KR20200060496A - 핵산-폴리펩티드 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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앤드류 쟌 지올
벤카타 라마나 도팔라푸디
조엘 다이엘 아리아스
데이빗 사이-호 츄
마이클 카라미안 코치란
롭 브루크
필립 코바치
바르보라 말레코바
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어비디티 바이오사이언시스 인크.
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Abstract

변형된 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 조성물 및 약제학적 제제가 본원에서 개시된다. 또한, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 조성물 및 약제학적 제제를 이용하는 암의 치료 방법이 본원에 포함된다.

Description

핵산-폴리펩티드 조성물 및 그의 용도
교차 참조
본 출원은 2017년 10월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/568,238호의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
RNA-유도된 유전자 침묵에 의한 유전자 억제는 전사 불활성화, 작은 간섭 RNA(siRNA)-유도된 mRNA 분해 및 siRNA-유도된 전사 감소와 같은 여러 수준의 제어를 제공한다. 일부 경우에, RNA 간섭(RNAi)은 다수의 세포 분열에 걸쳐 오래 지속되는 효과를 제공한다. 따라서, RNAi는 약물 표적 검증, 유전자 기능 분석, 경로 분석 및 질환 치료제에 유용한 실행 가능한 방법을 제시한다.
개시내용의 요약
특정 실시양태에서, 폴리핵산(polynucleic acid) 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 조성물 및 약제학적 제제가 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, 또한 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 조성물 또는 약제학적 제제를 이용하는 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 본원에서 설명된다.
특정 실시양태에서, 하기 식 I의 분자가 본원에서 개시된다:
A-X-B-Y-C
식 I
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 siRNA 분자이다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214 또는 1215-1242로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214 또는 1215-1242로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, X 및 Y는 독립적으로 결합 또는 비중합체 링커기이다. 일부 실시양태에서, X는 결합이다. 일부 실시양태에서, X는 C1-C6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, Y는 C1-C6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, X는 선택적으로 C1-C6 알킬기에 접합된 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 일부 실시양태에서, Y는 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과(camelid) 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 결합 단편은 항-EGFR 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, C는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, C는 약 5000 Da의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, A-X는 B의 5' 말단에 접합되고, Y-C는 B의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, Y-C는 B의 5' 말단에 접합되고 A-X는 B의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, A-X, Y-C 또는 이들의 조합은 뉴클레오티드간(internucleotide) 연결기에 접합된다.
일부 실시양태에서, 분자는 D를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, D는 C 또는 A에 접합된다.
일부 실시양태에서, D는 하기 식 II에 따라 식 I의 분자에 접합된다:
(A-X-B-Y-Cn)-L-D
식 II
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성(endosomolytic) 모이어티이고;
n은 0 내지 정수 1이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; D는 A, B 또는 C 상의 임의의 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, D는 INF7 또는 멜리틴이다.
일부 실시양태에서, D는 엔도솜 분해성 중합체이다.
일부 실시양태에서, L은 C1-C6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, L은 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다.
일부 실시양태에서, 분자는 적어도 제2 결합 모이어티 A를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 제2 결합 모이어티 A는 A, B 또는 C에 접합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 제2 결합 모이어티 A는 콜레스테롤이다.
일부 실시양태에서, 분자는 적어도 추가의 폴리뉴클레오티드 B를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 추가의 폴리뉴클레오티드 B는 A, B, 또는 C에 접합된다.
일부 실시양태에서, 분자는 적어도 추가의 중합체 C를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 추가의 중합체 C는 A, B, 또는 C에 접합된다.
특정 실시양태에서, 하기 식 I의 분자가 본원에서 개시된다: A-X-B-Y-C(식 I). 여기서, A는 항체 또는 그의 결합 단편이고; B는 폴리뉴클레오티드이고; C는 중합체이고; X는 결합 또는 제1 비중합체 링커이고; Y는 결합 또는 제2 링커이고; 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 반전된(inverted) 무염기(abasic) 모이어티는 적어도 하나의 말단에 존재한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Y는 비중합체 링커기이다. 일부 실시양태에서, X는 결합이다. 일부 실시양태에서, X는 C1-C6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, Y는 C1-C6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, X는 선택적으로 C1-C6 알킬기에 접합된 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 일부 실시양태에서, Y는 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, C는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, C는 약 1000 Da, 2000 Da 또는 5000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, A-X는 B의 5' 말단에 접합되고, Y-C는 B의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, Y-C는 B의 5' 말단에 접합되고, A-X는 B의 3' 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, 분자는 D를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, D는 C 또는 A에 접합된다. 일부 실시양태에서, D는 하기 식 II에 따른 식 I의 분자에 접합된다: (A-X-B-Y-Cn)-L-D(식 II). 여기서, A는 항체 또는 그의 결합 단편이고; B는 폴리뉴클레오티드이고; C는 중합체이고; X는 결합 또는 제1 비중합체 링커이고; Y는 결합 또는 제2 링커이고; L은 결합 또는 제3 링커이고; D는 엔도솜 분해성 모이어티이고; c는 0 내지 1의 정수이며; 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 포함하고; 여기서 A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않고; D는 A 또는 C 중 임의의 곳에 또는 B의 말단에 접합된다. 일부 실시양태에서, D는 INF7 또는 멜리틴이다. 일부 실시양태에서, D는 엔도솜 분해성 중합체이다. 일부 실시양태에서, L은 C1-C6 알킬기이다. 일부 실시양태에서, L은 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 일부 실시양태에서, 분자는 적어도 제2 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 제2 결합 모이어티는 A, B 또는 C에 접합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 제2 결합 모이어티는 콜레스테롤이다. 일부 실시양태에서, 분자는 적어도 추가의 폴리뉴클레오티드 B를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 추가의 폴리뉴클레오티드 B는 A, B, 또는 C에 접합된다. 일부 실시양태에서, 분자는 적어도 추가의 중합체 C를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 추가의 중합체 C는 A, B, 또는 C에 접합된다.
특정 실시양태에서, 상기 설명된 분자 및 약제학상 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 나노입자 제제로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 비경구, 경구, 비강내, 협측, 직장 또는 경피 투여용으로 제제화된다.
특정 실시양태에서, 상기 설명된 분자를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 KRAS 관련, EGFR 관련, AR 관련 암, β-카테닌 관련 암, PIK3C 관련 암 또는 MYC 관련 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 다형성 교모세포종, 두경부암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선 암 또는 갑상선암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병, CLL, DLBCL 또는 다발성 골수종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양 면역 요법이다.
특정 실시양태에서, 상기 설명된 분자를 1차 세포에 투여하는 것을 포함하는, 환자의 1차 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체내 방법이다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다.
특정 실시양태에서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환 또는 장애를 치료하기 위해 상기 설명된 분자를 포함하는 종양 면역 요법제가 본원에서 개시된다.
특정 실시양태에서, 상기 설명된 분자를 포함하는 키트가 본원에서 개시된다.
도 1a는 예시적인 분자 생물학 10에서 설명되는 바와 같이, 19개의 상보성 염기 및 3' 디뉴클레오티드 오버행(overhang)을 갖는 21mer 이중체의 구조를 그림으로 나타낸 표현을 도시한 것이다.
도 1b는 분자 생물학 실시예 10에서 설명되는 바와 같이, 19개의 상보성 염기 및 하나의 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 블런트(blunt) 말단 이중체의 구조를 그림으로 나타낸 표현을 도시한 것이다.
도 2는 분자 생물학 실시예 11에서 설명되는 바와 같이, HPRT siRNA를 사용한 HCT 형질감염에 대한 Log(siRNA(nM)) 대 상대적인 HPRT mRNA(%)의 플롯을 도시한 것이다.
도 3은 분자 생물학 실시예 12에서 설명되는 바와 같이, MSTN siRNA를 사용한 SJCRH30 형질감염에 대한 Log(siRNA(nM)) 대 상대적인 MSTN mRNA 수준(비처리된 대조군의 %)의 플롯을 도시한 것이다.
도 4는 분자 생물학 실시예 13에서 설명되는 바와 같이, 항체 siRNA 접합체의 IV 투여 후에 비복근에서의 생체내 MSTN 및 HPRT mRNA 하향조절을 보여준다.
도 5는 분자 생물학 실시예 14에서 설명되는 바와 같이, 항체 siRNA 접합체의 IV 투여 후에 (A) 비복근, (B) 사두근 및 (C) 심장 근육에서의 생체내 MSTN mRNA 하향조절을 보여준다.
도 6은 분자 생물학 실시예 15에서 설명되는 바와 같이, 항체 siRNA 접합체의 TV 투여 후에 (A) 비복근 및 (B) 간에서의 생체내 HPRT mRNA 하향조절을 보여준다.
도 7은 분자 생물학 실시예 16에서 설명되는 바와 같이, 농도(nM) 대 % SSB mRNA의 플롯을 보여준다.
도 8은 분자 생물학 실시예 17에서 설명되는 바와 같이, SJCRH30 형질감염에 대한 siRNA 농도(nM) 대 상대적인 MSTN(도 8A) 및 SSB(도 8B) mRNA 발현의 플롯을 보여준다.
도 9는 분자 생물학 실시예 18에 기재된 바와 같이 siRNA 농도(nM) 대 상대적인 MSTN(도 9A) 및 SSB(도 9B) mRNA 발현의 플롯을 도시한 것이다.
개시내용의 상세한 설명
핵산(예를 들어, RNAi) 요법은 높은 선택성 및 특이성을 갖는 표적 요법이다. 그러나, 일부 경우에, 핵산 요법은 또한 불량한 세포내 흡수, 제한된 혈액 안정성 및 비특이적 면역 자극에 의해 방해된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 예를 들어,보다 우수한 안정화 및/또는 낮은 독성을 위한 신규한 링커, 증가된 표적 특이성 및/또는 표적 전달을 위한 결합 모이어티의 최적화, 및 안정성 증가 및/또는 표적을 벗어난(off-target) 효과 감소를 위한 핵산 중합체 변형과 같은 핵산 조성물의 다양한 변형이 탐구된다.
일부 실시양태에서, 핵산 조성물을 구성하는 상이한 성분의 배열 또는 순서는 세포내 흡수, 안정성, 독성, 효능 및/또는 비특이적 면역 자극에 추가로 영향을 미친다. 예를 들어, 핵산 성분이 결합 모이어티, 중합체 및 폴리핵산 분자(또는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 결합 모이어티, 중합체 및/또는 폴리핵산 분자(또는 폴리뉴클레오티드)의 순서 또는 배열(예를 들어, 결합 모이어티-폴리핵산 분자-중합체, 결합 모이어티-중합체-폴리핵산 분자 또는 중합체-결합 모이어티-폴리핵산 분자)은 세포내 흡수, 안정성, 독성, 효능 및/또는 비특이적 면역 자극에 추가로 영향을 미친다.
일부 실시양태에서, 핵산 성분의 배열이 세포내 흡수, 안정성, 독성, 효능 및/또는 비특이적 면역 자극에 영향을 미치는 분자가 본원에서 설명된다. 일부 경우에, 분자는 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자는 하기 식 I에 따른 분자를 포함한다: A-X-B-Y-C. 여기서, A는 결합 모이어티이고, B는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, C는 중합체이고, X는 결합 또는 제1 링커이고, Y는 결합 또는 제2 링커이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 분자는 엔도솜 분해성 모이어티인 D를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 바와 같이 배열된 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 분자는 세포내 흡수, 안정성 및/또는 효능을 향상시킨다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 바와 같이 배열된 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 분자는 독성 및/또는 비특이적 면역 자극을 감소시킨다. 일부 경우에, 분자는 하기 식 I에 따른 분자를 포함한다: A-X-B-Y-C. 여기서, A는 결합 모이어티이고, B는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, C는 중합체이고, X는 결합 또는 제1 링커이고, Y는 결합 또는 제2 링커이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 분자는 엔도솜 분해성 모이어티인 D를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 추가로 사용된다. 일부 경우에, 질환 또는 장애의 치료를 위한 분자는 하기 식 I에 따른 분자이다: A-X-B-Y-C. 여기서, A는 결합 모이어티이고, B는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, C는 중합체이고, X는 결합 또는 제1 링커이고, Y는 결합 또는 제2 링커이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 분자는 엔도솜 분해성 모이어티인 D를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자는 또한 이를 필요로 하는 환자의 1차 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용된다. 그러한 경우에, 그러한 사용을 위한 분자는 하기 식 I에 따른 분자이다: A-X-B-Y-C. 여기서, A는 결합 모이어티이고, B는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, C는 중합체이고, X는 결합 또는 제1 링커이고, Y는 결합 또는 제2 링커이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 분자는 엔도솜 분해성 모이어티인 D를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자는 질환 또는 장애의 치료를 위한 종양 면역 요법으로서 추가로 사용된다. 일부 경우에, 분자는 하기 식 I에 따른 분자이다: A-X-B-Y-C. 여기서, A는 결합 모이어티이고, B는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, C는 중합체이고, X는 결합 또는 제1 링커이고, Y는 결합 또는 제2 링커이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 분자는 엔도솜 분해성 모이어티인 D를 추가로 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 설명되는 하나 이상의 분자를 포함하는 키트가 본원에서 설명된다.
치료 분자 플랫폼
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 I에 따른 분자를 포함한다:
A-X-B-Y-C
식 I
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 경우에, 식 I의 분자는 엔도솜 분해성 모이어티인 D를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 A 및/또는 적어도 하나의 C는 B의 5' 말단, B의 3' 말단, B의 내부 부위, 또는 이들의 임의의 조합에서 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 A는 B의 하나의 말단에서 접합되고, 적어도 하나의 C는 B의 반대 말단에서 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 A는 B의 한 말단에서 접합되는 반면, 적어도 하나의 C는 B의 내부 부위에서 접합된다.
일부 경우에, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 접합되거나 부착되지 않는다. 일부 경우에, A는 B의 제1 말단에서 B에 부착되거나 접합된다. 일부 경우에, C는 B의 제2 말단에서 B에 부착되거나 접합되고, B의 제2 말단은 제1 말단과 상이하다. 일부 경우에, A는 B의 5' 말단에서 B에 부착되거나 접합되고, C는 B의 3' 말단에서 B에 부착되거나 접합된다. 다른 경우에, A는 B의 3' 말단에서 B에 부착되거나 접합되고, C는 B의 5' 말단에서 B에 부착되거나 접합된다.
일부 실시양태에서, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, C는 중합체이다. 일부 경우에, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 접합되거나 부착되지 않는다. 일부 경우에, A는 B의 제1 말단에서 B에 부착되거나 접합된다. 일부 경우에, C는 B의 제2 말단에서 B에 부착되거나 접합되고, B의 제2 말단은 제1 말단과 상이하다. 일부 경우에, A는 B의 5' 말단에서 B에 부착되거나 접합되고, C는 B의 3' 말단에서 B에 부착되거나 접합된다. 다른 경우에, A는 B의 3' 말단에서 B에 부착되거나 접합되고, C는 B의 5' 말단에서 B에 부착되거나 접합된다. 일부 경우에, A를 B에 연결하는 X는 결합 또는 비중합체 링커이다. 일부 경우에, X는 비펩티드 링커(또는 아미노산 잔기를 포함하지 않는 링커)이다. 일부 경우에, B를 C에 연결하는 Y는 결합 또는 제2 링커이다. 일부 경우에, X는 A를 B의 5' 말단에 연결하고, Y는 C를 B의 3' 말단에 연결한다. 다른 경우에, X는 A를 B의 3' 말단에 연결하고, Y는 C를 B의 5' 말단에 연결한다.
일부 실시양태에서, X-B는 A의 N-말단, C-말단, 불변 영역, 힌지 영역 또는 Fc 영역에 접합되거나 부착된다. 일부 경우에, X-B는 A의 N-말단에 접합되거나 부착된다 일부 경우에, X-B는 A의 C-말단에 접합되거나 부착된다. 일부 경우에, X-B는 A의 힌지 영역에 접합되거나 부착된다. 일부 경우에, X-B는 불변 영역에 접합되거나 부착된다. 일부 경우에, X-B는 A의 Fc 영역에 접합되거나 부착된다.
일부 경우에, 적어도 하나의 B 및/또는 적어도 하나의 C, 및 선택적으로 적어도 하나의 D가 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 B는 말단(예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단)에서 제1 A에 접합되거나 또는 내부 부위를 통해 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 C는 제1 A에 직접 또는 2개 이상의 B를 통해 간접적으로 접합된다. 2개 이상의 B를 통해 간접적으로 접합될 경우, 2개 이상의 C는 제1 A와 동일한 B 상의 말단에서, 제1 A의 반대 말단에서, 또는 독립적으로 내부 부위에서 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 A가 제1 A, B 또는 C에 추가로 접합된다. 추가의 경우에, 적어도 하나의 D는 선택적으로 제1 A, 적어도 하나의 B 또는 적어도 하나의 C에 직접 또는 간접적으로 접합된다. 제1 A에 직접 접합되는 경우, 적어도 하나의 D는 또한 선택적으로 적어도 하나의 B에 접합되어 A-D-B 접합체를 형성하거나 또는 선택적으로 적어도 하나의 B 및 적어도 하나의 C에 접합되어 A-D-B-C 접합체를 형성한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 A는 제1 A와 상이하다.
일부 경우에, 2개 이상의 B 및/또는 2개 이상의 C가 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 2개 이상의 B는 말단(예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단)에서 제1 A에 접합되거나 또는는 내부 부위를 통해 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 2개 이상의 C는 제1 A에 직접 또는 2개 이상의 B를 통해 간접적으로 접합된다. 2개 이상의 B를 통해 간접적으로 접합되는 경우, 2개 이상의 C는 제1 A와 동일한 B 상의 말단에서, 제1 A의 반대 말단에서, 또는 독립적으로 내부 부위에서 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 A가 제1 A, 2개 이상의 B 또는 2개 이상의 C에 추가로 접합된다. 추가의 경우에, 적어도 하나의 D는 선택적으로 제1 A, 2개 이상의 B 또는 적어도 2개 이상의 C에 직접 또는 간접적으로 접합된다. 제1 A에 간접적으로 접합되는 경우, 적어도 하나의 D는 2개 이상의 B를 통해, 2개 이상의 C를 통해, A-B-C-D 타입 접합체를 형성하기 위해 B-C 배향을 통해 또는 A-C-B-D 타입 접합체를 형성하기 위해 C-B 배향을 통해 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 A는 제1 A와 상이하다. 일부 경우에, 2개 이상의 B는 상이하다. 다른 경우에, 2개 이상의 B는 동일하다. 일부 경우에, 2개 이상의 C는 상이하다. 다른 경우에, 2개 이상의 C는 동일하다. 추가의 경우에, 2개 이상의 D는 상이하다. 추가의 경우에, 2개 이상의 D는 동일하다.
일부 경우에, 2개 이상의 B 및/또는 2개 이상의 D, 선택적으로 2개 이상의 C가 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 2개 이상의 B는 말단(예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단)에서 제1 A에 접합되거나 또는는 내부 부위를 통해 제1 A에 접합된다. 일부 경우에, 2개 이상의 D는 제1 A에 직접 또는 2개 이상의 B를 통해 간접적으로 접합된다. 2개 이상의 B를 통해 간접적으로 접합되는 경우, 2개 이상의 D는 제1 A와 동일한 B 상의 말단에서, 제1 A의 반대 말단에서, 또는 독립적으로 내부 부위에서 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 A가 제1 A, 2개 이상의 B 또는 2개 이상의 D에 추가로 접합된다. 추가의 경우에, 적어도 하나의 C는 선택적으로 제1 A, 2개 이상의 B 또는 적어도 2개 이상의 D에 직접 또는 간접적으로 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 A는 제1 A와 상이하다. 일부 경우에, 2개 이상의 B는 상이하다. 다른 경우에, 2개 이상의 B는 동일하다. 일부 경우에, 2개 이상의 C는 상이하다. 다른 경우에, 2개 이상의 C는 동일하다. 추가의 경우에, 2개 이상의 D는 상이하다. 추가의 경우에, 2개 이상의 D는 동일하다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 II에 따른 분자를 포함한다:
(A-X-B-Y-Cc)-L-D
식 II
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
c는 0 내지 1의 정수이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; D는 A, B 또는 C 상의 임의의 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 III에 따른 분자를 포함한다:
Aa-X-Bb-Y-Cc-L-Dn
식 III
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
a 및 b는 독립적으로 1-3의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이며;
n은 0 내지 10의 정수이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; A는 B, C 또는 D 상의 임의의 위치에 접합되고; B는 A, C 또는 D의 어느 곳에 나 접합되고; C는 A, B 또는 D 상의 임의의 위치에 접합되고; D는 A, B 또는 C 상의 임의의 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 IIIa에 따른 분자를 포함한다: A-X-B-L-D-Y-C.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 IIIb에 따른 분자를 포함한다: Aa-X-Bb-L-Dn.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 IV에 따른 분자를 포함한다:
A-X-(Bb-Y-Cc-L-Dn)m
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
a 및 b는 독립적으로 1-3의 정수이고;
c는 0 내지 3의 정수이며;
n은 0 내지 10의 정수이며;
m은 1-3의 정수이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; C는 B 또는 D 상의 임의의 위치에 접합되고; D는 B 또는 C 상의 임의의 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 분자(예를 들어, 치료 분자)는 하기 식 IVa에 따른 분자를 포함한다: A-X-(Bb-L-Dn-Y-Cc)m.
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00007
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00011
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00013
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00014
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00017
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00018
일부 실시양태에서, 분자(예를 들어, 치료 분자)는 아래에서 예시되는 분자이다:
Figure pct00019
상기 예시된 바와 같은
Figure pct00020
은 단지 제시를 위한 것으로서, 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다.
폴리핵산 분자 표적
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 종양 유전자 상의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자(또는 폴리뉴클레오티드)이다. 일부 경우에, 종양 유전자는 성장 인자 또는 미토겐, 수용체 티로신 키나제, 세포질 티로신 키나제, 세포질 세린/트레오닌 키나제, 조절 GTPase 및 전사 인자로 추가로 분류된다. 예시적인 성장 인자는 c-Sis를 포함한다. 예시적인 수용체 티로신 키나제는 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR) 및 HER2/neu를 포함한다. 예시적인 세포질 티로신 키나제는 Src-패밀리 티로신 키나제, 티로신 키나제의 Syk-ZAP-70 패밀리, 티로신 키나제의 BTK 패밀리, 및 CML에서의 Abl 유전자를 포함한다. 예시적인 세포질 세린/트레오닌 키나제는 Raf 키나제 및 시클린 의존성 키나제를 포함한다. 예시적인 조절 GTPase는 Ras 단백질 패밀리, 예를 들어 KRAS를 포함한다. 예시적인 전사 인자는 MYC 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 종양 유전자는 성장 인자 또는 미토겐, 수용체 티로신 키나제, 세포질 티로신 키나제, 세포질 세린/트레오닌 키나제, 조절 GTPase 또는 전사 인자로부터 선택되는 종양 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 성장 인자 또는 미토겐, 수용체 티로신 키나제, 세포질 티로신 키나제, 세포질 세린/트레오닌 키나제, 조절 GTPase 또는 전사 인자로부터 선택되는 종양 유전자의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 종양 유전자는 Abl, AKT-2, ALK, AML1(또는 RUNX1), AR, AXL, BCL-2, 3, 6, BRAF, c-MYC, EGFR, ErbB-2(Her2, Neu), Fms, FOS, GLI1, HPRT1, IL-3, INTS2, JUN, KIT, KS3, K-sam, LBC(AKAP13), LCK, LMO1, LMO2, LYL1, MAS1, MDM2, MET, MLL(KMT2A), MOS, MYB, MYH11/CBFB, NOTCH1(TAN1), NTRK1(TRK), OST(SLC51B), PAX5, PIM1, PRAD-1, RAF, RAR/PML, HRAS, KRAS, NRAS, REL/NRG, RET, ROS, SKI, SRC, TIAM1, 또는 TSC2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 Abl, AKT-2, ALK, AML1(또는 RUNX1), AR, AXL, BCL-2, 3, 6, BRAF, c-MYC, EGFR, ErbB-2(Her2, Neu), Fms, FOS, GLI1, HPRT1, IL-3, INTS2, JUN, KIT, KS3, K-sam, LBC(AKAP13), LCK, LMO1, LMO2, LYL1, MAS1, MDM2, MET, MLL(KMT2A), MOS, MYB, MYH11/CBFB, NOTCH1(TAN1), NTRK1(TRK), OST(SLC51B), PAX5, PIM1, PRAD-1, RAF, RAR/PML, HRAS, KRAS, NRAS, REL/NRG, RET, ROS, SKI, SRC, TIAM1, 또는 TSC2의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 종양 유전자는 KRAS, EGFR, AR, HPRT1, CNNTB1(β-카테닌) 또는 β-카테닌 관련 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 KRAS, EGFR, AR, HPRT1, CNNTB1(β-카테닌) 또는 β-카테닌 관련 유전자의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 KRAS의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 EGFR의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 AR의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 CNNTB1(β-카테닌)의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 CNNTB1(β-카테닌) 관련 유전자의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, β-카테닌 관련 유전자는 PIK3CA, PIK3CB, 및 Myc를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 B는 HPRT1의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
키르스텐(Kirsten) 래트 육종 바이러스 종양 유전자 상동체(KRAS)를 표적으로 하는 폴리핵산 분자
키르스텐 래트 육종 바이러스 종양 유전자 상동체(GTPase KRas, V-Ki-ras2 키르스텐 래트 육종 바이러스 종양 유전자 상동체 또는 KRAS로도 알려짐)는 세포 분열 조절에 관여한다. K-Ras 단백질은 Ras 수퍼패밀리에 속하는 GTPase이다. 일부 경우에, K-Ras는 세포 주기 진행을 조절할 뿐만 아니라, 상이한 환경적 트리거(예를 들어, 세포 스트레스, 자외선, 열 충격 또는 이온화 방사선 조사) 하에서 성장 정지, 아폽토시스 및 복제 노화를 유도한다. 일부 경우에, 야생형 KRAS 유전자는 상이한 유형의 암에서 종양 진행 동안 빈번하게 손실되는 것으로 나타났지만, KRAS 유전자의 돌연변이는 암 발생과 관련되었다. 일부 경우에, KRAS 증폭은 또한 암 발생에 연루되었다(예를 들어, 문헌 [Valtorta et al. "KRAS gene amplification in colorectal cancer and impact on response to EGFR-targeted therapy," Int. J. Cancer 133: 1259-1266 (2013)] 참조). 이 경우에, 암은 환자가 특정 억제제 또는 억제제 클래스에 대한 내성을 획득한 불응성 암에 관련된다.
일부 실시양태에서, KRAS 유전자는 야생형이거나 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, KRAS mRNA는 야생형이거나 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 야생형 KRAS DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 KRAS DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, KRAS DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS DNA 또는 RNA는 엑손 1의 코돈 12 또는 13에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, KRAS DNA 또는 RNA는 코돈 61, 63, 117, 119 또는 146에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, KRAS DNA 또는 RNA는 KRAS 폴리펩티드의 아미노산 잔기 12, 13, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 36, 59, 61, 63, 64, 68, 110, 116, 117, 119, 146, 147, 158, 164, 176, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, KRAS DNA 또는 RNA는 KRAS 폴리펩티드의 G12V, G12D, G12C, G12A, G12S, G12F, G13C, G13D, G13V, A18D, L19F, T20R, Q22K, I24N, N26K, I36L, I36M, A59G, A59E, Q61K, Q61H, Q61L, Q61R, E63K, Y64D, Y64N, R68S, P110S, K117N, C118S, A146T, A146P, A146V, K147N, T158A, R164Q, K176Q, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 KRAS DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 1의 코돈 12 또는 13에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 KRAS DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 코돈 61, 63, 117, 119 또는 146에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 KRAS DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 KRAS 폴리펩티드의 아미노산 잔기 12, 13, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 36, 59, 61, 63, 64, 68, 110, 116, 117, 119, 146, 147, 158, 164, 176, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 KRAS DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 KRAS 폴리펩티드의 G12V, G12D, G12C, G12A, G12S, G12F, G13C, G13D, G13V, A18D, L19F, T20R, Q22K, I24N, N26K, I36L, I36M, A59G, A59E, Q61K, Q61H, Q61L, Q61R, E63K, Y64D, Y64N, R68S, P110S, K117N, C118S, A146T, A146P, A146V, K147N, T158A, R164Q, K176Q, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 표적으로 하는 폴리핵산 분자
표피 성장 인자 수용체(EGFR, ErbB-1 또는 HER1)는 막 횡단 티로신 키나제 수용체 및 ErbB 수용체 패밀리의 구성원(또한 HER2/c-neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3) 및 Her4(ErbB-4)를 포함함)이다. 일부 경우에, EGFR 돌연변이는 RAS/RAF/MAPK, PI3K/AKT 및/또는 JAK/STAT 경로의 하류 활성화를 유도하여, 유사분열, 세포 증식 및 아폽토시스의 억제를 초래한다. 또한, 야생형 EGFR 유전자의 증폭은 교모세포종 및 비소세포 폐암과 같은 암의 발생에 연루된다(Talasila, et al., "EGFR Wild-type Amplification and Activation Promote Invasion and Development of Glioblastoma Independent of Angiogenesis," Acta Neuropathol. 125(5): 683-698 (2013); Bell et al., "Epidermal GrowthFactor Receptor Mutations and Gene Amplification in Non-Small-Cell Lung Cancer: Molecular Analysis of the IDEAL/INTACT Gefitinib Trials," J. Clinical Oncology 23(31): 8081-8092 (2005)).
일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 야생형 EGFR 또는 돌연변이를 포함하는 EGFR이다. 일부 경우에, EGFR은 야생형 EGFR이다. 일부 경우에, EGFR DNA 또는 RNA는 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 야생형 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 경우에, EGFR DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 엑손은 엑손 18, 엑손 19, 엑손 20, 엑손 21 또는 엑손 22를 포함한다. 일부 경우에, EGFR DNA 또는 RNA는 엑손 18, 엑손 19, 엑손 20, 엑손 21, 엑손 22 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 34, 38, 45, 62, 63, 77, 78, 108, 114, 120, 140, 148, 149, 160, 177, 178, 189, 191, 198, 220, 222, 223, 229, 237, 240, 244, 252, 254, 255, 256, 263, 270, 273, 276, 282, 288, 289, 301, 303, 304, 309, 314, 326, 331, 354, 363, 373, 337, 380, 384, 393, 427, 428, 437, 441, 447, 465, 475, 515, 526, 527, 531, 536, 541, 546, 571, 588, 589, 596, 596, 598, 602, 614, 620, 628, 636, 641, 645, 651, 671, 689, 694, 700, 709, 712, 714, 715, 716, 719, 720, 721, 731, 733, 739-744, 742, 746-750, 746-752, 746, 747, 747-749, 747-751, 747-753, 751, 752, 754, 752-759, 750, 761-762, 761, 763, 765, 767-768, 767-769, 768, 769, 769-770, 770-771, 772, 773-774, 773, 774, 774-775, 776, 779, 783, 784, 786, 790, 792, 794, 798, 803, 805, 807, 810, 826, 827, 831, 832, 833, 835, 837, 838, 839, 842, 843, 847, 850, 851, 853, 854, 856, 858, 861, 863, 894, 917, 967, 1006, 1019, 1042, 1100, 1129, 1141, 1153, 1164, 1167 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 747, 761, 790, 854, 858 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 761, 790, 858 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 747에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 761에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 790에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 854에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 858에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, EGFR DNA 또는 RNA는 EGFR 폴리펩티드의 T34M, L38V, E45Q, L62R, G63R, G63K, S77F, F78L, R108K, R108G, E114K, A120P, L140V, V148M, R149W, E160K, S177P, M178I, K189T, D191N, S198R, S220P, R222L, R222C, S223Y, S229C, A237Y, C240Y, R244G, R252C, R252P, F254I, R255(넌센스 돌연변이), D256Y, T263P, Y270C, T273A, Q276(넌센스), E282K, G288(프레임 시프트), A289D, A289V, A289T, A289N, A289D, V301(결실), D303H, H304Y, R309Q, D314N, C326R, G331R, T354M, T363I, P373Q, R337S, S380(프레임 시프트), T384S, D393Y, R427L, G428S, S437Y, V441I, S447Y, G465R, I475V, C515S, C526S, R527L, R531(넌센스), V536M, L541I, P546Q, C571S, G588S, P589L, P596L, P596S, P596R, P596L, G598V, G598A, E602G, G614D, C620Y, C620W, C628Y, C628F, C636Y, T638M, P641H, S645C, V651M, R671C, V689M, P694S, N700D, E709A, E709K, E709Q, E709K, F712L, K714N, I715S, K716R, G719A, G719C, G719D, G719S, S720C, S720F, G721V, W731(정지), P733L, K739-I744(삽입), V742I, V742A, E746-A750(결실), E746K, L747S, L747-E749(결실), L747-T751(결실), L747-P753(결실), G746-S752(결실), T751I, S752Y, K754(결실), S752-I759(결실), A750P, D761-E762(예를 들어, 잔기 EAFQ 삽입(서열 번호 2110)), D761N, D761Y, A763V, V765A, A767-S768(예를 들어, 잔기 TLA 삽입), A767-V769(예를 들어, 잔기 ASV 삽입), S768I, S768T, V769L, V769M, V769-D770(예를 들어, 잔기 Y 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 GL 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 G 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 CV 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 SVD 삽입), P772R, 773-774(예를 들어, 잔기 NPH 삽입), H773R, H773L, V774M, 774-775(예를 들어, 잔기 HV 삽입), R776H, R776C, G779F, T783A, T784F, T854A, V786L, T790M, L792P, P794H, L798F, R803W, H805R, D807H, G810S, N826S, Y827(넌센스), R831H, R832C, R832H, L833F, L833V, H835L, D837V, L838M, L838P, A839V, N842H, V843L, T847K, T847I, H850N, V851A, I853T, F856L, L858R, L858M, L861Q, L861R, G863D, Q894L, G917A, E967A, D1006Y, P1019L, S1042N, R1100S, H1129Y, T1141S, S1153I, Q1164R, L1167M, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 18, 엑손 19, 엑손 20, 엑손 21, 엑손 22 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 34, 38, 45, 62, 63, 77, 78, 108, 114, 120, 140, 148, 149, 160, 177, 178, 189, 191, 198, 220, 222, 223, 229, 237, 240, 244, 252, 254, 255, 256, 263, 270, 273, 276, 282, 288, 289, 301, 303, 304, 309, 314, 326, 331, 354, 363, 373, 337, 380, 384, 393, 427, 428, 437, 441, 447, 465, 475, 515, 526, 527, 531, 536, 541, 546, 571, 588, 589, 596, 596, 598, 602, 614, 620, 628, 636, 641, 645, 651, 671, 689, 694, 700, 709, 712, 714, 715, 716, 719, 720, 721, 731, 733, 739-744, 742, 746-750, 746-752, 746, 747, 747-749, 747-751, 747-753, 751, 752, 754, 752-759, 750, 761-762, 761, 763, 765, 767-768, 767-769, 768, 769, 769-770, 770-771, 772, 773-774, 773, 774, 774-775, 776, 779, 783, 784, 786, 790, 792, 794, 798, 803, 805, 807, 810, 826, 827, 831, 832, 833, 835, 837, 838, 839, 842, 843, 847, 850, 851, 853, 854, 856, 858, 861, 863, 894, 917, 967, 1006, 1019, 1042, 1100, 1129, 1141, 1153, 1164, 1167 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 747, 761, 790, 854, 858 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 761, 790, 858 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 747에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 761에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 790에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 854에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 858에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 T34M, L38V, E45Q, L62R, G63R, G63K, S77F, F78L, R108K, R108G, E114K, A120P, L140V, V148M, R149W, E160K, S177P, M178I, K189T, D191N, S198R, S220P, R222L, R222C, S223Y, S229C, A237Y, C240Y, R244G, R252C, R252P, F254I, R255(넌센스 돌연변이), D256Y, T263P, Y270C, T273A, Q276(넌센스), E282K, G288(프레임 시프트), A289D, A289V, A289T, A289N, A289D, V301(결실), D303H, H304Y, R309Q, D314N, C326R, G331R, T354M, T363I, P373Q, R337S, S380(프레임 시프트), T384S, D393Y, R427L, G428S, S437Y, V441I, S447Y, G465R, I475V, C515S, C526S, R527L, R531(넌센스), V536M, L541I, P546Q, C571S, G588S, P589L, P596L, P596S, P596R, P596L, G598V, G598A, E602G, G614D, C620Y, C620W, C628Y, C628F, C636Y, T638M, P641H, S645C, V651M, R671C, V689M, P694S, N700D, E709A, E709K, E709Q, E709K, F712L, K714N, I715S, K716R, G719A, G719C, G719D, G719S, S720C, S720F, G721V, W731(정지), P733L, K739-I744(삽입), V742I, V742A, E746-A750(결실), E746K, L747S, L747-E749(결실), L747-T751(결실), L747-P753(결실), G746-S752(결실), T751I, S752Y, K754(결실), S752-I759(결실), A750P, D761-E762(예를 들어, 잔기 EAFQ 삽입(서열 번호 2110)), D761N, D761Y, A763V, V765A, A767-S768(예를 들어, 잔기 TLA 삽입), A767-V769(예를 들어, 잔기 ASV 삽입), S768I, S768T, V769L, V769M, V769-D770(예를 들어, 잔기 Y 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 GL 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 G 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 CV 삽입), 770-771(예를 들어, 잔기 SVD 삽입), P772R, 773-774(예를 들어, 잔기 NPH 삽입), H773R, H773L, V774M, 774-775(예를 들어, 잔기 HV 삽입), R776H, R776C, G779F, T783A, T784F, T854A, V786L, T790M, L792P, P794H, L798F, R803W, H805R, D807H, G810S, N826S, Y827(넌센스), R831H, R832C, R832H, L833F, L833V, H835L, D837V, L838M, L838P, A839V, N842H, V843L, T847K, T847I, H850N, V851A, I853T, F856L, L858R, L858M, L861Q, L861R, G863D, Q894L, G917A, E967A, D1006Y, P1019L, S1042N, R1100S, H1129Y, T1141S, S1153I, Q1164R, L1167M, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 L747S, D761Y, T790M, T854A, L858R, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 D761Y, T790M, L858R, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 돌연변이 L747S를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 돌연변이 D761Y를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 돌연변이 T790M을 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 돌연변이 T854A를 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 EGFR 폴리펩티드의 돌연변이 L858R을 포함하는 EGFR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
안드로겐 수용체(AR)를 표적으로 하는 폴리핵산 분자
안드로겐 수용체(AR)(NR3C4, 핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 유전자 4로도 알려짐)는 다음과 같은 관련 구성원과 함께 핵 수용체 수퍼패밀리의 스테로이드 호르몬 그룹에 속한다: 에스트로겐 수용체(ER), 글루코코르티코이드 수용체(GR), 프로게스테론 수용체(PR) 및 미네랄로코르티코이드 수용체(MR). 안드로겐 또는 스테로이드 호르몬은 안드로겐 수용체를 통해 단백질 합성 및 조직 재형성을 조절한다. AR 단백질은 표적 유전자 발현을 조절하는 리간드-유도성 징크 핑거 전사 인자이다. AR 유전자에서의 돌연변이의 존재는 몇몇 유형의 암(예를 들어, 전립선암, 유방암, 방광암 또는 식도암)에서 관찰되었으며, 일부 경우에는 전이성 진행과 관련되었다.
일부 실시양태에서, AR DNA 또는 RNA는 야생형이거나, 하나 이상의 돌연변이 및/또는 스플라이스 변이체를 포함한다. 일부 경우에, AR DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, AR DNA 또는 RNA는 AR1/2/2b, ARV2, ARV3, ARV4, AR1/2/3/2b, ARV5, ARV6, ARV7, ARV9, ARV10, ARV11, ARV12, ARV13, ARV14, ARV15, ARV16, 및 ARV(v567es)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 AR 스플라이스 변이체로부터 선택되는 하나 이상의 스플라이스 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가) 또는 스플라이스 변이체를 포함하는 AR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, AR DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, AR DNA 또는 RNA는 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 엑손은 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 또는 엑손 8을 포함한다. 일부 실시양태에서, AR DNA 또는 RNA는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8 또는 이들의 조합 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, AR DNA 또는 RNA는 AR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 2, 14, 16, 29, 45, 54, 57, 64, 106, 112, 176, 180, 184, 194, 198, 204, 214, 221, 222, 233, 243, 252, 255, 266, 269, 287, 288, 334, 335, 340, 363, 368, 369, 390, 403, 443, 491, 505, 513, 524, 524, 528, 533, 547, 548, 564, 567, 568, 574, 547, 559, 568, 571, 573, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 585, 586, 587, 596, 597, 599, 601, 604, 607, 608, 609, 610, 611, 615, 616, 617, 619, 622, 629, 630, 638, 645, 647, 653, 662, 664, 670, 671, 672, 674, 677, 681, 682, 683, 684, 687, 688, 689, 690, 695, 700, 701, 702, 703, 705, 706, 707, 708, 710, 711, 712, 715, 717, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 730, 732, 733, 737, 739, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 748, 749, 750, 751, 752, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 771, 772, 774, 777, 779, 786, 795, 780, 782, 784, 787, 788, 790, 791, 793, 794, 798, 802, 803, 804, 806, 807, 812, 813, 814, 819, 820, 821, 824, 827, 828, 830, 831, 834, 840, 841, 842, 846, 854, 855, 856, 863, 864, 866, 869, 870, 871, 874, 875, 877, 879, 880, 881, 886, 888, 889, 891, 892, 895, 896, 897, 898, 902, 903, 904, 907, 909, 910, 911, 913, 916, 919, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, AR DNA 또는 RNA는 AR 폴리펩티드의 E2K, P14Q, K16N, V29M, S45T, L54S, L57Q, Q64R, Y106C, Q112H, S176S, K180R, L184P, Q194R, E198G, G204S, G214R, K221N, N222D, D233K, S243L, A252V, L255P, M266T, P269S, A287D, E288K, S334P, S335T, P340L, Y363N, L368V, A369P, P390R, P390S, P390L, A403V, Q443R, G491S, G505D, P513S, G524D, G524S, D528G, P533S, L547F, P548S, D564Y, S567F, G568W, L574P, L547F, C559Y, G568W, G568V, Y571C, Y571H, A573D, T575A, C576R, C576F, G577R, S578T, C579Y, C579F, K580R, V581F, F582Y, F582S, R585K, A586V, A587S, A596T, A596S, S597G, S597I, N599Y, C601F, D604Y, R607Q, R608K, K609N, D610T, C611Y, R615H, R615P, R615G, R616C, L616R, L616P, R617P, C619Y, A622V, R629W, R629Q, K630T, L638M, A645D, S647N, E653K, S662(넌센스), I664N, Q670L, Q670R, P671H, I672T, L674P, L677P, E681L, P682T, G683A, V684I, V684A, A687V, G688Q, H689P, D690V, D695N, D695V, D695H, L700M, L701P, L701I, H701H, S702A, S703G, N705S, N705Y, E706(넌센스), L707R, G708A, R710T, Q711E, L712F, V715M, K717Q, K720E, A721T, L722F, P723S, G724S, G724D, G724N, F725L, R726L, N727K, L728S, L728I, V730M, D732N, D732Y, D732E, Q733H, I737T, Y739D, W741R, M742V, M742I, G743R, G743V, L744F, M745T, V746M, A748D, A748V, A748T, M749V, M749I, G750S, G750D, W751R, R752Q, F754V, F754L, T755A, N756S, N756D, V757A, N758T, S759F, S759P, L762F, Y763H, Y763C, F764L, A765T, A765V, P766A, P766S, D767E, L768P, L768M, N771H, E772G, E772A, R774H, R774C, K777T, R779W, R786Q, G795V, M780I, S782N, C784Y, M787V, R788S, L790F, S791P, E793D, F794S, Q798E, Q802R, G803L, F804L, C806Y, M807V, M807R, M807I, L812P, F813V, S814N, N819Q, G820A, L821V, Q824L, Q824R, F827L, F827V, D828H, L830V, L830P, R831Q, R831L, Y834C, R840C, R840H, I841S, I842T, R846G, R854K, R855C, R855H, F856L, L863R, D864N, D864E, D864G, V866L, V866M, V866E, I869M, A870G, A870V, R871G, H874Y, H874R, Q875K, T877S, T877A, D879T, D879G, L880Q, L881V, M886V, S888L, V889M, F891L, P892L, M895T, A896T, E897D, I898T, Q902R, V903M, P904S, P904H, L907F, G909R, G909E, K910R, V911L, P913S, F916L, Q919R 또는는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산은 하나 이상의 AR 스플라이스 변이체에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산은 AR1/2/2b, ARV2, ARV3, ARV4, AR1/2/3/2b, ARV5, ARV6, ARV7, ARV9, ARV10, ARV11, ARV12, ARV13, ARV14, ARV15, ARV16, 및 ARV(v567es)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 AR 스플라이스 변이체를 포함하는 AR DNA 또는 RNA에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8 또는 이들의 조합 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 AR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 2, 14, 16, 29, 45, 54, 57, 64, 106, 112, 176, 180, 184, 194, 198, 204, 214, 221, 222, 233, 243, 252, 255, 266, 269, 287, 288, 334, 335, 340, 363, 368, 369, 390, 403, 443, 491, 505, 513, 524, 524, 528, 533, 547, 548, 564, 567, 568, 574, 547, 559, 568, 571, 573, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 585, 586, 587, 596, 597, 599, 601, 604, 607, 608, 609, 610, 611, 615, 616, 617, 619, 622, 629, 630, 638, 645, 647, 653, 662, 664, 670, 671, 672, 674, 677, 681, 682, 683, 684, 687, 688, 689, 690, 695, 700, 701, 702, 703, 705, 706, 707, 708, 710, 711, 712, 715, 717, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 730, 732, 733, 737, 739, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 748, 749, 750, 751, 752, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 771, 772, 774, 777, 779, 786, 795, 780, 782, 784, 787, 788, 790, 791, 793, 794, 798, 802, 803, 804, 806, 807, 812, 813, 814, 819, 820, 821, 824, 827, 828, 830, 831, 834, 840, 841, 842, 846, 854, 855, 856, 863, 864, 866, 869, 870, 871, 874, 875, 877, 879, 880, 881, 886, 888, 889, 891, 892, 895, 896, 897, 898, 902, 903, 904, 907, 909, 910, 911, 913, 916, 919, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 AR 폴리펩티드의 E2K, P14Q, K16N, V29M, S45T, L54S, L57Q, Q64R, Y106C, Q112H, S176S, K180R, L184P, Q194R, E198G, G204S, G214R, K221N, N222D, D233K, S243L, A252V, L255P, M266T, P269S, A287D, E288K, S334P, S335T, P340L, Y363N, L368V, A369P, P390R, P390S, P390L, A403V, Q443R, G491S, G505D, P513S, G524D, G524S, D528G, P533S, L547F, P548S, D564Y, S567F, G568W, L574P, L547F, C559Y, G568W, G568V, Y571C, Y571H, A573D, T575A, C576R, C576F, G577R, S578T, C579Y, C579F, K580R, V581F, F582Y, F582S, R585K, A586V, A587S, A596T, A596S, S597G, S597I, N599Y, C601F, D604Y, R607Q, R608K, K609N, D610T, C611Y, R615H, R615P, R615G, R616C, L616R, L616P, R617P, C619Y, A622V, R629W, R629Q, K630T, L638M, A645D, S647N, E653K, S662(넌센스), I664N, Q670L, Q670R, P671H, I672T, L674P, L677P, E681L, P682T, G683A, V684I, V684A, A687V, G688Q, H689P, D690V, D695N, D695V, D695H, L700M, L701P, L701I, H701H, S702A, S703G, N705S, N705Y, E706(넌센스), L707R, G708A, R710T, Q711E, L712F, V715M, K717Q, K720E, A721T, L722F, P723S, G724S, G724D, G724N, F725L, R726L, N727K, L728S, L728I, V730M, D732N, D732Y, D732E, Q733H, I737T, Y739D, W741R, M742V, M742I, G743R, G743V, L744F, M745T, V746M, A748D, A748V, A748T, M749V, M749I, G750S, G750D, W751R, R752Q, F754V, F754L, T755A, N756S, N756D, V757A, N758T, S759F, S759P, L762F, Y763H, Y763C, F764L, A765T, A765V, P766A, P766S, D767E, L768P, L768M, N771H, E772G, E772A, R774H, R774C, K777T, R779W, R786Q, G795V, M780I, S782N, C784Y, M787V, R788S, L790F, S791P, E793D, F794S, Q798E, Q802R, G803L, F804L, C806Y, M807V, M807R, M807I, L812P, F813V, S814N, N819Q, G820A, L821V, Q824L, Q824R, F827L, F827V, D828H, L830V, L830P, R831Q, R831L, Y834C, R840C, R840H, I841S, I842T, R846G, R854K, R855C, R855H, F856L, L863R, D864N, D864E, D864G, V866L, V866M, V866E, I869M, A870G, A870V, R871G, H874Y, H874R, Q875K, T877S, T877A, D879T, D879G, L880Q, L881V, M886V, S888L, V889M, F891L, P892L, M895T, A896T, E897D, I898T, Q902R, V903M, P904S, P904H, L907F, G909R, G909E, K910R, V911L, P913S, F916L, Q919R, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AR DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
B-카테닌 및 B-카테닌 관련 유전자를 표적으로 하는 폴리핵산 분자
카테닌 베타-1(CTNNB1, β-카테닌 또는 베타-카테닌으로도 알려짐)은 카테닌 단백질 패밀리의 구성원이다. 인간에서, 이것은 CTNNB1 유전자에 의해 코딩되며, 세포-세포 부착 및 유전자 전사라는 그의 이중 기능이 알려져 있다. 베타-카테닌은 카드헤린 기반 부착 접합부(adherens junction)의 필수 구조 성분이고, 세포 성장 및 세포 사이의 부착을 조절하고 액틴 세포 골격을 고정한다. 일부 경우에, 베타-카테닌은 상피 시트가 완료되면 세포가 분열하는 것을 멈추게 하는 접촉 억제 신호의 전달을 담당한다. 베타-카테닌은 또한 Wnt 신호전달 경로의 핵심적인 핵 이펙터이다. 일부 경우에, 베타-카테닌의 구조적 및 신호전달 특성의 불균형은 암과 같은 악성 종양과 관련된 질환 및 조절되지 않은 성장을 초래한다. 예를 들어, 베타-카테닌의 과다발현은 위암과 같은 암과 관련이 있다(Suriano, et al., " Beta-catenin (CTNNB1) gene amplification: a new mechanism of protein overexpression in cancer," Genes Chromosomes Cancer 42(3): 238-246 (2005)). 일부 경우에, CTNNB1 유전자의 돌연변이는 암 발생(예를 들어, 결장암, 흑색종, 간세포 암종, 난소암, 자궁내막암, 수모세포종, 모기질종 또는 전립선암)과 관련이 있고, 일부 경우에는 전이성 진행과 관련되어 있다. 추가의 경우에, CTNNB1 유전자의 돌연변이는 베타-카테닌이 외부 자극없이 핵으로 이동하고 그의 표적 유전자의 전사를 연속적으로 유발한다. 일부 경우에, 이환된 세포의 이전의 상피 표현형을 침습적인 중간엽 유사 형태로 변경하는 베타-카테닌의 능력은 전이 형성에 기여한다.
