TR201811076T4 - Geliştirilmiş lipit formulasyonu. - Google Patents

Abstract

Buluş, lipit partikülleri kullanılarak terapötik ajanın verilmesi alanı ile ilgilidir. Özellikle, mevcut buluş spesifik bir katyonik lipit ile, bunun bir terapötik ajanın bir hücreye verilmesindeki kullanımları ile ve bahsedilen katyonik lipidi içeren lipit formülasyonları ile ilgilidir.

Description

Tarifnameye göre kullanilabilecek onkoloji Haplarinin örnekleri, ancak sinirlandirilmamis olarak, adriamisin, alkeran, allopurinol, altretamin, amifostin, anastrozol, araC, arsenik trioksit, azatioprin, beksaroten, biCNU, bleomisin, busulfan intravenöz, busulfan oral, kapesitabin (Xeloda), karboplatin, karmustin, CCNU, selekoksib, klorambusil, sisplatin, kladribin, siklosporin A, sitarabin, sitozin arabinosid, daunorubisin, sitoksan, daunorubisin, deksametazon, deksrazoksan, dodetaksel, doksorubisin, doksorubisin, DTIC, epirubisin, estramustin, etoposid fosfat, etoposid ve VP- 16, eksemestan, FK506 fludarabin, florouracil, 5- FU, gemsitabin (Gemzar), gemtuzumab- ozogarnicin, goserelin asetat, hidrea, hidroksiüre, idarubisin, ifosfamid, imatinib mesilat, interferon, irinotekan (Camptostar, CPT- 111), Ietrozol, lökovorin, löstatin, I`oprolid, Ievamisol, Iitretinoin, megastrol, melfalan, L- PAM, mesna, metotreksat, metoksalen, mitramisin, mitomisin, mitoksantron, azot hardali, paklitaksel, pamidronat, Pegademaz, pentostatin, porfimer sodyum, prednizon, rituksan, streptozosin, STI- 571, tamoksifen, taksoter, temozolamid, teniposid, VM- 26, topotekan (Hycamtin), toremifen, tretinoin, ATRA, valrubisin, velban, vinblastini vinkristin VP 16 ve vinorelbin içerir. Kullanilabilecek diger onkoloji ilaci örnekleri, eliptisin ve eliptisin analoglari ya da türevleri, epotilonlar, hücre içi kinaz inhibitörleri ve kamptotesindir. Nükleik Asit- Lipit Partikülleri Bazi düzenlemelerde, burada tarif edilen lipit partikülleri, bir nükleik asit lipit partikülünde elde edilen bir nükleik asit ile birliktedir. Belirli düzenlemelerde, nükleik asit lipit partikül'u içinde tamamen enkapsüllenmistir. Burada kullanildigi sekliyle, 50 nükleotide kadarini içeren fragmanlar genel olarak oligonükleotidler olarak tanimlanir ve uzun fragmentler, polinükleotidler olarak adlandirilir. Belirli düzenlemelerde, burada tarif edilen oligonükleotidler uzunlukça 20- 50 nükleotidlerdir. Bu bulus baglaminda, "polinükleotid" ve "oligonükleotid" terimleri, dogal olarak olusan bazlar, sekerler ve iç seker (omurga) baglarindan olusan nükleotid ya da nükleosid monomerlerinin bir polimer ya da oligomeri anlamina gelmektedir. "Polinükleotid" ve olusmayan monomerleri veya bunlarin kisimlarini içeren polimerleri ya da oligomerleri kapsamaktadir. Bu tür modifiye edilmis ya da ikame edilmis oligonükleotidler, örnegin n'ukleazlarin mevcudiyetinde artirilmis stabilite ve artan hücresel geri alimi gibi özelliklerden dolayi genellikle dogal formlar 'üzerinde tercih edilir. Oligonükleotitler, deoksiribooligonükleotitler ya da ribonükleotitler olarak siniflandirilir. Bir deoksiribooligonükleotit, deoksiriboz olarak adlandirilan, degisen, dallanmamis bir polimer olusturmak için bu sekerin 5' ve 3' karbonunda fosfata kovalent olarak baglanan 5- karbon sekerinden olusur. Bir ribooligonükleotit ise, 5- karbon sekerinin riboz oldugu yerde benzer bir tekrarlayan yapidan olusur. Burada tarif edilen bir lipit- nükleik asit partikülünde mevcut olan nükleik asit, bilinen herhangi bir nükleik asit formunu içerir. Burada kullanilan nükleik asitler, tek sarmalli DNA ya da RNA ya da çift sarmalli DNA ya da RNA ya da DNA- RNA hibridleri olabilir, çift sarmalli DNA örnekleri, yapisal genleri, kontrol ve sonlandirma bölgeleri dahil olmak üzere genleri ve viral ya da plazmid DNA gibi kendi kendini kopyalayan sistemleri içerir. Çift sarmalli RNA örnekleri, siRNA ve diger RNA interferans reajanlari içerir. Tek sarmalli nükleik asitler, antisens oligonükleotidler, ribozimler, mikroRNA ve tripleks olusturan oligonükleotidleri içerir. Burada tarif edilen nükleik asitler, genel olarak nükleik asidin belirli formuna bagli olarak çesitli uzunluklarda olabilir. Örnegin, belirli düzenlemelerde, plazmidler ya da Ozel düzenlemelerde, oligonükleotidler yaklasik 10 ila 100 nükleotid uzunlugunda olabilir. Çesitli ilgili uygulamalarda, oligonükleotidler, hem tek sarmalli, çift sarmalli hem de üç sarmalli olarak, yaklasik 10 ila yaklasik 50 nükleotid arasinda, yaklasik 20 ila yaklasik 50 nükleotid arasinda, yaklasik 15 ila yaklasik 30 nükleotid arasinda, yaklasik ila 30 nükleotid arasinda uzunlukta olabilir. Belirli uygulamalarda, burada tarif edilen oligonükleotid (ya da bunlarin bir sarmal) özellikle bir hedef polinükleotide hidritlesir ya da bir hedef polinükleotide tamamlayicidir. "Spesifik olarak hibritlenebilir" ve "tamamlayici", DNA ya da RNA hedef ve oligonükleotid arasinda stabil ve spesifik baglanmanin gerçeklesecegi sekilde yeterli bir tamamlayicilik derecesini belirtmek için kullanilan terimlerdir. Bir oligonükleotidin, spesifik olarak hibritlenebilir olabilmesi için kendi hedef nükleik asit sekansina % 100 tamamlayici olmasi gerekmedigi anlasilmaktadir. Bir oligonükleotid, oligonükleotidin hedefe baglanmasi, buradaki fayda ya da ifadesinin kaybina neden olmak için hedef molekülün normal fonksiyonu ile etkilesime girdiginde spesifik olarak hibritlenebilir ve spesifik baglanmanin istendigi kosullar altinda, yani, in vivo olarak analizler ya da terap'ötik tedavi durumunda fizyolojik kosullar altinda, ya da deneylerin yürütüldügü kosullar altinda, in vitro olarak deneyler durumunda fizyolojik kosullar altinda oligonükleotidin hedef olmayan sekanslara spesifik olmayan baglanmasini önlemek için yeterli derecede tamamlayicilik bulunmaktadir. Böylece, diger uygulamalarda, bu oligonükleotid, spesifik olarak hibridize ettigi ya da hedeflendigi bir gen ya da mRNA sekansinin bölgesine kiyaslandigi üzere, `örnegin uyumsuz eslesmeler gibi, 1, 2 ya da 3 baz ikameleri içerir. RNA Interferans Nükleik Asitler Ozel düzenlemelerde, burada tarif edilen nükleik asit- Iipit partikülleri, RNA interferans (RNAi) molekülleri ile iliskilidir. RNAi moleküllerini kullanan RNA interferans yöntemleri ilgili bir gen ya da polinükleotid ifadesini bozmak için kullanilabilir. Küçük müdahale edici RNA (siRNA) esas olarak, gelistirilme altinda hedeflenmis oligonükleotid ilaçlarin bir sonraki jenerasyonu olarak antisens ODN ve ribozimlerin yerini almistir. SiRNA'Iar, RNAi kaynakli susturma kompleksi (RlSC) olarak bilinen bir sitoplazmik multi- protein kompleksi ile iliskilendirilebilen normal olarak 21- 30 nükleotid uzunlugundaki RNA dubleksleridir. siRNA ile yüklenmis RISC, homolog mRNA transkriptlerinin bozulmasina aracilik eder, bu nedenle siRNA, protein ekspresyonunu yüksek spesifite ile yikmak üzere tasarlanabilir. Diger antisens teknolojilerinden farkli olarak, siRNA, kodlama olmayan RNA yoluyla gen ifadesini kontrol etmek için dogal bir mekanizma dogrultusunda islev görür. Bu durum, genellikle aktivitelerinin in vitro ve in vivo seklinde ya antisens ODN ya da ribozimlerden daha etkin olmasinin nedeni olarak kabul edilir. Klinik olarak ilgili hedefleri hedefleyen siRNA'lar dahil olmak üzere çesitli RNAi sayili belgede tarif edildigi gibi farmasötik gelisme altindadir. Ilk tarif edilen RNAi molekülleri, hem bir RNA sens hem de RNA antisens sarmallarini içeren RNA: RNA hibritleri olmus iken, simdi DNA sens: RNA antisens hibritleri, RNA sens: DNA antisens hibritleri ve DNA: DNA hibritlerinin, RNAitya aracilik edebildigi gösterilmistir (Lamberton, JS. ve Christian, AT., (2003) Molecular Biotechnology 24: 111- 119 sayili belge). Dolayisiyla, burada, bu farkli tipteki çift- sarmalli moleküllerden herhangi birini içeren RNAi moleküllerin kullanimi ihtiva edilir. Buna ilaveten, RNAi moleküllerin çesitli formlar halinde hücrelere dahil edilebilecegi ve kullanilabilecegi anlasilmaktadir. Buna bagli olarak, burada kullanildigi sekliyle, RNAi molekülleri, iki farkli sarmallari, yani bir sens sarmali ve bir antisens sarmali, içeren çift sarmalli oligonükleotidleri, örnegin küçük müdahale edici RNA (siRNA); nükleotidil olmayan baglayici ile birlikte baglanan iki farkli sarmallari içeren çift- sarmalli oligonükleotidi; örnegin, shRNAi molekülleri gibi, bir çift- sarmalli bölgeyi olusturan tamamlayici sekanslarin saç tokasi ilmegini içeren oligonükleotidleri ve bir baska polinükleotid ile kombinasyon halinde ya da tek basina bir çift sarmalli polinükleotidi olusturabilen bir ya da daha fazla polinükleotidi ifade eden ifade vektörleri de dahil olmak üzere hücrelerde bir RNAi yanitini tetikleyebilen herhangi birini ve tüm molekülleri içerir, ancak bunlarla sinirli tutulamaz. Burada kullanildigi sekliyle, bir "tek sarmalli siRNA bilesigi , bir tek molekülden yapilan bir siRNA bilesigidir. Örnegin, bir saç tokasi ya da tava sapi yapisi olabilen ya da içerebilen, intra- sarmal eslesmesi ile olusturulan bir dubleks bölgeyi içerebilir. Tek sarmalli siRNA, hedef molekülüne göre antisens olabilir. Birtek sarmalli siRNA bilesigi, RISC'ye girebilecek ve bir hedef mRNA'nin RISC aracili bölünmesine katilabilecek kadar uzun olabilir. Bir tek sarmalli siRNA bilesigi en az 14 uzunlugundadir. Bazi düzenlemelerde, 200, 100, ya da 607dan daha az nükleotid uzunlugundadir. nükleotid çiftine esittir ya da bunlarin bir dubleks bölgesine sahip olacaktir. Dubleks bölge, belki de uzunlukça 200, 100, ya da 50'ye esit ya da daha az bir uzunlukta olabilir. 21 nükleotid çiftleri uzunlugundadir. Saç tokasi yapisi, tek sarmalli bir çikintiya ya da terminal çiftlenmemis bölgeye sahiptir. Bazi düzenlemelerde, çikintilar 2- 3 nükleotid uzunlugundadir. Bazi düzenlemelerde, çikinti saç tokasi yapisinin sens tarafindadir ve bazi uygulamalarda saç tokasi yapisinin antisensi üzerindedir. Burada kullanildigi sekliyle bir "çift sarmalli siRNA bilesik", burada zincirler arasi hibridizasyonunun bir dubleks yapisinin bir bölgesini olusturabilen birden fazla ve bazi durumlarda ikisini içeren bir siRNA*dir. nükleotid uzunlugundadir. Burada kullanildigi sekliyle, "antisens sarmali" terimi, örnegin bir hedef RNA gibi bir hedef molekülüne yeterli bir sekilde tamamlayici olan bir siRNA bilesiginin sarmali anlamina gelmektedir. nükleotid uzunlugundadir. olabilir. Belki de, 200, 100, ya da 50'ye esit ya da daha az bir uzunlukta olabilir. Birçok düzenlemede, siRNA bilesigi örnegin siRNA ajanlari gibi, daha küçük siRNA bilesiklerini üretmek için bir endojen molekül ile, örnegin Dicer ile, bölünebilmek için yeteri kadar büyüktür. Sens ve antisens sarmallari, çift- sarmalli siRNA bilesigi, molekülün bir ya da her iki ucunda çiftlenmemis bölgeyi ya da bir tek sarmali içerecek bir sekilde seçilebilmektedir. Böylece, bir çift- sarmalli siRNA bilesigi, örnegin, 1- 3 nükleotidin bir ya da iki 5' ya da 3' çiktisini ya da bir 3' çiktisi gibi bir çiktisini içermek üzere çiftlenen sens ve antisens sarmallari içerebilir. Çiktilar, bir sarmalin digerinden daha uzun olmasinin bir sonucu olabilir, ya da ayni uzunluktaki iki sarmallarin katlanmasinin sonucu olabilir. Bazi düzenlemeler en az bir 3' çiktisina sahiptir. Bir düzenlemede, bir siRNA molekülünün her iki ucu, bir 3' çiktisina sahip olacaktir. Bazi düzenlemelerde, çikti 2 nükleotittir. Bazi düzenlemelerde, dubleks bölge için uzunluk, örnegin yukarida tartisilan ssiRNA nükleotittir. ssiRNA bilesikleri, uzun dsiRNA'lardan dogal Dicerrle islenmis ürün uzunluklarina ve yapisina benzeyebilir. ssiRNA bilesiginin iki sarmalinin bagli oldugu, örnegin kovalent bagli oldugu düzenlemeler de dahil edilmistir. Saç tokasi yapisi, ya da gereken çift sarmalli bölgeyi temin eden diger tek sarmalli yapilar ve bir 3' çikintisi da ayni zamanda bulusa dahildir. Çift sarmalli siRNA bilesikleri ve tek- sarmalli siRNA bilesikleri de dahil olmak üzere burada tarif edilen siRNA bilesikleri, örnegin bir proteini kodlayan bir genin transkripti olan örnegin, mRNA gibi bir hedef RNA'nin susturulmasina aracilik edebilir. Uygunluk açisindan, bu tür mRNA burada, susturulacak mRNA olarak da adlandirilmaktadir. Bu tür bir gen de ayni zamanda bir hedef gen olarak adlandirilir. Genelde, susturulacak olan RNA, endojen bir gen ya da patojen bir genidir. Buna ilaveten, mRNA disindaki RNA*Iar, örnegin tRNA'Iar ve viral RNA'lar da hedeflenebilir. Burada kullanildigi sekliyle, "RNAi'ye aracilik etme" ifadesi, bir sekansa spesifik bir sekilde bir hedef RNA'yi susturma yetenegini ifade eder. Teoriye bagli kalmak istenmemekle birlikte, susturmanin RNAi makinesi ya da prosesini ve bir kilavuz RNA'yi, 21 ila 28 nükleotidli bir ssiRNA bilesigini kullandigina inanilmaktadir. Bir düzenlemede, bir siRNA bilesigi, örnegin, bir hedef mRNA gibi hedef bir RNA'ya proteinin üretimini susturur. Bir baska düzenlemede, siRNA bilesigi, örnegin hedef RNA gibi bir hedef RNA'ya "tam olarak tamamlayicidir" ve siRNA bilesigi, örnegin tamamen tamamlayicilik bölgesinde sadece Watson- Crick baz çiftlerinden yapilmis bir melez olusturmak üzere tavlanmaktadir. "Yeterince tamamlayici" bir hedef RNA, bir hedef RNA'ya tam olarak tamamlayici olan bir iç bölgeyi (örnegin, en az 10 nukleotid) içerebilir. Bundan baska, bazi düzenlemede, siRNA bilesigi özellikle bir tek- nükleotid farkini ayirt eder. Bu durumda, siRNA bilesigi, tam tamamlayicilik, tek nukleotid farki bölgesinde bulundugunda (örnegin 7 nükleotidler içerisinde) sadece RNAi aracilik Hedef polinükleotitlerin ifadesini spesifik olarak inhibe etmek için RNA müdahalesi (RNAi) kullanilabilir. Genin ve nükleik asidin ifadesinin çift sarmalli RNA aracili baskilanmasi, hücrelere veya organizmalara dsRNA, siRNA veya shRNA7nin sokulmasiyla gerçeklestirilebilir. siRNA çift sarmalli RNA veya hem RNA hem de DNA, örnegin bir RNA sarmali ve bir DNA sarmali içeren bir hibrit molekül olabilir. siRNAtlarin bir hücreye dogrudan sokulmasinin memeli hücrelerinde RNAi'yi tetikleyebildigi hücrelerinde baskilama RNA seviyesinde ortaya çikmistir ve RNA ve protein baskilamasi arasinda güçlü bir korelasyonla birlikte hedeflenen genler için spesifiktir üzere genis bir çesitlilikteki hücre hatlarinin bir dereceye kadar siRNA susturmasina duyarli oldugu gösterilmistir (Brown, D. Vd., TeohNotes 9(1): 1- 7, www.d0t.ambion.dot.com / techlib / tn / 912.html (9 / 1 /02) websitesinde bulunabilir). Spesifik polinükleotitleri hedefleyen RNAi molekülleri teknikte bilinen prosedürlere göre kolayca hazirlanabilir. Etkili siRNA moleküllerinin yapisal karakteristikleri transkripti hedeflemek için genis bir çesitlilikte farkli siRNA moleküllerinin kullanilabilecegini anlayacaktir. Belirli bazi düzenlemelerde bulusa göre siRNA molekülleri çift sarmallidir ve aradaki her bir tamsayiyi içerecek sekilde 16- 30 veya 18- 25 nükleotit uzunlugundadir. Bir düzenlemede bir siRNA 21 nükleotit uzunlugundadir. Belirli bazi düzenlemelerde siRNAilar 0- 7 nükleotitlik 3* çikintilarina veya 0- 4 nükleotitlik 5' çikintilarina sahiptir. Bir düzenlemede bir siRNA molekülü bir iki nükleotitlik 3' çikintisina sahiptir. Bir düzenlemede bir siRNA iki nükleotitlik 3, çikintisi ile birlikte 21 nükleotit uzunluguna sahiptir (yani sens ve antisens sarmallari arasina bir 19 nükleotitlik tamamlayici bölge içerir). Belirli bazi düzenlemelerde, çikintilar UU veya deT 3, çikintilaridir. Genel olarak siRNA molekülleri bir hedef DNA molekülünün bir sarmali için tamamen tamamlayicidir çünkü tek bir baz çifti uyusmazliginin bile susturmayi azalttigi gösterilmistir. Diger düzenlemelerde siRNA'lar, örnegin 2'- deoksi- veya 2"- O- metil modifikasyonlari gibi modifiye bir iskelete sahip olabilir. Bununla birlikte tercih edilen düzenlemelerde siRNA sarmalinin tamami 2'- deoksi veya 2- O- modifiye bazlardan yapilmaz. Diger bir düzenlemede burada açiklanan, bir hücredeki bir genin ifadesini inhibe etmek için bir vektör içeren bir hücredir. Vektör, burada açiklanan dsRNAilardan birinin en az bir sarmalini kodlayan bir nükleotit dizisine islevsel olarak baglanan bir düzenleyici sekansi içerir. Bir düzenlemede siRNA hedef bölgeleri, hedef mRNA transkript sekansinin AA dinükleotit sekanslarinin bulunusu için taranmasi ile seçilir. 3' bitisik yaklasik 19 nükleotit ile kombinasyon halindeki her bir AA dinükleotit sekansi potansiyel siRNA hedef bölgeleridir. Bir düzenlemede siRNA hedef bölgeleri tercih edilen sekliyle 51 ve 3, translate edilmemis bölgeler arasinda (UTR'Ier) baslangiç kodonu (yaklasik 75 baz içinde) yakinindaki bölgelerde konumlanmamistir çünkü düzenleyici bölgelere baglanan proteinler siRNP endonükleaz kompleksinin baglanmasina müdahale www.ncbi.nlm'de NCBI sunucusu üzerinde bulunur, gibi uygun bir genom veritabani ile karsilastirilabilir ve diger kodlama sekanslarina önemli derecede homolog olan potansiyel hedef sekanslari elimine edilebilir. Belirli bazi düzenlemelerde kisa saç tokasi RNAilar burada açiklanan nükleik asit- Iipit parçaciklarinin nükleik asit bilesenini yapilandirabilir. Kisa saç tokasi RNA (shRNA), sekansa spesifik olarak bir hedef genin ifadesini azaltma yetenegine sahip bir saç tokasi RNA formudur. Kisa saç tokasi RNA'Iar, hücresel ortamda genel olarak daha kararli olduklari için ve bozunmaya karsi daha az duyarli olduklari için gen ifadesini bastirmada siRNAîlara kiyasla bir avantaj sunabilirler. Bu tür kisa saç tokasi RNA aracili gen susturmanin, çesitli normal ve kanser hücre hatlarinda ve fare ve insan hücreleri de dahil olmak üzere memeli hücrelerinde çalistigi gösterilmistir. Paddison, kromozal genleri tasiyan transgenik hücre hatlari üretilmistir. Bu hücreler yapisal olarak shRNA'Iari sentezleme kabiliyetine sahiptirler, dolayisiyla döl hücrelerine geçebilen uzun süreli veya yapisal gen susturmayi kolaylastirirlar. Paddison, P. vd., shRNA'Iar bir kök ilmek yapisini içerirler. Belirli bazi düzenlemelerde çesitli kök uzunluklarina, tipik olarak 19 ila 29 nükleotit uzunluguna veya bunlarin arasindaki herhangi bir sayidaki uzunluga sahip olabilirler. Belirli bazi düzenlemelerde saç tokasi 19 ila 21 nükleotit köküne sahip olabilirken, diger düzenlemelerde saç tokalari 27 ila 29 nükleotit köklerine sahip olabilir. Belirli bazi düzenlemelerde ilmek boyutu 4 ila 23 nükleotit uzunlugundadir, ancak ilmek boyutu susturma aktivitesini önemli derecede etkilemeden 23 nükleotitten büyük olabilir. shRNA molekülleri, örnegin tesiri azaltmadan shRNA'nin iki sarmali arasindaki G- U uyusmazligi gibi uyusmazliklari içerebilirler. Aslinda belirli bazi düzenlemelerde shRNA*Iar, örnegin bakterilerin çogalmasi sirasinda saç tokalarini stabilize etmek için saç tokasi kökünde bir veya birkaç G- U çiftlenmesi içermek üzere tasarlanmislardir. Bununla birlikte hedef mRNAtya (antisens sarmali) baglanan kök kismi ve mRNA arasinda tamamlayicilik tipik olarak gereklidir ve bu bölgede tek bir baz çifti uyusmazligi bile susturmayi ortadan kaldirabilir. 5, ve 3' çikintilari gerekli degildir çünkü mevcut olabilmelerine ragmen shRNA fonksiyonu için kritik olmadiklari görülür (Paddison vd., (2002) Genes & Dev. 16(8): 948- 58). MikroRNA'lar Mikro RNA'Iar (miRNA'Iar), bitki ve hayvanlarin genomlarinda DNA'dan kopyalanan, ancak proteine dönüstürülmeyen, oldukça yüksek bir sekilde korunmus küçük RNA moleküllerin bir sinifidir. islenmis miRNA'Iar, tek sarmalli ~17- 25 nükleotid (nt) RNA molekülleri olup, RNA kaynakli susturma kompleksi (RISC) içerisine dahil edilirler ve gelisim, hücre proliferasyonu, apoptoz ve farklilasmanin anahtar düzenleyicileri olarak tanimlanmislardir. Gen ifadesinin düzenlenmesinde, 3'- çevrilmemis spesifik mRNA bölgesine baglanarak bir rol oynadiklarina inanilmaktadir. RlSC, gen ekspresyonunun translasyon inhibisyonu, transkript bölünmesi, ya da her ikisi dogrultusunda asagi regülasyonuna aracilik eder. RISC, ayni zamanda genis bir ökaryot araligindaki nükleus içindeki transkripsiyonel susturmada da rol oynar. Bugüne kadar tanimlanmis miRNA sekanslarinin sayisi, büyüktür ve gelismeye devam etmektedir, bunun açiklayici örnekleri, örnegin: "miRBasez mikroRNA dizileri, hedefler ve gen nomenklatürleri" Griffiths- Jones 8, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, ayni zamanda http: / / mikroma.sanqer.ac.uk / sequences /_adresinden bulunabilir. Antisens Oliqonükleotitleri Bir düzenlemede, bir nükleik asit, bir hedef polinükleotide yönelik bir antisens oligonükleotididir. "Antisens oligonükleotid" terimi, ya da basitçe "antisens" teriminin, hedeflenmis bir polinükleotid sekansina tamamlayici olan oligonükleotidleri içerdigi anlamina gelir. Antisens oligonükleotidleri, seçilen bir sekansa tamamlayici olan DNA ya da RNAtnin tek sarmallaridir. Örnegin, bir hedef gen mRNA`sidir. Antisens oligonükleotidlerinin tamamlayici bir mRNA'ya baglanarak gen ifadesini inhibe ettigi düsünülmektedir. Hedef mRNA'ya baglanma, gen ifadesinin inhibisyonuna, ya tamamlayici mRNA sarmallarinin ona baglanarak translasyonunu önleyerek ya da hedef mRNA'nin bozunmasina yol açarak gen ifadesinin inhibisyonuna yol açabilir. Antisens DNA, spesifik, tamamlayici (kodlayan ya da kodlamayan) RNA'yi hedeflemek için kullanilabilir. Baglanma gerçeklesirse, bu DNA / RNA hibrid enzim RNaz H tarafindan bozunabilir. Bazi uygulamada, antisens oligonükleotidleri yaklasik 10 ila yaklasik 50 arasinda nükleotidleri, daha fazla tercih edilen sekliyle yaklasik 15 ila yaklasik 30 arasinda nükleotidleri içerir. Terim ayni zamanda istenen hedef gene tam olarak tamamlayici olamayan antisens oligonükleotidleri de kapsar. Bu nedenle, tarifname, hedef olmayan spesifik aktivitelerin, antisens ile bulundugu durumlarda kullanilabilir, ya da, hedef sekansinin belirli bir kullanim için en çok tercih edildigi durum ile bir ya da daha fazla uyumsuzluk içeren bir antisens sekansinin bulundugu durumlarda kullanilabilir. Antisens oligonukleotidlerinin, protein sentezinin etkili ve hedeflenmis inhibitörleri oldugu gösterilmistir ve sonuç olarak, hedeflenen bir gen tarafindan protein sentezini spesifik olarak inhibe etmek için kullanilabilir. Protein sentezini inhibe etmek için antisens oligon'ukleotidlerin etkinligi iyi olusturulmustur. Ornegin, poligalaktauronaz ve muskarin tip 2 asetilkolin reseptörünün sentezi, ilgili mRNA sekanslarina yönlendirilen antisens oligon'ukleotidler tarafindan inhibe edilir (U. 8. Patent 5,739,119 ve U. 8. Patent 5,759,829 sayili belgeler). Ayrica, antisens inhibisyonu örnekleri, nükleer protein siklin, çoklu ilaç dirençli gen (MDG1), lCAM- 1, E- selektin, STK- 1, striatal GABAA reseptörü ve insan EGF'si ile gösterilmistir (Jaskulski ve dig., Science. 1988 ,610,288 sayili belgeler). Ayrica, antisens yapilari da ayni zamanda çesitli anormal hücresel proliferasyonlari, örnegin kanseri, önlemek ve tedavi etmek için Patent 5,783,683 sayili belgeler). Antisens oligonükleotidleri üretme yöntemleri teknikte bilinmektedir ve herhangi bir polinükleotid sekansini hedefleyen bir antisens oligonükleotidinin 'üretilmesi için kolaylikla uyarlanabilir. Belirli bir hedef sekans için spesifik antisens oligon'ukleotid sekanslarinin seçimi, seçilen hedef sekansin analizine ve ikincil yapi, Tm, baglanma enerjisi ve nispi stabilitenin belirlenmesine dayanir. Antisens oligon'ukleotidleri, bir konakçi hücrede hedef mRNA'ya spesifik baglanmayi azaltabilmesi ya da engellenmesi 'üzere dimerleri, saç tokalari yapilari ya da diger sekonder yapilari olusturmak için göreceli yetersizliklerine bagli olarak seçilebilir. mRNA'nin oldukça fazla tercih edilen hedef bölgeleri, AUG translasyon baslatma kodonunun yakininda bulunan ya da bu kodonda bulunan bu bölgeleri ve mRNA'nin 5' bölgelerine tamamlayici olan bu sekanslari içerir. Bu sekonder yapi analizleri ve hedef alan seçimi varsayimlari, v.4 OLIGO primer analizi yazilimi (Molecular Biology Insights) ve I veya 3389- 402) kullanilarak olusturulabilir. Antagomirler Antagomirler, RNAz korumasi ve artmis doku ve hücresel alim gibi farmakolojik özellikler için çesitli modifikasyonlari barindiran RNA benzeri oligon'i'ikleotidlerdir. Bunlar, normal RNAidan, örnegin, seker, fosforotioat omurgasi ve örnegin, 3'- ucunda kolesterol- kisminin tam 2'- O- metilasyonu ile ayrilirlar. Antagomirler, antagomir ve endojen miRNAilari içeren dubleksler olusturarak etkili bir sekilde susturma endojen miRNAtlari için kullanilabilir, böylece miRNA ile kaynaklanan gen susturulmasini önler. Antagomir aracili miRNA susturmaya ait bir örnek, Krutzfeldt ve dig., Nature, 2005, RNA'lari standart kati faz oligonükleotid sentezi protokolleri kullanilarak sayili belge. Bir antagomir, oligonükleotid sentezi için Iigand- konjuge monomer alt- birimleri ve monomerleri içerebilir. Ornek teskil eden monomerler, 10 Agustos 2004'te dosyalanan açiklandigi gibi bir ZXY yapisina sahip olabilir. Bir antagomir, bir amfipatik kisim ile kompleks hale getirilebilir. Oligonükleotid ajanlar ile kullanim için örnek teskil eden amfipatik kisimlar, 8 Mart 2004 tarihinde dosyalanmis PCT Basvurusu No. PCT / US2004 / 07070 sayili tarif edilmistir. Aptamerler Aptamerler, yüksek afinite ve özgüllüge sahip belirli bir ilgi molekülüne baglanan organik moleküllere kadar birçok farkli varliklari baglayan DNA ya da RNA aptamerleri basarili bir sekilde üretilmistir. Bakiniz Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 10- 16 (1997), 820- 5 (2000). Aptamerler RNA ya da DNA bazli olabilir, ve bir ribosiviç içerebilir. Bir ribosiviç, bir mRNA molekülünün, küçük bir hedef moleküle direkt olarak baglanabilen ve hedefin baglanmasinin genin aktivitesini etkiledigi bir parçasidir. Böylece, bir ribosiviç içeren bir mRNA, kendi hedef molekülünün mevcudiyetine ya da yokluguna bagli olarak, kendi aktivitesini düzenlemede dogrudan rol oynar. Genel olarak, aptamerler, örnegin küçük moleküller, proteinler, nükleik asitler ve hatta hücre, dokular ve organizmalar gibi çesitli moleküler hedeflere baglanmalari için in vitro seçimin ya da esit bir sekilde tekrarlanan kontrolü, SELEX (üslü zenginlestirme ile ligandlarin sistematik evrimi) yoluyla tasarlanmistir. Aptamer, sentetik, rekombinant ve saflastirma metotlari da dahil olmak üzere bilinen herhangi bir metot ile hazirlanabilir ve tek basina ya da ayni hedef için spesifik diger aptamerler ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Ayrica. burada daha ayrintili olarak tarif edildigi gibi "aptamer" terimi, 'özellikle verilen bir hedefe iki ya da daha fazla bilinen aptameri karsilastirmaktan türetilen bir konsensüs sekansini içeren "sekonder aptamerler" terimini içerir. Ribozimler Bunun içinde tarif edilen baska bir uygulamaya göre, nükleik asit- lipit partikülleri ribozimler ile iliskilidir. Ribozimler, endonükleaz aktivitesine sahip olan spesifik katalitik alanlara sahip RNA molekül kompleksleridir (Kim ve Cech, Proc Natl Acad Sci USA. sayili belgeler). Ornegin, çok sayida ribozim, bir oligonükleotid substratta siklikla birkaç fosfoesterden sadece birini bölerek yüksek derecede spesifite ile fosfoester transfer reaksiyondan önce ribozimin dahili kilavuz sekansina ("lGS") spesifik baz eslestirme etkilesimleri vasitasiyla baglanmasi gereksinimine baglanmistir. Dogal olarak olusan enzimatik RNA'Iarin en az alti temel çesidi günümüzde bilinmektedir. Her biri, trans halindeki RNA fosfodiester baglarinin hidrolizini fizyolojik kosullar altinda (ve böylece diger RNA moleküllerini b'olebilir) katalize edebilir. Genelde, enzimatik nükleik asitler, bir hedef RNA,ya ilk baglanarak hareket eder. Bu tür baglanma, hedef RNA'nin bölünmesi için etki eden molekülün bir enzimatik kismina çok yakin bir yerde tutulan bir enzimatik nükleik asitin hedef baglama kismi yoluyla olusur. Böylece, enzimatik nükleik asit ilk önce tanimlanir ve daha sonra tamamlayici baz eslestirmesi ile bir hedef RNA'yi baglar ve bir kez dogru yere baglanir, hedef RNA'yi kesmek için enzimatik olarak hareket eder. Bu tür bir hedef RNA'nin stratejik bölünmesi, kodlanmis bir proteinin sentezini dogrudan degistirme yetenegini ortadan kaldiracaktir. Bir enzimatik nükleik asidin baglanmasi ve kendi RNA hedefini bölmesinden sonra, baska bir hedef aramak için bu RNAidan salinir ve tekrar tekrar yeni hedeflere baglanabilir. Enzimatik nükleik asit molekülü, bir çekiç basi, saç tokasi, bir hepatit ö virüs, grup l intron ya da RNazP RNA'sinda (bir RNA kilavuz sekansi ile baglantili olarak) ya da Neurospora VS RNA motif, örnegin olusturulabilir. Çekiç basi motiflerinin spesifik ile tarif edilmistir. Saç tokasi motiflere ait örnekler, Hampel ve dig. (Eur. Pat. Appl. Publ. ,631,359 sayili belgeler tarafindan tarif edilmektedir. Hepatit ö virüs motifine ait bir tarif edilmistir; RNAthye ait bir örnek, Guerrier- Takada ve dig., Celi. 1983 Aralik 35(3 Pt 2): 849- 57 sayili belgede tarif edilmistir; Neurospora VS RNA ribozim motifi Collins bir örnek, U. 8. Patent 4,987,071 sayili belgede tarif edilmistir. Bulusa göre kullanilan enzimatik nükleik asit moleküllerinin önemli karakteristikleri, hedef gen DNA ya da RNA bölgelerinin bir ya da daha fazlasina tamamlayicisi olan spesifik bir substrat baglanma alanina sahip olmalari ve moleküle bir RNA bölünme aktivitesi veren substrat baglanma bölgesi içerisinde ya da çevreleyen nükleotid sekanslarina sahip olmalaridir. Böylece ribozim yapilarinin, burada belirtilen spesifik motiflerle sinirli olmasi gerekmez. Herhangi bir polinükleotid sekansina hedeflenen bir ribozim üretme metotlari, teknikte bilinmektedir. Ribozimler, Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93 / 23569 ve lnt. Pat. Appl. Publ. No. WO 94 / 02595 sayili belgede tarif edildigi gibi tasarlanabilir ve burada tarif edildigi gibi, in vivo ve in vivo olarak test edilecek sekilde sentezlenir. Ribozim aktivitesi, ribozim baglama kollarinin uzunlugunu degistirerek ya da ribozomlari kimyasal ribozimler ile degistirerek, serum ribonükleazlari tarafindan bozunmasini önleyen modifikasyonlarla (bakiniz, örnegin, Uluslararasi Patent Basvurusu Yayin No. WO 92 / 07065; Uluslararasi Patent Basvurusu Yayin No. WO Basvurusu Yayin No. WO 94 / 13688, enzimatik RNA moleküllerinin seker kisimlarina yapilabilecek çesitli kimyasal modifikasyonlari tanimlar), burada RNA sentez sürelerini kisaltmak ve kimyasal gereksinimleri azaltmak için hücre IIJde etkinligini artiran ve kök Burada tarif edilen kompozisyonlarda ve