KR20220038771A

KR20220038771A - 엑손 44-표적화된 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 디스트로핀-기반 근병증 치료용 재조합 아데노-관련 바이러스

Info

Publication number: KR20220038771A
Application number: KR1020227006796A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스 세바스티앙 웨인; 케빈 플래니건
Original assignee: 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2022-03-29
Also published as: WO2021026075A1; JP2022543236A; US20220282247A1; CN114466682A; EP4007633A1; IL290287A; CA3149488A1; EP4007633A4; AU2020324957A1

Abstract

본 개시내용은 듀시엔형 근이영양증 (DMD)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 근이영양증의 치료를 위한 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 U7-기반 소형 핵 리보핵산 (RNAs) (snRNA), U7-기반 snRNA을 인코딩하는 핵산을 포함한 핵산, 및 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 임의의 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이로 인해 발생하는 DMD를 포함하지만 이에 한정되지 않는 근이영양증 치료에 사용하기 위해 U7-기반 snRNA을 인코딩하는 핵산을 전달하여 엑손-스키핑을 유도하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 제공한다.

Description

엑손 44-표적화된 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 디스트로핀-기반 근병증 치료용 재조합 아데노-관련 바이러스

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 8월 2일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/882,216호의 이익을 주장하며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.

분야

본 개시내용은 근이영양증의 치료를 위한 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 U7-기반의 소형 핵 리보핵산 (RNA) (snRNA)인 U7-기반 snRNA을 인코딩하는 핵산을 비롯한 핵산, 및 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 임의의 돌연변이를 비제한적으로 포함하는 DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이로 인해 발생하는 근이영양증 치료에 사용하기 위해 U7-기반 snRNA를 인코딩하는 핵산을 전달하여 엑손-스키핑을 유도하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 제공한다.

서열 목록의 참조에 의한 통합

본 출원은, 본 개시내용과 별도로, 컴퓨터-판독가능한 형식의 서열 목록 (파일명: 54313A_Seqlisting.txt; 크기: 22,771 바이트: 2020년 8월 3일 생성)을 포함하고, 이것은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.

근이영양증 (MD)은 주로 수의근에 영향을 미치는 유전적 퇴행성 질환의 그룹이다. 이 그룹은 움직임을 제어하는 골격근의 진행성 약화 및 퇴화를 특징으로 한다. 일부 형태의 MD는 유아기 또는 아동기에 발병하는 반면, 다른 형태의 경우는 중년 또는 그 이후에 나타날 수도 있다. 상기 장애는 근육 약화의 분포와 정도 (일부 형태의 MD도 심장 근육에 영향을 미침), 발병 연령, 진행 속도, 및 유전 패턴의 측면에서 달라진다.

MD는 개인, 가족, 및 지역사회에 중대한 영향을 미치는 확인된 치료법이 없는 질환 그룹이다. 비용은 계산이 불가능할 정도이다. 개인은 자존감 상실과 관련된 정서적 긴장과 삶의 질 저하를 겪는다. 사지 기능 상실로 인한 극심한 신체적 어려움은 일상 생활 활동을 어렵게 만든다. 가족 역학은 금전적 손실 및 대인 관계에 어려움을 겪는다. 영향을 받은 형제 자매는 소원해지고, 특히 근이영양증에 대한 책임을 부모 중 한 사람에게 돌릴 수 있는 경우 배우자간의 다툼은 종종 이혼으로 이어진다. 치료법을 찾기 위한 노력의 부담은 종종 삶의 모든 측면을 훼손하고 힘들게 하는 평생의 집요한 노력이 된다. 가족을 넘어, 지역 사회는 특수 교육, 특별 이동수단으로 근이영장증 환자의 장애에 부합하는 추가 시설의 필요성으로 인한 재정적 부담을 짊어지고 있으며, 재발성 호흡기 감염, 및 심장 합병증을 치료하기 위한 반복 입원에 대한 비용을 떠안는다. 재정적 책임은 주정부 및 연방 정부의 관련 기관들이 나눠 가지며, 이와 같은 책임은 납세 의무가 있는 지역 사회로 확장된다.

MD의 한 형태는 듀시엔형 (Duchene) 근이영양증 (DMD)이다. 이는 신생 남아 5000명 중 1명에게 영향을 미치는 가장 흔한 중증 소아 근이영양증이다. DMD는 DMD 유전자의 돌연변이로 인해 골격 및 심장 근육뿐만 아니라, 위장관, 및 망막에 디스트로핀 단백질 (427 KDa)이 결핍되어 발생한다. 디스트로핀은 비정상적인 수축으로부터 근초를 보호할 뿐만 아니라, 매우 근접한 수 많은 신호전달 단백질을 근초에 고정시킨다. MD의 다른 형태는 베커 (Becker) 근이영양증 (BMD)이다. DMD와 마찬가지로 BMD는 신체의 근육을 점차적으로 약하게 만드는 유전 질환이다. BMD는 심장뿐만 아니라 엉덩이, 골반, 허벅지, 어깨의 근육에도 영향을 미치지만, DMD보다 심각한 문제를 일으키지 않는 것으로 알려져있다.

DMD의 여러 임상 사례는 DMD 유전자 중 결실 돌연변이와 연관된다. 결실 돌연변이와 대조적으로, DMD 엑손 중복은 디스트로핀병증 환자의 비편협적 샘플에서 질환-유발 돌연변이의 약 5%를 차지하는데 [Dent et al., Am J Med Genet, 134(3): 295-298 (2005)], Flanigan et al에 의해 유나이티드 디스트로핀병증 프로젝트에서 출판된 것을 포함한 돌연변이의 일부 카탈로그의 경우 중복의 수가 훨씬 많다. [Hum Mutat, 30(12): 1657-1666 (2009)], 여기서는 11%이었다. BMD는 또한 단백질을 너무 짧게 만드는 디스트로핀 유전자의 변화로 인해 발생한다. 결함이 있는 디스트로핀은 정상적인 사용 시 근육 세포를 손상시킬 위험이 있다. 또한, 2012년 3월 29일자로 공개된 미국 특허 출원 공보 제2012/0077860호; 2013년 3월 21자로 공개된 제2013/0072541호; 및 2013년 2월 21자로 공개된 제2013/0045538호를 참조한다.

엑손 45의 결실은 DMD 환자에서 발견되는 가장 흔한 결실 중 하나인 반면, 엑손 44 및 45의 결실은 일반적으로 BMD와 관련이 있다 [Anthony et al., JAMA Neurol 71:32-40 (2014)]. 따라서, 엑손 44가 이러한 DMD 환자의 전사체인 pre-메신저 (pre-messenger) RNA (mRNA)에서 우회될 수 있다면, 이는 판독 프레임을 복원하고 부분적으로 기능하는 BMD-유사 디스트로핀의 생산을 가능하게 할 것이다 [Aartsma-Rus et al., Nucleic Acid Ther 27(5): 251-259 (2017)]. 사실, 엑손 45에 인접한 결실이 있는 많은 환자들은 비록 매우 낮은 수준임에도 불구하고 자발적으로 엑손 44를 스키핑하는 것으로 보인다. 이것은 다른 결실을 가진 DMD 환자와 비교할 때 디스트로핀의 수준을 약간 증가시키고, 다른 결실을 가진 DMD 환자와 비교하여 이들 환자에서 관찰되는 덜 심각한 질병 진행의 기초가 될 가능성이 가장 높다 [Anthony et al., supra; Pane et al., PLoS One 9:e83400 (2014); van den Bergen et al., J Neuromuscul Dis 1:91-94 (2014)].

DMD 유전자의 확인에 따른 많은 연구에도 불구하고, 치료 옵션은 제한적이다. 따라서, DMD를 포함하는 MD에 대한 치료가 당업계에 여전히 필요하다. 가장 진보된 치료법에는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON)-매개 엑손 스피핑과 같은 돌연변이-특이적 유전적 접근을 사용하여 누락된 단백질인 디스트로핀을 복원시키는 것을 목표로하는 치료법이 포함된다.

요약

본 개시내용은 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 임의의 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이를 포함하는 근이영양증을 치료, 개선, 진행 지연, 및/또는 예방하기 위한 새로운 유전자 요법을 위한 생산물, 방법, 및 용도를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 본 개시내용은 U7-기반 소형 핵 리보핵산 (RNAs) (snRNA)인 핵산, 및 DMD 엑손 44의 중복, 엑손 43 또는 45의 결실, 또는 엑손 45-56의 결실로 인한 근이영양증 치료에 사용하기 위한 변형된 형태의 디스트로핀 단백질을 제공하도록 U7-기반 snRNA를 인코딩하는 핵산을 전달하여 엑손-스키핑을 유도하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 제공한다.

본 개시내용은 DMD 유전자의 엑손 44를 인코딩하는 폴리뉴클레오디드에 결합하거나 이에 상보적인 핵산 분자를 제공하며, 상기 DMD 엑손 44를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 1 또는 2에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 서열 번호: 3에 명시된 아미노산 서열을 인코딩한다.

본 개시내용은 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 또는 35에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나에 결합하거나 이에 상보적인 핵산 분자를 제공한다.

본 개시내용은 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 32, 33, 34, 또는 35에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 32, 33, 34, 또는 35에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산 분자를 제공한다.

본 개시내용은 서열 번호: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 서열 번호: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산 분자를 제공한다.

본 개시내용은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 제공하고, 상기 rAAV의 게놈은 자기-상보적 게놈이거나 단일-가닥 게놈이다. 일부 양태에서, 상기 rAAV는 rAAV-1, rAAV-2, rAAV-3, rAAV-4, rAAV-5, rAAV-6, rAAV-7, rAAV-8, rAAV-9, rAAV-10, rAAV-11, rAAV-12, rAAV-13, rAAV-rh74, 또는 rAAV-anc80이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 제공하고, 상기 rAAV의 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 결여되어 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 제공하고, 상기 rAAV는 AAV-1 캡시드, AAV-2 캡시드, AAV-3 캡시드, AAV-4 캡시드, AAV-5 캡시드, AAV-6 캡시드, AAV-7 캡시드, AAV-8 캡시드, AAV-9 캡시드, AAV-10 캡시드, AAV-11 캡시드, AAV-12 캡시드, AAV-13 캡시드, AAV-rh74 캡시드, 또는 AAV-anc80 캡시드를 추가로 포함한다.

본 개시내용은 세포에서 상기 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나를 상기 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 상기 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는 rAAV를 상기 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 rAAV를 상기 세포에 제공하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, DMD 엑손 44 스키핑 가능한 임의의 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선, 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는 rAAV를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 rAAV를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, DMD 엑손 44스키핑 가능한 상기 돌연변이는 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 DMD 유전자 서열의 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 돌연변이는 엑손 1-43, 2-43, 3-43, 4-43, 5-43, 6-43, 7-43, 8-43, 9-43, 10-43, 11-43, 12-43, 13-43, 14-43, 15-43, 16-43, 17-43, 18-43, 19-43, 20-43, 21-43, 22-43, 23-43, 24-43, 25-43, 26-43, 27-43, 28-43, 29-43, 30-43, 31-43, 32-43, 33-43, 34-43, 35-43, 36-43, 37-43, 38-43, 39-43, 40-43, 41-43, 42-43, 43, 45, 45-46, 45-47, 45-48, 45-49, 45-50, 45-51, 45-52, 45-53, 45-54, 45-55, 45-56, 45-57, 45-58, 45-59, 45-60, 45-61, 45-62, 45-63, 45-64, 45-65, 45-66, 45-67, 45-68, 45-69, 45-70, 45-71, 45-72, 45-73, 45-74, 45-75, 45-76, 45-77, 및 45-78의 결실, 및/또는 엑손 44의 중복이다. 일부 양태에서, 상기 돌연변이는 DMD 엑손 44의 중복, 엑손 43 또는 45의 결실, 또는 엑손 45-56의 결실이다. 일부 양태에서, 상기 투여하는 단계는 디스트로핀 단백질의 변형된 형태 또는 상기 대상체에서 기능적으로 활성인 변형된 형태 또는 단편의 디스트로핀 단백질의 증가된 발현을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 디스트로핀 단백질의 증가된 발현을 초래한다. 일부 양태에서, 상기 투여하는 단계는 상기 대상체의 이영양성 병리의 진행을 억제한다. 일부 양태에서, 상기 투여하는 단계는 상기 대상체의 근육 기능을 향상시킨다. 일부 양태에서, 이러한 근육 기능의 향상은 근력이 향상되는 것이다. 일부 양태에서, 이러한 근육 기능의 향상은 서있거나 걸을 때 안정성이 향상되는 것이다.

