PL169576B1

PL169576B1 - Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL

Info

Publication number: PL169576B1
Application number: PL91298867A
Authority: PL
Inventors: Fritz Eckstein; Wolfgang A Pieken; Fritz Benseler; David B Olsen; David M Williams; Olaf Heidenreich
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-09-23
Publication date: 1996-08-30
Also published as: DE69123979T2; WO1992007065A1; EP0552178B1; ES2061416T1; JP3257675B2; US5698687A; AU8613991A; EP0552178A1; CA2093664C; DE552178T1; JPH06501842A; CA2093664A1; AU649074B2; GR930300130T1; JP2002101893A; US6890908B1; DE69123979D1; US5672695A; ES2061416T3; ATE147098T1

Abstract

1. Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej, znamienny tym, ze przeprowadza sie synteze lancucha RNA i wlacza sie co najmniej jeden zmodyfi- kowany nukleotyd, w którym grupe wodorotlenowa w pozycji 2' cukru rybozy zastapiono grupa modyfikujaca, wybrana sposród chlorowców, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej i grup aminowych, podstawionych w jednej lub dwóch pozycjach. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej.

Pewne naturalnie występujące kwasy rybonukleinowe (RNA) ulegają samodzielnemu cięciu. Pierwszym opisanym przykładem było cięcie prekursora rybosomalnego RNA pierwotniaka Tetrahymena (patrz praca przeglądowa Cech, Ann-Rev.Biochem. 59 (1990), 543-568), które wymaga guanozyny jako kofaktora.

Następnie odkryto szereg przykładów cięcia RNA w wiroidach, wirusoidach i satelitarnych RNA (patrz prace przeglądowe Sheldon i wsp. Nucleic Acids and Molecular Biology (1990) tom 4, str. 227-242, wyd.F.Eckstein i D.M.J. Lilley, Springer Verlag Berlin Heidelberg; Symons, TEBS 14 (1989), 445-450). Cięcia te obejmują specyficzne miejscowo pęknięcie wiązania fosfodwuestrowego w obecności dwuwartościowego kationu takiego jak Mg +, w wyniku którego powstają końce fosfodwuestrowe 5'-wodorotlenowy i 2',3'-cykliczny. Analiza sekwencji wokół miejsca samodzielnego cięcia kilku takich RNA stworzyła podstawy do identyfikacji wspólnej cechy strukturalnej istotnej dla procesu cięcia, którą nazwano strukturą obucha młotka (Hutchins i wsp., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 3627-3640). Ta struktura składa się z trzech helis i 13 konserwowanych nukleotydów (ujętych na poniższym schemacie), które tworzą trójwymiarową strukturę odpowiedzialną za zajście cięcia w jednej określonej pozycji. To samokatalizujące się cięcie jest normalnie procesem wewnątrzcząsteczkowym, to znaczy pojedyncza cząsteczka RNA pełni wszystkie funkcje niezbędne do zajścia cięcia. Jednakże Uhlenbeck (Nature 328 (1987), 596-600) wykazał, że ta struktura obucha nie musi być zbudowana z jednej nici, lecz może być utworzona z dwóch nici. Te dwie nici tworzą strukturę obucha, która doprowadza do przecięcia wiązania fosfodwuestrowego (zaznaczonego strzałką) w jednej z nici (nić S), podczas gdy druga (nić E) pozostaje nie zmieniona i może uczestniczyć w wielu reakcjach cięcia. Ta nić odpowiada definicji enzymu i nazwano ją rybozymem. Podczas gdy sekwencje w ramkach (poniższy schemat) są konserwowane, inne mogą różnić się zapewniając tym samym nienaruszalność struktury parujących ze sobą zasad i rejonów jednoniciowych.

Gppp

CG CG „ U A S
'J	@ / C AGGA U
A (^G/	/£7UC CUGGGppp
U GGCCl/	/U/
Ugccgg	^G

169 576

Zbadano dokładnie reakcję przecinania po trójce nukleotydów GUC (Ruffner i wsp., Gene 82 (1989), 31-41; Fedor i Uhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 1668-1672). Skonstruowano również rybozymy o nowych charakterystycznych cechach (Haseloff i Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591), wskazujące, że cięcie może mieć na przykład również miejsce po sekwencjach GUA, GUU, CUC, AUC i UUC. Dalszymi przykładami enzymów RNA są RNA o strukturze spinki do włosów (Hampel i wsp., Nucleic Acids RES. 18 (1990), 299-304), a także RNA zawierający białka jak telomeraza (Greider i Blackburn, Nature 337 (1989), 331-337) i RNaza P (Baer i wsp., w Nucleic Acids and Molecular Biology (1988), tom 3, str. 231-250, wyd. F. Eckstein i D.M.J. Lilley, Springer Verlag, Berlin/Haidelberg. Potencjalnie interesujące jest użycie rybozymów jako środków leczniczych (patrz praca przeglądowa Rossi i Sarver, TIBTECH8(1990), 179-183). Możliwą strategią byłoby zniszczenie RNA niezbędnego dla ekspresji zarówno obcych genów takich jak geny wirusowe jak i odpowiednich genów gospodarza. Wymaga to skonstruowania cząsteczki RNA, która jest zdolna do utworzenia struktury obucha lub spinki do włosów z RNA substratowym i przecięcia go w uprzednio określonym miejscu. Opublikowano pierwsze zastosowanie takiej inhibicji w stosunku do wirusa HIV-I (Sarver i wsp., Science 247 (1990), 1222-1224). Następne przykłady działania rybozymów o strukturze obucha ukierunkowanych na określony substrat in vivo podali Cammeron i Jennings (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1986), 9139-9143) i in vitro Cotten i wsp. (Mol. Cell. Biol. 9 (1989), 4479-4487). Ponadto znane są inne użyteczne właściwości katalityczne rybozomów, na przykład aktywności defosforylazy i transferazy nukleotydylowej (patrz Zgłoszenie Patentowe W088/04300). W zgłoszeniu tym wykazano, że enzymy RNA mają zdolność defosforylacji substratów oligonukleotydowych z wysoką specyficznością w stosunku do sekwencji, co odróżnia je od znanych enzymów białkowych. Cząsteczki RNA mogą również działać jak polimerazy RNA, różniąc się od enzymów białkowych tym, że używają raczej wewnętrznej niż zewnętrznej matrycy. Dzięki temu można konstruować różne heteropolimery używając różnych form enzymu RNA. Umożliwia to tworzenie na przykład cząsteczek matrycowego RNA dla odpowiednich białek lub peptydów. Ponadto Herschlag i Cech (Nature 344, (1990), 405-409) opisali enzym RNA o aktywności DNazy.

Enzym RNA musi być wprowadzony do komórek docelowych, aby mógł służyć jako czynnik leczniczy. A priori istnieją dwie metody wprowadzenia rybozymu do komórek docelowych:

(a) egzogenne dostarczenie uprzednio zsyntetyzowanego RNA;

(b) endogenna transkrypcja genu kodującego rybozym, umieszczonego w plazmidzie.

Duża niedogodność metody (a) polega na bardzo niskiej stabilności cząsteczek RNA w warunkach fizjologicznych z powodu ich szybkiej degradacji przez różne enzymy o aktywności rybonukleolitycznej obecne w żywej komórce. Niedogodności metody (b) wynikają z dużych trudności w specyficznym i stabilnym umieszczeniu genu kodującego rybozym w komórkach wyższych organizmów. Ponadto problem degradacji występuje również w przypadku cząsteczek RNA zsyntetyzowanych in vivo.