metotlarda kullanilmasi için uygun oligonükleotidlerin (ODN'ler) ilave spesifik nükleik asit sekanslari, US Patent 6,406,705 ve Raney ve dig., Journal of Pharmacology ve Experimental Therapeutics, tarif edilen kompozisyonlarda ve metotlarda kullanilan ODN'Ier, bir fosfodiester ("PO") omurgaya ya da bir fosforotioat ("PS") omurgaya ve / veya bir CpG motif içinde en az bir metillenmis sitosin kalinitisina sahiptir. Nükleik Asit Modifikasyonlari ilaç tasarimi için yeni, heyecan verici bir paradigma ve gelisim gösterdi, ancak bunlarin iri vivo uygulamalari endo- ve egzo- nükleaz aktivitesi ve bunun yani sira basarili hücre içi dagitimin eksikliginden dolayi engellendi. Bozunma konusu, oligonükleotit (oligo) ilaçlarin nükleaz enzimleri tarafindan taninmasini önleyen ancak bunlarin etki mekanizmalarini engelleyemeyen kimyasal modifikasyonlar üzerinde yapilan takip eden kapsamli arastirma ile etkin bir sekilde asildi. Bu arastirma, günümüzde gelismekte olan antisens ODN ilaçlarin, degistirilmemis moleküller için dakikalar ile karsilastirildiginda in vivo olarak günlerce bozunmadan kalmasi oldukça basariliydi (Kurreck, J. 2003. Antisense technologies. Improvement through novel Chemical modifications. Eur J Biochem 270: 1628- 44). Bununla birlikte, hücre içi dagitim ve etki mekanizma konulari bugüne kadar antisens ODN ve ribozimlerin klinik ürün haline gelmesini sinirlamistir. RNA dupleksleri dogal olarak tek sarmalli DNA veya RNA'ya göre nükleazlara daha stabildir ve antisens ODN'nin aksine, modifiye edilmemis siRNA sitoplazmaya eristiklerinde iyi aktivite gösterir. Yine de ne kadar kimyasal modifikasyonunun tolere edilebilecegini ve farmakokinetik ve farmakodinamik aktivitenin artirilip artirilamayacagini belirlemek için ODN ve ribozomlar ayni zamanda sistematik olarak siRNAiya uygulanmistir. siRNA dupleksler tarafindan RNA müdahalesi bir antisens ve sens sarmalini gerektirir ki bu farkli fonksiyonlara sahiptir. Her ikisi de siRNA'nin RlSC'e girmesini saglamak için gereklidir, ancak bir kez yüklendiginde iki sarmal ayrilir ve sens sarmali bozunur oysaki antisens sarmali RISC'yi hedef mRNA'ya yönlendirmek için oldugu gibi kalir. RISC'e giris, hedef mRNA,nin taninmasi ve ayrilmasindan yapisal olarak daha az zorlayicidir. Sonuç olarak sens sarmalinin pek çok farkli kimyasal modifikasyonu mümkündür ancak yalnizca sinirli degisimler antisens sarmali tarafindan tolere edilebilir (Zhang vd., 2006) Teknikte bilindigi üzere bir nükleosit bir baz- seker kombinasyonudur. Nükleotitler, ayrica nükleositin seker kismina kovalent olarak baglanan bir fosfat grubunu içeren nükleositlerdir. Bir pentofurasonil sekeri içeren nükleositler için fosfat grubu sekerin 2', 3' veya 5! hidroksil grubuna baglanabilir. Oligonükleotitler olusurken, fosfat gruplari dogrusal bir polimerik bilesik olusturmak üzere bitisik nükleositleri bir digerine kovalent olarak baglarlar. Dolayisiyla bu dogrusal polimerik yapinin ilgili uçlari ayrica dairesel bir yapi olusturmak üzere birlestirilebilir. Oligonükleotit yapisi içinde, fosfat gruplari siklikla oligonükleotitlerin internükleosit iskeletini olusturdugu seklinde anilir. RNA ve DNAinin normal bagi veya iskeleti bir 3' veya 5' fosfodiester bagidir. Bir lipit- nükleik asit parçaciginda kullanilan, burada tarif edilen nükleik asit bilinen herhangi bir formdaki nükleik asidi içerir. Böylece nükleik asit, nükleaz direncini ve serum stabilitesini artirmak için daha önce kullanilan türde bir modifiye nükleik asit olabilir. Ancak, sasirtici bir sekilde terapötik ürünler, dogal nükleik asit polimerlerinin fosfodiester baginda modifikasyona sahip olmayan nükleik asitlerden gelen lipit- nükleik asit parçaciklarini formüle etmek için burada tarif edilen yöntemin kullanilmasi ile de hazirlanabilirler ve modifiye edilmemis fosfodiester nükleik asitlerin kullanimi (yani tüm baglarin fosfodiester baglari oldugu nükleik asitler) tercih edilen bir düzenlemedir. Iskelet Modifikasyonlari Burada faydali olan antisens, siRNA ve diger oligonükleotitler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte modifiye iskeletleri veya dogal olmayan internükleosit baglarini içeren oligonükleotitleri içerir. Modifiye iskeletlere sahip oligonükleotitler iskelette bir fosfor atomunu bulunduran ve iskelette bir fosfor atomuna sahip olmayanlari içerir. internükleosit iskeletlerinde bir fosfor atomuna sahip olmayan modifiye oligonüklotitler de ayni zamanda oligonükleositler olarak düsünülebilir. Modifiye Oligonükleotit iskeletleri ayni zamanda, örnegin fosforotiyoatlari, kiral fosforotiyoatlari, fosforoditiyoatlari, fosfortriesterleri, aminoalkilfosfotri- esterleri, 3'- alkilen fosfonatlar ve kiral fosfonatlar da dahil olmak 'üzere diger metil ve alkil fosfonatlari, fosfinatlari, 3'- amino fosforamidat ve aminoalkilfosforamidatlar da dahil olmak üzere fosforamidatlari, tiyonofosforamidatlari, tiyonoalkilfosfonatlari, tiyonoalkilfosfotriesterleri, fosforoselenat, metilfosfonat veya 0- alkil fosfotriester baglarini ve normal 3,- 5, baglarina sahip boranofosfatlar, bunlarin 21 - 57 bagli analoglari ve nükleosit birimlerinin bitisik çiftlerinin 3" - &ben 5; - 3"e veya 2' - 5"den 57 - 2"ye baglandigi durumda ters çevrilmis polariteye sahip olanlarini içerir. Burada tarif edilen bir nükleik asit içinde bulunabilecek belirli modifikasyonlarin belirli, sinirlayici olmayan örnekleri Tablo 2'de gösterilmistir. Çesitli tuzlar, tuz karisimlari ve serbest asit formlari da dahildir. Yukaridaki baglarin hazirlanmasini ögreten temsili Birlesik Devletler patentleri, bunlarla sinirli olmamakla Belirli bazi düzenlemelerde bir fosfor atomu içermeyen modifiye oligonükleotit iskeletler kisa zincirli alkil veya sikloalkil internükleosit baglar, karisik heteroatom ve alkil veya sikloalkil intern'ukleosit baglar veya bir veya daha fazla kisa zincir heteroatomik veya heterosiklik internükleosit baglar tarafindan olusturulan iskeletlere sahiptirler. Bunlar, 'örnegin morfolin baglari (kismen bir nükleositin seker kismindan olusan); siloksan iskeletler; sülfür, sülfoksit ve sülfon iskeletleri; formasetil ve tiyoformasetil iskeletleri, metilen formasetil ve tiyoformasetil iskeletleri; alken içeren iskeletler; s'ülfamat iskeletleri; metilenimino ve metilenhidrazino iskeletleri; sülfonat ve s'L'ilfonamid iskeletleri ve karisik N, 0, S ve CH2 bilesen parçalarina sahip digerlerini içerir. Yukaridaki oligonükleositleri tarif eden temsili Birlesik Devletler patentleri, Fosfodiester baginda köprü olusturmayan bir oksijenin kükürt ile yer degistirdigi fosforotiyoat iskeleti modifikasyonu (Tablo 3, #1), nükleik asit ilaçlarini nükleaz bozunmasina karsi stabilize etmek için uygulanan en eski ve en yaygin araçlardan biridir. Genel olarak aktivite üzerinde pek fazla etki yaratmadan her iki siRNA sarmalinda yogun bir sekilde PS modifikasyonlari yapilabilecegi görülmektedir sonuçlanacak sekilde, özellikle intravenöz uygulama `üzerine spesifik olmayan bir biçimde istekli olarak proteinlerle birlestigi bilinmektedir. Bu nedenle PS modifikasyonu genellikle 3, ve 5' uçlarinda bir veya iki baz ile sinirlandirilir. Boranofosfat baglayici (Tablo 3, #2), açik bir sekilde PStden daha stabil bir yakin zamanli modifikasyonduri siRNA aktivitesini artirir ve düsük bir toksisiteye sahiptir (Hall vd., Nucleic Acids Res. Tablo 3. siRNA ve Diger Nükleik Asitlere Uygulanan Kimyasal Modifikasyonlar Diger faydali nükleik asit türevleri, köprüleme oksijen atomlarinin (fosfoester baglarini olusturanlar) -S- ,- NH- ,- CH2- ve benzerleri ile degistirildigi nükleik asit moleküllerini içerir. Belirli düzenlemelerde, kullanilan antisens, siRNA ya da diger nükleik asitlerdeki degisiklikler nükleik asitlerle iliskili negatif yükleri tam olarak etkilemeyecektir. Bu yüzden, baglarin bir kisminin örnegin bir nötr metil fosfonat ya da fosforamidat baglari ile degistirilen antisens, siRNA ve diger nükleik asitlerin kullanimi düsünülmektedir. Nötr baglar kullanildiginda, belirli düzenlemede, nükleik asit baglarinin % 80iden daha azi bu sekilde ikame edilir ya da baglarin % 50'sinden daha azi ikame edilir. Baz Modifikasyonlari Baz modifikasyonlari iskelet ve seker modifikasyonlarindan daha az yaygindir. 0,3 - 6*da gösterilen modifikasyonlarin tamaminin nükleazlara karsi siRNA'yi stabilize ettigi ve aktivite üzerinde çok küçük bir etki yarattigi görülmektedir (Zhang, H. Y., Du, Q., Wahlestedt, C., Liang, Z. 2006. RNA lnterference with chemically modified siRNA. Curr Top Med Chem 6: 893- 900). Buna göre oligonükleotitler ayni zamanda nükleobazlari (siklikla teknikte basitçe "baz" olarak belirtilir) modifikasyonlari veya sübstitüsyonlari da içerebilir. Burada kullanildigi haliyle "modifiye edilmemis" veya "dogal" nükleobazlar pürin bazlari adenin (A) ve guanin (G) ve primidin bazlari timin (T), sitosin (C) ve urasili (U) içerir. Modifiye nükleobazlar 5- metilsitosin (5- me- C veya m50), 5- hidroksimetil sitosin, ksantin, hipoksantin, 2- aminoadenin, adenin ve guaninin 6- metil ve diger alkil türevleri, adenin ve guaninin 2- propil ve diger alkil türevleri, 2- tiyourasil, 2- tiyotimin ve 2- tiyositosin, - halourasil ve sitosin, 5- propinil urasil ve sitosin, 6- azo urasil, sitosin ve timin, 5- urasil (psödourasil), 4- tiyourasil, 8- halo, 8- amino, 8- tiyol, 8- tiyoalkil, 8- hidroksil ve diger 8- sübstitüe adeninler ve guaninler, 5- halo 'özellikle 5- bromo, 5- triflorometil ve diger 5- sübstitüe urasiller ve sitosinler, 7- metilguanin ve 7- metiladenin, 8- azaguanin deazaedenin gibi diger sentetik ve dogal nükleobazlari içerir. Belirli bazi nükleobazlar burada tarif edilen, 2- aminopropiladenin, 5- propinilurasil ve - propinilsitosini içeren 5- sübstitüe primidinler, 6- azaprimidinler ve N- 2, N- 6 ve O- 6 sübstitüe pürinleri içeren oligomerik bilesiklerin baglanma afinitesini artirmak için özellikle faydalidirlar. 5- Metilsitosin sübstitüsyonlarinin nükleik asit dupleks stabilitesini 0.6 - 1.2 I) arasinda artirdigi gösterilmistir (Sanghvi, Y. 8., Crooke, S. T. ve Lebleu, B., ed., Antisense Research and Applications 1993, CRC Press, Boca Raton, sayfa 276 - 278). Bunlar, ozellikle düzenlemeler 2'- O- metoksietil seker modifikasyonlari ile kombine edilebilir. Bu modifiye nükleobazlardan belirli bir kisminin ve bunlarin yani sira diger modifiye nükleobazlarin hazirlanmasini Ögreten Birlesik Devletler patentleri, bunlarla sinirli olmamakla birlikte yukarida belirtilen US Patent No. Seker Modifikasyonlari Seker grubu üzerindeki tüm modifikasyonlar RNA seker halkasinin 2,- OHii üzerinde meydana gelir ki bu uygun bir kimyasal reaktif bölge saglar (Manoharan, M. 2004. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs. Curr Opin Chem Biol 8: 570- 9; Zhang, H.Y., Du, Q., Wahlestedt, C., Liang, Z. 2006. RNA interference with ve 8) yaygindir ve her ikisi de stabiliteyi artirir, 2'- OME modifikasyonu sarmal basina 4 nükleotitten daha azi ile sinirli oldugu sürece aktiviteyi azaltmaz (Holen, T., Amarzguioui, M., Babaie, E., Prydz, H. 2003. Similar behaviour of single strand and double- strand siRNAs suggests they act through a common RNAi pathway. Nucleic Acids Res 31: en çok. modifiye bazlar molekülün orta bölgesi ile sinirlandiginda siRNA içinde etkilidir (Prakash, T.P., Allerson, C.R., Dande, P., Vickers, T.A., Sioufi, N., Jarres, R., Baker, B.F., Swayze, E.E., Griffey, R.H., Bhat, B. 2005. Positional effect on Chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. J Med Chem 48: 4247- 53). Aktivite kaybi olmadan siRNA'yi stabilize ettigi bulunan diger modifikasyonlar 0.10 - 14 arasinda gösterilir. Modifiye oligon'ükleotitler ayni zamanda bir veya daha fazla sübstit'üe seker grubu içerebilirler. Ornegin burada oligonükleotitler asagidakilerden birini 2' konumunda içerir: OH; F; 0- , 8- veya N- alkil, O- alkil- O- alkil, 0-, 8- veya N- alkenil veya 0- , 8- veya N- alkinil, burada alkil, alkenil ve alkinil sübstit'üe veya s'übstit'ue olmayan C1 ila C10 alkil veya C2 ila C10 alkenil ve alkinil olabilir. Ozellikle tercih edilenler O(CH2)nONH2 ve O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2'dir, burada n ve m 1 ila yaklasik 10'dur. Diger tercih edilen oligon'ukleotitler asagidakilerden birini 2' konumunda içerir: C1 ila 010 düsük alkil, sübstitüe düsük alkil, alkaril, aralkil, O- alkaril veya 0- aralkil, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCFa, SOCH3, SO2CH3, ONOz, N02, Ns, NH2, heterosikloalkil, heterosikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, süsbtitüe silil, bir RNA ayrilan grup, bir haberci grup, bir interkalatör, bir oligon'ukletitin farmakokinetik özelliklerini iyilestirmek için bir grup ve benzer özelliklere sahip diger sübstit'uentler. Bir modifikasyon 2'- metoksietoksi (2'- O- CH2CH200H3), ayni zamanda 2,- O- (2- 504) yani bir alkoksialkoksi grubu içerir. Diger modifikasyonlar 2,- dimetilaminooksietoksi, yani bir O(CH2)20N(CH3)2 grubunu, ayni zamanda 2*- DMAOE ve 27- dimetilaminoetoksietoksi (2'- DMAEOE) olarak da bilinen grubu içerir. Ilave modifikasyonlar 21- metoksi (27- O-CHs), 2iamin0pr0p0ksi (2,- OCH2CH2CH2NH2) ve 2,- floroyu (21- F) içerir. Benzer modifikasyonlar ayni zamanda oligonükleotit üzerinde diger konumlarda, özellikle 3' uçlu nükleotit 'üzerinde sekerin 3: konumunda veya 2' - 5' bagli oligonükleotitlerde ve 5, uçlu nükleotitin 5, konumu üzerinde yapilabilir. Oligonükleotitler ayni zamanda pentofurasonil sekerinin yerine siklobutil gruplari gibi seker mimetiklerine de sahip olabilirler. Bu tür modifiye seker yapilarinin hazirlanmasini ögreten temsili Birlesik Devletler patentleri, bunlarla sinirli Diger oligonükleotit mimetiklerinde hem seker hem de intern'ukleosit bag, yani nükleotit birimlerinin iskeleti yeni gruplarla degistirilir, ancak baz birimleri uygun bir nükleik asit hedef bilesigi ile hibritlesmesi için korunur. Bu türde bir oligomerik bilesik, mukemmel hibritlesme özelliklerine sahip oldugu gösterilen bir oligonükleotit mimetik bir peptit nükleik asit (PNA) olarak ifade edilir. PNA bilesiklerinde bir oligonükleotitin seker iskeleti bir amid içeren iskelet ile özellikle bir aminoetilglisin iskeleti ile degistirilir. N'L'ikleobazlar korunur ve iskeletin amid kisminin aza azot atomlarina dogrudan veya dolayli olarak baglanir. PNA bilesiklerinin hazirlanmasini ögreten temsili Birlesik Devletler patentleri, bunlarla sinirli olmamakla birlikte US Pat. No. 5,539,082; Burada açiklanan belirli bazi düzenlemeler fosforotiyoat iskeletlerine sahip oligonükleotitler ve özellikle yukarida referans verilen US Pat No. 5,489,677*deki- CH2- NH- 0- CH2- ,- CH2- N(CH3)- O- CH2- (metilen (metilimino) veya MMI iskeleti olarak ifade edilir)- CH2- O- N(CH3)- CH2- ,- CH2- N(CH3)- N(CH3)- CH2- ve -O- N(CH3)- CH2- CH2- (burada dogal fosfodiester iskeleti -O- P- O- CH2 olarak temsil edilir) ve yukarida referans verilen US Pat. No. 5,602,240'in amid iskeletleridir. Ayrica yukarida referans verilen US Pat. No. 5,034,506'nin morfolino iskelet yapilarina sahip oligon'ükleotitleri de tercih edilir. Seker grubu ayni zamanda ribozda karsilik gelen karbonunkine göre zit stereokimyasal konfigürasyona sahip bir veya daha fazla karbon atomunu da içerebilir. Dolayisiyla bir oligon'ukleotit, örnegin seker olarak arabinoz içeren nükleotitleri içerebilir. Monomer, seker 'üzerinde, örnegin alfa nükleositler 'üzerinde 1' konumunda bir alfa bagina sahip olabilir. Oligonükleotitler ayni zamanda "abazik" sekerleri de içerebilir ki bunlar C- 1'de bir nükleobazdan yoksundurlar. Bu abazik sekerler ayni zamanda yapilandirici seker atomlarindan bir veya daha fazlasini da içerebilirler. Oligonükleotitler ayni zamanda L formunda olan, örnegin L- nükleositler, bir veya daha fazla seker de içerebilir. Kimerik Oliqonükleotitler Verilen bir bilesikteki tüm konumlarin es dagilimli bir sekilde modifiye edilmesi gerekmez ve aslinda tek bir bilesikte veya bir oligonükleotit içine tek bir nükleosite yukarida bahsedilen modifikasyonlar dahil edilebilir. Burada bahsedilen belirli bazi tercih edilen oligonükleotitler kimerik oligonükleotitlerdir. "Kimerik oligonükleotitler" veya "kimeralar" buradaki baglamda her biri en az bir nükleotidden meydana gelen iki veya daha fazla kimyasal olarak ayri bölgeyi içeren oligonükleotitlerdir. Bu oligonükleotitler tipik olarak bir veya daha fazla yararli özellige (örnegin artan nükleaz direnci, hücreler artan alim, RNA hedefi için artan baglanma afinitesi) sahip en az bir modifiye nükleotit bölgesi ve RNaz H parçalanmasi için bir substrat olan bir bölgeyi Bir düzenlemede kimerik bir oligonükleotit hedef baglanma afinitesini artirmak için en az bir bölge içerir. Hedefi için bir oligonükleotitin afinitesi bir oligonükleotit / hedef çiftinin Tmisi ölçülerek rutin olarak belirlenir ki bu sicaklik oligonükleotit ve hedefin ayristigi sicakliktir, ayrisma spektrofotometrik olarak saptanir. Tm ne kadar yüksek olursa, oligonükleotitin hedef için afinitesi de o kadar büyük olur. Bir düzenlemede hedef mRNA baglanma afinitesini artirmak için modifiye edilen oligonükleotitin bölgesi sekerin 2' konumunda modifiye edilen en az bir nükleotit, en çok tercih edilen sekliyle bir 2,- O- alkil, 2,- O- alkiI- O- alkil veya 2*- floro modifiye nükleotiti içerir. Bu tür modifikasyonlar rutin olarak oligonükleotitlere dahil edilir ve bu oligonükleotitlerin verilen bir hedefe karsi 2'- deoksioligonükleotite kiyasla daha yüksek Tm'ye sahip oldugu gösterilmistir. Bu sekilde artan afinitenin etkisi hedef gen ifadesinin oligonükleotit inhibisyonunu büyük ölçüde artirmaktir. Diger bir düzenlemede kimerik bir oligonükleotit RNAz H için substrat olarak davranan bir bölgeyi içerir. Elbette oligonükleotitlerin burada açiklanan çesitli modifikasyonlarin herhangi bir kombinasyonunu içerebilecegi anlasilmaktadir. Oligonükleotitlerin burada açiklanan diger modifikasyonu oligonükleotitin aktivitesini, hücresel dagilimini veya hücresel alimini artiracak sekilde oligonükleotite bir veya daha fazla grubun veya konjugatin kimyasal olarak baglanmasini içerir. Teknikte uzman kimseler terapötik etkinlik gibi in vivo kullanim için makul bir ampirik kural, sekansin tiyolanmis bir versiyonu serbest formda çalisiyorsa, ayni sekansin herhangi bir yapidaki kapsüllenmis parçaciklarinin da etkin olacagidir. Antisens terapiye baska türlü yanit verdigi bilinmeyen durumlarda ve modellerde etkinlik sergileyecek sekilde kapsüllenmis parçaciklar ayni zamanda daha genis bir in vivo kullanima sahip olabilirler. Alaninda uzman kimseler bu bulusu uygulayarak, simdi antisens terapiye yanit veren eski modeller bulabileceklerini bilmektedirler. Ayrica atilan antisens sekanslarini veya yapilarini tekrar ziyaret edebilirler ve bulusu uygulayarak etkinligi bulabilirler. Mevcut bulusla uyumlu olarak kullanilan oligonükleotitler kati faz sentezi için iyi bilinen teknik araciligiyla kolayca ve rutin bir sekilde yapilabilirler. Bu tür sentezler için ekipman Applied Biosystems da dahil olmak üzere birkaç tedarikçi tarafindan satilmaktadir. Bu tür bir sentez için herhangi bir baska araç da kullanilabilir, oligonükleotitlerin gerçek sentezi rutin uygulayicinin yetenekleri dahilindedir. Fosforotiyoatlar ve alkillenmis türevleri gibi diger oligonükleotitleri hazirlamak için benzer tekniklerin kullanilmasi da iyi bilinmektedir. Bagisikligi Uyarici Oliqonükleotitler Burada tarif edilen lipit partikülleri ile iliskili nükleik asitler, bir memeliye ya da baska bir hasta olabilen bir kisiye tatbik edildiginde bir bagisiklik tepkisi uyandirabilen bagisiklik uyarici oligonükleotidler (ISS; tek ya da çift sarmalli) dahil olmak üzere bagisiklik uyarici olabilir. ISS, örnegin saç tokasi sekonder yapilara (bakiniz Yamamoto S., ve palindromlarin yani sira diger bilinen ISS özellikleri (multi- G etki alanlari gibi, bakiniz WC 96/ 11266 sayili belge) içerir. Bagisiklik yaniti, dogustan ya da adaptif bir bagisiklik yaniti olabilir. Bagisiklik sistemi daha fazla dogustan gelen bir bagisiklik sistemine ayrilir ve daha sonra ayrica humoral hücresel bilesenlere ayrilan omurgalilarin adaptif bagisiklik sistemini kazanir. Ozel düzenlemelerde, bagisiklik yaniti mukozal olabilir. Belirli düzenlemelerde, bir nükleik asit olan bir bagisiklik uyarici sadece bir lipit partikülü ile kombinasyon halinde uygulandiginda yalnizca bagisiklik uyaricidir ve kendi "serbest formda" uygulandiginda bagisiklik uyarici degildir. Mevcut bulusa göre, bu tür bir oligonükleotidin bagisiklik uyarici oldugu düsünülmektedir. Bagisiklik uyarici nükleik asitlerin, bir bagisiklik yanitini uyarmak üzere bir hedef proteinin ekspresyonunu azaltmasi ya da 'özellikle baglanmasi gerekli olmadiginda sekansa özgü olmadigi düsünülmektedir. Bu nedenle, belirli bagisiklik uyarici nükleik asitler, dogal olarak olusan bir gen ya da mRNA'nin bir bölgesine karsilik gelen bir sekansi içerebilir, ancak yine de, sekansa özgü olmayan spesifik bagisiklik uyarici nükleik asitler olarak kabul edilebilirler. Bir düzenlemede, bagisiklik uyarici nükleik asit ya da Oligonükleotid, en az bir CpG dinükleotidi içerir. Oligonükleotid ya da CpG dinükleotid, metillenmemis ya da metillenmis olabilir. Baska bir düzenlemede, bagisiklik uyarici nükleik asit, bir metillenmis sitosine sahip olan en az bir CpG dinükleotid içerir. Bir düzenlemede, nükleik asit, bir tek CpG dinükleotid içermekte olup içerisinde bahsi geçen CpG dinükleotid içindeki sitosin metillenmistir. Spesifik bir düzenlemede, nükleik asit, sekans 5' TAACGTTGAGGGGCAT 3' içerir. Alternatif bir düzenlemede, nükleik asit, en az iki CpG dinükleotidi içermekte olup, içerisinde CpG dinükleotidleri içindeki en az bir sitosin metillenmistir. Ayrica bir düzenlemede, sekans içinde mevcut olan CpG dinükleotidleri içindeki her bir sitosin metillenmistir. Baska bir düzenlemede. nükleik asit birçok CpG dinükleotidlerin içermekte, burada bahsi geçen CpG dinükleotidlerin en az biri, bir metillenmis sitosin ihtiva etmektedir. Spesifik bir düzenlemede, nükleik asit, sekans 5' TTCCATGACGTTCCTGACGT 3' içerir. Baska bir spesifik düzenlemede, nükleik asit sekansi, sekans 5' TCCATGACGTTCCTGACGT 3' içerir, burada koyu olarak belirtilen iki sitosinler metillenmistir. Belirli düzenlemelerde, ODN, asagida gösterildigi gibi, ODN #1, ODN ODN'ler grubu arasindan seçilmektedir. Tablo 4. Ornek Niteligindeki Bagisiklik Uyarici Oligonükleotitler (ODN'Ier) ODN ISMI SEK ID ODN SEKANSI (5'- 3'). insan 0- myc * ODN Im 5'- T AAZGTT GAGGGGCAT- 3 ODN 5 5'- AACGTT- 3 ODN 10 mürin 5'- T GCAT CCCCCAGGCCACCAT- 3 Hücreler arasi Ad hezyon ODN 11 insan Hücreler arasi Ad hezyon '- GCCCAAGCTGGCATCCGTCA- 3' ODN 12 insan Hücreler arasi Ad hezyon Molekülü- ODN 13 insan erb- '- GGT GCTCACTGC GGC- 3' ODN 14 insan o- '- AACC GTT GAG GGG CAT- 3' ODN 15 insan c- '- GTGCCG GGGTCTTCGGGC- 3' ODN 17 insan '- GGACCCT CCT CCGGAGCC- 3' insülin Büyüme Faktörü 1- Reseptörü ODN 18 insan insülin Büyüme Faktörü 1- Reseptörü ODN 19 insan Epidermal Büyüme Faktörü- Reseptörü '- AAC GTT GAG GGG CAT- 3' ODN 20 Epidermal Büyüme Faktörü- Reseptörü '- CCGTGGTCA TGCTCC- 3' ODN 21 insan Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü ODN 22 mürin Fosfokinaz C- alfa ODN 24 insan Bcl- '- TCT CCCAGCGTGCGCCAT- 3' ODN 25 insan C- '- GTG CTC CAT TGA TGC- 3' ODN #26 insan Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü Reseptörü- 1 ODN #27 5'- RRCGYY- 3' ODN #30 insan c- 5'- T AACGTT G AGGGG CAT- 3' ODN 1, bir 16- mer içerisinde ODN 1 yapan 5, ucu üzerine ilave edilen bir timidine sahip ayni oligonükleotiditir. ODN 14 ve ODN 1 arasindaki biyolojik aktivitede hiçbir farklilik tespit edilmemistir ve her ikisi de benzer bagisiklik uyarici aktiviteyi sergiler (Mui ve dig., 2001) Burada tarif edilen kompozisyonlarda ve metotlarda kullanilmasi için uygun oligonükleotidlerin (ODN,Ier) ilave spesifik nükleik asit sekanslari, Raney ve dig., belgede tarif edilmistir. Bazi uygulamalarda, bunun içinde tarif edilen 5 kompozisyonlarda ve metotlarda kullanilan ODNiler, bir fosfodiester ("PO") omurgaya ya da bir fosforotioat ("PS") omurgaya ve I veya bir CpG motif içinde en az bir metillenmis sitosin kalinitisina sahiptir. Sahte Oliqonükleotitler Transkripsiyon faktörleri, nispeten kisa baglanma sekanslarini tanidiklari için, çevreleyen genomik DNA'nin yoklugunda bile, belirli bir transkripsiyon faktörünün konsensüs baglanma sekansini tasiyan kisa oligonükleotidler, canli hücrede gen ifadesini manipüle etmek için araçlar olarak kullanilabilir. Bu strateji, daha sonra hedef faktörü tarafindan kabul edilen ve bu tür "sahte oligonükleotidlerin" hücre içi dagitimini içerir. Transkripsiyon faktörünün DNA- baglama bölgesinin, tuzak tarafindan isgal edilmesi, daha sonra hedef genlerin promoter bölgelerine baglanamayan transkripsiyon faktörün'u meydana getirir. Bu strateji, daha sonra hedef faktörü tarafindan taninan ve baglanan bu tür "sahte oligonükleotidlerin" hücreler arasi dagitimini kapsar. Tuzaklar, ya bir transkripsiyon faktörü tarafindan aktive edilen genlerin ifadesinin inhibe etmek için ya da bir transkripsiyon faktörünün baglanmasiyla bastirilan genlerin yukari düzenlenmesi için terapötik ajanlar olarak kullanilabilir. Sahte 1075 sayili belgede bulunabilir. Süpermir Bir süpermir, ribonükleik asidin (RNA) ya da deoksiribonükleik asidin (DNA) ya da her ikisinin veya bunlarin modifikasyonlarinin bir tek sarmalli, çift sarmalli ya da kismen çift sarmalli oligomeri ya da ya da polimerini ifade etmekte olup, bu bir miRNA ile büyük ölçüde özdes olan ve kendi hedefine göre antisens olan bir nükleotit sekansina sahiptir. Bu terim, dogal olarak olusan nükleobazlar, sekerler ve kovalent internükleosit (omurga) baglarindan olusan oligonükleotidleri ve benzer bir sekilde islev gören dogal olmayan bir kisim içeren en az bir tanesini içerir. Bunun gibi modifiye edilmis ya da ikame edilmis oligonükleotidler, Örnegin, gelistirilmis hücresel geri alimi, nükleik asit hedefi için gelistirilmis afinite ve nükleusun mevcudiyetinde artan stabilite gibi istenilen özelliklerinden dolayi dogal formlar üzerinde tercih edilir. Tercih edilen bir düzenlemede, süpermir, bir sens sarmalini içermez ve bir baska tercih edilen düzenlemede, süpermir bir önemli uzantiya kendiliginden melezlenmez. Bunun içinde öne çikan bir süpermir sekonder yapiya sahip olabilir, ancak fizyolojik kosullar altinda büyük ölçüde tek sarmallidir. Büyük ölçüde tek sarmalli olan süpermir, yaklasik % 50 süpermirden daha azi (örnegin, yaklasik % 40, % 30, % 20, % 10, ya da % 5'den daha az) bir kendisi ile çiftlestirilen uzanti için tek sarmallidir. Süpermir, bir saç tokasi segmentini içerebilir, örnegin, sekans, tercih edilen sekliyle 3' ucunda, kendiliginden melezlesebilir ve bir dubleks bölge, örnegin en az 1, 2, 3, ya da 4 ve tercih edilen sekliyle 8, 7, 6, ya da n nükleotidden daha azini, örnegin, 5 nükleotide sahip bir dubleks bölgesini olusturur. Dubleks hale getirilen bölge, bir baglayici ile, örnegin bir nükleotid baglayici, örnegin, 3, 4, 5, ya da 6 de, örnegin, modifiye edilmis de ile baglanabilir. Baska bir düzenlemede süpermir, örnegin 3' ve 5, ucunun birinde ya da her ikisinde ya da süpermirin bir ucunda ve terminal olmayan ya da orta ucunda, örnegin 5, 6, 7, 8, 9, ya da 10 uzunlukta nükleotit gibi bir kisa oligo ile dubleks hale getirilir. miRNA taklitleri miRNA taklitleri, bir ya da daha fazla miRNA'nin gen susturma yetenegini taklit etmek için kullanilabilecek moleküllerin bir sinifini temsil eder. Ayrica, "mikroRNA taklidi" terimi, RNAI yoluna girebilen ve gen ifadesini düzenleyebilen sentetik kodlayici olmayan RNAilar (yani, miRNA, endojen miRNA kaynagindan saflastirma ile elde edilmez) anlamina gelir. miRNA taklitleri, olgun moleküller (örnegin, tek sarmalli) ya da taklit öncüleri (örnegin, pri- ya da pre- miRNA'lar) olarak tasarlanabilir. miRNA taklitleri, sinirlandirilmaksizin, RNA, modifiye edilmis RNA, DNA, modifiye edilmis DNA, kenetli nükleik asitler ya da 2'- ya da yukaridakilerin herhangi kombinasyonu (DNA- RNA hibritler dahil olmak üzere) içeren oligonükleotidler dahil olmak üzere nükleik asitten (modifiye edilmis ya da modifiye edilmis nükleik asitler) olusabilir. Ilaveten, miRNA taklitleri, tasinma, hücreler arasi bölümlendirme, stabilite, özgüllük, islevsellik, sarmal kullanimi ve / veya potensini etkileyen konjugatlari içerebilir. Bir tasarimda, miRNA taklitleri, çift sarmalli moleküllerdir (örnegin, uzunlukça yaklasik 16 ve yaklasik 31 nükleotid arasinda bir dubleks bölgesi ile) ve verilen bir miRNA'nin olgun sarmali ile özdeslige sahip olan bir ya da daha fazla sekansi içerir. Modifikasyonlar, nükleik asit stabilitesini ve / veya özgüllügünü arttiran molekül ve internükleotid modifikasyonlarinin (örnegin fosfortioat modifikasyonlari) biri ya da her iki sarmali üzerinde 2' modifikasyonlari (2'- O metil modifikasyonlari ve 2' F modifikasyonlari dahil) içerebilir. Ilaveten, miRNA taklitleri çikintilari içerebilir. Çikintilar, her sarmalin ya 3' ya da 5' ucu üzerinde 1- 6 nükleotidden olusabilir ve stabiliteyi ya da islevselligini arttirmak için modifiye edilebilir. Bir düzenlemede, bir miRNA taklidi, 16 ve 31 nükleotit arasinda bir dubleks bölgeyi ve asagidaki kimyasal modifikasyon kaliplarin bir ya da daha fazlasini içerir: sens sarmali, nüklotidler 1 ve ?nin 2'- O- metil modifikasyonlarini (sens oligonükleotidlerin 5' ucundan itibaren sayilan) ve Cs ve Us'nin tümünü içerir; antisens sarmal modifikasyonlari, Cs ve Usinin tümünün 2' F modifikasyonunu, oligonükleotidin 5' ucunun fosforilasyonunu ve bir 2 nükleotid 3 ' çikintisi ile birlikte stabilize edilmis internükleotit baglarini içerebilir. Antimir ya da miRNA inhibitör'ü ve spesifik miRNA'larin yetenegine müdahale eden oligonükleotidler ya da modifiye edilmis oligonükleotidler anlamina gelir. Genelde, inhibitörler, RNA, modifiye edilmis RNA, DNA, modifiye edilmis DNA, kenetli nükleik asitler (LNA'lar) ya da yukaridakilerin herhangi kombinasyonunu içeren oligonükleotidler dahil olmak üzere dogada nükleik asit ya da modifiye edilmis nükleik asitlerdir. Modifikasyonlar, tasinma, stabilite, özgüllük, islevsellik, hücreler arasi bölümlendirme ya da potensini etkileyen 2' modifikasyonlar (2,- 0 alkil modifikasyonlari ve 2' F modifikasyonlar dahil olmak üzere) ve internükleotid modifikasyonlar (örnegin, fosforotioat