본 개시내용은 세포에서 상기 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 유도하기 위한 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 세포는 대상체 내에서 발견되거나 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이를 갖는 대상체로부터 분리된다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 rAAV에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 개시되거나 기재된 다양한 핵산 분자 중 하나 이상 또는 본원에 개시되거나 기재된 다양한 핵산 분자의 조합이 rAAV에 제공된다.

본 개시내용은 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선, 및/또는 예방하기 위한 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선, 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본원에 개시되거나 기재된 핵산 분자 중 적어도 하나의 용도를 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 rAAV에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 개시되거나 기재된 다양한 핵산 분자 중 하나 이상 또는 본원에 개시되거나 기재된 다양한 핵산 분자의 조합 은 rAAV에 제공된다. 일부 양태에서, 상기 돌연변이는 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 또는 이에 영향을 미치는 상기 서열의 돌연변이이다. 일부 양태에서, 상기 돌연변이는 DMD 엑손 44의 중복, 엑손 43 또는 45의 결실, 또는 엑손 45-56의 결실이다. 일부 양태에서, 상기 용도는 디스트로핀 단백질의 증가된 발현 또는 디스트로핀 단백질의 기능적 활성을 갖는 변형된 형태의 디스트로핀 단백질의 증가된 발현을 초래한다. 일부 양태에서, 상기 용도는 이영양성 병리의 진행을 억제한다. 일부 양태에서, 상기 용도는 근육 기능을 향상시킨다. 일부 양태에서, 상기 근육 기능의 향상은 근력이 향상되는 것이다. 일부 양태에서, 상기 근육 기능의 향상은 서있거나 걸을 때 안정성이 향상되는 것이다.

본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 도면의 설명 및 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 도면, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에 개시된 주제의 구현예를 나타내면서 단지 예시의 목적으로 주어진 것으로 이해되어야 한다.

도 1a-f는 Del45-56 FibroMyoD, Del45 FibroMyoD, 및 Dup44 FibroMyoD을 다양한 바이러스 작제물에 형질도입한 후 인간 DMD 엑손의 엑손 스키핑을 도시한다. 도 1a는 SD44, LESE44, 또는 SESE44 작제물 [Del45-56 (미처리) 및 Del 44-56 (처리)]로 처리된 Del45-56 FibroMyoD의 RT-PCR 결과를 도시한다. SD44로 처리된 Del45-56 FibroMyoD는 Del44-56에서 강한 밴드로 도시된 바와 같은 엑손 스키핑을 나타낸다. LESE44 또는 SESE44로 처리된 Del45-56 FibroMyoD는 Del45-56 및 Del44-56에서 밴드로 표시되는 부분적인 엑손 스키핑을 나타낸다. 도 1b는 LESE44, SESE44, SD44, 및 BP43AS44 작제물 [Del45 (미처리) 및 Del 44-45 (처리)]로 처리된 Del45 FibroMyoD의 RT-PCR을 도시한다. 처리된 모든 FibroMyoD가 엑손 스키핑을 나타내지만, SD44는 가장 많은 양의 엑손 스키핑을 나타낸다. 도 1c는 SD44, BP43AS44, 및 LESE44 작제물 [Del45 (미처리) 및 Del 44-45 (처리)]로 처리된 Dup44 FibroMyoD의 RT-PCR을 도시한다. 처리된 모든 FibroMyoD가 엑손 스키핑을 나타내지만, SD44는 가장 많은 양의 엑손 스키핑을 나타낸다. 도 1d는 SD44, 4X-SD44, 또는 SD44-스터퍼 작제물 [Del45-56 (미처리) 및 Del 44-56 (처리)]로 처리된 Del45-56 FibroMyoD의 RT-PCR 결과를 도시한다. 모든 작제물로 처리된 Del45-56 FibroMyoD는 4X-SD44 및 SD44-스터퍼 작제물로 처리된 FibroMyoD에서 발견된 가장 강한 밴드와 함께 세 가지 작제물 모두에서 Del44-56의 강한 밴드로 도시된 바와 같은 강한 엑손 스키핑을 나타낸다. 도 1e는 4X-SD44, SD44-스터퍼, 및 SD44 작제물 [Del45 (미처리) 및 Del 44-45 (처리)]로 처리된 Del45 FibroMyoD의 RT-PCR을 도시한다. 처리된 모든 FibroMyoD는 Del45 FibroMyoD에서 강력한 엑손 44 스키핑을 나타낸다. 도 1e는 SD44-스터퍼, 4X-SD44, 및 SD44 작제물 [Del45 (미처리) 및 Del 44-45 (처리)]로 처리된 Dup44 FibroMyoD의 RT-PCR을 도시한다. 처리된 모든 FibroMyoD는 강력한 엑손 스키핑을 나타내었으며 SD44-스터퍼 및 4X-SD44 모두 이 실험에서 가장 많은 양의 엑손 스키핑을 나타내었다.
도 2는 3개의 상이한 rAAV 바이러스 벡터를 주사한지 1개월 후, 3개월령 hDMDdel45/mdx 마우스의 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 DMD 엑손 44의 효율적인 스키핑을 도시한다. 실험은 2마리의 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (작제물 당 n=4 TA 근육). 이러한 RT-PCR결과는 마우스 #57 및 #58 (미처리된 hDMDdel45/mdx 마우스)에서 엑손 스키핑의 부재; 마우스 #60 및 #61 (U7-SD44-스터퍼 (서열 번호: 27)가 주사된 hDMDdel45/mdx 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑; 마우스 #66 및 #72 (U7-SD44 (서열 번호: 23)가 주사된 hDMDdel45/mdx 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑; 및 마우스 #84 (U7-4x-SD44 (서열 번호: 26)가 주사된 hDMDdel45/mdx 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑을 입증하였다. 블랙 6 (Bl6) 마우스는 인간 DMD 유전자를 함유하지 않는 야생형 마우스이므로 인간 DMD에 대한 음성 대조군이다.
도 3a-e는 3개의 상이한 rAAV 바이러스 벡터를 주사한지 1개월 후, 3개월령 hDMD/mdx del45 마우스의 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 디스트로핀의 면역형광 발현을 도시한다. 실험은 2마리의 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (작제물 당 n=4 TA 근육). 이러한 면역형광 결과는 #58 (미처리된 마우스); 마우스 #72 (U7-SD44 (서열 번호: 23)가 주사된 마우스; 도 3c); 마우스 #60 (U7-SD44-스터퍼 (서열 번호: 27)가 주사된 마우스; 도 3d); 및 마우스 #84 (U7-4x-SD44 (서열 번호: 26)가 주사된 마우스; 도 3e)에서 얻었다. Bl6는 인간 DMD 유전자를 함유하지 않는 야생형 마우스이지만, 이 면역형광 실험에 사용된 항체는 인간 및 마우스 디스트로핀을 모두 인식하였다. 처리 한달 후, 면역염색은 세 가지rAAV 바이러스 벡터 모두로 바이러스 감염 후에 디스트로핀이 발현되었음을 나타내며, SD44-스터퍼 벡터 (도 3d) 및 4X-SD44 벡터 (도 3e)가 근육에서 가장 높은 수준의 디스트로핀 발현을 초래하는 것으로 나타났다. 도 3a는 미처리된 hDMDdel45/mdx 마우스에서 디스트로핀 발현이 없음을 도시한다. 도 3b 는 항체가 마우스 디스트로핀과 반응하기 때문에 Bl6 모델에서 디스트로핀 발현을 나타낸다.
도 4는 3개의 상이한 rAAV 바이러스 벡터를 주사한 지 1개월 후, hDMD/mdx del45 마우스의 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 디스트로핀의 웨스턴 블롯 발현을 도시한다. 실험은 2마리의 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (작제물 당 n=4 TA 근육). 1개월 후, 웨스턴 블롯 결과는 세 가지 rAAV 바이러스 벡터 모두로 감염 후 디스트로핀이 발현되었음을 나타내며, SD44스터퍼 벡터가 근육에서 가장 높은 수준의 디스트로핀 발현을 초래하는 것으로 나타났다. 이러한 웨스턴 블롯 결과는 마우스 #57 및 #58 (미처리된 hDMD/mdx del45 마우스); 마우스 #60 및 #61 (hDMD/mdx del45 U7-SD44-스터퍼 (서열 번호: 27)가 주사된 마우스); 마우스 #66 및 #72 (hDMD/mdx del45 U7-SD44 (서열 번호: 23)가 주사된 마우스) 및 마우스 #84 (hDMD/mdx del45 U7-4x-SD44 (서열 번호: 26)가 주사된 마우스)에서 얻었다. Bl6는 인간 DMD 유전자를 함유하지 않는 야생형 마우스이고; 그러나 이 웨스턴 블롯에 사용된 항체는 인간 및 마우스 디스트로핀을 모두 인식한다. 액틴은 대조군으로 사용하였다.
도 5a-e는 주사 후 3개월, 단백질 회복 및 근력 향상을 위한 hDMD/mdx del45 마우스의 형질도입 후 인간 DMD 엑손 44의 효율적인 엑손 스키핑을 도시한다. 도 5a는 hDMD/mdx del45 마우스의 RT-PCR 결과를 도시한다. 도 5a는 rAAV.U7_SD44스터퍼 바이러스 벡터를 주사한 지 3개월 후, 3개월령 hDMDdel45/mdx 마우스의 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 DMD 엑손 44의 효율적인 스키핑을 도시한다. 실험은 2마리의 마우스의 각 전방 경골 (TA)에서 수행하였다 (n=6 TA 근육). 이러한 RT-PCR 결과는 마우스 (미처리된 hDMDdel45/mdx 마우스 n=6 TA 근육)에서 매우 드문 엑손 스키핑; 및 마우스 (rAAV.U7_SD44스터퍼 (n=6 TA 근육; 서열 번호: 27)가 주사된 hDMDdel45/mdx 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑을 입증하였다. WT 마우스는 인간 DMD 유전자를 함유하지 않지만 마우스 DMD 유전자를 함유하는 야생형 마우스이고; 따라서, 이 WT 마우스는 양성 대조군이다. 도 5b는 rAAV.U7_SD44스터퍼 주사 3개월 후 hDMD/mdx del45 마우스의 TA 근육에서 인간 디스트로핀의 웨스턴 블롯 발현을 도시한다. 실험은 3마리 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (n=6 TA 근육). 3개월 후, 웨스턴 블롯 결과는 rAAV.U7_SD44스터퍼 (서열 번호: 27)로 감염 후 디스트로핀이 발현되었음을 보여주었다. 이러한 웨스턴 블롯 결과는 마우스, 즉 주사된 6개 TA 중 3개에서 얻은 것이다. WT는 인간 DMD를 함유하지 않는 야생형 마우스이고; 그러나 웨스턴 블롯에 사용된 항체는 인간 및 마우스 디스트로핀을 모두 인식한다. 액틴은 대조군으로 사용하였다. 도 5c-e는 rAAV.U7_SD44스터퍼 (서열 번호: 27) 주사 후 3개월차에 근육력의 향상을 도시한다. 도 5c는 행 와이어의 향상을 도시하고; 도 5d는 비력을 도시하고; 그리고 도 5e는 주사 후 3개월 차에 편심 수축을 도시한다.

본 개시내용은, DMD 엑손 44의 중복, 엑손 43 또는 45의 결실, 또는 엑손 45-56의 결실을 포함하지만 이에 한정되지 않는, DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이를 수반하는 근이영양증을 치료, 개선, 진행 지연, 및/또는 예방하기 위한 생산물, 방법, 및 용도를 제공한다. 가장 큰 것으로 알려진 인간 유전자인 DMD는 디스트로핀이라는 단백질을 형성하기 위한 지침을 제공한다. 디스트로핀은 주로 운동에 사용되는 근육 (골격근) 및 심장 (heart) (심장 (cardiac)) 근육에 있다.

보다 구체적으로, 본 개시내용은 DMD 엑손 44 또는 DMD 엑손 44 및 그 주변 인트론 서열에 결합하도록 설계된 서열을 포함하는 핵산을 제공하여, DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이로 인한 근이영양증 치료에 사용하기 위한 변형된 형태의 디스트로핀 단백질을 제공한다. 본 개시내용은 U7-기반 소형 핵 리보핵산 (snRNA) (U7 snRNA)을 인코딩하고 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이로 인한 근이영양증 치료에 사용하기 위한 변형된 형태의 디스트로핀 단백질을 제공하도록 U7-기반 snRNA을 인코딩하는 핵산을 전달하여 DMD 엑손 44의 엑손-스키핑을 유도하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)와 같은 벡터를 제공한다. 엑손 스키핑은 $$ 디스토핀의 생성을 교정하고 회복시키는 치료법이다. 특정 유전자 돌연변이의 경우 바디가 더 짧고 사용 가능한 디스토핀을 형성할 수 있다. 비록 지금까지의 엑손 스키핑은 DMD의 치료법이 아니지만 DMD의 영향을 덜 심각하게 만들 수 있다.

