JP6921833B2 - ヒトサイトメガロウイルスワクチン - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項のもとで、「ヒトサイトメガロウイルスワクチン」と題された２０１５年１０月２２日に出願された米国仮出願第６２／２４５，１６６号、および「ヒトサイトメガロウイルスワクチン」と題された２０１５年１０月２８日に出願された米国仮出願第６２／２４７，６１４号、および２０１５年１０月２２日に出願された米国仮出願第６２／２４５，０３１号の利益を主張するものであり、その各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒａｌｅｓ目のウイルスの属であり、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科で、Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅの亜科である。この属には現在、ヒト、サル、およびげっ歯類を含む異なる哺乳類について同定および分類されている８種が存在する。最も研究された属は、ヒトサイトメガロウイルスであり、これはまた、ヒト集団に広く分布しているヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）としても知られている。ＨＨＶ−５に関連する疾患としては、単核球症および肺炎が挙げられる。全てのヘルペスウイルスは、長時間にわたり体内潜在性を維持する特徴的な能力を共有する。それらは体全体に見られるかもしれないが、ＣＭＶ感染はしばしばヒトおよび他の哺乳動物の唾液腺と関連している。他のＣＭＶウイルスは、いくつかの哺乳動物種に見出されるが、動物から単離された種は、ゲノム構造に関してＨＣＭＶとは異なり、ヒト疾患を引き起こすとは報告されていない。
ＨＣＭＶは、世界のほとんどの地域で風土病である。ＨＣＭＶは、世界中の成人人口の５０〜１００％に感染する遍在性の大型エンベロープ型ウイルスである。免疫不全宿主では一般的に無症候性であるが、ＨＣＭＶ感染は、乳児に続いて、先天性または新生児感染、移植レシピエント、またはＡＩＤＳ患者などの、免疫無防備状態の人における罹患率および死亡率の主要な原因である。
一次感染は通常、無症状の疾患を引き起こし、その後ウイルスは潜伏性になり、後で再活性化する能力を保持する。このウイルスは、血液、唾液、尿、精液および母乳などの体液を介して伝染する。特に、未発症または免疫不全の個体は、ＨＣＭＶによる感染に対して非常に敏感である。米国人口の少なくとも６０％がＣＭＶに曝されており、高リスク群（例えば、妊娠中に母親がＣＭＶに感染した胎児またはＨＩＶ感染者）において９０％超の罹患率を有すると推定されている。
健康な人では、ＨＣＭＶは典型的には、無症候性感染症を引き起こすか、軽度のインフルエンザ様の症状を生じる。しかし、２つの集団の中で、ＨＣＭＶは重大な病状の原因となる。第１に、ＨＣＭＶは、子宮内で感染した新生児の先天性欠損の主要な原因である。先天的に感染した新生児のうち、５〜１０％は小頭症、頭蓋内石灰化および肝炎ならびに中枢神経系、肝臓および網膜を含む多くの組織および器官に影響を及ぼし、多臓器不全および死につながる可能性がある巨細胞封入体症など、出生時に主要な臨床症状を有する。他の乳児は、出生時に無症候性である場合もあるが、後に聴力損失または中枢神経系異常を発症し、特に知的能力低下および精神遅滞を引き起こす。これらの病理は、ＨＣＭＶが上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、ニューロン、および単球／マクロファージを含む多様な細胞型に進入して複製する能力に部分的に起因する。
リスクのある第２の集団は、ＨＩＶ感染に罹患している患者および移植を受けている患者のような免疫無防備状態の患者である。この状況では、ウイルスは日和見病原体となり、罹患率および死亡率が高い重度の疾患を引き起こす。臨床的疾患は、発熱、肺炎、肝炎、脳炎、脊髄炎、大腸炎、ブドウ膜炎、網膜炎および神経障害を含む様々な症状を引き起こす。免疫不全個体におけるＨＣＭＶ感染症のまれな顕在化としては、ギラン・バレー症候群、髄膜脳炎、心膜炎、心筋炎、血小板減少症、および溶血性貧血が挙げられる。さらに、ＨＣＭＶ感染は、移植血管硬化症および再狭窄による臓器移植片喪失のリスクを増大させ、移植患者および一般集団におけるアテローム性動脈硬化症を増大し得る。ＨＣＭＶ感染は、移植後１年目の患者の７５％において臨床的疾患を引き起こすと推定される。
現在、承認されたＨＣＭＶワクチンはない。２つの候補ワクチンであるＴｏｗｎｅおよびｇＢ／ＭＦ５９は、第ＩＩ相の有効性試験を完了している。Ｔｏｗｎｅワクチンは、病原性Ｔｏｌｅｄｏ株による攻撃によって引き起こされる感染症および疾患の両方に対して防御的であり、また重度の移植後ＣＭＶ疾患を予防するのにも有効であるようである。しかし、小規模の第ＩＩ相臨床試験では、低用量のＴｏｗｎｅワクチンは、子供はＣＭＶが活発に遊離しているが、血清陰性である母親の感染に対して防御を示せなかった。
ｇＢ／ＭＦ５９ワクチンは、ヒトにおいて高レベルの線維芽細胞進入中和抗体を誘導するＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の膜貫通欠損型バージョンから構成されるタンパク質サブユニットワクチンであり、成人および幼児の両方において安全でかつ耐容性が高いことが示されている。ｇＢ／ＭＦ５９ワクチンの最近の第ＩＩ相二重盲検プラセボ対照試験では、滅菌免疫を誘導する際に５０％の有効性が明らかになった。このワクチンは強力な抗体応答を誘発するが、非常に弱いＴ細胞応答を誘導するので、ワクチンによってもたらされる部分的有効性は、主に抗体媒介性であると考えられる。このＨＣＭＶワクチンは保護効果を示す最初のものであるが、その５０％の保護はほとんどのワクチンにとって望ましい８０〜９０％には及ばない。
さらに、抗体療法は、免疫無防備状態の個体におけるＨＣＭＶ感染を制御し、母体−胎児感染の病理学的結果を軽減させるために使用されているが、このような治療は通常ウイルスを根絶するのに十分ではない。混合結果を有するＨＣＭＶ疾患の予防のための免疫抑制治療に関連して、移植患者にＨＣＭＶ免疫グロブリン（Ｉｇ）を投与した。抗体治療はまた、先天性感染を制御し、新生児の疾患を予防するためにも使用されている。しかしながら、これらの生成物は、比較的低い効能を有する血漿誘導体であり、十分な量の中和抗体を送達するためには、非常に高用量で静脈内注入によって投与されなければならない。
ＨＣＭＶは、神経発達異常および子供の他の先天性欠損の主要なウイルス性原因であり、社会への費用は相当なものである。抗ウイルス療法が利用可能であるが、抗ウイルス剤による治療は不完全であり、ＣＭＶワクチンの開発はＣＭＶ感染を予防するための最も有望な戦略である。効果的なＨＣＭＶワクチンの健康および経済的利益が重要であることを考えると、米国医学研究所および米国国立ワクチンプログラムオフィスは、ＣＭＶワクチンの開発を最優先事項に分類しているが、候補ワクチンのライセンス供与は検討されていない。
要約
ＨＣＭＶワクチンがないという観点から、ＨＣＭＶ感染を予防および／または処置するために、全ての患者集団において安全かつ有効であるワクチンの必要性が重要である。特に、ＨＣＭＶの重篤度および／または持続時間を予防または軽減するために、免疫無防備状態の妊娠のリスクのある女性、および幼児患者にとって安全かつ有効なワクチンが必要とされている。本明細書では、リボ核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））が身体の細胞機構を安全に誘導して、天然のタンパク質から抗体、および細胞の内部および外部の治療活性を有し得る他の全体として新規なタンパク質構築物まで、目的のほぼあらゆるタンパク質を産生することができるという知識をなすＲＮＡワクチンが提供される。本開示のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを用いて、ＤＮＡまたは弱毒化ウイルスワクチン接種に関連する多くのリスクなしに、細胞性免疫および体液性免疫の両方を含むヒトサイトメガロウイルスに対するバランスの取れた免疫応答を誘導し得る。
ＲＮＡワクチンは、感染の蔓延、または満たされていない医学的必要性の程度もしくはレベルに応じて、様々な状況で利用し得る。ＲＮＡワクチンは、種々の遺伝子型、株および分離株のＨＣＭＶを治療および／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販されている抗ウイルス療法治療よりもかなり大きな抗体価を生成し、かつより早い応答を生じるという点で優れた特性を有する。理論に縛られることは望まないが、ｍＲＮＡポリヌクレオチドとしてのＲＮＡワクチンは、ＲＮＡワクチンが天然の細胞機構を共用するので、翻訳時に適切なタンパク質高次構造を生成するようにより良く設計されていると考えられる。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発し得る伝統的ワクチンとは異なり、ＲＮＡワクチンは、より自然な様式で細胞系に提示される。
本開示に包含される種々のヒトサイトメガロウイルスアミノ酸配列は、以下の表１、２および６に示される。本明細書で提供されるＲＮＡワクチンは、表１、２もしくは６に提供されるＨＣＭＶタンパク質の少なくとも１つをコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド、または、その断片、ホモログ（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性）または誘導体を含み得る。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。１つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、単一ＲＮＡポリヌクレオチド上にコードされてもよく、または複数（例えば、２つ以上）のＲＮＡポリヌクレオチドに個別にコードされてもよい。
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドはＨＣＭＶ糖タンパク質である。例えば、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮおよびｇＭ、ならびにその免疫原性断片またはエピトープから選択され得る。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＬポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＯポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＮポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＭポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、または配列番号１１３の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、変異体ｇＨポリペプチド、変異体ｇＬポリペプチド、または変異体ｇＢポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬまたはｇＢポリペプチドは、以下のドメイン配列のうちの１つ以上を欠いている切断型ポリペプチドである：（１）疎水性膜近位ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、および（３）細胞質ドメイン。いくつかの実施形態では、切断型ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、またはｇＢポリペプチドは、疎水性膜近位ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、切断型ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、またはｇＢポリペプチドは、細胞外ドメイン配列のみを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ切断型糖タンパク質は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。いくつかの実施形態では、この抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ８３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３０ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３１Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶタンパク質は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質、その断片、またはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、２つ以上の糖タンパク質、その断片、またはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、少なくとも１つのＨＣＭＶ糖タンパク質、その断片またはエピトープおよび少なくとも１つの他のＨＣＭＶタンパク質、その断片またはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、単一のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされ、例えば、各ＨＣＭＶポリペプチドは、別個のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢと、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つ以上のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨと、ｇＬ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つ以上のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＬと、ｇＢ、ｇＨ、ｇＯ、ｇＮ、およびｇＭポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つ以上のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ｇＢおよびｇＨである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ｇＢおよびｇＬである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ｇＨおよびｇＬである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ｇＢ、ｇＬおよびｇＨである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＵＬ１２３およびＵＬ１３０である。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＵＬ１２３および１３１Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＵＬ１３０および１３１Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＵＬ １２８、ＵＬ１３０および１３１Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨとｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つ以上のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＬと、ｇＨ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される１つ以上のＨＣＭＶポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶ糖タンパク質は、ｇＬ、ｇＨ、ＵＬ １２８、ＵＬ１３０および１３１Ａである。ワクチンが２つ以上のＨＣＭＶタンパク質を含むこれらの実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＭＶ ｇＨは、変異体ｇＨ、例えば、本明細書に開示される任意の変異体ＨＣＭＶ ｇＨ糖タンパク質、例えば、前出の段落に、および実施例に開示された任意の変異体ＨＣＭＶであってもよい。ワクチンが２つ以上のＨＣＭＶタンパク質を含むこれらの実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＭＶ ｇＢは、変異体ｇＢ、例えば、本明細書に開示される任意の変異体ＨＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質、例えば、前出の段落におよび実施例に開示された任意の変異体ＨＣＭＶ ｇＢであってもよい。ワクチンが２つ以上のＨＣＭＶ ｇＬタンパク質を含むこれらの実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＭＶ ｇＬは、変異体ｇＬ、例えば、本明細書に開示される任意の変異体ＨＣＭＶ ｇＬ糖タンパク質、例えば、前の段落および実施例に開示されている任意の変異体ＨＣＭＶ ｇＬであってもよい。
ＨＣＭＶワクチンが、２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープ（単一ＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされるか、または２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされるかのいずれか、例えば、個別のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる各々のタンパク質）をコードするオープンリーディングフレームを有する２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む特定の実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、変異体ｇＢ、例えば、前の段落で本明細書に開示される任意の変異体ｇＢポリペプチド、ならびにｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、変異体ｇＨ、例えば、前の段落で本明細書において開示された任意の変異体ｇＨポリペプチド、ならびにｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶタンパク質は、変異体ｇＨ、例えば、前の段落において本明細書で開示された任意の変異体ｇＨポリペプチド、ならびにｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるＨＣＭＶタンパク質である。変異体ＨＣＭＶタンパク質が変異体ＨＣＭＶ ｇＢ、変異体ＨＣＭＶ ｇＬおよび変異体ＨＣＭＶ ｇＨであるいくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶポリペプチドは、以下の切断型ポリペプチドから選択される切断型ポリペプチドである：疎水性膜近位ドメインを欠く；膜貫通ドメインを欠く；細胞質ドメインを欠く；疎水性膜の近位、膜貫通、および細胞質ドメインのうちの２つ以上を欠く；ならびに細胞外ドメインのみを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンは、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する多量体ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。本開示のいくつかの実施形態は、ＨＣＭＶワクチンであって、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、ここでＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、パターン化されたＵＴＲを含む、ＨＣＭＶワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、パターン化されたＵＴＲは、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたは１回、２回、もしくは３回以上反復されるその変異体などの反復パターンまたは交互パターンを有する。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、第１の核酸）の５’ＵＴＲは、別のＲＮＡポリヌクレオチド（第２の核酸）のＵＴＲとの相補性の領域を有する。例えば、２つのＵＴＲがハイブリダイズして多量体分子を形成するように、（例えば、多量体分子中の）結合しようとする２つのポリヌクレオチドのＵＴＲヌクレオチド配列を、相補性領域を含むように修飾してもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭおよびｇＮから選択されるＨＣＭＶ糖タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように修飾される。これらの実施形態のいずれかにおいて、多量体は、二量体、三量体、五量体、六量体、七量体、八量体 九量体、または十量体であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、二量体の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、三量体の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、五量体の形成を可能にするように修飾される。多量体分子（例えば、二量体、三量体、五量体など）の形成のための修飾された５’ＵＴＲ配列を有する例示的なＨＣＭＶ核酸は、配列番号１９〜２６を含む。
上記の任意の実施形態のいずれかでは、ＨＣＭＶ ＲＮＡポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えばＦＬＡＧタグおよびヒスチジンタグのような１つ以上のリンカー配列または１つ以上の配列タグをさらに含み得る。
本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする単一のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、ＨＣＭＶワクチンであって、２つ以上のオープンリーディングフレーム、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。これらの実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨ、ｇＢ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａおよびその断片またはエピトープから選択される２以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＬ８３およびＵＬ１２３をコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨおよびｇＬをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａをコードする。少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、２つ以上（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを有するいくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、さらに、追加の配列、例えば、リンカー配列、またはＨＣＭＶ ＲＮＡ転写物またはポリペプチドのプロセシングを助ける配列、例えば切断部位配列を含む。いくつかの実施形態では、この追加の配列は、フーリン配列のようなプロテアーゼ配列であってもよい。いくつかの実施形態では、追加の配列は、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＴ２Ａ配列などの自己切断２Ａペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列および切断部位配列は、ＨＣＭＶポリペプチドをコードする配列の間に散在している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１によってコードされる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３のいずれかから選択される少なくとも１つの核酸配列、ならびに配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３から選択される核酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３のいずれかから選択される少なくとも１つの核酸配列、ならびに配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３から選択される核酸配列と少なくとも９０％（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．８％または９９．９％）の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３のいずれかから選択される核酸配列の少なくとも１つの断片、ならびに配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３から選択される核酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本明細書に開示される任意の核酸配列から選択される少なくとも１つの核酸配列、ならびに本明細書に開示の任意の核酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有するホモログによってコードされる。
前の段落における上記の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＭＶ ＲＮＡポリヌクレオチドは、さらに、追加の配列、例えばＦＬＡＧタグおよびヒスチジンタグのような１つ以上のリンカー配列または１つ以上の配列タグをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２〜５２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２〜５２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２〜５２、５９、６１、６３、６５、６７、および６９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２〜５２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２〜５２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２〜５２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶポリペプチドがコードされるオープンリーディングは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３３の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３４の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３８の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４０の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４２の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４７の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号５０の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドはコドン最適化ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３２の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％以上の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３３の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３３の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％を超える同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３４の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３４の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％を超える同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３８の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３８の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％を超える同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４０の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４０の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％を超える同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４２の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号４２の抗原性タンパク質をコードし、ＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％を超える同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜３１から選択される配列によってコードされ、少なくとも１つの化学修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンは多価である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＶＲ１８１４ ＶＲ６９５２、ＶＲ３４８０Ｂ１（ガンシクロビル耐性）、ＶＲ４７６０（ガンシクロビルおよびフォスカーネット耐性）、Ｔｏｗｎｅ、ＴＢ４０／Ｅ、ＡＤ１６９、ＭｅｒｌｉｎおよびＴｏｌｅｄｏから選択されるウイルス株または分離株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームおよび少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンであって、ここでこの少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドが少なくとも１つの化学修飾を有するＨＣＭＶワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、第２の化学修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、５’末端キャップを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンから選択される。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供し、ここで、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％）が化学修飾を有し、必要に応じてこのワクチンは脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾は、ウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−エチルシュードウリジンである。
本開示のいくつかの実施形態は、カチオン性脂質ナノ粒子内に製剤化されるＨＣＭＶワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオアート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、およびＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ、２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、この脂質は、
Figure 0006921833
 である。
いくつかの実施形態では、この脂質は、
Figure 0006921833
 である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜２５％の非カチオン性脂質、約２５〜５５％のステロール、および約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、０．４未満の多分散性値を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
本開示のいくつかの実施形態は、抗原特異的免疫応答を生じるのに有効な量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与することを包含する、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答を生成する方法は、ワクチンの単回投与を含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ブースター用量のワクチンを対象に投与することをさらに包含する。いくつかの実施形態では、このワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。
対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で対象にワクチンを投与することを包含する方法において使用するためのＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンもまた提供される。
本明細書にさらに提供されるのは、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量のワクチンを対象に投与することを包含する方法において使用するための医薬の製造におけるＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンの使用である。
さらに、本開示のワクチンを対象に投与することを包含する、ＨＣＭＶ感染を予防または治療する方法が提供される。
本明細書中に開示されるＨＣＭＶワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して１〜３対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも２倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも５倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１０倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して２〜１０倍増大する。
いくつかの実施形態では、上記対照は、ＨＣＭＶワクチンを投与されていない対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、上記対照は、生弱毒化または不活性化ＨＣＭＶワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも２倍の低下と等しい用量であり、かつ上記対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価が、組換えもしくは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等価である。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも４倍の低下と等しい用量であり、かつ上記対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１０倍の低下と等しい用量であり、かつ上記対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１００倍の低下と等しい用量であり、かつ上記対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１０００倍の低下と等しい用量であり、かつ上記対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価に等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準ケア用量の２〜１０００倍の低下に等しい用量であり、かつ対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、５０〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、上記有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、上記有効量は、対象に合計で２回投与される２５μｇの用量である。いくつかの実施形態では、上記有効量は、上記対象に合計で２回投与される１００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、上記有効量は、上記対象に合計で２回投与される４００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、上記有効量は、上記対象に合計で２回投与される５００μｇの用量である。
本開示の他の態様は、対象において抗原特異的免疫応答を生じるのに有効な量で本明細書に開示されるＨＣＭＶワクチンを対象に投与することを包含する、対象における抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して１〜３対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照と比較して少なくとも２倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも５倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１０倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して２〜１０倍増大する。
いくつかの実施形態では、上記対照は、ＨＣＭＶワクチンを投与されていない対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、上記対照は、生弱毒化または不活性化ＨＣＭＶワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、上記対照は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも２倍の低下と等しい用量であり、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも４倍の低下と等しい用量であり、対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量の少なくとも１０倍の低下と等しい用量であり、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、上記有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１０００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量の２〜１０００倍の低下に等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は５０〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される２５μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される１００μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される４００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される５００μｇの用量である。
本開示の他の態様は、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ糖タンパク質またはその抗原性断片である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢ、ｇＭ、ｇＮ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０またはＵＬ１３１Ａタンパク質またはその抗原性断片もしくはエピトープである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢ、ｇＭ、ｇＮ、ｇＨ、ｇＬおよびｇＯから選択される。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＨである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＬである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ１３０である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ１３１Ａである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ８３である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶタンパク質は、ＨＣＭＶ ＵＬ１２３である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、変異体ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、変異体ＨＣＭＶ ｇＬポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、変異体ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドはＩｇＥシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドはＩｇＥ ＨＣ（Ｉｇ重鎖イプシロン−１）シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号５３）を有する。
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドはＩｇＧκシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５４）を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンは、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド、およびｇＢまたはその抗原性断片もしくはエピトープをコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
本明細書ではさらに、先天性ＨＣＭＶ感染を予防するためのＨＣＭＶワクチンの使用が、提供される。さらに、本明細書では、出産適齢期の女性にＨＣＭＶワクチンを投与する方法が提供される。
