JP2023537798A - 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置するための組成物および方法 - Google Patents

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するためのポリ核酸分子、医薬組成物、および方法が本明細書に開示される。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０２０年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９９２，０７１号および２０２０年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０６６，６５５号の利益を主張するものであり、これらは各々、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
ＲＮＡによって誘導される遺伝子サイレンシングによる遺伝子抑制は複数のレベルの制御、すなわち、転写不活性化、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって誘導されるｍＲＮＡ低下、およびｓｉＲＮＡ誘導転写減衰を提供する。いくつかの例において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、複数の細胞分裂にわたって長い永続的な効果を与える。したがって、ＲＮＡｉは、薬物標的の検証、遺伝子機能分析、経路分析、および疾患治療に役立つ実行可能な方法を表す。
参照による組み込みI
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態では、筋萎縮症、とりわけ、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）に関連する遺伝子を調節するためのポリ核酸分子および医薬組成物が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるポリ核酸分子あるいはポリ核酸分子コンジュゲートで、筋萎縮症、とりわけ、ＦＳＨＤを処置する方法も本明細書に記載される。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子にコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合断片を含むポリ核酸分子コンジュゲートであり、ポリ核酸分子コンジュゲートは、ＤＵＸ４．特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体またはその結合フラグメント、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント、モノクローｎａｌ 抗体を含む。またはその抗原結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体またはその抗原結合フラグメント。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合断片である。
特定の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖はそれぞれ独立して、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合、または少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＵＸ４の標的配列の少なくとも８個の連続する塩基にハイブリダイズする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、長さが約８から約５０ヌクレオチド、または長さが約１０から約３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ポリ核酸分子は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％を含む。配列番号１～７０または配列番号１４１～２１０から選択される配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。あるいはおよび／またはさらに、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号７１～１４０または配列番号２１１～２８０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含み、さらに、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含み、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合を含む。特定の実施形態では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される３つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第２０１９／０１９２６８１号に記載されているもののような、５’末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、２’修飾ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドはセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドはプリンヌクレオチドであるか、または２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドはピリジンヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、５’末端に少なくとも２つ、３つ、または４つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、ポリ核酸分子コンジュゲートは、標的細胞結合部分をポリ核酸部分に接続するリンカーを含む。そのような実施形態では、リンカーはＣ１～Ｃ６アルキルリンカーであるか、またはリンカーはホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーであり、マレイミド基、ジペプチド部分、安息香酸基、またはその誘導体を含む。あるいはおよび／またはさらに、リンカーは、切断可能または切断不可能なリンカーである。特定の実施形態において、ポリ核酸部分と標的細胞結合部分との間の比率は、約１：１、２：１、３：１、または４：１である。
特定の実施形態において、ポリ核酸部分は、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象における筋ジストロフィーの症状を調節する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉は、未処理細胞におけるＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量と比較して、ＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現を少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％以上減少させることを含む。代替的および／または追加的に、ＲＮＡ干渉は、細胞におけるＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸを含むまたはからなる群から選択されるマーカー遺伝子の発現に影響を与えることを含む。いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子の発現に影響を与えることは、マーカー遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上低下させることである。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
特定の実施形態では、ポリ核酸分子コンジュゲートは、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ－Ｂの分子を含み、ここで、Ａは、抗体またはその抗原結合断片であり、Ｂは、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子であり、Ｘは、Ａのシステイン残基にコンジュゲートする結合または非ポリマーリンカーである。
ある実施形態において、医薬組成物が本明細書で開示され、上記医薬組成物は、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、バッカル投与、直腸投与、経皮投与、または静脈内投与、皮下投与、または髄腔内投与のために製剤化される。
ＦＳＨＤの症状には、骨格筋への影響が含まれる。ＦＳＨＤの影響を受ける骨格筋には、目と口の周りの筋肉、肩の筋肉、上腕の筋肉、下肢の筋肉、腹筋、股関節の筋肉が含まれます。場合によっては、ＦＳＨＤの症状が視覚や聴覚にも影響を及ぼします。場合によっては、ＦＳＨＤの症状が心臓や肺の機能にも影響を与えます。場合によっては、ＦＳＨＤの症状には、筋力低下、筋萎縮、筋ジストロフィー、痛みの炎症、拘縮、脊柱側弯症、前弯症、低換気、網膜の異常、角膜炎への曝露、軽度の難聴、およびＥＭＧ異常が含まれます。本明細書で使用される筋萎縮という用語は、ＦＳＨＤの広範囲の筋関連効果を指す。
特定の実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載のポリ核酸コンジュゲートを提供し、それを必要とする対象にポリ核酸コンジュゲートを投与して筋ジストロフィーを治療することによって、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法である。．ポリ核酸コンジュゲートは、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写産物の量を減らします。いくつかの実施形態では、ポリ核酸部分は、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋萎縮を調節する。特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉は、筋ジストロフィーに冒された細胞において、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸを含むまたはからなる群から選択されるマーカー遺伝子の発現に影響を与えることを含む。好ましくは、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と診断された、またはその疑いがある対象を治療するための、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは医薬組成物の使用である。また、特定の実施形態において、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と診断されたまたは疑われる対象を治療するための医薬を製造するための、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは医薬組成物の使用も本明細書に開示される。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは薬学的組成物を含むキットである。
本開示の様々な態様が、添付の特許請求の範囲において具体的に明記されている。本開示の特徴と利点についてのより良好な理解は、本開示の原理が利用されている例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載と以下の添付の図面とを参照することにより得られる。本特許出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を包含している。カラーの図面を有するこの特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の支払い後に当該事務局によって提供される。
ＦＳＨＤ病理のダイアグラムを例証する。 ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのインシリコ選択のフローチャートダイアグラムを示す。 ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ転写物における選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの位置および数を示す。 筋核におけるＤＵＸ４発現の免疫蛍光検出を示す。 ＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介減少の棒グラフを示す。 図６Ａ－Ｂは、培養ＦＳＨＤ初代筋管におけるＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介減少、および培養ＦＳＨＤ初代筋管におけるＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現のｓｉＲＮＡ媒介減少のＦＳＨＤ複合体のグラフを示す。 濃度１０ｎＭのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した筋管におけるＡＣＴＡ１遺伝子発現の棒グラフを示す。 濃度１０ｎＭのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現を示す。 濃度０．５ｎＭのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現を示す。 最初のスクリーニングからのデータに基づくＤＵＸ４上位２８個のｓｉＲＮＡの選択のフローチャートダイアグラムを示す。 図１１Ａ－Ｂは、濃度１０ｎＭおよび０．５ｎＭのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理したときの２つのＦＳＨＤ初代筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現を示す。 １つ以上のＦＳＨＤ初代筋管において有効なＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを同定するＫＤ相関分析を示す。 濃度１０ｎＭのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した患者由来の筋管におけるＡＣＴＡ１遺伝子発現を示す。 濃度１０ｎＭのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現を示す。 ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した６例の患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現を示す。 １４の選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した３例の患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 １４の選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した３例の患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 １４の選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した３例の患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 ８つの選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した３例のＦＳＨＤ患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 ８つの選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した３例のＦＳＨＤ患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 ８つの選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで処理した３例のＦＳＨＤ患者由来の筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 図１８Ａ－Ｂは、ビニルホスホネートを含まない８つの抗体ＤＵＸ４－ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＤＵＸ４－ＡＯＣ）またはビニルホスホネートを含む８つの抗体ＤＵＸ４－ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処理した培養ＦＳＨＤ初代筋管におけるＦＳＨＤ複合体発現のグラフを示す。 マウスの骨格筋における核局在化Ｉｎｃ－ＲＮＡ Ｍａｌａｔ１レベルのＡＯＣ媒介インビボ減少のグラフを示す。 ３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回投与による８週間の間のマウス骨格筋におけるＳＳＢ ｍＲＮＡレベルの持続的なＳＳＢ－ＡＯＣ媒介インビボ減少のグラフを示す。
筋萎縮症は、筋肉量の喪失あるいは筋肉、例えば、運動、心筋、および平滑筋を制御する骨格または随意筋の進行性の低下と変性である。廃用、癌、糖尿病、および腎不全を含む様々な病態生理学的な疾病、あるいは、グルココルチコイドを用いる処置は、筋萎縮症および強度の喪失を引き起こす。筋萎縮症の表現効果は、筋タンパク質合成の阻害、筋タンパク質の増強されたターンオーバー、衛星細胞分化の異常なレギュレーション、および筋線維型の異常な転換を含む様々な分子事象によって引き起こされる。
ＦＳＨＤは、承認された治療法がない、まれな、進行性の障害をもたらす疾患である。ＦＳＨＤは、筋ジストロフィーの最も一般的な形態の１つであり、男女ともに等しく影響を受け、通常は１０代および若年成人で発症します。ＦＳＨＤは、進行性の骨格筋の喪失を特徴とし、最初は顔、肩、腕、および体幹の筋肉の衰弱を引き起こし、下肢および骨盤帯の筋肉の衰弱へと進行します。骨格筋の衰弱は、深刻な身体的制限をもたらします。これには、笑顔やコミュニケーションの不能を引き起こす可能性のある顔面筋肉の進行性の喪失、日常生活での腕の使用の困難、ベッドからの脱出の困難などがあります。日常の移動活動のための車椅子。ＦＳＨＤ患者の大部分は、慢性的な痛み、不安、抑うつを経験していると報告している。
ＦＳＨＤは、骨格筋における遺伝子ＤＵＸ４の異常な発現によって引き起こされ、ＤＵＸ４タンパク質の不適切な存在をもたらす。ＤＵＸ４自体は、他の遺伝子の発現を誘導する転写因子であり、これらの不適切に発現された下流遺伝子が筋肉の病理を引き起こします。通常、ＤＵＸ４による遺伝子発現は、生殖細胞系列および初期の幹細胞の発生に限定される。ＦＳＨＤ患者では、骨格筋のＤＵＸ４タンパク質が他の遺伝子産物を調節しており、その一部は筋肉にとって毒性があります。異常なＤＵＸ４駆動型遺伝子発現の証拠は、ＦＳＨＤの影響を受けた筋肉組織と健康な筋肉を区別する主要な分子的特徴です。ＦＳＨＤにおける異常なＤＵＸ４発現の結果は、筋肉の死とその脂肪による置換であり、骨格筋の衰弱と進行性の障害をもたらします。データは、ＤＵＸ４遺伝子とその下流の転写プログラムの発現を低下させることで、ＦＳＨＤの根本原因を治療するための疾患修飾治療アプローチを提供できることを示唆している。
ＤＵＸ４遺伝子を非サイレンシングまたは抑制解除することができる２つの方法がある。ＦＳＨＤ患者の約９５％を占めるＦＳＨＤ１では、Ｄ４Ｚ４として知られる第４染色体の長腕の末端近くの領域に一連のＤＮＡが短くなる変異があり、サブテロメア領域に反復があります。染色体の。Ｄ４Ｚ４領域は異常に短縮されており、通常の１１～１００回の繰り返しではなく、１～１０回の繰り返しが含まれています。この収縮により、Ｄ４Ｚ４領域の低メチル化とＤＵＸ４の抑制が解除されます。ＦＳＨＤ２の患者は意味のあるＤ４Ｚ４反復収縮を持っていませんが、ＳＭＣＨＤ１遺伝子として知られる調節遺伝子に変異があり、通常はＤＮＡメチル化を介してＤＵＸ４遺伝子の抑制に寄与します。ＳＭＣＨＤ１遺伝子の変異によりＤ４Ｚ４領域の低メチル化が引き起こされ、その抑制が失われると、ＤＵＸ４が不適切に発現され、疾患状態が誘発されます。図１は、ＦＳＨＤ病理の説明図を示す。
核酸（例えば、ＲＮＡｉ）治療は高い選択率と特異性を誇る標的療法である。しかしながら、いくつかの例において、核酸治療も、脆弱な細胞内取り込み、限定的な血液安定性、および非特異的な免疫刺激によって妨害される。こうした諸問題に対応するために、核酸組成物の様々な修飾、例えば、より優れた安定化および／またはより低い毒性のための新規なリンカー、増加した標的特異性および／または標的送達用の結合部分の最適化、ならびに、安定性の増加および／または的外れの効果の減少のための核酸ポリマー修飾などが探求されている。
いくつかの実施形態において、核酸組成物を構成する様々な成分の構成または順序はさらに、細胞内取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激をもたらす。例えば、核酸成分が結合部分、ポリマー、およびポリ核酸分子（あるいは、ポリヌクレオチド）を含む場合、結合部分、ポリマー、および／または、ポリ核酸分子（あるいは、ポリヌクレオチド）の順序または構成）（例えば、結合部分ポリ核酸分子ポリマー、結合部分ポリマーポリ核酸分子、あるいはポリマー結合部分ポリ核酸分子）はさらに、細胞内取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激をもたらす。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるものは、筋萎縮症、とりわけ、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーまたはそれに付随する筋萎縮症の処置のためのポリ核酸分子およびポリ核酸分子コンジュゲートを含む。いくつかの例において、本明細書に記載されるポリ核酸分子コンジュゲートは、細胞内の取り込み、安定性、および／または有効性を増強する。いくつかの例において、ポリ核酸分子コンジュゲートは、ポリ核酸分子にコンジュゲートされた抗体または抗原結合フラグメントを含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＵＸ４、好ましくは、ヒトＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズする。
本明細書に記載されるさらなる実施形態は、本明細書に記載されるポリ核酸分子あるいはポリ核酸分子コンジュゲートを被験体に投与する工程を含む、ＦＳＨＤを処置する方法を含む。
ポリ核酸分子
特定の実施形態において、ポリ核酸分子は、ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＤＵＸ４遺伝子（ＤＵＸ４）の標的配列にハイブリダイズし、筋細胞においてＤＵＸ４ ｍＲＮＡを減少させる。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、配列番号１～７０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、配列番号１４１～２１０から選択される配列に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、配列番号７１～１４０から選択される配列に対して９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、配列番号２１１～２８０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。場合によっては、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１～７０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。。場合によっては、第２のポリヌクレオチドは、配列番号７１～１４０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。場合によっては、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１４１～２１０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、第２のポリヌクレオチドは、配列番号２１１～２８０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）およびアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）を含む。場合によっては、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）は、配列番号１～７０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）は、配列番号７１～１４０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）およびアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）を含む。場合によっては、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）は、配列番号１４１～２１０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）は、配列番号２１１～２８０から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
場合によっては、センス鎖は、配列番号１、２、３、６、１４、３６、５２、５６、６１、６２、６３、６５、６６から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、アンチセンス鎖は、配列番号７１、７２、７３、７６、８４、１０６、１２２、１２７、１３１、１３２、１３３、１３５、１３６から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ｓｉＲＮＡは、表１１に提示されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
場合によっては、センス鎖は、配列番号１４１、１４２、１４３、１４６、１７６、１９２、１９６、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。アンチセンス鎖は、配列番号２１１、２１２、２１３、２１６、２４６、２６２、２６６、２７１、２７２、２７３、２７５、２７６から選択される配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、場合によっては、ｓｉＲＮＡは、表１２に提示されるようなセンス鎖およびアンチセンスを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によっては、ポリ核酸分子はＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｓｈＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｔＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｒＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｈｎＲＮＡを含む。いくつかの例において、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子はｓｉＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、核酸ポリマーは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態では、核酸ポリマーは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約８ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドはセンス鎖またはパッセンジャー鎖である。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドはアンチセンス鎖またはガイド鎖である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第１のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例において、第２のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子はさらに平滑末端、オーバーハングあるいはその組み合わせを含む。いくつかの例において、平滑末端は、５’平滑末端、３’平滑末端、あるいはその両方である。場合によっては、オーバーハングは５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方である。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、あるいは６の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、あるいは４の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは２つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは３つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは４つの非塩基対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、３’末端にオーバーハングとして２つの非塩基対形成ヌクレオチドを含むが、センス鎖はオーバーハングを有さない。任意選択で、そのような実施形態において、非塩基対形成ヌクレオチドは、ＴＴ、ｄＴｄＴ、またはＵＵの配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス配列に相補的な１つ以上のヌクレオチドを５’末端に有する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は、ＤＵＸ４の標的配列に対して、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％相補的である。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４の標的配列は、約１０－５０塩基対長、約１５－５０塩基対長、１５－４０塩基対長、１５－３０塩基対長、または１５－２５塩基対長の核酸配列であり、ここでは、標的配列の最初のヌクレオチドは、コード領域、または５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のＤＵＸ４ ｍＲＮＡ転写物の任意のヌクレオチドにおいて開始する。例えば、標的配列の最初のヌクレオチドは、それが核酸位置（ｎａｌ、ＤＵＸ ｍＲＮＡの全長の５’末端から開始する番号、例えば、５’末端の最初のヌクレオチドがｎａｌ．１である）１、ｎａｌ ２、ｎａｌ ３、ｎａｌ ４、ｎａｌ ５、ｎａｌ ６、ｎａｌ ７、ｎａｌ ８、ｎａｌ ９、ｎａｌ １０、ｎａｌ １１、ｎａｌ １２、ｎａｌ １３、ｎａｌ １４、ｎａｌ １５、ｎａｌ １５、ｎａｌ １６、ｎａｌ １７、またはＤＵＸ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域（５’または３’非翻訳領域）における任意の他の核酸位置から始まるように選択することができる。いくつかの実施形態では、標的配列の最初のヌクレオチドは、ｎａｌ １０－ｎａｌ １５、ｎａｌ １０－ｎａｌ ２０、ｎａｌ ５０－ｎａｌ ６０、ｎａｌ ５５－ｎａｌ ６５、ｎａｌ １０－ｎａｌ １５、ｎａｌ １０－ｎａｌ ２０、ｎａｌ ５５－ｎａｌ ６５、ｎａｌ ７５－ｎａｌ ８５、ｎａｌ ９５－ｎａｌ １０５、ｎａｌ １３５－ｎａｌ １４５、ｎａｌ １５５－ｎａｌ １６５、ｎａｌ ２２５－ｎａｌ ２３５、ｎａｌ ２６５－ｎａｌ ２７５、ｎａｌ ２７５－ｎａｌ ２８５、ｎａｌ ２８５－ｎａｌ ２９５、ｎａｌ ３２５－ｎａｌ ３３５、ｎａｌ ３３５－ｎａｌ ３４５、ｎａｌ ３８５－ｎａｌ ３９５、ｎａｌ ５１５－ｎａｌ ５２５、ｎａｌ ６６５－ｎａｌ ６７５、ｎａｌ ６７５－ｎａｌ ６８５、ｎａｌ ６９５－ｎａｌ ７０５、ｎａｌ ７０５－ｎａｌ ７１５、ｎａｌ ８７５－ｎａｌ ８８５、ｎａｌ ８８５－ｎａｌ ８９５、ｎａｌ ８９５－ｎａｌ ９０５、ｎａｌ １０３５－ｎａｌ １０４５、ｎａｌ １０４５－ｎａｌ １０５５、ｎａｌ １１２５－ｎａｌ １１３５、ｎａｌ １１３５－ｎａｌ １１４５、ｎａｌ １１４５－ｎａｌ １１５５、ｎａｌ １１５５－ｎａｌ １１６５、ｎａｌ １１２５－ｎａｌ １１３５、ｎａｌ １１５５－ｎａｌ １１６５、ｎａｌ １２２５－ｎａｌ １２３５、ｎａｌ １２３５－ｎａｌ １２４５、ｎａｌ １２７５－ｎａｌ １２８５、ｎａｌ １２８５－ｎａｌ １２９５、ｎａｌ １３０５－ｎａｌ １３１５、ｎａｌ １１２５－ｎａｌ １１３５、ｎａｌ １１５５－ｎａｌ １１６５、ｎａｌ １２２５－ｎａｌ １２３５、ｎａｌ １２３５－ｎａｌ １２４５、ｎａｌ １２７５－ｎａｌ １２８５、ｎａｌ １２８５－ｎａｌ １２９５、ｎａｌ １３０５－ｎａｌ １３１５、ｎａｌ １３１５－ｎａｌ １３２５、ｎａｌ １３３５－ｎａｌ １３４５、ｎａｌ １３４５－ｎａｌ １３５５、ｎａｌ １５２５－ｎａｌ １５３５、ｎａｌ １５３５－ ｎａｌ １５４５、ｎａｌ １６０５－ｎａｌ １６１５、ｎａｌ １６１５－ｃ．１６２５、ｎａｌ １６２５－ｎａｌ １６３５の中またはこれらの間の位置で開始するように選択することができる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも５０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも６０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも７０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９９％相補的である。いくつかの例において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に１００％相補的である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して５つ以下のミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して４つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して３つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して２つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して１つ以下のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、すべてのポリ核酸分子の中から、ＤＵＸ４の標的配列に潜在的に結合するポリ核酸分子のグループを選択して、ポリ核酸分子ライブラリーを作成する。特定の実施形態では、そのような選択プロセスは、あまり望ましくないポリ核酸分子を候補から排除する１つ以上の工程を介してインシリコで行われる。例えば、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、一塩基多型（ＳＮＰ）および／またはＭＥＦ＜－５を有する１つ以上のポリ核酸分子の排除工程を含む。あるいは、および／またはさらに、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、ヒトトランスクリプトームにおいて０および１のミスマッチ（ＭＭ）を有する１つ以上のポリ核酸分子の排除工程を含む（許容されるヒットのみがＤＵＸ、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴであるように）。あるいは、および／またはさらに、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、ヒト遺伝子内領域において０ＭＭを有する１つ以上のポリ核酸分子の排除工程を含む（許容されるヒットのみがＤＵＸ１、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴ偽遺伝子であるように）。あるいはおよび／またはさらに、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、ＦＬＥｘＤＵＸ４ ＦＳＨＤマウスモデルで使用されるＭＭからＤＵＸ４ヒト配列を有する１つ以上のポリ核酸分子の排除工程を含む。代替的および／または追加的に、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、予測生存率＜６０の１つ以上のポリ核酸分子の排除工程を含む。代替的および／または追加的に、そのような選択プロセスは、予測生存率≧６０の１つ以上のポリ核酸分子を繰り越す工程を含む。あるいはおよび／またはさらに、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、既知のｍｉＲＮＡ１－１０００のシード領域と一致する１つ以上のポリ核酸分子の排除工程を含む。あるいはおよび／またはさらに、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、％ＧＣ含有量が７５以上である１つ以上のポリ核酸分子の除去工程を含む。あるいは、および／またはさらに、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、２ＭＭで８個以下の予測オフターゲットヒットの選択工程を含む。いくつかの実施形態では、領域２９５－１１３２（ｎａｌ ２９５－１１３２）について、２ＭＭで１２以下の予測オフターゲットヒットが許容される。
