 대해 상보성을 가진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적인"은 선택 (예를 들어, 생리학적) 조건에서 다른 헤테로사이클릭 염기에 비해 우선적으로 상호 수소 결합을 형성하는 뉴클레오베이스 (또는 간단히 "염기") 쌍을 지칭한다 (또는 올리고뉴클레오티드의 "상보-성"을 평가하는 경우 상황에 따라 어느 정도의 상보성이 필요할 수도 있음). 뉴클레오베이스가 변형 또는 비-변형된 천연 또는 합성 퓨린 및 피리미딘일 경우, 용어 "상보적인"은 왓슨 클릭 의미에서 상보성을 의미한다.
핵산 쌍의 하나 이상의 가닥의 모든 염기들이 반대쪽 이의 상보적인 염기에서 발견되는 경우, 이러한 가닥은 다른 가닥의 서열과 완전히 상보적인 것으로 간주된다. 이러한 가닥의 하나 이상의 염기가 이의 상보적인 염기 쌍을 제외한 임의의 다른 반대쪽 염기가 있는 위치에서 발견되면, 그 염기는 "불-일치"로 간주되고, 그 가닥은 부분적으로 상보적인 것으로 간주된다. 즉, 가닥들은 염기가 정렬되지 않을 때까지, 즉 이들이 비-상보적인 지점 (예를 들어, 상보성 0%)까지 부분적인 상보성의 정도는 다양할 수 (예를 들어, 상보성 0%<x<100%) 있다. 당해 기술 분야의 당업자가 쉽게 이해 및 인지하는 바와 같이, 완전한 (즉, 완전한, 100%) 상보성이 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 또는 기타) 가닥들의 혼성화에 요구되는 것은 아니다.
구현예들에서, 표적 RNA는 mRNA, pre-mRNA, ncRNA, lncRNA 또는 microRNA일 수 있다. 구현예들에서, 표적 RNA는 mRNA이다.
구현예들에서, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 일부이다.
본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 유용한 임의의 기타 물질 또는 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 조절 효과를 약화시키지 않는다. 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 유용한 물질(들)로는 소분자, 펩타이드, 백신, 항원, 항체, 바람직하게는 단일클론 항체, 세포독성 물질, 키나제 저해제, 알레르겐, 항생제, siRNA 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TLR 길항제 (예, TLR3 및/또는 TLR7의 길항제 및/또는 TLR8의 길항제 및/또는 TLR9의 길항제), 화학치료제 (전통적인 화학요법 및 현대 표적화 요법), 표적화된 치료학적 물질, 활성화된 세포, 펩타이드, 단백질, 유전자 요법 벡터, 펩타이드 백신, 단백질 백신, DNA 백신, 보강제 및 공동-자극 분자 (예, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 트랜스-활성화 인자, 펩타이드 또는 변형된 아미노산을 포함하는 펩타이드) 또는 이들의 조합 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는, 본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 조절의 정도 또는 특이성을 강화하기 위해 다른 화합물과 조합하여 (예를 들어, 지질 또는 리포솜을 이용한 제형화하고, 펩타이드, 항체 또는 소분자와 접합됨) 투여될 수 있다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결을 포함한다. 구현예들에서, 뉴클레오티드 간 연결들 중 적어도 절반이 포스포로티오에이트이다. 구현예들에서, 뉴클레오티드 간 연결들 모두 포스포로티오에이트이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 90%이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 95%이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 97%이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 98%이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 99%이다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 100%이다.
기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 CRISPR-기반의 시스템의 올리고뉴클레오티드 또는 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 시스템인 구현예에서, 표적 RNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드의 일부분 (상보적인 도메인)은 전체 길이에서 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 또는 바람직하게는 적어도 100%이다.
본원에 기술된 화합물, 조성물 또는 방법들 중 임의의 경우에, 본 발명의 CSO는 서열 3'-CGGTCACTCCTCCGTGCG-5'-5'-GCCAGT-3', 3'-CGGTCACTCCTCCGTGCG-5'-5'-GCGAAT-3', 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'-3'-CGCACG-5', 5'-GCGTGCCTCCTCACGGC-3'-3'-GGAACC-5', 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'-3'-CGCAC-5', 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'-3'-GGAACCG-5', 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'-3'-CGCACGGA-5', 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'-3'-GGAAC-5' 또는 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'-3'-GGAACAG-5'을 가진 올리고뉴클레오티드가 아니다.
기능성 도메인
다양한 구현예에서, CSO의 기능성 도메인은 아래에서 추가로 상세히 기술한 올리고뉴클레오티드이다. CSO의 고리화 도메인 및 링커는 달리 언급되지 않은 한 상기에 언급한 바와 같다.
유전자 발현의 저해
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하며, 여기서, 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 5' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-45개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 표적 RNA에 대해 상보적이고; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 유전자 조절성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형된다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 유전자 조절성 올리고뉴클레오티드 (즉, 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드)로는 안티센스 올리고뉴클레오티드, microRNA (miRNA), piRNA, hnRNA, ncRNA, snRNA, sgRNA, esiRNA, shRNA 또는 lncRNA 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 변형된 뉴클레오베이스, 당 및/또는 뉴클레오티드 간 연결을 포함한다.
본원에 나타낸 바와 같이, 5'-5' 연결을 통해 고리화 도메인과 연결된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 CSO는 놀랍게도 증가된 효능을 나타내었다. 이러한 결과는 증가된 안정성 (예를 들어, 3'-3' 연결된 올리고뉴클레오티드)이 효능 증가로 이어질 것이라는 초기 가설과는 완전히 반대였다. 아울러, 5'-말단부의 결손은 CSO의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 덜 염증성이게 만들 것이다. 이러한 설계는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 선형 구조로 언폴딩되어, 표적 RNA가 발현된 세포에서 활성을 나타낼 수 있도록 허용한다.
CSO가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 경우, 이는 상보적인 표적 RNA의 존재 하에 선형 형태를 취하여 표적 RNA에 결합하는 한, 고리 형태로 존재한다. 고리 형태에서 선형 형태로의 변화는 열 용융 및 RNase H 절단 연구에 의해 검증할 수 있었다. 선형 형태에서, 기능성 도메인은 (최소한 생리학적 조건 하에) 상보적인 표적 RNA와 혼성화하여 듀플렉스를 형성한다. 이 듀플렉스는 RNase H의 존재 하에, 그리고 적절한 조건 (예, 생리학적) 하에 RNase H에 대한 기질이고, 듀플렉스의 RNA 가닥은 RNase H에 의해 절단되어 발현은 방지될 것이다.
안티센스 기능성 도메인을 포함하는 CSO는 세포 배양물에서 활성을 유지한다. 이러한 CSO에서 예상되는 이점은 이의 분자내 고리 구조의 형성이 비-표적화된 거대 분자 (핵산 및 단백질 포함)와의 상호작용을 낮추고, 다가 음이온-관련 부작용을 감소시키고, 표적화된 유전자 또는 RNA 존재 시에만 선형화된다 것이다. 아울러, 고리형 구조로 인해, 이들 CSO는 5'-말단부의 상호작용의 결여로 엔도솜으로부터 벗어날 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단리된 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "단리된"은 인간 개입을 통해 천연 상태에서 달라지거나 또는 취해지는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 올리고뉴클레오티드는 "단리된"이 아니지만, 이의 자연 상태에서 공존하는 물질로부터 일부 또는 완전히 분리된 올리고뉴클레오티드 또는 합성 올리고뉴클레오티드는 "단리된" 것이다. 단리된 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 올리고뉴클레오티드가 전달된 세포와 같이 비-천연 환경에 존재할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 정제된 DNA 및/또는 RNA, 실질적으로 순수한 DNA 및/또는 RNA, 합성 DNA 및/또는 RNA, 또는 재조합에 의해 생산된 DNA 및/또는 RNA, 뿐 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환 및/또는 변이에 의해 자연 생성 FNA 및/또는 RNA와 상이한 변이된 DNA 및/또는 RNA를 포괄할 수 있다. 이러한 변이는 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 절단에 저항성으로 만드는 변형을 비롯하여, 올리고뉴클레오티드의 말단(들) 또는 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 내부 뉴클레오티드 등에서의 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 포함한다.
용어 "microRNA", "miRNA" 및 "MiR"은 상호 호환적이며, 유전자 발현을 조절할 수 있는 내인성 또는 인공적인 비-암호화 RNA를 지칭한다. miRNA는 RNA 간섭을 통해 기능하는 것으로 생각된다. 이러한 microRNA의 설계는 당업자의 능력 내이다.
용어 "piRNA" 및 "Piwi-상호작용성 RNA"는 상호 호환적이며, 유전자 침묵화에 참여하는 소형 RNA 유형을 지칭한다. PiRNA 분자는 전형적으로 뉴클레오티드 26-31개 길이이다. 이러한 PiRNA의 설계는 당업자의 능력 내이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO2020/191177에 기술된 바와 같으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 구현예들에서, 기능성 도메인의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-25개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물을 포함하거나 또는 이로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 3' 도메인 및 5' 도메인을 포함하고, 3' 도메인은 뉴클레오티드 10-12개 길이이고 각각의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 및 포스포다이에스테르 또는 포스포티오에이트 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합물을 포함하고; 5' 도메인은 뉴클레오티드 5-15개 길이이고, 5' 도메인은 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 비-변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하되, 단 5' 도메인은 변형된 당 및/또는 백본을 포함하는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드를 적어도 1개 포함한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 "스플리트머"로 지칭된다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 스플리트머는 표적 RNA의 동일한 길이 일부분에 대해 상보적인 인접 뉴클레오베이스가 적어도 12개인, 연결된 뉴클레오티드 17-25개를 포함한다.
구현예들에서, 스플리트머의 변형된 리보뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같이 2'-치환된 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 2'-치환된 뉴클레오티드는 2' O-메틸 리보뉴클레오티드 또는 2'-MOE로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 3' 도메인은 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12번 위치에 뉴클레오티드들을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 도메인은 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11번 위치들에서 뉴클레오티드들을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 도메인은 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10번 위치들에서 뉴클레오티드들을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 도메인이 뉴클레오티드 12개 길이인 경우, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 식 (I)으로 표시된다:
5'-NmN14N13N12N11N10N9N8N7N6N5N4N3N2N1-3'
여기서,
N은 임의의 뉴클레오티드이고;
N13 내지 Nm은 5' 도메인을 포함하고;
N1 내지 N12는 3' 도메인을 포함하고; 및
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 도메인이 뉴클레오티드 11개 길이인 경우, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 식 (Ia)로 표시된다:
5'-NmN14N13N12N11N10N9N8N7N6N5N4N3N2N1-3'
여기서,
N은 임의의 뉴클레오티드이고;
N12 내지 Nm은 5' 도메인을 포함하고;
N1 내지 N11은 3' 도메인을 포함하고; 및
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 식 (Ib)로 표시된다:
5'-NmN14N13N12N11N10N9N8N7N6N5N4N3N2N1-3'
여기서,
N은 임의의 뉴클레오티드이고;
N11 내지 Nm은 5' 도메인을 포함하고;
N1 내지 N10은 3' 도메인을 포함하고; 및
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된다.
일부 구현예에서, m은 0이다. 일부 구현예에서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, m은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, m은 1, 2, 3, 4 또는 5로부터 선택된다. 일부 구현예에서, m은 1, 2, 3 또는 4로부터 선택된다. 일부 구현예에서, m은 1, 2 또는 3이다. 일부 구현예에서, m은 1이다. 일부 구현예에서, m은 2이다. 일부 구현예에서, m은 3이다. 일부 구현예에서, m은 4이다. 일부 구현예에서, m은 5이다. 일부 구현예에서, m은 6이다. 일부 구현예에서, m은 7이다. 일부 구현예에서, m은 8이다. 일부 구현예에서, m은 9이다. 일부 구현예에서, m은 10이다. 일부 구현예에서, m은 11이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 표적 RNA 서열의 동일한 길이 일부분에 대해 상보적인 인접한 뉴클레오베이스를 적어도 12개 포함하는 뉴클레오티드 17-25개 길이이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 3' 도메인, 및 3' 도메인과 인접한 5' 도메인을 포함하고, 3' 도메인은 뉴클레오티드 10-12개 길이이고 각각의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 및 포스포다이에스테르 또는 포스포티오에이트 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합을 포함하고; 및
5' 도메인은 뉴클레오티드 5-15개 길이이고, 5' 도메인은 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 비-변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하되, 단 5' 도메인은 변형된 당 및/또는 백본을 포함하는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드를 적어도 1개 포함한다.
구현예들에서, 3' 도메인은 뉴클레오티드 12개 길이이고, 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12번 위치에서 뉴클레오티드들을 포함한다 (1번 위치가 3' 말단이다). 구현예들에서, 3' 도메인은 뉴클레오티드 11개 길이이고, 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11번 위치에서 뉴클레오티드들을 포함한다. 구현예들에서, 3' 도메인은 뉴클레오티드 12개 길이이고, 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10번 위치에서 뉴클레오티드들을 포함한다.
구현예들에서, 3' 도메인의 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오베이스를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 도메인에서 뉴클레오티드의 뉴클레오베이스와 당은 비-변형된다. 이러한 측면에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 도메인에서 뉴클레오티드의 뉴클레오베이스와 당은 자연 생성된 것이다. 3' 도메인의 각각의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 및 포스포다이에스테르 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합을 포함한다. 3'-도메인의 뉴클레오티드는 RNase H를 활성화하는 것으로 알려진, 천연 데옥시리보스 당 및 포스포로티오에이트, 포스포다이에스테르 또는 기타 인-기반의 연결 또는 이들의 조합을 포함한다.
구현예들에서, 3' 도메인의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오베이스를 포함한다.
구현예들에서, 3' 말단으로부터 제9 또는 10번째 위치에 있는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 구현예들에서, 3' 말단으로부터 11번째 위치에 있는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다.
구현예들에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결을 포함한다.
구현예들에서, 적어도 절반 이상의 뉴클레오티드 간 연결이 포스포로티오에이트이다.
구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "5' 도메인"은 3' 도메인 다음에 놓인 첫번째 뉴클레오티드로부터 시작하는 뉴클레오티드를 지칭하고, 5' 말단까지 이어진다. 5' 도메인은 표적 RNA에 혼성화하지만, 이 도메인에서 RNase H가 표적 RNA를 자르도록 허용하지 않는다. 용어 "5' 도메인"은 일반적으로 뉴클레오티드 2-15개 길이이고, 3' 도메인의 길이에 따라 3' 말단으로부터 측정시 안티센스 올리고뉴클레오티드의 11번째부터 25번째까지의 뉴클레오티드 (1번째 뉴클레오티드는 3' 말단임), 12번째부터 25번째까지의 뉴클레오티드 또는 13번째부터 25번째까지의 뉴클레오티드를 지칭한다.
예를 들어, 뉴클레오티드 17개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 1번에서 10번까지 3' 도메인과 11번에서 17번까지 5' 도메인을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드에 대한 지정은 뉴클레오티드-특이적인 것과는 대조적으로 위치-특이적이다.
5' 도메인은 RNase H를 활성화하지 않는 변형된 당 및/또는 변형된 백본과 같은 non-RNase H 활성화 변형을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 당을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 당 및 변형된 백본을 둘다 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 변형된 백본은 비-인-기반의 백본 (non-phosphorus-based backbone)이다.
이러한 안티센스 설계는 3' 도메인의 5' 말단 방향으로 특이적인 부위에서 표적화된 RNA 절단을 허용한다.
이러한 구현예들 중 임의 구현예에서, 5' 도메인은 백본 변형 또는 치환 및/또는 당 변형 또는 치환을 가진 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 5' 도메인 내 한 위치, 5' 도메인 내 일부 위치들, 또는 5' 도메인 내 모든 위치에서 뉴클레오티드는 백본 변형 또는 치환 및/또는 당 변형 또는 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 2개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 3개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 4개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 5개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 6개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 7개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인은 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 적어도 8개 포함한다. 일 구현예에서, 5' 도메인의 모든 뉴클레오티드들이 변형된 백본 및/또는 당을 포함하는 뉴클레오티드이다.
