CN105641700A - 对抗肌肉病症的方式和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了缓解杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的方式和方法。将利用提供给患者功能性蛋白的化合物的治疗与至少一种减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或至少一种改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物组合。

Description

对抗肌肉病症的方式和方法

发明领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。

发明背景

肌肉病症是一种通常对个体生活有明显影响的疾病。肌肉病症可能有遗传原因或非遗传原因。与遗传原因相关的一类重要肌肉疾病是贝克型肌营养不良(BeckerMuscularDystrophy,BMD)和杜兴氏肌营养不良(DuchenneMuscularDystrophy,DMD)。这些病症是由肌肉蛋白的基因缺陷引起的。

贝克型肌营养不良和杜兴氏肌营养不良是相对高发病率的遗传性肌营养不良。在杜兴氏和贝克型肌营养不良两者中，肌肉蛋白肌肉营养不良蛋白受到影响。在杜兴氏肌营养不良中缺乏肌营养不良蛋白，而在贝克型肌营养不良中存在一些肌营养不良蛋白，但其产量大部分时候都是不够的和/或存在的肌营养不良蛋白是异常形成的。两种疾病都与隐性X连锁遗传相关。DMD是由DMD基因的移码突变造成的。DMD基因中的移码导致截短的非功能性肌营养不良蛋白的产生，引起渐进性肌肉萎缩和无力。当突变不导致DMD基因的移码时，发生BMD。在BMD中，存在一些肌营养不良蛋白，与此相反，DMD缺乏肌营养不良蛋白。BMD具有比DMD严重性更轻的症状。DMD的发作早于BMD。DMD通常在儿童早期就表现出来，而BMD是在十几岁或成年早期。BMD的发展比DMD缓慢且更难以预测。BMD患者可存活至成年中期至晚期。DMD患者很少能存活超过三十岁。

在肌纤维中，肌营养不良蛋白发挥着重要的结构作用，联接细胞外基质和细胞骨架。N末端区结合肌动蛋白，而C末端是肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)的一部分，该复合物跨越肌膜。缺乏肌营养不良蛋白时，机械应激会导致肌浆破裂，使钙未受控制地流入肌纤维内部，由此触发钙激活的蛋白酶和纤维坏死。

对于大部分遗传性肌营养不良，目前没有临床可应用的和有效的治疗。现在探索外显子跳跃技术以对抗遗传性肌营养不良。最近我们和其他人已报道了有关基因治疗的可喜成果^1-11，该基因治疗旨在恢复mdx小鼠和DMD患者的细胞中肌营养不良蛋白前mRNA(pre-mRNA)的读框(readingframe)。通过特定外显子的靶向跳跃，DMD表型(缺乏肌营养不良蛋白)被转化成更轻度的BMD表型(部分转化为大量功能性肌营养不良蛋白)。优选通过靶向一个或两个剪接位点或外显子内在序列的反义寡核糖核苷酸(AONs)的结合来诱导外显子的跳跃。因为当两个剪接位点由剪接体复合物所识别时，外显子只内含在mRNA中，因此剪接位点是AONs的明显靶标。可选地，或另外，采用对一个或多个外显子序列的至少一部分具有特异性的一个或多个AONs。采用对外显子46序列具有特异的外显子内部AONs，我们以前就可以在外显子45缺失的两个不同DMD患者的培养的肌管中调节剪接模式¹¹。AON处理之后，外显子46发生跳跃，这在至少75％的细胞中导致读框恢复并诱导肌营养不良蛋白的合成。最近我们发现，采用外显子内部AONs，也可在人类对照和患者肌肉细胞中针对39个不同DMD外显子有效地诱导外显子跳跃^1,2,11-15。

因此，在肌营养不良蛋白基因中应用外显子跳跃技术，可在DMD患者中生成至少部分功能性肌营养不良蛋白-虽然较短。因为DMD是由功能失调的肌营养不良蛋白引起的，因此预期一旦给DMD患者提供功能性肌营养不良蛋白就足以缓解DMD的症状。然而，本发明提供的观点是，即使外显子跳跃技术能诱导肌营养不良蛋白合成，但仍然通过给予患者减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，来进一步缓解DMD症状。根据本发明，即使在DMD患者中恢复肌营养不良蛋白缺陷，组织炎症和受损肌肉细胞的存在，仍持续促成DMD症状。因此，即使DMD的原因-即功能失调的肌营养不良蛋白得到缓解，但仍然还通过另外采用本发明的辅助治疗改善DMD治疗。而且，本发明提供的观点是炎症的减少不会造成肌肉细胞摄取AON的明显减少。这是令人惊奇的，因为通常炎症会增强细胞、血液和其他化合物的运输。结果，炎症期间AON摄取/运输也增强。因此，在本发明之前，预期对抗炎症的辅助治疗涉及消极影响AON治疗的风险。然而，情况并非如此。

因此本发明提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括：

-给予所述个体向其提供(至少部分)功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及

-给予所述个体减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物。

在另一优选实施方案中，缓解个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的方法包括，给予所述个体减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物。

令人惊奇的发现是，当使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时，如果也向表达mRNA的细胞提供减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，则来自包括所述外显子的所述前mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率得以增强。跳跃频率的增强也增加了DMD或BMD个体肌细胞所产生的功能性肌营养不良蛋白的水平。

本发明还提供了在表达前mRNA的细胞中增强来自肌营养不良蛋白的所述前mRNA的外显子跳跃的方法，该方法包括：

-使所述细胞中的所述前mRNA与使所述外显子跳跃的寡核苷酸接触，以及

-使所述细胞与减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物接触。

因为杜兴氏和贝克型肌营养不良在肌细胞中具有明显表型，因此，优选所述细胞是肌细胞。优选地，所述细胞包括编码突变肌营养不良蛋白的基因。优选地，所述细胞是患有DMD或BMD的个体的细胞。

本发明还提供了在患有杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的个体的表达前mRNA的细胞中增强来自肌营养不良蛋白前mRNA的外显子跳跃的方法，该方法包括：

-给予所述个体向其提供(至少部分)功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及

-给予所述个体减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物。

可通过多种方式向个体提供功能性肌营养不良蛋白。在一个实施方案中，应用外显子跳跃技术。然而，可选的方法是可用的，例如通过庆大霉素或PTC124(也称为3-(5-(2-氟苯基)-1,2,4-恶二唑-3-基)苯甲酸)抑制终止密码子^16,17，和/或腺伴随病毒(AAV)-介导的功能性小或微肌营养不良蛋白基因的基因送递^18-20。PTC124^TM是新泽西州南普莱恩菲尔德PTCTherapeutics,Inc.(PTCTherapeutics,Inc.SouthPlainfield,NewJersey)的注册商标。

如本文所定义的，功能性肌营养不良蛋白优选是野生型肌营养不良蛋白，其对应具有SEQIDNO:1所确定的氨基酸序列的蛋白。功能性肌营养不良蛋白优选是肌营养不良蛋白，其具有N末端部分(在N末端的头240个氨基酸)的肌动蛋白结合结构域、富含半胱氨酸结构域(氨基酸3361-3685)和C末端结构域(C末端的最后325个氨基酸)，且本领域技术人员已知，每个这些结构域都存在于野生型肌营养不良蛋白中。此处所示的氨基酸对应由SEQIDNO:1表示的野生型肌营养不良蛋白的氨基酸。换而言之，功能性肌营养不良蛋白是至少一定程度上表现出野生型肌营养不良蛋白活性的肌营养不良蛋白。“至少一定程度上”优选表示至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的相应野生型功能性肌营养不良蛋白的活性。在本文中，功能性肌营养不良蛋白的活性是优选与肌动蛋白和与肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物(DGC)结合⁵⁶。可通过对疑似肌营养不良的肌肉的活检进行采用总蛋白提取物的免疫共沉淀或横切片的免疫荧光分析，使肌营养不良蛋白与肌动蛋白和与DGC复合物的结合可视化，这是本领域技术人员已知的。

患有杜兴氏肌营养不良的个体通常在编码肌营养不良蛋白的基因上有突变，肌营养不良蛋白可防止完整蛋白的合成即提前终止(prematurestop)防止C末端的合成。在贝克型肌营养不良中，肌营养不良蛋白基因与野生型相比也包括突变，但其突变一般不包括提前终止，且C末端通常是合成的。结果合成了功能性肌营养不良蛋白，其具有与野生型蛋白至少在种类上相同的活性，尽管在活性水平上不一定相同。BMD个体的基因组通常编码包括N末端部分(在N末端的头240个氨基酸)、富含半胱氨酸结构域(氨基酸3361-3685)和C末端结构域(C末端的最后325个氨基酸)的肌营养不良蛋白，但它的中心杆状结构域可以比野生型肌营养不良蛋白的短⁵⁶。用于治疗DMD的外显子跳跃通常涉及，通过使杆结构域状的结构域中的外显子跳跃以矫正读框并允许合成包括C末端的肌营养不良蛋白的残余部分，而克服前mRNA的提前终止，尽管由于杆结构域较小，导致该蛋白有些小。在优选的实施方案中，向患有DMD并通过上述定义的方法治疗的个体提供至少一定程度上表现出野生型肌营养不良蛋白活性的肌营养不良蛋白。更优选地，如果所述个体是杜兴氏患者或疑似是杜兴氏患者，则功能性肌营养不良蛋白是患有BMD的个体的肌营养不良蛋白：通常所述肌营养不良蛋白能与肌动蛋白和DGC两者相互作用，但其中心杆状结构域比野生型肌营养不良蛋白的短(Aartsma-Rusetal(2006,ref56)。野生型肌营养不良蛋白的中心杆结构域包括24个血影蛋白样重复⁵⁶。例如，本文所提供的肌营养不良蛋白中心杆状结构域可包括5-23个、10-22个或12-18个血影蛋白样重复，只要它可与肌动蛋白和与DGC结合。

在本发明的方法中，缓解个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状，可通过以下任何试验进行评估：丧失行走的时间延长，肌肉强度的改善，举重能力的改善，从平地站起所花时间的改善，九米行走时间的改善，攀登4层楼所花时间的改善，腿功能级别的改善，肺功能的改善，心脏功能的改善，生活质量的改善。这些试验的每一种都是技术人员已知的。例如，Manzuratal(2008,ref58)的公开，给出了每个这种试验的广泛解释。对于每种这些试验，一旦发现试验所测量的参数的可检测改善或延长，就优选表示，采用本发明的方法缓解了个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状。可检测改善或延长优选是如Hodgettsetal(2006,ref57)所述统计学上的显著改善或延长。可选地，个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的缓解，可通过测量本文之后所定义的肌纤维功能、完整性和/或存活的改善来评估。

减少炎症的辅助化合物包括能至少部分减少炎症优选由受损肌细胞引起的炎症的任何治疗。所述辅助化合物最优选能减少肌肉组织炎症。优选通过检测疑似肌营养不良的肌肉组织中浸润免疫细胞例如嗜中性粒细胞和/或肥大细胞和/或树突细胞和/或淋巴细胞数量的增加来评估炎症。优选在疑似肌营养不良的肌肉组织的活检⁵⁷横切片上经过如上所述的特异性免疫细胞染色之后进行这种评估。优选在显微镜下进行定量。因此优选通过在疑似肌营养不良的肌肉组织的横切片中检测免疫细胞数量的减少来评估炎症的减少。检测减少优选表示至少一种如上所述的免疫细胞的数量与治疗前相同个体中免疫细胞相比，减少至少1％、2％、3％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。最优选地，在所述活检横切片中未检测到浸润免疫细胞。

改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物包括，与其他不存在所述辅助化合物的相似情况相比，可测量地增强肌纤维功能、完整性和/或存活的任何治疗。肌纤维功能、完整性和/或存活的改善可采用以下试验中至少之一评估：血液中可检测到的肌酸激酶减少，疑似肌营养不良的肌肉活检横切片中可检测到的肌纤维坏死的减少，和/或疑似肌营养不良的肌肉活检横切片中可检测到的肌纤维直径同质性的增加。这些试验中的每一个都是技术人员已知的。

可以检测血液中的肌酸激酶，如57所述。可检测到的肌酸激酶的减少表示，与相同个体治疗前肌酸激酶浓度相比，减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

可检测到的肌纤维坏死的减少优选采用活检横切片在肌肉活检中进行评估，更优选如57所述进行评估。可检测到的坏死的减少表示采用活检横切片确定的坏死面积减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。减少通过与相同个体治疗前所评估的坏死进行比较来测量。

可检测到的肌纤维直径同质性的增加优选在肌肉活检横切片中评估，更优选如57所述进行评估。

本发明所述方法的治疗为大约至少一周、大约至少一个月，大约至少几个月，大约至少一年，大约至少2、3、4、5、6年或更久。

在一个实施方案中，使用增加受损肌细胞更新的辅助化合物。增加受损肌细胞更新的辅助化合物包括，能至少部分诱导和/或增加受损肌细胞更新的任何治疗。受损肌细胞是比健康完整的肌细胞具有显著更小的临床可测量功能性的肌细胞。在缺乏肌营养不良蛋白时，机械应激导致肌浆破裂，使钙未受控制地流入肌纤维内部，由此触发钙激活的蛋白酶类和纤维坏死，产生受损肌细胞。受损肌细胞更新的增加表示，与受损肌细胞更新不增加的情况相比，受损肌细胞更快地被降解和/或移除。受损肌细胞的更新优选采用活检横切片在肌肉检中进行评估，更优选如57所述进行评估。可检测到的更新增加可以是采用活检横切片鉴定的更新的面积增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。增加通过与相同个体治疗前所评估的更新进行比较来测量。

