CN117377491A - 免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及载体配制的mRNA，其包含编码流感HA茎多肽的至少一个编码序列，并涉及相关方面。

Description

免疫原性组合物
本申请要求2021年3月26日提交的美国临时申请号63/166539的优先权，其通过引用以其整体并入。
本发明是在履行与美国卫生与公众服务部下属机构美国国立卫生研究院的合作研究和开发协议时创建的。美国政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
本发明涉及使用以载体配制的mRNA形式递送的血凝素(HA)茎多肽的流感免疫，并涉及相关方面。
背景技术
流感病毒对全球公共卫生产生重大影响，每年造成数百万例重病、数千人死亡以及相当大的经济损失。目前的三价或四价流感疫苗会引发针对疫苗毒株和密切相关的分离株的抗体应答，但很少扩展到一个亚型内更多样化的毒株或其他亚型。此外，选择合适的疫苗株面临许多挑战，并且经常导致保护效果不佳。
流感病毒疫苗接种诱导的保护性免疫应答主要针对病毒HA蛋白，该蛋白是病毒表面的一种负责病毒与宿主细胞受体的相互作用的糖蛋白。病毒表面的HA蛋白是HA蛋白单体的三聚体，该三聚体经酶促切割产生氨基末端HA1和羧基末端HA2多肽。球状头部仅由HA1多肽的主要部分组成，而将HA蛋白锚定到病毒脂质包膜中的茎由HA2和部分HA1组成。HA蛋白的球状头部包括两个结构域：受体结合结构域(RBD)(包含唾液酸结合位点的结构域)和残留酯酶结构域(RBD正下方的较小区域)。球状头部包括几个抗原位点，其中包括免疫显性表位。
因此，针对流感的抗体通常靶向HA球状头部中的可变抗原位点，因此仅中和抗原密切相关的病毒。HA头部的变异性是由于流感病毒的恒定抗原漂移(即，蛋白质序列的变化)造成的，并且是流感季节性流行的原因。根据HA和其他也受抗原漂移影响的表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)的序列，流感病毒株被分为不同的亚型。迄今为止，总共分离出18个HA和11个NA，并进一步各自分为两组，例如：HA组1含有例如H1、H2、H5和H9以及组2含有例如H3、H7和H10。
与HA头部相比，HA茎高度保守，几乎没有抗原漂移。
事实上，一类全新的针对流感病毒的广泛中和抗体已经被分离出来，其能够识别高度保守的HA茎(Corti，2011)。与株特异性抗体不同，该新类别的抗体能够中和多种抗原不同的病毒。然而，通过接种缺乏头部结构域的HA茎来在受试者体内强烈引发这些抗体一直很困难(Steel，2010)。通过基因操作去除HA的免疫显性头部区域(包含竞争性表位)并稳定所得的茎区域是改善这些广泛中和性茎抗体的引发的一种潜在方法。
过去几十年，生物技术的进步使得生物材料工程化被开发用于生成新型疫苗平台。铁蛋白是一种几乎在所有活生物体中发现的铁储存蛋白，其已被广泛研究和工程化用于许多潜在的生化/生物医学目的。Corbett,2019描述了使用铁蛋白自组装纳米颗粒来呈现稳定的茎三聚体。
信使RNA(mRNA)是一种单链RNA分子，其对应于基因的遗传序列，并在产生蛋白质的过程中被核糖体读取。基于mRNA的疫苗为涉及活减毒/灭活病原体或亚单位疫苗的传统策略提供了替代疫苗接种方法(Zhang，2019)。mRNA疫苗可以利用非复制mRNA或自我复制RNA(也称为自我扩增mRNA或SAM)。基于非复制mRNA的疫苗通常编码目的抗原，并含有5’和3’非翻译区(UTR)、5’帽和聚(A)尾；而自我扩增RNA还编码能够细胞内RNA扩增的病毒复制机制(Pardi,2018)。
仍然需要针对流感病毒提供广泛且稳健的免疫应答的流感疫苗。尤其仍然需要保护个体免受异源流感病毒株(包括未来进化的季节性和大流行性流感病毒株)的流感疫苗(即“通用疫苗”)。
发明内容
已发现，当以载体配制的mRNA形式递送时，流感HA茎区域的免疫原性增强。
特别地，或此外，已发现，由载体配制的mRNA编码的流感HA茎多肽诱导针对流感病毒的同源、异源和/或异亚型交叉反应性免疫原性应答，适合针对甲型流感病毒，更适合针对组1和/或组2的甲型流感亚型。
因此，本发明提供了载体配制的mRNA，其包含编码流感HA茎多肽的至少一个编码序列。由于mRNA编码流感HA茎多肽，因此提供了编码茎多肽但不编码流感HA头部区域的载体配制的mRNA。因此，该mRNA不编码全长流感HA蛋白。
在一些实施方案中，载体是脂质纳米颗粒(LNP)。
在一些实施方案中，LNP包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、甾醇和可电离阳离子脂质。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有式III：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有式III：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基；
G3是C1-C24亚烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基；
R3是OR5；并且
R5是H。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有下式：
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有式III-3：
在一些实施方案中，至少一种PEG-脂质包含PEG-DMG或PEG-cDMA。
在一些实施方案中，至少一种PEG-脂质包含式IVa：
其中n具有30至60范围内的平均值，适当地其中n具有约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54的平均值，最适当地其中n具有的49或45的平均值；或者
其中n是选择的整数，使得PEG脂质的平均分子量为约2500g/mol。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有式III-3：
在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或鞘磷脂(SM)，合适地中性脂质是DSPC。
在一些实施方案中，甾醇是胆固醇。
在一些实施方案中，LNP包含约0.5至15摩尔％的PEG修饰的脂质、约5至25摩尔％的非阳离子脂质、约25至55摩尔％的甾醇和约20摩尔％至60摩尔％的可电离阳离子脂质。
在一些实施例中，LNP的直径为50至200nm。
在一些实施方案中，LNP具有0.4或更小，例如0.3或更小的多分散性。
在一些实施方案中，核苷酸(N)与磷脂(P)的比率在1N:1P至20N:1P、1N:1P至10N:1P、2N:1P至8N:1P、2N:1P至6N:1P或3N:1P至5N:1P的范围内。
在一些实施方案中，至少一半的mRNA，合适地至少85％，尤其是至少95％，例如全部的mRNA被包封在LNP中。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个另外编码序列，其编码一个或多个异源肽或蛋白质元件，所述异源肽或蛋白质元件选自信号肽、接头、辅助表位、抗原聚簇元件、三聚体元件、跨膜元件、蛋白质纳米颗粒和/或VLP形成序列。
在一些实施方案中，mRNA包含编码蛋白质纳米颗粒的至少一个另外编码序列。
在一些实施方案中，蛋白质纳米颗粒是铁蛋白。
在一些实施方案中，铁蛋白选自细菌和昆虫铁蛋白。
在一些实施方案中，铁蛋白是细菌铁蛋白。
在一些实施方案中，细菌铁蛋白是幽门螺杆菌铁蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质纳米颗粒和流感HA茎多肽通过接头连接，并且其中接头由1至10个残基、适当地2至5个残基、例如2、3、4或5个残基组成。
在一些实施方案中，接头包含多肽序列SGG或由多肽序列SGG组成。
在一些实施方案中，跨膜元件是天然流感HA跨膜元件。
在一些实施方案中，信号肽是天然前导序列或HLA-Drα前导序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码信号肽、合适地天然前导序列的编码序列、所述至少一个编码序列、接头和跨膜元件。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码信号肽、合适地天然前导序列的编码序列、所述至少一个编码序列、接头和蛋白质纳米颗粒，合适地为细菌铁蛋白，更合适地为幽门螺杆菌铁蛋白。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽是包含全长流感HA茎区域或由全长流感HA茎区域组成的多肽。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽是包含流感HA茎区域的免疫原性片段或由流感HA茎区域的免疫原性片段组成的多肽。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽是包含流感HA茎区域的免疫原性变体或由流感HA茎区域的免疫原性变体组成的多肽。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感，例如甲型流感组1或组2。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感组1，合适地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17或H18。在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感H1亚型。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中任一项所示氨基酸序列。在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQID NO:7中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感组2，合适地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和H15。在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感亚型H3、H7或H10。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的HA茎编码序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:18至21中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:24至29中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，编码序列是经密码子修饰的编码序列，其中由经密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列与由相应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比适当地没有被修饰。
在一些实施方案中，经密码子修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任意组合。
在一些实施方案中，经密码子修饰的编码序列具有至少约45％、50％、55％或60％的G/C含量。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽的长度为400个残基或更少，特别是300个残基或更少，特别是250个残基或更少，例如220个残基或更少。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽的长度为130个残基或更多，特别是160个残基或更多，特别是180个残基或更多，例如190个残基或更多。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽的长度为130至400，特别是160至300，特别是180至250，例如190至220个残基。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含两个或更多个各自编码流感HA茎多肽的编码序列，其中所述编码序列在单独的mRNA分子上编码。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含两个或更多个各自编码流感HA茎多肽的编码序列，其中所述编码序列在同一mRNA分子上编码。
在一些实施方案中，所述两个或更多个编码序列编码不同的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列包含各自编码流感HA茎多肽的三个或四个编码序列。
在一些实施方案中，所述两个或更多个编码序列编码衍生自甲型流感，例如甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感组1、合适地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和/或H18的流感HA茎多肽；以及所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感组2、合适地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和/或H15的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；以及所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3、H7和/或H10的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽，以及所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；以及所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H10的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含各自编码流感HA茎多肽的三个或更多个编码序列，所述三个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H7的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含各自编码流感HA茎多肽的至少三个编码序列，但不包含编码衍生自甲型流感亚型H10的流感HA茎多肽的编码序列。
在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的HA茎编码序列。
在一些实施方案中，所述衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:18至21中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:24至29中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含5’帽，合适地为m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构，合适地为5’-帽1结构。
在一些实施方案中，mRNA包含聚(A)尾序列，适当地包含30至200个腺苷核苷酸和/或至少一个聚(C)序列，适当地包含10至40个胞嘧啶核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个组蛋白茎环。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个包含30至200个腺苷核苷酸的聚(A)尾序列，其中所述RNA的3’末端核苷酸是腺苷。在一些实施方案中，mRNA包含至少一个包含100个腺苷核苷酸的聚(A)尾序列，其中所述RNA的3’末端核苷酸是腺苷。
在一些实施方案中，mRNA包含5’非翻译区(UTR)。
在一些实施方案中，5’UTR包含以下或由以下组成：衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因或来自这些基因中任一个的同源物、片段或变体的5’-UTR的核酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含3’UTR。
在一些实施方案中，3’UTR包含以下或由以下组成：衍生自选自PSMB3、ALB7、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或来自这些基因中任一个的同源物、片段或变体的3’-UTR的核酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含异源5’-UTR，其包含以下或由以下组成：衍生自HSD17B4的5’-UTR的核酸序列，并且至少一个异源3’-UTR包含以下或由以下组成：衍生自PSMB3的3’-UTR的核酸序列。
在一些实施方案中，mRNA从5’至3’包含：
i)5’-帽1结构；
ii)衍生自HSD17B4基因的5’-UTR的5’-UTR；
iii)编码序列；
iv)衍生自PSMB3基因的3’-UTR的3’-UTR；
v)任选地，组蛋白茎环序列；以及
vi)包含约100A核苷酸的聚(A)序列，其中所述RNA的3’末端核苷酸是腺苷。
在一些实施方案中，mRNA不包含化学修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷和/或假尿苷。在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，mRNA包含的化学修饰是尿苷修饰，优选其中mRNA中100％的尿苷位置被修饰。
在一些实施方案中，mRNA是非复制的。
在一些实施方案中，mRNA是自我复制的。
在一些实施方案中，自我复制RNA分子编码(i)可以从自我复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，RNA分子包含两个开放阅读框，第一开放阅读框编码甲病毒复制酶，第二开放阅读框编码流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，RNA分子包含三个开放阅读框，第一开放阅读框编码甲病毒复制酶，第二开放阅读框编码流感HA茎多肽，及第三开放阅读框编码蛋白质纳米颗粒。
在一些实施方案中，mRNA具有5’帽-5’UTR-非结构蛋白(NSP)1-4-亚基因组启动子-流感HA茎多肽-接头-蛋白质纳米颗粒-3’UTR-聚A构型。
还提供了包含本文定义的载体配制的mRNA的免疫原性组合物，其中组合物任选地包含至少一种药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，组合物是除本文定义的mRNA之外还包含多个或至少一个另外的mRNA的多价组合物。
在一些实施方案中，多价组合物包含两个或更多个本文定义的mRNA。在一些实施方案中，多价组合物包含两个、三个或四个本文定义的mRNA，各自编码不同的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个mRNA编码衍生自甲型流感，例如甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感组1，合适地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和/或H18的流感HA茎多肽；以及所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感组2、合适地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和/或H15的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；以及所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3、H7和/或H10的流感HA茎多肽。在一些实施方案中，所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；并且所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，所述两个或更多个mRNA中的至少一个是非复制的。在一些实施方案中，所述两个或更多个mRNA中的每一个是非复制的。
还提供了包含本文定义的mRNA和/或本文定义的免疫原性组合物的疫苗。
在一些实施方案中，疫苗是多价疫苗，其包含多个或至少多于一个本文定义的RNA，或多个或至少多于一个本文定义的组合物。
还提供了包含本文定义的RNA，和/或本文定义的组合物，和/或本文定义的疫苗的试剂盒或成套试剂盒，任选地包含用于溶解的液体媒剂，以及任选地提供关于组分施用和剂量信息的技术说明书。
还提供了用作药物的本文定义的载体配制的mRNA、本文定义的免疫原性组合物、本文定义的疫苗、本文定义的试剂盒或成套试剂盒。
还提供了本文定义的RNA、本文定义的组合物、本文定义的疫苗、本文定义的试剂盒或成套试剂盒，用于治疗或预防流感病毒、合适地甲型流感病毒的感染。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA的单剂量为0.001至1000μg，尤其是1至500μg，特别是10至250μg总mRNA。
在一些实施方案中，用途是用于肌内施用。
在一些实施方案中，引发免疫应答。在一些实施方案中，引发适应性免疫应答。在一些实施方案中，引发针对流感病毒、适当地针对甲型流感病毒的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发的免疫应答部分地或完全地降低受试者经历的流感病毒感染的一种或多种症状的严重性和/或缩短受试者经历流感病毒感染的一种或多种症状的时间。
在一些实施方案中，引发的免疫应答降低在激发后发展为确定的流感病毒感染的可能性。
在一些实施方案中，引发的免疫应答减缓流感的进展。
还提供了治疗或预防病症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者应用或施用本文定义的载体配制的mRNA、本文定义的组合物、本文定义的疫苗或本文定义的试剂盒或成套试剂盒。
在一些实施方案中，病症是流感病毒感染。在一些实施方案中，病症是甲型流感病毒感染。
在一些实施方案中，有需要的受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，有需要的受试者是人受试者。
还提供了引发免疫应答的方法，其中该方法包括向有需要的受试者应用或施用本文定义的载体配制的mRNA、本文定义的组合物、本文定义的疫苗或本文定义的试剂盒或成套试剂盒。
在一些实施方案中，免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是针对流感病毒的保护性适应性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是针对甲型流感病毒的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，适应性免疫应答包括产生的与不是由载体配制的mRNA编码的HA蛋白结合的抗体。
在一些实施方案中，免疫应答包括针对流感病毒的同源、异源和/或异亚型交叉反应性免疫原性应答。在一些实施方案中，免疫应答包括针对甲型流感病毒的同源、异源和/或异亚型交叉反应性免疫原性应答。在一些实施方案中，免疫应答包括针对甲型流感病毒组1和/或组2的同源、异源和/或异亚型交叉反应性免疫原性应答。
在一些实施方案中，有需要的受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，有需要的受试者是人受试者。
在下文中提供了本发明的进一步的实施方案。
序列简述
SEQ ID NO:1：来自A/New Caledonia/20/1999(H1N1)的稳定HA茎的多肽序列
SEQ ID NO:2：来自A/Michigan/45/2015(H1N1)的稳定HA茎的多肽序列
SEQ ID NO:3：来自A/Finland/486/2004(H3N2)的稳定HA茎的多肽序列
SEQ ID NO:4：来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)(也称为“A/Jiangxi-Donghu/346/2013”)的稳定HA茎的多肽序列
SEQ ID NO:5：幽门螺杆菌铁蛋白的多肽序列
SEQ ID NO:6：H1ssF_pylori(来自A/New Caledonia/20/1999(H1N1)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:7：H1ssF_pylori(来自A/Michigan/45/2015(H1N1)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:8：H3ssF_pylori(来自A/Finland/486/2004(H3N2)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:9：H10ssF_pylori(来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:10：来自A/Anhui/1/2013(H7N9)的稳定HA茎的多肽序列
SEQ ID NO:11：H7ssF_pylori(来自A/Anhui/1/2013(H7N9)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:12：H1ssF_TM(来自A/Michigan/45/2015(H1N1)-SGG-跨膜元的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:13：H3ssF_TM(来自A/Finland/486/2004(H3N2)-SGG-跨膜元的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:14：H10ssF_TM(来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)-SGG-跨膜元的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:15：H7ssF_TM(来自A/Anhui/1/2013(H7N9)-SGG-跨膜元的信号肽稳定HA茎)的多肽序列
SEQ ID NO:16：来自A/Michigan/45/2015(H1N1)的未修饰天然SP_H1ss_pylori的核酸序列
SEQ ID NO:17：来自A/Michigan/45/2015(H1N1)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H1ss_pylori的核酸序列
SEQ ID NO:18：来自A/Finland/486/2004(H3N2)的未修饰天然SP_H3ss_pylori的核酸序列
SEQ ID NO:19：来自A/Finland/486/2004(H3N2)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H3ss_pylori的核酸序列
SEQ ID NO:20：来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H10ss_pylori的核酸序列
SEQ ID NO:21：来自A/Anhui/1/2013(H7N9)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H7ss_pylori的核酸序列
SEQ ID NO:22：来自A/Michigan/45/2015(H1N1)的未修饰的天然SP_H1ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:23：来自A/Michigan/45/2015(H1N1)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H1ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:24：来自A/Finland/486/2004(H3N2)的未修饰的天然SP_H3ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:25：来自A/Finland/486/2004(H3N2)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H3ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:26：来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的未修饰的天然SP_H10ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:27：来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H10ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:28：来自A/Anhui/1/2013(H7N9)的未修饰的天然SP_H7ss_TM的核酸序列
SEQ ID NO:29：来自A/Anhui/1/2013(H7N9)的N1-甲基假尿苷修饰的天然SP_H7ss_TM的核酸序列
附图说明
图1描绘了研究A：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H1茎IgG抗体滴度
图2描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H1茎IgG抗体滴度
图3描绘了研究A：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H1/NC/99IgG抗体滴度
图4A和4B描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H1/NC/99IgG抗体滴度
图5A和5B描绘了研究A：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H1/Mich/15IgG抗体滴度
图6描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H1/Mich/15IgG抗体滴度
图7描绘了研究A：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H2/Neth/99IgG抗体滴度
图8描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H2/Neth/99IgG抗体滴度
图9描绘了研究A：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H9 IgG抗体滴度
图10描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H9 IgG抗体滴度
图11描绘了研究A：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H18 IgG抗体滴度
图12描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H18 IgG抗体滴度
图13描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H3 IgG抗体滴度
图14描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H7 IgG抗体滴度
图15A和15B描绘了研究B：第2次给药后14天通过ELISA检测抗H10 IgG抗体滴度
图16描绘了研究A：第2次给药后14天茎H1/Mich/2015特异性CD4+T细胞的百分比
图17描绘了研究B：第2次给药后14天茎H1/Mich/2015特异性CD4+T细胞的百分比
图18描绘了研究A：第2次给药后14天茎H1/Mich/2015特异性CD8+T细胞的百分比
图19描绘了研究B：第2次给药后14天茎H1/Mich/2015特异性CD8+T细胞的百分比
图20描绘了研究B：第2次给药后14天茎H10/Jiangxi-Donghu特异性CD4+T细胞的百分比
图21描绘了研究B：第2次给药后14天茎H10/Jiangxi-Donghu特异性CD8+T细胞的百分比
图22描绘了第2次给药后14天针对H1/Mich/15、H1/NC/99和H5/Vn/04的微量中和滴度
图23A和23B描绘了HA茎构建体的体外翻译。
图24A和24B描绘了组织培养中的体外HA茎三聚体表达
图25A和25B描绘了H1-和H3-茎mRNA共转染后的体外H1-茎表达
图26描绘了H3-TM/H3-F转染细胞中H3的体外检测
图27描绘了H1/H3-LNP的体外免疫刺激
图28描绘了初次免疫后18小时的体内血清IFNα水平
图29A和29B描绘了第35天的体内T细胞应答CD4+IFNγ+TNF+
图30描绘了第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+TNF+
图31描绘了第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+CD107+
图32描绘了第21天的体内抗H1结合抗体
图33描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Michigan/45/2015)
图34描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Hawaii/70/2019)
图35描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Christchurch/16/2010)
图36描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/California/6/09)
图37描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Singapore/1/57)
图38描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Vietnam/1203/2004)
图39描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Finland/486/2004)
图40描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Hong Kong/45/2019)