일부 실시양태에서, CTNNB1 유전자는 야생형 CTNNB1이거나, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1이다. 일부 경우에, CTNNB1은 야생형 CTNNB1이다. 일부 경우에, CTNNB1은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 야생형 CTNNB1의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 CTNNB1의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, CTNNB1 DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTNNB1 DNA 또는 RNA는 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 엑손은 엑손 3을 포함한다. 일부 경우에, CTNNB1 DNA 또는 RNA는 코돈 32, 33, 34, 37, 41, 45, 183, 245, 287 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, CTNNB1 DNA 또는 RNA는 CTNNB1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 25, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 41, 45, 140, 162, 170, 199, 213, 215, 257, 303, 322, 334, 354, 367, 373, 383, 387, 402, 426, 453, 474, 486, 515, 517, 535, 553, 555, 582, 587, 619, 623, 641, 646, 688, 703, 710, 712, 714, 724, 738, 777 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTNNB1 DNA 또는 RNA는 CTNNB1 폴리펩티드의 W25(넌센스 돌연변이), L31M, D32A, D32N, D32Y, D32G, D32H, S33C, S33Y, S33F, S33P, G34R, G34E, G34V, I35S, H36Y, S37F, S37P, S37C, S37A, T41N, T41A, T41I, S45Y, S45F, S45C, I140T, D162E, K170M, V199I, C213F, A215T, T257I, I303M, Q322K, E334K, K354T, G367V, P373S, W383G, N387K, L402F, N426D, R453L, R453Q, R474 (넌센스 돌연변이), R486C, R515Q, L517F, R535(넌센스 돌연변이), R535Q, M553V, G555A, R582Q, R587Q, C619Y, Q623E, T641(프레임 시프트), S646F, M688T, Q703H, R710H, D712N, P714R, Y724H, E738K, F777S 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 3 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 코돈 32, 33, 34, 37, 41, 45, 183, 245, 287 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 CTNNB1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 25, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 41, 45, 140, 162, 170, 199, 213, 215, 257, 303, 322, 334, 354, 367, 373, 383, 387, 402, 426, 453, 474, 486, 515, 517, 535, 553, 555, 582, 587, 619, 623, 641, 646, 688, 703, 710, 712, 714, 724, 738, 777, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 CTNNB1 폴리펩티드의 W25(넌센스 돌연변이), L31M, D32A, D32N, D32Y, D32G, D32H, S33C, S33Y, S33F, S33P, G34R, G34E, G34V, I35S, H36Y, S37F, S37P, S37C, S37A, T41N, T41A, T41I, S45Y, S45F, S45C, I140T, D162E, K170M, V199I, C213F, A215T, T257I, I303M, Q322K, E334K, K354T, G367V, P373S, W383G, N387K, L402F, N426D, R453L, R453Q, R474(넌센스 돌연변이), R486C, R515Q, L517F, R535(넌센스 돌연변이), R535Q, M553V, G555A, R582Q, R587Q, C619Y, Q623E, T641(프레임 시프트), S646F, M688T, Q703H, R710H, D712N, P714R, Y724H, E738K, F777S 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CTNNB1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, 베타-카테닌 관련 유전자는 PIK3CA, PIK3CB, 및 MYC를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 베타-카테닌 관련 유전자는 PIK3CA DNA 또는 RNA를 추가로 포함한다. PIK3CA(포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제, 촉매 서브유닛 알파 또는 p110α 단백질)는 ATP를 사용하여 포스파티딜이노시톨을 인산화하는 클래스 i PI 3-키나제 촉매 서브유닛이다. 일부 실시양태에서, PIK3CA 유전자는 야생형 PIK3CA 또는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CA이다. 일부 경우에, PIK3CA DNA 또는 RNA는 야생형 PIK3CA이다. 일부 경우에, PIK3CA DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 야생형 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, PIK3CA DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, PIK3CA DNA 또는 RNA는 적어도 하나의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, PIK3CA DNA 또는 RNA는 엑손 9 및/또는 20 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, PIK3CA DNA 또는 RNA는 PIK3CA 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1, 4, 10-16, 11-18, 11, 12, 38, 39, 65, 72, 75, 79, 81, 83, 88, 90, 93, 102, 103, 103-104, 103-106, 104, 105-108, 106, 106-107, 106-108, 107, 108, 109-112, 110, 111, 113, 115, 137, 170, 258, 272, 279, 320, 328, 335, 342, 344, 345, 350, 357, 359, 363, 364, 365, 366, 378, 398, 401, 417, 420, 447-455, 449, 449-457, 451, 453, 454, 455, 455-460, 463-465, 471, 495, 522, 538, 539, 542, 545, 546, 547, 576, 604, 614, 617, 629, 643, 663, 682, 725, 726, 777, 791, 818, 866, 901, 909, 939, 951, 958, 970, 971, 975, 992, 1004, 1007, 1016, 1017, 1021, 1025, 1029, 1037, 1040, 1043, 1044, 1045, 1047, 1048, 1049, 1052, 1065, 1069, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, PIK3CA DNA 또는 RNA는 PIK3CA 폴리펩티드의 M1V, R4(넌센스 돌연변이), L10-M16(결실), W11-P18(결실), W11L, G12D, R38L, R38H, R38C, R38S, E39K, E39G, E65K, S72G, Q75E, R79M, E81K, E81(결실), F83Y, R88Q, C90Y, C90G, R93Q, R93W, I102(결실), E103G, E103-P104(결실), E103-G106(결실), P104L, V105-R108(결실), G106V, G106-N107(결실), G106-R108(결실), G106R, N107S, R108L, R108H, E109-I112(결실), E110(결실), K111E, K111R, K111N, K111(결실), L113(결실), R115L, Q137L, N170S, D258N, Y272(넌센스 돌연변이), L279I, G320V, W328S, R335G, T342S, V344G, V344M, V344A, N345K, N345I, N345T, D350N, D350G, R357Q, G359R, G363A, G364R, E365K, E365V, P366R, C378R, C378Y, R398H, R401Q, E417K, C420R, C420G, P447-L455(결실), P449L, P449-N457(결실), G451R, G451V, E453K, E453Q, E453D, D454Y, L455 (프레임 시프트 삽입), L455-G460(결실), G463-N465(결실), P471L, P471A, H495L, H495Y, E522A, D538N, P539R, E542K, E542V, E542G, E542Q, E542A, E545K, E545A, E545G, E545Q, E545D, Q546K, Q546R, Q546P, E547D, S576Y, C604R, F614I, A617W, S629C, Q643H, I663S, Q682(결실), D725N, W726K, R777M, E791Q, R818C, L866W, C901F, F909L, D939G, R951C, Q958R, E970K, C971R, R975S, R992P, M1004I, G1007R, F1016C, D1017H, Y1021H, Y1021C, T1025A, T1025S, D1029H, E1037K, M1040V, M1043V, M1043I, N1044K, N1044Y, D1045V, H1047R, H1047L, H1047Y, H1047Q, H1048R, G1049R, T1052K, H1065L, 1069W(비정지 돌연변이)로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 내의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 9 또는 엑손 20 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 PIK3CA 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1, 4, 10-16, 11-18, 11, 12, 38, 39, 65, 72, 75, 79, 81, 83, 88, 90, 93, 102, 103, 103-104, 103-106, 104, 105-108, 106, 106-107, 106-108, 107, 108, 109-112, 110, 111, 113, 115, 137, 170, 258, 272, 279, 320, 328, 335, 342, 344, 345, 350, 357, 359, 363, 364, 365, 366, 378, 398, 401, 417, 420, 447-455, 449, 449-457, 451, 453, 454, 455, 455-460, 463-465, 471, 495, 522, 538, 539, 542, 545, 546, 547, 576, 604, 614, 617, 629, 643, 663, 682, 725, 726, 777, 791, 818, 866, 901, 909, 939, 951, 958, 970, 971, 975, 992, 1004, 1007, 1016, 1017, 1021, 1025, 1029, 1037, 1040, 1043, 1044, 1045, 1047, 1048, 1049, 1052, 1065, 1069, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 PIK3CB 폴리펩티드의 M1V, R4(넌센스 돌연변이), L10-M16(결실), W11-P18(결실), W11L, G12D, R38L, R38H, R38C, R38S, E39K, E39G, E65K, S72G, Q75E, R79M, E81K, E81(결실), F83Y, R88Q, C90Y, C90G, R93Q, R93W, I102(결실), E103G, E103-P104(결실), E103-G106(결실), P104L, V105-R108(결실), G106V, G106-N107(결실), G106-R108(결실), G106R, N107S, R108L, R108H, E109-I112(결실), E110(결실), K111E, K111R, K111N, K111(결실), L113(결실), R115L, Q137L, N170S, D258N, Y272(넌센스 돌연변이), L279I, G320V, W328S, R335G, T342S, V344G, V344M, V344A, N345K, N345I, N345T, D350N, D350G, R357Q, G359R, G363A, G364R, E365K, E365V, P366R, C378R, C378Y, R398H, R401Q, E417K, C420R, C420G, P447-L455(결실), P449L, P449-N457(결실), G451R, G451V, E453K, E453Q, E453D, D454Y, L455(프레임 시프트 삽입), L455-G460(결실), G463-N465(결실), P471L, P471A, H495L, H495Y, E522A, D538N, P539R, E542K, E542V, E542G, E542Q, E542A, E545K, E545A, E545G, E545Q, E545D, Q546K, Q546R, Q546P, E547D, S576Y, C604R, F614I, A617W, S629C, Q643H, I663S, Q682(결실), D725N, W726K, R777M, E791Q, R818C, L866W, C901F, F909L, D939G, R951C, Q958R, E970K, C971R, R975S, R992P, M1004I, G1007R, F1016C, D1017H, Y1021H, Y1021C, T1025A, T1025S, D1029H, E1037K, M1040V, M1043V, M1043I, N1044K, N1044Y, D1045V, H1047R, H1047L, H1047Y, H1047Q, H1048R, G1049R, T1052K, H1065L, 1069W(비정지 돌연변이) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CA DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 베타-카테닌 관련 유전자는 PIK3CB를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PIK3CB 유전자는 야생형이거나 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, PIK3CB DNA 또는 RNA는 야생형 PIK3CB DNA 또는 RNA이다. 일부 경우에, PIK3CB DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 야생형 PIK3CB DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 PIK3CB DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, PIK3CB DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, PIK3CB DNA 또는 RNA는 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, PIK3CB DNA 또는 RNA는 PIK3CB 폴리펩티드의 아미노산 잔기 18, 19, 21, 28, 50, 61, 68, 103, 135, 140, 167, 252, 270, 290, 301, 304, 321, 369, 417, 442, 470, 497, 507, 512, 540, 551, 552, 554, 562, 567, 593, 595, 619, 628, 668, 768, 805, 824, 830, 887, 967, 992, 1005, 1020, 1036, 1046, 1047, 1048, 1049, 1051, 1055, 1067, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, PIK3CB DNA 또는 RNA는 PIK3CB 폴리펩티드의 W18(넌센스 돌연변이), A19V, D21H, G28S, A50P, K61T, M68I, R103K, H135N, L140S, S167C, G252W, R270W, K290N, E301V, I304R, R321Q, V369I, T417M, N442K, E470K, E497D, P507S, I512M, E540(넌센스 돌연변이), C551R, E552K, E554K, R562(넌센스 돌연변이), E567D, A593V, L595P, V619A, R628(넌센스 돌연변이), R668W, L768F, K805E, D824E, A830T, E887(넌센스 돌연변이), V967A, I992T, A1005V, D1020H, E1036K, D1046N, E1047K, A1048V, L1049R, E1051K, T1055A, D1067V, D1067A, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CB DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CB DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 PIK3CB 폴리펩티드의 아미노산 잔기 18, 19, 21, 28, 50, 61, 68, 103, 135, 140, 167, 252, 270, 290, 301, 304, 321, 369, 417, 442, 470, 497, 507, 512, 540, 551, 552, 554, 562, 567, 593, 595, 619, 628, 668, 768, 805, 824, 830, 887, 967, 992, 1005, 1020, 1036, 1046, 1047, 1048, 1049, 1051, 1055, 1067, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CB DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 PIK3CB 폴리펩티드의 W18(넌센스 돌연변이), A19V, D21H, G28S, A50P, K61T, M68I, R103K, H135N, L140S, S167C, G252W, R270W, K290N, E301V, I304R, R321Q, V369I, T417M, N442K, E470K, E497D, P507S, I512M, E540(넌센스 돌연변이), C551R, E552K, E554K, R562(넌센스 돌연변이), E567D, A593V, L595P, V619A, R628(넌센스 돌연변이), R668W, L768F, K805E, D824E, A830T, E887(넌센스 돌연변이), V967A, I992T, A1005V, D1020H, E1036K, D1046N, E1047K, A1048V, L1049R, E1051K, T1055A, D1067V, D1067A로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 PIK3CB DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, 베타-카테닌 관련 유전자는 MYC를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC 유전자는 야생형 MYC 또는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 MYC이다. 일부 경우에, MYC는 야생형 MYC DNA 또는 RNA이다. 일부 경우에, MYC DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 야생형 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화하는 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, MYC DNA 또는 RNA는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC DNA 또는 RNA는 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, MYC DNA 또는 RNA는 엑손 2 또는 엑손 3 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, MYC DNA 또는 RNA는 아미노산 잔기 2, 7, 17, 20, 32, 44, 58, 59, 76, 115, 138, 141, 145, 146, 169, 175, 188, 200, 202, 203, 248, 251, 298, 321, 340, 369, 373, 374, 389, 395, 404, 419, 431, 439, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYC DNA 또는 RNA는 MYC 폴리펩티드의 P2L, F7L, D17N, Q20E, Y32N, A44V, A44T, T58I, P59L, A76V, F115L, F138S, A141S, V145I, S146L, S169C, S175N, C188F, N200S, S202N, S203T, T248S, D251E, S298Y, Q321E, V340D, V369D, T373K, H374R, F389L, Q395H, K404N, L419M, E431K, R439Q, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 2 또는 엑손 3 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 MYC 폴리펩티드의 아미노산 잔기 2, 7, 17, 20, 32, 44, 58, 59, 76, 115, 138, 141, 145, 146, 169, 175, 188, 200, 202, 203, 248, 251, 298, 321, 340, 369, 373, 374, 389, 395, 404, 419, 431, 439, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 MYC 폴리펩티드의 P2L, F7L, D17N, Q20E, Y32N, A44V, A44T, T58I, P59L, A76V, F115L, F138S, A141S, V145I, S146L, S169C, S175N, C188F, N200S, S202N, S203T, T248S, D251E, S298Y, Q321E, V340D, V369D, T373K, H374R, F389L, Q395H, K404N, L419M, E431K, R439Q, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 MYC DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1(HPRT1)을 표적으로 하는 폴리핵산 분자
하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT)는 하이포잔틴의 이노신 모노포스페이트로의 및 구아닌의 구아노신 모노포스페이트로의 전환을 촉매하는 트랜스퍼라제이다. HGPRT는 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제1(HPRT1) 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, HPRT1 DNA 또는 RNA는 야생형이거나 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, HPRT1 DNA 또는 RNA는 적어도 하나의 엑손 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 엑손은 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 6, 엑손 8 또는 엑손 9를 포함한다. 일부 경우에, HPRT1 DNA 또는 RNA는 HPRT1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 35, 48, 56, 74, 87, 129, 154, 162, 195, 200, 210, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 HPRT1 폴리펩티드의 V35M, R48H, E56D, F74L, R87I, N129(스플라이스-부위 돌연변이), N154H, S162(스플라이스-부위 돌연변이), Y195C, Y195N, R200M, E210K, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HPRT1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HPRT1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 6, 엑손 8 또는 엑손 9 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HPRT1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 HPRT1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 35, 48, 56, 74, 87, 129, 154, 162, 195, 200, 210, 또는 이들의 조합에 상응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HPRT1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 HPRT1 폴리펩티드의 V35M, R48H, E56D, F74L, R87I, N129(스플라이스-부위 돌연변이), N154H, S162(스플라이스-부위 돌연변이), Y195C, Y195N, R200M, E210K, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HPRT1 DNA 또는 RNA의 표적 영역에 혼성화한다.
폴리핵산 분자 서열
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 표 1, 3, 5, 6 또는 7에 예시된 표적 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 B이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 B는 표 1에 예시된 표적 서열(KRAS 표적 서열)에 혼성화하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 B는 표 3에 예시된 표적 서열(EGFR 표적 서열)에 혼성화하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 B는 표 5에 예시된 표적 서열(AR 표적 서열)에 혼성화하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 B는 표 6에 예시된 표적 서열(β-카테닌 표적 서열)에 혼성화하는 서열을 포함한다. 추가의 경우에, 폴리핵산 분자 B는 표 7에 예시된 표적 서열(PIK3CA 및 PIK3CB 표적 서열)에 혼성화하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 표 2에 열거된 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 16-45에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 표 4에 열거된 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 422-1173에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 표 8에 열거된 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 1195-1214에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 표 9에 열거된 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 B는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 1215-1242에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리핵산 분자
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 RNA 또는 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 RNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA) 또는 이질성 핵 RNA(hnRNA)를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 shRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 miRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 dsRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 tRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 rRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 hnRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 siRNA를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 siRNA를 포함한다. 일부 경우에, B는 siRNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 23, 또는 약 20 내지 약 22개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 45개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 18개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 17개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 16개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 14개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 13개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 11개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 45개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 15 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 길이는 약 12 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 패신저(passenger) 가닥이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 23, 또는 약 20 내지 약 22개의 뉴클레오티드이다.
일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 45개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 18개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 17개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 16개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 14개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 13개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 11개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 45개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 12 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 23, 또는 약 20 내지 약 22개의 뉴클레오티드이다.
일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 45개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 18개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 17개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 16개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 14개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 13개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 11개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 45개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 12 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 블런트 말단, 오버행 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 블런트 말단은 5' 블런트 말단, 3' 블런트 말단 또는 둘 모두이다. 일부 경우에, 오버행은 5' 오버행, 3' 오버행 또는 둘 모두이다. 일부 경우에, 오버행은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 1, 2, 3 또는 4개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 1개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 2개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 3개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 4개의 비염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 50% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 60% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 70% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 80% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 90% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 95% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 99% 상보성이다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 적어도 100% 상보성이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 5개 이하의 불일치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 4개 이하의 불일치를 갖는다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 3개 이하의 불일치를 가질 수 있다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 2개 이하의 불일치를 가질 수 있다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에서 설명되는 표적 서열에 대해 1개 이하의 불일치를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 표적 서열에 혼성화하는 폴리핵산 분자의 특이성은 표적 서열에 대한 폴리핵산 분자의 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 상보성이다. 일부 경우에, 혼성화는 매우 엄격한 혼성화 조건이다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 8개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 9개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 10개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 11개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 12개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 13개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 14개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 15개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 16개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 17개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 18개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 19개의 연속적인 염기에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 표적 서열의 적어도 20개의 연속적인 염기에 혼성화한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 표적을 벗어난 효과를 감소시켰다. 일부 경우에, "표적을 벗어난" 또는 "표적을 벗어난 효과"는 주어진 표적에 대해 유도된 폴리핵산 중합체가 또 다른 mRNA 서열, DNA 서열 또는 세포 단백질 또는 다른 모이어티와 직접 또는 간접적으로 상호작용함으로써 의도하지 않은 효과를 야기하는 임의의 경우를 지칭한다. 일부 경우에, "표적을 벗어난 효과"는 다른 전사체와 폴리핵산 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥 사이의 부분 상동성 또는 상보성으로 인해 다른 전사체가 동시에 분해되는 경우에 발생한다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 천연, 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 DNA, RNA 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기는 적어도 하나 이상의 리보스 모이어티, 포스페이트 모이어티, 뉴클레오시드 모이어티 또는 이들의 조합에서의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 설명된 뉴클레오티드 유사체 또는 인공 뉴클레오티드 염기는 리보스 모이어티의 5' 히드록실기에서 변형된 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 아래에서 제공되는 뉴클레오티드로부터 선택된다.
Figure pct00021
일부 경우에, 2' 히드록실기에서의 변형은 프로필 링커를 포함하는 연장된 아민기가 아민기를 2' 산소에 결합하는 2'-O-아미노프로필 변형이다. 일부 경우에, 이 변형은 1개의 당마다 아민기로부터 하나의 양전하를 도입함으로써 올리고뉴클레오티드 분자의 포스페이트-유도된 전체 음전하를 중화하고, 이에 따라 그의 양쪽이온성 특성으로 인해 세포 흡수 특성을 개선한다.
일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 잠금 또는 가교된 리보스 변형(예를 들어, 잠금 핵산 또는 LNA)으로 2' 히드록실기에서 추가로 변형되고, 여기서 2' 탄소에 결합된 산소 분자는 메틸렌기에 의해 4' 탄소에 연결되어, 2'-C,4'-C-옥시-메틸렌-연결된 바이시클릭 리보뉴클레오티드 단량체를 형성한다. 5'-비닐포스포네이트 변형된 LNA의 화학 구조에 대한 예시적인 표시가 아래에 예시되어 있으며, 여기서 J는 뉴클레오티드간 연결이다.
Figure pct00022
LNA(잠금 핵산)
일부 실시양태에서, 2' 히드록실기에서의 추가의 변형은 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 유사체는 변형된 염기, 예를 들어 5-프로피닐우리딘, 5-프로피닐시티딘, 6-메틸아데닌, 6-메틸구아닌, N,N-디메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-프로필구아닌, 2-아미노아데닌, 1-메틸이노신, 3-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘 및 5 위치에 변형을 갖는 다른 뉴클레오티드, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-할로시티딘, 5-할로우리딘, 4-아세틸시티딘, 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, 3-메틸시티딘, 6-메틸우리딘, 2-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2,2-디메틸구아노신, 5-메틸아미노에틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 데아자뉴클레오티드(예를 들어, 7-데아자-아데노신, 6-아조우리딘, 6-아조시티딘 또는 6-아조티미딘), 5-메틸-2-티오우리딘, 다른 티오 염기(예를 들어, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘 및 2-티오시티딘), 디히드로우리딘, 슈도우리딘, 퀘우오신, 아르카에오신, 나프틸 및 치환된 나프틸기, 임의의 O- 및 N-알킬화 퓨린 및 피리미딘(예를 들어, N6-메틸아데노신, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 피리딘-4-온 또는 피리딘-2-온), 페닐 및 변형된 페닐기, 예를 들어 아미노페놀 또는 2,4,6-트리메톡시 벤젠, G-클램프 뉴클레오티드로서 작용하는 변형된 시토신, 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-치환된 우라실 및 티민, 아자피리미딘, 카르복시히드록시알킬 뉴클레오티드, 카르복시알킬아미노알킬 뉴클레오티드, 및 알킬카르보닐알킬화 뉴클레오티드를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 또한 당 모이어티와 관련하여 변형된 뉴클레오티드뿐만 아니라, 리보실이 아닌 당 또는 그의 유사체를 갖는 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 당 모이어티는 일부 경우에 만노스, 아라비노스, 글루코피라노스, 갈락토피라노스, 4'-티오리보스 및 다른 당, 헤테로사이클 또는 카르보사이클이거나 또는 이를 기반으로 한다. 용어 뉴클레오티드는 또한 관련 기술 분야에 범용(universal) 염기로 알려진 것을 포함한다. 예로서, 범용 염기는 3-니트로피롤, 5-니트로인돌 또는 네불라린을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 유사체는 모르폴리노, 펩티드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트, 또는 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA)을 추가로 포함한다. 모르폴리노 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고(PMO)는 그 구조가 천연 핵산 구조와 유사하지만 정상적인 당 및 포스페이트 구조와는 다른 합성 분자를 포함한다. 일부 경우에, 5원 리보스 고리는 4개의 탄소, 1개의 질소 및 1개의 산소를 함유하는 6원 모르폴리노 고리로 치환된다. 일부 경우에, 리보스 단량체는 포스페이트기 대신에 포스포르디아미데이트기에 의해 연결된다. 이러한 경우에, 골격 변경은 하전된 올리고뉴클레오티드에 의해 사용되는 것과 같은 세포 전달제의 도움 없이 세포막을 가로지를 수 있는 모르폴리노 중성 분자를 만드는 모든 양전하 및 음전하를 제거한다. 5'-비닐포스포네이트 변형된 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
Figure pct00023
일부 실시양태에서, 상기 설명된 5'-비닐포스포네이트 변형된 모르폴리노 또는 PMO는 양전하 또는 양이온 전하를 포함하는 PMO이다. 일부 경우에, PMO는 PMOplus(Sarepta)이다. PMOplus는 임의의 수의 (1-피페라지노)포스피닐리덴옥시, (1-(4-(오메가-구아니디노-알카노일))-피페라지노)포스피닐리덴옥시 연결을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머, 예를 들어, PCT 공개 번호 제WO2008/036127호에 기재된 것을를 지칭한다. 일부 경우에, PMO는 미국 특허 제7943762호에 기재된 PMO이다.
일부 실시양태에서, 상기 설명된 모르폴리노 또는 PMO는 PMO-X(Sarepta)이다. 일부 경우에, PMO-X는 적어도 하나의 연결 또는 적어도 하나의 개시된 말단 변형을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머, 예를 들어 PCT 공개 번호 제WO2011/150408호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2012/0065169호에 개시된 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 상기 설명된 모르폴리노 또는 PMO는 미국 특허 출원 공개 번호 제2014/0296321호의 표 5에 기재된 바와 같은 PMO이다.
5'-비닐포스포네이트 변형된 핵산의 화학 구조에 대한 예시적인 표시가 아래에 예시되어 있으며, 여기서 J는 뉴클레오티드간 연결이다.
Figure pct00024
일부 실시양태에서, 펩티드 핵산(PNA)은 당 고리 또는 포스페이트 연결을 함유하지 않으며, 염기는 올리고글리신-유사 분자에 의해 부착되고 적절히 이격되어, 골격 전하를 제거한다.
Figure pct00025
일부 실시양태에서, 5'-비닐포스포네이트 변형된 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 변형은 뉴클레오티드간 연결에서 선택적으로 발생한다. 일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 메틸포스포네이트; 5'-알킬렌포스포네이트; 5'-메틸포스포네이트; 3'-알킬렌 포스포네이트; 보론트리플루오리데이트; 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결의 보라노 포스페이트 에스테르 및 셀레노포스페이트; 포스포트리에스테르; 티오노알킬포스포트리에스테르; 수소 포스포네이트 연결; 알킬 포스포네이트; 알킬포스포노티오에이트; 아릴포스포노티오에이트; 포스포로셀레노에이트; 포스포로디셀레노에이트; 포스피네이트; 포스포르아미데이트; 3'-알킬포스포르아미데이트; 아미노알킬포스포르아미데이트; 티오노포스포르아미데이트; 포스포로피페라지데이트; 포스포로아닐로티오에이트; 포스포로아닐리데이트; 케톤; 술폰; 술폰아미드; 카르보네이트; 카르바메이트; 메틸렌히드라조; 메틸렌디메틸히드라조; 포름아세탈; 티오포름아세탈; 옥심; 메틸렌이미노; 메틸렌메틸이미노; 티오아미데이트; 리보아세틸을 갖는 연결; 아미노에틸 글리신; 실릴 또는 실록산 연결; 예를 들어, 포화 또는 불포화 및/또는 치환되고/되거나 헤테로원자를 함유하는 1 내지 10개의 탄소의 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 알킬 또는 시클로알킬 연결; 모르폴리노 구조, 아미드 또는 폴리아미드를 갖는 연결(여기서, 염기는 골격의 아자 질소에 직접 또는 간접적으로 부착됨); 및 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 변형은 메틸포스포네이트 또는 티올포스포네이트 변형과 같은 메틸 또는 티올 변형이다. 예시적인 티올포스포네이트 뉴클레오티드(왼쪽), 포스포로디티오에이트(중앙) 및 메틸포스포네이트 뉴클레오티드(오른쪽)가 아래에 예시되어 있다.
Figure pct00026
일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 아래에 예시된 포스포르아미다이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다:
Figure pct00027
일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로디아미데이트 연결이다. 모르폴리노 시스템과의 포스포로디아미데이트 연결의 비제한적인 예가 아래에 제시된다.
Figure pct00028
일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 메틸포스포네이트 연결이다. 메틸포스포네이트 연결의 비제한적인 예가 아래에 제시된다.
Figure pct00029
일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 아미드 연결이다. 아미드 연결의 비제한적인 예가 아래에 제시된다.
Figure pct00030
일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드는 아래에서 예시되는 변형된 핵산을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 변형은 변형된 포스페이트 골격을 포함하고, 여기서 변형은 중성 또는 하전되지 않은 골격을 생성한다. 일부 경우에, 포스페이트 골격은 하전되지 않은 또는 중성 포스페이트 골격을 생성하기 위해 알킬화에 의해 변형된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 알킬화는 메틸화, 에틸화 및 프로필화를 포함한다. 일부 경우에, 알킬화와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 지칭한다. 일부 경우에, 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸 및 2-에틸부틸기를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 변형된 포스페이트는 미국 특허 제9481905호에 기재된 포스페이트기이다.
일부 실시양태에서, 추가의 변형된 포스페이트 골격은 메틸포스포네이트, 에틸포스포네이트, 메틸티오포스포네이트 또는 메톡시포스포네이트를 포함한다. 일부 경우에, 변형된 포스페이트는 메틸포스포네이트이다. 일부 경우에, 변형된 포스페이트는 에틸포스포네이트이다. 일부 경우에, 변형된 포스페이트는 메틸티오포스포네이트이다. 일부 경우에, 변형된 포스페이트는 메톡시포스포네이트이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 변형은 선택적으로 리보스 모이어티, 포스페이트 골격 및 뉴클레오시드의 변형, 또는 3' 또는 5' 말단에서의 뉴클레오티드 유사체의 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 3' 말단은 선택적으로 3' 양이온성 기를 포함하거나, 3' 말단에서 뉴클레오시드를 3'-3' 연결로 반전시킴으로써 변형된다. 다른 대안에서, 3' 말단은 아미노알킬기, 예를 들어 3' C5-아미노알킬 dT와 선택적으로 접합된다. 추가의 대안에서, 3' 말단은 선택적으로 무염기 부위, 예를 들어 무푸린(apurinic) 또는 무피리미딘(apyrimidinic) 부위와 접합된다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 적어도 하나의 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 본원에서 설명되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 또는 그 초과의 인공 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인공 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트 또는 이들의 조합을 포함한다.. 일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 또는 그 초과의 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 또는 그 초과의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 또는 그 초과의 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 또는 그 초과의 티올포스포네이트 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22개 또는 그 초과의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242의 폴리핵산 분자이다.
일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22개 또는 그 초과의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242의 폴리핵산 분자이다.
일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 약 5% 내지 약 100% 변형, 약 10% 내지 약 100% 변형, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100% 변형, 약 40% 내지 약 100% 변형, 약 50% 내지 약 100% 변형, 약 60% 내지 약 100% 변형, 약 70% 내지 약 100% 변형, 약 80% 내지 약 100% 변형, 및 약 90% 내지 약 100% 변형 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242의 폴리핵산 분자이다.
일부 경우에, 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자의 약 5 내지 약 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214, 또는 1215-1242의 폴리핵산 분자의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 서열 번호 16-45의 폴리핵산 분자의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 일부 경우에, 서열 번호 422-1173의 폴리핵산 분자의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 서열 번호 1195-1214의 폴리핵산 분자의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 서열 번호 1215-1242의 폴리핵산 분자의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 본원에서 설명되는 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인공 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 경우에, 본원에서 설명되는 하나 이상의 인공 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 유사체는 천연 폴리핵산 분자와 비교할 때, 예를 들어 리보뉴클레아제, 예컨대 RNase H, 데옥시리보뉴클레아제, 예컨대 DNase 또는 엑소뉴클레아제, 예컨대 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 대한 내성이 있다. 일부 경우에, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트 또는 이들의 조합을 포함하는 인공 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 리보뉴클레아제, 예컨대 RNase H, 데옥시리보뉴클레아제, 예컨대 DNase 또는 엑소뉴클레아제, 예컨대 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 대한 내성이 있다. 일부 경우에, 2'-O-메틸 변형된 폴리뉴클레오티드 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필 변형된 폴리뉴클레오티드 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-데옥시 변형된 폴리뉴클레오티드 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, T-데옥시-2'-플루오로 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, LNA-변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, ENA-변형된 폴리뉴클레오티드 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, HNA-변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 모르폴리노는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)일 수 있다. 일부 경우에, PNA-변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드-변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에는, 티올포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하는 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 5' 접합체는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해 절단을 억제한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 3' 접합체는 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해 절단을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 하나 이상의 인공 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 유사체는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하는 하나 이상의 인공 뉴클레오티드 유사체는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-메틸 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-데옥시 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, T-데옥시-2'-플루오로 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE) 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, LNA-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, ENA-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, PNA-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, HNA-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 모르폴리노-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 티올포스포네이트 뉴클레오티드-변형된 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하는 폴리핵산 분자는 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 그의 mRNA 표적에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 증가된 친화도는 보다 낮은 Kd, 보다 높은 용융 온도(Tm), 또는 이들의 조합으로 제시된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 5'-비닐포스포네이트 변형된 폴리핵산 분자는 키랄상 순수한(chirally pure)(또는 입체이성체상 순수한(stereo pure)) 폴리핵산 분자, 또는 단일 에난티오머를 포함하는 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 L-뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 D-뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 조성물은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만의 그의 거울 에탄티오머를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 조성물은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는 이보다 적은 라세미 혼합물을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 미국 특허 출원 공개 번호 제2014/194610호 및 제2015/211006호; 및 PCT 공개 번호 제WO2015107425호에 기재된 폴리핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 앱타머 접합 모이어티를 포함하도록 추가로 변형된다. 일부 경우에, 앱타머 접합체 모이어티는 DNA 앱타머 접합 모이어티이다. 일부 경우에, 앱타머 접합 모이어티는 알파머(Alphamer)(Centauri Therapeutics)이며, 이것은 특정 세포 표면 표적을 인식하는 앱타머 부분 및 순환 항체에 부착하기 위한 특정 에피토프를 나타내는 부분을 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 미국 특허 제8,604,184호, 제8,591,910호 및 제7,850,975호에 기재된 바와 같은 앱타머 접합 모이어티를 포함하도록 추가로 변형된다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 RNA(예를 들어, siRNA)이고, 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키도록 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키기 위해 상기 설명된 적어도 하나의 변형에 의해 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 2' 히드록실 위치에서, 예를 들어 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형에 의해 또는 잠금 또는 가교된 리보스 입체형태(예를 들어, LNA 또는 ENA)에 의해 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 2'-O-메틸 및/또는 2'-O-메톡시에틸 리보스에 의해 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키기 위해 모르폴리노, PNA, HNA, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 및/또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 키랄상 순수한(또는 입체이성체상 순수한) 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, 키랄상 순수한(또는 입체이성체상 순수한) 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키도록 변형된다. 전달 안정성을 증가시키기 위해 RNA에 대한 적합한 변형은 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 상기 설명된 유전자에 의해 코딩되는 RNA의 발현을 조절하는 RNAi 활성을 갖는다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 유전자의 발현을 하향조절하는 이중 가닥 siRNA 분자이며, 상기 이중 가닥 siRNA 분자의 가닥 중 하나는 유전자 또는 그의 일부에 의해 코딩되는 유전자 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열의 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이중 가닥 siRNA 분자의 제2 가닥은 유전자 또는 그의 일부에 의해 코딩되는 유전자 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 유전자의 발현을 하향조절하는 이중 가닥 siRNA 분자이며, 상기 siRNA 분자의 각각의 가닥은 약 15 내지 25, 18 내지 24, 또는 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 가닥은 다른 가닥의 뉴클레오티드에 상보성인 적어도 약 14, 17 또는 19개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 유전자의 발현을 하향조절하는 이중 가닥 siRNA 분자이고, 상기 siRNA 분자의 각각의 가닥은 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 가닥은 다른 가닥의 뉴클레오티드에 상보성인 적어도 약 19개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 유전자는 KRAS, EGFR, AR, HPRT1, CNNTB1(β-카테닌) 또는 β-카테닌 관련 유전자이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자는 관련 기술 분야에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소 라이게이션 반응을 사용하여 구축된다. 예를 들어, 폴리핵산 분자는 천연 생성 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 폴리핵산 분자와 표적 핵산 사이에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성된다. 예시적인 방법은 미국 특허 제5,142,047호; 제5,185,444호; 제5,889,136호; 제6,008,400호; 및 제6,111,086호; PCT 공개 번호 제WO2009099942호; 또는 EP 1579015에 기재된 것을 포함한다. 추가의 예시적인 방법은 문헌 [Griffey et al.,"2'-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides," J. Med. Chem. 39(26):5100-5109 (1997)); Obika, et al. "Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering". Tetrahedron Letters 38 (50): 8735 (1997); Koizumi, M. "ENA oligonucleotides as therapeutics". Current opinion in molecular therapeutics 8 (2): 144-149 (2006); 및 Abramova et al., "Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities," Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726 (2009)]에 기재된 것을 포함한다. 대안적으로, 폴리핵산 분자는 폴리핵산 분자가 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성된다(즉, 삽입된 폴리핵산 분자로부터 전사된 RNA는 관심 있는 표적 폴리핵산 분자에 대해 안티센스 배향일 것이다).
한 실시양태는 하기 식 I의 분자를 제공한다:
A-X-B-Y-C
식 I
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드를 포함하고;
A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
다른 실시양태는 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 추가로 포함하는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 위치하는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결에 위치하는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 2'-위치에서 추가로 변형되는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태는 2'-변형이 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00031
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 화학식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00032
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00033
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00034
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R6은 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)으로부터 선택되는 식 I의 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00035
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 화학식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00036
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 I의 분자를 제공한다:
Figure pct00037
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R6은 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로디아미데이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 아미드 연결을 포함하는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티가 적어도 하나의 말단에 존재하는 것인 식 I의 분자를 제공한다.
한 실시양태는 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 추가로 포함하는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 위치하는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결에 위치하는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 2'-위치에서 추가로 변형되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 2'-변형이 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) , T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00038
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00039
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00040
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00041
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R6은 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)으로부터 선택되는 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00042
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00043
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00044
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
R6은 수소, 할로겐, 알킬 또는 알콕시로부터 선택되고;
J는 폴리뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로디아미데이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 아미드 연결을 포함하는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티가 적어도 하나의 말단에 존재하는 것인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 100개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 90개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 80개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 70개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 60개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 50개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 40개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 20개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 10개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 8 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 10 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 14 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 18 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 22 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태는 올리고뉴클레오티드의 길이가 26 내지 약 30개의 잔기인 식 II의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