不希望受限于理论，认为增加肌细胞的更新是优选的，因为这减少了炎症反应。

根据本发明，向个体提供功能性肌营养不良蛋白的治疗与减少个体炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助治疗的组合，特别适宜用作药物。这种组合甚至比向个体提供功能性肌营养不良蛋白的单一治疗能更好地缓解杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状。这个实施方案也增强了来自包括外显子的前mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率，在使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时。跳跃频率的增强也增加了DMD或BMD个体肌细胞所产生的功能性肌营养不良蛋白的水平。

因此还提供了用作药物的向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与减少所述个体炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物的组合。因此所述组合特别适宜对抗DMD，因此本发明也提供了向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与减少所述个体炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物用于制备缓解杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，使用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。

优选的减少炎症辅助化合物包括，类固醇、TNFα抑制剂、mIGF-1源和/或抗氧化剂。然而，如上所述能减少炎症的任何其他化合物也可包括在本发明内。这些化合物中的每一种将在随后展开描述。可单独或相互组合和/或与改善肌纤维功能、完整性和/或存活的一种或多种辅助化合物组合使用所展开描述的每种化合物。

而且，向个体提供功能性肌营养不良蛋白的治疗与改善个体肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助治疗的组合，特别适宜用作药物。这种组合甚至比向个体提供功能性肌营养不良蛋白的单一治疗能更好地缓解杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状。

因此还提供了用作药物的向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与改善所述个体肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物的组合。这种组合还特别适宜对抗DMD。因此也提供了向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与改善所述个体肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物用于制备缓解杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，使用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。

优选用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物包括，离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、L-精氨酸和/或血管紧张素II型I受体阻断剂。然而，如上所述的能改善肌纤维功能、完整性和/或存活的任何其他化合物也可包括在本发明内。这些化合物的每一种将在随后展开描述。可单独或相互组合和/或与用于减少炎症的一种或多种辅助化合物组合使用所展开描述的每种化合物。

在一个实施方案中，制备了药物制剂，其包括至少一种以上述组合，所述组合包括向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物以及本发明所述辅助化合物。因此还提供了药物制剂，其包括：

-向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及

-减少所述个体炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善所述个体肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，以及

-药物可接受载体、佐剂、稀释剂和/或赋形剂。适宜载体和佐剂的实例是本领域公知的，例如包括盐溶液。本发明所述的药物制剂所用化合物的剂量范围是根据符合严格方案要求的临床试验中上升剂量研究而设计的。

在一个特别优选的实施方案中，向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与类固醇组合。如实施例所示的，这种结合明显缓解了DMD症状。因此本发明的一个优选的实施方案提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体类固醇与向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了用作药物的类固醇与向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，以及类固醇与向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时，该实施方案也增强了来自包括所述外显子的前mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率。跳跃频率的增强也增加了DMD或BMD个体肌细胞所产生的功能性肌营养不良蛋白的水平。

在一个实施方案中，使用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。

类固醇是萜类脂质，其特征在于碳骨架具有四个稠合的环并通常以6-6-6-5的方式排列。通过附于这些环的功能团和环的氧化状态，类固醇可发生改变。类固醇包括通常用于减轻肿胀和炎症的激素和药物，例如泼尼松、地塞米松和维生素D。

根据本发明，辅助类固醇治疗在DMD患者中的补充作用包括，减少组织炎症、抑制细胞毒性细胞和改善钙平衡。在小男孩中获得了大多数阳性结果。优选类固醇是皮质类固醇(糖皮质类固醇)。优选，在本发明的方法中使用泼尼松类固醇(例如泼尼松、泼尼松龙或地夫可特)²¹。本文所述的治疗应用所用的(糖皮质)类固醇的剂量范围是根据符合严格方案要求的临床试验中上升剂量研究而设计的。通常的剂量，对泼尼松和泼尼松龙而言是大约0.5-1.0mg/kg/天，优选大约0.75mg/kg/天，而对地夫可特而言是大约0.4-1.4mg/kg/天，优选大约0.9mg/kg/天。

在一个实施方案中，在给予向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物之前，给予所述个体类固醇。在该实施方案中，优选在给予向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物之前的至少一天、更优选至少一周、更优选至少两周、更优选至少三周，给予所述类固醇。

在另一优选实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂组合。肿瘤坏死因子α(TNFα)是刺激炎症反应的促炎细胞因子。用中和抗体英夫利昔单抗(类克)在药理上阻断TNFα活性，在临床上高效减少炎症疾病的症状。在mdx小鼠中，英夫利昔单抗和依那西普都延迟和减少营养不良肌肉的坏死^24,25，伴有对肌肉强度、氯离子通道功能和CK水平减少的附加生理优势，这在经长期治疗实践的成年mdx小鼠中得到证实²⁶。这种设计用于其它临床状况的高度特异性消炎药物是DMD所用类固醇的有吸引力替代物。在一个实施方案中，当肌肉损伤和劣化特别明显时，TNFα抑制剂的使用仅限于男孩肌肉密集生长期。

因而，本发明的一方面提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予向所述个体TNFα抑制剂和向所述给他提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了用作药物的TNFα抑制剂和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，以及TNFα抑制剂和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，使用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。优选的TNFα抑制剂是二聚体融合蛋白，其由与人IgG1的Fc部分连接的TNFα的人p75受体的细胞外配体结合结构域组成。更优选的TNFα抑制剂是依那西普(Amgen,America)²⁶。依那西普的通常剂量是一周两次大约0.2mg/kg，优选大约0.5mg/kg。优选皮下给药。

在另一优选实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与mIGF-1源组合。如上所限定的，IGF-1源优选包括mIGF-1本身，能增强mIGF-1表达和/或活性的化合物。此处的增强与增加是同义的。mIGF-1的表达与mIGF-1的量是同义的。mIGF-1通过增加卫星细胞的活性促进肌肉的再生，并减少炎症和纤维化²⁷。局部肌肉损伤导致mIGF-1表达增加。在具有额外的IGF-1基因的转基因小鼠中，可观察到肌肉肥大和扩大的肌纤维²⁷。同样，转基因mdx小鼠显示出肌纤维变性减少²⁸。mIGF-1基因的上调和/或给予额外量的mIGF-1蛋白或其功能等同物(特别是mIGF-1Ea同种型[如27所述，人类同系物IGF-1同种型4:SEQIDNO:2])从而促进其他效果，优选DMD的基因治疗，包括反义诱导的外显子跳跃。在上述转基因小鼠中，其他mIGF-1水平不会诱导心脏问题，也不会促成癌症，并且没有生理副作用。因而本发明的一个方面提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体向其提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，和向所述个体提供mIGF-1源，优选mIGF-1本身，能增加mIGF-1表达和/或活性的化合物。如之前所述，例如通过增强mIGF-1基因的表达和/或通过给予mIGF-1蛋白和/或其功能等同物(特别是mIGF-1Ea同种型[如27所述，人类同系物IGF-1同种型4:SEQIDNO:2])来增加mIGF-1的量。也提供了mIGF-1或能增强mIGF-1表达或mIGF-1活性的化合物和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，该组合用作药物，以及mIGF-1或能增强mIGF-1表达或mIGF-1活性的化合物和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用这种组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。

在本发明的上下文中，可通过增加IGF-1基因的基因表达水平，通过增加相应IGF-1蛋白的量和/或通过增加IGF-1蛋白的活性，实现mIGF-1的量或活性的增加。优选的mIGF-1蛋白如本文之前所限定的。所述蛋白活性的增加在本文理解为，表示与未经治疗的个体中所述活性或稳定状态相比，在由所述蛋白显露的生物活性或在所述蛋白的稳定状态水平上的任何可检测到的改变。优选通过检测肌肉肥大生物标记GATA-2表达的增加来评估mIGF-1的量或活性的增加(如27所述的)。

优选使用经典分子生物技术例如(实时)PCR、阵列或Northern分析评估基因表达水平。通过定量蛋白的量，直接测定蛋白的稳定状态水平。通过任何已知技术例如Western印迹或使用针对蛋白而产生的抗体的免疫分析，可定量蛋白的量。技术人员应当理解的是，可选地或与基因表达水平和/或相应蛋白的定量组合，相应蛋白的底物或已知与相应蛋白的功能或活性相关的任何化合物的定量或使用特定试验对相应蛋白的所述功能或活性的定量，可用于评估蛋白的活性或稳定状态水平的变化。

在本发明的方法中，所述蛋白的活性或稳定状态水平可在蛋白本身的水平上改变，例如通过从外部来源向细胞提供蛋白。

优选地，所述基因表达水平的增加或上调表示使用阵列所述基因的表达水平增加至少5％。更优选地，所述基因表达水平的增加表示增加至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。在另一优选实施方案中，所述蛋白表达水平的增加表示使用western印迹和/或使用ELISA或适宜试验，所述蛋白表达水平增加至少5％。更优选地，蛋白表达水平的增加表示增加至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。

在另一优选的实施方案中，多肽活性的增加表示使用适宜试验多肽活性增加至少5％。更优选地，多肽活性的增加表示增加至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。优选通过比较个体治疗前的相应活性来评估增加。

提供mIGF1源的优选方式是，导入编码mIGF1优选mIGF1Ea同种型(如27所述的，人类同系物IGF-1同种型4:SEQIDNO:2)的转基因，更优选在如本文随后所限定的AAV载体中。特别是在如27所述的小鼠肌肉组织中表达这种mIGF1源。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与抗氧化剂组合。氧化应激是DMD发展的重要因素并促进了慢性炎症和纤维化²⁹。在杜兴氏症男孩中，氧化应激的最常见产物，即过氧化脂质平均增加了35％。超氧化物岐化酶和过氧化氢酶的酶水平增加减少了造成这些效果的过量自由基。事实上，对膳食补充剂(LifeVantage)进行了临床检验，发现其可增加超氧化物歧化酶(达30％)和过氧化氢酶(达54％)的水平，其在29个健康人中确实明显抑制脂质的过氧化³⁰。因而这种氧化应激的有效管理保留了肌肉质量并由此促进了DMD治疗的积极作用。艾迪苯醌(Idebenone)是另一种有效抗氧化剂，其具有源自天然辅酶Q10的化学结构。它可保护线粒体，其中三磷酸腺苷即ATP通过氧化磷酸化产生。在DMD中缺乏肌营养不良蛋白在心脏中并且也可能在骨骼肌中消极地影响的这个过程。最近在美国和欧洲，将艾迪苯醌应用于临床试验，证实了对Friedreich型共济失调(Friedreich’sAtaxia)的神经学方面的效果³¹。最近在比利时开始了艾迪苯醌的IIa期双盲安慰剂对照随机临床试验，包括21个8-16岁的杜兴氏症男孩。该研究的主要目的是测定艾迪苯醌对心脏肌肉功能的影响。另外，将进行几个不同的检验，以检测对患者肌肉强度的可能的功能性益处。若有效，则艾迪苯醌是用于本发明方法的优选辅助化合物，以便增强DMD治疗特别在心脏中的治疗效果。因而本发明的一个方面提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体抗氧剂和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了用作药物的抗氧化剂和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，以及抗氧化剂和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。根据抗氧化剂的特性，技术人员应当知道其优选的使用量。抗氧化剂可包括假马齿苋皂素(bacoside)、水飞蓟素、姜黄素、多酚，优选表没食子酸儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)。优选地，抗氧化剂是作为膳食补充剂(LifeVantage)的抗氧化剂的混合物。675mg的日胶囊包括150mg的假马齿苋(B.monniera)(45％假马齿苋皂素)，225mg的水飞蓟(S.marianum)(70-80％水飞蓟素)，150mg的印度人参(W.somnifera)粉末，75mg的绿茶(98％多酚，其中45％的EGCG)和75mg的姜黄根素(95％的姜黄素)。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与离子通道抑制剂组合。DMD中受损肌肉膜的存在搅乱了钙离子进入肌纤维的通道，由此破坏的钙平衡激活了许多酶，例如蛋白酶，其引起其他损伤和肌肉坏死。直接促成钙在营养不良肌肉中病理积累的离子通道是治疗DMD的辅助化合物的潜在目标。有证据显示，一些药物例如己酮可可碱阻断运动灵敏性钙通道³²，且阻断牵张激活通道的抗生素可减少mdx小鼠中的肌纤维坏死和DMD男孩中的CK水平³³。因而一个实施方案提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体离子通道抑制剂与向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了用作药物的离子通道抑制剂与向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，以及离子通道抑制剂和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。