本発明の態様は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ワクチンであって：ｉ）ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および／またはＵＬ１３１Ａ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド；ｉｉ）ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＢ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ならびにｉｉｉ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含むワクチンに関する。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨまたはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＬ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１２８またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３０、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；およびＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３１Ａ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチド、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のオープンリーディングフレームがコドン最適化される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３から選択される少なくとも１つの核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つは、配列番号５９、６１、６３、６５、６７および６９の任意のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号５９の抗原性タンパク質をコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有するか、または野生型ｍＲＮＡ配列と８０％超の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６１の抗原性タンパク質をコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有するか、または野生型ｍＲＮＡ配列と８０％超の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６３の抗原性タンパク質をコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは、野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有するか、または野生型ｍＲＮＡ配列と８０％超の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６５の抗原性タンパク質をコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有するか、または野生型ｍＲＮＡ配列と８０％超の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６７の抗原性タンパク質をコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有するか、または野生型ｍＲＮＡ配列と８０％超の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号６９の抗原性タンパク質をコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは野生型ｍＲＮＡ配列と８０％未満の同一性を有するか、または野生型ｍＲＮＡ配列と８０％超の同一性を有するが、野生型ｍＲＮＡ配列は含まない。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは多価である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＶＲ１８１４、ＶＲ６９５２、ＶＲ３４８０Ｂ１、ＶＲ４７６０、Ｔｏｗｎｅ、ＴＢ４０／Ｅ、ＡＤ１６９、ＭｅｒｌｉｎおよびＴｏｌｅｄｏから選択されるウイルス株または分離株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンは、第２の化学修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、および２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの８０％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、この化学修飾は、ウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾は、Ｎ１−メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、化学修飾は、Ｎ１−エチルシュードウリジンである。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子内に製剤化される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜２５％の非カチオン性脂質、約２５〜５５％のステロール、および約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、０．４未満の多分散性値を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
本発明の態様は、対象に抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載のワクチンのいずれかを抗原特異的免疫応答を生じるのに有効な量で対象に投与することを包含する方法に関する。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｂ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答を生成する方法は、ワクチンの単回投与を包含する。いくつかの実施形態では、方法は、ブースター用量のワクチンを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。
本発明の態様は、対象に抗原特異的免疫応答を誘導する方法において使用するための、本明細書に記載のＨＣＭＶワクチンに関し、この方法は、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量でこの対象にワクチンを投与することを包含する。
本発明の態様は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法において使用するための医薬の製造における、本明細書に記載のＨＣＭＶワクチンの使用に関し、この方法は、このワクチンを、抗原特異的免疫応答を生じるのに有効な量で対象に投与することを包含する。
本発明の態様は、本明細書に記載のワクチンを対象に投与することを包含する、ＨＣＭＶ感染を予防または治療する方法に関する。
本発明の態様は、対象において抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量で製剤化された本明細書に記載のＨＣＭＶワクチンに関する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１対数、または対照に対して１〜３対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも２倍、対照に対して少なくとも５倍、対照に対して少なくとも１０倍、または対照に対して２〜１０倍増大する。
いくつかの実施形態では、対照は、ＨＣＭＶワクチンを投与されていない対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照は、生弱毒化または不活性化ＨＣＭＶワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも２倍の低下と等しい用量であり、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも４倍の低下と等しい用量であり、対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量の少なくとも１０倍の低下と等しい用量であり、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１０００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量の２〜１０００倍の低下に等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量は、５０〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される２５μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される１００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される４００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される５００μｇの用量である。
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体が対象において産生され、抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体の力価が対照に対して少なくとも１対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して１〜３対数増大する。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、対象において産生される抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも２倍、対照に対して少なくとも５倍、対照に対して少なくとも１０倍、または対照に対して２〜１０倍増大する。
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、対照は、ＨＣＭＶワクチンを投与されていない対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、対照は、生弱毒化または不活性化ＨＣＭＶワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも２倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも４倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１０倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１０００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における２〜１０００倍の低下と等しい用量であり、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えもしくは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は５０〜１０００μｇの総用量である。本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される２５μｇの用量である。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される１００μｇの用量である。本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計で２回投与される４００μｇの用量である。本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される５００μｇの用量である。
本発明の態様は、ＨＣＭＶワクチンであって、ｉ）ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および／もしくはＵＬ１３１Ａ、またはその抗原性断片もしくはエピトープ；およびｉｉ）ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＢ、またはその抗原性断片もしくはエピトープ；を含み、ここでＨＣＭＶ抗原ポリペプチドのうち１つ以上は、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに連結されたシグナル配列を含む。
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドはＩｇＥシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＥ ＨＣ（Ｉｇ重鎖イプシロン−１）シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号５３）を有する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧκシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５４）を有する。
いくつかの実施形態では、対象は、出産適齢期の女性である。
本発明の態様は、ｉ）ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および／またはＵＬ１３１Ａ、またはそれらの抗原性断片もしくはエピトープをコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチド；ｉｉ）ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＢ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ならびにｉｖ）薬学的に許容される担体または賦形剤：を含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ワクチンの治療上有効な量を、出産適齢期の女性に投与することを包含する先天性ＨＣＭＶ感染を予防する方法に関する。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨまたはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＬ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１２８またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３０、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；およびＵＬ１３１またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、化学的に修飾される。他の実施形態では、核酸ワクチンは非修飾である。
さらに他の態様は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを包含する、対象にワクチン接種するための組成物およびワクチン接種方法を提供し、ここで上記ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化エレメントを含まず、かつここで、アジュバントは、ワクチンと同時製剤化されていないか、または同時投与されない。
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種するための組成物または方法であって、この方法は、対象に、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを投与することを包含し、ここでは１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの投与量の核酸ワクチンを対象に投与する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの投与量は、１用量あたり、１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜１５μｇ、１５〜２０μｇ、１０〜２５μｇ、２０〜２５μｇ、２０〜５０μｇ、３０〜５０μｇ、４０〜５０μｇ、４０〜６０μｇ、６０〜８０μｇ、６０〜１００μｇ、５０〜１００μｇ、８０〜１２０μｇ、４０〜１２０μｇ、４０〜１５０μｇ、５０〜１５０μｇ、５０〜２００μｇ、８０〜２００μｇ、１００〜２００μｇ、１２０〜２５０μｇ、１５０〜２５０μｇ、１８０〜２８０μｇ、２００〜３００μｇ、５０〜３００μｇ、８０〜３００μｇ、１００〜３００μｇ、４０〜３００μｇ、５０〜３５０μｇ、１００〜３５０μｇ、２００〜３５０μｇ、３００〜３５０μｇ、３２０〜４００μｇ、４０〜３８０μｇ、４０〜１００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜４００μｇ、または３００〜４００μｇである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンの第２の用量は、２１日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの用量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの用量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、２００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドの投与量が、対象に投与される核酸ワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節において１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは化学的に修飾されない。
本発明の態様は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド（このＲＮＡポリヌクレオチドは安定化エレメントを含まない）および薬学的に許容される担体または賦形剤（アジュバントはワクチンに含まれない）を含む核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、この安定化エレメントは、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化エレメントは、野生型配列に対して増大したＧＣ含量を有する核酸配列である。
本発明の態様は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、このＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主へのインビボ投与のための製剤中に存在し、ヒト対象の許容可能なパーセンテージについて第１の抗原に対する血清防御の基準を上回る抗体価を付与する。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンにより産生される抗体価は、中和抗体価である。いくつかの実施形態では、中和抗体価は、タンパク質ワクチンよりも大きい。他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される中和抗体価は、アジュバント添加タンパク質ワクチンよりも大きい。さらに他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される中和抗体価は、１，０００〜１０，０００、１，２００〜１０，０００、１，４００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００，１，０００〜４，０００，１，８００〜１０，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００、３，０００〜５，０００、３，０００〜４，０００または２，０００〜２，５００である。中和力価は、典型的には、プラーク数の５０％の減少を達成するために必要とされる最も高い血清希釈として表される。
第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンも提供され、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化エレメントを有するか、またはアジュバントと共に製剤化され、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体価よりも長時間持続する高い抗体価を惹起するための宿主に対するインビボ投与のための製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回の投与の１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチドおよび免疫刺激性核酸から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ペプチドはプロタミンである。
態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むかまたは必要に応じてヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、このオープンリーディングフレームは、第１の抗原ポリペプチドをコードし、ここでこのＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主における抗原発現のレベルが、安定化エレメントを有するか、またはアジュバントと共に製剤化され、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって産生される抗原発現のレベルを顕著に超えるように、宿主に対するインビボ投与のための製剤中に存在する。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、または必要に応じてヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、このオープンリーディングフレームは、第一の抗原ポリペプチドをコードし、ここで、このワクチンは、等価な抗体価を産生するための非修飾ｍＲＮＡワクチンに必要なＲＮＡポリヌクレオチドより少なくとも１０倍少ない。いくつかの実施形態では、このＲＮＡポリヌクレオチドは、２５〜１００マイクログラムの用量で存在する。本発明の態様はまた、少なくとも１つの化学修飾を含むかまたは必要に応じてヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有する１０ｕｇと４００ｕｇの間の１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、このオープンリーディングフレームは第１の抗原ポリペプチドをコードしており、ならびにヒト対象への送達のために製剤化された薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、１単位の使用のワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、このワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本発明の態様は、個体または個体の集団におけるウイルス株への抗原記憶を作製、維持または回復する方法を提供し、この方法は、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、このようなポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含んでいるか、または必要に応じてヌクレオチド修飾を含んでおらず、２つ以上のコドン最適化オープンリーディングフレームを含む、このようなオープンリーディングフレームは１セットの参照抗原ポリペプチドをコードする、ＲＮＡポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）必要に応じて薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、抗原性記憶ブースター核酸ワクチンを、上記個体または集団に投与することを包含する。いくつかの実施形態では、このワクチンは、筋肉内投与、皮内投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象の筋肉組織を組成物の注射に適したデバイスと接触させることを包含する。いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象の筋肉組織を、エレクトロポレーションと組み合わせた組成物の注射に適したデバイスと接触させることを包含する。
本発明の態様は、対象にワクチン接種する方法であって、対象にワクチン接種するのに有効な量で、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの間の単回投与量で、対象に投与することを包含する、方法を提供する。他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、このオープンリーディングフレームは、第１の抗原ポリペプチドをコードし、ここでこのワクチンは、等価な抗体価を産生するために非修飾ｍＲＮＡワクチンに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも１０倍少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５〜１００マイクログラムの用量で存在する。
他の態様は、ヌクレオチド修飾（未改変）を含まないオープンリーディングフレームを有するＬＮＰ配合ＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、このオープンリーディングフレームは、第一の抗原ポリペプチドをコードし、ここでこのワクチンは、等価な抗体価を産生するためにＬＮＰ中に配合されていない未修飾のｍＲＮＡワクチンに必要とされるよりも少なくとも１０倍少ないＲＮＡポリヌクレオチドを有する、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５〜１００マイクログラムの用量で存在する。
実施例に示されたデータは、本発明の製剤を用いて顕著に増強された免疫応答を示す。驚くべきことに、先行技術の報告とは対照的に、ワクチンの製造のために担体に配合された化学的に修飾されていないｍＲＮＡを使用することが好ましく、化学修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは、非修飾ｍＲＮＡよりも必要とする有効なｍＲＮＡ用量がかなり低く、すなわち、ＬＮＰ以外の担体中に配合した場合、非修飾ｍＲＮＡの１０分の１未満であることが本明細書に記載される。本発明の化学的に修飾されたＲＮＡワクチンおよび非修飾のＲＮＡワクチンの両方は、異なる脂質キャリアに製剤化されたｍＲＮＡワクチンよりも良好な免疫応答を生じる。
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種するのに有効な量で、抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを包含する、６０歳以上の高齢の対象を処置する方法を包含する。
他の態様では、本発明は、１７歳以下の若年の対象を処置する方法であって、対象にワクチン接種するのに有効な量で、抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンをこの対象に投与することを包含する、方法を包含する。
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種するのに有効な量で、抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを包含する成人対象を処置する方法を包含する。
いくつかの態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む混合ワクチンを対象にワクチン接種する方法であって、ここでこのワクチンの投与量が、併用治療用量であり、ここで抗原をコードする各々の個々の核酸の投与量が、治療用量未満である方法である。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中のＲＮＡポリヌクレオチド１００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中の５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中のＲＮＡポリヌクレオチド７５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中のＲＮＡポリヌクレオチドの１５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、併用投与量は、対象に投与される核酸ワクチン中のＲＮＡポリヌクレオチドの４００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、抗原をコードする各々の個々の核酸の治療用量未満とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０マイクログラムである。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは化学的に修飾されていない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および１０８〜１１３の１つであり、かつ少なくとも１つの化学修飾を含む。他の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および１０８〜１１３の１つであり、任意のヌクレオチド修飾を含まないか、または修飾されていない。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号７〜１２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のいずれかの抗原性タンパク質をコードし、少なくとも１つの化学修飾を含む。他の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号７〜１２、５９、６１、６３、６５、６７および６９のいずれかの抗原性タンパク質をコードし、任意のヌクレオチド修飾を含まないか、または修飾されていない。
好ましい態様において、本発明のワクチン（例えば、ＬＮＰ−カプセル化ｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種された対象の血液または血清中の抗原特異的抗体の予防的および／または治療的に有効なレベル、濃度および／または力価を生じる。本明細書で定義するように、抗体価という用語は、対象、例えばヒト対象において産生される抗原特異的抗体の量を指す。例示的な実施形態では、抗体価は、依然として陽性結果を与える最大希釈度の逆数（連続希釈で）として表される。例示的な実施形態では、抗体価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体価は、中和アッセイによって、例えば、微量中和アッセイによって決定または測定される。特定の態様において、抗体価測定は、１：４０、１：１００などのような比として表される。
本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、１：４０超、１：１００超、１：４００超、１：１０００超、１：２０００超、１：３０００超、１：４０００超、１：５００超、１：６０００超、１：７５００超、１：１００００超という抗体価を生じる。例示的な実施形態では、抗体価は、ワクチン接種後１０日まで、ワクチン接種後２０日まで、ワクチン接種後３０日まで、ワクチン接種後４０日まで、またはワクチン接種後５０日以上までに産生または到達される。例示的な実施形態では、力価は、対象に投与されるワクチンの単回用量に続いて産生されるかまたは到達される。他の実施形態では、力価は、例えば、第１および第２の用量（例えば、ブースター用量）に続いて、複数の用量に続いて生成または到達される。
本発明の例示的な態様において、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌという単位で測定されるか、またはＩＵ／Ｌ（１リットルあたりの国際単位）またはｍＩＵ／ｍｌ（１ｍｌあたりのミリ国際単位）という単位で測定される。本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞０．１μｇ／ｍｌ、＞０．２μｇ／ｍｌ、＞０．３５μｇ／ｍｌ、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞１μｇ／ｍｌ、＞２μｇ／ｍｌ、＞５μｇ／ｍｌまたは＞１０μｇ／ｍｌを生じる。本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは＞１０ｍＩＵ／ｍｌ、＞２０ｍＩＵ／ｍｌ、＞５０ｍＩＵ／ｍｌ、＞１００ｍＩＵ／ｍｌ、＞２００ｍＩＵ／ｍｌ、＞５００ｍＩＵ／ｍｌまたは＞１０００ｍＩＵ／ｍｌを生じる。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは濃度は、ワクチン接種後１０日後まで、ワクチン接種後２０日まで、ワクチン接種後３０日まで、ワクチン接種後４０日まで、またはワクチン接種後５０日以上までに生成または到達される。例示的な実施形態では、対象に投与されるワクチンの単回投与後に、このレベルまたは濃度が生成されるかまたは到達される。他の実施形態では、複数の用量に続いて、例えば、第１および第２の用量（例えば、ブースター用量）に続いて、このレベルまたは濃度が生成または到達される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは濃度は、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは濃度は、中和アッセイによって、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。
本発明の限界の各々は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、任意の１つのエレメントまたはエレメントの組合わせを含む本発明の各限界が、本発明の各態様に含まれ得ることが予期される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される、構成要素の構築および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施されるか、実施されることが可能である。
添付の図面は一定の縮尺で描く意図ではない。この図面において、様々な図に示されている各々の同一またはほぼ同一の構成要素は、同様の番号で表されている。わかりやすくするために、各図面には全ての構成要素に表示をしていない場合がある。以下が図面である。
図１Ａ〜図１Ｃは、ｈＣＭＶタンパク質によって形成される異なるタンパク質複合体を示す。ｈＣＭＶの指向性は、別個のタンパク質複合体によって指示される。図１Ａは、ｈＣＭＶの線維芽細胞への進入を媒介するｇＨ／ｇＬ／ｇＢ複合体を示す。図１Ｂは、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａを含有する五量体複合体を示す。そのような五量体複合体は、ｈＣＭＶの上皮細胞、内皮細胞、単球および樹状細胞への進入を媒介する。図１Ｃは、Ｍａｃａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４（２）：１００５−１３から採用され、ここでは、五量体複合体のタンパク質構成要素に特異的な抗体とさらに複合体化したｈＣＭＶ五量体複合体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）を示す：８Ｉ２１（抗−五量体）、３Ｇ１６（抗ｇＨ）、１５Ｄ８（抗ＵＬ１２８）、７Ｉ１３（抗ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）および１０Ｐ３（抗ｇＬ）。 図２Ａ〜図２Ｄは、ｈＣＭＶ五量体の種々のサブユニットをコードする予め混合されたｍＲＮＡの送達が、ＨｅＬａ細胞における五量体複合体の表面発現をもたらすことを示す。図２Ａは、ｇＨの表面発現を示す。図２Ｂは、ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａの表面発現を示す。図２ＣはＵＬ１２８の表面発現を示す。図２Ｄは、五量体の表面発現を示す。 図２Ａ〜図２Ｄは、ｈＣＭＶ五量体の種々のサブユニットをコードする予め混合されたｍＲＮＡの送達が、ＨｅＬａ細胞における五量体複合体の表面発現をもたらすことを示す。図２Ａは、ｇＨの表面発現を示す。図２Ｂは、ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａの表面発現を示す。図２ＣはＵＬ１２８の表面発現を示す。図２Ｄは、五量体の表面発現を示す。 図３Ａ〜３Ｂによって、ｈＣＭＶ五量体複合体が、コアサブユニットの１つが存在しない場合に細胞表面上で発現しないことが示される。五量体のサブユニットの全てまたは一部をコードするｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞で発現させ、五量体の表面発現を抗五量体抗体（８Ｉ２１）によって検出した。全てのコアサブユニットが発現された場合にのみ、五量体の表面発現が高レベルで検出された。 図３Ａ〜３Ｂによって、ｈＣＭＶ五量体複合体が、コアサブユニットの１つが存在しない場合に細胞表面上で発現しないことが示される。五量体のサブユニットの全てまたは一部をコードするｍＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞で発現させ、五量体の表面発現を抗五量体抗体（８Ｉ２１）によって検出した。全てのコアサブユニットが発現された場合にのみ、五量体の表面発現が高レベルで検出された。 図４Ａ〜図４Ｂでは、ｇＨ−ｇＬの二量体化がｇＨの表面発現を導くのに十分であることが示される。抗ｇＨ抗体（３Ｇ１６）を、細胞表面上のｇＨの検出に使用した。ｇＨおよびｇＬが同時発現された場合、五量体複合体中の全てのサブユニットが発現された場合と同様に、ＨｅＬａ細胞の表面上に同様のレベルのｇＨが検出された。ｇＨを単独で発現させた場合、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の表面にはごくわずかなｇＨしか検出されなかった。 図５Ａ〜５Ｄは、ｈＣＭＶ抗原ｇＢの細胞内発現および表面発現を示す。ｇＢをコードするｍＲＮＡは、細胞内および細胞表面の両方で発現された（図５Ａ〜５Ｃ）。ｇＢ前駆体およびタンパク質分解処理された成熟ｇＢの両方を、イムノブロットで抗ｇＢ抗体によって検出した（図５Ｄ）。「＊」は、レーンが過負荷になったことを示す。 図５Ａ〜５Ｄは、ｈＣＭＶ抗原ｇＢの細胞内発現および表面発現を示す。ｇＢをコードするｍＲＮＡは、細胞内および細胞表面の両方で発現された（図５Ａ〜５Ｃ）。ｇＢ前駆体およびタンパク質分解処理された成熟ｇＢの両方を、イムノブロットで抗ｇＢ抗体によって検出した（図５Ｄ）。「＊」は、レーンが過負荷になったことを示す。 ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物の免疫原性研究を示す。示された用量のｍＲＮＡを、ワクチン接種スケジュールに従ってマウスにワクチン接種した。免疫化後のマウス血清では、高力価の抗五量体抗体が検出された。五量体ｍＲＮＡの異なる製剤は、匹敵するレベルの抗体を産生した。３回目の免疫は、抗体産生のブーストをもたらさなかった。 五量体複合体ｍＲＮＡ構築物を伴うかまたは伴わないｈＣＭＶ ｇＢ ｍＲＮＡワクチン構築物の免疫原性研究を示す。ｇＢ ｍＲＮＡ構築物は、３回の免疫後にｇＢタンパク質／ＭＦ５９抗原と同様のＩｇＧ力価を生じた。３回目の免疫後にＩｇＧ産生のブーストが観察された。五量体ｍＲＮＡ構築物の追加は、抗ｇＢ ＩｇＧの誘導に干渉しなかった。 上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９におけるｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物の中和研究を示す。感染したＡＲＰＥ−１９細胞におけるＩＥ１染色が実証される。ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物による免疫は、マウスにおいて非常に強力な中和抗体を誘発する。４１日目（２回目の免疫から３週間後）のマウス血清中の中和抗体価（１：２５６００）は、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるｈＣＭＶ臨床分離株ＶＲ１８１４を中和することができた。 ｈＣＭＶ臨床分離株ＶＲ１８１４に感染したＡＲＰＥ−１９細胞におけるｈＣＭＶ中和ＩｇＧ力価の測定値を示す。表５も参照のこと。 図１０〜図１０Ｂは、本明細書に記載の第１世代の五量体構築物（「旧」と称される）およびこれもまた本明細書に記載される第二世代の五量体構築物（「新」と称される）によってコードされるｈＣＭＶ五量体複合体（ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ）のＨｅＬａ細胞における表面発現を示す。第２世代構築物内のｍＲＮＡの配列は、配列番号５８〜６９に対応する表６に提供される。図１０Ａおよび１０Ｃは、８Ｉ２１（抗五量体）抗体を用いて、五量体複合体の表面発現を検出する蛍光活性化細胞（ＦＡＣＳ）選別実験の結果を示す。五量体複合体の表面発現は、出現する蛍光細胞集団によって示される。図１０Ｂおよび１０Ｄは、ＦＡＣＳ実験の定量化を示す。 図１０〜図１０Ｂは、本明細書に記載の第１世代の五量体構築物（「旧」と称される）およびこれもまた本明細書に記載される第二世代の五量体構築物（「新」と称される）によってコードされるｈＣＭＶ五量体複合体（ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ）のＨｅＬａ細胞における表面発現を示す。第２世代構築物内のｍＲＮＡの配列は、配列番号５８〜６９に対応する表６に提供される。図１０Ａおよび１０Ｃは、８Ｉ２１（抗五量体）抗体を用いて、五量体複合体の表面発現を検出する蛍光活性化細胞（ＦＡＣＳ）選別実験の結果を示す。五量体複合体の表面発現は、出現する蛍光細胞集団によって示される。図１０Ｂおよび１０Ｄは、ＦＡＣＳ実験の定量化を示す。 図１１Ａ〜図１１Ｅは、本明細書に記載の第１世代五量体構築物（「旧」と称される）およびこれもまた本明細書に記載される第二世代五量体構築物（「新」と称される）によってコードされるｈＣＭＶ五量体複合体のサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａ）の発現を示すウェスタンブロットを示す。 図１２は、五量体ｍＲＮＡ複合体を用いた免疫が、高力価の抗体を誘発し、これが数ヶ月まで維持されることを示す。ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物の免疫原性研究を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、示された用量のｍＲＮＡ（下のパネル）を用いてワクチン接種スケジュールに従ってワクチン接種した。免疫後、２０日、４１日、６２日、９２日および１２３日に、マウス血清ＩｇＧ力価を測定した。ｈＣＭＶ五量体コーティングプレートを用いて血清ＩｇＧ力価を測定した。高力価の抗五量体抗体が、免疫したマウスの血清中で検出された。 ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物が、ｈＣＭＶの予防のために臨床的に使用される過免疫血清であるＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）よりもマウスで高い中和抗体価を誘発したことを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、示された用量のｍＲＮＡ（下のパネル）を用いてワクチン接種スケジュールに従ってワクチン接種した。マウス血清中の中和抗体価を、免疫後４２、１２２、１５２および１８２日目に、ｈＣＭＶ臨床分離株ＶＲ１８１４に感染したＡＲＰＥ−１９上皮細胞で測定した。ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチンによって誘導された中和抗体の高力価は、最大６ヶ月まで維持された。 ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物によってマウスにおいて誘導された中和抗体価を示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、示された用量のｍＲＮＡ（下のパネル）を用いてワクチン接種スケジュールに従ってワクチン接種した。マウス血清中の中和抗体価は、５００〜２０００ｐｆｕのｈＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染したＨＥＬ２９９線維芽細胞を用いて、免疫後４２、６２、および１８２日目に測定した。 自己切断２Ａペプチド（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）：ｅ１８５５６、２０１１に記載されているような）によって連結された五量体サブユニットの模式図である。 ２Ａペプチドによって連結されたｇＨおよびｇＬが、効率的な自己切断を受けて個々のｇＨおよびｇＬサブユニットを生成することを示すウェスタンブロットである。 連結された２Ａペプチドの自己切断から生成された個々のｇＨおよびｇＬサブユニットが、細胞表面に二量体化および転位することができたことを示すグラフである。 図１８Ａ〜図１８Ｂは、マウスにおける抗五量体結合抗体および中和抗体の高い力価および持続力価を示す。図１８Ａは、抗五量体抗体価を示すグラフを示す。五量体ｍＲＮＡの等モルおよび等質量製剤を比較し、等しく有効であることが判明した。図１８Ｂは、ｈＣＭＶ株ＶＲ１８１４に感染したＡＲＰＥ１９上皮細胞で測定した中和力価を示すグラフを示す。五量体ｍＲＮＡの等モルおよび等質量製剤を比較し、等しく有効であることが判明した。中和力価は、ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）よりも約２５倍高いことが判明した。 図１９Ａ〜図１９Ｃによって、上皮細胞感染に対する中和活性が、抗五量体抗体に依存することが示される。図１９Ａによって、枯渇タンパク質が五量体またはｇＨ／ｇＬ二量体のいずれかであったことが示される。図１９Ｂおよび図１９Ｃは、中和を示すグラフを示す。図１９Ｂは、五量体またはｇＨ／ｇＬ二量体で免疫したマウスからの血清による中和を示す。図１９Ｃは、五量体またはｇＨ／ｇＬと組み合わせたＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）による中和を示す。 図２０Ａ〜図２０Ｂは、化合物２５脂質と共に製剤化された第２世代ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物の免疫原性を示すグラフである。五量体およびｇＢをコードする第２世代のｍＲＮＡ構築物は、最初の免疫後２０日程度のはやさで、五量体特異的抗体（図２０Ａ）およびｇＢ特異的抗体（図２０Ｂ）を誘導した。五量体特異的抗体価およびｇＢ特異的抗体価は、ブースト用量後にマウスにおいて増大し続ける。 五量体複合体をコードするＨＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物の総用量３μｇが、ｈＣＭＶの予防のために臨床的に使用される過免疫血清であるＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）よりも高い中和抗体価を誘発することを示すグラフである。
本開示の実施形態は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科に属する遍在性二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＣＭＶは、ＤＮＡコア、外側のキャプシドで構成され、ウイルス特異的糖タンパク質を取り込んだ脂質膜（エンベロープ）で覆われている。直径は約１５０〜２００ｎｍである。ゲノムは、約２００ｋｂの長さの線状および非セグメントである。ウイルス複製は核であり、溶原性である。複製は、ｄｓＤＮＡ双方向複製である。