본원에 논의된 구현예들은 특이적인 뉴클레오티드 및 위치 맥락에서 3' 말단을 기준으로 한 위치에서 구현될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 13번 위치에 변형된 뉴클레오티드를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 13번 위치에 변형된 뉴클레오티드를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이의 전체 길이에 대해 표적 RNA의 일부분에 대한 상보성이 적어도 90%이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 "갭머"이다. 본원에 사용된 바와 같이, 갭머는 RNase H 절단을 유도하기에 충분히 긴 데옥시뉴클레오티드 모노머들의 중심 블럭을 가진 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 통상적으로, 본 발명의 갭머는 표적 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 겨냥한다. 이러한 갭머의 설계는 당업자의 능력 내이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2개의 외부 영역 또는 "윙"과 중앙 또는 내부 영역 또는 "갭"에 의해 정의되는 갭머 모티프를 가진 영역을 포함하거나 또는 구성되는 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 갭머 모티프의 3개의 영역 (5'-윙, 갭 및 3'-윙)은 뉴클레오시드들로 된 연속적인 서열을 형성하는데, 각 윙의 뉴클레오시드의 당 모이어티 중 적어도 일부는 갭의 뉴클레오시드의 당 모이어티들 중 적어도 일부와 상이하다. 구체적으로, 적어도 갭에 가장 가까운 각각의 윙의 뉴클레오시드들 (5'-윙의 최대 3'-뉴클레오시드와 3'윙의 최대 5'-뉴클레오시드)의 당 모이어티는 이웃한 갭 뉴클레오시드의 당 모이어티와는 상이하므로, 윙과 갭 사이에 경계 (즉, 윙/갭 정션)가 정의된다. 특정 구현예에서, 갭 내 당 모이어티들은 서로 동일하다. 특정 구현예에서, 갭은 갭의 하나 이상의 다른 뉴클레오시드의 당 모이어티와는 다른 당 모이어티를 가진 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 윙 2개의 당 모티프는 서로 동일하다 (대칭 갭머). 특정 구현예에서, 5'-윙의 당 모티프는 3'-윙의 당 모티프와 다르다 (비-대칭 갭머).
특정 구현예에서, 갭머의 윙들은 독립적으로 뉴클레오시드를 1-6개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 윙들은 독립적으로 뉴클레오시드를 1-5개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 윙들은 뉴클레오시드를 동일한 개수로 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 윙들은 뉴클레오시드를 4개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 각각의 윙의 각각의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 7-24개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 7-18개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 9-14개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 7-23개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 9개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 10개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 11개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 13개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 14개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 17개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭은 뉴클레오시드를 18개 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 갭에서 각각의 뉴클레오시드는 비-변형된 2'-데옥시 뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, 갭머는 데옥시 갭머이다. 구현예들에서, 각각의 윙/갭 정션의 갭 측에 놓인 뉴클레오시드는 비-변형된 2'-데옥시 뉴클레오시드이고, 각각의 윙/갭 정션의 윙 측에 놓인 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 갭의 각각의 뉴클레오시드는 비-변형된 2'-데옥시 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 갭머의 각각의 윙에서 각각의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이다.
본원에서, 갭머의 3개의 영역의 길이 (뉴클레오시드의 수)는 표기법 [5'-윙의 뉴클레오시드의 #] - [갭의 뉴클레오시드 #] - [3'-윙의 뉴클레오시드 #]으로 나타낼 수 있다. 따라서, 5-10-5 갭머는 각 윙 내 연결된 뉴클레오시드 5개와 갭에서 연결된 뉴클레오시드 10개로 구성된다. 이러한 명명법 다음으로 특이적인 변형이 배치된 경우, 변형은 윙에서의 변형이고, 갭 뉴클레오시드는 비-변형된 데옥시뉴클레오시드 당을 포함한다. 따라서, 5-11-5 MOE 또는 OMe 갭머는 5'윙에 연결된 MOE 또는 OMe 변형된 뉴클레오시드 5개, 갭에 연결된 데옥시뉴클레오시드 11개, 및 3'-윙에 연결된 MOE 또는 OMe 뉴클레오시드 5개로 구성된다.
특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 4-13-4 MOE 또는 OMe 갭머이다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 5-11-5 MOE 또는 OME 갭머이다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 3-15-3 BNA 갭머이다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 3-15-3 LNA 갭머이다.
본원에 기술된 임의 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 완전히 변형된 당 모이어티를 가진 영역을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 이러한 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 완전 변형된 영역의 각각의 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 전체 변형된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 완전히 변형된 당 모이어티를 가진 영역을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 여기서 완전히 변형된 영역 내 각각의 뉴클레오시드는 본원에서 단일하게 변형된 당 모이어티 (uniformly modified sugar motif)로서 언급되는 동일한 변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 완전히 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일하게 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 단일하게 변형된 각각의 뉴클레오시드는 동일한 2'-변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일하게 변형된 당 모티프는 뉴클레오시드 12-30개 길이이다. 특정 구현예에서, 단일하게 변형된 당 모티프의 각각의 뉴클레오시드는 2'-치환된 뉴클레오시드, 당 서로게이트 (sugar surrogate) 또는 이환식 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 단일하게 변형된 당 모티프의 각각의 뉴클레오시드는 2'-OCH2CH2OCH3 기 또는 2'-OCH3 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 완전히 변형된 당 모티프를 가진 변형된 올리고뉴클레오티드는 2'-데옥시뉴클레오시드를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개 가질 수 있다.
유전자 침묵화에 유용한 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에 대한 예로는 표 1의 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드들이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 표 1에서 올리고뉴클레오티드 # 1-6은 프로단백질 컨버타제 섭틸리신/케신 타입 9 (PCSK9)를 표적으로 한다. 표 1에서 올리고뉴클레오티드 # 1512-1520, 1536-1545 및 1605는 파타틴-유사 포스포리파제 도메인-함유 단백질 3 (PNPLA3)를 표적으로 한다. 임의의 기타 대상 표적을 겨냥하는 기능성 도메인을 가진 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 당해 기술 분야의 당업자의 능력 내에서 충분하다. 모든 뉴클레오티드 간 연결은 달리 언급되지 않은 한 포스포로티오에이트 연결이다.
표 1
| 화합물 # | 서열번호(들) | 서열 |
| 1 | 서열번호 146 & 서열번호 1 | 3'-T2C2G2T2G2G-5'-5'-GGTCTCCTCCATCAGCACC-3' |
| 2 | 서열번호 147 & 서열번호 2 | 3'-T2C2G2T2G2G2-5'-5'-G1G1U1CTCCTCCATCAGCA1C1C1-3' |
| 3 | 서열번호 147 & 서열번호 3 | 3'-T2C2G2T2G2G2-5'-5'-G1G1U1C1U1C1CTCCATCAGCACC-3' |
| 4 | 서열번호 4 | 5'-GGTCTCCTCCATCAGCACC-3' |
| 5 | 서열번호 5 & 서열번호 148 | 5'-GGTCTCCTCCATCAGCACC-3'-3'-C2C2A2G2A2G-5' |
| 6 | 서열번호 6 & 서열번호 6 | 3'-CCACGACTACCTCCTCTGG-5'-5'-GGTCTCCTCCATCAGCACC-3' |
| 1605 | 서열번호 59 & 서열번호 149 | 3'-GACGAAGTAGGGGAAGATG-5'-5'-CTGCTTC-3' |
| 1512 | 서열번호 61 & 서열번호 150 | 3'-GACGAAGTAGGGGAAGATG-5'-5'-CTGCTT-3' |
| 1513 | 서열번호 62 & 서열번호 151 | 3'-GACGAAGTAGGGGAAGATG-5'-5'-CTGCT-3' |
| 1514 | 서열번호 63 & 서열번호 152 | 3'-GACGAAGTAGGGGAAGATG-5'-5'-CTGC-3' |
| 1515 | 서열번호 64 & 서열번호 153 | 3'-GACGAAGTAGGGGAAGATG-5'-5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 1516 | 서열번호 65 & 서열번호 154 | 3'-GACGAAGTAGGGGAAGATG-5'-5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 1517 | 서열번호 66 & 서열번호 153 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 1518 | 서열번호 67 & 서열번호 154 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 1519 | 서열번호 68 & 서열번호 153 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 1520 | 서열번호 69 & 서열번호 154 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 1536 | 서열번호 .70 & 서열번호 149 | 3'-GACGAAGTACGGGAAGATG-5'-5'-CTGCTTC-3' |
| 1537 | 서열번호 71 & 서열번호 150 | 3'-GACGAAGTACGGGAAGATG-5'-5'-CTGCTT-3' |
| 1538 | 서열번호 72 & 서열번호 151 | 3'-GACGAAGTACGGGAAGATG-5'-5'-CTGCT-3' |
| 1539 | 서열번호 73 & 서열번호 152 | 3'-GACGAAGTACGGGAAGATG-5'-5'-CTGC-3' |
| 1540 | 서열번호 74 & 서열번호 153 | 3'-GACGAAGTACGGGAAGATG-5'-5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 1541 | 서열번호 75 & 서열번호 154 | 3'-GACGAAGTACGGGAAGATG-5'-5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 1542 | 서열번호 76 & 서열번호 153 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 1543 | 서열번호 77 & 서열번호 154 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 1544 | 서열번호 78 & 서열번호 153 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 1545 | 서열번호 79 & 서열번호 154 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 1546 | 서열번호 130 & 서열번호 150 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCTT-3' |
| 1547 | 서열번호 131 & 서열번호 151 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCT-3' |
| 1548 | 서열번호 132 & 서열번호 150 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCTT-3' |
| 1549 | 서열번호 133 & 서열번호 151 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCT-3' |
| 1550 | 서열번호 134 & 서열번호 150 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCTT-3' |
| 1551 | 서열번호 135 & 서열번호 151 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCT-3' |
| 1552 | 서열번호 136 & 서열번호 150 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCTT-3' |
| 1553 | 서열번호 137 & 서열번호 151 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CTGCT-3' |
| 1554 | 서열번호 138 & 서열번호 156 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2TT2-3' |
| 1555 | 서열번호 139 & 서열번호 157 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2T-3' |
| 1556 | 서열번호 140 & 서열번호 156 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2TT2-3' |
| 1557 | 서열번호 141 & 서열번호 157 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2T-3' |
| 1558 | 서열번호 142 & 서열번호 156 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2TT2-3' |
| 1559 | 서열번호 143 & 서열번호 157 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2T-3' |
| 1560 | 서열번호 144 & 서열번호 156 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2TT2-3' |
| 1561 | 서열번호 145 & 서열번호 157 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-CT2GC2T-3' |
| 1562 | 서열번호 138 & 서열번호 213 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2T-3' |
| 1563 | 서열번호 139 & 서열번호 214 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2-3' |
| 1564 | 서열번호 140 & 서열번호 213 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2T-3' |
| 1565 | 서열번호 141 & 서열번호 214 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2-3' |
| 1566 | 서열번호 142 & 서열번호 213 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2T-3' |
| 1567 | 서열번호 143 & 서열번호 214 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2-3' |
| 1568 | 서열번호 144 & 서열번호 213 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2T-3' |
| 1569 | 서열번호 145 & 서열번호 214 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C2TG2CT2-3' |
| 1570 | 서열번호 138 & 서열번호 215 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3T3-3' |
| 1571 | 서열번호 139 & 서열번호 216 | 3'-GACGAAGTAGG1 G 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3-3' |
| 1572 | 서열번호 140 & 서열번호 215 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3T3-3' |
| 1573 | 서열번호 141 & 서열번호 216 | 3'-GACGAAGTAGGG 1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3-3' |
| 1574 | 서열번호 142 & 서열번호 215 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3T3-3' |
| 1575 | 서열번호 143 & 서열번호 216 | 3'-GACGAAGTACG1G1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3-3' |
| 1576 | 서열번호 144 & 서열번호 215 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3T3-3' |
| 1577 | 서열번호 145 & 서열번호 216 | 3'-GACGAAGTACGG1G1A1A1G1A1T1G1-5'-5'-C3T3G3C3T3-3' |
GCAT- DNA 포스포로티오에이트 연결; G1/C1/A1/U1 - 2'OME 포스포로티오에이트 연결; A2/T2/C2/G2 - DNA 포스포다이에스테르 연결; G = 7-데아자-G; A3/T3/C3/G3 - RNA 포스포다이에스테르 연결
특정 구현예에서, 표적 핵산 (표적 RNA)은 뮤라인 표적 서열이다. 특정 구현예에서, 표적 핵산 (표적 RNA)은 인간 표적 서열이다.
특정 구현예에서, PCSK9 핵산은 GENBANK 등재번호 NM_153565.2에 기재된 뮤라인 서열 (본원에서 서열번호 57로 통합)이다. 특정 구현예에서, PCSK9 핵산은 GENBANK 등재번호 NM_174936.3에 기재된 인간 서열 (본원에서 서열번호 58로 통합)이다.
특정 구현예에서, PNPLA3 핵산은 GENBANK 등재번호 NM_054088.3 (본원에 서열번호 80으로 통합)에 기재된 뮤라인 서열이다. 특정 구현예에서, PCSK9 핵산은 GENBANK 등재번호 NM_025225.2 (본원에 서열번호 81로 통합)에 기재된 인간 서열이다. 특정 구현예에서, PCSK9 핵산은 GENBANK 등재번호 XM 001109144.3 (본원에 서열번호 82로 통합)에 기재된 레수스 원숭이 서열이다. 특정 구현예에서, PCSK9 핵산은 GENBANK 등재번호 XM_005567051.2 (본원에 서열번호 83으로 통합)에 기재된 시노몰구스 원숭이 서열이다.
siRNA
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 siRNA이다. siRNA는 RNA를 표적으로 하는, 뉴클레오티드 약 15 내지 약 50개 길이, 바람직하게는 뉴클레오티드 약 18 내지 약 36개 길이의 짧은 이중 가닥 RNA를 포함한다.
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하며, 여기서 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 5' 또는 3' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-50개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 표적화된 RNA에 대해 상보적이고; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-100개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 siRNA를 포함한다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 siRNA의 가닥의 서열과 동일한 길이를 가진다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 siRNA의 가닥의 서열보다 더 길다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 siRNA의 가닥의 서열보다 짧다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-50개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 15-45개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 15-45개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 길이이다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-10개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 6-10개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 6-8개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구현예들에서, 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 길이이다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 siRNA 가닥에 대해 적어도 95% 상보성을 가진다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 siRNA 가닥에 대해 적어도 97% 상보성을 가진다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 siRNA 가닥에 대해 적어도 98% 상보성을 가진다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 siRNA 가닥에 대해 적어도 99% 상보성을 가진다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 siRNA 가닥에 대해 적어도 100% 상보성을 가진다.
용어 "siRNA" 및 "짧은 간섭 RNA"는 상호 호환되고, RNA 간섭을 유도할 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. siRNA 분자는 전형적으로 18-36 염기쌍 길이의 듀플렉스 영역을 가진다. 이러한 siRNA의 설계는 당업자의 능력 내이다.
일 구현예에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA일 경우, 고리화 도메인은 링커 분절을 통해 siRNA의 센스 가닥의 5'-말단에서 부착된다 (도 2A 참조). 일 구현예에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA일 경우, 고리화 도메인은 링커 분절을 통해 siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단부에서 부착된다.
다른 구현예에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 siRNA의 안티센스 가닥일 경우, 고리화 도메인은 siRNA의 센스 가닥이고 안티센스 가닥의 3'- 또는 5'-말단부에서 부착된다 (도 2B 및 2C 참조). 다시 말해, 이러한 구현예에서, siRNA의 센스 가닥은 또한 고리화 도메인으로 작용한다.
본 발명의 siRNA의 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥은 또한 3'-오버행을 포함할 수 있다. "3' 오버행"은 RNA 가닥의 3'-말단부에서 연장된 하나 이상의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 지칭한다. 즉, 일 측면에서, 본 발명의 siRNA는 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함하는) 뉴클레오티드 1 내지 약 6개 길이, 바람직하게는 뉴클레오티드 1 내지 약 5개 길이, 더 바람직하게는 뉴클레오티드 1 내지 약 4개 길이, 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 약 1 내지 약 2개 길이의 3' 오버행을 하나 이상 포함한다.
siRNA 분자의 양쪽 가닥이 3' 오버행을 포함하는 경우, 오버행의 길이는 각 가닥에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 3' 오버행은 siRNA의 양쪽 가닥에 존재하고, 뉴클레오티드 2개 길이이다. siRNA의 안정성을 강화하기 위해, 3' 오버행은 또한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 일 구현예에서, 오버행은 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드와 같은 퓨린 뉴클레오티드를 함유함으로써 안정화된다.
대안적으로, 피리미딘 뉴클레오티드에서 변형된 유사체로의 치환, 예를 들어 3' 오버행에서 우리딘 뉴클레오티드의 2'-데옥시티미딘으로의 치환은 허용되며, RNAi 분해 효율에는 영향을 미치지 않는다. 특히, 2'-데옥시티미딘에서 2' 하이드록실의 생략은 조직 배양 배지 중에 3' 오버행의 뉴클레아제 내성을 유의하게 강화한다.
본 발명의 siRNA는 표적 mRNA 서열의 약 18-30, 바람직하게는 19-25개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 임의 가닥에 대해 표적화할 수 있다. siRNA에 대한 표적 서열을 선별하는 기법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 따라서, 본 siRNA의 센스 가닥은 표적 mRNA에서 뉴클레오티드 약 18 내지 약 30개 길이의 임의의 연속 가닥에 대해 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
스플라이싱 올리고뉴클레오티드
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하며, 여기서 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 5' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-45개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 표적 RNA에 대해 상보적이며; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 스플라이싱 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 변형된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스플라이싱 올리고뉴클레오티드"는 스플라이싱을 조절하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 스플라이스 조절을 위해, 안티센스는 표적 RNA에 결합해 스플라이싱을 조절함으로써 단백질의 발현을 조절한다. 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드에서, 고리화 도메인은 3' 말단 또는 5' 말단에서 부착되어 고리형 구조를 형성한다. 바람직한 구현예에서, 고리화 도메인은 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로 부착된다. 고리형 구조는 단백질 결합의 저하, 다가 음이온 특징 저하 및 엔도솜 탈출을 허용하고 패턴 인지 수용체와의 상호작용을 완화하는 말단에 대한 접근성 결여를 가능하게 한다.