图41描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Perth/16/2009)
图42描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Beijing/47/1992)
图43描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Philippines/2/1982)
图44描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Hong Kong/1/68)
图45描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Shanghai/2/2013)
图46描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)
图47描绘了第2次给药后14天通过ADCC报告生物测定的体内抗H1A/Michigan/45/2015茎抗体
图48A和48B描绘了通过ADCC报告生物测定的体外抗H3茎抗体
图49A和49B描绘了体外和体内的先天免疫刺激
图50描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Michigan/45/2015)(具有经修饰的核苷)
图51描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Hawaii/70/2019)(具有经修饰的核苷)
图52描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Christchurch/16/2010)(具有经修饰的核苷)
图53描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/California/6/09)(具有经修饰的核苷)
图54描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Singapore/1/57)(具有经修饰的核苷)
图55描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Vietnam/1203/2004)(具有经修饰的核苷)
图56描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Finland/486/2004)(具有经修饰的核苷)
图57描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Hong Kong/45/2019)(具有经修饰的核苷)
图58描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Perth/16/2009)(具有经修饰的核苷)
图59描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Beijing/47/1992)(具有经修饰的核苷)
图60描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HAIgG抗体(A/Philippines/2/1982)(具有经修饰的核苷)
图61描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Hong Kong/1/68)(具有经修饰的核苷)
图62描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Shanghai/2/2013)(具有经修饰的核苷)
图63描绘了第2次给药后14天通过多重血清学Luminex测定的体内抗HA IgG抗体(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)(具有经修饰的核苷)
图64描绘了第2次给药后14天通过ADCC报告生物测定进行的体内抗H1A/Michigan/45/2015茎抗体(具有经修饰的核苷)
图65描绘了第2次给药后14天通过ADCC报告生物测定进行的体外抗H3A/Finland/486/2004(H3N2)茎抗体
图66A和66B描绘了第35天的体内T细胞应答CD4+IFNγ+TNF+(修饰的核苷)
图67描绘了第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+TNF+(修饰的核苷)
图68描绘了第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+CD107+(修饰的核苷)
图69描绘了HA茎-幽门螺杆菌铁蛋白插入物的示意图。
具体实施方案
流感HA茎多肽
流感血凝素(HA)是病毒颗粒的主要表面抗原，也是病毒中和抗体的主要靶标。HA是同三聚体表面糖蛋白，每个单体由两个二硫键连接的亚基(HA1、HA2)组成，由单个HA前体蛋白的蛋白水解切割产物产生。HA1链形成膜远端球状头部和膜近端茎(或“茎”)区域的一部分。HA2链代表茎区域的主要组分。HA的头部介导受体结合，而膜锚定茎是膜融合机制的主要部分。本文公开的发明涉及从流感HA头部区域分离时的流感HA茎区域。本文公开的发明不涉及包含在全部流感HA多肽内的流感HA茎区域。
本文使用的“流感HA茎多肽”是指包含全长流感HA茎区域或流感HA茎区域的免疫原性片段或变体的多肽。在一个实施方案中，流感HA茎多肽是包含以下或由以下组成的多肽：全长流感HA茎区域或流感HA茎区域的免疫原性片段或变体。
在一个实施方案中，流感HA茎多肽的长度期望地为400个残基或更少，特别是300个残基或更少，特别是250个残基或更少，例如220个残基或更少。在一个实施方案中，流感HA茎多肽的长度期望地为130个残基或更多，特别是160个残基或更多，特别是180个残基或更多，例如190个残基或更多。在一个实施方案中，流感HA茎多肽的长度期望地为130至400，特别是160至300，特别是180至250，例如190至220个残基。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下：与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下：与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下：与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中任一项所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中任一项所示氨基酸序列。
合适地，流感HA茎多肽衍生自A型或B型流感病毒。更合适地，流感HA茎多肽衍生自甲型流感病毒。
在一个实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感，例如甲型流感组1或组2。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感组1，例如亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17或H18，更合适地H1或H10，更合适地H1。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中任一项所示氨基酸序列。在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感组2，例如亚型H3、H4、H7、H10、H14和H15。在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感H3、H7或H10。在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感H10。在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感H3。在一些实施方案中，流感HA茎多肽衍生自甲型流感H7。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3或SEQID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列。
在另一个实施方案中，流感HA茎多肽衍生自乙型流感。在一个实施方案中，分离的流感HA茎多肽不是衍生自甲型流感HA亚型H8，例如不是衍生自甲型流感HAH9分支(H8、H9和H12)。
流感HA茎多肽不是全长流感HA蛋白。流感HA茎多肽不包含流感HA头部区域，更合适地，流感HA茎多肽不包含来自流感HA的任何另外区域。
流感HA茎多肽在本文中也称为“抗原”或“流感茎多肽”或“抗原性肽或蛋白质”。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含两个或更多个各自编码流感HA茎多肽的编码序列，其中编码序列在单独的mRNA分子上编码。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含两个或更多个各自编码流感HA茎多肽的编码序列，其中编码序列在同一mRNA分子上编码。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列编码不同的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列包含三个或四个各自编码流感HA茎多肽的编码序列。
根据一些实施方案，两个或更多个编码序列编码衍生自甲型流感，例如甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感组1，例如甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和/或H18的流感HA茎多肽；以及两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感组2，例如甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和/或H15的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；以及两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3、H7和/或H10的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；以及两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H10的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽，以及两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含各自编码流感HA茎多肽的三个或更多个编码序列，三个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H7的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA包含各自编码流感HA茎多肽的至少三个编码序列，但不包含编码衍生自甲型流感亚型H10的流感HA茎多肽的编码序列。
在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项所示氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
根据一些实施方案，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQID NO:4中所示氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列。
流感HA茎多肽可以包含在包含另外的多肽序列的构建体内。另外的多肽序列可以包括例如一个或多个信号肽和/或一个或多个接头和/或一个或多个蛋白质纳米颗粒。因此，在一些实施方案中，本发明的mRNA包含至少一个另外的编码序列，其编码一个或多个异源肽或蛋白质元件。
在一些实施方案中，一个或多个异源肽或蛋白质元件可促进或改善编码的茎HA抗原性肽或蛋白质的分泌(例如，通过分泌信号序列)、促进或改善本发明编码的抗原性肽或蛋白质在质膜中的锚定(例如，通过跨膜元件)、促进或改善抗原复合物的形成(例如，通过多聚化结构域或抗原聚簇元件)，或促进或改善病毒样颗粒的形成(VLP形成序列)。此外，茎HA的核酸可另外地编码肽接头元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突细胞靶向序列。
在一些实施方案中，一个或多个异源肽或蛋白质元件选自信号肽、接头、辅助表位、抗原簇元件(多聚化元件)、三聚化元件、跨膜元件、蛋白质纳米颗粒和/或VLP形成序列。
在实施方案中，抗原性肽或蛋白质包含异源信号肽。异源信号肽可用于改善所编码的茎HA抗原的分泌。
在一些实施方案中，本发明的mRNA包含编码蛋白质纳米颗粒的至少一个另外编码序列。在一些实施方案中，蛋白质纳米颗粒是铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白选自细菌和昆虫铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是细菌铁蛋白，例如幽门螺杆菌铁蛋白。
在一些实例中使用的流感HA茎多肽包含在构建体内，该构建体任选地包括非结构蛋白1-4(nsP1-4)、信号肽(SP)、稳定的HA茎、丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸(SGG)接头和幽门螺杆菌铁蛋白。该构建体的形式如下：nsP1-4(任选)-SP稳定的HA茎-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白(图69)。
在一些实例中使用的特异性构建体的多肽序列是SEQ ID NO:7(来自A/Michigan/45/2015(H1N1)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定的HA茎)、SEQ ID NO:6(来自A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定的HA茎)、SEQ ID NO:8(来自A/Finland/486/2004(H3N2)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定的HA茎)、和SEQID NO:9(来自A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定的HA茎)。包含替代性HA茎多肽的另一类似构建体具有SEQ ID NO:11中给出的多肽序列(来自A/Anhui/1/2013(H7N9)-SGG-幽门螺杆菌铁蛋白的信号肽稳定的HA茎)。
因此，在一个实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:6-9或11中任一项具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。适当地，构建体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:6-9或11中的任一项。
在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:6具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:7具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:8具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:9具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:11具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。
在一些其他实施方案中，本发明的mRNA包含编码跨膜元件的至少一个另外编码序列。在一些实施方案中，流感HA茎多肽可以包含在构建体内，该构建体包括信号肽、稳定的HA茎、丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸接头和跨膜元件。
因此，在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:12-15、更合适地SEQ ID NO:12或13中任一项具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQID NO:12或13中任一项具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:12具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:13具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，构建体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:12-15中的任一项。在一些实施方案中，构建体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:12或13中的任一项。在一些实施方案中，构建体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，构建体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:13。
适当地，由流感HA茎多肽引发的免疫应答产生针对流感病毒的抗体。更合适地，引发的免疫应答产生抗茎区域抗体。
流感病毒的类型是指甲型流感、乙型流感或丙型流感。将病毒指定为特定类型涉及相应M1(基质)蛋白、M2(离子通道)蛋白或NP(核蛋白)的序列差异。甲型流感病毒进一步分为组1和组2。这些组进一步分为亚型，亚型是指根据病毒HA蛋白的序列对病毒进行分类。当前普遍认可的亚型的实例是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18。组1流感亚型为H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18。组2流感亚型为H3、H4、H7、H10、H14和H15。最后，术语“株”是指一个亚型内的病毒，它们彼此不同，因为它们在基因组中有小的遗传变异。
在一个实施方案中，引发的免疫应答产生抗组1甲型流感茎区域抗体，合适地抗H1、H2、H5、H9和/或H18茎区域抗体。在一些实施方案中，引发的免疫应答产生抗组2甲型流感茎区域抗体。在一些实施方案中，引发的免疫应答产生抗H3、H7和/或H10。在一些实施方案中，引发的免疫应答产生抗H7和/或H10茎区域抗体。适当地，引发的免疫应答产生抗组1抗体，适当地抗H1、H2、H5、H9和/或H18茎区域抗体，和抗组2抗体，适当地抗H3、H7和/或H10甲型流感茎区域抗体。
在一些实施方案中，引发的免疫应答产生抗H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10和/或H18茎区域抗体中的一种或多种。更合适地，引发的免疫应答产生抗H1、H2、H5、H7、H9、H10和/或H18茎区域抗体中的一种或多种。
适当地，引发的免疫应答产生所有抗H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10和/或H18茎区域抗体。更合适地，引发的免疫应答产生所有抗H1、H2、H5、H7、H9、H10和/或H18茎区域抗体。
在一些实施方案中，引发的免疫应答是同源的(针对相同株)、异源的(针对亚型内的不同株)和/或异亚型交叉反应性的(针对一个或多个不同亚型内的不同株，例如来自组1和/或来自组2亚型)。
本领域普通技术人员将认识和理解引发的免疫应答上下文中的术语“同源的”，例如是针对相同株(如相同的甲型流感株)引发的免疫应答。例如，载体配制的mRNA可包含编码衍生自A/Michigan/45/2015(H1N1)的茎HA多肽的编码序列，其可引发针对A/Michigan/45/2015(H1N1)株的免疫应答。
本领域普通技术人员将认识和理解引发的免疫应答中的术语“异源的”，其例如是针对亚型内不同株引发的免疫应答，例如亚型如H1或H10亚型内的不同甲型流感株。例如，载体配制的mRNA可包含编码衍生自A/Michigan/45/2015(H1N1)的茎HA多肽的编码序列，其可引发针对A/New Caledonia/20/1999(H1N1)株的免疫应答。
本领域普通技术人员将认识和理解引发的免疫应答上下文中的术语“异亚型”，其例如是针对一个或多个不同亚型内的不同株(例如来自甲型流感1组和/或2组亚型)引发的免疫应答。例如，载体配制的mRNA可包含编码衍生自A/Michigan/45/2015(H1N1)的茎HA多肽的编码序列，其可引发针对A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的免疫应答。
全长流感HA茎区
在一个实施方案中，流感HA茎多肽是包含全长流感HA茎区域的多肽。合适地，流感HA茎多肽是由全长流感HA茎区组成的多肽。
全长流感HA茎区域的长度期望地为400个残基或更少，特别是300个残基或更少，特别是250个残基或更少，例如220个残基或更少。全长流感HA茎区域的长度期望地为130个残基或更多，特别是160个残基或更多，特别是180个残基或更多，例如190个残基或更多。
适当地，全长流感HA茎区域包含以下或更适当地由以下组成：选自SEQ ID NO:1-4和10的多肽序列。更合适地，全长流感HA茎区域包含以下或更适当地由以下组成：SEQ IDNO:1或2。更合适地，全长流感HA茎区域包含以下或更适当地由以下组成：SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，全长流感HA茎区域包含以下或更适当地由以下组成：SEQ ID NO:3、4或10。
其他合适的全长流感HA茎区域是WO2013/044203、WO2015/183969、特别是WO2018/045308的表2中公开的那些。
免疫原性片段在一个实施方案中，流感HA茎多肽是包含流感HA茎区的免疫原性片段的多肽。合适地，流感HA茎多肽是由流感HA茎区的免疫原性片段组成的多肽。
在一些实施方案中，本发明中使用的流感HA茎区域的免疫原性片段包括全长(如天然的)流感HA茎区域的片段，其能够引发针对流感病毒(如甲型流感病毒)的中和抗体和/或T细胞应答(如CD4或CD8 T细胞应答)，合适地，保护性免疫应答(例如，部分或完全降低一种或多种症状的严重性和/或受试者在感染后经历一种或多种症状的时间，降低在攻击后发展为确定的感染的可能性和/或减缓疾病的进展(例如，延长存活时间))。
合适地，流感HA茎区域的免疫原性片段包含来自全长流感HA茎区域的一个或多个表位，例如一个、两个或三个或更多个表位。
流感HA茎区域的免疫原性片段的序列与包含在全长流感HA茎区域内的相应序列(例如SEQ ID NO:1-4或10中提供的序列，例如SEQ ID NO:1或2-4，最合适地SEQ ID NO:2-4)具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高，例如最合适地100％的同一性。
贯穿本说明书在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“片段”通常可以是例如核酸序列或氨基酸序列的全长序列的较短部分。因此，片段通常由与全长序列内的相应区段相同的序列组成。在本发明的上下文中，序列的合适片段由一段连续的实体组成，例如对应于该片段所来源的分子中一段连续的实体的核苷酸或氨基酸，其代表该片段所来源的总(即全长)分子(例如流感病毒的HA茎区域)的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。本说明书全文中在蛋白质或肽的上下文中使用的术语“片段”通常可以包括本文定义的蛋白质或肽的序列，就其氨基酸序列而言，与原始蛋白质的氨基酸序列相比，其N-末端和/或C-末端被截短。因此，这种截短可以发生在氨基酸水平上或相应地发生在核酸水平上。因此，关于本文定义的这种片段的序列同一性可适当地指本文定义的完整蛋白质或肽，或这种蛋白质或肽的完整(编码)核酸分子。蛋白质或肽的片段可以包含那些蛋白质或肽的至少一个表位。
免疫原性变体
在一个实施方案中，流感HA茎多肽是包含流感HA茎区域的免疫原性变体的多肽。合适地，流感HA茎多肽是由流感HA茎区域的免疫原性变体组成的多肽。
在一些实施方案中，本发明中使用的流感HA茎区域的免疫原性变体包括全长(如天然的)流感HA茎区的变体，其能够引发针对流感病毒(如甲型流感病毒)的中和抗体和/或T细胞应答(如CD4或CD8 T细胞应答)，合适地，保护性免疫应答(例如，部分或完全降低一种或多种症状的严重性和/或受试者在感染后经历一种或多种症状的时间，降低在攻击后发展为确定感染的可能性和/或减缓疾病的进展(例如，延长存活时间))。
流感HA茎区域的免疫原性变体可包含以下，如由以下组成：与SEQ ID NO:1-4或10，如SEQ ID NO:1或2-4，最合适地SEQ ID NO:2-4中所示的氨基酸序列具有至少90％，如至少95％，如至少98％，如至少99％，如100％同一性的氨基酸序列。
合适地，流感HA茎区域的免疫原性变体包含来自全长流感HA茎区域的一个或多个表位，例如一个、两个或三个或更多个表位。
本领域普通技术人员将认识和理解本说明书全文中在核酸序列上下文中使用的术语“变体”，例如是指衍生自另一核酸序列的核酸序列的变体。例如，与衍生该变体的核酸序列相比，核酸序列的变体可以表现出一个或多个核苷酸缺失、插入、添加和/或置换。核酸序列的变体可以与衍生该变体的核酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％同一性。变体是功能性变体，意思是变体保留了其来源的序列的至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％或更多的功能。核酸序列的“变体”可以在该核酸序列的至少10、20、30、50、75或100个核苷酸的区段内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的核苷酸同一性。
本说明书全文中在蛋白质或肽的上下文中使用的术语“变体”旨在例如是指具有在一个或多个突变/置换(例如一个或多个置换、插入和/或缺失的氨基酸)中不同于原始序列的氨基酸序列的蛋白质或肽变体。在一些实施方案中，这些片段和/或变体具有相同或相当的特异性抗原特性(免疫原性变体、抗原变体)。插入和置换是可能的，特别是在不引起三维结构改变或不影响结合区域的那些序列位置处。通过插入或缺失对三维结构的修饰可以很容易地确定，例如使用CD光谱(圆二色光谱)。蛋白质或肽的“变体”可以在该蛋白质或肽的至少10、20、30、50、75或100个氨基酸的区段内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。在一些实施方案中，蛋白质的变体包含该蛋白质的功能性变体，在本发明的上下文中，这意旨该变体发挥与其来源的蛋白质基本相同或至少40％、50％、60％、70％、80％、90％的免疫原性。
序列比对
关于序列的同一性或同源性在本文中定义为，在对序列进行比对并在必要时引入缺口以获得最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考氨基酸序列相同的氨基酸残基的百分比。
序列同一性可以通过通常用于比较两个多肽的氨基酸位置相似性的标准方法来确定。使用计算机程序如BLAST或FASTA，将两种多肽进行比对，以使它们各自的氨基酸最佳匹配(或者沿着一个或两个序列的全长，或者沿着一个或两个序列的预定部分)。该程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，并且可以与计算机程序结合使用诸如PAM 250(标准评分矩阵；参见Dayhoff，1978)之类的评分矩阵。例如，百分比同一性可以计算如下：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入较短序列以比对两个序列的缺口数之和。
稳定性和纳米颗粒
为了在其天然环境中稳定的组装同三聚体，流感HA茎区域需要头部区域和跨膜结构域。同三聚体形成的排列确保抗原构象表位的呈现。因此，在一个实施方案中，流感HA茎多肽是稳定的流感HA茎多肽，即，当在受试者中表达时，该多肽基本上保留其天然构象。
流感HA茎多肽可以是合成稳定的(在不存在头部和跨膜结构域的情况下)。稳定化可以通过螺旋稳定、环优化、二硫键添加和侧链重新包装来实现(如Corbett，2019年所公开)。可替代地或另外地，可通过提供多聚体形式的茎区域来实现稳定化，例如同三聚体或异三聚体。
流感HA茎多肽可以在载体配制的mRNA内“裸露”地提供，即不与其他稳定蛋白或组分结合。可替代地，流感HA茎多肽可以在宿主中与一种或多种其他稳定蛋白共表达。在一个具体的实施方案中，流感HA茎多肽存在于纳米颗粒的表面，例如蛋白质纳米颗粒，例如Diaz等人2018年公开的那些，包括铁蛋白、二氧四氢蝶啶和胶囊蛋白(encapsulin)。
当以同三聚体或异三聚体的形式提供时，流感HA茎多肽最适合展示在自组装蛋白质纳米颗粒上，例如最适合展示在铁蛋白纳米颗粒上，例如更适合展示在昆虫或细菌铁蛋白纳米颗粒上。
铁蛋白是一种蛋白质，其主要功能是细胞内铁的储存。几乎所有生物体都会产生铁蛋白，铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由以八面体对称的四级结构自组装的四α螺旋束组成。其自组装成纳米颗粒的特性非常适合携带和暴露抗原。
在一些实施方案中，铁蛋白用于促进抗原聚集并，因此可以促进所编码的茎HA抗原的免疫应答。
根据一些实施方案，蛋白质纳米颗粒是细菌铁蛋白纳米颗粒。在一些实施方案中，蛋白质纳米颗粒是幽门螺杆菌铁蛋白纳米颗粒(例如Corbett,2019、WO2013/044203、WO2015/183969和WO2018/045308中公开的那些)。当在宿主中共表达时，与流感HA茎多肽连接的幽门螺杆菌铁蛋白将与各自与流感HA茎多肽连接的其他幽门螺杆菌铁蛋白自组装，以形成展示多个流感HA茎多肽的纳米颗粒，从而允许它们组装成一个或多个同三聚体和/或一个或多个异三聚体。
合适地，铁蛋白，更合适地，细菌铁蛋白，再更合适地，幽门螺杆菌铁蛋白，和流感HA茎多肽通过接头连接，合适地，接头由1至10个残基组成，更合适地由2至5个残基组成，例如包含多肽序列SGG的接头，例如由多肽序列SGG组成。
在一些实施方案中，流感HA茎多肽可以与跨膜元件在宿主中共表达。
在一些实施方案中，跨膜元件是天然流感HA跨膜元件。
另外的抗原
本发明可以涉及多种抗原组分，例如目的是引发针对流感病毒的广泛免疫应答。因此，可以存在一个以上抗原，可以存在一个以上编码抗原的多核苷酸，可以存在一个编码一个以上抗原的多核苷酸，或者可以存在一个或多个抗原和编码一个或多个抗原的一个或多个多核苷酸的混合物。还可以存在多糖，例如多糖缀合物。
在一些实施方案中，术语抗原意旨能够引发免疫应答的肽、蛋白质或多肽。适当地，抗原包含至少一个B或T细胞表位。引发的免疫应答可以是产生中和抗体的抗原特异性B细胞应答。引发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身反应和/或局部反应。抗原特异性T细胞反应可包括CD4+ T细胞应答，例如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD4+ T细胞的应答。可替代地，或另外地，抗原特异性T细胞反应包括CD8+ T细胞应答，例如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+ T细胞的应答。
mRNA
信使RNA(mRNA)可以指导受试者的细胞机制产生蛋白质。mRNA可以是环状的或分支的，但通常是线性的。mRNA可以是环状的或线性的。
术语“RNA”和“mRNA”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是核糖核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷单磷酸、尿苷单磷酸、鸟苷单磷酸和胞苷单磷酸单体，它们沿着所谓的主链相互连接。主链由第一相邻单体的糖(即核糖)和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定序列称为RNA序列。mRNA提供可以翻译成特定肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸编码序列。
在本发明的上下文中，mRNA可以提供编码本文定义的抗原性蛋白质的至少一个编码序列，该抗原性蛋白质在施用后(例如，在施用给受试者，例如人受试者后)被翻译成(功能性)抗原。
因此，该mRNA适合于本发明的疫苗。
本文所用的mRNA优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含蛋白质(例如酶)、其他核酸(例如DNA和核苷磷酸单体)等，通常纯度至少约50％(重量)，通常纯度至少90％，例如纯度至少95％或至少98％(如下文进一步详细描述的)。
mRNA可以以多种方式制备，例如通过全部或部分化学合成，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长的核酸，通过连接来自基因组或cDNA文库的较短的核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)等。具体而言，可以使用DNA模板酶促制备mRNA(如下文进一步详细描述的)。
本文所用的术语mRNA包括常规mRNA或mRNA类似物，例如含有经修饰的主链或经修饰的碱基(例如假尿苷等)的那些。mRNA可能有也可能没有5’帽(如下文进一步详细描述的)。
mRNA包含编码抗原的至少一个序列。通常，本发明的核酸将是重组形式，即自然界中不存在的形式。例如，除了编码抗原的序列之外，mRNA可以包含一个或多个异源核酸序列(例如编码另一个抗原的序列和/或控制序列，如启动子或内部核糖体进入位点)。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA是人工核酸。
本文所用的术语“人工核酸”旨在是指非天然存在的核酸。换句话说，人工核酸可以被理解为非天然核酸分子。由于其单独的序列(例如G/C含量修饰的编码序列，UTR)和/或由于其它修饰，例如核苷酸的结构修饰，这种核酸分子可以是非天然的。通常，人工核酸可以通过基因工程化和/或产生，以对应于所需的人工核苷酸序列。在本文中，人工核酸是可能不是天然存在的序列，即与野生型或参考序列/天然存在的序列至少有一个核苷酸不同的序列(通过例如密码子修饰，如下文进一步详细描述的)。术语“人工核酸”不限于意指“一个单一分子”，而是应理解为包含基本相同的核酸分子的集合。因此，它可以涉及多个基本上相同的核酸分子。