いくつかの実施形態では、選択プロセスは、あまり望ましくないポリ核酸分子を候補から排除する１つ以上の連続工程を介してインシリコで行われる。例えば、いくつかの実施形態では、選択プロセスは、候補ポリ核酸分子を収集してライブラリーを生成することから始まる。ライブラリーから、第１の除去工程は、一塩基多型（ＳＮＰ）および／またはＭＥＦ＜－５を有する１つ以上のポリ核酸分子を除去することを含む。次に、第２除去工程は、ヒトトランスクリプトームで０および１ＭＭの１つ以上のポリ核酸分子を除去することを含む（許可されるヒットのみがＤＵＸ、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴになるように）。次いで、第３の除去工程は、ヒト遺伝子内領域において０ＭＭを有する１つ以上のポリ核酸分子を除去することを含む（許可されるヒットのみがＤＵＸ１、ＤＵＸ５およびＤＢＥＴ偽遺伝子であるように）。次いで、次の除去工程は、ＦＬＥｘＤＵＸ４ ＦＳＨＤマウスモデルで使用されるＭＭからＤＵＸ４へのヒト配列を有する１つ以上のポリ核酸分子を除去することを含む。次に、次の工程は、予測生存率が６０以上のポリ核酸分子のみ、または１つ以上のポリ核酸分子を持ち越すことである。次に、除去工程は、既知のｍｉＲＮＡ１－１０００のシード領域に一致する１つ以上のポリ核酸分子を除去することを含む。次いで、％ＧＣ含有量が７５以上の１つ以上のポリ核酸分子を除去する除去工程が続く。次に、最終的な選択プロセスは、最大１２ヒットが許可される領域２９５－１１３２を除いて、２ＭＭで８以下の予測オフターゲットヒットを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子の特異性は、標的配列に対するポリ核酸分子の９５％、９８％、９９％、９９．５％、あるいは１００％の配列相補性である。いくつかの例において、ハイブリダイゼーションは高いストリンジェントなハイブリダイゼーション状態である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はオフターゲット効果を減少させた。いくつかの例において、「オフターゲット」あるいは「オフターゲット効果」とは、所定の標的に対するポリ核酸ポリマーが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、あるいは細胞タンパク質またはその他の部分を直接的あるいは間接的に相互作用することによって意図しない効果を引き起こすあらゆる例を指す。いくつかの例において、その他の転写物とポリ核酸分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖との間の部分的な相同性あるいは相補性によって他の転写物の同時の分解がある場合に、「オフターゲット効果」が生じる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は天然または合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドアナログの組み合わせを含む。いくつかの例において、合成または人工ヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、リン酸塩部分、ヌクレオシド部分、あるいはその組み合わせの１つ以上で修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログあるいは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’ヒドロキシル基に修飾を有する核酸を含む。いくつかの例において、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、あるいはＣＮを含み、Ｒはアルキル部分である。例示的なアルキル部分としては、限定されないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられる。いくつかの例において、アルキル部分はさらに修飾を含む。いくつかの例において、修飾はアゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、あるいはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネートまたはシアナート基、あるいは硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、スルフィド、およびジスルフィド）を含む。いくつかの例において、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。いくつかの例において、複素環基の炭素は窒素、酸素、あるいは硫黄によって置換される。いくつかの例において、複素環式置換は、限定されないが、モルホリノ、イミダゾール、および、ピロリジノを含む。
いくつかの事例では、２’ヒドロキシル基の修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾である。場合によっては、２’－Ｏ－メチル修飾は、メチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加え、一方で２’Ｏ－メトキシエチル修飾は、メトキシエチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加える。アデノシン分子の２’－Ｏ－メチル修飾およびウリジンの２’Ｏ－メトキシエチル修飾の典型的な化学構造が、以下に例証される。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合させる、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾である。いくつかの例において、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。２’－Ｏ－アミノプロピルヌクレオシドホスホラミダイトの典型的な化学構造が、以下に例証される。
いくつかの例において、２’ヒドロキシル基の修飾はロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）であり、ここで、２’炭素で結合された酸素分子はメチレン基によって４’炭素に結合され、したがって、２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシ－メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。ＬＮＡの化学構造の代表例が以下に例証される。左に示される代表例は、ＬＮＡ単量体の化学結合性を強調している。右に示される代表例は、ＬＮＡ単量体のフラノース環のロックド３’－エンド（３Ｅ）構造を強調している。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、糖構造を３’－エンド糖パッカリング構造（ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとロックする、例えば、２’－４’－エチレン架橋した核酸などのエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む修飾された核酸の架橋された核酸クラスの一部である。ＥＮＡおよび架橋された核酸の典型的な化学構造は、以下に例証される。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での追加の修飾は、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、限定されないが、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，－ジメチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－プロピルグアニン、２－アミノアデニン、１－メチルイノシン、３－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、および、５位置に修飾を有する他のヌクレオチド、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、４－アセチルシチジン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、３－メチルシチジン、６－メチルウリジン、２－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２，２－ジメチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メトキシウリジン、７－デアザ－アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６－アゾウリジン、６－アゾシチジン、６－アゾチミジン、５－メチル－２－チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２－チオウリジンと４－チオウリジン、および２－チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、Ｏ－およびＮ－アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン、５－オキシ酢酸、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６－トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８－置換されたアデニンおよびグアニン、５－置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖あるいはそのアナログを有するヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、糖部は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’－チオリボース、および、その他の糖類、複素環、あるいは炭素環であるか、または、これらがベースである。ヌクレオチドとの用語はさらに、普遍的な塩基として当技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、またはネブラリンを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの組み合わせをさらに含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、正常な糖およびリン酸塩構造からの偏差（ｄｅｖｉａｔｅｓ）によって天然の核酸構造を模倣している。いくつかの例において、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。いくつかの場合では、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合する。場合によっては、骨格の変質は、荷電オリゴヌクレオチドによって使用されるような細胞送達剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ）の助けを借りることなく細胞膜を横断することができるモルホリノ中性分子を作るすべての正および負の電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖骨格環もリン酸塩結合を含まず、塩基は結合し、オリゴグリシン様分子によって適切に間隔を置かれ、ゆえに、骨格電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾が随意にヌクレオチド間結合で生じる。いくつかの例において、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、５’－メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、三フッ化ホウ素（ｂｏｒｏｎｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄａｔｅｓ）、３’－５’結合あるいは２’－５’結合のボラノリン酸エステルおよびセレノホスフェート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホネート結合、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホロチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’－アルキルホスホルアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルジメチルヒドラゾ、ホルムアセタル、チオホルムアセタル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との結合、アミノエチルグリシン、シリル、あるいはシロキサン結合、例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換されたおよび／またはヘテロ原子を含む１～１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルあるいはシクロアルキル結合、モルホリノ構造との結合、アミド、塩基が骨格のアザ窒素に直接的あるいは間接的に結合したポリアミド、またはこれらの組み合わせを含む。ホスホロチオエート アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）は、ホスホロチオエート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例示的なＰＳ ＡＳＯが以下に説明される。
いくつかの例において、修飾は、メチルホスホネートあるいはチオールホスホネート修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。
いくつかの例において、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示される２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを含む：
いくつかの例において、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示されるヘキシトール核酸（あるいは、１’、５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））を含む：
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾はさらに、リボース部分、ホスフェート骨格、およびヌクレオシドの修飾、あるいは３’または５’末端のヌクレオチドアナログの修飾を含む。例えば、３’末端は随意に３’カチオン基を含み、あるいは、３’－３’結合を含む３’－末端でヌクレオシドを反転させる。別の代替物では、３’－末端は随意に、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５－アミノアルキルｄＴと結合する。追加の代替物では、３’－末端は随意に、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と結合する。いくつかの例において、５’－末端は、アミノアルキル基、例えば、５’－Ｏ－アミノアルキル置換基と結合する。場合によっては、５’－末端は、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と結合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載された１つ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上のチオールホスホネートヌクレオチドを含む。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。
場合によっては、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。
さらなる場合には、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの例において、約５から約１００％のポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約１０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約１５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約２０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約２５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約３０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約３５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約４０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約４５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約５０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約５５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約６０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約６５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約７０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約７５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約８０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約８５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約９０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約９５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約９６％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約９７％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約９８％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約９９％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子の約１００％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、－メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１～約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、１つのポリヌクレオチドはセンス鎖を含み、第２のポリヌクレオチドはポリ核酸分子のアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、センス鎖はリンカー分子によってアンチセンス鎖に接続され、これは、いくつかの例において、ポリヌクレオチドリンカーあるいは非ヌクレオチドリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－プリンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つは、複数（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個またはそれ以上、６個以上、７個以上、８個以上など）の２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、複数の２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも２つが連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、連続する２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する。いくつかの実施形態において、連続する２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子のセンス鎖は、その５’末端および／または３’末端、またはその両方に、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個の連続した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、そのような実施形態では、ポリ核酸分子のセンス鎖は、ポリヌクレオチドの５’末端における少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個の連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドポリヌクレオチドの３’末端、またはポリヌクレオチドの３’末端における少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個の連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドの５’末端に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個の２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。また任意選択で、そのような少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個の２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、連続したヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドはプリンヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドはピリジンヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に２つ以上の連続した２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、３’末端に２つ以上の連続した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、または７個の連続した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆＮｆＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｓｎｓａ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＵｆｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆＮｆＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｓｎｓａ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＵｆｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、センス鎖の５’－末端、３’－末端、あるいは５’と３’の末端の両方でキャップ部分を含む。他の実施形態では、末端のキャップ部分は反転デオキシ脱塩基部分である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にグリセリル修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のに関するおよび／または、普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、あるいは１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、約１～約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約２５以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、約１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチドを含み、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９あるいは１０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約５、例えば、約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の各鎖において、約１～約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾された短干渉核酸分子である。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にリン酸骨格修飾を含む。あるいは、および／またはさらに、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖はアンチセンス鎖の５’末端にリン酸骨格修飾を含む。場合によっては、リン酸骨格修飾はホスホロチオエートである。いくつかの実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエート骨格を介して結合された３つの連続したヌクレオシドを有する。
別の実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は２’－５’ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例において、２’－５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の配列鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－末端と５’－末端の両方にある。追加の例では、２’－５’ヌクレオチド間結合は、一方あるいは両方の配列鎖内の様々な他の位置に存在し、例えば、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’－５’ヌクレオチド間結合を含み、あるいは、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中にプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’－５’ヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、細胞中のＲＮＡｉ活性を媒介するか、インビトロ系で再構成された単鎖ポリ核酸分子であり、ここで、ポリ核酸分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み、および、ポリ核酸中に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、ここで、ピリミジンヌクレオチドはすべて２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、あるいは、代替的に、複数のピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドである）、および、ポリ核酸中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’－デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、すべてのプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは代替的に、複数のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドである）、および、末端のキャップ修飾は、アンチセンス配列の３’－末端、５’－末端、あるいは３’と５’－末端の両方で随意に存在し、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の３’末端に約１～約４（例えば、約１、２、３、あるいは４）の末端２’－デオキシリボヌクレオチドを随意にさらに含み、ここで、末端のヌクレオチドはさらに、１つ以上（例えば、１、２、３、あるいは４）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、および、ポリ核酸分子は随意に５’－末端リン酸基などの末端リン酸基をさらに含む。
場合によっては、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、天然のポリ核酸分子と比較して、例えば、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’－３’エキソヌクレアーゼや３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例において、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいは、これらの組み合わせを含む人工ヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’－３’エキソヌクレアーゼや３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例において、２’－Ｏメチル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－デオキシ－２’－Ｏ－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、モルホリノは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性を有する（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）。いくつかの例において、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例において、本明細書に記載された５’コンジュゲートは５’－３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例において、本明細書に記載された３’コンジュゲートは３’－５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－メチル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、モルホリノ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例において、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。場合によっては、増加した親和性は、低Ｋｄ、高融解温度（Ｔｍ）、あるいはその組み合わせで例証される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、キラル純粋（あるいはステレオ純粋）なポリ核酸分子、または単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。いくつかの例において、ポリ核酸分子はＬ－ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子はＤ－ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像異性体の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。場合によっては、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第２０１４／１９４６１０号と第２０１５／２１１００６号；および、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１５１０７４２５に記載されるポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、アプタマー結合部分を含めるようにさらに修飾される。いくつかの例において、アプタマー結合部分はＤＮＡアプタマー結合部分である。いくつかの例において、アプタマー結合部分は、Ａｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、これは、特定細胞表面標的と、循環抗体に結合するための特定のエピトープを示す部分とを認識するアプタマー部分を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、米国特許第８，６０４，１８４号、第８，５９１，９１０号、および、第７，８５０，９７５号に記載されるようなアプタマー結合部分を含めるようにさらに修飾される。
追加の実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾される。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）である。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、その安定性を増大させるために上に記載された修飾の１つ以上によって修飾されている。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、あるいは、ロックドまたは架橋リボース構造（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によるなどして、２ヒドロキシル位置で修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－Ｏ－メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、その安定性を増大させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、および／または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子はキラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子である。いくつかの例において、キラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾されている。送達の安定性を増大させるためのＲＮＡの適切な修飾は当業者には明らかである。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む、二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。いくつかの例において、ポリ核酸分子は２つの別々のポリヌクレオチドから組み立てられ、１つの鎖はセンス鎖であり、もう一つの鎖はアンチセンス鎖であり、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的であり（例えば、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖とセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成する場合など。例えば、二本鎖領域は約１９、２０、２１、２２、２３、またはそれ以上の塩基対である）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。代替的に、ポリ核酸分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ポリ核酸分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合する。