ＨＣＭＶは、広範囲の哺乳動物細胞に感染することができ、これは、ほとんどの器官および組織を感染させるその能力と相関する。宿主細胞への進入は、エンドサイトーシスを媒介する宿主細胞受容体へのウイルス糖タンパク質の付着によって達成される。ＨＣＭＶは、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、白血球および樹状細胞などのいくつかの細胞型に感染する能力を有する、広範な宿主細胞範囲を示す。この広い細胞指向性によって、ＨＣＭＶが多数の受容体または共通の表面分子に結合し得ることが示唆される。
ＨＣＭＶの外套は非常に複雑であり、２０を超える糖タンパク質を含み、これがＨＣＭＶの広い細胞指向性の理由であり得る。ＨＣＭＶ粒子は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびおそらく他の表面受容体への結合を介して細胞表面との最初の相互作用を必要とするＨＣＭＶ感染に全てが関与する、少なくとも４つの主要な糖タンパク質複合体を含む。
ｇＣＩ複合体は、糖タンパク質ｇＢの二量体分子から構成される。１６０ｋＤａの各モノマーを切断して、ジスルフィド結合によって５５ｋＤａの膜貫通成分に連結された１１６ｋＤａの表面単位を生成する。ｇＢに免疫特異的ないくつかの抗体は、ビリオンの細胞への付着を阻害するが、他のものは感染細胞の融合を阻止し、このことはｇＢタンパク質が、感染の開始時に複数の機能を発揮し得ることを示唆する。研究により、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、受容体に結合し、膜融合を媒介することにより、ＨＣＭＶの細胞への進入を容易にすることが確認されている。いくつかの細胞膜タンパク質は、ｇＢと相互作用し、その相互作用はおそらく進入を容易にし、細胞シグナル伝達経路を活性化する。
ｇＣＩＩ複合体は、糖タンパク質複合体の中で最も豊富であり、糖タンパク質ｇＭおよびｇＮからなるヘテロ二量体である。この複合体は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと結合し、このことは、ビリオンと細胞表面との最初の相互作用に寄与している可能性を示唆している。いくつかのα−ヘルペスウイルスに見られるｇＭ−ｇＮ複合体と同様に、ビリオンの集合／外套の間に構造的役割を果たすこともできる。
ｇＣＩＩＩ複合体は、ジスルフィド結合によって共有結合される糖タンパク質ｇＨ、ｇＬ、ｇＯからなる三量体である。全ての既知のヘルペスウイルスは、ビリオンエンベロープと細胞膜との融合を媒介するｇＨ−ｇＬヘテロ二量体をコードする。ヒトＣＭＶ ｇＨに特異的な抗体は、ウイルス付着に影響を与えないが、浸透および細胞間伝達を遮断する。ＨＣＭＶのｇＯ欠損突然変異体（株ＡＤ１６９）は、顕著な増殖欠損を示す。
ＨＣＭＶタンパク質ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａは、ｇＨタンパク質およびｇＬタンパク質と会合して、ＨＣＭＶの表面に見られる異種五量体複合体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１Ａと命名）を形成する。天然の変異体ならびに欠失および突然変異分析は、例えば、内皮細胞、上皮細胞および白血球を含む特定の細胞型を感染させる能力を有するｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１Ａ複合体のタンパク質を意味している。
ＨＣＭＶは、原形質膜（線維芽細胞）またはエンドソーム膜（上皮細胞および内皮細胞）のいずれかとそのエンベロープを融合することによって細胞に入る。ＨＣＭＶは、エンベロープ糖タンパク質Ｍ（ｇＭ）またはｇＢを用いて細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合することによって細胞進入を開始する。このステップの後に、細胞内シグナル伝達の進入を誘発または開始させる細胞表面レセプターとの相互作用が続く。進入受容体機能は、ｇＨ／ｇＬ糖タンパク質複合体によって提供される。異なるｇＨ／ｇＬ複合体は、上皮細胞、内皮細胞、または線維芽細胞への進入を容易にすることが公知である。例えば、線維芽細胞への進入は、ｇＨ／ｇＬヘテロ二量体を必要とするが、上皮細胞および内皮細胞への進入には、ｇＨ／ｇＬに加えて、五量体複合体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１が必要である。したがって、異なるｇＨ／ｇＬ複合体は、上皮／内皮細胞および線維芽細胞上の異なる進入受容体に係合する。受容体の係合に続いて、ｇＢおよびｇＨ／ｇＬによって媒介されるプロセスである膜融合が行われる。初期の抗体研究は、ＨＣＭＶ進入におけるｇＢおよびｇＨ／ｇＬの両方にとって重要な役割を支持してきた。ｇＢは、進入および細胞拡散に必須である。ｇＢおよびｇＨ／ｇＬは、細胞融合に必要かつ十分であり、したがって、他のヘルペスウイルスの中で保存されているＨＣＭＶの「核融合機構」を構成する。
したがって、４つの糖タンパク質複合体は、ウイルス付着、結合、融合および宿主細胞への進入において決定的な役割を果たす。
ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１Ａ複合体を含む研究によって、ＨＣＭＶ糖タンパク質ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭおよびｇＮ、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａタンパク質が抗原性であり、かつ種々の細胞型における免疫刺激応答に関与することが示された。さらに、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ遺伝子は、ＨＣＭＶ分離株の間で比較的保存されており、したがってワクチン接種の魅力的な標的である。さらに、最近の研究では、五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１複合体内のエピトープに対する抗体が、内皮細胞、上皮細胞および他の細胞型への進入を中和し、したがってＨＣＭＶがいくつかの細胞型に感染する能力をブロックすることが示されている。
ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質複合体（ｇＣＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８−１３１Ａ）は、抗ウイルス免疫応答の主要な抗原標的である。本開示の実施形態は、ＨＣＭＶ抗原、特にＨＣＭＶ糖タンパク質複合体の１つ由来のＨＣＭＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。本開示の実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。本明細書で提供されるＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンおよび生弱毒化ワクチンに関連する多くのリスクなしに、細胞性免疫および体液性免疫の両方を含む、バランスのとれた免疫応答を誘導するために使用され得る。
「核酸ワクチン」と題する国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００（ＷＯ２０１５／１６４６７４）の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、現在のワクチンよりもいくつかの点で優れていることが発見されている。第１に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達は、文献に記載されているプロタミン塩基アプローチを含む他の製剤より優れており、追加のアジュバントは必要ではない。ＬＮＰの使用は、化学的に修飾されるかまたは修飾されていないｍＲＮＡワクチンの効果的な送達を可能にする。さらに、修飾および非修飾ＬＮＰ配合ｍＲＮＡワクチンの両方が、従来のワクチンよりも顕著な程度に優れていることが本明細書において実証されている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、従来のワクチンより少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１，０００倍優れている。
ｍＲＮＡワクチンおよび自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンの製造が試みられているが、これらのＲＮＡワクチンの治療効果はまだ完全に確立されていない。かなり驚くべきことに、本発明者らは、本発明の態様によって、中和能力を有する増強された抗原生成および機能的抗体産生を含む、顕著に増強され、多くの点で相乗的な免疫応答を生じる、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤のクラスを発見した。これらの結果は、他のクラスの脂質ベースの製剤で使用されるｍＲＮＡ用量と比較して、著しく低い用量のｍＲＮＡが投与された場合でも達成され得る。本発明の製剤は、予防剤および治療剤としての機能的なｍＲＮＡワクチンの有効性を確立するのに十分な重大な予想外のインビボ免疫応答を示した。さらに、自己複製ＲＮＡワクチンは、ウイルス複製経路に依存して細胞に十分なＲＮＡを送達し、免疫原性応答を生じさせる。本発明の製剤は、強力な免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を産生するためにウイルス複製を必要としない。したがって、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な成分を含まない。
本発明は、いくつかの態様において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、化学的に修飾されたｍＲＮＡワクチンおよび非修飾ｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を顕著に向上するという驚くべき発見に関与する。ＬＮＰ中に製剤化されたｍＲＮＡワクチンの有効性を、いくつかの異なる抗原を用いてインビボで試験した。本明細書に提示された結果によって、他の市販のワクチンよりもＬＮＰで製剤化されたｍＲＮＡワクチンの予想外の優れた有効性が示される。
増強された免疫応答を提供することに加えて、本発明の製剤は、試験された他のワクチンよりも少ない用量の抗原で、より迅速な免疫応答を生成する。本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤はまた、異なる担体中に製剤化されたワクチンよりも定量的および定性的に優れた免疫応答を生じる。
本明細書に記載のデータによって、本発明の製剤が、既存の抗原ワクチンよりも顕著な予想外の改善をもたらしたことが示される。さらに、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、ｍＲＮＡの用量が他のワクチンよりも低い場合でも、他のワクチンより優れている。
本明細書に記載された研究で使用されるＬＮＰは、様々な動物モデルならびにヒトにおいてｓｉＲＮＡを送達するために以前にも使用されてきた。ＬＮＰ製剤のｓｉＲＮＡ送達に関連して行われた観察の観点から、ＬＮＰがワクチンに有用であるという事実はかなり驚くべきことである。ＬＮＰ中で製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的送達は、一時的なＩｇＭ応答に関連する望ましくない炎症反応を引き起こし、典型的には抗原産生の低下および免疫応答の低下をもたらすことが観察されている。ｓｉＲＮＡで観察された所見とは対照的に、本発明のＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤は、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防的および治療的方法に十分な増強されたＩｇＧレベルを生成することが本明細書で実証されている。
核酸／ポリヌクレオチド
本明細書で提供されるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ワクチンは、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つ以上の）リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。最も広い意味での用語「核酸」は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれかから選択される少なくとも１つの核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１〜３１、５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれかから選択される核酸配列の少なくとも１つの断片によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、配列番号５８によってコードされるオープンリーディングフレームまたはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチド；配列番号６０によってコードされるオープンリーディングフレーム、またはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチド；配列番号６２によってコードされるオープンリーディングフレーム、またはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチド；配列番号６４によってコードされるオープンリーディングフレーム、またはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチド；配列番号６６によってコードされるオープンリーディングフレームまたはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチド、および配列番号６８によってコードされるオープンリーディングフレーム、またはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ立体配置（ＬＮＡのジアステレオマー）を有するα−ＬＮＡ、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）またはそれらのキメラもしくは組合わせであっても、またはそれらを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然に存在するか、天然に存在しないか、またはアミノ酸の修飾されたポリマー）をコードする任意のポリヌクレオチドを指し、これは、翻訳されて、コードされたポリペプチドを、インビトロで、インビボで、インサイチュで、またはエキソビボで産生し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、インビボで翻訳される。当業者であれば、別段注記しない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列では「Ｔ」を挙げるが、この配列がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」で置き換えられることを理解する。したがって、特定の配列識別番号によって特定されるＤＮＡによってコードされるＲＮＡポリヌクレオチドのいずれも、ＤＮＡによってコードされる対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列を含んでもよく、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」は「Ｕ」で置き換えられる。
典型的には、ｍＲＮＡ分子の基本成分は、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップおよびポリＡ尾部を含む。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、核酸ベースの治療法を用いた有効なポリペプチド発現の既存の問題を克服するのに役立つその機能的および／または構造的デザインの特徴において、野生型ｍＲＮＡと区別され得る。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。１つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、単一ＲＮＡポリヌクレオチド上にコードされてもよく、または複数（例えば、２つ以上）のＲＮＡポリヌクレオチドに個別にコードされてもよい。
本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードする単一のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする、２つ以上のオープンリーディングフレーム、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶワクチンを提供する。これらの実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨ、ｇＢ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａおよびその断片またはエピトープから選択される２つ以上のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＬ８３およびＵＬ１２３をコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨおよびｇＬをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａをコードする。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨまたはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＬ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１２８またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３０、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３１Ａをコードするオープンリーディングフレームまたはその抗原性断片もしくはエピトープを有するＲＮＡポリヌクレオチド；およびＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＢ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、２つ以上（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを有するいくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、さらに追加の配列、例えば、リンカー配列、またはＨＣＭＶ ＲＮＡ転写物またはポリペプチドのプロセシングを助ける配列、例えば切断部位配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、さらなる配列は、フーリン配列のようなプロテアーゼ配列であってもよい。フーリンはまた、ＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸切断酵素）とも呼ばれ、対になった塩基性アミノ酸プロセッシング部位で、前駆体タンパク質を生物学的に活性な産物に切断するカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。その基質のいくつかとしては以下が挙げられる：プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜１型マトリクスメタロプロテイナーゼ、神経成長促進因子のβサブユニット、およびフォンビルブラント因子。特定のウイルスのエンベロープタンパク質は、完全に機能的になるためにフーリンによって切断されなければならないが、いくつかのウイルスは、宿主細胞への進入中にフーリン処理を必要とする。Ｔ細胞は、末梢免疫寛容を維持するためにフーリンを必要とする。いくつかの実施形態では、追加の配列は、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＴ２Ａ配列などの自己切断２Ａペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列および切断部位配列は、ＨＣＭＶポリペプチドをコードする配列の間に散在している。２Ａペプチドは、約１８〜２２アミノ酸の長さの「自己切断」小ペプチドである。リボソームは、２ＡペプチドのＣ末端でグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドおよびその直ぐ下流のペプチドの切断をもたらす。それらは、単一のプラスミドを用いて細胞内に２つ以上の遺伝子を同時に発現させるために、生物医学研究において頻繁に使用されている。以下を含む多くの２Ａペプチドが存在する：口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、ブタテスコウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、およびＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）。Ｔ２Ａは、最も高い切断効率（１００％に近い）を有し、Ｅ２Ａ、Ｐ２ＡおよびＦ２Ａが続く。アミノ酸配列は、以下のとおりである：
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７０）；Ｔ２Ａ：
（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７１）；Ｅ２Ａ：
（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号７２）；Ｆ２Ａ：
（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号７３）。いくつかの実施形態では、リンカー配列および切断部位配列は、ＨＣＭＶポリペプチドをコードする配列の間に散在している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９または９〜１０の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１００個または少なくとも２００個の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、１〜５０、１〜１００、２〜５０または２〜１００の抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。コドン最適化法は、当該技術分野で公知であり、本明細書で提供されるように使用してもよい。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的生物および宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折りたたみを確実にするために；ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増大させるか、または二次構造を減少させるために；遺伝子の構築または発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化するために；転写および翻訳制御領域をカスタマイズするために；タンパク質トラフィッキング配列を挿入または除去するために；コードされたタンパク質（例えばグリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加するために；タンパク質ドメインの追加、除去またはシャッフルのために；制限サイトを挿入または削除するために；リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；タンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれることを可能にするように翻訳速度を調節するために；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を減少もしくは排除するために使用してもよい。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスが当該技術分野で公知であり−その非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）および／または独自の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列に対して９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする天然に存在するかまたは野生型ｍＲＮＡ配列（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする天然に存在するかまたは野生型のｍＲＮＡ配列（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するかまたは野性型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％〜８５％（例えば、約６７％〜約８５％または約６７％〜約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在する配列または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然に存在するかまたは野性型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％〜７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
当業者であれば、特に明記しない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を挙げるが、その配列がＲＮＡである場合、「Ｔ」は「Ｕ」で置き換えられることが理解される。
抗原／抗原ポリペプチド
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ糖タンパク質である。例えば、ＨＣＭＶ糖タンパク質は、ＨＣＭＶ ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＮもしくはｇＭまたはその免疫原性断片もしくはエピトープであり得る。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＬポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＯポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＮポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＭポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＣポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＮポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＭポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａから選択されるＨＣＭＶタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ８３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３０ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３１Ａポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、抗原性ＨＣＭＶポリペプチドは、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドを含む。２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、単一ＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされてもよいし、または２つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされてもよく、例えば、各糖タンパク質は別個のＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされてもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、ｇＭ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ならびにｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、ｇＭ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＢと、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＮ、ｇＭ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＬと、ｇＨ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、ｇＭ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬと、ｇＢ、ｇＯ、ｇＮ、ｇＭ、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬと、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、ｇＮおよびｇＭのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択される糖タンパク質との任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬと、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるポリペプチドとの任意の組合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＨおよびｇＬである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＣＭＶポリペプチドは、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａである。
本開示は、変異体ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、変異体ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、変異体ＨＣＭＶ ｇＬポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、変異体ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドである。変異体ＨＣＭＶポリペプチドは、ＥＲ／ゴルジを通じた抗原ポリペプチドの通過を促進し、抗原の表面発現の増大をもたらすように設計される。いくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶポリペプチドは、以下のドメイン：疎水性膜近位ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの１つ以上を欠失させるために切断される。いくつかの実施形態では、変異体ＨＣＭＶポリペプチドは、細胞外ドメイン配列のみを含むように切断される。例えば、変異体ＨＣＭＶポリペプチドは、少なくともアミノ酸１〜１２４、例としては、例えば、アミノ酸１〜１２４、１〜１４０、１〜１６０、１〜２００、１〜２５０、１〜３００、１〜３５０、１〜３６０、１〜４００、１〜４５０、１〜５００、１〜５１１、１〜５５０、および１〜５６１、ならびに列挙されたサイズ範囲内の断片サイズを有するポリペプチド断片を含む、切断型ＨＣＭＶ ｇＨポリペプチド、切断型ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチド、または切断型ＨＣＭＶ ｇＬポリペプチドであってもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、２５アミノ酸より長く、５０アミノ酸より短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の等価物、変異体および前述の類似体が含まれる。ポリペプチドは単一分子であってもよく、または二量体、三量体もしくは四量体のような多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、抗体またはインスリンのような一本鎖または多鎖ポリペプチドを含んでもよく、会合または連結されてもよい。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多価ポリペプチドに見出される。ポリペプチドという用語はまた、少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
「ポリペプチド変異体」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。通常、変異体は、天然または参照配列と少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、天然または参照配列と少なくとも８０％、または少なくとも９０％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、「変異体模倣体」が提供される。本明細書中で使用される場合、「変異体模倣体」という用語は、活性化配列を模倣する少なくとも１つのアミノ酸を含むものである。例えば、グルタメートは、ホスホロ−スレオニンおよび／またはホスホロ−セリンの模倣体として役立ち得る。あるいは、変異体模倣体は、失活を生じる場合もあるし、または模倣体を含有する不活性化生成物を生じる場合もあり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として作用し得る；またはアラニンはセリンの不活性化置換として作用し得る。
「オルソログ」とは、異なる種の遺伝子であって、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化したものを指す。通常、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測にとって重要である。
「類似体」とは、親ポリペプチドまたは開始ポリペプチドの１つ以上の特性を依然として維持するアミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸変化、例えば置換、付加または欠失によって異なる、ポリペプチド変異体を含むことを意味する。
本開示は、変異体および誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドベースである、いくつかのタイプの組成物を提供する。これらとしては、例えば、置換、挿入、欠失および共有結合の変異体および誘導体が挙げられる。「誘導体」という用語は、「変異体」という用語と同義で使用されるが、一般に、参照分子または出発分子に対して任意の方法で修飾および／または変更された分子を指す。
このように、参照配列、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列に関して置換、挿入および／または付加、欠失および共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンを、ペプチド配列（例えば、Ｎ末端またはＣ末端の末端）に付加してもよい。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在化に使用してもよい。リジンは、ペプチド溶解性を増大させるために、またはビオチン化を可能にするために使用され得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を必要に応じて欠失させて、切断型配列を得てもよい。特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は代替として、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるかまたは固体支持体に連結されたより大きい配列の一部としての配列の発現として欠失されてもよい。
ポリペプチドに言及する場合の「置換変異体」とは、天然または開始配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸が同じ位置でその場所に挿入されたものである。置換は、分子中の１個のアミノ酸のみが置換されている単一置換であってもよく、または同一分子内で２個以上のアミノ酸が置換されている複数置換であってもよい。
本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷または極性の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリンおよびロイシンなどの非極性（疎水性）残基の別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、およびグリシンとセリンとの間など、ある極性（親水性）残基の別のものへの置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンのような塩基性残基の別のものでの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のような１つの酸性残基の別の酸性残基への置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンなどの極性（親水性）残基の置換、および／または極性残基の、非極性残基での置換が挙げられる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す場合の「特徴」とは、それぞれ、ある分子の別個のアミノ酸配列ベースまたはヌクレオチドベースの成分として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面顕在性、局所高次構造の形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
本明細書においてポリペプチドを指す場合、「ドメイン」という用語は、１つ以上の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の部位として働く結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。ポリペプチドに言及するとき本明細書で使用される場合、アミノ酸に基づく実施形態に関連する「部位」という用語は、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドについて「部位」という用語は、それがヌクレオチドベースの実施形態に関与する場合、「ヌクレオチド」と同義に用いられる。部位とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドベースの分子内で修飾、操作、改変、誘導体化または変化され得るペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチド内の位置を表す。
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに言及する場合、「末端（複数可）」という用語は、それぞれ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの末端を指す。そのような末端は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの第１部位または最終部位だけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸またはヌクレオチドを含んでもよい。ポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終結される）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終結される）の両方を有すると特徴付けられ得る。タンパク質は、場合によっては、ジスルフィド結合または非共有結合力（多量体、オリゴマー）によって一緒にされた複数のポリペプチド鎖で構成されている。これらのタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、場合によっては、ポリペプチドに基づかない部分（例えば、有機コンジュゲート）で開始または終了するように修飾されてもよい。
当業者に認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、目的のポリペプチドの範囲内にあると考えられる。例えば、本明細書で提供されるのは、参照タンパク質１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００アミノ酸を超える長さの（参照ポリペプチド配列よりも短いが、それ以外は同一の少なくとも１つのアミノ酸残基のポリペプチド配列を意味する）任意のタンパク質断片である。別の例では、本明細書中に記載される配列のいずれかに対して４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％同一性である２０、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質は、本開示に従って利用され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で提供または参照される配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含む。
本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、例えば、当該技術分野において記載されている分子（例えば、操作された分子または設計された分子または野生型分子）によって、参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）とある程度の配列類似性または同一性を共有し得る。当該技術分野で知られている「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。当該技術分野において、同一性とはまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、それらの間の配列関連性の程度も意味する。同一性とは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアライメント（もしあれば）との小さい２つ以上の配列間の同一マッチのパーセントを測定する。関連するペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。「同一性％」とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される場合、必要に応じて、最大同一性パーセントを達成するために配列を整列させ、ギャップを導入した後、第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップおよびペナルティのせいで値が異なる可能性があることが理解される。一般に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載され、当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定される、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ただし１００％未満の配列同一性を有する。このようなアライメントのためのツールとしては、ＢＬＡＳＴスイート（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ” ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）のツールが挙げられる。別の一般的な局所アライメント技術は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ、ＴＦ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＭＳ（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）に基づいている。動的なプログラミングに基づく、一般的なグローバルアライメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ、ＣＤ（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）。さらに最近、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント方法よりも迅速にヌクレオチドおよびタンパク質配列のグローバルアライメントを意図的に生成する高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。本明細書では、特に以下の「同一性」の定義に他のツールが記載されている。
本明細書において、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。マッチする残基のアライメントによって決定される類似性または同一性の閾値レベルを共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えばＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子）は、相同的と呼ばれる。相同性とは、分子間の関係を記述し、定量的な類似性または同一性に基づくことができる定性的用語である。類似性または同一性は、２つの比較された配列間の配列一致の程度を定義する定量的な用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、お互いに対して「相同性」であるとみなす。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％であれば相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の独自に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。長さが６０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４〜５個の独自に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。２つのタンパク質配列が少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、その２つのタンパク質配列は相同であるとみなされる。