可替代地或另外地，与编码抗原的天然存在的序列相比，核酸的序列或化学结构可以被修饰。核酸分子的序列可以被修饰，例如，以增加核酸表达或复制的功效，或提供另外的稳定性或抗降解性。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA是修饰的和/或稳定的核酸，适当地是经修饰的和/或稳定的人工核酸。
根据一些实施方案，mRNA因此可以作为“稳定的人工核酸”或“稳定的编码核酸”提供，也就是说显示对体内降解的改善的抗性的核酸和/或显示体内稳定性改善的核酸，和/或显示体内可翻译性改善的核酸。在下文中，描述了在该上下文中适合“稳定”核酸的特定合适的修饰/适应。
在下文中描述了能够“稳定”mRNA的合适修饰。
mRNA也可以被密码子优化。在一些实施方案中，mRNA包含经密码子修饰的至少一个编码序列。在一些实施方案中，mRNA的编码序列是经密码子修饰的至少一个编码序列。适当地，与相应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，由经密码子修饰的至少一个编码序列编码的氨基酸序列没有被修饰。
在一些实施方案中，mRNA可以针对在人细胞中的表达进行密码子优化。“密码子优化”旨在关于密码子使用的修饰可以增加核酸的翻译效率和/或半衰期。术语“经密码子修饰的编码序列”涉及与相应野生型或参考编码序列相比，在密码子(编码一个氨基酸的核苷酸三联体)方面不同的至少一个编码序列。适当地，在本发明上下文中，经密码子修饰的编码序列可以表现出改善的体内降解抗性和/或改善的体内稳定性和/或改善的体内可翻译性。最广泛意义上的密码子修饰利用遗传密码的简并性，其中多个密码子可以编码相同的氨基酸，并且可以互换使用(参见WO2020002525的表1)以优化/修饰编码序列，用于本文概述的体内应用。
在一些实施方案中，mRNA的编码序列是经密码子修饰的至少一个编码序列，其中经密码子修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任意组合。
在一些实施方案中，mRNA的至少一个编码序列具有至少约45％、50％、55％或60％的G/C含量。在具体实施方案中，mRNA的至少一个编码序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％的G/C含量。
当转染到哺乳动物宿主细胞中时，包含经密码子修饰的编码序列的mRNA具有12-18小时，或大于18小时，例如24、36、48、60、72小时，或大于72小时的稳定性，并且能够被哺乳动物宿主细胞(例如肌肉细胞)表达。
当转染到哺乳动物宿主细胞中时，包含经密码子修饰的编码序列的mRNA被翻译成蛋白质，其中蛋白质的量至少可相比，或适当地比由转染到哺乳动物宿主细胞中的天然存在的或野生型或参考编码序列获得的蛋白质的量多至少10％，或多至少20％，或多至少30％，或多至少40％，或多至少50％，或多至少100％，或多至少200％。
在实施方案中，mRNA可以被修饰，其中与相应的野生型或参考编码序列(本文称为“C最大化编码序列”)的C含量相比，至少一个编码序列的C含量可以增加，适当地最大化。与相应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，由经C最大化的mRNA编码序列编码的氨基酸序列适当地不被修饰。经C最大化的核酸序列的产生可以适当地使用根据WO2015/062738的修饰方法来进行。在本文中，WO2015/062738的公开通过引用并入本文。
在一些实施方案中，mRNA可以被修饰，其中与相应的野生型或参考编码序列的G/C含量相比，至少一个编码序列的G/C含量(本文称为“G/C含量优化的编码序列”)可以被优化。在该上下文中“优化”是指其中G/C含量被适当地增加至基本上最高可能的G/C含量的编码序列。与相应野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比，由经G/C含量优化的mRNA编码序列编码的氨基酸序列适当地不被修饰。G/C含量优化的mRNA序列的产生可以使用根据WO2002/098443的方法进行。在本文中，WO2002/098443的公开被包括在本发明的全部范围内。
在一些实施方案中，mRNA可以被修饰，其中至少一个编码序列中的密码子可以适应人密码子使用(本文称为“适应人密码子使用的编码序列”)。编码相同氨基酸的密码子在人中出现的频率不同。因此，适当修饰mRNA的编码序列，使得编码相同氨基酸的密码子的频率对应于根据人密码子使用的该密码子的天然出现频率。例如，在氨基酸Ala的情况下，野生型或参考编码序列以以下的方式进行适当地适应：密码子“GCC”的使用频率为0.40，密码子“GCT”的使用频率为0.28，密码子“GCA”的使用频率为0.22，密码子“GCG”的使用频率为0.10等(参见例如WO2020002525的表1)。因此，将这样的程序(如Ala所示例的)应用于由RNA编码序列编码的每个氨基酸，以获得适应人密码子使用的序列。
在实施方案中，mRNA可以被修饰，其中与相应的野生型或参考编码序列的G/C含量相比，至少一个编码序列的G/C含量(本文称为“G/C含量修饰的编码序列”)可以被修饰。在本文中，术语“G/C优化”或“G/C含量修饰”涉及与相应的野生型或参考编码序列相比，包含修饰的、适当增加数量的鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸的核酸。这种数量的增加可以通过用含有鸟苷或胞嘧啶核苷酸的密码子替换含有腺苷或胸苷核苷酸的密码子来产生。适当地，具有增加的G/C含量的核酸序列比具有增加的A/U的序列更稳定或显示更好的表达。与相应野生型或参考序列编码的氨基酸序列相比，由经G/C含量修饰的mRNA编码序列编码的氨基酸序列适当地不被修饰。在一些实施方案中，与相应野生型或参考核酸序列的编码序列的G/C含量相比，核酸编码序列的G/C含量增加了至少10％、20％、30％，合适地增加了至少40％。
在实施方案中，mRNA可被修饰，其中至少一个编码序列中的密码子适应指数(CAI)可增加或适当最大化(本文称为“CAI最大化编码序列”)。在一些实施方案中，在例如人中相对罕见的野生型或参考核酸序列的所有密码子被替换为在例如人中常见的相应密码子，其中常见密码子编码与相对罕见密码子相同的氨基酸。适当地，最常见的密码子用于所编码蛋白质的每个氨基酸(参见WO2020002525的表1，最常见的人密码子用星号标记)。适当地，mRNA包含至少一个编码序列，其中至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。在一些实施方案中，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)是1(CAI＝1)。例如，在氨基酸Ala的情况下，野生型或参考编码序列可以以最常见的人密码子“GCC”总是用于氨基酸的方式进行适应。因此，此类程序(如对于Ala所示例的)可以应用于由mRNA的编码序列编码的每个氨基酸以获得CAI最大化的编码序列。
在实施方案中，相对于原始核酸序列(例如，野生型或参考序列)中的A和/或U核苷酸的数量，可以通过改变核酸序列中A和/或U核苷酸的数量来修饰mRNA。在一些实施方案中，进行此类AU改变以改变组合物中各个核酸的保留时间，以(i)允许使用HPLC方法进行共纯化，和/或允许分析所获得的核酸组合物。这种方法在公开的PCT申请WO2019092153A1中有详细描述。WO2019092153A1的权利要求1至70通过引用并入本文。
在一些实施方案中，mRNA的编码序列是经密码子修饰的至少一个编码序列，其中经密码子修饰的编码序列选自G/C优化的编码序列、人密码子使用适应的编码序列、或G/C修饰的编码序列。
聚A尾(例如，约30个或更多个腺苷残基)可连接至RNA的3’末端以增加其半衰期。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个聚(N)序列，例如至少一个聚(A)序列、至少一个聚(U)序列、至少一个聚(C)序列或其组合。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个聚(A)序列。
本文使用的术语“聚(A)序列”、“聚(A)尾”或“3’-聚(A)尾”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如是旨在是腺苷核苷酸序列，通常位于线性RNA(或环状RNA)的3’末端，至多约1000个腺苷核苷酸。在一些实施方案中，聚(A)序列基本上是均聚的，例如，例如100个腺苷核苷酸的聚(A)序列基本上具有100个核苷酸的长度。在其他实施方案中，聚(A)序列可以被至少一个不同于腺苷核苷酸的核苷酸中断，例如，例如100个腺苷核苷酸的聚(A)序列可以具有超过100个核苷酸的长度(包括100个腺苷核苷酸，另外至少一个核苷酸-或一段核苷酸-不同于腺苷核苷酸)。
聚(A)序列可包含约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸、或约40至约150个腺苷核苷酸。在一些实施方案中，聚(A)序列的长度可以是至少约或甚至多于约10、50、64、75、100、200、300、400或500个腺苷核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个包含约30至约200个腺苷核苷酸的聚(A)序列。在一些实施方案中，聚(A)序列包含约64个腺苷核苷酸(A64)。在其他一些实施方案中，聚(A)序列包含约100个腺苷核苷酸(A100)。在其他实施方案中，聚(A)序列包含约150个腺苷核苷酸。
在进一步的实施方案中，mRNA包含至少一个包含约100个腺苷核苷酸的聚(A)序列，其中该聚(A)序列被非腺苷核苷酸、适当地被10个非腺苷核苷酸中断(A30-N10-A70)。
本文定义的聚腺苷酸序列可以直接位于mRNA的3’末端。在一些实施方案中，3’-末端核苷酸(即多核苷酸链中的最后一个3’-末端核苷酸)是至少一个聚(A)序列的3’-末端A核苷酸。术语“直接位于3’末端”必须被理解为精确地位于3’末端—换句话说，核酸的3’末端由以A核苷酸终止的聚(A)序列组成。
在一个实施方案中，mRNA包含至少70个腺苷核苷酸、适当地连续的至少70个腺苷核苷酸的聚(A)序列，其中3’-末端核苷酸是腺苷核苷酸。
在实施方案中，核酸的聚(A)序列是在RNA体外转录过程中从DNA模板获得的。在其他实施方案中，聚(A)序列通过常规的化学合成方法在体外获得，而不必从DNA模板转录。在其他实施方案中，聚(A)序列通过RNA的酶促聚腺苷酸化(在RNA体外转录后)产生，使用市售的聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案，或者通过使用固定化的聚(A)聚合酶，例如使用WO2016174271中描述的方法和手段。
mRNA可包含通过酶促聚腺苷酸化获得的聚(A)序列，其中大多数核酸分子包含约100(+/-20)至约500(+/-50)，合适地约250(+/-20)腺苷核苷酸。
在实施方案中，mRNA包含衍生自模板DNA的聚(A)序列，并且任选地另外包含通过酶促聚腺苷酸化产生的至少一个另外聚(A)序列，例如，如WO2016091391中所述。
在实施方案中，mRNA包含至少一个聚腺苷酸化信号。
在实施方案中，mRNA包含至少一个聚(C)序列。
本文所用的术语“聚(C)序列”旨在至多约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸序列。在实施方案中，聚(C)序列包含约10至约200个胞嘧啶核苷酸、约10至约100个胞嘧啶核苷酸、约20至约70个胞嘧啶核苷酸、约20至约60个胞嘧啶核苷酸、或约10至约40个胞嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，聚(C)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
在实施方案中，mRNA包含至少一个组蛋白茎环(hSL)或组蛋白茎环结构。
术语“组蛋白茎环”(在例如序列表中缩写为“hSL”)旨在形成主要在组蛋白mRNA中发现的茎环二级结构的核酸序列。
组蛋白茎环序列/结构可以适当地选自WO2012019780中公开的组蛋白茎环序列，该公开涉及组蛋白茎环序列/组蛋白茎环结构，在此引入作为参考。可以使用的组蛋白茎环序列可以衍生自WO2012019780的式(I)或(II)。根据另一个实施方案，mRNA包含至少一个衍生自专利申请WO2012019780的具体式(Ia)或(IIa)中的至少一个的组蛋白茎环序列。
在其他实施方案中，mRNA不包含本文定义的hsL。
在实施方案中，mRNA包含3’-末端序列元件。3’-末端序列元件包含聚(A)序列和任选地组蛋白茎环序列。
RNA的5’末端可以加帽。可以通过添加5’-帽结构来修饰mRNA，5’-帽结构适当地稳定RNA和/或增强编码抗原的表达和/或减少对先天免疫系统的刺激(在施用给受试者后)。
例如，RNA的5’末端可以用具有结构m7G(5’)ppp(5’)N(帽0结构)或其衍生物的经修饰的核糖核苷酸加帽，其可以在RNA合成过程中掺入或可以在RNA转录后进行酶工程化(例如，通过使用由mRNA三磷酸酶、鸟苷酸基转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的痘苗病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持RNA分子的稳定性和翻译功效方面发挥着重要作用。mRNA分子的5’帽可以通过2’-O-甲基转移酶进一步修饰，这导致帽1结构(m7Gppp[m2’-O]N)的产生，这可以进一步提高翻译效率。
在实施方案中，mRNA包含5’-帽结构，适当地m7G、帽0、帽1、帽2、修饰的帽0或修饰的帽1结构。
本文使用的术语“5’-帽结构”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指位于RNA(例如mRNA)的5’-末端的5’-修饰的核苷酸，特别是鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，5’-帽结构通过5’-5’-三磷酸键连接至RNA。
可能合适的5’-帽结构是帽0(第一个核碱基的甲基化，例如m7GpppN)、帽1(m7GpppN相邻核苷酸的核糖的另外甲基化)、帽2(m7GpppN下游第二个核苷酸的核糖的另外甲基化)、帽3(m7GpppN下游第三个核苷酸的核糖的另外甲基化)、帽4(m7GpppN下游第4个核苷酸的核糖的另外甲基化)、ARCA(抗反向帽类似物)、修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1甲基鸟苷、2’-氟鸟苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代鸟苷、2-氨基鸟苷、LNA鸟苷和2-叠氮鸟苷。
5’-帽(帽0或帽1)结构可以在化学RNA合成中或在使用帽类似物的RNA体外转录(共转录加帽)中形成。
本文使用的术语“帽类似物”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指具有帽功能性的不可聚合的二核苷酸或三核苷酸，因为当掺入核酸分子的5’末端时，其促进翻译或定位，和/或防止核酸分子，特别是RNA分子的降解。不可聚合是指帽类似物仅在5’末端掺入，因为它没有5’三磷酸，因此不能通过模板依赖性聚合酶，特别是模板依赖性RNA聚合酶在3’方向延伸。帽类似物的实例包括但不限于选自以下的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如GpppG)；二甲基化帽类似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(例如m7Gpppm7G)或抗反向帽类似物(例如ARCA；m7,2'OmeGpppG、m7,2’dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸衍生物)。其他帽类似物先前已被描述(WO2008016473、WO2008157688、WO2009149253、WO2011015347和WO2013059475)。在该上下文中进一步合适的帽类似物描述于WO2017066793、WO2017066781、WO2017066791、WO2017066789、WO2017/053297、WO2017066782、WO2018075827和WO2017066797中，其中涉及帽类似物的公开通过引用并入本文。
在实施方案中，使用三核苷酸帽类似物产生经修饰的帽1结构，如WO2017053297、WO2017066793、WO2017066781、WO2017066791、WO2017066789、WO2017066782、WO2018075827和WO2017066797中公开的。具体地，衍生自WO2017053297的权利要求1-5中公开的结构的任何帽结构可适合用于共转录产生经修饰的帽1结构。此外，衍生自WO2018075827的权利要求1或权利要求21中限定的结构的任何帽结构可适当地用于共转录产生经修饰的帽1结构。
在实施方案中，mRNA包含帽1结构。
在实施方案中，5’-帽结构可以使用本文定义的三核苷酸帽类似物共转录添加，合适地在本文定义的RNA体外转录反应中。
在实施方案中，mRNA的帽1结构是使用三核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG通过共转录加帽形成的。在这种情况下，合适的帽1类似物是m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
在其他实施方案中，mRNA的帽1结构是使用三核苷酸帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG的共转录加帽形成的。
在其他实施方案中，mRNA的帽0结构是使用帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)G通过共转录加帽形成的。
在其他实施方案中，5’-帽结构是使用加帽酶(例如痘苗病毒加帽酶和/或帽依赖性2’-O甲基转移酶)的酶促加帽来形成的，以产生帽0或帽1或帽2结构。可以使用WO2016193226中公开的方法和手段，使用固定化的加帽酶和/或帽依赖性2’-O甲基转移酶来添加5’-帽结构(帽0或帽1)。
为了确定帽0或帽1结构的存在/不存在，可以使用如已公开的PCT申请WO2015101416中所述的加帽测定法，特别是如已公开的PCT申请WO2015101416的权利要求27至46中所述的加帽测定法。可用于确定RNA的帽0或帽1结构存在/不存在的其他加帽测定描述于PCT/EP2018/08667或公开的PCT申请WO2014152673和WO2014152659中。
在实施方案中，mRNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)帽结构。在此类实施方案中，mRNA包含5’-末端m7G帽，以及m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的另外甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化腺苷。在一些实施方案中，约70％、75％、80％、85％、90％、95％的RNA(种类)包含如使用加帽测定所确定的此类帽1结构。
在其他实施方案中，mRNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)帽结构。在此类实施方案中，mRNA包含5’-末端m7G帽，以及相邻核苷酸的核糖的另外甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化鸟苷。在一些实施方案中，约70％、75％、80％、85％、90％、95％的编码RNA(种类)包含如使用加帽测定所确定的此类帽1结构。
因此，mRNA序列的第一个核苷酸，即m7G(5’)ppp结构下游的核苷酸，可以是2’O甲基化鸟苷或2’O甲基化腺苷。
在实施方案中，mRNA的核糖体结合位点环境中的A/U(A/T)含量与其各自的野生型或参考核酸的核糖体结合位点环境中的A/U(A/T)含量相比可能增加。这种修饰(核糖体结合位点周围A/U(A/T)含量增加)提高了核糖体与mRNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合转而具有有效翻译mRNA的效果。
因此，在一些实施方案中，mRNA包含核糖体结合位点，也称为“Kozak序列”。
在一些实施方案中，本发明的mRNA可以包含至少一个异源非翻译区(UTR)，例如5’UTR和/或3’UTR。
术语“非翻译区”或“UTR”或“UTR元件”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指通常位于编码序列5’或3’的核酸分子的一部分。UTR不翻译成蛋白质。UTR可以是核酸的一部分，例如DNA或RNA。UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。此类调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点、启动子元件等。
在实施方案中，mRNA包含蛋白质编码区(“编码序列”或“cds”)和5’-UTR和/或3’-UTR。值得注意的是，UTR可能含有决定核酸的调控序列元件，例如RNA周转、稳定性和定位。此外，UTR可能含有增强翻译的序列元件。在核酸序列(包括DNA和RNA)的医学应用中，将核酸翻译成至少一种肽或蛋白质对于治疗功效至关重要。3’-UTR和/或5’-UTR的某些组合可以增强编码本发明的肽或蛋白质的可操作连接的编码序列的表达。含有UTR组合的核酸分子在对受试者施用后，适宜地在肌内施用后，有利地使抗原性肽或蛋白能够快速和瞬时表达。因此，本文提供的包含3’-UTR和/或5’-UTR的某些组合的mRNA特别适合作为疫苗施用，特别是适合施用到受试者的肌肉、真皮或表皮中。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源’-UTR。异源5’-UTR或3’-UTR可以衍生自天然存在的基因或可以是合成工程化的。在实施方案中，mRNA包含至少一个本文定义的编码序列，其可操作地连接至至少一个(异源)3’-UTR和/或至少一个(异源)5’-UTR。
在实施方案中，mRNA包含至少一个异源3’-UTR。
术语“3’-非翻译区”或“3’-UTR”或“3’-UTR元件”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指位于编码序列3’(即下游)并且不翻译成蛋白质的核酸分子的一部分。3’-UTR可以是核酸的一部分，例如位于编码序列和(任选的)末端聚(A)序列之间的DNA或RNA。3’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。此类调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。
在一些实施方案中，mRNA包含3’-UTR，其可以衍生自与半衰期延长的RNA(即提供稳定的RNA)相关的基因。
在一些实施方案中，3’-UTR包含一个或多个聚腺苷酸化信号、影响细胞中核酸位置稳定性的蛋白质的结合位点、或一个或多个miRNA或miRNA的结合位点。
在实施方案中，mRNA包含至少一个异源3’-UTR，其中至少一个异源3’-UTR包含衍生自或选自以下的核酸序列：选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或来自这些基因中任何一个的同源物、片段或变体的3’-UTR。
该上下文中的核酸序列可以衍生自公开的PCT申请WO2019077001A1，特别是WO2019077001A1的权利要求9。WO2019077001A1的权利要求9的相应3’-UTR序列通过引用并入本文。
在一些实施方案中，mRNA可包含如WO2016107877中所述的3’-UTR，WO2016107877涉及3’-UTR序列的公开通过引用并入本文。合适的3’-UTR是WO2016107877的SEQ ID NO:1-24和SEQ ID NO:49-318，或这些序列的片段或变体。在其他实施方案中，核酸包含如WO2017036580中所述的3’-UTR，WO2017036580涉及3’-UTR序列的公开通过引用并入本文。合适的3’-UTR是WO2017036580的SEQ ID NO:152-204，或这些序列的片段或变体。在其他实施方案中，核酸包含如WO2016022914中所述的3’-UTR，WO2016022914涉及3’-UTR序列的公开通过引用并入本文。特别合适的3’-UTR是根据WO2016022914的SEQ ID NO:20-36的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在实施方案中，mRNA包含至少一个异源5’-UTR。
术语“5’-非翻译区”或“5’-UTR”或“5’-UTR元件”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指位于编码序列5’(即上游)并且不翻译成蛋白质的核酸分子的一部分。5’-UTR可以是位于编码序列5’的核酸的一部分。通常，5’-UTR从转录起始位点开始，在编码序列的起始密码子之前结束。5’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。此类调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。5’-UTR可以被转录后修饰，例如通过酶促或转录后添加5’-帽结构(例如对于本文定义的mRNA)。
在一些实施方案中，mRNA包含5’-UTR，其可以衍生自与半衰期延长的RNA(即提供稳定的RNA)相关的基因。
在一些实施方案中，5’-UTR包含一个或多个影响细胞中RNA稳定性或RNA位置的蛋白质的结合位点，或一个或多个miRNA或miRNA的结合位点。
在实施方案中，mRNA包含至少一个异源5’-UTR，其中至少一个异源5’-UTR包含衍生自或选自以下的核酸序列：选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因或来自这些基因中任何一个的同源物、片段或变体的5’-UTR。
该上下文中的核酸序列可以选自公开的PCT申请WO2019077001A1，特别是WO2019077001A1的权利要求9。WO2019077001A1的权利要求9的相应5’-UTR序列通过引用并入本文(例如，WO2019077001A1的SEQ ID NO:1-20或其片段或变体)。
在一些实施方案中，组分A和/或组分B的核酸可以包含如WO2013143700中所述的5’-UTR，WO2013143700涉及5’-UTR序列的公开通过引用并入本文。特别合适的5’-UTR是衍生自WO2013143700的SEQ ID NO:1-1363、SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1421和SEQ ID NO:1422的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其他实施方案中，核酸包含如WO2016107877中所述的5’-UTR，WO2016107877涉及5’-UTR序列的公开通过引用并入本文。特别合适的5’-UTR是根据WO2016107877的SEQ ID NO:25-30和SEQ ID NO:319-382的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其他实施方案中，核酸包含如WO2017036580中所述的5’-UTR，WO2017036580涉及5’-UTR序列的公开通过引用并入本文。特别合适的5’-UTR是根据WO2017036580的SEQ ID NO:1-151的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其他实施方案中，核酸包含如WO2016022914中所述的5’-UTR，WO2016022914涉及5’-UTR序列的公开通过引用并入本文。特别合适的5’-UTR是根据WO2016022914的SEQ ID NO:3-19的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在实施方案中，mRNA包含如本文所述的至少一个编码序列，该编码序列编码本文定义的至少一个茎HA抗原蛋白，与选自下列5’UTR/3’UTR组合(“也称为UTR设计”)的3’-UTR和/或5’-UTR可操作地连接：a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(NDUFA4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rpl31/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)、i-2(RPL32/ALB7)、或i-3(α-珠蛋白基因)。
在实施方案中，mRNA包含本文定义的至少一个编码序列，该编码序列编码本文定义的至少一个茎HA抗原蛋白，其中该编码序列与HSD17B45’-UTR和PSMB3 3’-UTR(HSD17B4/PSMB3(UTR设计a-1))可操作地连接。
在进一步的实施方案中，mRNA包含本文定义的至少一个编码序列，该编码序列编码本文定义的至少一个茎HA抗原蛋白，其中该编码序列与SLC7A3 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR(SLC7A3/PSMB3(UTR设计a-3))可操作地连接。
在进一步的实施方案中，mRNA包含本文定义的至少一个编码序列，该编码序列编码本文定义的至少一个茎HA抗原蛋白，其中该编码序列与RPL31 5’-UTR和RPS9 3’-UTR(RPL31/RPS9(UTR设计e-2))可操作地连接。
在一些实施方案中，mRNA包含本文定义的至少一个编码序列，该编码序列编码本文定义的至少一个茎HA抗原蛋白，其中该编码序列与α-珠蛋白(“muag”)3’-UTR可操作地连接。
在一些实施方案中，本发明的mRNA从5’至3’包含：
i)5’-帽1结构；
ii)衍生自HSD17B4基因的5’-UTR的5’-UTR；
iii)编码序列；
iv)衍生自PSMB3基因的3’-UTR的3’-UTR；
v)任选地，组蛋白茎环序列；以及
vi)包含约100个A核苷酸的聚(A)序列，其中RNA的3’末端核苷酸是腺苷。
根据实施方案，mRNA是经修饰的RNA，其中修饰是指包括主链修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。
经修饰的mRNA可以包含一个或多个核苷酸类似物或经修饰的核苷酸(核苷酸类似物/修饰，例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰)。如本文所用，“核苷酸类似物”或“经修饰的核苷酸”是指在核苷(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))的含氮碱基之中或之上含有一个或多个化学修饰(例如置换)和/或在骨架的一个磷酸中含有一个或多个化学修饰的核苷酸。核苷酸类似物可在核苷的糖部分(例如核糖、修饰核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)或磷酸酯中或上含有进一步的化学修饰。核苷酸和修饰的核苷酸和核苷的制备是本领域众所周知的，参见以下参考文献：美国专利号4373071、4458066、4500707、4668777、4973679、5047524、5132418、5153319、5262530、5700642。许多修饰的核苷和修饰的核苷酸是可商购的。
本发明上下文中的主链修饰是这样的修饰，其中RNA的核苷酸主链的磷酸酯被化学修饰。本发明上下文中的糖修饰是RNA核苷酸的糖的化学修饰。此外，本发明上下文中的碱基修饰是RNA的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在本文中，核苷酸类似物或修饰适当地选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
可以掺入经修饰的核苷和核苷酸并存在于mRNA分子中的修饰核碱基(化学修饰)包括：m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫尿苷)、Um(2’-O-甲基尿苷)、m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2-1-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正戊酰氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正戊酰氨甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖腺苷(磷酸盐))；I(肌苷)；mil(1-甲基肌苷)；m’lm(1,2’-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫胞苷)；ac4C(N4-乙酰胞苷)；f5C(5-甲酰胞苷)；m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2-O-甲基胞苷)；k2C(赖氨酸)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2’-O-甲基鸟苷)；m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-O-二甲基鸟苷)；m22Gm(N2,N2,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸盐))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(未修饰的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基鸟苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQo(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQi(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G*(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫尿苷)；s2Um(2-硫代-2’-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟基乙酸)；mcmo5U(尿苷5-羟基乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cnmm5Um(5-羧基甲基1氨基甲基-2-L-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；m62A(N6,N6-二甲基腺苷)；Tm(2’-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧甲基尿苷)；m6Am(N6,2’-O-二甲基腺苷)；rn62Am(N6,N6,0-2-三甲基腺苷)；m2’7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2’2’7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2’-O-甲基胞苷)；mlGm(1,2’-0-二甲基鸟苷)；m’Am(1,2-O-二甲基腺苷)亚氨基甲基尿苷)；tm5s2U(S-牛磺酸甲基-2-硫尿苷))；iniG-14(4-去甲基鸟苷)；imG2(异鸟苷)；ac6A(N6-乙酰基腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤、其7-取代衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-取代的嘌呤、7-脱氮-8-取代的嘌呤、氢(无碱基残基)、m5C、m5U、m6A、s2U、W、或2’-O-甲基-U。许多这些经修饰的核碱基及其相应的核糖核苷可从商业供应商处获得。