場合によっては、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有する、二重の、非対称的で二重の、ヘアピン型の、または非対称的なヘアピン型の二次構造を有するポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。他の場合には、ポリ核酸分子は、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む基部とを有する、環状の単鎖ポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することが可能な活性なポリ核酸分子を生成するためにインビボまたはインビトロで処理される。さらなる場合には、ポリ核酸分子はさらに、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み（例えば、そのようなポリ核酸分子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列のポリ核酸分子内に存在することを必要としない）、単鎖ポリヌクレオチドはさらに、５’－リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３－５７４と、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７－５６８を参照）あるいは５’，３’－二リン酸塩などの末端のリン酸基を含む。
いくつかの例において、非対称のヘアピンは、アンチセンス領域と、ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドを含むループ部分と、センス領域とを含む線形のポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなすのに十分な相補的なヌクレオチドを有し、ループを有する二重鎖を形成する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有し、かつ、および約４～約８のヌクレオチドを含むループ領域を有するアンチセンス領域（例えば約１９～約２２ヌクレオチド）と、アンチセンス領域に相補的な約３～約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。場合によっては、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子はさらに、化学修飾された５’末端のリン酸基を含む。さらなる場合には、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、あるいはコンジュゲート分子を含む。
いくつかの実施形態において、非対称的な二重鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなすのに十分な相補的なヌクレオチドを有し、かつ、二重鎖を形成する程度で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的な二重のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば約１９約２２のヌクレオチド）、および、アンチセンス領域に相補的な約３～約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。
場合によっては、普遍的な塩基とは、ほとんど見分けがつかない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成するヌクレオチド塩基アナログを指す。普遍的な塩基の非限定的な例は、従来技術で知られているようなＣ－フェニル、Ｃ－ナフチル、および他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、および６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含む（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７－２４４７を参照）。
ポリ核酸分子合成
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、当該技術分野で知られている手順を用いて、化学合成および／または酵素ライゲーション反応を用いて構築される。例えば、ポリ核酸分子は、自然発生のヌクレオチドを使用して、あるいは、分子の生体安定性を増大させるために、または、ポリ核酸分子と標的核酸との間で形成された二重鎖の物理安定度を増大させるために設計されたさまざまな修飾ヌクレオチドを用いて、化学合成される。例示的な方法は、以下に記載されるものを含む：米国特許第５，１４２，０４７号；第５，１８５，４４４号；第５，８８９，１３６号；第６，００８，４００号；および、第６，１１１，０８６号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９０９９９４２号；あるいは、欧州特許公開第１５７９０１５号。追加の例示的な方法は、以下に記載されるものを含む：Ｇｒｉｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．，“２’－Ｏ－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，” Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（２６）：５１００－５１０９（１９９７））；Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ －ｃｙｔｉｄｉｎｅ．Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３，－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ”．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８（５０）：８７３５ １９９７；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．“ＥＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８（２）：１４４－１４９（２００６）；ａｎｄ Ａｂｒａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，” Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１－１７２６（２００９）。代替的に、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子がアンチセンス配向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に生成される（つまり、挿入されたポリ核酸分子の転写されたＲＮＡは所望の標的ポリ核酸分子に対してアンチセンス配向になる）。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はタンデム合成方法によって合成され、ここで、両方の鎖は切断リンカーによって分離された単一の隣接するオリゴヌクレオチドフラグメントあるいは鎖として合成され、これはその後切断されることで、二重鎖をハイブリダイズして二重鎖の精製を可能にする別々のフラグメントまたは鎖をもたらす。
いくつかの例において、ポリ核酸分子も２つの特徴的な核酸鎖あるいはフラグメントから組み立てられ、ここで、１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントは分子のアンチセンス領域を含む。
例えば、糖、塩基、およびホスフェート修飾を組み込むためのさらなる修飾方法は、以下を含む：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５－５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４－３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４－３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３３４，７１１ ａｎｄ Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７１６，８２４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６２７，０５３；Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／０８２，４０４ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｉｌｅｄ ｏｎ Ａｐｒ．２０，１９９８；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９－５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９－１３４；および、Ｂｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９－２０１０．上記公報は、触媒作用を調節することなく、核酸分子へ糖、塩基、および／またはリン酸塩修飾を取り込むための位置を決定するための方法や戦術を記載している。
いくつかの例において、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’－メチルホスホネート結合とのポリ核酸分子のヌクレオチド間結合の化学修飾が安定性を改善する一方で、過度の修飾はしばしば毒性または活性の減少を引き起こす。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は場合によっては最小限に抑えられる。そのような場合、これらの結合の濃度の減少は、これらの分子の毒性を低下させ、有効性と高い特異性を増加させる。
ポリ核酸分子コンジュゲート
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子（Ｂ）はさらに、所望の部位へ送達されるポリペプチドＡに結合する。場合によっては、ポリ核酸分子はポリペプチドＡと随意にポリマー部分に結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢに結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのポリペプチドＡは、Ａ－Ｂコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢに結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＡは、Ｂの５’末端、Ｂの３’末端、Ｂの内部部位、あるいはその任意の組み合わせに結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも２つのＢに結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、あるいはそれ以上のＢに結合する。
場合によっては、ポリ核酸分子は、ポリペプチド（Ａ）および任意選択でポリマー部分（Ｃ）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で結合され、その一方で、少なくとも１つのＣは、Ａ－Ｂ－Ｃコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢの反対側の末端で結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で結合され、その一方で、Ｃの少なくとも１つは少なくとも１つのＢの内部部位で結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＣに直接結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのＢは、Ａ－Ｃ－Ｂコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＣを介して少なくとも１つのポリペプチドＡに間接的に結合する。
いくつかの例において、少なくとも１つのＢおよび／または少なくとも１つのＣ、ならびに随意に少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに結合する。いくつかの例において、少なくとも１つのＢは、少なくとも１つのポリペプチドＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で結合され、あるいは少なくとも１つのポリペプチドＡに内部部位を介して結合する。場合によっては、少なくとも１つのＣは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、あるいは少なくとも１つのＢによって間接的に結合する。間接的に、少なくとも１つのＢによって、少なくとも１つのＣは、Ｂ上の少なくとも１つのポリペプチドＡと同じ末端で、少なくとも１つのポリペプチドＡからの対抗する末端で、あるいは、独立して内部部位で結合する。いくつかの例において、少なくとも１つの追加のポリペプチドＡはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに結合する。さらなる例では、少なくとも１つのＤは随意に、少なくとも１つのポリペプチドＡ、少なくとも１つのＢ、あるいは少なくとも１つのＣに、直接的あるいは間接的に結合する。直接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに結合される場合、少なくとも１つのＤもＡ－Ｄ－Ｂコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢに随意に結合され、あるいは、Ａ－Ｄ－Ｂ－Ｃコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に結合する。いくつかの例において、Ｄ－Ａ－Ｂ－Ｃコンジュゲートを形成するために、少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、および少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに間接的に結合する。間接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに結合される場合、少なくとも１つのＤもＡ－Ｂ－Ｄコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢに随意に結合され、あるいは、Ａ－Ｂ－Ｄ－Ｃコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に結合する。いくつかの例において、少なくとも１つの追加のＤはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに結合する。
結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分Ａはポリペプチドである。いくつかの例において、ポリペプチドは、抗体またはそのそのフラグメントである。場合によっては、フラグメントは結合フラグメントである。いくつかの例において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント、マウス抗体またはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント、モノクローｎａｌ 抗体またはその抗原結合フラグメント、軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインを有する結合フラグメント、２つの軽鎖ドメインおよび２つの重鎖ドメインを有する結合フラグメント、２つ以上の軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインを有する結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその抗原結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。
いくつかの実施形態では、結合部分Ａは、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの例において、二重特異性抗体は三機能性抗体あるいは二重特異性ミニ抗体である。場合によっては、二重特異性抗体は三機能性抗体である。いくつかの例において、三機能性抗体は、２つの異なる抗原のための結合部位を含む完全長のモノクローナル 抗体である。
場合によっては、二重特異性抗体は二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例において、二重特異性ミニ抗体は、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、あるいは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、２つのｓｃＦｖｓが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例において、Ａは二重特異性Ｆａｂ２である。いくつかの例において、Ａは二重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは二重特異性ビス－ｓｃＦｖである。場合によっては、Ａは二重特異性（ｓｃＦｖ）であるいくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ダイアボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ミニボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性の三重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性の四重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性のＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは三重特異性抗体である。いくつかの例において、三重特異性抗体はＦ（ａｂ）’３フラグメントあるいは三重特異性抗体を含む。いくつかの例において、Ａは三重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは三重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｄｉｍａｓ、ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，” Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２（９）：３４９０－３５０１（２０１５）に記載されるような三重特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの例において、結合部分Ａは、筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントである。場合によっては、結合部分Ａは、骨格筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、例示的な抗体は、限定されないが、抗ミオシン抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、および、筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）を認識する抗体である。いくつかの例において、抗体は抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１）抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体が抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１）抗体である場合、抗トランスフェリン抗体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合し、好ましくは、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）に特異的に結合し、またはより好ましくは、ヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）（またはヒトＣＤ７１）に特異的に結合する。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧを含み、ここで、Ｘ１はＮまたはＱから選択され、Ｘ２はＱまたはＥから選択され、そしてＨＣＤＲ３配列は配列番号２８３を含む。
いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＨ領域は、表１から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２、２８４、または２８５を含むＨＣＤＲ２配列を含む。場合によっては、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。場合によっては、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２を含むＨＣＤＲ２配列、配列番号２８５を含む配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、Ｘ３はＮまたはＳから選択され、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合、Ｆである。
いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＬ領域は、表２から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ３はＮまたはＳから選択される。
場合によっては、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択される。
場合によっては、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここでＸ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１はＮまたはＱから選択される、Ｘ２はＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここで、Ｘ３はＮまたはＳから選択され、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１がＮまたはＱから選択され、Ｘ２がＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ1ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ここで、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ３はＮまたはＳから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１がＮまたはＱから選択され、Ｘ２がＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１はＮまたはＱから選択され、Ｘ２はＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここでＸ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１はＮまたはＱから選択され、Ｘ２はＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧおよび配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１はＮまたはＱから選択され、Ｘ２はＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１はＮまたはＱから選択され、Ｘ２はＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、Ｘ１はＮまたはＱから選択され、Ｘ２はＱまたはＥから選択されるＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ１ＧＲＳＮＹＡＸ２ＫＦＱＧ、よび配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ３はＮまたはＳから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここでＸ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ３はＮまたはＳから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここでＸ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ３はＮまたはＳから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ４ＴＮＬＡＸ５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ４はＡまたはＧから選択され、Ｘ５はＤまたはＥから選択される。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここでＸ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ６を含み、ここで、Ｘ５はＤまたはＥから選択され、Ｘ６は存在または非存在であり、存在する場合はＦである。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域の配列は、配列番号２９３－２９６に対して約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含み、ＶＬ領域の配列は、配列番号２９８－３０１に対して約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２９３－２９６（表３）から選択される配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９８－３０１（表４）から選択される配列を含む。表３および表４の下線を付した領域は、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の配列を示す。

いくつかの実施形態では、抗トランスフェリン受容体抗体は、表５に例証されるようにＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧフレームワーク、ＩｇＡフレームワーク、ＩｇＥフレームワーク、またはＩｇＭフレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧフレームワーク（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ１フレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）フレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ２ａフレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ２ｂフレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ３フレームワークを含む。場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体はＩｇＧ４フレームワークを含む。
場合によっては、抗トランスフェリン受容体抗体は、フレームワーク領域、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域、またはそれらの組み合わせに１つ以上の変異を含む。場合によっては、１つ以上の変異は、抗体を安定化するため、および／または半減期を延長するためのものである。場合によっては、１つ以上の変異は、Ｆｃ受容体相互作用を調節し、ＦｃγＲ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃエフェクター機能を低下または排除するためのものである。追加の例では、１つ以上の変異は、グリコシル化を調節するためのものである。
いくつかの実施形態において、１つ以上の突然変異はＦｃ領域に位置する。場合によっては、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはそれらの組み合わせに変異を含む。場合によっては、変異はＬ２３４およびＬ２３５を含む。場合によっては、変異はＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む。場合によっては、残基の位置はＩｇＧ１を基準にしている。
場合によっては、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、もしくはＰ３２９、またはそれらの組み合わせに変異を含む。場合によっては、変異は、残基位置Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９における変異と組み合わせて、Ｌ２３４およびＬ２３５を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３４、Ｌ２３５、およびＫ３２２に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３４、Ｌ２３５、およびＬ３２８に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＤ２６５およびＮ２９７に突然変異を含む。場合によっては、残基の位置はＩｇＧ１を基準にしている。
場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇと組み合わせてＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＫ３２２Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＬ３２８Ｒを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＤ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇを含む。場合によっては、残基の位置はＩｇＧ１を基準にしている。
場合によっては、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３５、Ｌ２３６、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９に変異、または変異の組み合わせを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５およびＬ２３６に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、残基位置Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９での変異と組み合わせて、Ｌ２３５およびＬ２３６での変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５、Ｌ２３６、およびＫ３２２に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５、Ｌ２３６、およびＬ３２８に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５、Ｌ２３６、およびＰ３２９に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＤ２６５およびＮ２９７に変異を含む。場合によっては、残基の位置はＩｇＧ２ｂを基準にしている。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５ＡおよびＬ２３６Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇと組み合わせてＬ２３５ＡおよびＬ２３６Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＫ３２２Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＬ３２８Ｒを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＰ３２９Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＤ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇを含む。場合によっては、残基の位置はＩｇＧ２ｂを基準にしている。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に変異を含み、残基は、配列番号の位置２３３、２３４、２６４、２９６、３２１、３２７、および３２８に対応する。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３およびＬ２３４に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、残基位置Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８での変異と組み合わせて、Ｌ２３３およびＬ２３４での変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３、Ｌ２３４、およびＫ３２１に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３、Ｌ２３４、およびＬ３２７に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３、Ｌ２３４、およびＫ３２１に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３、Ｌ２３４、およびＰ３２８に変異を含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＤ２６４およびＮ２９６に突然変異を含む。場合によっては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４フレームワークにおける残基Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８と同等の位置が企図される。場合によっては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４フレームワークにおける配列番号３０３の残基Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に対応する残基への変異もまた企図される。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｄ２６４Ａ、Ｎ２９６Ｇ、Ｋ３２１Ｇ、Ｌ３２７Ｒ、またはＰ３２８Ｇを含み、残基は、配列番号３０３の位置２３３、２３４、２６４、２９６、３２１、３２７、および３２８に対応する。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３ＡおよびＬ２３４Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域は、Ｋ３２１Ｇ、Ｌ３２７Ｒ、またはＰ３２８Ｇと組み合わせてＬ２３３ＡおよびＬ２３４Ａを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＫ３２１Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ３２７Ｒを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＫ３２１Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＬ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＰ３２８Ｇを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＤ２６４ＡおよびＮ２９６Ｇを含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更するために、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６８（１０）：３８６３－７２；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６（４）：２５７１－５；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ｍＡｂｓ，２（２）：１８１－１８９；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６ ＰＮＡＳ，１０３（１１）：４００５－４０１０，Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ ＪＢＣ，２７６（９）：６５９１－６６０４；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２－８８９０；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．，４８：１５２－１６４； Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：３４６１－３４６８；Ｋａｎｅｋｏ ａｎｄ Ｎｉｗａ，２０１１ Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２５（１）：１－１１におけるレビューに記載されているアミノ酸修飾を用いて修飾され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体である。場合によっては、重鎖（ＨＣ）は、表６から選択される配列を含む。場合によっては、軽鎖（ＬＣ）は、表７から選択される配列を含む。下線を引いた領域は、それぞれのＣＤＲを示す。




いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、参照抗トランスフェリン受容体抗体と比較して改善された血清半減期を有する。場合によっては、改善された血清半減期は、少なくとも３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１４日間、３０日間、またはそれ以上の時間、参照抗トランスフェリン受容体抗体よりも長い。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）に非特異的に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基またはシステイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基（例えば、結合部分Ａに存在するリシン残基）を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。場合によっては、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、システイン残基（例えば、結合部分Ａに存在するシステイン残基）を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、ポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基、システイン残基を介して、５’－末端で、３’－末端で、非天然アミノ酸、あるいは酵素修飾または酵素触媒された残留物で、ポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基（例えば、結合部分Ａに存在するリシン残基）を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、システイン残基（例えば、結合部分Ａに存在するシステイン残基）を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、５’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、３’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、非天然アミノ酸を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例において、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で酵素修飾または酵素触媒された残留物を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリ核酸分子（Ｂ）は結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のポリ核酸分子は、１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約７のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約８のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約９のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１０のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例において、約１６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。場合によっては、１つ以上のポリ核酸分子が同じである。他の例では、１つ以上のポリ核酸分子が異なる。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａに結合したポリ核酸分子（Ｂ）の数は、ある比率を形成する。いくつかの例において、比率はＤＡＲ（薬物対抗体の）比率と呼ばれ、本明細書で言及されるような薬物はポリ核酸分子（Ｂ）である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１以上である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２以上である。
いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１３である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１４である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１５である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１６である。
いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、２である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、４である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、６である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、８である。いくつかの例において、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１２である。
いくつかの例において、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含むコンジュゲートと比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含むコンジュゲートは、活性を改善させた。いくつかの例において、改善された活性は、生物学的に関連する機能の増強、例えば、疾患状態の処置または予防における安定性、親和性、結合、機能的な活性、および有効性の改善をもたらす。いくつかの例において、疾患状態は、遺伝子の１つ以上の突然変異エクソンの結果である。いくつかの例において、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含むコンジュゲートと比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含むコンジュゲートは、１つ以上の突然変異したエクソンのエクソンスキッピングの増加をもたらす。いくつかの例において、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含むコンジュゲートと比較して、エクソンスキッピングは、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含むコンジュゲートにおいて、少なくともまたは約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは、９５％以上増加する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、単独であるいは組み合わせて、当該技術分野で知られている従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、追加を用いることによって、および／または、組換え、ならびに／あるいは、当該技術分野で知られている他の修飾（例えば、グリコシル化とリン酸化などの翻訳後および化学的な修飾）によって、さらに修飾される。いくつかの例において、修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用を調節するための修飾をさらに含む。いくつかの例において、１つ以上の修飾は、例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１に記載されるものを含み、当該文献はＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するアミノ酸残基を開示している。抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列の基礎となる核酸配列にそのような修飾を導入する方法は、当業者に周知である。
いくつかの例において、抗原結合フラグメントはさらにその誘導体を包含し、少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチド配列を含んでいる。
いくつかの例において、本明細書に記載されるような「単鎖」との用語は、二重特異性の単鎖構築物の第１と第２のドメインが、好ましくは、単一核酸分子によってコードすることができる共線形アミノ酸配列（ｃｏ－ｌｉｎｅａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の形態で共有結合されるということを意味する。
いくつかの例において、二重特異性単鎖抗体構築物は、２つの抗体由来の結合ドメインを含む構築物に関する。そのような実施形態では、二重特異性の単鎖抗体構築物はタンデムｂｉ－ｓｃＦｖあるいはダイアボディである。いくつかの例において、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって接続されたＶＨとＶＬのドメインを含む。いくつかの例において、リンカーは、第１と第２のドメインのそれぞれが、互いから独立して、その差次的な結合特異性を保持することができる十分な長さと配列である。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるように、～との結合または～による相互作用とは、互いに少なくとも２つの抗原相互作用部位の結合／相互作用を定義する。いくつかの例において、抗原相互作用部位は、特異性抗原または抗原の特異的な群との特定の相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。場合によっては、結合／相互作用は特定の認識を定義するとも理解される。そのような場合、特定の認識は、抗体あるいはその抗原結合フラグメントが、標的分子の各々の少なくとも２つのアミノ酸に特異的に相互作用および／または結合することができるということを指す。例えば、特定の認識は、抗体分子の特異性、あるいは標的分子の特定の範囲を区別するその能力に関する。追加の例では、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、例えば、抗原の立体配座の変化、抗原のオリゴマー化などの誘導による、シグｎａｌ の開始をもたらす。さらなる実施形態では、結合は「鍵と鍵穴の原則（ｋｅｙ－ｌｏｃｋ－ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」の特異性によって例証される。したがって、いくつかの例において、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフは、上記構造の第２の修飾の結果と同様に、その１次、２次、または３次構造の結果として互いに結合する。そのような場合、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、その部位の抗原への簡単な結合をもたらす。
いくつかの例において、特異的な相互作用はさらに、抗体またはその抗原結合フラグメントの減少した交差反応性、あるいは減少したオフターゲット効果を指す。例えば、所望のポリペプチド／タンパク質に結合するが、他のポリペプチドのいずれにも結合しないか、または本質的には結合しない抗体あるいはその抗原結合フラグメントは、所望のポリペプチド／タンパク質に対して特異的であるとみなされる。抗原相互作用部位の特異性抗原との特定の相互作用の例は、リガンドのその受容体との特異性、例えば、抗原決定基群（エピトープ）の、抗体の抗原結合部位との相互作用を含む。
追加の結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分は血漿タンパク質である。いくつかの例において、血漿タンパク質はアルブミンを含む。いくつかの例において、結合部分Ａはアルブミンである。いくつかの例において、アルブミンは、本明細書に記載される結合化学の１つ以上によって、ポリ核酸分子に結合する。いくつかの例において、アルブミンは、天然のライゲーション化学によってポリ核酸分子に結合する。いくつかの例において、アルブミンは、リジン結合によってポリ核酸分子に結合する。
いくつかの例において、結合部分Ａはステロイドである。例示的なステロイドは、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（飽和、不飽和であり、置換、あるいはそれらの組み合わせを含む）を含む。いくつかの例において、ステロイドはコレステロールである。いくつかの例において、結合部分はコレステロールである。いくつかの例において、コレステロールは、本明細書に記載される結合化学の１つ以上によってポリ核酸分子に結合する。いくつかの例において、コレステロールは、天然のライゲーション化学によってポリ核酸分子に結合する。いくつかの例において、コレステロールは、リジン結合によってポリ核酸分子に結合する。
いくつかの例において、結合部分は、限定されないが、細胞上の特定の表面マーカーに結合するポリ核酸分子アプタマーを含むポリマーである。この例では、結合部分は、標的遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズしないが、その代りに、細胞表面マーカーのその特定のエピトープに結合する抗体と同様に、細胞表面マーカーに選択的に結合することができるポリ核酸である。
場合によっては、結合部分はペプチドである。場合によっては、ペプチドは約１～約３ｋＤａを含む。場合によっては、ペプチドは、約１．２～約２．８ｋＤａ、約１．５～約２．５ｋＤａ、あるいは約１．５～約２ｋＤａを含む。いくつかの例において、ペプチドは二環式ペプチドである。場合によっては、二環式ペプチドは束縛された二環式ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。いくつかの例において、結合部分は二環式ペプチド（例えば、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのｂｉｃｙｃｌｅｓ）である。
さらなる場合には、結合部分は小分子である。いくつかの例において、小分子は抗体動員小分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。場合によっては、抗体動員小分子は、標的結合末端および抗体結合末端を含み、標的結合末端はそれで細胞表面受容体を認識して、相互作用することができる例えば、いくつかの例において、グルタミン酸塩尿素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｕｒｅａ ）化合物を含む標的結合末端は、ＰＳＭＡとの相互作用を可能にし、それにより、ＰＳＭＡを発現する細胞との抗体相互作用を増強する。いくつかの例において、結合部分は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒｅｍｏｔｅ ａｒｅｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３２（３６）：１２７１１－１２７１６（２０１０）；あるいは、ＭｃＥｎａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ，” ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．７（７）：１１３９－１１５１（２０１２）に記載される小分子である。
抗体あるいはその抗原結合フラグメントの産生
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体とその抗原結合フラグメント）は、とりわけ、化学合成によって、あるいは組換え発現によって、ポリペプチド（例えば、抗体）の合成に役立つように、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して生成され、および、好ましくは組換え発現技術によって生成される。
いくつかの例において、抗体あるいはその抗原結合フラグメントは組換え発現され、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載されるような）から組み立てられ、これは、抗体をコードする配列の一部を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、オリゴヌクレオチドのアニーリングとライゲーション、および、その後のＰＣＲによるライゲートされたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
代替的に、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’と５’の末端へハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、あるいは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローンを作ることによって、適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは免疫グロブリンを発現する任意の組織あるいは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー）から随意に生成される。
いくつかの例において、抗体またはその抗原結合は、ポリクローｎａｌ 抗体を産生するためにウサギなどの動物を免疫化することにより、あるいは、より好ましくは、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）によって記載されるように、あるいは、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）またはＣｏｌｅら（１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）によって記載されるように、モノクローｎａｌ 抗体を産生することによって、随意に生成される。代替的に、少なくとも抗体のＦａｂ部分をコードするクローンは、特異性抗原に結合するＦａｂフラグメントのクローンのためにＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１に記載される）をスクリーニングすることにより、あるいは抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４；Ｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７を参照）をスクリーニングすることにより、随意に得られる。
いくつかの実施形態において、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１－８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４－６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２－４５４）の産生のために開発された技術が使用される。キメラ抗体は、異なる部分が、マウスのモノクローｎａｌ 抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト化抗体）を有する動物種などの様々な動物種に由来する分子である。
いくつかの実施形態において、単鎖抗体の産生について記載された技術（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６９４，７７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５４）は、単鎖抗体を産生するのに適している。単鎖抗体は、アミノ酸ブリッジによってＦｖ領域の重鎖または軽鎖のフラグメントを結合することによって形成され、結果として単鎖ポリペプチドを生じさせる。大腸菌中の機能的なＦｖフラグメントの組み立てのための技術も随意に使用される（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１）。
いくつかの実施形態において、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターあるいは抗体のヌクレオチド配列は、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、および、リン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞はその後、抗体を産生するために従来の技術によって培養される。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的、誘導可能、あるいは組織特異的なプロモーターによって調節される。
いくつかの実施形態において、様々な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するために利用される。そのような宿主発現系は、抗体のコード配列が生成され、その後精製されるビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で変形されるか、あるいはトランスフェクトされるときに、抗体またはその抗原結合フラグメントをインサイチュで発現する細胞も表す。これらは、限定されないが、組み換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいは抗体またはその結合フラグメントコード配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌と枯草菌）などの微生物；抗体あるいはその抗原結合フラグメントコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミケス・ピキア）；抗体あるいはその抗原結合フラグメントコード配列を含む組替えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウィルス）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または、抗体あるいはその抗原結合フラグメントコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネイン・プロモーター）のゲノム、あるいは、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む、組換え発現構築物を保護する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）を含む。
組換えタンパク質の長期的かつ高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。いくつかの例において、安定して抗体を発現する細胞株が随意に操作される。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換される。外来性ＤＮＡの導入後に、細胞を操作して栄養強化培地で１－２日間成長させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体に安定的に統合させ、成長し、クローン化されて細胞株へと拡張するフォーカスを形成するのを可能にする。この方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。
いくつかの例において、限定されないが、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、あるいはａｐｒｔ－細胞で利用される単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含む、多くの選択系が使用される。同様に、代謝拮抗薬の耐性は、以下の遺伝子の選定基準として使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２１５）、ならびに、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。使用可能な組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で知られている既知の方法は一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ａｎｄ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ．；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）に記載される。
いくつかの例において、抗体の発現レベルは、ベクター増幅によって増大する（検討のために、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７を参照）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増大すると、マーカー遺伝子のコピーの数が増大する。増幅した領域が抗体のヌクレオチド配列に関連しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
いくつかの例において、抗体または抗体コンジュゲートの精製あるいは分析のための当該技術分野で知られているいかなる方法が、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、とりわけ、プロテインＡの後の特異性抗原への親和性、および、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解性、あるいはタンパク質の精製のための他の標準的な技術によって使用される。例示的なクロマトグラフィー方法としては、限定されないが、強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーが挙げられる。
コンジュゲーション化学
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは結合部分にコンジュゲートする。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは、式Ａ－Ｘ－Ｂ（ＸはＡおよびＢをコンジュゲートするリンカーである）の中の結合部分にコンジュゲートされる。いくつかの例において、結合部分は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、炭水化物、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールなどのポリマー、ならびに、これらのクラスの物質のすべてのアナログあるいは誘導体を含む。結合部分の追加の例はさらに、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（例えば、飽和、不飽和、または、置換を含む）、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類などのステロイドを含む。いくつかの例において、結合部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの例において、ポリ核酸分子はさらにポリマーに結合され、随意にエンドソーム溶解性部分に結合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は化学的なライゲーションプロセスによって結合部分に結合する。いくつかの例において、ポリ核酸分子は天然のライゲーションによって結合部分に結合する。いくつかの例において、コンジュゲートは、以下に記載される：Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６６，７７６－７７９；Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，” Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，４３２５－４３２９；Ｈａｃｋｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，１００６８－１００７３；あるいは、Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，” Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，４１１６－４１２５。いくつかの例において、コンジュゲーションは米国特許第８，９３６，９１０号に記載されるとおりである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、天然のライゲーション化学を介して、結合部分に部位特異的あるいは非特異的に結合する。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、「トレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」カップリング技術（ＰｈｉｌｏＣｈｅｍ）を利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合する。いくつかの例において、「トレースレス」カップリング技術は、アルデヒド基を含むポリ核酸分子とその後結合される結合部分のＮ末端 １，２－アミノチオール基を利用する。（Ｃａｓｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ＪＡＣＳ １３４（１３）：５８８７－５８９２（２０１２）を参照）
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、結合部分に導入された非天然のアミノ酸を利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合する。いくつかの例において、非天然アミノ酸はｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例において、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するために、アルコキシ－アミン由来の結合部分に選択的に結合する。（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” ＰＮＡＳ １０９（４０）：１６１０１－１６１０６（２０１２））を参照）。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、酵素触媒プロセスを利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合する。いくつかの例において、部位指定的な方法はＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｃａｔａｌｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を利用する。いくつかの例において、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスを介するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残留物の生成、および、ヒドラジノ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ（ＨＩＰＳ）ライゲーションを介するアルキルヒドラジン機能化ポリ核酸分子へのＦＧｌｙのその後の結合を含む。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ，” ＰＮＡＳ １０６（９）：３０００－３００５（２００９）；Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＮＡＳ １１０（１）：４６－５１（２０１３）を参照）
いくつかの例において、酵素触媒プロセスは、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子は、微生物トランスグルタミナーゼ触媒プロセスを用いて結合部分に結合する。いくつかの例において、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と機能化されたポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例において、ｍＴＧはストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）から産生される。（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ：ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２） １６１－１６７（２０１３）を参照）
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、配列特異的なトランスペプチダーゼを利用するＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１４０３１７号に記載されるような方法によって結合部分に結合する。
いくつかの例において、ポリ核酸分子は、米国特許公開第２０１５／０１０５５３９号および第２０１５／０１０５５４０号に記載されるような方法によって結合部分に結合する。
ポリマー結合部分