优选地，使用黄嘌呤类的离子通道抑制剂。更优选地，所述黄嘌呤是甲基黄嘌呤的衍生物，最优选地，所述甲基黄嘌呤衍生物选自己酮可可碱、呋拉茶碱、利索茶碱、丙戊茶碱、喷替茶碱、茶碱、托巴茶碱、阿比茶碱、恩丙茶碱和其衍生物。最优选使用己酮可可碱。当使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时，黄嘌呤类的离子通道抑制剂增强了来自包括所述外显子的前mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率。跳跃频率的增强也增加了DMD或BMD个体肌细胞所产生的功能性肌营养不良蛋白的水平。

根据离子通道抑制剂的特性，技术人员应当知道其优选的使用量。己酮可可碱的适宜剂量在大约1mg/kg/天至大约100mg/kg/天之间，优选剂量是在大约10mg/kg/天至大约50mg/kg/天之间。人的一般使用剂量是20mg/kg/天。

在一个实施方案中，在给予个体向其提供功能性肌营养不良蛋白的化合物之前，给予所述个体离子通道抑制剂。在该实施方案中，优选在给予向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物之前至少一天、更优选至少一周、更优选至少两周、更优选至少三周，给予所述离子通道抑制剂。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与蛋白酶抑制剂组合。钙蛋白酶是钙激活的蛋白酶，其在营养不良肌肉中增加并引起肌纤维变性。因此可应用钙蛋白酶抑制剂，例如钙蛋白酶抑制蛋白、亮抑蛋白酶肽³⁴、总钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)、钙蛋白酶抑制剂III或PD150606，减少变性过程。具有钙蛋白酶抑制剂和抗氧化剂双重作用的新化合物，BN82270(Ipsen)增加了肌肉强度，减少了血清CK并减少了mdx横膈膜的纤维化，这表明这种新化合物具有治疗效果³⁵。最近已提议将另一化合物亮抑蛋白酶肽/卡尼汀(Myodur)用于DMD患者的临床试验。

MG132是另一种蛋白酶体抑制剂，其显示出减少肌肉膜损伤，并改善肌营养不良的组织病理学病征³⁵。MG-132(CBZ-亮氨酰-亮氨酰-leucinal)是细胞渗透性，蛋白酶体抑制剂(Ki＝4nM)，其通过防止IkappaB降解来抑制NFkappaB激活(IC50＝3μM)。此外，它是肽醛，通过与20S和26S蛋白酶体结合并使其失活来抑制遍在蛋白介导的蛋白水解。MG-132显示出在mdx小鼠模型中抑制肌营养不良蛋白相关蛋白的蛋白酶体降解³⁶。因而这种化合物也适宜用作DMD的辅助药理化合物。因此还提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体蛋白酶抑制剂和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了用作药物的蛋白酶抑制剂与向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，以及蛋白酶抑制剂和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。根据蛋白酶抑制剂的特性，技术人员应当知道其优选的使用量。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与L-精氨酸组合。肌营养不良蛋白缺陷与纤维膜上DGC-复合物的丧失相关，包括神经元型一氧化氮合酶(nNOS)。在mdx小鼠中nNOS转基因的表达大幅减少了肌肉膜的损伤。同样，给予L-精氨酸(一氧化氮合酶的底物)增加了NO产生并在mdx小鼠中上调utrophin的表达。六周的L-精氨酸治疗改善了mdx小鼠的肌肉病理并减少了血清CK³⁷。使用以L-精氨酸作为辅助治疗与向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合尚未公开过。

因此还提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体L-精氨酸和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了L-精氨酸与向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，作为药物，以及L-精氨酸和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与血管紧张素II型I受体阻断剂氯沙坦组合，氯沙坦可使肌肉结构正常化和修复功能，如在肌营养不良蛋白缺陷的mdx小鼠模型中所示²³。因而本发明的一个方面提供缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体血管紧张素II型I受体阻断剂氯沙坦和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了血管紧张素II型I受体阻断剂氯沙坦与向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，该组合用作药物，以及血管紧张素II型I受体阻断剂氯沙坦和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。根据血管紧张素II型I受体阻断剂的特性，技术人员应当知道其优选的使用量。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，优选培哚普利组合。ACE抑制剂能降低血压。以培哚普利尽早开始治疗与更低的DMD患者死亡率相关²²。因而本发明的一个方面提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体ACE抑制剂优选培哚普利和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了ACE抑制剂优选培哚普利与向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，该组合用作药物，以及ACE抑制剂优选培哚普利和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。ACE抑制剂优选培哚普利的通常剂量是大约2-4mg/天²²。在一个更优选的实施方案中，将ACE抑制剂与至少一种前述确定的辅助化合物组合。

在另一优选的实施方案中，将向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物与能增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物组合。已经证明小化学化合物，例如特异性吲哚衍生物，选择性地抑制剪接体的组装和剪接³⁸，例如通过干扰富含丝氨酸和精氨酸的蛋白与它们的同源剪接增强子(ISEs或ESEs)的结合和/或通过干扰剪接阻遏物与沉默子序列(ESSs或ISSs)的结合。因此这些化合物适宜用作增强外显子跳跃的辅助化合物。

因此还提供了缓解个体杜兴氏肌营养不良的一个或多个症状的方法，该方法包括给予所述个体用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体的组装和/或剪接的化合物，和向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物。也提供了用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体的组装和/或剪接的化合物与向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物的组合，该组合用作药物，以及用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体的组装和/或剪接的化合物和向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物用于制备缓解DMD的一个或多个症状的药物的用途。在一个实施方案中，采用所述组合，以缓解严重BMD的一个或多个症状，其中形成了功能不足的非常短的肌营养不良蛋白。根据能增强外显子跳跃和/或抑制剪接体的组装和/或剪接的化合物的特性，技术人员应当知道其优选的使用量。在一个更优选的实施方案中，将用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体的组装和/或剪接的化合物与ACE抑制剂和/或与前述确定的任何辅助化合物组合。

也提供了药物制剂，其包括向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物、任何上述辅助化合物，及药物可接受载体、填充剂、防腐剂、佐剂、助溶剂、稀释剂和/或赋形剂。可在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿：药剂学的科学和实践),20thEdition.Baltimore,MD:LippincottWilliams&Wilkins,2000中查询药物可接受载体、填充剂、防腐剂、佐剂、助溶剂和/或赋形剂。

因而本发明提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中所述辅助化合物包括类固醇、ACE抑制剂(优选培哚普利)、血管紧张素II型I受体阻断剂氯沙坦、肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂、mIGF-1源优选mIGF-1、用于增强mIGF-1表达的化合物、用于增强mIGF-1活性的化合物、抗氧化剂、离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、L-精氨酸和/或用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物。

如本文之前所述，可通过多种方式向个体提供功能性肌营养不良蛋白，例如通过庆大霉素或PTC124^16,17抑制终止密码子，或通过腺伴随病毒(AAV)-介导的功能性小或微肌营养不良蛋白基因的基因送递^18-20。

然而，向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物优选包括寡核苷酸或其功能等同物，用于至少部分减少所述个体中异常肌营养不良蛋白的产生。异常肌营养不良蛋白mRNA或异常肌营养不良蛋白产生的减少优选表示，异常肌营养不良蛋白mRNA或异常肌营养不良蛋白初始量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少仍可通过RTPCR(mRNA)或免疫荧光或western印迹分析(蛋白)检测到。异常肌营养不良蛋白mRNA或蛋白在本文中也称为非功能性肌营养不良蛋白mRNA或蛋白。非功能性肌营养不良蛋白优选是不能与肌动蛋白和/或DGC蛋白复合物的成员结合的肌营养不良蛋白。非功能性肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白mRNA通常不具有或不编码具有完整的蛋白C末端的肌营养不良蛋白。所述寡核苷酸优选包括反义寡核糖核苷酸。在一个优选的实施方案中，应用了外显子跳跃技术。外显子跳跃干扰真核细胞内发生的天然剪接过程。在高级真核生物中，在细胞DNA中的蛋白遗传信息是由外显子编码的，所述外显子通过内含序列相互间隔开。在一些情况下这些内含子非常长。真核生物的转录机制产生含有外显子和内含子两者的前mRNA，同时通常在产生前mRNA期间，剪接机制已通过将存在于前mRNA中的外显子剪接在一起产生蛋白的实际编码区。

外显子跳跃产生缺少至少一个跳跃外显子的成熟mRNA。因此，当所述外显子编码氨基酸时，外显子跳跃会导致改变的产物的表达。目前外显子跳跃技术涉及反义寡核苷酸(AONs)的使用。在杜兴氏肌营养不良的mdx小鼠模型中已经进行了大量这种操作。在肌营养不良蛋白基因的外显子23中携带无义突变的mdx小鼠已用作DMD的动物模型。尽管应该阻止功能性肌营养不良蛋白合成的mdx突变罕见，但在mdx肌肉组织中已观察到天然存在的肌营养不良蛋白阳性纤维。这些肌营养不良蛋白阳性纤维被认为由于体细胞突变或通过可选的剪接而起源于明显天然存在的外显子跳跃机制。已经证明，分别针对肌营养不良蛋白前mRNA的内含子22和23的3’和/或5’剪接位点的AONs干扰通常参与内含子23移除的因子，从而也从mRNA中移除外显子23^3,5,6,39,40。

通过特定外显子的定向跳跃，将DMD表型转化成更轻度的BMD表型。优选通过靶向一个或两个剪接位点或外显子内部序列的AONs的结合，诱导外显子跳跃。针对外显子内部序列的寡核苷酸通常表现为与非外显子序列无重叠。优选其不与剪接位点重叠，至少在这些剪接位点存在于内含子中时不重叠。针对外显子内部序列的寡核苷酸优选不含有与邻近内含子互补的序列。因而还提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物、用于抑制肌营养不良蛋白前mRNA的外显子包括于由所述前mRNA剪接产生的mRNA内。优选应用外显子跳跃技术以便由肌营养不良蛋白前mRNA产生的mRNA的外显子的缺乏产生生功能性肌营养不良蛋白-虽然更短-的编码区。在本文中，抑制外显子内含优选表示为通过RTPCR评估，原始、异常肌营养不良蛋白mRNA的检测减少至少大约10％，或通过免疫荧光或western印迹分析评估，减少至少大约10％。优选减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

一旦向DMD患者提供功能性肌营养不良蛋白，DMD的病因便消失。因此，预期DMD的症状足以获得缓解。然而，如之前所述的，本发明提供的观点是，尽管外显子跳跃技术能提供功能性肌营养不良蛋白，但仍然还通过给予DMD患者减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物来进一步缓解DMD症状。而且，本发明提供的观点是，对抗炎症的辅助治疗对AON治疗没有消极影响。本发明还提供了这样的观点，即当使用针对外显子或针对所述外显子的一个或两个剪接位点的寡核苷酸时，增强了来自包括所述外显子的前mRNA的肌营养不良蛋白外显子的跳跃频率。跳跃频率的增强也增加了DMD或BMD个体肌细胞所产生的功能性肌营养不良蛋白的水平。

因为在两个剪接位点都被剪接体复合物识别时，只有肌营养不良蛋白前mRNA的外显子被内含在所得的mRNA中，因此剪接位点是AONs的明显靶点。因此一个实施方案提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA的非外显子区互补的序列。在一个实施方案中，使用仅与肌营养不良蛋白前mRNA的非外显子区互补的AON。然而这不是必需的：也可以使用包括内含子特异性序列以及外显子特异性序列的AON。这种AON包括与肌营养不良蛋白前mRNA的非外显子区互补的序列，以及与肌营养不良蛋白前mRNA的外显子区互补的序列。当然，AON不需要与肌营养不良蛋白外显子或内含子的整个序列互补。优选与这些外显子或内含子的一部分互补的AONs。AON优选与肌营养不良蛋白外显子和/或内含子的至少一部分互补，所述部分具有至少13个核苷酸。

经过两个连续的酯交换反应发生肌营养不良蛋白前mRNA的剪接。首先，在剪接体组装期间限定的内含子中特定分支点核苷酸的2'OH对5’剪接位点上的内含子的第一个核苷酸进行亲核攻击，形成套索中间体。其次，释放的5’外显子的3’OH对3’剪接位点上的内含子的最后一个核苷酸进行亲核攻击，从而连接外显子并释放内含子套索。因而内含子的分支点和剪接位点都参与了剪接过程。因此，包括与此类分支点和/或剪接位点互补的序列的寡核苷酸，可优选用于外显子跳跃。因此还提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA的剪接位点和/或分支点互补的序列。