한 실시양태는 하기 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 합성에 적합한 화합물을 제공한다:
Figure pct00045
여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이다.
접합 화학
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 항원, 독소, 호르몬, 지질, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 탄수화물, 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜뿐만 아니라, 상기 클래스의 모든 물질의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 결합 모이어티의 추가의 예는 또한 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 인지질, 디- 및 트리아실글리세롤, 지방산, 탄화수소(예를 들어, 포화, 불포화 또는 치환을 함유함), 효소 기질, 비오틴, 디곡시게닌 및 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 중합체 및 선택적으로 엔도솜 분해성 모이어티에 추가로 접합된다.
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 화학적 라이게이션 과정에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 천연 라이게이션에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 접합은 문헌 [Dawson, et al. "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779; Dawson, et al. "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 4325-4329; Hackeng, et al. "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology.," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 10068-10073; 또는 Wu, et al. "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew. Chem. Int. Ed.2006, 45, 4116-4125]에 기재된 바와 같다. 일부 경우에, 접합은 미국 특허 제8,936,910호에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 천연 라이게이션 화학을 통해 부위 특이적으로 또는 비특이적으로 결합 모이어티에 접합된다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 "흔적없는(traceless)" 커플링 기술(Philochem)을 사용하는 부위 지정 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, "흔적없는" 커플링 기술은 알데히드기를 함유하는 폴리핵산 분자와 추후 접합되는 결합 모이어티 상의 N-말단 1,2-아미노티올기를 이용한다(문헌 [Casi et al., "Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery," JACS 134(13): 5887-5892 (2012)] 참조).
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 결합 모이어티에 포함된 비천연 아미노산을 사용하는 부위 지정 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 p-아세틸페닐알라닌(pAcPhe)을 포함한다. 일부 경우에, pAcPhe의 케토기는 알콕시-아민 유도체 접합 모이어티에 선택적으로 커플링되어 옥심 결합을 형성한다(문헌 [Axup et al., "Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids," PNAS 109(40): 16101-16106 (2012)] 참조).
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 효소 촉매 과정을 사용하는 부위 지정 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 부위 지정 방법은 SMARTag™ 기술(Redwood)을 사용한다. 일부 경우에, SMARTag™ 기술은 알데히드 태그의 존재 하에서의 산화 과정을 통해 포르밀글리신 생성 효소(FGE)에 의해 시스테인으로부터 포르밀글리신(FGly) 잔기를 생성한 후, 히드라지노-픽텟-스펭글러(Pictet-Spengler) (HIPS) 라이게이션을 통해 FGly를 알킬히드라진 관능화된 폴리핵산 분자에 접합시키는 것을 포함한다(문헌 [Wu et al., "Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag," PNAS 106(9): 3000-3005 (2009); Agarwal, et al., "A Pictet-Spengler ligation for protein chemical modification,"PNAS 110(1): 46-51 (2013)] 참조).
일부 경우에, 효소 촉매 과정은 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 미생물 트랜스글루타미나제 촉매 과정을 이용하여 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, mTG는 인식 서열 내의 글루타민의 아미드 측쇄와 관능화된 폴리핵산 분자의 1차 아민 사이의 공유 결합의 형성을 촉매한다. 일부 경우에, mTG는 스트렙토마이세스 모바렌시스(Streptomyces mobarensis)로부터 생산된다(문헌 [Strop et al., "Location matters: site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates," Chemistry and Biology 20(2) 161-167 (2013)] 참조).
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 특이적 트랜스펩티다제를 이용하는, PCT 공개 번호 제WO2014/140317호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 미국 특허 출원 공개 번호 제2015/0105539호 및 제2015/0105540호에 기재된 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다.
결합 모이어티
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 단편이다. 일부 경우에, 단편은 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 뮤린 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2 , F(ab)'3 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술파이드 안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일 도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편, 이중 특이적 항체 또는 그의 결합 단편, 또는 이들의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다.
일부 경우에, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 뮤린 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2 , F(ab)'3 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술파이드 안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일 도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편, 이중 특이적 항체 또는 그의 결합 단편, 또는 이들의 화학적으로 변형된 유도체이다. 일부 경우에, A는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 뮤린 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 키메라 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 1가 Fab'이다. 일부 경우에, A는 2가 Fab2이다. 일부 경우에, A는 단일쇄 가변 단편(scFv)이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 이중 특이적 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 이중 특이적 항체는 삼작용성 항체 또는 이중 특이적 미니 항체이다. 일부 경우에, 이중 특이적 항체는 삼작용성 항체이다. 일부 경우에, 삼작용성 항체는 2개의 상이한 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 전장 모노클로날 항체이다. 예시적인 삼작용성 항체는 카투막소맙(EpCAM 및 CD3을 표적으로 함; Fresenius Biotech/Trion Pharma), 에르투막소맙(HER2/neu/CD3을 표적으로 함; Fresenius Biotech/Trion Pharma), 림포문 FBTA05(CD20/CD3을 표적으로 함; Fresenius Biotech/Trion Pharma), RG7221(RO5520985; 안지오포아이텐 2/VEGF를 표적으로 함; Roche), RG7597(Her1/Her3을 표적으로 함; Genentech/Roche), MM141(IGF1R/Her3을 표적으로 함; Merrimack), ABT122(TNFα/IL17을 표적으로 함; Abbvie), ABT981(IL1α/IL1β를 표적으로 함; Abbott), LY3164530(Her1/cMET를 표적으로 함; Eli Lilly) 및 TRBS07(엑토맙; GD2/CD3을 표적으로 함; Trion Research Gmbh)를 포함한다. 추가의 예시적인 삼작용성 항체는 mAb2(F-star Biotechnology Ltd.)를 포함한다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 삼작용성 항체이다. 일부 실시양태에서, A는 하기로부터 선택되는 이중 특이적 삼작용성 항체이다: 카투막소맙(EpCAM 및 CD3을 표적으로 함; Fresenius Biotech/Trion Pharma), 에르투막소맙(HER2/neu/CD3을 표적으로 함; Fresenius Biotech/Trion Pharma), 림포문 FBTA05(CD20/CD3을 표적으로 함; Fresenius Biotech/Trion Pharma), RG7221(RO5520985; 안지오포아이텐 2/VEGF를 표적으로 함; Roche), RG7597(Her1/Her3을 표적으로 함; Genentech/Roche), MM141(IGF1R/Her3을 표적으로 함; Merrimack), ABT122(TNFα/IL17을 표적으로 함; Abbvie), ABT981(IL1α/IL1β를 표적으로 함; Abbott), LY3164530(Her1/cMET를 표적으로 함; Eli Lilly), TRBS07(엑토맙; GD2/CD3을 표적으로 함; Trion Research Gmbh), 및 mAb2(F-star Biotechnology Ltd.).
일부 경우에, 이중 특이적 항체는 이중 특이적 미니 항체이다. 일부 경우에, 이중 특이적 미니 항체는 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 이중 특이적 T-세포 결합자(engager)(BiTE)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중 특이적 T-세포 결합자는 2개의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 함유하고 상기 2개의 scFv가 2개의 상이한 항원의 에피토프를 표적으로 하는 융합 단백질이다. 예시적인 이중 특이적 미니 항체는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: DART(이중 친화도 재표적화 플랫폼; MacroGenics), 블리나투모맙(MT103 또는 AMG 103; CD19/CD3을 표적으로 함; Micromet), MT111(CEA/CD3을 표적으로 함; Micromet/Amegen), MT112(BAY2010112; PSMA/CD3을 표적으로 함; Micromet/Bayer), MT110(AMG 110; EPCAM/CD3을 표적으로 함; Amgen/Micromet), MGD006(CD123/CD3을 표적으로 함; MacroGenics), MGD007(GPA33/CD3을 표적으로 함; MacroGenics), BI1034020(β-아밀로이드 상의 2개의 상이한 에피토프를 표적으로 함; Ablynx), ALX0761(IL17A/IL17F를 표적으로 함; Ablynx), TF2(CEA/헵텐을 표적으로 함; Immunomedics), IL-17/IL-34 biAb(BMS), AFM13(CD30/CD16을 표적으로 함; Affimed), AFM11(CD19/CD3을 표적으로 함; Affimed) 및 도메인 항체(dAb; Domantis/GSK).
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 이중 특이적 미니 항체이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 Fab2이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 F(ab)'3 단편이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 비스-scFv이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 (scFv)2이다. 일부 실시양태에서, A는 이중 특이적 디아바디이다. 일부 실시양태에서, A는 이중 특이적 미니바디이다. 일부 실시양태에서, A는 이중 특이적 트리아바디이다. 다른 실시양태에서, A는 이중 특이적 테트라바디이다. 다른 실시양태에서, A는 이중 특이적 T-세포 결합자(BiTE)이다. 추가의 실시양태에서, A는 하기로부터 선택되는 이중 특이적 미니바디이다: DART(이중 친화도 재표적화 플랫폼; MacroGenics), 블리나투모맙(MT103 또는 AMG 103; CD19/CD3을 표적으로 함; Micromet), MT111(CEA/CD3을 표적으로 함; Micromet/Amegen), MT112(BAY2010112; PSMA/CD3을 표적으로 함; Micromet/Bayer), MT110(AMG 110; EPCAM/CD3을 표적으로 함; Amgen/Micromet), MGD006(CD123/CD3을 표적으로 함; MacroGenics), MGD007(GPA33/CD3을 표적으로 함; MacroGenics), BI1034020(β-아밀로이드 상의 2개의 상이한 에피토프를 표적으로 함; Ablynx), ALX0761(IL17A/IL17F를 표적으로 함; Ablynx), TF2(CEA/헵텐을 표적으로 함; Immunomedics), IL-17/IL-34 biAb(BMS), AFM13(CD30/CD16을 표적으로 함; Affimed), AFM11(CD19/CD3을 표적으로 함; Affimed) 및 도메인 항체(dAb; Domantis/GSK).
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 삼중 특이적 항체이다. 일부 경우에, 삼중 특이적 항체는 F(ab)'3 단편 또는 트리아바디를 포함한다. 일부 경우에, A는 삼중 특이적 F(ab)'3 단편이다. 일부 경우에, A는 트리아바디이다. 일부 실시양태에서, A는 문헌 [Dimas, et al., "Development of a trispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target three different antigens on tumor cells," Mol. Pharmaceutics, 12(9): 3490-3501 (2015)]에 기재된 바와 같은 삼중 특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 세포 표면 단백질을 인식하는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 세포 표면 단백질은 암성 세포에 의해 발현된 항원이다. 예시적인 암 항원은 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 알파 태아 단백질, ASLG659, B7-H3, BAFF-R, 브레비칸, CA125(MUC16), CA15-3, CA19-9, 암배아 항원(CEA), CA242, CRIPTO(CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종 유래 성장 인자), CTLA-4, CXCR5, E16(LAT1, SLC7A5), FcRH2(IFGP4, IRTA4, SPAP1A(포스파타제 앵커 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C), 표피 성장 인자, ETBR, Fc 수용체 유사 단백질 1(FCRH1), GEDA, HLA-DOB(MHC 클래스 II 분자의 베타 서브유닛(Ia 항원), 인간 융모성 고나도트로핀, ICOS, IL-2 수용체, IL20Rα, 면역글로불린 수퍼패밀리 수용체 전좌 관련 2(IRTA2), L6, 루이스 Y, 루이스 X, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE 4, MART1, 메소텔린, MDP, MPF(SMR, MSLN), MCP1(CCL2), 대식세포 억제 인자(MIF), MPG, MSG783, 뮤신, MUC1-KLH, Napi3b(SLC34A2), 넥틴-4, Neu 종양 유전자 생성물, NCA, 태반 알칼리성 포스파타제, 전립선 특이적 막 항원(PMSA), 전립선 산 포스파타제, PSCA hIg, p97, 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅된 이온 채널 5(P2X5), LY64(림프구 항원 64(RP105), gp100, P21, 전립선의 6개의 막 횡단 상피 항원(STEAP1), STEAP2, Sema 5b, 종양 관련 당 단백질 72(TAG-72), TrpM4(BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4) 등.
일부 경우에, 세포 표면 단백질은 분화 클러스터(CD) 세포 표면 마커를 포함한다. 예시적인 CD 세포 표면 마커는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD45RA, CD45RB, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L(L-셀렉틴), CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD79(예를 들어, CD79a, CD79b), CD90, CD95(Fas), CD103, CD104, CD125(IL5RA), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD152(CTLA-4), CD221, CD274, CD279(PD-1), CD319(SLAMF7), CD326(EpCAM) 등.
일부 경우에, 결합 모이어티 A는 암 항원을 인식하는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 알파 태아 단백질, ASLG659, B7-H3, BAFF-R, 브레비칸, CA125(MUC16), CA15-3, CA19-9, 암배아 항원(CEA), CA242, CRIPTO(CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종 유래 성장 인자), CTLA-4, CXCR5, E16(LAT1, SLC7A5), FcRH2(IFGP4, IRTA4, SPAP1A(포스파타제 앵커 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C), 표피 성장 인자, ETBR, Fc 수용체 유사 단백질 1(FCRH1), GEDA, HLA-DOB(MHC 클래스 II 분자의 베타 서브유닛(Ia 항원), 인간 융모성 고나도트로핀, ICOS, IL-2 수용체, IL20Rα, 면역글로불린 수퍼패밀리 수용체 전좌 관련 2(IRTA2), L6, 루이스 Y, 루이스 X, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE 4, MART1, 메소텔린, MCP1(CCL2), MDP, 대식세포 억제 인자(MIF), MPF(SMR, MSLN), MPG, MSG783, 뮤신, MUC1-KLH, Napi3b(SLC34A2), 넥틴-4, Neu 종양 유전자 생성물, NCA, 태반 알칼리성 포스파타제, 전립선 특이적 막 항원(PMSA), 전립선 산 포스파타제, PSCA hIg, p97, 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅된 이온 채널 5(P2X5), LY64(림프구 항원 64(RP105), gp100, P21, 전립선의 6개의 막 횡단 상피 항원(STEAP1), STEAP2, Sema 5b, 종양 관련 당 단백질 72(TAG-72), TrpM4(BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4) 또는 이들의 조합물을 인식하는 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 경우에, 결합 모이어티 A는 CD 세포 표면 마커를 인식하는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD45RA, CD45RB, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L(L-셀렉틴), CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD79(예를 들어, CD79a, CD79b), CD90, CD95(Fas), CD103, CD104, CD125(IL5RA), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD152(CTLA-4), CD221, CD274, CD279(PD-1), CD319(SLAMF7), CD326(EpCAM), 또는 이들의 조합물을 인식하는 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 결합 단편은 잘루투무맙(HuMax-EFGr, Genmab), 아바고보맙(Menarini), 아비투주맙(Merck), 아데카투무맙(MT201), 알라시주맙 페골, 알렘투주맙(Campath®, MabCampath, 또는 Campath-1H; Leukosite), 알로뮨(AlloMune)(BioTransplant), 아마툭시맙(Morphotek, Inc.), 항-VEGF(Genetech), 아나투모맙 마페나톡스, 아폴리주맙(hu1D10), 아스크린바쿠맙(Pfizer Inc.), 아테졸리주맙(MPDL3280A; Genentech/Roche), B43.13(OvaRex, AltaRex Corporation), 바실릭시맙(Simulect®, Novartis), 벨리무맙(Benlysta®, GlaxoSmithKline), 베바시주맙(Avastin®, Genentech), 블리나투모맙(Blincyto, AMG103; Amgen), BEC2(ImGlone Systems Inc.), 카르루맙(Janssen Biotech), 카투막소맙(Removab, Trion Pharma), CEAcide(Immunomedics), 세툭시맙(Erbitux®, ImClone), 시타투주맙 보가톡스(VB6-845), 식수투무맙(IMC-A12, ImGlone Systems Inc.), 코나투무맙(AMG 655, Amgen), 다세투주맙(SGN-40, huS2C6; Seattle Genetics, Inc.), 다라투무맙(Darzalex®, Janssen Biotech), 데투모맙, 드로지투맙(Genentech), 두르발루맙(MedImmune), 두시기투맙(MedImmune), 에드레콜로맙(MAb17-1A, Panorex, Glaxo Wellcome), 엘로투주맙(Empliciti™, Bristol-Myers Squibb), 에미베투주맙(Eli Lilly), 에나바투주맙(Facet Biotech Corp.), 엔포르투맙 베도틴(Seattle Genetics, Inc.), 에노블리투주맙(MGA271, MacroGenics, Inc.), 엔시툭수맙(Neogenix Oncology, Inc.), 에프라투주맙(Lymphocide, Immunomedics, Inc.), 에르투막소맙(Rexomun®, Trion Pharma), 에타라시주맙(Abegrin, MedImmune), 파르레투주맙(MORAb-003, Morphotek, Inc), FBTA05(Lymphomun, Trion Pharma), 피클라투주맙(AVEO Pharmaceuticals), 피기투무맙(CP-751871, Pfizer), 플라보투맙(ImGlone Systems), 프레솔리무맙(GC1008, Aanofi-Aventis), 푸툭시맙, 글락시맙, 가니투맙(Amgen), 기렌툭시맙(Rencarex®, Wilex AG), IMAB362(Claudiximab, Ganymed Pharmaceuticals AG), 이말루맙(Baxalta), IMC-1C11(ImGlone Systems), IMC-C225(ImGlone Systems Inc.), 임가투주맙(Genentech/Roche), 인테투무맙(Centocor, Inc.), 이필리무맙(Yervoy®, Bristol-Myers Squibb), 이라투무맙(Medarex, Inc.), 이사툭시맙(SAR650984, Sanofi-Aventis), 라베투주맙(CEA-CIDE, Immunomedics), 렉사투무맙(ETR2-ST01, Cambridge Antibody Technology), 린투주맙(SGN-33, Seattle Genetics), 루카투무맙(Novartis), 루밀릭시맙, 마파투무맙(HGS-ETR1, Human Genome Sciences), 마투주맙(EMD 72000, Merck), 밀라투주맙(hLL1, Immunomedics, Inc.), 미투모맙(BEC-2, ImGlone Systems), 나르나투맙(ImGlone Systems), 네시투무맙(Portrazza™, Eli Lilly), 네스바쿠맙(Regeneron Pharmaceuticals), 니모투주맙(h-R3, BIOMAb EGFR, TheraCIM, Theraloc, 또는 CIMAher; Biotech Pharmaceutical Co.), 니볼루맙(Opdivo®, Bristol-Myers Squibb), 오비누투주맙(Gazyva 또는 Gazyvaro; Hoffmann-La Roche), 오카라투주맙(AME-133v, LY2469298; Mentrik Biotech, LLC), 오파투무맙(Arzerra®, Genmab), 오나르투주맙(Genentech), 온툭시주맙(Morphotek, Inc.), 오레고보맙(OvaRex®, AltaRex Corp.), 오트레르투주맙(Emergent BioSolutions), 파니투무맙(ABX-EGF, Amgen), 판코맙(Glycotope GMBH), 파르사투주맙(Genentech), 파트리투맙, 펨브롤리주맙(Keytruda®, Merck), 펨투모맙(Theragyn, Antisoma), 페르투주맙(Perjeta, Genentech), 피딜리주맙(CT-011, Medivation), 폴라투주맙 베도틴(Genentech/Roche), 프리투무맙, 라코투모맙(Vaxira®, Recombio), 라무시루맙(Cyramza®, ImGlone Systems Inc.), 리툭시맙(Rituxan®, Genentech), 로바투무맙(Schering-Plough), 세리반투맙(Sanofi/Merrimack Pharmaceuticals, Inc.), 시브로투주맙, 실툭시맙(Sylvant™, Janssen Biotech), Smart MI95(Protein Design Labs, Inc.), Smart ID10(Protein Design Labs, Inc.), 타발루맙(LY2127399, Eli Lilly), 타플리투모맙 팝톡스, 테나투모맙, 테프로투무맙(Roche), 테툴로맙, TGN1412(CD28-SuperMAB 또는 TAB08), 티가투주맙(CD1008, Daiichi Sankyo), 토시투모맙, 투라스투주맙(헤르셉틴®), 트레멜리무맙(CP-672,206; Pfizer), 투코투주맙 셀모루킨(EMD Pharmaceuticals), 우블리툭시맙, 우레루맙(BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), 볼로식시맙(M200, Biogen Idec), 자툭시맙 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 잘루투무맙(HuMax-EFGr, Genmab), 아바고보맙(Menarini), 아비투주맙(Merck), 아데카투무맙(MT201), 알라시주맙 페골, 알렘투주맙(Campath®, MabCampath, 또는 Campath-1H; Leukosite), 알로뮨(BioTransplant), 아마툭시맙(Morphotek, Inc.), 항-VEGF(Genetech), 아나투모맙 마페나톡스, 아폴리주맙(hu1D10), 아스크린바쿠맙(Pfizer Inc.), 아테졸리주맙(MPDL3280A; Genentech/Roche), B43.13(OvaRex, AltaRex Corporation), 바실릭시맙(Simulect®, Novartis), 벨리무맙(Benlysta®, GlaxoSmithKline), 베바시주맙(Avastin®, Genentech), 블리나투모맙(Blincyto, AMG103; Amgen), BEC2(ImGlone Systems Inc.), 카르루맙(Janssen Biotech), 카투막소맙(Removab, Trion Pharma), CEAcide(Immunomedics), 세툭시맙(Erbitux®, ImClone), 시타투주맙 보가톡스(VB6-845), 식수투무맙(IMC-A12, ImGlone Systems Inc.), 코나투무맙(AMG 655, Amgen), 다세투주맙(SGN-40, huS2C6; Seattle Genetics, Inc.), 다라투무맙(Darzalex®, Janssen Biotech), 데투모맙, 드로지투맙(Genentech), 두르발루맙(MedImmune), 두시기투맙(MedImmune), 에드레콜로맙(MAb17-1A, Panorex, Glaxo Wellcome), 엘로투주맙(Empliciti™, Bristol-Myers Squibb), 에미베투주맙(Eli Lilly), 에나바투주맙(Facet Biotech Corp.), 엔포르투맙 베도틴(Seattle Genetics, Inc.), 에노블리투주맙(MGA271, MacroGenics, Inc.), 엔시툭수맙(Neogenix Oncology, Inc.), 에프라투주맙(Lymphocide, Immunomedics, Inc.), 에르투막소맙(Rexomun®, Trion Pharma), 에타라시주맙(Abegrin, MedImmune), 파르레투주맙(MORAb-003, Morphotek, Inc), FBTA05(Lymphomun, Trion Pharma), 피클라투주맙(AVEO Pharmaceuticals), 피기투무맙(CP-751871, Pfizer), 플라보투맙(ImGlone Systems), 프레솔리무맙(GC1008, Aanofi-Aventis), 푸툭시맙, 글락시맙, 가니투맙(Amgen), 기렌툭시맙(Rencarex®, Wilex AG), IMAB362(Claudiximab, Ganymed Pharmaceuticals AG), 이말루맙(Baxalta), IMC-1C11(ImGlone Systems), IMC-C225(ImGlone Systems Inc.), 임가투주맙(Genentech/Roche), 인테투무맙(Centocor, Inc.), 이필리무맙(Yervoy®, Bristol-Myers Squibb), 이라투무맙(Medarex, Inc.), 이사툭시맙(SAR650984, Sanofi-Aventis), 라베투주맙(CEA-CIDE, Immunomedics), 렉사투무맙(ETR2-ST01, Cambridge Antibody Technology), 린투주맙(SGN-33, Seattle Genetics), 루카투무맙(Novartis), 루밀릭시맙, 마파투무맙(HGS-ETR1, Human Genome Sciences), 마투주맙(EMD 72000, Merck), 밀라투주맙(hLL1, Immunomedics, Inc.), 미투모맙(BEC-2, ImGlone Systems), 나르나투맙(ImGlone Systems), 네시투무맙(Portrazza™, Eli Lilly), 네스바쿠맙(Regeneron Pharmaceuticals), 니모투주맙(h-R3, BIOMAb EGFR, TheraCIM, Theraloc, 또는 CIMAher; Biotech Pharmaceutical Co.), 니볼루맙(Opdivo®, Bristol-Myers Squibb), 오비누투주맙(Gazyva 또는 Gazyvaro; Hoffmann-La Roche), 오카라투주맙(AME-133v, LY2469298; Mentrik Biotech, LLC), 오파투무맙(Arzerra®, Genmab), 오나르투주맙(Genentech), 온툭시주맙(Morphotek, Inc.), 오레고보맙(OvaRex®, AltaRex Corp.), 오트레르투주맙(Emergent BioSolutions), 파니투무맙(ABX-EGF, Amgen), 판코맙(Glycotope GMBH), 파르사투주맙(Genentech), 파트리투맙, 펨브롤리주맙(Keytruda®, Merck), 펨투모맙(Theragyn, Antisoma), 페르투주맙(Perjeta, Genentech), 피딜리주맙(CT-011, Medivation), 폴라투주맙 베도틴(Genentech/Roche), 프리투무맙, 라코투모맙(Vaxira®, Recombio), 라무시루맙(Cyramza®, ImGlone Systems Inc.), 리툭시맙(Rituxan®, Genentech), 로바투무맙(Schering-Plough), 세리반투맙(Sanofi/Merrimack Pharmaceuticals, Inc.), 시브로투주맙, 실툭시맙(Sylvant™, Janssen Biotech), Smart MI95(Protein Design Labs, Inc.), Smart ID10(Protein Design Labs, Inc.), 타발루맙(LY2127399, Eli Lilly), 타플리투모맙 팝톡스, 테나투모맙, 테프로투무맙(Roche), 테툴로맙, TGN1412(CD28-SuperMAB 또는 TAB08), 티가투주맙(CD1008, Daiichi Sankyo), 토시투모맙, 투라스투주맙(헤르셉틴®), 트레멜리무맙(CP-672,206; Pfizer), 투코투주맙 셀모루킨(EMD Pharmaceuticals), 우블리툭시맙, 우레루맙(BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), 볼로식시맙(M200, Biogen Idec), 자툭시맙을 포함한다. 일부의 실시양태예에서, 결합 모이어티 A는 잘루투무맙(HuMax-EFGr, Genmab)이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 식 I에 따라 폴리핵산 분자(B), 및 중합체(C), 및 선택적으로 본원에서 설명되는 식 II에 따른 엔도솜 분해성 모이어티(D)에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 표 2, 4, 8 또는 9에 제시된 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214 또는 1215-1242에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 16-45, 422-1173, 1195-1214 또는 1215-1242로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 중합체 C는 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티 D는 INF7 또는 멜리틴 또는 이들의 각각의 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 폴리핵산 분자(B), 및 중합체(C), 및 선택적으로 엔도솜 분해성 모이어티(D)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 비특이적으로 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 비부위 특이적 방식으로 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 비부위 특이적 방식으로 라이신 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 비부위 특이적 방식으로 시스테인 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식으로 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식으로 라이신 잔기, 시스테인 잔기, 5'-말단, 3'-말단, 비천연 아미노산 또는 효소 변형된 또는 효소 촉매된 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식을 통해 라이신 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식을 통해 시스테인 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식을 통해 5'-말단에서 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식을 통해 3'-말단에서 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식을 통해 비천연 아미노산을 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식을 통해 효소 변형된 또는 효소 촉매된 잔기를 통해 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편)의 하나 이상의 영역은 폴리핵산 분자(B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A의 하나 이상의 영역은 결합 모이어티 A의 N-말단, C-말단, 불변 영역, 힌지 영역 또는 Fc 영역을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B)는 결합 모이어티 A의 N-말단(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편의 N-말단)에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B)는 결합 모이어티 A의 C-말단(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편의 N-말단)에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B)는 결합 모이어티 A의 불변 영역(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편의 불변 영역)에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B)는 결합 모이어티 A의 힌지 영역(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편의 불변 영역)에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B)는 결합 모이어티 A의 Fc 영역(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편의 불변 영역)에 접합된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리핵산 분자(B)는 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 또는 그 초과의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 1개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 2개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 3개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 4개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 5개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 6개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 7개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 8개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 9개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 10개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 11개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 12개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 13개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 14개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 15개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 16개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 하나 이상의 폴리핵산 분자는 동일하다. 다른 경우에, 하나 이상의 폴리핵산 분자가 상이하다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 항체 또는 그의 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편)에 접합된 폴리핵산 분자(B)의 수는 일정 비율을 형성한다. 일부 경우에, 비율은 DAR(약물 대 항체) 비율로 지칭되며, 여기서 본원에 언급된 약물은 폴리핵산 분자(B)이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 그 초과이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 1 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 2 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 3 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 4 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 5 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 6 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 7 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 8 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 9 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 10 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 11 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 12 이상이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A(예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편)의 DAR 비율은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 1이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 2이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 3이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 4이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 5이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 6이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 7이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 8이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 9이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 10이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 11이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 12이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 13이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 14이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 15이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 약 16이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 1이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 2이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 4이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 6이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 8이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자(B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비율은 12이다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 결합 단편은 관련 기술 분야에 알려진 종래의 기술을 사용하여, 예를 들어, 단독으로 또는 조합하여 아미노산 결실, 삽입, 치환, 부가를 사용하여, 및/또는 재조합 및/또는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 다른 변형(예를 들어, 번역후 및 화학적 변형, 예컨대 글리코실화 및 인산화)에 의해 추가로 변형된다. 일부 경우에, 변형은 Fc 수용체와의 상호작용을 조절하기 위한 변형을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 변형은 예를 들어 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 개시하는, 국제 공개 제WO97/34631호에 기재된 것을 포함한다. 항체 또는 그의 결합 단편의 아미노산 서열의 기초를 이루는 핵산 서열에 이러한 변형을 도입하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다.
일부 경우에, 항체 결합 단편은 그의 유도체를 추가로 포함하고, 적어도 하나의 CDR을 함유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본원에서 사용되는 용어 "단일쇄"는 이중 특이적 단일쇄 구축물의 제1 및 제2 도메인이 바람직하게는 단일 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있는 공통 선상의(co-linear) 아미노산 서열의 형태로 공유 연결됨을 의미한다.
일부 경우에, 이중 특이적 단일쇄 항체 구축물은 2개의 항체 유래의 결합 도메인을 포함하는 구축물에 관한 것이다. 이러한 실시양태에서, 이중 특이적 단일쇄 항체 구축물은 탠덤(tandem) bi-scFv 또는 디아바디이다. 일부 경우에, scFv는 링커 펩티드에 연결된 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 링커는 제1 및 제2 도메인 각각이 서로 독립적으로 이들의 상이한 결합 특이성을 유지할 수 있는 것을 보장하기에 충분한 길이 및 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 결합 또는 상호작용은 적어도 2개의 항원 상호작용 부위의 서로에 대한 결합/상호작용을 정의한다. 일부 경우에, 항원 상호작용 부위는 특정 항원 또는 특정 항원군과 특이적 상호작용을 나타내는 폴리펩티드의 모티프를 정의한다. 일부 경우에, 결합/상호작용은 또한 특이적 인식을 정의하는 것으로 이해된다. 이러한 경우, 특이적 인식은 항체 또는 그의 결합 단편이 각각의 표적 분자의 적어도 2개의 아미노산과 특이적으로 상호작용하고/하거나 이에 대해 결합할 수 있다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 특이적 인식은 항체 분자의 특이성, 또는 표적 분자의 특정 영역을 구별할 수 있는 능력과 관련된다. 추가의 경우에, 항원 상호작용 부위와 그의 특이적 항원과의 특이적 상호작용은 예를 들어 항원의 입체형태적 변화의 유도, 항원의 올리고머화 등으로 인해 신호의 개시를 초래한다. 추가의 실시양태에서, 결합은 "열쇠-자물쇠 원리(key-lock-principle)"의 특이성에 의해 예시된다. 따라서, 일부 경우에, 항원 상호작용 부위의 아미노산 서열에서의 특정 모티프 및 항원은 이들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과뿐만 아니라, 상기 구조의 2차 변형의 결과로서 서로 결합한다. 이러한 경우, 항원 상호작용 부위와 그의 특이적 항원과의 특이적 상호작용은 또한 항원에 대한 부위의 간단한 결합을 초래한다.
일부 경우에, 특이적 상호작용은 항체 또는 그의 결합 단편의 감소된 교차반응성 또는 감소된 표적을 벗어난 효과를 추가로 지칭한다. 예를 들어, 관심있는 폴리펩티드/단백질에 결합하지만 임의의 다른 폴리펩티드에는 결합하지 않거나 본질적으로 결합하지 않는 항체 또는 그의 결합 단편은 관심있는 폴리펩티드/단백질에 대해 특이적인 것으로 간주된다. 항원 상호작용 부위와 특이적 항원의 특이적 상호작용의 예는 그의 수용체에 대한 리간드의 특이성, 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위와 항원 결정기(에피토프)의 상호작용을 포함한다.
추가의 결합 모이어티
일부 실시양태에서, 결합 모이어티는 혈장 단백질이다. 일부 경우에, 혈장 단백질은 알부민을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 알부민이다. 일부 경우에, 알부민은 본원에서 설명되는 하나 이상의 접합 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 알부민은 천연 라이게이션 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 알부민은 라이신 접합에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 스테로이드이다. 예시적인 스테로이드는 콜레스테롤, 인지질, 디- 및 트리-아실글리세롤, 지방산, 포화, 불포화, 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 탄화수소를 포함한다. 일부 경우에, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 콜레스테롤이다. 일부 경우에, 콜레스테롤은 본원에서 설명되는 하나 이상의 접합 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 콜레스테롤은 천연 라이게이션 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 콜레스테롤은 라이신 접합에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 세포 상의 특정 표면 마커에 결합하는 폴리핵산 분자 앱타머를 포함하지만 이로 제한되지 않는 중합체이다. 이 경우에, 결합 모이어티는, 표적 유전자 또는 mRNA에는 혼성화하지 않지만, 대신에 세포 표면 마커의 그의 특이적 에피토프에 결합하는 항체와 유사하게 세포 표면 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 폴리핵산이다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 펩티드이다. 일부 경우에, 펩티드는 약 1 내지 약 3 kDa를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드는 약 1.2 내지 약 2.8 kDa, 약 1.5 내지 약 2.5 kDa, 또는 약 1.5 내지 약 2 kDa를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드는 바이시클릭 펩티드이다. 일부 경우에, 바이시클릭 펩티드는 제한적 바이시클릭 펩티드이다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 바이시클릭 펩티드(예를 들어, Bicycle Therapeutics의 바이사이클)이다.
추가의 경우에, 결합 모이어티는 소분자이다. 일부 경우에, 소분자는 항체 동원 소분자이다. 일부 경우에, 항체 동원 소분자는 표적 결합 말단 및 항체 결합 말단을 포함하고, 여기서 표적 결합 말단은 세포 표면 수용체를 인식하고 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 글루타메이트 우레아 화합물을 포함하는 표적 결합 말단은 PSMA와의 상호작용을 가능하게 하고, 이에 의해 PSMA를 발현하는 세포(예를 들어, 암성 세포)와의 항체 상호작용을 향상시킨다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 문헌 [Zhang et al., "A remote arene-binding site on prostate specific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules," J Am Chem Soc. 132(36): 12711-12716 (2010); 또는 McEnaney, et al., "Antibody-recruiting molecules: an emerging paradigm for engaging immune function in treating human disease," ACS Chem Biol. 7(7): 1139-1151 (2012)]에 기재된 소분자이다.
항체 또는 그의 결합 단편의 생산
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 및 그의 결합 단편)는 특히 화학적 합성에 의해 또는 폴리펩티드에 의해 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 합성에 유용한 것으로 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산되고, 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의해 생산된다.
일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 재조합 방식으로 발현되고, 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립되고(예를 들어, 문헌 [Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기술된 바와 같이), 이것은 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션, 이어서 PCR에 의한 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
대안적으로, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 클로닝에 의해 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리 또는 면역글로불린을 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리)으로부터 선택적으로 생성된다.
일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 토끼와 같은 동물을 면역화하여 폴리클로날 항체를 생성함으로써 또는, 보다 바람직하게는 예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497)]에 기재된 바와 같이 또는, 문헌 [Cole et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)]에 기재된 바와 같이, 모노클로날 항체를 생성함으로써 선택적으로 생성된다. 대안적으로, 항체의 적어도 Fab 부분을 코딩하는 클론은 선택적으로 특이적 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론에 대해 Fab 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써(예를 들어 문헌 [Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281]에 기재된 바와 같음) 또는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써(예를 들어, 문헌 [Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937] 참조) 수득된다.
일부 실시양태에서, 적절한 생물학적 활성을 갖는 인간 항체 분자의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)이 사용된다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종, 예컨대 뮤린 모노클로날 항체 및 인간 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어 인간화 항체로부터 유래된 가변 영역을 갖는 것들로부터 유래된 분자이다.
일부 실시양태에서, 단일쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기술(미국 특허 제4,694,778호; 문헌 [Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334:544-54])은 단일쇄 항체를 생산하기 위해 개조된다. 단일쇄 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하여 단일쇄 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다. 이. 콜라이(E. coli)에서의 기능적 Fv 단편의 조립을 위한 기술이 또한 선택적으로 사용된다(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
일부 실시양태에서, 항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 항체의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 기술(예를 들어, 전기천공, 리포솜 형질감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 형질감염된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 항체를 생성한다. 특정 실시양태에서, 항체의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
일부 실시양태에서, 다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에서 설명되는 항체 또는 그의 결합 단편을 발현시키기 위해 이용된다. 이러한 숙주 발현 시스템은 그에 의해 항체의 코딩 서열이 생산된 다음 정제되는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때, 원위치에서 항체 또는 그의 결합 단편을 발현하는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 또는 그의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물(예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 항체 또는 그의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아(Saccharomyces Pichia)); 항체 또는 그의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 또는 항체 또는 그의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 갖는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3 세포)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 일부 경우에, 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 선택적으로 조작된다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선택 가능 마커로 형질전환된다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 농축된 배지에서 1-2일 동안 성장한 다음, 선택 배지로 옮겨진다. 재조합 플라스미드 내의 선택 가능 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 초점(focus)을 형성하도록 허용하고, 상기 초점은 다시 클로닝되어 세포주로 확대된다. 이 방법은 항체 또는 그의 결합 단편을 발현하는 세포주를 조작하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.
일부 경우에, 비제한적으로 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자를 포함하는, 많은 선택 시스템이 사용되며, 이는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용된다. 또한, 항대사물질 내성이 다음과 같은 유전자를 선택하기 위한 기초로서 사용된다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215) 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법은 문헌 [Ausubel et al. eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)]에 기재되어 있다.
일부 경우에, 항체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가된다(검토를 위해, 문헌 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체의 뉴클레오티드 서열과 관련되기 때문에, 항체의 생산 또한 증가할 것이다(Crouse et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:257).
일부 경우에, 항체의 정제를 위한 관련 기술 분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후의 특이적 항원에 대한 친화도, 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술이 사용된다.
중합체 접합 모이어티
일부 실시양태에서, 중합체 모이어티 C는 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자, 본원에서 설명되는 결합 모이어티, 또는 이들의 조합에 추가로 접합된다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 결합 모이어티에 접합된다. 다른 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리핵산 분자 결합 모이어티 분자에 접합된다. 추가의 경우에, 중합체 모이어티 C는 치료 분자 플랫폼 섹션 하에서 논의된 바와 같이 접합된다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 2차원 또는 3차원으로 분지되거나 비분지된 단량체의 긴 사슬, 및/또는 단량체의 가교결합된 네트워크로 이루어진 천연 또는 합성 중합체이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리사카라이드, 리그닌, 고무, 또는 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 중합체 모이어티 C는 비제한적으로, 알파-, 오메가-디히드록실폴리에틸렌글리콜, 생분해성 락톤계 중합체, 예를 들어 폴리아크릴산, 폴리락티드산(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리올레핀, 폴리아미드, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리이미드, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET, PETG), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PETE), 폴리테트라메틸렌 글리콜(PTG), 또는 폴리우레탄뿐만 아니라, 이들의 혼합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 혼합물은 동일한 화합물 내에서뿐만 아니라 블록 공중합체와 관련하여 상이한 중합체의 사용을 지칭한다. 일부 경우에, 블록 공중합체는 중합체의 적어도 하나의 부분이 또 다른 중합체의 단량체로부터 형성되는 중합체이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리알킬렌 옥사이드를 포함한다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 PEG를 포함한다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리에틸렌 이미드(PEI) 또는 히드록시 에틸 전분(HES)을 포함한다.
일부 경우에, C는 PEG 모이어티이다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 폴리핵산 분자의 5' 말단에서 접합되는 반면, 결합 모이어티는 폴리핵산 분자의 3' 말단에서 접합된다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 폴리핵산 분자의 3' 말단에서 접합되는 반면, 결합 모이어티는 폴리핵산 분자의 5' 말단에서 접합된다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 폴리핵산 분자의 내부 부위에 접합된다. 일부 경우에, PEG 모이어티, 결합 모이어티, 또는 이의 조합은 폴리핵산 분자의 내부 부위에 접합된다. 일부 경우에, 접합은 직접 접합이다. 일부 경우에, 접합은 천연 라이게이션을 통해서 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG)는 다분산계 또는 단분산계 화합물이다. 일부 경우에, 다분산계 물질은 평균 중량(중량 평균) 크기 및 분산성을 특징으로 하는, 상이한 분자량의 물질의 분산 분포를 포함한다. 일부 경우에, 단분산계 PEG는 하나의 크기의 분자를 포함한다. 일부의 실시양태예에서, C는 다분산 또는 단분산된 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG)이며, 표시된 분자량은 폴리알킬렌 옥사이드, 예컨대, PEG 분자의 분자량의 평균을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG)의 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da이다.
일부 실시양태에서, C는 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG)이며, 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, C는 PEG이며, 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1100 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1450 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2100 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3250 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3350 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3750 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4250 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4750 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 5000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 5500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 6000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 6500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 7000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 7500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 8000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 10,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 12,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 20,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 35,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 40,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 50,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 60,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 100,000 Da이다.
일부 실시양태에서, 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, PEG)는 별개의 PEG이며, 별개의 PEG는 1개를 초과하는 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함하는 중합체 PEG이다. 일부 경우에, 별개의 PEG(dPEG)는 2 내지 60, 2 내지 50, 또는 2 내지 48개의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 42, 48, 50개 또는 그 초과의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 2개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 3개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 4개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 5개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 6개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 7개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 8 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 9개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 10개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 11개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 12개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 13개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 14개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 15개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 16개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 17개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 18개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 19개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 20개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 22개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 24개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 26개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 28개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 30개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 35개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 40개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 42개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 48개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 약 50개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 단계적인 방식으로 순수한(예를 들어, 약 95%, 98%, 99%, 또는 99.5%) 출발 물질로부터 단일 분자량 화합물로서 합성된다. 일부 경우에, dPEG는 평균 분자량보다는 특정 분자량을 갖는다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 dPEG는 콴타 바이오디자인(Quanta Biodesign, LMD)의 dPEG이다.