根据一些实施方案，本发明的mRNA包含至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，可掺入经修饰的mRNA中的核苷酸类似物/修饰选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸、2-氨基嘌呤-核苷-5’-三磷酸；2-氨基腺苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧胞苷三磷酸、2-硫胞苷-5’-三磷酸、2-硫尿苷-5’-三磷酸、2’-氟胸苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基肌苷-5’-三磷酸4-硫尿苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基脲-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸、7-脱氮腺苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸、8-叠氮腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸、或嘌呤霉素-5’-三磷酸、黄嘌呤核苷-5’-三磷酸。特别优选用于碱基修饰的核苷酸选自以下的碱基修饰的核苷酸：5-甲基胞苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、和假尿苷-5’-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、和N2、N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸盐)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸盐)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸盐)-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸盐)-尿苷、5’-O-(1-硫代磷酸盐)-假尿苷、6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。
在一些实施方案中，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在上下文中特别合适的是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷，更合适的是假尿苷(ψ)和N1-甲基假尿苷(m1ψ)，还更合适的是N1-甲基假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方案中，mRNA编码序列中基本上所有的，例如基本上100％的尿嘧啶具有化学修饰，合适的化学修饰在尿嘧啶的5-位。
在一些实施方案中，mRNA包含的化学修饰是尿苷修饰，优选其中mRNA中100％的尿苷位置被修饰。
将经修饰的核苷酸，例如将假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和/或5-甲氧基尿苷掺入到mRNA的编码序列中可能是有利的，因为不需要的先天免疫应答(在施用编码mRNA或疫苗后)可能会调整或减少(如果需要)。
在实施方案中，mRNA包含编码本文定义的至少一个抗原性蛋白质的至少一个编码序列，其中编码序列包含至少一个选自假尿苷(ψ)和N1-甲基假尿苷(m1ψ)的经修饰的核苷酸，合适地，其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换，任选地，其中所有尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)核苷酸和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)核苷酸置换。
在一些实施方案中，mRNA不包含N1-甲基假尿苷(m1Ψ)置换位置。在进一步的实施方案中，mRNA不包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷置换位置。
在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷和/或假尿苷。在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷
在实施方案中，本发明的mRNA包含仅由G、C、A和U核苷酸组成的编码序列，因此不包含经修饰的核苷酸(除了5’末端帽结构(帽0、帽1、帽2))。
mRNA可以编码一个以上的抗原。例如，编码抗原蛋白的mRNA可以仅编码抗原或可以编码另外的蛋白。
在实施方案中，mRNA可以是单顺反子、双顺反子或多顺反子。
术语“单顺反子”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指仅包含一个编码序列的核酸。术语“双顺反子”或“多顺反子”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指可以包含两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)编码序列的核酸。
在实施方案中，mRNA是单顺反子的。
在实施方案中，mRNA是单顺反子，并且mRNA的编码序列编码至少两个不同的抗原性肽或蛋白质。因此，编码序列可以编码至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和更多个抗原性肽或蛋白质，用或不用氨基酸接头序列连接，其中接头序列可以包括刚性接头、柔性接头、可切割接头或其组合。此类构建体在本文中称为“多抗原构建体”。
在实施方案中，mRNA可以是双顺反子或多顺反子，并且包含至少两个编码序列，其中如本文所述至少两个编码序列编码两个或更多个不同的抗原性肽或蛋白。因此，双顺反子或多顺反子核酸中的编码序列适当地编码本文定义的不同抗原蛋白或肽或其免疫原性片段或免疫原性变体。在一些实施方案中，双顺反子或多顺反子构建体中的编码序列可以被至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列分开。因此，术语“编码两个或更多个抗原性肽或蛋白质”可以意指，但不限于，双顺反子或多顺反子核酸编码例如病毒分离物的至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个(适当不同的)抗原性肽或蛋白质。可替代地，双顺反子或多顺反子核酸可以编码例如衍生自同一病毒的至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个(适当不同的)抗原性肽或蛋白质。在这种情况下，合适的IRES序列可以选自根据专利申请WO2017081082的SEQ ID NO:1566-1662的核酸序列列表，或者这些序列的片段或变体。在本文中，WO2017081082涉及IRES序列的公开通过引用并入本文。
应理解，在本发明的上下文中，编码序列的某些组合可以通过单顺反子、双顺反子和多顺反子RNA构建体和/或多抗原构建体的任意组合来产生，以获得编码本文定义的多个抗原性肽或蛋白质的mRNA集合。
在实施方案中，可以使用本领域已知的任何方法制备mRNA，包括化学合成，例如固相RNA合成，以及体外方法，例如RNA体外转录反应。因此，在一个实施方案中，RNA是通过RNA体外转录获得的。
因此，在实施方案中，mRNA是体外转录的RNA。
术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及其中在无细胞系统(体外)中合成RNA的过程。RNA可以通过依赖于DNA的适当DNA模板的体外转录获得，该模板可以是线性化的质粒DNA模板或PCR扩增的DNA模板。用于控制RNA体外转录的启动子可以是任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的具体实例是T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶。在本发明的一个实施方案中，在进行RNA体外转录之前，用合适的限制性酶将DNA模板线性化。
RNA体外转录所用的试剂通常包括：具有启动子序列的DNA模板(线性化质粒DNA或PCR产物)，该启动子序列与其各自的RNA聚合酶(例如噬菌体编码的RNA聚合酶(T7、T3、SP6或Syn5))具有高结合亲和力；四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的三磷酸核糖核苷酸(NTP)；任选地，本文定义的帽类似物；任选地，本文定义的进一步修饰的核苷酸；能够结合DNA模板内的启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶)；任选地，核糖核酸酶(RNase)抑制剂，以灭活任何潜在污染性的RNase；任选地，焦磷酸酶降解焦磷酸盐，以抑制RNA体外转录；MgCl2，提供Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子；用于维持合适pH值的缓冲液(TRIS或HEPES)，其还可以含有最佳浓度的抗氧化剂(例如DTT)和/或多胺，例如亚精胺，例如包含TRIS-柠檬酸盐的缓冲系统，如WO2017109161中公开的。
在实施方案中，mRNA的帽1结构是使用三核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG通过共转录加帽形成的。可用于制造本发明的编码RNA的合适的帽1类似物是m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
在其他实施方案中，mRNA的帽1结构是使用三核苷酸帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG的共转录加帽形成的。
在其他实施方案中，mRNA的帽0结构是使用帽类似物3’OMe-m7G(5’)ppp(5’)G通过共转录加帽形成的。
在实施方案中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物可以另外包含本文定义的经修饰的核苷酸。在本文中，合适的经修饰核苷酸可以选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。在实施方案中，核苷酸混合物中的尿嘧啶核苷酸被假尿苷(ψ)和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)置换(部分或完全)以获得经修饰的RNA。
在一些其他实施方案中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物不包含本文定义的经修饰的核苷酸。在实施方案中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物仅包含G、C、A和U核苷酸，以及任选地本文定义的帽类似物。
在实施方案中，用于RNA体外转录反应的核苷酸混合物(即，混合物中每个核苷酸的分数)可以针对给定的RNA序列进行优化，适当地如WO2015188933中所述。
在这种情况下，体外转录是在序列优化的核苷酸混合物和任选的帽类似物存在下进行的。
在本文中，序列优化的三磷酸核苷(NTP)混合物是用于给定序列的RNA分子(包含四种三磷酸核苷(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP)的体外转录反应的三磷酸核苷(NTP)混合物，其中序列优化的三磷酸核苷(NTP)混合物中四种三磷酸核苷(NTP)各自的分数对应于RNA分子中相应核苷酸的分数。如果RNA分子中不存在核糖核苷酸，则相应的三磷酸核苷也不存在于序列优化的三磷酸核苷(NTP)混合物中。
在必须产生一个以上本文定义的不同RNA的实施方案中，例如，必须产生2、3、4、5、6、7、8、9、10或甚至更多个不同RNA的实施方案中，可适当使用WO2017109134中所述的程序。
在基于核酸的疫苗生产中，可能需要提供GMP级核酸，例如GMP级RNA或DNA。GMP级RNA或DNA可以使用监管机构批准的制造工艺来生产。因此，在一些实施方案中，RNA生产是在现行良好生产规范(GMP)下进行，适当地根据WO2016180430在DNA和RNA水平上实施各种质量控制步骤。在实施方案中，本发明的mRNA是GMP级mRNA。因此，用于疫苗的RNA合适地为GMP级RNA。
获得的RNA产物可以使用(CureVac,Tübingen,Germany；根据WO2008077592的RP-HPLC)和/或切向流过滤(如WO2016193206中所述)和/或寡聚d(T)纯化(参见WO2016180430)进行纯化。
在一些实施方案中，通过以下纯化mRNA：使用RP-HPLC，合适地使用具有大孔苯乙烯/二乙烯基苯柱(例如，粒径30μm，孔径4000)的反相高压液相色谱(RP-HPLC)，并且另外使用具有截留分子量约为100kDa的纤维素基膜的过滤盒。
在进一步的实施方案中，将mRNA冻干(例如根据WO2016165831或WO2011069586)以产生温度稳定的干燥mRNA(粉末)。本发明的mRNA还可以使用喷雾干燥或喷雾冷冻干燥(例如根据WO2016184575或WO2016184576)来干燥，以产生本文定义的温度稳定的mRNA(粉末)。因此，在制造和纯化RNA的背景下，WO2017109161、WO2015188933、WO2016180430、WO2008077592、WO2016193206、WO2016165831、WO2011069586、WO2016184575和WO2016184576的公开通过引用并入本文。
因此，在实施方案中，mRNA是干燥的mRNA。
本文使用的术语“干燥的mRNA”应理解为已如上文定义被冻干、或喷雾干燥、或喷雾冷冻干燥以获得温度稳定的干燥mRNA(粉末)的mRNA。
在实施方案中，本发明的mRNA是纯化的mRNA。
本文使用的术语“纯化的mRNA”应理解为在某些纯化步骤(例如HPLC、TFF、寡聚d(T)纯化、沉淀步骤)之后具有比起始材料(例如体外转录的RNA)更高的纯度的RNA。纯化的RNA中基本不存在的典型杂质包括肽或蛋白质(例如，衍生自DNA依赖性RNA体外转录的酶，例如RNA聚合酶、RNA酶、焦磷酸酶、限制性内切核酸酶、DNA酶)、亚精胺、BSA、无效RNA序列、RNA片段(短双链RNA片段、无效序列等)、游离核苷酸(修饰核苷酸、常规NTP、帽类似物)、模板DNA片段、缓冲液成分(HEPES、TRIS、MgCl2)等。可能源自例如发酵过程的其它潜在杂质包括细菌杂质(生物负荷、细菌DNA)或源自纯化过程的杂质(有机溶剂等)。因此，在这方面期望“RNA纯度”尽可能接近100％。对于RNA纯度来说，还期望全长RNA转录物的量尽可能接近100％。因此，本文使用的“纯化的RNA”具有大于75％、80％、85％、非常特别地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，并且最有利地99％或更多的纯度。纯度可以例如通过分析型HPLC测定，其中上面提供的百分比对应于靶RNA的峰面积与代表副产物的所有峰的总面积之间的比率。可替代地，纯度可以例如通过分析性琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳来测定。
应理解，本文定义的“干燥的mRNA”和本文定义的“纯化的mRNA”或本文定义的“GMP级RNA”可以具有优异的稳定性特征(体外、体内)和改进的功效(例如更好的体内mRNA可翻译性)，因此特别适合医疗目的，例如疫苗。
在实施方案中，mRNA已通过RP-HPLC和/或TFF纯化以去除双链RNA、非加帽RNA和/或RNA片段。
在例如RNA体外转录过程中，作为副产物的双链RNA的形成可导致先天免疫应答的诱导，特别是IFNα，它是诱导接种受试者发热的主要因素，这当然是不期望的副作用。当前的dsRNA免疫印迹技术(例如通过斑点印迹、血清学特异性电子显微镜(SSEM)或ELISA)用于从核酸混合物中检测dsRNA种类并确定其大小。
在一些实施方案中，mRNA已通过如本文所述的RP-HPLC和/或TFF纯化以减少dsRNA的量。
在实施方案中，mRNA包含比未用RP-HPLC和/或TFF纯化的mRNA少约5％、10％或20％的双链RNA副产物。
在一些实施方案中，RP-HPLC和/或TFF纯化的mRNA包含比已经用寡聚dT纯化、沉淀、过滤和/或AEX纯化的RNA少约5％、10％或20％的双链RNA副产物。
在实施方案中，组合物的mRNA具有范围从约40％至约100％的RNA完整性。
术语“RNA完整性”通常描述组合物中是否存在完整的RNA序列。低RNA完整性可能是由于RNA降解、RNA切割、不正确或不完全的RNA化学合成、不正确的碱基配对、经修饰的核苷酸的整合或已经整合的核苷酸的修饰、缺乏加帽或不完全加帽、缺乏聚腺苷酸化或不完全聚腺苷酸化、或不完全的RNA体外转录。RNA是一种容易降解的脆弱分子，这可能是由以下原因引起的：温度、核糖核酸酶、pH或其他因素(例如亲核攻击、水解等)可能会降低RNA的完整性，从而降低RNA的功能性。
技术人员可以从多种不同的色谱或电泳方法中进行选择来确定RNA完整性。色谱法和电泳法是本领域众所周知的。如果使用色谱法(例如RP-HPLC)，RNA完整性的分析可以基于确定相应色谱图中全长RNA的峰面积(或“峰下面积”)。峰面积可以通过评估检测器系统的信号的任何合适的软件来确定。确定峰面积的过程也称为积分。代表全长RNA的峰面积通常根据相应样品中总RNA的峰面积来设置。RNA完整性可以用％RNA完整性来表示。
在本发明各方面的上下文中，可以使用分析型(RP)HPLC来确定RNA完整性。通常，可以用去污剂(例如约2％Triton X100)处理包含包封RNA的基于脂质的载体的组合物的测试样品，以解离基于脂质的载体并释放包封的RNA。基本上根据制造商的说明，可以使用合适的结合化合物，例如Agencourt AMPure XP珠(Beckman Coulter，Brea，CA，USA)捕获释放的RNA。制备RNA样品后，可以进行分析(RP)HPLC以确定RNA的完整性。通常，为了确定RNA的完整性，可以使用例如注射用水(WFI)将RNA样品稀释至0.1g/l的浓度。约10μl稀释的RNA样品可注入HPLC柱(例如整体聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质)。分析型(RP)HPLC可以使用标准条件进行，例如：梯度1：缓冲液A(0.1M TEAA(pH 7.0))；缓冲液B(0.1M TEAA(pH 7.0)，含有25％乙腈)。从30％缓冲液B开始，梯度在2分钟内延伸至32％缓冲液B，然后在15分钟内以1ml/min的流速延伸至55％缓冲液B。HPLC色谱图通常在260nm波长下记录。可以使用软件评估所获得的色谱图，并且可以如本领域公知的以百分比(％)确定相对峰面积。相对峰面积表示具有100％RNA完整性的RNA量。由于注入HPLC的RNA量通常已知，因此相对峰面积的分析可提供有关RNA完整性的信息。因此，如果总共注射了例如100ng RNA，并且100ng被确定为相对峰面积，则RNA完整性将为100％。例如，如果相对峰面积对应于80ng，则RNA完整性将为80％。因此，本发明上下文中的RNA完整性使用分析型HPLC、合适地分析型RP-HPLC来测定。
在实施方案中，组合物的mRNA具有范围从约40％至约100％的RNA完整性。在实施方案中，mRNA具有范围从约50％至约100％的RNA完整性。在实施方案中，mRNA具有范围从约60％至约100％的RNA完整性。在实施方案中，mRNA具有范围从约70％至约100％的RNA完整性。在实施方案中，mRNA完整性为例如约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。RNA完整性适当地使用分析型HPLC、适当地分析型RP-HPLC来测定。
在实施方案中，组合物的RNA具有至少约50％、合适地至少约60％、更合适地至少约70％、最合适地至少约80％或约90％的RNA完整性。RNA完整性适当地使用分析型HPLC、更适当地分析型RP-HPLC来测定。
在如本文所定义的共转录加帽之后，并且在本文定义的纯化之后，可以使用如公开的PCT申请WO2015101416中所述的加帽试验来确定获得的RNA的加帽程度，特别地，可以使用如公开的PCT申请WO2015101416的权利要求27至46中所述的加帽试验。可替代地，可以使用PCT/EP2018/08667中描述的加帽测定法。
在实施方案中，用于进行RNA体外转录的自动化装置可用于产生和纯化本发明的mRNA。这种装置还可用于生产组合物或疫苗(如下文进一步详细描述的)。在一些实施方案中，可以适当地使用如WO2020002598中描述的装置，具体地，如WO2020002598的权利要求1至59和/或68至76(以及图1-18)中描述的装置。
本文描述的方法可以应用于生产免疫原性组合物或疫苗的方法，如下文进一步详细描述的。
在各种实施方案中，mRNA适当地在5’-至3’-方向上包含以下元件：
A)5’-帽结构，适当地如本文所述；
B)5’-末端起始元件，适当地如本文所述；
C)任选地，5’-UTR，适当地如本文所述；
D)核糖体结合位点，适当地如本文所述；
E)至少一个编码序列，适当地如本文所述；
F)3’-UTR，适当地如本文所述；
G)任选地，聚(A)序列，适当地如本文所述；
H)任选地，聚(C)序列，适当地如本文所述；
I)任选地，组蛋白茎环，适当地如本文所述；
J)任选地，3’-末端序列元件，适当地如本文所述。
根据一些实施方案，mRNA可以是非复制的。
在一些实施方案中，mRNA不包含复制酶元件(例如编码复制酶的核酸)。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:18至21中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:24至29中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
根据一些其他实施方案，mRNA是复制的，也称为自我扩增(SAM)。自我扩增mRNA分子可以是甲病毒衍生的mRNA复制子。mRNA扩增还可以通过提供编码抗原的非复制mRNA与单独的编码复制机制的mRNA来实现。
自我复制的RNA分子在本领域是众所周知的，并且可以通过使用来源于例如甲病毒的复制元件，并用编码目的蛋白质的核苷酸序列置换结构病毒蛋白质来产生。自我复制的RNA分子通常是a+-链分子，其在递送至细胞后可以直接翻译，并且该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，然后该酶从递送的RNA产生反义和有义转录物。因此，递送的RNA导致多个子RNA的产生。这些子体RNA以及共线亚基因组转录物可以自身翻译以提供编码抗原的原位表达，或者可以被转录以提供与递送的RNA具有相同意义的进一步转录物，其被翻译以提供抗原的原位表达。该转录序列的总体结果是引入的复制子RNA数量的巨大扩增，因此编码的抗原成为细胞的主要多肽产物。
合适的甲病毒复制子可以使用来自辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可以使用突变体或野生型病毒序列，例如VEEV的减毒TC83突变体已经用于复制子中，参见以下参考文献：WO2005/113782。
在某些实施方案中，本文所述的自我复制RNA分子编码(i)可以从自我复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)抗原，例如流感HA茎多肽。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如包含一种或多种甲病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4(其中nsP代表非结构蛋白)。
尽管天然甲病毒基因组除了编码非结构复制酶多蛋白之外还编码结构病毒粒子蛋白，但自我复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，自我复制的RNA可以导致细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不会产生含有RNA的病毒粒子。无法产生这些病毒颗粒意旨，与野生型甲病毒不同，自我复制的RNA分子无法以传染性形式永久存在。在野生型病毒中永久存在所必需的甲病毒结构蛋白不存在于本发明的自我复制RNA中，它们的位置被编码目的免疫原的一个或多个基因所置换，使得亚基因组转录物编码免疫原，而不是甲病毒结构病毒体蛋白。
因此，可用于本发明的自我复制RNA分子可以具有两个开放阅读框。第一(5’)开放阅读框编码复制酶，适当地是甲病毒复制酶；第二(3’)开放阅读框编码抗原，例如流感HA茎多肽。在一些实施方案中，RNA可以具有另外的(例如下游)开放阅读框，例如编码另外的抗原或编码另外的多肽。在一些实施方案中，RNA分子包含三个开放阅读框，第一开放阅读框编码甲病毒复制酶，第二开放阅读框编码流感HA茎多肽，及第三开放阅读框编码蛋白质纳米颗粒。
在某些实施方案中，本文公开的自我复制RNA分子具有5’帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强RNA的体内翻译。在一些实施方案中，必须选择自我复制RNA分子的5’序列以确保与编码的复制酶的相容性。
自我复制的RNA分子可能具有3’聚(A)尾。它还可以在其3’末端附近包括聚A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。
自我复制的RNA分子可以有不同的长度，但它们通常为5000-25000个核苷酸长。自我复制的RNA分子通常是单链的。单链RNA通常可以通过结合TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR来启动佐剂作用。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可以与TLR3结合，并且该受体也可以由dsRNA触发，该dsRNA在单链RNA复制过程中或在单链RNA的二级结构中形成。
在另一个实施方案中，自我复制的RNA可以包含两个单独的RNA分子，每个包含衍生自甲病毒的核苷酸序列：一个RNA分子包含用于表达甲病毒复制酶的RNA构建体，并且一个RNA分子包含可被复制酶反式复制的RNA复制子。用于表达甲病毒复制酶的RNA构建体包含5’-帽。参见WO2017/162265。
自我复制RNA可以通过体外转录(IVT)方便地制备。IVT可以使用在细菌中以质粒形式产生和繁殖的或合成产生的(cDNA)模板(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程化方法)。例如，DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6 RNA聚合酶)可用于从DNA模板转录自我复制RNA。可以根据需要使用适当的加帽和聚腺苷酸添加反应(尽管复制子的聚腺苷酸通常编码在DNA模板内)。这些RNA聚合酶对转录的5’核苷酸有严格的要求，在一些实施方案中，这些要求必须与编码的复制酶的要求相匹配，以确保IVT转录的RNA能有效地作为其自身编码的复制酶的底物。
自我复制RNA可以包括(除了任何5’帽结构之外)一个或多个具有经修饰的核碱基的核苷酸。本发明所使用的RNA理想地仅包括核苷之间的磷酸二酯键，但在一些实施方案中，它可以含有氨基磷酸酯和/或甲基膦酸酯键。
自我复制的RNA分子可以编码单个异源多肽抗原(即抗原)，或者任选地，两个或更多个异源多肽抗原以这样的方式连接在一起，即当表达为氨基酸序列时，每个序列保持其同一性(例如，串联)。从自我复制RNA产生的异源多肽然后可以作为融合多肽产生，或者以产生单独的多肽或肽序列的方式进行工程化。
本文所述的自我复制RNA分子可经工程化以表达来自两个或多个开放阅读框的多个核苷酸序列，从而允许蛋白质(例如一个、两个或多个抗原(例如一个、两个或多个茎蛋白))与细胞因子或其他免疫调节剂一起共表达，这可增强免疫应答的产生。这种自我复制的RNA分子可能特别有用，例如，同时生产各种基因产物(例如蛋白质)，例如作为二价或多价疫苗。
如果需要，可以使用本领域技术人员已知的各种体外或体内测试方法来筛选或分析自我复制RNA分子，以确认其治疗和预防特性。例如，可以测试包含自我复制RNA分子的疫苗对目的特定淋巴细胞类型(例如B细胞、T细胞、T细胞系和T细胞克隆)的增殖诱导或效应子功能的影响。例如，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞，并且细胞毒性T淋巴细胞具有裂解自体靶细胞的能力，其含有编码抗原的自我复制RNA分子。此外，辅助性T细胞分化可以通过ELISA测量TH1(IL-2和IFN-γ)和/或TH2(IL-4和IL-5)细胞因子的增殖或产生来分析，或者直接在CD4+ T细胞中通过细胞质细胞因子染色和流式细胞术来分析。
也可以测试编码抗原的自我复制RNA分子诱导体液免疫应答的能力，例如通过诱导B细胞产生对目的抗原特异的抗体来证明。这些测定可以使用例如来自免疫个体的外周B淋巴细胞进行。此类测定方法是本领域技术人员已知的。可用于表征自我复制RNA分子的其他测定可涉及检测靶细胞编码抗原的表达。例如，FACS可用于检测细胞表面或细胞内的抗原表达。FACS选择的另一个优点是可以对不同水平的表达进行分类；有时可能需要较低的表达。用于鉴定表达特定抗原的细胞的其它合适方法包括在板上使用单克隆抗体进行淘选或使用包被有单克隆抗体的磁珠进行捕获。
在一个实施方案中，mRNA具有5’帽-5’UTR-非结构蛋白(NSP)1-4-信号肽-流感HA茎多肽-接头-蛋白质纳米颗粒-3’UTR-聚A构型。
非复制mRNA通常含有10000个碱基或更少，特别是8000个碱基或更少，特别是5000个碱基或更少，特别是2500个碱基或更少。复制mRNA通常包含25000个碱基或更少，特别是20000个碱基或更少，特别是15000个碱基或更少。
单剂量的mRNA可以是0.001至1000ug、0.01至1000ug、特别是1至500ug、特别是10至250ug的总mRNA。mRNA的单剂量可以是0.01至1ug，特别是0.05至0.5ug，特别是约0.1ug。mRNA的单剂量可以是0.1至10ug，特别是0.5至5ug，特别是约1ug。mRNA的单剂量可以是1至20ug，特别是5至15ug，特别是约10ug。
在一个实施方式中，mRNA是非复制mRNA。在第二个实施方案中，mRNA是复制mRNA。
载体
已经描述了一系列载体系统，其包封或复合mRNA以便与未包封或复合的mRNA相比促进mRNA递送和随后的编码抗原的表达。本发明可以利用任何合适的载体系统。值得注意的特定载体系统在以下进一步描述。
在实施方案中，本发明的mRNA与一种或多种脂质(例如阳离子脂质和/或中性脂质)复合、包封、部分包封或缔合，从而形成基于脂质的载体，例如脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物(lipoplex)，和/或纳米脂质体，合适地脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA单独配制(在本文定义的任何制剂或络合剂中)，适当地其中两个或更多个mRNA配制在单独的脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体中。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA被共同配制(在本文定义的任何制剂或络合剂中)，适当地其中两个或更多个mRNA配制在单独的脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体中。
LNP
术语“脂质纳米颗粒”，也称为“LNP”，不限于任何特定的形态，并且包括当阳离子脂质和任选的一种或多种其它脂质结合时产生的任何形态，例如在水性环境中和/或在核酸(例如RNA)的存在下。例如，脂质体、脂质复合物、阳离子脂质体-DNA复合物等都在脂质纳米颗粒(LNP)的范围内。
脂质纳米颗粒(LNP)是mRNA可以被包封在其中的非病毒颗粒脂质体颗粒。将核酸掺入LNP在本文中也称为“包封”，其中核酸例如RNA完全包含在脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体的内部空间内。
LNP递送系统及其制备方法是本领域已知的。
颗粒可以包括一些外部mRNA(例如在颗粒的表面上)，但期望至少一半的RNA(并且合适地至少85％，尤其是至少95％，例如全部)被包封。
LNP适当地表征为具有通过一层或多层双层膜与外部介质隔离的内部水空间的微观囊泡。LNP的双层膜通常由两亲分子(例如合成或天然来源的脂质)形成，其包含空间分离的亲水和疏水结构域。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物体、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，LNP通常用于将mRNA转运至靶组织。
因此，在实施方案中，本发明的mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物，合适地LNP。在一些实施方案中，LNP适合于肌内和/或皮内施用。
在实施方案中，至少约80％、85％、90％、95％的基于脂质的载体(适当地LNP)具有球形形态，适当地包含实心核心或部分实心核心。
LNP通常包含阳离子脂质和一种或多种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合脂质(例如聚乙二醇化脂质)的赋形剂。mRNA可以包封在LNP的脂质部分中或被LNP的一些或全部脂质部分包封的水性空间中。mRNA或其部分也可与LNP缔合并复合。LNP可包含能够形成核酸附着的颗粒或其中包封一种或多种核酸的任何脂质。在一些实施方案中，包含LNP的核酸包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