modifikasyonlar) içerir. ilaveten, miRNA inhibitörleri, tasinma, hücreler arasi bölümlendirme, stabilite, ve /veya potensini etkileyen konjugatlari içerebilir. Inhibitörler, tek sarmalli, çift sarmalli (RNA/ RNA ya da RNA / DNA dubleksleri) ve saç tokasi tasarimlari dahil olmak üzere çesitli konfigürasyonlari benimseyebilir, genelde, mikroRNA inhibitörleri, hedeflenen miRNA'nin olgun sarmali (ya da sarmallari) ile tamamlayici olan ya da kismi olarak tamamlayici olan bir ya da daha fazla sekansi ya da sekanslarin kisimlarini içerir, ilaveten, miRNA inhibitörü ayni zamanda, olgun miRNA'nin ters tamamlayicisi olan sekansa 5' ve 3' yerlestirilmis ilave sekanslari içerir. Ilave sekanslar, olgun miRNA'nin türetildiginden ya da ilave sekanslarin rastlantisal sekanslar olabildiginden (A, G, C ya da U karisimina sahip) pri- miRNA içindeki olgun miRNASya bitisik olan sekanslarin ters tamamlayicisi olabilir. Bazi düzenlemelerde, ilave sekanslarin biri ya da her ikisi de saç tokasi yapisini olusturabilecek rastlantisal sekanslardir. Ayrica, bazi düzenlemelerde, miRNA'nin ters tamamlayicisi olan sekans, saç tokasi yapilari ile 5' yani 'üzerine ve 3' yani üzerine desteklenmektedir. Çift sarmalli oldugunda, mikro- RNA inhibitörleri, karsit sarmallar üzerindeki nükleotidler arasinda yanlis eslesmeleri içerir. Bundan baska, miro- RNA inhibitörleri, inhibitörün bir hücreye alinmasini kolaylastirmak için konjügat kisimlarina baglanabilir. Örnegin, bir mikro- RNA inhibitörü, bir mikro- RNA inhibitörünün bir hücreye pasif geri alinmasina olanak saglayan kolesteril 5- (bis(4- metoksifenil) (fenil) metoksi)- 3 hidroksipentilkarbamat)le baglanabilir. Saç tokasi yapisinda miRNA inhibitörleri de dahil olmak üzere, Mmikro- RNA inhibitörleri, detayli bir sekilde Vermeulen ve dig., "Double- Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent lnhibitors of RlSC Function," RNA 13: 723- Teknikte siradan yetkili bir kisi, istenen bir miRNA için veri tabanindan bir sekansi seçebilir ve burada açiklanan metotlar açisindan yararli bir inhibitör tasarlar. U1 adaptörü U1 adaptörü, poliA alanlarini inhibe eder ve hedef genin terminal eksonundaki bir alana tamamlayici olan bir hedef etki alanina ve U1 snRNP'nin U1 küçük nükleer RNA bilesenine baglanan bir 'U1 etki alanina' sahip çift islevselli oligonükleotidlerdir snRNP, primer olarak pre- mRNA ekson- intron sinirina baglanarak spliceosome olusumunda dogrudan erken asamalari yönlendiren bir ribonükleoprotein kompleksidir belge). U1 snRNA baz çiftinin 5' ucuna ait 2- 11 nükleotit, öncü mRNAinin 5issri ile baglanir. Bir düzenlemede, burada tarif edilen Oligonükleotidler U1 adaptörleridir. Bir düzenlemede, U1 adaptörü, en az bir diger iRNA ajani ile kombinasyon halinde tatbik edilebilir. Oliqonükleotit modifikasyonlari Modifiye edilmemis oligonükleotidler bazi düzenlemelerde optimalden daha az olabilirler, örnegin, modifiye edilmemis oligonükleotidler, örnegin, hücresel nükleazlar tarafindan bozunmaya egilimli olabilirler. Nükleazlar nükleik asit fosfodiester baglarini hidrolize edebilir. Bununla birlikte, oligonükleotidlerin kimyasal modifikasyonlari gelismis özellikler saglayabilir, ve örnegin, oligonükleotidleri nükleazlara daha stabil hale getirebilir. Oligonükleotidler alt birimlerin ya da monomerlerinin polimeri oldugundan, asagida tarif edilen bir çok modifikasyon, örnegin, bir bazin, bir sekerin, bir fosfat parçasinin bir modifikasyonunu ya da birfosfat kisminin köprü olmayan oksijeni gibi bir oligonükleotid içinde tekrarlanan bir pozisyonda meydana gelir. Verilen bir oligonükleotiddeki tüm pozisyonlarin üniform olarak modifiye edilmesi gerekli degildir ve aslinda daha önce bahsedilen modifikasyonlardan bir tanesinin bir oligonükleotid içindeki tek bir oligonükleotid içine ya da tek bir nükleosit içine bile katilabilecektir. Bazi durumlarda, oligonükleotiddeki söz konusu pozisyonlarin tamaminda, ancak bir çogunda modifikasyon meydana gelecektir, ve aslinda çogu durumda meydana gelmeyecektir. Ornek yoluyla, bir modifikasyon sadece 3 'ya da 5' terminal pozisyonunda meydana gelebilir, sadece iç bölgede meydana gelebilir, sadece terminal bölgelerinde meydana gelebilir, örnegin, bir terminal nükleotidinde bir pozisyonda olabilir ya da bir oligonükleotidin son 2, 3, 4, 5, ya da 10 nükleotidinde olabilir. Bir modifikasyon, çift sarmalli bölgede, bir tek sarmalli bölgede ya da her Bir modifikasyon, sadece çift sarmalli bir oligonükleotid bir çift sarmal bölgesinde meydana gelebilir ya da sadece bir çift sarmalli oligonükleotidin tek bir sarmal bölgesinde meydana gelebilir, örnegin, köprülü olmayan bir oksijen pozisyonunda bir fosforotioat modifikasyonu sadece bir ya da her iki uçta meydana 20 gelebilir, sadece bir terminal bölgelerde meydana gelebilir, örnegin, bir terminal nükleotid üzerindeki bir pozisyonda ya da bir sarmalin son 2, 3, 4, 5, ya da 10 nükleotidlerinde olabilir ya da çift sarmal ve tek sarmal bölgelerde, özellikle uçta meydana gelebilir. 57 ucu ya da uçlari fosforlasabilir. Burada tarif edilen bir modifikasyon, tek modifikasyon olabilir, ya da çoklu nükleotidler üzerinde yer alan tek modifikasyon türü olabilir, ya da bir modifikasyon, burada tarif edilen bir ya da daha baska modifikasyon ile kombine edilebilir. Burada tarif edilen modifikasyonlar ayni zamanda bir oligonükleotid üzerinde kombine edilebilir, örnegin bir oligonükleotidin farkli nükleotidleri burada tarif edilen farkli modifikasyonlara sahiptir. Bazi düzenlemelerde, tek sarmal çikintilarda, örnegin, bir 5' ya da 3' çikintisinda ya da her ikisinde de stabiliteyi arttirmak, çikintilarda belirli nükleobazlari içermek ya da modifiye edilmis nükleotidler ya da nükleotid yerine geçenleri içermek için özellikle tercih edilir. Ornegin, çikintilarda purin nükleotidlerin dahil edilmesi arzu edilebilir. Bazi düzenlemelerde, 3' ya da 5' çikintisinda bulunan bazlarin tümü ya da bazilari, örnegin, burada tarif edilen modifikasyon ile modifiye edilecektir. Modifikasyonlar, örnegin, riboz sekerinin 2* OH grubundaki modifikasyonun kullanimini, örnegin, deoksiribonükleotidlerin kullanimini, örnegin, ribonükleotidler yerine deoksitimidin ve fosfat grubu içindeki modifikasyonlari, örnegin, fosfotioat modifikasyonlarini içerebilir. Çikintilarin, hedef sekans ile homolog olmasi gerekmez. Spesifik modifikasyonlar asagida daha ayrintili olarak tartisilmaktadir. Fosfat Grubu Fosfat grubu negatif yüklü bir türdür. Yük, iki köprüleme olmayan oksijen atomu üzerinde esit olarak dagitilir. Bununla birlikte, fosfat grubu, oksijenlerden birinin farkli bir ikame ile yer degistirilmesi ile modifiye edilebilir. RNA fosfat omurgalarina yapilan bu modifikasyonun bir sonucu, oligoribonükleotidin nükleolitik bozulmaya karsi direncinin artmasidir. Bu nedenle teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, bazi düzenlemelerde simetrik olmayan yük dagilimi ile yüklü olmayan bir baglayici ya da yüklü bir baglayici ile sonuçlanan degisikliklere yol açmasi arzu edilebilir. Modifiye edilen fosfat gruplarina ait önekler, fosforotioat, fosforoselenatlar, borano fosfatlar, borano fosfat esterler, hidrojen fosfonatlar, fosforoamidatlar, alkil ya da ariI fosfonatlar ve fosfotriesterler içerir. Bazi düzenlemelerde, fosfat omurga kismindaki köprüleme olmayan fosfat oksijen atomlarindan biri asagidakilerin herhangi biri ile degistirilebilir: 8, Se, BR3 (R hidrojen, alkil, arildir), C (yani, bir alkil grubu, bir ariI grubu, vb'dir...), H, NR2 (R hidrojen, alkil, arildir), ya da OR (R hidrojen, alkil ya da arildir). Modifiye edilmemis bir fosfat grubundaki fosfor atomu akiraldir. Bununla birlikte, köprüleme olmayan oksijenlerden birinin, yukaridaki atomlarin biri ya da atom gruplarindan biri ile yer degistirmesi, fosfor atom kiralini meydana getirir; diger bir deyisle, bu sekilde modifiye edilen bir fosfat grubundaki fosfor atomu, stereojenik bir merkezdir. Stereojenik fosfor atomu, ya "R" konfigürasyona (burada, Rp) ya da the "8" konfigürasyona (burada, Sp) sahip olabilir. Fosforoditioatlarin ikisi de sülfür ile yer degistiren köprüleme olmayan oksijenleri içerir. Fosforoditioatlardaki fosfor merkezi, oligoribonükleotid diastereomerlerin olusumunu engelleyen akiraldir. Bu nedenle, teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, kiral merkezi elimine eden köprüleme olmayan oksijenlerdeki modifikasyonlar, örnegin fosforoditioat olusumunu, diastereomer karisimlari üretememeleri istenebilir. Böylece, köprüleme olmayan oksijenler bagimsiz olarak 8, Se, B, C, H, N, ya da OR (R, alkil ya da aril'dir) herhangi biri olabilir. Fosfat baglayicisi ayni zamanda köprüleme oksijenin (yani, fosfatin nükleosit'e baglandigi oksijen), azot (köprülü fosforoamidatlar), sülfür (köprülü fosforotioatlar) ve karbon (köprülü metilenfosfonatlar) ile yer degistirilmesiyle modifiye edilebilmektedir. Yer degistirme, ya baglanti yapan oksijenlerde ya da her iki baglanti yapan oksijenlerde meydana gelebilir. Köprülü oksijen bir nükleositin 3'- oksijeni oldugunda, karbon ile yer degistirme tercih edilir. Köprülü oksijen bir nükleositin 5'- oksijeni oldugunda, azot ile yer degistirme tercih edilir. Fosfat Grubunun Yer Degistirmesi Fosfat grubu, fosfor içermeyen konnektörler ile yer degistirilebilir. Teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, yüklü fosfodiester grubunun nükleolitik bozunmada reaksiyon merkezi oldugundan dolayi nötr yapisal taklitler ile yer degistirmesinin artmis nükleaz stabilitesi vermesi gerektigine inanilmaktadir. Tekrar, teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, birkaç uygulamada, yüklü fosfat grubunun bir nötr kismi ile yer degistirdigi degisikliklerin sokulmasi istenebilir. Fosfat grubunu degistirebilen kisimlara 'Örnekler, metil fosfonat, hidroksilamino, siloksan, karbonat, karboksimetil, karbamat, amid, tioeter, etilen oksit baglayici, sülfonat, sülfonamit, tioformasetal, formasetal, oksim, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo ve metilenoksimetilimino içerir. Tercih edilen yer degistirmeler metilenkarbonilamino ve metilenmetilimino gruplarini içerir. Oksijenlerden en az birinin fosfata baglandigi degistirilmis fosfat baglarinin yeri degistirilir ya da fosfat grubu, ayrica "fosfodiester olmayan omurga baglantisi" olarak da adlandirilan bir fosfor olmayan grup ile degistirilir. Ribofosfat Omurqanin Yer Degistirmesi Oligonükleotid taklit iskeleleri ayni zamanda yapilandirilabilmekte olup, burada fosfat baglayici ve riboz sekeri nükleaz dirençli nükleosit ya da nükleotid vekilleri ile degistirilir. Teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, tekrarli bir sekilde yüklü bir omurganin yoklugunun, polianyonlari (örnegin nükleazlar) taniyan proteinlere baglanmayi azalttigina inanilmaktadir. Tekrar, teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, bazi uygulamalarda, bazlarin nötr bir vekil omurga tarafindan baglanmis degisikliklerin ortaya konulmasi arzu edilebilir. Örnekler, morfilino, siklobütil, pirrolidin ve peptid nükleik asit (PNA) nükleosit vekillerini içerir. Tercih edilen bir vekil bir PNA vekilidir. Terminal Modifikasyonlari Bir oligonükleotidin 3' ve 5' uçlari modifiye edilebilir. Bu tür modifikasyonlar, molekülün 3' ucunda, 5' ucunda ya da her iki ucunda da olabilir. Fosfat grubunun atomlarinin bir ya da daha fazlasinin ya da tüm bir terminal fosfatin modifikasyonunu ya da yer degistirilmesini içerebilir. Ornegin, bir oligonükleotidin 3' ve 5' uçlari, örnegin, floroforlar (Örnegin, piren, TAMRA, flöresin, Cy3 ya da Cy5 boyalari) ya da koruyucu gruplar (örnegin sülfür, silikon, bor ya da ester üzerin bagli) gibi etiketleme kisimlari gibi diger fonksiyonel moleküler varliklara konjüge edilebilir. Fonksiyonel moleküler varliklar, bir fosfat grubu ve / veya bir baglayici vasitasiyla sekere baglanabilir. Baglayicinin terminal atomu, fosfat grubunun ya da C- 3' ya da C- 5' 0, N, 8 ya da sekerin C grubunun baglayici atomuna baglanabilir ya da yer degistirebilir. Alternatif olarak, baglayici bir nükleotid vekilinin (örnegin, PNAtlar) terminal atomuna baglanabilir ya da yer degistirebilir. Bir baglayici / fosfat ile fonksiyonel moleküler varlik- baglayici / fosfat dizisi, bir dsRNA'nin iki sarmali arasina sokuldugunda, bu dizi bir saç tokasi tipi RNA ajani içinde bir saç tokasi RNA halkasinin yerini alabilir. Module edici aktivite için faydali olan terminal modifikasyonlari, 5' ucunun fosfat ya da fosfat analoglari ile modifikasyonunu içerir. Ornegin, tercih edilen düzenlemelerde, dsRNA'larin antisens sarmallari, 5, fosforile edilmis olmaktadir ya da 5' ana ucunda bir fosforil analogu içerir. 5'- fosfat modifikasyonlari, RlSC aracili gen susturulmasi ile uyumlu olanlari içerir. Uygun modifikasyonlar: 5'- monofosfat ((HO)2(O)P- O- 5'); 5'- difosfat ((HO)2(O)P- O- P(HO)(O)- O- 5'); 5'- trifosfat ((HO)2(O)P- O- (HO)(O)P- O- P(HO)(O)- O- 5'); 5'- guanozin tepesi (7- metillenmis ya da metillenmemis) (7m- G- 0- '- (HO)(O)P- O- (HO)(O)P- O- P(HO)(O)- O- 5'); 5'- adenozin tepesi (Appp), ve herhangi modifiye edilmis ya da modifiye edilmemis nükleotid tepe yapisi (N- O- 5'- (HO)(O)P- O- (HO)(O)P- O- P(HO)(O)- O- 5'); 5'- monotiofosfat (fosforotioat; (HO)2(S)P- O- 5'); 5,- monoditiofosfat (fosforoditioat (HO)(HS)(S)P- O- 51), S'- fosforotiolat ((HO)2(O)P- S- 5'); oksijen / sülfür'un herhangi ilave kombinasyonu monofosfat, difosfat ve trifosfatlari yer degistirir (örnegin 5- alfa- tiotrifosfat, 5'- gama- tiotrifosfat, vb.), 5'- fosforamidatlar ((HO)2(O)P- NH- 5', (HO)(NH2)(O)P- O- 5,), 5'- alkilfosfonatlar (R = alkil = metil, etili izopropil, propil, vb., örnegin RP(OH)(O)- O- 5'- , (OH)2(O)P- 5'- CH2- ), 5`- alkileterfosfonatlar (R = alkileter = metoksimetil {MeOCH2- ), etoksimetil, vb., örnegin, RP(OH)(O)- O- 5'- ) içerir. Terminal modifikasyonlari ayni zamanda dagitimin takip edilmesi için yararli olabilir ve bu gibi durumlarda ilave edilecek tercih edilen gruplar arasinda floroforlar, örnegin, floresin, ya da Alexa boyasi, örnegin Alexa 488 bulunmaktadir. Terminal modifikasyonlari ayni zamanda geri alimin arttirilmasi için faydali olabilir kullanilabilir, bunun için kullanilan modifikasyonlar kolesterol içerir. Terminal modifikasyonlari ayni zamanda bir RNA ajanin baska bir kisma çapraz baglanmasi için de kullanilabilir; bunun için kullanilan modifikasyonlar mitomisin C içerir. Nükleobazlar Adenin, guanin, sitosin ve urasil RNA'da bulunan en yaygin bazlardir. Bu bazlar, RNA'larin gelistirilmis özelliklere sahip olmasi için modifiye edilebilir ya da yer degistirilebilir. Ornegin, nükleaz dirençli oligoribonükleotidler, bu bazlar ile ya da sentetik ve dogal nükleobazlar ile (örnegin, inosin, timin, ksantin, hipoksantin, nubularin, izoguanisin ya da tubersidin) ve yukaridaki modifikasyonlardan herhangi biri ile hazirlanabilir. Alternatif olarak, yukaridaki bazlardan herhangi birinin ikame edilmis ya da modifiye edilmis analoglari, burada açiklanan örnegin "olagandisi bazlar", Ornekler, sinirlandirilmaksizin, 2- aminoadenin, 6- metil ve adenin ve guanin'in diger alkil türevleri, 2- propil ve adenin ve guanin'in diger alkil türevleri, 5- halourasil ve sitosin, 5- propinil urasil ve sitosin, 6- azo urasil, sitosin ve timin, 5- urasil (pseudourasil), 4- tiourasil, 5- halourasil, 5- (2- aminopropil) urasil, 5- amino aIIiI urasil, 8- halo, amino, tiol, tioalkil, hidroksil ve diger 8- ikameli adeninler ve guaninler, 5- triflorometil ve diger 5- ikameli urasiller ve sitosinler, 7- metilguanin, 5- ikameli pirimidinler, 6- azapirimidinler ve N- 2, N- 6 ve O- 6 ikameli purinler, içeriginde 2- aminopropiladenin, 5- propinilurasil ve 5- propinilsitosin, dihidrourasil, 3- deaza- 5- azasitosin, 2- aminopurin, 5- alkilurasil, 7- alkilguanin, 5- alkil sitosin, 7- deazaadenin, N6, N6- dimetiladenin, 2,6- diaminopurin, 5- amino- allil- urasil, N3- metilurasil, ikame edilmis 1,2,4- triazoller, 2- piridinon, 5- nitroindol, 3- nitropirrol, 5- metoksiurasil, urasil- - oksiasetik asit, 5- metoksikarbonilmetilurasil, 5- metil- 2- tiourasil, 5- metoksikarbonilmetil- 2- tiourasil, 5- metilaminometil- 2- tiourasil, 3- (3- amino- 3karboksipropil)urasil, 3- metilsitosin, 5- metilsitosin, N4- asetil sitosin, 2- tiositosin, N6- metiladenin, N6- isopentiladenin, 2- metiltio- N6- isopenteniladenin, N- metilguaninler, ya da O- alkillenmis bazlari dahil olmak üzere içerir. Ayrica pürinler ve pirimidinler, U.S. Pat. No. 3,687,808 sayili belgede açiklananlari, Concise Ensiklopedia Of Polimer Science Ve Engineering, sayfalar 858- 859, Kroschvvitz, J. l., ed. John VViley & Sons, 1990 sayili belgelerde açiklananlari ve Englisch ve dig., Angevvandte Chemie, Katyonik Gruglar Oligonükleotidlere yönelik modifikasyonlar ayni zamanda bir ya da daha fazla katyonik grubun bir sekere, baza ve / veya fosfat ya da modifiye edilmis fosfat omurga kisminin fosfor atomuna baglanmasini içerebilir. Bir katyonik grubu, bir dogal, siradisi ya da evrensel bir baz 'üzerinde ornatma yetenegine sahip herhangi bir atoma baglanabilir. Tercih edilen bir pozisyon, hibridizasyona müdahale etmeyen bir, yani, baz eslestirmesi için gereken hidrojen baglama etkilesimlerine müdahale etmeyen bir konumdur. Bir katyonik grubu, örnegin, bir sekerin CZ' pozisyonda ya da bir siklik ya da asiklik seker vekilindeki analog pozisyonunda baglanabilir. Katyonik gruplar, örnegin, protonlu amino gruplari, örnegin, 0- AMIN (AMIN = NH2; alkilamino, di alkilamino, heterosiklil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, ya da diheteroaril amino, etilen diamin, poliamino); aminoalkoksi, Örnegin, O(CH2)nAMIN, (örnegin, AMIN = NH2; alkilamino, dialkilamino, heterosiklil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, ya da diheteroaril amino, etilen diamin, poliamino); amino (örnegin NH2; alkilamino, di alkilamino, heterosiklil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino, ya da amino asit); ya da NH(CH2CH2NH)nCH20H2- AMIN (AMIN = NH2; alkilamino, di alkilamino, heterosiklil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, ya da diheteroaril amino) arasindan türetilenleri içerir. Bir oliqon'ukleotit icine yerlestirme Bazi modifikasyonlar tercih edilen sekliyle bir oligonükleotid üzerinde, belirli bir konumda, örnegin bir oligonükleotidin 5 'ya da 3' ucunda ya da bir sarmalin bir iç pozisyonunda yer alabilir. Bir oligonükleotid üzerindeki bir modifikasyonun tercih edilen bir konumu, ajan `üzerinde tercih edilen özellikler kazandirabilir, örnegin, belirli modifikasyonlarin tercih edilen konumlari, optimum gen susturma özelliklerine ya da endonükleaz ya da ekson'ükleaz aktivitesine direncin artmasini saglayabilir. Bir oligonükleotidin bir ya da daha fazla nükleotidi bir 2'- 5' baglantiya sahip olabilir. Bir oligon'ukleotidin bir ya da daha fazla nükleotidi, ters baglantilara, örnegin 37- 3', 5'- 5', 2*- 2, ya da 2- 3' baglantilara sahiptir. Bir çift- sarmalli oligon'ükleotid, en az bir 5,- 'üridin- adenin- 3' (5,- UA- 3,) din'ukleotid olup, burada 'üridin, bir 2*- modifiye edilmis nükleotid, ya da a terminal 5'- 'L'iridin- guanin- S! (57- UG- 3') dinükleotiddir, burada 5'- üridin, bir 2'- modifiye edilmis nükleotid, ya da a terminal 5,- sitidin- adenin- 3* (5'- CA- 3,) din'ukleotiddir, burada 5*- sitidin, bir 2,- modifiye edilmis nükleotid, ya da a terminal 5'- üridin- üridin- 3' (5'- UU- 3,) dinükleotiddir, burada 5- üridin, bir 2,- modifiye edilmis nükleotiddir, ya da a terminal - sitidin- sitidin- 37 (5'- 00- 3') din'ukleotiddir, burada 5'- sitidin, bir 2'- modifiye edilmis nükleotid, ya da a terminal S- sitidin- üridin- S' (5'- CU- 3') dinükleotiddir, burada 5'- sitidin, bir 2'- modifiye edilmis nükleotid, ya da bir terminal 5'- 'üridin- sitidin- 3' (5'- UC- 37) dinükleotiddir, burada 5'- üridin, bir 2- modifiye edilmis nükleotiddir. Bu modifikasyonlar dahil olmak üzere çift- sarmalli oligonükleotidler özellikle endon'ükleaz aktiviteye karsi stabilize edilir. Genel Referanslar Burada kullanilan oligoribonükleotidler ve oligoribonükleositler kati faz sentezi ile sentezlenebilirler, bakiniz örnegin "Oligonucleotide synthesis, a practical approach", Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, lRL Press, 1991 (özellikle Bölüm 1, Modern machine- aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis, Bölüm 2, Oligoribonucleotide synthesis, Bölüm 3, 20'- Methyloligoribonucleotide- s: synthesis and applications, Bölüm 4, Phosphorothioate oligonucleotides, Bölüm 5, Synthesis of 30 oligonucleotide phosphorodithioates, Bölüm 6, Synthesis of oligo- 21- deoxyribonucleoside methylphosphonates, and. Bölüm 7, Oligodeoxynucleotides containing modified bases sayili belgeler. Diger 'özellikle kullanilan sentetik prosedürler ayiraçlar, bloke etme WO 02 / 44321 sayili belgelerde tarif edilen modifikasyonlar burada kullanilabilir. Fosfat Grubu Referanslari Fosfinat oligoribonükleotidlerin hazirlanmasi, U.S. Pat. No. 5,508,270 sayili belgede tarif edilmektedir. Alkil fosfonat oligoribonükleotidlerin hazirlanmasi, U.S. Pat. No. 4,469,863 sayili belgede tarif edilmistir. Fosforamidit oligoribonükleotidlerin tarif edilmistir. Fosfotriester oligoribonükleotidlerin hazirlanmasi, U.S. Pat. No. ,023,243 sayili belgede tarif edilmistir. Borano fosfat oligoribonükleotid'in 3'- deoksi- 3'- amino fosforamidat oligoribonükleotidlerin hazirlanmasi, U.S. Pat. No. ,476,925 sayili belgede tarif edilmistir. 3=- deoksi- 3'- metilenfosfonat sayili belgede tarif edilmistir. Sülfür köprülü nükleotidlerin hazirlanmasi, Sproat ve dig. 4693 sayili belgelerde tarif edilmistir. Seker Grubu Referanslari 2' modifikasyonlarina modifikasyonlar, Verma, S. ve dig. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99- 134 sayili belgede ve bunlarin içindeki tüm referanslarda bulunabilir. Riboza spesifik modifikasyonlar asagidaki referanslarda bulunabilir: 2'- fluoro (Kawasaki ve Fosfat Grubu Referanslarinin Yer Degistirmesi Metilenmetilimino ile baglanmis oligoribonükleositler, ayni zamanda burada MMI ile baglanmis oligoribonükleositler olarak da tanimlanan, metilendimetilhidrazo ile baglanmis oligoribonükleositler, ayni zamanda burada MDH ile baglanmis oligoribonükleositler olarak da tanimlanan ve metilenkarbonilamino ile baglanmis oligon'ukleositler, ayni zamanda burada amid- 3 ile baglanmis oligoribonükleositler olarak da tanimlanan ve metilenaminokarbonil ile baglanmis oligonükleositler, ayni zamanda burada amid- 4 ile baglanmis oligoribonükleositler olarak da tanimlanmasinin yani sira mesela MMI ve PO ya da PS baglantilarinin degistirilmesine sayili belgelerde ve yayimlanan PCT basvurulari PCT / US92 / 04294 ve PCT / US92 olarak yayimlanan) tarif edildigi gibi hazirlanabilir. Formasetal ve tioformasetal ile belgelerdeki gibi hazirlanabilir. Etilen oksit ile baglanmis oligoribonükleositler, U.S. Pat. No. 5,223,618 sayili belgelerdeki gibi hazirlanabilir. Siloksan yer degisimleri, Cormier, tarif edilmistir. Karboksimetil yer degisimleri, Edge, MD. ve dig. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991 sayili belgelerde tarif edilmistir. Karbamat yer degisimleri, Fosfat- Riboz Omurqa Referanslarinin Yer Degistirmesi Siklobütil seker vekil bilesikleri, U.S. Pat. No. 5,359,044 sayili belgede tarif edilmistir. Pirrolidin seker vekil bilesikler, U.S. Pat. No. 5,519,134 sayili belgede tarif edilmistir. belgelerde ve diger ilgili patent tarifnamelerde tarif edilmistir. Peptid Nükleik Asitler (PNArlar) kendi basina bilinmektedir ve Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5- 23 sayili belgelerde tanimlanan çesitli prosedürlere uygun olarak hazirlanabilir. Bunlar ayrica U.S. Pat. No. 5,539,083 sayili belgeye göre hazirlanabilir. Terminal Modifikasyon Referanslari Terminal modifikasyonlari, Manoharan, M. ve dig. Antisens ve Nucleic Acid Drug edilmistir. Nükleobazlarin Referanslari N- 2 ornatilmis purin nükleosit amiditler, U.S. Pat. No. 5,459,255 sayili belgede tarif edildigi gibi hazirlanabilir. 3- Deaza purin nükleosit amiditler, U.S. Pat. No. 5,457,191 sayili belgede tarif edildigi gibi hazirlanabilir. 5,6- Ornatilmis pirimidin n'ükleosit amiditler, U.S. Pat. No. 5,614,617 sayili belgede tarif edildigi gibi hazirlanabilir. 5- 5 Propinil pirimidin nükleosit amiditler, U.S. Pat. No. 5,484,908 sayili belgede tarif edildigi gibi hazirlanabilir. Bag Iayicilar Baglayicilar, tipik olarak bir dogrudan bagi ya da oksijen ya da sülfür gibi bir atomu, 10 bir birimi NRl, C(O), C(O)NH, 80, 802, SOzNH ya da atomlarin bir zinciri gibi, ikame edilmis ya da ikame edilmemis alkil, ikame edilmis ya da ikame edilmemis alkenil, ikame edilmis ya da ikame edilmemis alkinil, aril alkil, arilalkenil, arilalkinil, heteroaril alkil, heteroarilalkenil, heteroarilalkinil, heterosiklil alkil, heterosiklilalkenil, heterosiklilalkinil, aril, heteroaril, heterosiklil, siklo alkil, sikloalkenil, alkilaril alkil, alkil, alkinilarilalkenil, alkinilarilalkinil, alkilheteroaril alkil, alkilheteroarilalkenil, alkilheteroarilalkinil, alkilheteroarilalkenil, alkilheteroarilalkinil, alkenilheteroarilalkil, alkenilheteroarilalkenil, alkenilheteroarilalkinil, alkinilheteroarilalkil, alkinilheteroarilalkenil, alkinilheteroarilalkinil, alkinilheterosiklilalkil, alkilheterosiklilalkenil, alkilhererosiklilalkinil, alkenilheterosiklilalkil, alkenilheterosiklilalkenil, alkenilheterosiklilalkinil, alkinilheterosislilalkil, alkinilheterosiklilalkenil, alkinilheterosiklilalkinil, alkilaril, alkenilaril, alkinilaril, alkilheteroaril, alkenilheteroaril, alkinilheteroaril içerir, burada bir ya da daha fazla metilen 0, S, S(O), 802, N(R1)2, C(O), parçalanabilir bir baglanti grubu, ikame edilmis ya da ikame edilmemis aril, ikame edilmis ya da ikame edilmemis heteroaril, ikame edilmis ya da ikame edilmemis heterosiklik kesilebilir ya da tarafindan sonlandirilabilir; içerisinde R1 ifadesi hidrojen, asil, alifatik ya da ornatilmis alifatik olmaktadir. Bir düzenlemede baglayici- [(P- Q- R)q- X- (P- Q- R )q ]q "- T- olup, burada: P, R, T, P,, R, ve T'nin her biri bagimsiz olarak her olusum için bos, CO, NH, 0, S, ya da heterosiklildir; Q ve O' her biri, her olusum için bagimsiz olarak bos,- (CH2)n- ,- C(R1)(R2)(CH2)n- ,- X ifadesi bostur ya da parçalanabilir bir baglanti grubudur; Rarnin her biri H ya da an amino asit yan zinciridir; R1 ve R2'nin her biri bagimsiz olarak her olusum için H, CH3, OH, SH ya da N(RN)2'dir; RN ifadesinin her biri bagimsiz olarak her olusum için H, metil, etil, propil, izopropil, q, q, ve q" her biri bagimsiz olarak her olusum için 0- 20 olmaktadir ve içerisinde tekrarlanan birim ayni ya da farkli olabilir; n ifadesi bagimsiz olarak her olusum için 1- 20'dir; ve m ifadesi bagimsiz olarak her olusum için 0- 50'dir. Bir düzenlemede, baglayici en az bir parçalanabilen baglanti grup içerir. Bazi düzenlemelerde, baglayici bir dallanmis baglayicidir. Dallanmis baglayicinin dallanma noktasi en az üç degerlikli olabilir, ancak bir dört degerlikli, bir bes degerlikli ya da alti degerlikli atom olabilir, ya da bu gibi birden fazla degeri sunan bir grup olabilir. Bazi düzenlemelerde, dallanma noktasi,- N,- N{Q)- C,- 0- C,- 8- C,- 88- C,- C(O)N(Q)- C,- OC(0)N(Q)- C,- N(Q)C(O)- C, ya da- N(Q)C(O)O- C olmaktadir; burada Q ifadesi, bagimsiz olarak her olusum için H ya da opsiyonel olarak ikame edici alkil olmaktadir. Diger bir düzenlemede, dallanma noktasi gliserol ya da gliserol türevidir. Parcalanabilir Baglanti Gruplari Bir parçalanabilir baglanti grubu, hücrenin disinda yeterince stabil olan, fakat bir hedef hücreye giris üzerine baglayicinin bir arada tutuldugu iki parçayi serbest birakmak üzere parçalanir. Tercih edilen bir düzenlemede, parçalanabilir baglanti grubu, hedef hücresinde en az 10 kat ya da daha fazla, tercih edilen sekliyle 100 kat daha hizli parçalanabilir ya da bir denegin kanindan ziyade bir ilk referans kosulu altinda (ki bu da, örnegin taklidi seçilebilen ya da hücreler arasi kosullari temsil eden) ya da bir ikinci referans kosulu altinda (ki bu da, örnegin taklidi seçilebilen ya da kanda veya serumda bulunan kosullari temsil eden) parçalanabilir. Parçalanabilir baglanti gruplari, parçalanabilir ajanlara, örnegin, pH, redoks potansiyel ya da degradatif moleküllerin mevcudiyetine duyarlidir. Genel olarak, parçalanma ajanlari, daha yaygin olan ya da serumda da kandaki aktivitelerin daha yüksek seviyelerde bulundugunu göstermektedir. Bu tür degradatif ajanlar: belirli substratlar için seçici olan ya da örnegin oksidatif ya da redüktif enzimler dahil olmak üzere substrat spesifitesine sahip olmayan redoks ajanlarini ya da redüksiyon ile bir redoks parçalanma baglanti grubunu indirgeyebilen hücre içinde mevcut olan merkaptanlar gibi redüktif ajanlar; esterazlar; endozomlar ya da bir asidik ortamo olusturan, örnegin, bir pH bes ya da daha düsügü ile elde edilenler, ajanlar; peptidazlar (substrata özgü olabilen) ve fosfatazlar gibi bir genel asit olarak etki ederek bir asit ile parçalanabilen baglanti grubunu indirgeyebilen ya da hidrolize edebilen enzimleri içerir. Disülfid bagi gibi bir parçalanabilir baglanti grubu pH'a duyarli olabilir. Insan serumunun pH'i 7.4 iken, ortalama hücre içi pH oldukça düsük olup pH yaklasik 7.1- 7.3 arasinda bir araliktadir. Endozomlar 5.5- 6.0 araliginda daha asidik pH'a sahiptir ve lizozomlar 5.0 civarinda daha da asidik pH degerine sahiptir. Bazi baglayicilar, tercih edilen bir pH'da parçalanan ve böylece katyonik Iipidi hücrenin içindeki liganddan serbest birakan, ya da hücrenin istenen bölmesine salinilabilen, parçalanabilir bir baglanti grubuna sahip olacaktir. Bir baglayici, belirli bir enzim tarafindan parçalanabilen, parçalanabilen bir baglanti grubunu içerebilir. Bir baglayiciya dahil edilen ayrilabilen baglanti grubunun tipi, hedeflenecek hücreye bagli olabilir. Örnegin, karacigeri hedefleyen ligandlar, katyonik lipitlere bir ester grubu içeren bir baglayici ile baglanabilir. Karaciger hücreleri esteraz açisindan zengindir, bu nedenle baglayici, karaciger hücresinde esteraz bakimindan zengin olmayan hücre tiplerine göre daha etkin bir sekilde parçalanacaktir. Esterazlar bakimindan zengin diger hücre tipleri akciger, renal korteks ve testisin hücrelerini içerir. Peptit baglari içeren baglayicilar, karaciger hücreleri ve sinoviyositler