구현예들에서, 스플라이싱을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드는 snRNA이다. 용어 "snRNA" 및 "소형 핵 RNA"는 상호 호환적으로 사용되고, RNA 스플라이싱 및 전사 인자 조절 등의 다양한 과정에 참여하는 소형 RNA 부류를 지칭한다. 소형 뉴클레올러 RNA (small nucleolar RNA, snoRNA)의 하위군 역시 포함된다. 이 용어는 또한 snRNA의 안티센스 유도체와 같은 인공 snRNA를 망라하는 것으로 의도된다. 이러한 snRNA의 설계는 당업자의 능력 내이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 WO 2021/055011에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 구체적으로, 구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 잔류 인트론을 포함하는 표적 pre-mRNA에 대해 상보적인 14-30개 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 영역 1-3개를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성 또는 제약된 당 (constrained sugar) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 스플라이싱을 조절하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기능성 도메인을 가진 CSO는 mRNA 전사체를 적어도 2개 포함하는 유전자에서 제1 mRNA 전사체를 선택하는데 유용하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 영역에 대해 상보적인 적어도 12개의 연속적인 뉴클레오시드를 포함하고; 올리고뉴클레오티드는 제2 mRNA 전사체에 대한 pre-mRNA의 스플라이스 부위를 표적으로 함으로써, 제2 mRNA 전사체에 대한 스플라이스 부위를 차단하고 pre-mRNA에서 제1 mRNA 전사체로의 스플라이싱을 지시한다. 구현예들에서, 2'-치환된 뉴클레오티드는 2' O-메틸 리보뉴클레오시드 또는 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오시드 (MOE)로부터 선택된다.
구현예들에서, 스플라이싱 올리고뉴클레오티드는 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 영역 하나를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 2'-치환된, 비-이온성 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 스플라이싱 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드들을 포함하는 영역 2개를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 2'-치환된, 비-이온성 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, 스플라이싱 올리고뉴클레오티드는 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 영역 3개를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드들은 2'-치환된, 비-이온성 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 뉴클레오티드 2-4개 길이이다. 일부 구현예에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 뉴클레오티드 4개 길이이다.
구현예들에서, 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 또는 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하거나 또는 2'-치환된, 비-이온성, 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합 옆에 위치한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 2'-치환된, 비-이온성, 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합의 측면에 위치한다.
구현예들에서, 스플라이싱 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 잔류 인트론을 포함하는 표적 pre-mRNA의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 적어도 12개의 연속적인 뉴클레오시드를 가진 14-30개의 연결된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 영역 1-3개를 포함하고, 각각의 영역은 독립적으로 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하고 나머지 뉴클레오티드는 2 '-치환된, 비-이온성 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 2'-치환된 뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같다. 구현예들에서, 2'-치환된 뉴클레오티드는 2' O-메틸 리보뉴클레오티드 또는 2'-MOE로부터 선택된다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 영역 하나를 포함한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드들은 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에, 2'-치환된, 비-이온성, 또는 제약된 당 뉴클레오티드의 측면에 또는 이들의 조합에 위치한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드들은 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드는 스플라이싱 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다.
구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드들은 뉴클레오티드 2-4개 길이이다. 구현예들에서, 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드들은 뉴클레오티드 4개 길이이다.
구현예들에서, 엑손은 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 측면에 위치한다. 구현예들에서, 엑손은 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 측면에 위치한다. 구현예들에서, 엑손이 잔류 인트론의 5' 스플라이스 부위 옆에 위치하고, 엑손이 잔류 인트론의 3' 스플라이스 부위 옆에 위치한다.
스플라이싱에 이용가능한 고리형 올리고뉴클레오티드에 대한 예로는 표 2의 고리형 올리고뉴클레오티드가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 표 2에서 올리고뉴클레오티드들은 DMD를 표적으로 한다. 임의의 기타 대상 표적을 겨냥하는 기능성 도메인을 가진 고리형 올리고뉴클레오티드들은 당해 기술 분야의 당업자의 능력 내에서 충분하다.
표 2
| 화합물 # | 서열번호 | 서열 |
| 7 | 서열번호 158 & 서열번호 7 | 3'- A2T2G2G2A2 -5'-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3' |
| 8 | 서열번호 159 & 서열번호 8 | 3'-A2A2T2G2G2A2-5'-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3' |
| 9 | 서열번호 160 & 서열번호 9 | 3'-A1A1U1G1G1A1-5'-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3' |
| 10 | 서열번호 10 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 11 | 서열번호 11 & 서열번호 162 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2T2-5' |
| 12 | 서열번호 12 & 서열번호 163 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3'-3'-C1C1G1G1U1U1-5' |
| 13 | 서열번호 158 & 서열번호 13 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G2G2C2C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3' |
| 14 | 서열번호 158 & 서열번호 14 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A2A2A2C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3' |
| 15 | 서열번호 158 & 서열번호 15 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C2T2C2G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3' |
| 16 | 서열번호 158 & 서열번호 16 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G2C2T2U1A1C1C1U1-3' |
| 17 | 서열번호 158 & 서열번호 17 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G2G2C2C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C1U1-3' |
| 18 | 서열번호 158 & 서열번호 18 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C2C2T2-3' |
| 19 | 서열번호 158 & 서열번호 19 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G2G2C2C2A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3' |
| 20 | 서열번호 158 & 서열번호 20 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A2A2A2C2C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3' |
| 21 | 서열번호 158 & 서열번호 21 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C2T2C2G2G1C1U1U1A1C1C1U1-3' |
| 22 | 서열번호 158 & 서열번호 22 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G2C2T2T2A1C1C1U1-3' |
| 23 | 서열번호 158 & 서열번호 23 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C2T2T2A2C2C2T2-3' |
| 24 | 서열번호 158 & 서열번호 24 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1T2T2A2C2C2T2-3' |
| 25 | 서열번호 158 & 서열번호 25 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1T2A2C2C2T2-3' |
| 26 | 서열번호 158 & 서열번호 26 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C2C2T2-3' |
| 27 | 서열번호 158 & 서열번호 27 | 3'- A2T2G2G2A2 -5-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C2T2-3' |
| 28 | 서열번호 28 & 서열번호 161 | 5'-G2G2C2C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 29 | 서열번호 29 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A2A2A2C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 30 | 서열번호 30 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C2T2C2G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 31 | 서열번호 31 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G2C2T2U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 32 | 서열번호 32 & 서열번호 161 | 5'-G2G2C2C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 33 | 서열번호 33 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 34 | 서열번호 34 & 서열번호 161 | 5'-G2G2C2C2A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 35 | 서열번호 35 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A2A2A2C2C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 36 | 서열번호 36 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C2T2C2G2G1C1U1U1A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 37 | 서열번호 37 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G2C2T2T2A1C1C1U1-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 38 | 서열번호 38 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C2T2T2A2C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 39 | 서열번호 39 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1T2T2A2C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 40 | 서열번호 40 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1T2A2C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 41 | 서열번호 41 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C2C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 42 | 서열번호 42 & 서열번호 161 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A1C1C2T2-3'-3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 43 | 서열번호 164 & 서열번호 43 | 3'- A1U1G1G1A1 -5'-5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3' |
| 44 | 서열번호 44 & 서열번호 165 | 5'-G1G1C1C1A1A1A1C1C1U1C1G1G1C1U1U1A2C2C2T2-3'-3'-C1C1G1G1U1-5' |
G1/C1/A1/U1 - 2'OME 뉴클레오티드; A2/T2/C2/G2 - 데옥시리보뉴클레오티드
ADAR
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하고, 여기서 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 5' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-500개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 표적화된 RNA에 대해 상보적이고; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 시스템의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 내인성 ADAR (RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제) 효소를 동원해 내인성 전사체를 편집하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. ADAR은 RNA 편집으로 알려진 공정으로 아데노신 (A)에서 이노신 (I)으로의 변환을 촉매하는 효소 군이다. ADAR이 여러가지 타입의 RNA에 작용할 수 있지만, mNRA의 암호화 영역에서 편집 현상은 구아노신 (G)과 같이 I의 염기 쌍이므로 특히 흥미롭다. 즉, ADAR에 의해 촉매화된 모든 A에서 I로의 변화는 번역시 A에서 G로의 변화로 읽히며, 잠재적으로 단백질 서열 및 기능을 바꾼다. 이러한 재-암호화 능력은 ADAR을 매력적인 치료학적 도구로 만들어 mRNA 내 유전자 돌연변이를 교정한다.
ADAR 시스템의 올리고뉴클레오티드는 자체적으로 하나 이상의 도메인을 포함한다. 상보성 도메인으로 알려진 도메인 하나는 표적 RNA에 대해 상보적인 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 영역을 포함한다. 구현예들에서, 상보성 도메인은 뉴클레오티드 약 15 내지 약 120개 길이이다. 구현예들에서, 상보성 도메인은 뉴클레오티드 약 17 내지 약 60개 길이이다. 동원 도메인으로 알려진 다른 도메인은 ADAR 효소를 동원하는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 영역을 포함한다.
CRISPR
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하고, 여기서 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 5' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 17-500개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 표적화된 RNA에 대해 상보적이고; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 안티센스 CRISPR-기반의 시스템의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 CRISPR에 기반한 시스템에서 가이드 RNA로서 기능하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "sgRNA" 및 "가이드 RNA"는 상호 호환적으로 사용되고, 대상 표적 DNA 또는 RNA 영역을 인지하여 편집하기 위해 이곳으로 엔도뉴클레아제를 유인하는 특이적인 RNA 서열을 지칭한다. gRNA는 통상적으로 2개의 파트로 구성된다: crispr RNA (crRNA), 즉 표적 DNA에 대해 상보적인 17-30개의 뉴클레오티드 서열, 및 Cas 뉴클레아제에 대한 결합 스캐폴드로서 이용되는 tracr RNA.
임의의 적합한 조작된 sgRNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA는, 표적 DNA 또는 RNA를 인지하는데 유효한 한 이용가능하다. 이러한 sgRNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA에 대한 설계는 당업자의 능력 내이다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하며, 여기서 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 3' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 11-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 척추동물에서 인터페론 반응을 유도할 수 있다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 다른 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표적 RNA에 대해 상보적이지 않으며 결합하지 않는다. 이러한 구현예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 아니고, 안티센스 활성을 가지지 않는다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 11-40개 길이이다. 구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 15-28개 길이이다. 구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-25개 길이이다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 서열과 동일한 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 서열보다 길다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 서열보다 짧다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 11-40개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 15-28개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 17-25개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-10개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-8개 길이이다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포다이에스테르 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포다이에스테르이다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트와 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결의 조합이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포다이에스테르 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포다이에스테르이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트와 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결의 조합이다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트이고, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포다이에스테르이거나, 또는 그 역도 가능하다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드로는 엔도솜 Toll-유사 수용체, RIG 유사 수용체, STING, cGAS 및 인플라마솜 (inflammasome)을 통해 면역자극을 유도하는 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. Toll-유사 수용체 (TLR)는 잠재적으로 유해한 병원체를 검출함으로써 선천적인 면역 반응의 개시에 중요한 역할을 수행하는 패턴 인지 수용체 (PRR)이다. 각각의 TLR은 광범위한 특이성을 가지며, 예를 들어, TLR1, 2, 4-6은 박테리아 지질을 인지하고, TLR3, 7 및 8은 바이러스 RNA를 인지하고, TLR9는 CG 모티프를 포함하는 박테리아 DNA를 인지하고, TLR5 및 10은 박테리아 또는 기생충 단백질을 인지한다. 이러한 면역자극 올리고뉴클레오티드의 설계는 당업자의 능력 내이다.
구현예들에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우, 고리화 도메인은 기능성 도메인의 5'-말단부 또는 3'-말단부에 링커 분절을 통해 부착된다 (예를 들어, 도 3 참조). 구현예들에서, 고리화 도메인은 5' 말단에서 부착된다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 3' 말단에서 부착된다.
다른 구현예에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고, 고리화 도메인은 다른 면역자극성 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 고리화 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며, 기능성 도메인의 3' 말단에서 부착된다. 다시 말해, 이러한 구현예에서, 고리화 도메인은 또한 면역자극성 올리고뉴클레오티드로 작용한다.
면역자극에 유용한 고리형 올리고뉴클레오티드에 대한 예로는 표 3의 고리형 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 표 3에서 올리고뉴클레오티드는 CpG 다이뉴클레오티드를 포함하고 Toll-유사 수용체 9 (TLR-9)를 활성화한다. 임의의 다른 대상 PRR 또는 TLR을 겨냥하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기능성 도메인을 가진 고리형 올리고뉴클레오티드들은 당해 기술 분야의 당업자의 기술에서 충분하다.
표 3
| 화합물 # | 서열번호 | 서열 |
| 45 | 서열번호 166 & 서열번호 45 | 3'- TAGCA -5'-5'-TCGTAACGTTACGTATTCGAATCGT-3' |
| 46 | 서열번호 167 & 서열번호 46 | 3'-TTAGCA-5'-5'-TCGTAACGTTACGTATTCGAATCGT-3'' |
| 47 | 서열번호 168 & 서열번호 47 | 3'-ATGCT-5'-5'-ACGATTCGAATACGTAACGTTACGA-3' |
| 48 | 서열번호 169 & 서열번호 48 | 3'-AATGCT-5'-5'-ACGATTCGAATACGTAACGTTACGA-3' |
| 49 | 서열번호 170 & 서열번호 49 | 5'-TTACGA-3'-3'-TGCTAAGCTTATGCATTGCAATGCT-5' |
| 50 | 서열번호 171 & 서열번호 50 | 5'-TACGA-3'-3'-TGCTAAGCTTATGCATTGCAATGCT-5' |
| 51 | 서열번호 172 & 서열번호 51 | 5'-AATGCT -3'-3'-AGCATTGCAATGCATAAGCTTAGCA-5' |
| 52 | 서열번호 173 & 서열번호 52 | 5'- ATGCT -3'-3'-AGCATTGCAATGCATAAGCTTAGCA-5' |
| 53 | 서열번호 53 & 서열번호 55 | 5'-TCGTAACGTTACGTATTCGAATCGT-3'-3'-AGCATTGCAATGCATAAGCTTAGCA-5' |
| 54 | 서열번호 54 & 서열번호 56 | 3'-AGCATTGCAATGCATAAGCTTAGCA-5'-5'-TCGTAACGTTACGTATTCGAATCGT-3' |
| 55 | 서열번호 84 & 서열번호 85 | 5'-T2C2G2T2A2A2C2G2T2T2A2C2G2T2A2T2T2C2G2A2A2T2C2G2T2-3'-3'-A2G2C2A2T2T2G2C2A2A2T2G2C2A2T2A2A2G2C2T2T2A2G2C2A2-5' |
| 1101 | 서열번호 86 & 서열번호 174 | 5'-TCGTATCGTAACGTATTCGAATCGT-3'-3'-AGCATAGCATTGCATAAGCTTAGCA-5' |
| 1102 | 서열번호 87 & 서열번호 175 | 5'-T2C2G2T2A2T2CGTAACGTATTCGAATCGT-3'-3'-AGCATAGCATTGCATAAGCT2T2A2G2C2A2-5' |
| 1103 | 서열번호 88 & 서열번호 176 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC-3'-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 1104 | 서열번호 89 & 서열번호 177 | 5'-TCGACUTGAACGATTCGAATACGTAAC-3'-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 1105 | 서열번호 90 & 서열번호 178 | 5'-TCGACTTIAACGATTCGAATACGTAAC-3'-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 1106 | 서열번호 91 & 서열번호 179 | 5'-T2C2G2A2C2T2TGAACGATTCGAATACGTAAC-3'-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATG2C2A2T2T2G2-5' |
| 1107 | 서열번호 92 & 서열번호 180 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTAT-5' |
| 1108 | 서열번호 93 & 서열번호 181 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCT -5' |
| 1109 | 서열번호 94 & 서열번호 182 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-3'-AGCTGAACTTGCT-5' |
| 1110 | 서열번호 95 & 서열번호 183 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC-3'-3'-AGCTGA -5' |
| 1111 | 서열번호 96 & 서열번호 184 | 5'-T2C2G2A2C2T2TGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-3'-A2G2C2T2G2A2-5' |
| 1112 | 서열번호 97 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3' |
| 1113 | 서열번호 98 & 서열번호 185 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC-3'-L-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 1114 | 서열번호 99 & 서열번호 186 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-L-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 1115 | 서열번호 100 & 서열번호 187 | 5'-TCGACTTGA2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-L-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2ATGCATTG-5' |
| 1116 | 서열번호 101 & 서열번호 188 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-L-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTAT-5' |
| 1117 | 서열번호 102 & 서열번호 189 | 5'-TCG ACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-L-3'-AGCTGAACTTGCTAAGCT -5' |
| 1118 | 서열번호 103 & 서열번호 190 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGT AAC -3'-L-3'-AGCTGAACTTGCT-5' |
| 1119 | 서열번호 104 & 서열번호 191 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGT AAC -3'-L-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2 -5' |
| 1120 | 서열번호 105 & 서열번호 192 | 5'-TCG ACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'L-3'-AGCTGA -5' |
| 1121 | 서열번호 106 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 1122 | 서열번호 107 & 서열번호 193 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5'-5'- TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC-3' |
| 1123 | 서열번호 108 & 서열번호 194 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5'-5'- TCGACT-3' |
| 1124 | 서열번호 109 & 서열번호 195 | 5'-T2C2G2T2A2T2C2G2T2A2A2C2G2T2A2T2T2C2G2A2A2T2C2G2T2-3'-3'-A2G2C2A2T2A2G2C2A2T2T2G2C2A2T2A2A2G2C2T2T2A2G2C2A2-5' |
| 1125 | 서열번호 110 & 서열번호 196 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 1126 | 서열번호 111 & 서열번호 197 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2-5' |
| 1127 | 서열번호 112 & 서열번호 198 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5'-5'- T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3' |
| 1128 | 서열번호 113 & 서열번호 199 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 1129 | 서열번호 114 & 서열번호 200 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2-5' |
| 1130 | 서열번호 115 & 서열번호 201 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2-5' |
| 1131 | 서열번호 116 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3' |
| 1132 | 서열번호 117 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 1133 | 서열번호 118 & 서열번호 202 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3'-3'-A2C2G2T2G2A2A2C2T2T2C2G2T2A2A2C2G2T2T2A2T2C2G2A2T2T2G2-5' |
| 1134 | 서열번호 119 & 서열번호 203 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC-3'-L- 3'-A3G3C3T3G3A3A3C3T3T3G3C3T3A3A3G3C3T3T3A3T3G3C3A3T3T3G3-5' |
| 1135 | 서열번호 120 & 서열번호 204 | 5'-TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC -3'-L-3'-A3G3C3T3G3A3A3C3T3T3G3C3T3A3A3G3C3T3-5' |
| 1136 | 서열번호 217 & 서열번호 204 | 5'-T3C3G3A3C3T3T3G3A3A3C3G3A3T3T3C3G3A3A3T3A3C3G3T3A3A3C3 -3'-L-3'-A3G3C3T3G3A3A3C3T3T3G3C3T3A3A3G3C3T3-5' |
GCAT - DNA 포스포로티오에이트 연결; A2/T2/C2/G2 - DNA 포스포다이에스테르 연결; A3/T3/C3/G3 - RNA 포스포다이에스테르 연결; U = 데옥시 우리딘; I = 데옥시 이노신; L = 트리에틸렌 글리콜
면역 길항제
구현예들에서, 본 발명은 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)를 제공하며, 여기서 기능성 도메인과 고리화 도메인은 이들의 3' 말단에서 연결되고, 기능성 도메인은 뉴클레오티드 11-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며; 기능성 도메인은 면역 길항제 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드는 척추동물 세포에서 인터페론 반응을 차단할 수 있다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 다른 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표적 RNA에 대해 상보적이지 않으며 결합하지 않는다. 이러한 구현예에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드가 아니고, 안티센스 활성을 가지지 않는다.