LNP可以例如由(i)PEG修饰的脂质(ii)非阳离子脂质(iii)甾醇(iv)可电离阳离子脂质的混合物形成。可替代地，LNP可以例如由(i)PEG修饰的脂质(ii)非阳离子脂质(iii)甾醇(iv)不可电离阳离子脂质的混合物形成。
在一些实施方案中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)包含
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，合适地是胆固醇；以及
(iv)至少一种聚合物缀合脂质，合适地是PEG-脂质；
其中，(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％甾醇和0.5-15％聚合物缀合脂质。
LNP的体内特征和行为可以通过在LNP表面添加亲水性聚合物包衣，例如聚乙二醇(PEG)来改变，以赋予空间稳定性。此外，LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)可通过将配体(例如抗体、肽和碳水化合物)连接到其表面或附接的PEG链的末端(例如通过聚乙二醇化脂质或聚乙二醇化胆固醇)来用于特异性靶向。
在一些实施方案中，LNP包含聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物缀合脂质的实例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。PEG化脂质是本领域已知的，并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。
如本文所定义的聚合物缀合脂质，例如PEG-脂质，可以用作减少聚集的脂质。
在某些实施方案中，LNP包含稳定脂质，其是聚乙二醇脂质(PEG化脂质)。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方案中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一些实施例中，聚乙二醇脂质是PEG-2000-DMG。在一种实施方式中，聚乙二醇脂质是PEG-c-DOMG)。在其他实施例中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)、例如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)、或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在实施方案中，聚乙二醇化脂质适当地衍生自公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IV)。因此，衍生自公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IV)的聚乙二醇化脂质以及与其相关的相应公开通过引用并入本文。
在一些实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成LNP，其中LNP包含聚合物缀合的脂质，合适地聚乙二醇化的脂质，其中PEG脂质合适地衍生自公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IVa)。因此，公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式(IVa)衍生的聚乙二醇化脂质及其相关的相应公开通过引用并入本文。
在一个实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒，其中LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)包含聚合物缀合的脂质，适当地聚乙二醇化脂质/PEG脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质或聚乙二醇化脂质具有式(IVa)：
其中n具有30至60范围内的平均值，例如约30±2、32±2、34±2、36±2、38±2、40±2、42±2、44±2、46±2、48±2、50±2、52±2、54±2、56±2、58±2或60±2。在一个实施方案中，n为约49。在另一个实施方案中，n为约45。在进一步的实施方案中，PEG脂质具有式(IVa)，其中n是选择的整数，使得PEG脂质的平均分子量为约2000g/mol至约3000g/mol或约2300g/mol至约2700g/mol，适当地约2500g/mol。
适用于本文的式IVa的脂质具有化学术语2[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺，也称为ALC-0159。
在US20150376115A1和WO2015199952中提供了适合该上下文的PEG-脂质的进一步实例，其各自通过引用以其整体并入。
PEG修饰的脂质可以包含分子量为10000Da或更小、特别是5000Da或更小、特别是3000Da、例如2000Da或更小的PEG分子。PEG修饰的脂质的实例包括PEG-二硬脂酰甘油、PEG-二棕榈酰甘油和PEG-二肉豆蔻酰甘油。PEG修饰的脂质通常以约0.5至15摩尔％存在。
在一些实施方案中，LNP包括基于LNP中脂质的总摩尔数小于约3、2或1摩尔％的PEG或PEG修饰的脂质。在进一步的实施方案中，LNP包含以摩尔计约0.1％至约20％的PEG修饰的脂质，例如，以摩尔计约0.5至约10％、约0.5至约5％、约10％、约5％、约3.5％、约3％、约2.5％、约2％、约1.5％、约1％、约0.5％或约0.3％(基于LNP中脂质的总摩尔数为100％)。在实施方案中，LNP包含以摩尔计约1.0％至约2.0％的PEG修饰的脂质，例如，约1.2至约1.9％、约1.2至约1.8％、约1.3至约1.8％、约1.4至约1.8％、约1.5至约1.8％、约1.6至约1.8％，特别是约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％，最合适地1.7％(基于LNP中脂质的总摩尔数为100％)。在各种实施方案中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比范围为约100:1至约25:1。
在实施方案中，LNP包含一种或多种另外的脂质，其在其配制期间或在制备过程期间稳定颗粒的形成(例如中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物)。
在实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒，其中LNP包含一种或多种中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物。
合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
非阳离子脂质可以是中性脂质，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和鞘磷脂(SM)。非阳离子脂质通常以约5至25摩尔％存在。
在实施方案中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)包含一种或多种中性脂质，其中中性脂质选自：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)、和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)、或其混合物。
在一些实施方案中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各种实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比范围为约2:1至约8:1。
在实施方案中，中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。合适地，阳离子脂质与DSPC的摩尔比可以在约2:1至约8:1的范围内。
在实施方案中，类固醇是胆固醇。合适地，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比可以在约2:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，胆固醇可以是聚乙二醇化的。
甾醇可以是胆固醇。甾醇通常以约25至55摩尔％存在。
甾醇可以是脂质颗粒的约10摩尔％至约60摩尔％或约25摩尔％至约40摩尔％。在一个实施方式中，甾醇占脂质颗粒中存在的总脂质的约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或约60摩尔％。在另一个实施方案中，LNP包括基于摩尔的约5％至约50％的甾醇，例如基于摩尔的约15％至约45％、约20％至约40％、约48％、约40％、约38.5％、约35％、约34.4％、约31.5％或约31％(基于脂质纳米颗粒中脂质的总摩尔数为100％)。
LNP的阳离子脂质可以是可阳离子化的，即，当pH值降低至脂质的可电离基团的pK以下时，它会质子化，但在较高的pH值下逐渐变得更加中性。当pH值低于pK时，脂质能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方案中，阳离子脂质包含在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质。一系列合适的可电离阳离子脂质是本领域已知的，其通常以约20至60摩尔％存在。
此类脂质(对于脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物、和/或纳米脂质体)包括但不限于DSDMA、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基三甲基丙烷氯化铵(DOTAP)(也称为N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵和1,2-二油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯化盐)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、ckk-E12、ckk、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、98N12-5、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、ICE(基于咪唑基)、HGT5000、HGT5001、DMDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)HGT4003、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺))、1,1’-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N,N 16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、(市售阳离子脂质体，包含DOTMA和1,2-二油酰-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE)、来自GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y.)；(市售阳离子脂质体，包含N-(1-(2,3二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和(可商购的包含乙醇中的双十八烷基酰胺甘氨酰羧基精胺(DOGS)的阳离子脂质，来自Promega Corp.，Madison，WI)或任何上述物质的任意组合。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括国际专利公开WO2010053572(并且特别是第[00225]段中描述的CI 2-200)和WO2012170930(两者均通过引用并入本文)中描述的那些、HGT4003、HGT5000、HGTS001、HGT5001、HGT5002(参见US20150140070A1)。
在实施方案中，脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体的阳离子脂质可以是氨基脂质。
代表性的氨基脂质包括但不限于1,2-二亚麻基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚麻基氧基-3吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基氧基-3二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在实施方案中，脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体的阳离子脂质可以是氨基醇类脂质。
氨基醇类脂质可以通过美国专利号8,450,298中描述的方法来制备，其通过引用以其整体并入本文。合适的(可电离的)脂质还可以是如表1、2和3中公开的以及如WO2017075531A1的权利要求1-24中所限定的化合物，其通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，合适的脂质也可以是WO2015074085A1中公开的化合物(即ATX-001至ATX-032或权利要求1-26中指定的化合物)、美国申请号61/905,724和15/614,499或美国专利号9,593,077和9,567,296中公开的化合物，其通过引用以其整体并入本文。
在其他实施方案中，合适的阳离子脂质还可以是如WO2017117530A1中公开的化合物(即脂质13、14、15、16、17、18、19、20或根据权利要求中指定的化合物)，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，可电离的或阳离子的脂质也可以选自WO2018078053A1中公开的脂质(即衍生自WO2018078053A1的式I、II和III的脂质，或WO2018078053A1的权利要求1至12中指定的脂质)，WO2018078053A1的公开通过引用以其整体并入本文。在这种情况下，WO2018078053A1的表7中公开的脂质(例如衍生自式I-1至I-41的脂质)和WO2018078053A1的表8中公开的脂质(例如衍生自式II-1至II-36的脂质)可以合适地是在本发明的上下文中使用。因此，WO2018078053A1的式I-1至式I-41和式II-1至式II-36以及与其相关的具体公开通过引用并入本文。
在一些实施方案中，阳离子脂质可衍生自公开的PCT专利申请WO2018078053A1的式III。因此，WO2018078053A1的式III以及与其相关的具体公开通过引用并入本文。
在一些实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)，其中LNP的阳离子脂质选自公开的PCT专利申请WO2018078053A1的表9的结构III-1至III-36。因此，WO2018078053A1的式III-1至III-36以及与其相关的具体公开通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有式III：
/>
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，
其中：
L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有式III：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，
其中：
L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基；
G3是C1-C24亚烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基；
R3是OR5；以及
R5是H。
在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有下式：
在一些实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质体、脂质纳米粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体，合适地为LNP，其中脂质体、脂质纳米粒(LNP)、阳离子脂质体-DNA复合物和/或纳米脂质体，合适地为LNP包含根据式III-3的阳离子脂质：
适用于本文的式III-3的脂质具有化学术语(((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)，也称为ALC-0315，即CAS号2036272-55-4。
在某些实施方案中，本文定义的阳离子脂质，更合适地阳离子脂质化合物III-3((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))，相对于LNP的总脂质含量，以约30摩尔％至约80摩尔％，合适地约30摩尔％至约60摩尔％，更合适地约40摩尔％至约55摩尔％，更合适地约47.4摩尔％的量存在于LNP中。如果LNP中掺入了一种以上的阳离子脂质，则此类百分比适用于组合的阳离子脂质。
在一些实施方案中，LNP包含具有以下结构的阳离子脂质：
在实施方案中，阳离子脂质以约30摩尔％至约70摩尔％的量存在于LNP中。在一个实施方案中，LNP中存在的阳离子脂质的量为约40摩尔％至约60摩尔％，例如约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50分别为51、52、53、54、55、56、57、58、59或60摩尔％。在实施方案中，阳离子脂质在LNP中的存在量分别为约47摩尔％至约48摩尔％，例如约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9、50.0摩尔％，其中47.4摩尔％是特别合适的。
在一些实施方案中，阳离子脂质以LNP中存在的总脂质的约20摩尔％至约70摩尔％或75摩尔％或约45摩尔％至约65摩尔％或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或约70摩尔％的比例存在。在进一步的实施方案中，LNPs包含以摩尔计约25％至约75％的阳离子脂质，例如，以摩尔计约20％至约70％、约35％至约65％、约45％至约65％、约60％、约57.5％、约57.1％、约50％或约40％(基于脂质纳米颗粒中脂质的总摩尔数为100％)。在一些实施方案中，阳离子脂质与核酸(例如编码RNA或DNA)的比率为约3至约15，例如约5至约13或约7至约11。
其他合适的(阳离子或可电离的)脂质公开于WO2009086558、WO2009127060、WO2010048536、WO2010054406、WO2010088537、WO2010129709、WO2011153493、WO2013063468、US20110256175、US20120128760、US20120027803、US8158601、WO2016118724、WO2016118725、WO2017070613、WO2017070620、WO2017099823、WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2008103276、WO2013086373、WO2013086354、美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333、8,466,122和8,569,256和美国专利公开号US20100036115、US20120202871、US20130064894、US20130129785、US20130150625、US20130178541、US20130225836和US20140039032和WO2017112865。在这种情况下，WO2009086558、WO2009127060、WO2010048536、WO2010054406、WO2010088537、WO2010129709、WO2011153493、WO 2013063468、US20110256175、US20120128760、US20120027803、US8158601、WO2016118724、WO2016118725、WO2017070613、WO2017070620、WO2017099823、WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865、WO2008103276、WO2013086373、WO2013086354、美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333、8,466,122和8,569,256和美国专利公开号US20100036115、US20120202871、US20130064894、US20130129785、US20130150625、US20130178541、US20130225836和US20140039032和WO2017112865中特别涉及适用于LNP的(阳离子)脂质(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)的公开通过引入并入本文。
在其他实施方案中，阳离子或可电离脂质是
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在实施方案中，本文定义的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，使得脂质在等于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH(合适地等于或高于生理pH)下为中性。当然，可以理解的是，作为pH值的函数，质子的添加或去除是一个平衡过程，提到的带电或中性脂质是指主要种类的性质，并不要求所有的脂质都必须以带电或中性形式存在。不排除具有多于一个可质子化基团或可去质子化基团的脂质，或者是两性离子的脂质，并且同样可以适合于本发明的上下文。在一些实施方案中，可质子化脂质具有在约4至约11范围内的可质子化基团的pKa，例如约5至约7的pKa。
LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)可以包含两种或更多种(不同的)如本文所定义的阳离子脂质。可选择的阳离子脂质有助于不同的有利特性。例如，LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)中可以使用具有不同性质(如胺pKa、化学稳定性、循环半衰期、组织半衰期、组织中净积累或毒性)的阳离子脂质。特别地，可以选择阳离子脂质，使得混合LNP的性质比单独脂质的单一LNP的性质更理想。
可以考虑核酸货物的量来选择永久阳离子脂质或类脂质的量。在一个实施方案中，选择这些量以使得纳米颗粒或组合物的N/P比在约0.1至约20的范围内，或
(i)使得达到N/P比在约1至约20、合适地约2至约15、更合适地约3至约10、甚至更合适地约4至约9的范围内，最合适地适当地约6的量；
(ii)使得达到N/P比在约5至约20、更合适地约10至约18、甚至更合适地约12至约16的范围内、最合适地约14的量；
(iii)使得达到脂质：mRNA重量比在20至60，适当地为约3至约15、5至约13、约4至约8或约7至约11的范围内的量；或者
(iv)对于根据本发明的脂质纳米颗粒，尤其是包含阳离子脂质III-3的脂质纳米颗粒，使得达到N/P比在约6的范围内的量。
在本文中，N/P比定义为脂质或类脂质的碱性含氮基团的氮原子(“N”)与用作货物的核酸的磷酸基团(“P”)的摩尔比。N/P比可以基于例如1μgRNA通常含有约3nmol磷酸残基来计算，前提是RNA表现出碱基的统计分布。阳离子脂质或类脂质的“N”值可以基于其分子量和永久阳离子基团和可阳离子化基团(如果存在)的相对含量来计算。如果存在多于一种阳离子脂质，则N值应基于脂质纳米颗粒中包含的所有阳离子脂质来计算。
在一种实施方式中，脂质纳米颗粒包含约40％阳离子脂质LKY750、约10％两性离子脂质DSPC、约48％胆固醇和约2％聚乙二醇化脂质DMG(w/w)。
在一些实施方案中，脂质LNP包含：
(a)本发明的mRNA，(b)阳离子脂质，(c)聚集减少剂(如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG修饰的脂质)，(d)任选的非阳离子脂质(如中性脂质)，和(e)任选地甾醇。
在一些实施方案中，阳离子脂质(如上文所定义)、非阳离子脂质(如上文所定义)、胆固醇(如上文所定义)和/或PEG修饰的脂质(如上文所定义)可以以各种相对摩尔比组合。例如，阳离子脂质与非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质与聚乙二醇化脂质的比例可以分别在约30-60:20-35:20-30:1-15之间，或者以大约40:30:25:5、50:25:20:5、50:27:20:3、40:30:20:10、40:32:20:8、40:32:25:3或40:33:25:2的比例，或者以大约50:25:20:5、50:20:25:5、50:27:20:340:30:20:10,40:30:25:5或40:32:20:8、40:32:25:3或40:33:25:2的比例。
在一些实施方案中，LNP(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)包含脂质化合物II(ALC-0315)、本发明的mRNA、中性脂质(其为DSPC)、类固醇(其为胆固醇)和聚乙二醇化脂质(其为式(I ALC-0159)的化合物)。
在一个实施方案中，LNP基本上由以下组成：(i)至少一种阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)甾醇，例如，胆固醇；以及(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，摩尔比为约20-60％的阳离子脂质:5-25％中性脂质:25-55％甾醇；0.5-15％PEG-脂质。
在一些实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒，其中LNP包含
(i)至少一种如本文所定义的阳离子脂质，合适地是式III-3的脂质(ALC-0315)；
(ii)至少一种如本文所定义的中性脂质，合适地是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种如本文所定义的类固醇或类固醇类似物，合适地是胆固醇；以及
(iv)至少一种聚合物缀合的脂质，合适地是本文定义的PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，合适地是式(I ALC-0159)或衍生自式(IALC-0159)的聚乙二醇化脂质。
在一些实施方案中，mRNA与一种或多种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP包含摩尔比为以下的(i)至(iv)：约20-60％阳离子脂质:5-25％中性脂质:25-55％甾醇；0.5-15％聚合物缀合脂质，合适的是PEG-脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒(或脂质体、纳米脂质体、阳离子脂质体-DNA复合物)包含：具有式(III-3)的阳离子脂质和/或具有式(IVa)的PEG脂质，任选地中性脂质，合适地1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和任选地类固醇，合适地胆固醇，其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比任选地在约2:1至8:1的范围内，其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比任选地在约2:1至1:1的范围内。
在实施方案中，组合物包含mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)，其摩尔比为约50:10:38.5:1.5、合适地47.5:10:40.8:1.7或更合适地47.4:10:40.9:1.7(即，阳离子脂质(合适地式III-3(ALC-0315)的脂质)、DSPC、胆固醇和聚合物缀合脂质、合适地PEG-脂质(合适地具有n＝49的式(I)的PEG-脂质)，甚至更合适地具有n＝45的式(I)的PEG-脂质；ALC-0159)；溶于乙醇的比例(摩尔％))。
RNA与脂质的比例可以变化(参见例如WO2013/006825)。在一些实施方案中，“N:P比”是指阳离子脂质中的可质子化氮原子(通常仅在脂质的头基中)与RNA中的磷酸根的摩尔比。核苷酸(N)与磷脂(P)的比例可以在例如1N:1P至20N:1P、1N:1P至10N:1P、2N:1P至8N:1P、2N:1P至6N:1P或3N:1P至5N:1P的范围内。核苷酸(N)与磷脂(P)的比例可以在例如1N:1P、2N:1P、3N:1P、4N:1P、5N:1P、6N:1P、7N:1P、8N:1P、9N:1P或10N:1P的范围内。可替代地地或另外地，核苷酸(N)与磷脂(P)的比例是4N:1P。
WO2017/070620提供了关于LNP组合物的一般信息，并且通过引用并入本文。其他有用的LNP在以下参考文献中进行了描述：WO2012/006376；WO2012/030901；WO2012/031046；WO2012/031043；WO2012/006378；WO2011/076807；WO2013/033563；WO2013/006825；WO2014/136086；WO2015/095340；WO2015/095346；WO2016/037053，其也通过引用并入本文。
在各种实施方案中，合适地包封本发明mRNA的平均直径为约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、或200nm的LNP基本上是无毒的。如本文所用，平均直径可以由如本领域众所周知的动态光散射测定的z平均尺寸来表示。
LNP的直径通常为50至200nm(Z平均)。合适地，LNP具有0.4或更小的多分散性，例如0.3或更小。通常，PDI通过动态光散射来确定。
在一些实施方案中，组合物的多分散指数(PDI)值小于约0.4，合适地小于约0.3，更合适地小于约0.2，最合适地小于约0.1。
在一个实施例中，载体是脂质纳米颗粒(LNP)。
CNE
载体可以是阳离子纳米乳液(CNE)递送系统。这种阳离子水包油乳液可用于将mRNA递送至细胞内部。乳剂颗粒包含疏水油核和阳离子脂质，后者可以与mRNA相互作用，从而将其锚定到乳剂颗粒上。在CNE递送系统中，编码抗原的mRNA与阳离子水包油乳液颗粒复合。CNE载体及其制备方法描述于WO2012/006380、WO2013/006837和WO2013/006834中，其通过引用并入本文。
因此，mRNA可以与阳离子水包油乳液的颗粒复合。颗粒通常包含在25℃下处于液相的油核(例如植物油或角鲨烯)、阳离子脂质(例如磷脂)和任选的表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨醇酯80)；还可以包括聚乙二醇。可替代地或另外地，CNE包含角鲨烯和阳离子脂质，例如1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)(参见例如Brito，2014)。在一个实施方案中，CNE是用聚山梨醇酯80和/或脱水山梨糖醇三油酸酯稳定的DOTAP和角鲨烯的水包油乳液。
期望地，至少一半的RNA(并且适当地至少85％，例如全部)与阳离子水包油乳液载体复合。
CNE的直径通常为50至200um(Z平均)。合适地，CNE具有0.4或更小的多分散性，例如0.3或更小。
在一个实施方案中，载体是阳离子纳米乳液(CNE)。
LION
类脂质包被的氧化铁纳米颗粒(LION)能够将mRNA递送到细胞中，并且在施用给受试者后可以通过施加外部磁场来辅助。LION是具有一个或多个包含脂质和/或类脂质的包衣的氧化铁颗粒，其中编码抗原的mRNA通过静电相互作用掺入脂质和/或类脂质包衣中或与脂质和/或类脂质包衣缔合。嵌入包衣内的mRNA可提供免受酶促降解的保护。LION中包含的脂质和/或类脂质可以例如包括Jiang,2013的图S1中包含的那些，特别是包含长度为12至14个碳的烷基尾的类脂质，特别是Jiang,2013中公开的类脂质C14-200。LION通常可包含200至5000个，例如500至2000个，特别是约1000至约1000个脂质和/或类脂质分子。典型地，LION的直径为20至200nm，尤其是直径为50至100nm。脂质/类脂质与mRNA的重量比可以是约1∶1至10∶1，特别是约5∶1。特别合适的LION和制备LION的方法在Jiang,2013中公开。
在一个实施方案中，载体是脂质包被的氧化铁纳米颗粒(LION)。
测定
靶向头部区域的疫苗的体外功效可以通过研究疫苗是否阻止流感病毒与靶细胞结合的试验来确定。此类测定的实例是血细胞凝集抑制(HAI)测定，它被认为是该领域的金标准，并提供了体内保护的相关性。然而，靶向茎区域的疫苗虽然具有潜在的保护作用，但可能无法阻止流感病毒与靶细胞结合。因此，上述测定不适用于研究靶向茎区域的疫苗的功效。
用于研究已经施用于小鼠的靶向茎区域的疫苗的功效的合适测定如下。在本文提供的实例中使用了这些测定的实施。
ELISA检测抗HA IgG抗体
使用HA抗原(全长或仅茎)作为包被，通过ELISA进行小鼠抗HAIgG抗体的定量。然后培养板。将稀释的血清加入包被的板中并孵育。在加入稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG之前，洗涤板。用H2SO4终止反应，并读取光密度。滴度以ELISA单位滴度表示。
茎特异性T细胞频率
收集脾脏并制备细胞悬浮液。过滤、收获并离心脾细胞悬浮液。然后将新鲜的脾细胞置于覆盖茎蛋白序列的重叠肽池的存在下。刺激后，洗涤细胞并用抗CD16/32、抗CD4-V450和抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体染色。添加活/死细胞染色剂。使用抗IL2-FITC、抗IFN-APC和抗TNFα-PE抗体对细胞进行透化和染色。通过流式细胞术分析染色的细胞。
中和抗体滴度
将小鼠血清稀释，并在报告流感病毒存在下孵育。孵育后，将血清-病毒混合物添加到细胞培养物中。通过流式细胞术对流感阳性细胞进行分析和定量。滴度表示为50％中和滴度(IC50)，对应于通过血清反向稀释的回归分析计算出的减少滴度，与对照孔(仅病毒，无血清)相比，血清反向稀释提供50％细胞感染减少。
上述测定的更具体实施在实例中详细描述。这些更具体的测定也可用于研究靶向茎区的疫苗的功效。
受试者
本发明一般旨在用于哺乳动物受试者，特别是人受试者。受试者可以是野生或家养动物。哺乳动物受试者包括例如猫、狗、猪、羊、马或牛。在本发明的一个实施方案中，受试者是人。