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはさらに、本明細書に記載されるポリ核酸分子、本明細書に記載される結合部分、あるいはこれらの組み合わせに結合する。いくつかの例において、ポリマー部分Ｃは、式Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃ（Ｘ１、Ｘ２は、ＡおよびＢ、ＢおよびＣをそれぞれコンジュゲートする２つのリンカーである）の中のコンジュゲートされたポリ核酸分子である。ポリ核酸分子に結合する。場合によっては、ポリマー部分Ｃは結合部分に結合する。他の場合には、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子結合部分分子に結合する。さらなる場合には、ポリマー部分Ｃは上で例証されるように結合する。
いくつかの例において、ポリマー部分Ｃは分枝したあるいは分枝していない単量体、および／または、二次元または三次元の単量体の架橋したネットワークの長鎖からなる、天然または合成のポリマーである。いくつかの例において、ポリマー部分Ｃは多糖、リグニン、ゴム、あるいはポリアルキルエンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。いくつかの例において、少なくとも１つのポリマー部分Ｃとしては、限定されないが、アルファ－、オメガ－ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生分解性ラクトンベースのポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ、またはＰＥＴＥとしても知られている）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、あるいはポリウレタン、およびこれらの混合物が挙げられる。本明細書で使用されるように、混合物は、ブロックコポリマーに関連する場合と同様に、同じ化合物内の様々なポリマーの使用を指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーの単量体から構築されるポリマーである。いくつかの例において、ポリマー部分Ｃはポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例において、ポリマー部分ＣはＰＥＧを含む。いくつかの例において、ポリマー部分Ｃはポリエチレン・イミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。
いくつかの例において、ＣはＰＥＧ部分である。いくつかの例において、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端で結合されるが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端で結合する。いくつかの例において、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端で結合されるが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端で結合する。いくつかの例において、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の内部部位に結合する。いくつかの例において、ＰＥＧ部分、結合部分、あるいはその組み合わせは、ポリ核酸分子の内部部位に結合する。いくつかの例において、コンジュゲートは直接コンジュゲートである。いくつかの例において、結合は天然のライゲーションを介するものである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、多分散または単分散の化合物である。いくつかの例において、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度を特徴とする、異なる分子量の材料の分散した分布を含む。いくつかの例において、単分散のＰＥＧは１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃは多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）分子の分子量の平均を表す。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＣはＰＥＧであり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、あるいは１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約６００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約７００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約８００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約９００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１１００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１２００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１３００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１４００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１４５０Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１６００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１７００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１８００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１９００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２１００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２２００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２３００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２４００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２６００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２７００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２８００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２９００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３２５０Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３３５０Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３７５０Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４２５０Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４６００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４７５０Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約５０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約５５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約６０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約６５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約７０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約７５００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約８０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１０，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１２，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約２０，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約３５，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約４０，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約５０，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約６０，０００Ｄａである。いくつかの例において、Ｃの分子量は約１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、別々のエチレンオキシド単位（例えば、４～約４８のエチレンオキシド単位）を含む。いくつかの例において、別々のエチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシドは直鎖である。他の例では、別々のエチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシドは分枝鎖である。
いくつかの例において、ポリマー部分Ｃは別々のエチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）である。場合によっては、ポリマー部分Ｃは約４～約４８エチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８のエチレンオキシド単位を含む。
いくつかの例において、ポリマー部分Ｃは例えば、約４～約４８エチレンオキシド単位を含む別のＰＥＧを含む。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８のエチレンオキシド単位を含む、別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。
場合によっては、ポリマー部分Ｃは、ｄＰＥＧ（登録商標）（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）である。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはカチオン性ムチン酸ベースのポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。いくつかの例において、ｃＭＡＰは、少なくとも１つの反復サブユニットの１つ以上のサブユニットを含み、サブユニット構造は式（∨）として表される：
ここで、ｍは、各出現時、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、好ましくは、４－６、または５であり；および、ｎは、各出現時、独立して、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態において、ｍとｎは、例えば、約１０である。
いくつかの例において、ｃＭＡＰはさらにＰＥＧ部分に結合し、ｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。いくつかの例において、ＰＥＧ部分は約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲である。いくつかの例において、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ～約１０００Ｄａ、１０００Ｄａよりも大きい～約５０００Ｄａ、５０００Ｄａよりも大きい～約１０，０００Ｄａ、１０，０００よりも大きい～約２５，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａよりも大きい～約５０，０００Ｄａ、あるいはこれらの範囲の２つ以上の任意の組み合わせである。
いくつかの例において、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合によっては、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマーである。他の場合には、ポリマー部分ＣはｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合には、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃは、上で例証されるように、ポリ核酸分子、結合部分、および、随意にエンドソーム溶解性部分に結合する。
エンドソーム溶解性または細胞膜透過部分
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子はさらに、追加の結合部分を含む。いくつかの例において、追加の結合部分は、エンドソーム溶解性部分および／または細胞膜透過部分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、細胞区画放出成分、例えば、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、あるいは細胞を有する他の小胞体などの、当該技術分野で知られている細胞の区分のいずれかから放出することができる化合物である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、あるいはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合では、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリマーを含む。場合によっては、細胞膜透過部分は細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む。他の場合では、細胞膜透過部分は細胞透過脂質を含む。他の場合では、細胞膜透過部分は細胞透過小分子を含む。
エンドソーム溶解性および細胞膜浸透ポリペプチド
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性ポリペプチドとさらに結合する。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドはｐＨ依存性膜活性ペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは両親媒性ポリペプチドである。追加の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはペプチド模倣薬である。いくつかの例において、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、ムチン（ｍｅｕｃｉｎ）、あるいはそのそれぞれの誘導体を含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦまたはその誘導体を含む。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、メリチンまたはその誘導体を含む。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ムチンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例において、ＩＮＦ７は２４残留物ポリペプチドであり、これらの配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（配列番号３３１）、あるいはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（配列番号３３２）を含む。いくつかの例において、ＩＮＦ７またはその誘導体は、以下の配列を含む：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ（配列番号３３３）、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧ－（ＰＥＧ）６－ＮＨ２（配列番号３３４）、または ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ－ＳＧＳＣ－Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２（配列番号３３５）。
場合によっては、メリチンは２６残基ポリペプチドであり、この配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（配列番号３３６）、あるいはＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号３３７）を含む。いくつかの例において、メリチンは、米国特許第８，５０１，９３０号に記載されるポリペプチド配列を含む。
いくつかの例において、ムチンは、サソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）の毒液腺に由来する抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。いくつかの例において、ムチンはムチン－１３（これらの配列は、ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ－ＮＨ２（配列番号３３８）を含む）およびムチン－１８（これらの配列は、ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（配列番号３３９）を含む）から構成される。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、その配列がＩＮＦ７あるいはその誘導体に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは９９％の配列同一性であるポリペプチド、メリチンあるいはその誘導体、または、ムチンあるいはその誘導体を含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはムチンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分はＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３１－３３５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３２－３３５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３１を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３２－３３５を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３１からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３２－３３５からなる。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分はメリチンまたはその誘導体である。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３６または３３７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号２８６を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３７を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３６からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３７からなる。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分はムチンまたはその誘導体である。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３８または３３９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３８を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３９を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３８からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は配列番号３３９からなる。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は表８で例証されるような配列を含む。

場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、Ｂｃｌ－２および／またはＢｃｌ－ｘＬなどの抑制因子標的の拮抗を介してアポトーシスを誘発するＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、Ａｌｂａｒｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ，” Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７１：２６１－２６５（２０１１）に記載されるＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３／１６６１５５号またはＷＯ２０１５／０６９５８７号に記載されるようなポリペプチド（例えば、細胞透過性ポリペプチド）を含む。
エンドソーム溶解性脂質
いくつかの実施形態において、エンドソーム溶解性部分は脂質（例えば、融合性脂質）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性脂質（例えば、融合性脂質）とさらに結合する。例示的な融合性脂質は、１，２－ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６、９、２８、３１－テトラエン－１９－オール（Ｄｉ－Ｌｉｎ）、およびＮ－メチル（２，２－ジ（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ－ｋ－ＤＭＡ）ならびにＮ－メチル－２－（２，２－ジ（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタンアミン（ＸＴＣ）を含む。
いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０９／１２６，９３３に記載される脂質（例えば、融合性脂質）である。
エンドソーム溶解性小分子
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は小分子である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性小分子とさらに結合する。エンドソーム溶解性部分として適切な例示的な小分子としては、限定されないが、キニーネ、クロロキン、水酸化クロロキン、アモジアキン（ｃａｒｎｏｑｕｉｎｅｓ）、アモピロキン、プリマキン、メフロキン、ｎｉｖａｑｕｉｎｅｓ、ハロファントリン、キノンイミン、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例において、キノリンエンドソーム溶解性部分としては、限定されないが、７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（クロロキン）；７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）；７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン；４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）；７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；４－（４－エチル－（２－ヒドロキシ－エチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ－）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；ヒドロキシクロロキンホスフェート；７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル－１）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルヒドロキシクロロキン）；７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ（キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；８－［（４－アミノペンチル）アミノ－６－メトキシジヒドロクロリドキノリン；１－アセチル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン；８－［（４－アミノペンチル）アミノ］－６－メトキシキノリンジヒドロクロリド；１－ブチリル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン；３－クロロ－４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン）（４－［（４－ジエチル－アミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン；３－フルオロ－４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン（４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン；４－（４－ヒドロキシ－α、α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン；４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン；３，４－ジヒドロ－１－（２Ｈ）－キノリンカルボキシアルデヒド；１、１’－ペンタメチレンキノリニウムヨージド；８－硫酸キノリノールおよびアミノ、アルデヒド、カルボン酸、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフヒドリル、ならびにビニル誘導体またはそのアナログ。いくつかの例において、エンドソーム溶解性部分は、Ｎａｉｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ（１９９７，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８０：８８４－８９３）および米国特許第５，７３６，５５７号に記載される小分子である。
細胞透過性ポリペプチド（ＣＰＰ）
いくつかの実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、５～３０個のアミノ酸を有する正に荷電した短いペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、アルギニンまたはリジンに富むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、表９に列挙された任意のポリペプチドまたはその組み合わせを含む
リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである。いくつかの例において、リンカーは切断可能なリンカーである。他の例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。
場合によっては、リンカーは非ポリマーリンカーである。非ポリマーリンカーは、重合プロセスによって生成された単量体の反復単位を含まないリンカーを指す。例示的な非ポリマーリンカーとしては、限定されないが、Ｃ１－Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。場合によっては、非ポリマーリンカーは、Ｃ１－Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせを含む。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは、２つを超える同じタイプのリンカー、例えば、２つを超えるホモ二機能性架橋リンカー、あるいは２つを超えるペプチドリンカーを含まない。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは随意に１つ以上の反応性官能基を含む。
いくつかの例において、非ポリマーリンカーは、上に記載されたポリマーを包含しない。いくつかの例において、非ポリマーリンカーは、ポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）を包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはＰＥＧを包含しない。
いくつかの例において、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。例示的なホモ二機能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’－ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデートピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、４、４’－ジフルオロ－３、３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３、３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレン・スルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、あるいは、Ｎ，Ｎ’－ヘキサメチレン－ビス（ヨードアセトアミド）を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。例示的なヘテロ二機能性リンカーとしては、限定されないが、アミン反応的およびスルフヒドリル架橋リンカー、例えば、Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノアート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ｉｏｄｏａｃｔｅｙｌ）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド・エステル（ＧＭＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢ）、スクシンイミジル ６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノアート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル ６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノアート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル ４－（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル ６－（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノアート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）などのカルボニル反応的およびスルフヒドリル反応的な架橋リンカー、アミン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノアート（スルホ－ＮＨ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ρ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル ４－（ρ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル ２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル ７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ρ－ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン－４－マレイミドカルボニル反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ－アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボン酸塩反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、および、アルギニン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ－アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）が挙げられる。
いくつかの例において、リンカーは反応性官能基を含む。場合によっては、反応性官能基は、結合部分に存在する求電子基に反応性の求核基を含む。例示的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシル、または酸無水物などのカルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、反応性官能基はアルデヒドである。例示的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド基を含む。いくつかの例において、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。いくつかの例において、マレイミド基はカプロン酸をさらに包含し、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成する。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上に記載されたスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、あるいは、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
いくつかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例において、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用をもたらすために、マレイミドに隣接する塩基性アミノ基を取り込むべくジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それによって、マレイミドがレトロマイケル反応による脱離反応を経験することのないようにする。いくつかの例において、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｌｆ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（１０）：１０５９－１０６２（２０１４） に記載されるマレイミド基である。いくつかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドである。