因为剪接位点含有共有序列，使用包括序列的寡核苷酸或其功能等同物(本文也称为AON)涉及混乱杂交的风险，所述序列与剪接位点互补。AONs与除待跳跃的外显子位点之外的其他剪接位点杂交，容易干扰剪接过程的准确性。为克服使用与内含子序列互补的AONs相关的这些问题和其他潜在问题，一个优选的实施方案提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子互补的序列。优选地，所述AON能特异性地抑制在所述肌营养不良蛋白前mRNA中的至少一个外显子的外显子内含信号。干扰外显子内含信号(exoninclusionsignal,EIS)的优势在于，这种元件位于外显子内。通过为待跳跃外显子内部的提供AON，干扰外显子内含信号从而有效地掩蔽来自剪接装置的外显子是可能的。剪接装置不能识别待跳跃的外显子从而导致外显子排除在终mRNA之外。该实施方案不直接干扰剪接机制的酶促过程(外显子的连接)。认为这可使该方法更具特异性和/或更可靠。认为EIS是外显子的特定结构，其可使剪接受体和供体呈现特定空间构象。在这个概念中，是特定空间构象能使剪接机制识别外显子。然而，当然，本发明并不限于这个模式。已发现能与外显子结合的试剂能够抑制EIS。AON可在任何位点特异性地接触所述外显子，并仍能够特异性地抑制所述EIS。

采用对外显子46序列具有特异性的外显子内部AONs，我们以前就能在来自缺失外显子45的两个不同的DMD患者的培养的肌管中调节剪接模式¹¹。AON治疗后，外显子46跳跃了，其在至少75％的细胞中恢复了读框并诱导肌营养不良蛋白的合成。最近我们发现，采用外显子内部AONs，也可在人类对照和具有不同突变包括缺失、复制和点突变的多个患者中针对39个不同DMD外显子有效地诱导外显子跳跃^1,2,11-15。

在本发明的上下文中，寡核苷酸的功能等同物优选表示如本文所限定的寡核苷酸，其中一个或多个核苷酸被取代，且所述功能等同物至少在某种程度上保留了活性。优选地，所述功能等同物的活性提供功能性肌营养不良蛋白。因此优选通过定量功能性肌营养不良蛋白的量来评估所述功能等同物的所述活性。本文优选将功能性肌营养不良蛋白定义为能够与肌动蛋白和DGC蛋白复合物的成员结合的肌营养不良蛋白。优选通过RT-PCR或通过免疫荧光或Western印迹分析进行寡核苷酸所述活性的评估。当所述活性表示衍生出功能等同物的所述寡核苷酸的相应活性的至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或更高时，优选在至少某种程度上保留所述活性。在本申请中，当使用寡核苷酸这个词时，其可被本文所限定的功能等同物替换。

因此，包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子互补序列或由其组成的寡核苷酸或其功能等同物的使用，提供了良好的抗DMD结果。在一个优选的实施方案中，使用寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子2、8、9、17、19、29、40-46、48-53、55或59的至少一部分互补的序列或由其组成，所述部分具有至少13个核苷酸。然而，所述部分也可具有至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子RNA的13-50个核苷酸的连续部分互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子RNA的14-25个核苷酸的连续部分互补的序列。

最优选地，使用AON，其包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子51、44、45、53、46、43、2、8、50和/或52的至少一部分互补的序列或由其组成，所述一部分具有至少13个核苷酸。然而，所述一部分也可具有至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸。最优选的寡核苷酸可通过以下序列SEQIDNO:3-SEQIDNO:284的任一个来鉴别。因此，本文所用的最优选的寡核苷酸由来自SEQIDNO:3-SEQIDNO:284的序列表示。本文所用的最优选的寡核苷酸选自SEQIDNO:3-SEQIDNO:284。

所述外显子按患者群体适用性降序排列。因此，相对于包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子44以及其他互补的序列的AON，包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子51互补的序列的AON的用途，适宜用于DMD患者群体的更大部分。

在优选的实施方案中，包括与肌营养不良蛋白前mRNA的一部分互补的序列的本发明的寡核苷酸，是这样的互补部分，其是本发明寡核苷酸长度的至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％或甚至更优选至少95％，或甚至更优选至少98％或更长。在最优选的实施方案中，本发明寡核苷酸由与本文所限定的肌营养不良蛋白前mRNA的一部分互补的序列组成。例如，寡核苷酸可包括与本文所限定的肌营养不良蛋白前mRNA的一部分互补的序列和其他侧翼序列。在更优选的实施方案中，所述寡核苷酸的所述互补部分的长度是至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸。优选地，其他侧翼序列用于修饰蛋白与寡核苷酸的结合，或修饰寡核苷酸的热力学特性，更优选地修饰靶RNA结合亲和力。

一个优选的实施方案提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括：

-与肌营养不良蛋白前mRNA外显子的区域互补的序列，该区域可与肌营养不良蛋白前mRNA外显子的其他部分杂交(封闭结构)，以及

-与肌营养不良蛋白前mRNA外显子的区域互补的序列，该区域不与所述肌营养不良蛋白前mRNA杂交(开放结构)。

对于该实施方案，可参照我们的专利申请WO2004/083432。RNA分子显示出牢固的二级结构，主要是由于相同RNA内部互补或部分互补的一段序列的碱基配对。早就认为RNA的结构对RNA的功能发挥作用。在不受理论的限制的情况下，认为外显子RNA的二级结构在构建剪接过程中发挥作用。通过它的结构，外显子被识别作为需要内含于mRNA中的一部分。因此这种信号功能被称为外显子内含信号。该实施方案的互补寡核苷酸能干扰外显子的结构，从而能干扰外显子的外显子内含信号。已发现许多互补寡核苷酸的确包括这种能力，有些比其他的更有效。该优选实施方案的寡核苷酸，即具有针对天然外显子RNA中开放和封闭结构的所述重叠的寡核苷酸，是从所有可能的寡核苷酸选择的。选择包括可有效干扰外显子内含信号的寡核苷酸。在不受理论的限制的情况下，据认为，与开放结构的重叠可改善寡核苷酸的入侵效率(即增加寡核苷酸进入结构的效率)，而与封闭结构的重叠随后增加干扰外显子RNA的二级结构的效率，从而干扰外显子内含信号。据发现，与封闭和开放结构两者的部分互补性的长度是不受极端限制的。我们观察到在任一结构中具有可变长度的互补性的寡核苷酸具有高效率。本文所用的术语互补性是指在生理条件下可与另一段核苷酸互补的一段核苷酸。因而不会绝对要求互补性区域中的所有碱基都能与相反链上的碱基配对。例如，在设计寡核苷酸时，可能想并入例如不能与互补链上的碱基进行碱基配对的残基。如果在细胞环境中，一段核苷酸能与互补部分杂交，则可以允许某种程度的错配。在一个优选的实施方案中，互补部分(或与所述开放或与所述封闭结构互补)包括至少3个、更优选至少4个连续核苷酸。互补区域优选设计成在组合时它们对前mRNA中的外显子是特异性的。这种特异性可由不同长度的互补区域产生，因为这取决于体系中其他(前)mRNA的实际序列。通过增加寡核苷酸的大小可减少寡核苷酸也能与一个或多个其他前mRNA杂交的风险。显然在互补区域包括错配但保留可与前mRNA中靶向区域杂交的能力的寡核苷酸可用于本发明。然而，优选至少互补部分不包括这种错配，因为它们通常比在一个或多个互补区域中具有这种错配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。据认为，更高的杂交强度(即增加与相反链相互作用的数量)有利于增加体系的干扰剪接机制的过程的效率。优选地，互补性介于90-100％之间。这通常在约20个核苷酸的寡核苷酸中允许大约1或2个错配。

在外显子所在的前mRNA中，二级结构是最好分析的。可在实际RNA中分析这种结构。然而，目前采用结构建模程序可以非常准确地预测RNA分子的二级结构(以最低能量成本)。适宜程序的非限制性示例是RNAmfoldversion3.1server⁴¹。本领域技术人员在给予核苷酸序列后能够以适宜的重现性预测可能的外显子结构。在向这种建模程序提供外显子和侧翼内含子序列时，可获得最佳预测。通常不需要对整个前mRNA结构的建模。

优选寡核苷酸所涉及的开放和封闭结构相互邻近。据认为，以这种方式，寡核苷酸与开放结构的退火可诱导封闭结构的开放，借此退火发展至该封闭结构中。通过这种作用，之前封闭的结构呈现不同的构象。不同构象造成外显子内含信号的破坏。然而，当靶向外显子内存在潜在(隐含)的剪接受体和/或供体序列时，偶尔会产生新的外显子内含信号，从而限定具有不同5’端、不同3’端或两者的不同(新)外显子。这种类型的活性落入本发明范围内，因为靶向外显子被排除在mRNA之外。在mRNA中存在含有部分靶向外显子的新外显子，不会改变靶点外显子被排除的事实。新外显子的内含可以看作仅偶尔发生的副作用。在使用外显子跳跃来恢复由于突变而破坏的肌营养不良蛋白的可读框时，存在两种可能。一种可能是新外显子具有恢复读框的功能，而另一种情况是未恢复读框。当通过外显子跳跃方式为恢复肌营养不良蛋白读框选择寡核苷酸时，当然很明显的是，在这种条件下仅会选择确实引起外显子跳跃的寡核苷酸，所述外显子跳跃在具有或不具有新外显子的情况下恢复肌营养不良蛋白可读框。

还提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子的RNA中的丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白的结合位点互补的序列。在我们的专利申请WO2006/112705中，我们公开了在外显子内部反义寡核苷酸(AON)诱导外显子跳跃的效率与所述AON的靶前mRNA位点中存在所预测的SR结合位点(例如通过ESE探测器)之间存在相关性。因此，在一个实施方案中，产生了寡核苷酸，所述实施方案包括测定肌营养不良蛋白外显子RNA中SR(Ser-Arg)蛋白的(假定)结合位点，并产生与所述RNA互补且与所述(假定)结合位点至少部分重叠的寡核苷酸。在本文中术语“至少部分重叠”定义成包括SR结合位点的仅单个核苷酸以及所述结合位点的多个核苷酸的重叠，以及所述结合位点的完全重叠。该实施方案优选还包括由所述RNA二级结构确定与所述RNA另一部分杂交的区域(封闭结构)和在所述结构中不杂交的区域(开放结构)，并随后生成与所述(假定)结合位点至少部分重叠、与所述封闭结构的至少一部分重叠且与所述开放结构的至少一部分重叠的寡核苷酸。在这种方式中，我们增加了获得能干扰外显子从前mRNA内含于mRNA中的寡核苷酸的机会。可能的是，首先选择的SR结合区域不具有所要求的开放-封闭结构，在这种情况下选择另一(第二)SR蛋白结合位点，然后将其用于检验开放-封闭结构的存在。持续这个过程，直到含有SR蛋白结合位点以及(部分重叠的)开放-封闭结构的序列得到鉴定。然后用该序列设计与所述序列互补的寡核苷酸。

也可通过反转所述顺序来实施产生寡核苷酸的这种方法，即首先产生寡核苷酸，包括由肌营养不良蛋白外显子RNA的二级结构确定呈现与所述RNA另一部分杂交的结构的区域(封闭结构)和在所述结构中不杂交的区域(开放结构)，并随后生成寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一部分与所述封闭结构互补，且其中所述寡核苷酸的至少另一部分与所述开放结构互补。接下来确定SR蛋白结合位点是否与所述开放/封闭结构至少重叠。以这种方式中改善了WO2004/083432的方法。仍然在另一实施方案中，同时进行选择。

在不期望受任何理论限制的情况下，目前认为使用针对SR蛋白结合位点的寡核苷酸(至少部分)影响SR蛋白与SR蛋白结合位点的结合，这造成剪接受到破坏或削弱。

优选地，开放/封闭结构和SR蛋白结合位点部分重叠，甚至更优选开放/封闭结构与SR蛋白结合位点完全重叠，或SR蛋白结合位点与开放/封闭结构完全重叠。这允许改善对外显子内含的破坏。

除共有剪接位点序列之外，许多(如果并非所有)外显子含有剪接调节序列例如外显子剪接增强子(ESE)序列以有利于剪接体识别真正的剪接位点^42,43。称为SR蛋白的剪接因子亚群可与这些ESEs结合并将其他剪接因子例如U1和U2AF募集至(弱限定的)剪接位点。已经详细分析了四种最丰富的SR蛋白(SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55)的结合位点，且在ESE探测器中执行这些结果，ESE探测器是可预测这些SR蛋白的潜在结合位点的网路源^42,43。在AON的效力与SF2/ASF、SC35和SRp40结合位点的存在/缺乏之间存在相关性。在优选的实施方案中，本发明提供了如上所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中所述SR蛋白是SF2/ASF或SC35或SRp40。

在一个实施方案中，通过使用能特异性地结合调节RNA序列的寡核苷酸或其功能等同物向DMD患者提供功能性肌营养不良蛋白，所述调节RNA序列是在转录物中正确剪接肌营养不良蛋白外显子所必需的。几个顺式作用RNA序列也是在转录物中正确剪接外显子所必需的。尤其是，附加元件例如内含子或外显子的剪接增强子(ISEs和ESEs)或沉默子(ISSs和ESEs)是经鉴定，特异并有效地调节组成型外显子和可选型外显子的剪接。使用与该元件结合的序列特异性反义寡核苷酸(AONs)，其调节功能受到破坏，从而使外显子跳跃，如DMD所示的。因此，在一个优选的实施方案中，使用与内含子的剪接增强子(ISE)、外显子的剪接增强子(ESE)、内含子的剪接沉默子(ISS)和/或外显子的剪接沉默子(ESS)互补的寡核苷酸或其功能等同物。如本文之前所述，在一个优选的实施方案中通过能特异性抑制所述外显子的外显子内含信号的试剂，使肌营养不良蛋白外显子跳跃，以使所述外显子不能被剪接机制识别为需要内含于mRNA中的一部分。结果，形成无所述外显子的mRNA。