Zatem problemem podkreślanym w prezentowanym wynalazku było dostarczenie cząsteczek RNA, posiadających zarówno aktywności katalityczne, jak i podwyższoną odporność na degradację chemiczną i enzymatyczną, których można używać jako czynników leczniczych lub jako biokatalizatorów w procesach biochemicznych lub biotechnologicznych. Z ostatniej publikacji Perreault i wsp. (Nature 344 (1990), 565-567) wiadomo że pewne modyfikacje enzymu RNA, na przykład włączenie 2'-dezoksyrybonukleotydu w kilku miejscach rybozymu powoduje znaczne obniżenie jego aktywności katalitycznej. Obecnie ze zdziwieniem stwierdzono, że pewne chemiczne zmiany w pozycji 2' cukru rybozy, które podnoszą stabilność cząsteczki RNA, nie wpływają w znaczący sposób ani nie niszczą właściwości katalitycznych rybozymów. Zatem przedmiotem prezentowanego wynalazku jest dostarczenie cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej zawierającej przynajmniej jeden zmieniony nukleozyd, w którym grupa wodorotlenowa w pozycji 2' cukru rybozy jest zastąpiona przez grupę modyfikującą, wybraną spośród grup halogenowych, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej albo pojedynczo lub podwójnie podstawionych grup aminowych. Katalityczna aktywność cząsteczki RNA według prezentowanego wynalazku obejmuje, co jest korzystne, przynajmniej jedną z grup o aktywności transferazy

169 576 nukleotydylowej, defosforylazy, deoksyrybonukleazy i endorybonukleazy specyficznej w stosunku do sekwencji. W korzystnym wariancie aktywność katalityczna obejmuje aktywność endorybonukleazy specyficzną w stosunku do sekwencji. W bardziej korzystnym wariancie RNA jest rybozymem o strukturze obuchajak opisano wyżej. W najlepszym przypadku rybozym może być połączony z mną nicią RNA w celu utworzenia struktury obucha złożonej z dwóch nici, gdzie zmodyfikowaną nicią RNA jest nić E jak opisano wyżej. Chociaż rybozym o strukturze obucha jest szczególnie preferowany, prezentowany wynalazek obejmuje również inne enzymy RNA, na przykład rybozym Tetrahymena (Cech, Ann. Rev. Biochem. 59 (1990), 543-568) w formie naturalnie występującej lub skróconej (Zang i wsp., Biochemistry 27 (1988), 8924-8931), a zwłaszcza RNA o strukturze spinki do włosów (Hampel i wsp. Nucleic Acids Res. 18 (1990) 299-304) lub RNA zawierający białka jak RNaza P (Baer i wsp., w Nucleic Acids & Molecular Biology (1988), tom 3, str. 231-250, wyd. F. Eckstein i D.M.J. Lilley, Springer Verlag Heidelberg) i telemerazę (Greider i Blackburn, Nature 337 (1989), 331-337).

Włączenie zmodyfikowanej grupy w pozycji 2' cukru rybozy wydaje się być również szczególnie użyteczne w przypadku RNA z nowymi funkcjami, otrzymywanymi zarówno za pomocą procedury, która polega na kolejnym zmienianiu cykli selekcji (Tuerg i Gold, Science 249 (1990), 505-510; Ellington i Szostak, Nature 346 (1990), 818-822) jak i za pomocą jakiejkolwiek innej metody.

Zmodyfikowaną grupę zastępującą grupę wodorotlenową w pozycji 2' cukru rybozy wybiera się spośród grup halogenowych, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej albo pojedynczo lub podwójnie podstawionych grup aminowych. Grupą halogenową może być grupa fluorowa, chlorowa, bromowa lub jodowa, z tym że grupa fluorowa jest preferowana. Najkorzystniejszymi podstawnikami podstawionych grup aminowych są grupy C1-C3 alkilowe i/lub hydroksyalkilowe. Najlepszymi grupami modyfikującymi są grupy halogenowa lub niepodstawiona grupa aminowa.

Włączenie grupy modyfikującej w pozycji 2' cukru rybozy w sposób znaczący zwiększa odporność nacięcie enzymatyczne. Potwierdzono, że 2'-dezoksy-2'-fluorourydyna i 2'-dezoksy-2'-aminourydyna, włączone w odpowiednie miejsce rybozymu zapobiegają przecięciu tego miejsca przez RNazę A (patrz Fig. 3 + 4). Enzym ten przecina w pozycji 3' nukleozydy pirymidynowe i wymaga obecności w pozycji 2' grupy wodorotlenowej (Uchida i Egami (1971), w The Enzymes tom IV, wyd. 3 (wyd. P. D. Boyer), Academic Pres str. 205-250). Ponadto wyniki uzyskane z użyciem polinukleotydów pokazują, że obecność funkcyjnej grupy aminowej w pozycji 2' zmniejsza również degradację przez niespecyficzne nukleazy jak fosfodwuesteraza z jadu węża (Hobbs i wsp., Biochemistry 12 (1973), 5138-5145). Obecność w pozycji 2' grupy halogenowej hamuje również nukleazy takie jak DNaza I (Hobbs i wsp., Biochemistry 11 (1972), 4336-4344). Wyniki uzyskane z użyciem polinukleotydów pokazują również, że obecność halogenu w pozycji 2' nukleotydu chroni przed działaniem nukleaz z surowicy ludzkiej (Black i wsp., Virology 48 (1972) 537-545). Zatem ochrona przez włączenie zmodyfikowanego cukru rybozy zgodnie z prezentowanym wynalazkiem będzie miała raczej charakter ogólny i nie będzie ograniczona do RNaz, których aktywność zależy od obecności grupy wodorotlenowej w pozycji 2'.

W kwasie rybonukleinowym cukier ryboza łączy się z nukleotydem wiązaniem N-glikozydowym. Zasadę nukleotydową, która jest połączona ze zmodyfikowanym cukrem rybozą w cząsteczce RNA prezentowanego wynalazku, wyselekcjonowano z grupy zawierającej zasady naturalnie występujące w RNA i z podstawionych zasad. Korzystne jest przyłączenie zmodyfikowanej rybozy do adeniny, guaniny, cytozyny i/lub uracylu, które są naturalnymi zasadami występującymi w RNA. Jednakże zmodyfikowaną rybozę można przyłączać również do podstawionych zasad, najlepiej wybranych z grupy zawierającej zasady ksantynę, hypoksantynę, 2,6-dwuaminopurynę, 2-hydroksy-6-merkamptopurynę i purynę, podstawione w pozycji 6 siarką lub zasadami pirymidynowymi, podstawionymi w pozycji 5 grupami halogenowymi lub C 1-C5 alkilowymi, zwłaszcza grupą bromową lub metylową. Najkorzystniejszą zasadą nukleotydową przyłączoną do zmodyfikowanego cukru rybozy jest uracyl.

Zmodyfikowanymi nukleozydami, które włączano do cząsteczki RNA, były zarówno poprzednio opisane związki jak i związki, które można przygotować analogicznie do znanych

169 576 związków. Najkorzystniejsze fluorowe i aminowe analogi rybonukleozydów opisano wyżej, 2'-dezoksy-2'-fluorocytydynę (Doerr & Fox, J. Org. Chem. 32 (1967), 1462; Mengel & Guschlbauer, Ang. Chem. 90 (1978), 557-558); 2'-dezoksy-2'-fluoroadenozynę (Ikehara&Miki, Chem. Pharm. Bull. 26 (1978) 2449-2453), 2'-dezoksy-2'-fluorourydynę (Codington i wsp., J. Org. Chem. 29 (1964), 558-564), 2'-dezoksy-2'-aminourydynę (Verheyden i wsp., J. Org. Chem. 36 (1971), 250) i 2'-dezoksy-2-aminocytydynę (Verheyden i wsp. (1971) jak wyżej). Do syntezy niektórych z tych związków zastosowano najnowsze metody syntezy. 2'-dezoksy-2'-fluorocytydynę można otrzymać z 2'-dezoksy-2'-fluorourydyny metodą Sunga (J. Org. Chem. 47 (1982), 3623-3628). Tej samej metody można używać do przekształcenia 2'-dezoksy-2'-azydourydyny w 2'-dezoksy-2'-azydocytydynę (Verheyden i wsp. (1971), jak wyżej). Tę ostatnią można zredukować do 2'-dezoksy-2'-aminocytydyny metodą Mungalla i wsp. (J. Org. Chem. 40 (1975), 1659).