gibi peptidazlar bakimindan zengin hücre tiplerini hedeflerken kullanilabilir. Genelde, bir aday parçalanabilir grubun uygunlugu, bir parçalanabilir ajanin (ya da kosulu) aday baglanti grubunu parçalama kabiliyetinin test edilmesi ile degerlendirilebilir. Ayrica, diger hedef olmayan doku ile temas halindeyken ya da kandaki bölünmeye direnme yetenegi bakimindan aday parçalanabilir baglanti grubunun test edilmesi de istenecektir. Böylece, bir birinci ve bir ikinci kosul arasindaki ayrilmaya karsi nispi duyarlilik belirlenebilmekte olup, burada birincisi, bir hedef hücrede parçalanma belirtisi olarak seçilir ve ikincisi, örnegin, kan ya da serum gibi diger dokularda ya da biyolojik sivilardaki parçalanma belirtisi olarak seçilir. Degerlendirmeler hücre içermeyen sistemlerde, hücre içinde, hücre kültüründe, organ ya da doku kültüründe ya da bütün hayvanlarda gerçeklestirilebilir. Hücresiz ya da kültür kosullarinda baslangiç degerlendirmelerinin yapilmasi ve bütün hayvanlarda daha fazla degerlendirmenin yapilmasi ile teyit edilmesi yararli olabilir. Tercih edilen uygulamalarda, yararli aday bilesikler, kan ya da serumu ile karsilastirildiginda (ya da taklit için seçilen in vitro kosullar altinda hücre disi kosullar) hücre içinde (hücre içi kosullari taklit etmek için seçilen in vitro kosullar altinda) en az 2, 4, 10 ya da 100 kat daha hizli parçalanir. Redoks parçalanabilen baglanti qruplari Parçalanabilen baglanti grubunun bir sinifi, indirgeme ya da oksidasyonu üzerine parçalanan redoks parçalanabilir baglanti gruplaridir. Indirgeyici olarak parçalanabilen baglanti grubunun bir örnegi, bir disülfid baglanti grubudur (- S- S- ). Bir aday parçalanabilen baglanti grubunun uygun bir "indirgeyici olarak parçalanabilen baglanti grubu" olup olmadigini ya da örnegin bir iRNA parçasi ve özel hedefleme ajani ile kullanim için olup olmadigini belirlemek için, kisi, bunun içinde tarif edilen metotlara bakabilir. Örnegin, bir aday ditiothreitol (DTT) ile inkübasyon, ya da bir diger hücrede, örnegin bir hedef hücrede gözlenecek olan bölünme oranini taklit eden teknolojide bilinen reaktifler kullanilarak diger indirgeyici ajan ile degerlendirilebilir. Adaylar ayni zamanda kan ya da serum kosullarini taklit etmek için seçilen kosullar altinda degerlendirilebilir. Tercih edilen bir düzenlemede, aday bilesikleri, kanda en çok % 10 oraninda parçalanir. Tercih edilen düzenlemelerde, yararli aday bilesikler, kan ile karsilastirildiginda (ya da taklit için seçilen in vitro kosullar altinda hücre disi kosullar) hücre içinde (hücre ipi kosullari taklit etmek için seçilen in vitro kosullar altinda) en az 2, 4, 10 ya da 100 kat daha hizli indirgenebilir. Aday bilesiklerin parçalanma hizi, hücre içi ortami taklit etmek için seçilen kosullar altinda standart enzim kinetigi deneyleri kullanilarak ve hücre disi ortami taklit etmek için seçilen kosullarla karsilastirilarak belirlenebilir. Fosfat tabanli parcalanabilir baglanti qruplari Fosfat tabanli parçalanabilen baglanti gruplari, fosfat grubunu indirgeyen ya da hidrolize eden ajanlartarafindan parçalanir. Hücre içindeki fosfat gruplarini parçalayan bir ajana ait bir örnek, hücre içindeki fosfatazlar gibi enzimlerdir. Fosfat- bazli parçalanabilen baglanti gruplarina örnekler,- O- P(O)(ORk)- O- ,- O- P(S)(ORk)- O- ,- O- ,- S- P(S)(Rk)- O- ,- 8- P(O)(Rk)- S- ,- O- P(S)(Rk)- S- olmaktadir. Tercih edilen uygulamalar,- O- P(O)(OH)- O- ,- O- P(S)(OH)- O- ,- 0- P(S)(SH)- O- ,- S- P(O)(OH)- P(S)(H)- S- olmaktadir, tercih edilen bir uygulama- O- P(O)(OH)- O- olmaktadir. Bu adaylar, yukarida tarif edilenlere benzer metotlar kullanilarak degerlendirilebilir. Asitle parçalanabilen baglanti gruplari Asitle parçalanabilen baglanti gruplari, asidik kosullar altinda parçalanan baglanti gruplaridir. Tercih edilen uygulamalarda asitle parçalanabilen baglanti gruplari, yaklasik 6.5 ya da daha düsük (örnegin, yaklasik 6.0, 5.5, 5.0, ya da daha düsük) bir pH ile asidik bir ortamda parçalanir ya da bir genel asit olarak etki edebilen enzimler gibi ajanlar ile parçalanir. Bir hücrede, endozomlar ve Iizozomlar gibi spesifik düsük pH organelleri, asitle parçalanabilen baglanti gruplari için bir parçalanma ortami saglayabilir. Asitle parçalanabilen baglanti gruplarina örnekler, ancak sinirlandirilmamis olarak, hidrazonlar, esterler, ve amino asitlerin esterlerini içerir. Asitle parçalanabilen gruplar, genel formül- C = NN- , C(O)O, ya da- OC(O) sahiptir. Tercih edilen bir uygulama, esterin (alkoksi grubu) oksijenine baglanan karbonun, bir dimetil pentil ya da t- bütil gibi bir ikame edilmis grup, ya da tersiyer grup oldugu bir aril grubu oldugu zamandir. Bu adaylar, yukarida tarif edilenlere benzer metotlar kullanilarak degerlendirilebilir. Ester tabanli baglanti qruplari Ester tabanli parçalanabilen baglanti gruplari, hücrede esterazlar ve amidazlar gibi enzimler tarafindan parçalanir. Ester tabanli parçalanabilen baglanti gruplari, alkilen, alkenilen ve alkinilen gruplarinin esterlerini içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Ester ile parçalanabilen baglanti gruplari, genel formül- C(O)O- , ya da- OC(O)- sahiptir. Bu adaylar, yukarida tarif edilenlere benzer metotlar kullanilarak degerlendirilebilir. Peptit tabanli parçalanan qruplar Peptid tabanli parçalanabilen baglanti gruplari, hücrelerdeki peptidazlar ve proteazlar gibi enzimler tarafindan parçalanir. Peptid tabanli parçalanabilen baglanti gruplari, oligopeptidler (örnegin, dipeptidler, tripeptidler vb.) ve polipeptidler verecek sekilde amino asitler arasinda olusturulan peptid baglaridir. Peptid tabanli parçalanabilir gruplar, amid grubunu (- C(O)NH- ) içermez. Amid grubu herhangi bir alkilen, alkenilen ya da alkinelen arasinda olusturulabilir. Bir peptit bagi, peptidleri ve proteinleri vermek üzere amino asitler arasinda olusan 'özel bir amid bagi türüdür. Peptid tabanli parçalanma grubu genel olarak, peptidleri ve proteinleri vererek amino asitler arasinda olusan peptid bagiyla (yani, amid bagi) sinirlandirilir ve tüm amid islevsel grubunu içermez. Peptid tabanli parçalanabilen baglanti gruplari, genel formül NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- sahip olup içerisinde RA ve RB ifadeleri, iki komsu amino asitlerin R gruplaridir. Bu adaylar, yukarida tarif edilenlere benzer metotlar kullanilarak degerlendirilebilir. Ligandlar Çok çesitli varliklar bunun içinde tarif edilen oligonükleotidler ve lipidlere baglanabilir. Tercih edilen parçalar, tercih edilen sekliyle araya giren bir teter vasitasiyla dogrudan ya da dolayli olarak baglanan, tercih edilen sekliyle kovalent olarak baglanan ligandlardir. Tercih edilen düzenlemelerde, bir Iigand, içerisine dahil edildigi molekülün ömrünü hedefleyen dagilimi degistirir. Tercih edilen düzenlemelerde, bir ligand, Iigand içermeyen bir tür ile karsilastirildiginda örnegin, molekül, hücre ya da hücre tipi, bölme gibi, örnegin, bir hücresel ya da organ bölmesi, doku, organ ya da vücut bölgesi gibi seçilmis bir hedef için gelistirilmis bir afinite saglar. Seçilen bir hedef için gelismis afinite saglayan ligandlar da ayni zamanda hedefleme ligandlari olarak adlandirilir. Burada tarif edilen Iipitlere konjugasyon için tercih edilen ligandlar, hedefleme ligandlaridir. Bazi ligandlar endozomolitik özelliklere sahip olabilir. Endozomolitik ligandlar, burada açiklanan endozomun Iizisini ve / veya kompozisyonun transportunu, ya da endozomdan hücrenin sitoplazmasina kadar kendi bilesenlerini destekler. Endozomolitik Iigand, pH bagimli membran aktivitesi ve fuzojenisite gösteren bir polianyonik peptid ya da peptidomimetik olabilir. Bazi uygulamalarda, endosomolitik ligand, kendi aktif konformasyonunu endozomal pH'de varsayar. "Aktif" konformasyon, endosomolitik Iigandlarin, bunun içinde açiklanan endosomun Iizisini ve / veya kompozisyonun transportunu, ya da endozomdan hücrenin sitoplazmasina kadar kendi bilesenlerini destekledigi bu konformasyondur. Ornek teskil eden endozomolitik düzenlemelerde, endozomolitik bilesen, pH degerindeki bir degisiklige yanit olarak yükte ya da protonasyonda bir degisiklik geçirecek bir kimyasal grup (örnegin, bir amino asit) içerebilir. Endozomolitik bilesen, lineer ya da dallanmis olabilir. Peptit bazli endosomolitik Iigandlarin örnek primer sekanslari, Tablo 5'te gösterilmistir. Tablo 5. Endozomolitik aktiviteye sahip peptitlerin listesi Isim Sekans (N ila C) Ref. lnf HA- 2 GLFGAIAGFIENGVVEGMIDGVVYG 5 diINF- 7 GLF EAl EGFI ENGW EGMl 5 DGVVYGC GLF EAI EGFI ENGVV diINF3 GLF EAl EGFI ENGVV EGMI 6 DGGC GLF EAI EGFI ENGVV GALA- INF3 GLFEAIEGFI ENGVVEGLAEALAEALEALAAGGSC 6 K GLF EAI EGFI ENGVV EGnI n, norlösin Referanslar 3. Turk, M. J., Reddy, J. A. ve dig. (2002). Characterization of a novel pH- sensitive peptide that enhances drug release from folate- targeted Iiposomes at endosomal pHs. Biochim. Biophys. Acta 1559, 56- 68. 4. Plank, C. Oberhauser, B. Mechtler, K. Koch, C. VVagner, E. (1994). The influence of endosome- disruptive peptides on gene transfer using synthetio virus- like . Mastrobattista, E., Koning, G. A. ve dig. (2002). Functional characterization of an endosome- disruptive peptide and its application in cytosolic delivery of 6. Oberhauser, B., Plank, C. ve dig. (1995). Enhancing endosomal exit of nucleic acids using pH- sensitive viral füzyon peptides. Deliv. Strategies Antisense Tercih edilen Iigandlar transport, hibridizasyon ve özgüllük özelliklerini gelistirebilir ve ayrica dogal olarak modifiye edilmis oligoribonükleotidin nükleaz direncini de gelistirebilir, ya da burada tarif edilen monomerlerin herhangi bir kombinasyonunu içeren bir polimerik molekül ya da modifiye ribonükleotidlerin nükleaz direncini de gelistirebilir. Ligandlar genel olarak örnegin, geri alimi gelistirmek için terapötik modifiye edicileri; Örnegin dagilimi gözlemlemek için, tani bilesikleri ya da haberci gruplari; çapraz baglama ajanlari; ve nükleaz direnci veren kisimlari içerebilir. Genel olarak örnekler, lipidler, steroidler, vitaminler, sekerler, proteinler, peptidler, poliaminler ve peptid taklitleri içerir. Ligandlar, bir protein (örnegin, insan serum albümini (HSA), düsük yogunluklu lipoprotein (LDL), yüksek yogunluklu lipoprotein (HDL), ya da globulin); bir karbohidrat (örnegin, a dekstran, pullulan, kitin, kitosan, inulin, siklodekstrin ya da hiyalüronik asit); ya da bir Iipit gibi dogal olarak olusan bir maddeyi içerir. Ligand ayni zamanda, bir rekombinant ya da sentetik polimer gibi sentetik molekül, örnegin bir sentetik poliamino asit, bir oligonükleotid (örnegin bir aptamer) olabilir. Poliamino asitlere örnekler, poliamino asidi içermekte olup, bunlar bir polilisin (PLL), poli L- aspartik asit, poli L- glutamik asit, stiren- maleik asit anhidrit kopolimer, poli(L- laktit- ko- glikolied) kopolimer, divinil eter- maleik anhidrit kopolimer, N- (2- hidroksipropil) metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkol (PVA), poliüretan, poli (2- etilakrilik asit), N- izopropilakrilamid polimerler, ya da polifosfazindir. Poliaminlere ait örnek: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, polyamin, psödopeptid- poliamin, peptidomimetik poliamin, dendrimer polyamin, arjinin, amidin, protamin, katyonik Iipid, katyonik porfirin, bir polyaminin kuarternar tuzu ya da bir alfa heliks peptid içerir. Ligandlar ayni zamanda hedefleme gruplari, örnegin, bir hücre ya da doku hedefleme ajani, örnegin, a lektin, glikoprotein, Iipid ya da protein, bir böbrek hücresi gibi özellestirilmis bir hücreye baglanan örnegin, bir antikoru içerir. Bir hedefleme grubu, bir tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, sürfaktan protein A, Musin karbohidrat, çok degerli laktoz, çok degerli galaktoz, N- asetil- galaktozamin, N asetil- gulukosamin çok degerli manoz, çok degerli fukoz, glikosilatlanmis poliamino asitler, çok degerli galaktoz, transferrin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, bir lipit, kolesterol, bir steroid, safra asidi, folat, vitamin 812, biotin, bir RGD peptidi, bir RGD peptidi taklidi ya da bir aptamer olabilir. Tablo 6, hedefleme Iigandlarin ve bunlarin iliskili reseptörlerinin bazi örneklerini gösterir. Tablo 6: Hedefleme Ligandlari ve bunlarin iliskili reseptörleri Karaciger Hücreleri Ligand Reseptör 1) Parenkimal Hücresi (PC) Galaktoz ASGP- R (Hepatositler) (Asiologlikoprotein reseptör) Gal NAc (n- asetil- ASPG- R galaktosamin) Gal NAc Reseptörü Laktoz Asialofetuin ASPG- r 2) Sinusoidal Endotelyal Hiyaluronan Hiyaluronan reseptör Hücresi (SEC) Prokollaien Prokollaien reseptör Negatif olarak yüklü Süpür'üc'ü reseptörler moleküller Manoz Manoz reseptörleri N- asetil Glukosamin Süpürücü reseptörler lmmünoglobulinler Fc Reseptör'ü CD 14 Reseptör Insülin Reseptör aracili transsitosiz Transferrin Reseptör aracili transsitosiz Albuminler Spesifik olmayan $eker- Albumin konjügatlari Manoz- 6- fosfat Manoz- 6- fosfat reseptörü 3) Kupffer Hücresi (KC) Manoz Manoz reseptörleri Fu koz Fukoz reseptörleri Albuminler Spesifik olmayan Manoz- albumin konjügatlar Ligandlara ait diger örnekler, boyalar, araya eklenen ajanlar (örnegin, akridinleri), çapraz baglayicilar (örnegin, psoralen, mitomisin C), porfirinler (TPPC4, teksaprin, Sapfirin), polisiklik aromatik hidrokarbonlar (örnegin, fenazin, dihidrofenazin), yapay endonükleazlar (örnegin EDTA), Iipofilik moleküller, örnegin, kolesterol, kolik asit, adamantan asetik asit, 1- piren bütirik asit, dihidrotestosteron, 1,3- Bis- O (hekzadesil) gliserol, geraniloksihekzil grubu, hekzadesilgliserol, borneol, mentol, 1,3- propandiol, heptadesil grubu, palmitik asit, miristik asit, 03- (oleoil) litokolik asit, 03- (oleoil) kolenik asit, dimetoksitritil, ya da fenoksazin) ve peptid konjügatlari (örnegin, antennapedia peptid, Tat peptid), alkilleyici ajanlar, fosfat, amino, merkapto, PEG (örnegin, PEG- 40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, ornatilmis alkil, radyoaktif isaretli markerler, enzimler, haptenler (örnegin, biyotin), transport / absorpsiyon kolaylastiricilari (örnegin, aspirin, E vitamini, folik asit), sentetik ribonükleazlar (örnegin, imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol kümeleri, akridin- imidazol konjügatlari, tetraazamakrolaplarin Eu3 + kompleksleri ), dinitrofenil, HRP ya da AP içerir. Ligandlar, proteinler, örnegin, glikoproteinler ya da peptidler, örnegin bir ko- ligand için spesifik bir afiniteye sahip moleküller ya da antikorlar, örnegin, bir kanser hücresi, endotel hücre, ya da kemik hücresi gibi belirli bir hücre türüne baglanan bir antikor olabilir. Ligandlar ayni zamanda hormonlar ve hormon reseptörleri içerebilir. Ayni zamanda Iipidler, lektinler, karbohidratlar, vitaminler, kofaktörler, çok degerli Iaktoz, çok degerli galaktoz, N- asetil- galaktozamin, N- asetil- gulukosamin çok degerli manoz, çok degerli fukoz, ya da aptamerler gibi peptidik olmayan türleri içerir. Ligand, örnegin, bir Iipopolisakkarit, p38 MAP kinazin bir aktivatörü ya da NF- KB'nin bir aktivatörü olabilir. Ligand, örnegin, hücrenin hücre iskeletini bozarak, örnegin hücrenin mikrotübüllerini, mikrofilamentlerini ve / veya ara filamentleri bozarak, hücre içerisine iRNA ajanin geri alimini arttirabilen, örnegin bir ilaç gibi bir madde olabilir. Ilaç, örnegin, takson, vinkristin, vinblastin, sitokalasin, nokodazol, japlakinolid, latrunculin A, palloidin, swinholide A, indanokin, ya da miyoservin olabilir. Ligand, örnegin, bir inflamatuar yaniti aktive ederek iRNA ajanin hücre içine geri alinmasini artirabilir. Bu tür bir etkiye sahip olan örnek teskil eden ligandlar, tümör nekroz faktör alfa (TNFaIfa), interlökin- 1 beta, ya da gama interferon içerir. Bir bakis açisinda, Iigand, bir Iipit ya da Iipit bazli moleküldür. Böyle bir Iipit ya da lipid bazli bir molekül tercih edilen sekliyle bir serum proteinini, örnegin insan serum albümini (HSA) baglar. Bir HSA baglanma Iigandi, konjügatin, vücudun böbrek disi bir hedef dokusu olan bir hedef dokuya dagilmasina izin verir. Ornegin, hedef doku, karacigerin parankimal hücresi de dahil olmak üzere karaciger olabilir. HSA'yi baglayabilen diger moleküller de ayni zamanda ligand olarak kullanilabilir. Ornegin, neproksin ya da aspirin kullanilabilir. Bir lipit ya da Iipit bazli Iigand, (a) konjügatin bozunmasina karsi direncini artirabilir, (b) bir hedef hücre ya da hücre membrani içerisine tasinmayi ya da hedeflemeyi arttirilabilir ve / veya (0) örnegin, HSA gibi bir serum proteine baglamayi ayarlamak için kullanilabilir. Bir Iipit tabanli ligand, örnegin konjügatin bir hedef dokuya baglanmasini kontrol etmek, modüle etmek için kullanilabilir. Ornegin, HSA'ya daha güçlü baglanan lipit ya da Iipit bazli bir Iigandin böbrege hedeflenmesi daha az olasidir ve bu nedenle vücuttan temizlenme olasiligi daha düsüktür. HSA'ya daha az kuvvetle baglanan bir Iipit ya da lipit bazli ligand, konjügati böbrege hedeflemek için kullanilabilir. Tercih edilen bir düzenlemede, lipid tabanli ligand HSA'yi baglar. Tercih edilen sekliyle, HSA'yi, konjügatin tercih edilen sekliyle böbrek disi bir dokuya dagitilacagi sekilde yeterli bir afinite ile baglar. Bununla birlikte, afinitenin, HSA- ligand baglanmasinin tersine çevrilemeyecek kadar güçlü olmamasi tercih edilir. Bir baska tercih edilen düzenlemede, lipid tabanli ligand HSA*yi zayif bir sekilde baglar ya da hiç baglamaz, öyle ki konjugat tercih edilen sekliyle böbrege dagitilacaktir. Böbrek hücrelerini hedefleyen diger kisimlar, Iipit bazli liganda ek olarak ya da bunun yerine kullanilabilir. Bir baska bakis açisinda, Iigand, örnegin bir prolifere edici hücre gibi bir hedef hücre tarafindan alinan örnegin bir vitamin gibi bir kismidir. Bunlar, örnegin kanser hücreleri gibi, örnegin, malignant ya da malignant olmayan türe ait istenmeyen hücre proliferasyonu ile karakterize edilen rahatsizliklari tedavi etmek için özellikle kullanilmaktadir. Ornek teskil eden vitaminler, vitamin A, E, ve K içerir. Diger örnek teskil eden vitaminler, B vitamini içermekte olup, örnegin, kanser hücresi ile alinan folik asit, B12, riboflavin, biyotin, piridoksal ya da diger vitaminler ya da besinlerdir. Ayni zamanda dahil edilenler HAS, düsük yogunluklu Iipoprotein (LDL) ve yüksek yogunluklu Iipoproteindir (HDL). Baska bir bakis açisinda, Iigand, bir hücreye geçirgenlik ajani, tercih edilen sekliyle bir sarmal hücreye geçirgenlik ajanidir. Bu ajan tercih edilen sekliyle amfipatiktir. 'Ornek teskil eden bir ajan, tat ya da antennopedia gibi bir peptiddir. Ajan bir peptid ise, bir peptidilimetik, invertomerler, peptit olmayan ya da psödo- peptid baglari ve D- amino asitlerinin kullanimi da dahil olmak üzere modifiye edilebilir. Sarmal ajan tercih edilen sekliyle bir lipofilik ve bir Iipofobik faza sahip olan bir alfa- helisel ajandir. Ligand, bir peptid ya da peptidomimetik olabilir. Bir peptidomimetik (burada ayrica bir oligopeptidomimetik olarak da adlandirilir), dogal bir peptide benzer bir tanimlanmis üç boyutlu yapiya katlanabilen bir moleküldür. Peptid ya da peptidomimetik kisim, , 40, 45, ya da 50 amino uzunlugundadir (Tablo 7'ye bakiniz). Tablo 7. Ornek Teskil Eden Hücre Geçirgenligi Peptitleri Bir peptid ya da peptidomimetik, örnegin bir hücre geçirgenlik peptidi, katyonik peptid, amfipatik peptid, ya da hidrofobik peptid olabilir (örnegin, primer olarak Tyr, Trp ya da Phe'den olusur). Peptit kismi, bir dendrimer peptid, sinirlanmis peptid ya da Çapraz baglanmis peptid olabilir. Baska bir alternatifte, peptit kismi, bir hidrofobik membran translokasyon sekansi (MTS) içerebilir. Ornek teskil eden bir hidrofobik MTS içerikli peptid, AAVALLPAVLLALLAP amino asit sekansina sahip RFGFJdir. Bir hidrofobik MTS içeren bir RFGF analogu (örnegin, amino asit sekansi AALLPVLLAAP) da bir hedefleme kismi olabilir. Peptit kismi, hücre membranlari boyunca peptidler, oligonükleotidler ve protein dahil olmak üzere büyük polar molekülleri tasiyabilen bir "iletim" peptidi olabilir. Örnegin, HIV Tat proteini (GRKKRRQRRRPPQ) ve Drosophila Antennapedia proteininin (RQlKIWFQNRRMKWKK) sekanslarinin, iletim peptidleri olarak islev görebildigi bulunmustur. Bir peptid ya da peptidomimetik, bir faj- görüntüleme kütüphanesinden ya da bir- boncuk- bir- bilesik (OBOC) kombinatoryal kütüphanesinden tanimlanmis bir peptid gibi rastgele bir DNA sekansi tarafindan kodlanabilir (Lam ve dig., Nature, 354: 82- 84, 1991). Tercih edilen sekliyle, bir birlesik monomer birimi yoluyla bir iRNA ajanina tetritlenmis peptid ya da peptidomimetik, bir arjinin- glisin- aspartik asit (RGD)- peptid, ya da RGD mimik gibi bir hücre hedefleyici peptiddir. Bir peptit kismi yaklasik amino asitten yaklasik 40 amino asit uzunluga kadar degisebilir. Peptit kisimlari, dogrudan konformasyon özelliklerinde stabiliteyi arttirmak için yapisal bir modifikasyona sahip olabilir. Asagida açiklanan yapisal modifikasyonlardan herhangi biri kullanilabilir. Bir RGD peptid kismi, bir endotelyal hücre ya da bir gögüs kanseri tümör hücresi gibi birtümör hücresinin hedeflenmesi için kullanilabilir (Zitzmann ve dig., Cancer Res., 62: karaciger de dahil olmak üzere çesitli diger dokulara ait olanlari hedeflemesini sekliyle, RGD peptidi, bir iRNA ajaninin böbrege hedeflenmesini kolaylastiracaktir. RGD peptidi lineer ya da siklik olabilir, spesifik dokulara hedeflemeyi kolaylastirmak için modifiye edilebilir, örnegin glikosillenebilir ya da metillenebilmektedir. Ornegin, glikosile edilmis bir RGD peptidi, dvßs eksprese eden bir tümör hücresine bir iRNA Prolifere olan hücrede zenginlestirilmis isaretleyicileri hedef alan peptitler kullanilabilir. Ornegin, peptid ve peptidomimetikler içeren RGD, kanser hücrelerini, özellikle de bir oivßs integrini sergileyen hücreyi hedefleyebilir. Böylece, RGD peptidleri, RGD içeren siklik peptidler, D- amino asitler içeren RGD peptidleri ve bunun yani sira sentetik RGD mimikleri de kullanilabilir. RGD'ye ilave olarak, oivßs integrin ligandini hedefleyen diger kisimlar kullanilabilir. Genel olarak, bu tür Iigandlar, hücre ve anjiyogensizlerin çogaltilmasini kontrol etmek için kullanilabilir. PECAM- 1, VEGF ya da diger kanser geni, örnegin burada tarif edilen bir kanser geni hedefleyen bu tip Iigandlarin tercih edilen konjügatlardir. Bir "hücre geçirgenlik peptidi", örnegin bir insan hücresi gibi bir memeli hücresi ya da bir bakteriyel ya da fungal hücre gibi bir mikrobiyal hücre olan bir hücreye nüfuz edebilir. Bir mikrobiyal hücre geçirgenlik peptidi, örnegin, oi- helisel lineer bir peptid (örnegin, LL- 37 ya da Ceropin P1), bir disülfid bagi içerikli peptid (örnegin, oi- defensin, (ß- defensin ya da baktenesin) ya da sadece bir ya da iki dominant amino asitleri içeren (örnegin, PR- 39 ya da indolisidin) bir peptittir. Bir hücre geçirgenlik peptidi ayni zamanda bir nükleer Iokalizasyon sinyali (NLS) içerebilir. Örnegin, bir hücre geçirgenlik peptidi, HIV- 1 gp41 ve SV40 büyük T antijeninin NLS'sinin füzyon peptid bölgesinden türetilen MPG gibi bir bipartit amfipatik peptid olabilir (Simeoni ve dig., Nucl. Acids Res. Bir düzenlemede, bir hedefleme peptidi, bir iRNA ajanina baglanir ve / veya tasiyici oligomer bir amfipatik oi- helisel peptid olabilir. Ornek teskil eden amfitatik o- helisel peptidler, sekropinler, likotoksinler, paradaksinler, buforin, CPF, bombinin benzeri peptid (BLP), katelisidinler, keratotoksinler, S. dava peptidleri, balik bagirsak antimikrobiyal peptidler (HFIAP'Ier), magaininler, brevininler- 2, dermaseptinler, melittinler, plörosidin, H2A peptidleri, Ksenopus peptidleri, esculentinis- 1 ve caerinler içerir, ancak bunlarla sinirli tutulmamaktadir. Heliks stabilitesinin bütünlügünü korumak için bir takim faktörler tercih edilen sekliyle düsünülecektir. Ornegin, maksimum sayida heliks stabilizasyon kalintisi kullanilacaktir (örnegin, Ieu, ala, ya da Iys) ve minimum sayida heliks destabilizasyon kalintisi kullanilacaktir (örnegin, prolin, ya da siklik monomerik birimler). Kaplama kalintisi, göz önüne alinacaktir (örnegin, Giy örnek teskil eden bir N- kaplama kalintisidir ve / veya C- terminal amidasyonu, sarmalin stabilize edilmesi için ekstra bir H- bagi temin etmek üzere kullanilabilir. i ± 3, ya da i ± 4 pozisyonlari ile ayrilan karsit yüklere sahip kalintilar arasindaki tuz köprülerinin olusumu, , stabiliteyi saglayabilir. Ornegin, Iisin, arjinin, homo- arjinin, ornitin ya da histidin gibi katyonik kalintilar, anyonik kalintilar glutamat ya da aspartat ile tuz köprülerini olusturabilir. Peptit ve peptidomimetik Iigandlar, dogal olarak olusan ya da modifiye edilmis peptidlere sahip olanlari, örnegin D ya da L peptidleri; or, [5 ya da y peptidleri; N- metil peptidleri; azapeptidleri; bir ya da daha fazla amide sahip peptidler, yani, peptid, bir ya da daha fazla üre, tioüre, karbamat, ya da sülfonil üre baglari ile yer degistirilen baglar; ya da siklik peptidleri içerir. Hedefleme ligandi, spesifik bir reseptörü hedefleyebilen herhangi bir Iigand olabilir. Ornekleri: folat, Ga1NAc, galaktoz, manoz, manoz- 6P, Ga1NAc kümesi, manoz kümesi, galaktoz kümesi gibi seker kümeleri ya da bir apatamerdir. Bir küme, iki ya da daha fazla seker biriminin bir kombinasyonudur. Hedefleme ligandlari ayni zamanda, integrin reseptör ligandlari, kemokin reseptör ligandlari, transferrin, biyotin, serotonin reseptör ligandlari, PSMA, endotelin, GCPlI, somatostatin, LDL ve HDL ligandlari içerir. Ligandlar ayni zamanda nükleik asit, örnegin bir aptamere dayanabilir. Aptamer modifiye edilmeyebilir ya da burada açiklanan modifikasyonlarin herhangi bir Endosomal salinim ajanlari, imidazoller, poli ya da oligoimidazoller, PEI'ler, peptidler, füzojenik peptidler, polikarboksilatlar, poliaksiyonlar, maskeli oligo ya da poli katyonlari ya da anyonlar, asetaller, poliasetaller, ketaller/ poliketyallar, ortoesterler, maskeli ya da maskesiz katyonik ya da anyonik yüklü polimerler, maskeli ya da maskesiz katyonik ya da anyonik yüklü dendrimerleri içerir. PK modülatör farmakokinetik modülatör anlamina gelir. PK modülatörü, Iipofiller, safra asitleri, steroidler, fosfolipid analoglari, peptidler, protein baglama ajanlari, PEG, vitaminler vb. içerir. Ornek teskil eden PK modülatörü, ancak sinirlandirilmamis olarak, kolesterol, yagli asitler, kolik asit, Iitokolik asit, di alkilgliseridler, diasilgliserid, fosfolipidler, sfingolipidler, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin vb. içerir. Bir dizi fosforotioat bagi içeren oligonükleotidlerin de ayni zamanda serum proteinine baglandigi bilinmektedir, böylece omurgasinda fosforotioat baglantilarinin çogunu içeren örnegin, yaklasik 5 baz, 15 baz ya da 20 baz oligonükleotidler gibi kisa oligonükleotidler de ayni zamanda ligandlar olarak kullanilabilir (örnegin PK modüle edici ligandlar olarak). Ilaveten, serum bilesenlerini baglayan aptamerler (örnegin serum proteinleri) de ayni zamanda PK modüle edici ligandlar olarak kullanilabilir. Bunun içinde kullanilan diger ligandlar, 10 Agustos 2004'te dosyalanan USSN: 10 / edilmektedir. Iki ya da daha fazla Iigand mevcut oldugunda, Iigandlarin hepsi ayni özelliklere sahip olabilir, hepsi farkli özelliklere sahip olabilir, ya da bazi ligandlar ayni özelliklere sahipken digerleri farkli özelliklere sahip olabilir. Ornegin, bir Iigand hedefleme özelliklerine sahip olabilir, ya da PK modüle edici özelliklere sahip olan endosomolitik aktiviteye sahip olabilir. Tercih edilen bir uygulamada, tüm ligandlar farkli özelliklere sahiptir. Ligandlar, oligonükleotidlere çesitli yerlerde, örnegin, 3,- ucu, 5,- ucu ve / veya bir iç pozisyonda birlestirilebilir. Tercih edilen uygulamalarda, ligand, araya giren bir baglanti vasitasiyla oligonükleotidlere baglanir. Bahsi geçen monomer, büyüyen sarmal içerisine dahil edildiginde Iigand ya da baglanmis Iigand bir monomer üzerinde mevcut olabilir. Bazi uygulamalarda, ligand, bahsi geçen "öncü" monomerin büyüyen sarmala dahil edilmesinden sonra bir "öncü" monomere birlestirilmesi yoluyla birlestirilebilir. Örnegin, bir amino ile sonlandirilan baglanti (yani, ilgili bir Iiganda sahip olmayan), örnegin TAP- (CH2)nNH2 sahip bir monomer, büyüyen sens ya da antisens sarmali içerisine birlestirilebilir. Bir sonraki islemde, yani, öncü monomerin sarmal içerisine birlestirildikten sonra, bir elektrofilik gruba sahip bir ligand, örnegin, bir pentaflorofenil ester ya da aldehit grubu, öncü monomerin baglantisinin terminal nükleofilik grubu ile ligandin elektrofilik grubunun birlestirilmesiyle öncü monomere baglanabilir. Çift sarmalli oligonükleotidler için, ligandlar bir ya da her iki sarmala da baglanabilir. Bazi uygulamalarda, çift sarmalli bir iRNA ajani, sense sarmalina konjuge edilmis bir ligand içerir. Diger uygulamalarda çift sarmalli bir iRNA ajani, antisens sarmalina konjuge edilmis bir ligand içerir. Bazi uygulamalarda, ligandlar, nükleobazlar, seker kisimlari ya da nükleik asit moleküllerin internükleosidik baglantilarina konjuge edilebilir. Saf nükleobazlara ya da bunlarin türevlerine konjugasyon, endosiklik ve ekzosiklik atomlari dahil olmak üzere herhangi bir konumda olusabilir. Bazi uygulamalarda, bir purin nükleobazin 2- , 6- , 7- bunlarin türevlerine konjugasyon, herhangi bir pozisyonda da ortaya çikabilir. Bazi uygulamalarda, Bir pirimidin nükleobazinin 2- , 5- ve 6- pozisyonlari bir konjugat kismi ile ikame edilmis olabilir. Nükleositlerin seker kisimlarina konjugasyon herhangi bir karbon atomunda meydana gelebilir. Bir konjugat kismina baglanabilen bir seker kisminin 'Örnek karbon atomlari, 2 ', 3' ve 5 'karbon atomlarini içerir. 