本发明方法所用的AON优选与肌营养不良蛋白外显子RNA或肌营养不良蛋白内含子RNA的13-50个核苷酸之间的连续部分互补。在一个实施方案中，本发明方法所用的AON与肌营养不良蛋白外显子RNA或肌营养不良蛋白内含子RNA的16-50个核苷酸之间的连续部分互补。优选地，所述AON优选与所述外显子RNA的15-25个核苷酸之间的连续部分互补。更优选地，使用包括这样的序列的AON，该序列与肌营养不良蛋白外显子RNA或肌营养不良蛋白内含子RNA的20-25个核苷酸之间的连续部分互补。

可使用不同类型的核酸来产生寡核苷酸。优选地，所述寡核苷酸包括RNA，因为RNA/RNA杂交体(hybrid)非常稳定。因为外显子跳跃技术的目的之一是，针对受试者中的剪接，因此，优选寡核苷酸RNA包括为RNA提供其他特性的修饰，例如内切核酸酶和RNaseH抗性，其他杂交强度，稳定性增加(例如在体液中)，灵活性增加或减少，毒性减少，细胞内运输增加，组织特异性等。优选地所述修饰包括2’-O-甲基-硫代磷酸寡核糖核苷酸修饰。优选地所述修饰包括2’-O-甲基-硫代磷酸寡脱氧核苷酸修饰。因而一个实施方案提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中使用包括RNA的寡核苷酸，该RNA含有修饰，优选2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)或脱氧核糖(DNA)修饰。

在一个实施方案中，本发明提供了包括寡核苷酸和锁核酸的杂交寡核苷酸，所述寡核苷酸包括2’-O-甲基-硫代磷酸寡(脱氧)核糖核苷酸修饰。这种具体组合与由锁核酸组成的等同物相比，包括更好的序列特异性，且当与由2’-O-甲基-硫代磷酸寡(脱氧)核糖核苷酸修饰组成的寡核苷酸相比，包括效率获得改善。

随着核酸模拟技术的出现，可以生成具有与核酸本身在类型上相似优选相同而在数量上不一定的杂交特征的分子。这种功能等同物当然也适宜用于本发明的方法中。寡核苷酸的功能等同物的优选实例是肽核酸和/或锁核酸。最优选地，使用吗啉代磷酸二酰胺(morpholinophosphorodiamidate)。本发明寡核苷酸等同物的适宜但非限制性实例可见于44-50中。当然，一个或多个等同物相互之间和/或核酸之间的杂交体也是适宜的。在优选的实施方案中，用锁核酸作为寡核苷酸的功能等同物，因为锁核酸表现出更高的靶标亲和力和减少的毒性因此表现出更高的外显子跳跃效率。

在一个实施方案中，将可以抑制肌营养不良蛋白外显子内含于肌营养不良蛋白mRNA中的寡核苷酸或其功能等同物，与至少一种可以抑制另一肌营养不良蛋白外显子内含于肌营养不良蛋白mRNA中的其他寡核苷酸或其功能等同物组合。以此方式，防止了肌营养不良蛋白前mRNA的两个或多个外显子内含于由该前mRNA产生的mRNA中。这个实施方案还称为双或多外显子跳跃^2,15。在大部分情况中，双外显子跳跃可使仅两个靶点外显子排除在肌营养不良蛋白前mRNA之外。然而，在其他情况中发现，所述前mRNA中的靶向外显子和所述外显子之间的整个区域不存在于所产生的mRNA中，甚至当其他外显子(干预外显子)存在于所述区域时。对于源自DMD基因的寡核苷酸组合的多跳跃尤其如此，其中外显子45的一寡核苷酸和外显子51的一寡核苷酸被添加至转录DMD基因的细胞中。这种配置使产生的mRNA不含有外显子45-51。显然，在存在所述寡核苷酸的情况下，前mRNA结构可刺激剪接机制，使外显子44和52相互连接。

因此还提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中使用包括至少8个、优选16-80个连续核苷酸的核苷酸序列，该连续核苷酸与肌营养不良蛋白前mRNA的第一外显子互补，其中使用包括至少8个、优选16-80个连续核苷酸的核苷酸序列，该连续核苷酸与肌营养不良蛋白前mRNA的第二外显子互补。

在一个优选的实施方案中，在所述肌营养不良蛋白前mRNA中通过至少一个不与所述寡核苷酸互补的外显子隔离所述第一和所述第二外显子。

通过提供两个互补寡核苷酸之间的连接，也可能特异性地促进干预外显子的跳跃。因此，在一个实施方案中，通过连接部分隔离与至少两个肌营养不良蛋白外显子互补的核苷酸段。因而在该实施方案中连接了至少两段核苷酸以形成单个分子。因此还提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中用于向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述寡核苷酸或其功能等同物，与肌营养不良蛋白前mRNA的至少两个外显子互补，所述寡核苷酸或其功能等同物包括至少两个部分，其中第一部分包括具有至少8个优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，该连续核苷酸与所述至少两个外显子的第一个是互补，其中第二部分包括具有至少8个优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，该连续核苷酸与所述肌营养不良蛋白前mRNA的第二外显子互补。连接可通过任何方式但优选通过核苷酸连接完成。在后种情况中，在一个或其他互补外显子之间不含有重叠的核苷酸的数量可以是零，但优选是4-40个核苷酸。连接部分可以是能够连接寡核苷酸的任何类型部分。优选地，所述连接部分包括至少4个尿嘧啶核苷酸。目前，可获得模拟寡核苷酸杂交特征的许多不同化合物。这种化合物本文称为寡核苷酸的功能等同物，如果该等同物包括在类型上相似而数量上不一定相似的杂交特征其，则该等同物也适宜用于本发明。在说明书之前提及了适宜的功能等同物。如所述，本发明的寡核苷酸不必由仅有利于与靶向外显子杂交的寡核苷酸组成。可加入其他材料和/或核苷酸。

DMD基因是一个大基因，具有许多不同的外显子。考虑到该基因位于X染色体上，主要是男孩受到影响，尽管女孩也可受到该疾病的影响，因为她们可能接收来自双亲的一个坏基因拷贝，或由于在她们的肌细胞中特别偏爱X染色体的失活而患有功能等位基因的特别偏爱失活。蛋白由超过至少2.6Mb的多个外显子(79)编码。缺陷可以发生在DMD基因的任何部分。特定单个外显子或特定多个外显子的跳跃常常形成编码比正常更短的但具有至少部分功能性肌营养不良蛋白的重建的mRNA。在开发基于外显子跳跃技术的药物中的实际问题是，可造成细胞中功能性肌营养不良蛋白缺陷的多个突变。尽管通过使单个外显子跳跃可校正多个不同突变，但这种多个突变需要生成大量不同药物，因为对于不同的突变而言，需要跳跃不同的外显子。能诱导两个或多个外显子跳跃的化合物的优势是，可以用单个药物就使大于一个的外显子跳跃。这个特性不仅在实践中非常有用，因为仅需要生成有限数量的药物用于治疗不同DMD或特别严重的BMD突变。现在本领域技术人员可选的另一选择是，选择特定的功能性重建肌营养不良蛋白并产生能生成这些优选肌营养不良蛋白的化合物。这种优选的最终结果还称为轻度表型肌营养不良蛋白。

本文定义用于本发明的每个化合物、寡核苷酸和/或辅助化合物都适宜直接给予患有DMD或BMD或具有患该病风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，并可体内、离体或体外直接给药。

可选地，现有技术中存在向细胞提供寡核苷酸或其等同物的适宜方式。例如寡核苷酸或其功能等同物可以以表达载体的形式提供给细胞，其中表达载体编码包括所述寡核苷酸的转录物。优选经基因送递媒介将表达载体导入细胞中。优选的送递媒介是病毒载体，例如腺伴随病毒载体(AAV)，或逆转录病毒载体例如慢病毒载体^4,51,52，等等。质粒、人工染色体、适宜人细胞基因组靶向同源重组和整合的质粒，也可适宜应用于送递本文所限定的寡核苷酸。本发明优选的是这样的载体，其中转录是由PolIII启动子驱动的，和/或转录子采用与U1或U7转录子融合体的形式，其可产生送递小转录物的良好结果。本领域技术人员可设计适宜转录物。优选的是PolIII驱动的转录物。优选采用与U1或U7转录物的融合转录物的形式^4,51,52。如53,54所述，产生这种融合体。寡核苷酸可如是送递。然而，寡核苷酸也可通过病毒载体编码。通常是以RNA转录物的形式，其在部分转录物中包括寡核苷酸序列。

鉴于迄今已经实现的进展，预料对向细胞提供寡核苷酸或其等同物的方式进行改善。当然可并入这种未来改善，以采用本发明方法实现对重建mRNA的所述效果。寡核苷酸或其等同物可照原来的样子送递至细胞。当向个体给予寡核苷酸或其等同物，优选将寡核苷酸溶解在与送递方法相容的溶液中。对于静脉内、皮下、肌肉内、鞘内和/或心室内给药，优选的溶液是生理盐水溶液。对于本发明的方法，特别优选使用可辅助将本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起送递至细胞和进入细胞、优选肌肉细胞的赋形剂。优选赋形剂可以形成复合物、媒介和/或脂质体，其能将本文所限定的这类化合物优选寡核苷酸和任选地连同复合或集结在媒介或脂质体中的辅助化合物一起送递通过细胞膜。许多这些赋形剂是本领域已知的。适宜赋形剂包括聚乙烯亚胺(PEI)，或类似的阳离子聚合物，包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PECs)和其衍生物，ExGen500，合成的两亲物(syntheticamphiphils,SAINT-18)，阳离子脂质体TM(lipofectinTM)，DOTAP和/或病毒壳体蛋白，其能自我组装成能将本文所限定的这类化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起送递至细胞优选肌肉细胞的颗粒。已经证明，这种赋形剂可将核酸(寡核苷酸例如反义)高效送递至多种培养细胞，包括肌肉细胞。根据整体细胞存活，将它们高的转染潜力与预期低至中度毒性相组合。结构修饰的便利性可用于允许进一步修饰和分析它们的其他(体内)核酸转移特征和毒性。

阳离子脂质体表示脂质体转染介质的实例。它由两个脂质成分组成，即阳离子脂质N-[1-(2,3二油酰氧基(dioleoyloxy))丙基]-N,N,N-三甲基铵氯(DOTMA)(cp.DOTAP其是甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性成分介导细胞内释放。另一组送递体系是聚合的纳米颗粒。

可将作为公知的DNA转染介质而著称的聚阳离子例如二乙胺乙基(DEAE)-葡聚糖与氰基丙烯酸丁酯(butylcyanoacrylate,PBCA)和氰基丙烯酸己酯(hexylcyanoacrylate,PHCA)组合，以配制阳离子纳米颗粒，所述阳离子纳米颗粒可将本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起跨越细胞膜送递通至细胞内。

除了这些常见的纳米颗粒材料之外，阳离子肽鱼精蛋白提供了一种将本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起配制成胶体的可选途径。这种胶体纳米颗粒体系可形成所谓的颗粒(proticles)，其可通过简单的自我组装过程制备，以包装本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起，且介导其细胞内释放。技术人员可选择并调整任何上述或其他商业可供选择的赋形剂和送递体系，以包装并送递本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起，供用于本发明以送递所述化合物来治疗人的杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良。

此外，本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起，可共价或非共价连接于靶向配体，该配体经特异性设计，促进进入细胞胞、细胞质和/或其核内的摄取。这类配体可包括(i)识别促进细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽状结构)和/或(ii)能促进进入细胞内的摄取和/或来自媒介例如内体或溶酶体的本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起的细胞内释放的化学化合物。

因此，在优选的实施方案中，将本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起配制成药物，该药物提供有至少一种赋形剂和/或寻靶配体(targetingligand)和/或送递装置，用于将所述化合物送递至细胞和/或增强其细胞内送递。因此，本发明也包括药物可接受组合物，其包括本文所限定的化合物优选寡核苷酸和任选地连同辅助化合物一起，还包括至少一种赋形剂和/或寻靶配体和/或送递装置，用于将所述化合物送递至细胞和/或增强其细胞内送递。应该理解的是寡核苷酸和辅助化合物可以不配制在单个组合物或制剂中。根据它们的特性，技术人员可知道哪种类型的配制最适宜于每种化合物。

在优选实施方案中，本发明提供了成套试剂盒，其包括向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，和减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物。

在优选的实施方案中，本文所限定的寡核苷酸的使用浓度为大约0.1nM至大约1□M。更优选地，所用的浓度为大约0.3nM至大约400nM，甚至更优选大约1nM至大约200nM。如果使用几个寡核苷酸，该浓度是指寡核苷酸的总浓度或所加每种寡核苷酸的浓度。以上所给出的寡核苷酸浓度范围是体内或离体使用的优选浓度。技术人员应当理解的是，根据所用的寡核苷酸、待治疗的靶细胞、基因靶点及其表达水平、所用的介质以及转染和孵育条件，还可改变寡核苷酸的浓度，并需要进一步优化。