따라서, 본 개시내용은 엑손 44 스키핑 가능한 임의의 돌연변이를 치료하기 위한 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 엑손 44 스키핑 가능한 이러한 돌연변이는 DMD 엑손 스키핑 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 돌연변이이다. 엑손 44 스키핑 가능한 이러한 돌연변이의 예는 https colon-slash-slash-www.cureduchenne.org-slash-wp-content-slash-uploads-slash-2016-slash-11-slash-Duchenne-Population-Potentially-Amenable-to-Exon -Skipping-11.10.16.pdf에서 제공되는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 엑손 44 스키핑-가능한 돌연변이는 1-43, 2-43, 3-43, 4-43, 5-43, 6-43, 7-43, 8-43, 9-43, 10-43, 11-43, 12-43, 13-43, 14-43, 15-43, 16-43, 17-43, 18-43, 19-43, 20-43, 21-43, 22-43, 23-43, 24-43, 25-43, 26-43, 27-43, 28-43, 29-43, 30-43, 31-43, 32-43, 33-43, 34-43, 35-43, 36-43, 37-43, 38-43, 39-43, 40-43, 41-43, 42-43, 43, 45, 45-46, 45-47, 45-48, 45-49, 45-50, 45-51, 45-52, 45-53, 45-54, 45-55, 45-56, 45-57, 45-58, 45-59, 45-60, 45-61, 45-62, 45-63, 45-64, 45-65, 45-66, 45-67, 45-68, 45-69, 45-70, 45-71, 45-72, 45-73, 45-74, 45-75, 45-76, 45-77, 및 45-78의 결실, 및 엑손 44의 중복을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 이러한 돌연변이는 DMD 엑손 44의 중복, 엑손 43 또는 45의 결실, 또는 엑손 45-56의 결실이다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 핵산을 이를 필요로하는 대상체에 전달하기 위한 벡터를 포함한다.

본 개시내용은 엑손 44 또는 엑손 44 주변 인트론 영역을 표적으로 하도록 설계된 안티센스 서열 또는 안티센스 서열의 역 상보체 (reverse complement)를 포함하는 핵산 (또는 핵산 분자)를 전달하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 "엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물"인 엑손 44를 표적으로 하는 안티센스 서열을 포함하는 U7 snRNA를 인코딩하는 핵산 분자를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 전달을 위해 바이러스 벡터의 게놈에 삽입된다. 일부 양태에서 엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 전달하는데 사용되는 벡터는 rAAV이다.

본 개시내용은 관심 안티센스를 발현하여 엑손 스키핑을 매개하는 U7 소형 RNA 프로모터를 전달하기 위한 rAAV를 제공한다. 이 접근법의 장점은 rAAV 바이러스가 영향을 받는 근육을 효율적으로 표적화하여 엑손 스키핑 시스템을 전달할 것이라는 점이다.

DMD 유전자는 인간에게 알려진 가장 큰 유전자이다. 이는 크기가 240만 염기쌍이고, 79개의 엑손을 포함하며 전사되고 동시 전사적으로 스플라이싱되는데 16시간 이상이 걸린다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DMD 유전자의 엑손 44를 표적화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 엑손 44 스키핑을 유도하는 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 안티센스-매개된 엑손 스키핑의 근거는 표적 엑손의 스키핑을 유도하여 판독 프레임을 복원하는 것이다. 주변 인트론 서열이 있는 DMD 유전자의 엑손 44의 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 번호: 1에 명시되어 있다. 대문자의 뉴클레오티드는 엑손 서열을 나타내고 소문자의 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다. DMD 유전자의 엑손 44의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 2에 명시되고 148개의 염기 쌍으로 구성되어 있으며 (미국 특허 공보 제 2012/0059042호), 엑손 44의 아미노산 서열은 서열 번호 3에 명시되어 있다. 서열 번호: 2의 첫 번째 "G"는 엑손 43의 최종 C-말단 아미노산을 인코딩하는 말단 뉴클레오티드이다. 따라서, "G"는 서열 번호: 2의 첫 번째 뉴클레오티드이지만, 엑손 44는 서열 번호: 3의 N-말단 "R" (아르기닌)을 인코딩하는 "CGA"에 의해 코딩되기 시작한다.

본 개시내용은 DMD 유전자의 엑손 44를 표적화하도록 설계된 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 핵산 (또는 핵산 분자) 또는 핵산을 제공한다. 주변 인트론 서열이 있는 DMD 유전자의 엑손 44는 서열 번호: 1에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. DMD 유전자의 엑손 44는 서열 번호: 2에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 서열 번호: 3에 명시된 아미노산 서열을 인코딩한다.

다양한 양태에서, 본 개시내용의 방법은 또한 서열 번호: 1 또는 2에 명시된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호: 3에 명시된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 이소형 및 변이체를 표적화한다. 일부 양태에서, 변이체는 서열 번호: 3에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 및 70% 동일성을 포함한다. 표 1은 인간 DMD 엑손 44 및 그 주변 인트론 영역의 서열을 제공한다.

본 개시내용은 표 2에 명시된 센스 및 안티센스 서열을 포함하는 엑손 44 및 그 주변에 다양한 영역의 표적 서열을 포함하는 다양한 핵산 서열, 및 세포에서 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 유도하는 방법에서의 그의 용도를 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 엑손 44를 표적화하는 핵산 분자, 즉 "엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물"을 세포에 제공하는 단계를 포함하는, 세포에서 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 유도하는 방법 및 용도를 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 엑손 44의 다양한 영역을 표적화하는 안티센스 서열 및 이들 서열의 역 상보체를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 표적 서열, 즉, 안티센스 서열에 의해 표적화되는 엑손 44의 고유 서열은 서열 번호: 4 [BP43AS44 (분기점 43 수용체 부위 44) 표적 서열], 서열 번호: 5 [LESE44 (긴 엑손 스플라이싱 인핸서 44) 표적 서열], 서열 번호: 6 [SESE44 (짧은 엑손 스플라이싱 인핸서 44) 표적 서열], 또는 서열 번호: 7 [SD44 (스플라이스 공여체) 표적 서열]로 명시된 서열, 또는 이의 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 이들 표적 서열은 U7-인코딩 서열, 즉, 서열 번호: 29에 삽입된다. 일부 양태에서, 이들 안티센스 서열는 U7-인코딩 서열, 즉, 서열 번호: 28에 삽입된다. 일부 양태에서, 이들 서열의 다중 카피 (copies)가 U7-인코딩 서열에 삽입된다. 본 개시내용은 또한 엑손 44의 다양한 영역을 표적화하는 서열, 표적 서열의 역 상보체, 및 서열 번호: 32 [BP43AS44 표적 서열의 mRNA], 서열 번호: 33 [LESE44 표적 서열의 mRNA], 서열 번호: 34 [SESE44 표적 서열의 mRNA], 또는 서열 번호: 35 [SD44 표적 서열의 mRNA]에 명시된 mRNA 서열, 또는 이의 변이체를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 표 2를 참조한다. 서열의 대문자는 엑손 서열 (즉, 엑손 44의 서열)을 나타내고 소문자는 엑손 44 주변 인트론 서열을 나타낸다. 이들 서열은 서열 번호: 1 또는 2 내에서 발견되는 DMD 유전자에 존재한다.

본 개시내용은 스플라이소솜을 방해하여 DMD 유전자의 엑손 44의 발현을 방해하는 안티센스 서열 (및 안티센스 서열의 역 상보체인 서열)을 포함하거나 이로 구성된 핵산 분자를 포함하여, DMD 유전자의 돌연변이 및 이에 따른 mRNA의 변형된 버전으로 인한 근이영양증을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 절단된 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 mRNA의 판독 프레임을 복원하기 위한 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 초래한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, " 디스트로핀의 증가된 발현"은 "절단된 디스트로핀 단백질, 변형된 형태 $$ 또는 디스트로핀 단백질, 또는 디스트로핀 단백질의 기능적 단편의 증가된 발현"을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 엑손 44 및 그 주변 인트로 서열을 표적으로 하는 안티센스 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 안티센스 서열은 서열 번호: 8-11 중 어느 하나에 명시된 서열, 또는 이의 변이체 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 엑손 44 및 그 주변 인트로 서열을 표적으로 하는 안티센스 mRNA 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 이들 안티센스 서열의 mRNA 서열은 서열 번호: 12-15에 명시된 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 표 3을 참조한다. 일부 양태에서, 이들 안티센스 서열 또는 그의 역 상보체는 U7-인코딩 서열, 예를 들어, 서열 번호: 28 또는 29에 삽입된다. 일부 양태에서, 이들 서열의 다중 카피가 U7-인코딩 서열에 삽입된다.

본 개시내용은 U7 프로모터의 제어 하에 서열 번호: 4-15 또는 32-35 중 어느 하나에 명시된 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하거나 또는 U7 소형 핵 RNA (U7 snRNA)를 인코딩하는 서열에 삽입된 핵산을 포함한다. U7 snRNA를 인코딩하는 이러한 서열은 서열 번호: 28 및 29에 명시되며 표 5에서 찾을 수 있다 U7 snRNA는 엑손 스키핑 및 스플라이싱 조절에서 중요한 도구인 것으로 밝혀졌다 [Goyenvalle et al., Mol Ther 17(7):1234-40 (2009)]. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON)를 사용한 스플라이싱 조절은 지난 20년 동안 많인 잘환, 특히 듀시엔형 근이영양증 (DMD)에 대한 잠재적 치료법으로 개발되었다. 여기에는 전임상 및 임상 시험이 포함된다 [Mendell et al., Ann Neurol 74:637-47 (2013)]. 그러나, 이러한 AON은 심장과 횡경막 (즉, DMD 소년이 가장 영향을 받는 근육)을 약하게만 관통하고 즉DMD 환자의 재주입이 필요한 만큼 안정적이지 않기 때문에 약한 엑손 스키핑을 매개한는 것으로 나타났다. 따라서 AAV-기반 snRNA 유전자 치료 접근법이 상술한 AON의 잠재적 전달 문제를 우회하는데 도움이 된다고 본원에 기재되어 있다.

본 개시내용은 스플라이소솜을 방해하여 DMD 유전자의 엑손 44의 발현을 방해하는 U7 snRNA (U7 snRNA 안티센스 서열, 즉, 서열 번호: 16-19, 24, 및 25, 및 역 상보체 U7 snRNA 안티센스 서열, 즉, 서열 번호: 20-23, 26, 및 27)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산 분자를 포함하여, DMD 유전자 및 이에 따른 mRNA의 변형된 버전의 돌연변이로 인한 근이영양증을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 절단된 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 mRNA의 판독 프레임을 복원하기 위한 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 초래한다. 표 4를 참조한다.

본 개시내용은 서열 번호: 4-27 및 32-35 중 어느 하나에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상, 또는 서열 번호: 4-27 및 32-35 중 어느 하나에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 핵산 (즉, 핵산 분자 또는 핵산 작제물)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 스플라이싱을 억제하거나 방해하기 위해 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 U7 snRNA 분자를 사용한다. U7 snRNA는 일반적으로 히스톤 pre-mRNA 3' 말단 처리에 관여하지만, 일부 양태에서는 스플라이싱 조절을 위한 다목적 도구 또는 세포에서 연속적으로 발현되는 안티센스 RNA로 전환된다 [Goyenvalle et al., Science 306(5702): 1796-9 (2004)]. 야생형 U7 Sm 결합 부위를 스플라이시오솜 snRNA 로부터 유래된 공통 서열로 대체함으로써 생성된 RNA는 스플라이시오솜 snRNA에서 발견되는 7개의 Sm 단백질과 조립된다. 결과적으로, 이 U7 Sm OPT RNA는 핵질에 더 효율적으로 축적되고 히스톤 pre-mRNA 절단을 더 이상 매개하진 않지만, 여전히 히스톤 pre-mRNA에 결합하고 야생형 U7 소형 핵 리보핵단백질 (snRNP)에 대한 경쟁적 억제제로 작용할 수 있다. 히스톤 다운스트림 요소에 결합하는 서열을 스플라이싱 기질의 특정 표적에 상보적인 것으로 교체함으로써, 특정 스플라이싱 이벤트를 조절할 수 있는 U7 snRNA를 생성할 수 있다. U7 유도체를 사용하는 한 가지 이점은 안티센스 서열이 소형 핵 리보핵단백질 (snRNP) 복합체에 내장되어 있다는 것이다. 또한, 유전자 치료 벡터에 내장될 때, 이러한 작은 RNA는 단일 주사 후 표적 세포 내부에서 영구적으로 발현될 수 있으며 AAV 접근법을 사용한 이들의 용도는 생체내에서 조사되었다 [Levy et al., Eur J Hum Genet 18(9): 969-70 (2010); Wein et al., Hum Mutat 31(2): 136-42 (2010); Wein et al., Nat Med 20(9): 992-1000 (2014)].