구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 11-30개 길이이다. 구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 15-28개 길이이다. 구현예들에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 17-25개 길이이다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 서열과 동일한 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 서열보다 길다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 이것이 상보적인 기능성 도메인의 서열보다 짧다.
구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 11-40개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 15-28개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 17-25개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-10개 길이이다. 구현예들에서, 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-8개 길이이다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포다이에스테르 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포다이에스테르이다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트와 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결의 조합이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포다이에스테르 또는 이들의 조합이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포다이에스테르이다.
구현예들에서, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트와 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결의 조합이다.
구현예들에서, 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포로티오에이트이고, 고리화 도메인의 뉴클레오티드 간 연결은 포스포다이에스테르이거나, 또는 그 반대도 가능하다.
면역 길항제 올리고뉴클레오티드로는 엔도솜 Toll-유사 수용체, RIG 유사 수용체, STING, cGAS 및 인플라마솜 (inflammasome)을 통해 면역자극을 차단하는 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. Toll-유사 수용체 (TLR)는 잠재적으로 유해한 병원체를 검출함으로써 선천적인 면역 반응의 개시에 중요한 역할을 수행하는 패턴 인지 수용체 (PRR)이다. 각각의 TLR은 광범위한 특이성을 가지며, 예를 들어, TLR1, 2, 4-6은 박테리아 지질을 인지하고, TLR3, 7 및 8은 바이러스 RNA를 인지하고, TLR9는 CG 모티프를 포함하는 박테리아 DNA를 인지하고, TLR5 및 10은 박테리아 또는 기생충 단백질을 인지한다. 이러한 면역 길항제 올리고뉴클레오티드의 설계는 당업자의 능력 내이다.
다른 구현예에서, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드는 면역 길항제 올리고뉴클레오티드이고, 고리화 도메인은 다른 면역 길항제 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 면역 길항제 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드는 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며, 기능성 도메인의 3' 말단부에서 부착된다 (도 3B 참조). 다시 말해, 이러한 구현예에서, 고리화 도메인은 또한 면역 길항제 올리고뉴클레오티드로 작용한다.
면역자극에 유용한 고리형 올리고뉴클레오티드에 대한 예로는 표 4의 고리형 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 표 4에서 올리고뉴클레오티드는 CpG 다이뉴클레오티드 내 메틸화된 C를 포함하고 Toll-유사 수용체 9 (TLR-9)의 활성화를 차단한다. 임의의 다른 대상 PRR 또는 TLR을 겨냥하는 면역 길항제 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기능성 도메인을 가진 고리형 올리고뉴클레오티드들은 당해 기술 분야의 당업자의 기술에서 충분하다.
표 4
| 화합물 # | 서열번호 | 서열 |
| 1201 | 서열번호 121 & 서열번호 205 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC-3'-3'-AGCmTGAACTTGCmTAAGCmTTATGCmATTG-5' |
| 1202 | 서열번호 122 & 서열번호 206 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC-3'-3'-AGCmTGAACTTGCmTAAGCmTTAT-5' |
| 1203 | 서열번호 123 & 서열번호 207 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC-3'-3'-AGCmTGAACTTGCmTAAGCmT -5' |
| 1204 | 서열번호 124 & 서열번호 208 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC-3'-3'-AGCmTGAACTTGCmT -5' |
| 1205 | 서열번호 125 & 서열번호 209 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC-3'-3'-AGCmTGA -5' |
| 1206 | 서열번호 126 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC -3' |
| 1207 | 서열번호 127 & 서열번호 210 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC -3'-3'-AGCTGAACTTG -5' |
| 1208 | 서열번호 128 & 서열번호 211 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGT AAC -3'-3'-AGCTGAAC -5' |
| 1209 | 서열번호 129 & 서열번호 212 | 5'-TCmGACTTGAACmGATTCmGAATACmGTAAC -3'-3'-AGCTGA -5 |
Cm = 5'-메틸화된 C
본원에 기술된 고리형 올리고뉴클레오티드에 이용가능한 고리화 도메인에 대한 예로는 표 5의 고리화 도메인들이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
표 5
| 서열번호 | 서열 |
| 서열번호 146 | 3'-T2C2G2T2G2G-5' |
| 서열번호 147 | 3'-T2C2G2T2G2G2-5' |
| 서열번호 148 | 3'-C2C2A2G2A2G-5' |
| 서열번호 149 | 5'-CTGCTTC-3' |
| 서열번호 150 | 5'-CTGCTT-3' |
| 서열번호 151 | 5'-CTGCT-3' |
| 서열번호 152 | 5'-CTGC-3' |
| 서열번호 153 | 5'-C2T2G2C2T2T2-3' |
| 서열번호 154 | 5'-C2T2G2C2T2-3' |
| 서열번호 155 | 5'-C2T2G2C2-3' |
| 서열번호 156 | 5'-CT2GC2TT2-3' |
| 서열번호 157 | 5'-CT2GC2T-3' |
| 서열번호 158 | 3'- A2T2G2G2A2 -5' |
| 서열번호 159 | 3'-A2A2T2G2G2A2-5' |
| 서열번호 160 | 3'-A1A1U1G1G1A1-5' |
| 서열번호 161 | 3'-C2C2G2G2T2-5' |
| 서열번호 162 | 3'-C2C2G2G2T2T2-5' |
| 서열번호 163 | 3'-C1C1G1G1U1U1-5' |
| 서열번호 164 | 3'- A1U1G1G1A1 -5' |
| 서열번호 165 | 3'-C1C1G1G1U1-5' |
| 서열번호 166 | 3'- TAGCA -5' |
| 서열번호 167 | 3'-TTAGCA-5' |
| 서열번호 168 | 3'-ATGCT-5' |
| 서열번호 169 | 3'-AATGCT-5' |
| 서열번호 170 | 5'-TTACGA-3' |
| 서열번호 171 | 5'-TACGA-3' |
| 서열번호 172 | 5'-AATGCT -3' |
| 서열번호 173 | 5'- ATGCT -3' |
| 서열번호 174 | 3'-AGCATAGCATTGCATAAGCTTAGCA-5' |
| 서열번호 175 | 3'-AGCATAGCATTGCATAAGCT2T2A2G2C2A2-5' |
| 서열번호 176 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 서열번호 177 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 서열번호 178 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 서열번호 179 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATG2C2A2T2T2G2-5' |
| 서열번호 180 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTAT-5' |
| 서열번호 181 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCT -5' |
| 서열번호 182 | 3'-AGCTGAACTTGCT-5' |
| 서열번호 183 | 3'-AGCTGA -5' |
| 서열번호 184 | 3'-A2G2C2T2G2A2-5' |
| 서열번호 185 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTATGCATTG-5' |
| 서열번호 186 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 서열번호 187 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2ATGCATTG-5' |
| 서열번호 188 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCTTAT-5' |
| 서열번호 189 | 3'-AGCTGAACTTGCTAAGCT -5' |
| 서열번호 190 | 3'-AGCTGAACTTGCT-5' |
| 서열번호 191 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2 -5' |
| 서열번호 192 | 3'-AGCTGA -5' |
| 서열번호 193 | 5'- TCGACTTGAACGATTCGAATACGTAAC-3' |
| 서열번호 194 | 5'- TCGACT-3' |
| 서열번호 195 | 3'-A2G2C2A2T2A2G2C2A2T2T2G2C2A2T2A2A2G2C2T2T2A2G2C2A2-5' |
| 서열번호 196 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 서열번호 197 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2-5' |
| 서열번호 198 | 5'-T2C2G2A2C2T2T2G2A2A2C2G2A2T2T2C2G2A2A2T2A2C2G2T2A2A2C2-3' |
| 서열번호 199 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2T2G2-5' |
| 서열번호 200 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2T2-5' |
| 서열번호 201 | 3'-A2G2C2T2G2A2A2C2T2T2G2C2T2A2A2G2C2T2T2A2T2G2C2A2-5' |
| 서열번호 202 | 3'-A2C2G2T2G2A2A2C2T2T2C2G2T2A2A2C2G2T2T2A2T2C2G2A2T2T2G2-5' |
| 서열번호 203 | 3'-A3G3C3T3G3A3A3C3T3T3G3C3T3A3A3G3C3T3T3A3T3G3C3A3T3T3G3-5' |
| 서열번호 204 | 3'-A3G3C3T3G3A3A3C3T3T3G3C3T3A3A3G3C3T3-5' |
| 서열번호 205 | 3'-AGCmTGAACTTGCmTAAGCmTTATGCmATTG-5' |
| 서열번호 206 | 3'-AGCmTGAACTTGCmTAAGCmTTAT-5' |
| 서열번호 207 | 3'-AGCmTGAACTTGCmTAAGCmT -5' |
| 서열번호 208 | 3'-AGCmTGAACTTGCmT -5' |
| 서열번호 209 | 3'-AGCmTGA -5' |
| 서열번호 210 | 3'-AGCTGAACTTG -5' |
| 서열번호 211 | 3'-AGCTGAAC -5' |
| 서열번호 212 | 3'-AGCTGA -5 |
| 서열번호 213 | 5'-C2TG2CT2T-3' |
| 서열번호 214 | 5'-C2TG2CT2-3' |
| 서열번호 215 | 5'-C3T3G3C3T3T3-3' |
| 서열번호 216 | 5'-C3T3G3C3T3-3' |
| 서열번호 217 | 5'-T3C3G3A3C3T3T3G3A3A3C3G3A3T3T3C3G3A3A3T3A3C3G3T3A3A3C3 -3' |
Cm = 5'-메틸화된 C; GCAT- DNA 포스포로티오에이트 연결; G1/C1/A1/U1 - 2'OME 포스포로티오에이트 연결; A2/T2/C2/G2 - DNA 포스포다이에스테르 연결; A3/T3/C3/G3 - RNA 포스포다이에스테르 연결
약학적 조성물
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 CSO 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 기술한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함한다. 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균 염수 용액 및 하나 이상의 CSO 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균 염수 용액과 하나 이상의 CSO 화합물로 구성된다. 특정 구현예에서, 멸균 염수는 약학 등급의 염수이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 CSO 화합물과 멸균수를 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 CSO 화합물 1종과 멸균수로 구성된다. 특정 구현예에서, 멸균수는 약학 등급의 물이다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 CSO 화합물과 포스페이트-완충화된 염수 (PBS)를 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 CSO 화합물과 멸균 PBS로 구성된다. 특정 구현예에서, 멸균 PBS는 약학 등급의 PBS이다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 CSO 화합물과 하나 이상의 부형제를 포함한다. 특정 구현예에서, 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀라제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 CSO 화합물은 약학적 조성물 또는 제형을 제조하기 위해 약제학적으로 허용가능한 활성 및/또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학적 조성물의 제형을 위한 조성물과 방법은 비-제한적으로 투여 경로, 질환 정도 또는 투여할 용량 등의 여러가지 기준에 따라 결정된다.
접합 기
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 CSO는 선택적으로 하나 이상의 접합 기 (conjugate group)를 추가로 포함한다. 접합 기들은 하나 이상의 접합 모이어티, 및 하나 이상의 접합 모이어티를 올리고뉴클레오티드와 연결하는 접합 링커로 구성된다. 접합 기들은 올리고뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에, 및/또는 임의의 내부 위치에서 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 접합 기들은 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드의 2'-위치로 부착된다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착되는 접합 기는 말단 기이다. 일부 이러한 구현예에서, 접합 기 또는 말단 기는 올리고뉴클레오티드의 3' 및/또는 5'-말단부에서 부착된다. 이러한 일부 구현예에서, 접합 기는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부에서 부착된다. 특정 구현예에서, 접합 기는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부 근처에서 부착된다. 특정 구현예에서, 접합 기는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단부에서 부착된다. 특정 구현예에서, 접합 기는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단부 근처에서 부착된다.
본원의 임의 구현예에서, 접합 기는 GalNAc 리간드 1-3개를 포함하는 GalNAc 클러스터를 포함한다.
본원의 임의 구현예에서, 접합 링커는 단일 결합으로 구성된다.
본원의 임의 구현예에서, 접합 링커는 절단가능하다.
본원의 임의 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드 1-3개를 포함한다.
본원의 임의 구현예에서, 접합 기는 기능성 도메인의 5'-말단부에서 CSO에 부착된다. 본원의 임의 구현예에서, 접합 기는 기능성 도메인의 3'-말단부에서 CSO에 부착된다. 본원의 임의 구현예에서, 접합 기는 고리화 도메인의 5'-말단부에서 CSO에 부착된다. 본원의 임의 구현예에서, 접합 기는 고리화 도메인의 3'-말단부에서 CSO에 부착된다
특정 구현예에서, CSO는 하나 이상의 접합 기에 공유적으로 부착된다. 특정 구현예에서, 접합 기는 비-제한적으로 약력학, 약동학, 안정성, 결합성, 흡수, 조직 분포, 세포 분포, 세포 흡수, 부하 (charge) 및 소거 (clearance) 등의 CSO의 하나 이상의 특성을 변형한다. 특정 구현예에서, 접합 기는 CSO에 새로운 특성을 부여하며, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있는 형광단 또는 리포터 기가 있다. 일부 접합 기 및 접합 모이어티는 이전에 언급된 바 있으며, 예를 들어, 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸다이올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를 들어, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 l,2-다이-O-헥사데실-rac-글리세롤-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937), 토코페롤 기 (Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; 및 Nishina et al., Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740), 또는 GalNAc 클러스터 (예를 들어, WO2014/179620) 등이 있다.