Syntezę 5'-trójfosforanów 2'-dezoksy-2'-fluoronukleozydów można przeprowadzić zarówno według Ludwig (Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. 16 (1981), 131-133) lub Ludwig i Eckstein (J. Org. Chem. 54 (1989), 631-635). 5'-trójfosforany 2'-dezoksy-2'-aminourydyny i -cytydyny można otrzymać jak opisał to dla dwufosforanów Hobbs i wsp. (Biochemistry 12 (1973), 5138-5145), z tym, że zamiast fosforanu stosuje się pirofosforan, 3'-fosforoamidy 2'-dezoksy-2'-fluoronukleozydów do automatycznej syntezy oligonukleotydu można otrzymać metodą Sinha i wsp. (Nucleic Acids Res. 12 (1984), 4539-4557). Do syntezy odpowiednich pochodnych 2'-aminowych grupa aminowa może być chroniona przez trójfluoroacetylowanie według Imazara i Eckstein (J.Org.Chem. 44 (1979), 2039-2041). Cząsteczka RNA wytworzona sposobem według wynalazku obejmuje przynajmniej jeden zmodyfikowany nukleozyd, gdzie grupa wodorotlenowa rybozy w pozycji 2' jest zastąpiona przez grupę modyfikującą. Korzystna jest cząsteczka RNA, w której wszystkie nukleozydy jednego rodzaju (to znaczy adenozyna lub guanozyna lub cytydyna lub urydyna) zawierają zmodyfikowane cukry, podczas gdy pozostałe trzy nukleozydy zawierają niezmodyfikowane cukry. Bardziej korzystnym zmodyfikowanym nukleozydem jest nukleozyd pirymidynowy, to znaczy cytydyna lub urydyna albo ich podstawione pochodne. Najkorzystniejszym cukrem jest 2'-fluororyboza lub 2'-aminoryboza. Przykładami tych cząsteczek są rybozymy E2 i E3 o strukturze obucha, które pochodzą od rybozymu E1 o strukturze obucha opisanego przez Fedor i Uhlenbeck (Proc.Natl. Acad.Sci. USA 87 (1990), 1668-1672). W E2 wszystkie reszty urydynowe zastąpiono resztami 2'-dezoksy-2'-fluorourydynowymi i w E3 wszystkie reszty urydynowe zastąpiono resztami 2'-dezoksy-2'-aminourydynowymi. Rybozymy E2 i E3 wykazują aktywność rybonukleazy, porównywalną z aktywnością niezmodyfikowanej cząsteczki RNA E1.

W innej korzystnej cząsteczce RNA wytwarzanej sposobem według wynalazku wszystkie nukleozydy dwóch różnych rodzajów zawierają zmodyfikowane cukry, podczas gdy pozostałe dwa nukleozydy zawierają niezmodyfikowane cukry. Korzystniej wszystkie nukleozydy pirymidynowe, to znaczy cytydyna i urydyna (łącznie z podstawionymi zasadami pirymidynowymi) zawierają zmodyfikowane cukry, najlepiej pochodne rybozy 2'-fluorowe lub 2'-aminowe.

Sposobem według wynalazku wytwarza się cząsteczkę RNA obejmującą zmodyfikowany wzór (to znaczy taki, w którym pewne nukleozydy są zmodyfikowane i pewne są niezmodyfikowane), który nazwano selektywnym wzorem modyfikacji. RNA obejmujący selektywny wzór modyfikacji jest cząsteczka, gdzie nukleozydy w wybranych specyficznych pozycjach mogą być zmodyfikowane, podczas gdy nukleozydy w innych wybranych specyficznych pozycjach mogą być niezmodyfikowane. Na przykład nukleozydy, o których wiadomo, że są miejscami nadwrażliwymi na działanie rybonukleaz (na przykład w związku z drugorzędową strukturą RNA) powinny być zmodyfikowane w celu przedłużenia życia cząsteczki RNA. Przykładem miejsca nadwrażliwego na działanie rybonukleazy jest pozycja 21 rybozymu E1. Jak pokazano na fig. 3 RNaza A przecina cząsteczkę RNA w tej pozycji z dużą częstością.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku wytwarzana cząsteczka RNA dodatkowo zawiera przynajmniej jedno zmodyfikowane międzynukleotydowe wiązanie fosfodwuestrowe. Przykładami odpowiednio zmodyfikowanych wiązań dwuestrowych są zmetylowane grupy fosfoniowe lub grupy tiofosforanowe, z których ostatnie są szczególnie korzystne. Korzystne jest, gdy przynajmniej 5'-końcowe wiązanie fosfodwuestrowe i/lub 3'-końcowe wiązanie fosfodwuestro169 576

Ί we w cząsteczce RNA jest zmodyfikowane. Najkorzystniej jest, gdy 5'-końcowe wiązanie fosfodwuestrowe i ostatnie trzy 3'-końcowe wiązania fosfodwuestrowe są zmodyfikowane.

Stwierdzono, że sama obecność zmodyfikowanych wiązań międzynukleotydowych nie wystarcza do spowodowania zwiększonej odporności na degradację. Jednakże połączona obecność reszt rybozowych zmodyfikowanych w pozycji 2' i zmodyfikowanych wiązań międzynukleotydowych wykazuje dodatkowy efekt zwiększonej stabilności. Więcej niż pięćdziesięciokrotny wzrost stabilności nadany przez obie modyfikacje przeważa zmniejszoną efektywność przecinania w porównaniu z niezmodyfikowanym rybozymem.

Syntezę cząsteczek RNA posiadających zmodyfikowane wiązania międzynukleotydowe najlepiej jest przeprowadzać na drodze chemicznej jak opisano dalej.

Sposób wytwarzania cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej, według wynalazku polega na tym, ze przeprowadza się syntezę łańcucha RNA i włącza się co najmniej jeden zmodyfikowany nukleozyd, w którym grupę wodorotlenową w pozycji 2' cukru rybozy zastąpiono grupą modyfikującą, wybraną spośród chlorowców, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej i grup aminowych w jednej lub dwóch pozycjach.

Korzystną grupą modyfikującą jest chlorowiec (to znaczy grupa fluorowa, chlorowa, bromowa lub jodowa) lub grupa aminowa, przy czym bardziej korzystna jest grupa fluorowa lub niepodstawiona grupa aminowa. Zaznacza się, że sposób prezentowanego wynalazku obejmuje również syntezę cząsteczki RNA, do której włączono nukleotydy z przynajmniej dwoma zmodyfikowanymi grupami (to znaczy grupami fluorową lub aminową).

Najkorzystniejsze są dwa podejścia do włączania tych zmodyfikowanych nukleotydów do RNA. Jednym z nich jest zautomatyzowana chemiczna synteza, którą można przeprowadzać na stałym podłożu lub w roztworze, najlepiej z odpowiednimi fosforoamidami lub H-fosfonianami jako prekursorami nukleotydów, drugie podejście obejmuje enzymatyczne włączenie przez transkrypcję odpowiedniego kwasu nukleinowego, najlepiej matryc DNA, przeprowadzaną przy użyciu polimerazy kwasu nukleinowego i 5'-trójfosforanów nukleozydów zmodyfikowanych w pozycji 2'. Zautomatyzowaną chemiczną syntezę cząsteczek RNA, obejmujących zmodyfikowane wiązania międzynukleotydowe, można przeprowadzić przez włączenie do łańcucha RNA odpowiednich chemicznie zmodyfikowanych prekursorów nukleotydów takich jak metylowe pochodne związków fosfoniowych. W celu wprowadzenia wiązań tiofosforanowych jako prekursorów nukleotydów używa się standartowych pochodnych fosforoamidowych. Po przyłączeniu prekursora do łańcucha RNA następuje etap odpowiedniego utlenienia, jednakże nie przeprowadza się go za pomocą jodu, jak to jest w przypadku nie zmodyfikowanych wiązań lecz za pomocą siarki lub czynników siarkujących, dzięki czemu otrzymuje się grupę tiofosforanową.

Chemiczną syntezę zmodyfikowanych cząsteczek RNA przeprowadza się analogicznie do powszechnie znanej syntezy niezmodyfikowanych cząsteczek RNA lub DNA. Bardziej specyficznie syntezę RNA przeprowadza się przez chemiczną syntezę na stałym podłożu, obejmująca stopniowe dodawanie prekursorów nukleotydowych. Po otrzymaniu zsyntetyzowanego produktu RNA żądanej długości RNA usuwa się ze stałego podłoża stosując konwencjonalne metody i oczyszcza, najlepiej przez elektroforezę w żelu. Alternatywnie można również przeprowadzić chemiczną syntezę RNA stosując jakąkolwiek inną znaną technikę bez zastosowania stałego podłoża. Na przykład RNA można syntetyzować w formie rozpuszczonej i następnie oczyścić przy pomocy znanych metod.