更优选地，用于本发明以预防、治疗DMD或BMD的化合物优选寡核苷酸，和辅助化合物，是合成产生的并以在药物可接受组合物或制剂中的配制形式直接给予细胞、组织、器官和/或患者。优选通过一次或多次非肠道注射，例如静脉内和/或皮下和/或肌肉内和/或鞘内和/或心室内给药，优选在人体一个或多个部位注射，将药物组合物送递至受试者。

除外显子跳跃之外，通过基于终止密码子通读的治疗向DMD患者提供功能性肌营养不良蛋白，也是可能的。能抑制终止密码子的化合物特别适宜用于受到造成肌营养不良蛋白基因内形成终止密码子的无意义突变(～7％)影响的DMD患者亚群。在一个实施方案中，所述能抑制终止密码子的化合物包括抗生素庆大霉素。在最近的mdx小鼠研究中，庆大霉素治疗诱导新的高达正常水平的20％的肌营养不良蛋白表达，尽管在动物间具有差异性。但庆大霉素的人体试验却是不确定的⁵⁵。PTC124属于一类新的小分子，其可在较低浓度下模拟庆大霉素的通读活性。PTC124给药可在体外或mdx小鼠中产生全长且功能活性的肌营养不良蛋白。PTC124的I/II期试验目前还在继续，不仅应用于DMD还可用于囊性纤维化^16,17。参考文献16和17也描述了用于本发明的PTC124化合物的优选剂量。因此，还提供了本发明所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括用于抑制终止密码子的化合物。优选用于抑制终止密码子的所述化合物包括庆大霉素、PTC124或其功能等同物。最优选地，所述化合物包括PTC124。

在一个实施方案中，使用包括微小肌营养不良蛋白基因的载体，优选病毒载体，向个体提供功能性肌营养不良蛋白。最优选地，使用重组腺伴随病毒(rAAV)载体。AVV是单链DNA细小病毒，其是非致病性的并显示出依赖辅助子的生命周期。与其他病毒(腺病毒、逆转录病毒和单纯疱疹病毒)相反，rAAV载体已经证明可高效地转导成熟的骨骼肌。rAAV受限的包装限制(<5kb)，阻碍了其在典型DMD“基因添加”研究中的应用。因此，优选将rAAV应用于高效送递小得多的微或小肌营养不良蛋白基因。给予这种微或小肌营养不良蛋白基因，造成至少部分功能性肌营养不良蛋白基因的存在。可参阅文献18-20。

可按任何顺序将本发明的向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物和至少一种辅助化合物给予个体。在一个实施方案中，同时给予向个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物和所述至少一种辅助化合物(表示在10小时之内优选1小时之内给予所述化合物)。然而这并不是必需的。在一个实施方案中，在给予向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物之前，将至少一种辅助化合物给给予需要其的个体。因此根据本发明还提供了一种方法，其包括：

-将减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物给予需要其的个体，和/或将改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物给予所述个体，以及，之后

-将向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物给予所述个体。

仍然在另一实施方案中，在给予所述至少一种辅助化合物之前，给予向个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物。

还提供了用于至少部分增加细胞中功能性肌营养不良蛋白产生的方法，所述细胞包括编码异常肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白基因的前mRNA，该方法包括：

向所述细胞提供用于抑制外显子内含于由所述肌营养不良蛋白前mRNA的剪接产生的mRNA中的化合物，以及

向所述细胞提供用于减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或向所述细胞提供改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，

该方法还包括允许由所述前mRNA的剪接产生的mRNA翻译。在一个实施方案中，在体外例如使用细胞培养物实施所述方法。

在本文中，增加功能性肌营养不良蛋白的产生已在上文开始进行了定义。

除非另有说明，本文所述的每个实施方案都可与本文所述另一实施方案组合。

在本文和其权利要求中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，表示包括该词后的项目，但不排除未特定提及的项目。此外动词“由……组成”可以被“基本上由……组成”替换，其表示本文所限定的化合物或辅助化合物可包括除特别确定的组分之外的其他成分，而所述其他成分并不改变本发明的独特特征。

此外，以不定冠词“a”或“an”提及一个元素时并不排除存在多于一个元素的可能性，除非文中明确要求有且只有一个元素。因而不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。

当与数值联合使用时，词语“约”或“大约”(约10，大约10)优选表示数值可以是给定值10及该数值偏差1％。

本说明书所引用的所有专利和参考文献都由此通过引用全文并入。

以下实施例将进一步解释本发明。这些实施例并不限制本发明的范围，仅用于阐述本发明。

附图简要说明

图1.外显子跳跃的图示

在缺失外显子50的杜兴氏肌营养不良患者中，产生了框外转录物(out-of-frametranscript)，其中外显子49被剪接成外显子51(A面)。结果，在外显子51中产生了终止密码子，其过早地终止了肌营养不良蛋白的合成。外显子内部反义寡核苷酸PRO051的序列特异性结合干扰了剪接过程中外显子51的正确内含，使得该外显子实际上跳跃了(B面)。这恢复了转录去的可读框并可合成类似于患有贝克型肌营养不良的患者(BMD)的肌营养不良蛋白。

图2.四例患者的预筛选研究

四例患者小腿(3号患者的左腿和其余三个患者的右腿)的磁性共振图显示了胫前肌的适当状况(小于50％的脂肪浸润和纤维化)(A面)。这些患者中杜兴氏肌营养不良的诊断通过之前由四头肌获取的活检标本横切片的二氨基联苯胺四盐酸盐染色证实(B面)。未观察到肌营养不良蛋白表达，除了在2号患者中的一个肌营养不良蛋白阳性或回复纤维(剪头)。对位于患者的突变和外显子51侧翼的转录区域进行的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析，在RNA水平证实了非处理的肌管(NT)中的个体突变和在处理的肌管(T)中的对PRO051(即外显子51跳跃)的阳性反应(C面)。1号患者外显子的跳跃效率是49％，2号患者的是84％，3号患者的是58％，而4号患者的是90％。在细胞培养物中通过PRO051有时可激活外显子51内隐含的剪接位点，形成额外的异常剪接产物，如在4号患者的处理样品中所看到的。泳道M显示了100bp大小的标记，泳道C为来自健康对照肌肉的RNA。来自处理和非处理的肌管的RT-PCR片段的序列分析确定了每个患者外显子51的准确跳跃(D面)。新的框内转录物引起实质性肌营养不良蛋白合成，如通过使用单克隆抗体NCL-DYS2对处理的肌管进行免疫荧光分析所检测的(E面)。

在处理之前，未检测到肌营养不良蛋白。

图3.从患者活检标本的连续切片中分离的RNA的RT-PCR分析

以PRO051治疗之后，逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析显示了每个患者的新的、更短的转录片段。这些片段的大小和序列都证实了外显子51的准确跳跃。未观察到其他的剪接变体。在第28天，仍可检测到明显的框内RNA转录物，这表明了肌肉中PRO051的持久性得以延长。由于少量的切片材料，使用了高灵敏性PCR条件，这个过程阻碍了跳跃效率和RNA与蛋白水平之间有意义相关性的准确定量。M表示大小标记，C为对照。

图4.PRO051的单次肌肉内剂量的肌营养不良蛋白恢复效果

使用肌营养不良蛋白抗体MANDYS106的免疫荧光分析明确显示，在从每个患者获取的活检标本中，肌营养不良蛋白在大部分纤维膜中的表达(A面)。在B面中以更高放大倍数显示了正方形所示的区域。为了比较，来自未治疗的杜兴氏肌营养不良(DMD)患者的样品和来自腓肠肌(HC)的健康对照样品包括在患者样品中。假定的回复纤维以剪头表示。对含有肌营养不良蛋白和层粘连蛋白α2的肌纤维总数进行手动计数并对肌营养不良蛋白与层粘连蛋白α2的比例作图(C面)。使用NCL-DYS1抗体对从患者活检标本分离的总蛋白提取物进行Western印迹分析显示，在所有患者中肌营养不良蛋白表达得以恢复(E面)。对于每个患者，装载30μg(右泳道)和60μg(左泳道)；为了比较，还装载了30μg来自健康腓肠肌样品的总蛋白(以避免感光过度)。因为在这些患者DMD基因中相对小的缺失，在蛋白大小上未观察到差异。在1号患者中，转移不规则扰乱了60μg泳道的信号检测。为了校正不同横切片中肌纤维的不同密度，将每个切片中总荧光肌营养不良蛋白信号(面积百分比)图示为与层粘连蛋白-α2面积百分比的比例(D面)。

图5.在以PS49单独治疗(第3组)或以PS49和泼尼松龙治疗(第4组)的mdx小鼠(每组两只小鼠)的不同肌肉组(Q：四头肌；TA：胫前肌；DIA：横膈膜肌)中，在RNA水平上的外显子23跳跃水平

图6A、B.在肌细胞中，随己酮可可碱浓度(0-0.5mg/ml)的增加，DMD基因外显子44(A)或外显子45(B)的跳跃水平得以增强。图6C.在以PS49单独治疗(第3组)或以PS49和己酮可可碱治疗(第4组)的mdx小鼠(每组两只小鼠)的不同肌肉组(Q：四头肌；TA：胫前肌；Tri：三头肌；HRT：心肌)中，RNA水平上的外显子23跳跃水平。

图7.肌营养不良蛋白(DMD)基因的氨基酸序列。

图8.人IGF-1同种型4的氨基酸序列。

图9.针对所示肌营养不良蛋白(DMD)基因外显子的各种寡核苷酸。

实施例

实施例1

在最近临床研究中，评估了反义化合物PRO051的局部安全性、耐受性和肌营养不良蛋白恢复效果。最近公开了该临床研究。公开的内容复制于本文实施例1A中。简而言之，PRO051是合成的、修饰的RNA分子，具有序列5'-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3'，经设计，特异性诱导外显子51跳跃⁵⁹。其携带了全长2’-O-甲基取代的核糖部分和硫代磷酸核苷酸间连接。包括了四个具有可通过外显子51跳跃来校正的不同特定DMD基因缺失的DMD患者。在第0天，评估了一系列安全性参数。患者的腿(即胫前肌)以定制的塑料模型进行固定并仔细记录它的位置。使用局部麻醉剂(EMLA)麻醉皮肤。使用2.5cm肌电图针头(MyoJect一次性皮下针头电极(MyoJectDisposableHypodermicNeedleElectrode)，TECAAccessories)，沿着在两个小皮肤纹理之间1.5cm的线进行4次PRO051注射，以确保肌肉内送递。每次注射的体积为200μl，含有200μg的PRO051，在约30度的角度下等比例分散。在第28天，再一次评估相同系列的安全性参数。使用患者自身模型对腿进行定位，并使用具有两个锋利铗口的镊子(BlakesleyConchotoma,DKInstruments)，在局部麻醉下，在纹理之间取得半开放肌肉活检。将活检在液氮冷却的2-甲基丁烷中速冻。依次治疗患者。研究期间，两例患者(1号和2号)也用皮质类固醇(泼尼松或地夫可特)，一个刚停止类固醇治疗(4号)以及一个患者从未使用过类固醇(3号)(参见表1)。后面的患者与其他三例患者相比，是在最小年龄丧失救护的一个。分析活检，以在RNA水平检测特定外显子跳跃(RT-PCR分析，未示出)和在蛋白水平检测肌营养不良蛋白的新表达(免疫荧光和western印迹分析，表1所示)。治疗之前和之后对系列安全性参数进行的评估(肾和肝功能的常规血浆和尿参数、电解质水平、血细胞计数、血红蛋白、aPPT、AP50和CH50值)表明，PRO051化合物是局部安全的且可良好耐受的。对于免疫荧光分析，将丙酮固定的活检横切片与抗中心杆状结构域(MANDYS106，Dr.G.Morris，UK，1:60)、C-末端结构域(NCL-DYS2，NovocastraLaboratoriesLtd.,1:30)或作为参照的层粘连蛋白-α2(ChemiconInternational，Inc，1:150)的单克隆抗体一起孵育90分钟，之后与AlexaFluor488羊抗小鼠IgG(H+L)(分子探针,Inc,1:250)抗体一起孵育一小时。将切片以Vectashield封片剂(VectashieldMountingMedium,VectorLaboratoriesInc.)进行封片。对于定量图像分析，按60,61所述，使用ImageJ(图像J)软件(W.Rasband,NIH,USA；http://rsb.info.nih.gov/ij)。根据切片大小，将整个横切片再分成6-10个邻近图像。为确保可靠的测量，使用固定的曝光装置且避免像素饱和，在一个时间段内进行切片染色和记录所有图像。在杜兴氏肌营养不良背景下，设置更低的强度阈值，为每个切片(面积百分比)，定量肌营养不良蛋白和层粘连蛋白-α2两者的阳性荧光。如1所述，在整个活检切片中，使用来自四个连续50μm切片组的混合的匀浆物，进行Western印迹分析。对于患者，应用30和60μg的总蛋白，而对于对照样品是3μg。将印迹与肌营养不良蛋白单克隆抗体NCL-DYS1(NovocastraLaboratories,1:125)一起孵育过夜，之后与羊抗鼠IgG-HRP(SantaCruzBiotechnology,1:10.000)一起孵育一小时。使用ECLPlusWestern印迹检测系统(ECLPlusWesternBlottingDetectionSystem,GEHealthcare)和HyperfilmECL(Amersham,Biosciences)使免疫反应带显现。使用ImageJ测量信号强度。