접합 모이어티로는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 펩타이드, 탄수화물, 비타민 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜, 티오에테르, 폴리에테르, 콜레스테롤, 티오콜레스테롤, 콜산 모이어티, 폴레이트, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아다만탄, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 형광단 및 염색제 (dye) 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 접합 모이어티는 활성 약물 물질, 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜 (suprofen), 펜부펜 (fen-bufen), 케토프로펜 (ketoprofen), (S)-(+)-프라노프로펜 ((S)-(+)-pranoprofen), 카프로펜 (carprofen), 단실사르코신 (dansylsarcosine), 2,3,5-트리요오도벤조산, 핑고리모드 (fingolimod), 플루페남산 (flufenamic acid), 폴린산 (folinic acid), 벤조티아다이아지드 (benzothiadiazide), 클로로티아지드 (chlorothiazide), 디아제핀 (diazepine), 인도메티신 (indo-methicin), 바르비투레이트 (barbiturate), 세팔로스포린 (cephalosporin), 설파 약물 (sulfa drug), 항-당뇨병제 (antidiabetic), 항-세균제 (antibacterial) 또는 항생제를 포함할 수 있다.
접합 모이어티는 접합 링커를 통해 CSO에 부착된다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 화학적 단일 결합이다 (즉, 접합 모이어티는 단일 결합을 통해 CSO에 직접 부착된다). 특정 구현예에서, 접합 링커는 하이드로카르빌과 같은 사술 구조, 또는 에틸렌 글리콜, 뉴클레오시드 또는 아미노산 유닛과 같은 반복 유닛들로 구성된 올리고머를 포함한다.
특정 구현예에서, 접합 링커는 알킬, 아미노, 옥소, 아미드, 다이설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 하이드록실아미노로부터 선택되는 하나 이상의 기를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 접합 링커는 알킬, 아미노, 옥소, 아미드 및 에테르 기들로부터 선택되는 기들을 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 알킬 기 및 아미드 기로부터 선택되는 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 알킬 기와 에테르 기로부터 선택되는 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 하나 이상의 포스포러스 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 하나 이상의 포스페이트 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 하나 이상의 중성 연결 기를 포함한다.
특정 구현예에서, 전술한 접합 링커 등의 접합 링커는 이관능성 연결 모이어티, 예를 들어 본원에 제시된 올리고뉴클레오티드 등의 모 화합물에 접합 기를 부착하는데 유용한 것으로 당해 기술 분야에서 공지된 모이어티이다. 일반적으로, 이관능성 연결 모이어티는 관능기를 적어도 2개 포함한다. 관능기 중 하나는 CSO 상의 특정 부위에 결합하도록 선택되고, 다른 하나는 접합 기에 결합하도록 선택된다. 이관능성 연결 모이어티에 이용되는 관능기의 예로는 친핵성 기와 반응하기 위한 친전자체 및 친핵성 기와 반응하기 위한 친핵체 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 이관능성 연결 모이어티는 아미노, 하이드록실, 카르복시산, 티올, 알킬, 알케닐 및 알키닐로부터 선택되는 하나 이상의 기를 포함한다.
접합 링커에 대한 예로는 피롤리딘, 8-아미노-3,6-다이옥사옥타노익산 (ADO), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-l-카르복실레이트 (SMCC) 및 6-아미노헥산산 (AHEX 또는 AHA) 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 접합 링커로는 C1-C10 알킬, 치환 또는 비-치환된 C2-C10 알케닐 또는 치환 또는 비-치환된 C2-C10 알키닐 등이 있으나 이들로 제한되는 것은 아니며, 바람직한 치환기에 대한 비-제한적인 목록은 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다.
특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드 1-10개를 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드 2-5개를 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드를 정확하게 3개 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 TCA 모티프를 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 링커-뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 이러한 링커-뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커-뉴클레오시드는 비-변형된다. 특정 구현예에서, 링커-뉴클레오시드는 퓨린, 치환된 퓨린, 피리미딘 또는 치환된 피리미딘으로부터 선택되는 선택적으로 보호된 헤테로사이클릭 염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 우라실, 티민, 시토신, 4-N-벤조일시토신, 5-메틸시토신, 4-N-벤조일-5-메틸시토신, 아데닌, 6-N-벤조일아데닌, 구아닌 및 2-N-이소부티릴구아닌으로부터 선택되는 뉴클레오시드이다. 표적 조직에 도달된 후 올리고머 화합물로부터 절단되는 것이 전형적으로 링커-뉴클레오시드로 바람직하다. 이에, 링커-뉴클레오시드는 전형적으로 서로, 그리고 올리고머 화합물의 나머지 부분에 대해 절단가능한 결합을 통해 연결된다. 특정 구현예에서, 이러한 절단가능한 결합은 포스포다이에스테르 결합이다.
본원에 사용된 바와 같이, 링커-뉴클레오시드는 일반적으로 CSO의 일부인 것으로 고려되지 않거나, 또는 특히 고리화 도메인 또는 기능성 도메인의 일부로 고려되지 않는다. 즉, 링커-뉴클레오시드의 뉴클레오티드는 CSO의 길이 또는 이의 도메인의 길이로 계수되지 않으며, 참조 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 상보성 %를 결정하는데 이용되지 않는다. 달리 나타내지 않은 한, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드를 10개 이하로 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드를 5개 이하로 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드를 3개 이하로 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드를 2개 이하로 포함한다. 특정 구현예에서, 접합 링커는 링커-뉴클레오시드를 1개 이하로 포함한다.
특정 구현예에서, 접합 기는 CSO로부터 절단되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 특정 경우에, 특정한 접합 모이어티를 포함하는 CSO는 특정 세포 유형에 더 잘 흡수되지만, CSO가 일단 흡수되면 접합 기는 비-접합된 또는 모 CSO를 해리하도록 절단되는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 접합 링커는 하나 이상의 절단가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 절단가능한 결합이다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 하나 이상의 절단가능한 결합을 포함하는 원자 군이다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 절단가능한 결합을 1개, 2개, 3개, 4개 또는 더 많이 가진 원자 군을 포함한다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 세포 또는 아세포 구획, 예를 들어 리소솜 안에서 선택적으로 절단된다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 뉴클레아제와 같은 내인성 효소에 의해 선택적으로 절단된다.
특정 구현예에서, 절단가능한 결합은 다음으로부터 선택된다: 아미드, 에스테르, 에테르, 포스포다이에스테르의 한쪽 또는 양쪽 에스테르, 포스페이트 에스테르, 카바메이트 또는 다이설파이드. 특정 구현예에서, 절단가능한 결합은 포스포다이에스테르의 한쪽 또는 양쪽 에스테르이다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 포스페이트 또는 포스포다이에스테르를 포함한다. 특정 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 올리고뉴클레오티드와 접합 모이어티 또는 접합 기 간의 포스페이트 연결이다.
용도
고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 다양한 작용 기전에서 유용할 수 있다. 이러한 것으로는 mRNA, ncRNA, microRNA, lncRNA 및 스플라이싱을 위한 안티센스를 포함한다. 또한, 2중 가닥의 고리형 구조를 이용해 siRNA 작제물을 전달할 수 있다. 아울러, 고리형 구조는 ADAR 및 CRISPR 기반의 기전을 위한 안티센스를 전달하는데 이용할 수 있었다. 아울러, 고리형 구조는 RNA 구조를 파괴해 번역을 높이기 위해 안티센스를 전달하는 새로운 접근법을 제공한다. 고리형 구조는 또한 핵산에 규정된 구조를 제공해, PRR과의 상호작용 정도 및 유도되는 면역 캐스케이드를 다양하게 허용할 수 있다.
예를 들어, 기능성 도메인이 안티센스 올리고뉴클레오티드일 경우, 본 발명에 따른 CSO는 유전자 발현의 저해가 요망되는 치료학적 방식에 유용하다. 이는, 예를 들어, 내인성 유전자 (예를 들어 온코진) 또는 외인성 유전자 (예를 들어 병원체의 생장 및/또는 대사에 필수적인 유전자)의 저해를 포함할 수 있다.
구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 유전자 발현의 저해 방법을 제공한다.
구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대립 유전자-특이적인 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 유전자의 발현 저해가 유익한 질환 또는 장애를 가진 개체를 치료하는데 유용하다. 구현예들에서, 질환 또는 장애는 세포성 유전자의 생산 또는 비정상적인 발현으로부터 기인한다.
구현예들에서, 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 국소적으로 투여된다.
구현예들에서, 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 전신으로 투여된다.
구현예들에서, 본원에 기술된 CSO 화합물을 투여하는 것을 포함하는 RNA 프로세스를 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 기능성 도메인은 표적 RNA의 동일 길이 부분에 대해 상보적인 적어도 12개의 연속적인 뉴클레오베이스를 가진 14-30개의 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 영역 1-3개를 포함하고, 각각의 영역은 독립적으로 2-5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하고, 나머지 뉴클레오티드는 2 '-치환된, 비-이온성 또는 제약된 당 뉴클레오티드 또는 이들의 조합이다. 구현예들에서, RNA의 프로세싱은 스플라이싱을 포함한다.
구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 적어도 2종의 mRNA 전사체를 포함하는 유전자에서 제1 mRNA 전사체를 선별하는 방법을 제공한다.
구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, RNA 프로세싱을 조절하는 것이 개체를 치료하는데 유익한, 개체에서 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다.
구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 표적 RNA의 넌센스 매개 제거 (nonsense mediated decay)를 유도하는 방법을 제공한다.
구현예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 기능성 mRNA의 수준을 증가시키고 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 임의의 다른 물질 또는 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 물질 또는 요법은 공동-투여되거나 또는 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 물질 또는 요법은 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 예방하는데 유용할 수 있으며, 본 발명에 따른 고리형 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 효과를 감소시키지 않는다. 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 예방하는데 유용한 물질(들)로는 소분자, 펩타이드 백신, 항원, 항체, 바람직하게는 단일클론 항체, 세포독성 물질, 키나제 저해제, 알레르겐, 항생제, siRNA 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TLR 길항제 (예, TLR3 및/또는 TLR7의 길항제 및/또는 TLR8의 길항제 및/또는 TLR9의 길항제), 화학치료제 (전통적인 화학요법 및 최신 ㅍ적화 요법), 표적화 치료학적 물질, 활성화된 세포, 펩타이드, 단백질, 유전자 요법 벡터, 펩타이드 백신, 단백질 백신, DNA 백신, 보강제 및 공동-자극 분자 (예, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 트랜스-활성화 인자, 펩타이드 또는 변형된 아미노산을 포함하는 펩타이드) 또는 이들의 조합 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 대안적으로, 본 발명에 따른 고리형 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따른 고리형 올리고뉴클레오티드의 유전자 발현 조절의 특이성 또는 수준을 강화하기 위해 다른 화합물 (예를 들어, 지질 또는 리포솜)과 조합하여 투여할 수 있다.
본 발명의 고리형 올리고뉴클레오티드는 비-제한적으로 비경구, 점막 전달, 경구, 설하, 경피, 국소, 흡입, 종양내, 정맥내, 피하, 척수강내, 비강내, 에어로졸, 안내, 기관내, 직장내, 질, 유전자 총에 의해, 진피 패치 또는 점안제 형태 또는 구강세척제 형태 등의 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 방법에서, 본 발명에 따른 고리형 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 비-제한적으로 방광, 간, 폐 또는 신장 등의 조직 또는 장기로 직접적으로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 고리형 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 근육내 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 점막 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 경구 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 직장내 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 척수강내 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 종양내 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 비경구 투여에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단독 투여 또는 임의의 다른 물질과 조합한 투여는 피하 투여에 의한 것이다.
구현예들에서, 본원에 기술된 임의의 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 CSO의 부위 특이적인 전달을 제공하는 모이어티와 접합될 수 있다. 구현예들에서, 이러한 접합물로는 항체, 펩타이드, 지질 또는 소분자 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
구현예들에서, 본원에 기술된 임의의 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는 CSO를 부위 특이적으로 전달하게 하는 모이어티에 의해 캡슐화될 수 있다. 구현예들에서, CSO는 예를 들어 지질, 지질 나노입자 (LNP) 또는 펩타이드 마크로사이클릭 구조 안에 캡슐화될 수 있다.
비경구, 진피내 또는 피하 용도로 사용되는 용액제 또는 현탁제는 다음과 같은 성분을 함유할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항세균제, 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 사이트레이트 또는 포스페이트 및 긴장도 조절 물질, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 적정할 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제작된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이얼 안에 수용될 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 질환의 증상 또는 서로게이트 마커를 감소시키는데 유효한 기간 동안 유효량으로 이용해 공지된 절차로 수행할 수 있다. 예를 들어, 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효량은 증상을 완화 또는 감소시키거나, 종양, 암 또는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 지연 또는 개선하는데 필요한 양일 수 있다. 유전자 발현을 조절하는 조성물의 투여 맥락에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효량은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부재시 유전자 발현과 비교해 요망하는 조절을 달성하기에 충분한 양이다. 임의의 특정 용도를 위한 유효량은 치료 중인 질환 또는 병태, 투여 중인 구체적인 올리고뉴클레오티드, 개체의 크기 또는 질환 또는 병태의 중증도와 같이 이러한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 과도한 실험 없이도 특정한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
합성
본원에 기술된 CSO는 비-제한적으로 H-포스포네이트 화학, 포스포르아미디트 화학 또는 H-포스포네이트 화학과 포스포르아미디트 화학의 조합 (즉, 일부 고리에 대해서는 H-포스포네이트 화학을 다른 고리에 대해서는 포스포르아미디트 화학) 등의 임의의 적합한 기술 분야에서 인지되는 임의의 방법에 의해 제조할 수 있으며, 이는 수동으로 또는 자동 합성기에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이의 표적에 혼성화하는 능력은 손상시키지 않으면서 다양한 방식으로 변형할 수도 있다 (예를 들어, Agrawal and Gait, Advances in Nucleic Acid Therapeutics, (2019) https://doi.org/10.1039/9781788015714 참조).
정의
구체적인 정의가 제공되지 않은 한, 본원에 언급된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법, 절차 및 기법들은 당해 기술 분야에서 잘 알려지고 통상적으로 사용되는 것이다. 허용되는 경우, 본원 전체에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물 및 기타 데이터는 그 전체가 원용에 의해 본원에 통합된다.
달리 나타내지 않은 한, 하기 용어들은 다음과 같은 의미를 가진다:
본원에 사용된 바와 같이, "2'-데옥시뉴클레오시드"는 자연 생성 데옥시리보핵산 (DNA)에서 발견되는 바와 같이 2'-H(H) 푸라노실 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 특정 구현예에서, 2'-데옥시뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오베이스를 포함할 수 있거나 또는 RNA 뉴클레오베이스 (우라실)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "2 '-치환된 뉴클레오시드"는 2'-치환된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 당 모이어티와 관련하여 "2'-치환된"은 H 또는 OH가 아닌 하나 이상의 2'-치환기를 포함하는 당 모이어티를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "5-메틸 시토신"은 5-위치에 부착된 메틸 기로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸 시토신은 변형된 뉴클레오베이스이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명확하게 달리 지칭하지 않은 한 단수 및 복수의 참조를 둘다 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "투여"는 약학적 물질을 동물에 제공하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "동물"은 인간 또는 인간이 아닌 동물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 개체"는 이러한 치료 또는 요법이 필요한, 치료 또는 요법에 대해 선택된 인간 또는 인간을 제외한 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "안티센스 활성"은 안티센스 화합물이 이의 표적 핵산에 혼성화됨으로써 발생하는 임의의 검출가능한 및/또는 측정가능한 변화를 의미한다. 특정 구현예에서, 안티센스 활성은 안티센스 화합물의 부재시의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준 대비, 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해 암호화된 단백질의 양 또는 발현의 감소이다. 특정 구현예에서, 안티센스 활성은 안티센스 화합물의 부재시의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준 대비, 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해 암호화된 단백질의 양 또는 발현의 증가이다.
본원에 사용된 바와 같이, "안티센스 화합물"은 하나 이상의 안티센스 활성을 달성할 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료와 관련하여 "개선한다"는 치료하지 않을 경우의 동일한 증상 대비 하나 이상의 증상의 개선을 의미한다. 특정 구현예에서, 개선은 증상의 중증도 또는 빈도의 감소, 또는 증상의 중증도 또는 빈도 측면에서 발병 지연 또는 진행의 서행이다. 특정 구현예에서, 증상 또는 홀마크는 운동실조, 신경병증 및 응집체 형성이다. 특정 구현예에서, 이들 증상의 개선으로 운동 기능 향상, 신경병증 저하 또는 응집체 개수 감소가 달성된다.