相同性は、比較された配列が進化において共通の起点から分岐したことを意味する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列に由来する第２のアミノ酸配列または核酸配列に関連する、第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質配列）を指す。「ホモログ」という用語は、種分化の事象によって分離された遺伝子および／もしくはタンパク質間の関係、または遺伝子複製の事象によって分離された遺伝子および／またはタンパク質間の関係に適用され得る。「オルソログ」とは、異なる種の遺伝子（またはタンパク質）であり、種分化によって共通の祖先遺伝子（またはタンパク質）から進化したものである。典型的には、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内での複製によって関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持するが、一方パラログは、元のものと関連していても新しい機能を進化させる。
「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。例えば、２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために２つの配列をアライメントさせることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、非同一配列は、比較目的に関しては無視することができる）。特定の実施形態では、比較目的のためにアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されるならば、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような方法を用いて決定することができる。例えば、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定することができる。２つの核酸配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを用いたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて、代替的に決定してもよい。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に使用される方法としては、限定するものではないが、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されている方法が挙げられるが、これに限定されない。同一性を決定する技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにまとめられている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、さらなる配列または機能的ドメインをさらに含む。例えば、本開示のＨＣＭＶポリペプチドは、１つ以上のリンカー配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＭＶは、ポリペプチドタグ、例えば、アフィニティータグ（キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＳＢＰ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリン−タグ）；可溶化タグ；クロマトグラフィータグ（ＦＬＡＧタグのようなポリアニオン性アミノ酸タグ）；エピトープタグ（Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｅタグ、Ｓタグ、およびＨＡタグなどの高親和性抗体に結合する短いペプチド配列）；蛍光タグ（例えば、ＧＦＰ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＭＶは、ポリペプチド配列（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に付加することができる１つ以上のリジン、ヒスチジンまたはグルタミン酸などのアミノ酸タグを含んでもよい。リジンは、ペプチド溶解性を増大させるために、またはビオチン化を可能にするために使用してもよい。タンパク質およびアミノ酸タグは、組換えタンパク質に遺伝的にグラフトされたペプチド配列である。配列タグは、例えば、アフィニティー精製、タンパク質アレイ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、および免疫沈降を含む様々な用途における使用のために、種々の目的、例えば、ペプチド精製、同定または局在化のためにタンパク質に結合される。そのようなタグは、その後、化学的薬剤によって、または特異的タンパク質分解もしくはインテインスプライシングなどの酵素的手段によって除去可能である。
あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を必要に応じて欠失させて、切断型配列を提供してもよい。特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、代替的に、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるかまたは固体に連結されたより大きい配列の一部としての配列の発現として欠失されてもよい。
多タンパク質および多成分ワクチン
本開示は、ＨＣＭＶワクチン、たとえば、単一の抗原ポリペプチドを各々がコードする複数のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ヒトサイトメガロウイルスに対するワクチン、および２つ以上の抗原ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドとして）をコードする単一ＲＮＡポリヌクレオチドを包含するＨＣＭＶワクチンを包含する。したがって、第１のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、および第２のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含むワクチン組成物は、（ａ）第１のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする第１のＲＮＡポリヌクレオチド、および第二のＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする第二のＲＮＡポリヌクレオチドを含むワクチン、ならびに（ｂ）第１および第２のＨＣＭＶ抗原ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドとして）をコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含むワクチンを含むことが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、本開示のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、各々が、異なるＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする、オープンリーディングフレームを有する２〜１０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）以上のＲＮＡポリヌクレオチド（または、２〜１０個以上の異なるＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｍ（ｇＭ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｎ（ｇＮ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、およびＨＣＭＶ糖タンパク質Ｏ（ｇＯ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ＵＬ１２８タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３０タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ＵＬ１３１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ｇＭタンパク質およびｇＮタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬおよびｇＯタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ＵＬ８３、ＵＬ１２８、ＵＬ１２３、ＵＬ１３０、またはＵＬ１３１Ａタンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６または７）のＨＣＭＶタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａタンパク質、またはその断片、ならびにＨＣＭＶ ｇＢタンパク質またはその断片をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ｇＨタンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ｇＬタンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＵＬ１２８タンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＵＬ１３０タンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、ＵＬ１３１Ａタンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド、およびｇＢタンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（例えば、配列番号５３または５４）に融合されたＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする。シグナルペプチドは、抗原ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で融合されてもよい。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ核酸によってコードされる抗原ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。タンパク質のＮ末端１５〜６０アミノ酸を含むシグナルペプチドは、典型的には、分泌経路上の膜を横切る移行に必要であり、したがって、真核生物および原核生物の両方における大部分のタンパク質の分泌経路への進入を普遍的に制御する。シグナルペプチドは一般に、３つの領域：すなわち正に帯電したアミノ酸、疎水性領域および短いカルボキシ末端ペプチド領域を通常は含む、異なる長さのＮ末端領域を含む。真核生物では、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗い小胞体（ＥＲ）膜に向かわせ、それを横切って成長するペプチド鎖の輸送を開始する。しかしながら、シグナルペプチドは、成熟タンパク質の最終的な目的地に関与しない。それらの配列中にさらなるアドレスタグがない分泌タンパク質は、デフォルトでは外部環境に分泌される。シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）に存在するシグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質から切断されるか、または未切断のままであり、膜アンカーとして機能する。近年、シグナルペプチドのより高度な見方が進化しており、特定のシグナルペプチドの機能および免疫優性は、以前予想されていたよりもずっと融通性があることが示されている。
本開示のＨＣＭＶワクチンは、例えば、人工シグナルペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドを含み得、シグナルペプチドコード配列は、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドのコード配列と作動可能に連結され、それとインフレームである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＨＣＭＶワクチンは、シグナルペプチドに融合されたＨＣＭＶ抗原ポリペプチドを含む抗原ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドのＣ末端に融合される。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに融合されたシグナルペプチドは、人工シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによってコードされるＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに融合された人工シグナルペプチドは、免疫グロブリンタンパク質、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドから得られる。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンによりコードされるＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、以下の配列を有するＩｇ重鎖イプシロン−１シグナルペプチド（ＩｇＥ ＨＣ ＳＰ）である：ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号５３）。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによってコードされるＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに融合されたシグナルペプチドは、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５４）の配列を有するＩｇＧｋ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＨＡＨシグナルペプチド（ＩｇＧｋＳＰ）である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによってコードされるＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに融合されたシグナルペプチドは、配列番号５３または配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する。本明細書に開示される実施例は、限定されることは意味しておらず、タンパク質の細胞膜へのプロセシングおよび／または標的化のための、タンパク質のＥＲへの標的化を容易にすることが当該技術分野で公知である任意のシグナルペプチドを、本開示に従って、使用してもよい。
シグナルペプチドは、１５〜６０アミノ酸の長さを有し得る。例えば、シグナルペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸という長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、２０〜６０、２５〜６０、３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０、４５〜６０、５０〜６０、５５〜６０、１５〜５５、２０〜５５、２５〜５５、３０〜５５、３５〜５５、４０〜５５、４５〜５５、５０〜５５、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１５〜４５、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５、３５〜４５、４０〜４５、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、３５〜４０、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、１５〜２５、２０〜２５、または１５〜２０アミノ酸という長さを有してもよい。
本開示のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによってコードされるシグナルペプチドに融合されたＨＣＭＶ抗原ポリペプチドの非限定的な例は、表２の配列番号３２〜５２に見出され得る。
シグナルペプチドは、典型的には、ＥＲプロセシング中に切断接合部で新生ポリペプチドから切断される。本開示のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによって産生される成熟ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドは、典型的には、シグナルペプチドを含まない。
化学修飾
本開示のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を含む、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
「化学修飾」および「化学修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する修飾であって、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団のうちの少なくとも１つにおける修飾を指す。一般に、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分のリボヌクレオチド修飾を指すものではない。ポリペプチドに関して、「修飾」という用語は、正準のセットの２０アミノ酸に対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドはまた、アミノ酸の置換、挿入または置換および挿入の組合せを含むそれらの「修飾されたもの」と考えられる。
ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態では、様々な（２つ以上の）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定の領域は、１、２、またはそれ以上の（必要に応じて異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ、非変性ポリヌクレオチドと比較して、細胞または生物において低下した分解を示す。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾されたｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ、細胞または生物において減少した免疫原性（例えば、生得的反応の低下）を呈し得る。
ポリヌクレオチドの修飾には、本明細書に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、天然に存在するか、天然に存在しない修飾を含んでもよいし、またはポリヌクレオチドは、天然に存在する修飾と天然に存在しない修飾との組合わせを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸基、ホスホジエステル結合またはホスホジエステル骨格に対する）の任意の有用な修飾を含んでもよい。
ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態では、所望の機能または特性を達成するためにポリヌクレオチドの合成または合成後に導入される非天然修飾ヌクレオチドを含む。この修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成または鎖の末端または鎖の他の場所のポリメラーゼ酵素を用いて導入されてもよい。ポリヌクレオチドの任意の領域が、化学的に修飾されてもよい。
本開示は、ポリヌクレオチドの修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチド）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドをいう。修飾されたヌクレオチドは、例えば、化学的、酵素的、または組換え的などの任意の有用な方法によって合成され、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの１つ以上の領域を含んでもよい。このような領域は、可変の骨格結合を有してもよい。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってもよく、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチドおよび／もしくは修飾ヌクレオチド（非標準または修飾塩基を含む）間に形成された塩基対も包含し、ここで水素結合供与体および水素結合受容体の配置は、非標準塩基と標準塩基の間、または２つの相補的非標準塩基構造の間の水素結合を可能にする。そのような非標準塩基対形成の一例は、修飾されたヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの任意の組合わせを、本開示のポリヌクレオチドに組み込んでもよい。
本開示のワクチンにおいて有用なポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾には、限定するものではないが、以下が挙げられる：２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−メチルアデノシン；Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；１−メチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６−アセチルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；７−デアザ−アデノシン；Ｎ１−メチル−アデノシン；Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６−シス−ヒドロキシ−イソペンテニル−アデノシン；α−チオ−アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２−（アルキル）アデニン；２−（アミノアルキル）アデニン；２−（アミノプロピル）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（プロピル）アデニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６−（アルキル）アデニン；６−（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８−（アルケニル）アデニン；８−（アルキル）アデニン；８−（アルキニル）アデニン；８−（アミノ）アデニン；８−（ハロ）アデニン；８−（ヒドロキシル）アデニン；８−（チオアルキル）アデニン；８−（チオール）アデニン；８−アジド−アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６−（イソペンチル）アデニン；７−デアザ−８−アザ−アデノシン；７−メチルアデニン；１−デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ＯＭｅ−２−アミノ−ＡＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルアデノシンＴＰ；２−アミノアデニン；２−アミノアデノシンＴＰ；２−アミノ−ＡＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−アジドアデノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルアデノシンＴＰ；２−ブロモアデノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２−フルオロアデノシンＴＰ；２−ヨードアデノシンＴＰ；２−メルカプトアデノシンＴＰ；２−メトキシ−アデニン；２−メチルチオ−アデニン；２−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ブロモアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−クロロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−フルオロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ヨードアデノシンＴＰ；３−デアザアデノシンＴＰ；４’−アジドアデノシンＴＰ；４’−炭素環アデノシンＴＰ；４’−エチニルアデノシンＴＰ；５’−ホモ−アデノシンＴＰ；８−アザ−ＡＴＰ；８−ブロモ−アデノシンＴＰ；８−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９−デアザアデノシンＴＰ；２−アミノプリン；７−デアザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン；２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン；２−チオシチジン；３−メチルシチジン；５−ホルミルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−メチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン；リジン；Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−２’−ＯＭｅ−シチジンＴＰ；４−メチルシチジン；５−アザ−シチジン；シュード−イソ−シチジン；ピロロ−シチジン；α−チオ−シチジン；２−（チオ）シトシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−α−アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３−（アルキル）シトシン；３−（デアザ）５（アザ）シトシン；３−（メチル）シチジン；４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５−（アルキル）シトシン；５−（アルキニル）シトシン；５−（ハロ）シトシン；５−（プロピニル）シトシン；５−（トリフルオロメチル）シトシン；５−ブロモ−シチジン；５−ヨード−シチジン；５−プロピニルシトシン；６−（アゾ）シトシン；６−アザ−シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；１−メチル−シュードイソシチジン；２−メトキシ−５−メチル−シチジン；２−メトキシ−シチジン；２−チオ−５−メチル−シチジン；４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−メトキシ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−チオ−シュードイソシチジン；５−アザ−ゼブラリン；５−メチル−ゼブラリン；ピロロ−シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）シチジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−シチジンＴＰ塩酸塩；２’フルオロ−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’−ａ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）シチジンＴＰ；３’−エチニルシチジンＴＰ；４’−アジドシチジンＴＰ；４’−炭素環シチジンＴＰ；４’−エチニルシチジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−シチジンＴＰ；５−（２−クロロ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−（４−アミノ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−アミノアリル−ＣＴＰ；５−シアノシチジンＴＰ；５−エチニルアラ−シチジンＴＰ；５−エチニルシチジンＴＰ；５’−ホモ−シチジンＴＰ；５−メトキシシチジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−シチジンＴＰ；Ｎ４−アミノシチジンＴＰ；Ｎ４−ベンゾイル−シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７−メチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；１−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）；７−アミノメチル−７−デアザグアノシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アルカエオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；６−チオ−グアノシン；７−デアザ−グアノシン；８−オキソ−グアノシン；Ｎ１−メチル−グアノシン；α−チオ−グアノシン；２（プロピル）グアニン；２−（アルキル）グアニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−デオキシ−２’− α−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６−（アルキル）グアニン；６−（メチル）グアニン；６−メチル−グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７−（アルキル）グアニン；７−（デアザ）グアニン；７−（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８−（アルケニル）グアニン；８−（アルキル）グアニン；８−（アルキニル）グアニン；８−（アミノ）グアニン；８−（ハロ）グアニン；８−（ヒドロキシル）グアニン；８−（チオアルキル）グアニン；８−（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ−（メチル）グアニン；１−メチル−６−チオ−グアノシン；６−メトキシ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−グアノシン；６−チオ−７−メチル−グアノシン；７−デアザ−８−アザ−グアノシン；７−メチル−８−オキソ−グアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン；Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン；１−Ｍｅ−ＧＴＰ；２’−フルオロ−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシグアノシンＴＰ；４’−アジドグアノシンＴ

Ｐ；４’−炭素環グアノシンＴＰ；４’−エチニルグアノシンＴＰ；５’−ホモ−グアノシンＴＰ；８−ブロモ−グアノシンＴＰ；９−デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；１−メチルイノシン；イノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；７−メチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；エポキシクエオシン；ガラクトシル−クエオシン；マンノシルクエオシン；クエオシン；アリルアミノ−チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ−チミジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；３−メチルウリジン；５−カルボキシメチルウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メチルウリジン；５−タウリノメチル−２−チオウリジン；５−タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；１−メチル−３−（３−アミノ−５−カルボキシプロピル）シュードウリジン；１−メチルシュードウリジン；１−メチル−シュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−メチル−シュード−ウリジンＴＰ；４−チオウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５，６−ジヒドロ−ウリジン；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルジヒドロウリジン；５−オキシ酢酸−ウリジンＴＰ；５−オキシ酢酸−メチルエステル−ウリジンＴＰ；Ｎ１−メチル−シュード−ウリジン；Ｎ１−エチル−シュード−ウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−ウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５−プロピニルウラシル；α−チオ−ウリジン；１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル；１置換２（チオ）−シュードウラシル；１置換２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２−（チオ）−シュードウラシル；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−シュード−ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２−（チオ）ウラシル；２，４−（ジチオ）シュードウラシル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ−グアノシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−アジドウリジンＴＰ；２−メチルシュードウリジン；３（３アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）ウラシル；４−チオウラシル；５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５（２−アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５−（２−アミノプロピル）ウラシル；５−（アルキル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）シュードウラシル；５−（アルキル）ウラシル；５−（アルキニル）ウラシル；５−（アリルアミノ）ウラシル；５−（シアノアルキル）ウラシル；５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５−（ハロ）ウラシル；５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５−（メトキシ）ウラシル；５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５−（メチル）２（チオ）ウラシル；５−（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチル）４（チオ）ウラシル；５−（メチル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（メチル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）シュードウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル；５−（プロピニル）ウラシル；５−（トリフルオロメチル）ウラシル；５−アミノアリル−ウリジン；５−ブロモ−ウリジン；５−ヨード−ウリジン；５−ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６−（アゾ）ウラシル；６−アザ−ウリジン；アリルアミノ−ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード−ＵＴＰ−１−２−エタン酸；シュードウラシル；４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−カルボキシメチル−シュードウリジン；１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；１−プロピニル−ウリジン；１−タウリノメチル−１−メチル−ウリジン；１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン；１−タウリノメチル−シュードウリジン；２−メトキシ−４−チオ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−シュードウリジン；２−チオ−５−アザ−ウリジン；２−チオ−ジヒドロシュードウリジン；２−チオ−ジヒドロウリジン；２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−シュードウリジン；４−チオ−１−メチル−シュードウリジン；４−チオ−シュードウリジン；５−アザ−ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；１−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，２−ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−ベンジル）シュードＵＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−フェニル）シュードＵＴＰ；１−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）シュードＵＴＰ；１−（２−アミノ−エチル）シュードＵＴＰ；１−（２−ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２−メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ビス−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−アミノ−プロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−シクロプロピル−プロパ−２−イニル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−アミノ−４−カルボキシブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メトキシ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ニトロ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１（４−ニトロ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（５−アミノ−ペンチル）シュード−ＵＴＰ；１−（６−アミノ−ヘキシル）シュード−ＵＴＰ；１，６−ジメチル−シュード−ＵＴＰ；１−［３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１−アセチルシュードウリジンＴＰ；１−アルキル−６−（１−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−（２−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−アリル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−エチニル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ホモアリル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ビニル−シュード−ＵＴＰ；１−アリルシュードウリジンＴＰ；１−アミノメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジル−シュード−ＵＴＰ；１−ビオチニル−ＰＥＧ２−シュードウリジンＴＰ；１−ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シアノメチルシュードウリジンＴＰ；１−

シクロブチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘプチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘプチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピル−シュード−ＵＴＰ；１−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−ヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−ホモアリルシュードウリジンＴＰ；１−ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−２−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１−メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエチル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（置換フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アジド−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−ペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１−プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−プロピニル−シュードウリジン；１−ｐ−トリル−シュード−ＵＴＰ；１−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−ウリジンＴＰ；２’−ブロモ−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｆ−５−メチル−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−シュード−ＵＴＰ；２’−ａ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシウリジンＴＰ；２−メトキシ−４−チオ−ウリジン；２−メトキシウリジン；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）ウリジンＴＰ；３−アルキル−シュード−ＵＴＰ；４’−アジドウリジンＴＰ；４’−炭素環ウリジンＴＰ；４’−エチニルウリジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−ウリジンＴＰ；５−（２−フラニル）ウリジンＴＰ；５−シアノウリジンＴＰ；５−ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’−ホモ−ウリジンＴＰ；５−ヨード−２’−フルオロ−デオキシウリジンＴＰ；５−フェニルエチニルウリジンＴＰ；５−トリデューテロメチル−６−デューテロウリジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−ウリジンＴＰ；５−ビニルアラウリジンＴＰ；６−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（置換フェニル）−シュード−ＵＴＰ；６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；６−アジド−シュード−ＵＴＰ；６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；６−エチル−シュード−ＵＴＰ；６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−メチル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ１−〔３−（２−エトキシ）〕プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ｝−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−〔３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ｝〕プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−３−プロピオン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−４−ブタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−５−ペンタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−６−ヘキサン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−７−ヘプタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−メチル−ｐ−安息香酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−ｐ−安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；未修飾ヒドロキシワイブトシン；４−デメチルワイオシン；２，６−（ジアミノ）プリン；１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル：１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル；１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５−（トリメチル）フェニル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−シチジン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−アデニン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−ウリジン；２’−アミノ−２’−デオキシリボース；２−アミノ−６−クロロ−プリン；２−アザ−イノシニル；２’−アジド−２’−デオキシリボース；２’フルオロ−２’−デオキシリボース；２’−フルオロ−修飾塩基；２’−Ｏ−メチル−リボース；２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３−イル；２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル；２−ピリジノン；３ニトロピロール；３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル；３−（メチル）イソカルボスチリリル；４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール；４−（メチル）ベンズイミダゾール；４−（メチル）インドリル；４，６−（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５−（メチル）イソカルボスチリリル；５−ニトロインドール；６−（アザ）ピリミジン；６−（アゾ）チミン；６−（メチル）−７−（アザ）インドリル；６−クロロ−プリン；６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（アザ）インドリル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；７−（プロピニル）イソカルボスチリリル；７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル；７−デアザ−イノシニル；７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル；７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル；９−（メチル）−イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラセニル；ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ビス−オルト置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリリル；イソグアニジン；Ｎ２置換プリン；Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン；Ｎ６−置換プリン；Ｎ−アルキル化誘導体；ナフタレニル；ニトロベンズイミダゾリル；ニトロイミダゾリル；ニトロインダリル；ニトロピラゾリル；ヌブラリン；Ｏ６−置換プリン；Ｏ−アルキル化誘導体；オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル；ペンタセニル；フェナントラセニル；フェニル；プロピニル−７−（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン−３−イル；ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル；ピロロ−ピリミジ