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド部分を含む。いくつかの例において、ペプチド部分は、少なくとも２、３、４、５、または６より多くのアミノ酸残基を含む。いくつかの例において、ペプチド部分は、多くとも２、３、４、５、６、７、または８のアミノ酸残基を含む。いくつかの例において、ペプチド部分は、約２、約３、約４、約５、あるいは約６のアミノ酸残基を含む。いくつかの例において、ペプチド部分は、切断可能なペプチド部分（例えば、酵素的または化学的に）である。いくつかの例において、ペプチド部分は切断不可能なペプチド部分である。いくつかの例において、ペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙを含む。いくつかの例において、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙなどのペプチド部分を含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ－Ｃｉｔを含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ－Ｃｉｔである。
いくつかの実施形態において、リンカーは安息香酸基あるいはその誘導体を含む。いくつかの例において、安息香酸基あるいはその誘導体はパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例において、安息香酸基あるいはその誘導体はγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、任意の組み合わせにおける、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例において、マレイミド基はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例において、ペプチド基はｖａｌ－ｃｉｔである。いくつかの例において、安息香酸基はＰＡＢＡである。いくつかの例において、リンカーはｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。場合によっては、リンカーはｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合には、リンカーはｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは自壊性リンカーあるいは自己排除リンカーである。場合によっては、リンカーは自壊性リンカーである。他の場合には、リンカーは自己排除リンカー（例えば、環化自己排除リンカー）である。いくつかの例において、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４あるいはＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０３８４２６に記載されるリンカーを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは樹状型リンカーである。いくつかの例において、樹状型リンカーは分岐した多機能リンカー部分を含む。いくつかの例において、樹状型リンカーは、ポリヌクレオチドＢ対結合部分Ａのモル比を増加させるために使用される。いくつかの例において、樹状型リンカーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、トレースレスリンカーあるいは切断後にリンカー部分（例えば、原子あるいはリンカー基）を結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、またはエンドソーム溶解性部分Ｄに残さないリンカーである。例示的なトレースレスリンカーは、限定されないが、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、あるいはフェニルヒドラジドリンカーを含む。場合によっては、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ－ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）：２４９３－２４９７（２０１３）に記載されるトレースレスアリール－トリアゼンリンカーである。いくつかの例において、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：２６０７－２０２４（２００２）に記載されるトレースレスリンカーである。いくつかの例において、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号に記載されるトレースレスリンカーである。
いくつかの実施形態では、リンカーは、米国特許第６，８８４，８６９号；第７，４９８，２９８号；第８，２８８，３５２号；第８，６０９，１０５号；あるいは、第８，６９７，６８８号；米国特許公開第２０１４／０１２７２３９号；第２０１３／０２８９１９号；第２０１４／２８６９７０号；第２０１３／０３０９２５６号；第２０１５／０３７３６０号；あるいは、第２０１４／０２９４８５１号；または、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５０５７６９９号；第ＷＯ２０１４０８０２５１号；第ＷＯ２０１４１９７８５４号；第ＷＯ２０１４１４５０９０号；あるいは、第ＷＯ２０１４１７７０４２号に記載されるリンカーである。
いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して、単結合あるいは非ポリマーリンカーである。いくつかの例において、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して単結合である。場合によっては、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して非ポリマーリンカーである。
いくつかの例において、Ｘ１は単結合または、非ポリマーリンカーを含む。いくつかの例において、Ｘ１は単結合である。いくつかの例において、Ｘ１は非ポリマーリンカーである。いくつかの例において、リンカーはＣ１－Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｘ１は、例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基などのＣ１－Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｃ１－Ｃ６アルキル基は非置換のＣ１－Ｃ６アルキル基である。リンカーの文脈において、とりわけ、Ｘ１の文脈において使用される場合、アルキルは、最大で６つの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。いくつかの例において、Ｘ１は上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ１はヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ１はｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキル基に随意に結合したヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、Ｘ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキル基に随意に結合したｓＭＣＣを含む。いくつかの追加例では、Ｘ１は、上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含まない。
いくつかの例において、Ｘ２は単結合またはリンカーである。いくつかの例において、Ｘ２は単結合である。その他の場合において、Ｘ２はリンカーである。さらなる場合には、Ｘ２は非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＣ１－Ｃ６アルキル基である。いくつかの例において、Ｘ２は上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例において、Ｘ２は上に記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例において、Ｘ２は上に記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例において、Ｘ２は、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例において、Ｘ２はＶａｌ－Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例において、Ｘ２はＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｘ２は、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。
使用の方法
筋萎縮症は、筋肉量の喪失および／または筋肉の進行性の低下と変性を指す。場合によっては、筋肉量の喪失あるいは筋肉の進行性の低下と変性は、高いタンパク質分解率、低いタンパク質合成率、あるいは両方の組み合わせによって生じる。場合によっては、高い筋タンパク質分解率は、筋タンパク質異化作用（つまり、糖新生のために基質としてアミノ酸を使用するための筋タンパク質の分解）による。
１つの実施形態では、筋萎縮症は、筋力の著しい喪失を指す。筋力の著しい喪失によって、対照被験体の同じ筋組織と比較して、被験体の病気の、損傷した、あるいは未使用の筋組織の強度の低下を意味する。ある実施形態において、筋力の著しい喪失は、対照被験体の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上の強度の低下である。別の実施形態では、筋力の著しい喪失によって、使用不能期間の前の同じ被験体の同じ筋組織の筋力と比較して、未使用の筋組織の強度の低下を意味する。ある実施形態において、筋力の著しい喪失は、使用不能期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋強度と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上の低下である。
別の実施形態では、筋萎縮症は、筋肉量の著しい喪失を指す。筋肉量の著しい喪失によって、対照被験体の同じ筋組織と比較して、被験体の病気の、損傷した、あるいは未使用の筋組織の筋肉体積の減少を意味する。ある実施形態において、筋肉体積の著しい喪失は、対照被験体の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上である。別の実施形態では、筋肉量の著しい喪失によって、使用不能期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋肉体積と比較して、未使用の筋組織の筋肉体積の低下を意味する。ある実施形態において、筋肉組織の著しい喪失は、使用不能期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋肉体積と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上である。筋肉体積は、磁気共鳴撮像（例えば、筋肉体積／断面積（ＣＳＡ）ＭＲＩ方法による）によるなど筋肉の断面積を評価することにより随意に測定される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリ核酸分子を提供する工程、および治療有効量の本明細書に記載のポリ核酸分子または本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートを対象に投与してヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物の量を減少させる工程を含む、対象の筋萎縮を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、筋萎縮は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）に関連する。ポリ核酸部分は、対象の筋萎縮の調節に関して、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４発現によって影響を受ける１つ以上のマーカー遺伝子の発現も、ヒトＤＵＸ４の発現低下によって変動または調節（例えば、低下）される。マーカー遺伝子には、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、１つ以上のマーカー遺伝子の発現は、未処理の細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％減少する。いくつかの実施形態において、グループまたは複合体としての１つ以上のマーカー遺伝子の発現は、未処理の細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％減少する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートを提供する工程、および治療有効量の本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートを対象に投与する工程、および上記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む、対象における筋萎縮を処置する方法である。場合によっては、筋萎縮はＦＳＨＤに関連している。ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートは、対象における筋萎縮を治療するために、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、これは、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートの治療有効量を対象に投与する工程、および上記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＤＵＸ４ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲート（ＤＵＸ４ｓｉＲＮＡコンジュゲートまたはＤＵＸ４－ＡＯＣ）を提供する工程、および治療有効量のＤＵＸ４ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートを対象に投与する工程、および前記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む、対象の筋萎縮を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、筋萎縮はＦＳＨＤに関連している。ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートは、対象の筋萎縮を治療するために、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、これは、治療有効量の本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートを対象に投与する工程、および前記対象においてヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲート（ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡコンジュゲートまたはＤＵＸ４－ＡＯＣ）を提供する工程、治療有効量の本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートを対象に投与する工程、および上記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む、対象におけるＦＳＨＤを処置する方法である。場合によっては、ＦＳＨＤは１型ＦＳＨＤ（ＦＳＨＤ１）である。場合によっては、ＦＳＨＤは２型ＦＳＨＤである。ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートは、対象におけるＦＳＨＤを治療するために、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、これは、治療有効量の本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを対象に投与する工程、および上記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４発現によって影響を受ける１つ以上のマーカー遺伝子の発現レベルも、ヒトＤＵＸ４の発現レベルの低下によって変化または調節される。ＤＵＸ４バイオマーカー遺伝子には、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＤＵＸ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲート（ＤＵＸ４－ｓｉＲＮＡコンジュゲートまたはＤＵＸ４－ＡＯＣ）を提供する工程、および、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることにより、治療有効量の本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを対象に投与する工程を含む、ＦＳＨＤの対象における症状を軽減する方法が本明細書に記載される。場合によっては、ＦＳＨＤは１型ＦＳＨＤ（ＦＳＨＤ１）である。場合によっては、ＦＳＨＤは２型ＦＳＨＤである。別の実施形態では、ＦＳＨＤ患者の症状を軽減する方法であって、本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する工程、および、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させること、またはＤＵＸ４タンパク質のレベルを低下させることによって、本明細書に記載の治療有効量のｓｉＲＮＡコンジュゲートをＦＳＨＤ患者に投与する工程を含む方法が、本明細書に記載される。
場合によっては、ＦＳＨＤの症状は骨格筋に影響を与える。ＦＳＨＤの影響を受ける骨格筋には、目と口の周りの筋肉、肩の筋肉、上腕の筋肉、下肢の筋肉、腹筋、および股関節の筋肉が含まれる。場合によっては、ＦＳＨＤの症状は視覚や聴覚にも影響を及ぼす。場合によっては、ＦＳＨＤの症状が心臓や肺の機能にも影響を与える。場合によっては、ＦＳＨＤの症状には、筋力低下、筋萎縮、筋ジストロフィー、痛みの炎症、拘縮、脊柱側弯症、前弯症、低換気、網膜の異常、角膜炎への曝露、軽度の難聴、およびＥＭＧ異常が含まれる。
いくつかの実施形態において、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させること、またはＤＵＸ４タンパク質のレベルを低下させることによって、治療有効量の本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートをＦＳＨＤ患者に投与する工程を含む、ＦＳＨＤ患者の骨格筋機能を改善する方法が本明細書に記載される。場合によっては、ＦＳＨＤは１型ＦＳＨＤ（ＦＳＨＤ１）である。いくつかの例では、ＦＳＨＤは２型ＦＳＨＤである。いくつかの実施形態において、ＦＳＨＤに罹患している患者の骨格筋機能、視覚、聴覚、心機能または肺機能を改善する方法が本明細書に記載され、上記方法は、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させるか、またはＤＵＸ４タンパク質のレベルを低下させることにより、治療有効量の本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートをＦＳＨＤ患者に投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）抗体コンジュゲート（ＡＳＯコンジュゲート）を提供する工程、および治療有効量のＡＳＯ抗体コンジュゲートを対象に投与する工程、および上記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む、対象におけるＦＳＨＤを治療する方法である。場合によっては、ＦＳＨＤは１型ＦＳＨＤ（ＦＳＨＤ１）である。場合によっては、ＦＳＨＤは２型ＦＳＨＤである。ＡＳＯコンジュゲートは、対象におけるＦＳＨＤを処置するために、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、これは、治療有効量の本明細書に記載のＡＳＯ－抗体コンジュゲートを対象に投与する工程、および上記対象におけるヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程を含む。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４発現によって影響を受ける１つ以上のマーカー遺伝子の発現レベルも、ヒトＤＵＸ４の発現レベルの低下によって変化または調節される。 ＤＵＸ４バイオマーカー遺伝子には、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、対象におけるＦＳＨＤを処置する方法が本明細書に記載される。場合によっては、ＦＳＨＤ被験者はＦＳＨＤ１に罹患している。他の例では、ＦＳＨＤ被験者はＦＳＨＤに罹患している。別の実施形態において、ＦＳＨＤ対象は、第４染色体の長腕のＤ４Ｚ４領域における遺伝的およびエピジェネティックな分子変化によって引き起こされるＤＵＸ４タンパク質を異常に発現する筋細胞を有する。筋細胞における遺伝的な分子変化は、ＦＳＨＤ対象の第４染色体の通常の１１から１００の反復の代わりに、１から１０の反復を含むＤ４Ｚ４領域の短縮につながる変異である。筋細胞におけるエピジェネティックな分子変化は、ＦＳＨＤ患者の第４染色体のＤ４Ｚ４領域の低メチル化につながる変化である。場合によっては、筋細胞は骨格筋細胞である。
医薬製剤
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬製剤は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、頬側、直腸、または経皮の投与経路を含む複数の投与経路によって、被験体に投与される。いくつかの例において、本明細書に記載される医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、髄腔内、大脳内、脳室内、あるいは頭蓋内）投与のために製剤化される。他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。また他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は、経鼻投与のために製剤化される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、限定されないが、水性分散液、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固形剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル、丸剤、遅延放出製剤、拡張放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、および、即時放出と制御放出の混合製剤を含む。
いくつかの例において、医薬製剤は多粒子製剤を含む。いくつかの例において、医薬製剤はナノ粒子製剤を含む。いくつかの例において、ナノ粒子は、ｃＭＡＰ、シクロデキストリン、あるいは脂質を含む。場合によっては、ナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、あるいはミセル溶液を含む。さらなる例示的なナノ粒子としては、限定されないが、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、および量子ドットが挙げられる。いくつかの例において、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、およびこれらの組み合わせ、その合金またはオキシドのナノ粒子である。
いくつかの例において、ナノ粒子は、コア、あるいは、コアシェルナノ粒子におけるように、コアとシェルを含む。
いくつかの例において、ナノ粒子は、（例えば、本明細書に記載されるポリ核酸分子または結合部分の１つ以上との）機能要素の結合のために分子でさらにコーティングされる。いくつかの例において、コーティングは、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（あるいはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、α－キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、またはデキストリンあるいはシクロデキストリンを含む。いくつかの例において、ナノ粒子はグラフェンコーティングされたナノ粒子を含む。
場合によっては、ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、あるいは１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有する。
いくつかの例において、ナノ粒子製剤は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、または量子ドットを含む。いくつかの例において、本明細書に記載されるポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に結合する。いくつかの例において、本明細書に記載される少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、あるいはそれ以上のポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に結合する。
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、送達ベクター、例えば、細胞へのポリ核酸分子の送達のための組換えベクターを含む。いくつかの例において、組換えベクターはＤＮＡプラスミドである。他の例において、組換えベクターは、ウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、あるいはアルファウイルスに由来したベクターを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子を発現することができる組換えベクターは、標的細胞中での安定した発現をもたらす。さらなる例では、ポリ核酸分子の一時的発現をもたらすウイルスベクターが使用される。
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、本明細書で開示される組成物との適合性ならびに所望の投与形態の放出プロフィール特性に基づいて選択された担体または担体材料を含む。例示的な担体物質としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、加湿剤、希釈剤などが含まれる。薬学的に適合可能な担体材料としては 限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖ステアロイル乳酸ナトリウム（ｓｕｇａｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどが挙げられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照。
いくつかの例において、医薬製剤はさらに、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および、塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基、ならびに、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、ｐＨ調節剤または緩衝剤をさらに含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持するのに必要な量で含まれる。
いくつかの例において、医薬製剤は、組成物の浸透圧を許容可能な範囲にするのに必要な量の１つ以上の塩を含む。こうした塩は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオン、ならびに塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または重亜硫酸塩のアニオンを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および、硫酸アンモニウムを含む。
いくつかの例において、医薬製剤は、より安定した環境を提供することから、化合物を安定させるために使用される希釈剤をさらに含む。限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水を含む緩衝液中に溶解した塩（ｐＨの制御あるいは維持ももたらす）が、当該技術分野の希釈剤として利用される。特定の例において、希釈剤は、組成物の大きさを増大させて、圧縮を促進するか、またはカプセル充填のための均質な混合のために十分な大きさ（ｂｕｌｋ）を作り出す。そのような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；リン酸水素カルシウム、リン酸カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水乳糖、噴霧乾燥したラクトース；α化デンプン、Ｄｉ－Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮可能な糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセタート・ステアラート、スクロース系の希釈剤、粉砂糖；一塩基の硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストラート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）；加水分解したシリアル固形物、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
場合によっては、医薬製剤は、物質の分解または崩壊を促進するための崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）または崩壊物質（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を含む。用語「崩壊する」は、胃腸液と接触した際の剤形の溶解および分散の両方を含む。崩壊剤の例は、デンプン、例えば、天然のデンプン、例えば、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン、α化デンプン、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ １５５１またはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）、またはナトリウムデンプングリコラート、例えば、Ｐｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）またはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、セルロース、例えば、木製品、メチル結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎ Ｔｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標））、メチルセルロース、クロスカルメロース、または架橋セルロース、例えば、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｃ－Ｄｉ－Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、または架橋クロスカルメロースの架橋デンプン、例えば、ナトリウムデンプングリコラート、クロスポビドンなどの架橋ポリマー、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、例えばアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸の塩、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、ゴム、例えば、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、またはトラガカント、ナトリウムデンプングリコラート、ベントナイト、天然のスポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘類のパルプ、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプンを組み合わせたラウリル硫酸ナトリウムなどを含む。
いくつかの例において、医薬製剤は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、α化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの充填剤を含む。
潤滑剤と滑剤も、材料の癒着あるいは摩擦を防ぎ、減少させ、阻害するための本明細書に記載される医薬製剤に随意に含まれる。典型的な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ナトリウム・ステアリル・フマラート、鉱油などの炭化水素、水素添加大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの硬化植物油、高級脂肪酸、およびアルカリ金属とアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ－４０００）またはメトキシポリエチレン・グリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイダルシリカ、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
可塑剤は、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化することでそれらの脆さを抑えるために使用される化合物を含む。適切な可塑剤は、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、トリアセチンを含む。可塑剤は、分散剤または湿潤剤としても機能する。
可溶化剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００－６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
安定剤は、任意の抗酸化剤、緩衝液、酸、防腐剤などの化合物を含む。
懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、あるいは、ポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００から約６０００まで、約３３５０から約４０００まで、または約７０００から約５４００までの分子量を有する）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースステアリン酸アセテート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、グアーゴム、キサンタンゴムを含むキサンタン、糖、セルロース系、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの、化合物を含む。
界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン・ソルビタンモノオレート、ポリソルベート、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁塩、グリセリルモノステアレート、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。付加的な界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油）；および、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０などを含む。しばしば、界面活性剤は、物理的安定性を高めるために、または他の目的のために含まれる。
粘度増強剤は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサン、およびこれらの組み合わせを含む。