在所有四例患者治疗区内的大部分肌纤维中都检测肌膜中新的肌营养不良蛋白表达。对层粘连蛋白-α2染色之后，对每个切片的纤维进行手动计数，层粘连蛋白-α2是不受肌营养不良蛋白缺陷影响的基础层蛋白。个体数量是不同的，与活检大小和患者肌肉质量一致。在最大的切片中，2号患者有726个纤维，其中620个是肌营养不良蛋白阳性的，而3号患者有120个纤维，其中117个是肌营养不良蛋白阳性的。肌营养不良蛋白的强度通常低于健康肌肉活检中的强度。Western印迹分析证实存在不同数量的肌营养不良蛋白。扫描肌营养不良蛋白信号并与对照关联(每μg总蛋白)。数量的变化从具有最多营养不良肌肉的3号患者的3％，至具有保留最好的肌肉的2号患者的12％。因为基于总蛋白的这种比较不能校正杜兴氏肌营养不良患者的不同数量的纤维化和脂肪组织，因此，相对于每个切片中相似定位的层粘连蛋白-α2的荧光信号，我们还通过ImageJ分析对肌营养不良蛋白的荧光信号进行了定量。当对照切片中肌营养不良蛋白/层粘连蛋白-α2的比例设定为100％时，以皮质类固醇共治疗的两个患者都显示出肌营养不良蛋白的最高百分比，1号患者为32％和2号患者为35％(表1)。在3号患者中检测到肌营养不良蛋白的最低百分比，为17％。在4号患者中观察到中间百分比25％。这些百分比与靶肌肉的相对质量相关，其在1和2号患者最好而3号患者最差。

结论：在也进行皮质类固醇治疗的患者中，PRO051反义化合物的效果是更明显的。

实施例1A

由VanDeutekomJCetal,(2007)AntisenseOligonucleotidePRO051RestoresLocalDystrophininDMDPatients.NEnglJMed.,357(26):2677-86复制。

方法

患者和研究设计

选择年龄8-16岁的杜兴氏肌营养不良患者参与研究。所有患者具有可通过外显子51跳跃校正的缺失且在之前诊断的肌肉活检中没有肌营养不良蛋白。并允许并存的糖皮质激素治疗。视情况而定，从患者或其双亲处获得了书面知情同意书。预筛选期间(长达60天)，证实了每个患者的突变状态和在体内对PRO051的阳性外显子跳跃反应，并通过T₁-加权磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)确定胫前肌的状况⁶²。对于研究所包括的患者，纤维化组织和脂肪组织可占不大于50％的靶点肌肉。

探查基线期间，评估安全性测量。将每个患者待注射的腿以定制塑料模型进行固定并记录其位置。使用局部麻醉剂的局部低熔混合物(EMLA)麻醉皮肤。使用2.5cm肌电图针头(MyoJect一次性皮下针头电极，TECAAccessories)，在两个小皮肤纹理之间1.5cm的线进行4次PRO051注射，以确保肌肉内送递。每次注射体积为200μl，含有200μg的PRO051，其在约30度的角度下等比例分散。

在第28天，再次评估安全性参数。使用患者自身模型定位腿，并在局部麻醉下，使用具有两个锋利铗口的镊子(BlakesleyConchotoma,DKInstruments)在纹理之间进行半开放肌肉活检⁶³。将活检标本在液氮冷却的2-甲基丁烷中速冻。

从2006年5月至2007年3月依次对患者进行治疗，并遵循良好临床试验规范准则和赫尔辛基宣言条款。研究获得涉及人个体研究的荷兰中央委员会和在莱顿大学医学中心的当地机构审查委员会批准。所有作者对研究设计做出贡献、参与数据收集和分析、完全和自由地使用数据、共同撰写手稿，并保证数据和所做分析的完整性和准确性。

PRO051的说明

PRO051是合成的、修饰的RNA分子，具有序列5'-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3'¹²。其携带了全长的2’-O-甲基取代的核糖分子和硫代磷酸核苷酸间连接。该药物是由ProsensaB.V.以1mg在小瓶中的不含赋形剂的冻干材料提供的。将其溶解在无菌、新鲜的盐水(0.9％氯化钠)中并给药。通过细菌Aems检验发现PRO051是不致突变的。在规范的良好实验室规范安全性研究中，接受每公斤体重高达8mg的肌肉内单次给药和每公斤50mg的静脉内给药的大鼠未显示出副作用；当该药物通过静脉内1小时注入或通过皮下注射给药时，接受PRO051一个月的猴子显示出耐受高达每周每公斤16mg的剂量，且在临床上没有相关副作用。

体外预筛选

将先前存在的初级成肌细胞培养物¹用于4号患者的预筛选。对于其他三例患者，如之前所述^1,64,65，注射含有肌原细胞转录因子(MyoD)基因的腺病毒载体之后，成纤维细胞被转化成肌原细胞。按照的生产商有关ExGen500(MBIFermentas)的说明书，以PRO051(100nM)和聚乙烯亚胺(2μl每微克PRO051)转染肌管培养物。48小时后，分离RNA。如之前所述^1,12，进行逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫荧光和Western印迹分析。采用2100生物分析仪(Agilent)分析PCR片段，并将其分离，用于由莱顿基因组技术中心进行测序。

安全性评估

在基线和注射后2小时、1天和28天，所有患者接受完整身体检查(包括测量生命体征)并做心电图。此外，获得血浆和尿，以经典(CH50)和可选(AP50)途径，测定肾和肝功能、电解质水平、完全细胞计数、激活的部分凝血酶原时间和补体活性值。记录伴随药物的使用。在基线和第28天，使用医学研究委员会标度⁶⁶评估了胫前肌的强度，以估算程序是否已影响肌肉性能。(在这种标度中，0分表示不运动而5分表示正常肌肉强度)。因为仅治疗了小区域的肌肉，对有关肌肉强度增加的临床益处没有预期。每次探查时，记录不良事件。

RNA评估

将冷冻肌肉活检标本的连续切片(50μm)在RNA-Bee溶液(CamproScientific)和MagNALyser绿色小球(RocheDiagnostics)中进行均质化。按照生产商说明书，分离并纯化总RNA。对于互补DNA，用转录者逆转录酶(Transcriptorreversetranscriptase,RocheDiagnostics)，使用500ngRNA，用人外显子53或54特异性反向引物，在20μl反应中，55℃、30分钟，完成合成。如之前所述^1,12，进行PCR分析。在2％琼脂糖凝胶中分析产物并测序。此外，使用蛋白截断检验的引物组⁶⁷的RT-PCR，用于在DMD基因中快速筛选非特异性异常剪接事件。

蛋白水平的评估

对于免疫荧光分析，将丙酮固定的切片与下述单克隆抗体一起孵育90分钟：以1:60稀释的抗中心杆状结构域(MANDYS106，Dr.G.Morris，UK)的单克隆抗体，以1:30稀释的抗C-末端结构域(NCL-DYS2，NovocastraLaboratories)的单克隆抗体或(作为参照的)以1:150稀释的抗层粘连蛋白-α2(ChemiconInternational)的单克隆抗体，层粘连蛋白-α2是不受肌营养不良蛋白缺陷影响的基础层蛋白，之后与以1:250稀释的AlexaFluor488羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(分子探针)一起孵育一小时。将切片用Vectashield封片剂(VectorLaboratories)进行封片。按之前所述^60,61，使用ImageJ软件(W.Rasband,NationalInstitutesofHealth,http://rsb.info.nih.gov/ij)，进行定量图像分析。根据切片大小，将整个横切片再分成6-10个邻近图像。为确保可靠的测量，使用固定的曝光装置且避免像素饱和，在一个时间段内进行切片染色和记录所有图像。在杜兴氏肌营养不良背景下，设置更低的强度阈值，为每个切片(面积百分比)，定量肌营养不良蛋白和层粘连蛋白-α2两者的阳性荧光。

在整个活检标本中，使用来自四个连续50μm切片组的混合匀浆物，如之前所述¹，进行Western印迹分析。对于每个患者，应用30μg和60μg的总蛋白，而对于对照样品是3μg。将Western印迹与以1:125稀释的肌营养不良蛋白单克隆抗体NCL-DYS1(NovocastraLaboratories)一起孵育过夜，之后与以1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(SantaCruzBiotechnology)一起孵育一小时。使用ECLPlusWestern印迹检测系统(GEHealthcare)和HyperfilmECL(Amersham,Biosciences)使免疫反应带显现。使用ImageJ软件测量信号强度。

结果

患者预筛选

计划对4-6例患者进行研究。邀请6例患者参与，并拒绝1例。对剩余5例患者进行预筛选。首先，在MRI中评估胫前肌状况。四例患者的肌肉状况被认为适宜用于研究(图2A)，在患者原始活检标本中证实不存在肌营养不良蛋白(图2B)。其次，在成纤维细胞培养物中证实了四例患者的突变状态和对PRO051的阳性外显子跳跃反应。对每个患者而言，PRO051治疗生成了新的、更短的信使RNA片段，占总RT-PCR产物的46％(4号患者)-90％(1号患者)(图2C)。由测序证实了准确的外显子-51跳跃(图2D)。未发现被改变的其他转录区域。免疫荧光分析显示肌营养不良蛋白阳性肌管占优势(图2E)，并由Western印迹分析证实了该发现(未示出)。因而，四例患者被鉴定为可以用于PRO051治疗。他们的基线特征由表2所示。

安全性和不良事件

所有患者都具有一个或多个不良事件。然而，仅一例患者报告在注射位点有轻度局部疼痛，这被认为是与研究药物相关的不良事件。其他事件包括肌肉活检后轻度至中度疼痛。两例患者在用于包扎伤口的绷带下起泡。在注射和活检之间的时期，两例患者报告有几天的流感样症状，一例患者有1天的轻度腹泻。在基线时，按医学研究委员会标度，1、2、3和4号患者中被治疗胫前肌的肌肉强度分分别为4、2、3和4。没有患者显示出在研究期间该肌肉强度的变化或标准实验室测量中的明显改变或补体裂解产物或激活的部分凝血酶原时间的测量增加。在患者的肌肉切片中未检测到局部炎症或毒性反应(数据未示出)。3号患者在完成研究之后的一个月成功地进行脊柱侧凸的预先计划的手术。

RNA和蛋白水平

在第28天，对每个患者进行了治疗区的活检。从整个活检标本的连续切片中分离总肌肉RNA。在所有患者中，RT-PCR鉴定了由外显子-51跳跃形成的新的、更短的片段，如测序所证实的(图3)。进一步转录物分析显示没有其他改变(数据未示出)。每个患者整个活检标本的切片的免疫荧光分析表明在大部分肌纤维中有明显的肌浆肌营养不良蛋白信号(图4A和4B)。所用的远离和接近缺失的肌营养不良蛋白抗体包括MANDYS106(图4A和4B)和NCL-DYS2(类似于MANDYS106，未示出)。层粘连蛋白-α2染色⁶⁸之后，对每个切片中的纤维进行手动计数。个体数量是不同的，与活检标本大小和肌肉质量一致。在最大的切片中，2号患者有726个纤维，其中620个是肌营养不良蛋白阳性的，而3号患者有120个纤维，其中117个是肌营养不良蛋白阳性的(图4A和4C)。肌营养不良蛋白强度通常低于健康肌肉活检标本的强度(图4B)。2和3号患者中具有更强肌营养不良蛋白信号的单个纤维极有可能是回复纤维(图4B)。

Western印迹分析证实存在不同数量的肌营养不良蛋白(图4E)。扫描肌营养不良蛋白信号并与对照关联(每μg总蛋白)。数量变化从具有最多营养不良肌肉的3号患者的3％，至具有保留最好肌肉的2号患者的12％。因为基于总蛋白的这种比较不能校正杜兴氏肌营养不良患者的不同数量的纤维化组织和脂肪组织，相对于相似定位的层粘连蛋白-α2的荧光信号，我们还通过ImageJ分析对每个切片肌营养不良蛋白荧光信号进行定量。当对照切片中肌营养不良蛋白/层粘连蛋白α2比例设定为100时，1、2、3和4号患者分别具有33、35、17和25的比例(图4D)。