Kiedy modyfikującą grupę aminową w pozycji 2' włącza się do łańcucha RNA, to musi on być chroniony przed reakcją fosfitylacji (to znaczy preparatyka prekursora nukleotydu) i w celu użycia do następujących po tym reakcji parowania.

W tym celu najlepiej jest używać jako grupy chroniącej grupy trójfluoroacetylowej, ponieważ jest ona stabilna podczas cykli syntezy w syntetyzerze kwasu nukleinowego i można ją usunąć przez konwencjonalne działanie amoniakiem.

Alternatywnie można przeprowadzić syntezę łańcucha RNA przez transkrypcję matrycy kwasu nukleinowego za pomocą odpowiedniej polimerazy kwasu nukleinowego. Korzystne jest użycie DNAjako matrycy ipolimerazy kwasu nukleinowego, którajest polimerazą RNA zależną od DNA. Jeszcze lepsza jest polimeraza RNA zależna od DNA, wybrana spośród polimeraz T7,

169 576

T3 i SP6, które są wysokowydajnymi polimerazami RNA bakteriofaga. Spośród tych polimeraz najlepsza jest polimeraza rNa T7. Matrycę DNA używaną do syntezy zmodyfikowanej cząsteczki RNA zgodnie z prezentowanym wynalazkiem najlepiej jest otrzymać przez wstawienie syntetycznego fragmentu DNA, kodującego żądaną sekwencję RNA do odpowiedniego miejsca w plazmidzie, który zawiera promotor dla odpowiedniej polimerazy RNA i wspomniane miejsce znajdujące się w takiej pozycji plazmidu, która umożliwia transkrypcję syntetycznego fragmentu DNA z wspomnianego promotora. Korzystną cechą tej reakcji transkrypcji jest to, że przebiega ona do końca matrycy DNA (tak zwana transkrypcja run off). Alternatywnie syntetyczne fragmenty DNA mogą służyć jako matryce do transkrypcji bez udziału plazmidu. Jednakże fragmenty te powinny zawierać sygnał rozpoczęcia transkrypcji, który pozwala na wydajną transkrypcję DNA.

Polimeryzację 2'-dezoksy-2'-halonukleotydów, to znaczy 2'-dezoksy-2'-fluorourydyny, -cytydyny, -adenozyny, -guanozyny i odpowiednich związków zawierających chlor najlepiej jest przeprowadzać przy udziale polimerazy T7 w obecności jonów Mn²⁺ jako kofaktora. Alternatywnie polimeryzację 2'-aminonukleotydów, to znaczy 2'-dezoksy-2'-aminourydyny, 2'-dezoksy-2'-aminocytydyny, 2'-dezoksy-2'-aminoadenozyny i 2'-dezoksy-2'-ammoguanozyny najlepiej jest przeprowadzać w obecności jonów Mg2+.

Z danych eksperymentalnych w następujących przykładach wynika, że obecność 2'-dezoksy-2'-fluorourydyny i 2'-dezoksy-2'-aminourydyny w rybozymie o strukturze obucha nie znosi aktywności katalitycznej. Jakościowo pokazano to na fig. 3 dla obecności 2'-fluorourydyny w części substratowej i ilościowo w tablicy 1 dla różnych innych par enzym/substrat. Prawdą jest, ze wszystkie te modyfikacje powodują wzrost wartości K_m, który jest najbardziej zdecydowany w przypadku podstawienia aminowego. Jednakże to zaburzenie aktywnej struktury mieści się w zakresie zmian Km obserwowanych dla systemów o strukturze obucha z innym składem zasad (Fedor & Uhlenbeck, jak wyżej). Dodatkowo niespodziewanie okazało się, że włączenie pojedynczej 2'-aminourydyny zaraz za miejscem 5' cięcia w substracie znacznie zwiększa kkat (tabela I), stąd staje się wyobrażalne wytwarzanie rybozymów o zwiększonej aktywności przez selektywne wprowadzenie nukleozydów zmodyfikowanych w pozycji 2' w specyficzne miejsca. Wyniki te w sposób ostateczny pokazują, że nie jest wymagana dla aktywności katalitycznej obecność grup 2-wodorotlenowych w części enzymatycznej, ale że modyfikacje zgodnie z prezentowanym wynalazkiem są tolerowane przynajmniej w pewnych pozycjach. Przeciwnie, stwierdzono, że włączenie tylko 15% 2'-dezoksynukleotydów do rybozymu o strukturze obucha zmniejsza wydajność katalityczną o dwa rzędy wielkości, lecz nie wpływa na Km (Perreault i wsp. (1990), jak wyżej). Dopóki tempo przecinania jest określone przez kąt ataku grupy 2'-wodorotlenowej na fosfor w miejscu przecięcia, pozostaje ono pod dużym wpływem całościowej struktury obucha. Zatem obserwowany wpływ modyfikacji w pozycji 2' na to tempo potwierdza obserwację, że analogi z podstawionym fluorem w pozycji 2' przystosowują strukturę w sposób bardziej podobny do struktury rybonukleotydów niż do struktury dezoksyrybonukleotydów. Widoczne jest to również dla analogów aminowych. Inne nukleozydy zmodyfikowane w pozycji 2' zgodnie z prezentowanym wynalazkiem wykazują podobną aktywność katalityczną.

Cząsteczki RNA z aktywnością katalityczną zawierające przynajmniej jeden zmodyfikowany nukleozyd mogą być stosowane jako czynniki lecznicze, zwłaszcza służące do przecinania materiału genetycznego pochodzącego od wirusów albo z innych obcych źródeł lub do przecinania wirusowych albo innych obcych transkryptów lub jako biokatalizatory w procesach biochemicznych lub biotechnologicznych. Do tych celów cząsteczki RNA wytwarzane sposobem według wynalazku są bardziej odpowiednie niż ich nie zmodyfikowane analogi, ponieważ wykazują większą odporność na chemiczne i/lub enzymatyczne cięcia.

Wynalazek będzie następnie zilustrowany następującymi przykładami w połączeniu z fig. 1-7. Jednakże przykłady te nie ograniczają zakresu ochrony wynalazku.

Figura 1 pokazuje autoradiogramy transkryptów plazmidu pUCRS otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 w procesie transkrypcji run off po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.

169 576

Figura 2 pokazuje autoradiogram transkryptów plazmidu pUCRE zawierającego 2'-aminourydynę otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 w procesie transkrypcji run off po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.

Figura 3 pokazuje autoradiogram transktryptów E1 i E2 otrzymanych w procesie transkrypcji run off częściowo strawionych rybonukleazą A znakowanych na 5'-końcu rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym.

Figura 4 pokazuje autoradiogram całkowitej degradacji S1 i S2 przez RNazę A.

Figura 5 pokazuje autoradiogram cięcia przez rybozym El 2'-fluorourydyny i substratu S3 zawierającego r-AMP.

Figura 6 pokazuje wykres Eadiego-Hofstee dla reakcji rybozymu E2 z S1.

Figura 7 pokazuje wykres Lineweavera-Burka dla reakcji rybozymu E3 z S1.

Figura 8 pokazuje organizację sekwencji HIV-1 sklonowanej w pOTH33.

Figura 9 pokazuje sekwencję nukleotydową rybozymu RE 115.

PRZYKŁADY

Przykład I. Przygotowanie oligorybonukleotydów

Automatyczna synteza oligorybonukleotydów: Automatyczną syntezę oligorybonukleotydów przeprowadzano za pomocą syntetyzera DNA Applied Biosystems 380B na skalę 1 pmol przy użyciu monomerów fosforoamidów rybonukleotydowych dostarczonych przez Milligen/Biosearch. Kontrolne kolumny ze szkła porowatego ze sprzężonym z nimi rybonukleozydem pochodziły zarówno z Milligen/Biosearch jak i Peninsula. Oligomery mieszano zgodnie z opisami załączonymi przez dostawcę fosforoamidów rybonukleotydowych (.Milligen/Biosearch). Po usunięciu grup ochronnych oligorybonukleotydy zatężano przez wirową dializę na membranowych filtrach typu centricon 10 firmy Amicon i strącano etanolem. Wysuszone osady zawieszano w 50 pl wody i poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Prążki oglądano przez podświetlenie UV, wycinano i izolowano RNA przez elucję w 37°C przez noc w buforze (0,25 M octan amonu 10 mM TRIS/HCl pH 8,0,1 mM EDTA) (Fedor & Uhlenbeck, PNAS USA 87 (1990), 1668-1672). Stężenie określano używając współczynnika ekstynkcji o wartości 6600 M’1 cm^u podawane w literaturze (Fedor & Uhlenbeck 1990). Wodne roztwory oligorybonukleotydów przechowywano w -20°C.