일부 실시양태에서, 중합체 모이어티 C는 양이온성 뮤신산 기반 중합체(cMAP)를 포함한다. 일부 경우에, cMPA는 적어도 하나의 반복 서브유닛의 하나 이상의 서브유닛을 포함하며, 상기 서브유닛 구조는 하기 식 III으로 표시된다:
Figure pct00046
식 III
여기서, m은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 바람직하게는 4-6 또는 5이고; n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 일부 실시양태에서, m 및 n은 예를 들어 약 10이다.
일부 경우에, cMAP는 PEG 모이어티에 추가로 접합되어, cMAP-PEG 공중합체, mPEG-cMAP-PEGm 삼블록 중합체, 또는 cMAP-PEG-cMAP 삼블록 중합체를 생성한다. 일부 경우에, PEG 모이어티의 분자량은 약 500 Da 내지 약 50,000 Da의 범위이다. 일부 경우에, PEG 모이어티의 분자량은 약 500 Da 내지 약 1000 Da, 1000 Da 초과 내지 약 5000 Da, 5000 Da 초과 내지 약 10,000 Da, 10,000 Da 초과 내지 약 25,000 Da, 25,000 Da 초과 내지 약 50,000 Da, 또는 이들 범위 중 둘 이상의 임의의 조합이다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 cMAP-PEG 공중합체, mPEG-cMAP-PEGm 삼블록 중합체, 또는 cMAP-PEG-cMAP 삼블록 중합체이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 cMAP-PEG 공중합체이다. 다른 경우에, 중합체 모이어티 C는 mPEG-cMAP-PEGm 삼블록 중합체이다. 추가의 경우에, 중합체 모이어티 C는 cMAP-PEG-cMAP 삼블록 중합체이다.
일부 실시양태에서, 중합체 모이어티 C는 폴리핵산 분자, 결합 모이어티, 및 선택적으로 엔도솜 분해성 모이어티에 접합된다.
엔도솜 분해성 모이어티
일부 실시양태에서, 식 I(A-X-B-Y-C)의 분자는 추가의 접합 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 추가의 접합 모이어티는 엔도솜 분해성 모이어티이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 세포 구획 방출 성분, 예컨대 관련 기술 분야에 알려진 임의의 세포 구획, 예컨대 엔도솜, 리소솜, 소포체(ER), 골지체, 미세소관, 퍼옥시솜, 또는 세포를 갖는 다른 소포체(vesicular body)로부터 방출될 수 있는 화합물이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드, 엔도솜 분해성 중합체, 엔도솜 분해성 지질, 또는 엔도솜 분해성 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체를 포함한다.
엔도솜 분해성 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 식 I(A-X-B-Y-C)의 분자는 엔도솜 분해성 폴리펩티드와 추가로 접합된다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 pH 의존성 막 활성 펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 양친매성 폴리펩티드이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 펩티드 모방체(peptidomimetic)이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 INF, 멜리틴, 메우신(meucin), 또는 이들의 각각의 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 INF 또는 그의 유도체를 포함한다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 멜리틴 또는 그의 유도체를 포함한다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 메우신 또는 그의 유도체를 포함한다.
일부 경우에, INF7은 그 서열이 CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA(서열 번호 1243), 또는 GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC(서열 번호 1244)를 포함하는 24개 잔기의 폴리펩티드이다. 일부 경우에, INF7 또는 그의 유도체는 GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG(서열 번호 1245), GLFEAIEGFIENGWEGMIDG WYG-(PEG)6-NH2(서열 번호 1246), 또는 GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2(서열 번호 1247)의 서열을 포함한다.
일부 경우에, 멜리틴은 그 서열이 CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ(서열 번호 1248), 또는 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열 번호 1249)를 포함하는 26개 잔기의 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 멜리틴은 미국 특허 제8,501,930호에 기재된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 메우신은 전갈 메소부투스 에우페우스(Mesobuthus eupeus)의 독샘으로부터 유래된 항미생물 펩티드(AMP)이다. 일부 경우에, 메우신은 그 서열이 IFGAIAGLLKNIF-NH2(서열 번호 1250)을 포함하는 메우신-13 및 그 서열이 FFGHLFKLATKIIPSLFQ(서열 번호 1251)를 포함하는 메우신-18을 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 그의 서열이 INF7 또는 그의 유도체, 멜리틴 또는 그의 유도체, 또는 메우신 또는 그의 유도체에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체, 멜리틴 또는 그의 유도체, 또는 메우신 또는 그의 유도체를 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243-1247에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1244-1247에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1244-1247을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243으로 이루어진다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1244-1247로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248 또는 1249에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1249에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1249를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248로 이루어진다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1249로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 메우신 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1250 또는 1251에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1250에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1251에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1250을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1251을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1250으로 이루어진다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1251로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 10에 예시된 바와 같은 서열을 포함한다.
표 10
Figure pct00047
Figure pct00048
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 Bcl-2 및/또는 Bcl-xL과 같은 억제인자 표적의 길항을 통해 아폽토시스를 유도하는 Bak BH3 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 문헌 [Albarran, et al., "Efficient intracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsive carrier," Reactive & Functional Polymers 71: 261-265 (2011)]에 기재된 Bak BH3 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 PCT 공개 제WO2013/166155호 또는 제WO2015/069587호에 기재된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 세포 투과 폴리펩티드)를 포함한다.
엔도솜 분해성 중합체
일부 실시양태에서, 식 I(A-X-B-Y-C)의 분자는 엔도솜 분해성 중합체와 추가로 접합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 엔도솜 분해성 중합체는 선형, 분지형 네트워크, 별, 빗, 또는 사다리 유형의 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 중합체는 2개 이상의 상이한 유형의 단량체를 포함하는 동종중합체 또는 공중합체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 중합체는 다가 양이온 중합체이다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 중합체는 다가 음이온 중합체이다.
일부 경우에, 다가 양이온 중합체는 전하 양성, 전하 중성, 또는 전하 음성인 단량체 단위를 포함하며, 그의 순 전하는 양성이다. 다른 경우에, 다가 양이온 중합체는 2 이상의 양전하를 함유하는 비중합체 분자를 포함한다. 예시적인 양이온 중합체는 폴리(L-라이신)(PLL), 폴리(L-아르기닌)(PLA), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산](PAGA), 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(DMAEMA), 또는 N,N-디에틸아미노에틸 메타크릴레이트(DEAEMA)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 다가 음이온 중합체는 전하 양성, 전하 중성, 또는 전하 음성인 단량체 단위를 포함하며, 그의 순 전하는 음성이다. 다른 경우에, 다가 음이온 중합체는 2 이상의 음전하를 함유하는 비중합체 분자를 포함한다. 예시적인 음이온 중합체는 p(알킬아크릴레이트)(예를 들어, 폴리(프로필 아크릴산)(PPAA)) 또는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(NIPAM)를 포함한다. 추가의 예는 문헌 [Khormaee, et al., "Edosomolytic anionic polymer for the cytoplasmic delivery of siRNAs in localized in vivo applications," Advanced Functional Materials 23: 565-574 (2013)]에 기재된 L-페닐알라닌-폴리(L-라이신 이소프탈아미드) 중합체인 PP75를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 엔도솜 분해성 중합체는 pH 반응성 엔도솜 분해성 중합체이다. pH 반응성 중합체는 환경의 pH에 따라 크기가 증가(팽윤)하거나 붕괴하는 중합체를 포함한다. 폴리아크릴산 및 키토산은 pH 반응성 중합체의 예이다.
일부 경우에, 본원에서 설명되는 엔도솜 분해성 모이어티는 막 붕괴성 중합체이다. 일부 경우에, 막 붕괴성 중합체는 양이온 중합체, 중성 또는 소수성 중합체, 또는 음이온 중합체를 포함한다. 일부 경우에, 막 붕괴성 중합체는 친수성 중합체이다.
일부 경우에, 본원에서 설명되는 엔도솜 분해성 모이어티는 pH 반응성 막 붕괴성 중합체이다. 예시적인 pH 반응성 막 붕괴성 중합체는 p(알킬아크릴산), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(NIPAM) 공중합체, 숙시닐화된 p(글리시돌), 및 p(β-말산) 중합체를 포함한다.
일부 경우에, p(알킬아크릴산)은 폴리(프로필아크릴산)(폴리PAA), 폴리(메타크릴산)(PMAA), 폴리(에틸아크릴산)(PEAA), 및 폴리(프로필 아크릴산)(PPAA)을 포함한다. 일부 경우에, p(알킬아크릴산)은 문헌 [Jones, et al., Biochemistry Journal 372: 65-75 (2003)]에 기재된 p(알킬아크릴산)을 포함한다.
일부 실시양태에서, pH 반응성 막 붕괴성 중합체는 p(부틸 아크릴레이트-co-메타크릴산)을 포함한다(문헌 [Bulmus, et al., Journal of Controlled Release 93: 105-120 (2003); 및 Yessine, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1613: 28-38 (2003)] 참조).
일부 실시양태에서, pH 반응성 막 붕괴성 중합체는 p(스티렌-alt-말레산 무수물)을 포함한다(문헌 [Henry, et al., Biomacromolecules 7: 2407-2414 (2006)] 참조).
일부 실시양태에서, pH 반응성 막 붕괴성 중합체는 피리딜디술파이드 아크릴레이트(PDSA) 중합체, 예컨대 폴리(MAA-co-PDSA), 폴리(EAA-co-PDSA), 폴리(PAA-co-PDSA), 폴리(MAA-co-BA-co-PDSA), 폴리(EAA-co-BA-co-PDSA), 또는 폴리(PAA-co-BA-co-PDSA) 중합체를 포함한다(문헌 [El-Sayed, et al., "Rational design of composition and activity correlations for pH-responsive and glutathione-reactive polymer therapeutics," Journal of Controlled Release 104: 417-427 (2005); 또는 Flanary et al., "Antigen delivery with poly(propylacrylic acid) conjugation enhanced MHC-1 presentation and T-cell activation," Bioconjugate Chem. 20: 241-248 (2009)] 참조).
일부 실시양태에서, pH 반응성 막 붕괴성 중합체는 하기 염기 구조를 포함하는 용해성 중합체를 포함한다:
Figure pct00049
일부 경우에, 본원에서 설명되는 엔도솜 분해성 모이어티는 추가의 접합체, 예를 들어 중합체(예를 들어, PEG), 또는 변형된 중합체(예를 들어, 콜레스테롤 변형된 중합체)에 추가로 접합된다.
일부 경우에, 추가의 접합체는 세제(예를 들어, 트리톤 X-100)를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 엔도솜 분해성 모이어티는 세제(예를 들어, 트리톤 X-100)와 접합된 중합체(예를 들어, 폴리(아미도아민))를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 엔도솜 분해성 모이어티는 폴리(아미도아민)-트리톤 X-100 접합체를 포함한다(Duncan, et al., "A polymer-Triton X-100 conjugate capable of pH-dependent red blood cell lysis: a model system illustrating the possibility of drug delivery within acidic intracellular compartments," Journal of Drug Targeting 2: 341-347 (1994)).
엔도솜 분해성 지질
일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티는 지질(예를 들어, 융합성(fusogenic) 지질)이다. 일부 실시양태에서, 식 I(A-X-B-Y-C))의 분자는 엔도솜 분해성 지질(예를 들어, 융합성 지질)과 추가로 접합된다. 예시적인 융합성 지질은 1,2-딜레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE), 포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(Di-Lin), N-메틸(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)-1,3-디옥솔란-4-일)메탄아민(DLin-k-DMA) 및 N-메틸-2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄아민(XTC)을 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 PCT 공개 제WO09/126,933호에 기재된 지질(예를 들어, 융합성 지질)이다.
엔도솜 분해성 소분자
일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 식 I(A-X-B-Y-C)의 분자는 엔도솜 분해성 소분자와 추가로 접합된다. 엔도솜 분해성 모이어티로서 적합한 예시적인 소분자는 퀴닌, 클로로퀴닌, 히드록시클로로퀴닌, 아모디아퀸(카르노퀸), 아모피로퀸, 프리마퀸, 메플로퀸, 니바퀸, 할로판트린, 퀴논 이민, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 퀴놀린 엔도솜 분해성 모이어티는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 7-클로로-4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸-아미노)퀴놀린(클로로퀴닌); 7-클로로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸-아미노)퀴놀린(히드록시클로로퀴닌); 7-플루오로-4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸-아미노)퀴놀린; 4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-디에틸-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린(데스메틸클로로퀴닌); 7-플루오로-4-(4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린); 4-(4-디에틸-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-디에틸-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-디에틸-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 4-(4-에틸-(2-히드록시-에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노-)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 히드록시클로로퀴닌 포스페이트; 7-클로로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸-1)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린(데스메틸히드록시클로로퀴닌); 7-플루오로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 8-[(4-아미노펜틸)아미노-6-메톡시디히드로클로라이드 퀴놀린; 1-아세틸-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린; 8-[(4-아미노펜틸)아미노]-6-메톡시퀴놀린 디히드로클로라이드; 1-부티릴-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린; 3-클로로-4-(4-히드록시-알파,알파'-비스(2-메틸-1-피롤리디닐)-2,5-자일리디노퀴놀린, 4-[(4-디에틸-아미노)-1-메틸부틸-아미노]-6-메톡시퀴놀린; 3-플루오로-4-(4-히드록시-알파,알파'-비스(2-메틸-1-피롤리디닐)-2,5-자일리디노퀴놀린, 4-[(4-디에틸아미노)-1-메틸부틸-아미노]-6-메톡시퀴놀린; 4-(4-히드록시-알파,알파'-비스(2-메틸-1-피롤리디닐)-2,5-자일리디노퀴놀린; 4-[(4-디에틸아미노)-1-메틸부틸-아미노]-6-메톡시퀴놀린; 3,4-디히드로-1-(2H)-퀴놀린카르복시알데히드; 1,1'-펜타메틸렌 디퀴놀레이늄 디아이오다이드; 8-퀴놀리놀 술페이트 및 아미노, 알데히드, 카르복실, 히드록실, 할로겐, 케토, 술프히드릴 및 비닐 유도체 또는 이의 유사체. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 문헌 [Naisbitt et al. 1997, J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893] 및 미국 특허 제5,736,557호에 기재된 소분자이다.
식 I 분자-엔도솜 분해성 모이어티 접합체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 엔도솜 분해성 모이어티는 적어도 하나의 결합 모이어티, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 적어도 하나의 중합체, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 분자에 접합된다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 하기 식 II에 따라 접합된다:
(A-X-B-Y-Cc)-L-D
식 II
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
c는 0 내지 1의 정수이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; D는 A, B 또는 C 상의 임의의 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합 또는 비중합체 링커기이다. 일부 경우에, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, C는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 폴리펩티드, 중합체, 지질, 또는 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체이다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 지질이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 소분자이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243으로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 10에 예시된 바와 같은 서열이다.
추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체, 예를 들어 pH 반응성 엔도솜 분해성 중합체, 막 붕괴성 중합체, 다가 양이온 중합체, 다가 음이온 중합체, pH 반응성 막 붕괴성 중합체, 또는 이들의 조합이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 p(알킬아크릴산) 중합체, p(부틸 아크릴레이트-co-메타크릴산) 중합체, p(스티렌-alt-말레산 무수물) 중합체, 피리딜디술파이드 아크릴레이트(PDSA) 중합체, 중합체-PEG 접합체, 중합체-세제 접합체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티 접합체는 하기 식 IIa에 따른다:
D-L-A-X-B-Y-Cc
식 IIa
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
c는 정수 1이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합 또는 비중합체 링커기이다. 일부 경우에, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, C는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 폴리펩티드, 중합체, 지질, 또는 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체이다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 지질이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 소분자이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243으로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 10에 예시된 바와 같은 서열이다.
추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체, 예를 들어 pH 반응성 엔도솜 분해성 중합체, 막 붕괴성 중합체, 다가 양이온 중합체, 다가 음이온 중합체, pH 반응성 막 붕괴성 중합체, 또는 이들의 조합이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 p(알킬아크릴산) 중합체, p(부틸 아크릴레이트-co-메타크릴산) 중합체, p(스티렌-alt-말레산 무수물) 중합체, 피리딜디술파이드 아크릴레이트(PDSA) 중합체, 중합체-PEG 접합체, 중합체-세제 접합체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티 접합체는 하기 식 IIb에 따른다:
A-X-B-L-D
식 IIb
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합 또는 비중합체 링커기이다. 일부 경우에, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, C는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 폴리펩티드, 중합체, 지질, 또는 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체이다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 지질이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 소분자이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243으로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 10에 예시된 바와 같은 서열이다.
추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체, 예를 들어 pH 반응성 엔도솜 분해성 중합체, 막 붕괴성 중합체, 다가 양이온 중합체, 다가 음이온 중합체, pH 반응성 막 붕괴성 중합체, 또는 이들의 조합이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 p(알킬아크릴산) 중합체, p(부틸 아크릴레이트-co-메타크릴산) 중합체, p(스티렌-alt-말레산 무수물) 중합체, 피리딜디술파이드 아크릴레이트(PDSA) 중합체, 중합체-PEG 접합체, 중합체-세제 접합체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티 접합체는 하기 식 IIc에 따른다:
A-X-B-Y-Cc-L-D
식 IIc
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
c는 정수 1이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합 또는 비중합체 링커기이다. 일부 경우에, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, C는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 폴리펩티드, 중합체, 지질, 또는 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체이다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 지질이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 소분자이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243으로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 10에 예시된 바와 같은 서열이다.
추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체, 예를 들어 pH 반응성 엔도솜 분해성 중합체, 막 붕괴성 중합체, 다가 양이온 중합체, 다가 음이온 중합체, pH 반응성 막 붕괴성 중합체, 또는 이들의 조합이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 p(알킬아크릴산) 중합체, p(부틸 아크릴레이트-co-메타크릴산) 중합체, p(스티렌-alt-말레산 무수물) 중합체, 피리딜디술파이드 아크릴레이트(PDSA) 중합체, 중합체-PEG 접합체, 중합체-세제 접합체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티 접합체는 하기 식 IId에 따른다:
A-L-D-X-B-Y-Cc
식 IId
여기서,
A는 결합 모이어티이고;
B는 폴리뉴클레오티드이고;
C는 중합체이고;
X는 결합 또는 제1 링커이고;
Y는 결합 또는 제2 링커이고;
L은 결합 또는 제3 링커이고;
D는 엔도솜 분해성 모이어티이고;
c는 정수 1이며;
상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 2' 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합 또는 비중합체 링커기이다. 일부 경우에, A는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, C는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 폴리펩티드, 중합체, 지질, 또는 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체이다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 지질이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 소분자이다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1243으로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 그의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1248로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 10에 예시된 바와 같은 서열이다.
추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체, 예를 들어 pH 반응성 엔도솜 분해성 중합체, 막 붕괴성 중합체, 다가 양이온 중합체, 다가 음이온 중합체, pH 반응성 막 붕괴성 중합체, 또는 이들의 조합이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 p(알킬아크릴산) 중합체, p(부틸 아크릴레이트-co-메타크릴산) 중합체, p(스티렌-alt-말레산 무수물) 중합체, 피리딜디술파이드 아크릴레이트(PDSA) 중합체, 중합체-PEG 접합체, 중합체-세제 접합체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
링커
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 링커는 절단 가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커이다. 일부 경우에, 링커는 절단 가능한 링커이다. 일부 경우에, 링커는 산 절단 가능한 링커이다. 일부 경우에, 링커는 절단 불가능한 링커이다. 일부 경우에, 링커는 C1-C6 알킬기(예를 들어, C5, C4, C3, C2, 또는 C1 알킬기)를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 동종이작용성 교차 링커, 이종이작용성 교차 링커 등을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 흔적없는 링커(또는 제로-길이(zero-length) 링커)이다. 일부 경우에, 링커는 비중합체 링커이다. 일부 경우에, 링커는 비펩티드 링커 또는 아미노산 잔기를 함유하지 않는 링커이다.
일부 경우에, 링커는 동종이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 동종이작용성 링커는 로만트(Lomant) 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트(DTSSP), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)수베레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디술포숙신이미딜 타르트레이트(술포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술파이드(BASED), 포름알데히드, 글루타르알데히드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디히드라지드, 카르보히드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디아이오도-p-자일렌 술폰산, N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드), 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(아이오도아세트아미드)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 링커는 이종이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 이종이작용성 링커는 아민-반응성 및 술프히드릴 교차 링커, 예컨대 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(술포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 술포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC), 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(술포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르(술포-MB), N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 술포숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(술포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(술포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)술포숙신이미드 에스테르(술포-GMB), 숙신이미딜 6-((아이오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((아이오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((아이오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-((((4-아이오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카르보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 아이오도아세테이트(NPIA), 카르보닐 반응성 및 술프히드릴 반응성 교차 링커, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실-히드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(PDPH), 아민-반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도살리실산(술포-NHs-AsA), 술포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(술포-NHs-LC-AsA), 술포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-히드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(술포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NO), 술포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-술포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(술포-sADP), 술포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(술포-sAPB), 술포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(술포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 술프히드릴 반응성 및 광반응성 교차링커, 예컨대 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(아이오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-아이오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 카르보닐 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 ρ-아지도벤조일 히드라지드(ABH), 카르복실레이트 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA), 및 아르기닌 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 링커는 반응성 관능성 기를 포함한다. 일부 경우에, 반응성 관능성 기는 결합 모이어티에 존재하는 친전자성 기에 반응성인 친핵성 기를 포함한다. 예시적인 친전자성 기는 카르보닐 기, 예컨대 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할라이드 또는 산 무수물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응성 작용성 기는 알데히드이다. 예시적인 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 말레이미드 기를 포함한다. 일부 경우에, 말레이미드 기는 말레이미드 스페이서로도 지칭된다. 일부 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도카프로일(mc)을 형성하는 카프로산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도메틸 기, 예컨대 상기 설명된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC) 또는 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-sMCC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 말레이미드 기는 자가 안정화 말레이미드이다. 일부 경우에, 자가 안정화 말레이미드는 디아미노프로피온산(DPR)을 사용하여 말레이미드에 인접한 염기성 아미노 기를 도입하여 티오숙신이미드 고리 가수분해의 분자내 촉매작용을 제공하고, 이에 의해 레트로-마이클(retro-Michael) 반응을 통한 제거 반응을 거침으로써 말레이미드를 제거한다. 일부 경우에, 자가 안정화 말레이미드는 문헌 [Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)]에 기재된 말레이미드 기이다. 일부 경우에, 링커는 자가 안정화 말레이미드를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 자가 안정화 말레이미드이다.
일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 절단가능한 펩티드 모이어티(예를 들어, 효소적으로 또는 화학적으로)이다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 절단 불가능한 펩티드 모이어티이다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 Val-Cit(발린-시트룰린), Gly-Gly-Phe-Gly(서열 번호 2111), Phe-Lys, Val-Lys, Gly-Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu(서열 번호 2112), 또는 Gly-Phe-Leu-Gly(서열 번호 2113)를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 펩티드 모이어티, 예컨대 Val-Cit(발린-시트룰린), Gly-Gly-Phe-Gly(서열 번호 2111), Phe-Lys, Val-Lys, Gly-Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu(서열 번호 2112), 또는 Gly-Phe-Leu-Gly(서열 번호 2113)를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 Val-Cit를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 Val-Cit이다.
일부 실시양태에서, 링커는 벤조산 기, 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 벤조산 기 또는 그의 유도체는 파라아미노벤조산(PABA)을 포함한다. 일부 경우에, 벤조산 기 또는 그의 유도체는 감마-아미노부티르산(GABA)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 말레이미드 기, 펩티드 모이어티, 및/또는 벤조산 기 중 하나 이상을 임의의 조합으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 말레이미드 기, 펩티드 모이어티, 및/또는 벤조산 기의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도카프로일(mc)이다. 일부 경우에, 펩티드 그룹은 val-cit이다. 일부 경우에, 벤조산 기는 PABA이다. 일부 경우에, 링커는 mc-val-cit 기를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 val-cit-PABA 그룹을 포함한다. 추가의 경우에, 링커는 mc-val-cit-PABA 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 자가 희생 링커(self-immolative) 또는 자가 제거 링커이다. 일부 경우에, 링커는 자가 희생 링커이다. 다른 경우에, 링커는 자가 제거 링커(예를 들어, 고리화 자가 제거 링커)이다. 일부 경우에, 링커는 미국 특허 제9,089,614호 또는 PCT 공개 제WO2015038426호에 기재된 링커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 수지 유형(dendritic type) 링커이다. 일부 경우에, 수지 유형 링커는 분지형 다작용성 링커 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 수지 유형 링커는 폴리뉴클레오티드 B 대 결합 모이어티 A의 몰비를 증가시키기 위해 사용된다. 일부 경우에, 수지 유형 링커는 PAMAM 덴드리머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 흔적없는 링커 또는 절단 후 결합 모이어티 A, 폴리뉴클레오티드 B, 중합체 C, 또는 엔도솜 분해성 모이어티 D에 링커 모이어티(예를 들어, 원자 또는 링커기)를 남기지 않는 링커이다. 예시적인 흔적없는 링커는 게르마늄 링커, 규소 링커, 황 링커, 셀레늄 링커, 질소 링커, 인 링커, 붕소 링커, 크롬 링커, 또는 페닐히드라지드 링커를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 링커는 문헌 [Hejesen, et al., "A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry," Org Biomol Chem 11(15): 2493-2497 (2013)]에 기재된 바와 같은 흔적없는 아릴-트리아젠 링커이다. 일부 경우에, 링커는 문헌 [Blaney, et al., "Braceless solid-phase organic synthesis," Chem. Rev. 102: 2607-2024 (2002)]에 기재된 흔적없는 링커이다. 일부 경우에, 링커는 미국 특허 제6,821,783호에 기재된 바와 같은 흔적없는 링커이다.
일부 경우에, 링커는 링커 및 접합 모이어티(예를 들어, 본원에서 설명되는 A, B, C, 또는 D) 사이의 결합 부위에서 입체 방해를 가하는 작용성 기를 포함한다. 일부 경우에, 입체 방해는 디술파이드 결합 주위의 입체 방해이다. 입체 방해를 나타내는 예시적인 링커는 이종이작용성 링커, 예컨대 상기 기재된 이종이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에, 입체 방해를 나타내는 링커는 SMCC 및 SPDB를 포함한다.
일부 경우에, 링커는 산 절단 가능한 링커이다. 일부 경우에, 산 절단 가능한 링커는 가수분해 절단에 민감한 히드라존 결합을 포함한다. 일부 경우에, 산 절단 가능한 링커는 티오말레암산 링커를 포함한다. 일부 경우에, 산 절단 가능한 링커는 문헌 [Castaneda, et al, "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibody-drug conjugation," Chem. Commun. 49: 8187-8189 (2013)]에 기재된 바와 같은 티오말레암산 링커이다.
일부 경우에, 링커는 미국 특허 제6,884,869호; 제7,498,298호; 제8,288,352호; 제8,609,105호; 또는 제8,697,688호; 미국 특허 출원 공개 제2014/0127239호; 제2013/028919호; 제2014/286970호; 제2013/0309256호; 제2015/037360호; 또는 제2014/0294851호; 또는 PCT 공개 제WO2015057699호; 제WO2014080251호; 제WO2014197854호; 제WO2014145090호; 또는 제WO2014177042호에 기재된 링커이다.
일부 실시양태에서, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합 또는 링커이다. 일부 경우에, X, Y, 및 L은 독립적으로 결합이다. 일부 경우에, X, Y, 및 L은 독립적으로 링커이다.
일부 경우에, X는 결합 또는 링커이다. 일부 경우에, X는 결합이다. 일부 경우에, X는 링커이다. 일부 경우에, 링커는 C1-C6 알킬기이다. 일부 경우에, X는 C1-C6 알킬기, 예컨대, C5, C4, C3, C2, 또는 C1 알킬기이다. 일부 경우에, C1-C6 알킬기는 비치환된 C1-C6 알킬기이다. 링커의 맥락에서, 및 특히 X의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 알킬은 최대 6개의 탄소 원자를 함유하는 포화된 직선형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 경우에, X는 비중합체 링커이다. 일부 경우에, X는 상기 기재된 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에, X는 이종이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에, X는 sMCC를 포함한다. 다른 경우에, X는 C1-C6 알킬기에 선택적으로 접합된 이종이작용성 링커를 포함한다. 다른 경우에, X는 C1-C6 알킬기에 선택적으로 접합된 sMCC를 포함한다. 추가의 경우에, X는 상기 기재된 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커를 포함하지 않는다.
일부 경우에, Y는 결합 또는 링커이다. 일부 경우에, Y는 결합이다. 다른 경우에, Y는 링커이다. 일부 실시양태에서, Y는 C1-C6 알킬기이다. 일부 경우에, Y는 상기 기재된 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 일부 경우에, Y는 상기 기재된 동종이작용성 링커이다. 일부 경우에, Y는 상기 기재된 이종이작용성 링커이다. 일부 경우에, Y는 말레이미드기, 예컨대 상기 기재된 말레이미도카프로일(mc) 또는 자가 안정화 말레이미드기를 포함한다. 일부 경우에, Y는 펩티드 모이어티, 예컨대 Val-Cit를 포함한다. 일부 경우에, Y는 벤조산 기, 예컨대 PABA를 포함한다. 추가의 경우에, Y는 말레이미드기, 펩티드 모이어티, 및/또는 벤조산기의 조합을 포함한다. 추가의 경우에, Y는 mc 기를 포함한다. 추가의 경우에, Y는 mc-val-cit 기를 포함한다. 추가의 경우에, Y는 val-cit-PABA 기를 포함한다. 추가의 경우에, Y는 mc-val-cit-PABA 기를 포함한다.
일부 경우에, L은 결합 또는 링커이다. 일부 경우에, L은 결합이다. 다른 경우에, L은 링커이다. 일부 실시양태에서, L은 C1-C6 알킬기이다. 일부 경우에, L은 상기 기재된 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 일부 경우에, L은 상기 기재된 동종이작용성 링커이다. 일부 경우에, L은 상기 기재된 이종이작용성 링커이다. 일부 경우에, L은 말레이미드기, 예컨대 상기 기재된 말레이미도카프로일(mc) 또는 자가 안정화 말레이미드기를 포함한다. 일부 경우에, L은 펩티드 모이어티, 예컨대 Val-Cit를 포함한다. 일부 경우에, L은 벤조산기, 예컨대 PABA를 포함한다. 추가의 경우에, L은 말레이미드기, 펩티드 모이어티, 및/또는 벤조산 기의 조합을 포함한다. 추가의 경우에, L은 mc 기를 포함한다. 추가의 경우에, L은 mc-val-cit 기를 포함한다. 추가의 경우에, L은 val-cit-PABA 기를 포함한다. 추가의 경우에, L은 mc-val-cit-PABA 기를 포함한다.
사용 방법
일부 실시양태에서, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 질환 또는 장애의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 질환 또는 장애의 치료를 위한 면역 요법으로서 사용된다. 일부 경우에, 면역 요법은 종양 면역 요법이다.
암
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 일부 경우에, 암은 혈액 종양이다. 일부 경우에, 암은 재발성 또는 불응성 암, 또는 전이성 암이다. 일부 경우에, 고형 종양은 재발성 또는 불응성 고형 종양, 또는 전이성 고형 종양이다. 일부 경우에, 혈액 종양은 재발성 또는 불응성 혈액 종양, 또는 전이성 혈액 종양이다.
일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 예시적인 고형 종양은 항문암, 맹장암, 담관암(즉, 담관암종), 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 원발부위 불명암(CUP: cancer of Unknown Primary), 식도암, 안구암, 난관암, 소화기암, 신장암, 간암, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 구강암, 난소암, 췌장암, 부갑상선 질환, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 직장암, 피부암, 위암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 자궁암, 질암, 또는 외음부암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 고형 종양의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 항문암, 맹장암, 담관암(즉, 담관암종), 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 원발부위 불명암(CUP), 식도암, 안구암, 난관암, 소화기암, 신장암, 간암, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 구강암, 난소암, 췌장암, 부갑상선 질환, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 직장암, 피부암, 위암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 자궁암, 질암, 또는 외음부암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 고형 종양은 재발성 또는 불응성 고형 종양, 또는 전이성 고형 종양이다.
일부 경우에, 암은 혈액 종양이다. 일부 경우에, 혈액 종양은 백혈병, 림프종, 골수종, 비-호지킨(Hodgkin) 림프종, 또는 호지킨 림프종이다. 일부 경우에, 혈액 종양은 만성 림프모구 백혈병(CLL), 작은 림프모구 림프종(SLL), 고위험 CLL, 비-CLL/SLL 림프종, 전림프모구 백혈병(PLL), 소포성 림프종(FL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트롬(Waldenstrom) 거대글로불린혈증, 다발성 골수종, 림프절외 변연부 B 세포 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 비-버킷 림프종 고등급 B 세포 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종(PMBL), 면역모세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구 림프종, B 세포 전림프모구 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈장 세포 골수종, 혈장세포종, 종격동(thymic) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종모양 육아종증이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 혈액 종양의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 백혈병, 림프종, 골수종, 비호지킨 림프종, 또는 호지킨 림프종의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 혈액 종양은 만성 림프모구 백혈병(CLL), 작은 림프모구 림프종(SLL), 고위험 CLL, 비-CLL/SLL 림프종, 전림프모구 백혈병(PLL), 소포성 림프종(FL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 다발성 골수종, 림프절외 변연부 B 세포 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 비-버킷 고등급 B 세포 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종(PMBL), 면역모세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구 림프종, B 세포 전림프모구 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈장 세포 골수종, 혈장세포종, 종격동(흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종모양 육아종증의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 혈액 종양은 재발성 또는 불응성 혈액 종양, 또는 전이성 혈액 종양이다.
일부 경우에, 암은 KRAS 관련 암, EGFR 관련 암, AR 관련 암, HPRT1 관련 암, 또는 β-카테닌 관련 암이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 KRAS 관련 암, EGFR 관련 암, AR 관련 암, HPRT1 관련 암, 또는 β-카테닌 관련 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 KRAS 관련 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 EGFR 관련 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 AR 관련 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 HPRT1 관련 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 및 중합체에 접합된 결합 모이어티를 포함하는 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 β-카테닌 관련 암의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 일부 경우에, 암은 혈액 종양이다. 일부 경우에, 고형 종양은 재발성 또는 불응성 고형 종양, 또는 전이성 고형 종양이다. 일부 경우에, 혈액 종양은 재발성 또는 불응성 혈액 종양, 또는 전이성 혈액 종양이다. 일부 경우에, 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 다형성 교아종, 두경부암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 급성 골수성 백혈병, CLL, DLBCL, 또는 다발성 골수종을 포함한다. 일부 경우에, β-카테닌 관련 암은 PIK3C 관련 암 및/또는 MYC 관련 암을 추가로 포함한다.
면역 요법
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 질환 또는 장애의 치료를 위한 면역 요법으로서 사용된다. 일부 경우에, 면역 요법은 종양 면역 요법이다. 일부 경우에, 종양 면역 요법은 능동, 수동, 또는 조합(능동 및 수동) 방법으로 분류된다. 능동 종양 면역 요법에서, 예를 들어, 종양 관련 항원(TAA)이 면역 시스템에 제공되어 이들 TAA를 제시하는 암세포에 대한 공격을 촉발한다. 일부 경우에, 능동 종양 면역 요법은 종양 표적화제 및/또는 면역 표적화제(예를 들어, 모노클로날 항체와 같은 체크포인트 억제제), 및/또는 백신, 예컨대 원위치 백신 접종(in situ vaccination) 및/또는 세포 기반 또는 비세포 기반(예를 들어, 수지상 세포 기반, 종양 세포 기반, 항원, 항-이디오타입(anti-idiotype), DNA, 또는 벡터 기반) 백신을 포함한다. 일부 경우에, 세포 기반 백신은 환자 자신의 면역 시스템에서 수득된 후에 환자 자신의 암에 의해 활성화되는, 활성화된 면역 세포를 사용하여 생성된 백신이다. 일부 경우에, 능동 종양 면역 요법은 비특이적 능동 면역 요법 및 특이적 능동 면역 요법으로 더 세분된다. 일부 경우에, 비특이적 능동 면역 요법은 일반 면역 시스템 반응을 유도하기 위해 사이토카인 및/또는 다른 세포 신호전달 성분을 이용한다. 일부 경우에, 특이적 능동 면역 요법은 면역 반응을 유발하기 위해 특이적 TAA를 이용한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료를 위한 능동 종양 면역 요법으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 종양 표적화제를 포함한다. 일부 경우에, 종양 표적화제는 결합 모이어티 A에 포함된다. 다른 경우에, 종양 표적화제는 식 I의 분자와 조합하여 사용되는 추가의 작용제이다. 일부 경우에, 종양 표적화제는 종양 지향 폴리펩티드(예를 들어, 종양 지향 항체)이다. 일부 경우에, 종양 표적화제는 직접 사멸(예를 들어, 신호전달 유도 아폽토시스), 보체 의존적 세포독성(CDC), 및/또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)과 같은 메카니즘을 통해 그의 항종양 활성을 발휘하는 종양 지향 항체이다. 추가의 경우에, 종양 표적화제는 항종양 T 세포의 유도와 함께 적응 면역 반응을 유발한다.
일부 실시양태에서, 결합 모이어티 A는 종양 지향 폴리펩티드(예를 들어, 종양 지향 항체)이다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 직접 사멸(예를 들어, 신호전달 유도 아폽토시스), 보체 의존적 세포독성(CDC), 및/또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)과 같은 메카니즘을 통해 그의 항종양 활성을 발휘하는 종양 지향 항체이다. 추가의 경우에, 결합 모이어티 A는 항종양 T 세포의 유도와 함께 적응 면역 반응을 유발한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 면역 표적화제를 포함한다. 일부 경우에, 면역 표적화제는 결합 모이어티 A에 포함된다. 다른 경우에, 면역 표적화제는 식 I의 분자와 조합하여 사용되는 추가의 작용제이다. 일부 경우에, 면역 표적화제는 사이토카인, 체크포인트 억제제, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 표적화제는 체크포인트 억제제이다. 일부 경우에, 면역 체크포인트 분자는 CD4 및/또는 CD8 T 세포의 세포 표면 상에 제시되는 분자이다. 예시적인 면역 체크포인트 분자는 프로그램된 사멸-리간드 1(B7-H1, CD274로도 알려진 PD-L1), 프로그램된 사멸 1(PD-1), CTLA-4, B7H1, B7H4, OX-40, CD137, CD40, 2B4, IDO1, IDO2, VISTA, CD27, CD28, PD-L2(B7-DC, CD273), LAG3, CD80, CD86, PDL2, B7H3, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2aR, MARCO(콜라겐성 구조를 갖는 대식세포 수용체), PS(포스파티딜세린), ICOS(유도성 T 세포 공동자극자), HAVCR2, CD276, VTCN1, CD70, 및 CD160을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 분자의 활성을 조절하거나 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 경우에, 면역 체크포인트 억제제는 항체, 항체 유도체(예를 들어, Fab 단편, scFv, 미니바디, 디아바디), 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 앱타머, 또는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 프로그램된 사멸-리간드 1(B7-H1, CD274로도 알려진 PD-L1), 프로그램된 사멸 1(PD-1), CTLA-4, PD-L2(B7-DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS(유도성 T 세포 공동자극자), KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO(콜라겐성 구조를 갖는 대식세포 수용체), PS(포스파티딜세린), OX-40, SLAM, TIGHT, VISTA, VTCN1, 또는 이의 임의의 조합의 억제제이다.
일부 실시양태에서, 예시적인 체크포인트 억제제는 다음을 포함한다:
PD-L1 억제제, 예컨대 제넨테크(Genentech)의 MPDL3280A(RG7446), 바이오엑스셀(BioXcell)의 항-마우스 PD-L1 항체 클론 10F.9G2(Cat # BE0101), 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Meyer's Squibb)의 항-PD-L1 모노클로날 항체 MDX-1105(BMS-936559) 및 BMS-935559, MSB0010718C, 마우스 항-PD-L1 클론 29E.2A3, 및 아스트라제네카(AstraZeneca)의 MEDI4736;
PD-L2 억제제, 예컨대 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)의 AMP-224(Amplimmune), 및 rHIgM12B7;
PD-1 억제제, 예컨대 바이오엑스셀의 항-마우스 PD-1 항체 클론 J43(Cat # BE0033-2), 바이오엑스셀의 항-마우스 PD-1 항체 클론 RMP1-14(Cat # BE0146), 마우스 항-PD-1 항체 클론 EH12, 머크(Merck)의 MK-3475 항-마우스 PD-1 항체(Keytruda, 펨브롤리주맙, 람브롤리주맙), ANB011로 알려진 아납티바이오(AnaptysBio)의 항-PD-1 항체, 항체 MDX-1 106(ONO-4538), 브리스톨-마이어스 스퀴브의 인간 IgG4 모노클로날 항체 니볼루맙(Opdivo®, BMS-936558, MDX1106), 아스트라제네카의 AMP-514 및 AMP-224, 및 큐어테크(CureTech Ltd)의 피딜리주맙(CT-011);
CTLA-4 억제제, 예컨대 브리스톨-마이어스 스퀴브의 항-CTLA-4 항체 이필리무맙(Yervoy®, MDX-010, BMS-734016 및 MDX-101로도 알려짐), 항-CTLA4 항체, 밀리포어(Millipore)의 클론 9H10, 화이자(Pfizer)의 트레멜리무맙(CP-675,206, 티실리무맙), 및 압캠(Abcam)의 항-CTLA4 항체 클론 BNI3;
LAG3 억제제, 예컨대 이바이오사이언스(eBioscience)의 항-Lag-3 항체 클론 eBioC9B7W(C9B7W), 라이프스팬 바이오사이언시스(LifeSpan Biosciences)의 항-Lag3 항체 LS-B2237, 이뮤텝(Immutep)의 IMP321(ImmuFact), 항-Lag3 항체 BMS-986016, 및 LAG-3 키메라 항체 A9H12;
B7-H3 억제제, 예컨대 MGA271;
KIR 억제제, 예컨대 리릴루맙(IPH2101);
CD137(41BB) 억제제, 예컨대 우레루맙(BMS-663513, 브리스톨-마이어스 스퀴브), PF-05082566(항-4-1BB, PF-2566, Pfizer), 또는 XmAb-5592(Xencor);
PS 억제제, 예컨대 바비툭시맙; 및
억제제, 예컨대 항체 또는 그의 단편(예를 들어, 모노클로날 항체, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체), RNAi 분자, 또는 TIM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, OX40 (CD134), GITR, ICOS, BTLA (CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2, 또는 SLAM에 대한 소분자.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 결합 모이어티 A는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 이중특이적 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 프로그램된 사멸-리간드 1(B7-H1, CD274로도 알려진 PD-L1), 프로그램된 사멸 1(PD-1), CTLA-4, PD-L2(B7-DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS(유도성 T 세포 공동자극자), KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO(콜라겐성 구조를 갖는 대식세포 수용체), PS(포스파티딜세린), OX-40, SLAM, TIGHT, VISTA, VTCN1, 또는 이의 임의의 조합의 억제제를 포함하는 결합 모이어티 A는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 면역 체크포인트 억제제는 프로그램된 사멸-리간드 1(B7-H1, CD274로도 알려진 PD-L1), 프로그램된 사멸 1(PD-1), CTLA-4, PD-L2(B7-DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS(유도성 T 세포 공동자극자), KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO(콜라겐성 구조를 갖는 대식세포 수용체), PS(포스파티딜세린), OX-40, SLAM, TIGHT, VISTA, VTCN1, 또는 이의 임의의 조합의 억제제를 포함한다. 일부 경우에, 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료를 위해, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 펨롤리주맙, 피딜리주맙, MPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C, MK-3475, 또는 BMS-936559와 조합하여 사용된다.
일부 실시양태에서, 면역 표적화제는 사이토카인이다. 일부 경우에, 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 및 종양 괴사 인자로 추가로 세분화된다. 일부 실시양태에서, 케모카인은 세포의 이동을 안내하는 화학 유인물질로서 기능하고, 4개의 하위패밀리 CXC, CC, CX3C, 및 XC로 분류된다. 예시적인 케모카인은 CC 하위패밀리, 즉 CCL1, CCL2(MCP-1), CCL3, CCL4, CCL5(RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9(또는 CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, 및 CCL28; CXC 하위패밀리, 즉 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, 및 CXCL17; XC 하위패밀리, 즉 XCL1 및 XCL2; 및 CX3C 하위패밀리 CX3CL1로부터의 케모카인을 포함한다.
인터페론(IFN)은 인터페론 유형 I(예를 들어 IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, 및 IFN-ω), 인터페론 유형 II(예를 들어 IFN-γ), 및 인터페론 유형 III을 포함한다. 일부 실시양태에서, IFN-α는 IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, 및 IFNA21을 포함하는 약 13개의 하위유형으로 추가로 분류된다.
인터루킨은 백혈구 또는 백혈구 세포에 의해 발현되고, T 및 B 림프구 및 조혈 세포의 발달 및 분화를 촉진한다. 예시적인 인터루킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, 및 IL-36을 포함한다.
종양 괴사 인자(TNF)는 아폽토시스를 조절하는 사이토카인의 그룹이다. 일부 경우에, TNF 패밀리 내에는 TNFα, 림프독소-알파(LT-알파), 림프독소-베타(LT-베타), T 세포 항원 gp39(CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, 및 TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 약 19개의 구성원이 있다.
일부 실시양태에서, 사이토카인과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 케모카인과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 인터페론과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 인터루킨과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 종양 괴사 인자와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, IL-1β, IL-2, IL-7, IL-8, IL-15, MCP-1(CCL2), MIP-1α, RANTES, MCP-3, MIP5, CCL19, CCL21, CXCL2, CXCL9, CXCL10, 또는 CXCL11과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 백신을 포함한다. 일부 경우에, 백신은 원위치 백신 접종이다. 일부 경우에, 백신은 세포 기반 백신이다. 일부 경우에, 백신은 비세포 기반 백신이다. 일부 경우에, 수지상 세포 기반 백신과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 종양 세포 기반 백신과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 항원 백신과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 항-이디오타입 백신과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, DNA 백신과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 벡터 기반 백신과 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료를 위한 수동 종양 면역 요법으로서 사용된다. 수동 방법은 일부 경우에 암세포를 공격하기 위해 외인성으로 생성된 T 세포, 자연 살해(NK) T 세포, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포와 같은 적응 면역 시스템 성분을 이용한다.