1 'pozisyonu, bir abasik kalintida oldugu gibi bir konjugat kismina da baglanabilir. Internükleosidik baglantilar da konjugat kisimlari tasiyabilir. Fosfor içerikli baglar için (örnegin, fosfodiester, fosforotioat, fosforoditiyotat, fosforoamidat, ve benzeri), konjugat kismi, fosfor atomuna dogrudan bagli ya da fosfor atomuna baglanan bir 0, N, ya da S atomuna baglanir. Amin- ya da amid- içerikli intern'ukleosidik baglantilar (örnegin, PNA) için, konjüge kismi, amin ya da amide ait azot atomuna ya da bir komsu karbon atomuna baglanabilir. Oligomerik bilesiklerin konjugatlarini hazirlamak için sayisiz metot bulunmaktadir. Genel olarak bir oligomerik bilesik, bir konjugat kismi üzerinde reaktif bir grup ile reaktif bir grup (örnegin, OH, SH, amin, karboksil, aldehit, ve benzeri) oligomerik bilesik grup elektrofilik ve digeri nükleofiliktir. Örnegin, bir elektrofilik grubu, karbonil içerikli bir islevsellik olabilir ve bir nükleofilik grubu, bir amin ya da tiyol olabilir. Baglanma gruplari ile ya da baglanma gruplari olmaksizin nükleik asitlerin ve ilgili oligomerik bilesiklerin konjugasyon metotlari, örnegin, Manoharan in Antisens Research ve Applications, Crooke ve LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, Bölüm 17 sayili belgedeki gibi literatürde iyi tarif edilmistir. Oligonükleotid konjügatlarinin hazirlanmasini ögreten temsili Birlesik Devletler 279 içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Tanimlar Kolaylik olmasi için tarifnamede, örneklerde ve ekli istemlerde kullanilan belirli bazi terimlerin ve ifadelerin anlami asagida verilmistir. Bir terimin kullaniminda mevcut tarifnamenin diger kisimlari ile bu bölümde saglanan anlam arasinda belirgin bir tutarsizlik varsa, bölümdeki anlam geçerlidir. bir baz olarak içeren bir nükleotiti ifade eder. Ancak "ribonükleotit" veya "nükleotit" ayni zamanda asagida ayrintili olarak açiklandigi gibi modifiye bir nükleotiti veya bir vekil ikame grubunu ifade edebilir. Alaninda uzman kimse guanin, sitosin, adenin ve urasilin bu tür bir ikame grubu tasiyan bir nükleotit de dahil olmak üzere bir oligonükleotitin baz çiftlenme özelliklerini büyük ölçüde degistirmeden diger gruplarla yer degistirebileceginin farkindadir. Ornegin sinirlama olmaksizin baz olarak inosin içeren bir nükleotit adenin, sitosin veya urasil içeren nükleotitlerle baz çifti olusturabilir. Dolayisiyla urasil, guanin veya adenin içeren nükletotitler burada açiklanan nükleotit sekanslari içinde, örnegin inosin içeren bir nükleotitle yer degistirebilir. Bu tür ikame gruplar içeren sekanslar burada açiklanan düzenlemelerdir. Burada kullanilan "Faktör VII" ile bir Faktör VII mRNA, protein, peptit veya polipeptit ifade edilir. "Faktör Vll" terimi ayni zamanda teknikte AI132620, Cf7, koagülasyon faktörü VII öncülü, koagülasyon faktörü VII, FVll, serum protrombin dönüsüm hizlandiricisi, FVII koagülasyon proteini ve eptacog alfa olarak da bilinir. Burada kullanildigi haliyle "hedef sekansi", bir primer transkripsiyon ürününün RNA islemesinin bir ürünü olan mRNA da dahil olmak üzere genin transkripsiyonu sirasinda olusan bir mRNA'nin nükleotit sekansinin bitisik bir bölümünü ifade eder. Burada kullanildigi haliyle "bir sekans içeren sarmal", sarmal nükleotit terminolojisi kullanilarak basvurulan sekans tarafindan tarif edilen bir nükleotit zincirini içeren bir oligonükleotiti ifade eder. Burada kullanildigi haliyle ve aksi belirtilmedigi sürece bir nükleotit çifti baglaminda kullanilan "tamamlayici" terimi klasik bir Watson- Crick çiftini, yani GC, AT veya AU'yu ifade eder. Ayni zamanda burada tarif edildigi gibi bir veya daha fazla nükleotitin Örnegin bir riboz modifikasyonu veya bir fosfat iskelet modifikasyonu ile modifiye edildigi klasik Watson- Crick çiftlerine kadar uzanir. Ayrica baz çiftlenme özelliklerini büyük ölçüde degistirmeyen bir inosin veya diger varliklari da içerir. Burada kullanildigi haliyle ve aksi belirtilmedigi sürece "tamamlayici" terimi, ikinci bir nükleotit sekansina göre birinci bir nükleotit sekansini tarif etmek için kullanildiginda, alaninda uzman kimse tarafindan anlasilacagi üzere birinci nükleotit sekansini içeren bir oligonükleotit veya polinükleotitin ikinci nükletotit sekansini içeren bir oligonükleotit veya polinükleotitle belirli kosullar altinda hibritlesme ve bir dupleks yapisi olusturma yetenegini ifade eder. Tamamlayicilik fizyolojik kosullar altinda, örnegin bir organizmada karsilasilabilecek fizyolojik olarak ilgili kosullar altinda hibritlesmeye izin veren tam bir tamamlayiciligi, büyük ölçüde tamamlayiciligi ve yeterli tamamlayiciligi içerir. Tam tamamlayicilik yukarida tarif edildigi gibi bireysel bir çift için birinci ve ikinci sekansin tüm çiftlerinde tamamlayiciligi ifade eder. Bir sekans burada açiklanan ikinci bir sekansa göre "büyük ölçüde tamamlayici" oldugunda, iki sekans tamamen tamamlayici olabilir veya nihai uygulamalarina en uygun kosullar altinda hibritlesme yeteneklerini korurken, hibritlesme üzerine bir veya daha fazla uyusmayan baz çifti olustururlar ancak genel olarak 4, 3 veya ?den daha fazlasini olusturmazlar. Büyük ölçüde tamamlayici, ayni amanda zorlayici kosullar altinda hibritlesme olarak tanimlanabilir, burada zorlayici kosullar sunlari içerebilir: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12 saat boyunca 50 CC veya 70 cC ardindan yikama. Alaninda uzman kimse hibritlesen nükleotitlerin nihai uygulamalarina uygun olarak iki sekansin tamamlayiciliginin bir testi için en uygun kosullar setini belirleyebilecektir. Bununla birlikte hibritlesme üzerine iki oligonükleotit bir veya daha fazla tek sarmal çikintisi olusturmak üzere tasarlandiginda, bu tür çikintilar tamamlayiciligin belirlenmesi ile ilgili olarak uyusmazlik olarak kabul edilmemelidir. Örnegin 21 nükleotit uzunlugunda bir oligonükleotit içeren bir dsRNA ve 23 nükleotit uzunlugunda baska bir oligonükleotit hala "tam tamamlayici" olarak adlandirilabilir, burada daha uzun oligon'ukleotit kisa nükleotit için tam tamamlayici olan 21 nükleotit uzunlugunda bir sekans içerir. yeteneklerine göre yukaridaki gereksinimler karsilandigi sürece Watson Crick disi baz çiftleri ve / veya dogal olmayan ve modifiye nükleotitleri içerebilir veya tamamen bunlardan meydana gelebilir. Fizyolojik kosullar altinda, örnegin bir organizmada karsilasilabilecek fizyolojik olarak ilgili kosullar altinda hibritlesmeye izin vermek üzere "tamamlayici", "tam tamamlayici", anlasilacagi üzere bir dsRNA'nin sens sarmali ve antisens sarmali arasinda veya bir dsRNAinin antisens sarmali ve bir hedef dizisi arasinda baz eslesmesine göre kullanilabilir. Burada kullanildigi haliyle bir mesajci RNA (mRNA) için "tamamlayici, örnegin bunun bir kismi için büyük ölçüde tamamlayici" olan bir polinükleotit, ilgili mRNA'nin (örnegin kodlayan Faktör VII) bitisik bir kismi için tamamlayici, örnegin büyük ölçüde tamamlayici olan bir polinükleotiti ifade eder. Örnegin bir polinükleotit, eger sekans bir mRNA kodlayan Faktör Vll'in dokunulmayan bir kismi için büyük ölçüde tamamlayici ise bir Faktör VII mRNArnin en az bir kismi için tamamlayicidir. Burada kullanildigi haliyle "çift sarmalli RNA" veya "dsRNA" , yukarida tanimlandigi gibi iki anti paralel ve büyük ölçüde tamamlayici nükleik asit sarmali içeren bir dupleks yapisina sahip bir ribonükleik asit molekülünü veya ribonükleik asit moleküllerinin kompleksini ifade eder. Dupleks yapisini olusturan iki sarmal daha büyük RNA molekülünün farkli kisimlari olabilirler ya da ayri RNA molekülleri olabilirler. Iki sarmalin daha büyük bir molekülün parçasi oldugu ve dolayisiyla dupleks yapisini olusturan bir sarmalin 3' ucu ve ilgili diger sarmalin 5,- ucu arasinda dokunulmayan bir zincir ile baglandigi durumda, baglayici RNA zinciri bir "saç tokasi ilmegi olarak ifade edilir. Iki sarmalin dupleks yapisini olusturan bir sarmalin 3' ucu ve ilgili diger sarmalin 5'- ucu arasinda dokunulmayan bir zincir disinda bir yolla kovalent olarak baglandigi durumda, baglayan yapi bir "baglayici" olarak ifade edilir. RNA sarmallari ayni veya farkli sayida nükleotitlere sahip olabilirler. Baz çiftlerinin maksimum sayisi dsRNASnin en kisa sarmalindaki nükleotitlerin sayisidir. Dupleks yapisina ek olarak bir dsRNA burada kullanildigi haliyle ayni zamanda bir "küçük inhibitör RNA", "siRNA", "siRNA ajani", Burada kullanildigi haliyle bir "nükleotit çikintisi" çiftlenmeyen nükleotiti veya dsRNArnin bir sarmalinin bir 3, ucu diger sarmalin 5,- ucunun ötesine uzandiginda ve tam tersi durumda bir dsRNA,nin dupleks yapasindan çikinti yapan nükleotitlerini ifade eder. "Kör" veya "kör uç" dsRNA7nin ucunda çiftlenmemis nükleotitlerin yani nükleotit çikintisinin bulunmadigini ifade eder. Bir "kör uçlu" dsRNA, tam uzunlugu boyunca çift sarmalli olan, yani molekülün hiçbir ucunda nükleotit çikintisi bulunmayan bir dsRNArdir. bölgeyi içeren bir dsRNAinin sarmalini ifade eder. Burada kullanildigi haliyle hedef sekansi için büyük ölçüde tamamlayici olan antisens sarmalinin bölgesini ifade eder. Tamamlayicilik bölgesinin hedef sekans için tam tamamlayici olmadigi durumda, uyusmazliklar en çok uç bölgelerde tolere edilirler ve eger mevcutsa, genel olarak bir uç bölge ya da bölgelerde, örnegin 5' ve / veya 3, ucunun 6, 5, 4, 3 veya 2 nükleotitleri içindedir. Burada kullanildigi haliyle "sens sarmali", antisens sarmalinin bir bölgesi için büyük ölçüde tamamlayici olan bir bölgeyi içeren bir dsRNAJnin sarmalini ifade eder. polinükleotit arasindaki iliskidir. Kimlik ayni zamanda bu tür sekanslarin iplikçikleri arasindaki eslesme ile belirlendigi üzere polinükleotit sekanslari arasindaki sekans ilgisinin derecesi anlamina da gelir. Iki polinükleotit sekansi arasindaki kimligi ölçmek için bir dizi yöntem varsa da, terim alaninda uzman kimseler tarafindan iyi bilinir (bakiniz, örnegin Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); ve Sequence Analysis Primer, Gribskov., M. ve Devereux, J., ed., M. Stockton Press, New York (1991)). Burada kullanildigi haliyle "büyük ölçüde özdes", dsRNA,nin sens sarmali ve hedef genin karsilik gelen kismi arasinda çok yüksek bir homolojinin (tercih edilen sekliyle % 100 dizi kimligi) var oldugu anlamina gelir. Bununla birlikte % 90'dan fazla veya % 95'den fazla dizi kimligine sahip dsRNA burada kullanilabilir ve dolayisiyla genetik mutasyona, sus polmorfizmine veya evrimsel ayrismaya bagli olarak beklenebilecek sekans varyasyonlari tolere edilebilir. % 100 kimlik tercih edilse de dsRNA RNA ve hedef gen arasinda tek veya çoklu baz çifti rastlantisal uyusmazliklari içerebilir. Bir dsRNAryla ilgili olarak "bir hücreye sokma", alaninda uzman kimsenin anlayacagi üzere hücreye alimin veya absorbsiyonun kolaylastirilmasi anlamina gelir. dsRNAtnin alimi veya absorbsiyonu yardim almayan difüzif veya aktif hücresel proseslerle veya yardimca ajanlarla veya cihazlarla ortaya çikabilir. Bu durumda hücreye sokma, organizmaya iletimi içerecektir. Ornegin in vivo iletim için dsRNA bir doku bölgesine enjekte edilebilir veya sistemik olarak uygulanabilir. Bir hücreye in vitro olarak getirme elektroporasyon ve Iipofeksiyon gibi teknikte bilinen yöntemleri içerir. Burada Faktör Vll geniyle ilgili olarak "susturma" ve "ifadesini inhibe etme" terimleri, birinci Faktör VII geninin transkribe edildigi ve Faktör Vll geninin ifadesinin inhibe edilecegi sekilde muamele edildigi bir hücre veya hücre grubundan, büyük ölçüde birinci hücre veya hücre grubuna özdes ancak bu sekilde muamele edilmeyen (kontrol hücreleri) ikinci bir hücre veya hücre grubuna göre, izole edilebilecek Faktör VIl geninden gelen mRNA miktarinda bir azalmayla ortaya kondugu 'üzere Faktör VIl geninin ifadesinin en azindan kismen baskilanmasini ifade eder. inhibisyon derecesi genellikle asagidaki sekilde ifade edilir: (kontrol hücrelerindeki mRNA) - (tedavi edilen hücrelerdeki mRNA) x % 100 (kontrol hücrelerindeki mRNA) Alternatif olarak inhibisyon derecesi fonksiyonel olarak Faktör VII gen transkripsiyonuna baglanan bir parametrenin, örnegin bir hücre tarafindan salgilanan Faktör VII geni tarafindan kodlanan protein miktari veya belirli bir fenotipi gösteren hücre sayisi, örnegin apaptozun azalmasi cinsinden verilebilir. Prensipte Faktör Vll gen susturmasi yapisal olarak veya genomik mühendislikle ve uygun bir analizle hedefi ifade eden herhangi bir hücrede saptanabilir. Ancak verilen bir siRNAinin Faktör Vll geninin ifadesini belirli bir dereceye kadar inhibe edip etmedigini belirlemek için bir referans gerektiginde, asagidaki Orneklerde saglanan analizler bu tür bir referans olarak hizmet edebilir. Ornegin belirli bazi durumlarda Faktör VII geninin ifadesi , burada açiklanan çift sarmalli oligonükleotitlerin uygulanmasi ile en az yaklasik % 20, % 25, % 35, % 40 veya % 50 baskilanir. Bir düzenlemede Faktör VII geni burada açiklanan çift sarmalli oligonükleotitin uygulanmasiyla en az yaklasik % 60, % 70 veya % 80 baskilanir. Daha fazla tercih edilen bir düzenlemede Faktör VII geni burada açiklanan çift sarmalli oligonükleotitin uygulanmasi ile en az yaklasik % 85, % 90 veya % 95 baskilanir. veya bunlarin hafiflemesini ifade eder. Asagida geçen diger hastalik durumlarindan herhangi biriyle ilgili oldugu sürece (örnegin trombotik bir bozukluktan baska bir Faktör VII aracili durum), "tedavi etme", "tedavi" ve benzerleri bu tür durumlarla ilgili en az bir semptomdan kurtulma ya da bunun hafiflemesini veya bu tür bir hastalik durumunun ilerleyisini yavaslatma veya geri çevirmeyi ifade eder. bozuklugu veya bir hastaligin veya bozuklugun bir semptomunu hafifletebilir. Burada kullanildigi haliyle "Faktör Vll aracili durum veya hastalik" ve ilgili terimler ve ifadeler uygun olmayan, örnegin normalden büyük Faktör Vll aktivitesini ifade eder. Uygun olmayan Faktör VIl fonksiyonel aktivitesi, normalde Faktör Vll'yi ifade etmeyen hücrelerdeki Faktör Vll ifadesinin veya artan Faktör VIl bir sonucu olarak ifadesinin (örnegin viral bir hemorajik ates veya bir trombus semptomuna yol açarak) artabilir. Bir Faktör VII aracili hastalik durumu veya hastaliga tamamen veya kismen uygun olmayan Faktör Vll fonksiyonel aktivitesi aracilik edebilir. Ancak bir Faktör VII aracili hastalik durumu veya hastalik, Faktör Vll modülasyonunun altta yatan hastalik durumu veya bozukluk üzerinde bir miktar etkiyle sonuçlandigi bir bozukluk veya hastaliktir (örnegin bir Faktör VII inhibitörü en azindan bazi hastalarda hastanin esenliginde bir miktar ilerlemeye yol açar). Bir "hemorajik ates", bir viral enfeksiyonun neden oldugu bir hastalik kombinasyonunu içerir. Ates ve gastrointestinal semptomlari tipik olarak kapiler hemoraji takip eder. Bir "koagülopati" bir denegin kari pihtilasma mekanizmasindaki herhangi bir kusurdur. Burada kullanildigi haliyle bir "trombotik bozukluk", istenmeyen kan koagülasyonu ile karakterize edilen herhangi bir bozuklugu içeren, tercih edilen sekliyle istenmeyen FVIl ifadesinden kaynaklanan herhangi bir bozukluktur. Burada kullanildigi haliyle "terapötik olarak etkili miktar" ve "profilaktik olarak etkili miktar" ifadeleri, viral bir hemorajik atesin veya bu tür bir bozuklugun, örnegin hemoraj, ates, güçsüzlük. kas agrisi, bas agrisi, enflamasyon veya dolasim soku gibi bir açik semptomunun tedavisi, önlenmesi veya idaresinde terapötik bir fayda saglayan bir miktari ifade eder. Terapötik olarak etkili olan spesifik miktar siradan bir tip hekimi tarafindan kolayca belirlenebilir ve teknikte bilinen, örnegin trombotik bozuklugun türü, hastanin hikayesi ve yasi, hastaligin evresi ve uygulanan diger ajanlar gibi faktörlere bagli olarak degisebilir. Burada kullanildigi haliyle bir "farmasötik bilesim", bir dsRNAmin farmakolojik olarak etkili bir miktarini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içerir. Burada kullanildigi haliyle "farmakolojik olarak etkili miktar", "terapötik olarak etkili miktar" veya basitçe "etkili miktar", bir RNA,nin istenen farmakolojik, terapötik veya önleyici sonucunu üretmek için etkili bir RNA miktarini ifade eder. Örnegin bir hastalik veya bozuklukla ilgili ölçülebilen bir parametrede en az % 25'lik bir azalma oldugunda verilen bir klinik tedavi etkili sayilirsa, bu hastalik veya bozuklugun tedavisi için bir ilacin terapötik olarak etkili bir miktari bu parametreyi en az % 25 oraninda etkilemek için gerekli miktardir. bir tasiyiciyi ifade eder. Bu tür tasiyicilar, bunlarla sinirli olmamakla birlikte tuzlu su çözeltisi, tamponlanmis tuzlu su çözeltisi, dekstroz, su, gliserol, etanol ve bunlarin kombinasyonunu içerir. Terim spesifik olarak hücre kültürü ortamini dislar. Oral olarak uygulanan ilaçlar için farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, bunlarla sinirli olmamakla birlikte inert seyrelticiler, dagitici ajanlar, baglayici ajanlar, kaydirici ajanlar, tatlandirici ajanlar, aroma verici ajanlar, renklendirici ajanlar ve koruyuculari içerir. Uygun inert seyrelticiler sodyum ve kalsiyum karbonat, sodyum ve kalsiyum fosfat ve laktozu içerirken, misir nisastasi ve alginik asit uygun dagitici ajanlardir. Baglayici ajanlar nisasta ve jelatini içerirken, kaydirici ajan, eger mevcutsa, genel olarak magnezyum stearat, stearik asit veya talk olacaktir. Eger istenirse, tabletler gastrointestinal sistemde absorbsiyonu geciktirmek için gliseril monostearat veya gliseril distearat gibi bir malzeme ile kaplanabilir. Burada kullanildigi haliyle bir "dönüstürülmüs hücre", bir dsRNA molekülünün ifade edilebilecegi bir vektörün sokuldugu bir hücredir. Nükleik Asit Lipit Partiküllerinin Karakteristikleri Bazi uygulamalarda, burada tarif edilenler, nükleik özelliklerin bir Iipit tabakasi içinde kapsüllenmis oldugu lipit- enkapsüle edilmis nükleik asit partiküllerin üretilmesine yönelik metotlar ve kompozisyonlardir. siRNA oligonükleotidlerini içeren bu tip nükleik asit- Iipit partikülleri, asagidakiler dahil olmak üzere çesitli biyofiziksel parametreler kullanilarak karakterize edilir: (1) ilaç ila lipit orani; (2) kapsülleme verimliligi; ve (3) parçacik büyüklügü. Yüksek ilaç ila Iipit oranlari, yüksek kapsülleme verimliligi, iyi nükleaz direnci ve serum stabilitesi ve kontrol edilebilir partikül büyüklügü, genel olarak çap olarak 200 nm'den küçük olmasi arzu edilir. Buna ek olarak, nükleik asitin polimerinin dogasinin o kadar önemlidir, çünkü nükleik asitlerin modifikasyonu nükleaz direncini kazandirma pahasinda birçok durumda terapötiklerin maliyetini arttirirken birçok durumda sadece sinirli bir direnç saglar. Aksi belirtilmedigi sürece, bu kriterler asagidaki gibi bu tarifnamede hesaplanabilir: Nükleik asit ila Iipit orani, ayni hacimde Iipidin miktari ile bölünen preparasyonun 30 tanimlanmis bir hacimde nükleik asidin miktaridir. Bu, mol bazi basina bir mol ya da agirlik bazi basina bir agirlik ya da mol bazi basina bir agirlik üzerine olabilir. Nihai olarak, uygulamaya hazir formülasyonlar, nükleik asit: Iipit orani, diyalizden sonra hesaplanir, kromatografi ve / veya enzim (örn., nükleaz) kadar dis nükleik asidin çikarilmasi için kullanilir; Kapsülleme etkinligi, uygulamaya yetkin formülasyon olan nihai ilaç ila Iipit orani ile bölünen baslangiç karisiminin ilaç ila Iipit orani anlamina gelir. Bu nispi verimin bir ölçüsüdür. Mutlak verimin bir ölçüsü için, uygulamaya yetkin formülasyonda biten baslangiç karisimina ilave edilen toplam nükleik asit miktari da ayni zamanda hesaplanabilir. Formülasyon islemi sirasinda kaybolan Iipit miktari da ayni zamanda hesaplanabilir. Verimlilik, formülasyonun israfi ve masrafinin bir ölçüsüdür; ve Boyut, olusan partiküllerin boyutunu (çapini) gösterir. Boyut dagilimi, bir Nicomp Model kullanilarak belirlenebilir. Neoplazmlar ve iltihap bölgeleri gibi neo- vaskülarize (sizintili) dokulara dagitilmak üzere 200 nm altindaki partiküller tercih edilir. Lipit partiküllerini hazirlama yöntemleri Burada tarif edilen metotlar ve kompozisyonlar, eslik eden Orneklerde ve asagida tarif edilen sentez, hazirlama ve karakterizasyonu olan bazi katyonik Iipitleri kullanirlar. Buna ilaveten, burada tarif edilenler, örnegin, bir nükleik asit gibi terapötik ajan ile iliskili olanlar dahil olmak üzere Iipid partiküllerini hazirlama metotlaridir. Burada tarif edilen metotlarda, Iipitlerin bir karisimi, Iipit partiküllerinde enkapsüllenmis nükleik asidi içeren bir ara maddeyi üretmek için nükleik asidin tamponlu bir sulu çözelti ile kombine edilmekte olup içerisinde enkapsüle edilmis nükleik asitler, agirlikça yaklasik % 3 ila yaklasik % 25 arasinda, tercih edilen sekliyle agirlikça % 5 ila % 15 arasinda bir nükleik asit / Iipit oraninda mevcuttur. Ara madde karisimi, opsiyonel olarak Iipit ile enkapsüllenmis nükleik asit partikülleri elde etmek için boyutlandirilabilir, burada Iipit parçalari, tercih edilen sekliyle 30 ila 150 nm bir çapa, daha fazla tercih edilen sekliyle yaklasik 40 ila 90 nm bir çapa sahip tek lamelli vesiküllerdir. pH daha sonra Iipid- nükleik asit partikülleri üzerindeki yüzey yüklerinin en az bir kismini nötralize etmek için yükseltilir böylece en az kismen yüzeyden nötrlestirilmis lipit kapsüllenmis nükleik asit kompozisyonu saglanir. Yukarida tarif edildigi gibi, bu katyonik lipidlerin birçogu, amino grubunun pKa'sinin altinda bir pH'ta yüklü olan ve pKa'nin üzerinde bir pH degerinde büyük ölçüde nötr olan amino lipidlerdir. Bu katyonik Iipidlertitrasyonlu katyonik lipidler olarak adlandirilir ve iki adimli bir islem kullanilarak bunun içinde tarif edilen formülasyonlarda kullanilabilir. Birincisi, Iipit vesikülleri, nükleik asitlerin mevcudiyetinde titrasyonlu katyonik lipidler ve diger vesikül bilesenleri ile düsük pH'da olusturulabilir. Bu sekilde, vesiküller nükleik asitleri kapsüllemekte ve yakalayacaktir. Ikincisi, yeni olusan vesiküllerin yüzey yükü, yani fizyolojik pH ya da daha yüksek mevcut olan pKa titrasyonlu katyonik Iipitlerin üzerinde bir seviye ila ortamin pH artmasiyla nötralize edilebilir. Bu islemin özellikle avantajli bakis açilari arasinda, hem herhangi yüzey absorbe edilmis nükleik asit hem de nötr bir yüzeye sahip olan nükleik asit tasiyici bir aracin çikarilmasini içerir. Nötr bir yüzeye sahip olan Iipozomlar ya da lipid partiküller, katyonik lipozom preparasyonlari ile iliskili olan belirli toksisitelerin önlenmesi için ve dolasimdan hizli bir sekilde temizlenmesinin sakinilmasi beklenir. Bu tür titrasyonlu katyonik Iipitlerin nükleik asit- Iipit partiküllerinin formülasyonunda bu kullanimlarina temin edilmektedir. Ayrica, bu sekilde olusturulan vesiküllerin, nükleik asitlerin yüksek içerigine sahip tek biçimli vesikül boyutuna sahip formülasyonlar sagladigi da belirtilmektedir. ilaveten, vesiküller yaklasik 30 ila yaklasik 150 nm arasinda, daha fazla tercih edilen sekliyle yaklasik 30 ila yaklasik 90 nm'lik arasinda bir boyut araligina sahiptir. Herhangi bir özel teoriye bagli kalmaksizin, nükleik asit enkapsüllemenin çok yüksek verimliliginin düsük pH'ta elektrostatik etkilesimin bir sonucu olduguna inanilmaktadir. Asidik pH'da (pH 4.0), vesikül yüzeyi yüklenir ve elektrostatik etkilesimlerle nükleik asitlerin bir kismini baglar. Harici asidik tampon daha nötr bir tampon için degistirildigi zaman (örnegin, pH 7.5), lipid partikülü ya da Iipozomunun yüzeyi nötralize olup herhangi bir harici nükleik asitin çikarilmasina izin verir. Formülasyon süreci hakkinda daha detayli bilgi çesitli yayinlarda verilmektedir (örnegin, U.S. Patent 6,287,591 ve U.S. Patent 6,858,225 sayili belgeler). Yukaridakilerin isiginda, burada tarif edilenler lipit / nükleik asit formülasyonlarini hazirlama metotlardir. Burada tarif edilen metotlarda, Iipitlerin bir karisimi, lipit partiküllerde enkapsüllenmis nükleik asit içeren bir ara madde karisimini üretmek için nükleik asidin tamponlanmis bir sulu çözelti ile kombine edilmekte olup, örnegin içerisinde enkapsüllenmis nükleik asitler, agirlikça yaklasik % 10 ila agirlikça yaklasik lipit ile enkapsüllenmis nükleik asit partikülleri elde etmek için boyutlandirilabilmekte olup içerisinde lipit kisimlari, tercih edilen sekliyle 30 ila 150 nm arasinda bir çapa, daha tercih edilen sekliyle yaklasik 40 ila 90 mm'lik bir papa sahip tek lamelli vesiküllerdir. pH daha sonra, lipid- nükleik asit partikülleri üzerindeki yüzey yüklerinin bir kismini nötralize etmek için yükseltilir, böylece en az kismen yüzeyde nötrlestirilmis lipid kapsüllenmis nükleik asit kompozisyonu saglanir. Bazi düzenlemelerde, lipit karisimi, en az iki lipit bileseni içerir: burada tarif edilen, lipidin pKa'nin altinda pH degerinde katyonik olan ve pKa'nin üzerinde pH'ta nötr olan bir pKa'ya sahip Iipidler arasindan seçilen bir birinci lipit bileseni ve Iipid- nükleik asit partikül olusumu sirasinda partikül agregasyonunu önleyen Iipidler arasindan seçilen bir ikinci lipit bileseni. Belirli düzenlemelerde, amino lipit, burada tarif edilen bir yeni katyonik Iipittir. Burada tarif edilen nükleik asit- lipit partiküllerin hazirlanmasinda, lipitlerden olusan karisim tipik olarak bir organik çözücü içindeki Iipitlerin bir çözeltisidir. Lipidlerin bu karisimi daha sonra ince bir film olusturmak üzere kurutulabilir ya da lipozomlar olusturmak için sulu bir tampon ile hidratlanmadan önce bir toz olusturmak üzere liyofilize edilir. Alternatif olarak, tercih edilen bir metotta, lipit karisimi, etanol gibi suda karisabilir bir alkol içinde çözülebilir ve bir sulu tampona eklenen bu etanolik çözelti, spontan lipozom olusumu ile sonuçlanir. Birçok uygulamada, alkol, ticari olarak temin edilebilen formda kullanilir, örnegin, etanol mutlak etanol (% 100) olarak ya da % 95 etanol olarak da kullanilabilir, geri kalani ise sudur. Bu metot, U.S. Patent 5,976,567 sayili belgede daha ayrintili olarak anlatilmaktadir. Bir örnek teskil eden uygulamada, Iipitlerden olusan karisim, bir alkol çözücüsü içindeki katyonik lipidler, nötr Iipidler (katyonik bir Iipid disinda), bir sterol (örnegin, kolesterol) ve PEG ile modifiye edilmis bir Iipidin (bir PEG- DMG ya da PEG- DMA) karisimidir. Tercih edilen uygulamalarda, lipit karisimi, esasen bir katyonik lipit, nötr lipit, kolesterol ve alkol içinde daha çok tercih edilen sekliyle etanol içinde PEG ile modifiye edilmis bir lipittir. Ayrica tercih edilen uygulamalarda, birinci çözelti, yukaridaki lipitlerden olusan karisimda belirtilen molar oranlarinda yaklasik % 20- % 70 katyonik lipit: % 5- % 45 nötr lipid: % 20- % 55 kolesterol: % 0.5- % 15 PEG ile modifiye edilmis Iipitten olusur. Ayrica yine de tercih edilen uygulamalarda, birinci çözelti, esasen Tablo 1, DSPC, Kol ve PEG- DMG ya da PEG- DMA arasindan seçilen, daha fazla tercih edilen sekliyle PEG- DMG ya da PEG- DMA bir molar oraninda bir Iipitten olusur. Belirli uygulamalarda, molar lipit orani yaklasik olarak 50 / 10 / 38.5/ 1.5 (% mol katyonik lipit katyonik Iipit/ DPPC/ Kol/ PEG- cDMA), 40 / 15 / 40 / 5 (% mol katyonik lipit / DSPC DMG), 40/ 10 / 40 / 10 (% mol katyonik lipit/ DSPC / Kol/ PEG- DMG ya da PEG- cDMA), 35/ 15/40/ 10 (% mol katyonik lipit / DSPC / Kol / PEG- DMG ya da PEG- cDMA) ya da 52 / 13/ 30 / 5 (% mol katyonik lipit/ DSPC / Kol / PEG- DMG ya da PEG- cDMA)'dir. Tercih edilen uygulamalara ait bir baska grupta, bu kompozisyonlar içindeki nötr lipit, POPC, DPPC, DOPE ya da SM ile yer degistirir. Tarifnameye göre, lipid karisimi, nükleik asitleri içerebilen bir tamponlu sulu çözelti ile kombine edilir. Tamponlu sulu solüsyon, tipik olarak tamponun, lipit karisimindaki protonlanabilir tamponlara ait örnekler, sitrat, fosfat, asetat, ve MES içerir. Ozellikle tercih edilen tampon sitrat tamponudur. Tercih edilen tamponlar, kapsüllenmis olan nükleik asidin kimyasina bagli olarak 1- 1000 mM anyon araliginda olabilecektir ve tampon konsantrasyonun optimizasyonu, yüksek yükleme seviyelerinin gerçeklestirilmesi için belgeler). Alternatif olarak, klorit, sülfat ya da benzeri ile pH 5- @ya asitlestirilen saf su kullanilabilir. Bu durumda, % 5 glukoz ilave edilmesi ya da partiküller etanolü uzaklastirmak için diyalize edildiginde, pH'i arttirdigi ya da normal salin gibi farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile karistirildigi partikül membran boyunca potansiyel ozmotigi dengeleyecek olan bir baska iyonik olmayan çözücünün ilave edilmesi uygun olabilir. Tampon içindeki nükleik asidin miktari degisebilir, ancak tipik olarak yaklasik 0.01 mg / mL ila yaklasik 200 mg / mL, daha fazla tercih edilen sekliyle yaklasik 0.5 mg / mL ila yaklasik 50 mg / mL arasinda olacaktir. Lipitlerden olusan karisim ve terapötik nükleik asitlerin tamponlu sulu çözeltisi ara madde karisim saglamak için kombine edilmistir. Ara madde karisimi tipik olarak, kapsüllenmis nükleik asitlere sahip olan bir lipit taneciklerinin bir karisimidir. Buna ilaveten, ara madde karisimi ayni zamanda nükleik asitlerin bazi kismini da içerebilmekte olup negatif yüklü nükleik asitlerin ve lipit partikül yüzeyinde pozitif yüklü lipitlerin iyonik çekimine bagli olarak lipit partiküllerin yüzeyine (Iipozomlar ya da lipid vesiküller) baglanirlar (Protonlanabilir ilk lipit bilesenini olusturan amino Iipidler veya diger Iipitler, lipit üzerinde protonlanabilir grubun pKa'sindan daha düsük bir pH'a sahip olan bir tampon içinde pozitif olarak yüklenir). Tercih edilen uygulamalarin bir grubunda, lipidlerin bir karisimi lipitlerin bir alkol çözeltisidir ve çözeltilerin her birinin hacimleri, kombinasyon halinde, elde edilen alkol içeriginin hacimce yaklasik % 20 ila hacimce yaklasik % 45 arasinda olacagi sekilde ayarlanir. Karisimlari kombine edilmesine ait metot, çogunlukla üretilen formülasyonun ölçegine bagli olarak çesitli islemlerden herhangi birini içerebilir. Ornegin, toplam hacim yaklasik 10- 20 mL ya da daha az oldugunda, çözeltiler bir test tüpü içinde kombine edilir ve bir vorteks mikseri kullanilarak birlikte karistirilir. Büyük ölçekli islemler uygun üretim ölçekli cam esyalarda gerçeklestirilebilir. Opsiyonel olarak, lipit karisimi ve terapötik ajanlarin (nükleik asitler) tamponlanmis sulu çözeltisinin kombine edilmesiyle üretilen lipit ile kapsüllenmis terapötik ajan (örnegin, nükleik asit) kompleksleri, istenilen bir boyut araligini ve lipit partikül boyutlarin nispeten dar dagilimini gerçeklestirmek için boyutlanabilir. Tercih edilen sekliyle, bunun içinde temin edilen kompozisyonlar yaklasik 70 ila yaklasik 200 nm, daha fazla tercih edilen sekliyle yaklasik 90 ila yaklasik 130 nm arasinda bir ortalama papa sahip olacaklardir. Lipozomlari istenilen boyuta getirmek için çesitli teknikler mevcuttur. Bir boyutlama metodu, U.S. Pat. No. 4,737,323 sayili belgede tarif edilmistir. Ya banyo ya da prob sonikasyon ile bir lipozom süspansiyonun ultrasonik banyoda tutulmasi, boyutu yaklasik 0,05 mikrondan küçük olan küçük tek katmanli vesiküllere (SUVlar) indirgenmis bir progresif boyutu üretir. Homojenizasyon, büyük lipozomlari daha küçük olanlara parçalamak için enerji kesmeye dayanan baska bir metottur. Tipik bir homojenizasyon