待使用本发明的方法治疗的受试者可以是任何年龄。
在一个实施方案中，受试者是人婴儿(至多12个月大)。在一个实施方案中，受试者是人儿童(小于18岁)。在一个实施方案中，受试者是成年人(18-59岁)。在一个实施方案中，受试者是老年人(60岁或更大)。
施用年幼儿童(例如小于12岁)的剂量可以相对于同等成人剂量减少，例如减少50％。
本发明的方法旨在适用于预防，即施用于未感染流感病毒的受试者。
配制与施用
载体配制的mRNA可以通过各种合适的途径施用，包括肠胃外施用，例如肌内或皮下施用。适当地，肌内和/或皮内施用载体配制的mRNA。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA的肌内施用导致所编码的抗原构建体在受试者中表达。载体配制的mRNA的施用导致mRNA的翻译并导致受试者中编码的茎HA抗原的产生。
载体配制的mRNA可以以液体或干燥(例如冻干)形式提供。优选的形式将取决于多种因素，例如载体配制的mRNA的精确性质，例如载体配制的mRNA是否易于干燥，或者可能存在的其它组分。
载体配制的mRNA通常以液体形式提供。
在实施方案中，本文所述的mRNA制剂可被冻干，以改善制剂和/或mRNA的储存稳定性。在实施方案中，本文所述的mRNA制剂可被喷雾干燥，以改善制剂和/或mRNA的储存稳定性。用于冻干和/或喷雾干燥的冻干保护剂可以选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、葡聚糖和菊粉。
适当地，免疫原性组合物，例如，将包含LNP的组合物冻干(例如根据WO2016165831或WO2011069586)以产生如本文所定义的温度稳定的干燥mRNA(粉末)组合物。组合物，例如包含LNP的组合物，也可以使用喷雾干燥或喷雾冷冻干燥(例如根据WO2016184575或WO2016184576)来干燥，以产生如本文所定义的温度稳定的组合物(粉末)。
因此，在一些实施方案中，药物组合物是干燥的组合物。
本文所用的术语“干燥组合物”应理解为如上所定义的已经冻干、或喷雾干燥、或喷雾冷冻干燥的组合物，以获得温度稳定的干燥组合物(粉末)，例如包含LNP复合RNA(如上所定义)。
在实施方案中，冻干或喷雾干燥的组合物的含水量小于约10％。
在一些实施方案中，冻干或喷雾干燥的组合物具有约0.5％至5％的含水量。
在一些实施方案中，冻干或喷雾干燥的组合物在约5℃储存至少2个月，合适地至少3个月、4个月、5个月、6个月后稳定。
用于在施用前与其他组合物组合的包含载体配制的mRNA的组合物本身不需要具有生理上可接受的pH或生理上可接受的张力；用于施用的制剂应该具有生理上可接受的pH值和生理上可接受的渗透压。
液体制剂的pH根据组合物的组分和对人受试者施用的必要适宜性来调节。制剂的pH通常至少是4，特别是至少是5，尤其是至少是5.5，例如至少是6。制剂的pH通常是9或更低，尤其是8.5或更低，尤其是8或更低，例如7.5或更低。制剂的pH可以是4至9，尤其是5至8.5，尤其是5.5至8，例如6.5至7.4(例如6.5至7.1)。
对于肠胃外施用，溶液应该具有生理上可接受的渗透压，以避免过度的细胞变形或溶解。生理上可接受的渗透压通常是指溶液的渗透压接近等渗或轻度高渗。合适地，用于施用的制剂将具有250至750mOsm/kg，特别是250至550mOsm/kg，尤其是270至500mOsm/kg，例如270至400mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。重量克分子渗透压浓度可以根据本领域已知的技术来测量，例如通过使用可商购的渗透压计，例如可从InstrumentsInc.(USA)获得的Advanced Model 2020。
用于重构的液体基本上是水性的，例如注射用水、磷酸盐缓冲盐水等。如上所述，对缓冲剂和/或张力调节剂的需求将取决于被重构的容器的内容物和重构内容物的后续用途。缓冲剂可选自醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和TRIS。缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂，例如Na/Na2PO4、Na/K2PO4或K/K2PO4。
合适地，用于本发明的制剂具有0.05ml至1ml之间的剂量体积，例如0.1ml至0.6ml，特别是0.45ml至0.55ml的剂量体积，例如0.5ml。所用组合物的体积可取决于受试者、递送途径和部位，皮内途径给予的剂量较小。通过诸如肌内途径施用的典型人剂量在200ul至750ul的范围内，例如400ul至600ul，特别是约500ul，例如500ul。
载体配制的mRNA可以在各种物理容器中提供，例如小瓶或预填充的注射器。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA以单剂量的形式提供。在其他实施方案中，载体配制的mRNA以多剂量形式提供，例如含有2、5或10个剂量。
通常，液体在容器之间转移，例如从小瓶转移到注射器，以提供“超额”，确保所需的全部体积可以方便地转移。所需的超额水平将视情况而定，但应避免超额以减少浪费，超额不足可能会造成实际困难。超额可以是每剂量20至100ul，例如30ul或50ul的量级。
可以存在稳定剂。当提供多剂量容器时，稳定剂可能特别重要，因为最终制剂的剂量可以经一段时间施用给受试者。
制剂优选是无菌的。
建立强而持久的免疫的方法通常包括重复免疫，即通过施用一次或多次进一步的剂量来增强免疫应答。此类进一步的施用可以用相同的免疫原性组合物(同源加强)或不同的免疫原性组合物(异源加强)进行。本发明可以作为同源或异源的初始/加强方案的一部分，作为初始或加强免疫。
因此，载体配制的mRNA的施用可以是多剂量施用方案的一部分。例如，载体配制的mRNA可以在多剂量方案中作为初始剂量提供，特别是两剂量或三剂量方案，尤其是两剂量方案。载体配制的mRNA可以在多剂量方案中作为加强剂量提供，特别是两剂量或三剂量方案，例如两剂量方案。
初始和加强剂量可以是同源或异源的。因此，载体配制的mRNA可以在同源多剂量方案中作为初始剂量和加强剂量提供，特别是两剂量或三剂量方案，尤其是两剂量方案。可替代地，载体配制的mRNA可以作为异源多剂量方案中的初始剂量或加强剂量提供，特别是二或三剂量方案，特别是二剂量方案，并且一个或多个加强剂量可以不同(例如载体配制的mRNA；或备选的抗原呈递物，如蛋白质或病毒载体抗原—有或没有佐剂，如角鲨烯乳剂佐剂)。
剂量之间的时间可以是两周到六个月，例如三周到三个月。也可以提供定期的长期加强剂量，例如每2至10年一次。
因此，还提供了包含根据本发明的载体配制的mRNA的免疫原性组合物，其中该组合物任选包含至少一种药学上可接受的载体。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”适当地包括用于施用的组合物的液体或非液体基质。如果组合物以液体形式提供，载体可以是水，例如无热原的水；等渗盐水或缓冲(水)溶液，如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。可以使用水或合适的缓冲液，更合适的是含水缓冲液，其含有钠盐，合适的是至少50mM的钠盐，钙盐，合适的是至少0.01mM的钙盐，和任选的钾盐，合适的是至少3mM的钾盐。根据一些实施方案，钠盐、钙盐和任选的钾盐可以以其卤化物形式存在，例如氯化物、碘化物或溴化物，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等形式存在。钠盐的实例包括NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括KCl、碘化钾、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，钙盐的实例包括CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。
此外，前述阳离子的有机阴离子可以在缓冲液中。因此，在实施方案中，药物组合物可包含药学上可接受的载体或赋形剂，使用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，以例如增加稳定性、增加细胞转染、允许持续或延迟、增加体内编码的抗原性肽或蛋白质的翻译、和/或改变体内编码的抗原性肽或蛋白质的释放模式。除了传统的赋形剂如任何和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，赋形剂可以包括但不限于类脂、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、阳离子脂质体-DNA复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用多核苷酸转染的细胞、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物及其组合。在实施方案中，也可以使用一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物，其适于对受试者施用。本文所用术语“相容的”是指组合物的组分能够与组分A和/或组分B的至少一种核酸以及任选的组合物的多种核酸以不发生相互作用的方式混合，所述相互作用在典型使用条件下(例如，肌内或皮内施用)会显著降低组合物的生物活性或药物有效性。药学上可接受的载体或赋形剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适于施用于待治疗的受试者。可用作药学上可接受的载体或赋形剂的化合物可以是糖，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；黄芪粉；麦芽；明胶；牛油；固体助流剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。
可以选择免疫原性组合物的至少一种药学上可接受的载体或赋形剂以适合于免疫原性组合物的肌内或皮内递送/施用。免疫原性组合物适当地是适合于向受试者肌内施用的组合物。
考虑施用免疫原性组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业相关的鸟类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在各种实施方案中，免疫原性组合物不超过一定比例的游离mRNA。
在本文中，术语“游离mRNA”或“非复合mRNA”或“非包封mRNA”包括未包封在本文定义的基于脂质的载体中的RNA分子。在组合物的配制过程中(例如，在将RNA包封到基于脂质的载体中的过程中)，游离RNA可能代表污染或杂质。
在实施方案中，免疫原性组合物包含约30％至约0％的游离mRNA。在实施方案中，组合物包含约20％游离mRNA(和约80％包封的mRNA)、约15％游离mRNA(和约85％包封的mRNA)、约10％游离mRNA(和约90％包封的mRNA)、或约5％游离mRNA(以及约95％包封的mRNA)。在一些实施方案中，组合物包含小于约20％游离mRNA，合适地小于约15％游离mRNA，更合适地小于约10％游离mRNA，最合适地小于约5％游离mRNA。
术语“包封的mRNA”包括包封在本文定义的基于脂质的载体中的mRNA分子。在本发明的上下文中，包封的mRNA的比例通常使用RiboGreen测定来确定。
在一些实施方案中，组合物是除本发明的mRNA之外还包含多个或至少一个另外的mRNA的多价组合物。
在一些实施方案中，多价组合物包含两个或更多个本发明的mRNA，适当地各自编码不同的流感HA茎多肽。在一些实施方案中，多价组合物包含两个、三个或四个mRNA。在一些实施方案中，多价组合物包含两个、三个或四个mRNA，每个编码不同的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA编码衍生自甲型流感，例如甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感组1、合适地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和/或H18，更合适地H1的流感HA茎多肽；并且两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感组2、适合地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和/或H15、更优适合地H3、H7和/或H10，还更适合地H3的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；以及两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3、H7和/或H10的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；并且两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H3的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H1的流感HA茎多肽；并且两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H10的流感HA茎多肽。
在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项，合适地SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项、合适地SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:12具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:8、9或11中任一个具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，流感茎多肽包含在具有多肽序列的构建体中，该多肽序列具有与SEQ ID NO:13、14或15中任一个具有80％或更高，例如90％或更高，例如95％或更高，例如98％或更高，例如99％或更高序列同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:18至21中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:24至29中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，两个或更多个mRNA中的至少一个是非复制的。在一些实施方案中，两个或更多个mRNA中的每一个是非复制的。
还提供了包含mRNA和/或免疫原性组合物的疫苗。
在一些实施方案中，疫苗是包含多种或至少多于一个本发明的RNA、或多个或至少多于一个组合物的多价疫苗。
进一步提供了试剂盒或成套试剂盒，其包含mRNA、和/或组合物、和/或疫苗，任选地包含用于溶解的液体媒剂，以及任选地提供关于组分的施用和剂量信息的技术说明书。
试剂盒的技术说明书可能含有有关施用和剂量以及患者群体的信息。这种试剂盒，合适地为成套试剂盒，可用于例如本文提及的任何应用或用途，合适地用于免疫原性组合物或疫苗的用途，用于治疗或预防由流感病毒，合适地为甲型流感病毒引起的感染或疾病。
在一些实施方案中，免疫原性组合物或疫苗在试剂盒的单独部分中提供，其中免疫原性组合物或疫苗被适当地冻干或喷雾干燥或喷雾冷冻干燥。
试剂盒可以进一步含有用于溶解干燥或冻干的核酸组合物或疫苗的媒剂(例如缓冲溶液)作为一部分。
在一些实施方案中，本文定义的试剂盒或成套试剂盒包含用于施用组合物/疫苗的多剂量容器和/或施用装置(例如用于肌内和/或皮内注射的注射器)。
任何上述试剂盒可用于本文定义的治疗或预防。
还提供了用作药物的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗或试剂盒或成套试剂盒。
此外提供了载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗或试剂盒的几种应用和用途。
因此，进一步提供了用于治疗或预防流感病毒、合适地甲型流感病毒感染的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗或试剂盒或成套试剂盒。
在一些实施方案中，每种载体配制的mRNA的载体配制的mRNA的量在质量上基本上相等。在其他实施方案中，将每种核酸种类的核酸量被选择为等摩尔。
在一些实施方案中，载体配制的mRNA的单剂量为0.001至1000μg、0.01至1000μg、特别是1至500μg、特别是10至250μg总mRNA。在进一步的实施方案中，载体配制的mRNA的单剂量包含3、4、5、6、7、8、9或10种不同mRNA的混合物，并且每种mRNA为0.01至100μg，尤其是0.25至250μg，尤其是0.5至25μg。
在一些实施方案中，使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒用于肌内和/或皮内施用，合适地肌内施用。
在一些实施方案中，引发免疫应答。
在一些实施方案中，引发适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发针对流感病毒的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发针对甲型流感病毒的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发针对来自组1和/或组2的一种或多种甲型流感病毒亚型的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发的免疫应答包括针对流感病毒、合适地甲型流感病毒、更合适地针对来自组1和/或组2的一种或多种甲型流感病毒亚型的中和抗体滴度。
在一些实施方案中，引发的免疫应答包含可以有效中和相应病毒的功能性抗体。
在进一步的实施方案中，引发的免疫应答包括针对相应病毒的广泛的、功能性的细胞T细胞应答。具体地，引发的免疫应答包括CD4+T细胞免疫应答和/或CD8+T细胞免疫应答。
在进一步的实施方案中，引发的免疫应答包括针对相应病毒的平衡良好的B细胞和T细胞应答。
在一些实施方案中，引发的免疫应答包括抗原特异性免疫应答。
在一些实施方案中，引发的免疫应答部分地或完全地降低受试者经历的流感病毒感染的一种或多种症状的严重性和/或缩短受试者经历流感病毒感染的一种或多种症状的时间。
在一些实施方案中，引发的免疫应答降低在激发后发展为确定的流感病毒感染的可能性。
在一些具体实施方案中，引发的免疫应答减缓流感的进展。
还提供了治疗或预防病症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者应用或施用载体配制的mRNA、组合物、疫苗或试剂盒或成套试剂盒。
预防(抑制)或治疗疾病，特别是病毒感染涉及抑制疾病或病症的完全发展，例如，在具有疾病如病毒感染风险的受试者中。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后，改善其体征或症状的治疗性干预。关于疾病或病理状况，术语“改善”是指治疗的任何可观察到的有益效果。抑制疾病可以包括预防或降低疾病的风险，例如预防或降低病毒感染的风险。这种有益效果可以通过以下来证明：例如易感受试者中疾病临床症状的延迟发作、疾病的一些或所有临床症状严重性的降低、疾病进展的减缓、病毒载量的降低、受试者整体健康或幸福的改善，或特定疾病的其他特异性参数。“预防性”治疗是对没有表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的受试者进行的治疗，目的是降低发生病变的风险。
在一些实施方案中，以治疗有效量施用载体配制的mRNA、组合物、疫苗或试剂盒或成套试剂盒。
在一些实施方案中，病症是流感病毒、合适地甲型流感病毒的感染。
在一些实施方案中，有需要的受试者是哺乳动物受试者，合适地是人受试者。
还提供了引发免疫应答的方法，其中该方法包括向有需要的受试者应用或施用载体配制的mRNA、组合物、疫苗或试剂盒或试剂盒。
在一些实施方案中，引发免疫应答。
在一些实施方案中，引发适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发针对流感病毒的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发针对甲型流感病毒的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发针对来自组1和/或组2的一种或多种甲型流感病毒亚型的保护性适应性免疫应答。
在一些实施方案中，引发的免疫应答包括针对流感病毒、合适地甲型流感病毒、更合适地针对来自组1和/或组2的一种或多种甲型流感病毒亚型的中和抗体滴度。
在一些实施方案中，适应性免疫应答包含产生与不是由载体配制的mRNA编码的HA蛋白结合的抗体。
在一些实施方案中，引发的免疫应答包含可以有效中和相应病毒的功能性抗体。
在进一步的实施方案中，引发的免疫应答包括针对相应病毒的广泛的、功能性的细胞T细胞应答。
在进一步的实施方案中，引发的免疫应答包括针对相应病毒的平衡良好的B细胞和T细胞应答。
在一些实施方案中，免疫应答包括针对流感病毒、合适地针对甲型流感病毒、更合适地针对组1和/或组2甲型流感病毒亚型的同源、异源和/或异亚型交叉反应性免疫原性应答。
在一些实施方案中，有需要的受试者是哺乳动物受试者，合适地是人受试者。
在实施方案中，向受试者施用载体配制的mRNA、组合物、疫苗或试剂盒或试剂盒引发中和抗体，并且不引发疾病增强抗体。具体地，向受试者施用载体配制的mRNA、组合物、疫苗或试剂盒不会引发免疫病理学效应，例如疾病加重和/或抗体依赖性增强(ADE)。
必须注意，在本发明的载体配制的mRNA和/或本发明的免疫原性组合物的上下文中描述的具体特征和实施方案同样适用于本发明的疫苗、试剂盒或成套试剂盒部分或其它方面，包括例如医学用途(第一和第二医学用途)和例如治疗方法。
另外的定义
为了清楚和可读起见，提供以下定义。对于这些定义提及的任何技术特征可以在本发明的每个和所有实施方案中解读。另外的定义和解释可以在这些实施方案的上下文中具体提供。
贯穿说明书，包括权利要求书，其中在上下文允许的情况下，术语“包含”及其变体如“包括”应被解释为包括所述的一个或多个要素(例如整数)，而不一定排除任何其他要素(例如整数)。因此,“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括一些另外的，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，例如，与“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。
关于数值x的术语“约”或“大约”是任选的，表示例如给定数值的x+10％，如给定数值的x+5％。
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非内容另有明确指示。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，组分可以以任何顺序混合。如果有三个组分，那么两个组分可以彼此组合，然后该组合可以与第三组分组合，等等。
数字中的百分比应理解为相对于各个项的总数。在其他情况下，除非上下文另有规定，百分比应理解为重量百分比(wt.-％)。
术语“免疫原性片段”或“免疫原性变体”应理解为能够在受试者中引起免疫应答的相应流感抗原的任何片段/变体。
适应性免疫应答：本领域普通技术人员将会认识和理解本文所用的术语“适应性免疫应答”，例如，其旨在是指免疫系统(适应性免疫系统)的抗原特异性应答。抗原特异性允许产生针对特定病原体或病原体感染细胞的应答。产生这些定制应答的能力通常由体内的“记忆细胞”(B细胞)维持。在本发明的上下文中，抗原由编码至少一种衍生自流感病毒的抗原性肽或蛋白质的mRNA提供。
抗原：本文使用的术语“抗原”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指以下物质，该物质可被免疫系统识别的，合适地被适应性免疫系统识别，并且能够触发抗原特异性免疫应答，例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分。通常，抗原可以是或可以包含可以由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。在本发明的上下文中，包含至少一个表位的肽或蛋白质的片段、变体和衍生物也被理解为抗原。在本发明的上下文中，抗原可以是本文指定的所提供的mRNA的翻译产物。
抗原性肽或蛋白质：术语“抗原性肽或蛋白质”或“免疫原性肽或蛋白质”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指衍生自(抗原性或免疫原性)蛋白质的肽、蛋白质，其刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。因此，抗原/免疫原性肽或蛋白质包含其来源的蛋白质(例如流感病毒的HA)的至少一个表位(如本文定义)或抗原(如本文定义)。
阳离子：除非在具体的上下文中有明确的不同含义，否则术语“阳离子”意旨相应的结构带有正电荷，永久地或非永久地，但是响应于某些条件如pH值。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“可阳离子化”。
可阳离子化：本文所用的术语“可阳离子化”意旨化合物、基团或原子在其环境的较低pH下带正电，而在较高pH下不带电。此外，在无法确定pH的非水环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在高氢离子浓度下带正电，而在低氢离子浓度或氢离子活性下不带电。它取决于可阳离子化或可聚阳离子化化合物的单独性质，特别是各个可阳离子化基团或原子的pKa，在该pH或氢离子浓度下其带电或不带电。在稀释的水性环境中，可阳离子化的化合物、带有正电荷的基团或原子的分数可以使用本领域技术人员众所周知的所谓的Henderson-Hasselbalch方程来估计。例如，在一些实施方案中，如果化合物或部分是可阳离子化的，则合适的是其在约1至9，合适地4至9，5至8或甚至6至8的pH值，更优选pH值为9或低于9，8或低于8，最合适的是在生理pH值下，例如约7.3至7.4，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下带正电荷。在其它实施方案中，合适的是可阳离子化化合物或部分在生理pH值，例如约7.0-7.4下主要是中性的，但在较低的pH值下变得带正电荷。在一些实施方案中，可阳离子化化合物或部分的pKa的合适范围是约5至约7。
编码序列/编码区域：术语“编码序列”或“编码区域”以及本文所用的相应缩写“cds”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指几个核苷酸三联体的序列，其可被翻译成肽或蛋白质。在本发明的上下文中，编码序列可以是DNA序列，合适地是RNA序列，由可被三分的多个核苷酸组成，其以起始密码子开始，并合适地以终止密码子终止。
衍生自：本说明书全文中使用的术语“衍生自”在核酸的上下文中，即对于“衍生自”(另一)核酸的核酸，意旨衍生自(另一)核酸的核酸与衍生它的核酸具有例如至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。技术人员知道，通常针对相同类型的核酸(即针对DNA序列或针对RNA序列)计算序列同一性。因此，应当理解，如果RNA“衍生自”DNA，则在第一步中，DNA序列被转换成相应的RNA序列(特别是通过在整个序列中用U替换T)。此后，确定RNA序列的序列同一性。合适地,“衍生自”核酸的核酸也是指与其来源的核酸相比被修饰的核酸，例如为了进一步增加RNA的稳定性和/或延长和/或增加蛋白质的产生。在氨基酸序列(例如抗原性肽或蛋白质)的上下文中，术语“衍生自”是指衍生自(另一)氨基酸序列的氨基酸序列与衍生它的氨基酸序列具有例如至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
表位：本文所用的术语“表位”(在本领域中也称为“抗原决定簇”)将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指T细胞表位和B细胞表位。T细胞表位或抗原性肽或蛋白质的部分，可包含长度合适地为约6至约20个或甚至更多个氨基酸的片段，例如由MHC类分子加工和呈递的片段，长度合适地为约8至约10个氨基酸，例如8、9或10个(或甚至11或12个氨基酸)，或由MHC类分子加工和呈递的片段，长度合适地为约13至约20个或甚至更多个氨基酸。这些片段通常以由肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即这些片段通常不能以其天然形式被识别。B细胞表位通常是位于(天然)蛋白质或肽抗原外表面的片段，合适地具有5至15个氨基酸，更合适地具有5至12个氨基酸，甚至更合适地具有6至9个氨基酸，其可被抗体识别，即以其天然形式。此外，蛋白质或肽的此类表位可以选自本文提到的此类蛋白质或肽的任何变体。在本文中，表位可以是由本文定义的蛋白质或肽的区段组成的构象表位或不连续表位(所述区段在本文定义的蛋白质或肽的氨基酸序列中是不连续的，但在三维结构中集合在一起)，或者是由单个多肽链组成的连续或线性表位。
体液免疫应答：术语“体液免疫”或“体液免疫应答”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指B细胞介导的抗体产生，以及任选地旨在伴随抗体产生的辅助过程。体液免疫应答的典型特征可以是，例如通过Th2激活和细胞因子产生、生发中心形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞生成。体液免疫也可以是指抗体的效应功能，包括中和病原体和毒素、经典补体激活以及调理素促进吞噬作用和消除病原体。
免疫原、免疫原性：术语“免疫原”或“免疫原性”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指能够刺激/诱导免疫应答的化合物。在一些实施方案中，免疫原是肽、多肽或蛋白质。本发明意义上的免疫原是所提供的核酸的翻译产物，包含至少一个编码序列，该编码序列编码至少一个抗原肽、蛋白质，该抗原肽、蛋白质衍生自如本文所定义的例如流感HA茎(合适地，甲型流感HA茎)。通常，免疫原引发适应性免疫应答。
免疫应答：术语“免疫应答”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指适应性免疫系统对特定抗原的特异性反应(所谓的特异性或适应性免疫应答)或先天免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天免疫应答)，或其组合。
先天免疫系统：术语“先天免疫系统”(也称为非特异性或非特异性免疫系统)将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如旨在是指通常包含以非特异性方式保护宿主免受其他生物体感染的细胞和机制的系统。这意旨先天系统的细胞可能以通用方式识别病原体并对其做出应答，但与适应性免疫系统不同，它不会赋予宿主持久或保护性免疫力。先天免疫系统可以被模式识别受体的配体激活，例如Toll样受体、NOD样受体或RIG-I样受体等。
多价疫苗/组合物：本发明的多价疫苗或组合提供衍生自一种以上病毒(例如本文定义的至少一种流感病毒和本文定义的至少一种另外的流感病毒)的多于一价(例如抗原)。
实施例
第1节-SAM构建体实施例
实施例1-LNP详细信息和小鼠免疫接种
本文实施例中使用的LNP是“RV39”脂质纳米颗粒(由40％阳离子脂质LKY750、10％两性离子脂质DSPC、48％胆固醇和2％聚乙二醇化脂质DMG(w/w)组成)。这些LNP用于产生LNP配制的重组自我扩增mRNA(SAM)复制子，其编码稳定在幽门螺杆菌细菌铁蛋白上的各种流感毒株的HA茎(单展示)。HA茎-铁蛋白融合基因是通过将HA的胞外结构域与幽门螺杆菌铁蛋白通过Ser-Gly-Gly接头融合而产生的。
研究A
在CB6F1小鼠中评估了茎HAH1候选疫苗的免疫原性。在第0天和第28天用以下对10只雌性CB6F1小鼠进行免疫：
(a)包含在LNP内的SAM-茎H1A/Michigan/45/2015(编码茎HAH1A/Michigan/45/2015多肽和幽门螺杆菌铁蛋白的SAM(SEQ ID NO:7))，
(b)QIV(市售四价流感疫苗，包含株A/Brisbane/02/2018H1N1pdm09、A/Kansas/14/2017H3N2、B/Colorado/06/2017(B/Victoria)和B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata))的灭活分裂流感病毒体，无佐剂，
(c)用AS03配制的QIV，或
(d)NaCl溶液。
如以下实施例3至7中所述，使用实施例2中描述的测定方案来收集和分析血清样品。
如果比较组间GMT(GMR)之比的90％CI下限(LL)≥0.5，则可得出非劣效性结论。如果GMR+90％CI>0.5，则可以得出生物学/临床意义(非劣效性界值)。如果GMR+90％CI≥2，则可得出统计学优势。
研究B
与上述研究A类似，进行了进一步的后续研究以调查施用不同剂量的SAM编码的茎HA和衍生自不同流感株的SAM编码的茎HA多肽的影响。
雌性CB6F1小鼠用以下免疫接种：
(a)包含在LNP内的SAM-茎H1A/Michigan/45/2015(编码茎HA H1A/Michigan/45/2015多肽和幽门螺杆菌铁蛋白的SAM(SEQ ID NO:7))，
(b)包含在LNP内的SAM-茎H1A/New Caledonia/20/99(编码茎HA H1A/NewCaledonia/20/99多肽和幽门螺杆菌铁蛋白的SAM(SEQ ID NO:6))，
(c)包含在LNP内的SAM-茎H10A/Jiangxi-Donghu/346/2013(编码茎HAH10A/Jiangxi-Donghu/346/2013多肽和幽门螺旋杆菌铁蛋白的SAM(SEQ ID NO:9))，
(d)不含佐剂的QIV，
(e)用25uL AS03配制的QIV，或
(f)NaCl溶液。
每组(a)-(e)包括十四只小鼠，并且(f)组包括四只小鼠。
如以下实施例3至7中所述，使用实施例2中描述的测定方案来收集和分析血清样品。
如果比较组间GMT(GMR)之比的90％CI下限(LL)≥0.5，则可得出非劣效性结论。如果GMR+90％CI>0.5，则可以得出生物学/临床意义(非劣效性界值)。如果GMR+90％CI≥2，则可得出统计学优势。
实施例2-测定方案
ELISA检测抗HA IgG抗体
使用HA抗原(全长或仅茎)作为包被，在PBS(50μl/孔)中以4μg/ml的浓度稀释，通过ELISA对小鼠抗HAIgG抗体进行定量。然后将板在37℃饱和缓冲液中孵育1小时。将稀释的血清添加到包被板中(50μl/孔)并在37℃下孵育90分钟。在添加稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG之前洗涤板。用H2SO4 2N终止反应并在490-620nm处读取光密度。滴度表示为ELISA单位滴度(EU/ml)。
茎特异性T细胞频率