일부 실시양태에서, T 세포 기반 치료제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, T 세포 기반 치료제는 상기 기재된 CD 세포 표면 마커 중 하나 이상을 인식하는 활성화된 T 세포 기반 치료제이다. 일부 경우에, T 세포 기반 치료제는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD27, CD28, CD80, CD134, CD137, CD152, CD154, CD160, CD200R, CD223, CD226, CD244, CD258, CD267, CD272, CD274, CD278, CD279, 또는 CD357 중 하나 이상을 인식하는 활성화된 T 세포 기반 치료제를 포함한다. 일부 경우에, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD27, CD28, CD80, CD134, CD137, CD152, CD154, CD160, CD200R, CD223, CD226, CD244, CD258, CD267, CD272, CD274, CD278, CD279, 또는 CD357 중 하나 이상을 인식하는 활성화된 T 세포 기반 치료제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 자연 살해(NK) T 세포 기반 치료제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, NK 기반 치료제는 상기 기재된 CD 세포 표면 마커 중 하나 이상을 인식하는 활성화된 NK 작용제이다. 일부 경우에, NK 기반 치료제는 CD2, CD11a, CD11b, CD16, CD56, CD58, CD62L, CD85j, CD158a/b, CD158c, CD158e/f/k, CD158h/j, CD159a, CD162, CD226, CD314, CD335, CD337, CD244, 또는 CD319 중 하나 이상을 인식하는 활성화된 NK 작용제이다. 일부 경우에, CD2, CD11a, CD11b, CD16, CD56, CD58, CD62L, CD85j, CD158a/b, CD158c, CD158e/f/k, CD158h/j, CD159a, CD162, CD226, CD314, CD335, CD337, CD244, 또는 CD319 중 하나 이상을 인식하는 활성화된 NK 작용제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, CAR-T 세포 기반 치료제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 엔도솜 막을 불안정화하는(또는 엔도솜-리소솜 막 트래피킹(trafficking)을 파괴하는) 추가의 작용제와 조합된 식 I의 분자는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에 사용된다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 항유사분열제를 포함한다. 예시적인 항유사분열제는 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 탁산; 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드; 카바지탁셀; 콜히친; 에리불린; 에스트라무스틴; 에토포시드; 익사베필론; 포도필로톡신; 테니포시드; 또는 그리세오풀빈을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 카바지탁셀, 콜히친, 에리불린, 에스트라무스틴, 에토포시드, 익사베필론, 포도필로톡신, 테니포시드, 또는 그리세오풀빈을 포함한다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 탁솔을 포함한다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 파클리탁셀을 포함한다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 에토포시드를 포함한다. 다른 경우에, 추가의 작용제는 비타민 K3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 조성물 또는 약제학적 제제는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료에서 조합 방법(능동 및 수동 방법 둘 모두를 포함하는)으로서 사용된다.
약제학적 제제
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 약제학적 제제는 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내), 경구, 비강내, 협측, 직장, 또는 경피 투여 경로를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다수의 투여 경로에 의해 대상에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내) 투여용으로 제제화된다. 다른 경우에, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제제화된다. 또 다른 경우에, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 비강내 투여용으로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 약제학적 제제는 수성 액체 분산액, 자가 유화 분산액, 고체 용액, 리포솜 분산액, 에어로졸, 고체 투여 형태, 분말, 즉시 방출 제제, 제어 방출 제제, 신속 용융 제제, 정제, 캡슐, 환제, 지연 방출 제제, 연장 방출 제제, 맥동성(pulsatile) 방출 제제, 다입자 제제(예를 들어, 나노입자 제제), 및 혼합된 즉시 및 제어 방출 제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 약제학적 제제는 다입자 제제를 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 제제는 나노입자 제제를 포함한다. 일부 경우에, 나노입자는 cMAP, 시클로덱스트린, 또는 지질을 포함한다. 일부 경우에, 나노입자는 고체 지질 나노입자, 중합체 나노입자, 자가 유화 나노입자, 리포솜, 미세에멀젼, 또는 미셀 용액을 포함한다. 추가의 예시적인 나노입자는 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 금속 나노입자, 풀러린(fullerene) 유사 물질, 무기 나노튜브, 덴드리머(예를 들어, 공유 결합된 금속 킬레이트를 갖는 덴드리머), 나노섬유, 나노혼(nanohorn), 나노오니온(nano-onion), 나노로드(nanorod), 나노로프(nanorope) 및 양자점을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 나노입자는 금속 나노입자, 예를 들어 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트륨, 지르코늄, 니오븀, 몰리브덴, 루테늄, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 하프늄, 탄탈룸, 텅스텐, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 가돌리늄, 알루미늄, 갈륨, 인듐, 주석, 탈륨, 납, 비스무트, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 리튬, 나트륨, 칼륨, 붕소, 규소, 인, 게르마늄, 비소, 안티몬의 나노입자, 및 이의 조합물, 합금 또는 산화물이다.
일부 경우에, 나노입자는 코어-쉘 나노입자에서와 같이 코어 또는 코어 및 쉘을 포함한다.
일부 경우에, 나노입자는 작용성 요소의 부착을 위한 분자(예를 들어, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자 또는 결합 모이어티 중 하나 이상)로 추가로 코팅된다. 일부 경우에, 코팅은 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란 술페이트, 카르복시메틸 덱스트란, 알긴산, 펙틴, 카라기난, 푸코이단, 아가로펙틴, 포르피란, 카라야 검, 젤란 검, 잔탄 검, 히알루론산, 글루코사민, 갈락토사민, 키틴(또는 키토산), 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 리소자임, 시토크롬 C, 리보뉴클레아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, α-키모트립신, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 히스톤, 프로타민, 난백 알부민, 덱스트린, 또는 시클로덱스트린을 포함한다. 일부 경우에, 나노입자는 그래핀 코팅된 나노입자를 포함한다.
일부 경우에, 나노입자는 약 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 또는 100 nm 미만 중 적어도 하나의 치수를 갖는다.
일부 경우에, 나노입자 제제는 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 금속 나노입자, 풀러린 유사 물질, 무기 나노튜브, 덴드리머(예를 들어, 공유결합된 금속 킬레이트를 덴드리머), 나노섬유, 나노혼, 나노오니언, 나노로드, 나노로프 또는 양자점을 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자 또는 결합 모이어티는 나노입자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 경우에, 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자 또는 결합 모이어티가 나노입자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 약제학적 제제는 본원에 개시된 조성물과의 상용성, 및 원하는 투여 형태의 방출 프로파일 특성에 기초하여 선택된 담체 또는 담체 물질을 포함한다. 예시적인 담체 물질은 예를 들어 결합제, 현탁화제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다. 약제학적으로 상용성인 담체 물질은 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 젖산칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 규산마그네슘, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 카제인산나트륨, 대두 레시틴, 타우로콜린산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 접합체, 당 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 전호화 전분 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)]을 참고한다.
일부 경우에, 약제학적 제제는 아세트산, 붕산, 시트르산, 젖산, 인산 및 염산과 같은 산; 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 젖산나트륨 및 트리스-히드록시메틸아미노메탄과 같은 염기; 및 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄과 같은 버퍼를 포함하는, pH 조절제 또는 완충제를 추가로 포함한다. 이러한 산, 염기 및 버퍼는 조성물의 pH를 허용되는 범위로 유지하는데 필요한 양으로 포함된다.
일부 경우에, 약제학적 제제는 조성물의 삼투질농도(osmolality)를 허용되는 범위로 조절하는데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함한다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 중탄산염, 술페이트, 티오술페이트 또는 바이술파이트 음이온을 갖는 것을 포함하며; 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 아황산수소나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.
일부 경우에, 약제학적 제제는 화합물을 안정화하기 위해 사용되는 희석제를 추가로 포함하고, 그 이유는 이들이 보다 안정한 환경을 제공할 수 있기 때문이다. 완충된 용액(또한 pH 제어 또는 유지를 제공할 수 있음)에 용해된 염이 관련 기술 분야에서 희석제로서 이용되며, 이는 포스페이트 완충 염수를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 경우에, 희석제는 조성물의 부피를 증가시켜 압축을 용이하게 하거나 캡슐 충전을 위해 균질한 혼합을 위한 충분한 부피를 생성한다. 이러한 화합물은 예를 들어 락토스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 덱스트로스, 미세결정 셀룰로오스, 예컨대 아비셀(Avicel)®; 이염기성 인산칼슘, 인산이칼슘 이수화물; 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토스, 분무 건조된 락토스; 전호화 전분, 압축성 당, 예컨대 Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 수크로스계 희석제, 정제 설탕; 일염기성 황산칼슘 일수화물, 황산칼슘 이수화물; 젖산칼슘 삼수화물, 덱스트레이트; 가수분해된 시리얼 고형물, 아밀로스; 분말화된 셀룰로오스, 탄산칼슘; 글리신, 카올린; 만니톨, 염화나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 약제학적 제제는 물질의 파괴 또는 붕해를 촉진하는 붕해제를 포함한다. 용어 "붕해시키다"는 위장관액과 접촉할 때 투여 형태의 용해 및 분산 둘 모두를 포함한다. 붕해제의 예는 전분, 예를 들어 천연 전분, 예컨대 옥수수 전분 또는 감자 전분, 전호화 전분, 예컨대 내셔널(National) 1551 또는 아미젤(Amijel)®, 또는 나트륨 전분 글리콜레이트, 예컨대 프로모겔(Promogel)® 또는 엑스플로탭(Explotab)®, 셀룰로오스, 예컨대 목재 생성물, 메틸미세결정 셀룰로오스, 예를 들어, 아비셀(Avicel)®, 아비셀® PH101, 아비셀® PH102, 아비셀® PH105, 엘세마(Elcema)® P100, 엠코셀(Emcocel)®, 비바셀(Vivacel)®, 밍 티아(Ming Tia)®, 및 솔카-플록(Solka-Floc)®, 메틸셀룰로오스, 크로스카르멜로스, 또는 가교결합된 셀룰로오스, 예컨대 가교결합된 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스(Ac-Di-Sol®), 가교결합된 카르복시메틸셀룰로오스, 또는 가교결합된 크로스카르멜로스, 가교결합된 전분, 예컨대 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교결합된 중합체, 예컨대 크로스포비돈, 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 알기네이트, 예컨대 알긴산 또는 알긴산의 염, 예컨대 알긴산나트륨, 점토, 예컨대 비검(Veegum)® HV(마그네슘 알루미늄 실리케이트), 검, 예컨대 아가, 구아, 로커스트 빈, 카라야, 펙틴, 또는 트라가칸트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 벤토나이트, 천연 스폰지, 계면활성제, 수지, 예컨대 양이온 교환 수지, 시트러스 펄프, 나트륨 라우릴 술페이트, 전분과 조합된 나트륨 라우릴 술페이트 등을 포함한다.
일부 경우에, 약제학적 제제는 충전제, 예컨대 락토스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미세결정 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 전호화 전분, 수크로스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함한다.
윤활제 및 활택제는 또한 물질의 접착 또는 마찰을 방지, 감소 또는 억제하기 위해 본원에서 설명되는 약제학적 제제에 선택적으로 포함된다. 예시적인 윤활제는 예를 들어 스테아르산, 수산화칼슘, 탈크, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 탄화수소, 예컨대 미네랄 오일, 또는 수소첨가된 식물성 오일, 예컨대 수소첨가된 대두 오일(스테로텍스(Sterotex)®), 고급 지방산 및 이들의 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤, 탈크, 왁스, 스테아로웨트(Stearowet)®, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 카르보왁스(Carbowax)™, 올레산나트륨, 벤조산나트륨, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 술페이트, 콜로이드성 실리카, 예컨대 실로이드(Syloid)™, Cab-O-Sil®, 전분, 예컨대 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면활성제 등을 포함한다.
가소제는 미세캡슐화 물질을 연화하기 위해 사용되는 화합물 또는 이들이 덜 부서지게 하기 위한 필름 코팅제를 포함한다. 적합한 가소제는 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로오스 및 트리아세틴을 포함한다. 가소제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능할 수 있다.
가용화제는 화합물, 예컨대 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 나트륨 도큐세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, N-히드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알콜, 콜레스테롤, 담즙산염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코푸롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜, 디메틸 이소소르비드 등을 포함한다.
안정화제는 임의의 항산화제, 버퍼, 산, 보존제 등과 같은 화합물을 포함한다.
현탁화제는 화합물, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있음), 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 폴리소르베이트-80, 히드록시에틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 검, 예를 들어 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아 검, 잔탄 검을 포함하는 잔탄, 당, 셀룰로오스 화합물, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡시화 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡시화 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈 등을 포함한다.
계면활성제는 나트륨 라우릴 술페이트, 나트륨 도큐세이트, 트윈 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트, 폴록사머, 담즙산염, 글리세릴 모노스테아레이트, 산화에틸렌과 산화프로필렌의 공중합체, 예를 들어 플루로닉(Pluronic)®(BASF) 등과 같은 화합물을 포함한다. 추가의 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 식물성 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌(60) 수소첨가 피마자유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 때때로, 계면활성제는 물리적 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 포함된다.
점도 향상제는 예를 들어 메틸 셀룰로오스, 잔탄 검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 카르보머, 폴리비닐 알콜, 알기네이트, 아카시아, 키토산 및 이의 조합을 포함한다.
습윤제는 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 나트륨 도큐세이트, 나트륨 올레에이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 나트륨 도큐세이트, 트리아세틴, 트윈 80, 비타민 E TPGS, 암모늄 염 등과 같은 화합물을 포함한다.
치료 요법
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 치료 적용을 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 매일 1회, 매일 2회, 매일 3회 또는 그 초과로 투여된다. 약제학적 조성물은 매일, 격일, 매주 5일, 매주 1회, 격주, 매월 2주, 매월 3주, 매월 1회, 매월 2회, 매월 3회 또는 그 초과로 투여된다. 약제학적 조성물은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 2년, 3년 또는 그 초과의 기간 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 약제학적 조성물은 동시에, 순차적으로, 또는 일정 시간 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 약제학적 조성물은 동시에 투여된다. 일부 경우에, 하나 이상의 약제학적 조성물은 순차적으로 투여된다. 추가의 경우에, 하나 이상의 약제학적 조성물은 일정 시간 간격으로 투여된다(예를 들어, 제1 약제학적 조성물의 첫 번째 투여는 제1 일이며, 그 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5일 또는 그 초과의 간격으로 적어도 제2 약제학적 조성물이 투여된다).
일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 약제학적 조성물이 공동투여된다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 약제학적 조성물은 동시에 공동투여된다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 약제학적 조성물은 투여 사이에 시간 간격 없이 순차적으로 공동투여된다. 다른 경우에, 2개 이상의 상이한 약제학적 조성물은 투여 사이에 약 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 12시간, 1일, 2일 또는 그 초과의 시간 간격으로 순차적으로 공동투여된다.
환자의 상태가 개선된 경우, 조성물의 투여는 의사의 판단에 따라 지속적으로 제공되고; 대안적으로, 투여되는 조성물의 용량은 일시적으로 감소되거나 또는 특정 시간 동안 일시적으로 중단된다(즉, "약물 휴지기(drug holiday)". 일부 경우에, 약물 휴지기의 길이는 2일 내지 1년으로 다양하며, 단지 예로서, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일, 또는 365일을 포함한다. 약물 휴지기 동안의 용량 감소는 10%-100%이며, 단지 예로서, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함한다.
환자의 병태가 개선되면, 필요한 경우 유지 용량이 투여된다. 이후, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는, 증상의 함수로서, 개선된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준으로 선택적으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 상기 양에 상응하는 주어진 제제의 양은 특정 화합물, 질환의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상체 또는 숙주의 특성(예를 들어, 체중)과 같은 인자에 따라 달라지지만, 그럼에도 불구하고, 예를 들어 투여되는 특정 작용제, 투여 경로, 및 치료되는 대상체 또는 숙주를 비롯하여 환자를 둘러싼 특정 환경에 따라 관련 기술 분야에 알려진 방식으로 일상적으로 결정된다. 일부 경우에, 원하는 용량은 단일 용량으로서 간편하게 제공되거나 또는 분할된 용량으로서 동시에(또는 짧은 시간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 1일당 2, 3, 4개 또는 그 초과의 하위용량으로 간편하게 제공된다.
상기 범위는 단지 제시하는 것에 불과한데, 이것은 개별 치료 요법에 대한 변수가 많고 이들 권장값으로부터 상당히 벗어나는 경우가 드물지 않기 때문이다. 이러한 투여량은 사용된 화합물의 활성, 치료되는 질환 또는 병태, 투여 방식, 개별 대상체의 요구사항, 치료되는 질환 또는 병태의 중증도, 및 의사의 판단을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 변수에 따라 변경된다.
일부 실시양태에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 치사적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)의 결정을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해 결정된다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수(therapeutic index)이며, 이것은 LD50과 ED50 사이의 비율로서 표현된다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 정하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 최소 독성을 보이면서 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 속한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라진다.
키트/제조 물품
특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 하나 이상의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에서 개시된다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함하며, 각각의 용기(들)는 본원에서 설명되는 방법에서 사용되는 개별 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 한 실시양태에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성된다.
본원에서 제공되는 제조 물품은 포장재를 포함한다. 약제학적 포장재의 예는 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 임의의 포장재를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 용기(들)는 본원에서 개시되는 바와 같이 선택적으로 엔도솜 분해성 모이어티 D에 접합된 식 I(A-X-B-Y-C)의 분자를 포함한다. 이러한 키트는 선택적으로 본원에서 설명되는 방법에서의 그의 용도와 관련된 식별 설명서 또는 라벨 또는 설명서를 포함한다.
키트는 전형적으로 내용물을 열거하는 라벨 및/또는 사용을 위한 설명서 및 사용을 위한 설명서가 존재하는 포장 삽입물을 포함한다. 설명서 세트가 또한 전형적으로 포함될 것이다.
한 실시양태에서, 라벨은 용기 상에 있거나 또는 용기와 결합된다. 한 실시양태에서, 라벨을 형성하는 글자, 숫자, 또는 다른 문자가 용기 자체에 부착되거나, 몰딩되거나 또는 에칭될 때 라벨은 용기 상에 있으며; 예를 들어 포장 삽입물로서, 용기를 또한 보유하는 통 또는 캐리어 내에 존재할 때, 라벨은 용기와 결합된 것이다. 한 실시양태에서, 라벨은 내용물이 특정 치료 용도로 사용되어야 한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 라벨은 또한 본원에서 설명되는 방법에서와 같이 내용물의 사용을 위한 지시 내용을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본원에서 제공되는 화합물을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유하는 팩 또는 디스펜서 장치 내에 제공된다. 팩은 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 포일을 함유한다. 한 실시양태에서, 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여를 위한 설명서가 제공된다. 한 실시양태에서, 팩 또는 디스펜서에는 또한 의약품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태로 용기와 결합된 안내문이 제공되며, 이 안내문은 인간 또는 동물 투여를 위한 약물 형태에 대한 당국에 의한 승인을 반영한다. 이러한 안내문은 예를 들어 처방 약물 또는 승인된 제품 삽입물에 대해 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)에 의해 승인된 라벨이다. 한 실시양태에서, 상용성의 약제학적 담체에서 제제화된 본원에서 제공되는 화합물을 함유하는 조성물이 또한 제조되고, 적절한 용기에 담기고, 표시된 병태의 치료를 위해 라벨이 제시된다.
특정 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 특허 청구된 주제가 속하는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 전술한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 특허 청구된 임의의 주제를 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본원에서, 단수의 사용은 달리 명시적으로 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 나타내지 않는 한 "및/또는"를 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한적인 의미로 사용되는 것이 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5 μL"는 "약 5 μL" 및 또한 "5 μL"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내일 것으로 예측되는 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 섹션 제목은 단지 조직적인 표현을 위한 것이며, 설명되는 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체(들)", "대상체(들)" 및 "환자(들)"는 임의의 포유동물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비인간이다. 상기 용어들은 보건 전문가(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 임상 간호사, 의료 조무사, 잡역부 또는 호스피스 직원)의 감독(예를 들어, 지속적 또는 간헐적)을 특징으로 하는 상황을 요구하거나 이로 제한되지 않는다.
실시예
이들 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본원에서 제공되는 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
화학적 합성 실시예
실시예 1. 화합물 1-3 및 5-8의 제조
Figure pct00050
또는
Figure pct00051
화합물 2, 3 및 5-8을 실시예 1에 예시된 절차에 따라 제조하였다.
Figure pct00052
실시예 2. 화합물 4의 제조
Figure pct00053
또는
Figure pct00054
실시예 3. 화합물 9의 제조
Figure pct00055
또는
Figure pct00056
실시예 4. 화합물 10의 제조
Figure pct00057
또는
Figure pct00058
실시예 5. 화합물 11의 제조
Figure pct00059
또는
Figure pct00060
실시예 6. 화합물 12의 제조
Figure pct00061
또는
Figure pct00062
실시예 7. 화합물 14의 제조
Figure pct00063
또는
Figure pct00064
실시예 8. 화합물 15의 제조
Figure pct00065
실시예 9. 화합물 16의 제조
Figure pct00066
실시예 10. 화합물 17의 제조
Figure pct00067
실시예 11. 화합물 18의 제조
Figure pct00068
실시예 12. 화합물 19의 제조
Figure pct00069
실시예 13. 화합물 20의 제조
Figure pct00070
실시예 14. 화합물 21의 제조
Figure pct00071
실시예 15. 화합물 22의 제조
Figure pct00072
실시예 16. 화합물 23의 제조
Figure pct00073
실시예 17. 화합물 24의 제조
Figure pct00074
실시예 18. 화합물 25의 제조
Figure pct00075
실시예 19. 화합물 26의 제조
Figure pct00076
화합물 26의 제조를 위한 합성 절차
화합물 26-2
Figure pct00077
Py(3500 mL) 중 화합물 26-1(500 g, 2.05 mol, 1.00 eq)의 용액에 DMTrCl(763 g, 2.25 mol, 1.10 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 10/1, 화합물 26-2: Rf = 0.60)는 화합물 26-1이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM(5.00L)으로 희석하고, NaHCO3(2.00 L x 2)로 세척하였다. 유기층을 합하여 염수(2.00 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/TEA = 50/1/0.5% 내지 0/1/0.5%)에 의해 정제하였다. 화합물 26-2(700 g, 56.3% 수율, 90.0% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00078
화합물 26-3
Figure pct00079
디옥산(2500 mL) 중 화합물 26-2(250 g, 457 mmol, 1.00 eq)의 용액에 포화 NaIO4(103 g, 484 mmol, 4.85 mL, 1.06 eq) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 10/1, 화합물 26-3: Rf = 0.49)는 화합물 26-2가 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하였다. 조질 생성물 화합물 26-3(250 g)을 무색 오일로서 수득하고, 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 26-4
Figure pct00080
디옥산(3000 mL) 중 화합물 26-3(250 g, 459 mmol, 1.00 eq)의 용액에 NaBH4(17.3 g, 459 mmol, 1.00 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 0.3시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 10/1, 화합물 26-4: Rf = 0.41)는 화합물 26-3이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 아세톤으로 켄칭하고, 20% 아세트산으로 중화하고, 농축하여 감압 하에 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 DCM(2.00 L)으로 희석하고, H2O(2.00 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 생성물을 추가의 정제없이 다음 단계에 사용하였다. 화합물 26-4(250 g)를 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00081
화합물 26-5
Figure pct00082
톨루엔(2500 mL) 중 화합물 26-4(50.0 g, 91.1 mmol, 1.00 eq)의 용액에 25℃의 벤조일 벤조에이트(30.9 g, 136 mmol, 25.7 mL, 1.50 eq) 및 리포자임 TL IM(30.0 g, 29.2 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 20/1, 화합물 26-5: Rf = 0.58)는 화합물 26-4가 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하고, 메탄올(250 mL)을 첨가하여 켄칭하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/TEA = 10/1/0.5% 내지 1/2/0.5%)에 의해 정제하였다. 화합물 26-5(37.5 g, 63.0% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
화합물 26-6
Figure pct00083
Py(1700 mL) 중 화합물 26-5(340 g, 520 mmol, 1.00 eq)의 용액에 TBSCl157 g, 1.04 mol, 127 mL, 2.00 eq)을 25℃ 미만에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 19시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 20/1, 화합물 26-6: Rf = 0.37)는 화합물 26-5가 완전히 소비되었음을 나타내었다. 물(340 mL)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 뉴클레오시드를 함유하는 생성된 혼합물을 MeOH(1.00 L)에 용해시킨 다음, 0℃에서 MeOH 중 NaOH(1.00 L, pH = 10)를 적가한 다음, 0℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 포화 수성 NH4Cl(1.00 L)을 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 물(1.00 L)을 첨가하고, 혼합물을 DCM(1.00 L)으로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻고, 이를 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/TEA = 10/1/0.5% 내지 0/1/0.5%)에 의해 정제하였다. 화합물 26-6(250 g, 339 mmol, 65.2% 수율, 90.0% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00084
화합물 26-7
Figure pct00085
DMF(500 mL) 중 화합물 26-6(50.0 g, 75.4 mmol, 1.00 eq)의 용액에 -20℃에서 NaH(9.96 g, 248. mmol, 1.81 uL, 60% 순도, 3.30 eq)를 첨가하고, -20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 알콕시 브로마이드(15.7 g, 113. mmol, 10.6 mL, 1.50 eq)를 반응물에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/2, 화합물 7: Rf = 0.43)는 화합물 26-6이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 25℃에서 NH4Cl(1.00 L x 2)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭한 후, 에틸 아세테이트(500 mL)로 희석하고, 물(500 mL)로 세척하였다. 유기층을 합하여 염수(500 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/TEA = 10/1/0.5% 내지 0/1/0.5%). 화합물 26-7(34.0 g, 47.1 mmol, 62.5% 수율)을 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00086
화합물 26-8
Figure pct00087
DCM(468 mL) 중 화합물 26-7(46.8 g, 64.9 mmol, 1.00 eq)의 용액에 TFA(43.1 g, 378 mmol, 28.0 mL, 5.83 eq) 및 Et3SiH(15.1 g, 129 mmol, 20.7 mL, 2.00 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 0/1, 화합물 26-8: Rf = 0.43)는 화합물 26-7이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM(500 mL)으로 희석하고, H2O(500 mL)로 세척하였다. 유기층을 합하여 NaHCO3(500 mL x 3) 및 염수(500 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1 내지 0/1)에 의해 정제하였다. 화합물 26-8(17.0 g, 36.5 mmol, 56.3% 수율, 90.0% 순도)을 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00088
Figure pct00089
화합물 26-9
Figure pct00090
ACN(170 mL) 중 화합물 26-8(17.0 g, 40.6 mmol, 1.00 eq)의 용액에 IBX(17.1 g, 60.9 mmol, 1.50 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 화합물 26-8이 완전히 소비되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 조질 생성물 화합물 26-9(17.0 g, 조질)를 무색 오일로서 수득하고, 추가 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 26-10
Figure pct00091
THF(100 mL) 중 화합물 테트라메틸 메틸렌디포스포네이트(15.1 g, 65.3 mmol, 1.60 eq)의 용액에 t-BuOK(6.87 g, 61.2 mmol, 1.50 eq)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 THF(70.0 mL) 중 화합물 26-9(17.0 g, 40.8 mmol, 1.00 eq)에 적가하고, 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 25℃에 도달하도록 한 후, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 0/1, 화합물 10: Rf = 0.07)는 화합물 26-9가 완전히 소비되었음을 나타내었다. NH4Cl(500 mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭한 후, 에틸 아세테이트(200 mL)로 희석하고, 추출하였다. 유기층을 합하여 염수(200 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 0/1 내지 10/1)에 의해 정제하였다. 화합물 26-10(11.4 g, 16.3 mmol, 40.1% 수율, 75.0% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00092
화합물 26-11
Figure pct00093
메탄올(114 mL) 중 화합물 26-10(11.4 g, 21. mmol, 1.00 eq)의 용액에 NH4F(6.46 g, 174 mmol, 8.00 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 65℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 20/1, 화합물 10: Rf = 0.28)는 화합물 26-10이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 에틸 아세테이트/메탄올 = 100/1 내지 10/1)에 의해 정제하였다. 화합물 26-11(5.90 g, 13.0 mmol, 59.6% 수율, 90.0% 순도)을 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00094
화합물 26
Figure pct00095
DCM(49.0 mL) 중 화합물 26-11(4.90 g, 12.0 mmol, 1.00 eq)의 용액에 0℃에서 DCI(2.27 g, 19.2 mmol, 1.60 eq) 및 2-시아노에틸 N,N,N',N-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(6.51 g, 21.6 mmol, 6.86 mL, 1.80 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH = 10/1, 화합물 26: Rf = 0.58)는 화합물 26-11이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM(50.0 mL)으로 희석하고, 수성 NaHCO3(50.0 mL x 2)로 세척하였다. 유기층을 합하여 염수(50.0 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트/TEA = 100/1/0.5% 내지 0/1/0.5%)에 의해 정제하였다. 화합물 26(5.40 g, 8.52 mmol, 70.9% 수율, 96.0% 순도)을 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00096
C24H42N4O10P2에 대해 계산된 MS (ESI) (M-H)- m/z = 607.2, 실측치 607.2
실시예 20. 화합물 27의 제조
Figure pct00097
실시예 21. 화합물 28의 제조
Figure pct00098
실시예 22. 화합물 29의 제조
Figure pct00099
실시예 23. 화합물 30의 제조
Figure pct00100
실시예 24. 화합물 31의 제조
Figure pct00101
실시예 25. 화합물 32의 제조
Figure pct00102
실시예 26. 분석 데이터
본원에서 설명되는 다양한 화합물에 대한 31P 디커플링된 1H NMR, 31P NMR 및 MS (ESI) 데이터가 아래에 제시된다:
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
분자 생물학 실시예
실시예 1. 서열
표 1, 3, 5, 6 및 7은 본원에서 설명되는 표적 서열을 제시한다. 표 2, 4, 8 및 9는 본원에서 설명되는 폴리핵산 분자 서열을 제시한다.
표 1. KRAS 표적 서열
Figure pct00108
표 2. KRAS siRNA 서열
Figure pct00109
표 3. EGFR 표적 서열
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
표 4. EGFR siRNA 서열
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
표 5. AR 표적 서열
Figure pct00133
표 6. β-카테닌 표적 서열
Figure pct00134
표 7. PIK3CA* 및 PIK3CB* 표적 서열
Figure pct00135
*종은 호모 사피엔스이다.
표 8. PIK3CA 및 PIK3CB siRNA 서열
Figure pct00136
Figure pct00137
표 9. 추가의 폴리핵산 분자 서열
Figure pct00138
실시예 2. 일반적인 실험 프로토콜
siRNA의 정량을 위한 줄기-루프 qPCR 검정
혈장 샘플을 TE 버퍼에서 직접 희석하였다. 50 mg 조직 조각을 FastPrep-24 조직 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 1 mL의 트리졸에서 균질화한 다음, TE 버퍼에서 희석하였다. 처리하지 않은 동물의 혈장 또는 균질화된 조직에 siRNA를 넣은 다음, TE 버퍼로 연속 희석하여 표준 곡선을 생성하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 25 nM의 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 갖는 TaqMan 마이크로RNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 역전사시켰다. RT 단계의 cDNA를 1.5 μM의 정방향 프라이머, 0.75 μM의 역방향 프라이머, 및 0.2 μM의 프로브를 갖는 TaqMan 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(TaqMan Fast Advanced Master Mix; Applied Biosystems)를 사용한 실시간 PCR에 이용하였다. 정량적 PCR 반응을 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(Life Technologies)에서 표준 순환 조건을 사용하여 수행하였다. Ct 값을 표준 곡선으로부터 도출된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환하였다.
mRNA 녹다운의 결정을 위한 비교 qPCR 검정
조직 샘플을 상기 기재된 바와 같이 트리졸에서 균질화하였다. 총 RNA를 RNeasy RNA 단리 96웰 플레이트(Qiagen)를 사용하여 단리한 다음, 500 ng RNA를 High Capacity RNA to cDNA 키트(ThermoFisher)를 사용하여 역전사시켰다. KRAS, EGFR, CTNNB1 및 PPIB mRNA를 ViiA 7 실시간 PCR 시스템으로 수행된 TaqMan qPCR 분석에 의해 정량하였다. EGFR 및 CTNNB1에 대한 TaqMan 프라이머 및 프로브를 사전 검증된 유전자 발현 분석으로서 Applied Biosystems로부터 구입하였다. 사전 검증된 유전자 발현 검정으로서 Applied Biosystems으로부터 구입한 PPIB에 대한 모든 TaqMan 프라이머 및 프로브와 함께, PPIB(하우스키핑 유전자)를 내부 RNA 로딩 대조군으로 사용하였다. 표적 유전자(KRAS, CTNNB1, 또는 EGFR) Ct 값과 PPIB Ct 값 간의 차이(△Ct)를 계산하는 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산한 다음, 2차 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군에 대해 추가로 표준화하였다.
동물
모든 동물 연구는 USDA 동물 복지법뿐만 아니라 "실험 동물의 관리 및 사용 가이드"(National Research Council publication, 8th Ed., 2011년 개정)에 개괄된 규정을 준수하는 엑스플로라 바이오랩스(Explora BioLabs)의 실험 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 따른 프로토콜에 따라 수행하였다. 모든 마우스는 찰스 리버 연구실(Charles River Laboratories) 또는 할란 연구실(Harlan Laboratories)에서 입수하였다.
H358, HCC827, 및 Hep-3B2 1-7 피하 옆구리 종양 모델
H358 피하 옆구리 종양 모델의 경우, 종양 세포를 접종하고, 하기 방법에 따라 종양을 확립하였다. 암컷 NCr nu/nu 마우스를 세포 주사 전날 귀 태그(ear-tag)에 의해 확인하였다. 마우스를 접종하기 전에 체중을 측정하였다. H358 세포를 10% FBS/RPMI 배지를 이용하여 배양하고, 0.05% 트립신 및 세포 스트리퍼(MediaTech)를 사용하여 채취하였다. 마트리겔이 존재하는 0.05 ml 행크 균형 염 용액(HBSS: Hank's Balanced Salt Solution) 내의 5백만 개의 H358 세포(1:1)를 각각의 마우스의 우측 상부 옆구리에 피하 주사하였다. 접종 후 7일부터 디지털 캘리퍼스를 사용한 종양 부피 측정에 의해 종양 성장을 모니터링하였고, 평균 종양 부피가 >100 및 ≤ 300 mm3에 도달할 때까지 매주 2회 실시하였다. 종양이 원하는 부피(평균 100 내지 300 mm3)가 되면, 동물을 무작위로 추출하고, 매우 크거나 작은 종양을 가진 마우스를 희생시켰다. 마우스를 필요한 그룹으로 나누고, 종양 부피에 의해 무작위로 추출하였다. 이어서, 마우스를 개별 실험에 기재된 바와 같이 처리하였다.
Hep3B 동소이식 간 종양 모델의 경우, 종양 세포를 접종하고, 하기 방법에 따라 종양을 확립하였다. 암컷 NCr nu/nu 마우스를 전날 귀 태그에 의해 확인하였고, 마우스는 이소플루란으로 마취하였다. 이어서, 체온을 유지하기 위해 마우스를 물 순환 가열 패드에 바로 누운 자세로 놓았다. 흉골 아래에서 작은 횡절개를 수행하여 간을 노출시켰다. 암세포를 28-게이지 바늘을 사용하여 간의 좌상엽에 천천히 주사하였다. 세포의 투명한 소기포(bleb)가 간 캡슐을 통해 관찰될 수 있도록, 세포를 간 내에 30도 각도로 주사하였다. Hep 3B2.1-7 세포는 차가운 PBS(0.1-5x106 세포)에 현탁시키고, 희석된 마트리겔과 혼합하여(PBS에서 30x) 제조하였다. 30-50 ul의 세포/마트리겔을 접종하였다. 주사 후, 멸균 거즈의 작은 조각을 주사 부위에 놓고, 1분 동안 가벼운 압력을 가하여 출혈을 방지하였다. 이어서, 복부를 6-0 실크 봉합사로 봉합하였다. 종양 세포 이식 후, 동물을 따뜻한 우리에 유지시키고, 1-2시간 동안 관찰한 다음, 마취로부터 완전히 회복된 후 동물 우리로 돌려보냈다. 종양 이식 후 7-10일에 동물을 무작위로 추출하고, 필요한 그룹으로 나눈 다음, 개별 실험에서 기재된 바와 같이 처리하였다.
LNCap 피하 옆구리 종양 모델
LNCaP 세포(ATCC®　CRL-1740™)를 비필수 아미노산 및 피루브산나트륨이 보충된 RPMI + 10% FBS에서 약 80%의 융합도(confluency)까지 성장시켰다. 세포를 마트리겔과 1:1로 혼합하고, 5-7*106개의 세포를 수컷 SCID 마우스(6-8주)에 피하 주사하였다. 종양은 일반적으로 3-5주 내에 100-350 mm3의 크기로 발달하였다. 이 범위 내의 종양을 갖는 동물을 무작위로 추출하고, 꼬리 정맥 내로의 주사에 의해 ASC로 처리하였다. PD 연구를 위해, 동물을 주사 후 96시간에 희생시키고, 장기 파편을 채취하고, 칭량하고, 액체 질소에서 동결시켰다. RNA 단리를 위해, 장기 샘플을 트리졸에서 균질화하고, RNA를 제조사의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 96 플러스 키트를 사용하여 제조하였다. RNA 농도를 분광 방법에 의해 결정하였다. RNA를 역전사에 의해 cDNA로 전환시키고, 특이적 표적의 발현을 △△CT 방법 및 검증된 Taqman 검정(Thermofisher)을 사용한 qPCR에 의해 정량하였다. 샘플을 PPIB의 발현 수준에 대해 표준화하였다.
펩티드 합성
펩티드를 표준 Fmoc 화학을 사용하여 고상에서 합성하였다. 두 펩티드는 N-말단에 시스테인을 가지며, 절단된 펩티드를 HPLC에 의해 정제하고, 질량 분광학에 의해 확인하였다. INF7 펩티드는 서열 번호 2055로 제시되어 있다. 멜리틴 펩티드는 서열 번호 2060으로 제시되어 있다.
항-EGFR 항체
항-EGFR 항체는 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 완전 인간 IgG1κ 모노클로날 항체이다. 이것은 인간 항-EGFR 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(2F8)로부터 유래된 항체 유전자를 갖는 GS 벡터를 이용한 형질감염에 의해 CHO 세포주 CHO-K1SV로부터 유래된, 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DJT33에서 생산된다. 표준 포유동물 세포 배양 및 정제 기술이 항-EGFR 항체의 제조에 사용된다.
글리칸이 없는 항-EGFR 항체의 이론적인 분자량(MW)은 146.6 kDa이다. 항체의 주요 글리코실화된 이소형의 실험적 MW는 질량 분광 분석법에 의해 결정된 바와 같이 149 kDa이다. 환원 조건 하에 SDS-PAGE를 사용하여, 경쇄의 MW는 대략 25 kDa이고 중쇄의 MW는 대략 50 kDa인 것으로 밝혀졌다. 중쇄는 2개의 사슬간 디술파이드 결합에 의해 서로 연결되고, 하나의 경쇄는 하나의 사슬간 디술파이드 결합에 의해 각각의 중쇄에 부착된다. 경쇄는 2개의 사슬내 디술파이드 결합을 가지며, 중쇄는 4개의 사슬내 디술파이드 결합을 갖는다. 항체는 N-아세틸-글루코사민, 만노스, 푸코스 및 갈락토스로 구성된 글리칸으로 중쇄의 Asn305에서 N-연결 글리코실화된다. 존재하는 주요 글리칸은 0개 또는 1개의 말단 갈락토스 잔기를 함유하는 푸코실화 이중 안테나(bi-antennary) 구조이다.
IgG1κ 항체의 하전된 이소형 패턴을 영상 모세관 IEF, 아가로스 IEF 및 분석 양이온 교환 HPLC를 사용하여 조사하였다. 다수의 하전된 이소형이 발견되고, 주요 이소형은 대략 8.7의 등전점을 갖는다.
항-EGFR 항체의 주요 작용 메카니즘은 A431 암 세포에서 EGF유도 EGFR 인산화의 농도 의존적 억제이다. 추가로, 낮은 항체 농도에서 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)의 유도가 전임상 세포 시험관내 연구에서 관찰되었다.
실시예 3: 항체-PEG-EGFR 및 항체-EGFR 접합체의 합성, 정제 및 분석
Figure pct00139
단계 1: 말레이미드-PEG-NHS와, 이어서 SH-EGFR과의 항체 접합
항-EGFR 항체(EGFR-Ab)를 1X 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 교환하고, 5 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 2 당량의 SMCC 링커 또는 말레이미드-PEGxkDa-NHS(x = 1, 5, 10, 20)를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 반응하지 않은 말레이미드-PEG를 50 kDa MWCO 아미콘(Amicon) 스핀 필터 및 PBS pH 7.4를 사용한 스핀 여과에 의해 제거하였다. 항체-PEG-Mal 접합체를 수집하고, 반응 용기로 옮겼다. SH-C6-EGFR(2 당량)을 실온에서 PBS 중의 항체-PEG-말레이미드에 첨가하고, 밤새 회전시켰다. 반응 혼합물을 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의해 분석하고, 반응하지 않은 항체 및 siRNA와 함께 접합체가 관찰되었다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용하여 AKTA 익스플로러(explorer) FPLC에 의해 정제하였다. 항체-PEG-EGFR 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 농축하고, PBS, pH 7.4로 버퍼를 교환하였다. SMCC 링커, PEG1kDa, PEG5kDa 및 PEG10kDa와의 항체 siRNA 접합체를 siRNA 로딩에 기초하여 분리하였다.
단계-3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체를 질량 분광 분석법 또는 SDS-PAGE에 의해 규명하였다. 접합체의 순도를 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2 또는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-3을 이용한 분석용 HPLC에 의해 평가하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 방법-1
1. 컬럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
2. 용매 A: 20 mM TRIS 버퍼, pH 8.0; 용매 B: 20 mM TRIS, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
3. 구배:
a. %A %B 컬럼 부피
b. 100 0 1.00
c. 60 40 8.00
d. 40 60 2.00
e. 40 60 5.00
f. 0 100 2.00
g. 100 0 2.00
음이온 교환 크로마토그래피 방법-2
1. 컬럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 1.0 ml/분
3. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0.0 90 10
c. 3.00 90 10
d. 11.00 40 60
e. 13.00 40 60
f. 15.00 90 10
g. 20.00 90 10
음이온 교환 크로마토그래피 방법-3
1. 컬럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl
3. 유속: 0.75 ml/분
4. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0.0 90 10
c. 3.00 90 10
d. 11.00 40 60
e. 23.00 40 60
f. 25.00 90 10
g. 30.00 90 10
실시예 4: 항체-siRNA-PEG 접합체의 합성, 정제 및 분석
Figure pct00140
단계 1: SMCC 링커와, 이어서 SH-KRAS-PEG5kDa와의 항체 접합
항-EGFR 항체를 1X 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 교환하고, 5 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 2 당량의 SMCC 링커(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트)를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 반응하지 않은 SMCC 링커를 50 kDa MWCO 아미콘 스핀 필터 및 PBS 버퍼 pH 7.4를 사용한 스핀 여과에 의해 제거하였다. 잔류액을 수집하고, 2당량의 SH-C6-KRAS-PEG5kDa를 실온에서 첨가하고, 밤새 회전시켰다. 반응 혼합물을 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용한 AKTA 익스플로러 FPLC에 의해 정제하였다. 항체-KRAS-PEG 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 농축하고, PBS, pH 7.4로 버퍼를 교환하였다.
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체를 질량 분광 분석법 또는 SDS-PAGE에 의해 규명하였다. 접합체의 순도를 음이온 교환 크로마토그래피 방법-3(실시예 1에 기재됨)을 사용한 분석 HPLC에 의해 평가하였다.
실시예 5: 항체-S-S-siRNA-PEG 접합체의 합성, 정제 및 분석
Figure pct00141
단계 1: SPDP 링커와, 이어서 SH-siRNA-PEG5kDa와의 항체 접합
항-EGFR 항체를 1X 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 교환하고, 5 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 2당량의 SPDP 링커(숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 반응하지 않은 SPDP 링커를 50 kDa MWCO 아미콘 스핀 필터 및 pH 7.4 PBS 버퍼를 사용한 스핀 여과에 의해 제거하였다. 잔류액을 수집하고, 2당량의 SH-C6-siRNA-PEG5kDa를 실온에서 첨가하고, 밤새 회전시켰다. 반응 혼합물을 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의해 분석하고, 반응하지 않은 항체와 함께 접합체가 결정되었다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용한 AKTA 익스플로러 FPLC에 의해 정제하였다. 항체-PEG-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 농축하고, PBS, pH 7.4로 버퍼를 교환하였다.
단계-3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체를 질량 분광 분석법 또는 SDS-PAGE에 의해 규명하였다. 접합체의 순도를 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용한 분석 HPLC에 의해 평가하였다.
실시예 6: 항체-SMCC-엔도솜 탈출 펩티드 접합체의 합성, 정제 및 분석
Figure pct00142
단계 1: SMCC 링커 또는 말레이미드-PEG-NHS와, 이어서 SH-Cys-펩티드-CONH 2 와의 항체 접합
항-EGFR 항체를 1X 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 교환하고, 10 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 3당량의 SMCC 링커(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트) 또는 말레이미드-PEG1kDa-NHS를 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 회전시켰다. 반응하지 않은 SMCC 링커 또는 PEG 링커를 50 kDa MWCO 아미콘 스핀 필터 및 PBS 버퍼 pH 7.4(멜리틴 접합체의 경우 25 mM MES pH=6.1)를 사용한 스핀 여과에 의해 제거하였다. 잔류액을 수집하고, 3당량의 SH-Cys-펩티드-CONH2를 실온에서 첨가하고, 밤새 회전시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 HIC 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하여 항-EGFR 항체-펩티드 또는 항-EGFR 항체-PEG1k-펩티드를 단리하였다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 방법-1 또는 양이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용한 AKTA 익스플로러 FPLC에 의해 정제하였다. 항체-펩티드 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 농축하고, PBS, pH 7.4로 버퍼를 교환하였다(멜리틴 접합체의 경우 10 mM 아세테이트 pH=6.0).
단계-3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체를 질량 분광 분석법 또는 SDS-PAGE에 의해 규명하였다. 순도 및 펩티드 로딩을 HIC 방법-2 또는 양이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용한 분석 HPLC에 의해 평가하였다.
양이온 교환 크로마토그래피 방법-1
1. 컬럼: GE Healthcare HiPrep SP HP 16/10
2. 용매 A: 50 mM MES pH=6.0; 용매 B: 50 mM MES + 0.5M NaCl pH=6.0; 유 속: 2.0 ml/분
3. 구배:
a. %A %B 컬럼 부피
b. 100 0 0.1
c. 100 0 플러쉬 루프 12 ml
d. 100 0 2.5
e. 0 100 15
f. 0 100 5
g. 100 0 0.5
h. 100 0 5
양이온 교환 크로마토그래피 방법-2
1. 컬럼: Thermo Scientific, MAbPac™ SCX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm (제 품 # 074625)
2. 용매 A: 20 mM MES pH=5.5; 용매 B: 20 mM MES + 0.3 M NaCl pH=5.5; 유속: 0.5 ml/분
3. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0.0 100 0
c. 5 100 0
d. 50 0 100
e. 80 0 100
f. 85 100 0
g. 90 100 0
소수성 상호작용 크로마토그래피 방법-1(HIC 방법-1)
1. 컬럼: GE Healthcare Butyl Sepharose High Performance (17-5432-02) 200 ml
2. 용매 A: 50 mM 인산나트륨 + 0.8M 황산암모늄 (pH=7.0); 용매 B: 80% 50 mM 인산나트륨 (pH=7.0), 20% IPA; 유속: 3.0 ml/분
3. 구배:
a. %A %B 컬럼 부피
b. 100 0 0.1
c. 0 100 3
d. 0 100 1.35
e. 100 0 0.1
f. 100 0 0.5
소수성 상호작용 크로마토그래피 방법-2(HIC 방법-2)
1. 컬럼: Tosoh Bioscience TSKgel 부틸-NPR 4.6mm ID x 10cm 2.5 μm
2. 용매 A: 100 mM 인산나트륨 + 1.8 M 황산암모늄 (pH=7.0); 용매 B: 80% 100 mM 인산나트륨 (pH=7.0), 20% IPA; 유속: 0.5 ml/분
3. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0 100 0
c. 3 50 50
d. 21 0 100
e. 23 0 100
f. 25 100 0
실시예 7: EEP-항체-siRNA-PEG 접합체의 합성, 정제 및 분석
Figure pct00143
단계 1: PEG24 링커, 이어서 SH-Cys-펩티드-CONH 2 의 EGFR-Ab-siRNA-PEG에 대한 접합
1의 siRNA 로딩을 갖는 EGFR-Ab-siRNA-PEG 접합체를 PBS, pH 7.4 버퍼 중의 4당량의 PEG1k 링커(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트)와 접합시키고, 실온에서 1.5시간 동안 회전시켰다. 반응하지 않은 PEG1k 링커를 50 kDa MWCO 아미콘 스핀 필터 및 PBS 버퍼 pH 7.4를 사용한 스핀 여과에 의해 제거하였다. 잔류액을 수집하고, 4당량의 SH-Cys-펩티드-CONH2를 실온에서 첨가하고, 밤새 회전시켰다.
단계 2: 정제
이어서, 반응하지 않은 펩티드가 HPLC에 의해 모니터링할 때 제거될 때까지, 반응 혼합물을 PBS 버퍼 pH 7.4 및 50 kDa 아미콘 스핀 필터를 사용한 반복된 스핀 여과에 의해 정제하였다. 생성물은 0, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 펩티드가 항체 골격에 접합된 접합체의 혼합물을 함유한다.
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체를 질량 분광 분석법 또는 SDS-PAGE에 의해 규명하였다. 접합체의 순도 및 펩티드 로딩을 HIC 방법-2 또는 양이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용한 분석 HPLC에 의해 평가하였다.
실시예 8. 종양 PK/PD 연구
피하 옆구리 H358 종양을 갖는 암컷 NCr nu/nu 마우스에게 0.5 mg/kg(siRNA 기준)의 EGFR 항체-siRNA-EEP 접합체를 투여할 것이다. 다수의 EEP(엔도솜 분해성 모이어티)는 대조군에 비해 표적 유전자의 최상의 녹다운을 초래하는 최적의 엔도솜 탈출을 보이는 펩티드 서열을 결정하기 위해 사용될 것이다.
실시예 9. 나노입자를 이용한 ABC 접합체의 제제화
예시적인 ABC 접합체를 시클로덱스트린 중합체(10 kDa) 및 과량의 비접합된 siRNA(ED 40-60 nm, PDI 0.1-0.2)를 사용하여 자가 조립된 나노입자 내로 패키징한다. 이들 입자에서, 예시적인 ABC 접합체는 항체 표적과 상호작용하는 능력을 유지한다. 생체내 순환에서 입자의 안정성 및 표적 결합능은 패키징 siRNA의 변형을 통해 조절된다.
나노입자 형성
나노입자를 1.6 mg/mL의 최종 siRNA 농도로 제조한다. 1:20의 비율로 CY5-siRNA를 함유하는 siRNA를 먼저 물에 2x의 최종 농도로 희석한다. 시클로덱스트린 중합체(CDP)를 중성 pH에서 10 mM 포스페이트 버퍼에서 3:1의 질소 대 인 비율(N:P)을 달성하기 위해 필요한 2x의 최종 농도로 희석한다. CDP를 siRNA에 빠르게 첨가하고, 피펫팅에 의해 더 혼합한다. 입자를 투여 또는 분석하기 전에 적어도 15분 동안 인큐베이팅한다.
시험관내 EGFR 결합
다양한 양의 예시적인 ABC 접합체를 함유하는 나노입자를 소 태아 혈청으로 10 nM의 최종 농도로 희석하고, 150 nM의 정제된 EGFR-Fc 단백질(Sino Biological)이 로딩된 단백질 G 다이나비드(Dynabead)(Thermofisher)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 비드를 0.01% 트윈 20 및 0.05% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척한 다음, 비드가 결합한 나노입자를 0.01% 트윈 20 및 100 ug/ml 헤파린을 함유하는 물로 파괴한다. 투입물, 결합하지 않은 분획, 세척물 및 비드 용리액에 함유된 CY5-siRNA의 양을 TECAN 인피니트(Infinite) M200 Pro(여기 635 nm; 방출 675 nm)를 사용하여 형광에 의해 정량한다.
실시예 10. siRNA 합성
모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 완전히 조립하고, HPLC를 사용하여 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다.
실시예 11 내지 15에 사용된 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3, 15, 26, 27 및 28)는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00144
화합물 3을 비교를 위한 표준물질로 사용하였다.
화합물 15, 26, 27, 28, 30 및 32를 개별 가이드 가닥에 통합시켰다.
화합물 28을 디뉴클레오티드로서 고상 합성 동안 패신저의 5' 말단에 통합시켰다.
모든 siRNA 패신저 가닥은 5' 말단에 C6-NH2 접합 핸들을 함유하였다.
19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체의 경우, 접합 핸들은 반전된 무염기 포스포디에스테르를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결되었다(도 1a 참조).
19개 염기의 상보성 및 하나의 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 블런트 말단 이중체의 경우, 접합 핸들을 말단 염기 상의 포스포디에스테르를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결시켰다(도 1b 참조).
정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
실시예 11. HCT116 세포에서 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조의 시험관내 활성
siRNA 설계 및 합성: 21mer HPRT 가이드 가닥을 마우스 HPRT에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU이었다.
비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조(화합물 3, 15 및 27)를 포함하는 3가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 0RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 도 1b에 기재된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