U7-snRNA 시스템에는 3가지 주요 기능이 있다: (1) 표적 세포에서 변형된 snRNA; (2) 스플라이스 접합, 분기점 또는 스플라이싱 인핸서와 염기쌍을 이루도록 설계된, snRNA 백본에 삽입된 안티센스 서열; (3) U7snRNA와 복합체를 형성하여 이를 더 안정하게 만드는 RNA 결합 단백질의 별개의 고리를 모집하는 변형된 서열 (smOPT라고 함);의 발현을 유도하는 U7 프로모터. [Schumperli et al., Cell and Mol Life Sciences 61:2560-70 (2004)]. 안티센스 서열 및 U7 소형 핵 RNA (snRNA) (U7 snRNA)가 근이영양증의 대형 동물 모델에서 생체내 사용에 안전한 것으로 입증되었다는 것은 주목할 만하다 [LeGuiner et al., Mol Ther 22:1923-35 (2014)].

본 개시내용은 서열 번호: 4-27 및 32-35 중 어느 하나에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자를 포함한다.

따라서, 본 개시내용은 표적 서열을 인코딩하는 핵산, 안티센스 서열 및 안티센스 서열의 역 상보체를 인코딩하는 핵산, U7-기반 소형 핵 리보핵산 (snRNA), 즉, U7-기반 snRNA을 인코딩하는 핵산, U7-기반 snRNA의 역 상보체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산, 및 근이영양증 치료에 사용하기 위해 U7-기반 snRNA를 인코딩하는 핵산을 전달하여 엑손-스키핑을 유도하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 DMD 유전자의 엑손 44의 발현 및/또는 mRNA로의 통합을 억제하거나 방해하는 완전한 작제물 (본원에서 엑손 44 U7 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물, 또는 엑손 44-표적화된 U7 snRNA로 지칭됨)을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 (1) 엑손 44-표적화된 U7snRNA-인코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 번호: 16-19, 24, 및 25), 및 (2) 엑손 44-표적화된 역 상보적 U7 snRNA-인코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 번호: 20-23, 26, 및 27)를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

따라서, 본 개시내용은 서열 번호: 1-7에 명시된 표적 서열 중 어느 하나에 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 엑손 44 및 그 주변 인트로 서열 (즉, 서열 번호: 8-11)을 표적화하도록 설계된 안티센스 서열 (DND 레벨에서 표적화된 서열의 역 상보체)인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 엑손 44 및 그 주변 인트로 서열 (즉, 서열 번호: 12-15)을 표적화하도록 설계된 역 상보적 서열 (RNA 레벨에서 표적화된 서열의 역 상보체)인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 서열 번호: 4-15 및 32-35에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된 U7 snRNA를 인코딩하는 핵산, 및 서열 번호: 16-27에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된 핵산을 포함한다. 본 개시내용은 이들 억제성 스플라이싱 RNA를 인코딩하는 핵산이 서열-특이적 유전자 엑손 스키핑을 담당한다는 것을 고안하였다 일부 양태에서, 본원에 기재된 핵산 또는 핵산 분자 또는 작제물은 벡터에 삽입된다.

따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 이들 핵산 중 어느 하나의 하나 이상이 단일 벡터로 결합된다. 따라서, 일부 양태에서, 엑손 44-표적화된 핵산 또는 엑손 44-표적화된 U7 snRNA 작제물의 조합이 단일 벡터에 존재한다. 따라서 본 개시내용은 서열 번호: 4-27 및 32-35에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상, 또는 서열 번호: 4-27 및 32-35 중 어느 하나에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 본원에 개시된 바와 같이 DMD 엑손 44를 매개하는 안티센스 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 말-관련 바이러스, 알파바이러스, 수두 바이러스, 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 신드비스 바이러스 및 백시니아 바이러스) 이다. 일부 양태에서, 아데노-관련 바이러스 (AAV)가 사용된다. 일부 양태에서, 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)가 사용된다.

일부 양태에서, 본 개시내용의 rAAV 게놈은 예를 들어, 하나 이상의 DMD 엑손 44 U7-기반 snRNA (즉, 엑손 44 내부 또는 주변의 유전자 서열에 결합하고 U7 snRNA로부터 발현되는 snRNA)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 플랭킹 (flanking)하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 전사 제어 DNA, 특히 표적 세포에서 기능하는 프로모터 DNA에 작동 가능하게 연결된다.

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 복제-결핍 파보바이러스로, 이것의 단일-가닥 DNA 게놈은 2개의 145개 뉴클레오티드 역 말단 반복부 (inverted terminal repeat, ITR)를 포함하여 길이가 약 4.7 kb이고 이중-가닥 DNA 게놈은 2개의 145개 뉴클레오티드 ITR을 포함하여 길이가 약 2.3 kb이다. AAV에는 여러 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열이 알려져있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_002077으로 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_{_}001401 및 Srivastava et al., J Virol, 45: 555-64 (1983)으로 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_1829으로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_001829으로 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank 승인 번호 AF085716으로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_00 1862로 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 승인 번호. AX753246 및 AX753249로 제공되고; AAVrh74 게놈; AAV-9 게놈은 Gao et al., J Virol, 78: 6381-8 (2004)로 제공되고; AAV-10 게놈은 Mol Ther 13(1): 67-76 (2006)으로 제공되고; AAV-11 게놈은 Virology, 330(2): 375-83 (2004)으로 제공되고; AAV-12의 게놈은 GenBank 승인 번호 DQ813647.1으로 제공되고; 그리고 AAV-13의 게놈은 GenBank 승인 번호 EU285562.1에 제공되어 있다. 바이러스 DNA 복제 (rep), 캡슐화/패키징 및 숙주 세포 염책체 통합을 지시하는 Cis-작용 서열은 AAV ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터 (상대 맵 위치에 대해 p5, p19, 및 p40로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 유도한다. 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)는 단일 AAV 인트론 (뉴클레오티드2107 및 2227에서)의 차등 스플라이싱과 결합되어 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질 (rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40)을 생성한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제를 담당하는 여러 효소적 특성을 가지고 있다. cap 유전자는 p40 프로모터에서 발현되며 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 인코딩한다. 대체 스플라이싱 및 비-공통 번역 시작 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 수명 주기 및 유전학은 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에서 검토되었다.

AAV는 예를 들어 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적인 독특한 기능을 가지고 있다. 배양 중 세포의 AAV 감염은 비세포변성적이며, 인간과 다른 동물의 자연 감염은 조용하고 무증상이다. 또한, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체내에서 많은 상이한 조직을 표적화할 가능성을 허용한다. 또한, AAV는 천천히 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포를 형질도입하고, 본질적으로 이러한 세포의 일생동안 전사적으로 활성인 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드에 복제된 DNA로 삽입되어 재조합 게놈을 형성할 수 있다. 또한, AAV 복제 및 게놈 캡슐화를 지시하는 신호가 AAV 게옴의 ITR 내에 포함되어 있기 때문에, 게놈의 내부 약 4.3 kb (복제 및 구조적 캡시드 단백질을 인코딩하는 rep-cap)의 일부 또는 전체가 외래 DNA로 대체될 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위해, rep 및 cap 단백질을 트랜스로 제공할 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 매우 안정적이고 강력한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 비활성화하는데 사용되는 조건 (몇 시간 동안 56 내지 65 ℃)을 쉽게 견디므로 AAV의 저온 보존이 덜 중요하다. AAV는 동결건조될 수도 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복 감염에 내성이 없다.

본 개시내용의 재조합 AAV 게놈은 적어도 하나의 엑손 44-표적화된 U7 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 플랭킹하는 하나 이상의 AAV ITR를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이 엑손 44를 표적으로 하는 안티센스 서열 각각을 포함하는 엑손 44-표적화된 U7 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 갖는 게놈뿐만 아니라 본원에 기재된 엑손 44를 표적으로 하는 안티센스 서열의 2개 이상의 각각 가능한 조합을 포함하는 엑손 44-표적화된 U7 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 갖는 게놈이 구체적으로 고안되었다. 예시된 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, U7 snRNA 폴리뉴클레오티드는 그 자신의 프로모터를 포함한다.

rAAV 게놈의 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13, AAV-rh74, 및 AAV-anc80를 포함하지만 이에 한정되지 않는 재조합 바이러스가 유도될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. 이들 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열이 당업계에 공지되어 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 프로모터 DNA는 근육-특이적 제어 요소로, 액틴 및 미오신 유전자 패밀리, 예컨대 myoD 유전자 패밀리 [Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991) 참조], 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2 [Cserjesi and Olson, Mol. Cell. Biol., 11: 4854-4862 (1991)], 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 제어 요소 [Muscat et al., Mol. Cell. Biol., 7: 4089-4099 (1987)], 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나제 서열 요소 [Johnson et al., Mol. Cell. Biol., 9:3393-3399 (1989)] 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 (MCK) 요소, 데스민 프로모터, 골격 속근 (fast-twitch) 트로포닌 C 유전자, 지근 (slow-twitch) 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자로부터 유래된 제거 요소: 저산소증-유도성 핵 인자 [Semenza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5680-5684 (1991)], 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)를 포함하는 스테로이드-유도성요소 및 프로모터 [See Mader 및 White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5603-5607 (1993)], 및 기타 제어 요소로부터 유래된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 개시내용의 DNA 플라스미드는 본 개시내용의 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, E1-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로 감염이 허용되는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 당업계의 표준이다. rAAV의 생산은 다음 구성성분이 단일 세포 (본원에서 패키징 세포로 표시됨) 내에 존재하는 것을 요구한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈과 분리된 (즉, rAAV 게놈에 없는) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 유전자는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13, AAV-rh74, 및 AAV-anc80를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있고 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. 동족 구성성분의 사용이 구체적으로 고안되었다. 위형 rAAV의 생산은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는 제WO 01/83692호에 개시되어 있다.

본 개시내용의 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 단일-가닥 게놈 또는 자기-상보적 게놈이다. 방법의 일부 구현예에서, rAAV의 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 결여되어 있다.

패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 생산에 필요한 모든 구성성분을 안정적으로 발현하는 세포주를 형성하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여되어 있는 rAAV 게놈, rAAV 게놈에서 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 네오마이신 내성 유전자와 같은 선택 가능한 마커를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈에 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링 (tailing) [Samulski et al., Proc Natl Acad Sci USA, 79:2077-81 (1982)], 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 추가 [Laughlin et al., Gene, 23:65-73 (1983)]와 같은 절차에 의해, 또는 직접적인 블런트-말단 결찰에 의해 [Senapathy et al., J Biol Chem 259:4661-6 (1984)] 박테리아 플라스미드에 도입된 바 있다. 그런 다음 패키징 세포주는 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스에 감염된다. 이 방법의 이점은 세포가 선택가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 플라스미드 보다 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스를 사용하여 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포에 도입시키는 것이다.

rAAV 생산의 일반적인 원칙들은, 예를 들어, Carter, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539 (1992); 및 Muzyczka, Curr Topics in Microbial and Immunol, 158:97-129 (1992))에서 검토되었다. 다양한 접근법이 Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); 및 Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-8 (1989); 미국 특허 번호 제5,173,414호; 제WO 95/13365호 및 대응하는 미국 특허 번호 제5,658.776호; 제WO 95/13392호; 제WO 96/17947호; 제PCT/US98/18600호; 제WO 97/09441호 (제PCT/US96/14423호); 제WO 97/08298호 (제PCT/US96/13872호); 제WO 97/21825호 (제PCT/US96/20777호); 제WO 97/06243 호 (제PCT/FR96/01064호); 제WO 99/11764호; Perrin et al., Vaccine 13:1244-50 (1995); Paul et al., Human Gene Therapy 4:609-615 (1993); Clark et al., Gene Therapy 3:1124-32 (1996); 미국 특허 번호 제5,786,211호; 미국 특허 번호 제 5,871,982호; 및 미국 특허 번호 제 6,258,595호에 기재되어 있다. 상술한 문헌들은 rAAV 생산에 관한 문헌의 해당 섹션에 특히 중점을 두고 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.