prosedüründe, çok katmanli vesiküller, tipik olarak yaklasik 0.1 ve 0.5 mikron arasinda seçilen lipozom büyüklükleri gözlenene kadar standart bir emülsiyon homojenlestirici içinden yeniden sirküle edilir. Her iki metotta, partikül boyutu dagilimi, konvansiyonel lazer isini partikül boyutu tayini ile izlenebilir. Buradaki belirli metotlar için, ekstrüzyon, tek biçimli bir vesikül boyutu elde etmek için kullanilir. Bir küçük gözenekli polikarbonat membran ya da bir asimetrik seramik membran boyunca lipozom kompozisyonlarin ekstrüzyonu, nispeten iyi tanimlanmis bir boyut dagilimi ile sonuçlanir. Tipik olarak, süspansiyon, arzu edilen lipozom kompleksinin boyut dagilimina ulasilana kadar bir veya daha fazla kez membran dogrultusunda çevrilir. Lipozomlar, lipozom boyutunda kademeli bir azalma saglamak için basarili bir sekilde daha küçük gözenekli membran boyunca ekstrüde edilebilir. Bazi durumlarda, olusturulan lipit- nükleik asit kompozisyonlari herhangi bir boyutlandirma olmaksizin kullanilabilir. Belirli uygulamalarda, burada tarif edilen metotlar ayrica, Iipit- nükleik asit kompozisyonlarin lipit kisimlari üzerindeki yüzey yüklerinin en azindan bazilarini nötralize etmenin bir adimini içerir. Yüzey yüklerini en azindan kismen nötralize ederek, kapsüllenmemis nükleik asit lipit partikülü yüzeyinden serbest birakilir ve konvansiyonel teknikler kullanilarak kompozisyondan çikarilabilir. Tercih edilen sekliyle, kapsüllenmemis ve yüzeye adsorbe edilmis nükleik asitler, tampon çözeltilerinin degisimi yoluyla elde edilen kompozisyonlardan çikarilir. Örnegin, bir HEPES- tamponlu salin (HBS pH yaklasik 7.5) çözeltisi ile bir sitrat tamponu (kompozisyonlari olusturmak için kullanilan pH yaklasik 4.0) yer degistirilmesi, lipozom yüzeyinin nötralizasyonu ile sonuçlanir ve nükleik asit yüzeyden salinir. Salinan nükleik asit daha sonra standart metotlar kullanilarak kromatografiyle çikarilabilir ve daha sonra kullanilan lipidin pKa'sinin üzerinde bir pH'a sahip bir tampona dönüstürülebilir. Opsiyonel olarak, lipit vesikülleri (yani, lipit partikülleri), nükleik asit ilavesinden önce yukarida tarif edilen metotlarin herhangi biri kullanilarak boyutlandirilmis bir sulu tamponda hidrasyon ile olusturulabilir. Yukarida tarif edildigi üzere, sulu tampon, amino lipitin pKa'sinin altinda bir tha olmalidir. Daha sonra bu boyutlandirilmis, önceden olusturulmus vesiküllere nükleik asitlerin bir çözeltisi ilave edilir. Nükleik asitlerin bu tür etanol gibi bir alkol içermelidir. Etanol durumunda, yaklasik % 20 (ag. / 10 ag.) ila yaklasik % 45 (ag. /ag.) arasinda konsantrasyonunda mevcut olmalidir. Buna ilaveten, sulu tampon- etanol karisiminda önceden olusturulmus vesiküller ve nükleik asit karisiminin, Iipid vesiküllerin kompozisyonuna ve nükleik asitin dogasina bagli olarak yaklasik 25 "C ila yaklasik 50 "C arasinda bir sicakliga isitilmasi gerekli olabilir. Teknikte ortalama tecrübeye sahip kisilerin açikça görecegi üzere, kapsülleme isleminin lipit vesiküllerin arzu edilen bir seviyede nükleik asit elde etmek için optimizasyonu, etanol konsantrasyonu ve sicaklik gibi degiskenlerin manipüle edilmesini gerektirecektir. Nükleik asit kapsülleme için uygun kosullarin örnekleri, Orneklerde verilmistir. Nükleik asitler önceden olusturulmus vesiküller içinde kapsüllendikten sonra, dis pH, yüzey yükünü kismen nötralize edecek sekilde arttirilabilir. Enkapsüle edilmemis ve yüzeyi absorbe edilen nükleik asitler yukarida açiklandigi gibi çikarilabilir. Kullanim Yöntemi Burada tarif edilen lipit tanecikleri, in vitro ya da in vivo olarak bir terapötik ajani bir hücreye vermek için kullanilabilir. Belirli uygulamalarda, terapötik ajan, burada tarif edilen bir nükleik asit- lipit partikülü kullanilarak bir hücreye verilen bir nükleik asittir. Burada tarif edilen Iipid partiküllerinin ve ilgili farmasötik kompozisyonlarina ait çesitli metotlarin asagidaki tarifleri, nükleik asit- lipit partikülleri ile ilgili açiklama ile örneklenirken, bu metotlarin ve kompozisyonlarin, herhangi bir terapötik ajanin bu tür bir tedaviden fayda saglayacak herhangi bir hastalik ya da bozuklugunun tedavisi için verilmesi için kolayca adapte edilebilir. Bazi uygulamalarda burada tarif edilenler, bir nükleik asitin bir hücreye sokulmasi için metotlardir. Hücre içine sokulmak üzere tercih edilen nükleik asitler siRNA, immün stimüle edici oligonükleotidler, plazmidler, antisens ve ribozimlerdir. Bu metotlar, burada tarif edilen partiküllerin ya da kompozisyonlarin, hücrelerarasi dagitimin gerçeklesmesi için yeterli bir süre boyunca hücre ile temas ettirilmesiyle gerçeklestirilebilir. Burada tarif edilen kompozisyonlar hemen hemen her hücre türüne örnegin, HeLa, dizileri içeren ancak bunlarla sinirli olmayan tümör hücresi dizilerine adsorbe edilebilir. Bir kez adsorbe edildikten sonra, nükleik asit- Iipit partikülleri, hücrenin bir kismi, hücre membranlari ile Iipit degisimi, ya da hücre ile birlikte olabilir. Kompleksin nükleik asit kisminin transfer edilmesi ya da dahil edilmesi bu yollardan herhangi biri ile gerçeklesebilir. Endositoz ile hücreye alinan partiküller söz konusu oldugunda, partiküllerin daha sonra endozomal membran ile etkilesime girdigine ve bunun sonucunda muhtemelen iki- katmanli olmayan fazlarin olusumuyla sonuçlanan endozomal membranin dengesizlesmesine neden olduguna, kapsüllenmis nükleik asitin hücre sitoplazmasina girmesi ile sonuçlandigina inanilmaktadir. Benzer sekilde, partiküllerin hücre plazma membrani ile dogrudan füzyonu durumunda, füzyon gerçeklestigi zaman, lipozom membran, hücre zarina birlestirilir ve Iipozomun içerigi hücre içi siviyla birlestirilir. Hücre ile lipit- nükleik asit kompozisyonlar arasindaki temas, in vitro olarak gerçeklestirildiginde biyolojik olarak uyumlu bir ortamda gerçeklesecektir. Kompozisyonlarin konsantrasyonu, belirli uygulamaya bagli olarak büyük Ölçüde degisebilir ancak genel olarak yaklasik 1 pmol ve yaklasik 10 mmol arasindadir. Bazi uygulamalarda, hücrenin Iipit- nükleik asit kompozisyonlari ile isleme tabii tutulmasi genellikle fizyolojik sicakliklarda (yaklasik 37 °C), yaklasik 1 ila 24 saat arasinda, tercih edilen sekliyle yaklasik 2 ila 8 saat arasinda bir zaman periyodu boyunca gerçeklestirilir. In vitro uygulamalar için, nükleik asitlerin verilmesi, bitki ya da hayvan orijinli, omurgali ya da omurgasiz olsun olmasin kültür içinde büyüyen herhangi bir hücreye ya da herhangi bir dokuya ya da türe olabilir. Tercih edilen uygulamalarda, hücreler, hayvan hücreleri, daha çok tercih edilen sekliyle memeli hücreleri ve en çok tercih edilen sekliyle insan hücreleri olacaktir. Uygulamalarin bir grubunda, bir lipit- nükleik asit partikül süspansiyonu, yaklasik 103 ila yaklasik 105 hücre / mL arasinda, daha çok tercih edilen sekliyle yaklasik 2 X 104 hücre / mL hücre yogunluguna sahip olan % 60- % 80 konflüent kaplanmis hücrelere ilave edilir. Hücrelere ilave edilen süspansiyonun konsantrasyonu, tercih edilen sekliyle yaklasik 0.01 ila 20 pg / mL arasinda, daha fazla tercih edilen sekliyle yaklasik 1 (19 / mL olmaktadir. Tipik uygulamalar, siRNA'nin spesifik hücresel hedefleri susturmak için ya da nakavt olmasi için hücre içi dagitimini saglamak üzere iyi bilinen prosedürlerin kullanilmasini içerir. Alternatif olarak, uygulamalar, terap'ötik olarak yararli polipeptidleri kodlayan DNA ya da mRNA sekanslarin verilmesini içerir. Bu sekilde, terapi, eksik ya da bos gen ürünleri tedarik ederek (yani, Duchenne'nin distrofisi için, bkz. Kunkel ve dig., Brit. Burada tarif edilen kompozisyonlara yönelik diger kullanimlar, antisens oligonükleotidlerin hücre içine sokulmasini içerir (bakiniz, Bennett, ve dig., Mol. Pharm. Alternatif olarak, burada tarif edilen kompozisyonlar, teknikte tecrübeli kisilerce bilinen metotlar kullanilarak, nükleik asitlerin in vivo olarak hücreye aktarilmasi için de kullanilabilir. DNA ya da mRNA sekanslarinin verilmesi ile ilgili olarak, Zhu, ve dig., sitomegalovirüs (CMV)- kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) ifadesi plazmidinin intravenöz yoldan uygulanmasini tarif eder. Hyde, ve dig., Nature 362: 250- 256 (1993), Iipozomlar kullanilarak farelerin akcigerinde hava yolu ve alveollerin epiteline sistik fibrozis transmembran iletkenlik düzenleyici (CFTR) geninin verilmesini tarif eder. transfeksiyonunu, hücre içi enzimi kloramfenikol asetiltransferazi (CAT) kodlayan islevsel bir prokaryotik gen ile tarif eder. Bu nedenle, bunun içinde tarif edilen kompozisyonlar, bulasici hastaliklarin tedavisinde kullanilabilir. Bundan dolayi, bir baska yaklasimda, burada tarif edilen formülasyonlar, FVII, E95, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta geni, Erb- B geni, Src geni, CRK geni, GRB2 geni, RAS geni, MEKK geni, JNK geni, RAF geni, Erk1 / 2 geni, PCNA (p21) geni, MYB geni, JUN geni, FOS geni, BCL- 2 geni, Siklin D geni, EGF geni, EGFR geni, Siklin A geni, Siklin E geni, WNT- l geni, beta- katenin geni, c- MET geni, PKC geni, NFKB geni, STAT3 geni, survivin geni, Her2 / Neu geni, topoizomeraz I geni, topoizomeraz Il alfa geni, p73 geni, p21 (WAF1l / CIP1) geni, p27 (KIP1) geni, PPM1D geni, RAS geni, kaveolin l geni, MIB I geni, MTAI geni, M68 geni, tümör baskilayici genler, p53 tümör baskilayici gen, p53 ailesi üyesi DN- p63, pRb tümör baskilayici geni, APCl tümör baskilayici geni, BRCA1 tümör baskilayici geni, PTEN tümör baskilayici gen, mLL füzyon geni, BCR / ABL füzyon geni, TEL / AML1 füzyon geni, EWS / FLI1 füzyon geni, TLS / FUS1 füzyon geni. PAX3 / FKHR füzyon geni. AML1 /ETO füzyon geni, alfa v- integrin geni, Flt- 1 reseptör geni, tubulin geni, Insan Papilloma Virüsü geni, Insan Papilloma Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Insan Bagisiklik Yetmezligi Virüsü geni, Insan Bagisiklik Yetmezligi Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit B Virüsü geni, Hepatit B Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit C Virüsü geni, Hepatit C Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit D Virüsü geni, Hepatit D Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit E Virüsü geni, Hepatit E Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit F Virüsü geni, Hepatit F Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit G Virüsü geni, Hepatit G Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Hepatit H Virüsü geni, Hepatit H Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Respiratuar Sinsitiyal Virüs geni, Respiratuar Sinsitiyal Virüs replikasyonu için gerekli olan bir gen, Herpes Simpleks Virüs geni, Herpes Simpleks Virüs replikasyonu için gerekli bir gen, herpes Sitomegalovirüs geni, herpes Sitomegalovirüs replikasyonu için gerekli bir gen, herpes Epstein Barr Virüsü gen, herpes Epstein Barr virüs replikasyonu için gerekli olan bir gen, Kaposi'nin Sarcoma ile iliskili Herpes Virus geni, Kaposi'nin Sarcoma ile iliskili Herpes Virüs replikasyonu için gerekli olan bir gen, JC Virüs geni, JC Virüs replikasyonu için gerekli olan insan geni, miksovirüs gen replikasyonu için gerekli olan bir gen olan miksovirüs geni, rinovirüs geni, rinovirüs replikasyonu için gerekli bir gen, koronavirüs geni, koronavirüs replikasyonu için gerekli bir gen, Bati Nil Virüsü geni, Bati Nil Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, St. Louis Ensefaliti geni, St. Louis Ensefaliti replikasyonu için gerekli olan bir gen, Keneyle geçen ensefalit virüs geni, Keneyle geçen ensefalit virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Murray Valley ensefalit virüsü geni, Murray Valley ensefalit virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, dang virüsü geni, dang virüsü geni replikasyonu için gerekli olan bir gen, Simian Virus 40 geni, Simian Virus 40 replikasyonu için gerekli bir gen, Insan T Hücresi Lenfotropik Virüs geni, Insan T Hücresi Lenfotropik Virüs replikasyonu için gerekli bir gen, Moloney- Murin Lösemi Virüsü geni, Moloney- Murin Lösemi Virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, ensefalomiyokardit virüs geni, ensefalomiyokardit virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, kizamik virüs geni, kizamik virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, Vericella zoster virüs geni, Vericella zoster virüs replikasyonu için gerekli bir gen, adenovirüs replikasyonu için gerekli bir gen, sari humma virüsü geni, sari humma virüsü replikasyonu için gerekli bir gen, poliovir'us geni, poliovirüs replikasyonu için gerekli bir gen, poksvirüs geni, poksvir'üs replikasyonu için gerekli bir gen, Plasmodium geni, Plasmodium için gerekli bir gen, Mikobakteriyum ülserabkar geni, Mikobakteriyum Mikobakteriyum tüberküloz replikasyonu için gerekli bir gen, Mikobakteriyum cüzzam geni, Mikobakteriyum cüzzam replikasyonu için gerekli bir gen, Staphylococcus aureus geni, Staphylococcus aureus replikasyonu için gerekli bir gen, Pnömokok geni, Pnömokok replikasyonu için gerekli bir gen, streptokok piyojenler geni, streptokok piyojenlerin replikasyonu için gerekli bir gen, Akciger iltihaplanmasi geni, Akciger iltihaplanmasinin replikasyonu için gerekli bir gen, Mikoplazma pnömani geni, Mikoplazma pnömani replikasyonu için gerekli bir gen, bir integrin geni, bir selektin geni, komplement sistem geni, kemokin geni, kemokin reseptör geni, GCSF geni, Grol geni, Gr02 geni, Gr03 geni, PF4 geni, MIG geni, Pro- Trombosit Bazik Protein geni, MlP- ll geni, MIP- lJ geni, RANTES geni, MCP- I geni, MCP- 2 geni, MCP- 3 geni, CMBKRI geni, CMB KR2 geni, CMB KR3 geni, CMBKRSV, AlF- l geni, 1- 309 geni, bir iyon kanalinin bir bilesenine bir gen, bir nörotransmiter reseptör'une bir gen, bir nörotransmitter Iigandi için bir gen, amiloid- aile geni, presenilin geni, HD geni, DRPLA geni, SCA1 geni, SCA2 geni, MJD1 geni, CACNL1A4 geni, SCA7 geni, SCA8 geni, LOH hücrelerinde bulunan allel geni veya bir polimorfik genin bir allel geni içeren ancak bunlarla sinirli olmayan bu tip bir hedef geni baskilamak ya da degistirmek için kullanilabilir. olarak, yani, intraartik'uler olarak, intravenöz olarak, intraperitonal olarak, subkutan olarak ya da kas içinden tatbik edilir. Belirli uygulamalarda, farmasötik kompozisyonlari, bir bolus enjeksiyonu ile intravenöz olarak ya da intra peritoneal olarak tatbik edilir. Bir örnek için bakiniz, Stadler, ve dig., U.S. Patent No. 5,286,634 sayili belge. Hücresel arasi nükleik asit verilmesi de ayni zamanda Straubringer, ve dig., METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, New York. 101: 512- 527 (1993) sayili belgelerde tartisilmaktadir. Halen lipit- bazli terapötiklerin uygulanmasina ait diger metotlar, örnegin, Rahman ve dig., U.S. Patent No. 3,993,754; Sears, U.S. Fountain ve dig., U.S. Patent No. 4,588,578 sayili belgelerde tarif edilmistir. Diger metotlarda, farmasötik preparasyonlar, preparasyonun dokuya dogrudan uygulanmasiyla hedef doku ile temas ettirilebilir. Uygulama, topikal, "açik" ya da orofarenks, dis isitsel kanal, ve benzeri gibi çevreye maruz kalan bir dokuya dogrudan uygulanmasi anlamina gelmektedir. "Açik" prosedürler, bir hastanin cildini incitmeyi ve farmasötik preparasyonlarin uygulandigi altta yatan dokunun dogrudan görsellestirilmesini içeren prosedürlerdir. Bu genellikle, akcigerlere erismek için torakotomi, abdominal viseraya erismek için abdominal Iaparotomi, ya da hedef dokuya diger dogrudan cerrahi yaklasim gibi bir cerrahi prosedürle gerçeklestirilir. küçük yaralar yoluyla aletlerin sokulmasi yoluyla erisildigi invazif prosedürlerdir, Örnegin, preparasyonlar, igne Iavaji ile peritona tatbik edilebilir. Benzer sekilde, farmas'otik preparasyonlar, lomber delinmesi sirasinda infüzyon yoluyla meninges ya da omurilige uygulanarak spinal kordun spinal anestezi ya da metrazamid magingi için yaygin olarak uygulanan hastanin uygun pozisyonu ile uygulanabilir. Alternatif olarak, preparasyonlar endoskopik cihazlarla uygulanabilir. Lipit- nükleik asit kompozisyonlari da ayni zamanda akcigerlere inhale edilen bir belge) ya da hastalik bölgesine dogrudan enjeksiyon yoluyla (Culver, Human Gen Therapy, Mary Ann Liebert, Ine., Publishers, New York, syf.70- 71 (1994) sayili belge) tatbik edilebilir. Burada tarif edilen metotlar çesitli konakçilarda uygulanabilir. Tercih edilen konakçilar, insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler, kediler, sigirlar, atlar, koyunlar ve benzerleri gibi memeli türleri içerir. Burada tarif edilen Iipit- terapötik ajan partikülleri için dozajlar, terapötik ajanin Iipide oranina ve hastanin yasina, kilosuna ve durumuna dayanarak doktorun görüsüne bagli olacaktir. Bir uygulamada, burada tarif edilen, bir hedef polinükleotid ya da polipeptidin ekspresyonunun modüle edilmesine ait bir metottur. Bu metotlar genel olarak, bir polinükleotid ya da polipeptidin ifadesinin modüle edebilen bir nükleik asit ile iliskili olan burada tarif edilen bir Iipit partikülü ile bir hücrenin temas ettirilmesini içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "modüle etme" terimi, bir hedef polinükleotid ya da polipeptidin ekspresyonunu degistirmeyi ifade eder. Farkli uygulamalarda, modüle etme, artan ya da zenginlestirici anlamina gelebilir, ya da azalma ya da küçülme anlamina gelebilir. Bir hedef polinükleotid ya da polipeptidin ekspresyon seviyesinin ölçülmesine yönelik metotlar, teknikte bilinmekte ve temin edilmektedir ve örnegin ters transkripsiyon- polimeraz zincir reaksiyonu (RT- PCR) ve immünohistokimyasal teknikleri kullanan metotlari içerir. Belirli uygulamalarda, bir hedef polinükleotid ya da polipeptidin ekspresyon seviyesi, uygun bir kontrol degerine kiyasla en az % 10, % 20, % 30, % 40, % 50, ya da % 50'den daha fazla arttirilir ya da azaltilir. Ornegin, arzulanan bir polipeptidin ekspresyonun artmasi durumunda, nükleik asit istenen polipeptidi kodlayan bir polinükleotid içeren bir ekspresyon vektörü olabilir. Diger taraftan, polinükleotid ya da polipeptidin ekspresyonunun azaltilmasi istendiginde, daha sonra nükleik asit, hedef polipeptidi kodlayan bir polinükleotide spesifik olarak hibritlenen bir polinükleotid sekansini içeren bir antisens oligonükleotid, siRNA, ya da mikroRNA olabilir, böylece hedef polinükleotid ya da polipeptidin ekspresyonunu bozar. Alternatif olarak, nükleik asit, böyle bir antisens oligonükleotid, siRNA ya da mikroRNA'yi eksprese eden bir plazmid olabilir. Özel bir düzenlemede, burada tarif edilen, bir polipeptit ekspresyonunun bir hücre ile modüle edilmesine dair bir yöntem olup, örnegin, yaklasik % 20- 65 formül Irin katyonik modifiye edilmis PEG molar oraninda formül I*in bir katyonik Iipit, bir nötr Iipit, bir sterol, PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis Iipitten olusan ya da esas olarak bunlardan olusan bir lipit partikülünün bir hücreye saglanmasini içerir, burada Iipit partikülü polipeptidin ekspresyonunu modüle edebilen bir nükleik asit ile iliskilidir. Ozel DPPC / Kol/ PEG- DMG ya da PEG- cDMArnin mol % isi). Bazi düzenlemelerde, Iipit partikülü ayrica burada tarif edilen gibi bir hedefleme lipidi (örnegin, Iipit partikülü, temel olarak formül Irin bir katyonik Iipidi, bir nötr Iipit, bir sterol, PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis Iipitten ve bir hedefleme parçasindan olusur) içerir. Düzenlemelerin bir baska grubunda, bu kompozisyonlardaki nötr lipit, DPPC, POPC, DOPE ya da SM ile yer degistirir. Düzenlemelerin bir baska grubunda ise PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis Iipit, PEG- DSG, PEG- DMG ya da PEG- DPG ile yer degistirir. Belirli uygulamalarda, terapötik ajan, bir siRNA, bir mikroRNA, bir antisens oligonükleotid ve bir siRNA, bir mikroRNA ya da bir antisens oligonükleotidi eksprese edebilen bir plazmid arasindan seçilir ve içerisinde siRNA, mikroRNA, ya da antisens RNA, polipeptidin ifadesini azaltacak sekilde polipeptidi kodlayan bir polinükleotide spesifik olarak baglanan bir polinükleotid içerir. Diger uygulamalarda, nükleik asit, burada polipeptid ya da bir fonksiyonel varyant ya da bunlarin fragmentini kodlayan bir plasmiddir, öyle ki polipeptid ya da bir fonksiyonel varyant ya da bunlarin fragmentinin ekspresyonu artmaktadir. Ilgili düzenlemelerde, burada tarif edilenler, hücrelerin kültür içinde transfeksiyonu için faydali reaktiflerdir. Ornegin, burada tarif edilen lipit formülasyonlari kültürlenmis hücrelere (Örn, yapisik hücreler, süspansiyon hücreleri, vb.)nükleik asitlerin verilmesi için kullanilabilir. Ilgili uygulamalarda, burada tarif edilen, bir hastadaki bir polipeptidin asiri ekspresyonu ile karakterize edilen bir hastalik ya da bozuklugunun tedavi edilmesine yönelik bir metot olup, burada tarif edilen bir farmasötik kompozisyonun hastaya sunulmasini içerir, burada terapötik ajan, bir siRNA, bir mikroRNA, bir antisens oligonükleotid arasindan ve bir siRNA, bir mikroRNA ya da bir antisens oligonükleotid eksprese edebilen bir plazmid arasindan seçilir ve burada siRNA, mikroRNA, ya da antisens RNA, polipeptidi kodlayan bir polinükleotide ya da bunlarin bir tamamlayicisina özellikle baglanan bir polinükleotidi içerir. Bir düzenlemede, farmas'otik kompozisyon örnegin, yaklasik % 20- 65 formül l'in tarafindan modifiye edilmis PEG- DMG, PEG- C- DOMG ya da PEG- cDMA molar oraninda formül Iiin bir katyonik lipidi, DSPC, Kol ve PEG- DMG, PEG- C- DOMG ya da PEG- cDMA'dan olusan ya da esas olarak bunlardan olusan bir lipit partikülü içerir, burada lipit partikülü terapotik nükleik asit ile iliskilidir. Ozel düzenlemelerde, molar lipit 40/ 15 / 40 / 5'dur (formül l'in katyonik lipidi / DSPC / Kol/ PEG- DMG ya da PEG- cDMA'nin mol % ,si). Bazi düzenlemelerde, lipit partikülü ayrica burada tarif edilen gibi bir hedefleme lipidi (örnegin, lipit partikülü, temel olarak formül I'in bir katyonik lipidi, bir nötr lipit, bir sterol, PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis lipitten ve bir hedefleme parçasindan (örn., Ga1NA03- PEG- DSG) olusur) içerir. Bazi düzenlemelerde, hedefleme lipidi bir PEG parçasi içerdiginde ve var olan bir Iipozomol formülasyona eklendiginde, PEG tarafindan degistirilmis lipidin miktari, PEG tarafindan degistirilmis lipidin toplam miktari (yani, PEG tarafindan degistirilmis lipit, örnegin PEG- DMG ve PEG içerikli hedefleme lipidi) sabit bir mol yüzdesinde (örn., % 0.3 mol, % 1.5 mol ya da % 3.5 mol) tutulacak sekilde azaltilir. Düzenlemelerin bir baska grubunda, bu kompozisyonlardaki nötr lipit, DPPC, POPC, DOPE ya da SM ile yer degistirir. Düzenlemelerin bir baska grubunda ise PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis lipit, PEG- DSG ya da PEG- DPG ile yer degistirir. Iliskili bir baska düzenlemede, burada tarif edilen, bir denekte bir polipeptidin alt ekspresyonu ile karakterize edilen bir hastaligin ya da rahatsizligin tedavi edilmesine dair bir yöntem olup, bahsedilen denege burada tarif edilen bir farmasötik kompozisyonun saglanmasini içerir, burada terapötik ajan polipeptidi ya da bunun islevsel bir varyantini ya da fragmanini kodlayan bir plazmittir. Burada ayrica açiklanan, bir denekteki bagisiklik tepkisini tetikleyen bir yöntem olup, bahsedilen denege burada tarif edilen bir farmasötik kompozisyonun saglanmasini içerir, burada terapötik ajan bagisikligi baskilayan bir oligonükleotittir. Belirli düzenlemelerde, bagisiklik tepkisi hümoral ya da mukozal bir bagisiklik tepkisidir ve ve % 0.5- 15 PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis PEG- DMG, PEG- C- DOMG ya da PEG- cDMArlik bir molar oraninda formül I'in bir katyonik lipidi, DSPC, Kol ve PEG- DMG, PEG- C- DOMG ya da PEG- CDMAidan olusan ya da esas olarak bunlardan olusur, burada lipit partikülü terapötik nükleik asit ile iliskilidir. Ozel PEG- DMG ya da PEG- cDMA'nin mol % *si). Bazi düzenlemelerde, lipit partikülü ayrica burada tarif edilen gibi bir hedefleme lipidi (örnegin, lipit partikülü, temel olarak formül I7in bir katyonik lipidi, bir nötr lipit, bir sterol, PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis lipitten ve bir hedefleme parçasindan olusur) içerir. Bazi düzenlemelerde, hedefleme lipidi bir PEG parçasi içerdiginde ve var olan bir Iipozomol formülasyona eklendiginde, PEG tarafindan degistirilmis Iipidin miktari, PEG tarafindan degistirilmis lipidin toplam miktari (yani, PEG tarafindan degistirilmis Iipit, örnegin PEG- DMG ve PEG içerikli hedefleme Iipidi) sabit bir mol yüzdesinde (örn., % 0.3 mol, % 1.5 mol ya da % 3.5 mol) tutulacak sekilde azaltilir. Düzenlemelerin bir baska grubunda, bu kompozisyonlardaki nötr Iipit, DPPC, POPC, DOPE ya da SM ile yer degistirir. Düzenlemelerin bir baska grubunda ise PEG ya da PEG tarafindan modifiye edilmis lipit, PEG- DSG ya da PEG- DPG ile yer degistirir. Baska düzenlemelerde, farmasötik kompozisyon denege bir asi ya da antijen ile birlikte saglanir. Böylece, burada temin edilenler, burada tarif edilen bir Iipit partikülünü içeren asilar olup, bir bagisikligi baskilayici oligonükleotit içerir ve ayrica bir bagisiklik tepkisinin arzu edildigi bir antijen ile iliskilidir. Ozel düzenlemelerde, antijen bir tümör antijenidir ya da örn., bir virüs, bakteri ya da parazit gibi bulasici bir ajan ile iliskilidir. Çesitli antijenler, enfeksiyon ajan antijenleri ve diger hastaliklarla iliskili antijenler, bu alanda iyi bilinmektedir ve bunlarin örnekleri burada belirtilen referanslarda açiklanmistir. Burada kullanim açisindan uygun antijenlerin örnekleri, polipeptid antijenleri ve DNA antijenlerini içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Antijenlerin spesifik örnekleri, Hepatit A, Hepatit B, çiçek hastaligi, çocuk felci, sarbon, grip, tifüs, tetanoz, kizamik, rotavirüs, difteri, bogmaca, tüberküloz ve rubella antijenidir. Tercih edilen bir düzenlemede, antijen, bir Hepatit B rekombinant antijenidir. Diger bakis açilarinda, antijen bir Hepatit A rekombinant antijenidir. Diger bir yaklasimda, antijen bir tümör antijenidir. Bu tür tümör ile iliskili antijenlere ait örnekler, MUC- 1, EBV antijen ve Burkitt lenfoma ile ilisikili antijenlerdir. Daha baska bir yaklasimda, antijen birtirosinaz ile iliskili protein tümör antijen rekombinant antijenidir. Teknikte yetkili kisiler, diger uygun ajanlari bilecektir. Burada kullanim için uygun olan tümör ile iliskili antijenler, birkaç tümör tipi arasindan paylasilan tekil tümör tipinin indikatifi olabilen ve / veya normal hücreler ile kiyaslandiginda tümör hücresi içinde sadece eksprese edilen ya da asiri eksprese edilen hem mutasyona ugramis hem de mutasyona ugramamis molekülleri içerir. Proteinler ve glikoproteinlere ilave olarak, karbohidratlarin, gangliosidlerin, glikolipidlerin ve müsinlerin ekspresyonuna özgü spesifik desenler de belgelenmistir. Denek kanser asilarinda kullanim için örnek teskil eden tümör ile iliskili antijenler, onkogenlerin protein ürünlerini, tümör baskilayici genleri ve tümör hücresine özgü mutasyonlar ya da yeniden düzenlemelere sahip diger genleri, yeniden aktive edilmis embriyonik gen ürünleri, onkofetal antijenler, dokuya özgü (ancak, spesifik olmayan tümör) farklilasma antijenleri, büyüme faktörü reseptörleri, hücre yüzeyi karbohidrat kalintilari, yabanci viral proteinler ve bir dizi diger kendi kendine ait proteinleri içerir. Tümör ile iliskili antijenlere ait spesifik uygulamalar, örnegin, Ras p21 protoonkogenler, tümör baskilayici p53 ve BCR- abl onkojenler, bunun yani sira CDK4, MUM1, Kaspaz 8, ve Beta kateninie ait protein ürünleri gibi mutasyona ugramis antijenleri; galektin 4, galektin 9, karbonik anhidraz, Aldolaz A, PRAME, Her2 / neu, ErbB- 2 ve KSA gibi asiri eksprese edilmis antijenleri, alfa fetoprotein (AFP), insan korionik gonadotropin (hCG) gibi onkofetal antijenleri; karsinoembriyonik antijen (CEA) gibi kendi antijenleri ve Mart 1 / Melan A, gpiOO, gp75, Tirosinaz, TRP1 ve TRP2 gibi melanosit farklilasma antijenleri; PSA, PAP, PSMA, PSM- P1 ve PSM- P2 gibi prostat ile iliskili antijenler; MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE gibi reaktive edilmis embriyonik gen ürünleri ve NY- E801, SSX2 ve SCP1 gibi diger kanser testis antijenleri; GM2, GD2 ve GDB gibi gangliosidleri, Lewis (y) ve globo- H gibi nötr glikolipitler ve glikoproteinleri ve Tn, Thompson- Freidenreioh antijen (TF) ve sTn gibi glikoproteinleri içerir. Ayrica burada tümör ile iliskili antijenler olarak dahil edilenler, tüm hücre ve tümör hücre Iizatlarinin yani sira bunlarin immünojenik kisimlari, yani sira B hücre Ienfomalara karsi kullanilmasi için B Ienfositlerin monoklonal proliferasyonu üzerine ifade edilen immünoglobulin idiyotiplerdir. Patojenler, memelileri ve daha özellikle insanlari enfekte eden bulasici ajanlari, örnegin virüsleri içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Enfekte eden virüse ait örnekler, ancak sinirlandirilmamis olarak: Retroviridae (örnegin, HIV- 1 gibi insan immün yetmezlik virüsleri, (ayrica HTLV- III, LAV ya da HTLV- Ill / LAV, ya da HlV- lll olarak da anilir) ve HIV- LP gibi diger izolatlar; Picomaviridae (örnegin, poIio virüsleri, hepatit A virüsü; enterovirüsler, insan Coxsackie virüsleri, rinovirüsler, echovirüsler); Caliciviridae (örnegin, gastroenterite neden olan suslar); Togaviridae (örnegin, ekuin ensefalit virüsleri, kizamikçik virüsleri); Flaviviridae (örnegin dang virüsleri, ensefalit virüsleri, sari humma virüsleri); Coronoviridae (örnegin, coronavirüsler); Rhabdoviradae (örnegin, vesiküler stomatitis virüsleri, kuduz virüsleri); Coronaviridae (örnegin, coronavirüsler); Rhabdoviridae (örnegin, vesiküler stomatit virüsleri, kuduz virüsleri); Filoviridae (örnegin, ebola virüsleri); Paramyxoviridae (örnegin, parainfluenza virüsleri, kabakulak virüsü, kizamik virüsü, solunum sinsityal virüsü); Orthomyxoviridae (örnegin, influenza virüsleri); Bungaviridae (örnegin, Hantaan virüsleri, bunga virüslerin, phlebovirüsler ve Nairo virüslerin; Arena viridae (hemorajik ates virüsleri); Reoviridae (örnegin, reovirüsler, orbiviurses ve rotavirüsler); Bimaviridae; Hepadnaviridae (Hepatit B virüsü); Parvovirida (parvovirüsler); Papovaviridae (papilloma virüsleri, polioma virüsleri); Adenoviridae (pogu adenovirüs); Herpesviridae herpes simpleks virüsü (HSV) 1 ve 2, varisella zoster virüsü, sitomegalovirüs (CMV), herpes virüsü; Poxviridae (variola virüsleri, vaccinia virüsleri, pox virüsleri); ve