시험관내 연구: 상이한 siRNA를 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 및 0.0001 nM의 최종 농도에서 인간 결장직장 암종 HCT116 세포 내로 형질감염시켰다. siRNA는 제조자의 "정방향 형질감염" 지침에 따라 시판되는 형질감염 시약인 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMAX(Life Technologies)와 함께 제제화되었다. 세포는 웰당 50000개의 세포로 24웰 조직 배양 플레이트 상에 형질감염되기 24시간 전에 3회 플레이팅되었다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, TRIzol® 시약(Life Technologies)으로 수집하였다. 제조자의 지침에 따라, Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Research)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 제조자의 지침에 따라, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 10 ㎕의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플은 TaqMan® 패스트 어드밴스트 매스터 믹스(Fast Advanced Master Mix)(Applied Biosystems)를 사용하여 HPRT-특이적 및 PPIB-특이적 TaqMan 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)에 의해 qPCR에 의해 평가되었다. 각각의 샘플 내에서 HPRT 값을 PPIB 유전자 발현으로 표준화하였다. HPRT 하향조절의 정량은 표준 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 수행되었다. 모든 실험은 3회 수행되었다.
도 2는 이중체의 시험관내 형질감염 후, HPRT siRNA의 가이드 가닥 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 HPRT 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 15 및 27)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
실시예 12. 횡문근육종 세포에서 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조의 시험관내 활성
siRNA 설계 및 합성: 21mer 미오스타틴(MSTN) 가이드 가닥을 인간 MSTN에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU이었다. 상이한 구조(화합물 3, 15, 26, 27 및 28)를 포함하는 5가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 도 1a에 기재된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
시험관내 연구: siRNA의 활성을 형질감염된 인간 횡문근육종 세포(SJCRH30, ATCC CRL-2061)에서 평가하였다. 10% 열 불활성화된 FBS(Gibco) 및 10 mM FIEPES 및 1 mM 피루브산나트륨이 보충된 RPMI-1640에서 세포를 성장시켰다. siRNA 형질감염을 위해, 세포를 24웰 플레이트 상에 20,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 제조자의 "정방향 형질감염" 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)를 사용하여 다양한 농도의 siRNA(0.0001-100 nM의 최종 농도)로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, 300 ㎕/웰의 TRIzol® 시약(Life Technologies)으로 수집하였다. 제조자의 지침에 따라, Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Research)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 제조자의 지침에 따라, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 10 ㎕의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플은 TaqMan® 패스트 어드밴스트 매스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 MSTN-특이적 및 PPIB-특이적 TaqMan 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 사용하는 qPCR 및 ΔΔCt 방법에 의해 평가되었다. 개별 실험은 3회 또는 2회 수행되었다.
하기 표는 유사체(화합물 15, 26, 27 및 28)의 50% 최대 억제 농도 및 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)에 대해 달성된 최대 녹다운을 나타낸다.
Figure pct00145
도 3은 이중체의 시험관내 형질감염 후, MSTN siRNA의 가이드 가닥 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 MSTN 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 15, 26, 27 및 28)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
실시예 13. 2017-PK-407-WT: siRNA의 생체내 트랜스페린 mAb 접합체 전달
그룹 1-4의 경우, 21mer HPRT 가이드 가닥을 마우스 HPRT에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 상기 설명된 바와 같은 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 가이드 가닥은 화합물 3 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 이용하였다. 패신저 가닥은 반전된 무염기 포스포디에스테르 연결을 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1a 참조).
그룹 5-8의 경우, 21mer HPRT 가이드 가닥을 마우스 HPRT에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 도 c에서 설명되는 바와 같은 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 가이드 가닥은 화합물 15 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 이용하였다. 패신저 가닥은 말단 염기 상의 포스포디에스테르 연결을 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1b 참조).
그룹 9-12의 경우, 21mer HPRT 가이드 가닥을 마우스 HPRT에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 가이드 가닥은 화합물 27 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 이용하였다. 패신저 가닥은 말단 염기 상의 포스포디에스테르 연결을 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1b 참조).
그룹 13-16의 경우, 21mer MSTN 가이드 가닥을 인간 MSTN에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 가이드 가닥은 화합물 28 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 이용하였다. 패신저 가닥은 반전된 무염기 포스포디에스테르 연결을 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1a 참조).
그룹 17-20의 경우, 21mer MSTN 가이드 가닥을 인간 MSTN에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 가이드 가닥은 화합물 3 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 이용하였다. 패신저 가닥은 반전된 무염기 포스포디에스테르 연결을 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1a 참조).
비스-말레이미드(BisMal) 링커를 사용한 항체 siRNA 접합체 합성
단계 1: TCEP를 사용한 항체 환원
항체를 1 mM DTPA와 함께 25 mM 보레이트 버퍼(pH 8)로 버퍼를 교환하고, 10 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 보레이트 버퍼 중의 4당량의 TCEP를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0의 10 mM 아세테이트 버퍼 중의 BisMal-siRNA(1.25당량)의 용액과 조합하고, 밤새 4℃에서 유지하였다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 반응하지 않은 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 나타내었다. 반응 혼합물을 10 EQ의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg/mL의)로 처리하여 임의의 임의의 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용한 AKTA Pure FPLC에 의해 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축하고, pH 7.4의 PBS로 버퍼를 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1
1. 컬럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
2. 용매 A: 20 mM TRIS 버퍼, pH 8.0; 용매 B: 20 mM TRIS, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
3. 구배:
a. %A %B 컬럼 부피
b. 100 0 1
c. 81 19 0.5
d. 50 50 13
e. 40 60 0.5
f. 0 100 0.5
g. 100 0 2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
1. 컬럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
3. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0.0 90 10
c. 3.00 90 10
d. 11.00 40 60
e. 14.00 40 60
f. 15.00 20 80
g. 16.00 90 10
h. 20.00 90 10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가되었다.
Figure pct00146
생체내 연구
생체내 실험(야생형 CD-1 마우스)에서 골격근에서의 미오스타틴(MSTN) 및 HPRT의 mRNA 하향조절을 매개하는 능력에 대해 접합체를 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥내(iv) 주사를 통해 마우스에게 투여하였다(하기 표 참조). 168시간 후, 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고, 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 비교 qPCR 검정을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량하였다. PPIB(하우스키핑 유전자)는 내부 RNA 로딩 대조군으로서 사용되었으며, 결과는 비교 Ct 방법에 의해 계산되었으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 간의 차이(△Ct)가 계산된 후, 2차 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군에 대해 추가로 표준화되었다.
Figure pct00147
Figure pct00148
도 4는 siRNA 가이드 가닥 상의 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 트랜스페린 수용체를 표적으로 하는 항-TfR mAb에 접합될 때 위 근육에서 이들의 표적 유전자의 용량 의존적 하향조절을 나타냄을 보여준다. 유사체의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조와 유사하였다.
실시예 14. 2017-PK-421-WT: siRNA의 생체내 트랜스페린 mAb 접합체 전달
그룹 1-12의 경우, 21mer MSTN 가이드 가닥은 인간/마우스 MSTN에 대해 설계되었다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 5' 말단에 3개의 상이한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조(화합물 3, 15 및 26)를 갖는 3개의 가이드 가닥을 제조하였다. 패신저 가닥은 포스포디에스테르-반전된 무염기 연결을 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다.
항-TfR1 mAb-MSTN DAR1 접합체는 다음과 같이 합성되었다:
Figure pct00149
단계 1: TCEP를 사용한 항체 환원
항체를 1 mM DTPA와 함께 25 mM 보레이트 버퍼(pH 8)로 버퍼를 교환하고, 10 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 보레이트 버퍼 중의 4당량의 TCEP를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0의 10 mM 아세테이트 버퍼 중의 BisMal-siRNA(1.25당량)의 용액과 조합하고, 밤새 4℃에서 유지하였다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 반응하지 않은 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 나타내었다. 반응 혼합물을 10 EQ의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg/mL의)로 처리하여 임의의 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용한 AKTA Pure FPLC에 의해 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축하고, pH 7.4의 PBS로 버퍼를 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1
1. 컬럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
2. 용매 A: 20 mM TRIS 버퍼, pH 8.0; 용매 B: 20 mM TRIS, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
3. 구배:
a. %A %B 컬럼 부피
b. 100 0 1
c. 81 19 0.5
d. 50 50 13
e. 40 60 0.5
f. 0 100 0.5
g. 100 0 2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
1. 컬럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
3. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0.0 90 10
c. 3.00 90 10
d. 11.00 40 60
e. 14.00 40 60
f. 15.00 20 80
g. 16.00 90 10
h. 20.00 90 10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가되었다.
Figure pct00150
생체내 연구
생체내 실험(야생형 CD-1 마우스)에서 골격근에서의 미오스타틴(MSTN)의 mRNA 하향조절을 매개하는 능력에 대해 접합체를 평가하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥내(iv) 주사를 통해 마우스에게 투여하였다. 168시간 후, 비복근(gastroc), 사두근(quad) 및 (C) 심장 근육 조직을 수거하고, 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 섹션에서 설명된 바와 같이, 비교 qPCR 검정을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량하였다. PPIB(하우스키핑 유전자)는 내부 RNA 로딩 대조군으로서 사용되었으며, 결과는 비교 Ct 방법에 의해 계산되었으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 간의 차이(△Ct)가 계산된 후, 2차 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군에 대해 추가로 표준화되었다.
Figure pct00151
Figure pct00152
도 5는 가이드 가닥의 5' 말단에 상이한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 함유하는 항체 siRNA 접합체에 의한 비복근, 사두근 및 심장 근육에서의 MSTN mRNA 하향조절을 입증한다. 유사체의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조와 유사하였다.
실시예 15. 2017-PK-422-WT: siRNA의 생체내 트랜스페린 mAb 접합체 전달
그룹 1-4 및 9-12의 경우, 21mer HPRT 가이드 가닥을 마우스 HPRT에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 5' 말단에 화합물 3 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 갖는 가이드 가닥을 제조하였다. 패신저 가닥은 반전된 무염기 포스포디에스테르 링커를 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1a 참조).
그룹 5-8 및 13-16의 경우, 21mer HPRT 가이드 가닥을 마우스 HPRT에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU이었다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 5' 말단에 화합물 26 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조를 갖는 가이드 가닥을 제조하였다. 패신저 가닥은 말단 포스포로티오에이트를 통해 5' 말단에 접합 핸들을 가졌다(도 1b 참조).
항-TfR1 mAb-HPRT DAR1 접합체는 다음과 같이 합성되었다:
Figure pct00153
단계 1: TCEP를 사용한 항체 환원
항체를 1 mM DTPA와 함께 25 mM 보레이트 버퍼(pH 8)로 버퍼를 교환하고, 10 mg/ml 이하의 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 보레이트 버퍼 중의 4당량의 TCEP를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 10 mM 아세테이트 버퍼(pH 6.0) 중의 BisMal-siRNA(1.25당량)의 용액과 조합하고, 밤새 4℃에서 유지하였다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 반응하지 않은 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 나타내었다. 반응 혼합물을 10 EQ의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg/mL의)로 처리하여 임의의 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조질 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용한 AKTA Pure FPLC에 의해 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축하고, pH 7.4의 PBS로 버퍼를 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1
1. 컬럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
2. 용매 A: 20 mM TRIS 버퍼, pH 8.0; 용매 B: 20 mM TRIS, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
3. 구배:
a. %A %B 컬럼 부피
b. 100 0 1
c. 81 19 0.5
d. 50 50 13
e. 40 60 0.5
f. 0 100 0.5
g. 100 0 2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
1. 컬럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM TRIS pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
3. 구배:
a. 시간 %A %B
b. 0.0 90 10
c. 3.00 90 10
d. 11.00 40 60
e. 14.00 40 60
f. 15.00 20 80
g. 16.00 90 10
h. 20.00 90 10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가되었다.
Figure pct00154
생체내 연구
생체내 실험(야생형 CD-1 마우스)에서 근육 및 간에서의 HPRT의 mRNA 하향조절을 매개하는 능력에 대해 접합체를 평가하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥내(iv) 주사를 통해 마우스에게 투여하였다. 168시간 후, 비복근(gastroc) 및 간 조직을 수거하고, 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 섹션에서 설명된 바와 같이, 비교 qPCR 검정을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량하였다. PPIB(하우스키핑 유전자)는 내부 RNA 로딩 대조군으로서 사용되었으며, 결과는 비교 Ct 방법에 의해 계산되었으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 간의 차이(△Ct)가 계산된 후, 2차 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군에 대해 추가로 표준화되었다.
Figure pct00155
Figure pct00156
도 6은 siRNA 가이드 가닥 상의 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 마우스에게 IV 투여한 후, 마우스 간 및 비복근에서 HPRT 표적 유전자의 용량 의존적 하향조절을 매개할 수 있음을 입증한다. 근육 상의 트랜스페린 수용체를 표적으로 하는 항-TfR mAb에 접합될 때, siRNA는 근육에서 HPRT 하향조절을 매개할 수 있었다. 간세포 상의 ASGR 수용체를 표적으로 하는 항-ASGR mAb에 접합될 때, siRNA는 간에서 HPRT 하향조절을 매개할 수 있었다.
실시예 16. HCT116 세포에서 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조의 시험관내 활성
siRNA 설계 및 합성: 21mer SSB 가이드 가닥을 마우스 SSB에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUACAUUAAAGUCUGUUGUUU이었다. 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조(화합물 3, 30 및 32)를 포함하는 3가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조는 도 A3에 기술된 아미다이트를 사용하여 통합되었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 상기 설명된 바와 같은 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
시험관내 연구: 상이한 siRNA를 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 및 0.0001 nM의 최종 농도에서 인간 결장직장 암종 HCT116 세포 내로 형질감염시켰다. siRNA는 제조자의 "정방향 형질감염" 지침에 따라 시판되는 형질감염 시약인 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)와 함께 제제화되었다. 세포는 웰당 50000개의 세포로 24웰 조직 배양 플레이트 상에 형질감염되기 24시간 전에 3회 플레이팅되었다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, TRIzol® 시약(Life Technologies)으로 수집하였다. 제조자의 지침에 따라, Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Research)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 제조자의 지침에 따라, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 10 ㎕의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플은 TaqMan® 패스트 어드밴스트 매스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 HPRT-특이적 및 PPIB-특이적 TaqMan 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)에 의해 qPCR에 의해 평가되었다. 각각의 샘플 내에서 HPRT 값을 PPIB 유전자 발현으로 표준화하였다. HPRT 하향조절의 정량은 표준 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 수행되었다. 모든 실험은 3회 수행되었다.
EC50 값은 다음과 같았다:
Figure pct00157
도 7은 이중체의 시험관내 형질감염 후, SSB siRNA의 가이드 가닥의 5' 말단 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 SSB 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 30 및 32)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
실시예 17. 횡문근육종 세포에서 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조의 시험관내 활성
siRNA 설계 및 합성: 21mer 미오스타틴(MSTN) 가이드 가닥을 마우스 및 인간 MSTN에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU이었다. 상이한 구조(화합물 3, 26, 30 및 32)를 포함하는 4가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조는 상기 설명된 바와 같은 아미다이트를 사용하여 통합되었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 상기 설명된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
또한, 21mer SSB 가이드 가닥을 마우스 SSB에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUACAUUAAAGUCUGUUGUUU이었다. 상이한 구조(화합물 3, 30 및 32)를 포함하는 3가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조는 상기 설명된 바와 같은 아미다이트를 사용하여 통합되었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 상기 설명된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
시험관내 연구: siRNA의 활성을 형질감염된 인간 횡문근육종 세포(SJCRH30, ATCC CRL-2061)에서 평가하였다. 10% 열 불활성화된 FBS(Gibco) 및 10 mM FIEPES 및 1 mM 피루브산나트륨이 보충된 RPMI-1640에서 세포를 성장시켰다. siRNA 형질감염을 위해, 세포를 24웰 플레이트 상에 20,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 제조자의 "정방향 형질감염" 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)를 사용하여 다양한 농도의 siRNA(0.0001-100 nM의 최종 농도)로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, 300 ㎕/웰의 TRIzol® 시약(Life Technologies)으로 수집하였다. 제조자의 지침에 따라, Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Research)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 제조자의 지침에 따라, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 10 ㎕의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플은 TaqMan® 패스트 어드밴스트 매스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 MSTN-특이적 및 PPIB-특이적 TaqMan 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 사용하는 qPCR 및 ΔΔCt 방법에 의해 평가되었다. 개별 실험은 2회 또는 3회 수행되었다.
도 8A는 이중체의 시험관내 형질감염 후, MSTN siRNA의 가이드 가닥 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 MSTN 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 26, 30 및 32)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
도 8B는 이중체의 시험관내 형질감염 후, SSB siRNA의 가이드 가닥 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 SSB 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 30 및 32)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
실시예 18. 외관상 건강한 인간 유래 불멸화 골격근 근모세포(MB)에서 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조의 시험관내 활성
siRNA 설계 및 합성: 21mer 미오스타틴(MSTN) 가이드 가닥을 마우스 및 인간 MSTN에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU이었다. 상이한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조(화합물 3, 26, 30 및 32)를 포함하는 4가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조는 상기 설명된 바와 같은 아미다이트를 사용하여 통합되었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 상기 설명된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
또한, 21mer SSB 가이드 가닥을 마우스 SSB에 대해 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'으로)은 UUACAUUAAAGUCUGUUGUUU이었다. 상이한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조(화합물 3, 30 및 32)를 포함하는 3가지 버전을 제조하였다. 가이드 및 완전 상보성 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파르아미다이트 화학을 사용하여 고체 상에 조립하고, HPLC를 통해 정제하였다. 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조는 상기 설명된 바와 같은 아미다이트를 사용하여 통합되었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고, 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 상기 설명된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 수득하였다.
시험관내 연구: siRNA의 활성을 외관상 건강한 인간 유래 불멸화 골격근 근모세포(MB)(프랑스 소재 Institut de Myologie의 데니스 펄링(Denis Furling)으로부터 입수함)에서 평가하였다. MB 세포를 완전한 골격근 세포 성장 배지(PromoCell)에서 성장시켰다. 웰당 4000개의 (MB) 세포로 96웰 조직 배양 플레이트 상에서 3회 형질감염시키기 24시간 전에 세포를 플레이팅하였다. siRNA를 세포 내로 50 nM, 5.5556 nM, 0.6173 nM, 0.0686 nM, 0.0076 nM, 0.0008 nM 및 0.0001 nM의 최종 농도로 형질감염시켰다. siRNA는 제조자의 "정방향 형질감염" 프로토콜 지침에 따라 시판되는 형질감염 시약인 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)를 사용하여 제제화하였다. 형질감염 48시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, TRIzol® 시약(Life Technologies)으로 수집하였다. 제조자의 지침에 따라, Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Research)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 제조자의 지침에 따라, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 10 ㎕의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플은 TaqMan® 패스트 어드밴스트 매스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 SSB-특이적, MSTN-특이적 및 PPIB-특이적 TaqMan 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 사용하는 qPCR에 의해 평가되었다. 각각의 샘플 내에서 SSB 및 MSTN 발현 값을 PPIB 유전자 발현으로 표준화하였다. 표준 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 SSB 및 MSTN 하향조절의 정량을 수행하였다. 모든 실험은 3회 수행되었다.
도 9A는 이중체의 시험관내 형질감염 후, MSTN siRNA의 가이드 가닥 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 MSTN 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 26, 30 및 32)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
도 9B는 이중체의 시험관내 형질감염 후, SSB siRNA의 가이드 가닥 상의 신규한 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드 구조가 RISC에 로딩될 수 있고 표적 SSB 유전자의 서열 특이적 하향조절을 매개할 수 있음을 나타내는 용량 반응 곡선을 도시한 것이다. 유사체(화합물 30 및 32)의 활성은 표준 비닐포스포네이트 변형된 뉴클레오티드(화합물 3)와 유사하였다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 다양한 변형, 변경, 및 치환이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 실시될 것이다. 본원에서 설명되는 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고, 이들 청구범위 및 그의 균등물에 속하는 방법 및 구조는 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> AVIDITY BIOSCIENCES LLC <120> NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> 45532-719.601 <140> PCT/US2018/054444 <141> 2018-10-04 <150> 62/568,238 <151> 2017-10-04 <160> 1277 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaaugacuga auauaaacuu gug 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 aaugacugaa uauaaacuug ugg 23 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacuuguggu aguuggagcu ggu 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uaggcaagag ugccuugacg aua 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggcaagagug ccuugacgau aca 23 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 gcaagagugc cuugacgaua cag 23 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 caagagugcc uugacgauac agc 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 agugccuuga cgauacagcu aau 23 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 gugccuugac gauacagcua auu 23 <210> 10 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 38 cagcuaauuc agaaucauut t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 aaugauucug aauuagcugt t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 40 guggacgaau augauccaat t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 41 uuggaucaua uucguccact t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 42 gacgaauaug auccaacaat t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 43 uuguuggauc auauucguct t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 44 acgaauauga uccaacaaut t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 45 auuguuggau cauauucgut t 21 <210> 46 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 ggcggccgga gucccgagcu agc 23 <210> 47 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 ggccggaguc ccgagcuagc ccc 23 <210> 48 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 gccggagucc cgagcuagcc ccg 23 <210> 49 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 ccggaguccc gagcuagccc cgg 23 <210> 50 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 cggagucccg agcuagcccc ggc 23 <210> 51 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 ggagucccga gcuagccccg gcg 23 <210> 52 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 gagucccgag cuagccccgg cgg 23 <210> 53 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 gucccgagcu agccccggcg gcc 23 <210> 54 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 ccggacgaca ggccaccucg ucg 23 <210> 55 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 cggacgacag gccaccucgu cgg 23 <210> 56 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 ggacgacagg ccaccucguc ggc 23 <210> 57 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 gacgacaggc caccucgucg gcg 23 <210> 58 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 acgacaggcc accucgucgg cgu 23 <210> 59 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 gacaggccac cucgucggcg ucc 23 <210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 acaggccacc ucgucggcgu ccg 23 <210> 61 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 caggccaccu cgucggcguc cgc 23 <210> 62 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 aggccaccuc gucggcgucc gcc 23 <210> 63 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 ggccaccucg ucggcguccg ccc 23 <210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 gccaccucgu cggcguccgc ccg 23 <210> 65 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 ccaccucguc ggcguccgcc cga 23 <210> 66 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 caccucgucg gcguccgccc gag 23 <210> 67 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 accucgucgg cguccgcccg agu 23 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 ccucgucggc guccgcccga guc 23 <210> 69 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 cucgucggcg uccgcccgag ucc 23 <210> 70 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 ucgucggcgu ccgcccgagu ccc 23 <210> 71 <211> 23 <212> RNA 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<211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 augcgacccu ccgggacggc cgg 23 <210> 84 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 gcgacccucc gggacggccg ggg 23 <210> 85 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 cgacccuccg ggacggccgg ggc 23 <210> 86 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 acccuccggg acggccgggg cag 23 <210> 87 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 aaagaaaguu ugccaaggca cga 23 <210> 88 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 aagaaaguuu gccaaggcac gag 23 <210> 89 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 gaaaguuugc caaggcacga gua 23 <210> 90 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 aaaguuugcc aaggcacgag uaa 23 <210> 91 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 aaguuugcca aggcacgagu aac 23 <210> 92 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 aguuugccaa ggcacgagua aca 23 <210> 93 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 guuugccaag gcacgaguaa caa 23 <210> 94 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 uuugccaagg 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RNA <213> Homo sapiens <400> 129 gcagaggaau uaugaucuuu ccu 23 <210> 130 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 130 cagaggaauu augaucuuuc cuu 23 <210> 131 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 131 ggaauuauga ucuuuccuuc uua 23 <210> 132 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 132 gaauuaugau cuuuccuucu uaa 23 <210> 133 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 133 auuaugaucu uuccuucuua aag 23 <210> 134 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 134 uaugaucuuu ccuucuuaaa gac 23 <210> 135 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 135 gaucuuuccu ucuuaaagac cau 23 <210> 136 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 136 uuccuucuua aagaccaucc agg 23 <210> 137 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 137 uccuucuuaa agaccaucca gga 23 <210> 138 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 138 cuucuuaaag accauccagg agg 23 <210> 139 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 139 ucuuaaagac cauccaggag gug 23 <210> 140 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 140 cuuaaagacc 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RNA <213> Homo sapiens <400> 175 uuaucuaacu augaugcaaa uaa 23 <210> 176 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 176 uaucuaacua ugaugcaaau aaa 23 <210> 177 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 177 aucuaacuau gaugcaaaua aaa 23 <210> 178 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 178 cuaacuauga ugcaaauaaa acc 23 <210> 179 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 179 augaugcaaa uaaaaccgga cug 23 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 180 ugaugcaaau aaaaccggac uga 23 <210> 181 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 181 gaugcaaaua aaaccggacu gaa 23 <210> 182 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 182 ugcaaauaaa accggacuga agg 23 <210> 183 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 183 gcaaauaaaa ccggacugaa gga 23 <210> 184 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 184 caaauaaaac cggacugaag gag 23 <210> 185 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 185 aauaaaaccg gacugaagga gcu 23 <210> 186 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 186 auaaaaccgg 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 424 ccggaguccc gagcuagcct t 21 <210> 425 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 425 ggcuagcucg ggacuccggt t 21 <210> 426 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 426 cggagucccg agcuagccct t 21 <210> 427 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 427 gggcuagcuc gggacuccgt t 21 <210> 428 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 428 ggagucccga gcuagcccct t 21 <210> 429 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 429 ggggcuagcu cgggacucct t 21 <210> 430 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 430 gagucccgag cuagccccgt t 21 <210> 431 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 431 cggggcuagc ucgggacuct t 21 <210> 432 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 432 agucccgagc uagccccggt t 21 <210> 433 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 433 ccggggcuag cucgggacut t 21 <210> 434 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 434 gucccgagcu agccccggct t 21 <210> 435 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 435 gccggggcua gcucgggact t 21 <210> 436 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 436 cccgagcuag ccccggcggt t 21 <210> 437 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 437 ccgccggggc uagcucgggt t 21 <210> 438 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 438 ggacgacagg ccaccucgut t 21 <210> 439 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 439 acgagguggc cugucgucct t 21 <210> 440 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 440 gacgacaggc caccucguct t 21 <210> 441 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 441 gacgaggugg ccugucguct t 21 <210> 442 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 442 acgacaggcc accucgucgt t 21 <210> 443 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 443 cgacgaggug gccugucgut t 21 <210> 444 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 444 cgacaggcca ccucgucggt t 21 <210> 445 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 445 ccgacgaggu ggccugucgt t 21 <210> 446 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 446 gacaggccac cucgucggct t 21 <210> 447 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 447 gccgacgagg uggccuguct t 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 448 caggccaccu cgucggcgut t 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 449 acgccgacga gguggccugt t 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 450 aggccaccuc gucggcguct t 21 <210> 451 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 451 gacgccgacg agguggccut t 21 <210> 452 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 452 ggccaccucg ucggcgucct t 21 <210> 453 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 453 ggacgccgac gagguggcct t 21 <210> 454 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 454 gccaccucgu cggcguccgt t 21 <210> 455 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 455 cggacgccga cgagguggct t 21 <210> 456 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 456 ccaccucguc ggcguccgct t 21 <210> 457 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 457 gcggacgccg acgagguggt t 21 <210> 458 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 458 caccucgucg gcguccgcct t 21 <210> 459 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 459 ggcggacgcc gacgaggugt t 21 <210> 460 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 460 accucgucgg cguccgccct t 21 <210> 461 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 461 gggcggacgc cgacgaggut t 21 <210> 462 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 462 ccucgucggc guccgcccgt t 21 <210> 463 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 463 cgggcggacg ccgacgaggt t 21 <210> 464 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 464 cucgucggcg uccgcccgat t 21 <210> 465 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 465 ucgggcggac gccgacgagt t 21 <210> 466 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 466 ucgucggcgu ccgcccgagt t 21 <210> 467 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 467 cucgggcgga cgccgacgat t 21 <210> 468 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 468 cgucggcguc cgcccgagut t 21 <210> 469 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 469 acucgggcgg acgccgacgt t 21 <210> 470 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 470 gucggcgucc gcccgaguct t 21 <210> 471 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 471 gacucgggcg gacgccgact t 21 <210> 472 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 472 ucggcguccg cccgagucct t 21 <210> 473 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 473 ggacucgggc ggacgccgat t 21 <210> 474 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 474 gcguccgccc gaguccccgt t 21 <210> 475 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 475 cggggacucg ggcggacgct t 21 <210> 476 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 476 cguccgcccg aguccccgct t 21 <210> 477 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 477 gcggggacuc gggcggacgt t 21 <210> 478 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 478 gcccgagucc ccgccucgct t 21 <210> 479 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 479 gcgaggcggg gacucgggct t 21 <210> 480 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 480 aacgccacaa ccaccgcgct t 21 <210> 481 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 481 gcgcgguggu uguggcguut t 21 <210> 482 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 482 acgccacaac caccgcgcat t 21 <210> 483 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 483 ugcgcggugg uuguggcgut t 21 <210> 484 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 484 cgccacaacc accgcgcact t 21 <210> 485 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 485 gugcgcggug guuguggcgt t 21 <210> 486 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 486 ccacaaccac cgcgcacggt t 21 <210> 487 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 487 ccgugcgcgg ugguuguggt t 21 <210> 488 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 488 cacaaccacc gcgcacggct t 21 <210> 489 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 489 gccgugcgcg gugguugugt t 21 <210> 490 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 490 acaaccaccg cgcacggcct t 21 <210> 491 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 491 ggccgugcgc ggugguugut t 21 <210> 492 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 492 augcgacccu ccgggacggt t 21 <210> 493 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 493 ccgucccgga gggucgcaut t 21 <210> 494 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 494 ugcgacccuc cgggacggct t 21 <210> 495 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 495 gccgucccgg agggucgcat t 21 <210> 496 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 496 gcgacccucc gggacggcct t 21 <210> 497 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 497 ggccgucccg gagggucgct t 21 <210> 498 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 498 gacccuccgg gacggccggt t 21 <210> 499 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 499 ccggccgucc cggaggguct t 21 <210> 500 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 500 acccuccggg acggccgggt t 21 <210> 501 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 501 cccggccguc ccggagggut t 21 <210> 502 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 502 ccuccgggac ggccggggct t 21 <210> 503 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 503 gccccggccg ucccggaggt t 21 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 504 agaaaguuug ccaaggcact t 21 <210> 505 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 505 gugccuuggc aaacuuucut t 21 <210> 506 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 506 gaaaguuugc caaggcacgt t 21 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 507 cgugccuugg caaacuuuct t 21 <210> 508 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 508 aaguuugcca aggcacgagt t 21 <210> 509 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 509 cucgugccuu ggcaaacuut t 21 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 510 aguuugccaa ggcacgagut t 21 <210> 511 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 511 acucgugccu uggcaaacut t 21 <210> 512 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 512 guuugccaag gcacgaguat t 21 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 513 uacucgugcc uuggcaaact t 21 <210> 514 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 514 uuugccaagg cacgaguaat t 21 <210> 515 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 515 uuacucgugc cuuggcaaat t 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 516 uugccaaggc acgaguaact t 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 517 guuacucgug ccuuggcaat t 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 ugccaaggca cgaguaacat t 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 519 uguuacucgu gccuuggcat t 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 gccaaggcac gaguaacaat t 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 uuguuacucg ugccuuggct t 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 522 acgcaguugg gcacuuuugt t 21 <210> 523 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 523 caaaagugcc caacugcgut t 21 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 524 cgcaguuggg cacuuuugat t 21 <210> 525 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 525 ucaaaagugc ccaacugcgt t 21 <210> 526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 526 gcaguugggc acuuuugaat t 21 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 527 uucaaaagug cccaacugct t 21 <210> 528 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 528 caguugggca cuuuugaagt t 21 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 529 cuucaaaagu gcccaacugt t 21 <210> 530 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 530 aguugggcac uuuugaagat t 21 <210> 531 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 531 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 560 uucaauaacu gugagguggt t 21 <210> 561 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 561 ccaccucaca guuauugaat t 21 <210> 562 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 562 ucaauaacug ugagguggut t 21 <210> 563 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 563 accaccucac aguuauugat t 21 <210> 564 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 564 caauaacugu gaggugguct t 21 <210> 565 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 565 gaccaccuca caguuauugt t 21 <210> 566 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 566 aauaacugug agguggucct t 21 <210> 567 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 567 ggaccaccuc acaguuauut t 21 <210> 568 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 568 auaacuguga ggugguccut t 21 <210> 569 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 569 aggaccaccu cacaguuaut t 21 <210> 570 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 570 uaacugugag gugguccuut t 21 <210> 571 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 571 aaggaccacc ucacaguuat t 21 <210> 572 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 584 gggaauuugg aaauuaccut t 21 <210> 585 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 585 agguaauuuc caaauuccct t 21 <210> 586 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 586 ggaauuugga aauuaccuat t 21 <210> 587 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 587 uagguaauuu ccaaauucct t 21 <210> 588 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 588 agaggaauua ugaucuuuct t 21 <210> 589 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 589 gaaagaucau aauuccucut t 21 <210> 590 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 590 gaggaauuau gaucuuucct t 21 <210> 591 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 591 ggaaagauca uaauuccuct t 21 <210> 592 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 592 aauuaugauc uuuccuucut t 21 <210> 593 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 593 agaaggaaag aucauaauut t 21 <210> 594 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 594 auuaugaucu uuccuucuut t 21 <210> 595 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 595 aagaaggaaa gaucauaaut t 21 <210> 596 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 596 uaugaucuuu ccuucuuaat t 21 <210> 597 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 597 uuaagaagga aagaucauat t 21 <210> 598 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 598 ugaucuuucc uucuuaaagt t 21 <210> 599 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 599 cuuuaagaag gaaagaucat t 21 <210> 600 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 600 ucuuuccuuc uuaaagacct t 21 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 601 