ン−２−オン−３−イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４−トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン−５’−ＴＰ；２−チオ−ゼブラリン；５−アザ−２−チオ−ゼブラリン；７−デアザ−２−アミノ−プリン；ピリジン−４−オンリボヌクレオシド；２−アミノ−リボシド−ＴＰ；ホルマイシンＡＴＰ；ホルマイシンＢＴＰ；ピロロジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−アデノシンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−シチジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−ウリジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−グアノシンＴＰ；５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれ以上）の上述の修飾核酸塩基の組合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）における修飾核酸塩基は、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれ以上）の上述の修飾核酸塩基の組合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾された核酸塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシンおよびα−チオ−アデノシンからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４またはそれ以上）の上述の修飾核酸塩基の組合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（Ψ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジンおよび５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンおよび５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）および５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのようなＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾のために一様に修飾される（例えば、完全に修飾され、全配列にわたって修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾されてもよく、これはｍＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で置換されていることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列中に存在する任意のタイプのヌクレオシド残基について、上述したような修飾された残基で置換することによって、均一に修飾されてもよい。
例示的な修飾シトシンを有する核酸塩基およびヌクレオシドとしては、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）および２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。例示的な核酸塩基およびいくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾されたシトシンである。修飾されたウリジンを有するヌクレオシドには、５−シアノウリジンおよび４’−チオウリジンが含まれる。いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）およびＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾されたグアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。
本開示のポリヌクレオチドは、分子の全長に沿って部分的に修飾されても、または完全に修飾されてもよい。例えば、１つ以上のまたは全てのまたは所定の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つまたは全て）を、本発明のポリヌクレオチドにおいて、またはその所定の事前決定された配列領域中で均一に修飾してもよい（例えば、ポリＡ尾部を含むかまたは除外するｍＲＮＡ中）。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド中（またはその所定の配列領域中）の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、ここでＸは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つまたは組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであってもよい。
ポリヌクレオチドは、約１％〜約１００％の修飾されたヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含有量に関して、または１つ以上の種類のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つ以上に関して）または任意の介在するパーセント（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を含んでもよい。残りのパーセンテージは、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解される。
ポリヌクレオチドは、最初１％および最大１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の介在するパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾されたウラシルまたはシトシンなどの修飾されたピリミジンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾されたウラシル（例えば、５−置換ウラシル）で置換されてもよい。修飾されたウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよく、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾されたシトシン（例えば、５−置換シトシン）で置き換えられる。修飾されたシトシンは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えられてもよく、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えられてもよい。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、例えば、Ｇ／Ｃのレベルが増強されたものであってもよい。核酸分子のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。増大した量のグアニン（Ｇ）および／またはシトシン（Ｃ）残基を有するＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む核酸よりも機能的により安定であり得る。ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域における配列改変により安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。遺伝暗号の縮重のために、この修飾は、得られたアミノ酸を変更することなく、より大きなＲＮＡ安定性を促進するもののために既存のコドンを置換することによって機能する。このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。
従って、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、５’ＵＴＲエレメント、必要に応じてコドン最適化オープンリーディングフレーム、および３’ＵＴＲエレメント、ポリ（Ａ）配列および／またはポリアデニル化シグナル（ＲＮＡは化学修飾されていない）を含む。いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾されたウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、シュードウリジン（Ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−１−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−ジュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、Ｎ１−エチル−シュードウリジン３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソチチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジンおよび２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、非修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
インビトロにおけるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の転写
本開示のＨＣＭＶワクチンは、ｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）などの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡは例えば、「インビトロ転写鋳型」と呼ばれる、鋳型ＤＮＡからインビトロで転写される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、そして３’ＵＴＲおよびポリＡ尾部をコードする。インビトロ転写鋳型の特定の核酸配列組成および長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されたｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）から直接上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン（すなわち、翻訳終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）から直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終始コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
「ポリＡ尾部」は、複数の連続するアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲから下流、例えば、直接下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリＡ尾部は、１０〜３００個のアデノシン一リン酸を含んでもよい。例えば、ポリＡ尾部は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００のアデノシン一リン酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、５０〜２５０のアデノシン一リン酸塩を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）において、ポリ（Ａ）尾部は、ｍＲＮＡを酵素分解から（例えば、細胞質において）保護し、転写終結において、核からのｍＲＮＡの輸送および翻訳を補助するように機能する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２００〜３０００ヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００〜５００、２００〜１０００、２００〜１５００、２００〜３０００、５００〜１０００、５００〜１５００、５００〜２０００、５００〜３０００、１０００〜１５００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１５００〜３０００、または２０００〜３０００ヌクレオチド）を含んでもよい。
処置の方法
本明細書では、ヒトおよび他の哺乳動物におけるＨＣＭＶの予防および／または処置のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キットおよび試薬が提供される。ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、治療薬または予防薬として使用してもよい。それらは、感染症の予防および／または処置のために医薬で使用してもよい。例示的な態様において、本発明のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ヒトサイトメガロウイルス感染からの予防的保護を提供するために使用され、サイトメガロウイルス感染の臨床徴候の重篤度および／または期間を予防または軽減するために、免疫不全患者および幼児患者の予防および／または処置に特に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチンは、母親から子供へのＨＣＭＶの先天性伝播を低減または防止する。
広域スペクトルワクチン
ＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療薬または予防薬として使用してもよい。ヒトが２つ以上のベータコロナウイルスの感染の危険性がある（例えば、ＨＣＭＶに感染する危険性がある）状況が存在し得ることが想定される。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）治療用ワクチンは、製造速度、知覚される地理的脅威に適応するためのワクチンを迅速に調整する能力などを含むが、これらに限定されない多数の因子に起因して、混合ワクチン接種アプローチに特に適している。さらに、ワクチンは、人体を利用して、抗原性タンパク質を産生するので、ワクチンは、より大きく、より複雑な抗原性タンパク質の産生に適しており、適切な折りたたみ、表面発現、抗原提示などをヒト対象において可能にする。２つ以上のＨＣＭＶ株を防御するために、第１のＨＣＭＶの少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡを含み、さらに第２のＨＣＭＶの少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡを含む混合ワクチンを投与してもよい。ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、例えば、単一のＬＮＰ中で同時配合してもよいし、または同時投与が予定されている個別のＬＮＰに配合してもよい。
対象においてＨＣＭＶに対する免疫応答を誘発する方法は、本発明の態様において提供される。この方法は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与し、それによりその対象にＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導することを包含し、ここでこの対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価に対して、ワクチン接種後に増大する。「抗抗原ポリペプチド抗体」とは、抗原ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防有効用量は、臨床的に許容可能なレベルでウイルスによる感染を予防する治療上有効な用量である。いくつかの実施形態では、治療上有効な用量は、ワクチンの添付文書に列挙された用量である。本明細書中で使用される伝統的ワクチンは、本発明のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、伝統的ワクチンとしては、限定するものではないが、生存微生物ワクチン、死菌微生物ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、伝統的ワクチンとは、規制認可を得ているか、および／または国の医薬品規制機関、例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較してワクチン接種後に１対数〜１０対数増大する。
いくつかの実施形態では、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、ワクチン接種後に１対数増大する。
いくつかの実施形態では、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、ワクチン接種後に２対数増大する。
いくつかの実施形態では、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較してワクチン接種後に３対数増大する。
いくつかの実施形態では、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較してワクチン接種後に５対数増大する。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶに対する予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、ワクチン接種後に１０対数増大する。
対象においてＨＣＭＶに対する免疫応答を誘発する方法は、本発明の他の態様において提供される。この方法は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与すること、それによりその対象にＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導することを包含し、ここで対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して用量レベルの２倍〜１００倍でＨＣＭＶに対する伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における免疫応答と等しい。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して２倍の用量レベルで、伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における免疫応答と等しい。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して３倍の用量レベルで、伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における免疫応答と等しい。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して４倍の用量レベルで伝統的ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と等しい。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して５倍の用量レベルで伝統的ワクチン接種を受けた対象における免疫応答と等しい。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して１０倍の用量レベルで伝統的ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と等しい。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して５０倍の用量レベルで伝統的ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と等価である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して１００倍の用量レベルで伝統的なワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と等価である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して１０倍〜１０００倍の用量レベルで伝統的ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と等価である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンと比較して１００倍〜１０００倍の用量レベルで伝統的ワクチンでワクチン接種された対象における免疫応答と等価である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象において抗抗原ポリペプチド抗体価を測定することによって評価される。
他の態様では、本発明は、少なくとも１つのＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、ＨＣＭＶに対して対象における免疫応答を惹起し、それによって、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答をその対象において誘発する方法であって、対象における免疫応答が、ＨＣＭＶに対する伝統的なワクチンの予防有効量でワクチン接種された対象において誘導される免疫応答に対して２〜１０週間早く誘導される方法である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的なワクチンをＲＮＡワクチンと比較して２倍から１００倍の用量でワクチン接種された対象において誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して２日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、伝統的なワクチンの予防有効量をワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して３日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的なワクチンでワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して１週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して２週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して３週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して、５週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防有効量の伝統的ワクチンでワクチン接種された対象において誘導される免疫応答と比較して１０週間早く誘導される。
第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与することによってＨＣＭＶに対して対象の免疫応答を惹起する方法であって、前記ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化エレメントを含まず、アジュバントが、ワクチンと同時製剤化もされず、または同時投与もされない方法も本明細書に提供される。
ＣＭＶの予防と処置のためのケアの標準
免疫化戦略を含む、ＣＭＶを予防および／または処置するための様々なアプローチが以前に追求されているか、または現在進行中であり、そのうちのいくつかを以下に要約する。しかし、これらのアプローチの全てには欠点および限界がある。（Ｓｃｈｌｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２５：３６１−３８２）。
ガンシクロビルおよびバルガンシクロビル
いくつかの実施形態では、ガンシクロビルまたはバルガンシクロビルは、ＣＭＶ感染の治療または予防のためのケア療法の標準である（Ｒｅｕｓｓｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０００）；１３０（４）：１０１−１２；Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１ ：１５４−１６３）。
ガンシクロビル（ＣＹＴＯＶＥＮＥ（登録商標）およびＺＩＲＧＡＮ（登録商標）として販売）およびバルガンシクロビル（ＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標）として市販されているＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒのプロドラッグ型）は、ＣＭＶ感染を治療するためにＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅによって開発された抗ウイルス薬である。これらは２’−デオキシ−グアノシンの類似体であり、これはＤＮＡへのｄＧＴＰの組み込み、次いでウイルス複製を競合的に阻害する（Ｓｕｇａｗａｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０００；８９（６）：７８１−９）。ＣＹＴＯＶＥＮＥ−ＩＶ（注射用ガンシクロビルナトリウム）は、「免疫不全患者におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎の処置およびＣＭＶ疾患のリスクのある移植患者におけるＣＭＶ疾患の予防における使用に限って」ＦＤＡが承認している（ＦＤＡ Ｌａｂｅｌ，１／３１／２００６，ｐａｇｅ １）。
正常な腎機能を有する患者のＣＭＶ網膜炎の治療のためのＣＹＴＯＶＥＮＥ−ＩＶの推奨投与レジメンは、１４〜２１日間、１２時間ごとに５ｍｇ／ｋｇの誘導期（１時間にわたって静脈内投与）、続いて５ｍｇ／ｋｇ（１時間にわたって静脈内投与）という維持期、１週間に７日、１日１回または６ｍｇ／ｋｇを１日１回、週５日を含む。（同上、２２ページ）。正常腎機能を有する移植患者のＣＭＶ予防のために、推奨される用量レジメンは、７〜１４日間１２時間ごとに５ｍｇ／ｋｇ（１時間にわたって静脈内投与される）；次いで５ｍｇ／ｋｇを１日１回、週に７日、または６ｍｇ／ｋｇを１日１回、週５日を含む。（同上）。
移植後１２０日目の心臓移植患者を対象とした研究では、血清陽性対象におけるＣＭＶの発生率は、プラセボを与えられた対象の４６％と比較して、処置を受けた対象では９％であった。（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１：１５４−１６３，ｐａｇｅ １５７）。骨髄移植対象に関する研究では、移植後１００日で、処置された対象におけるＣＭＶの発生率は、プラセボで治療した対象における４３％と比較して３％であった。（同上）。
Ｂａｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ（ＺＩＲＧＡＮ（登録商標））によって販売されているガンシクロビルの１つの形態は、急性ヘルペス性角膜炎（樹枝状潰瘍）の処置についてＦＤＡが承認する眼科用ゲルの形態である（ＦＤＡラベル、９／１５／２００９，ｐａｇｅ ４；Ｗｉｌｈｅｌｍｕｓ ＫＲ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ １２：ＣＤ００２８９８）。
錠剤型のＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標）（塩酸バルガンシクロビル）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者のＣＭＶ網膜炎の処置および高リスクの腎臓、心臓、および腎臓−膵臓移植患者のＣＭＶ疾患の予防について、成人患者でＦＤＡが承認している。（ＦＤＡラベル、２０１５年４月２３日、ｐａｇｅ １）ＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標）の投与レジメンは、２０１５年４月２３日付けのＦＤＡラベルに示されているとおり、以下の表に示す。
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ガンシクロビルの経口型は、バイオアベイラビリティが低いことが判明した。（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１：１５４−１６３）。バルガンシクロビルは、ガンシクロビルよりも良好なバイオアベイラビリティを有することが報告されている。（Ｐｅｓｃｏｖｉｔｚ ＭＤ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４（１０）：２８１１−５；Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１：１５４−１６３）。
ガンシクロビルおよびバルガンシクロビルに伴う有害な副作用としては：発熱、発疹、下痢、および血液学的影響（好中球減少症、貧血および血小板減少症など）、ならびに潜在的な生殖毒性が挙げられる。ガンシクロビルは、動物試験で妊孕性に影響を与え、発癌性および催奇性に影響することも判明した。（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１：１５４−１６３）。
ガンシクロビルまたはバルガンシクロビルによるＣＭＶ感染の処置を含む第３相臨床試験には、以下の臨床試験政府識別番号に関連する試験が含まれる：ＮＣＴ０００００１４３、ＮＣＴ０００００１３６、ＮＣＴ０００００１３４、ＮＣＴ００４９７７９６、ＮＣＴ００２２７３７０、ＮＣＴ００４６６８１７、およびＮＣＴ００２９４５１５。ガンシクロビルまたはバルガンシクロビルを含む臨床試験の結果は、Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１：１５４−１６３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）にまとめられている。
ＣＭＶの開発における実験的ワクチン
ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）（ＡＳＰ０１１３およびＶＣＬ−ＣＢ０１としても公知）
ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）は、Ｖｉｃａｌ ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄおよびＡｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅｓ １（４）：３９８−４１４）によって開発されているＣＭＶワクチンである。ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）は、ＣＲＬ１００５ポロキサマーおよびベンザルコニウム中で製剤化された、ＣＭＶ ｐｐ６５およびｇＢ抗原をコードするプラスミドを含む二価ＤＮＡワクチンである。（同上；Ｋｈａｒｆａｎ−Ｄａｂａｊａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２：２９０−９９）。ｐｐ６５抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し、細胞性免疫を与えるが、ｇＢ抗原は、細胞性免疫および抗原特異的抗体産生の両方を誘発する。したがって、ワクチンは、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘導することを意図している。ｐｐ６５およびｇＢ配列は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅｓ １（４）：３９８−４１４の４０２〜４０３頁に記載されているように、野生型タンパク質配列から欠失およびコドン最適化によって修飾されている。
ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）は、骨髄移植および固形臓器移植（ＳＯＴ）患者などの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）について、米国および欧州でオーファンドラッグ指定を受けている。
第１相臨床試験では、ワクチンの１ｍｇおよび５ｍｇをそれぞれ投与されたＣＭＶ対象の３７．５％および５０％が、抗体またはＴ細胞応答を示した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅｓ １（４）：３９８−４１４の４０６ページ）。同種異系造血幹細胞移植を受けている患者で第２相臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ００２８５２５９）を実施した（Ｋｈａｒｆａｎ−Ｄａｂａｊａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２：２９０−９９）。移植患者は、移植前に１回を含む４回、実験ワクチンを受けた（同上、２９２ページ）。移植前の用量は、移植の３〜５日前に投与されたが、移植後の用量は、移植の２１〜４２日後、および移植の８４および１９６日後に投与された（同上）。エンドポイントには、サイトメガロウイルスのウイルス血症の安全性および低下の評価が含まれていた。（同上）。サイトメガロウイルスのウイルス血症の発生率は、プラセボと比較して、ワクチンを受けた患者では低いことが判明した（６１．８％（プラセボ）と比較して３２．５％（ワクチン群）；Ｋｈａｒｆａｎ−Ｄａｂａｊａ ｅｔ ａｌ．の２９４ページの表２）。このワクチンはまた、耐容性が高く、安全であると報告されている（同上、２９５ページ）。しかし、ワクチン処置後、抗ウイルス治療を必要とするウイルス血症の発生率は、プラセボ対照のそれに似ていた（同上、２９６ページ）。
ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）は現在、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１８７７６５５に基づいて、造血細胞移植（ＨＣＴ）患者の治療の第３相臨床試験で試験されている。試験のエンドポイントは、移植後１年目の死亡率および末梢器疾患（ＥＯＤ）である。推定登録は５００であり、ワクチンは筋肉内注射によって投与される。ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）は現在、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１９７４２０６に基づいて、ＣＭＶ−血清陽性ドナー由来の臓器を与えられているＣＭＶ−血清陰性腎臓移植レシピエントにおける第２相臨床試験でも試験されている。この試験で測定される主な転帰は、薬物の最初の投与の１年後のＣＭＶウイルス血症の発生率である。登録は１５０であり、ワクチンは、筋肉内注射によって投与される。試験に参加した対象は、移植の１０日以内に無作為化してガンシクロビルまたはバルガンシクロビルを投与された。
ＴｒａｎｓＶａｘ（商標）を含む臨床試験は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖのＷｅｂサイトで、次のＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ０２１０３４２６、ＮＣＴ０１８７７６５５、ＮＣＴ０１９７４２０６、およびＮＣＴ０１９０３９２８として見出される。
Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．に譲渡され、ＣＭＶに関連する米国特許および公開された出願には、以下が挙げられる：参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６７３，３１７号、同第９，１８０，１６２号、同第８，２７８，０９３号、同第７，８８８，１１２号、同第７，４１０，７９５号。
Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ／米国国立がん研究所／Ｈｅｌｏｃｙｔｅによる開発中の実験的ワクチン
いくつかの実験的ＣＭＶワクチンが、Ｃｉｔｙ ｏｆ ＨｏｐおよびそのライセンシーであるＨｅｌｏｃｙｔｅによって開発中である。Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅに譲渡され、ＣＭＶに関連する米国特許および公開出願としては以下が挙げられる：米国特許７，３８７，７８２号、同第７，０２５，９６９号、同第６，１３３，４３３号、同第６，２０７，１６１号、同第６，０７４，６４５号、同第６，２５１，３９９号、同第６，７２７，０９３号、同第６，７２６，９１０号、同第６，８４３，９９２号、同第６，５４４，５２１号、同第６，９５１，６５１号、同第８，５８０，２７６号、同第７，１６３，６８５号、同第６，２４２，５６７号、同第６，８３５，３８３号、同第６，１５６，３１７号、同第６，５６２，３４５号、米国特許出願公開第２０１４−００６５１８１号および同第２０１５−０２１６９６５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ＣＭＶＰｅｐＶａｘ
ＣＭＶＰｅｐＶａｘは、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅメディカルセンター、米国国立がん研究所、およびＨｅｌｏｃｙｔｅ，Ｉｎｃによって開発中の実験用ワクチンである。このワクチンは、ｐｐ６５ Ｔ細胞エピトープおよび破傷風Ｔヘルパーエピトープをキメラペプチドの形態で含み、またアジュバントＰＦ０３５１２６７６も含む。（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１６）Ｆｅｂ；３（２）：ｅ８７−９８）。ＣＭＶＰｅｐＶａｘは、造血幹細胞移植（ＨＣＴ）を受けているＣＭＶ血清陽性患者の第１ｂ相臨床試験で試験した（同上）。このワクチンは、２８日目および５６日目に皮下投与により投与された（同上）。ワクチンを投与された患者は、無再発生存期間の改善を示したことが報告された（同上）。この臨床試験には、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１５８８０１５が与えられた。ＣＭＶＰｅｐＶａｘは現在、第２相臨床試験中であり、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２３９６１３４に準拠した、ドナー幹細胞移植を受けた血液悪性腫瘍患者におけるサイトメガロウイルス事象の頻度を低減する有効性を測定するために試験中である。
ＣＭＶ−ＭＶＡトリプレックス
ＣＭＶ−ＭＶＡ−トリプレックスは、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅメディカルセンター、米国国立がん研究所およびＨｅｌｏｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（以前のＤｉａＶａｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって開発中の実験的なＣＭＶワクチンである。このワクチンは、ＣＭＶ抗原ＵＬ８３（ｐｐ６５）、ＵＬ１２３（ＩＥ１）およびＵＬ１２２（ＩＥ２）をコードする不活性化改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターからなる。（ＮＣＩ Ｄｒｕｇ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ。）
ＣＭＶ−ＭＶＡトリプレックスは、以前にＣＭＶに感染し、ドナー造血細胞移植を受けている患者のＣＭＶ合併症を軽減する有効性を検討する第２相臨床試験で現在試験中です。この試験には、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２５０６９３３が付与されている。以前にＣＭＶに曝露されているかまたはしていない健常ボランティアの第１相臨床試験も進行中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１９４１０５６）。
五量体
Ｃｉｔｙ ｏｆ ＨｏｐｅおよびＨｅｌｏｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．はまた、５つのＣＭＶ五量体サブユニットをコードする改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターを用いて五量体ワクチンを追求している。このワクチンはまだ前臨床開発中である。（Ｗｕｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ １０（１１）：ｅ１００４５２４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００４５２４）。
ｇＢ／ＭＦ５９
この実験ワクチンは、もともと１９９０年代に開発されたもので、ｇＢ抗原とＭＦ５９アジュバントを組み合わせている。（Ｐａｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ ４６（Ｓｕｐｐｌ ４）：Ｓ７３−Ｓ７６）。１９９０年代に行われたＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが支援したいくつかの臨床試験で、このワクチンが安全であることが示された。（同上、２頁）。Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒは後にこのワクチンの権利を取得した（同上）。
第２相臨床試験は、ＣＭＶ感染までの終点を使用して、１９９９年に開始した産後の女性（２００６年に登録完了した）で実施した（同上、３頁）。対象に０、１および６ヶ月でワクチンを投与した。（Ｒｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ ２０（Ｓｕｐｐｌ．５）：９５−１０２，ｐａｇｅ ９８）。ＣＭＶの感染は、プラセボ処置対象の１４％（それぞれ４３％の有効性に相当）と比較して、ワクチン処置対象の８％で診断された。結果によって、ワクチンで処置された対象におけるＣＭＶ感染率の５０％の低下が示された（プラセボ処置対象における６．６％と比較して試験対象における３．３％）（同上；Ｐａｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ ４６（Ｓｕｐｐｌ ４）：Ｓ７３−Ｓ７６，ｐａｇｅ ４）。ＣＭＶ感染率の５０％低下は、「臨床的観点から望むよりも低い」と記載されている（Ｒｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ ２０（Ｓｕｐｐｌ．５）：９５−１０２，ｐａｇｅ９８）。
腎臓移植患者および肝臓移植患者において、第２相臨床試験がまた、ｇＢ／ＭＦ５９で行われている（同上、１００頁）。「高ｇＢ抗体価は、ウイルス血症の持続時間が短いことと相関している」ということ、および「ウイルス血症の期間およびガンシクロビル治療の日数は減少した」ということが報告された（同上）。