따라서 본 개시내용은 감염성 rAAV를 생산하는 패키징 세포를 제공한다. 하나의 구현예에서 패키징 세포는 안정적으로 형질전환된 암 세포, 예컨대 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포 (동족 293 계통) 일 수 있다. 다른 구현예에서, 패키징 세포는 형질전환된 암 세포가 아닌 세포, 예컨대 저계대 293 세포 (아데노바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포 (인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포 (인간 태아 섬유아세포), Vero 세포 (원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포 (붉은털원숭이 태아 폐 세포)이다.

상기 및 하기에 기재된 본 개시내용의 방법의 세포 형질도입 효율은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 퍼센트 효율일 수 있다.

rAAV는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Clark et al., Hum. Gene Ther. 10(6): 1031-9 (1999); Schenpp et al., Methods Mol. Med. 69:427-43 (2002); 미국 특허 번호 제6,566,118호; 및 제WO 98/09657호에 개시된 방법을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 핵산 분자 또는 작제물을 포함하는 rAAV를 포함하는 조성물을 고안한다. 하나의 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 snRNA를 전달하기 위한 rAAV를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 개시내용의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 rAAV를 포함한다. 조성물은 또한 희석제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 허용되는 담체 및 희석제는 수용체에게 무독성을 띄며 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 또는 다른 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리피닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계만활성제, 예컨대 Tween, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

멸균 주사 용액은 필요에 따라 위에 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 rAAV를 혼입한 후 필터 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

본 개시내용의 방법에서 투여되는 rAAV의 역가는 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체, 및 표적화되는 세포 유형(들)에 따라 달라질 것이며, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 약 1x10⁶, 약 1x10⁷, 약 1x10⁸, 약 1x10⁹, 약 1x10¹⁰, 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³ to 약 1x10¹⁴ 또는 그 이상의 ml 당 DNase 내성 입자 (DRP) 의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈 (vg) 단위로 표현될 수 있다 (즉, 각각 1x10⁷ vg, 1x10⁸ vg, 1x10⁹　vg, 1x10¹⁰　vg,　1x10¹¹　vg,　1x10¹²　vg,　1x10¹³　vg,　1x10¹⁴　vg).

일부 양태에서, 본 개시내용은 엑손 44-표적화된 snRNA를 인코딩하는 rAAV를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 서열 번호: 4-27 및 32-35 중 어느 하나에 명시된 snRNA를 인코딩하는 DNA를 이를 필요로하는 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 엑손 44-표적화된 snRNA의 전달을 위한 AAV 형질도입 세포를 제공한다.

생체내 또는 시험관내에서 표적 세포 (예를 들어, 골격근)에 rAAV를 형질도입하는 방법이 본 개시내용에 의해 고안되었다. 상기 방법은 본 개시내용의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효 용량, 또는 유효 다중 용량을 이를 필요로 하는 동물 (인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 용량이 근이영양증, 예를 들어 DMD가 발병하기 전에 투여되는 경우, 투여는 예방 차원이다. 상기 용량이 근이영양증이 발명한 후에 투여되는 경우, 투여는 치료 차원이다. 본 개시내용의 실시예에서, 유효 용량은 치료 대상인 근이영양증과 관련된 적어도 하나의 증상을 완화 (제거 또는 감소) 시키고, 근이영양증, 예를 들어 DMD의 진행을 늦추거나 예방하고, 근이영양증 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 예방하고, 질환의 정도를 축소시키고, 질환의 차도 (부분적 또는 전체적)를 초래하고, 및/또는 장애 또는 질환을 앓고 있는 대상체의 생존을 연장시키는 용량이다.

조성물의 유효 용량의 투여는 근육내, 비경구, 정맥내, 척수강내, 경구, 볼 안쪽, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구내, 직장 또는 질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계의 표준 경로에 의할 수 있다. 본 개시내용의 rAAV의 AAV 구성성분 (특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로 (들) 및 혈청형 (들)은 치료 대상인 감염 및/또는 질환 및 표적 세포/조직 (들)을 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 매칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 근육내이다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 정맥내이다.

병용 요법 또한 본 발명에서 고려된다. 본원에서 사용된 바와 같이 병용에는 동시 치료 또는 순차적 치료가 포함된다. 본 개시내용의 방법과 표준 의학적 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드 및/또는 면역억제제)의 조합이 구체적으로 고안되며, 이는 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 번호 제 WO 2013/016352호에 개시된 것과 같은 다른 요법과의 조합이다.

조성물의 유효 용량의 투여는 근육내, 비경구, 정맥내, 척수상내, 경구, 볼 안쪽, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구내, 직장 또는 질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계의 표준 경로에 의할 수 있다. 본 개시내용의 rAAV (특히 AAV ITRs 및 캡시드 단백질)의 AAV 구성성분의 투여 경로 (들) 및 혈청형 (들)은 치료 대상인 감염 및/또는 질환 및 엑손 44 표적화된 U7-기반 snRNA를 발현하는 표적 세포/조직 (들)을 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 매칭될 수 있다.

특히, 본 개시내용의 rAAV의 실제 투여는 일부 양태에서 rAAV 벡터를 대상체의 표적 조직 내로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 달성된다. 본 개시내용에 따른 투여는 근육, 간, 뇌척수액, 또는 혈류로의 주사를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 단순히 인산염 완충 식염수에 rAAV를 재현탁시키는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하는데 충분한 것으로 입증되었으며, rAAV와 함께 공동-투여될 수 있는 담체 또는 기타 구성성분에 대해 알려진 제한은 없다 (그러나 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV와 함께 정상적인 방식으로 피해야 한다). 일부 양태에서, rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 근육과 같은 특정 관심 표적 조직을 표적으로 하도록 변형된다. 예를 들어, 그 개시내용이 본원에 참조로 통합된 제WO 02/053703호를 참조한다. 일부 양태에서, 조성물 또는 약제학적 조성물은 주사용 제제로서 또는 경피 수송에 의해 근육에 전달되는 국소 제제로서 제조된다. 근육내 주사 및 경피 수송 모두를 위한 수만은 제형이 이전에 개발되었으며 본 개시내용을 실시하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, rAAV는 투여 및 취급의 용이성을 위해 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 사용된다.

일부 양태에서, 근육내 주사의 목적을 위해, 보조제, 예컨대 참깨 또는 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜 중 용액 및 멸균 수용액이 사용된다. 다양한 측면에서 이러한 수용액은 원하는 경우 완충되고, 액체 희석제는 식염수 또는 포도당과 등장성이 된다. 일부 양태에서, 유리산 (DNA는 산성 포스페이트기를 함유함) 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 rAAV의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록스프로필셀룰로오스와 적합하게 혼합된 물에서 제조된다. 다양한 양태에서, rAAV의 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 (들) 및 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조된다. 일반적인 보관 및 사용 조건에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업계의 표준 기술에 의해 쉽게 얻을 수 있다.

주사용으로 적합한 약제학적 형태를 포함하는 제형은 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 무균 상태여야 하며 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건에서 안정해야 하며 미생물, 예컨대 박테리아 및 곰팡이의 오염 작용에 대비하여 보존되어야 한다. 일부 양태에서, 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질이다. 일부 양태에서, 적절한 유동성은 코팅체, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 미생물 작용을 방지하는 것은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 일부 양태에서, 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시키는 것은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 사용에 의해 이루어질 수 있다.

멸균 주사 용액은 일부 양태에서 필요에 따라 위에 열겨된 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매의 필요한 양의 rAAV를 혼입한 후 필터 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 위에 열겨된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

일부 양태에서, rAAV를 사용한 형질도입은 시험관내에서 수행된다. 하나의 구현예에서, 예를 들어, 원하는 표적 근육 세포가 대상체로부터 제거되고, rAAV로 형질도입되고 대상체에 재도입된다. 대안적으로, 일부 측면에서 동계 (syngeneic) 또는 이종 (xenogeneic) 근육 세포는 이들 세포가 대상체에게 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우에 사용된다.

형질도입된 세포를 대상체로 형질도입 및 재도입하기 위한 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 하나의 구현예에서, 세포는 예를 들어 적절한 배지에서 근육 세포와 rAAV를 조합하거나, 서던 블롯 및/또는 PCR 과 같은 당업계의 통상적인 기술의 사용하여 관심 DNA를 보유하는 세포에 대해 스크리닝하거나, 선택가능한 마커를 사용함으로써 시험관내 형질도입된다. 일부 양태에서, 형질도입된 세포는 이어서 약제학적 조성물을 포함하는 조성물로 제형화되고, 상기 조성물은 근육내, 정맥내, 피하, 및/또는 복강내 주사와 같은 다양한 기술에 의해 또는 예를 들어 카테터 (catheter)를 사용하여 평활근 및 심장 근육에 주사함으로써 대상체로 도입된다.

본 개시내용은 억제성 RNA를 인코딩하는 rAAV 및 엑손 44를 표적으로 하고 엑손 44를 스키핑하는 snRNA를 포함하는 억제성 RNA의 조합을 인코딩하는 rAAV의 유효 용량 (또는 본질적으로 동시에 투여되는 용량 또는 간격을 두고 투여되는 용량)을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 세포에 rAAV를 형질도입하는 것은 엑손 44 U7-기반 snRNA의 지속적인 발현을 초래한다. 용어 "형질도입"은 본 발명의 복제-결핍 rAAV를 통해 생체내 또는 시험관내에서 하나 이상의 엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 수용체 세포에 투여/전달하여 수용체 세포에 의한 하나 이상의 엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물의 발현을 초래하는 것을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서 본 개시내용은 엑손 44 U7-기반 snRNA를 발현하는 rAAV를 대상체에게 투여/전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.

이러한 방법에는 본 개시내용의 하나 이상의 rAAV을 사용하여 혈액 및 혈관계, 중추신경계, 및 조직 (조직, 예컨대 근육, 기관, 예컨대 간 및 뇌, 및 땀샘, 예컨대 침샘을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 형질도입은 조직 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행된다. 예를 들어, 본 개시내용의 하나의 구현예는, 액틴 및 미오신 유전자 패밀리, 예컨대 myoD 유전자 패밀리 [Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991) 참조], 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2 [Cserjesi and Olson, Mol. Cell. Biol., 11: 4854-4862 (1991)], 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 제어 요소 [Muscat et al., Mol. Cell. Biol., 7: 4089-4099 (1987)], 심장 액틴 유전자, 금육 크레아틴 키나제 서열 요소 [Johnson et al., Mol. Cell. Biol., 9:3393-3399 (1989)] 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 (MCK) 요소, 데스민 프로모터, 골격 속근 (fast-twitch) 트로포닌 C 유전자, 지근 (slow-twitch) 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자로부터 유래된 제거 요소: 저산소증-유도성 핵 인자 [Semenza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5680-5684 (1991)], 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)를 포함하는 스테로이드-유도성요소 및 프로모터 [Mader et al., Proc Natl Acad Sci. USA 90: 5603-5607 (1993) 참조], 및 기타 제어 요소로부터 유래된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 근육 특이적 제어 요소에 의해 지시되는 근육 세포 및 근육 조직을 형질도입하는 방법을 제공한다.

AAV는 모든 디스트로핀 영향을 받는 기관을 표적으로 하기 때문에, 본 개시내용은 억제성 RNA를 인코딩하는 DNA를 대상체의 모든 세포, 조직, 및 기관에 전달하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 혈액 및 혈관계, 중추신경계, 근육 조직, 심장 및 뇌는 생체내 DNA 전달을 위한 매력적인 표적이다. 본 개시내용은 DMD 엑손 44 발현에 영향을 미치고 (예를 들어 스킵, 녹다운 또는 발현 억제) DMD 단백질의 발현을 변경하기 위해 형질도입된 세포로부터의 snRNA의 지속된 발현을 포함한다. 일부 양태에서, 근육 조직은 본 개시내용의 핵산 분자 및 벡터의 전달을 위해 표적화된다. 근육 조직은 생체내 DNA 전달을 위한 매력적인 표적인데, 그 이유는 근육 조직은 필수적인 기관이 아니며 접근하기 쉽기 때문이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 형질도입된 근섬유로부터 하나 이상의 엑손 44 U7-기반 snRNA의 지속적인 발현을 고안한다. "근육 세포" 또는 "근육 조직"은 모든 종류의 근육 (예를 들어, 골격근 및 평활근, 예를 들어 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직으로부터 유래됨)으로부터 유래된 세포 또는 세포군을 의미한다. 일부 양태에서, 이러한 근육 세포는 분화되거나 분화되지 않은, 예컨대 근모세포, 근세포, 근관, 심근세포 및 심근아세포이다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포를 엑손 44-표적화된 U7 snRNA를 인코딩하는 rAAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 DMD 유전자의 오픈 판독 프레임을 복원하는 방법을 제공하며, 상기 RNA는 서열 번호: 4-27 및 32-35 중 어느 하나 중 적어도 하나 이상에 명시된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, 엑손 44의 스키핑은 적어도 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 또는 100 퍼센트만큼 엑손 44의 배제 또는 억제를 초래한다.