Konstrukcja plazmidów zawierających matryce do transkrypcji run off':

Do konstrukcji plazmidu metodą fosforoamidową zsyntetyzowano następujące oligodezoksynukleotydy przy pomocy syntetyzera DNA Applied Biosystems 380B:

RS2-T,5'-d(GATATCCTGACTCCCTATAGTGAGTCGTATTA)-3;

RS2-C,5'-d(TAATACGACTCACTATAGGGAGTCAGGATATCTGCA)-3';

RE1-T,5'-d(GGAGTTTCGGCCTAACGGCCTCATCAGAGGACCCTATAGTGAGTCG

TATTA)-3'i

RE2-C,5'-d(TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCTGATGAGGCCGTTAGGCCGA

AACTCCTGCA)-3'.

Przygotowanie klonów pUCRS i pUCRE16 niosących rybozymy:

Handlowy plazmid pUC19 przecięto w jednoetapowej reakcji używając enzymów restrykcyjnych Iso-SacI i Pstl. Następnie DNA oczyszczano za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym, a potem elektroelucji przy użyciu Centricon 30 i aparatu do centroelucji dostarczonych przez Amicon. Pary primerów oligonukleotydowych RE1-T i RE2-C (enzym rybozymu) lub RS2-T i RS2-C (substrat rybozymu) fosforylowano jak opisano przedtem (Taylor i wsp., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 8749-8764). Tych par oligonukleotydów użyto do klonowania promotora T7 połączonego zarówno z sekwencją DNA dla rybozymu, w wyniku czego otrzymano.pUCRE16, jak i sekwencją DNA dla substratu rybozymu, w wyniku czego otrzymano pUCRS zgodnie z metodą King & Blakesley (Focus 8 -(1986), 1-3). Po transformacji komórek kompetentnych (Olsen & Eckstein, PNAS USA 87 (1990), 1451-1456) białe kolonie przeszukiwano pod kątem obecności drugiego miejsca Avall w przypadku pUCRE 16 lub pojedynczego miejsca EcoRV dla pUCRS. Sekwencję oczyszczonego dwuniciowego DNA określano metodą Olsen i Eckstein (Nucleic Acids Res. 17 (1989), 9613-9620).

169 576

Transkrypty typu run off' polimerazy RNA T7:

Transkrypty typu run off' polimerazy RNA T7 syntetyzowano na skalę 150 pl do 500 pl przystosowując do tego metodą podaną przez Milligan i Uhlenbeck (Meth. in Enzymology 180A (1989), 51-62). Reakcje transkrypcji przeprowadzano w 40 mM TRIS pH 8,0,1 mM spermidyna, 5 mM DTT, 0,01% Tritom x-100, 20 mM MgCh, 2,5 mM nukleotydy, 200 nM matrycy DNA, 0,2 U/pl inhibitora RNazy z łożyska ludzkiego i 100 U/pl polimerazy RNA T7. Jeżeli stosowano trójfosforany 2'-dezoksy-2'-fluoronukleozydów to MgCh zastępowano 20 mM MnCh. Reakcje przeprowadzano w 37°C przez 3 godziny. Transkrypty oczyszczano przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym jak opisano wyżej. Wodne roztwory oligorybonukleotydów przechowywano w -20°C.

Rysunek 1 pokazuje autoradiogramy otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 transkryptów typu run off pUCRS po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. A: Transkrypcję przeprowadzano na skalę 150 pl w obecności 20 mM MgCh i 2,5 mM każdego z czterech trójfosforanów nukleozydów w 37°C przez 3 godz. Mieszaninę reakcyjną defosforylowano za pomocą alkalicznej fosfatazy i znakowano na 5'-końcach³²P przy użyciu kinazy polinukleotydowej [τ-PJ-ATP. Wyznakowaną mieszaninę transkrypcyjną poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. B: Transkrypcję przeprowadzano na skalę 150 pl w 37°C przez 3 godz. w obecności 20 mM MnCl 12, 0,5 mM ATP, 25 pCi [a^PJ-ATP, 2,5 mM CTP i GTP i 2,5 mM trójfosforanu 2'-fluorourydyny. Mieszaninę transkrypcyjną natychmiast poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Gwiazdki oznaczają fosforany wyznakowane 32p. 'N' oznacza każdy nukleotyd dodany przez polimerazę RNA T7 poza całkowitą długością matrycy DNA (zob. Milligan i Uhlenbeck, Meth. in Enzymology 180a (1989), 51-62).

Rysunek 2 pokazuje autoradiogramy otrzymanych za pomocą polimerazy RNA T7 transkryptów typu run off pUCRE 16 zawierających 2'-aminourydynę po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Ścieżka 1: Znacznik E3, 34-mer zawierający 2'-aminourydynę, zsyntetyzowany chemicznie. Ścieżka 2: Transkrypcję przeprowadzano na skalę 150 pl w 37°C przez 3 godz. w obecności 20 mM MgCh, 60 pCi [α r]ATP, 1 mM CTP i GTP i 1 mM trójfosforanu 2'-aminourydyny. Mieszaninę transkrypcyjną poddawano natychmiast elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.

Przygotowanie oligorybonukleotydów:

Przygotowano następujące oligorybonukleotydy

a. ) metodą transkrypcji run off (sekwencje podano bez 5'-trójfosforanu):

EL 5'-GGGUCCUCUGAUGAGGCCGUUAGGCCGAAACUCC-3';

E2 5'-GGG(2'-FU)CC(2'-FU)C(2'-FU)GA(2'-FU)GAGGCCG(2'-FU)(2'-FU)AGGCCGAAAC(2'-FU)CC-3' i

E3. 5'-GGG(2'-NH2U)CC(2'-NH2U)C(2'-NH2U)GA(2'-NH2U)GAGGCCG(2'-NH₂U) (2'-NH2U)AGGCCGAAAC(2'-NH2U)CC-3';

S1. 5'-GGGGGACUGAAU-3';

S3. 5'-AAGAA(2'-FU)CAACA(2'-FU)-3' i

34. 5'AAGAAU(2'-FC)AGGAU-3'

b. ) metodą chemicznej syntezy: Oligorybonukleotydy E1, E2, E3, S1 i S2, 5'-GCGAC(2'· NH2U)GAGAAU-3'.

Oligorybonukleotydy znakowane w pozycji 5' ³2P:

Oligorybonukleotydy otrzymane metodą transkrypcji run off' defosforylowano działając wolną od RNazy alkaliczną fosfatazą z wołu, oczyszczano na'kolumnach Quiagen tip-20 zgodnie z przepisem dostarczonym przez producenta (Diagen Inc.) i działano na nie kinazą polinukleotydową T4 i τ-P-ATP. Wyznakowane oligorybonukleotydy oczyszczano elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym.

Przykład II. Trawienie oligorybonukleotydów RNazą A

Częściowe trawienie oligorybonukleotydów RNazą A:

Oligorybonukleotydy E1 i E2 trawiono RNazą A po uprzednim wyznakowaniu w pozycji 5' 32p zgodnie z metodą według Donis-Keller i wsp. (Nucleic Acids Res. 4 (1977)^ 2527-2538) z następującymi zmianami. Około 25 pmoli RNA wyznakowanego w pozycji 5'2²P dodawano do 50 pl buforu zawierającego 7 M mocznik, 50 mM EDTA, 0,04% błękitu bromofenolowego,

169 576

0,04% ksylen cyjanol FF i 0,25 mg/ml tRNA w lodzie. Następnie RNA rozdzielano równymi porcjami do 5 oznaczonych probówek, ogrzewano do 50°C przez 5 min. i natychmiast umieszczano w lodzie. Do pierwszej probówki dodawano 2 pl (2 X 10⁴ jednostek) rybonukleazy A i mieszano pipetą. Następnie wykonywano kolejno 5-krotne rozcieńczenia enzymu w trzech dodatkowych probówkach używając nowej końcówki pipety po każdym przeniesieniu z jednej probówki do następnej.-Piąta probówka była próbą kontrolną, do której nie dodano enzymu. Następnie wszystkie probówki inkubowano w 50°C przez 5 min., umieszczano w lodzie i analizowano elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym.