讨论

我们的研究表明，局部肌肉内注射PRO051，即与外显子51内20个核苷酸序列互补的2OMePS反义寡核糖核苷酸，诱导外显子-51跳跃，校正读框，以及因此在接受治疗的患有杜兴氏肌营养不良的所有四个患者的肌肉中导入肌营养不良蛋白。在整个患者活检标本中都发现了肌营养不良蛋白阳性纤维，这表明化合物在注射区内分散。因为未使用送递增强赋形剂，PRO051摄取看起来并不是主要的潜在限制因素。我们不能排除营养不良纤维膜渗透性增加具有有利影响。患者产生的肌营养不良蛋白水平是健康对照肌肉中水平的3-12％，如总蛋白的Western印迹分析所示。因为纤维化和脂肪的存在可能导致总蛋白提取物中肌营养不良蛋白被低估一些，我们测定了横切片中肌营养不良蛋白与层粘连蛋白-α2的比例，与对照肌肉中的100相比，其为17-35。PRO051的肌营养不良蛋白恢复效果限制在治疗区内，未观察到整个肌肉的强度改善。未来的全身治疗将需要重复给药以增加并保持肌营养不良蛋白更高水平的表达并获得临床效果。

由于未成年人干预的医学伦理规范，我们不能从患者未经注射的对侧肌肉获得活检标本。然而，在研究启动之前5-9年所获得的原始诊断活检标本中，患者显示出小于1％的回复纤维(表2和图2B)。我们认为很有可能是，我们观察到的效果与PRO051试剂的特性和序列相关，而与回复纤维的明显增加不相关。事实上，在2号患者和3号患者中都观察到了肌营养不良蛋白信号增加的单个可能的回复纤维(图4B)。总的来说，我们的研表明，对四个杜兴氏肌营养不良患者肌肉局部给予PRO051，使肌营养不良蛋白恢复至3-12％或17-35％的水平，这取决于相对于总蛋白或肌纤维含量的定量。与治疗的明显局限性特性一致，未观察到功能性改善。在患有最久严重疾病的3号患者中结果总是更差，表明当相对少的肌肉组织被纤维变性和脂肪组织所取代时，在相对年轻的患者中进行临床试验的重要性。我们的发现表明，反义介导的外显子跳跃可以是恢复杜兴氏肌营养不良患者肌肉中肌营养不良蛋白合成的潜在途径。

实施例2

在mdx小鼠(DMD的动物模型)的临床前研究中，评估了辅助化合物泼尼松对AON-诱导的外显子跳跃的作用。从查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories,荷兰)获得Mdx小鼠(C57Bl/10ScSn-mdx/J)。由于外显子23上的无意义突变，这些小鼠是肌营养不良蛋白缺陷的。通过移除无意义突变并校正可读框，AON诱导的外显子23跳跃在mdx小鼠中是治疗性的。每组两个mdx小鼠皮下注射：第1组)生理盐水(1-8周)，第2组)泼尼松龙(1mg/kg，1-8周)，第3组)经设计特异性诱导外显子23跳跃的小鼠特异性反义寡核苷酸PS49(100mg/kg，4周(5次)，5-8周(2次)，第4组)泼尼松龙(1mg/kg，1-8周)+PS49(100mg/kg，4周(5次)，5-8周(2次)。PS49(5’GGCCAAACCUCGGCUUACCU3’)具有全长的硫代磷酸骨架和2'O-甲基修饰的核糖分子。

在最后一次注射之后的一周处死所有小鼠。分离不同的肌肉组，包括四头肌、胫前肌和横膈膜肌，并在液氮冷却的2-甲基丁烷中冷冻。对于RT-PCR分析，将肌肉样品在RNA-Bee溶液(CamproScientific，荷兰)中均质化。按照生产商的说明书，分离并纯化总RNA。对于用逆转录酶(RocheDiagnostics，荷兰)的cDNA合成，在20μl反应中，使用300ngRNA，该反应于55℃下用小鼠DMD基因特异性引物反向引发，进行30分钟。首先，以外引物组进行PCRs，PCR条件是：94℃(40秒)、60℃(40秒)和72℃(60秒)，20次循环。然后使用直接位于外显子23侧翼的外显子内的巢式引物组合，对1μl该反应物(1:10稀释)进行再扩增，条件是94℃(40秒)、60℃(40秒)和72℃(60秒)，30次循环。在2％琼脂糖凝胶中分析PCR产物。使用DNA1000试剂盒和Agilent2100生物分析仪(AgilentTechnologies，荷兰)，通过定量PCR产物测定跳跃效率。在仅以生理盐水或泼尼松龙治疗的小鼠肌肉中，未观察到外显子23跳跃(第1和2组)。检测外显子23跳跃水平，并在仅以PS49治疗的小鼠(第3组)和以PS49和辅助化合物泼尼松龙治疗的小鼠(第4组)之间比较每个肌肉组。在四头肌(Q)、胫前肌(TA)和横膈膜肌(DIA)中，与第3组相比，第4组的外显子23跳跃水平通常更高(图5)。这表示，辅助化合物泼尼松龙确实增强以PS49治疗的mdx小鼠中外显子23的跳跃水平。

实施例3

A.、B.

在0-0.5mg/ml己酮可可碱的存在下，使用转染试剂聚合物UNIFectylin(在0.15MNaCl中，每μgAON，2.0μlUNIFectylin)，以250nMPS188([5’UCAGCUUCUGUUAGCCACUG3’；SEQIDNO:10]优化用来使外显子44特异性跳跃的AON)或250nMPS221([5’AUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGC3’；SEQIDNO:60]优化用来使外显子45特异性跳跃的AON)转染来自健康对照个体的分化的肌肉细胞培养物(肌管)。如果核酸是带负电荷的(例如2’-O-甲基硫代磷酸AONs)，UNIFectylin便与核酸发生静电相互作用。将己酮可可碱(SigmaAldrich)溶解在水中。按照生产商的说明书，转染之后24小时在RNA-Bee溶液(CamproScientific，荷兰)中分离总RNA。对于用逆转录酶(RocheDiagnostics，荷兰)的cDNA合成，在20μl反应中，使用500ngRNA，该反应于55℃下用DMD基因特异性引物反向引发，进行30分钟。首先，以外引物组进行PCRs，PCR条件是：94℃(40秒)、60℃(40秒)和72℃(60秒)，20次循环。然后使用直接位于外显子44或45侧翼的外显子内的巢式引物组合，对1μl该反应物(1:10稀释)进行再扩增，条件为：94℃(40秒)、60℃(40秒)和72℃(60秒)，30次循环。在2％琼脂糖凝胶中分析PCR产物。使用DNA1000试剂盒和Agilent2100生物分析仪(AgilentTechnologies，荷兰)，通过定量PCR产物测定跳跃效率。

对于用PS188和PS221，当与在未与己酮可可碱共治疗的细胞中获得的外显子44或45跳跃水平相比时，随着辅助化合物己酮可可碱浓度的增加，获得外显子44或45跳跃水平的增加(参见图6)。这样的结果表明，己酮可可碱增强肌细胞中外显子跳跃水平。

C.

在mdx小鼠(DMD的动物模型)的临床前研究中，评估了辅助化合物己酮可可碱对AON-诱导的外显子跳跃的作用。从查尔斯河实验室(荷兰)获得Mdx小鼠(C57Bl/10ScSn-mdx/J)。由于外显子23上的无意义突变，这些小鼠是肌营养不良蛋白缺陷的。通过移除无意义突变并校正可读框，AON诱导的外显子23跳跃在mdx小鼠中是治疗性的。每组两个mdx小鼠皮下注射：第1组)己酮可可碱(50mg/kg，1-2周)，第2组)经设计特异性诱导外显子23跳跃的小鼠特异性反义寡核苷酸PS49(100mg/kg，2周(2次)，第3组)己酮可可碱(50mg/kg，1-2周)+PS49(100mg/kg，2周(2次)。PS49(5’GGCCAAACCUCGGCUUACCU3’)具有全长的硫代磷酸骨架和2'O-甲基修饰的核糖分子。

在最后一次注射之后的一周处死所有小鼠。分离不同的肌肉组，包括四头肌、胫前肌、三头肌和心肌，并在液氮冷却的2-甲基丁烷中冷冻。对于RT-PCR分析，将肌肉样品在RNA-Bee溶液(CamproScientific,荷兰)中均质化。按照生产商说明书，分离并纯化总RNA。对于用逆转录酶(RocheDiagnostics，荷兰)的cDNA合成，在20μl反应中，使用300ngRNA，该反应于55℃下用小鼠DMD基因特异性引物反向引发，进行30分钟。首先，以外引物组进行PCRs，PCR条件是：94℃(40秒)、60℃(40秒)和72℃(60秒)，20次循环。然后使用直接位于外显子23侧翼的外显子内的巢式引物组合，对1μl该反应物(1:10稀释)进行再扩增，条件是：94℃(40秒)、60℃(40秒)和72℃(60秒)，30次循环。在2％琼脂糖凝胶中分析PCR产物。使用DNA1000试剂盒和Agilent2100生物分析仪(AgilentTechnologies，荷兰)，通过定量PCR产物测定跳跃效率。在仅以己酮可可碱治疗的小鼠肌肉中，未观察到外显子23跳跃(第1组)。检测外显子23跳跃水平，并在仅以PS49治疗的小鼠(第2组)和以PS49和辅助化合物己酮可可碱治疗的小鼠(第3组)之间比较每个肌肉组。在四头肌(Q)、胫前肌(TA)、三头肌(Tri)和心肌(HRT)中，与第2组相比，第3组的外显子23跳跃水平通常更高(图6c)。这表明，辅助化合物己酮可可碱确实增强了以PS49治疗的mdx小鼠中外显子23的跳跃水平。

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Claims (15)

1.缓解个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的方法，所述方法包括：

-给予所述个体向其提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及

-给予所述个体减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物。

2.用作药物的组合：

-向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及至少一种

-减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或

-改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物。

3.向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物中至少之一，在制备用于缓解所述个体杜兴氏肌营养不良或贝克型肌营养不良的一个或多个症状的药物中的用途。

4.药物制剂，其包括：

-向个体提供功能性肌营养不良蛋白的化合物，以及

-减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物，和/或改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，以及

-药物可接受载体、佐剂、稀释剂和/或赋形剂。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中所述辅助化合物包括类固醇优选(糖)皮质类固醇、ACE抑制剂(优选培哚普利)、血管紧张素II型I受体阻断剂氯沙坦、肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂、mIGF-1源、抗氧化剂、离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、L-精氨酸和/或用于增强外显子跳跃和/或抑制剪接体组装和/或剪接的化合物。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，用于至少部分减少所述个体中异常肌营养不良蛋白的产生。

7.如权利要求1-6中任一中所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，用于抑制肌营养不良蛋白前mRNA外显子内含于由所述前mRNA剪接产生的mRNA中，其中优选缺乏来自由肌营养不良蛋白前mRNA所产生的mRNA的所述外显子，产生了功能性肌营养不良蛋白的编码区。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前mRNA非外显子区的至少一部分互补的序列，所述部分具有至少13个核苷酸。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括抑制终止密码子的化合物，优选该化合物包括庆大霉素、PTC124或其功能等同物。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，用于特异性结合在转录物中校正肌营养不良蛋白外显子剪接所需要的调节RNA序列，并优选其中所述寡核苷酸或其功能等同物与内含子剪接增强子(ISE)、外显子剪接增强子(ESE)、内含子剪接沉默子(ISS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)互补。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括与肌营养不良蛋白前mRNA外显子RNA的13-50个核苷酸优选14-25个核苷酸之间的连续部分互补的序列。

12.如权利要求6-11中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中所述寡核苷酸包括RNA，并优选所述RNA含有修饰，优选2’-O-甲基修饰的核糖(RNA)或脱氧核糖(DNA)修饰，或其中所述寡核苷酸的所述功能等同物包括肽核酸、锁核酸、吗啉代磷酸二酰胺或其任意组合，最优选吗啉代磷酸二酰胺。

13.如权利要求7-12中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中所述外显子包括外显子51、44、45、53、46、43、2、8、50和/或52。

14.如权利要求7-13中任一项所述的方法、组合、用途或药物制剂，其中向所述个体提供功能性肌营养不良蛋白的所述寡核苷酸与肌营养不良蛋白前mRNA中的至少两个外显子互补，所述寡核苷酸包括至少两部分，其中第一部分包括具有至少8个优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，该连续核苷酸与所述至少两个外显子的第一个是互补的，其中第二部分包括具有至少8个优选16-80个连续核苷酸的寡核苷酸，该连续核苷酸与所述肌营养不良蛋白前mRNA的第二外显子是互补的，其中优选在所述肌营养不良蛋白前mRNA中，通过至少一个不与所述寡核苷酸互补的外显子隔离所述第一和所述第二外显子。

15.至少部分增加细胞中功能性肌营养不良蛋白产生的方法，所述细胞包括编码异常肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白基因的前mRNA，该方法包括：

向所述细胞提供用于抑制外显子内含于由所述肌营养不良蛋白前mRNA剪接产生的mRNA中的化合物，以及

向所述细胞提供减少炎症优选减少肌肉组织炎症的辅助化合物和/或向所述细胞提供改善肌纤维功能、完整性和/或存活的辅助化合物，

该方法还包括允许由所述前mRNA剪接产生的mRNA翻译。