湿潤剤は、オレイン酸、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドクサートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
治療レジメン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は治療用途のために投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１日に一回、１日に２回、１日に３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１日、１週おき、月２週間、月３週間、月１回、月２回、月３回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間投与される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の医薬組成物は同時に、連続して、またはある時間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、１以上の医薬組成物は同時に投与される。場合によっては、１つ以上の医薬組成物は連続して投与される。さらなる場合には、１以上の医薬組成物は、ある時間間隔で投与される（例えば、第１の医薬組成物の第１の投与は１日目であり、その後、少なくとも第２の医薬組成物の投与前に少なくとも１、２、３、４、５日またはそれ以上の間隔を空ける）。
いくつかの実施形態において、２つ以上の様々な医薬組成物が同時投与される。いくつかの例において、２以上の異なる医薬組成物が同時に投与される。場合によっては、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間の間隔なく連続して同時投与される。他の場合には、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間に約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日の間隔をおいて連続して同時投与される。
患者の状態が改善している場合、医者の判断で、組成物の投与は継続的に行われ；代替的に、投与されている組成物の用量は、一時的に減少されるか、または特定の期間の間一時的に中断される（つまり、「休薬期間」）。いくつかの例において、休薬期間の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む、２日～１年の間で変わる。休薬日中の投与量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％を含む、１０％～１００％である。
いったん患者の状態が改善すると、必要に応じて維持量が投与される。その後、投与量または投与頻度、あるいはその両方は、症状に応じて、改善された疾患、障害、または疾病が保持されるレベルにまで減少可能である。
いくつかの実施形態では、このような量に対応する所定の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要としている被験体または宿主の性質（例えば、体重）などの要因に左右されるが、それにもかかわらず、例えば、投与されている具体的な薬剤、投与経路、および処置されている被験体または宿主を含む、症例を取り囲む特定の環境に従って、当該技術分野で既知の方法で日常的に判定される。いくつかの例において、所望の投与量は一回量で、あるいは、同時に（または短時間にわたって）、あるいは適切な間隔を置いて投与された分割量、例えば、１日当たり２、３、あるいは４以上の分割用量（ｓｕｂ－ｄｏｓｅｓ）として、都合よく提示される。
個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値から大きく逸脱することは珍しいことではない。そのような投与量は、限定されないが、使用される化合物の活性、処置される疾患または疾病、投与の様式、個々の被験体の必要条件、処置されている疾患または疾病の重症度、および医師の判断を含む、多くの変数に依存して変更される。
いくつかの実施形態において、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（母集団の５０％までの致死投与量）と、ＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な投与量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤化するのに使用される。こうした化合物の投与量は、最小限の毒性を備えるＥＤ５０を含む一連の循環濃度内に位置するのが好ましい。投与量は、使用される剤形と利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わる。
キット／製品
ある実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の組成物と方法とともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装または容器を含み、各容器は、本明細書中に記載されている方法を使用するための別個の要素の１つを備える。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および選択された製剤と意図した投与および処置のモードに適する任意の包装材料が挙げられる。
例えば、容器は、本明細書に記載される標的核酸分子を含む。そのようなキットは、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
キットは典型的には、内容物および／または使用説明書を列挙するラベルと、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
１つの実施形態では、ラベルが容器上にあるか容器に付随する。一実施形態において、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるか、あるいは刻まれている場合は、ラベルは容器上に取付けられる。ラベルは、例えば、添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在するとき、容器に付随する。一実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために使用される。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物の使用方法も示している。
ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供された化合物を含む１つ以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置で提示される。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が添付してある。一実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、政府機関の承認を反映するものである。このような通知書は、例えば、処方薬または承認された添付文書に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。一実施形態において、適合する製薬担体で製剤化される本明細書で提供される化合物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられ、示された疾病の処置のためにラベル付けされる。
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、主題が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は例示的かつ説明的なものに過ぎず、任意の主題に限定されるものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に他のことを定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。
本明細書で使用されるように、範囲と量は「約」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。
本明細書で使用される段落の見出しは、組織化するためのものに過ぎず、記載される主題を制限するものと解釈されてはならない。
本明細書で使用されるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況に制限されない。
「治療上有効な量」との用語は、哺乳動物の被験体において所望の治療効果を提供するのに十分なポリ核酸分子コンジュゲートの量を指す。場合によっては、その量は、障害または再発性障害の少なくとも１つの症状を処置するため、予防するため、その発症を予防するため、上記症状を治癒するため、遅らせるため、その重症度を軽減するため、改善するため、あるいは、そのような治療のない場合に予想される以上に患者の生存期間を延長するために、患者（ヒトなど）への単回または複数回の投与量である。当然、治療上有効な量を提供するために使用される特定のポリ核酸分子コンジュゲートの投与量レベルは、損傷の種類、被験体の年齢、体重、性別、被験体の病状、疾病の重症度、投与経路、および使用される特定の阻害剤に依存して変化する。いくつかの例において、治療上有効な量のポリ核酸分子コンジュゲートは、本明細書に記載されたように、細胞培養物と動物モデルから最初に評価される。例えば、細胞培養方法で決定されたＩＣ５０値は随意に、動物モデル中の出発点として役立ち、その一方で、動物モデルで決定されたＩＣ５０値はヒトにおける治療上有効な量を見つけるために随意に使用される。
骨格筋あるいは随意筋は通常、腱によって骨へ固定され、移動あるいは姿勢を維持する際など骨格の動きをもたらすために通常使用される。骨格筋の複数の制御は一般的に無意識の反射（例えば、姿勢筋または横隔膜）として維持されるが、骨格筋は意識的な制御に反応する。平滑筋あるいは不随意筋は、食道、胃、腸、子宮、尿道、および血管などの臓器や構造の壁内で見られる。
骨格筋は、２つの広範な型：Ｉ型（あるいは「遅い収縮」）とＩＩ型（あるいは「速い収縮」）にさらに分類される。Ｉ型筋線維は毛細管で密集しており、ミトコンドリアとミオグロビンに富んでいて、このことがタイプＩの筋組織に特徴的な赤色を与えている。場合によっては、Ｉ型筋線維はより多くの酸素を運び、脂肪または炭水化物を燃料に使用して有酸素活動を維持する。Ｉ型筋線維は長時間、ただしわずかな力で収縮する。ＩＩ型筋線維は、収縮性のある速度と生じた力で異なる３つの主要な亜型（ＩＩａ、ＩＩｘ、およびＩＩｂ）へさらに細分される。ＩＩ型筋線維は、速く力強く収縮するが急速に疲労し、したがって、筋収縮が痛くなる前に、ごく短時間の集中的な無酸素活動をもたらす。
骨格筋とは異なり、平滑筋は意識的な制御下にはない。
心筋も不随意筋であるが、構造が骨格筋と非常によく似ていて、心臓でのみ見られる。心筋と骨格筋は、それらが高度な規則的配列の束に詰められているサルコメアを含むという点で条線がある。対照的に、平滑筋細胞の筋原線維はサルコメアで配されておらず、したがって、条線がない。
筋細胞は、筋組織に寄与するあらゆる細胞を包含する。例示的な筋細胞は、筋芽細胞、衛星細胞、筋管、および筋原線維組織を含む。
本明細書で使用されるように、筋力は断面積（ＣＳＡ）に比例し、筋肉速度は筋線維長さに比例する。したがって、様々な種類の筋肉間の断面積と筋線維の比較は、筋萎縮症の兆候を提供することができる。筋力および筋肉重量を測定するのに様々な方法が当該技術分野で知られており、例えば、“Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：Ｊｏｉｎｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎｕａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ” ｂｙ Ｈａｚｅｌ Ｍ．Ｃｌａｒｋｓｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００」を参照。計算された横断断層撮影による選択された筋組織の断層画像の生成と音波検査評価は、筋力を測定するさらなる方法である。
抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）という用語は、ヌクレオチドにコンジュゲートされた抗体を指す。
ｓｉＲＮＡコンジュゲートまたはｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートという用語は、ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた抗体を指す。
ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡコンジュゲートまたはＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートという用語は、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズするｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた抗体を指す。
ＤＵＸ４－ＡＯＣという用語は、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズするｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた抗体を指す。
これらの実施例は説明目的のために提供されるにすぎず、請求項の範囲を制限するものではない。
図２は、ＤＵＸ４ｓｉＲＮＡのインシリコ選択プロセスのフローチャートを示す。ＤＵＸ４またはＤＵＸ４の所定の領域に結合できるすべてのｓｉＲＮＡの配列を収集して、ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの開始セットを生成する。ＤＵＸ ｓｉＲＮＡの開始セットから、最初の除去工程は、一塩基多型（ＳＮＰ）および／またはＭＥＦ＜－５を有する１つ以上のＤＵＸ ｓｉＲＮＡを除去することを含む。次に、第２の除去工程では、ヒトトランスクリプトームにおいて０および１ＭＭのＤＵＸ ｓｉＲＮＡを除去する（その結果、許可されるヒットはＤＵＸ、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴのみになる）。次に、第３の除去工程は、ヒト遺伝子内領域でミスマッチ（ＭＭ）が０のＤＵＸ ｓｉＲＮＡを除去することを含む（その結果、許可されるヒットはＤＵＸ１、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴ偽遺伝子のみになる）。次に、次の排除工程では、ＦＬＥｘＤＵＸ４ＦＳＨＤマウスモデルにおいて使用されるＭＭからＤＵＸ４のヒト配列を含むＤＵＸｓｉＲＮＡを排除する。次に、次の工程は、予測生存率が６０以上のＤＵＸ ｓｉＲＮＡのみ、または１つ以上のＤＵＸｓｉＲＮＡを進めることである。次に、除去工程は、既知のｍｉＲＮＡ１～１０００のシード領域に一致する１つ以上のＤＵＸ ｓｉＲＮＡを除去することを含む。次に、ＧＣ％含有量が７５以上のＤＵＸ ｓｉＲＮＡ分子を除去する除去工程が続く。次に、最終的な選択プロセスは、最大１２ヒットが許可される領域２９５－１１３２を除いて、２ＭＭで８以下の予測オフターゲットヒットを含む。このような一連の選択工程を使用して、最終的な７０の候補ＤＵＸ ｓｉＲＮＡを１６９４のＤＵＸ ｓｉＲＮＡの開始セットから選択することができた。図３は、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００１３０６０６８）におけるそのように選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの位置および数を示す。
同定されたｓｉＲＮＡ候補は、以下の表１０に示されるように、それらの配列において共通の特徴を共有する。同定されたｓｉＲＮＡは、大部分が２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を有し、２’－Ｆはセンス鎖の７位、８位、９位上においてのみ位置し、アンチセンス鎖の１位、２位、６位、１４位、１６位にのみ位置する。また、同定されたｓｉＲＮＡは、各鎖に４つのチオエート修飾を含み、各５’および３’末端の最後の２つの連結に位置する。同定されたｓｉＲＮＡは、実際の標的ｍＲＮＡ配列に関係なく、アンチセンス鎖の５’末端の最初の位置に「Ｕｆ」をさらに含む（センス鎖の３’末端の最後の位置に「ａ」が結合している）。同定されたｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端のみに「ｕｕ」オーバーハングをさらに含み、センス鎖の３’末端にはオーバーハングを含まない。同定されたｓｉＲＮＡの最適化は、ホスホン酸ビニルヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはパッセンジャー鎖またはガイド鎖へのアミンリンカーを含み得る。
表１１、１２、および１３は、ヒトＤＵＸ４の調節のためのｓｉＲＮＡ候補の同定を例証する。




実施例２．ｓｉＲＮＡ配列および合成
標準的なホスホロアミダイト化学を使用して固相上ですべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。すべてのｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖は、鎖の各末端にひとつある、Ｃ６－ＮＨ２および／またはＣ６－ＳＨといった様々なフォーマットのコンジュゲーションハンドルを含む。コンジュゲーションハンドルまたは複数のコンジュゲーションハンドルは、逆脱塩基ホスホジエステルまたはホスホロチオエートを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはｓｉＲＮＡガイド鎖に接続される。以下は、インビボ実験で使用されるフォーマットの代表的な構造である。
ｓｉＲＮＡの代表的な構造は、パッセンジャー鎖またはガイド鎖の５’末端にＣ６－ＮＨ２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ６－ＳＨを備えている。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－ＮＨ２コンジュゲーションハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＰＥＧを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－ＮＨ２コンジュゲーションハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－Ｎ－ＳＭＣＣコンジュゲーションハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造は、５’末端にＰＥＧと３’末端にＣ６－ＳＨを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭと３’末端にＣ６－ＮＨ２コンジュゲーションハンドルを有する。
実施例３．コンジュゲート合成
以下の構造は、本明細書に記載される例示的なＡ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｙ（式Ｉ）構造を例証する。
構造－１：抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－Ｓ－５’－パッセンジャー鎖。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の５’末端のマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体の鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。
構造－２：抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－Ｓ－３’－パッセンジャー鎖。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端のマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体の鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。
ＡＳＣ構造－３：抗体－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端のビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対する抗体の鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。
ＡＳＣ構造－４：Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖のモデル構造。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端のビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対するＦａｂの鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。
ＡＳＣ構造－５：１つの抗体分子に結合した２つの異なるｓｉＲＮＡｓを有する抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートのモデル構造。このコンジュゲートは、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端のビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対して還元されたｍＡｂ鎖間システインへＳＳＢとＨＰＲＴのｓｉＲＮＡｓの混合物を結合することによって生成された。
ＡＳＣ構造－６：結合した２つの異なるｓｉＲＮＡｓを有する抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートのモデル構造。このコンジュゲートは、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端のマレイミド（ＳＭＣＣ）リンカーに対して還元されたｍＡｂ鎖間システインへＳＳＢとＨＰＲＴのｓｉＲＮＡｓの混合物を結合することによって生成された。
実施例３．１ ＳＭＣＣリンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲート合成
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の鎖間のジスルフィド還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡまたはＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－ＮＨＣＯ－ＰＥＧ－ＸｋＤａ（２当量）の溶液に加え（Ｘ＝０．５ｋＤａ～１０ｋＤａ）、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、実施例３．４に記載されるような陰イオン交換クロマトグラフィー方法－１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ＞２の抗体－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧのコンジュゲートを含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製されたコンジュゲートの分析
分離されたコンジュゲートを、ＳＥＣ、ＳＡＸクロマトグラフィー、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより特徴化した。コンジュゲートの純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２または陰イオン交換クロマトグラフィー方法－３のいずれかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。両方の方法は実施例３．４に記載されている。単離されたＤＡＲ１コンジュゲートは典型的には、分析的ＳＡＸ方法上で９．０±０．３分で溶出され、９０％を超える純度である。典型的なＤＡＲ＞２のシステインコンジュゲートは、８５％を超えるＤＡＲ２および１５％未満のＤＡＲ３を含んでいる。
実施例３．２．ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲート合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＢｉｓＭａｌ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－Ｓ－ＮＥＭ（２当量）の溶液に加え、４０℃で一晩維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡのコンジュゲートを含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製されたコンジュゲートの分析
分離されたコンジュゲートを、質量スペクトルまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥのいずれかにより特徴化した。コンジュゲートの純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２とサイズ排除クロマトグラフィー方法－１のいずれかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
実施例３．３．ｍＡｂからのＦａｂ’生成とｓｉＲＮＡへのコンジュゲーション
工程１：ペプシンによる抗体消化
抗体を、ｐＨ４．０、２０ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。固定されたペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｒｏｄ＃２０３４３）を加え、３７℃で３時間インキュベートした。反応混合物を、３０ｋＤａのＭＷＣＯ ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびｐＨ７．４のＰＢＳを使用して濾過した。残余分を集めて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、Ｆ（ａｂ’）２を単離した。その後、集めたＦ（ａｂ’）２を、１０当量のＴＣＥＰによって還元し、ｐＨ７．４のＰＢＳにおいて室温でＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧ５とコンジュゲートさせた。ＳＡＸクロマトグラフィー上での反応混合物の分析は、未反応のＦａｂおよびｓｉＲＮＡ－ＰＥＧと共にＦａｂ－ｓｉＲＮＡのコンジュゲートを示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２ Ｆａｂ－ｓｉＲＮＡのコンジュゲートを含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製されたコンジュゲートの分析
単離されたコンジュゲートの特徴付けと純度は、ＳＥＣ方法－１と同様に、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２あるいは３を使用する分析的なＨＰＬＣによって評価された。
実施例３．４．精製と分析方法
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
１．カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
２．溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍＬ／分
３．勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １．００
ｃ．６０ ４０ １８．００
ｄ．４０ ６０ ２．００
ｅ．４０ ６０ ５．００
ｆ．０ １００ ２．００
ｇ．１００ ０ ２．００
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
１．カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
２．溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍＬ／分
３．勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１３．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ９０ １０
ｇ．２０．００ ９０ １０
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－３
１．カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
２．溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；
３．流速：０．７５ｍＬ／分
４．勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．２３．００ ４０ ６０
ｆ．２５．００ ９０ １０
ｇ．３０．００ ９０ １０
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法－１
１．カラム：ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ ＸＬ、７．８×３００ｍｍ、５μＭ
２．移動相：１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液
３．流速：１５分間で１．０ｍｌ／分
実施例３．５．ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲート合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７℃で２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４℃で夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡのコンジュゲートを含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１００ ０ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
実施例４．筋核におけるＤＵＸ４の発現プロファイル
健康な個体およびＦＳＨＤ患者に由来する筋管を、ＤＵＸ４発現について評価した。図４に示すように、ＤＵＸ４発現を検出するために筋管を免疫染色した。筋細胞の核および細胞質を、ＤＡＰＩ （４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）およびトロポニンＴを標識することによって免疫染色した。示されるように、ＤＵＸ４の発現は、筋核の１％未満で、低くかつ散発的に検出され－このことは、細胞からの直接的なＤＵＸ４発現の検出は、ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ 活性の効果を決定する上で困難である可能性があることを示す。
実施例５．ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ処理によるＦＳＨＤドナー筋肉細胞におけるＤＵＸ４依存性マーカー遺伝子の発現プロファイル
２つのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＵＸ４－１およびｓｉＤＵＸ４－４は、Ｇｅｎｇ ＬＮら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，２０１２に開示されている）を使用して、疾患筋細胞（ＦＳＨＤドナー筋細胞）を処置し、５つのＤＵＸ４のＲＮＡ発現レベル依存性バイオマーカー遺伝子は、図５の棒グラフに示されるように定量化された。示されるように、ｓｉＤＵＸ４－１とｓｉＤＵＸ４－４の両方が、ベースライン（１００％）と比較して、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、およびＬＥＵＴＸの発現を大幅に減少させた。より具体的には、ｓｉＤＵＸ４－４は、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、およびＬＥＵＴＸの発現を、ベースライン（１００％）と比較して少なくとも～７５％減少させた。バイオマーカーとしてのＤＵＸ４標的遺伝子は、ｓｉＲＮＡを媒介するＤＵＸ４のダウンレギュレーションを測定するのに敏感であった。
実施例６．培養ＦＳＨＤ初代筋管における５つのＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現およびＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子のＦＳＨＤ複合体のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ媒介減少
ＦＳＨＤ１患者由来の初代筋芽細胞（ＭＢ０６）を使用して、公開された２つのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＵＸ４－およびｓｉＤＵＸ４－４（Ｇｅｎｇ ＬＮら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，２０１２）を用いて、用量依存濃度において、ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ活性を評価した。ＦＳＨＤ初代筋芽細胞（ＭＢ０６（ＦＳＨＤ１））は、推奨される培地で培養した。播種する前に、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ウェルあたり５０μＬの１％Ｍａｔｒｉｇｅｌで３７℃にて少なくとも２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。コーティング後、筋芽細胞を抗生物質なしで４０００細胞／ウェルにて４連で播種し、トランスフェクションの２４時間前に維持した。トランスフェクション当日、ＤＵＸ４－４ｓｉＲＮＡは、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、メーカーの「フォワードトランスフェクション」の説明書に従って製剤化した。ＤＵＸ４－４ ｓｉＲＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成された。筋芽細胞に、２５ｎＭの高濃度のＤＵＸ４－４ ｓｉＲＮＡを用いて９倍連続希釈でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、１５％ＫＯＳＲ含有分化培地で筋原性分化を誘導した。筋管は、分化を誘導してから４日後にＴｒｉｚｏｌで収集し、処理するまで－８０℃で保存した。製造元の指示に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ＲＮＡ分離キット（Ｚｙｍｏ）を使用してＲＮＡ分離を実施した。ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１００～５００ｎｇの精製ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６または７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を２連で使用して、ｑＰＣＲによりｃＤＮＡを分析した。データは ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。５つのＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＴＲＩＭ４３の発現レベルを評価した。ＤＵＸ４標的遺伝子の発現は、２つの参照遺伝子、ＡＨＳＡ１とＲＰＬ２７の複合体に対して正規化した。標的ｍＲＮＡ発現のパーセンテージは、２－ΔΔＣｔ法（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ２００１）を使用することにより、モック処理細胞と比較して決定された。図６Ａ－Ｂは、培養ＦＳＨＤ初代筋管における５つのＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ媒介減少を示す。ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡは、５つの個々のＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子（ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＴＲＩＭ４３）の発現（図６Ａ）、またはＦＳＨＤ初代筋管における５つのＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子のＦＳＨＤ複合体として（図６Ｂ）の発現を減少させた。