Całkowita degradacja oligorybonukleotydów RNazą A:

Oligorybonukleotydy S1 i S2 trawiono RNazą A po uprzednim wyznakowaniu ³2p na 5'-końcu według następującego przepisu: Przeprowadzano reakcję oligomeru (8,5 pM w końcowej objętości 20 pl) z 1,25 x 10'3 jednostek RNazy A w buforze zawierającym 50 mM TRIS/HCl pH 7,5 i 10 mM MgCk przez 10 min. w 37°C. Produkty analizowano elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym.

Rysunek 3 pokazuje autoradiogram częściowo strawionych rybonukleazą A transkryptów typu run off E1 i E2 wyznakowanych na 5'-końcu po rozdziale elektroforetycznym w żelu poliakrylamidowym. Stosowano warunki opisane poprzednio. Ponumerowane ścieżki odpowiadają 1) nie dodano enzymu, 2) 2Χ10⁴ jednostek RNazy A, 3) 3x10‘⁵ jednostek RNazy A, 4) 8x10'° jednostek RNazy A, 5) 16x10'⁷jednostek RNazy A. Liczenie zasad było ułatwione przez policzenie prążków, powstałych po cięciu niezmodyfikowanego transkryptu w obecności Mn2+ (10 pmoli RNA ogrzewanego do 90°C przez 3 min. w 10 mM MnCh). Numery zaznaczone kółkami wskazują prążki, które powstały, jak się oczekuje, przez cięcie RNazy-A we wrażliwych pozycjach. Strzałki wskazują prążki, które powstały przez cięcie urydyny w pozycji 3', a które są niewidoczne na ścieżkach gdzie poddawany był cięciu rybozym zawierający 2'-fluorourydynę.

Rysunek 4 pokazuje autoradiogram całkowitej degradacji S1 i S2 RNazą A po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Szczegóły reakcji podano wyżej. Ścieżka 1: całkowite trawienie 12-meru S2; ścieżka 2: całkowite trawienie 12-meru S1; ścieżka 3: drabina prążków, powstała po reakcji 34-meru E1 z 20 mM MnCh w 90°C przez 3 min. jako standart wielkości. Produkt cięcia S2 jest o 1 nukleotyd dłuższy niż produkt S1 co wskazuje na obecność 2'-aminourydyny w pozycji 6.

Przykład III. Cięcie substratów oligorybonukleotydowych przez rybozymy

Określenie kinetyki cięcia:

Reakcje cięcia przeprowadzano stosując przystosowaną do tego metodę według Fedor i Uhlenbeck (1990), jak wyżej). Roztwory podstawowe enzymu rybozymowego (zwykle 20 pl końcowej objętości, końcowe stężenie 100 nN, 50 mM TRIS/HCl, pH 7,5) i substratu oligonukleotydowego (zwykle 40 pl, końcowe stężenie 2 pM) podgrzewano oddzielnie w 90°C przez 1 min. i schładzano do temperatury pokojowej przez 15 min. przed dodaniem dwuwartościowego jonu metalu (MnCh lub MgCk, końcowe stężenie 10 mM). Te roztwory podstawowe inkubowano oddzielnie w 25°C przez 15 min. przed rozpoczęciem reakcji cięcia. Reakcje rozpoczynano przez dodanie enzymu do substratu (50 mM TRIS/HCl, pH 7,5,20 pl końcowej objętości, MgCk, końcowe stężenie 10 mM), z typowymi stężeniami 10 nN enzymu i między 50 i 5000 nN substratu. W przedziałach czasowych przenoszono 10 pl mieszaniny do 10 pl mieszaniny hamującej zawierającej mocznik i poddawano elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. Autoradiogramy analizowano za pomocą densytometru laserowego LKB ULTROSCAN XL.

W badanym systemie rybozymu o strukturze obucha substrat oligonukleotydowy składający się z 12 reszt (oznaczony jako S) przecinano przy użyciu enzymu oligonukleotydowego składającego się z 34 reszt) w pozycji 3' cytydyny-7 jak to zaznaczono strzałką w strukturze zamieszczonej we wstępie. To cięcie wytwarzało hektamer z 2'-3'-cyklicznym końcem fosforanowym (produkt 1) i pentamer z końcem 5'-wodorotlenowym (produkt 2) (Ruffner i wsp., Gene 82 (1989), 31-41). Obserwowaliśmy ten typ produktów cięcia nie tylko w reakcji z oligorybonukleotydami E1 i S1, lecz równie z substratem S3 zawierającym 2'-fluorourydynę (fig. 5). Jak oczekiwano, substrat oligonukleotydowy S4, zawierający 2'-fluorocytydynę w pozycji cięcia nie

965:576 ulega przecięciu w identycznych warunkach. Te dwie reakcje zawierają 2'-fluorourydynę w substracie oligonukleotydowym.

Jednakże, potencjalnie bardziej interesującym dla przyszłych zastosowań pytaniem jest kwestia, czy obecność tych modyfikacji w części enzymatycznej rybozymu będzie kolidowała z jego aktywnością enzymatyczną. Zatem zbadano reakcję rybozymu E2 zawierającego 2'-fluorourydynę z niezmodyfikowanym substratem S1. Rzeczywiście, analiza w żelu pokazywała, że substrat podlegał cięciu z podobną wydajnością jak w przypadku pary E1 i S1. Określono stałe katalityczne rybozymu E2 zawierającego 2'-fluorourydynę (fig. 6) i porównano z odpowiednimi wartościami dla nie zmodyfikowanego rybozymu E1. Porównanie wykazało, że stała szybkość reakcji dla pierwszego (kkattKm = 0,0026 nM'¹) jest o jeden rząd mniejsza niż dla drugiego (kkat/K_m = 0,023 nM°) (Fedor & Uhlenbeck (1990) jak wyżej) (tabela 1). Ten spadek katalitycznej wydajności jest przede wszystkim spowodowany spadkiem szybkości przecinania, podczas gdy wartości Km dla obu rybozymów są prawie identyczne. Jednakże ta zmniejszona szybkość przecinania mieści się dobrze w zakresie wydajności cięcia obserwowanej w rozmaitych systemach ze strukturą obucha o różnych składach zasad (Fedor & Uhlenbeck (1990), jak wyżej). Reakcje rybozymu o strukturze obucha można przeprowadzać zarówno z MgCb jak i MnCl2 jak i jonami metali jako kofaktorami, gdzie połowiczny czas trwania cięcia zmniej-sza się w obecności ostatniego kofaktora około 10 razy (Uhlenbeck, Nature 328 (1987), 596-609). Ten spadek połowicznego czasu trwania substratu w warunkach cięcia po zmianie Mg2+ na Mto⁺zaobserwowano również na reakcji enzymu E2 zawierającego 2'-fluorourydynę z substratem S1. To wymaganie obecności jonów metalu przez reakcję cięcia nie zmieniło się przez włączenie analogów 2'-fluoronukleotydów.

Zbadano również efekt obecności 2'-aminourydyny w rybozymie. Kiedy rybozym E3 zawierający 2'-aminourydynę reagował z niezmodyfikowanym substratem S1, wydajność katalityczna spadała do rzędu wielkości (kkat/Km = 0,0015 nM⁴). Ten spadek wydajności był w sposób oczywisty spowodowany wyższą Km, podczas gdy kkat pozostawała prawie nie zmieniona. Zatem całkowita wydajność rybozymu zawierającego 2'-aminourydynę jest porównywalna z wydajnością rybozymu zawierającego 2'-fluorourydynę. W komplementarnej reakcji niezmodyfikowanego rybozymu E1 z selektywnie zmodyfikowanym 2'-aminourydyną substratem S2 wydajność katalityczna wzrasta w porównaniu z powyższą reakcj ą do (kkat/Km = 0,0063 nM⁴). Ten efekt jest spowodowany wyłącznie przez wzrost kkat- Ta tendencja jest nawet wyraźnie widoczna w reakcji rybozymu E3, zawierającego 2'-aminourydynę, z S2, gdzie wydajność katalityczna wzrasta do (kkat/Km = 0,0011 nM’ ), znów głównie z powodu wzrostu kkat- Kinetyczne parametry dla wszystkich powyższych reakcji podsumowano w tabeli 1.