收集脾脏并置于补充的RPMI中，使用组织研磨机从每个脾脏制备细胞悬浮液。将脾细胞悬浮液过滤、收获、离心并重悬于完全培养基中。然后将新鲜脾细胞在覆盖H1 Mich15茎序列的重叠肽池存在下铺板于96孔板中。刺激后，使用5色ICS测定对细胞进行染色和分析。洗涤细胞并用抗CD16/32、抗CD4-V450和抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体染色。在4℃下添加活/死-PO 30分钟。将细胞透化并用抗IL2-FITC、抗IFN-APC和抗TNFα-PE抗体染色。使用LSRII和FlowJo软件通过流式细胞术分析染色的细胞。
中和抗体滴度
通过微量中和测定评估小鼠中和抗体滴度的定量。简而言之，将小鼠血清稀释并在报告流感病毒存在下孵育。孵育后，将血清-病毒混合物添加到细胞培养物中。通过流式细胞术对流感阳性细胞进行分析和定量。滴度表示为50％中和滴度(IC50)，对应于通过血清反向稀释的回归分析计算出的减少滴度，与对照孔(仅病毒，无血清)相比，血清反向稀释提供50％细胞感染减少。
实施例3-第2次给药后14天通过ELISA测定的抗H1茎IgG抗体滴度
在第二次免疫后14天(第42天)通过ELISA测定测量针对H1-茎的IgG抗体滴度。
来自研究A的结果显示在图1中，SAM H1茎诱导了高抗H1茎IgG抗体，与QIV/AS03免疫接种诱导的滴度(SAM茎H1 1μg/QIV：GMR 54.83和LL 21.94；SAM茎H1 1μg/QIV+AS03：GMR8.60和LL 3.08)相当，甚至改善(1μg)。ELISA滴度表示为中点值(Geomean为95％CI)。
来自研究B的结果显示在图2中，SAM茎H1/NC/99诱导了高抗H1茎IgG抗体，与QIV/AS03免疫接种诱导的滴度(SAM茎H1/NC/99/QIV：GMR 235.88和LL 100.78；SAM茎H1/NC/99/QIV+AS03：GMR 16.86和LL 12.34)相当，甚至改善。SAM茎H1/Mich/15诱导了高抗H1茎IgG抗体，与QIV/AS03免疫诱导的滴度(SAM茎H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 90.17和LL 38.79；SAM茎H1/Mich/15 0.2μg/QIV+AS03：GMR 6.45和LL 4.83)相当，甚至改善(0.2μg、1μg和5μg)。ELISA滴度表示为50％终点滴度(具有GMT和IC95的个体动物)。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
实施例4-第2次给药后14天通过ELISA测定的抗H1/NC/99和抗H1/Mich/15IgG抗体滴度
在第二次免疫后14天(第42天)使用以下通过ELISA测定测量针对H1的IgG抗体滴度：全长(具有折叠且不具有跨膜结构域的三聚体蛋白)A/H1N1/New Caledonia/20/1999多肽(研究A，图3和研究B，图4A)或全长A/H1N1/Michigan/2015多肽(研究A，图5A(对池分析的QIV组)和5B(对个体血清分析的QIV组)和研究B，图6)。
研究A揭示了SAM H1茎诱导产生高抗H1 NC99 IgG抗体，与QIV/AS03(SAM茎H1 1μg/QIV：GMR 46.10和LL 21.00；SAM茎H1 1μg/QIV+AS03：GMR 5.94和LL 2.30)免疫诱导的滴度相比改善(1μg)。SAM H1茎诱导产生高抗H1 Mich15 IgG抗体，比QIV免疫(SAM茎H1/QIV：GMR 3.58和LL 1.19)诱导的滴度改善(1μg)。
研究B揭示了SAM茎H1/NC/99和H1/Mich/15(0.2μg、1μg和5μg)诱导了高抗H1/NC/99IgG抗体，甚至比QIV/AS03免疫(SAM H1/NC/99/QIV：GMR 80.64和LL 42.74；SAM H1/NC/99/QIV+AS03：GMR 5.37和LL 3.19；SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 34.20和LL 17.60；SAM H1/Mich/150.2μg/QIV+AS03：GMR 2.28和LL 1.30)诱导的滴度改善。SAM茎H1/NC/99和H1/Mich/15(1μg和5μg)诱导产生高抗H1/Mich/15IgG抗体，比QIV免疫(SAM H1/NC/99/QIV：GMR 2.05和LL 1.12；SAM H1/Mich/15 1μg/QIV：GMR 2.08和LL 1.19)诱导的滴度改善。
仅在研究B中，使用仅茎A/H1N1/New Caledonia/20/1999多肽作为包被抗原重复实验。结果示于图4B。
对于图3和图5A和5B，ELISA滴度表示为中点值(Geomean为95％CI)。对于图4A和4B以及图6来说，ELISA滴度表示为50％终点滴度(具有GMT和IC95的个体动物)。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
实施例5-第2次给药后14天通过ELISA测定的抗组A1(H2、H9、H18)IgG抗体滴度
在第二次免疫后14天(第42天)使用以下通过ELISA测定测量针对组A1 HA的IgG抗体滴度：全长H2(研究A，图7和研究B，图8)、全长H9(研究A，图9和研究B，图10)或全长H18(研究A，图11和研究B，图12)。
研究A揭示了SAM-茎H1诱导抗H2、抗H9和抗H18 IgG抗体。
研究B揭示了SAM-茎H1/NC/99和H1/Mich/15(0.2μg、1μg和5μg)诱导抗H2 IgG抗体，甚至比QIV免疫(SAM H1/NC/99/QIV：GMR 10.07和LL 4.09；SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 4.38和LL 2.25)诱导的滴度改善。
研究B进一步揭示了SAM-茎H1/NC/99和H1/Mich/15(0.2μg、1μg和5μg)诱导抗H9IgG抗体，甚至比QIV/AS03免疫(SAM H1/NC/99/QIV：GMR 6.66和LL 3.11；SAM H1/Mich/150.2μg/QIV：GMR 7.63和LL 3.74；SAM H1/NC/99/QIV+AS03：GMR 2.23和LL 0.89；SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV+AS03：GMR 2.55和LL 1.06)诱导的滴度改善。
研究B进一步揭示了SAM-茎H1/NC/99和H1/Mich/15(0.2μg、1μg和5μg)诱导抗H18IgG抗体，甚至比QIV免疫(SAM H1/NC/99/QIV：GMR 6.17和LL 2.62；SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 2.96和LL 1.26)诱导的滴度改善。
对于图7、图9和图11，ELISA滴度表示为中点值(Geomean为95％CI)。对于图8、图10和图12，ELISA滴度表示为50％终点滴度(具有GMT和IC95的个体动物)。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
实施例6-第2次给药后14天通过ELISA测定的抗组A2(H3、H7、H10)IgG抗体滴度
该实验是针对研究B进行的。在第二次免疫后14天(第42天)使用以下通过ELISA测定测量针对组A2 HA的IgG抗体滴度：全长H3蛋白(图13)、全长H7蛋白(图14)或全长H10蛋白(图15A)。
研究B揭示了SAM-茎H10/Ji/13诱导抗H3和抗H10 IgG抗体。
研究B进一步揭示了SAM-茎H10/Ji/13诱导抗H7 IgG抗体，甚至比QIV/AS03免疫(SAM H10/Ji/13/QIV+AS03：GMR 2.46和LL 1.16)诱导的滴度改善。
使用仅茎多肽作为包被抗原重复H10 ELISA实验。结果示于图15B。
ELISA滴度表示为50％终点滴度(具有GMT和IC95的个体动物)。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
实施例7-第2次给药后14天的H1/mich/15茎特异性CD4+和CD8+ T细胞频率
评估了茎H1候选疫苗诱导的T细胞应答。在第二次免疫后14天测量H1茎特异性CD4+T细胞(研究A，图16和研究B，图17)和CD8+T细胞(研究A，图18和研究B，图19)的百分比。用覆盖H1茎(A/Michigan/45/2015)序列的肽池重新刺激6小时后，对脾细胞进行细胞内染色。
对于所有研究，与使用或不使用AS03的QIV(例如研究B-SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 10.58和LL 6.52；SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV+AS03：GMR 9.85和LL 6.39)相比，使用SAM-茎H1抗原观察到更高频率的H1/mich/15茎特异性CD4+ T细胞。
对于图16，结果表示为表达IFNγ和/或IL2和/或TNFα和/或IL13和/或IL17的H1A/Michigan/45/2015茎特异性CD4+ T细胞的百分比(具有中值的个体动物)。
对于图17，结果表示为表达IFNγ和/或IL2和/或TNFα的肽特异性CD4+T细胞的茎H1 FLU池的百分比(具有中值的个体动物)。
对于所有研究，与使用或不使用AS03的QIV(例如研究B–SAM H1/NC/99/QIV：GMR59.82和LL 19.56；SAM H1/NC/99/QIV+AS03：GMR 106.61和LL 32.30；H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 158.44和LL 110.40；SAM H1/Mich/15 0.2μg/QIV+AS03：GMR 282.38和LL134.11)相比，使用SAM-茎H1抗原观察到更高频率的H1/Mich/15茎特异性CD8+ T细胞。
对于图18，结果表示为表达IFNγ和/或IL2和/或TNFα和/或IL13和/或IL17的H1A/Michigan/45/2015茎特异性CD8+ T细胞的百分比(具有中值的个体动物)。
对于图19，结果表示为表达IFNγ和/或IL2和/或TNFα的肽特异性CD8+T细胞的茎H1 FLU池的百分比(具有中值的个体动物)。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
实施例8-第2次给药后14天的H10/Jiangxi-Donghu茎特异性CD4+和CD8+ T细胞频率
该实验仅针对研究B进行。第二次免疫后14天测量H10茎特异性CD4+T细胞(图20)和CD8+T细胞(图21)的百分比。用覆盖H10茎(H10/Jiangxi-Donghu)序列的肽池重新刺激6小时后，对脾细胞进行细胞内染色。
与使用AS03的QIV(SAM H1/NC/99/QIV+AS03：GMR 2.32和LL 1.19；SAM H1/Mich/15 1μg/QIV+AS03：GMR 4.65和LL 2.23；SAM H10/Ji/13/QIV+AS03：GMR 63.69和LL 35.53)相比，使用SAM-茎H10抗原观察到更高的H1/NC/99、H1/mich/15(1μg)和H10/Ji/13茎特异性CD4+T细胞频率。
与用或不用AS03的QIV(SAM H10/Ji/13/QIV：GMR 112.08和LL 23.70；SAM H10/Ji13/QIV+AS03：GMR 101.58和LL 47.44；H1/Mich/15 0.2μg/QIV：GMR 9.63和LL 1.91；SAMH1/Mich/15 0.2μg/QIV+AS03：GMR 8.72和LL 3.23)相比，使用SAM-茎H10抗原观察到更高的H1/Mich/15和H10/Ji/13茎特异性CD8+ T细胞频率。
对于图20，结果表示为表达IFNγ和/或IL2和/或TNFα的肽特异性CD4+T细胞的茎H10 FLU池的百分比(具有中值的个体动物)。
对于图21，结果表示为表达IFNγ和/或IL2和/或TNFα的肽特异性CD8+T细胞的茎H10 FLU池的百分比(具有中值的个体动物)。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
实施例9-组A1 H1/MIch/15、H1/NC/99和H5/Vn/04在第2次给药后14天的微中和滴度
使用H1/Mich/15(图A)、H1/NC/99(图B)或H5/Vn/04(图C)报道病毒通过微中和测定测量针对A1组流感病毒的微中和滴度(图22)。结果以IC50(log10稀释度)表示。
图中的水平虚线对应于检测阈值。
第2节-非复制mRNA构建体的实施例
对于第2节下的所有实施例，H1构建体基于A/Michigan/45/2015(H1N1)株(例如SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:12)，并且H3构建体基于A/Finland/486/2004(H3N2)株(例如SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:13)。
HA-茎构建体有来自幽门螺杆菌的铁蛋白(F或Fe)或跨膜结构域(TM)。
HA-茎构建体进一步提供有天然前导肽/信号肽(铁蛋白或TM构建体)或HLA-DRα前导肽(TM构建体)。
第2.1节-具有未修饰核苷的实施例
实施例10-HA-茎构建体的体外翻译
使用Promega兔网织红细胞裂解物系统和犬胰腺微粒体膜进行mRNA构建体的体外翻译。RNA在65℃下线性化3分钟，然后立即置于冰上。然后，根据制造商的说明，将0.2μgmRNA(或水＝模拟)与兔网织红细胞裂解物、氨基酸、RNase抑制剂和生物素化的赖氨酰-tRNA一起在25μl反应中孵育。一个反应除了翻译组分之外还含有犬微粒体膜。反应在30℃下孵育90分钟。将蛋白质样品缓冲液添加到反应中。通过SDS-PAGE在4-20％梯度凝胶上分离样品，并通过蛋白质印迹转移到PVDF-FL膜上。用TBS中的截留封闭缓冲液封闭膜。对于抗体稀释，封闭缓冲液在TBS中稀释，并添加0.2％Tween-20+0.01％SDS。使用IRDye 800CW缀合的链霉亲和素抗体(0.5x Intercept/TBS/0.2％Tween-20/0.01％SDS中1:2000)可视化体外翻译产物。将膜与抗体溶液在室温下孵育1小时，并用TBS/0.2％Tween-20/0.01％洗涤3次。使用Odyssey CLx图像系统检测条带。
结果如图23A所示(有膜的体外翻译-ivt w/膜)和23B(无膜的体外翻译-ivt w/o膜)。铁蛋白构建体比跨膜(TM)构建体翻译效率更高。TM设计之间没有观察到差异。当存在膜时，所有蛋白质都被糖基化(图23A上的权重较高)。
实施例11-组织培养物中的体外HA-茎三聚体表达
HeLa细胞以4x 105个细胞/孔的密度接种在6孔板中的2ml培养基中。第二天，根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000一式两份转染mRNA。对于每个孔，将0.5、1或2μgmRNA与0.75、1.5或3μl Lipofectamine 2000(比例1:1.5)在总共500μl Opti-MEM培养基中混合，然后添加到细胞中。18-24小时后收获细胞并用于染色。
转染的HeLa细胞用PBS洗涤，并与分离缓冲液(40mM Tris-HCl pH7.5、150mMNaCl、1mM EDTA)一起孵育，然后转移到Eppendorf管中。用PBS洗涤细胞，重悬于300μl PBS中，并分入96-V底板的3个孔中，使得1个孔的细胞用于三种不同的染色。所有样品均与200μl Aqua染料(1:1000在PBS中)在4℃下于黑暗中孵育30分钟，以区分活细胞和死细胞，用200μlPBS/0.5％BSA洗涤两次，并用于表面或细胞内染色。
对于表面染色，将细胞与100μl各自的单克隆抗体(在PBS/0.5％BSA中浓度为10μg/ml)或仅缓冲液一起孵育。样品在4℃下于黑暗中孵育30分钟，用200μl PBS/0.5％BSA洗涤两次，并在相同条件下与100μl PE标记的抗人IgG抗体(1:200的PBS/0.5％BSA溶液)一起孵育。抗体孵育后，用PBS/0.5％BSA洗涤细胞两次，用PBS中的1％甲醛固定，并再洗涤两次。将细胞重悬于PBEA(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA+0.01％NaN3)中，并使用ZE5流式细胞仪通过流式细胞术进行分析。
对于细胞内染色，通过在4℃下用200μl Cytofix/Cytoperm处理30分钟来固定和透化细胞。用Permwash洗涤细胞两次，并与100μl相应的单克隆抗体(在Permwash中的浓度为10μg/ml)或仅与Permwash一起孵育。样品在4℃下于黑暗中孵育30分钟，用200μlPermwash洗涤两次，并在相同条件下与100μl PE标记的抗人IgG抗体(1:200)在Permwash中孵育。抗体孵育后，用Permwash洗涤细胞两次，重悬于PBEA中，并使用ZE5流式细胞仪通过流式细胞术进行分析。
为每个重复绘制几何平均荧光强度(GMFI)。线条表示平均值+/-标准差。
结果如图24A(细胞三聚体)和24B(表面三聚体)所示，通过使用CT149抗体获得。CT149是一种人源性单克隆抗体，可识别组1和组2HA的HA茎。它与同一三聚体的两个原聚体结合，因此对HA茎的四级结构敏感(Wu,2015)。
铁蛋白设计比TM版本表达得少得多。任一TM构建体的信号肽之间没有差异。
实施例12-H1-和H3-茎mRNA共转染后的体外H1-茎表达
HeLa细胞以4x 105个细胞/孔的密度接种在6孔板中的2ml培养基中。第二天，根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000一式两份转染mRNA。对于每个孔，将总共2μg mRNA与3μl Lipofectamine 2000(比例为1:1.5)在总共500μl Opti-MEM培养基中混合，然后添加到细胞。18-24小时后收获细胞并用于染色。注意，mRNA如下等摩尔混合。将mRNA的重量调整为最重的mRNA(即H3_铁蛋白)。以相同摩尔浓度转染较轻的mRNA，并通过添加不相关的mRNA(即编码狂犬病病毒G蛋白的R1803)来补偿总mRNA重量的差异。将编码HA构建体的每种mRNA重量调整至1μg H3_铁蛋白mRNA的等摩尔浓度，并将R1803添加至2μg mRNA的总量中。如实施例11所述进行细胞染色和流式细胞术。
为每个重复绘制几何平均荧光强度(GMFI)。线条表示平均值+/-标准差。
结果如图25A(细胞表达，抗组1)和25B(表面表达，抗组1)所示，通过使用CR6261抗体获得。CR6261是一种人源性单克隆抗体，可识别组1HA的HA茎。它结合构象表位，因此对HA茎的正确折叠敏感(Friesen，2010)。
单表达和H3共表达样品中的高水平具有可比性。H3的设计对H1易位到细胞膜没有影响。
实施例13-H3-TM/H3-F转染细胞中H3的体外检测
293T细胞以2x 105个细胞/孔的密度接种在24孔板中的1ml培养基中。第二天，用Lipofectamine配制的mRNA(“RNA”)或LNP配制的mRNA(“LNP”)转染细胞。对于Lipofectamine转染，将1μg mRNA(或水＝模拟)与1.5μl Lipofectamine 2000(比例1:1.5)在总共250μl Opti-MEM培养基中混合，然后添加到细胞。对于LNP转染，将1μg LNP(或水＝模拟)稀释在50μl生长培养基(DMEM+10％FCS+1％L-Glu+1％Pen/Strep)中并添加到细胞。
第二天，用PBS清洗细胞，并使用每孔200μl RIPA缓冲液在板内裂解细胞。将板在冰上孵育30分钟，同时轻轻搅拌。将裂解物转移至Eppendorf管中并在4℃下离心10分钟。将裂解物与蛋白质样品缓冲液混合，煮沸5分钟，并使用Mini Protean TGX 4-20％梯度凝胶通过SDS-PAGE进行分离。通过蛋白质印迹将样品转移到PVDF膜上，并使用TBS中的截留封闭缓冲液在室温下封闭1小时。
用于检测的一抗是来自研究59-36-149(H1和H3蛋白设计的评估)组4(用H3_铁蛋白免疫)的混合小鼠血清，在TBS+0.2％Tween-20中的截留封闭缓冲液中按1:500稀释。将膜与一抗溶液在4℃下孵育过夜(旋转)。第二天，将膜在TBS+0.1％Tween-20中洗涤3x 10分钟，并与二抗680RD缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(在TBS+0.2％Tween-20中的截留缓冲液中按1:10,000稀释)一起室温孵育1小时。将膜在TBS+0.1％Tween-20中洗涤3x 10分钟，并使用Odyssey CLx图像系统观察条带。
结果如图26所示。H3茎的免疫印迹检测证实，与TM相比，铁蛋白构建体的总体表达较低，与流式细胞术观察到的结果相似。使用H3-铁蛋白疫苗接种后的小鼠血清进行检测(H1/H3免疫原性研究，与实施例19中的血清相同)。
实施例14-H1/H3-LNP的体外免疫刺激
通过Ficoll paque密度梯度离心从匿名捐献者的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)，用PBS洗涤，并在RPMI 1640+1％L-Glu+1％Pen/Strep+10％FCS中培养。为了用LNP刺激，将来自4个独立供体的PBMC与LNP样品一起孵育三次。将4x 105个细胞/孔接种到96孔板中，并与总共0.2ml的10μg/ml mRNA/LNP一起孵育。代表2个mRNA的样品用LNP处理，其中两种mRNA以1:1摩尔比配制在一起。
24小时后收集上清液，并根据制造商的说明，通过人IFN-αELISA进行分析(来自PBL的人泛IFN-αELISA试剂盒)。细胞上清液在添加到ELISA板之前根据人供体进行1:20或1:40稀释。该测定被设计为夹心ELISA，其中抗IFNα抗体被包被到板上。然后，将组织培养上清液添加到板中，IFNα将被包被的抗体结合。除去上清液，洗涤板并与生物素缀合的抗-IFNα抗体一起孵育，然后与HRP缀合的链霉亲和素一起孵育。ELISA使用TMB底物进行显色，停止并使用Synergy HTX读板器在450nm处读取吸光度。该试剂盒提供了IFNa标准品，该标准品与样品平行运行，从而可以在稀释的标准品样品范围内定量蛋白质浓度。
该测定中的技术对照由两种LNP配制的编码狂犬病病毒糖蛋白的mRNA(CV7202和R1803)、TLR7/8激动剂(ssRNA40)和作为阴性对照的培养基构成。CV7202和R1803已在不同的生产线中生产，并且已知可从人PBMC中诱导不同水平的IFNα。
为了更好地比较来自不同供体的数据，将结果标准化如下。首先，通过三次重复定量计算每个样品的平均IFNα浓度。然后，将样品“CV7202 GMP”的IFNα值设置为100％，并将来自同一供体的所有其他样品的结果针对该样品进行归一化，即[样品平均IFNα浓度]/[CV7202平均IFNα浓度]*100＝[CV7202的％]。图描绘了平均值+/-SD。
结果显示在图27中，并代表来自hPBMC(来自4个针对CV7202归一化的供体)的体外IFNα刺激。测试等量的每种LNP在人PMBC中的IFNα诱导作用。所有单价/二价候选疫苗诱导的IFNα水平相似，低于已知在该测定中诱导高水平IFNα的比较剂LNP配制的mRNA诱导的水平。
实施例15-初次免疫后18小时的体内血清IFNα水平
小鼠免疫
在BALB/c小鼠中评估了H1和H3茎mRNA构建体的免疫原性。mRNA组合以等摩尔比混合，并共同配制为单一LNP。在第0天和第21天用以下物质免疫10只雌性BALB/c小鼠：
(a)H1-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(b)H1-茎TM编码mRNA构建体
(c)H3-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(d)H3-茎TM编码mRNA构建体
(e)H1-茎铁蛋白和H3-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(f)H1-茎铁蛋白和H3-茎TM编码mRNA构建体
(g)H1-茎TM和H3-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(h)H1-茎TM和H3-茎TM编码mRNA构建体
(i)QIV(市售四价流感疫苗，包含株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)pdm09、A/Hong Kong/2671/2019(H3N2)、B/Washington/02/2019(B/Victoria)和B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata)的灭活分裂流感病毒体)，无佐剂(该组仅6只小鼠)
(j)NaCl(该组仅6只小鼠)。
小鼠免疫方案进一步适用于实施例16至21。
测定、分析和结果
第一次免疫后18小时通过球后出血采集血样。将140μl血液收集到Z-凝块激活剂200μl微管(Sarstedt，Cat#20.1291)中，并在室温(RT)下孵育30分钟以进行凝血。将样品离心5分钟，10 000rcf，RT，将血清转移至新鲜的Eppendorf管中并保存在-20℃下。根据制造商的说明(VeriKine-HS小鼠干扰素α所有亚型frpm PBL)，使用小鼠IFN-αELISA对小鼠IFN-α进行定量。血清按1:20稀释，并测试100μl稀释液。该测定使用包被抗鼠IFNα抗体的96孔板。将血清添加到板中，mIFNα与板上的抗体结合。除去血清，短暂洗涤板并与抗鼠IFNα检测抗体一起孵育，该抗体是生物素缀合的，与包被的抗体相比，与IFNα上不同的表位结合。然后用HRP缀合的链霉亲和素检测该夹心，并使用TMB(比色ELISA底物)进行可视化。用H2SO4终止溶液终止板，并使用Synergy HTX读数器在450nm处读取吸光度。该试剂盒提供了IFNα标准品，该标准品与样品平行运行，从而可以在稀释的标准品样品范围内定量蛋白质浓度。该图描绘了平均值+/-SD。
结果如图28所示。结果以pg/ml为单位表示为IFNα。在小鼠中，铁蛋白结构更具免疫刺激性。
实施例16-第35天的体内T细胞应答CD4+IFNγ+TNF+
为了分离脾细胞，将脾脏置于PBS+1％FCS中处理，并使用无菌5-10ml注射器的柱塞研磨。细胞两次通过孔径为0.45μm的细胞过滤器，并通过离心沉淀。为了去除红细胞，将细胞与红细胞裂解缓冲液(144mM NH4Cl、17mM Tris)在室温下孵育多达10分钟。离心样品并立即用PBS+1％FCS洗涤两次并冷冻直至进一步使用或直接用于细胞内细胞因子染色。
对于细胞内细胞因子染色，将细胞重悬于αMEM完全培养基(aMEM+10％FCS+1％谷氨酰胺+1％Pen/Strep+10mM Hepes)中，并在以每孔2x 106个细胞的96孔圆底板中进行刺激。接种后，通过离心板沉淀细胞并通过倒置除去上清液。将细胞重悬于含有以下刺激物的培养基中：
-1μg/ml肽文库(涵盖图中所示的H1茎或H3茎)
-2.5μg/ml抗CD28抗体
-PE-Cy7缀合的抗CD107a抗体(1:100稀释)
在添加GolgiPlug之前，将细胞在37℃下孵育1小时。再过5-6小时后，用新鲜的αMEM完全培养基更换培养基，并将板在4℃下储存过夜。
第二天，用PBS洗涤细胞两次，并用Aqua-Dye(PBS中1:1000；在4℃下30分钟)染色，以区分活细胞和死细胞。用PBS+0.5％BSA洗涤细胞2次，然后用抗表面标记抗体在4℃下染色30分钟。染色液含有α-CD8-APC-Cy7(1:200)、α-CD4-BD-Horizon V450(1:200)、α–Thy1.2-FITC(1:200)+FcγR-封闭(1:100)于100μl PBS/0.5％BSA中。再次用PBS+0.5％BSA洗涤细胞，并用Cytofix/Cytoperm处理进行细胞内染色(20分钟，室温)。用Permwash洗涤细胞2x，并使用100μl PermWash中的α-TNF-PE(1:100)+α-IFNγ-APC(1:100)对细胞因子进行染色(在4℃下30分钟)。将细胞在Permwash中洗涤2x以上，重悬于PBEA中，并在ZE5流式细胞仪上进行测量。使用FlowJo分析结果。
图显示对H1-茎(H1N1 A/Michigan/45/2015)或H3-茎(H3N2A/Finland/486/2004)具有特异性的IFNγ/TNF双阳性CD4+ T细胞(CD4+细胞的百分比)。线条表示平均值+/-SD。
结果如图29A和29B所示。两种蛋白质设计中的两种抗原都会诱导特异性CD4+ T细胞。TM诱导的水平往往高于铁蛋白设计诱导的水平。
实施例17-第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+TNF+
测定方案与实施例16中描述的相同。图描绘了IFNγ/TNF双阳性CD8+ T细胞(CD8+细胞的百分比)，线条表示平均值+/-SD。
结果如图30所示。H1茎设计可有效诱导CD8+。没有观察到蛋白质设计之间的明显差异。
实施例18-第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+CD107+
测定方案与实施例16中描述的相同。图描绘了IFNγ/CD107双阳性CD8+T细胞，线条表示平均值+/-SD。
结果如图31所示。CD8+ T细胞具有多功能表达IFNγ、TNF和/或CD107。
实施例19-第21天的体内抗H1结合抗体
第一次免疫后21天通过球后放血采集血清样品。如实施例15中所述制备血清。
使用100μl的1μg/ml碳酸氢盐缓冲液稀释液，在37℃下将重组HA(A/Hawaii/70/2019(H1N1))包被黑底96孔ELISA板4-5小时。用PBS/0.05％Tween 20清洗板，并用封闭缓冲液(PBS/0.05％Tween 20中5％奶)在4℃封闭过夜。第二天，洗涤ELISA板并与血清稀释液(在封闭缓冲液中稀释10倍，从1:50开始，使用100μl/孔)一起孵育，并在室温下孵育2-4小时。用PBS/0.05％Tween 20将板洗涤三次。HRP缀合的抗小鼠总IgG在封闭缓冲液中按1:5,000稀释，并在室温下孵育1小时。将板洗涤四次并用Amplex UltraRed显色。终点滴度代表最后一次血清稀释度的倒数，信号高于截止值。阳性信号的截止值定义为背景孔的平均值+5x标准差(不添加血清)。
线条代表GMT+95％置信区间。
结果如图32所示。单剂mRNA/LNP疫苗足以诱导异源抗体应答。铁蛋白设计比TM诱导更高的滴度。
实施例20-在第2次给药后14天通过多重血清学Luminex获得体内抗HA IgG抗体
Luminex的抗HA IgG多重血清学检测
使用以下方法在内部包被十四个不同的荧光磁珠群体(具有抗原特异性水平的APC/APC-Cy7荧光)。将100万个珠群体添加到试管中，用NaH2PO4100mM缓冲液洗涤并重悬，然后通过添加Sulfo-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺/ThermoFischerScientific cat.A39269，浓度为50mg/ml)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/ThermoFischerScientific cat.A35391，50mg/ml)活化羧基片段并在旋转搅拌器上室温孵育20分钟。每个步骤后，将珠剧烈涡旋并超声处理。用PBS清洗珠，并包被固定量的14种重组血凝素(HA)抗原(10或20μg，具体取决于抗原，以获得最佳信号)。抗原描述见表1。将珠在旋转搅拌器上在室温下孵育2小时。用PBS-TBN缓冲液(PBS-0.1％BSA-0.02％Tween 20-0.05％叠氮化物pH7.4)洗涤珠，并用该缓冲液在旋转搅拌器上室温孵育30分钟。然后再次洗涤珠并用PBS-TBN缓冲液重悬。使用TC20 Biorad计数器对珠进行计数并储存在4℃中。
测定如下进行。在96孔板中制备血清在PBS-Tween 0.05％缓冲液中的系列稀释液(体积为50μl/孔)。然后将50μl珠混合物(每个珠群体包含500个珠)添加到每个孔中，并在室温下轻轻振荡孵育60分钟。在磁力洗板机上用PBS-Tween 0.05％洗涤珠，并向每个孔中添加50μl在PBS-Tween 0.05％中按1:50稀释的抗小鼠IgG PE标记抗体(Southern Biotechcat.1030-09S)，并在轻轻振荡下在室温下孵育60分钟。在Luminex Bioplex 200读数器(Biorad)上采集之前，在磁力洗板机上用PBS-Tween 0.05％洗涤珠，并重悬于100μl PBS-Tween 0.05％中。使用Softmaxpro(Molecular Devices)软件计算抗体滴度。
表1-多重血清学板Luminex中包括的HA抗原
分析与结果
在第二次免疫后14天(第35天)，通过多重Luminex测定测量与组A的14种不同HA结合的IgG抗体的滴度。结果如图33-46所示。绘制各个滴度值，以及每组的几何平均值(GM)和样品量(N)。
H1-茎铁蛋白和TM抗原具有免疫原性，诱导同源应答(针对A/Michigan/45/2015)、异源应答(针对其他H1抗原)和异亚型交叉反应性应答(针对H2和H5抗原)。
H3-茎铁蛋白和TM具有免疫原性，诱导同源应答(针对A/Finland/486/2004)和异源应答(针对其他H3抗原)。H3-茎铁蛋白和TM抗原诱导异亚型交叉反应性应答(针对H10 A/Jiangxi-Dongu/346/2013)。H1茎铁蛋白和TM抗原诱导针对A2组HA抗原(即H7 A/Shanghai/2/2013)的交叉反应性应答，其中H1茎铁蛋白观察到应答较高。
H1和H3抗原的组合诱导A1组和A2组之间广泛的交叉反应。总而言之，比较4个组合组的不同分析表明，H1铁蛋白+H3铁蛋白在测试的14个HA中诱导了最广泛的抗体应答。
实施例21-在第2次给药后14天通过ADCC报告生物测定进行的体内抗H1A/Michigan/45/2015茎抗体
抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)报告生物测定(Promega)
为了确定ADCC功能，使用了Promega的小鼠FcγRIV试剂盒，并遵循以下方案。在96孔板中制备血清的系列稀释液。将靶细胞(内部转染的Expi293细胞在其表面表达来自H1A/Michigan/45/2015的血凝素茎抗原)添加到每个孔中(24000个细胞/孔)。效应细胞(Jurkat细胞，来自试剂盒，转染了被抗原-抗体-FcγRIII复合物激活时诱导生物发光的酶途径)也添加到每个孔中(60000个细胞/孔)，并在37℃下孵育6小时。在应用Bio-Glow底物(试剂盒中提供)后，使用发光板读数器测量荧光素酶活性。结果表示为曲线下面积(AUC)。
分析与结果
在第二次免疫后14天(第35天)，通过ADCC Reporter Bioassay Promega测量针对A/Michigan/45/2015H1茎的ADCC功能性抗体。结果如图47所示。绘制各个AUC(曲线下面积)值，以及几何平均值(GMT)和95％置信区间。对于H3-铁蛋白和H3-TMD组，仅测试了该组的一个合并样品。