ggucuuuaag aaggaaagat t 21 <210> 602 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 602 ccuucuuaaa gaccauccat t 21 <210> 603 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 603 uggauggucu uuaagaaggt t 21 <210> 604 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 604 cuucuuaaag accauccagt t 21 <210> 605 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 605 cuggaugguc uuuaagaagt t 21 <210> 606 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 606 ucuuaaagac cauccaggat t 21 <210> 607 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 607 uccuggaugg ucuuuaagat t 21 <210> 608 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 608 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 625 ugaggacaua accagccact t 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 626 gcccucaaca caguggagct t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 627 gcuccacugu guugagggct t 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 628 uuccuuugga aaaccugcat t 21 <210> 629 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 637 cucugaugau cugcagguut t 21 <210> 638 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 638 cugcagauca ucagaggaat t 21 <210> 639 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 639 uuccucugau gaucugcagt t 21 <210> 640 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 640 gaaaauuccu augccuuagt t 21 <210> 641 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 641 cuaaggcaua ggaauuuuct t 21 <210> 642 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 642 aaaauuccua ugccuuagct t 21 <210> 643 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 643 gcuaaggcau aggaauuuut t 21 <210> 644 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 644 aauuccuaug ccuuagcagt t 21 <210> 645 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 645 cugcuaaggc auaggaauut t 21 <210> 646 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 646 uccuaugccu uagcagucut t 21 <210> 647 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 647 agacugcuaa ggcauaggat t 21 <210> 648 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 648 ccuaugccuu agcagucuut t 21 <210> 649 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 649 aagacugcua aggcauaggt t 21 <210> 650 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 650 cuaugccuua gcagucuuat t 21 <210> 651 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 651 uaagacugcu aaggcauagt t 21 <210> 652 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 652 augccuuagc agucuuauct t 21 <210> 653 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 653 gauaagacug cuaaggcaut t 21 <210> 654 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 654 ugccuuagca gucuuaucut t 21 <210> 655 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 655 agauaagacu gcuaaggcat t 21 <210> 656 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 656 gccuuagcag ucuuaucuat t 21 <210> 657 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 661 guuagauaag acugcuaagt t 21 <210> 662 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 662 uuagcagucu uaucuaacut t 21 <210> 663 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 663 aguuagauaa gacugcuaat t 21 <210> 664 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 664 uagcagucuu aucuaacuat t 21 <210> 665 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 665 uaguuagaua agacugcuat t 21 <210> 666 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 666 agcagucuua ucuaacuaut t 21 <210> 667 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 667 auaguuagau aagacugcut t 21 <210> 668 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 668 gcagucuuau cuaacuaugt t 21 <210> 669 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 669 cauaguuaga uaagacugct t 21 <210> 670 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 670 cagucuuauc uaacuaugat t 21 <210> 671 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 671 ucauaguuag auaagacugt t 21 <210> 672 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 672 ucuuaucuaa cuaugaugct t 21 <210> 673 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 673 gcaucauagu uagauaagat t 21 <210> 674 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 674 cuuaucuaac uaugaugcat t 21 <210> 675 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 675 ugcaucauag uuagauaagt t 21 <210> 676 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 676 uuaucuaacu augaugcaat t 21 <210> 677 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 677 uugcaucaua guuagauaat t 21 <210> 678 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 678 uaucuaacua ugaugcaaat t 21 <210> 679 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 679 uuugcaucau aguuagauat t 21 <210> 680 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 680 aucuaacuau gaugcaaaut t 21 <210> 681 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 714 ggaaauccug cauggcgcct t 21 <210> 715 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 715 ggcgccaugc aggauuucct t 21 <210> 716 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 716 gaaauccugc auggcgccgt t 21 <210> 717 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 717 cggcgccaug caggauuuct t 21 <210> 718 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 718 aaauccugca uggcgccgut t 21 <210> 719 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 719 acggcgccau gcaggauuut t 21 <210> 720 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 720 aauccugcau ggcgccgugt t 21 <210> 721 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 721 cacggcgcca ugcaggauut t 21 <210> 722 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 722 uccugcaugg cgccgugcgt t 21 <210> 723 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 723 cgcacggcgc caugcaggat t 21 <210> 724 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 724 cugcauggcg ccgugcggut t 21 <210> 725 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 725 accgcacggc gccaugcagt t 21 <210> 726 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 726 ugcauggcgc cgugcgguut t 21 <210> 727 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 727 aaccgcacgg cgccaugcat t 21 <210> 728 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 728 gcauggcgcc gugcgguuct t 21 <210> 729 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 729 gaaccgcacg gcgccaugct t 21 <210> 730 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 734 ggcgccgugc gguucagcat t 21 <210> 735 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 735 ugcugaaccg cacggcgcct t 21 <210> 736 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 736 gcgccgugcg guucagcaat t 21 <210> 737 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 737 uugcugaacc gcacggcgct t 21 <210> 738 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 738 cgccgugcgg uucagcaact t 21 <210> 739 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 739 guugcugaac cgcacggcgt t 21 <210> 740 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 740 gccgugcggu ucagcaacat t 21 <210> 741 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 741 uguugcugaa ccgcacggct t 21 <210> 742 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 742 ccgugcgguu cagcaacaat t 21 <210> 743 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 743 uuguugcuga accgcacggt t 21 <210> 744 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 744 gugcgguuca gcaacaacct t 21 <210> 745 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 745 gguuguugcu gaaccgcact t 21 <210> 746 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 746 gcgguucagc aacaacccut t 21 <210> 747 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 747 aggguuguug cugaaccgct t 21 <210> 748 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 748 gguucagcaa caacccugct t 21 <210> 749 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 749 gcaggguugu ugcugaacct t 21 <210> 750 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 750 gcaacaaccc ugcccugugt t 21 <210> 751 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 751 cacagggcag gguuguugct t 21 <210> 752 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 752 aacaacccug cccugugcat t 21 <210> 753 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 753 ugcacagggc aggguuguut t 21 <210> 754 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 754 acguggagag cauccagugt t 21 <210> 755 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 755 cacuggaugc ucuccacgut t 21 <210> 756 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 756 cguggagagc auccaguggt t 21 <210> 757 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 757 ccacuggaug cucuccacgt t 21 <210> 758 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 758 guggagagca uccaguggct t 21 <210> 759 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 759 gccacuggau gcucuccact t 21 <210> 760 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 760 gagagcaucc aguggcgggt t 21 <210> 761 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 761 cccgccacug gaugcucuct t 21 <210> 762 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 762 agagcaucca guggcgggat t 21 <210> 763 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 763 ucccgccacu ggaugcucut t 21 <210> 764 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 764 gagcauccag uggcgggact t 21 <210> 765 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 765 gucccgccac uggaugcuct t 21 <210> 766 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 766 caguggcggg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 779 aguccaucga cauguugcut t 21 <210> 780 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 780 gcaacauguc gauggacuut t 21 <210> 781 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 781 aaguccaucg acauguugct t 21 <210> 782 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 782 aacaugucga uggacuucct t 21 <210> 783 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 791 gguucuggaa guccaucgat t 21 <210> 792 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 792 gaaccaccug ggcagcugct t 21 <210> 793 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 793 gcagcugccc aggugguuct t 21 <210> 794 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 794 gggcagcugc caaaagugut t 21 <210> 795 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 795 acacuuuugg cagcugccct t 21 <210> 796 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 796 gcagcugcca aaagugugat t 21 <210> 797 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 797 ucacacuuuu ggcagcugct t 21 <210> 798 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 798 ugccaaaagu gugauccaat t 21 <210> 799 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 799 uuggaucaca cuuuuggcat t 21 <210> 800 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 800 gccaaaagug ugauccaagt t 21 <210> 801 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 801 cuuggaucac acuuuuggct t 21 <210> 802 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 802 ccaaaagugu gauccaagct t 21 <210> 803 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 803 gcuuggauca cacuuuuggt t 21 <210> 804 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 804 aaagugugau ccaagcugut t 21 <210> 805 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 805 acagcuugga ucacacuuut t 21 <210> 806 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 806 ugugauccaa gcugucccat t 21 <210> 807 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 811 cauugggaca gcuuggauct t 21 <210> 812 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 812 auccaagcug ucccaauggt t 21 <210> 813 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 813 ccauugggac agcuuggaut t 21 <210> 814 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 814 uccaagcugu cccaaugggt t 21 <210> 815 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 815 cccauuggga cagcuuggat t 21 <210> 816 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 816 ccaagcuguc ccaaugggat t 21 <210> 817 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 817 ucccauuggg acagcuuggt t 21 <210> 818 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 818 caagcugucc caaugggagt t 21 <210> 819 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 819 cucccauugg gacagcuugt t 21 <210> 820 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 820 agcuguccca augggagcut t 21 <210> 821 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 821 agcucccauu gggacagcut t 21 <210> 822 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 822 ugucccaaug ggagcugcut t 21 <210> 823 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 823 agcagcuccc auugggacat t 21 <210> 824 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 824 ggugcaggag aggagaacut t 21 <210> 825 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 825 aguucuccuc uccugcacct t 21 <210> 826 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 826 aaacugacca aaaucaucut t 21 <210> 827 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 827 agaugauuuu ggucaguuut t 21 <210> 828 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 828 aacugaccaa aaucaucugt t 21 <210> 829 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 829 cagaugauuu uggucaguut t 21 <210> 830 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 830 acugaccaaa aucaucugut t 21 <210> 831 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 831 acagaugauu uuggucagut t 21 <210> 832 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 832 accaaaauca ucugugccct t 21 <210> 833 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 833 gggcacagau gauuuuggut t 21 <210> 834 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 834 ccaaaaucau cugugcccat t 21 <210> 835 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 835 ugggcacaga ugauuuuggt t 21 <210> 836 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 836 aaaucaucug ugcccagcat t 21 <210> 837 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 837 ugcugggcac agaugauuut t 21 <210> 838 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 838 gugcccagca gugcuccggt t 21 <210> 839 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 839 ccggagcacu gcugggcact t 21 <210> 840 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 840 gcccagcagu gcuccgggct t 21 <210> 841 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 841 gcccggagca cugcugggct t 21 <210> 842 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 842 ccagugacug cugccacaat t 21 <210> 843 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 843 uuguggcagc agucacuggt t 21 <210> 844 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 844 cagugacugc ugccacaact t 21 <210> 845 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 845 guuguggcag cagucacugt t 21 <210> 846 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 846 gagagcgacu gccuggucut t 21 <210> 847 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 847 agaccaggca gucgcucuct t 21 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 856 cgacugccug gucugccgct t 21 <210> 857 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 857 gcggcagacc aggcagucgt t 21 <210> 858 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 858 gccuggucug ccgcaaauut t 21 <210> 859 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 859 aauuugcggc agaccaggct t 21 <210> 860 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 864 uggucugccg caaauuccgt t 21 <210> 865 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 865 cggaauuugc ggcagaccat t 21 <210> 866 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 866 gucugccgca aauuccgagt t 21 <210> 867 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 867 cucggaauuu gcggcagact t 21 <210> 868 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 868 ucugccgcaa auuccgagat t 21 <210> 869 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 869 ucucggaauu ugcggcagat t 21 <210> 870 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 870 cugccgcaaa uuccgagact t 21 <210> 871 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 871 gucucggaau uugcggcagt t 21 <210> 872 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 872 ugccgcaaau uccgagacgt t 21 <210> 873 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 873 cgucucggaa uuugcggcat t 21 <210> 874 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 874 ccgcaaauuc cgagacgaat t 21 <210> 875 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 875 uucgucucgg aauuugcggt t 21 <210> 876 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 876 aauuccgaga cgaagccact t 21 <210> 877 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 877 guggcuucgu cucggaauut t 21 <210> 878 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 878 auuccgagac gaagccacgt t 21 <210> 879 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 879 cguggcuucg ucucggaaut t 21 <210> 880 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 880 uuccgagacg aagccacgut t 21 <210> 881 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 881 acguggcuuc gucucggaat t 21 <210> 882 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 882 uccgagacga agccacgugt t 21 <210> 883 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 883 cacguggcuu cgucucggat t 21 <210> 884 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 884 ccgagacgaa gccacgugct t 21 <210> 885 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 885 gcacguggcu ucgucucggt t 21 <210> 886 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 886 gagacgaagc cacgugcaat t 21 <210> 887 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 887 uugcacgugg cuucgucuct t 21 <210> 888 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 888 acgaagccac gugcaaggat t 21 <210> 889 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 889 uccuugcacg uggcuucgut t 21 <210> 890 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 890 cgaagccacg ugcaaggact t 21 <210> 891 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 891 guccuugcac guggcuucgt t 21 <210> 892 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 892 gaagccacgu gcaaggacat t 21 <210> 893 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 893 uguccuugca cguggcuuct t 21 <210> 894 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 894 aagccacgug caaggacact t 21 <210> 895 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 895 guguccuugc acguggcuut t 21 <210> 896 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 896 ccccacucau gcucuacaat t 21 <210> 897 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 897 uuguagagca ugaguggggt t 21 <210> 898 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 898 ccacucaugc ucuacaacct t 21 <210> 899 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 899 gguuguagag caugaguggt t 21 <210> 900 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 900 acucaugcuc uacaacccct t 21 <210> 901 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 901 gggguuguag agcaugagut t 21 <210> 902 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 902 caugcucuac aaccccacct t 21 <210> 903 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 903 ggugggguug uagagcaugt t 21 <210> 904 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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oligonucleotide <400> 908 gauggaugug aaccccgagt t 21 <210> 909 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 909 cucgggguuc acauccauct t 21 <210> 910 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 910 auggauguga accccgaggt t 21 <210> 911 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 911 ccucgggguu cacauccaut t 21 <210> 912 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 912 ggaugugaac cccgagggct t 21 <210> 913 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 913 gcccucgggg uucacaucct t 21 <210> 914 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 914 gaugugaacc ccgagggcat t 21 <210> 915 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 915 ugcccucggg guucacauct t 21 <210> 916 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 916 ugugaacccc gagggcaaat t 21 <210> 917 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 917 uuugcccucg ggguucacat t 21 <210> 918 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 918 aaccccgagg gcaaauacat t 21 <210> 919 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 919 uguauuugcc cucgggguut t 21 <210> 920 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 920 accccgaggg caaauacagt t 21 <210> 921 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 921 cuguauuugc ccucggggut t 21 <210> 922 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 922 cccgagggca aauacagcut t 21 <210> 923 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 923 agcuguauuu gcccucgggt t 21 <210> 924 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 924 ccgagggcaa auacagcuut t 21 <210> 925 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 925 aagcuguauu ugcccucggt t 21 <210> 926 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 926 cgagggcaaa uacagcuuut t 21 <210> 927 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 927 aaagcuguau uugcccucgt t 21 <210> 928 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 928 aaauacagcu uuggugccat t 21 <210> 929 <211> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 933 gguggcacca aagcuguaut t 21 <210> 934 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 934 cuuuggugcc accugcgugt t 21 <210> 935 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 935 cacgcaggug gcaccaaagt t 21 <210> 936 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 936 uuggugccac cugcgugaat t 21 <210> 937 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 937 uucacgcagg uggcaccaat t 21 <210> 938 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 938 ccaccugcgu gaagaagugt t 21 <210> 939 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 939 cacuucuuca cgcagguggt t 21 <210> 940 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 940 cugcgugaag aaguguccct t 21 <210> 941 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 945 cggggacacu ucuucacgct t 21 <210> 946 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 946 cgugaagaag uguccccgut t 21 <210> 947 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 947 acggggacac uucuucacgt t 21 <210> 948 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 948 gugaagaagu guccccguat t 21 <210> 949 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 949 uacggggaca cuucuucact t 21 <210> 950 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 950 ugaagaagug uccccguaat t 21 <210> 951 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 951 uuacggggac acuucuucat t 21 <210> 952 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 952 gaagaagugu ccccguaaut t 21 <210> 953 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 953 auuacgggga cacuucuuct t 21 <210> 954 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 954 aagaaguguc cccguaauut t 21 <210> 955 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 955 aauuacgggg acacuucuut t 21 <210> 956 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 956 agaagugucc ccguaauuat t 21 <210> 957 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 957 uaauuacggg gacacuucut t 21 <210> 958 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 958 gaaguguccc cguaauuaut t 21 <210> 959 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 959 auaauuacgg ggacacuuct t 21 <210> 960 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 960 aagugucccc guaauuaugt t 21 <210> 961 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 961 cauaauuacg gggacacuut t 21 <210> 962 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 962 aguguccccg uaauuaugut t 21 <210> 963 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 963 acauaauuac ggggacacut t 21 <210> 964 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 964 guguccccgu aauuaugugt t 21 <210> 965 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 969 accacauaau uacggggact t 21 <210> 970 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 970 ccccguaauu auguggugat t 21 <210> 971 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 971 ucaccacaua auuacggggt t 21 <210> 972 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 972 ccguaauuau guggugacat t 21 <210> 973 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 973 ugucaccaca uaauuacggt t 21 <210> 974 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 974 guaauuaugu ggugacagat t 21 <210> 975 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 975 ucugucacca cauaauuact t 21 <210> 976 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 976 uaauuaugug gugacagaut t 21 <210> 977 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 977 aucugucacc acauaauuat t 21 <210> 978 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 978 aauuaugugg ugacagauct t 21 <210> 979 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 979 gaucugucac cacauaauut t 21 <210> 980 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 980 auuauguggu gacagaucat t 21 <210> 981 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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oligonucleotide <400> 985 ccgugaucug ucaccacaut t 21 <210> 986 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 986 uggugacaga ucacggcuct t 21 <210> 987 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 987 gagccgugau cugucaccat t 21 <210> 988 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 988 gugacagauc acggcucgut t 21 <210> 989 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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21 <210> 1002 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1002 aucacggcuc gugcguccgt t 21 <210> 1003 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1003 cggacgcacg agccgugaut t 21 <210> 1004 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1004 ucacggcucg ugcguccgat t 21 <210> 1005 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1005 ucggacgcac gagccgugat t 21 <210> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1022 gacggcgucc gcaaguguat t 21 <210> 1023 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1023 uacacuugcg gacgccguct t 21 <210> 1024 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1024 acggcguccg caaguguaat t 21 <210> 1025 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1025 uuacacuugc ggacgccgut t 21 <210> 1026 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1082 aauagguauu ggugaauuut t 21 <210> 1083 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1083 aaauucacca auaccuauut t 21 <210> 1084 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1084 auagguauug gugaauuuat t 21 <210> 1085 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1085 uaaauucacc aauaccuaut t 21 <210> 1086 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1086 agguauuggu gaauuuaaat t 21 <210> 1087 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1087 uuuaaauuca ccaauaccut t 21 <210> 1088 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1088 gguauuggug aauuuaaagt t 21 <210> 1089 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1089 cuuuaaauuc accaauacct t 21 <210> 1090 <211> 21 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1154 ucuggaucca caggaacugt t 21 <210> 1155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1155 caguuccugu ggauccagat t 21 <210> 1156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1156 gauccacagg aacuggauat t 21 <210> 1157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1157 uauccaguuc cuguggauct t 21 <210> 1158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1158 auccacagga acuggauaut t 21 <210> 1159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1159 auauccaguu ccuguggaut t 21 <210> 1160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1160 ccacaggaac uggauauuct t 21 <210> 1161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1161 gaauauccag uuccuguggt t 21 <210> 1162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1162 cacaggaacu ggauauucut t 21 <210> 1163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1163 agaauaucca guuccugugt t 21 <210> 1164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1164 acuggauauu cugaaaacct t 21 <210> 1165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1165 gguuuucaga auauccagut t 21 <210> 1166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1166 auucugaaaa ccguaaaggt t 21 <210> 1167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1167 ccuuuacggu uuucagaaut t 21 <210> 1168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1168 uucugaaaac cguaaaggat t 21 <210> 1169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1169 uccuuuacgg uuuucagaat t 21 <210> 1170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1170 ugaaaaccgu aaaggaaaut t 21 <210> 1171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1171 auuuccuuua cgguuuucat t 21 <210> 1172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1172 gaaaaccgua aaggaaauct t 21 <210> 1173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1173 gauuuccuuu acgguuuuct t 21 <210> 1174 <211> 23 <212> RNA <213> Homo 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<223> Description of Unknown: Beta-catenin target sequence <400> 1183 acgacuaguu caguugcuuu u 21 <210> 1184 <211> 21 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Beta-catenin target sequence <400> 1184 aagcaacuga acuagucguu u 21 <210> 1185 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1185 tgctgttgac agtgagcgcc agctcaaagc aatttctaca tagtgaagcc acagatgtat 60 gtagaaattg ctttgagctg ttgcctactg cctcgga 97 <210> 1186 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1186 tgctgttgac agtgagcgaa aggatgaaac acaaaaggta tagtgaagcc acagatgtat 60 accttttgtg tttcatcctt ctgcctactg cctcgga 97 <210> 1187 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1187 tgctgttgac agtgagcgcc atgtcagagt tactgtttca tagtgaagcc acagatgtat 60 gaaacagtaa ctctgacatg atgcctactg cctcgga 97 <210> 1188 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1188 tgctgttgac agtgagcgca actagttcat ttcaaaatta tagtgaagcc acagatgtat 60 aattttgaaa tgaactagtt ttgcctactg cctcgga 97 <210> 1189 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1189 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<212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1195 uguagaaauu gcuuugagcu gu 22 <210> 1196 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1196 agcucaaagc aauuucuaca ua 22 <210> 1197 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1197 uaccuuuugu guuucauccu uc 22 <210> 1198 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1198 aggaugaaac acaaaaggua ua 22 <210> 1199 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1199 ugaaacagua acucugacau ga 22 <210> 1200 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1200 augucagagu uacuguuuca ua 22 <210> 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1212 agcuugaaga ugaaacacga ua 22 <210> 1213 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1213 uaauucgugu uuucuuuggu gg 22 <210> 1214 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1214 accaaagaaa acacgaauua ua 22 <210> 1215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1215 acucgugccu uggcaaacuu u 21 <210> 1216 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1216 aguuugccaa ggcacgaguu u 21 <210> 1217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1217 acucgugccu uggcaaacuu u 21 <210> 1218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1218 aguuugccaa ggcacgaguu u 21 <210> 1219 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1219 acucgugccu uggcaaacuu u 21 <210> 1220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1220 aguuugccaa ggcacgaguu u 21 <210> 1221 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1221 ugaauuagcu guaucgucau u 21 <210> 1222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1222 tgacgauaca gcuaauucau u 21 <210> 1223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1223 ugaauuagcu guaucgucau u 21 <210> 1224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1224 ugacgauaca gcuaauucau u 21 <210> 1225 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1225 ugaauuagcu guaucgucau u 21 <210> 1226 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1226 ugacgauaca gcuaauucau u 21 <210> 1227 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1227 uaaguauagg uccucauuau u 21 <210> 1228 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1228 uaaugaggac cuauacuuau u 21 <210> 1229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1229 tuucgaauca auccaacagu u 21 <210> 1230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1230 cuguuggauu gauucgaaau u 21 <210> 1231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1231 uuucgaauca auccaacagu u 21 <210> 1232 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1232 cuguuggauu gauucgaaau u 21 <210> 1233 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1233 uuucgaauca auccaacagu u 21 <210> 1234 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1234 cuguuggauu gauucgaaau u 21 <210> 1235 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1235 auaaaaucua cagucauagu u 21 <210> 1236 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1236 cuaugacugu agauuuuauu u 21 <210> 1237 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1237 uuaaaaucua cagucauagu u 21 <210> 1238 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1238 cuaugacugu agauuuuaau u 21 <210> 1239 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1239 uuaaaaucua cagucauagu u 21 <210> 1240 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1240 cuaugacugu agauuuuaau u 21 <210> 1241 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1241 gagagcucca uagugacacu u 21 <210> 1242 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1242 gugucacuau ggagcucucu u 21 <210> 1243 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1243 Cys Gly Ile Phe Gly Glu Ile Glu Glu Leu Ile Glu Glu Gly Leu Glu 1 5 10 15 Asn Leu Ile Asp Trp Gly Asn Ala 20 <210> 1244 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1244 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Cys 20 <210> 1245 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1245 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Trp Asp Tyr Gly Ser Gly Ser Cys Gly 20 25 <210> 1246 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1246 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 20 <210> 1247 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1247 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Trp Asp Tyr Gly Ser Gly Ser Cys Lys 20 25 <210> 1248 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1248 Cys Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln 20 25 <210> 1249 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1249 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 1250 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1250 Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Leu Leu Lys Asn Ile Phe 1 5 10 <210> 1251 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1251 Phe Phe Gly His Leu Phe Lys Leu Ala Thr Lys Ile Ile Pro Ser Leu 1 5 10 15 Phe Gln <210> 1252 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1252 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 1253 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1253 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala 1 5 10 15 His Ser Lys <210> 1254 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1254 Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr 1 5 10 15 Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp 20 25 <210> 1255 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1255 Cys Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Tyr Leu 1 5 10 15 Ile <210> 1256 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1256 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 1257 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1257 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ile Leu 20 <210> 1258 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1258 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala <210> 1259 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1259 His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu 1 5 10 15 Ile Arg Ala Phe 20 <210> 1260 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1260 Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu 1 5 10 15 Leu Trp Arg Ala 20 <210> 1261 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1261 Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala 20 25 30 <210> 1262 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1262 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Cys 20 <210> 1263 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1263 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 20 <210> 1264 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1264 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met 20 25 30 Lys Trp Lys Lys 35 <210> 1265 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1265 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Ser Ser Lys Lys Lys Lys 20 25 <210> 1266 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1266 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Gly Gly Tyr Cys 20 <210> 1267 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1267 Gly Leu Phe His Ala Ile Ala His Phe Ile His Gly Gly Trp His Gly 1 5 10 15 Leu Ile His Gly Trp Tyr Gly 20 <210> 1268 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1268 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala 20 25 30 <210> 1269 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1269 Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr 1 5 10 15 Thr Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 25 <210> 1270 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1270 Gly Gly Phe Gly 1 <210> 1271 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1271 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 1272 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1272 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 1273 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1273 uuauuauuug uucuuugccu u 21 <210> 1274 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1274 uuacauuaaa gucuguuguu u 21 <210> 1275 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1275 uuaaaaucua cagucauagu u 21 <210> 1276 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1276 Glu Ala Phe Gln 1 <210> 1277 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1277 Cys Gly Ile Phe Gly Glu Ile Glu Glu Leu Ile Glu Glu Gly Leu Glu 1 5 10 15 Asn Leu Ile Asp Trp Gly Asn Gly 20