ｇＢ／ＭＦ５９を対象とした臨床試験は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖのウェブサイトで、次のＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ００１３３４９７、ＮＣＴ００８１５１６５、およびＮＣＴ００１２５５０２で見出される。
Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ ＳＡに譲渡された米国特許出願第２００９−０１０４２２７号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｇＢ／ＡＳ０１
Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅは、ＡＳ０１アジュバントと組み合わせたｇＢ抗原を含む実験的ワクチンを開発中である。（ＭｃＶｏｙ（２０１３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５７（Ｓ４）：Ｓ１９６−９，ｐａｇｅ Ｓ１９７）。このワクチンは、ＧＳＫ１４９２９０３Ａと呼ばれる。ＧＳＫ１４９２９０３Ａを対象とした臨床試験は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖのＷｅｂサイトで、以下のＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ００４３５３９６およびＮＣＴ０１３５７９１５で見出される。
ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡによって出願されたＷＯ２０１６／０６７２３９およびＷＯ２０１５／１８１１４２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｔｏｗｎｅワクチン
ＣＭＶのＴｏｗｎｅワクチンは生弱毒化ワクチンである。（ＭｃＶｏｙ（２０１３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５７（Ｓ４）：Ｓ１９６−９、ｐａｇｅ Ｓ１９７）。このワクチンは、少なくとも低用量で投与された場合、一次的な母系感染からの保護に成功しなかった（同上）。腎臓移植対象を対象とした試験では、このワクチンを用いた処置は、軽度の疾患に与える影響を最小限に抑えながら、重度の疾患の軽減をもたらした。（Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８（１１）：１１７６−８）。
Ｔｏｗｎｅゲノムの切片が他の「低継代」株からの配列で置換された生弱毒化ワクチンも開発されており、これは「Ｔｏｗｎｅ−Ｔｏｌｅｄｏキメラ」と呼ばれ、第１相臨床試験で耐容性が高いことが判明した（ＭｃＶｏｙ（２０１３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５７（Ｓ４）：Ｓ１９６−９，ｐａｇｅ Ｓ１９７；Ｈｅｉｎｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９３：１３５０−６０）。Ｔｏｗｎｅゲノムの一部を含むキメラウイルスゲノムは、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２０４，９９０号に記載され、かつ参照により組み込まれる。
研究されている別のアプローチは、Ｔｏｗｎｅワクチンを、アジュバント組換えインターロイキン−１２（ｒｈＩＬ−１２）と同時投与することを包含する（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：５３１１−９）。
ＣＭＶ−ＣＴＬ
ＣＭＶ標的化Ｔ細胞プログラム（ＣＭＶ−ＣＴＬ）は、Ａｔａｒａ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されている細胞性免疫療法アプローチである。
第１相臨床試験では、ＣＭＶ ｐｐ６５またはｐｐ６５／ＩＥ１ペプチド混合物を用いて単球をパルスしてＣＭＶ ＣＴＬを拡大させ、免疫学的効果を調べた。（Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３５（３）：２９３−２９８）。ＣＴＬを受けた対象の約７０％において、ＣＭＶ特異的免疫応答が観察された（同上、５頁）。
同種造血幹細胞移植後のＣＭＶ感染または持続性ＣＭＶウイルス血症の処置のための第三者ドナー由来のＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞を調べる第２相臨床試験が現在進行中である。この試験には、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２１３６７９７を割り当てた。第２相臨床試験も進行中であり、同種造血幹細胞移植後のＣＭＶ感染または持続性ＣＭＶウイルス血症の処置のための初代移植ドナー由来ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞を検討している。この試験には、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１６４６６４５を割り当てた。
モノクローナルＡｂ
Ｎｏｖａｒｔｉｓ
Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されているＣＳＪ１４８は、ｇＢおよびＣＭＶ五量体複合体を標的とする２つのモノクローナル抗体の組合わせである。（Ｄｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ａｐｒ ２２；６０（５）：２８８１−７）。２つの抗体は、ＬＪＰ５３８およびＬＪＰ５３９として公知である。（同上）。ＬＪＰ５３８、ＬＪＰ５３９、およびＣＳＪ１４８は、健康なボランティアに静脈内投与された場合に安全であることが見出され、ＩｇＧの予想薬物動態を明らかにした（同上）。ＣＳＪ１４８は現在、幹細胞移植患者（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２２６８５２６）の有効性と安全性を調査する第２相臨床試験中である。
Ｔｈｅｒａｃｌｏｎｅ
ＴＣＮ−２０２は、ＴｈｅｒａｃｌｏｎｅによってＣＭＶ感染の処置のために開発されている完全ヒトモノクローナル抗体である。ＴＣＮ−２０２は、第１相臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１５９４４３７）において安全で許容性が高いことが判明した。腎臓移植レシピエントの有効性を調査するため、第２相試験が２０１３年に開始された。（Ｔｈｅｒａｃｌｏｎｅプレスリリース、２０１３年９月１０日）。
ブリンシドホビル
ブリンシドホビル（ＣＭＸ００１）は、ＣＭＶを含むＤＮＡウイルスの処置のために、Ｃｈｉｍｅｒｉｘ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．によって開発されてる実験的な脂質−ヌクレオチドコンジュゲートである。ブリンシドホビルは、ＦＤＡからＣＭＶについてファスト・トラック指定を受けた。
造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている対象におけるＣＭＶ予防を検討する第３相臨床試験（「ＳＵＰＰＲＥＳＳ」と呼ばれる）の結果は、２０１６年２月に発表された（Ｃｈｉｍｅｒｉｘ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１６年２月２０日）。この試験では、２４週でＣＭＶを予防するという主要エンドポイントに達しなかったが、治療段階で抗ウイルス効果が観察されたことが報告された（同上）。この試験には、ＨＣＴを受けている対象４５２人が参加し、週に２回ブリンシドホビルを最大１４週間まで投与された。（同上）。ブリンシドホビルによる処置後、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のためのコルチコステロイドなどの免疫ステロイドの使用が増大したことが、試験の主要エンドポイントに達しなかったことに寄与した可能性があると推測された。（同上）。他の第３相試験は、ＳＵＰＰＲＥＳＳ試験の結果に基づいて終了したが、Ｃｈｉｍｅｒｉｘは、腎臓移植を受けた対象において、第２相試験をさらに進める意向であることを示した。（同上）。
ブリンシドホビルに関連する臨床試験に関する情報は、以下の識別番号を含み、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖのウェブサイトに見出される：ＮＣＴ０２０８７３０６、ＮＣＴ０２２７１３４７、ＮＣＴ０２１６７６８５、ＮＣＴ０２５９６９９７、ＮＣＴ０２４３９９７０、ＮＣＴ００７９３５９８、ＮＣＴ０１７６９１７０、ＮＣＴ００７８０１８２、ＮＣＴ０１２４１３４４、ＮＣＴ００９４２３０５、ＮＣＴ０２４２００８０、ＮＣＴ０２４３９９５７、ＮＣＴ０１１４３１８１、およびＮＣＴ０１６１０７６５。
Ｖ１６０
Ｖ１６０は、弱毒化ＡＤ１６９株に基づく、Ｍｅｒｃｋによって開発中の実験的なＣＭＶワクチンである。Ｖ１６０は現在、健常成人の複数の製剤を試験する３回投与レジメンを評価する第１相臨床試験で試験されている。この試験には、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１９８６０１０を割り当てた。
Ｍｅｒｃｋはまた、ＣＭＶ五量体複合体を標的とするワクチンを追求している（Ｌｏｕｇｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ｊｂｃ．Ｍ１１５．６５２２３０）。Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐに譲渡された米国特許および公開出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４−０２２００６２号および米国特許第２０１５−０３０７８５０号を含む。
レテルモビル
レテルモビル（ＡＩＣ２４６）は、ＣＭＶ感染の処置のためにＭｅｒｃｋによって開発中の抗ウイルス薬である（Ｃｈｅｍａｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７０；１９，Ｍａｙ ８， ２０１４，Ｖｅｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｄｒｕｇｓ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍａｙ；３８（５）：２９１−２９８）。レテルモビルは、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０１０６３８２９に対応する、ＨＳＣＴレシピエントにおけるＣＭＶの予防を検討する第ＩＩｂ相臨床試験で試験され、移植対象におけるＣＭＶ感染の発生率を低下させることが判明した。
Ｒｅｄｖａｘ ＧｍｂＨ／Ｐｆｉｚｅｒ
ＣＭＶを標的とする前臨床候補は、Ｒｅｄｂｉｏｔｅｃ ＡＧからの独立企業であるＲｅｄｖａｘ ＧｍｂＨによって開発された。この候補は、現在、Ｐｆｉｚｅｒによって追求されている。
Ｒｅｄｖａｘ ＧｍｂＨまたはＰｆｉｚｅｒに譲渡され、ＣＭＶに関連する特許および特許刊行物としては、以下が挙げられる：それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５−０３２２１１５号、ＷＯ２０１５／１７０２８７号、米国特許出願公開第２０１５−０３５９８７９号およびＷＯ２０１４／０６８００１号。
治療的および予防的組成物
本明細書では、ヒトにおけるＨＣＭＶの予防、処置または診断のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キットおよび試薬が提供される。ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。それらは、感染症の予防および／または治療のために医薬において使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＭＶワクチンは、例えばエキソビボで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化する、免疫エフェクター細胞のプライミングに使用され、次いで対象に注入（再注入）されることが想定され得る。
例示的な実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含有するＨＣＭＶワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に投与してもよく、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて抗原ポリペプチドが産生される。いくつかの実施形態では、対象は、出産適齢期の女性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチンは、母親から子供へのＨＣＭＶの先天性伝染を低減または防止する（Ｐａｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ Ｐｅｄ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３（ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ２−Ｓ６）。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、細胞、組織または生物体におけるポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳のために誘導され得る。例示的な実施形態では、このような翻訳は、インビボで生じるが、このような翻訳がエキソビボ、培養またはインビトロで起こる実施形態が想定され得る。例示的な実施形態では、細胞、組織または生物は、抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含むＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを含む有効量の組成物と接触される。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンの「有効量」は、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、修飾されたヌクレオシドのサイズおよび程度）およびＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンの他の成分、および他の決定因子に少なくとも部分的に基づいて提供される。一般に、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、細胞内の抗原産生の関数として、好ましくは同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的な、誘発されたまたは増強された免疫応答を提供する。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクション（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）の増大、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の減少（示されるように、例えば、修飾されたポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増大した持続時間）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡワクチン（ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを含む）をＨＣＭＶの治療に使用してもよい。ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、健康な個体への活性免疫化スキームの一部として予防的にもしくは治療的に投与されてもよく、または感染の初期にインキュベーション段階中もしくは症状発現後の活性感染中に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織または対象に提供される本開示のＲＮＡワクチンの量は、免疫予防に有効な量であってもよい。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、他の予防または治療化合物と共に投与してもよい。非限定的な例として、予防的または治療的化合物は、アジュバントまたはブースターであってもよい。本明細書中で使用される場合、ワクチンなどの予防組成物を指す場合、「ブースター免疫」という用語は、予防（ワクチン）組成物の余分な投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物のより早期の投与後に与えられてもよい。予防組成物の初期投与とブースター投与との間の投与時間は限定するものではないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年または９９年超であってもよい。例示的な実施形態では、予防組成物の初期投与とブースターとの間の投与時間は、限定するものではないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年であり得る。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、当該技術分野で公知の不活性化ワクチンの投与と同様に、筋肉内または皮内に投与され得る。ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、感染の有病率、または満たされていない医学的必要性の程度もしくはレベルに応じて、様々な状況で利用することができる。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、様々な感染症を治療および／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、より大きな抗体価を生成し、市販の抗ウイルス剤よりも早く応答を生成する点で優れた特性を有する。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンおよびＲＮＡワクチン組成物および／または複合体を必要に応じて１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が本明細書で提供される。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、単独で、または１つ以上の他の成分と組み合わせて製剤化されても、または投与されてもよい。例えば、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン（ワクチン組成物）は、アジュバントを含むがこれに限定されない他の成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンはアジュバントを含まない（それらはアジュバントフリーである）。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されても、または投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の活性物質、例えば治療上有効な物質、予防的に有効な物質、またはその両方の組合わせを含む。ワクチン組成物は、滅菌であっても、発熱物質フリーであっても、または滅菌されかつ発熱物質フリーであってもよい。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化および／または製造における一般的な考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、一般にＲＮＡワクチンまたはその中に含まれるポリヌクレオチド、例えば抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡポリヌクレオチド）をいう。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているかまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と会合させること、次いで、必要であればおよび／または望ましい場合には、所望の単回投与単位または複数回投与単位に製品を分割、形成および／または包装することを包含する。
本開示による医薬組成物中の有効成分、医薬的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズおよび／または状態に依存して、さらに組成物が投与される経路に依存して変化する。一例として、この組成物は、０．１〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、（１）安定性を増大させるために；（２）細胞トランスフェクションを増大させるために；（３）持続放出または遅延放出（例えば、デポー製剤から）を可能にするために；（４）生体内分布を変えるために（例えば、標的を特定の組織または細胞型に標的する）；（５）インビボでコードされたタンパク質の翻訳を増大させるために；および／または（６）インビボでコードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルを変更するために、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化してもよい。任意のかつ全ての溶媒、分散媒質、希釈剤または他の液体ビヒクルなどの伝統的な賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、賦形剤は、限定されるものではないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンをトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植のため）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびそれらの組合わせを含んでもよい。
安定化エレメント
天然に存在する真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’−キャップ構造または３’−ポリ（Ａ）尾部のような他の構造的特徴に加えて、その５’末端（５’ＵＴＲ）および／またはその３’末端（３’ＵＴＲ）に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むがこれらに限定されない安定化エレメントを含むことが見出されている。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方とも、典型的には、ゲノムＤＮＡから転写され、早期ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴、例えば５’−キャップおよび３’−ポリ（Ａ）尾部は、通常、ｍＲＮＡプロセシング中に、転写された（早期）ｍＲＮＡに付加される。３’−ポリ（Ａ）尾部は、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されたアデニンヌクレオチドのストレッチである。これは約４００までのアデニンヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、３’−ポリ（Ａ）尾部の長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須の要素であり得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、１つ以上の安定化エレメントを含んでもよい。安定化エレメントとしては、例えば、ヒストンステムループを挙げてもよい。３２ｋＤａタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が同定されている。これは、核および細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端でヒストンステムループと会合している。その発現レベルは、細胞周期によって調節される；これは、Ｓ期の間にピークになり、この時、ヒストンｍＲＮＡレベルもまた上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰは、プロセシング後にステムループと関連し続け、次いで細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物および原生動物にわたって保存されており、ヒストンステムループへのその結合は、そのループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して少なくとも３つのヌクレオチド５’および２つのヌクレオチド３’を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、および必要に応じてポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、一般に、コードされたタンパク質の発現レベルを増強すべきである。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）でも、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、α−グロビン、ガラクトキナーゼおよびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））でもない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組合わせは、たとえ両者が本質的に代替的機構を示すとしても、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを超えてタンパク質発現を増大する。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組合わせの相乗効果は、そのエレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しないことが見出されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント」（ＨＤＥ）は、ヒストンプレ−ｍＲＮＡの成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与する、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの結合部位を表す、天然に存在するステムループの約１５〜２０ヌクレオチド３’のプリンリッチなポリヌクレオチドストレッチを含む。理想的には、本発明の核酸はイントロンを含まない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、エンハンサーおよび／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、この配列は、修飾されていても修飾されていなくてもよく、または活性化されても不活性化されていてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは一般に、ヒストン遺伝子に由来し、構造のループを形成する短い配列からなる、スペーサーによって分離された２つの隣接する部分的にまたは完全に逆相補的な配列の分子内塩基対形成を含む。対形成されていないループ領域は、通常は、いずれかのステムループエレメントと塩基対を形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡにおいてより頻繁に起こるが、同様に一本鎖ＤＮＡ中にも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、一般に、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、および対形成領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ウォブル塩基対形成（非ワトソン−クリック塩基対形成）が生じる場合がある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５〜４５ヌクレオチドの長さを含む。
他の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、１つ以上のＡＵリッチ配列が除去されてもよい。時にはＡＵＲＥＳと呼ばれるこれらの配列は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳは、ＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチン中に残っていてもよい。
ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子と呼ばれる脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化される。脂質ナノ粒子の形成は、当該技術分野で公知の方法により達成されてもよいし、および／またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号に記載されるように達成されてもよい。非限定的な例として、ポリカチオンとしては、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、限定するものではないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニン、ならびに国際出願番号ＷＯ２０１２０１３３２６または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のカチオン性ペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、限定されないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中に製剤化される。
脂質ナノ粒子製剤は、限定するものではないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和度、ＰＥＧ化の性質、全ての成分の比および生物学的パラメータ、例えばサイズなどの影響を受ける場合がある。Ｓｅｍｐｌｅらによる一例では（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１０ ２８：１７２−１７６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、脂質ナノ粒子製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロールおよび１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成される。別の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることにより、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより効果的に送達することができる（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、３５〜４５％のカチオン性脂質、４０〜５０％のカチオン性脂質、５０〜６０％のカチオン性脂質および／または５５〜６５％のカチオン性脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中の脂質対ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の比は、５：１〜２０：１、１０：１〜２５：１、１５：１〜３０：１および／または少なくとも３０：１であってもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤中のＰＥＧの比を増大もしくは減少させるか、および／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変して、その脂質ナノ粒子製剤の薬物動態および／または生体内分布を変更してもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子製剤は、０．５％〜３．０％、１．０％〜３．５％、１．５％〜４．０％、２．０％〜４．５％、２．５％〜５．０％および／または３．０％〜６．０％という脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（本明細書ではＰＥＧ−ＤＯＭＧとも呼ぶ）を、カチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールと比較して含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ脂質、例えば、限定するものではないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）および／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）で置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、限定されないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのような当該技術分野で公知の任意の脂質から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン製剤は、少なくとも１つの脂質を含むナノ粒子である。脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質およびアミノアルコール脂質から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってもよい。このアミノアルコールカチオン性脂質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号に記載されるか、および／または記載の方法によって製造された脂質であってもよい。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号中の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号の化合物３）；および２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号の化合物４）；または任意のその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であってもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的には、脂質、特にイオン化可能なカチオン性脂質、例えば２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメトルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに中性脂質、ステロールおよび粒子凝集を減少させることができる分子、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群より選択される少なくとも１つの脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール；ならびに（ｉｖ）ＰＥＧ−脂質、例えば、２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ−脂質というモル比でのＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で２５％〜７５％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を、例えば、モル基準で３５〜６５％、４５〜６５％、６０％、５７．５％、５０％または４０％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で０．５〜１５％、例えば、モル基準で、３〜１２％、５〜１０％または１５％、１０％または７．５％の中性脂質を含む。中性脂質の例としては、限定するものではないが、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭが挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で５％〜５０％のステロール（例えば、モル基準で１５〜４５％、２０〜４０％、４０％、３８．５％、３５％または３１％を含む。ステロールの非限定的な例は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で０．５％〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質（例えば、モル基準で０．５〜１０％、０．５〜５％、１．５％、０．５％、１．５％、３．５％または５％）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、２，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子重量２，０００未満、例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００ＤａのＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書ではまた、ＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（その内容が全体として参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）においてさらに考察されている）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２５〜７５％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、ならびに０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、３５〜６５％の、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、ならびに０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、４５〜６５％の、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、ならびに０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、６０％の、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質、７．５％の中性脂質、３１％のステロール、ならびに１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質、１０％の中性脂質、３８．５％のステロール、ならびに１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される５０％のカチオン性脂質、１０％の中性脂質、３５％のステロール、４．５％または５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、ならびに０．５％の標的化脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される４０％のカチオン性脂質、１５％の中性脂質、４０％のステロール、ならびに５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される５７．２％のカチオン性脂質、７．１％の中性脂質、３４．３％のステロール、および１．４％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、ＰＥＧ−ｃＤＭＡであるＰＥＧ脂質（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１０７，２７６−２８７（２００５）にさらに考察される）から選択される５７．５％のカチオン性脂質、７．５％の中性脂質、３１．５％のステロール、および３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２０〜７０％のカチオン性脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比の脂質混合物から本質的になる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比の脂質混合物から本質的になる。
いくつかの実施形態では、モル脂質比は、５０／１０／３８．５／１．５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧ）、５７．２／７．１１３４．３／１．４（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、４０／１５／４０／５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、５０／１０／３５／４．５／０．５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＳＧ）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＮＡ）。
脂質ナノ粒子組成物の非限定的な例およびそれらの作製方法は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３；およびＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０−１５７８（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質および構造脂質を含み、必要に応じて非カチオン性脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０％のカチオン性脂質、５〜１５％の非カチオン性脂質、１〜２％のＰＥＧ脂質および３０〜５０％の構造脂質を含んでもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％カチオン性脂質、１０％非カチオン性脂質、１．５％ＰＥＧ脂質および３８．５％構造脂質を含んでもよい。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％カチオン性脂質、１０％非カチオン性脂質、２．５％ＰＥＧ脂質および３２．５％構造脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、本明細書に記載の任意のカチオン性脂質、例えば、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＬ３１９であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４成分の脂質ナノ粒子であってもよい。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質および構造脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０％のカチオン性脂質、５〜１５％の非カチオン性脂質、１〜２％のＰＥＧ脂質および３０〜５０％の構造脂質を含んでもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％カチオン性脂質、１０％非カチオン性脂質、１．５％ＰＥＧ脂質および３８．５％構造脂質を含んでもよい。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％カチオン性脂質、１０％非カチオン性脂質、２．５％ＰＥＧ脂質および３２．５％構造脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、本明細書に記載の任意のカチオン性脂質、例えば、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＬ３１９であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質および構造脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧおよび３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧおよび３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧおよび３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧおよび３２．５％の構造脂質コレステロールを含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 0006921833
 、またはその塩もしくは異性体を含み、式中：
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”、またはＲ２およびＲ３からなる群より独立して選択され、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換のＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各々のｎは独立して１、２、３、４、および５から選択され；
各々のＲ５は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ６は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
ＭおよびＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、およびアリール基、およびヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ７はＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
Ｒ８はＣ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
Ｒ９はＨ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