따라서, 본 개시내용은 유효 용량 (또는 본질적으로 동시에 투여되거나 간격을 두고 투여되는 용량)의 엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물 또는 하나 이상의 엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 인코딩하는 게놈을 포함하는 rAAV를 이를 필요로하는 대상체 (예를 들어, 근이영양증, 예컨대 DMD를 앓고 있는 대상체 또는 환자)에게 투여하는 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 환자의 근이영양증을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, "치료하는"은 듀시엔형 근이영양증 (근육 소모, 근육 약화, 골격근 문제, 심장 기능 이상, 호흡 곤란, 언어 및 연하 장애 (구음 장애 및 연하곤란) 또는 인지 장애를 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 포함하는 근이영양증의 하나 이상의 증상을 개선, 억제, 또는 예방하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 치료 방법은 대상체에서 디스트로핀 단백질의 증가된 발현 또는 생리학적으로 또는 기능적으로 활성인 디스트로핀 단백질의 증가된 발현 또는 변경된 형태 또는 단편을 초래한다. 특정 양태에서, 치료 방법은 대상체에서 이영양성 병리의 진행을 억제한다. 일부 양태에서, 치료 방법은 대상체의 근육 기능을 향상시킨다. 일부 양태에서, 근육 기능의 향상은 근력이 향상되는 것이다. 일부 양태에서, 근육 기능의 향상은 서있거나 걸을 때 안정성이 향상되는 것이다. 근력의 향상은 최대 자발적 등척성 수축 시험 (MVICT)과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 결정된다. 어떤 경우에는, 근육 기능의 향상은 서있거나 걸을 때 안정성이 향상되는 것이다. 일부 양태에서, 안정성 또는 강도의 향상은 6분-보행 검사 (6MWT), 100미터 달리기/보행 검사, 또는 일정 시간 계단 오르기와 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 결정된다.

일부 구현예에서, 치료 방법은 벡터를 사용하지 않고 하나 이상의 엑손 44 U7-기반 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 rAAV를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rAAV의 게놈은 하나 이상의 엑손 44 U7-기반 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 근이영양증, 예컨대 DMD와 관련된 이영양증 병리의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 벡터를 사용하지 않고 하나 이상의 엑손 44 U7-기반 snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 rAAV를 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 rAAV의 게놈은 엑손 44-표적화된 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함한다.

본원에 인용된 공보, 특허 공보, 특허, 및 기타 참고 문헌은 본 개시내용과 모순되지 않는 범위 내에서 그 전체가 참조로 통합된다.

본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에 달리 명시되지 않는 한 단지 범위 및 각 끝점에 속하는 개별 값을 개별적으로 참조하기 위한 약식 방법으로 사용하기 위한 것이며, 각각의 개별 값 및 끝점은 본원에 개별적으로 인용된 바와 같이 본 명세서에 통합된다.

본원에 설명된 모든 방법은 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행된다. 본원에 제공된 모든 실시예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구하지 않는 한 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야 함을 이해해야 한다.

실시예

본 개시내용의 추가 양태 및 세부사항은 제한적이기 보다는 예시적인 것으로 의도되는 하기 실시예들로부터 명백할 것이다.

실시예 1

엑손 44를 표적으로 하는 서열의 설계 및 생성

엑손 44의 스키핑을 유도하는 U7snRNA 시스템의 능력을 시험하기 위해, 6개의 AAV1-U7snRNA를 만들었다. 안티센스 서열 (즉, 서열 번호: 8-27)은 mRNA로부터의 엑손 (예를 들어, 엑손 44)을 배제하기 위해 "엑손 정의" (분기점, 스플라이스 공여체 또는 수용체, 및 엑손 스플라이싱 인핸서)에 결합하도록 설계하였다. 이 "엑손 정의"는 온라인 소프트웨어 Human Splicing Finder (HSF, http colon-slash-slash-www.umd.be-slash-HSF-slash-HSF.shtml )를 사용하여 예측할 수 있다. 본 발명자들은 이 소프트웨어를 사용하여 다양한 표적 서열 및 다양한 길이 및 다양한 결합 부위를 갖는 다양한 표적화 서열을 설계하였다. 서열은 상업적으로 합성되었다 (GenScript).

하기 표 (즉, 아래의 표 5)는 DMD 유전자의 엑손 44의 서열 (뉴클레오티드 및 아미노산) (및 엑손 44 주변 인트론 서열), DMD 유전자 상의 표적 서열 (엑손 44 서열 (서열 번호: 1에서 대문자) 및 엑손 44 주변 인트론 서열 (서열 번호: 1에서 소문자)), DMD 유전자 상의 서열 (엑손 44 및 엑손 44 주변 인트론 서열)을 표적화하는데 사용되는 안티센스 서열, DMD 유전자 상의 서열 (엑손 44 및 엑손 44 주변 인트론 서열)을 표적화하는데 사용되는 안티센스 서열의 역 상보체, DMD 유전자 상의 서열 (엑손 44 및 엑손 44 주변 인트론 서열)을 표적화하는데 사용되는 안티센스 서열을 포함하는 U7 서열, 및 DMD 유전자 상의 서열 (엑손 44 및 엑손 44 주변 인트론 서열)을 표적화하는데 사용되는 안티센스 서열을 포함하는 U7 서열의 역 상보체를 제공한다.

서열 번호: 16-27에 명시된 각각의 작제물을 함유하는 플라스미드를 증폭시키고, 재배열하고, 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터 (즉, ITRS 사이)에 삽입하기 위해 네이션와일드 칠드런스 병원 (Nationwide Children's Hospital)의 바이러스 코어 벡터 (VVC)로 보냈다. 시험관내 형질도입 연구를 위해, AAV1 캡시드를 사용하여 작제물을 생산하였다. 생체내 연구를 위해, 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 임의의 AAV 캡시드로 생산하였다.

실시예 2

실험에 사용된 재료 및 방법

세포주의 생성

엑손 45 결실, 엑손 44 중복, 또는 엑손 45-56 결실을 앓는 3명의 환자로부터 피부 생검물을 얻었다. 이러한 피부 생검물은 섬유아세포에 hTERT (세포의 불멸화를 위함) 및 MyoD (세포를 근관으로 전환분화하도록 강제함) 둘 모두의 전달을 위한 렌티바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 3개의 세포주로 개발되어 디스트로핀을 발현하는 근원성 섬유아세포 (FibroMyoD)를 생성하였다. FibroMyoD는 본원에 기재된 바와 같이 다양한 rAAV 제제로 감염되었다. 10cm 접시 당 2.5e11 바이러스 게놈을 사용하였다. 4 내지 8일 후, 세포를 채취하여 RNA 및 단백질 추출을 수행하였다.

hDMD/mdx del45 마우스 모델

hDMD/mdx del45 마우스 모델 (본원에서 "hDMDdel45 mdx" 모델 또는 "hDMD/del45 mdx" 모델로도 지칭됨)은 Dr. Melissa Spencer [Young et al., J. Neuromuscul. Dis. 2017; 4(2): 139-145 (2017)]로부터 얻었다. 이 마우스에는 인간 버전의 DMD 유전자가 함유되어 있지만 hDMD 마우스에서 인간 DMD 유전자의 엑손 45가 결실되어 프레임 외 전사가 발생한다. 이 마우스는 또한 뮤린 DMD 유전자에 정지 돌연변이를 함유한다. 전체적으로, 이들 2개의 돌연변이는 이 마우스 모델이서 인간 또는 뮤린의 디스트로핀 발현을 유발하지 않는다. hDMD/mdx del45 마우스에는 마우스 및 인간 디스트로핀이 모두 결여되어 있기 때문에, 마우스는 전신의 여러 근육에서 이영양성 근육 병리를 나타낸다. 이 마우스 모델은 본원에 기재된 다양한 실험에 사용된다.

RNA 추출

세포를 원심분리한 후 세포 펠렛에 대해 RNA 추출을 수행하였다. 펠렛을 헹구고 1ml의 TRIzol (Life Technologies)을 첨가하였다. 세포 용해물을 피펫팅으로 균질화한 다음 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 1.5ml 튜브로 옮기고 1ml의 TRIzol 당 0.2ml의 클로로포름을 첨가하였다. 용해물/TRIzol/클로로포름 혼합물을 15초 동안 수동으로 진탕하였다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 2-3분 동안 인큐베이션하고 12,000g에서 15분 동안 원심분리하였다 (+4℃). 수상 (즉, 상부)를 채취하여 새 튜브로 옮겼다. 0.5ml의 이소프로판올 (TRIzol의 ml 당)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 방치하였다. 그런 다음 4℃에서 10분 동안 12,000g에서 원심분리한 후 상청액을 제거하고 펠렛을 1ml의 75% EtOH (TRIzol의 ml 당)로 세척하였다. 원심분리 (4℃에서 5분 동안 7,500g) 후, 펠렛을 공기 건조하고 RNA를 60℃에서 10분 동안 RNAse가 없는 물에 재현탁하였다.

역전사 및 PCR 증폭

이 프로토콜은 제조업체에 최적화된 프로토콜 (맥시마 역전사효소 (Maxima Reverse Transcriptase), (Thermo Fisher Scientific)을 기반으로 한다. 1μg의 RNA가 cDNA로 전환되었다. 2개의 PCR 프라이머를 증폭에 사용하였다 (즉, Fw: CTCCTGACCTCTGTGCTAAG (서열 번호: 30); Rv: ATCTGCTTCCTCCAACCATAAAAC (서열 번호: 31)). PCR Master Mix 시스템 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 60℃의 어닐링 온도로 PCR 증폭을 사용하였다.

단백질 추출 및 웨스턴 블롯팅

용해 완충액 (150mM Tris-NaCl, 1%NP-40, 디지토닌 (Sigma) 및 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (1860932, Thermo Inc.))를 사용하여 마우스 근육 용해물을 제조하였다. 완충액 중의 용해물을 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 완충액의 용해물을 20분 동안 14000g에서 원심분리하였다. 상청액을 채취하였다. BCA 단백질 검정 키트 (Pierce®)를 사용하여 단백질 정량 분석을 수행하였다. 그런 다음 상청액을 기존 SDS-Page 완충액과 혼합하고 100℃에서 5분 동안 끓였다. 150μg의 각 단백질 샘플을 80V (4℃)에서 16시간 동안 프리캐스트 3-8% 트리스-아세테이트 겔 (Tris-Acetate gel) (NuPage, Life Science)에서 런온 (run on)하였다. 겔을 300mA에서 밤새 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다.

디스트로핀의 C-말단에 대한 토끼 다클론 항체를 사용하였다 (1:250, PA1-21011, Thermo Fisher Scientific; 또는 1:400, 15277, Abcam). 알파-액티닌 (1:5000, A-7811, Sigma)을 로딩 대조군으로 사용하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 막을 세척하고 (TBS, TBST에서 0.1% Tween을 사용하여 5 Х 5 분) 1:1000 희석으로 2차 항체에 노출시켰다 (실온에서 60분). 모든 항체를 ½ Odyssey 차단 완충액 (Licor®) 및 ½ TBST에 희석하였다. 항-마우스 IgG (H + L) (IRDye® 680CW 접합체) 및 항-토끼 IgG (H + L) (IRDye® 800CW 접합체) (Licor®)를 1:1000 희석으로 사용하였다. TBS에서 0.1% Tween을 사용하여 5 Х 5 분 세척을 수행한 후 ddH₂O 침지를 수행하였다. 2개의 동시 IRDye® 신호를 LI-COR Odyssey® NIR를 사용하여 스캔하였다. 근육 절편의 경우, 각 근육에 대한 면역블롯팅을 수행하였다.

면역조직화학

동결된 근육을 8-10 마이크론으로 절단하고 절편을 30분 동안 염색하기 전에 공기 건조시켰다. 절편을 PBS에서 재수화하고 정상 염소 혈청 (1:20)으로 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 마우스 절편에 대해서만 실온에서 항-마우스 IgG 비접합 fab 단편과 함께 2시간 인큐베이션하였다. 1차 항체를 밤새 방치하였다: 디스트로핀 (1:250, PA1-21011, Thermo Fisher Scientific). 세척 후, 절편을, 즉 Alexa Fluor 488 또는 568-접합된 적절한 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다 (LifeScience). 슬라이드는 Fluoromount와 DAPI (벡터 Labs)로 덮였다. 관찰은 Olympus BX61를 사용하여 실현되었다. 획득은 DP 컨트롤러 (Olympus)를 사용하여 이루어졌다.