본원에 사용된 바와 같이, "이환식 뉴클레오시드" 또는 "BNA"는 이환식 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "이환식 당" 또는 "이환식 당 모이어티"는 고리를 2개 포함하는 변형된 당 모이어티를 의미하고, 2번째 고리가 첫번째 고리의 원자 2개를 연결하는 브릿지를 통해 만들어져 이환식 구조가 형성된다. 특정 구현예에서, 이환식 당 모이어티의 제1 고리는 푸라노실 모이어티이다. 특정 구현예에서, 이환식 당 모이어티는 푸라노실 모이어티를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "키랄 농화된 집단 (chirally enriched population)"은 동일한 분자식을 가진 복수개의 분자들을 의미하며, 여기서 집단에서 특정 키랄 센터에 특정한 입체화학적 배열을 가진 분자들의 개수 또는 %는, 특정한 키랄 센터가 입체 무작위이라면 집단 내 동일한 특정 키랄 센터에서 동일한 특정한 입체 화학 배열을 가진 것으로 예상되는 분자의 수 또는 %보다 더 큰 것을 의미한다. 각 분자에 복수의 키랄 센터를 가진 분자들의 키랄 농화된 집단은 하나 이상의 입체 무작위 키랄 센터를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 분자들은 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 분자들은 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "절단가능한 모이어티"는 생리학적 조건에서, 예를 들어 세포 안, 동물 또는 인간에서 절단되는 원자 기 또는 결합을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드와 관련하여 "상보적인"은, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오베이스 서열 및 기타 핵산을 서로 반대 방향으로 정렬하였을 경우, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오베이스 또는 이의 하나 이상의 영역 및 다른 핵산의 뉴클레오베이스 또는 이의 하나 이상의 영역의 적어도 70%가 서로 수소 결합을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 상보적인 뉴클레오베이스는 서로 수소 결합을 형성할 수 있는 뉴클레오베이스를 지칭한다.
상보적인 뉴클레오베이스 쌍들은 아데닌 (A) 및 티민 (T), 아데닌 (A) 및 우라실 (U), 시토신 (C) 및 구아닌 (G), 5-메틸 시토신 (mC) 및 구아닌 (G)을 망라한다. 상보적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 핵산이 각 뉴클레오시드에서 뉴클레오베이스 상보성을 가져야 하는 것은 아니다. 오히려, 일부 미스매치가 허용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드와 관련하여 "완전히 상보적인" 또는 "100% 상보성"은 올리고뉴클레오티드가 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산에 대해 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드 위치에서 상보적인 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "접합 기"는 올리고뉴클레오티드에 직접 또는 간접적으로 부착되는 원자 군을 의미한다. 접합 기는 접합 모이어티, 및 접합 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 접합 링커를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "접합 링커"는 접합 모이어티를 올리고뉴클레오티드와 연결하는 하나 이상의 결합을 포함하는 원자 군을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "접합 모이어티"는 접합 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착되는 원자 기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 맥락에서 "인접한"은 서로 바로 인접한 뉴클레오시드, 뉴클레오베이스, 당 모이어티 또는 뉴클레오시드 간 연결을 지칭한다. 예를 들어, "인접한 뉴클레오베이스"는 서열에서 서로 바로 접한 뉴클레오베이스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "링커-뉴클레오시드"는 본 발명의 CSO를 접합 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결하는 뉴클레오시드를 의미한다. 링커-뉴클레오시드는 접합 링커 내에 위치하고, CSO와 인접하더라도 CSO 화합물의 일부로 간주되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "갭머"는 하나 이상의 뉴클레오시드를 가진 외부 영역들 사이에 배치된 RNase H 절단을 뒷받침하는 복수의 뉴클레오시드를 가진 내부 영역을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 의미하고, 여기서 내부 영역을 구성하는 뉴클레오시드는 외부 영역을 구성하는 뉴클레오시드와 화학적으로 구분된다. 내부 영역은 "갭"으로 지칭될 수 있고, 외부 영역은 "윙"으로 지칭될 수 있다. 달리 나타내지 않은 한, "갭머"는 당 모티프를 지칭한다. 달리 나타내지 않은 한, 갭머의 갭에서 뉴클레오시드의 당 모이어티는 비-변형된 2'-데옥시푸라노실이다. 즉, 용어 "MOE 갭머"는 양쪽 윙에 2'-MOE 뉴클레오시드들로 된 당 모티프와 2'-데옥시뉴클레오시드들로 된 갭을 가진 갭머를 지칭한다. 달리 나타내지 않은 한, MOE 갭머는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 간 연결 및/또는 변형된 뉴클레오베이스를 포함할 수 있으며, 이러한 변형이 반드시 당 변형의 갭머 패턴을 따라야 하는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "핫스팟 영역"은 본원의 하기 실시예에서 입증된 바와 같이 표적 핵산의 양 또는 활성을 줄이기 위해 올리고머 화합물로 처리가능한 표적 핵산 상의 뉴클레오베이스 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, "혼성화"는 상보적인 올리고뉴클레오티드 및/또는 핵산의 쌍 형성 또는 어닐링을 의미한다. 특정한 기전으로 제한하는 것은 아니지만, 가장 일반적인 혼성화 기전은 상보적인 뉴클레오시드들 간의 왓슨 클릭, 후그스틴 또는 역위된 호그스틴 수소 결합일 수 있는, 수소 결합 형성을 수반한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오시드 간 연결"은 올리고뉴클레오티드에서 인접한 뉴클레오시드 간의 공유 결합이다. 본원에 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오시드 간 연결"은 포스포다이에스테르 뉴클레오시드 간 연결 이외의 다른 임의의 뉴클레오시드 간 연결을 의미한다. "포스포로티오에이트 연결"은 포스포다이에스테르 뉴클레오시드 간 연결의 비-브릿지된 산소 원자들 중 하나가 황 원자로 치환된 변형된 뉴클레오시드 간 연결이다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "발현 또는 활성 저해"는 무처리 또는 대조군 샘플에서의 활성 또는 발현을 기준으로 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 의미하며, 이것이 발현 또는 활성의 완전한 소거를 반드시 지칭하는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "링커-뉴클레오시드"는 올리고뉴클레오티드를 접합 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결하는 뉴클레오시드를 의미한다. 링커-뉴클레오시드는 올리고머 화합물의 접합 링커 내에 위치한다. 링커-뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드와 연속적이더라도 올리고머 화합물의 올리고뉴클레오티드 부분의 일부로 간주되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-이환식 변형된 당 모이어티"는 제2 고리를 형성하도록 당의 원자 2개 사이에 브릿지를 형성하지 않는, 치환기와 같은 변형을 포함하지 않는, 변형된 당 모이어티를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "미스매치" 또는 "비-상보적인"은 제1 올리고머 화합물과 제2 올리고머 화합물을 정렬하였을 때, 제2 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오베이스에 대해 상보적이지 않은 제1 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오베이스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "MOE"는 메톡시에틸을 의미한다. "2'-MOE"는 리보실 당 모이어티의 2' OH 기 대신 2'-OCH2CH2OCH3 기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "모티프"는 올리고뉴클레오티드에서 비-변형된 및/또는 변형된 당 모이어티, 뉴클레오베이스 및/또는 뉴클레오시드 간 연결로 이루어진 패턴을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "mRNA"는 단백질을 암호화하는 RNA 전사체를 의미하고, 달리 언급되지 않은 한 pre-mRNA 및 성숙 mRNA를 망라한다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오베이스"는 비-변형된 뉴클레오베이스 또는 변형된 뉴클레오베이스를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "비-변형된 뉴클레오베이스"는 아데닌 (A), 티만 (T), 시토신 (C), 우라실 (U) 및 구아닌 (G)이다. 본원에 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오베이스"는 하나 이상의 비-변형된 뉴클레오베이스와 쌍을 형성할 수 있는 비-변형된 A, T, C, U 또는 G 이외의 다른 원자 군이다. "5 -메틸시토신"은 변형된 뉴클레오베이스의 일 예이다. 범용 염기는 비-변형된 뉴클레오베이스 5종 중 어느 하나와 쌍을 형성할 수 있는 변형된 뉴클레오베이스이다. 변형된 염기는 또한 헤테로사이클릭 염기 모이어티로도 지칭되며, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티만 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 (5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신 포함), 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌 등의 다른 뉴클레오베이스를 망라한다.
특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오베이스는 다음으로부터 선택된다: 본원에 정의된 바와 같은 범용 염기, 소수성 염기, 무차적 염기 (promiscuous base), 크기-확장된 염기 (size-expanded base) 및 불화 염기 (fluorinated base). 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실; 5-프로피닐시토신; 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌. 추가적인 변형된 뉴클레오베이스로는 삼환계 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘 ([5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘 (예, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온) 등이 있다. 변형된 뉴클레오베이스는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 치환된 것, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오베이스는 5-메틸시토신이다.
대표적인 변형된 당으로는 카보사이클릭 또는 비환식 당, 2', 3' 또는 4' 위치 중 하나 이상에서 치환기를 가진 당 및 당의 하나 이상의 수소 원자 대신 치환기를 가진 당 등이 있다. 특정 구현예에서, 당은 2' 위치에 치환기를 가짐으로써 변형된다. 부가적인 구현예에서, 당은 3' 위치에 치환기를 가짐으로서 변형된다. 다른 구현예에서, 당은 4' 위치에 치환기를 가짐으로서 변형된다. 또한, 당이 이들 위치들 중 하나보다 여러 위치에서 변형을 가질 수 있거나, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 한 위치에 당 변형을 가진 하나 이상의 뉴클레오티드와 다른 위치에 당 변형을 가진 하나 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있는 것으로 고려된다.
올리고뉴클레오티드에서 고려되는 당 변형으로는 비-제한적으로 OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로부터 선택되는 당 치환기 등이 있으나 이들로 제한되는 것은 아니며, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비-치환된 C1-C10 알킬 또는 C2-C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 기들은 O(CH2)xOCH3, O((CH2)xO)yCH3, O(CH2)xNH2, O(CH2)xCH3, O(CH2)xONH2 및 O(CH2)xON((CH2)xCH3)2로부터 선택될 수 있으며, 여기서 x 및 y는 독립적으로 1-10이다.
일부 구현예에서, 변형된 당은 C1-C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, Cl, Br, CN, OCN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약동학 특성을 개선하기 위한 기 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약력학 특성을 개선하기 위한 기, 및 비슷한 특성을 가진 기타 치환기로부터 선택되는 치환기를 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE라고도 함)(Martin et al., 1995), 즉 알콕시알콕시 기를 포함한다. 다른 변형으로는 2'-다이메틸아미노옥시에톡시, 즉 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시 (당해 기술 분야에서 2'-O-다이메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려져 있음), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2 등이 있다.
부가적인 당 치환 기로는 알릴 (-CH2-CH=CH2), -O-알릴 CH2-CH=CH2), 메톡시 (-O-CH3), 아미노프로폭시 (-OCH2CH2CH2NH2) 및 플루오로 (F) 등이 있다. 2' 위치에서 당 치환 기는 아라비노 (위) 위치 또는 리보 (아래) 위치에 있을 수 있다. 하나의 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 다른 비슷한 변형도 올리고머 화합물 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오시드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 행해질 수 있다. 올리고머 화합물은 또한 당 모방체, 예를 들어 사이클로부틸 모이어티를 펜토푸라노실 당 대신 가질 수 있다. 변형된 당 구조의 제조를 개시한 미국 특허의 예로는 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920 등이 있으나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
대표적인 당 치환 기는 미국 특허 출원 공개공보 2005/0261218에 언급된 기 등이 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본원에 통합된다. 구체적인 구현예에서, 당 변형은 2'-O-Me 변형, 2' F 변형, 2' H 변형, 2' 아미노 변형, 4' 티오리보스 변형 또는 6' 위치에서 탄소와 연결된 카르복시 기 상의 포스포로티오에이트 변형 또는 이들의 조합이다.
특정 구현예에서, 2'-치환된 비-이환식 변형된 뉴클레오시드는 F, OCH3 및 OCH2CH2OCH3로부터 선택되는 비-브릿징 2'-치환기를 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
일부 변형된 당 모이어티는 프라노실 고리의 원자 2개를 가교하여 제2 고리를 형성함으로써 이환식 당 모이어티를 형성하는 치환기를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 이환식 당 모이어티는 푸라노스 고리 원자 4'와 2' 간의 가교를 포함한다. 이러한 4'-2' 가교를 형성하는 당 치환기에 대한 예로는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2' ("LNA"), 4'-CH2-S-2', 4'-(CH2)2-O-2' ("ENA"), 4'-CH(CH3)-O-2' ("제약된 에틸" 또는 "cEt"), 4'-CH2-O-CH2-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' ("제약된 MOE" 또는 "cMOE") 및 이들의 유사체 (예를 들어, Seth et al., U.S. 7,399,845, Bhat et al, U.S. 7,569,686, Swayze et al., U.S. 7,741,457, 및 Swayze et al, U.S. 8,022,193), 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체 (예를 들어, Seth et al., U.S. 8,278,283), 4'-CH2-N(OCH3)-2' 및 이의 유사체 (예를 들어, Prakash et al, U.S. 8,278,425), 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (예를 들어, Allerson et al., U.S. 7,696,345 및 Allerson et al, U.S. 8,124,745), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (예를 들어, Zhou, et al, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134), 4'-CH2-C(=CH2)-2' 및 이의 유사체 (예를 들어, Seth et al., U.S. 8,278,426), 4'-C(RaRb)-N(R)-O-2', 4,-C(RaRb)-O-N(R)-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 및 4'-CH2-N(R)-O-2' (여기서 각각의 R, Ra 및 Rb는 독립적으로, H, 보호기, 또는 C1-C12 알킬임)(예를 들어 Imanishi et al., U.S. 7,427,672) 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 이러한 4' -> 2' 브릿지는 독립적으로 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- 및 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택되는 1-4개의 연결된 기들을 포함하고;
여기서,
x는 0, 1 또는 2이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로, H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1) 또는 설폭실 (S(=O)-J1)이고; 각각의 J1 및 J2는 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
부가적인 이환식 당 모이어티는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어: Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J Am. Chem. Soc, 20017, 129, 8362-8379; Wengel et al., U.S. 7,053,207; Imanishi et al., U.S. 6,268,490; Imanishi et al., U.S. 6,770,748; Imanishi et al., U.S. RE44,779; Wengel et al., U.S. 6,794,499; Wengel et al., U.S. 6,670,461; Wengel et al., U.S. 7,034,133; Wengel et al., U.S. 8,080,644; Wengel et al., U.S. 8,034,909; Wengel et al., U.S. 8, 153,365; Wengel et al., U.S. 7,572,582; 및 Ramasamy et al., U.S. 6,525,191; Torsten et al., WO 2004/106356; Wengel et al., WO 1999/014226; Seth et al., WO 2007/134181; Seth et al., U.S. 7,547,684; Seth et al., U.S. 7,666,854; Seth et al., U.S. 8,088,746; Seth et al., U.S. 7,750, 131; Seth et al., U.S. 8,030,467; Seth et al., U.S. 8,268,980; Seth et al., U.S. 8,546,556; Seth et al., U.S. 8,530,640; Migawa et al., U.S. 9,012,421; Seth et al., U.S. 8,501,805; 및 미국 특허 공개번호 Allerson et al., US2008/0039618 및 Migawa et al., US2015/0191727을 참조한다.
특정 구현예에서, 이환식 당 모이어티 및 이러한 이환식 당 모이어티가 병합된 뉴클레오시드는 이성질체 배위에 의해 추가로 정의된다. 예를 들어, (본원에 기술된) LNA 뉴클레오시드는 α-L 배위 또는 β-D 배위일 수 있다.
α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-0-2') 또는 α-L-LNA 이환식 뉴클레오시드는 안티센스 활성을 보이는 올리고뉴클레오티드에 병합된 바 있다 (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372). 여기서, 이환식 뉴클레오시드에 대한 일반적인 설명은 2가지 이성질체 배위들을 모두 포함한다. 특정한 이환식 뉴클레오시드 (예를 들어, LNA 또는 cEt)의 위치들이 본원에 예시된 구현예에서 식별된 경우, 이는 달리 언급되지 않은 한 β-D 배위로 존재한다.
특정 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 하나 이상의 비-브릿징 당 치환기 및 하나 이상의 브릿징 당 치환기 (예를 들어, 5'-치환된 당 및 4'-2' 브릿징된 당)를 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 당 모이어티는 당 서로게이트 (sugar surrogate)이다. 일부 이러한 구현예에서, 당 모이어티의 산소 원자는 예를 들어 황, 탄소 또는 질소 원자로 치환된다. 일부 이러한 구현예에서, 이러한 변형된 당 모이어티는 또한 본원에 기술된 바와 같이 브릿징 치환기 및/또는 비-브릿징 치환기를 포함한다. 예를 들어, 일부 당 서로게이트는 4'-황 원자 및 2'-위치 및/또는 5' 위치에 치환기를 포함한다 (예를 들어, Bhat et al., U.S. 7,875,733 및 Bhat et al., U.S. 7,939,677).