Iridoviridae (örnegin, Afrika domuz atesi virüsü); ve siniflandirilmamis virüsler (örnegin, Spongiform ensefalopatilerin etiyolojik ajanlari, delta hepatitinin ajani (Hepatit B virüsü detektif bir uydu oldugu düsünüldü), A olmayan, B olmayan hepatitli ajanlar (sinif 1 = internal olarak iletilen; sinif 2 = parenteral yolla bulasan (yani Hepatit C); Nonivalk ve ilgili virüsler ve astrovirüsler) içerir. Ayrica, gram negatif ve gram pozitif bakteriler omurgali hayvanlarda antijenler olarak görev yapar. Böyle gram pozitif bakteriler, ancak sinirlandirilmamis olarak, Pasteurella türleri, Staphylococci türleri ve Streptococcus türleri içerir. Gram negatif bakteriler, ancak sinirlandirilmamis olarak, Escherichia coli, Pseudomonas türleri ve Salmonella türleri içerir. Enfekte edici bakterilere ait spesifik örnekler: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (örnegin, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogens, Streptococcus pyogens (Grup A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus), Streptococcus (viridans Grubu), Streptococcusfaecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps), Streptococcus pneumoniae, patojenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogens, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, ve Actinomyces israelii içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Patojenlere ait ilave örnekler, memelileri ve daha özellikle insanlari enfekte eden enfeksiyöz mantarlari içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Enfeksiyöz mantarlara ait örnekler: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Enfeksiyöz parazitlere ait örnekler, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, ve Plasmodium vivax gibi Plasmodium içerir. Diger enfeksiyöz organizmalar (yani, protists), Toxoplasma gondii içerir. Farmasötik kompozisyonlar Bir düzenlemede, burada tarif edilenler, burada açiklanan karaciger izleme modeli ile tanimlanan bir nükleik asit ajanini içeren farmasötik kompozisyonlardir. Kompozisyon, örn., bir dsRNA ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici gibi ajan içerir. Farmasötik kompozisyon, genin ekspresyonuyla ya da aktivitesi ile iliskili bir hastaligi ya da rahatsizligi tedavi etmek için faydalidir. Bu tip farmasötik kompozisyonlar verilis sekline bagli olarak formüle edilir. Parenteral dagitim araciligi ile sistemik uygulama için formüle edilen formülasyonlar bunun için bir örnektir. Tanimlanmis ajani içeren farmasötik kompozisyonlar hedef genin örnegin, Faktör VII geninin ekspresyonunu inhibe etmek için yeterli dozajlarda uygulanir. Genelde, dsRNA ajaninin uygun bir dozu, alicinin vücut agirligindaki kilogram basina günde 0.01 ila 5.0 miligramlik aralikta, genel olarak ise vücut agirligindaki kilogram basina günde 1 mikrogram ila 1 mgflik aralikta olacaktir. Farmasötik kompozisyon günde bir kez uygulanabilir ya da dsRNA, gün boyunca uygun araliklarla iki, üç ya da daha fazla alt dozlar halinde ya da hatta sürekli infüzyon ya da kontrollü bir salim formülasyonu vasitasi ile dagitim kullanilarak uygulanabilir. Bu durumda, her alt dozda ihtiva edilen dsRNA, toplam günlük dozaja ulasmak üzere uygun sekilde daha küçük olmalidir. Dozaj birimi ayrica, birkaç gün boyunca, örnegin birkaç günlük bir süre boyunca dsRNA'nin sürekli salimini saglayan geleneksel bir sürekli salim formülasyonu kullanilarak, dagitilmak üzere birlestirilebilir. Sürekli salim formülasyonlari teknikte iyi bilinmektedir ve özellikle bulusun ajanlari ile kullanilabilen maddelerin vajinal yoldan verilmesi için yararlidir. Bu düzenlemede, dozaj birimi uygun bir çoklu günlük doz içerir. Teknikte uzman bir kisi, hastaligin ya da rahatsizligin siddeti, önceki tedaviler, denegin genel saglik durumu ve / veya yasi ve mevcut diger hastaliklari da içeren ancak bunlarla sinirli olmayan bazi faktörlerin bir denegi etkili bir sekilde tedavi etmek için gerekli dozaji ve zamanlamayi etkileyebildigini takdir edecektir. Ayrica, bir denegin terapötik olarak etkili bir miktarda bir bilesimle tedavisi, tek bir tedaviyi veya bir dizi tedaviyi içerebilir. Bulus tarafindan kapsanan dsRNA'Iar için etkili dozajlar ve in vivo yari ömür tahminleri, geleneksel metodolojiler kullanilarak veya burada baska bir yerde tarif edildigi gibi uygun bir hayvan modeli kullanilarak in vivo testler temelinde yapilabilir. Belirli düzenlemelerde, burada tarif edilen lipit- nükleik asit partikülleri içeren farmasötik kompozisyonlar, standart tekniklere göre hazirlanir ve ayrica farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici içerir. Genel olarak, normal tuzlu su, farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici olarak tatbik edilecektir. Diger uygun tasiyicilar, örnegin, albumin, lipoprotein, globulin, vb. gibi gelismis stabilite için glikoproteinler dahil olmak üzere, su, tamponlanmis su, % 0.9 tuzlu su, % 0.3 glisin, ve benzeri içerir. Tuzlu su ya da diger tuz içerikli tasiyicilari içeren kompozisyonlarda, tasiyici tercih edilen sekliyle lipit partikül olusumunu takiben ilave edilir. Böylece lipit- nükleik asit kompozisyonlari olusturulduktan sonra, kompozisyonlar normal tuzlu su gibi farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilara seyreltilebilirler. Elde edilen farmasötik preparasyonlar, konvansiyonel, iyi bilinen sterilizasyon teknikleri ile sterilize edilebilir. Sulu çözeltiler, daha sonra, kullanim için paketlenebilir ya da aseptik kosullar altinda filtrelenir ve liyofilize edilir, liyofilize edilmis preparasyon, uygulamadan önce steril bir sulu çözelti ile birlestirilebilir. Kompozisyonlar, örnegin, sodyum asetat, sodyum laktat, sodyum klorit, potasyum klorit, kalsiyum klorit, vb. gibi, pH ayarlayici ve tamponlayici ajanlari, tonisite ayarlayici ajanlari ve benzeri gibi yaklasik fizyolojik kosullar için gereken sekilde farmasötik olarak kabul edilebilir maddeleri içerir. Buna ilaveten, Iipidik süspansiyonu, saklanmasi üzerine serbest radikal ve Iipid- peroksidatif hasarlara karsi koruyan lipit koruyucu ajanlari içerebilir, a- tokoferol gibi Iipofilik serbest radikal söndürücüler ve ferroksamin gibi suda çözünür demir spesifik kenetleyiciler uygundur. Farmasötik formülasyonlardaki lipit partikülü ya da Iipit- nükleik asit partikülünün konsantrasyonu, yani, agirlikça yaklasik % 0.01'den daha az, genellikle yaklasik % sekilde degisebilir ve seçilen belirli uygulama tarzina göre sivi hacimleri, viskoziteleri, vb. tarafindan primer olarak seçilecektir. Ornegin, konsantrasyon, tedaviyle iliskili sivi yükünü azaltmak için arttirilabilir. Bu, özellikle aterosklerozla iliskili konjestif kalp yetmezligi ya da ciddi hipertansiyonu olan hastalarda istenebilir. Alternatif olarak, irite edici Iipitlerden olusan kompleksler, uygulama bölgesinde enflamasyonu azaltmak için düsük konsantrasyonlara seyreltilebilir. Uygulamalarin bir grubunda, nükleik asit ekli bir etikete sahip olacak ve tani için kullanilacaktir (tamamlayici nükleik asit varligini endike edilmesiyle). Bu durumda, uygulanan komplekslerin miktari, kullanilan belirli etikete, teshis edilen hastalik durumuna ve klinisyenin kararina bagli olacaktir ancak genel olarak vücut agirliginin kilogrami basina (örn., nükleik asit ajaninin basina) yaklasik 0.01 ve yaklasik 50 mg arasinda, tercih edilen sekliyle yaklasik 0.1 ve yaklasik mg / kg vücut agirligi arasinda olacaktir. Bazi düzenlemelerde, uygulanan bir kompleks, vücut agirligindaki kilogram basina yaklasik 0.004 ila yaklasik 50 mg arasinda nükleik asit ajani içerir (örn., yaklasik 0.006 mg / kg ila yaklasik 0.2 mg / kg). Yukarida belirtildigi sekliyle, burada tarif edilen Iipit- terapötik ajan (örnegin, nükleik asit) partikülleri, polietilen glikol (PEG)- modifiye edilmis fosfolipidler, PEG- seramid ya da gangliosid GM1- modifiye edilmis lipitleri ya da agregasyonu önlemek ya da sinirlandirilmak için etkili diger lipitleri içerir. Bu gibi bilesenlerin ilavesi sadece karmasik agregasyonu önlemez. Daha ziyade, dolasim ömrünü arttirmak ve Iipid- nükleik asit kompozisyonun hedef dokulara verilmesini arttirmak için bir araç da saglayabilir. Ayni zamanda burada tarif edilenler, kit formunda lipid- terapötik ajan kompozisyonlardir. Kit tipik olarak kitin çesitli elementlerini tutmak için bölümlere ayrilmis bir konteynirdan olusacaktir. Kit, bunun içinde tarif edilen partiküller ya da farmasötik kompozisyonlar, tercih edilen sekliyle sudan arindirilmis ya da konsantre hale getirilmis formda içerecektir ve bunlarin rehidrasyonunu ya da seyreltilmesini ve uygulama talimatlarini içerecektir. Bazi uygulamalarda, partiküller, aktif ajani içerirken diger uygulamalarda içermezler. Karaciger tarama modeli ile tanimlanan bir ajan ihtiva eden farmasötik kompozisyonlar, lokal veya sistemik tedavinin istenip istenmedigine ve tedavi edilecek alana bagli olarak bir çok yolla uygulanabilir. Uygulama topikal, pulmoner, mesela nebulizer dahil olmak üzere tozlarin veya aerosollerin solunmasi veya havalandirilmasi ile olabilir; intratrakeal, intranazal, epidermal ve transdermal), oral veya parenteral olabilir. Uygulama ayrica lokal dagitim yoluyla belirli dokulara tercih edilen Iokalizasyon ile sonuçlanabilecek sekilde örn. eklem içine dogrudan intraartiküler enjeksiyon yoluyla, bagirsak ve bagirsaklara dogrudan uygulama için rektal uygulama ile, serviks ve vajinaya uygulanacak intravajinal uygulama yoluyla, göze verilmesi için intravitreal uygulama yoluyla tasarlanabilir. Parenteral uygulama intravenöz, intraarteriyal, intraartiküler, subkutan, intraperitonal veya intramüsk'uler enjeksiyon veya infüzyonu veya intrakranyal, örnegin intratekal veya intraventrik'uler uygulamayi içerir. Topikal uygulama için farmasötik kompozisyonlar ve formülasyonlar arasinda transdermal yamalar, merhemler, losyonlar, kremler, jeller, damlalar, fitiller, spreyler, sivilar ve tozlar bulunabilir. Geleneksel farmasötik tasiyicilar, sulu, toz veya yagli bazlar, koyulastiricilar ve benzerleri gerekli olabilir veya arzu edilebilir. Kaplanmis prezervatifler, eldivenler ve benzerleri de yararli olabilir. Tercih edilen topikal formülasyonlar, bulusun dsRNA'larinin bir Iipit, lipozom, yag asidi, yag asidi esterii steroid, kenetleme maddesi veya yüzey aktif madde gibi bir topikal dagitim bileseni ile karisim halinde oldugu bilesimleri içerir. Tercih edilen lipidler ve lipozomlar, nötr (bm, Dioleoilfosfatidil etanolamin (DOPE), dimiristoilfosfatidil kolin (DMPC), disearoilfosfatidil kolin) negatif (örn., dimiristoilfosfatidil gliserol veya DMPG) ve katyonik (bm. dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP ve dioleoilfosfatidil etanolamin DOTMA) içerir. Bulusa ait DsRNA'lar lipozomlar içinde kaps'ullenebilir veya özellikle katyonik lipozomlar kompleksler olusturabilir. Tercih edilen yag asitleri ve esterleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte arasidonik asit, oleik asit, ekosanoik asit, laurik asit, kaprilik asit, kaprik asit, miristik asit, palmitik asit, stearik asit, Iinoleik asit, linolenik asit, dikaprat, trikaprat, monoolin, dilaurini gliseril 1- monokaprat, 1- dodesilizasikloheptan- 2- on, bir asilkarnitin, bir asilkolin veya bir 01-10 alkil ester ('or., izopropil miristat IPM), monogliserit, digliserit veya farmasötik olarak kabul edilebilir tuzu yer alir. Topikal formülasyonlar, 20 Mayis 1999'da dosyalanmis ABD patent basvurusu Ser. No. 09/ 315,298 sayili ABD Patentinde tarif edilmektedir. Oral uygulama için bilesimler ve formulasyonlar, tozlar veya gran'uller, mikropartikülatlar, nanopartikülatlar, süspansiyonlar veya su veya sulu olmayan ortamlardaki çözeltiler, kaps'uller, jel kapsüller, paketler, tabletler veya mini tabletler içerir. Yogunlastiricilar, lezzet verici maddeler, seyrelticiler, em'ulsifiye ediciler, dagitici yardimci maddeler veya baglayicilar istenebilir. Tercih edilen oral formulasyonlar, bulusun dsRNA'Iannin bir veya daha fazla penetrasyon arttirici sürfaktan ve selatlayici ile birlikte uygulandigi formülasyonlardir. Tercih edilen yüzey aktif maddeler arasinda yag asitleri ve I veya esterleri veya bunlarin tuzlari, safra asitleri ve I veya bunlarin tuzlari bulunur. Tercih edilen safra asitleri / tuzlari arasinda, kenodeoksikolik asit (CDCA) ve üredeoksikondeoksikolik asit (UDCA), kolik asit, dehidrokolik asit, deoksikolik asit, glukolik asit, glikolik asit, glikodeoksikolik asit, taurokolik asit, taurodeoksikolik asit, sodyum tauro- 24, 25- dihidro- fusidat ve sodyum glikadhidrofutidat bulunur. Tercih edilen yag asitleri arasinda arasidonik asit, undekanoik asit, oleik asit, laurik asit, kaprilik asit, kaprik asit, miristik asit, palmitik asit. stearik asit, linoleik asit, linolenik asit, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliseril 1- monokaprat, I- dodesilizasikloheptan- 2- on, bir asilkarnitin, bir asilkolin veya bir monogliserit, bir digliserit veya bunun farmas'otik olarak kabul edilebilir bir tuzu (örn. sodyum) yer alir. Ayrica tercih edilenler, penetrasyon arttiricilarin, Örnegin safra asitleri /tuzlari ile kombinasyon halinde yag asitleri / tuzlarinin kombinasyonlaridir. `Ozellikle tercih edilen bir kombinasyon, laurik asit, kaprik asit ve UDCA'nin sodyum tuzudur. Daha fazla penetrasyon arttiricilar arasinda polioksietilen- 9- Iauril eter, polioksietilen- - setil eter bulunur. Bulusa ait DsRNA'Iar, püskürt'ulerek kurutulmus parçaciklar dahil olmak 'üzere gran'uler formda oral yoldan veya mikro veya nanopartik'uller olusturmak poli- amino asitler; poliiminler; poliakrilatlar; polialkil akrilatlar, poliokstanlar, poli alkilsianoakrilatlar; katyonize jelatinler, albuminler, nisastalar, akrilatlar, polietilenglikoller (PEG) ve nisastalar; poli alkilik anoakrilatlar; DEAE türevli poliminler, pollulanlar, sel'ulozlar ve nisastalar bulunur. Ozellikle tercih edilen komplekslestirici ajanlar kitosan, N- trimetilkitosan, poli- L- Iisin, polihistidin, poliornitin, poli sperminler, protamin, polivinilpiridin, politiyo- dietilaminometiletilen P (TDAE), poliaminostiren ('orn., P- amino), poli (metil siyanoakrilat), poli (etil siyanoakrilat), poli (bütilsiyanoakrilat), poli (izobutilsiyanoakrilat), poli (izohekzilsiyanoakrilat), DEAE- metakrilat, DEAE- heksilakrilat, DEAE- akrilamid, DEAE- albümin ve DEAE- dekstran, polimetakrilat, poliheksilakrilat, poli (D, L- Iaktik asit) ), poli (DL- laktik- ko- glikolik asit (PLGA), aljinat ve polietilenglikol (PEG) içerir. DsRNA'Iar için oral form'ulasyonlar ve olarak açiklanmaktadir. Parenteral, intratekal veya intraventrik'uler uygulama için bilesimler ve formülasyonlar, ayrica, sinirli olmamakla birlikte penetrasyon arttiricilar, tasiyici bilesikler ve diger farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar veya eksipiyanlar gibi tamponlar, seyrelticiler ve diger uygun katki maddeleri de ihtiva edebilen steril sulu çözeltileri içerebilir. Farmasötik bilesimler arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte çözeltiler, emülsiyonlar ve lipozom içeren formülasyonlar bulunur. Bu bilesimler, önceden olusturulmus sivilar, kendiliginden emülsifiye edici katilar ve kendi kendine emülsifiye yari katilari içeren ancak bunlarla sinirli olmayan çesitli bilesenlerden üretilebilir. Uygun olarak birim dozaj formunda sunulabilecek farmasötik formülasyonlar, farmasötik endüstrisinde iyi bilinen geleneksel tekniklere göre hazirlanabilir. Bu teknikler, aktif bilesenlerin farmasötik tasiyici (lar) veya yardimci madde (ler) ile bir araya getirilmesi adimini içerir. Genel olarak, formülasyonlar, aktif bilesenlerin sivi tasiyicilar veya ince bölünmüs kati tasiyicilar veya her ikisi ile muntazam bir sekilde ve bir araya getirilmesiyle ve daha sonra gerekirse ürünün sekillendirilmesiyle hazirlanir. Bilesimler, tabletler, kapsüller, jel kapsülleri, sivi suruplar, yumusak jeller. supozituvarlar ve lavmanlar gibi, ancak bunlarla sinirli olmayan birçok olasi dozaj formundan herhangi birine formüle edilebilir. Bulusun bilesimleri ayrica sulu, susuz veya karisik ortamlarda süspansiyon halinde formüle edilebilir. Sulu süspansiyonlar ayrica, örnegin sodyum karboksimetilselüloz, sorbitol ve / veya dekstran dahil olmak üzere süspansiyonun viskozitesini artiran maddeler içerebilir. Süspansiyon ayrica stabilizörler de içerebilir. Bir düzenlemede farmasötik bilesimler, köpükler halinde formüle edilebilir ve kullanilabilir. Farmasötik köpükler, bunlarla sinirli olmamak üzere, emülsiyonlar, mikroemülsiyonlar, kremler, jöleler ve Iipozomlar gibi formülasyonlari içerir. Temel olarak temelde benzer olsa da, bu formülasyonlar bilesenlerde ve nihai ürünün kivaminda degisiklik gösterir. Bu gibi bilesimlerin ve formülasyonlarin hazirlanmasi genel olarak farmasötik ve formülasyon teknolojilerinde uzman kisilerce bilinir ve burada tarif edilen bilesimlerin formülasyonuna uygulanabilir. Burada kullanilan ifadeler ve terminoloji, açiklama amaçlidir ve sinirlayici olarak kabul edilmemelidir. Burada "dahil", "içeren", "sahip olan", "ihtiva eden", "bulunduran" ve bunlarin varyasyonlarinin kullanimi, bundan sonra listelenen maddeleri ve bunlarin esdegerlerini ve ayrica ek maddeleri kapsamaktadir. DRNEKLER Asagidaki örnekler talep edilen bulusu açiklamayi, ancak sinirlamamayi önermektedir. Burada saglanan Orneklerde kullanildigi üzere, "ApoE" terimi, aksi belirtilmedigi sürece Ap0E3'ü ifade eder. Ornek 1: Luc ve FVII hedefleme için siRNA dupleksleri Asagidaki Tablo 8 Luc ve FVllinin hedeflenmesi için örnek niteliginde saglamaktadir. sekanslar Dupleks Sens / Antisens Sekans 5'- 3" 1000 / 2434 AAG fUAC UCAGCG fUAA GdT*dT 2433 / 1001 AAG UAC UCA GCG UAA GdeT 2433 / 2434 AAG fUAC UCAGCG fUAA GdT*dT 1000 / 1001 UAC UCAGCG UAA GdeT GGAUCAUCUCMGUCUUACdeT GUAAGACU UGAGAUGAUCCdeT GGAfUfCAfUfoUfCAAGfUfoUfUAfCdTSdT GfUAAGAfoUfUGAGAfUGAfUfoCdT Oe Ä/WNH Not: L8 ifadesi, edilmis nükleotittir, * osforotioat omurga baglaridir, fN ifadesi bir 2,- floro nükleotittir, dN ifadesi 2'- deoksi nükleotittir. 2"dir, küçük harf 2'- O- metil ile modifiye Ornek 2: Katyonik Iipit türevi Iipozomlar kullanilarak FVII'nin in vivo degerlendirilmesi 057BL / 6 farelerine (Charles River Labs, MA) ve Sprague- Davvley siçanlarina (Charles River Labs, MA), 0.01 mL / gtlik bir hacimde kuyruk ven enjeksiyonu araciligiyla arzu edilen formülasyonda ya salin (tuzlu su) ya da siRNA verilmistir. Uygulama sonrasi çesitli zaman noktalarinda, hayvanlara izofloran inhalasyonu ile anestezi uygulanmis ve kan, retro orbital kanamayla serum ayirici tüpleri içerisine toplanmistir. Faktör VII proteinin serum seviyeleri, üretici protokollerine göre bir kromojenik analizi (Coaset Faktör VII, DiaPharma Grubu, OH ya da Biofen FVII, Aniara Corporation, OH) kullanilarak numunelerde belirlenmistir. Salin ile isleme tabii tutulmus olan hayvanlardan toplanan serum kullanilarak standart bir egri olusturulur. Karaciger mRNA seviyelerinin degerlendirildigi deneylerde, uygulama sonrasi çesitli zaman noktalarinda, hayvanlar kurban edilmistir ve karacigerler toplanmis ve sivi nitrojen içinde dondurulmus halde tutulmustur. Dondurulmus karaciger dokusu toz haline getirilir. Doku lizatlari hazirlanir ve Faktör Vll ve apoB'nin karaciger mRNA seviyeleri dallanmis DNA analizi (Ouantijen Assay, Panomics, CA) kullanilarak belirlenir. Ornek 3. FVII hedefleme için Lipozom Formülasyonlari Faktör VII (FVII), pihtilasma kaskadindaki öne çikan bir protein karacigerde (hepatositlerde) sentezlenir ve plazmaya salgilanir. Plazmadaki FVII seviyeleri basit, plaka tabanli kolorimetrik bir analiz ile belirlenebilir. Bu sekilde, FVlI, hepatosit türevi proteinlerin sirna aracili asagi düzenlemesinin belirlenmesinin yani sira plazma konsantrasyonlarinin ve nükleik asit Iipit partiküllerinin ve siRNA doku dagiliminin izlenmesi için uygun bir model sunar. Farelerde Faktör VII Nakavti FVII aktivitesi, CS7BL / 6 farelerinde intravenöz (bolus) enjeksiyondan 24 saat sonra FVII siRNA ile muamele edilmis hayvanlarda degerlendirilmistir. FVll, serum ya da dokudaki protein seviyelerini belirlemeye yönelik ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanilarak, bir mikro plaka ölçeginde 'üreticinin talimatlari takip edilerek ölçülm'ust'ur. FVII azalmasi, tedavi edilmemis kontrol farelerine karsi belirlenmistir ve sonuçlar Kalinti FVII % 'si olarak ifade edilmistir. Dört doz seviyesi (2, 5, 12.5, 25 mg / kg FVll siRNA) her yeni lipozom kompozisyonun baslangiç ekraninda kullanilmistir ve bu dozlama, baslangiçtaki ekranda elde edilen sonuçlara dayanarak sonraki çalismalarda genisletilmistir. Tolere edilebilirligin belirlenmesi Her yeni lipozomal siRNA formülasyonunun tolere edilebilirligi, agirlik degisiminin, kafes yani gözlemleri, klinik kimya ve bazi durumlarda, hematolojinin izlenmesi ile degerlendirildi. Hayvan agirliklari tedaviden önce ve tedaviden 24 saat sonra kaydedildi. Veriler, Vücut Agirligindaki % ,ce Degisim olarak kaydedildi. V'ücut agirligi ölçümlerine ek olarak, enjeksiyondan 24 saat sonra her doz seviyesinde (2, 5, 12.5 ve mg / kg siRNA) karaciger fonksiyonu markörleri de dahil olacak sekilde bir tam klinik kimya paneli FVll analizi Için toplanan serumun bir bölüm kullanilarak elde edildi. Numuneler analiz için Hayvanlar için Merkezi Laboratuara (Langley, BC) gönderildi. Bazi durumlarda, hematoloji analizi için tüm kanin toplanmasina olanak saglamak üzere tedavi grubuna ek fareler dahil edildi. Terapötik Indeksin Belirlenmesi Terapötik indeks (TI), toksisite ve aktivite ölç'umlerinin karsilastirilmasi ile 'üretilen keyfi bir parametredir. Bu çalismalar için TI asagidaki gibi belirlenmistir: TI = MTD (maksimum tolere edilen doz) / ED50 (% 50 FVIl nakavt için doz) Bu çalismalara yönelik MTD, kemirgenlerde vücut agirliginda % 7tden büyük azalmaya, alanin aminotransferazda (ALT) a200 kat artisa, karaciger hasari için iyi spesifiteye sahip bir klinik kimyasal marköre yol açan en düsük doz olarak ayarlandi. ED50, FVlI doz aktivitesi egrilerinden belirlendi. Ornek 1ide saglanan gibi AD 1661 siTNA, DLin- M- 03- DMA: DSPC: Kol: PEG- DMG'nin asagidaki molar oranini da içeren formülasyonlarda uygulanmis olup, bunlar edilmekte, test edildigi üzere formülasyonlarin susturma kabiliyetini göstermektedir. Ornek 4. hazirlanmasi P. 5; (31 IS.` '."rc'ßsîi l "II-Ü' :vinJart ?.v\:,?w.LI-?ii i"i U %«ngîvu-iF-k . 's' _1 INT'J" :' . güya .y'sfDi-^ - lVa`nin Hazirlanmasi 1,2- Di- O- tetradesil- sn- gliserid la (30 9, 61.80 mmol) ve N,N'- süksinimidilkarbonat (DSC, içine alinir ve bir buzlu su karisimi üzerine karistirildi. Trietilamin (TEA, , karistirma cözeltisine ilave edildi ve sonradan reaksiyon karisimin, ortam sicakliginda bütün gece boyunca karistirilmasina izin verildi. Reaksiyonun ilerleyisi TLC ile izlenir. Reaksiyon karisimi DCM (, sulu NaHC03 çözeltisi ( akabinde standart düzen ile yikandi. Elde edilen kalinti bütün gece boyunca yüksek vakum altinda ortam sicakliginda kurutuldu. Kurutmanin ardindan, böylece elde edilen ham karbonat lla, diklorometan ( içinde çözündü ve bir buzlu banyo üzerinde karistirildi. Karistirilma çözeltisine, mPEGzooo- NH2 (III, 103.00 9, ve susuz piridin (Py, 80 mL, fazlalik) argon altinda ilave edildi. Reaksiyon karisiminin daha sonra bütün gece boyunca ortam sicakliginda karistirilmasina izin verildi. Çözücüler ve uçucular vakum altinda çikartildi ve kalinti DCM ( içinde çözünür ve etil asetat içinde silika jelin bir kolonu üzerine yüklendi. Kolon baslangiç olarak etil asetat ile ve sonradan beyaz bir kati olarak (105.30 9, % 83) istenen PEG- Lipit lVa'yi vermek üzere esdeg.), diklorometan (20 mL) içinde birlikte alindi ve bir buzlu su karisimi içinde 0 °C*ye sogutuldu. Trietilamin ( ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi, DCM ile seyreltildi, su (2 kere), NaHCOs çözeltisi ile yikandi ve sodyum sülfat üzerine kurutuldu. Çözücüler azalan basinç altinda ayristirildi ve llb'nin elde edilen kalintisi, bütün gece boyunca yüksek vakum altinda muhafaza edildi. Bu bilesik, ayrica saflastirilmaksizin bir sonraki reaksiyon için (Japonya) firmasindan satin alinir) ve Ilb (0.7029, 1.5 esdeg.), argon altinda diklorometan (20 mL) içinde çözündü. Reaksiyon 0 "Üye sogutuldu. Piridin (1 mL, fazlalik) ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi. Çözücüler ve uçucular vakum altinda çikartildi ve kalinti, beyaz bir kati olarak (1.46 9, % 76) arzu edilen bilesik lVb elde etmek üzere kromatografi ile (ilk etil asetat akabinde bir gradyan elüsyon olarak % 5- % 10 MeOH / DCM ile) saflastirildi. 1H NMR ch"nin Hazirlanmasi diklorometan (60 mL) içinde birlikte alinir ve bir buzlu su karisimi içinde 0 "Üye sogutuldu. Trietilamin ( ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi, DCM ile seyreltildi, su (2 kere), NaHC03 çözeltisi ile yikandi ve sodyum sülfat üzerine kurutuldu. Çözücüler azalan basinç altinda ayristirildi ve kalinti, bütün gece boyunca yüksek vakum altinda muhafaza edildi. Bu bilesik, ayrica saflastirilmaksizin bir sonraki reaksiyon için dogrudan kullanilmistir. MPEG firmasindan satin alinir) ve "C (07609, 1.5 esdeg.), argon altinda diklorometan ((20 mL) içinde çözündü. Reaksiyon 0 °C'ye sogutuldu. Piridin (1 mL, fazlalik) ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi. Çözücüler ve uçucular vakum altinda çikartildi ve kalinti, beyaz bir kati olarak (0.92 g, % 48) arzu edilen bilesik ch,yi elde etmek üzere kromatografi ile (etil asetat akabinde bir gradyan elüsyon olarak % - % 10 MeOH / DCM ile) saflastirildi. 1H NMR (CDCIs, 6 = 5.22- 1 H), , 1.80- 1.70 tetraen- 19- il- 4- (dimetilamino) bütanoat) hazirlanmasi (0.53 9) bir solüsyonu oda sicakliginda gece boyunca karistirildi. Solüsyon, seyreltik hidrolik asit ile bunu takibe seyreltik sulu sodyum bikarbonat ile yikandi. Organik fraksiyonlar susuz magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve bir rotovap (döner buharlastirici) üzerinde çözücü uzaklastirildi. Kalinti, % 1- &lik bir metanol / diklormetan elüsyon gradyeni kullanilarak bir silika jel kolonuna (20 g) aktarildi. Saflastirilmis ürünü içeren fraksiyonlar birlestirildi ve çözücü, renksiz bir yag (0.54 9) verecek sekilde uzaklastirildi. Burada tarif edilen bilesikler asagidaki makalelerde tarif edilen prosedürler ile sentezlenebilir: 1. Schlueter, Urs; Lu, Jun; Fraser- Reid, Bert. Synthetic Approaches To Heavily 3. Mach, Mateusz; Schlueter, Urs; Mathew, Felix; Fraser- Reid, Bert; Hazen, Kevin C. Comparing n- pentenyl orthoesters and n- pentenyl glycosides as alternative Ornek 6. Çesitli Iipozomal kompozisyonlara sahip MCS Iipozomlarinin siçanlarda etkinligi MC3 içeren lipozomal formülasyonlarin doz tepkisini incelemek için asagidaki tabloda sunuldugu gibi ihtiva edilen bilesenler su sekilde gösterilir: MC3- DSPC- Kolesterol- PEG- 014. Tablo 9, test edildigi üzere örnek niteliginde formülasyonlar Hayvanlar Sprague- Dawley Toplam 27 Enjeksiyon Vol. (uL) 5 ul / g enjeksiyon Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç boyum (mg / (uL lg) (mg / 1 3 5 PBS Sekil 2rde gösterildigi gibi % 50 mol MC3=e sahip olan Iipozomal formülasyon, % 40 mol MCS'e sahip olan Iipozomal formülasyonunkinden nispeten daha düsük siRNA konsantrasyonlarinda etkili bir dozaj tepkisi egrisi göstermistir. Ornek 7. MC3 Iipozomlarinin etkinligi farelerde ApoE bagimliligi qösterir. Çesitli lipozom formülasyonlarinin etkinligi açisindan ApoE'nin rolünü daha fazla incelemek için, vahsi tip ve ApoE nakavt farelerine, esas olarak Ornek 2'de tarif edildigi uygulanmistir. Lipozom formülasyonlarinin yarisi, ekzojen ApoE ilavesinin farelerde proteinin yoklugunun üstesinden gelip gelemeyecegini belirlemek için rekombinant ApoE proteini ile Önceden karistirilmistir. Tablo 10 asagida, test edilen gibi ornek niteligindeki formülasyonlari göstermektedir. Deneysel Plan Hayvanlar CSYBL / 6 ve ApoE nakavt Toplam 42 Enjeksiyon Vol. (uL) agirliga bagli olarak degisebilir Grup Grup Fare Hedef siRNA Konsan. Doz Araç boyutu Tipi (mg / (mg / 1 3 C57BL FVII 0.00 PBS /6 1.5w/ApoE /6 1.5w/Ap0E /6 1.5w/ApoE /6 38.5- 1.5 w / o /6 38.5- 1.5 w / o /6 38.5- 1.5 w / o 8 3 ApoE 1661 0.00 PBS nakavt 1.5 w / ApoE nakavt 1.5 w / ApoE nakavt 1.5 w / ApoE nakavt 38.5- 1.5 w / o nakavt 38.5- 1.5 w / o nakavt 38.5- 1.5 w / o Sekil 3, MC3 ile formüle edilmis Iipozomlar ile birlikte uygulandiginda, vahsi tipteki (sag çubuklar) FVII protein seviyelerinin doza bagli zayiflamasini gösterirken, ApoE eksikligi olan nakavt farelerinde (sol çubuklar) göstermez, hücresel alimda ve /veya karacigere verilmesinde ApoE'nin rolünü düsündürmektedir. Yukarida 1661 siRNA ile tarif edildigi gibi formüle edilen MCS lipozomlari, kendi basina 0.1, 0.03 ve 0.01 mg / kg konsantrasyonlarda uygulandi veya ApoE Iipoprotein ile 'önceden karistirildi. Bununla birlikte, çok daha yüksek dozlarda (örnegin, ~1.0 mg / kg veya üzeri), MC3 ile formüle edilmis formülasyonlarin, FVII mRNA ve proteinin susturulmasina aracilik ettigi bulunmustur (gösterilmemistir). Sekil 3'te gösterildigi gibi Test edilen MC3 form'L'iIl'L'i nakavt farelerinde FVIl'nin susturulmasina aracilik edememektedir. Böylece, ApoE nakavt farelerinde aktivite, MC3'ün (bir MC3 içeren lipozom) ApoE ile karistirilmasiyla kurtarilabilir. Ornek 8: Fosfokolinlerin mol yüzdesi ve kuyruk uzunlugu açisindan degisen Iipozomal formülasyonlar içeren MCSVun etkisi Çesitli Iipozom formülasyonlarinin etkinligine fosfolkolinlerin mol yüzdesi ve kuyruk uzunlugundaki varyasyonlarin etkisini incelemek için, DSPC, DMPC ve DLPC içeren çesitli formülasyonlar FVII susturmanin etkisi açisindan 0.01 ya da 0.03 mg / kgrda test Tablo 11 asagida, test edilen gibi 'örnek niteligindeki formülasyonlari göstermektedir: Deneysel Plan Hayvanlar C57BL / 6 Toplam 45 Enjeksiyon Vol. (uL) agirliga bagli olarak degisebilir Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Doz Araç boyutu (mg / (mg / 1 3 FVII 0.00 PBS Sekil 4, MC3"ün mol yüzdesindeki degisikliklerin etkilerini, ör., yüzde 50 ve 40 moI`L'i karsilastirarak ve formülasyonu içeren DMPC, 50, 40 ve 30 mol yüzdesi için olan etkiyi göstermektedir. Potansiyel alternatif dagitim mekanizmalarini arastirmak için in vivo deneyler, N- asetil galaktosamin (Ga1NAc) konjuge lipidleri içeren lipozom formülasyonlari kullanilarak gerçeklestirilmistir. Ga1NAc reseptör'un'un karacigerde yüksek oranda eksprese edildigi sanildigi