실시예 3

엑손 44 (AAV1.U7△ex44)를 표적으로 하는

rAAV 작제물의 시험관내 형질감염 및 발현

엑손 45 결실, 엑손 44 중복, 또는 엑손 45-56 결실을 앓는 3명의 환자로부터 피부 생검물을 얻었다. 이러한 피부 생검물은 섬유아세포에 hTERT (세포의 불멸화를 위함) 및 MyoD (세포를 근관으로 전환분화하도록 강제함) 둘 모두의 전달을 위한 렌티바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 3개의 세포주로 개발되어 디스트로핀을 발현하는 근원성 섬유아세포 (FibroMyoD)를 생성하였다. FibroMyoD는 4가지 다른 rAAV 제제로 감염되었다.

표적화를 위해 4개의 상이한 서열 [즉, 엑손 44 또는 엑손 44 및 엑손 44주변 인트론 서열에 존재하는 서열 번호: 4-7 (표 2 참조)]을 선택하였다. U7snRNA 작제물은 표적 서열에 결합하도록 설계된 서열 번호: 8-11 각각을 포함하도록 설계되었다. 각각의 U7snRNA 작제물 (즉, 서열 번호: 16-25)을 AAV1에 클로닝하여 상기 기재된 FibroMyoD로부터 생성된 근모세포에서 엑손-스키핑 효율을 평가하였다.

10cm 접시 당 2.5e11 바이러스 게놈을 사용하였다. 4 내지 8일 후, 세포를 채취하여 RNA 및 단백질 추출을 수행하였다. 엑손 스키핑을 관찰하기 위해 RT-PCR 실험을 3회 수행하였다. 모두 4개의 AAV1.U7-안티센스 (즉, 서열 번호: 20-23 각각을 포함하는 AAV)는 엑손 44 스키핑을 거의 100% 매개할 수 있었다 (도 1a-c). 유사하게, 3개의 AAV1.U7-안티센스 (즉, 서열 번호: 23, 26, 및 27 각각을 포함하는 AAV)는 엑손 44 스키핑을 거의 100% 매개할 수 있었다 (도. 1d-f).

엑손 4의 효율적인 스키핑이 BP43AS44, LESE44, SESE44, 및 SD44를 포함하는 작제물에 의해 이미 입증되었지만, SD44, 즉 U7.SD44의 4개의 카피가 단일 자기-상보적 (sc) AAV1 벡터 (U7-4xSD44"라고 함) 벡터에 복제되었다. 또한, U7.SD44에 의해 매개되는 엑손 스키핑이 이미 매우 효율적이기 때문에, U7.SD44의 단 하나의 카피와 추가된 스터퍼 서열, 즉 무작위 비-코딩 DNA를 운반하는 작제물도 생성되었다.

10cm 접시 당 2.5e11 바이러스 게놈을 사용하였다. 4 내지 8일 후, 세포를 채취하여 RNA 및 단백질 추출을 수행하였다. 엑손 스키핑을 관찰하기 위해 RT-PCR 실험을 3회 수행하였다. 3개의 AAV1.U7-안티센스 (즉, 서열 번호: 23, 26, 및 27 각각을 포함하는 AAV)를 사용하였다. 서열 번호: 26 (4xSD44) 및 27 (SD44-스터퍼) 각각을 포함하는 AAV는 엑손 44 스키핑을 거의 100% 매개할 수 있었다 (도 1d-f). AAV1.U7-SD44 (서열 번호: 23을 포함하는 AAV)를 이 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다.

실시예 4

엑손 44 스키핑 (AAV9.U7△ex44)을 유도하는 U7-snRNA를 포함하는

rAAV의 근육내 전달이 증가된 디스트로핀 발현을 초래한다

6마리의 2개월령 hDMD/mdx del45 마우스에 AAV1.U7-SD44 (서열 번호: 23을 포함하는 AAV), AAV1.U7-SD44-스터퍼 (서열 번호: 27를 포함하는 AAV) 및 AAV1.U7-4xSD44 (서열 번호: 26을 포함하는 AAV)를 2.5 e11 AAV1 바이러스 입자로 각각의 전방 전방 경골 (TA) 근육에 주사하였다. 실험은 2마리의 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (작제물 당 n=4 TA 근육). 바이러스 주사 1개월 후, 3개월령 마우스로부터 근육을 추출하고 RT-PCR로 인간 디스트로핀 발현을 측정하여 엑손 스키핑 요율을 결정하였다 (도 2). 도 2는 위에 명시된 세 가지 상이한 rAAV 바이러스 벡터를 주사한 지 1개월 후 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 DMD 엑손 44의 효율적인 스키핑을 도시한다. 이들 RT-PCR 결과는 마우스 #57 및 #58 (미처리된 마우스)에서 엑손 스키핑의 부재; 마우스 #60 및 #61 (U7-SD44-스터퍼, 즉, 서열 번호: 27를 포함하는 AAV가 주사된 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑; 마우스 #66 및 #72 (U7-SD44, 즉, 서열 번호: 23을 포함하는 AAV가 주사된 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑; 및 마우스 #84 (U7-4xSD44, 즉, 서열 번호: 26을 포함하는 AAV가 주사된 마우스)에서 효율적인 엑손 스키핑을 입증하였다. 블랙 6 (Bl6)은 인간 DMD 유전자를 함유하지 않는 야생형 마우스이므로 인간 DMD에 대한 음성 대조군이다.

디스트로핀 발현은 면역형광법에 의해 확인하였다 (도 3a-e). 도 3a-e는 세 가지 상이한 rAAV 바이러스 벡터를 주사한 지 1개월 후 2개월령 hDMD/mdx del45 마우스의 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 디스트로핀의 면역형광 발현을 도시한다. 실험은 2마리의 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (작제물 당 n=4 TA).

이러한 면역 실험 결과는 #58 (미처리된 hDMD/mdx del45 마우스; 도 3a); 블랙 6 (Bl6) 대조군 마우스 (도 3b), 즉, 인간 DMD 유전자를 함유하지 않는 Bl6 마우스로부터 얻어지고; 그러나, 이 면역형광 실험에 사용된 항체는 마우스 #72 (U7.SD44가 주사된 마우스; 도 3c); 마우스 #60 (U7-SD44스터퍼가 주사된 마우스; 도 3d); 및 마우스 #84 (U7-4xSD44가 주사된 마우스) (도 3e)에서 인간 및 마우스 디스트로핀을 모두 인식한다.

1개월 후, 근육의 면역염색은 세 가지 rAAV 벡터 모두로 바이러스 감염 후에 디스트로핀이 발현되었음을 나타내며, SD44-스터퍼 벡터 (U7-SD44-스터퍼, 즉, 서열 번호: 27를 포함하는 AAV가 주사된 마우스; 도 3d) 및 4x-SD44 벡터 (U7-4xSD44, 즉, 서열 번호: 26을 포함하는 AAV가 주사된 마우스; 도 3e)가 근육에서 가장 높은 수준의 디스트로핀 발현을 초래하는 것으로 나타났다.

디스트로핀 발현은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다 (도 4). 도 4는 3개의 상이한 rAAV 바이러스 벡터를 주사한 지 1개월 후 hDMD/mdx del45 마우스의 전방 경골 (TA) 근육에서 인간 디스트로핀의 웨스턴 블롯 발현을 도시한다. 실험은 2마리의 마우스의 각 TA에서 수행하였다 (작제물 당 n=4 TA). 1개월 후, 웨스턴 블롯 결과는디스트로핀이 세 가지 rAAV 바이러스 벡터 모두로 감염 후 발현되었음을 나타내며, SD44-스터퍼 벡터는 근육에서 가장 높은 수준의 디스트로핀 발현을 초래하는 것으로 나타났다. 이러한 웨스턴 블롯 결과는 마우스 #57 및 #58 (미처리된 마우스); 마우스 #60 및 #61 (U7.SD44-스터퍼, 즉, 서열 번호: 27을 포함하는 AVV가 주사된 마우스); 마우스 #66 및 #72 (U7.SD44, 즉, 서열 번호: 23을 포함하는 AVV가 주사된 마우스) 및 마우스 #84 (U7.4xSD44, 즉, 서열 번호: 26을 포함하는 AVV가 주사된 마우스)로부터 얻었다. 이 웨스턴 블롯에 사용된 항체가 인간 및 마우스 디스트로핀을 모두 인식하기 때문에 디스트로핀은 디스트로핀 Bl6 대조군에 의해 발현된다.

따라서, U7.SD44 (서열 번호: 23을 포함하는 AVV), U7.4xSD44 (서열 번호: 26을 포함하는 AVV), 및 U7.SD44-스터퍼 (서열 번호: 27을 포함하는 AVV)를 포함하는 세 가지rAAV 벡터 모두에서 AAV.U7snRNA-안티센스의 전달은 엑손 44에 인접한 인트론 서열을 표적화하는 것을 포함하여 엑손 44를 표적화함으로써 디스트로핀 발현을 유도하였다. 모든 작제물이 강력한 디스트로핀 발현을 유도하는 강력한 엑손 스키핑을 매개하는 반면, SD44-스터퍼 작제물 및 4x-SD44 작제물 ((도 3d-e 및 도 4)을 포함하는 rAAV는 이러한 실험에서 다른 것들보다 더 효율적인 것으로 나타났다.

실시예 5

엑손 44 스키핑 (AAV9.U7△ex44)을 유도하는 U7-snRNA를 포함하는

rAAV의 전신 전달은 증가된 디스트로핀 발현을 초래한다

10마리의 hDMDdel45/mdx 마우스 (2개월령)에 AAV9.U7-SD4-스터퍼 또는 AAV9.U7-4X-SD44 (각각 AAV9로 복제된 서열 번호: 27 및 26)를 측두 정맥 (즉, 신생아 마우스) 또는 꼬리 정맥 (즉 2개월령 마우스)에 3e13 vg/kg 내지 2e14 vg/kg 범위의 다양한 용량으로 주사하였다. 이러한 바이러스 벡터로 형질도입된 마우스는 주사 후 1, 3 또는 6개월에 채취되었다. 엑손 스키핑 효율은 RT-PCR, 면역형광법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 상술한 바와 같은 프로토콜을 사용하여 디스트로핀 발현을 측정함으로써 결정하였다.

본 개시내용이 특정 구현예의 관점에서 설명되었지만, 변형 및 수정이 당업자에게 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 청구범위에 나타낸 바와 같은 제한만이 본 개시내용에 적용되어야 한다.

본 출원에 언급된 모든 문헌은 참조된 내용에 특히 주의하면서 그 전체가 참조로 통합된다.

SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> EXON 44-TARGETED NUCLEIC ACIDS AND RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPRISING SAID NUCLEIC ACIDS FOR TREATMENT OF DYSTROPHIN-BASED MYOPATHIES <130> 28335/54313A/PC <150> US 62/882,216 <151> 2019-08-02 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 ttgtcagtat aaccaaaaaa tatacgctat atctctataa tctgttttac ataatccatc 60 tatttttctt gatccatatg cttttacctg caggcgattt gacagatctg ttgagaaatg 120 gcggcgtttt cattatgata taaagatatt taatcagtgg ctaacagaag ctgaacagtt 180 tctcagaaag acacaaattc ctgagaattg ggaacatgct aaatacaaat ggtatcttaa 240 ggtaagtctt tgatttgttt tttcgaaatt gtatttatct tcagcacatc tggactcttt 300 <210> 2 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 gcgatttgac agatctgttg agaaatggcg gcgttttcat tatgatataa agatatttaa 60 tcagtggcta acagaagctg aacagtttct cagaaagaca caaattcctg 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<220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 15 cuuaccuuaa gauaccauuu g 21 <210> 16 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 16 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180 aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240 acagacgcac ttccgcaaat ctgtcaaatc gcctgcaggt aaaagcatat ggatcaagaa 300 aaatttttgg agcaggtttt ctgacttcgg tcggaaaacc cctcccaatt tcactggtct 360 acaatgaaag caaaacagtt ctcttccccg ctccccggtg tgtgagaggg gctttgatcc 420 ttctctggtt tcctaggaaa cgcgtatgtg 450 <210> 17 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 17 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg 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Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 19 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180 aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240 acagacgcac ttccgcaact taccttaaga taccatttga atttttggag caggttttct 300 gacttcggtc ggaaaacccc tcccaatttc actggtctac aatgaaagca aaacagttct 360 cttccccgct ccccggtgtg tgagaggggc tttgatcctt ctctggtttc ctaggaaacg 420 cgtatgtg 428 <210> 20 <211> 1730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 20 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180 aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240 acagacgcac ttccgcaact taccttaaga taccatttga atttttggag 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cagtggctaa cagaagctga acagtttctc 180 agaaagacac aattgcggaa gtgcgtctgt agcgagccag ggaaggacat caactccact 240 ttcgatgagg gtgagatcaa ggtgccattt ccacacccct ccactgatat gtgaatcaca 300 aagcacagtt ccttattcgg ttcgataaac aatattctaa aagactatta aaaccgctcg 360 tttcttgagt ttgtgaccgc ttgtaaaggc tatgcaaatg agtcagtgct gattggctga 420 aaacagccaa tcacagctcc tatgttgtta 450 <210> 24 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 24 cacatacgcg tttcctagga aaccagagaa ggatcaaagc ccctctcaca caccggggag 60 cggggaagag aactgttttg ctttcattgt agaccagtga aattgggagg ggttttccga 120 ccgaagtcag aaaacctgct ccaaaaattt cagtggctaa cagaagctga acagtttctc 180 agaattgcgg aagtgcgtct gtagcgagcc agggaaggac atcaactcca ctttcgatga 240 gggtgagatc aaggtgccat ttccacaccc ctccactgat atgtgaatca caaagcacag 300 ttccttattc ggttcgataa acaatattct aaaagactat taaaaccgct cgtttcttga 360 gtttgtgacc gcttgtaaag gctatgcaaa tgagtcagtg ctgattggct gaaaacagcc 420 aatcacagct cctatgttgt ta 442 <210> 25 <211> 428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 25 cacatacgcg tttcctagga aaccagagaa ggatcaaagc ccctctcaca caccggggag 60 cggggaagag aactgttttg ctttcattgt agaccagtga aattgggagg ggttttccga 120 ccgaagtcag aaaacctgct ccaaaaattc aaatggtatc ttaaggtaag ttgcggaagt 180 gcgtctgtag cgagccaggg aaggacatca actccacttt cgatgagggt gagatcaagg 240 tgccatttcc acacccctcc actgatatgt gaatcacaaa gcacagttcc ttattcggtt 300 cgataaacaa tattctaaaa gactattaaa accgctcgtt tcttgagttt gtgaccgctt 360 gtaaaggcta tgcaaatgag tcagtgctga ttggctgaaa acagccaatc acagctccta 420 tgttgtta 428 <210> 26 <211> 1730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 26 cacatacgcg tttcctagga aaccagagaa ggatcaaagc ccctctcaca caccggggag 60 cggggaagag aactgttttg ctttcattgt agaccagtga aattgggagg ggttttccga 120 ccgaagtcag aaaacctgct ccaaaaattc aaatggtatc ttaaggtaag ttgcggaagt 180 gcgtctgtag cgagccaggg aaggacatca actccacttt cgatgagggt gagatcaagg 240 tgccatttcc acacccctcc actgatatgt gaatcacaaa gcacagttcc ttattcggtt 300 cgataaacaa tattctaaaa gactattaaa accgctcgtt tcttgagttt gtgaccgctt 360 gtaaaggcta tgcaaatgag tcagtgctga ttggctgaaa acagccaatc acagctccta 420 tgttgttatc tagccacata cgcgtttcct aggaaaccag agaaggatca aagcccctct 480 cacacaccgg ggagcgggga agagaactgt tttgctttca ttgtagacca gtgaaattgg 540 gaggggtttt ccgaccgaag tcagaaaacc tgctccaaaa attcaaatgg tatcttaagg 600 taagttgcgg aagtgcgtct gtagcgagcc agggaaggac atcaactcca ctttcgatga 660 gggtgagatc aaggtgccat ttccacaccc ctccactgat atgtgaatca caaagcacag 720 ttccttattc ggttcgataa acaatattct aaaagactat taaaaccgct cgtttcttga 780 gtttgtgacc gcttgtaaag gctatgcaaa tgagtcagtg ctgattggct gaaaacagcc 840 aatcacagct cctatgttgt tatctagcca catacgcgtt tcctaggaaa ccagagaagg 900 atcaaagccc ctctcacaca ccggggagcg gggaagagaa ctgttttgct ttcattgtag 960 accagtgaaa ttgggagggg ttttccgacc gaagtcagaa aacctgctcc aaaaattcaa 1020 atggtatctt aaggtaagtt gcggaagtgc gtctgtagcg agccagggaa ggacatcaac 1080 tccactttcg atgagggtga gatcaaggtg ccatttccac acccctccac tgatatgtga 1140 atcacaaagc acagttcctt attcggttcg ataaacaata ttctaaaaga ctattaaaac 1200 cgctcgtttc ttgagtttgt gaccgcttgt aaaggctatg caaatgagtc agtgctgatt 1260 ggctgaaaac agccaatcac agctcctatg ttgttatcta gccacatacg cgtttcctag 1320 gaaaccagag aaggatcaaa gcccctctca cacaccgggg agcggggaag agaactgttt 1380 tgctttcatt gtagaccagt gaaattggga ggggttttcc gaccgaagtc agaaaacctg 1440 ctccaaaaat tcaaatggta tcttaaggta agttgcggaa gtgcgtctgt agcgagccag 1500 ggaaggacat caactccact ttcgatgagg gtgagatcaa ggtgccattt ccacacccct 1560 ccactgatat gtgaatcaca aagcacagtt ccttattcgg ttcgataaac aatattctaa 1620 aagactatta aaaccgctcg tttcttgagt ttgtgaccgc ttgtaaaggc tatgcaaatg 1680 agtcagtgct gattggctga aaacagccaa tcacagctcc tatgttgtta 1730 <210> 27 <211> 1933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 27 cacatacgcg tttcctagga aaccagagaa ggatcaaagc ccctctcaca caccggggag 60 cggggaagag aactgttttg ctttcattgt agaccagtga aattgggagg ggttttccga 120 ccgaagtcag aaaacctgct ccaaaaattc aaatggtatc ttaaggtaag ttgcggaagt 180 gcgtctgtag cgagccaggg aaggacatca actccacttt cgatgagggt gagatcaagg 240 tgccatttcc acacccctcc actgatatgt gaatcacaaa gcacagttcc ttattcggtt 300 cgataaacaa tattctaaaa gactattaaa accgctcgtt tcttgagttt gtgaccgctt 360 gtaaaggcta tgcaaatgag tcagtgctga ttggctgaaa acagccaatc acagctccta 420 tgttgttaca tgcgtttaaa cttctgcagc tgctattgtc ttcccaatcc tcccccttgc 480 tgtcctgccc caccccaccc cccactgatc agcgagctct agtcgacggt atcgataacg 540 tgcttgatgg ccgctggtgg cgaccggtgg atcggccgcg ggtacaattc cgcagctttt 600 agagcagaag taacacttcc gtacaggcca gttaactttc tggtttttca gttcctcgtc 660 gactctaggc cgccaccgcg gtggctgatc ccgcctcgaa ccagacacgt agaaagccag 720 tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga 780 aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga 840 ctgggcgggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 900 gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgctcct gcaggactgg 960 tccacctaca acaaagctct catcaaccgt ggctccctca ctttctggct ggatgatggg 1020 gcgattcagg cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac gaggcagacc tcagcgcccc 1080 cccccccggc gcgccctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc 1140 aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga 1200 atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc 1260 ttcgcccacc ctagtagagc tttaaatctc tgtaggtagt ttgtccaatt atgtcacacc 1320 acagaagtaa ggttccttca caaagatccg gcgaatttct gccattcatc cgcttattat 1380 cacttattca ggcgtagcac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaggcgcg 1440 ccgcgaagca gcgcaaaacg cctaacccta agcagattct tcatgcaatt gtcggtcaag 1500 ccttgccttg ttgtagctta aattttgctc gcgcactact cagcgacctc caacacacaa 1560 gcagggagca gataggggat cgggagatct cccgatccgt cgacgtccct gcaggcggaa 1620 ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc cgtaattgat tactattaat aactagtcaa 1680 taatcaatgt caacgcgtat atctggcccg tacatcgcga agagtcaaga acgcgaaacg 1740 atcctcatcc tgtctcttga tcagagcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggcg 1800 agaaagccat ccagtttact ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg 1860 gcaattccgg ttcgcttgct gtccataaaa ccgcccagta gaagctgcag ttgatatctt 1920 ctcgagcctc tag 1933 <210> 28 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 28 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180 aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240 acagacgcac ttccgcaaaa tttttggagc aggttttctg acttcggtcg gaaaacccct 300 cccaatttca ctggtctaca atgaaagcaa aacagttctc ttccccgctc cccggtgtgt 360 gagaggggct ttgatccttc tctggtttcc taggaaacgc gtatgtg 407 <210> 29 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 29 cacatacgcg tttcctagga aaccagagaa ggatcaaagc ccctctcaca caccggggag 60 cggggaagag aactgttttg ctttcattgt agaccagtga aattgggagg ggttttccga 120 ccgaagtcag aaaacctgct ccaaaaattt tgcggaagtg cgtctgtagc gagccaggga 180 aggacatcaa ctccactttc gatgagggtg agatcaaggt gccatttcca cacccctcca 240 ctgatatgtg aatcacaaag cacagttcct tattcggttc gataaacaat attctaaaag 300 actattaaaa ccgctcgttt cttgagtttg tgaccgcttg taaaggctat gcaaatgagt 360 cagtgctgat tggctgaaaa cagccaatca cagctcctat gttgtta 407 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 30 ctcctgacct ctgtgctaag 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 31 atctgcttcc tccaaccata aaac 24 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 32 uuucuugauc cauaugcuuu uaccugcagg cgauuugaca gau 43 <210> 33 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 33 ucaguggcua acagaagcug aacaguuucu cagaaagaca caa 43 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 34 ucaguggcua acagaagcug aacaguuucu cagaa 35 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 35 caaaugguau cuuaagguaa g 21

Claims

DMD 유전자의 엑손 44를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합하거나 이에 상보적인 핵산 분자로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1 또는 2에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되거나 서열번호: 3에 명시된 아미노산 서열을 인코딩하는, 핵산 분자.
제1항에 있어서, 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 또는 35에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나에 결합하거나 이에 상보적인, 핵산 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 32, 33, 34, 또는 35에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 핵산 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28에 명시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 핵산 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 32, 33, 34, 또는 35에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 핵산 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28에 명시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 핵산 분자.
제1항 내지 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는 게놈을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV).
제7항에 있어서, 상기 게놈은 자기-상보적 게놈 또는 단일-가닥 게놈인, rAAV.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 rAAV는 rAAV-1, rAAV-2, rAAV-3, rAAV-4, rAAV-5, rAAV-6, rAAV-7, rAAV-8, rAAV-9, rAAV-10, rAAV-11, rAAV-12, rAAV-13, rAAV-rh74, 또는rAAV-anc80인, rAAV.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 결여되어 있는, rAAV.
제10항에 있어서, AAV-1 캡시드, AAV-2 캡시드, AAV-3 캡시드, AAV-4 캡시드, AAV-5 캡시드, AAV-6 캡시드, AAV-7 캡시드, AAV-8 캡시드, AAV-9 캡시드, AAV-10 캡시드, AAV-11 캡시드, AAV-12 캡시드, AAV-13 캡시드, AAV-rh74 캡시드, 또는 AAV-anc80 캡시드를 추가로 포함하는, rAAV.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 세포에 제공하는 단계를 포함하는, 세포에서 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 유도하는 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 rAAV를 세포에 제공하는 단계를 포함하는, 세포에서 DMD 유전자의 엑손 44의 스키핑을 유도하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자 중 적어도 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 rAAV 중 적어도 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선, 및/또는 예방하는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 돌연변이는 DMD 엑손 44를 수반하거나, 둘러싸거나, 이에 영향을 미치는 임의의 돌연변이인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 돌연변이는 DMD 엑손 44의 중복, 엑손 43 또는 45의 결실, 또는 엑손 45-56의 결실인, 방법.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상체에서 디스트로핀 단백질의 발현을 증가시키는, 방법.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상체의 이영양성 병리의 진행을 억제하는, 방법.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상체의 근육 기능을 향상시키는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 근육 기능의 향상은 근력 향상인, 방법.
제20항에 있어서, 상기 근육 기능의 향상은 서있거나 걸을 때의 안정성 향상인, 방법.
DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선, 및/또는 예방하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 핵산 분자의 용도.
DMD 유전자의 엑손 44 (DMD 엑손 44)를 스키핑할 수 있는 돌연변이를 갖는 대상체에서 근이영양증을 치료, 개선, 및/또는 예방하기 위한 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 rAAV의 용도.