各々のＲは独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ’は独立してＣ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ”は独立してＣ３−１４アルキルおよびＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各々のＲ＊は独立してＣ１−１２アルキルおよびＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各々のＹは独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択され；かつｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、以下のものであって、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５である場合、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが１または２である場合、Ｑが５、６もしくは７員のヘテロシクロアルキルではないものを含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換のＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、これは、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、およびＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されており、各々のｎは独立して１、２、３、４、および５から選択され；
各々のＲ５は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ６は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
ＭおよびＭ’は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
各々のＲは独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ’は独立してＣ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ”は独立してＣ３−１４アルキルおよびＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各々のＲ＊は独立してＣ１−１２アルキルおよびＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各々のＹは独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択され；かつ
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるもの、またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下のものであって、ここで、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は独立してＨ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換のＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、ならびに各々のｎは独立して１、２、３、４、および５から選択され；かつＱは、５〜１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４は−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、１もしくは２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４は−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでｎは、１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４は、−ＣＨＱＲおよび−ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５〜１４員のヘテロアリールまたは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり；
各々のＲ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ６は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
ＭおよびＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
各々のＲは独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ’は独立してＣ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ”は独立してＣ３−１４アルキルおよびＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各々のＲ＊は独立してＣ１−１２アルキルおよびＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各々のＹは独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択され；かつ
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるもの、またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下のものであって、ここで
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は独立してＨ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ” からなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３はそれらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換のＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、および各々のｎは独立して１、２、３、４、および５から選択され；
各々のＲ５は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ６は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
ＭおよびＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環および複素環からなる群より選択され；
各々のＲは独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ’は独立してＣ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ”は独立してＣ３−１４アルキルおよびＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各々のＲ＊は独立してＣ１−１２アルキルおよびＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各々のＹは独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択され；かつ
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるもの、またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下のものであって、ここで、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は独立してＨ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱは−Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎは、３、４、および５から選択され；
各々のＲ５は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ６は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
ＭおよびＭ’は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、およびアリール基、およびヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲは独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ’は独立してＣ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ”は独立してＣ３−１４アルキルおよびＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各々のＲ＊は独立してＣ１−１２アルキルおよびＣ１−１２アルケニルからなる群より選択され；
各々のＹは独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択され；かつ
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるもの、またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、以下のものであって、ここで、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は独立してＣ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、および−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、およびＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここでＱは−Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎは、１、２、３、４、および５から選択され；
各々のＲ５は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ６は独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
ＭおよびＭ’は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、およびアリール基、およびヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲは独立してＣ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ’は独立してＣ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、およびＨからなる群より選択され；
各々のＲ”は独立してＣ３−１４アルキルおよびＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各々のＲ＊は独立してＣ１−１２アルキルおよびＣ１−１２アルケニルからなる群より選択され；
各々のＹは独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択され；かつ
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるもの、またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの：
Figure 0006921833
 、またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｌは、１、２、３、４、および５から選択され；ｍは、５、６、７、８、および９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでＱは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；ＭおよびＭ’は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され；かつＲ２およびＲ３は独立してＨ、Ｃ１−１４アルキル、およびＣ２−１４アルケニルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは式（ＩＩ）のもの：
Figure 0006921833
 またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｌは、１、２、３、４、および５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、２、３、または４であり、およびＱはＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；ＭおよびＭ’は独立して−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され；かつＲ２およびＲ３は独立してＨ、Ｃ１−１４アルキル、およびＣ２−１４アルケニルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）のもの：
Figure 0006921833
 、またはその塩もしくは異性体を含み、ここでＲ４は、本明細書に記載されるとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）のもの：
Figure 0006921833
 、またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｎは、２、３、または４であり；かつｍ、Ｒ’、Ｒ”、およびＲ２〜Ｒ６は本明細書に記載されるとおりである。例えば、Ｒ２およびＲ３の各々は、Ｃ５−１４アルキルおよびＣ５−１４アルケニルからなる群より独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）のもの：
Figure 0006921833
 、またはその塩もしくは異性体を含み、ここでＲ４は、本明細書に記載のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）のもの：
Figure 0006921833
 ，またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｎは、２、３、または４であり；かつｍ、Ｒ’、Ｒ”、およびＲ２〜Ｒ６は本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立してＣ５−１４アルキルおよびＣ５−１４アルケニルからなる群より選択され得る。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下からなる群より選択される：
Figure 0006921833
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 。さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下からなる群より選択される：
Figure 0006921833
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 。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下からなる群より選択される：
Figure 0006921833
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 、およびそれらの塩および異性体。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、以下の化合物を含む：
Figure 0006921833
 またはそれらの塩および異性体。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ））を含む脂質成分を含むナノ粒子組成物を特徴とする。
ワクチン組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズおよび／または状態に依存して、さらに、組成物を投与する経路に依存して、変化し得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。一例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子、緩衝剤クエン酸三ナトリウム、スクロースおよび注射用水中に配合された、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含んでもよい。非限定的な例として、組成物は、以下を含む：２．０ｍｇ／ｍＬの薬物（例えば、Ｈ１０Ｎ８インフルエンザウイルスをコードするポリヌクレオチド）、２１．８ｍｇ／ｍＬのＭＣ３、１０．１ｍｇ／ｍＬのコレステロール、５．４ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、２．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０００−ＤＭＧ、５．１６ｍｇ／ｍＬのクエン酸三ナトリウム、７１ｍｇ／ｍＬのスクロースおよび１．０ｍＬの注射用水。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、１０〜５００ｎｍ、２０〜４００ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、４０〜２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、５０〜１５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、８０〜１００ｎｍまたは８０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
フラジェリンは、細菌の動きに関連して鞭毛を形成するために重合する約５００アミノ酸のモノマータンパク質である。フラジェリンは、様々な鞭毛細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびに非鞭毛細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）によって発現される。先天性免疫系（樹状細胞、マクロファージなど）の細胞によるフラジェリンの感知は、トール様受容体５（ＴＬＲ５）ならびにＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）ＩｐａｆおよびＮａｉｐ５によって媒介される。ＴＬＲおよびＮＬＲは、自然免疫応答および適応免疫応答の活性化において役割を果たすと同定されている。それゆえ、フラジェリンはワクチンにおいてアジュバント効果を提供する。
既知のフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースで公に入手可能である。とりわけ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．Ｌｕｐｉｎｉ、Ｂ．ｃｌａｒｒｉｄｇｅｉａｅ、Ｐ．Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＥ．ｃｏｌｉ由来のフラジェリン配列が知られている。
本明細書で使用されるフラジェリンポリペプチドとは、全長フラジェリンタンパク質、その免疫原性断片、およびフラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを指す。例示的なフラジェリンタンパク質としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（ＵｎｉＰｒｏ登録番号：Ｑ５６０８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＤＧ０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＢＡＢ７）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（Ｑ６Ｖ２Ｘ８）由来のフラジェリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、フラジェリンポリペプチドは、フラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、フラジェリンポリペプチドは免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を引き起こすフラジェリンタンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、免疫応答はＴＬＲ５免疫応答である。免疫原性断片の例は、ヒンジ領域の全てまたは一部が欠失されているか、または他のアミノ酸で置換されているフラジェリンタンパク質である。例えば、抗原ポリペプチドを、ヒンジ領域に挿入してもよい。ヒンジ領域は、フラジェリンの超可変領域である。フラジェリンのヒンジ領域はまた、「Ｄ３ドメインまたは領域」、「プロペラドメインまたは領域」、「超可変領域または領域」および「可変ドメインまたは領域」とも呼ばれる。「ヒンジ領域の少なくとも一部」とは、本明細書中で使用される場合、フラジェリンのヒンジ領域のいずれかの部分、またはヒンジ領域の全体を指す。他の実施形態では、フラジェリンの免疫原性断片は、フラジェリンの２０、２５、３０、３５、または４０アミノ酸のＣ末端断片である。
フラジェリンモノマーは、ドメインＤ０〜Ｄ３によって形成される。ステムを形成するＤ０およびＤ１は、縦列の長いαヘリックスから構成され、かつ異なる細菌間で高度に保存されている。Ｄ１ドメインは、ＴＬＲ５活性化に有用なアミノ酸のいくつかのストレッチを含む。Ｄ１ドメイン全体またはドメイン内の１つ以上の活性領域は、フラジェリンの免疫原性断片である。Ｄ１ドメイン内の免疫原性領域の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＦｌｉＣフラジェリンの残基８８〜１１４および残基４１１〜４３１が挙げられる。８８〜１００領域の１３アミノ酸内で、サルモネラのフラジェリンとＴＬＲ５活性化を依然として保持する他のフラジェリンとの間で少なくとも６個の置換が可能である。したがって、フラジェリンの免疫原性断片には、ＴＬＲ５を活性化し、かつＦｌｉＣ（ＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮ；配列番号４２８）の８８〜１００のサルモネラ配列と５３％以上同一である１３アミノ酸モチーフを含むフラジェリン様配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、フラジェリンと１つ以上の抗原ポリペプチドとの融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、構築物の２つの成分の連結を指す。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドのカルボキシ末端は、フラジェリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態では、抗原ポリペプチドのアミノ末端は、フラジェリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の抗原ポリペプチドに連結された例えば１、２、３、４、５、６またはそれ以上のフラジェリンポリペプチドを含んでもよい。２つ以上のフラジェリンポリペプチドおよび／または２つ以上の抗原ポリペプチドが連結される場合、このような構築物は、「多量体」と呼ばれ得る。
融合タンパク質の各成分は、互いに直接結合していてもよいし、またはリンカーを介して結合していてもよい。例えば、リンカーはアミノ酸リンカーであってもよい。融合タンパク質の成分を連結するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるアミノ酸リンカーは、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基およびアルギニン残基からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、１〜３０、１〜２５、１〜２５、５〜１０、５、１５または５〜２０アミノ酸の長さである。
他の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、少なくとも２つの別々のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、一方は１つ以上の抗原ポリペプチドをコードし、他方はフラジェリンポリペプチドをコードする。少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子のような担体中に共配合してもよい。
リポソーム、リポプレックスおよび脂質ナノ粒子
本発明のＲＮＡワクチンは、１種以上のリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を用いて製剤化してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１のうちの１つ以上をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを含む１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド成分の全てが、同じリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される。他の実施形態では、ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド成分のうち１つ以上が、異なるリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子に製剤化される。他の実施形態では、ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド成分の各々は、異なるリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１をコードするＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１をコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上のリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子中に製剤化してもよい。特定の実施形態では、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１をコードするＲＮＡポリヌクレオチドは、全て同じリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子中に含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンの医薬組成物にはリポソームが含まれる。リポソームは、人工的に調製された小胞であり、主に脂質二重層から構成され、栄養素および医薬製剤の投与のための送達媒体として使用され得る。リポソームは、限定するものではないが、直径が数百ナノメートルであってもよく、狭い水性区画によって分離された一連の同心の二重層を含んでいてもよい多層小胞（ＭＬＶ）、直径が５０ｎｍより小さくてもよい小さな単細胞小胞（ＳＵＶ）、直径が５０〜５００ｎｍであってもよい、大きな単層小胞（ＬＵＶ）などの異なるサイズであってもよい。リポソーム設計は、限定するものではないが、リポソームの不健康な組織への付着を改善するため、または限定するものではないが、エンドサイトーシスなどの事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含んでもよい。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低ｐＨを含んでも、または高ｐＨを含んでもよい。
リポソームの形成は、物理化学的特性、例えば、限定するものではないが、封入された医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散されている媒体の性質、封入された物質の有効濃度およびその潜在毒性、小胞の適用および／または送達中に関与する任意のさらなるプロセス、意図される用途のための小胞の最適化サイズ、多分散性および有効期間、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間の再現性および大規模生産の可能性に依存し得る。
非限定的な例として、合成膜小胞のようなリポソームは、その各々の内容が、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、および同第ＵＳ２０１３０１８３３７２に記載される方法、装置およびデバイスによって調製され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定するものではないが、リポソーム、例えば、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソームから形成されたリポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）および限定するものではないが、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）のＤＯＸＩＬ（登録商標）などの小分子薬物を送達し得るリポソームを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定するものではないが、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達について、これまでに記載され、適切であることが示されている安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるリポソームなどのリポソームを含んでもよい（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９ ６：２７１−２８１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９ ６：１４３８−１４４７；Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００５ ２２：３６２−３７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２：１００２−１００７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ ４４１：１１１−１１４；Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．２００５ １０７：２７６−２８７；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２−１７６；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１−６７３；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５−１３２；米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１２２１０４号（これらは全てその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによるオリジナルの製造方法は、界面活性剤透析法であり、これは後にＪｅｆｆｓらによって改良され、自発的小胞形成法と呼ばれる。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチドに加えて３〜４個の脂質成分から構成される。例として、リポソームは、限定するものではないが、５５％コレステロール、２０％ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）をＪｅｆｆｓらが記載のとおり含んでもよい。別の例として、特定のリポソーム製剤は、限定するものではないが、４８％コレステロール、２０％ＤＳＰＣ、２％ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％カチオン性脂質を含んでもよく、このカチオン性脂質は１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）をＨｅｙｅｓらが記載するように含んでもよい。
いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約２５．０％のコレステロール〜約４０．０％のコレステロール、約３０．０％のコレステロール〜約４５．０％のコレステロール、約３５．０％のコレステロール〜約５０．０％のコレステロール、および／または約４８．５％のコレステロール〜約６０％のコレステロールを含んでもよい。好ましい実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％および４３．５％からなる群より選択されるパーセンテージのコレステロールを含んでもよい。いくつかの実施形態では、製剤は、約５．０％〜約１０．０％のＤＳＰＣおよび／または約７．０％〜約１５．０％のＤＳＰＣを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原（抗原）または任意の他の目的のポリペプチドをコードし得るポリヌクレオチドを送達するように形成され得る、リポソームを含んでもよい。ＲＮＡワクチンは、リポソームによってカプセル化されてもよく、および／またはリポソームによって後にカプセル化され得る、水性コアに含有されてもよい（国際出願番号ＷＯ２０１２０３１０４６、ＷＯ２０１２０３１０４３、ＷＯ２０１２０３０９０１およびＷＯ２０１２００６３７８ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、同第ＵＳ２０１３０１９５９６９号、および同第ＵＳ２０１３０２０２６８４号（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
別の実施形態では、標的送達のためにリポソームを製剤化してもよい。非限定的な例として、リポソームは、肝臓への標的送達のために製剤化してもよい。標的送達のために使用されるリポソームとしては、限定するものではないが、その内容が全体として参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９５９６７号に記載されているリポソームおよび記載されているリポソームの製造方法が挙げられ得る。
別の実施形態では、免疫原（抗原）をコードし得るポリヌクレオチドは、カチオン性水中油エマルジョン中に製剤化され得、ここでは、エマルジョン粒子は、油コアおよびエマルジョン粒子に分子を固定するポリヌクレオチドと相互作用し得るカチオン性脂質を含む（国際出願番号ＷＯ２０１２００６３８０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、親水性相が分散されている連続疎水性相を含む油中水型エマルジョン中に製剤化されてもよい。非限定的な例として、エマルジョンは、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１０８７７９１に記載されている方法によって製造してもよい。
別の実施形態では、脂質製剤は、少なくともカチオン性脂質、トランスフェクションを増強することができる脂質、および脂質部分に結合した親水性頭部基を含む少なくとも１種の脂質を含んでもよい（国際出願番号ＷＯ２０１１０７６８０７および米国特許出願公開第２０１１０２００５８２号；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、免疫原をコードするポリヌクレオチドは、機能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞に製剤化されてもよい（その内容が全体として参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２０１７７７２４号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０８６５２６に記載されているように、リポソーム中に製剤化してもよい。ＲＮＡワクチンは、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０８６５２６に記載されているような逆ｐＨ勾配および／または最適化された内部緩衝液組成物を用いてリポソーム中に封入されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、リポソーム、例えば、限定するものではないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系のリポソーム（例えば、卵巣がんのためのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８−１７１３）；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、およびヒアルロナンコーティングされたリポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｓｒａｅｌ）中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１３００９０３７２号に記載されているような低分子量カチオン性脂質であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、機能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、カチオン性脂質を含むリポソーム中に製剤化されてもよい。リポソームは、その全体が本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１３００６８２５に記載されているように、カチオン性脂質中の窒素原子とＲＮＡ中のリン酸塩（Ｎ：Ｐ比）とのモル比が１：１〜２０：１であってもよい。別の実施形態では、リポソームは、２０：１よりも大きいかまたは１：１より小さいＮ：Ｐ比を有してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当該技術分野で公知の方法により、および／またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号に記載のように達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなどのカチオン性ペプチドまたはポリペプチド、ならびに国際出願番号ＷＯ２０１２０１３３２６または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるカチオン性ペプチドが挙げられる。別の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの非カチオン性脂質をさらに含んでもよい、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、アミノアルコールリピドイド中に製剤化されてもよい。本発明で使用することができるアミノアルコールリピドイドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４５０，２９８号に記載された方法によって調製してもよい。
リポソーム製剤は、限定するものではないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、ＰＥＧ化の性質、全ての成分の比、およびサイズなどの生物物理学的パラメータによって影響され得る。Ｓｅｍｐｌｅらによる一例では（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２−１７６；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロールおよび１．４％のＰＥＧ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えることにより、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより効果的に送達することができた（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０％〜約５０％のカチオン性脂質、約５０％〜約６０％のカチオン性脂質および／または約５５％〜約６５％のカチオン性脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リポソーム中の脂質対ｍＲＮＡの比は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１および／または少なくとも３０：１であってもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中のＰＥＧの比を増大または減少させてもよく、および／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変して、ＬＮＰ製剤の薬物動態および／または生体内分布を変更してもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％および／または約３．０％〜６．０％という脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）（本明細書ではＰＥＧ−ＤＯＭＧとも呼ばれる）を、カチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールと比較して含んでもよい。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、ＰＥＧ脂質、例えば、限定するものではないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）および／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）で置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのような当該技術分野で公知の任意の脂質から選択してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１２１７０９３０に記載されているような脂質ナノ粒子中に製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質およびアミノアルコール脂質から選択され得る。別の態様では、脂質は、カチオン性脂質、例えば、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびアミノアルコール脂質であってもよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号に記載された脂質および／または記載の方法によって製造された脂質であってもよい。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号中の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号の化合物３）；および２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号の化合物４）；またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であってもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的には、脂質、特にイオン化可能なカチオン性脂質、例えば２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬ１−ＭＣ３−ＤＭＡ）またはジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに中性脂質、ステロールおよび粒子凝集を減少させることができる分子、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、本質的に（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群より選択される少なくとも１つの脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール；ならびに（ｉｖ）ＰＥＧ−脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ（約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ−脂質というモル比で）からなる。
いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約２５％〜約７５％、例えばモル基準で約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％または約４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約１５％、例えば、約３〜約１２％、約５〜約１０％または約１５％、約１０％、または約７．５％の中性脂質を含む。例示的な中性脂質としては、限定するものではないが、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭが挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約５％〜約５０％のステロール（例えば、約１５〜約４５％、約２０〜約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％、または約３１％）をモル基準で含む。例示的なステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質（例えば、モル基準で約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％または約５％をモル基準で）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、２，０００未満、例えば約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ分子を含む。例示的なＰＥＧ−修飾脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡが挙げられる（さらに、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）で考察される）。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される２５〜７５％のカチオン性脂質、０．５〜１．５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、および０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される３５〜６５％のカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される４５〜６５％のカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される６０％のカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１％のステロール、および１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約５０％のカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約５０％のカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３５％のステロール、約４．５％または約５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、ならびに約０．５％の標的化脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約４０％のカチオン性脂質、約１５％の中性脂質、約４０％のステロール、ならびに約５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約５７．２％のカチオン性脂質、約７．１％の中性脂質、約３４．３％のステロール、ならびに約１．４％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