実施例７．ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング－ＭＢ０２およびＭＢ０６の２つの濃度（１０および０．５ｎＭ）での最初のラウンド
この実施例では、７０個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを、２つのＦＳＨＤ初代筋芽細胞株（ＭＢ０２（ＦＳＨＤ１）およびＭＢ０６（ＦＳＨＤ１））におけるそれらの活性についてスクリーニングして、より望ましいｓｉＲＮＡ候補を同定した。細胞を４，０００細胞／ウェル（ＭＷ９６）の密度で播種し、次いでＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ、および対照としてツールｓｉＲＮＡを４連でトランスフェクトした。トランスフェクションは、１０ｎＭ濃度でプレーティングしてから２４時間後に実施した。筋原性分化は、１５％ＫＯＳＲ（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２中）培地でプレーティングしてから２日後（トランスフェクションから２４時間後）に誘導された。細胞株に応じて、分化を誘導してから３日または４日後にサンプルを採取した。ＤＵＸ４下流の標的遺伝子発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価さした（複合ＡＨＳＡ１およびＲＰＬ２７ハウスキーピング遺伝子発現値に正規化）。この実施例に示されているデータは、平均ＦＳＨＤ複合体－／＋ＳＥＭとして表される。Ｎ＝４。
図７は、ＭＢ０２（ＦＳＨＤ１）およびＭＢ０６（ＦＳＨＤ１）細胞株におけるＡＣＴＡ１発現をモニターすることによる、１０ｎＭ濃度のｓｉＤＵＸ４での筋管分化および生存率の評価の棒グラフを示す。
図８は、ＦＳＨＤ複合発現を測定することによる７０個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの１０ｎＭ濃度での活性についてのスクリーニングの棒グラフを示す（ＦＳＨＤ複合体の計算：Ｄｃｔ＝（平均ｃｔ４ＤＵＸ４標的遺伝子）－（平均ｃｔ２ＨＫＧ）、ＤＤｃｔ）。＝Ｄｃｔ（ｓｉＤＵＸ４）－Ｄｃｔ（モック）、複合体＝２＾－ＤＤｃｔ＊１００（％））。
図９は、ＦＳＨＤ複合発現を測定することによる、７０個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの０．５ｎＭ濃度での活性のスクリーニングの棒グラフを示す。本明細書で使用されるように、ＦＳＨＤ複合体は、４つのＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＫＨＤＣ１Ｌから作られる。表１４－１５に示されるように、ＦＳＨＤ複合発現のダウンレギュレーションは、ＨＫＧ複合体（ＡＨＳＡ１、ＲＰＬ２７）（ｎ＝４）に対して正規化された場合、複合体における個々の遺伝子のダウンレギュレーションとよく相関しており、このことは、ＦＳＨＤ複合体発現の効果的なダウンレギュレーションがＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ効力に対する良好な指標であることを示している。
図１０に示すように、図１０では、７０個のｓｉＲＮＡ候補を有するＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡライブラリーから、１０ｎＭで少なくとも１つの細胞株において７０％未満のＫＤを有する３７個の候補が排除された。次に、両方の細胞株でＡＣＴＡ１発現が７０％未満になる３つの追加のｓｉＲＮＡ候補を除外した。次に、両方の細胞株で０．５ｎＭでヌル活性（＜１０％ＫＤ）を有する２つの追加のｓｉＲＮＡ候補を除外し、合計２８のｓｉＲＮＡ候補を次のスクリーニングプロセスに残した。表１６は、そのように選択された２８個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡと、選択された２８個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの濃度１０ｎＭおよび０．５ｎＭでの２つの細胞株におけるＦＳＨＤ複合体発現のダウンレギュレーションとを列挙する（図１１Ａおよび１１Ｂの棒グラフとしても示される）。
ヒト多型のデータベースは反復において信頼できず、多型位置を見逃す可能性がある。したがって、このラウンドの選択では、選択したＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡがさまざまなＦＳＨＤ患者由来の筋芽細胞で活性であることを検証する目的で、２つの筋芽細胞株のうちの１つで性能が低いｓｉＲＮＡを除外した。図１２は、２つの筋芽細胞株におけるＦＳＨＤ複合体をダウンレギュレートする効力による７０個のｓｉＲＮＡの分布を示す。ＫＤ相関分析により、フルライブラリースクリーニングで使用された２つのＦＳＨＤ初代筋芽細胞株の１つでのみ機能するＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの約１０％が特定された。
実施例８.ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡライブラリースクリーニング－４つの異なる患者由来の初代筋芽細胞株で１０ｎＭでの２回目のラウンド
この実施例では、全部で９つの高品質ＦＳＨＤ患者由来初代筋芽細胞株（６つのＦＳＨＤ１、３つのＦＳＨＤ２）を使用した。社内でＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４標的遺伝子発現の信頼できる検出を可能にする条件は、細胞を分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２中１５％ＫＯＳＲ）で培養することによって確立されました。時点は、各細胞株に対して具体的に選択された。９つのＦＳＨＤ細胞株すべてが、ツールＤＵＸ ４ｓｉＲＮＡに対して濃度依存的な応答を示した。
図１３は、４つの異なる患者由来の初代筋芽細胞株（ＭＢ０１、ＭＢ０５、ＭＢ１１、ＭＢ１２）におけるＡＣＴＡ１発現レベルの棒グラフを示す。上位２８のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのほとんどは、これらの細胞株でＡＣＴＡ１発現レベルに影響を与えなかったが、いくつかのｓｉＲＮＡは、試験した追加の４つのＦＳＨＤ初代細胞株において３０％を超える減少を示した（ＭＢ１１で８、ＭＢ０５で３、ＭＢ１２では３、ＭＢ０１ではなし）。さらに、図１４に示すように、上位２８個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡが、追加の４つのＦＳＨＤ初代細胞系すべてにおいて活性を示した。いくつかのｓｉＲＮＡは、ＭＢ０５、ＭＢ１１、ＭＢ１２の３つ細胞株で７５％を超えるＫＤを示しました。ＫＤレベルは全体的にＭＢ０１の方が低かった。図１５は、すべてのＦＳＨＤ細胞株（ＭＢ０１、ＭＢ０２、ＭＢ０５、ＭＢ０６、ＭＢ１１、ＭＢ１２）における１０ｎＭ濃度での上位２８個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの活性を示す。
上位２８個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡから上位１４個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを選択した。このような上位１４のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの選択は、ｉ）細胞毒性を示さないか最小限に抑えたｓｉＲＮＡ（ＡＣＴＡ１発現レベルの視覚的識別と評価）、およびｉｉ）１０ｎＭと０．５ｎＭの両方の濃度で最高の活性を示したｓｉＲＮＡでした。表１７は、選択された１４のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの１０ｎＭと０．５ｎＭの両方の濃度での６つの初代ＦＳＨＤ細胞株（ＭＢ０１、ＭＢ０２、ＭＢ０５、ＭＢ０６、ＭＢ１１、ＭＢ１２）における上位１４のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡおよびＦＳＨＤ複合体発現のダウンレギュレーション、および１０ｎＭの濃度での６つの初代ＦＳＨＤ細胞株におけるＡＣＴＡ１発現のダウンレギュレーションを列挙する。表１８は、上位１４個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡおよび９個のＦＳＨＤ一次筋管すべてにおけるＦＳＨＤ複合体発現のダウンレギュレーションを列挙する。
実施例９．ＭＢ０２、ＭＢ０５、ＭＢ０６における濃度応答の効力について評価された上位１４個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ
この実施例における実験の目的は、オフターゲット分析のために最良のＥｍａｘおよび効力を有する８つのｓｉＲＮＡを選択することである。３つのＦＳＨＤ初代筋芽細胞株（ＭＢ０２、ＭＢ０５、ＭＢ０６）を使用した。細胞を４，０００細胞／ウェル（ＭＷ９６）の密度で播種し、選択した１４個のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡで４連でトランスフェクトした。トランスフェクションは、プレーティングの２４時間後に行った。筋原性分化は、１５％ＫＯＳＲ（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２中）培地でプレーティングしてから２日後（トランスフェクションから２４時間後）に誘導した。細胞株に応じて、分化を誘導してから３日または４日後にサンプルを採取した。ＤＵＸ４下流の標的遺伝子発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した（複合ＡＨＳＡ１およびＲＰＬ２７ハウスキーピング遺伝子発現値に正規化）。データは平均－／＋ＳＥＭとして表される。Ｎ＝４。
図１６Ａ－Ｃは、３つのＦＳＨＤ患者由来の初代筋管、ＭＢ０２、ＭＢ０５、ＭＢ０６それぞれにおける１４の選択されたＤＵＸ４ｓｉＲＮＡの濃度応答を示す。ＤＵＸ－４標的遺伝子発現は、３つのＦＳＨＤ患者由来の初代筋芽細胞株の上位１４種のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのほとんどで７５％以上減少した。ｓｉＲＮＡ間の効力の違いは、細胞株に応じて６０倍から１００倍の範囲であることもまた観察された。表１９－２２は、ＦＳＨＤ複合体に基づく３つのＦＳＨＤ患者由来の一次筋管において評価されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの効力を示す。
実施例１１．抗体－ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＤＵＸ４－ＡＯＣ）は、培養ＦＳＨＤ初代筋管におけるＦＳＨＤ複合体（ＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子の複合体）発現の減少を媒介した
１６個のＤＵＸ４－ＡＯＣ（８個のｖｐＵｑ ＡＯＣまたは８個の非ＶＰ ＡＯＣ）のインビトロ濃度応答効力および最大有効性を、ＦＳＨＤ１患者由来の初代筋管（ＭＢ０６）において評価した。ＡＯＣのＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのガイド鎖は、鎖の５’末端にビニルホスホネートを含む（ｖｐＵｑ）か、鎖の５’末端にビニルホスホネートを含まない（非ＶＰ）のいずれかであった。
ヒトＴｆＲ１に対するヒトＩｇＧ１抗体は、二重遺伝子ベクターでＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ宿主細胞株をトランスフェクトすることによって作成されたＣＨＯ安定プールで発現された。抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して細胞培養上清から捕捉された。得られた抗体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（凝集体を減らすため）および陰イオン交換クロマトグラフィー（宿主細胞ＤＮＡおよびエンドトキシンを減らすため）を使用してさらに精製した。最終抗体は、ＰＢＳまたは５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５のいずれかに２０ｍｇ／ｍＬの濃度で緩衝液交換された。抗体の純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価された。
ガイドおよび完全に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖は、標準的なホスファラミダイト化学を使用して固相上で組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。精製された一本鎖を二本鎖化し、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。ガイド鎖は、５’末端にビニルホスホネート修飾ヌクレオチド構造を伴って生成された。パッセンジャー鎖は、ホスホロチオエート反転脱塩基ホスホジエステルリンカーを介して５’末端にコンジュゲーションハンドルを有していた。
ランダムシステインコンジュゲーション法を用いて、抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）を生成した。抗体の鎖間ジスルフィド結合は、マレイミドリンカー－ｓｉＲＮＡとのコンジュゲーションの前にＴＣＥＰで部分的に還元されました。反応混合物を強陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、薬物抗体比（ＤＡＲ）が１（つまり、１つの抗体分子あたり１つのｓｉＲＮＡ分子）になることを確実にした。収集したＡＯＣ画分を濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換し、０．２μｍフィルターを使用して滅菌濾過した。ＡＯＣの純度は、強陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して評価した。
ＦＳＨＤ初代筋芽細胞（ＭＢ０６（ＦＳＨＤ１））を推奨培地で増殖させた。播種する前に、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）をウェルあたり５０μＬの１％Ｍａｔｒｉｇｅｌで３７℃にて少なくとも２時間コーティングし、ＰＢＳで２回洗浄した。コーティング後、筋芽細胞を４０００細胞／ウェルで４連で播種した。プレーティングの２日後、筋原性分化を１５％ＫＯＳＲ含有分化培地で誘導した。分化誘導の２４時間後に、ｓｉＤＵＸ４－ＡＯＣを１０倍連続希釈で１００ｎＭの高濃度で培地に添加した。未処理の細胞は、相対対照として維持された。ＤＵＸ４－ＡＯＣとの３日間のインキュベーション後、筋管をＴｒｉｚｏｌ中で収集し、処理まで－８０℃にて保存した。製造元の指示に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ＲＮＡ分離キット（Ｚｙｍｏ）を使用してＲＮＡ分離を実行した。ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１００～５００ｎｇの精製ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６または７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を２連で使用して、ｑＰＣＲによりｃＤＮＡを分析した。データはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析された。ＤＵＸ４標的遺伝子の発現レベルは、２つの参照遺伝子（ＡＨＳＡ１およびＲＰＬ２７）に対して正規化された４つのＤＵＸ４標的遺伝子（ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、およびＫＨＤＣ１Ｌ）の発現レベルを統合したＦＳＨＤ複合スコアを計算することによって評価された。
図１８Ａ－Ｂは、培養ＦＳＨＤ初代筋管におけるＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現のＤＵＸ４－ＡＯＣ媒介減少の用量反応曲線を示す。ビニルホスホネートを含む大部分のＤＵＸ４－ＡＯＣ（図１８Ａ）およびビニルホスホネートを含まないいくつかのＤＵＸ４－ＡＯＣ（図１８Ｂ）は、ＦＳＨＤ１患者由来の初代筋管における４つのＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子（ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、およびＫＨＤＣ１Ｌ）のＦＳＨＤ複合体の発現を減少した。全体として、ＤＵＸ４－ＡＯＣは、ＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現の発現を減少させ、ＡＯＣにおいてＤＵＸ４ｓｉＲＮＡにビニルホスホネートが存在すると、ＤＵＸ４標的バイオマーカー遺伝子発現の減少が促進された。
実施例１２．Ｍａｌａｔ１－ｓｉＲＮＡ ＡＯＣは、３つの異なるマウス骨格筋における核局在化Ｉｎｃ－ＲＮＡ Ｍａｌａｔ１ ｍＲＮＡレベルのインビボでの減少を媒介した
野生型雌性ＣＤ－１マウス（約６～８週齢）に、Ｍａｌａｔ１またはＳｃｒａｎｂｌｅ ＡＯＣのいずれかを５ｍＬ／ｋｇ体重で尾静脈に単回ＩＶボーラス注射することにより１回投与し、ここで、ｓｉＲＮＡは、０．３、１、３、６ｍｇ／ｋｇ体重（ｓｉＲＮＡ量）の用量でマウス抗トランスフェリン受容体（ｍＴｆＲ１）抗体にコンジュゲートされていた。処置の２週間後にセラミックビーズを含むチューブに筋肉組織サンプルを採取し、液体窒素で瞬間凍結し、次いでＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して１ｍＬの冷却Ｔｒｉｚｏｌ中でホモジナイズした。製造元の指示に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ）を使用して、ホモジネート上清をＲＮＡ分離に使用した。ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１００～５００ｎｇの精製ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６または７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を２連で使用して、ｑＰＣＲによりｃＤＮＡを分析した。データはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅｖ１．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析された。標的遺伝子の発現は、参照遺伝子Ｐｐｉｂに対して正規化された。２－ΔΔＣｔ法を使用して、対照処置と比較して、処置サンプルにおける標的ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを決定した。データは、ＰＢＳ対照の％として表される（平均±ＳＥＭ；ｓｉＭａｌａｔ１およびｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ ＡＯＣについてＮ＝４、ＰＢＳグループについてＮ＝５）。
図１９は、マウスの骨格筋における核局在化ｌｎｃ－ＲＮＡ Ｍａｌａｔ１レベルのＭａｌａｔ１ ｓｉＲＮＡ－ＡＯＣ媒介インビボ減少を示す。マウスに最大６ｍｇ／ｋｇのＭａｌａｔ１ ｓｉＲＮＡ－ＡＯＣ（ｓｉＲＮＡ用量）を単回投与すると、投与後２週間で骨格筋の核内Ｍａｌａｔ１発現が最大８０％減少した。核のＭａｌａｔ１ ｍＲＮＡ発現レベルの減少は、ＡＯＣが核のＲＮＡを分解の標的とするインビボでの能力を示す。
実施例１３．８週間の期間中の３ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ ＡＯＣの単回投与によるマウス骨格筋におけるＳＳＢ ｍＲＮＡレベルの持続的なＡＯＣ媒介インビボ減少
野生型雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（約１２～１６週齢）に、ビニルホスホネートを含まないか（非ＶＰ）またはビニルホスホネートを含むか（ｖｐＵｑ）のいずれかである、３ｍｇ／ｋｇ体重（ｓｉＲＮＡ量）の用量でマウス抗ＴｆＲ１（ｍＴｆＲ１）抗体に結合したＳｓｂｓｉＲＮＡの、５ｍＬ／ｋｇ体重の単回ＩＶボーラス注射を尾静脈に１回投与した。投与後、以下の時点で腓腹筋を収集しました：１、７、１４、２８、４３、および５７日目。セラミックビーズを含むチューブに筋肉を入れ、液体窒素で瞬間凍結し、次いでＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して１ｍＬの冷Ｔｒｉｚｏｌでホモジナイズした。製造元の指示に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ分離キット（Ｚｙｍｏ）を使用して、ホモジネート上清をＲＮＡ分離に使用した。ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙｃ ＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１００～５００ｎｇの精製ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６または７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を２連で使用して、ｑＰＣＲによりｃＤＮＡを分析した。データはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅｖ１．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析された。Ｓｓｂ遺伝子発現は、参照遺伝子Ｐｐｉｂに対して正規化された。２－ΔΔＣｔ法を使用して、対照処置（ＰＢＳ）と比較して、処置サンプルにおける標的ｍＲＮＡ発現のパーセンテージを決定した。データは、ＰＢＳ対照の％として表される（平均±ＳＥＭ；ｓｉＳｓｂ－ＡＯＣｓについてＮ＝４、ＰＢＳグループについてＮ＝３－５）。
図２０は、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回投与による８週間のマウス骨格筋におけるＳＳＢ ｓｉＲＮＡ－ＡＯＣ媒介インビボＳＳＢｍＲＮＡレベルの減少を示す。ビニルホスホネートなし（非ＶＰ）とビニルホスホネートあり（ｖｐＵｑ）の両方のＳＳＢ ｓｉＲＮＡ－ＡＯＣを３ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ用量）で単回投与した後、マウス骨格筋において、ＳＳＢ ｍＲＮＡ発現レベルの持続的なＡＯＣ媒介性インビボ減少が達成された。
本開示の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは、当業者に明らかであろう。多くの変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、ならびに、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造はそれによって包含されることが、意図されている。

Claims (37)

  1. ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子にコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する、ポリ核酸分子コンジュゲート。
  2. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、非ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体または抗原結合そのフラグメントを含む、請求項１に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  3. 抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１－２のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  4. 前記ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖がそれぞれ独立して、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合、または少なくとも１つの反転脱塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ａｂａｓｉｃ）部分を含む、請求項１－３のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  5. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＵＸ４の標的配列の少なくとも８個の連続する塩基にハイブリダイズする、請求項１－４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  6. 前記ポリヌクレオチドが長さ約８－約５０ヌクレオチド長、または約１０－約３０ヌクレオチド長である、請求項１－５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  7. 前記ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１－７０または配列番号１４１－２１０から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む、請求項１－６のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  8. 前記ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号７１－１４０または配列番号２１１－２８０から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む、請求項１－７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  9. 前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含み、さらに２’修飾ヌクレオチドが、
    ２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含み、
    ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含み、または
    これらの組み合わせを含む、
    請求項１－８のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  10. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合を含む、請求項１－９のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  11. ポリ核酸分子が、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される３つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１－１０のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  12. 前記ポリ核酸分子が５’末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドを含む、請求項１－１１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  13. 前記２’修飾ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端にある、請求項１－１２のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  14. 前記２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドがプリンヌクレオチドである、請求項１３に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  15. 前記２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドがピリジンヌクレオチドである、請求項１３に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  16. 前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖が、５’末端に少なくとも２つ、３つ、または４つの連続する前記２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３－１５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  17. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントを前記ポリ核酸分子に接続するリンカーを含む、請求項１－１６のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  18. 前記リンカーがＣ１－Ｃ６アルキルリンカーである、請求項１７に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  19. 前記リンカーがホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーであり、マレイミド基、ジペプチド部分、安息香酸基、またはその誘導体を含む、請求項１７記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  20. 前記リンカーが、切断可能なまたは切断不可能なリンカーである、請求項１７記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  21. 前記ポリ核酸分子と前記抗体またはその抗原結合フラグメントとの間の比率が約１：１、２：１、３：１、または４：１である、請求項１－２０のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  22. 前記ポリ核酸分子が、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象における筋萎縮を調節する、請求項１－２１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  23. 前記ＲＮＡ干渉が、未処理細胞におけるＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量と比較して、ＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現を少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％以上低下させることを含む、請求項２２に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  24. 前記ＲＮＡ干渉が、細胞におけるＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸからなる群より選択されるマーカー遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、請求項２２－２３のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  25. 前記マーカー遺伝子の発現に影響を及ぼすことが、マーカー遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれ以上減少させることである、請求項２４に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  26. 筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項２２－２５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  27. 式（Ｉ）
    Ａ－Ｘ－Ｂ
    （式Ｉ）
    の分子を含み、式中、
    Ａは前記抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
    ＢはＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子であり、
    Ｘは結合または非ポリマーリンカーであり、
    ここで、ＸはＡのシステイン残基に結合している、
    請求項１－２６のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
  28. 請求項１－２７に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、および
    薬学的に許容される賦形剤
    を含む、医薬組成物。
  29. ナノ粒子製剤として処方される、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 非経口、経口、鼻腔内、口腔、直腸、経皮、静脈内、皮下、または髄腔内投与用に製剤化される、請求項２８－２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 必要とする対象において筋ジストロフィーを治療するための方法であって、
    請求項１－３０のいずれか一項に記載のポリ核酸コンジュゲートを供給する工程、および
    筋ジストロフィーを治療するために必要とする対象にポリ核酸コンジュゲートを投与する工程であって、ここで、前記ポリ核酸コンジュゲートがヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物の量を減少させる、工程、
    を含む、方法。
  32. 前記ポリ核酸部分が、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象における筋萎縮を調節する、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ＲＮＡ干渉が、筋ジストロフィーに冒された細胞において、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸからなる群より選択されるマーカー遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項３１－３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と診断されたかまたはその疑いのある対象を治療するための、請求項１－２７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは請求項２８－３０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  36. 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と診断されたかまたはその疑いのある対象を治療するための医薬を製造するための、請求項１－２７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは請求項２８－３０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  37. 請求項１－２７に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは請求項２８－３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
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