için Ga1NAc olasi bir hedefleme ligandi olarak seçilmistir. Bu nedenle, farelerde ve siçanlarda, Ornek 2'de tarif edildigi gibi, Formül Ill'ün Ga1NAc- PEG- DSG çalismalar yapilmistir. Tüm deneylerde, toplam PEG- konjuge Iipit miktari sabit tutuldu (Örnegin,% 0.5 mol GaINACS- PEG ilave edildiginde, karsilik gelen PEG- DSG miktari% 0.5 mol azaldi). Deneyde genotip basina dokuz grubun her biri için dört hayvan kullanilmistir. Asagidaki Tablo 12, formülasyonlarin C57BL6 farelerinde test edildigi,% 5 PEG Iipit konsantrasyonuna sahip olan MC3 içeren lipozomlari içeren yöntemler için deneysel ayrinti saglamaktadir. Asagidaki nispi molar miktarlari içeren lipozomlar: MCS / DSPC karsilik gelen PEG- DSG miktari°/o 4.5'e düsürül'ur. Deneysel Plan Hayvanlar CSYBL / 6 Toplam 45 Enjeksiyon Vol. (uL) agirliga bagli olarak degisebilir Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç lwl/"t" (mg / (uL I 9› (mg / 1 4 10 PES w % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAc Asagida Tablo 13, % 10 mol PEG- DSG lipidi konsantrasyonuna sahip lipozomlar içeren MC3 ihtiva eden yöntemler için deneysel detay saglar. burada formülasyonlar C57BL6 farelerinde test edildi. Lipozomlar asagidaki molar miktarlari içerdi: 50/ 10/ / 10 MC3 / DSPC / Kol / PEG- DSG. Burada % 0.5 Ga1NAcS- PEG ilave edildi, PEG- DSG*nin karsilik gelen miktari % 9.5 azaltildi. Deneysel Plan Hayvanlar CS7BL6 Toplam 36 Enjeksiyon Vol. (uL) agirliga bagli olarak degisebilir Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç bOWw (mg /(uL/g) (mg / 1 4 10 PES w % 0.5 Ga1NAc w % 0.5 GalNAc w % 0.5 Ga1NAc w % 0.5 Ga1NAc Sekil 5, artan PEG- kalkanlamanin CSYBLB farelerinde Ga1NAc aracili olmayan sessizlikleri azalttigini göstermektedir. Bu, C57BL6 farelerinde hem % 5 hem de % 10 PEG konsantrasyonlari ile gösterilmektedir. C18- PEG'nin (yani, PEG- DSG) % 10 mol oraninda dahil edilmesi etkili bir sekilde susturmayi engeller, bu da % 0.5 mol PEG lipidin bir esmolar miktarda Ga1NAc- Iipid (yani, Formül Ill'ün Ga1NAc3- PEG- DSG'si) ile yer degistirmesiyle)üstesinden gelinebilir. Bu nedenle, artan PEG- koruyucu (örnegin, % 5 mol ila % 10 mol), Ga1NAc aracili olmayan susturmayi degil, ayni Benzer deneyler ayrica siçanlarda gerçeklestirilir, burada PEG Iipidi (PEG- DSG) lipozomlarda hem % 5 hem de % 10 mol ihtiva edildi. Asagida Tablo 14, % 5 mol PEG lipidi konsantrasyonuna sahip Iipozomlar içeren MC3 ihtiva eden yöntemler için deneysel detay saglar, burada form'ulasyonlar siçanlarda test edildi. Lipozomlar asagidaki molar miktarlari içerdi: 50 / 10/35 /5 MC3 / DSPC/ Kol / PEG- DSG. Burada Deneysel Plan Hayvanlar Sprague- Dawley Siçanlari Toplam 36 Enjeksiyon Vol. (uL) Bolus enjeksiyon Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç bol/"t" (mg / (uL / 9) (mg / 1 4 5 PBS w % 5 Ga1NAc W % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAc Asagida Tablo 15, % 10 mol PEG Iipidi konsantrasyonuna sahip lipozomlar içeren MC3 ihtiva eden yöntemler için deneysel detay saglar, burada formülasyonlar siçanlarda test edildi. Lipozomlar asagidaki molar miktarlari içerdi: 50/ 10 I 30/ 10 MC3 / DSPC / Kol / PEG- DSG. Burada % 0.5 Ga1NAc3- PEG ilave edildi, PEG- DSG'nin karsilik Deneysel Plan Hayvanlar Sprague- Dawley Siçanlari Toplam 36 Enjeksiyon Vol. (uL) Bolus enjeksiyon Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç bOWIU (mg / (uL / 9) (mg / 1 4 5 PBS W % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAc w % 5 Ga1NAo w % 5 Ga1NAc Sekil 6, belirtilen dozajlarda siçanlara uygulanmis % 5 mol ve % 10 mol C18 PEG ihtiva eden MC3 formülasyonlarinin sonuçlarini göstermektedir. % 10 mol PEG- DSG içeren formülasyonlar, siçanlarda test edilen konsantrasyonlarda (0.625- 5 mg / kg) az bir sessizlik gösterir. Bununla birlikte, Formül Ill'e ait % 0.5 mol'lük Ga1NAc3- PEG- DSG'sinin eklenmesi (yani, C18- PEG'nin % 0.5 mol'ünün degistirilmesi), FVll'nin nakavtini eski haline getirir. Bu nedenle, fareler ile karsilastirildiginda, siçanda, daha yüksek ölçüde korunmus formülasyon genellikle % 5 mol ve % 10 mol PEG konsantrasyonlari arasindaki farkliliklarda gösterildigi gibi gücü daha iyi korur. Ornek 10: % 0.5 mol Ga1NA03- PEG- DSG'nin dahil edildigi ve edilmedigi lipozomal formülasyonlar içeren MC3ite bilesenlerin mol % 'sindeki varyasyonlarin degerlendirilmesi Ga1NAc3- PEG- DSG içeren ve içermeyen farkli mol yüzdesi bilesenlerine sahip olan MC3 içeren lipozomlarin etkinligini belirlemek için, asagidaki lipozomal formülasyonlar, büyük ölçüde yukarida Ornek 2'de tarif edildigi gibi C57BL6 farelerinde hazirlanmis ve test edilmistir. Bilesenler, tabloda gösterildigi gibi su sira ile saglanmaktadir: MCB / DSPC / Chol. / PEG- DSG. Burada % 0.5 Ga1NAc3- PEG ilave edildi, PEG- DSG'nin karsilik gelen miktari asagidaki Tablo 16'daki gibi % 4.5 azaltildi. Deneysel Plan Hayvanlar C578L6 Toplam 33 Enjeksiyon Vol. (uL) agirliga bagli olarak degisebilir Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç Mut" (mg i (uL I 9› (mg 1 3 10 PES Ga1NA03- Iipit Ga1NAc3- Iipit Ga1NAc- Iipit Ga1NAc- Iipit Sekil 7'de gösterildigi gibi G1aNAc,nin lipozomal formülasyonlara ilavesi, her formülasyondaki FVII'nin susturulmasini gelistirir, yani, burada MCP› % 50, 40 ve 30 mol olarak bulunmaktadir. Çesitli lipozom formülasyonlarinin etkinliginde ASGPR'nin rolünü incelemek için. yabani tip ve ASGPR nakavt farelerine, AD- 1661 siRNA bilesimini içeren MC3 lipozomlari, Ornek 1'de tarif edildigi gibi 3, 1 ve 0.3 mg / kg olarak verilmistir. Burada Tablo 17tde gösterildigi gibi % 9.5 azaltildi. Deneysel Plan Hayvanlar C578L6 ve ASPGRr KO Toplam 25 + 15 Enjeksiyon Vol. (uL) agirliga bagli olarak degisebilir Grup Grup Hedef siRNA Konsan. Enj. Hac. Doz Araç b°WtU (mg / (uL / 9) (mg / 1 5 10 PBS Ga1NAc- Iipit Ga1NAc- Iipit Ga1NAc- Iipit 6 5 FVlI 1661 10 PBS Ga1NAc- Iipit Sekil 8, bu deneylerin sonuçlarini göstermektedir ki, GalNAcS- PEG- DSG lipidinin dahil edilmesiyle C18 PEG ihtiva eden formülasyonlarda FVII nakavtinin yeniden kazanilmasini, Ga1NAc hedefleme parçasi için beklenen reseptör olan Asialoglycoprotein Reseptöründe (ASGPR) eksik olan bir fare susu içinde uygulandiginda ortadan kaldirildigini göstermektedir. Ornek 12: Oligonükleotit Sentezi Bütün oligonükleotidler bir AKTAoIigopiIot sentezleyici üzerinde sentezlenir. Standart koruyucu gruplarla ticari olarak temin edilebilen kontrollü gözenekli cam kati destek (dT- CPG, 500, Prime Synthesis) ve RNA fosforamidleri, 5'- O- dimetoksitritil N6- benzoil- 2,- t- bütildimetilsilil- adenozin- 3'- O- N,N'- diisopropil- 2- siyanoetilfosforamidit, 5)- O- dimetoksitritil- N4- asetil- 2!- t- bütildimetilsilil- sitidin- 3'- O- N,N!- diisopropil- 2- siyanoetilfosforamidit, 5'- O- dimetoksitritil- N2- - isobütiril- 2'- t- bütildimetilsilil- guanozin- 3,- O- N,N*- diisopropil- 2- siyanoetilfosforamidit, ve 55- O- dimetoksitritil- 2'- t- bütildimetilsilil- üridin- 3'- O- N,N*- diisopropil- 2- siyanoetilfosforamidit (Pierce Nucleic Acids Technologies), oligonükleotid sentezi için kullanildi. 2,- F fosforamiditler, 5- O- dimetoksitritil- N4- asetil- 25- fluro- sitidin- 3'- O- N,N'- diisopropil- 2- siyanoetilfosforamidit ve 5'- O- dimetoksitritil- 2'- fluro- üridin- 37- O- N,N'- diisopropil- 2- siyanoetil- fosforamidit, (Promega) firmasindan satin alinir. Bütün fosforamiditler, % 10 THF / ANC (hac. / hac.) içinde 0.2 M konsantrasyonda kullanilan guanozin hariç asetonitril (CHsCN) içinde 0.2M bir konsantrasyonda kullanilir. 16 dakikalik eslesme / geri dönüsüm süresi kullanilir. Aktivatör 5- etil tiotetrazol (0.75 M: American International Chemicals) olup, PO- oksidasyon için iyodin /su / piridin kullanilir ve içinde PS- oksidasyon için PADS (% 2) kullanilir. 3"- Iigand konjüge edilmis sarmallar, iliskili ligand içerikli kati destek kullanilarak sentezlenir. Ornegin, sekans içindeki kolesterolün girisi, bir hidroksiprolinol- kolesterol fosforamidit'ten gerçeklestirilir. Kolesterol, bir hidroksiprolinol- kolesterol kisminin elde edilmesi için bir 6- aminohekzanoat baglantisi araciligiyla trans- 4- hidroksiprolinol'e baglanmistir. 5'- uç Cy- 3 ve Cy- 5.5 (florofor) etiketli siRNArlar, Biosearch Technologies firmasindan satin alinan, karsilik gelen Quasar- fosforamidittten sentezlenir. 5'- uç ve ya da iç pozisyona Iigandlarin konjügasyonu, uygun korunmus Iigand- fosforamidit yapi blogu kullanilarak gerçeklestirilir. 5- (etilti0)- 1 H- tetrazol aktivatörü mevcudiyetinde susuz CH3CN içinde fosforamidit'in 0.1 M çözeltisinin bir katiya, uzatilmis bir 15 dak. eslenmesi oligonükleotid baglanir. Internükleotidin fosfata oksidasyonu, rapor edildigi (1) gibi standart iyodin- su kullanilarak ya da 10 dak. oksidasyon bekleme zamanli konjüge edilmis oligonükleotid ile tert- bütil hidroperoksit / asetonitril / su (10: 87: 3) ile islemle yürütülmektedir. Fosforotioat, örnegin DDTT (AM Chemicals firmasindan satin alinan), PADS ve veya Beaucage ayiraci gibi bir sülfür transfer ayiraci kullanilarak fosfit'in fosforotioat'a oksidasyonu ile girer. Kolesterol fosforamidit kurumda sentezlenir ve diklorometan içinde 0.1 M bir konsantrasyonda kullanilir. Kolesterol fosforamidit için eslesme zamani 16 dakikadir. Korumanin Kaldirilmasi I (Nükleobaz Korumasinin Kaldirilmasi) Sentezin tamamlanmasinin ardindan, destek, bir transfer edilir. Oligonükleotid, 55 "Cide 6.5 saat boyunca etanolik amonyumun [amonyak: etanol (3: 1)] bir 80 mL'Iik karisimi ile baz ve fosfat gruplarinin es zamanli koruyucu gruptan uzaklastirilmasi ile destekten ayrilir. Sise, buz üzerinde kisaca sogutulur ve daha sonra etanolik amonyak karisimi bir yeni 250 ml sise içerisine filtre edilir. CPG, etanol / su (1: 1 hac. / hac.) 2 X 40 mL kisimlari ile yikanir. Karisim hacmi daha sonra roto- buhar ile ~ 30 ml'ye azaltilir. Karisim daha sonra boya üzerinde dondurulur ve hizli vakum üzerinde vakum altinda kurutulur. Korumanin Kaldirilmasi I (2'- TBDMS grubunun uzaklastirilmasi) Kurutulmus kalinti, 26 mL trietilamin, trietilamin trihidroflorit (TEA-3HF) ya da piridin- HF ve DMSO (3: 4: 6) içinde yeniden süspansiyon hale getirilir ve 2! pozisyonda tert- bütildimetilsilil (TBDMS) gruplarin çikarilmasi için 90 dakika boyunca 60 °C7de isitilir. Reaksiyon daha sonra 50 mL 20 mM sodyum asetat ile sulandirilir ve pH 6.5'ye ayarlanir ve saflastirilana kadar dondurucuda saklanir. Analiz Oligonükleotidler, saflastirma öncesinde yüksek performansli sivi kromatografisi (HPLC) ile analiz edilir ve tampon ve kolonun seçimi, sekans ve ya da konjüge edilmis ligandin dogasina baglidir. HPLC Saflastirma Ligand ile konjüge edilmis oligonükleotidler, ters faz preparatif HPLC saflastirilir. Konjüge edilmemis oligonükleotidler, kurumda paketlenen bir TSK jel kolonu üzerinde anyon- degisim HPLC ile saflastirilir. Tamponlar, % 10 CH3CN (tampon A) içinde 20 mM sodyum fosfat (pH 8.5) ve % 10 CHsCN, 1M NaBr (tampon B) içinde 20 mM sodyum fosfat (pH 8.5) olmaktadir. Tam uzunlukta oligonükleotidleri içeren fraksiyonlar havuzda toplanir, tuzdan arindirilir ve liyofilize edilir. Yaklasik olarak 0.15 OD tuzdan arindirilmis oligonükleotidler, su içinde 150 pl"ye seyreltilir ve daha sonra CGE ve LC / IVIS analizi için özel siseler içine pipetlenir. Bilesikler daha sonra LC- ESMS ve CGE ile analiz edilir. siRNA gregarasyonu siRNA*nin hazirlanmasi için, esmolar miktarlarda sens ve antisens sarmali, 5 dak. boyunca 95 °C,de 1 X PBS içinde isitilir ve yavas bir sekilde oda sicakligina sogutulur. Dupleksin bütünlügü HPLC analizi ile konfirme edilir. Tablo 18. Luc ve FVII hedefleme için siRNA dupleksleri Dupleks Sek. Sekans 5,- 3, Hedef 1000 / 1 CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdeT Luc AD- 1955 3 cuuAcchGAGuAcuucGAdedT Luc 4 UCGAAGuACUcAGCuAAGdTSDT AD- 1596 5 GGAUCAUCUCAAGUCUUACdeT FVII 6 GUAAGACUUGAGAUGAUCCdeT AD- 1661 7 GGAfUfCAfUfoUfCAAGfUfoUfUAfCdTSdT FVII Küçük harf, 2'OMe modifikasyonudur ve Nf, bir 2'F modifiyeli n'ükleobazdir, dT ise deoksitimidin, s, fosfoiyonattir. Ornek 13: mPEGZOOO- 1,2- Di- O- alkil- sn3- karbomoilgliseritün sentezi mPEG2000- 1,2- Di- O- alkil- sn3- karbomoilgliserit gibi PEG lipitleri asagidaki prosedürler kullanilarak sentezlenmistir: ni i- ,mw .F '5 ~ '0' E' t' «32` ' g* :ML mPEGZOOO- 1,2- Di- O- alkil- sn3- karbomoilgliserit Bilesik 4a'nin (PEG- DMG) hazirlanmasi: 1,2- Di- O- tetradesil- sn- gliserid la (30 9, (DCM, içine alinir ve bir buzlu su karisimi 'üzerine karistirilir. Trietilamin (TEA, karisiminin, ortam sicakliginda bütün gece boyunca karistirilmasina izin verilir. Reaksiyonun ilerleyisi TLC ile izlenir. Reaksiyon karisimi DCM ( ile seyreltilir ve organik katman, su (2 X akabinde standart düzen ile yikanir. Elde edilen kalinti bütün gece boyunca yüksek vakum altinda ortam sicakliginda kurutulur. Kurutmanin ardindan, böylece elde edilen ham karbonat 2a, diklorometan ( içinde çözünür ve bir buzlu banyo üzerinde Corporation (Japonya) firmasindan satin alinir) ve susuz piridin (Py, 80 mL, fazlalik) argon altinda ilave edilir. Bazi düzenlemelerde, metoksi- (PEG)X- amin, bir 45 ila 49, tercih edilen sekliyle 47- 49 arasinda olan ve daha çok tercih edilen sekliyle 49 olan bir x'e sahiptir. Reaksiyon karisiminin daha sonra bütün gece boyunca ortam sicakliginda karistirilmasina izin verilir. Çözücüler ve uçucular vakum altinda çikartilir ve kalinti, DCM ( içinde çözünür ve etil asetat içinde silika jeIin bir kolonu üzerine yüklenir. Kolon baslangiç olarak etil asetat ile ve sonradan beyaz bir kati olarak (105.30 9, % 83) istenen PEG- Lipit 4a'yi vermek üzere diklorometan içinde % 5- % 10 DSC (0.710 9, 1.5 esdeg.), diklorometan (20 mL) içinde birlikte alindi ve bir buzlu su karisimi içinde 0 °C'ye sogutuldu. Trietilamin ( ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi, DCM ile seyreltildi, su (2 kere), NaHCOa çözeltisi ile yikandi ve sodyum sülfat üzerine kurutuldu. Çözücüler azalan basinç altinda ayristirildi ve 2b7nin elde edilen kalintisi, bütün gece boyunca yüksek vakum altinda muhafaza edildi. Bu bilesik, ayrica saflastirilmaksizin mmol, NOF Corporation (Japonya) firmasindan satin alinir) ve 2b (0.7029, 1.5 esdeg.), argon altinda diklorometan (20 mL) içinde çözündü. Reaksiyon 0 °C'ye sogutuldu. Piridin (1 mL, fazlalik) ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi. Çözücüler ve uçucular vakum altinda çikartildi ve kalinti, beyaz bir kati olarak (1.46 9, % 76) arzu edilen bilesik 4b elde etmek üzere kromatografi ile (ilk etil asetat akabinde bir gradyan elüsyon olarak % 5- % 10 MeOH / DCM ile) saflastirildi. 1H NMR (CDCIs, , 4.13 (dd, 2716- 2892. (2.58 9, 1.5 esdeg.), diklorometan (60 mL) içinde birlikte alinir ve bir buzlu su karisimi içinde 0 °C'ye sogutuldu. Trietilamin ( ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi, DCM ile seyreltildi, su (2 kere), NaHC03 çözeltisi ile yikandi ve sodyum sülfat üzerine kurutuldu. Çözücüler azalan basinç altinda ayristirildi ve kalinti, bütün gece boyunca yüksek vakum altinda muhafaza edildi. Bu bilesik, ayrica saflastirilmaksizin bir sonraki reaksiyon için (Japonya) firmasindan satin alinir) ve 26 (0.7609, 1.5 esdeg.), argon altinda diklorometan ((20 mL) içinde çözündü. Reaksiyon 0 °C*ye sogutuldu. Piridin (1 mL, fazlalik) ilave edildi ve reaksiyon bütün gece boyunca karistirildi. Reaksiyon TLC ile izlendi. Çözücüler ve uçucular vakum altinda çikartildi ve kalinti, beyaz bir kati olarak (0.92 9, % 48) arzu edilen bilesik 4c'yi elde etmek üzere kromatografi ile (etil asetat akabinde bir gradyan elüsyon olarak % 5- % 10 MeOH / DCM ile) saflastirildi. 1H NMR Ornek 14: Ekstrüzyon yöntemi için genel protokol Lipitler (formül I'in katyonik Iipidi, DSPC, kolesterol, DMG- PEG ) çözünebilirdir ve istenen molar oranina göre etanol içinde karistirilir. Lipozomlar, pH 5.2'de sodyum asetat tamponuna karistirilmis lipidlerin eklendigi bir etanol enjeksiyon yöntemiyle olusturulur. Bu, % 35 etanol içinde spontan lipozom olusumuyla sonuçlanir. Lipozomlar, en az 2 kez bir 0.08 um polikarbonat membrandan ekstrüde edilir. Sodyum asetat ve % 35 etanol içinde bir stok siRNA çözeltisi hazirlandi ve yüklenmek üzere lipozoma ilave edildi. SiRNA- lipozom çözeltisi, 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edildi ve daha sonra seyreltildi. Etanol çikarildi ve diyaliz veya tegetsel akis filtrasyonu ile PBS tamponuna degistirildi. Ornek 15: Hat içi karistirma yöntemi için genel protokol Bireysel ve ayri stok çözeltileri hazirlanir- biri Iipit ve diger siRNA içerir. Formül I'in katyonik lipidini, DSPC, kolesterol ve PEG Iipit içeren Iipit stok,% 90 etanol içinde çözündürülür. Kalan % 10 düsük pH'li sitrat tamponudur. Lipit stokunun konsantrasyonu 4 mg / mL'dir. Bu sitrat tamponunun pH'i, kullanilan füzyojenik lipidin tipine bagli olarak 3- 5 arasinda degisebilir. siRNA ayrica sitrat tamponu içinde 4 mg / mL'Iik bir konsantrasyonda çözündürülür. Küçük ölçekli, her bir stok çözeltisinin 5 mL'si hazirlanir. Stok çözeltileri tamamen berraktir ve siRNA ile birlestirilmeden önce Iipitlerin tamamen çözülmesi gerekir. Bu nedenle stok çözeltileri, Iipitleri tamamen çözündürmek için isitilabilir. Islemde kullanilan siRNA'Iar modifiye edilmemis oligonükleotidler olabilir veya modifiye edilebilir ve kolesterol gibi Iipofilik kisimlarla konjuge edilebilir. Tek tek stoklar, her bir çözümü bir T- kavsagina pompalayarak birlestirilir. Iki akisin baslangicini ve durusunu ayni anda kontrol etmek için çift kafali Watson- Marlow pompasi kullanilir. 1.6 mm'lik bir polipropilen boru, dogrusal akis oranini arttirmak için 0,8 mm'lik bir boruya daha da küçültülür. Polipropilen hatti (lD = 0.8 mm), bir T baglantisinin her iki tarafina baglanir. Polipropilen T, 4.1 mm3'lük bir hacim için 1.6 mm'lik bir dogrusal kenara sahiptir. Genis uçlarin (1.6 mm) her biri polipropilen hattinin herbiri, çözünmüs lipid stokunu veya çözündürülmüs siRNA'yi içeren test tüplerine yerlestirilir. T- baglanti noktasindan sonra, birlesik akimin yayilacagi tek bir boru yerlestirilir. Boru daha sonra 2x hacim PBS ile bir konteynere uzanmaktadir. PBS hizla karistirilir. Pompa için akis hizi 300 rpm veya 110 mL / dak'lik bir ayardadir. Etanol çikarilir ve diyaliz ile PBS için degistirildi. Lipit formülasyonlari daha sonra uygun bir çalisma konsantrasyonuna santrifüj veya diafiltrasyon kullanilarak konsantre edilir. (dimetilamino) bütanoat],in (formül liin bir katyonik lipidi ya da MC3) sentezi . i,, .na-w..;whavxw-..M !cu __A ..., «ww-_mr-J'xwww'uü' . n"..iiwpx_w-$S`-<1_,f-__ii "I".p ev 1 .- M`x° -i "`41" 'i:' J' .0 9 .,» ..E/`Jr`rw . J"'-.v"`u'i""i mi`_i.__.`,./-M`~.L'R nü | I' ,ç !v d"ç`1/"oi' mi›`_. '-"WI`H<^+VI"I 1'- 3, Mirc: i) Vtride / THF; ii) ivisci, EtsN, DMAP / DCM; iii) LiBr/ DMF; iv) Mg, HCOOEt; v) NaOH, THF, Su; vi) EDC, DMAP, DIPEA Alkol 2,nin hazirlanmasi Argon girisi ve termowell ile donatilmis temiz, kuru bir 2OOL cam reaktör 60 L THF ve .73 Kg (20.4 mol) Iinoleik asit ile dolduruldu. Reaktör'un içerigi, bir aseton- kuru buz banyosu kullanilarak 0 cC'nin altinda so gutuldu. Bu soguk çözeltiye, tolüen içinde 13.8 L Vitrid (agirlikça% 60), reaksiyon karisiminin iç sicakliginin 0 °C'nin altinda tutulmasiyla yavas yavas eklenmistir (Not: Baslangiçtaki vitridinin eklenmesi ekzotermiktir ve köpürme gözlenmistir. Köpürtme 15 dakika eklendikten sonra durdu). Vitridin eklenmesi 3 saat 45 dakika sürdü. Eklemenin tamamlanmasindan sonra, reaksiyon karisimi 2 saat ortam sicakliginda karistirildi. Bir kisim alinmis ve doymus. NazSO4 ve bu sekilde elde edilen ham 'ürün, baslangiç asitinin varligi bakimindan TLC ile analiz edildi. 646 / 5000 TLC, reaksiyonun tamamlandigini gösterdi ve reaksiyon karisimi, yaklasik 45 dakika içinde tekrar 0 "C'nin altinda so gutuldu. Doymus bir sodyum sülfat çözeltisi (1.5 L su içinde 1.1 Kg sodyum sülfat çözülerek hazirlanmis) 45 dakika boyunca reaksiyon karisimina yavas yavas eklenmistir. Eklemenin tamamlanmasindan sonra, karistirilarak 30 dakikalik bir süre boyunca 25 L etil asetat eklenmistir. Elde edilen reaksiyon karisimi, bir celite yatagindan 45 dakikalik bir süre zarfinda süzüldü ve selit yatak, kalintidan tüm ürünü çikarmak için 17 L etil asetat ile yikandi. Birlestirilen organikler düsük basinç altinda konsantre edildi. Kalinti, 15 L etil asetat içerisinde çözündürüldü ve organik tabaka su (2 X 7 L) ile yikandi ve sodyum sülfat (1.1 Kg) üzerinde kurutuldu. Süzüldükten sonra organik tabaka indirgenmis basinç altinda konsantre edildi ve ürün linoleyil alkolü bir yag olarak elde etmek için yüksek vakum altinda kurutuldu. Ham verim = 5.5 Kg (teorik verim = 5.43 Kg). Bu ürün, bir sonraki asamada daha fazla saflastirilmadan kullanildi. Linoleil mesilat 3 hazirlamak için proses Argon girisi ve termowell ile donatilmis temiz, kuru bir 200 L'lik tüm cam reaktör, 45 L DCM ve adim 1'den elde edilen 5.5 Kg ham ürün ile dolduruldu. Bu çözeltiye, 11.5 L trietilamin ilave edildi ve ardindan 0.252 Kg (2.0 mol) DMAP eklendi. Çözelti, bir kuru buz aseton karisimi kullanilarak- 10 °C'ye kadar so gutuldu ve sicaklik 3 saattir 0 `E'nin altinda tutulurken bu soguk reaksiyon kütlesine, bir süre zarfinda DCM (10 L) içindeki bir mesil klorid (3.2 L, 41.3 mol) çözeltisi damla damla ilave edildi. . Eklemenin tamamlanmasindan sonra, reaksiyon karisimi 1 saat 0 oC'de kari stirildiktan sonra reaksiyon karisiminin TLC'si (DCM içinde % 5 EtOAC; PMA lekesi) baslangiç alkolünün tamamen ortadan kalktigini gösterdi. Reaksiyon karisimina, 17 L buz gibi soguk su eklenmis ve tabakalar ayrilmistir. Ust sulu tabaka tekrar 10 L DCM ile yikandi ve katmanlar ayrildi. Birlestirilen organik katmanlar, 2 X 10 L seyreltik hidroklorik asit (2 L Konsantrasyonda HCI, 18 L RO su ile karistirilarak hazirlandi), 2 X 7.5 L su ve 10 L tuzlu su ile (11 Kg NaCl 10 L RO su içinde çözülerek hazirlandi ) yikandi. Organik tabaka ayrildi, NazsO4 (2.75 Kg) üzerinde kurutuldu ve süzüldü. Organik tabaka, indirgenmis basinç altinda buharlastirildi ve açik bir sari yag halinde ham mesilati elde etmek için vakumla kurutuldu. Ham verim = 7.1 Kg (teorik verim = 7.1 Kg). Bu materyal, bir sonraki asamada bir daha aritilmadan kullanildi. 1H NMR (CDCI3, 6 = Hesaplanan. 344.53, Bulunan . Linoleil bromür 4`ün hazirlanmasi Argon girisi ve termowell ile donatilmis temiz, kuru bir 200 L'lik tüm cam reaktör, 25 L DMF ve adim 2'den elde edilen 7.1 Kg ham ürün ile dolduruldu. Bu karisim aseton- kuru- buz karisimi ile- 10 °C'ye so gutuldu. Bu karistirilan karisima, reaksiyon sicakligi O "C'nin altinda tutulurken, 25 °C DMF içinde bir I ityum bromür çözeltisi (2.7 Kg, 31.0 mol), 1.5 saat boyunca ilave edildi. Eklemenin tamamlanmasindan sonra, reaksiyon karisimi, bir alikotun TLC'si (heksan içinde % 10 EtOAc, PMA boyasi), baslangiç mesilatinin tamamen kayboldugunu gösterene kadar, 18- 20 saat boyunca 45 cC'de karistirilmistir. Reaksiyon karisimi 70 L su ile seyreltildi ve 57 L heksanlar ile özü çikarildi. Sulu tabaka 2 X 10 L heksanlar ile ekstre edildi ve birlestirilen organik sodyum klorürün çözündürülmesiyle hazirlandi). 10 L su). Elde edilen organik tabaka (120 L), sodyum sülfat (4 Kg) üzerinde kurutuldu ve ham ürünü (6.5 Kg) elde etmek için düsük basinç altinda konsantre edildi. Ham ürün, elüent olarak heksanlar kullanilarak 60- 120 gözenekli silika jel kullanilarak kolon kromatografisiyle saflastirilmistir. Saf ürünün konsantrasyonu, renksiz bir sivi olarak bromür 4'ün 5.5 Kg'ini (% 81, üç adim) sagladi. 1H NMR (CDCI3, , 4.20 Dilinoleilmetanol 6°nin hazirlanmasi Argon girisi, geri akis kondenseri ve termowell ile donatilmis temiz, kuru 20 L'lik tüm cam reaktörler gazi alinmis ve argon ile temizlenmistir. Reaktör 277 9 (11.3 mol) aktif magnezyum ve 1.5 L susuz eter ile dolduruldu. Reaktör tekrar üç kere gazdan arindirildi ve argonla temizlendi. Bromür 4 (2.5 Kg, 7.6 mol) argon altinda 5 L susuz eter içinde çözülmüs ve bu çözeltinin IL'si reaktöre eklenmis, ardindan 25 mL (0.35 mol) dibromometan eklenmistir. Reaktörün içerigi bir su banyosu kullanilarak 40 CC'ye isitildi (efervesans gözlendi, ardindan Grignard reaktif formasyonunun basladigini gösteren geri akis gözlemlendi). Reaksiyonun baslatilmasindan sonra, isitma reaktörden çikarildi ve bromürün geri kalan 4L'si, karisimin hafif bir geri akisini koruyarak 2 saat 30 dakikalik bir süre boyunca yavasça ilave edildi. Eklemenin tamamlanmasindan sonra, reaksiyon karisimi tekrar 1 saat boyunca geri akisa (banyo sicakligi 45 °C) isitildi, daha sonra reaksiyon kari siminin bir kismi su ile söndürüldü ve TLC (Heksanlar, PMA boyasi) ile analiz edildi, bu da bromürün tamamen tükendigini gösterdi. Reaksiyon karisimi, bir buz banyosu kullanilarak 10 °C'nin altinda sogutuldu ve eter içinde bir etil format (4 L eter içinde çözeltisi, 2 saat 30 dakikalik bir süre zarfinda ilave edildi ve reaksiyonun tamamlanmasindan sonra reaksiyon karisimi oda sicakligina kadar ilitildi ve 1 saat karistirildi. Reaksiyon karisimi tekrar 10 °C'ye kadar sogutuldu ve karisima yavasça aseton (1.15 L) eklendi, ardindan 7 L buzlu su ve% 10 sülfürik asit çözeltisi eklendi (3.4 L sülfürik asit 34 L buzlu su ile seyreltilerek hazirlandi). Ürün 3 x 10 L eter ile ekstre edildi ve birlestirilen organik tabakalar 10 L tuzlu su ile yikandi ve sodyum sülfat (2 Kg) üzerinde kurutuldu. Organik tabakanin indirgenmis basinçta konsantre edilmesi, az miktarda O- formile edilmis ürün ile birlikte gerekli olan dilinoleyil alkolün bir karisimi olarak ham ürünü (2 Kg) sagladi. Bu ham ürün THF (4L) içinde yeniden çözündürüldü ve 20 litrelik cam reaktörüne dolduruldu. Buna bir NaOH çözeltisi (8 L buzlu su içinde çözülmüs 0.934 Kg) ilave edildi ve içerikler 18 saat 65 °C'de isitildi, daha sonra TLC (heksanla r içinde % 10 eter) gerekli olan dilinoleilmetanol için O- formile edilmis ürünün, tam dönüsümünü gösterdi. Reaksiyon karisimi sogutuldu ve eter (3 x 4 L) ile özümlendi ve birlestirilen organik katmanlar 5 L tuzlu su ile yikandi ve sodyum sülfat (4 Kg) üzerinde kurutuldu. Filtrasyon, ardindan organik tabakanin konsantrasyonu ham ürünü verdi. Bu sekilde elde edilen ham ürün, hekzan içinde % 4 eter kullanilarak 60- 120 gözenekli silika jel kullanilarak kolon kromatografisi ile saflastirilmistir. Saf ürün fraksiyonlarinin konsantrasyonu, renksiz bir sivi olarak saf 6 (, bütanoat] MC3 (8)"ün hazirlanmasi: Dilinoleil metanol 6 (144 g, 272 mmol) 1 L diklorometan içinde çözülmüs ve buna dimetilaminobütirik asit 7'nin hidroklorür tuzu (55 g, 328 mmol) eklenmis, ardindan diizopropiletilamin (70 mL) ve DMAP (4 g) eklenmistir. 5 dakika karistirildiktan sonra. ortam sicakliginda EDCI (80 g, 417 mmol) ilave edildi ve reaksiyon karisimi, gece boyunca oda sicakliginda karistirildi; daha sonra TLC (CH2CI2 içinde % 5 MeOH silika) analizi, baslangiç alkolünün tamamen ortadan kalktigini gösterdi. Reaksiyon karisimi CH2CI2 ( ve brin ( ile yikandi. Birlestirilen organik katmanlar, susuz NazSO4 üzerinde kurutuldu ve çözücüler vakumda uzaklastirildi. Bu sekilde elde edilen ham ürün (180 g), renksiz bir yag olarak saf ürün 8'i izole etmek üzere Flas kolon kromatografisi [2.5 Kg silika jel, Asagidaki elüsyonlari kullanarak i) DCM içinde 6L % 0.1 NEts ile doldurulmus kolon; yüklendikten sonra ii) DCM'de 4 L % DCM içerisinde 16L % 2 MeOH- °/o 98,% DCM'de Ornek 17. Onceden olusturulmus vesiküller kullanilarak siRNA formülasyonu Katyonik lipit içerikli partiküller, önceden olusturulmus vesikül metodu kullanilarak yapilmistir. Katyonik lipit, DSPC, kolesterol ve PEG- lipit, etanol içinde sirasiyla 40 I / 40 / 10 molar oraninda çözündürülmüstür. Lipit karisimi, sirasiyla % 30 (hac. / hac.) ve 6.1 mg / mL bir nihai etanol ve lipit konsantrasyonuna karistirilmasiyla bir sulu tampona (50 mM sitrat, pH 4) ilave edilir ve ekstrüksiyon öncesi 2 dak. boyunca oda sicakliginda dengelenmesine izin verilir. Hidratli lipitler, Nicomp analizi ile belirlendigi üzere, vesikül çapi 70- 90 nm elde edilene kadar bir Lipex Ekstrüder (Northern Lipids, Vancouver, BC) kullanilarak 22 "C,de iki adet 80 nm'lik gözenek boyutlu filtrelerden (Nuclepore) ekstrüde edilmistir. Genel olarak 1- 3 arasinda geçisleri gerektirir. Küçük vesikülleri olusturmayan bazi katyonik lipit karisimlari için, yardim edilen DSPC bas grubu üzerindeki fosfat grubunun proton eklenmesi için bir düsük pH tamponu (50 mM sitrat, pH 3) ile lipit karisiminin hidrate edilmesi, stabil 70- 90 nm vesikülleri olusturur. FVII siRNA (bir 50 mM sitrat, % 30 etanol içerikli pH 4 sulu çözeltisi içinde çözünen), °C'ye önceden dengelenmis vesiküllere ~ 5mL / dak. bir hizda karistirilarak ilave edilir. Bir nihai hedef sonrasi, 0.06 (ag. / ag.) siRNA/lipit orani gerçeklestirilir, karisim, vesikül yeniden organizasyonuna ve FVll siRNA enkapsülasyonuna olanak saglamak için 35 "C'de ayrica 30 dak. boyunca enkübe edilir. Etanol daha sonra çikartilir ve harici tampon, ya diyaliz ya da tegetsel akim diyafiltrasyonuyla PBS (155 mM NaCl, 3 mM NazHPO4, 1mM KH2PO4, pH 7.5) ile yer degistirir. Nihai enkaps'üle edilmis siRNA- Iipit orani, boyut dislama döndürme kolonlari ya da iyon degisimi döndürme kolonlari kullanilarak enkaps'üle edilmis siRNA'nin çikarilmasinin ardindan tespit edilir. Doza (mg / kg) karsi kalinti FVII % 'sini gösteren doz tepkisi egrisi Sekil 9ida gösterilmektedir. Ornek 18. Form'ül l'in bir Katyonik Lipidinin pKa'sini Belirleme Formül l'e ait katyonik lipidin pKa'si, esas olarak tarif edildigi gibi (Eastman ve membranlara baglandiginda gözle görülür derecede floresan hale gelen floresan prob 2- (p- toluidino)- 6- naftalens'ûlfonik asit (TNS) kullanilarak belirlendi. Katyonik Iipit / DSPC / CH / PEG- c- DOMG (40: 10: 40: 10 mol orani) içeren vesik'üller, çesitli pH'Iardaki, 2'den 11'e kadar, tamponlarda (13 Mm NaCl, 1 Mm CHsCOONHa, 1 Mm MES, 1 Mm HEPES) 0.1 mM'ye seyreltildi. Seyreltilmis vesiküllere bir TNS sulu çözeltisi (1 ;M son) bölüm ilave edildi ve 30 saniyelik bir dengeleme periyodundan sonra, TNS içeren çözeltinin flüoresani, sirasiyla 321 nm ve 445 nm'lik eksitasyon ve emisyon dalga boylarinda ölçüldü. Katyonik Iipit içeren vesiküllerin pKa'si, ölçülen floresansin çözeltilerin pH'sina karsi çizilmesi ve verilerin ticari grafik programi lgorPro kullanilarak bir Sigmodial egrisine yerlestirilmesiyle belirlenmistir. Formül l'in katyonik lipitine yönelik pKa titrasyon egrisi, sekil 10'da gösterilmektedir. TR