Tabela 1

Stałe kinetyczne rybozymów, zawierających zmodyfikowany w pozycji 2' nukleotyd. ^a

Enzym	Substrat	kkat (min-i)	Km (nM)	kkat/Km (nM-1 min-1)
E1 (niezmod.)	S1 (niezmod.)	3,0	140	0,023
E2 (2'-FU)	S1 (niezmod.)	0,8	300	0,0026
E3 (2'-NH2U)	S1 (niezmod.)	2,3	1500	0,0015
E3 (2'-NH2U)	S2 (2'-NH2U)	19,0	1800	0,011
E1 (niezmod.)	S2 (2'-NH2U)	10,0	1600	0,0063

^a Stałe kinetyczne wyznaczono z wykresu Eadiego-Hofstee dla reakcji cięcia przeprowadzanych z 10 nM rybozymu i w zakresie stężeń substratu od 50 nM do 1200 nM.

Zatem, zestawione tutaj dane kinetyczne pokazują, że chociaż wydajności cięcią rybozymu zmodyfikowanego 2'-fluoro- i 2'-aminourydyną jest w pewien sposób zredukowana, to wciąż mieści się ona w zakresie zmian obserwowanych w systemach o strukturze obucha z różnym składem zasad. Stało się również jasne, że jest możliwe zwiększenie wydajności katalitycznej przez selektywne wprowadzenie modyfikacji w pozycji 2' w specyficznych miejscach. Chociaż

169 576 ostatni efekt zaobserwowano dla substratu oligorybonukleotydowego, to przewiduje się, ze podobny wpływ na katalizę można znaleźć dla selektywnych modyfikacji w enzymie.

Rysunek 5 pokazuje autoradiogram cięcia przez rybozym E1 substratu S3, zawierającego 2'-fluorourydynę i ³²P-AMP. Reakcję cięcia przeprowadzano w obecności 10 mM MgCb w 50 mM TRIS/HCl, pH 7,5 na skalę 40 μl w 25°C. Stężenie Eli S3 wynosiło odpowiednio 2,5 μΜ i 7,5 μM, wszystkie inne szczegóły opisano wyżej (zob. Określenie kinetyki cięcia). W określonych przedziałach czasowych 10 μl próbki przenoszono do 10 μl wody i dodawano 10 μl mieszaniny hamującej z mocznikiem przed nałożeniem na Żel poliakrylamidowy. Ścieżka 1: reakcja po 0,5 min.; ścieżka 2: reakcja po 15 min.; ścieżka 3: reakcja po 30 min. Gwiazdki oznaczają fosforany wyznakowane ^MP.

Rysunek 6 pokazuje wykres Eadiego-Hofstee dla reakcji rybozymu E2 z S1. Reakcję cięcia przeprowadzano na skalę 20 μl w obecności 10 mM MgCb z 10 nM stężeniem E2 i stężeniami S1 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 500 nM i 700 nM. Po 7 min. 10 μl próbki przenoszono do 10 μl wody i dodawano 10 μl mieszaniny hamującej z mocznikiem przed nałożeniem na żel poliakrylamidowy. Najpierw określono, że te punkty czasowe mieszczą się w liniowym zakresie początkowej szybkości. Autoradiogramy analizowano przez integrację ich optycznej gęstości na densytometrze laserowym.

Rysunek 7 pokazuje wykres Lineweavera-Burka dla reakcji rybozymu E3 z S1. Reakcję cięcia przeprowadzano na skalę 20 μl w obecności 10 mM MgCb z 10 nM stężeniem E3 i stężeniami S1 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 500 nM i 700 nM. Wszystkie pozostałe szczegóły jak na fig. 6.

Przykład IV. Cięcie RNA LTR HIV-1 przy użyciu rybozymów

Konstrukcja plazmidu: Plazmid pOTH33 skonstruowano przez sklonowanie sekwencji HIV-1 od miejsca -525 do 386 (zgodnie z numeracją sekwencji według Ratner i wsp., Nature 313 (1985), 277-284) w handlowym plazmidzie pSPT19 (Pharmacia). Sekwencję HlV umieszczono pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (T7). Diagram wstawki HIV w pOTH33 podano na fig. 8. Rejon RTL HIV-1 składa się z rejonu U3, rejonu R i rejonu U5. Rejon ten posiada na 5'-końcu obszar polipurynowy i na 3'-końcu miejsce wiążące primer (PBS), sekwencję sygnałową i część genu gag. Strzałki w pozycjach -525 i 386 wskazują miejsca restrykcyjne użyte do konstrukcji pOTH33. Strzałka w pozycji 115 wskazuje miejsce cięcia przeprowadzanego przez rybozym.

RNA HIV1 od pozycji -525 do 386, obejmujące długą powtórzoną sekwencję końcową od nukleotydu -453 do 182 otrzymano przez transkrypcję run off plazmidu pOTH33, przeciętego EcoRI (100 ng/il matrycy DNA, 10 mM DTT, 500 μM każdego rNTP, 50 mM Tris-Cl pH 7,5,2 mM spermidyna, 6 mM MgCb, 2 iCi/ll [a-P]-ATP, 50 U/il inhibitora RNazy i 15 U/il polimerazy RNA T7,2 godz. w 4°C) i następnie inkubację mieszaniny reakcyjnej z DNaząI (1 U/il 10 min. w 37°C) (wolna od RNazy) i ekstrakcję mieszaniną fenolu i chloroformu. Otrzymane RNA nazwano RNA LTR.

Miejsce 115 RNA LTR HIV1 zawierające potencjalne miejsce cięcia GUC wybrano jako substrat dla cięcia katalizowanego przez rybozym. Rybozymy o strukturze obucha, skierowane przeciwko temu miejscu, zsyntetyzowano chemicznie. Sekwencję nukleotydową niezmodyfikowanego enzymu o strukturze obucha RE115 podano na fig. 9.

Kinetyka cięcia za pomocą RNA RTL: wartości kka/K_m określano w warunkach pojedynczej zmiany. Rybozymy preinkubowano w 75°C przez 1 min. w obecności 50 mM Tris-Cl pH 7,5, a następnie inkubowano przez 5 min. w 37°C. Dodawano MgCb do końcowego stężenia 10 mM i roztwory ponownie inkubowano przez 5 min w 37°C. RNA LTR używano bezpośrednio jako roztworu wodnego. Mieszanina reakcyjna (19 il) zawierała między 20 nM i 1 iM rybozymu, 50 mM Tris-Cl pH 7,5 i 10 mM MgCb. Reakcję rozpoczynano przez dodanie RNA RTL do końcowego stężenia 10 nM. Po 1 godz. w 37°C reakcję hamowano przez dodanie 10 il mieszaniny hamującej i analizowano elektroforetycznie w 4% żelu poliakrylamidowym (długość 40 cm, 8 M mocznik). Po 1 godz. elektroforezy przy 50 W wykonywano autoradiografię, a następnie frakcję nieprzeciętnego RNA RTL określano za pomocą laserowej densytometrii skaningowej.

169 576

Wartości kk_at/K_m otrzymano przez podzielenie pozostałej frakcji RNA RTL (Frac S) przez stężenie rybozymu ([RE]) według następującego równania:

k = ^ln(^FracS) = [RE]—²¹t K_m gdzie k jest obserwowaną szybkością reakcji i t jest czasem reakcji równym 1 godz.

W celu zbadania wpływu chemicznych modyfikacji na katalityczną aktywność rybozymu zsyntetyzowano kilka analogów REI 15 zawierających podstawienia 2'-fluoro lub 2'-dezoksy i/lub końcowe wiązania tiofosforanowe. Podczas gdy podstawienia 2'-fluorocytydynowe nie wpływały na wydajność katalityczną [tabela 2 REI 15 (FC)], to podstawienia 2'-fluorourydynowe powodowały pięciokrotny spadek kk_at/K_m [tabela 2 REI 15 (FU)]. Jednak 5'-końcowa grupa tiofosforanowa w połączeniu z trzema 3'-końcowymi grupami tiofosforanowymi obniżała wydajność katalityczną w stopniu zaniedbywalnym [tabela 2, REI 15 (S)]. To samo dotyczyło połączenia końcowych wiązań tiofosforanowych z podstawieniami 2'-fluorourydynowymi, gdzie nie obserwowano dalszego spadku wartości kk_at/K_m [tabela 2, REI 15 (FU, S)]. Podstawienie wszystkich rybonukleotydów pirymidynowych przez ich analogi 2'-fluorowe i wprowadzenie czterech wiązań tiofosforanowych zmniejszało wydajność katalityczną tylko siedem razy w porównaniu z niezmodyfikowanym rybozymem [tabela 2, REI 15 (FC, FU, S)]. Przeciwnie, podstawienia wszystkich rybonukleotydów pirymidynowych ich analogami 2'-dezoksynukleozydowymi w połączeniu z tiofosforanami powodowany pięćdziesięciokrotny spadek kk_at/K_m [tabela 2, REI 15 (dC, dU, S)]. Zatem REI 15 (dC, dU, S) jest około siedem razy mniej wydajne niż REI 15 (FC, FU, S).