특정 구현예에서, 당 서로게이트는 5개의 원자 이외의 다른 것을 가진 고리를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 당 서로게이트는 6원성 테트라하이드로피란 ("THP")을 포함한다. 이러한 테트라하이드로피란은 추가로 변형되거나 또는 치환될 수 있다. 이러한 변형된 테트라하이드로피란을 포함하는 뉴클레오시드로는 헥시톨 핵산 ("HNA"), 아니톨 핵산 ("ANA"), 만니톨 핵산 ("MNA") (예를 들어, Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854), 플루오로 HNA:
("F-HNA", 예를 들어, Swayze et al., U.S. 8,088,904; Swayze et al., U.S. 8,440,803; Swayze et al., U.S. 8,796,437; 및 Swayze et al., U.S. 9,005,906; F-HNA는 F-THP 또는 3'-플루오로 테트라하이드로피란으로도 지칭됨), 및 하기 식을 가진 부가적인 변형된 THP 화합물을 포함하는 뉴클레오시드 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다:
여기서, 독립적으로, 각각의 변형된 THP 뉴클레오시드에서:
Bx는 뉴클레오베이스 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 변형된 THP 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분과 연결하는 뉴클레오시드 간 연결 기이거나, 또는 T3 및 T4 중 하나는 변형된 THP 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분과 연결하는 뉴클레오시드 간 연결 기이고 T3 및 T4 중 다른 하나는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 접합 기 또는 5' 또는 3'-말단 기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, 치환 또는 비-치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN로부터 선택되되, X는 O, S 또는 NJ1이고, 각각의 J1, J2 및 J3는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7이 각각 H인 변형된 THP 뉴클레오시드가 제공된다. 특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 하나 이상은 H 이외의 것이다. 특정 구현예에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 하나 이상은 메틸이다. 특정 구현예에서, R1 및 R2 중 하나가 F인 변형된 THP 뉴클레오시드가 제공된다. 특정 구현예에서, R1은 F이고 R2는 H이고, 특정 구현예에서, R1은 메톡시이고 R2는 H이며, 특정 구현예에서, R1은 메톡시에톡시이고 R2는 H이다.
특정 구현예에서, 당 서로게이트는 원자를 6개 이상, 이종원자를 2 이상 가진 고리를 포함한다. 예를 들어, 모르폴리노 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드 및 이의 올리고뉴클레오티드에서의 이용이 보고된 바 있다 (예를 들어, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 및 Summerton et al., U.S. 5,698,685; Summerton et al., U.S. 5,166,315; Summerton et al., U.S. 5,185,444; 및 Summerton et al., U.S. 5,034,506). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모르폴리노"는 하기 구조를 가진 당 서로게이트를 의미한다:
특정 구현예에서, 모르폴리노는, 예를 들어 전술한 모노폴리노 구조로부터 다양한 치환기를 부가 또는 변경함으로써, 변형할 수 있다. 이러한 당 서로게이트는 본원에서 "변형된 모노폴리노"로 언급된다.
특정 구현예에서, 당 서로게이트는 비환식 모이어티를 포함한다. 이러한 비환식 당 서로게이트를 포함하는 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드로는 펩타이드 핵산 ("PNA"), 비환식 부틸 핵산 (예를 들어, Kumar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5853-5865), 및 Manoharan et al., WO2011/133876에 기술된 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
변형된 뉴클레오시드에 이용될 수 있는 다수의 기타 이환식 및 삼환식 당 및 당 서로게이트 고리 시스템들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
기능성 도메인 또는 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 잔기는 다수의 공지된 임의의 뉴클레오시드 간 연결에 의해 서로 커플링될 수 있다. 뉴클레오시드 간 연결 기에 대한 2가지 주요 유형은 인 원자의 존재 또는 부재에 따라 정의된다. 대표적인 인-함유 뉴클레오시드 간 연결로는 포스포다이에스테르 결합 ("P=O")(비-변형된 또는 자연 생성 연결로도 지칭됨), 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트 ("P=S"), 및 포스포로다이티오에이트 ("HS-P=S")를 함유한 포스페이트 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 대표적인 인 비-함유 뉴클레오시드 간 연결 기로는 메틸렌메틸이미노 (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오다이에스테르, 티오노카바메이트 (-O-C(=O)(NH)-S-); 실록산 (-O-SiH2-O-); 및 N,N'-다이메틸하이드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-) 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 인-함유 및 인 비-함유 뉴클레오시드 간 연결을 제조하는 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 충분히 공지되어 있다.
이러한 뉴클레오시드 간 연결로는 포스포다이에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 메틸포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 브릿지된 포스포르아미데이트, 브릿지된 메틸렌 포스포네이트, 브릿지된 포스포로티오에이트 및 설폰 뉴클레오시드 간 연결 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 간 연결들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트와 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 간 연결들 중 절반 이상에서 전체 미만이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 간 연결들 모두 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다.
키랄 센터를 가진 뉴클레오시드 간 연결을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드는 입체 무작위 뉴클레오시드 간 연결을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 집단 또는 특정한 입체화학 배위로 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 집단으로서 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 집단은, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 간 연결들 모두 입체 무작위인 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 간 연결을 포함한다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드는 각각의 포스포로티오에이트 연결의 입체 화학 배위의 무작위 선별을 달성하는 합성 방법을 이용해 구축할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 당해 기술 분야의 당업자들에게 충분히 이해되는 바와 같이, 각각의 개별 올리고뉴클레오티드 분자의 각각의 개별 포스포로티오에이트는 정의된 입체배위를 가진다. 특정 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 집단은 하나 이상의 특정한 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 간 연결, 특히 독립적으로 선택된 입체화학 배위를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드에 대해 농화된다.
특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결은 혼합된 Rp와 Sp 거울상 이성질체일 수 있거나, 또는 Rp 또는 Sp 형태로 입체 규칙성이거나 또는 실질적으로 입체 규칙성으로 제조될 수 있다. 연결이 Rp와 Sp 거울상 이성질체의 혼합인 구현예들에서, Rp 형태와 Sp 형태는 올리고뉴클레오티드 전체에 무작위 배치되거나 또는 올리고뉴클레오티드 내 규정된 위치에 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오베이스 서열"은 임의의 당 또는 뉴클레오시드 간 연결 변형과는 독립적으로 핵산 또는 올리고뉴클레오티드 내 연속적인 뉴클레오베이스 순서를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오시드"는 뉴클레오베이스 및 당 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다. 뉴클레오베이스 및 당 모이어티는 각각 독립적으로 비-변형되거나 또는 변형된다. 본원에 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오시드"는 변형된 뉴클레오베이스 및/또는 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 변형된 뉴클레오시드는 뉴클레오베이스가 결핍된 비염기 (abasic) 뉴클레오시드를 포함한다. "연결된 뉴클레오시드"는 연속적인 서열로 연결된 뉴클레오시드들이다 (즉, 연결된 뉴클레오시드 사이에 부가적인 뉴클레오시드가 존재하지 않음).
본원에 사용된 바와 같이, "올리고머 화합물"은 올리고뉴클레오티드 및 선택적으로 하나 이상의 부가적인 특징, 예를 들어 접합 기 또는 말단 기를 의미한다. 올리고머 화합물은 제1 올리고머 화합물에 대해 상보적인 제2 올리고머 화합물과 쌍을 형성할 수 있거나, 또는 쌍을 형성하지 않을 수 있다. "단일 가닥 올리고머 화합물"은 쌍을 형성하지 않은 올리고머 화합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 간 연결을 통해 연결된 뉴클레오시드 가닥을 의미하고, 여기서 각각의 뉴클레오시드와 뉴클레오시드 간 연결은 변형되거나 또는 비-변형될 수 있다. 달리 나타내지 않은 한, 올리고뉴클레오티드는 연결된 뉴클레오시드 8-50개로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 간 연결이 변형된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "비-변형된 올리고뉴클레오티드"는 임의의 뉴클레오시드 변형 또는 뉴클레오시드 간 변형을 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제"는 동물 투여에 이용하기에 적합한 임의의 물질을 의미한다. 일부 이러한 담체는 약학적 조성물을 예를 들어 개체에 경구 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제 및 로젠지 (lozenges)로서 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 멸균수; 멸균 염수; 또는 멸균 완충액이다.
본원에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한 염"은 올리고머 화합물과 같은 화합물의 생리학적으로 및 약제학적으로 허용가능한 염, 즉 모 화합물의 요망하는 생물학적 활성을 보유하지만 원치않는 독성 효과를 부여하진 않는 염을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 조성물"은 개체에 투여하기 적합한 물질들의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 안티센스 화합물 및 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 일부 세포주에서 자유 흡수 분석 (free uptake assay)에서 활성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "인 모이어티"는 인 원자를 포함하는 원자 군을 의미한다. 특정 구현예에서, 인 모이어티는 모노-, 다이- 또는 트리-포스페이트 또는 포스포로티오에이트를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "프로드럭"은 동물 또는 이의 세포 내부에서 다른 형태로 변환되는, 체외 형태의 치료학적 물질을 의미한다. 전형적으로, 동물 체내에서 프로드럭의 변환은 효소 (예, 내인성 또는 바이러성 효소)의 작용에 의해 또는 세포 또는 조직에 존재하는 화합물 및/또는 생리학적 조건에 의해 촉진된다.
본원에 사용된 바와 같이, "OMe"는 메톡시를 의미한다. "2'-OMe"는 리보실 당 모이어티의 2' OH 기를 대신한 2'-OCH3 기를 의미한다.
종점에 의한 수치 범위의 언급은 해당 범위에 포괄되는 모든 수치 및 분수뿐 아니라 언급된 종점을 망라한다.
본원에 제시된 범위들은 그 범위내 모든 수치들을 축약한 것으로 이해된다. 예를 들어, 범위 1-50은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50뿐 아니라 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 및 1.9와 같은 전술한 정수들 사이의 모든 소수점 수치로 이루어진 군으로부터 선택되는 모든 수치, 수치들의 조합 또는 하위 범위를 포괄하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 한쪽 종점에서 연장되는 "내포된 하위 범위"도 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 범위 예로서 1-50에 대한 내포된 하위 범위는 한쪽 방향으로 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30 및 1 내지 40, 또는 다른쪽 방향으로 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "양 또는 활성 감소 또는 저해"는 무처리 또는 대조군 샘플에서 전사 발현 또는 활성을 기준으로 전사 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 의미하고, 이것이 전사 발현 또는 활성의 완전한 소거를 반드시 지칭하는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드에 대해 자기-상보적인"은 자신에 대해 적어도 부분적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "표준 세포 분석"은 실시예 1에 언급된 분석 및 이에 대한 합당한 변형을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동일한 분자 식으로 이루어진 분자 집단의 맥락에서 "입체 무작위 키랄 센터"는 무작위 입체화학 배위를 가진 키랄 센터를 의미한다. 예를 들어, 입체 무작위 키랄 센터를 포함하는 분자 집단에서, 입체 무작위 키랄 센터의 (S) 배위를 가진 분자의 개수가 입체 무작위 키랄 센터의 (R) 배위를 가진 분자의 개수와 동일할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 키랄 센터의 입체화학 배위는, 입체화학 배위를 제어하도록 설계되지 않은 합성 방법의 결과일 경우에 무작위로 고려된다. 특정 구현예에서, 입체 무작위 키랄 센터는 입체 무작위 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 간 연결이다.
본원에 사용된 바와 같이, "당 모이어티"는 비-변형된 당 모이어티 또는 변형된 당 모이어티를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "비-변형된 당 모이어티"는 RNA ("비-변형된 RNA 당 모이어티")에서 발견되는 바와 같이 2'-OH(H) 푸라노실 모이어티, 또는 DNA ("비-변형된 DNA 당 모이어티")에서 발견되는 바와 같이 2'-H(H) 모이어티를 의미한다. 비-변형된 당 모이어티는 3' 및 4' 위치 각각에 수소 하나, 3' 위치에 산소, 그리고 5' 위치에 수소 2개를 가진다. 본원에 사용된 바와 같이, "변형된 당 모이어티" 또는 "변형된 당"은 변형된 푸라노실 당 모이어티 또는 당 서로게이트를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 변형된 푸라노실 당 모이어티는 비-변형된 당 모이어티의 하나 이상의 수소 대신 비-수소 치환기를 포함하는 푸라노실 당을 의미한다. 특정 구현예에서, 변형된 푸라노실 당 모이어티는 2'-치환된 당 모이어티이다. 이러한 변형된 푸라노실 당 모이어티는 이환식 당 및 비-이환식 당을 망라한다.
본원에 사용된 바와 같이, "당 서로게이트"는 뉴클레오시드 간 연결, 접합 기 또는 올리고뉴클레오티드에서 말단 기와 같이 뉴클레오베이스를 다른 기에 연결할 수 있는 푸라노실 모이어티 이외의 다른 모이어티를 가진 변형된 당 모이어티를 의미한다. 당 서로게이트를 포함하는 변형된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 내 하나 이상의 위치에 병합될 수 있으며, 이러한 올리고뉴클레오티드는 상보적인 올리고머 화합물 또는 핵산에 혼성화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 핵산" 및 "표적 RNA"는 안티센스 화합물이 작동하도록 설계된 핵산을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 영역"은 올리고머 화합물이 혼성화하도록 설계된 표적 핵산의 일부분을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "말단 기"는 올리고뉴클레오티드의 말단에 절단가능하게 연결된 화학 기 또는 원자 기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"은 동물에 치료학적 이점을 제공하는 약학적 물질의 양을 의미한다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 질환의 증상을 개선한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료한다", "치료" 또는 "치료하는"은 본원에 기술된 화합물을 질환, 장애 또는 병태의 변형 또는 개선을 달성하도록 투여하는 것을 의미한다.
"일부분 (portion)"은 핵산의 연속적인 (즉, 연결된) 뉴클레오베이스의 지정된 개수를 의미한다. 특정 구현예에서, 일부분은 표적 핵산의 연속적인 뉴클레오베이스의 지정된 개수를 의미한다. 특정 구현예에서, 일부분은 안티센스 화합물의 연속적인 뉴클레오베이스의 지정된 개수이다.
용어 "공동-투여" 또는 "공동-투여된다"는 일반적으로 적어도 2종의 서로 다른 물질의 투여를 의미한다. 공동-투여는 적어도 2종의 서로 다른 물질을 임의 순서로, 단일한 투여로 또는 개별 투여로 동시 투여하는 것뿐 아니라 최대 수일 간격의 시차를 두는 것을 의미한다.
용어 "조합하여"는 일반적으로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드계 화합물과, 환자 치료 코스에서 화합물의 활성을 무력화하지 않는 질환 또는 병태 치료에 유용한 다른 물질을 투여하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 동시 투여뿐 아니라 수초 내지 최대 수일의 시차를 둔 순서로 투여하는 것을 비롯하여 임의의 순서로 행해질 수 있다. 이러한 조합 치료는 또한 본 발명에 따른 화합물 및/또는 독립적으로 다른 물질의 2회 이상의 투여를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물과 다른 물질의 투여는 동일하거나 또는 서로 다른 경로를 통해 이루어질 수 있다.
용어 "개인" 또는 "개체" 또는 "환자"는 일반적으로 인간과 같은 포유류를 지칭한다. 용어 "포유류"는 비-제한적으로 인간, 인간을 제외한 영장류, 랫, 마우스, 고양이, 개, 말, 소 (cattle, cow), 돼지, 양 및 토끼 등의 온혈, 척추 동물을 망라하는 것으로 명확하게 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, "필요한 개체"는 이러한 치료 또는 요법이 필요한 치료 또는 요법의 대상으로 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "발현 또는 활성의 저해"는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 의미하지만, 반드시 발현 또는 활성의 완전한 소거를 지칭하는 것은 아니다.
실시예
안티센스 올리고뉴클레오티드 기능성 도메인을 포함하는 CSO의 합성
본 발명에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드는, 수동으로 또는 자동화된 합성기를 이용해 수행될 수 있는, 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학 등의, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 공정으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 선형적인 합성 접근 방식에 의해 합성할 수 있다.
본원에서 채택한 화합물은 포스포르아미디트 화학을 이용해 합성하였다. 이들 프로토콜은 예를 들어 pubs.rsc.org/en/content/chapter/bk9781788012096-00453/978-1-78801-209-6에 상세히 기술되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 CSO의 용융 온도
고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는 지를 확인하기 위해, 2 μM CSO 화합물 샘플을 10 mM 소듐 포스페이트, 100 nM 염화나트륨 완충제 용액 (pH 7.2)에서 혼합하였다. 샘플을 5분간 95℃까지 가열한 다음 천천히 실온까지 냉각시켰다. 샘플은 용융 온도 (Tm)를 측정하기 전 냉장고에 넣어 밤새 두었다. 20-90℃에서의 냉각 및 가열 곡선을 표 6에 나타낸다.