由所有含有H1茎抗原的测试构建体引发的抗体均通过ADCC发挥作用。
实施例22-通过ADCC报告生物测定的体外抗H3茎抗体
对于H3特异性ADCC测定，通过转染制备靶细胞。HeLa细胞以每孔200μl培养基中10,000个细胞的密度接种到白色平底96孔板中。第二天，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000用编码相应靶蛋白的mRNA转染细胞。对于每个孔，将0.05μg mRNA与0.075μl Lipofectamine 2000(比例为1:1.5)在总共50μl Opti-MEM培养基中混合，然后添加到细胞中。mRNA编码H3N2 A/Finland/486/2004的膜结合H3茎部分(即H3_TM疫苗；图48A)或H3N2 A/HongKong/45/2019的全长/野生型H3(含有在2020/2021的重组HA疫苗中；图48B)。
18-24小时后，根据制造商的说明，将细胞用于mFcγRIV ADCC报告生物测定(Promega)。首先，用25μl测定缓冲液/孔替换培养基。将血清样品以1:33.3(孔中最终稀释度为1:100)开始在测定缓冲液中稀释三倍(十次)，并将每种稀释液25μl添加到含有靶细胞的孔中。合并来自预期无ADCC活性的组的血清样品(H1_F组和H1_TM组各5只动物的2个池，NaCl组6只动物的1个池)。
将鼠FcγRIV效应细胞(即稳定表达mFcγRIV和NFAT应答元件依赖性荧光素酶表达盒的Jurkat细胞)以3x 106个细胞/ml的浓度在测定缓冲液中解冻，并添加25μl效应细胞悬浮液(75,000个细胞/孔)至测定孔。将板在37℃、5％CO2下孵育6小时，以允许信号传导和荧光素酶表达发生。
为了进行检测，将测定孔与75μl Bio-GloTM荧光素酶测定底物在室温下孵育15分钟，并使用BioTek Synergy HTX读板仪进行读数。针对血清稀释度绘制相对光单位，并使用GraphPad Prism 9计算曲线下面积(AUC)。没有血清孵育的孔的平均值+三个标准差用作AUC计算的基线值。图描绘了GMT+95％CI。对于没有信号的样品，AUC设置为1。
结果示于图48A和48B中。H3-茎疫苗诱导ADCC抗体，其靶向同源H3-茎(图48A)。抗体还可以结合来自不同H3N2株的异源全长HA(图48B)。
第2.2节-具有经修饰核苷的实施例
实施例23-体外和体内先天免疫刺激
体内研究-小鼠免疫
进行了进一步的研究以调查核苷修饰(假尿苷和1-甲基-假尿苷)对免疫原性的影响。将编码H1-茎和H3-茎并用相同核苷产生的mRNA以等摩尔比混合，并共同配制为一个LNP。在第0天和第21天用以下物质免疫10只雌性BALB/c小鼠：
(a)基于未修饰核苷的H1-茎铁蛋白和H3-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(b)基于假尿苷核苷的H1-茎铁蛋白和H3-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(c)基于1-甲基-假尿苷核苷的H1-茎铁蛋白和H3-茎铁蛋白编码mRNA构建体
(d)基于未修饰核苷的H1-茎TM和H3-茎TM编码mRNA构建体
(e)基于假尿苷核苷的H1-茎TM和H3-茎TM编码mRNA构建体
(f)基于1-甲基-假尿苷核苷的H1-茎TM和H3-茎TM编码mRNA构建体
(g)NaCl(该组仅5只小鼠)。
小鼠免疫方案进一步适用于实施例24、25和27至29。
体内研究的测定、分析和结果
如实施例15中所述检测血清中的小鼠IFNα。线条表示平均值+/-SD。
结果示于图49A中。核苷修饰可降低免疫应答的血清IFNα水平。
体外研究
如实施例14中所述进行PBMC刺激。线条表示平均值+/-SD。
结果显示于图49B中。核苷修饰可降刺激应答的血清IFNα水平。
实施例24-在第2次给药后14天通过多重血清学Luminex获得体内抗HA IgG抗体(具有经修饰的核苷)
Luminex的抗HA IgG多重血清学检测
如实施例20中所述进行多重Luminex测定。
分析与结果
在第二次免疫后14天(第35天)，通过多重Luminex测定测量与组A的14种不同HA结合的IgG抗体的滴度。结果如图50-63所示。绘制各个滴度值，以及每组的几何平均值(GM)、95％置信区间和样品量(N)。
所有H1茎铁蛋白和TM抗原(基于未修饰和经修饰的核苷)均具有免疫原性，可诱导同源应答(针对A/Michigan/45/2015)、异源应答(针对其他H1抗原)和异亚型交叉反应性应答(针对H2和H5抗原)。
所有H3-茎铁蛋白和TM抗原(基于未修饰的和经修饰的核苷)均具有免疫原性，诱导同源应答(针对A/Finland/486/2004)、异源应答(针对其他H3抗原)。所有抗原诱导异亚型交叉反应性应答(针对H10A/Jiangxi-Dongu/346/2013)。
H1和H3抗原的组合诱导A1组和A2组之间广泛的交叉反应。总而言之，比较不同组合组的不同分析表明，H1铁蛋白+H3铁蛋白在测试的14个HA中诱导了最广泛的抗体应答。
实施例25-在第2次给药后14天通过ADCC报告生物测定进行的体内抗H1A/Michigan/45/2015茎抗体(具有经修饰的核苷)
抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)报告生物测定(Promega)
ADCC报告生物测定如实施例21中所述进行。
分析与结果
在第二次免疫后14天(第35天)，通过ADCC Reporter Bioassay Promega测量针对A/Michigan/45/2015H1茎的ADCC功能性抗体。结果如图64所示。绘制各个AUC(曲线下面积)值，以及几何平均值(GMT)和95％置信区间。
由所有含有H1茎抗原的测试构建体引发的抗体均通过ADCC发挥作用。
实施例26-在第2次给药后14天通过ADCC报告生物测定进行的体外抗H3A/Finland/486/2004(H3N2)茎抗体
如实施例22中所述，使用表达H3N2A/Finland/486/2004(即，H3_TM疫苗；图65)的膜结合H3茎部分的靶细胞进行H3特异性ADCC报告生物测定。
图描绘了曲线数据(AUC)下的各个区域，其中GMT+95％CI用线条表示。
结果如图65所示。所有候选疫苗均诱导针对H3的ADCC诱导抗体。
实施例27-第35天的体内T细胞应答CD4+IFNγ+TNF+(经修饰的核苷)
如实施例16中所述进行脾细胞分离和细胞内细胞因子染色。图描绘了IFNγ/TNF双阳性CD4+ T细胞，线条表示平均值+/-SD。
结果示于图66A和66B中。TM设计诱导更高水平的HA茎特异性抗体。
实施例28-第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+TNF+(经修饰的核苷)
测定方案与实施例16中描述的相同。
图描绘了IFNγ/TNF双阳性CD8+ T细胞，线条表示平均值+/-SD。结果如图67所示。TM设计诱导更高水平的HA茎特异性CD8+ T细胞。
实施例29-第35天的体内T细胞应答CD8+IFNγ+CD107+
测定方案与实施例16中描述的相同。图描绘了IFNγ/CD107双阳性CD8+T细胞，线条表示平均值+/-SD。结果如图68所示。TM设计诱导更高水平的HA茎特异性抗体。所有设计均诱导表达IFNγ、TNF和/或CD107的多功能H1特异性CD8+ T细胞。
参考文献
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Claims (116)

1.一种载体配制的mRNA，其包含编码流感HA茎多肽的至少一个编码序列。
2.根据权利要求1所述的载体配制的mRNA，其中所述载体是脂质纳米颗粒(LNP)。
3.根据权利要求2所述的载体配制的mRNA，其中所述LNP包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、甾醇和可电离阳离子脂质。
4.根据权利要求3所述的载体配制的mRNA，其中所述可电离阳离子脂质具有式III：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基。
5.根据权利要求4所述的载体配制的mRNA，其中所述可电离阳离子脂质具有式III：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
L1或L2各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基；
G3是C1-C24亚烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基；
R3是OR5；以及
R5是H。
6.根据权利要求3所述的载体配制的mRNA，其中所述可电离阳离子脂质具有下式：
7.根据权利要求6所述的载体配制的mRNA，其中所述可电离阳离子脂质具有式III-3：
8.根据权利要求4所述的载体配制的mRNA，其中所述至少一种PEG-脂质包含PEG-DMG或PEG-cDMA。
9.根据权利要求4所述的载体配制的mRNA，其中所述至少一种PEG-脂质包含式IVa：
其中n具有30至60的平均值，优选地其中n具有约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54的平均值，最优选地其中n具有49或45的平均值；或者
其中n是选择的整数，使得所述PEG脂质的平均分子量为约2500g/mol。
10.根据权利要求9所述的载体配制的mRNA，其中所述可电离阳离子脂质具有式III-3：
11.根据权利要求3至10中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述非阳离子脂质是中性脂质，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或鞘磷脂(SM)，优选地所述中性脂质是DSPC。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述甾醇是胆固醇。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述LNP包含约0.5至15摩尔％的PEG修饰的脂质、约5至25摩尔％的非阳离子脂质、约25至55摩尔％的甾醇和约20摩尔％至60摩尔％的可电离阳离子脂质。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述LNP的直径为50至200nm。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述LNP具有0.4或更小，例如0.3或更小的多分散性。
16.根据权利要求2至15中任一项所述的载体配制的mRNA，其中核苷酸(N)与磷脂(P)的比率在1N:1P至20N:1P、1N:1P至10N:1P、2N:1P至8N:1P、2N:1P至6N:1P或3N:1P至5N:1P的范围内。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的载体配制的mRNA，其中至少一半的所述mRNA，合适地至少85％，尤其是至少95％，例如全部的所述mRNA被包封在所述LNP中。
18.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含至少一个另外编码序列，所述至少一个另外编码序列编码一个或多个异源肽或蛋白质元件，所述异源肽或蛋白质元件选自信号肽、接头、辅助表位、抗原聚簇元件、三聚体元件、跨膜元件、蛋白质纳米颗粒和/或VLP形成序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含编码蛋白质纳米颗粒的至少一个另外编码序列。
20.根据权利要求19所述的载体配制的mRNA，其中所述蛋白质纳米颗粒是铁蛋白。
21.根据权利要求20所述的载体配制的mRNA，其中所述铁蛋白选自细菌和昆虫铁蛋白。
22.根据权利要求20或21所述的载体配制的mRNA，其中所述铁蛋白是细菌铁蛋白。
23.根据权利要求22所述的载体配制的mRNA，其中所述细菌铁蛋白是幽门螺杆菌铁蛋白。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的载体配制的mRNA，其中蛋白质纳米颗粒和所述流感HA茎多肽通过接头连接，并且其中所述接头由1至10个残基、优选地2至5个残基、例如2、3、4或5个残基组成。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述接头包含多肽序列SGG或由多肽序列SGG组成。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述跨膜元件是天然流感HA跨膜元件。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述信号肽是天然前导序列或HLA-Drα前导序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：编码信号肽、优选地天然前导序列的编码序列，所述至少一个编码序列，接头和跨膜元件。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：编码信号肽、优选地天然前导序列的编码序列，所述至少一个编码序列，接头和蛋白质纳米颗粒，优选地为细菌铁蛋白，更优选地为幽门螺杆菌铁蛋白。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽是包含全长流感HA茎区域或由全长流感HA茎区域组成的多肽。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽是包含流感HA茎区域的免疫原性片段或由流感HA茎区域的免疫原性片段组成的多肽。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽是包含流感HA茎区域的免疫原性变体或由流感HA茎区域的免疫原性变体组成的多肽。
33.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽衍生自甲型流感，例如甲型流感组1或组2。
34.根据权利要求33所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽衍生自甲型流感组1，优选地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17或H18，更优选地H1。
35.根据权利要求34所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项，优选地SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
36.根据权利要求34或35所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项，优选地SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7中任一项，优选地SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
38.根据权利要求34至36中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
39.根据权利要求35或36所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
40.根据权利要求35或36中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
41.根据权利要求33所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽衍生自甲型流感组2，优选地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和H15，更优选地H3、H7或H10。
42.根据权利要求41所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，优选地其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的HA茎编码序列。
43.根据权利要求41或42所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列，优选地其中所述mRNA包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的HA茎编码序列。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
45.根据权利要求41至43中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：编码序列，其编码与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
46.根据权利要求42或43所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:18至21中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
47.根据权利要求42或43所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:24至29中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
48.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述编码序列是经密码子修饰的编码序列，其中由所述经密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列与由相应的野生型或参考编码序列编码的氨基酸序列相比优选地没有被修饰。
49.根据权利要求48所述的载体配制的mRNA，其中所述经密码子修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任意组合。
50.根据权利要求48或49所述的载体配制的mRNA，其中所述经密码子修饰的编码序列具有至少约45％、50％、55％或60％的G/C含量。
51.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽的长度为400个残基或更少，特别是300个残基或更少，特别是250个残基或更少，例如220个残基或更少。
52.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽的长度为130个残基或更多，特别是160个残基或更多，特别是180个残基或更多，例如190个残基或更多。
53.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述流感HA茎多肽的长度为130至400个残基，特别是160至300，特别是180至250，例如190至220个残基。
54.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其包含两个或更多个各自编码流感HA茎多肽的编码序列，其中所述编码序列在单独的mRNA分子上编码。
55.根据权利要求1至53中任一项所述的载体配制的mRNA，其包含两个或更多个各自编码流感HA茎多肽的编码序列，其中所述编码序列在同一mRNA分子上编码。
56.根据权利要求54或55所述的载体配制的mRNA，其中所述两个或更多个编码序列编码不同的流感HA茎多肽。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述两个或更多个编码序列包含各自编码流感HA茎多肽的三个或四个编码序列。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述两个或更多个编码序列编码衍生自甲型流感，例如甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感HA茎多肽。
59.根据权利要求58所述的载体配制的mRNA，其中所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感组1、优选地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和/或H18，更优选地H1的流感HA茎多肽；以及所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感组2、优选地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和/或H15、更优选地H3、H7和/或H10，还更优选地H3的流感HA茎多肽。
60.根据权利要求59所述的载体配制的mRNA，其中所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感病毒亚型H1的流感HA茎多肽，及所述两个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感病毒亚型H3的流感HA茎多肽。
61.根据权利要求60所述的载体配制的mRNA，其包含各自编码流感HA茎多肽的三个或更多个编码序列，所述三个或更多个编码序列中的至少一个编码衍生自甲型流感亚型H7的流感HA茎多肽，优选地，其中所述载体配制的mRNA不包含编码衍生自甲型流感H10亚型的流感HA茎多肽的编码序列。
62.根据权利要求60或61所述的载体配制的mRNA，其包含各自编码流感HA茎多肽的至少三个编码序列，但不包含编码衍生自甲型流感亚型H10的流感HA茎多肽的编码序列，优选地，其中所述载体配制的mRNA不包含编码衍生自甲型流感H7亚型的流感HA茎多肽的编码序列。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项，优选地SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
64.根据权利要求63所述的载体配制的mRNA，其中所述衍生自甲型流感组1的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一项，优选地SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
65.根据权利要求63或64所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
66.根据权利要求63或64中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
67.根据权利要求58至66中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中任一项所示氨基酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
68.根据权利要求67所述的载体配制的mRNA，其中所述衍生自甲型流感组2的流感HA茎多肽包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中任一项，优选地SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
69.根据权利要求67或68所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:18至21中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
70.根据权利要求67或68所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含以下或由以下组成：核酸序列，其与SEQ ID NO:24至29中任一项所示核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。
71.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含5’帽，优选地为m7G、帽0、帽1、帽2、经修饰的帽0或经修饰的帽1结构，优选地为5’-帽1结构。
72.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含聚(A)尾序列，优选地包含30至200个腺苷核苷酸和/或至少一个聚(C)序列，优选地包含10至40个胞嘧啶核苷酸。
73.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含至少一个组蛋白茎环。
74.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含至少一个包含30至200个腺苷核苷酸、优选地100个腺苷核苷酸的聚(A)尾序列，其中所述RNA的3’末端核苷酸是腺苷。
75.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含5’非翻译区(UTR)。
76.根据权利要求75所述的载体配制的mRNA，其中所述5’UTR包含以下或由以下组成：衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因或来自这些基因中任一个的同源物、片段或变体的5’-UTR的核酸序列。
77.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含3’UTR。
78.根据权利要求77所述的载体配制的mRNA，其中所述3’UTR包含以下或由以下组成：衍生自选自PSMB3、ALB7、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或来自这些基因中任一个的同源物、片段或变体的3’-UTR的核酸序列。
79.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含异源5’-UTR以及至少一个异源3’-UTR，所述异源5’-UTR包含以下或由以下组成：衍生自HSD17B4的5’-UTR的核酸序列，所述至少一个异源3’-UTR包含以下或由以下组成：衍生自PSMB3的3’-UTR的核酸序列。
80.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA从5’到3’包含：
i)5’-帽1结构；
ii)衍生自HSD17B4基因的5’-UTR的5’-UTR；
iii)所述编码序列；
iv)衍生自PSMB3基因的3’-UTR的3’-UTR；
v)任选地，组蛋白茎环序列；以及
vi)包含约100A核苷酸的聚(A)序列，其中所述RNA的3’末端核苷酸是腺苷。
81.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA不包含化学修饰的核苷酸。
82.根据权利要求1至80中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA包含至少一个化学修饰。
83.根据权利要求82所述的载体配制的mRNA，其中所述化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
84.根据权利要求82或83所述的载体配制的mRNA，其中所述化学修饰为N1-甲基假尿苷和/或假尿苷，优选地N1-甲基假尿苷。
85.根据权利要求82或84所述的载体配制的mRNA，其中mRNA包含的所述化学修饰是尿苷修饰，优选地其中所述mRNA中100％的尿苷位置被修饰。
86.根据前述权利要求中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA是非复制的。
87.根据权利要求1至85中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA是自我复制的。
88.根据权利要求87所述的载体配制的mRNA，其中所述自我复制RNA分子编码(i)可以从所述自我复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)所述流感HA茎多肽。
89.根据权利要求87或88所述的载体配制的mRNA，其中所述RNA分子包含两个开放阅读框，第一开放阅读框编码甲病毒复制酶，及第二开放阅读框编码所述流感HA茎多肽。
90.根据权利要求87或88所述的载体配制的mRNA，其中所述RNA分子包含三个开放阅读框，第一开放阅读框编码甲病毒复制酶，第二开放阅读框编码所述流感HA茎多肽，及第三开放阅读框编码蛋白质纳米颗粒。
91.根据权利要求88至90中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述mRNA具有5’帽-5’UTR-非结构蛋白(NSP)1-4-亚基因组启动子-流感HA茎多肽-接头-蛋白质纳米颗粒-3’UTR-聚A构型。
92.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至91中任一项所述的载体配制的mRNA，其中所述组合物任选地包含至少一种药学上可接受的载体。
93.根据权利要求92所述的免疫原性组合物，其中所述组合物是除根据权利要求1至91中任一项所定义的mRNA之外还包含多个或至少一个另外的mRNA的多价组合物。
94.根据权利要求93所述的免疫原性组合物，其中所述多价组合物包含两个或更多个根据权利要求1至91中任一项所定义的mRNA，优选地两个、三个或四个根据权利要求1至91中任一项所定义的mRNA，更优选地都各自编码不同的流感HA茎多肽。
95.根据权利要求94所述的免疫原性组合物，其中所述两个或更多个mRNA编码衍生自甲型流感，例如甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感HA茎多肽。
96.根据权利要求95所述的免疫原性组合物，其中所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感组1、优选地甲型流感亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和/或H18，更优选地H1的流感HA茎多肽；并且所述两个或更多个mRNA中的至少一个编码衍生自甲型流感组2、优选地甲型流感亚型H3、H4、H7、H10、H14和/或H15、更优选地H3、H7和/或H10，还更优选地H3的流感HA茎多肽。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述两个或更多个mRNA中的至少一个、优选地每一个是非复制的。
98.一种疫苗，其包含根据权利要求1至91中任一项所述的mRNA和/或根据权利要求92至97中任一项所述的免疫原性组合物。
99.根据权利要求98所述的疫苗，其中所述疫苗是多价疫苗，其包含多个或至少多于一个根据权利要求1至91中任一项所定义的RNA，或多个或至少多于一个根据权利要求92至97中任一项所定义的组合物。
100.一种试剂盒或成套试剂盒，其包含根据权利要求1至91中任一项所述的RNA、和/或根据权利要求92至97中任一项所述的组合物、和/或根据权利要求98或99所述的疫苗，任选地包含用于溶解的液体媒剂，以及任选的提供有关组分的施用和剂量信息的技术说明书。
101.根据权利要求1至91中任一项所述的载体配制的mRNA、根据权利要求92至97中任一项所述的免疫原性组合物、根据权利要求98或99所述的疫苗、根据权利要求100所述的试剂盒或成套试剂盒，用作药物。
102.根据权利要求1至91中任一项所述的载体配制的mRNA、根据权利要求92至97中任一项所述的组合物、根据权利要求98或99所述的疫苗、根据权利要求100所述的试剂盒或成套试剂盒，用于治疗或预防流感病毒、优选地甲型流感病毒的感染。
103.根据权利要求102所述使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒，其中所述载体配制的mRNA的单剂量为0.01至1000μg，尤其是1至500μg，特别是10至250μg总mRNA。
104.根据权利要求102或103所述使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒，用于肌内施用。
105.根据权利要求102至104中任一项所述使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒，其中引发针对流感病毒、优选地针对甲型流感病毒的免疫应答，优选地适应性免疫应答，更优选地保护性适应性免疫应答。
106.根据权利要求102至105中任一项所述使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒，其中所引发的免疫应答部分地或完全地降低受试者经历的流感病毒感染的一种或多种症状的严重性和/或缩短受试者经历流感病毒感染的一种或多种症状的时间。
107.根据权利要求102至106中任一项所述使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒，其中所引发的免疫应答降低了攻击后发展为确定的流感病毒感染的可能性。
108.根据权利要求102至107中任一项所述使用的载体配制的mRNA、免疫原性组合物、疫苗、试剂盒或成套试剂盒，其中所引发的免疫应答减缓流感的进展。
109.一种治疗或预防病症的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者应用或施用根据权利要求1至91中任一项所述的载体配制的mRNA、根据权利要求92至97中任一项所述的组合物、根据权利要求98或99所述的疫苗或根据权利要求100所述的试剂盒或成套试剂盒。
110.根据权利要求109所述的治疗或预防病症的方法，其中所述病症是流感病毒、优选地甲型流感病毒的感染。
111.根据权利要求109或110所述的治疗或预防病症的方法，其中所述有需要的受试者是哺乳动物受试者，优选地人受试者。
112.一种引发免疫应答的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者应用或施用根据权利要求1至91中任一项所述的载体配制的mRNA、根据权利要求92至97中任一项所述的组合物、根据权利要求98或99所述的疫苗或根据权利要求100所述的试剂盒或成套试剂盒。
113.根据权利要求112所述的引发免疫应答的方法，其中所述免疫应答是针对流感病毒、优选地针对甲型流感病毒的适应性免疫应答，优选地保护性适应性免疫应答。
114.根据权利要求113所述的引发免疫应答的方法，其中所述适应性免疫应答包括产生与HA蛋白结合的抗体，该HA蛋白不是由所述载体配制的mRNA编码。
115.根据权利要求112至114中任一项所述的引发免疫应答的方法，其中所述免疫应答包括针对流感病毒、优选地针对甲型流感病毒、更优选地针对组1和/或组2甲型流感病毒亚型的同源、异源和/或异亚型交叉反应性免疫原性应答。
116.根据权利要求112至115所述的引发免疫应答的方法，其中所述有需要的受试者是哺乳动物受试者，优选地人受试者。
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