Claims (68)

  1. 하기 식 I의 분자:
    A-X-B-Y-C
    식 I
    여기서,
    A는 결합 모이어티이고;
    B는 폴리뉴클레오티드이고;
    C는 중합체이고;
    X는 결합 또는 제1 비중합체 링커이고;
    Y는 결합 또는 제2 링커이고;
    상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드를 포함하고;
    A 및 C는 동일한 말단에서 B에 부착되지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간(internucleotide) 연결, 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 추가로 포함하는 것인 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 위치하는 것인 분자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결에 위치하는 것인 분자.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 2'-위치에서 추가로 변형되는 것인 분자.
  6. 제5항에 있어서, 2'-변형이 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'에톡시에틸(2'-O-EOE), 2'-O-(2-N-메틸카르바모일에틸), PEG1 또는 PEG2 변형된 뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 분자.
  7. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 분자:
    Figure pct00158

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이다.
  8. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 분자:
    Figure pct00159

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 분자:
    Figure pct00160

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 분자:
    Figure pct00161

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R6은 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)으로부터 선택되는 것인 분자.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 분자:
    Figure pct00162

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 분자:
    Figure pct00163

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기의 것인 분자:
    Figure pct00164

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R6은 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  15. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로디아미데이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 아미드 연결을 포함하는 것인 분자.
  16. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티가 적어도 하나의 말단인 분자.
  17. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥을 포함하는 것인 분자.
  18. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 분자.
  19. 제18항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형을 포함하는 것인 분자.
  20. 제18항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 RNA 분자인 분자.
  21. 제18항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 16-75, 452-1955, 1956-1962, 1967-2002, 2013-2032, 2082-2109, 또는 2117에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 분자.
  22. 제18항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 16-75, 452-1955, 1956-1962, 1967-2002, 2013-2032, 2082-2109, 또는 2117에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 분자.
  23. 제1항에 있어서, X 및 Y가 독립적으로 결합인 분자.
  24. 제1항에 있어서, X 및 Y가 독립적으로 C1-C6 알킬기인 분자.
  25. 제1항에 있어서, X가, 선택적으로 C1-C6 알킬기에 접합된, 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커인 분자.
  26. 제1항에 있어서, Y가 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커인 분자.
  27. 제1항에 있어서, 결합 모이어티가 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단일쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 것인 분자.
  28. 제1항에 있어서, 결합 모이어티가 펩티드 또는 소분자를 포함하는 것인 분자.
  29. 제1항에 있어서, C가 폴리에틸렌 글리콜인 분자.
  30. 제17항에 있어서, C가 약 1000 Da, 2000 Da 또는 5000 Da의 분자량을 갖는 것인 분자.
  31. 제1항에 있어서, A-X가 B의 5' 말단에 접합되고; Y-C는 B의 3' 말단에 접합되거나 또는 Y-C는 B의 5' 말단에 접합되고; A-X는 B의 3' 말단에 접합되는 것인 분자.
  32. 제1항에 있어서, D를 추가로 포함하고, 여기서 D는 엔도솜 분해성(endosomolytic) 모이어티 인 분자.
  33. 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드를 포함하는, 식 II의 올리고뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결 또는 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티를 추가로 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  35. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 위치하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  36. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 위치하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  37. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 3'-말단 또는 5'-말단에 위치하지 않는 것인 올리고뉴클레오티드.
  38. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결에 위치하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  39. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 2'-위치에서 추가로 변형되고, 여기서 2'-변형이 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드.
  40. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00165

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이다.
  41. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00166

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  42. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00167

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  43. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00168

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R6은 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  44. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 잠금 핵산(LNA) 또는 에틸렌 핵산(ENA)으로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드.
  45. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00169

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  46. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00170

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  47. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 5'-비닐포스포네이트 변형된 비천연 뉴클레오티드가 하기의 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00171

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이고;
    R6은 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 아미노알킬로부터 선택되고;
    J는 폴리뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드에 연결되는 뉴클레오티드간 연결기이다.
  48. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로디아미데이트 연결, 메틸포스포네이트 연결 또는 아미드 연결을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  49. 제34항에 있어서, 적어도 하나의 반전된 무염기 모이어티가 적어도 하나의 말단에 존재하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  50. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥인 올리고뉴클레오티드.
  51. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥인 올리고뉴클레오티드.
  52. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 100개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  53. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 90개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  54. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 80개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  55. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 70개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  56. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 60개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  57. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 50개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  58. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 40개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  59. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  60. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 20개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  61. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 2 내지 약 10개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  62. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 8 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  63. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 10 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  64. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 14 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  65. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 18 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  66. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 22 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  67. 제33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 길이가 26 내지 약 30개의 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  68. 하기 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 합성에 적합한 화합물:
    Figure pct00172

    Figure pct00173

    여기서, B는 헤테로시클릭 염기 모이어티이다.
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