표 6
| 화합물 # | Tm (℃) |
| 1009 | N/A |
| 1010 | N/A |
| 1101 | 43 |
| 1102 | 50 |
| 1103 | 37 |
| 1104 | 39 |
| 1105 | 45 |
| 1106 | 49 |
| 1107 | 41 |
| 1108 | 39 |
| 1109 | 31 |
| 1110 | N/A |
| 1111 | N/A |
| 1112 | N/A |
| 1124 | 64 |
| 1125 | 65 |
| 1126 | 62 |
| 1201 | 50 |
| 1202 | 44 |
| 1203 | 44 |
| 1204 | 30 |
| 1205 | N/A |
| 1206 | N/A |
| 1207 | 31 |
| 1208 | N/A |
| 1209 | N/A |
| 53 | 45 |
| 54 | 46 |
| 55 | 64 |
안티센스 올리고뉴클레오티드 기능성 도메인을 포함하는 CSO에 의한 표적 RNA의 저해
PCSK9 핵산을 표적으로 하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 설계하였으며, 시험관내에서 PCSK9 mRNA에 대해 효과를 검사하였다.
Hepa 1-6 세포를 DMEM 배지 + 10% FBS 및 100U/ml Pen/Strep에서 배양하였다 (ATCC). 세포를 접종하여, 형질감염 시점에 ~70% 컨플루언트 - ~100,000 세포/ml/12 웰 플레이트 - 가 되도록 밤새 인큐베이션하였다. 세포 배지를 교체하고, 각 웰에 900 ㎕ 씩 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드를 리포펙타민과 Opti-MEM 배지에서 혼합하여 이를 지질에 (1:1 비율) 첨가하여 15-20분간 인큐베이션하였다. 각 안티센스 농도 100 nM에 대해 각각의 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 약 16-48시간의 처리 기간 후, RNA 및/또는 단백질 분석을 위해 세포를 회수하였다.
세포 상층액에서 AK 방출 세포독성 분석으로 분석하였다. mPCSK9 및 PPIB 또는 HPRT1 (하우스키핑 대조군)에 대한 Taqman 프로브 (ThermoFisher)를 이용하였다. 각 실험의 결과들은 도 5에 나타낸다.
PNPLA3 핵산을 표적으로 하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 시험관내 PNPLA3 mRNA에 대해 효과를 검사하였다.
인간 HepG2 세포를 ATCC 권고 조건에 따라 배지 (이글스의 최소 필수 배지 + 10% FBS)에서 배양하였다. PDL 코팅된 96웰 플레이트에 세포를 50K/웰 밀도로 접종하고, 0.6 ㎕/웰 RNAiMax 및 지정된 농도의 올리고뉴클레오티드 화합물을 이용해 역 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 Cells to CT 세포용해 시약 (ThermoFisher 4391851C)을 사용해 회수하였다. RNA를 RT 시약 키트 (ThermoFisher A39110)를 이용해 cDNA 주형으로 역 전사하였다. qPCR 마스터 믹스 (ThermoFisher 4444964)를 사용해 정량적인 PCR을 수행하였다. PNPLA3 발현 수준을 PNPLA3-FAM 프로브 (ThermoFisher 4351368 Assay ID: Hs00228747)를 이용해 정량하고, 하우스키핑 유전자 POLR2A (ThermoFisher, 4448491, Assay ID: Hs01108291)에 대해 표준화하였다. 데이터는 GraphPad Prism에서 분석하였다.
스플리트머 포맷으로 변형된 RNA를 이용한 선형 ASO의 고리화가 추가적인 효능을 제공할 수 있는 지를 확인하기 위해, 동일한 염기 서열을 여러가지 포맷 및 화학 정렬로 포함하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PNPLA3 넉다운 수준을 비교하였다: 선형 ASO, 즉 비-변형된 RNA ID 1521, 선형의 갭머 1523, 선형의 스플리트머 1527, 1528, 1529, 및 고리형 스플리트머 ASO 1542, 1543, 1544 및 1545, 농도 200nM, 100nM, 50nM, 25nM 및 12.5nM (도 6A). 도 6B 및 도 6C에 도시한 바와 같이, 1세대 포맷 선형 AS0 1521은 고 농도 200nM에서도 활성이 없었으며, 선형 갭머 ASO 1523은 활성이 약하였으며, IC50 252 nM으로 약 50% 넉다운을 달성할 수 있었으며, 선형 스플리트머 포맷 ASO 1527, 1528 및 1529는 갭머 포맷보다 더 우수한 넉다운 활성을 달성할 수 있었으며, 모든 고리화된 스플리트머 ASO (CSOs 1542, 1543, 1544 및 1545)는 형질감염 후 24시간 후 PNPLA3 mRNA 수준을 낮추는데 가장 효과적이었다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드 기능성 도메인을 포함하는 CSO에 의한 면역 반응 유발
마우스 비장세포 재 자극 분석
C57BL/6J 마우스에서 수득한 비장을, 적혈구를 제거하기 위해 사용된 암모늄 클로라이드 세포용해 완충제 (Cat # 420302, BioLegend, San Diego, CA)를 이용해, 단일 세포 현탁물로 기계적으로 분산시켰다. 세포 생존성을 바이탈 염색제 (vital dye stain) 및 자동 세포 계수 시스템 (Countess 3, Thermo Fisher, Waltham, MA)을 이용해 확인하였다. 계수 한 후 생존 마우스 비장세포 1x105개를, 96웰 평면 바닥형 멸균 조직 배양물 처리 플레이트 (Cat # 3596, Corning, Glendale, AZ)의 각 웰에 10% 소 태아 혈청 (Cat # F2442, MilliporeSigma, Burlington, MA)이 함유된 RPMI 1640 (Cat # A1049101, Thermo Fisher) 중에 접종하였다.
Toll 유사 수용체 9 (TLR9)에 대한 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (ISO) 작용제 및 TLR9 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (ISO) 기능성 도메인을 포함하는 CSO는 표준 방법을 이용하여 Syngenis (Bentley, Australia) 사에서 합성한 다음 동결건조된 조제물로 공급받았으며, 이를 열 블록 인큐베이션 단계 (95℃, 5분)를 이용해 어닐링 완충제 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) 중에 재구성하였다. 어닐링한 후, 샘플 농도를 올리고뉴클레오티드 농도 측정을 위한 흡광 방법을 NanoDrop 분광광도계 (Thermo Fisher)를 이용해 적용하여 결정하였다. 대조군 TLR9 작용제는 Invivogen (San Diego, CA) 사에서 입수하였다. CSO 또는 대조군 작용제를 지정된 용량으로 지정된 웰에 지정된 농도로 첨가하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 자극하였다. 인큐베이션 기간 종료 후, 세포 배양 상층액을 회수하고, 커스텀 멀티플렉스 사이토카인/케모카인 분석 키트 (U-PLEX custom biomarker assay, Cat # K15069M-2, Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)를 사용해 분석하였으며, MSD S600 생물분석기 (Meso Scale)에서 데이터를 수집하고, MSD Discovery Workbench (Meso Scale)를 통해 원 데이터를 분석하였다. 결과들을 도 7-12에 도시한다.
면역 길항제 올리고뉴클레오티드 기능성 도메인을 포함하는 CSO의 활성을 평가하기 위해, 이러한 CSO를 단독으로 또는 TLR9 작용제와 함께 인큐베이션하고, 24시간 후 사이토카인을 분석하였다.
결과들을 도 13 및 14에 도시한다.
본 발명이 구체적으로 기술되고 바람직한 구현예를 들어 설명되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 첨부된 청구항에 의해 망라되는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에 대해 다양한 변화들이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
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Claims (100)
- 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단에서 연결되고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 고리화 도메인은 기능성 도메인과 혼성화하여 고리형 구조를 형성하고;
상기 기능성 도메인은 표적 RNA 서열과 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 적어도 12개의 연속적인 뉴클레오베이스를 포함하는, 뉴클레오티드 17-25개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물은 3' 도메인, 및 3' 도메인에 인접한 5' 도메인을 포함하고,
상기 3' 도메인은 뉴클레오티드 10-12개 길이이되, 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 임의의 데옥시리보뉴클레오티드이고 인접한 데옥시리보뉴클레오티드들 사이 각각의 뉴클레오티드 간 연결이 포스포다이에스테르 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합이고; 및
상기 5' 도메인은 뉴클레오티드 5-15개 길이이고, 5' 도메인은 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 비-변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하되, 단 5' 도메인은 변형된 당 및/또는 백본을 포함하는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 적어도 하나 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항에 있어서,
상기 3' 도메인이 뉴클레오티드 12개 길이이고, 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12번 위치에서의 뉴클레오티드들을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항에 있어서,
상기 3' 도메인이 뉴클레오티드 11개 길이이고, 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11번 위치에서의 뉴클레오티드들을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항에 있어서,
상기 3' 도메인이 뉴클레오티드 10개 길이이고, 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10번 위치에서의 뉴클레오티드들을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 도메인이 변형된 당을 포함하는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 적어도 1개 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 도메인이 비-인 기반의 백본 (nonphosphorus-based backbone)을 포함하는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 적어도 1개 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 도메인의 3개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 당 및/또는 백본을 포함하는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5' 도메인의 뉴클레오티드들 모두 변형된 당 및/또는 백본을 포함하는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 뉴클레오티드 4-6개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인의 뉴클레오티드가 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 비-변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제10항에 있어서,
상기 고리화 도메인의 뉴클레오티드가 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제10항에 있어서,
상기 고리화 도메인의 뉴클레오티드가 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제12항에 있어서,
상기 변형된 리보뉴클레오티드가 2'-치환된 리보뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제13항에 있어서,
상기 2'-치환된 리보뉴클레오티드가 2'-OMe 리보뉴클레오티드인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CSO의 기능성 도메인 및/또는 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결, 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커가 직접 결합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 상기 기능성 도메인과 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단에서 연결되고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-50개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 고리화 도메인은 기능성 도메인과 혼성화하여 고리형 구조를 형성하고;
상기 기능성 도메인이 siRNA를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 뉴클레오티드 4-12개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 siRNA의 센스 가닥의 5' 말단에서 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 또는 제19항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항에 있어서,
상기 기능성 도메인이 siRNA의 안티센스 가닥이고, 상기 고리화 도메인이 siRNA의 센스 가닥인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항에 있어서,
상기 기능성 도메인이 siRNA의 센스 가닥이고, 상기 고리화 도메인이 siRNA의 안티센스 가닥인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인의 뉴클레오티드가 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 비-변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제24항에 있어서,
상기 고리화 도메인의 뉴클레오티드가 비-변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제24항에 있어서,
상기 고리화 도메인의 뉴클레오티드가 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제26항에 있어서,
상기 변형된 리보뉴클레오티드가 2'-치환된 리보뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제27항에 있어서,
상기 2'-치환된 리보뉴클레오티드가 2'-OMe 리보뉴클레오티드인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CSO의 기능성 도메인 및/또는 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결, 포스포다이에스테르 뉴클레오티드 간 연결 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 상기 기능성 도메인과 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 siRNA가 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 3' 말단에서 연결되고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 고리화 도메인은 기능성 도메인과 혼성화하여 고리형 구조를 형성하고;
상기 기능성 도메인은 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 면역-저해성 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 면역-저해성 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 11-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항에 있어서,
상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 척추동물 세포에서 인터페론 반응을 유도할 수 있는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 또는 제34항에 있어서,
상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 상기 면역-저해성 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드가 아니고, 안티센스 활성을 갖지 않는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 상기 면역-저해성 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 17-40개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제36항에 있어서,
상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 상기 면역-저해성 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 20-30개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 뉴클레오티드 4-40개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제38항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 뉴클레오티드 4-30개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 다른 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 면역-저해성 올리고뉴클레오티드이고,
상기 고리화 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 면역-저해성 올리고뉴클레오티드가 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가진, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 변형되거나, 상기 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드가 변형되거나 또는 상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드와 고리화 도메인의 올리고뉴클레오티드 둘다 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 면역자극성 올리고뉴클레오티드인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 면역-저해성 올리고뉴클레오티드인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 링커를 통해 서로 연결되고,
상기 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-500개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 표적 RNA에 대해 상보적이고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가진, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제45항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제45항 또는 제46항에 있어서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단에서 연결된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제45항 또는 제46항에 있어서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 3' 말단에서 연결된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제47항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제48항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제46항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 간 연결의 변형, 당 변형, 헤테로사이클릭 염기의 변형 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드, microRNA (miRNA), siRNA, piRNA, hnRNA, ncRNA, snRNA, sgRNA, esiRNA, shRNA, lncRNA, 면역자극성 올리고뉴클레오티드, CRISPR-기반의 시스템, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 시스템 또는 스플라이싱 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단에서 연결되고;
상기 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-45개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 표적 RNA에 대해 상보적이고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 기능성 도메인이 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제54항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 뉴클레오티드 4-10개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제54항 또는 제55항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 간 연결의 변형, 당 변형, 헤테로사이클릭 염기의 변형 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드, microRNA (miRNA), piRNA, hnRNA, ncRNA, snRNA, sgRNA, esiRNA, shRNA 또는 lncRNA로부터 선택되는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단 또는 3' 말단에서 연결되고;
상기 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-100개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 표적화된 RNA에 대해 상보적이고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-100개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 기능성 도메인은 siRNA를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제60항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 siRNA의 센스 가닥의 5' 말단에서 또는 siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제60항에 있어서,
상기 기능성 도메인은 siRNA의 안티센스 가닥이고, 상기 고리화 도메인은 siRNA의 센스 가닥이며 안티센스 가닥의 3'-말단부 또는 5'-말단부에서 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제62항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 5' 말단으로 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제62항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 3' 말단으로 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제60항, 제62항 또는 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 siRNA가 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단에서 연결되고;
상기 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-45개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 표적 RNA에 대해 상보적이며;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 기능성 도메인이 스플라이싱 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제69항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 뉴클레오티드 4-10개 길이인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제69항 또는 제70항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 간 연결의 변형, 당 변형, 헤테로사이클릭 염기의 변형 또는 이들의 조합을 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 5' 말단에서 연결되고;
상기 기능성 도메인은 뉴클레오티드 15-500개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 표적화된 RNA에 대해 상보적이고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-12개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 기능성 도메인은 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 시스템의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 CRISPR-기반의 시스템의 가이드 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제74항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제74항 또는 제75항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 기능성 도메인, 고리화 도메인 및 링커를 포함하는 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 (CSO)로서,
상기 기능성 도메인과 고리화 도메인이 이들의 3' 말단에서 연결되고;
상기 기능성 도메인은 뉴클레오티드 11-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
상기 고리화 도메인은 뉴클레오티드 4-400개 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가지며;
상기 기능성 도메인은 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 5' 말단에 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 3' 말단에 부착된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항 또는 제78항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항 또는 제79항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 기능성 도메인의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단부와 혼성화하여 고리형 구조를 형성하는, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리화 도메인이 다른 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고,
상기 고리화 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 기능성 도메인 내 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고 이것이 상보적인 기능성 도메인 내 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 반대되는 극성을 가진, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 변형되거나, 상기 고리화 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 변형되거나 또는 상기 기능성 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드와 고리화 도메인의 면역자극성 올리고뉴클레오티드가 둘다 변형된, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 링커 분절이 직접 결합, 모노뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 2-5개 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 기타 화학적 모이어티이거나, 또는 이들의 조합인, 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드. - 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 제85항에 있어서,
소분자, 펩타이드, 백신, 항원, 항체, 세포독성 물질, 키나제 저해제, 알레르겐, 항생제, siRNA 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TLR 길항제, 화학치료제, 표적화된 치료학적 물질, 활성화된 세포, 단백질, 유전자 요법 벡터, 펩타이드 백신, 단백질 백신, DNA 백신, 보강제 및 공동-자극 분자, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는, 약학적 조성물. - 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는 유전자 발현을 저해하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대립유전자-특이적인 유전자 발현을 저해하는 방법.
- 제88항에 있어서,
상기 표적 대립유전자가 점 돌연변이를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는 RNA 프로세싱을 조절하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, mRNA 전사체를 적어도 2개 포함하는 유전자에서 제1 mRNA 전사체를 선별하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, RNA 프로세싱의 조절이 개체를 치료하는데 유익한 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 유전자 발현의 저해가 개체를 치료하는데 유익한 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 유도가 개체를 치료하는데 유익한 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 저해가 개체를 치료하는데 유익한 질환 또는 장애를 개체에서 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 표적 RNA의 논센스 매개 소거 (nonsense mediated decay)를 유도하는 방법.
- 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드 또는 제85항 또는 제86항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 단백질 암호화 mRNA 또는 기능성 mRNA의 수준 증가 및 단백질 또는 기능성 mRNA의 발현 증가를 달성하는 방법.
- 제87항 내지 제93항, 제96항 또는 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 유전자 발현의 조절이 유익한 질환 또는 장애를 가진 개체를 치료하는데 유익한, 방법 - 제98항에 있어서,
상기 질환 또는 장애가 세포성 유전자의 비정상적인 발현 또는 생산으로 유발된, 방법. - 제87항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고리형 구조의 올리고뉴클레오티드가 국소 투여되는, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US202163247556P | 2021-09-23 | 2021-09-23 | |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20240082367A true KR20240082367A (ko) | 2024-06-10 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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