Tabela 2

Wpływ chemicznych modyfikacji na cięcie RNA LTR przez REI 15

Rybozym	kk_at/Km, M'¹ s'¹	kk_at/Km, względne
RE115	500	1
RElll(S)	360	0,72
RE115(FC)‘	490	0,98
RE115(FU)‘	89	0,18
REllStFU.S)¹	59	0,12
REI 15(FC,FU,S)‘	69	0,14
REI 15(dC,dU,S)²	10	0,020

Przykłady prezentowanego wynalazku ² Przykład porównawczy

Przykład V. Stabilność oligorybonukleotydów

Rybozymy z przykładu IV badano pod względem ich odporności na trawienie nukleazą.

Warunki testu:

Klon komórkowy Molt 4 (otrzymany dzięki uprzejmości E. Jurkiewicz, Deutsches Primatenzentrum, Góttingen) hodowano wychodząc od 8 pojedynczych komórek, w pożywce RMPI 1640 do gęstości komórek około 10⁶ komórek/ml, a następnie żwirowano przy 1000 g przez 5 min. w mikrowirówce Heraeus. Rybozymy wyznakowane w pozycji 5'³² ogrzewano przez 1 min. w 90°C, chłodzono w lodzie, dodawano do nadsączu komórkowego do końcowego stężenia 300 nM i inkubowano w 37°C. Próbki pobierano po upływie wskazanych przedziałów czasowych i analizowano przez elektroforezę w 20% żelu poliakrylamidowym zawierającym 8 M mocznik, a następnie poddawano autoradiografii.

Wyniki:

Więcej niż 80% REI 15 było zdegradowanych po 2 min. inkubacji w nadsączu komórkowym jak wykazano to w denaturującym żelu poliakrylamidowy. Dla RE115(S) otrzymano podobne wyniki. Jednakże nie obserwowano degradacji REI 15(FC, FU, S) po 1 godz Porów169 576 nanie z szybkością degradacji niezmodyfikowanego rybozymu wskazuje na to, że połączenie nukleozydów pirymidynowych zmodyfikowanych w pozycji 2' z końcowymi wiązaniami tiofosforanowymi powoduje więcej niz pięćdziesięciokrotne (szacunkowo) wzrost odporności rybozymu na trawienie nukleazami znajdującymi się w nadsączu komórek T. Rybozymy zmodyfikowane w pozycji 2' bez grupy tiofosforanowej wykazują stabilność, którajest około dwóch razy mzsza niż stabilność REI 15 (FC, FU, S).

Fig.2

2

169 576

7-mer-.5'-*pGGGAG(2'-NH2UlC-3' 6-mer 5’-*pGGGAGU-3'

A

Fig.5

substrafe5'-pppGGG*AGI2'-FU)[^łAGG^łAi2'-FU)-3' product t5'(HOl*AGG*A(2^,-FUl[OHl-3' product 2 5'-pppGGG^łAG(2'-FU|C(>l-3'

169 576

Fig.6

-0 010

-0 006 -0 002

002

010

169 576

Hindlll

T7

Kpnl EcoRI

-525 115 386


		« V, ^ί~

U 3 R U 5 PBS LEADER gag

Lider

POTH33

Fig. 8

5'CACAACACUGAUGAGGCCGUUAGGCCGAAACGGGCA³'

Fig. 9

169 576

Fig .1

13-mer- 5'-*pGCGAGUCA GGA UN-3' 12-mer 5'-*pGGGAGUCAGGAU-3'

13-mer 5’-pp_pGGG*AGl2’-FU)C*AGG*A(2‘-FU)N-3· 12-mer S'-pppGGG*AG(2'-FU]CłAGG*A(2'-FUl-3·

Ł ii u

«*

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania cząsteczki RNA o aktywności katalitycznej, znamienny tym, ze przeprowadza się syntezę łańcucha RNA i włącza się co najmniej jeden zmodyfikowany nukleotyd, w którym grupę wodorotlenową w pozycji 2' cukru rybozy zastąpiono grupą modyfikującą, wybraną spośród chlorowców, grupy siarkowodorowej, azydkowej, aminowej i grup aminowych, podstawionych w jednej lub dwóch pozycjach.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że grupa modyfikująca jest chlorowcem lub grupą aminową.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że grupa modyfikująca jest fluorem.
4. Sposób według zastrz. 1, zamienny tym, że syntezę łańcucha RNA przeprowadza się przez chemiczną syntezę prekursorów nukleotydowych na stałym podłożu, usunięcie produktu RNA z tego stałego podłoża i oczyszczenie usuniętego produktu RNa.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syntezę łańcucha RNA przeprowadza się przez chemiczną syntezę prekursorów nukleotydowych w roztworze i oczyszczenie produktu RNA.
6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że jako prekursory nukleotydów stosuje się fosforoamidy lub H-fosfotiony.
7. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że modyfikującą grupę aminową włącza się do łańcucha RNA w formie trójfluoroacetylowanej grupy amidowej, a następnie chroniącą grupę trójfluoroacetylową usuwa się działając amoniakiem.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo włącza się do łańcucha RNA przynajmniej jedno zmodyfikowane wiązanie fosfodwuestrowe między nukleotydami.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że zmodyfikowane wiązanie fosfodwuestrowe jest grupą tiofosforanową.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syntezę łańcucha RNA przeprowadza się przez transkrypcję z matrycy kwasu nukleinowego przy użyciu polimerazy kwasu nukleinowego.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że matryca kwasu nukleinowego jest matrycą RNA, a polimeraza kwasu nukleinowego jest polimerazą RNA zależną od DNA.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że polimeraza RNA zależna od DNA wybrana jest z grupy, obejmującej polimerazę T7, T3 i SP6.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że polimerazą RNA zależną od DNA jest polimeraza T7.
14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że zmodyfikowana grupa jest chlorowcem i syntezę łańcucha RNA przeprowadza się w obecności jonów Mn²⁺.
15. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że grupa modyfikującajest grupą aminową lub grupą aminową podstawioną w jednej lub dwóch pozycjach i syntezę łańcucha RNA przeprowadza się w obecności jonów Mg²+.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zasadę nukleotydową przyłączoną do zmodyfikowanego cukru rybozy wybrano spośród grup naturalnie występujących w RNA i podstawionych zasad.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że podstawioną zasadę nukleotydową wybrano spośród grup zawierających ksantynę, hypoksantynę, 2,6-dwuaminopurynę, 2-hydroksy-6-merkaptopurynę i zasady purynowe, podstawione w pozycji 6 siarką lub zasadami pirymidowymi, podstawionymi w pozycji 5 chlorowcami lub grupami C1-C5alkilowymi.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że zasada nukleotydową przyłączona do zmodyfikowanego cukru rybozy jest zasadą naturalnie występującą w RNA.

169 576
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że zasada nukleotydowa przyłączona do zmodyfikowanego cukru rybozy jest zasadą pirymidynową.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie zasady nukleotydowe jednego specyficznego rodzaju są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wszystkie uracylowe zasady nukleotydowe są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że wszystkie cytozynowe zasady nukleotydowe są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie zasady nukleotydowe dwóch specyficznych rodzajów są przyłączone do zmodyfikowanego cukru rybozy.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że wszystkie cytozynowe i uracylowe zasady nukleotydowe są przyłączone do zmodyfikowanego cukru.
25. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że zmodyfikowany cukier ryboza obejmuje grupy 2'-fluorowe i 2'-aminowe.