いくつかの実施形態では、本発明の製剤は、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、その内容が全体として参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５））においてさらに考察されている）であるＰＥＧ脂質から選択される約５７．５％のカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１．５％のステロール、ならびに約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。
好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は本質的に、約２０〜７０％のカチオン性脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比であり；より好ましくは約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比である脂質混合物からなる。
特定の実施形態では、モル脂質比は、約５０／１０／３８．５／１．５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧ）、５７．２／７．１１３４．３／１．４（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、４０／１５／４０／５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、５０／１０／３５／４．５／０．５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／中性脂質のモル％、例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。
例示的な脂質ナノ粒子組成物およびその製造方法は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３；およびＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０−１５７８（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質および構造脂質を含んでもよく、必要に応じて非カチオン性脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜１５％の非カチオン性脂質、約１〜２％のＰＥＧ脂質および約３０〜５０％の構造脂質を含んでもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ脂質および約３８．５％の構造脂質を含んでもよい。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質および約３２．５％の構造脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＬ３１９などの本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４成分の脂質ナノ粒子であってもよい。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質および構造脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜１５％の非カチオン性脂質、約１〜２％のＰＥＧ脂質および約３０〜５０％の構造脂質を含んでもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ脂質および約３８．５％の構造脂質を含んでもよい。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質および約３２．５％の構造脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＬ３１９などの本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質および構造脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧおよび約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧおよび約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、および約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧおよび約３２．５％の構造脂質コレステロールを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、国際出願番号ＷＯ２０１２０４０１８４、ＷＯ２０１１１５３１２０、ＷＯ２０１１１４９７３３、ＷＯ２０１１０９０９６５、ＷＯ２０１１０４３９１３、ＷＯ２０１１０２２４６０、ＷＯ２０１２０６１２５９、ＷＯ２０１２０５４３６５、ＷＯ２０１２０４４６３８、ＷＯ２０１００８０７２４、ＷＯ２０１０２１８６５、ＷＯ２００８１０３２７６、ＷＯ２０１３０８６３７３およびＷＯ２０１３０８６３５４、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号、同第８，２８３，３３３号、および同第８，４６６，１２２号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号、同第ＵＳ２０１２０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１３００６４８９４号、同第ＵＳ２０１３０１２９７８５号、同第ＵＳ２０１３０１５０６２５号、同第ＵＳ２０１３０１７８５４１号、および同第ＵＳ２０１３０２２５８３６号（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるカチオン性脂質から選択され得る。別の実施形態において、カチオン性脂質は、限定されるものではないが、国際出願番号ＷＯ２０１２０４０１８４、ＷＯ２０１１１５３１２０、ＷＯ２０１１１４９７３３、ＷＯ２０１１０９０９６５、ＷＯ２０１１０４３９１３、ＷＯ２０１１０２２４６０、ＷＯ２０１２０６１２５９、ＷＯ２０１２０５４３６５、ＷＯ２０１２０４４６３８およびＷＯ２０１３１１６１２６または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７８５４１号および同第ＵＳ２０１３０２２５８３６号（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される式Ａから選択され得る。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、国際出願番号ＷＯ２００８１０３２７６の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩ、および米国特許出願公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号の式Ｉ〜ＶＩ、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１２３３３８号の式Ｉ（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）から選択され得る。非限定的な例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチロオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコス−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコス−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコント−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコス−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコント−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコス−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ、２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ、２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ、２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ、２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［（１Ｒ、２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ、２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ、２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクト−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メチルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシプロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ、２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ、２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミンおよび（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミンまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体から選択され得る。
いくつかの実施形態では、脂質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１２１７０８８９に記載されるような切断可能な脂質であってもよい。
別の実施形態では、脂質は、カチオン性脂質、例えば、限定するものではないが、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３００６４８９４号の式（Ｉ）であってもよい。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、当該技術分野で公知であるか、および／または国際出願番号ＷＯ２０１２０４０１８４、ＷＯ２０１１１５３１２０、ＷＯ２０１１１４９７３３、ＷＯ２０１１０９０９６５、ＷＯ２０１１０４３９１３、ＷＯ２０１１０２２４６０、ＷＯ２０１２０６１２５９、ＷＯ２０１２０５４３６５、ＷＯ２０１２０４４６３８、ＷＯ２０１００８０７２４、ＷＯ２０１０２１８６５、ＷＯ２０１３０８６３７３およびＷＯ２０１３０８６３５４（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって合成されてもよい。
別の実施形態では、カチオン性脂質は、トリアルキルカチオン性脂質であってもよい。トリアルキルカチオン性脂質の非限定的な例およびトリアルキルカチオン性脂質の作製および使用の方法は、国際出願番号ＷＯ２０１３１２６８０３に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンのＬＮＰ製剤は、３％脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含んでもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤ＲＲＮＡワクチンは、１．５％脂質モル比でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンの薬学的組成物は、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１２０９９７５５に記載されているＰＥＧ化脂質の少なくとも１つを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当該技術分野で公知のカチオン性脂質および少なくとも１つの他の成分を含んでもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００、当該技術分野で公知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含んでもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含んでもよい。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、２：４０：１０：４８のモル比でＰＥＧ−ＤＭＧ ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含んでもよい（例えば、Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ ２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１１１２７２５５またはＷＯ２００８１０３２７６に記載されている方法によって製剤化され得る。非限定的な例として、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、ＷＯ２０１１１２７２５５および／またはＷＯ２００８１０３２７６（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなＬＮＰ製剤にカプセル化してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２０７８４５号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されるような経口経路で送達されるナノ粒子中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、米国特許出願公開第ＵＳ２００１３０１５６８４５号または国際出願番号ＷＯ２０１３０９３６４８もしくはＷＯ２０１２０２４５２６号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された方法によって製造された脂質ナノ粒子中に製剤化してもよい。
本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１６４４００号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているシステムおよび／または方法によって滅菌環境で作製され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４９２，３５９号に記載されている核酸−脂質粒子のようなナノ粒子に製剤化してもよい。非限定的な例として、脂質粒子は、１つ以上の活性剤または治療剤；粒子中に存在する全脂質の約５０モル％〜約８５モル％を含む１種以上のカチオン性脂質；粒子中に存在する総脂質の約１３モル％〜約４９．５モル％を含む１種以上の非カチオン性脂質；および粒子中に存在する全脂質の約０．５モル％〜約２モル％を含む粒子の凝集を阻害する１種以上の複合脂質を含んでもよい。ナノ粒子中の核酸は、本明細書に記載のポリヌクレオチドであってもよく、および／または当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際出願番号ＷＯ２０１１１２７２５５またはＷＯ２００８１０３２７６に記載されている方法によって製剤化することができ、その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、ＷＯ２０１１１２７２５５および／またはＷＯ２００８１０３２７６（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにＬＮＰ製剤に封入されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、米国特許出願公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の式１〜６０から選択してもよい。別の実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡの送達のためにインビボおよび／またはインビトロで使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、さらに、透過性エンハンサー分子を含んでもよい。非限定的な透過性エンハンサー分子は、米国特許出願公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、限定するものではないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣がんのためのｓｉＲＮＡ送達）（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８−１７１３）；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、およびヒアルロナンコーティングされたリポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｓｒａｅｌ）などのリポソーム中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０６０２９３号に記載されるように、凍結乾燥ゲル相リポソーム組成物中に製剤化されてもよい。
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含んでもよい。リン酸コンジュゲートは、ナノ粒子のインビボ循環時間を増大させ得るか、および／またはナノ粒子の標的送達を増大させ得る。本発明での使用のためのリン酸コンジュゲートは、その各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載されている方法によって製造してもよい。非限定的な例として、リン酸コンジュゲートは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０３３４３８に記載されている式のいずれか１つの化合物を含んでもよい。
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含んでもよい。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってもよい。ポリマーコンジュゲートは、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号に記載されているような構造を有してもよい。一態様では、本発明のポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３００７２７０９号に記載されている方法および／またはセグメント化ポリマー試薬を用いて作製してもよい。別の態様では、ポリマーコンジュゲートは、限定するものではないが、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載されているポリマーコンジュゲートのような環部分を含むペンダント側基を有してもよい。
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を増強するコンジュゲートを含んでもよい。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを阻害し得る。一態様では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１−９７５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載された「自己」粒子）から設計された「自己」ペプチドであってもよい。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらが示すとおり、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介クリアランスを遅延させ、これがナノ粒子の送達を増強した。別の態様では、コンジュゲートは、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１−９７５を参照のこと）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらは、「自己」ペプチドと同様に、ＣＤ４７が、スクランブルされたペプチドおよびＰＥＧでコーティングされたナノ粒子と比較して、対象における循環粒子比を増大し得ることを示した。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、対象における本発明のナノ粒子の送達を増強するコンジュゲートを含むナノ粒子中に製剤化される。コンジュゲートは、ＣＤ４７膜であってもよく、またはコンジュゲートは、ＣＤ４７膜タンパク質、例えば先に記載された「自己」ペプチドに由来してもよい。別の態様において、ナノ粒子は、ＰＥＧおよびＣＤ４７またはその誘導体のコンジュゲートを含んでもよい。さらに別の態様において、ナノ粒子は、上記の「自己」ペプチドおよび膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでもよい。
別の態様において、「自己」ペプチドおよび／またはＣＤ４７タンパク質は、本発明のＲＮＡワクチンの送達のために、本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ウイルス粒子にコンジュゲートされてもよい。
別の実施形態では、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドおよび分解可能な結合を有し得るコンジュゲートを含む。コンジュゲートの非限定的な例としては、イオン化可能な水素原子、スペーサー部分、および水溶性ポリマーを含む芳香族部分が含まれる。非限定的な例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物およびそのような医薬組成物を送達するための方法は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１８４４４３号に記載されている。
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体およびＲＮＡワクチンを含む炭水化物ナノ粒子であってもよい。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンベータ−デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ−デキストリンを含むことができるが、これらに限定されない（例えば、国際出願番号ＷＯ２０１２１０９１２１号を参照（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーでコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、限定されるものではないが、ＰＥＧコーティングおよび／または中性表面電荷を有するコーティングのような親水性コーティングでコーティングされてもよい。親水性コーティングは、中枢神経系内のＲＮＡワクチン（これに限定されるものではない）のようなより大きなペイロードを有するナノ粒子を送達するのを助ける場合がある。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子およびこのようなナノ粒子を作製する方法は、米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であってもよい。親水性ポリマー粒子および親水性ポリマー粒子を作製する方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第２０１３０２１０９９１号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であってもよい。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速に除去された脂質ナノ粒子（ｒａｐｉｄｌｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ｒｅＬＮＰ）として知られている生分解性カチオン性脂質で置き換えることによって改善され得る。限定されるものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン化可能なカチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿および組織中に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源であり得る。急速に排除された脂質の迅速な代謝は、ラットにおける１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量までの１ケタで、脂質ナノ粒子の耐容性および治療指数を改善し得る。酵素的に分解されたエステル結合を含めることにより、カチオン性成分の分解および代謝プロファイルを改善し得、それと同時にｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持する。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置していてもよいし、または脂質鎖の末端に、末端に位置していてもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換えてもよい。
いくつかの実施形態では、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置していてもよい。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ナノ種、ポリマーおよび免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって誘発され得る。（米国公開第２０１２０１８９７００号および国際出願番号ＷＯ２０１２０９９８０５号；それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ポリマーは、ナノ種をカプセル化してもよく、またはナノ種を部分的にカプセル化してもよい。免疫原は、本明細書に記載される組換えタンパク質であっても、修飾ＲＮＡであっても、および／またはポリヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、限定されるものではないが、病原体などのワクチンにおける使用のために製剤化してもよい。
脂質ナノ粒子は、粒子の表面特性を変化させるように操作して、それによって脂質ナノ粒子が粘膜バリアに浸透するように操作してもよい。粘液は、限定するものではないが、口腔（例えば、頬側および食道の膜および扁桃組織）、眼科、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管および気管支の膜）、生殖器（例えば、膣、頸部および尿道の膜）などの粘膜組織上に位置する。より高い薬物封入効率および広い範囲の薬物の持続的送達を提供する能力のために好ましい、１０〜２００ｎｍより大きいナノ粒子は、粘膜障壁を通って迅速に拡散するには大きすぎると考えられてきた。粘液は、連続的に分泌されるか、出てくるか、捨てられるか、または消化されて再利用されるので、捕捉された粒子の大部分は、数秒以内または数時間以内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で高密度にコーティングされた大きな高分子ナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散する同じ粒子よりわずかに４〜６倍低く粘膜を通じて拡散した（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００７ １０４ （５）：１４８２−４８７；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００９ ６１（２）：１５８−１７１；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ナノ粒子の輸送は、光漂白（ＦＲＡＰ）後の蛍光回復および高分解能複数粒子追跡（ＭＰＴ）を含むがこれらに限定されない透過速度および／または蛍光顕微鏡技術を用いて決定され得る。非限定的な例として、粘膜バリアを貫通し得る組成物は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際出願番号ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されており、その各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
粘液に浸透するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）および／またはポリマー−ビタミンコンジュゲートおよび／またはトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料としては、限定するものではないが、ポリアミド類、ポリエーテル類、ポリアミド類、ポリエステル類、ポリカーバメート類、ポリ尿素類、ポリカーボネート類、ポリ（スチレン類）、ポリイミド類、ポリスルホン類、ポリウレタン類、ポリアセチレン類、ポリエチレン類、ポリエチレンイミン類、ポリイソシアネート類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリアクリロニトリル類、およびポリアリレート類が挙げられる。ポリマー材料は、生分解性であっても、および／または生体適合性であってもよい。生体適合性ポリマーの非限定的な例は、国際出願番号ＷＯ２０１３１１６８０４号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ポリマー材料をさらに照射してもよい。非限定的な例として、ポリマー材料をガンマ線照射してもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号ＷＯ２０１２８２１６５を参照のこと）。特定のポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（ビニルアセテート）、ポリハロゲン化ビニル、例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧおよびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、限定されるものではないが、ブロックコポリマー（その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号ＷＯ２０１３０１２４７６号に記載されている分岐ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマーなど）、および（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号および米国特許出願公開第２０１００００３３３７号、米国特許第８，２６３，６６５号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと）などのコポリマーでコーティングされてもまたはそれらと会合されてもよい。このコポリマーは、一般に安全とみなされる（ＧＲＡＳ）ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新しい化学物質が生成されないような方法であり得る。例えば、脂質ナノ粒子は、ヒト粘液にやはり迅速に浸透することができる新しい化学物質を形成することなく、ＰＬＧＡナノ粒子をコーティングするポロキサマーを含んでもよい（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１ ５０：２５９７−２６００；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ヒト粘液に浸透することができるナノ粒子を製造するための非限定的な拡張性のある方法は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（例えば、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３、１７０（２）：２７９−８６（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）に記載されている。
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであってもよい。コンジュゲートのビタミン部分は、他の適切な成分、例えば、限定するものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分、または他の界面活性剤の疎水性成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖およびアルキレンオキシド鎖）で置き換えられてもよい。
粘液に浸透するように操作された脂質ナノ粒子は、表面改変剤、例えば、限定するものではないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ムグワルト、ブロメライン、パパイン、シクロデンドロン、アセチルシステイン、ブロモヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アムブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテキシン、エルドステイン）およびｒｈＤＮアーゼを含む種々のＤＮアーゼを含み得る。表面改変剤は、粒子表面に埋め込まれてもよいし、もしくは取り込まれてもよいし、または脂質ナノ粒子の表面に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。（例えば、米国公開２０１００２１５５８０号および米国公開２００８０１６６４１４およびＵＳ２０１３０１６４３４３を参照；その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、粘液浸透脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入されてもよく、および／または粒子の表面に配置されてもよい。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に共有結合されてもよい。粘液浸透脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用し得、周囲の粘液の構造的および／または接着特性を変化させて、粘膜浸透性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増大させ得る粘膜付着を減少し得る粒子を含んでもよい。
別の実施形態では、粘液浸透脂質ナノ粒子は、粘膜浸透促進コーティングを含む低張性製剤であってもよい。製剤は、それが送達される上皮に対して低張性であり得る。低張性製剤の非限定的な例は、国際出願番号ＷＯ２０１３１１００２８号に見出され得、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、粘膜バリアを介する送達を増強するために、ＲＮＡワクチン製剤は、低張溶液を含んでもよいし、または低張性溶液であってもよい。低張性溶液は、限定するものではないが、粘液浸透性粒子などの粘液透過性粒子が、膣上皮表面に到達できる速度を増大させることが見出された（例えば、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｎｓｉｇｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１３ ３４（２８）：６９２２−９を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、リポプレックスとして、例えば、限定されないが、ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステムおよびＳｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（ＣＡｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のＳＴＥＭＦＥＣＴＴＭ、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的および非標的化送達の核酸酸として製剤化される（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８−９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６−７８；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８−５０７；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０−１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４；Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００７ ６；１０４：４０９５−４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５−１３２；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、このような製剤はまた、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むがそれらに限定されない、インビボで異なる細胞型に受動的または能動的に向けられるように、構築されてもよいし、またはそのように変更される組成物であってもよい（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９−７１７；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１−６７３；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４；Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００；ＦｅｎｓｋｅおよびＣｕｌｌｉｓ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：２５−４４；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８ ３１９：６２７−６３０；ＰｅｅｒおよびＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７−１１３３；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。肝細胞への製剤の受動的標的化の一例は、アポリポタンパク質Ｅに結合し、これらの製剤の肝細胞への結合および取り込みをインビボで促進することが示されているＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡベースの脂質ナノ粒子製剤を含む（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。製剤はまた、限定するものではないが、葉酸、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）および抗体標的化アプローチによって例示されるように、その表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的化されてもよい（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７−２０６；ＭｕｓａｃｃｈｉｏおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８−１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６−２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１−６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８−２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９−３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５−１１６；Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７−５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０：６３−６８；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００７ １０４：４０９５−４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９−３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８−２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８ ３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉ ｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７−１１３３；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０〜１０００ｎｍの球形であってもよい。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化し得、界面活性剤および／または乳化剤で安定化され得る固体脂質コアマトリクスを保有する。さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子は、自己集合脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２００８，２（８）、１６９６−１７０２頁（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。非限定的な例として、ＳＬＮは、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３１０５１０１に記載されたＳＬＮであってもよい。別の非限定的な例として、ＳＬＮは、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載される方法またはプロセスによって作製され得る。
リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を用いて、タンパク質産物を指向するポリヌクレオチドの有効性を改善してもよい、なぜならこれらの製剤はＲＮＡワクチンによる細胞トランスフェクションを増大し得るか；および／またはコードされたタンパク質の翻訳を増大し得るからである。そのような１つの例は、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にする脂質カプセル化の使用を含む（Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７ １５：７１３−７２０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、制御放出および／または標的送達のために製剤化されてもよい。本明細書で使用される場合「制御放出」とは、治療結果を達成するために放出の特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。いくつかの実施形態では、ＲＲＮＡワクチンは、制御された放出および／または標的送達のために、本明細書中に記載されるか、および／または当該技術分野で公知の送達剤にカプセル化されてもよい。本明細書で使用される場合、「カプセル化する」という用語は、囲む、包囲するまたは包むことを意味する。本発明の化合物の製剤化に関連する場合、カプセル化は、実質的であっても、完全であってもまたは部分的であってもよい。「実質的にカプセル化された」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９または９９．９９９％超が送達剤内に封入され、包囲され、または封入され得ることを意味する。「部分的封入」とは、１０、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ未満の本発明の薬学的組成物または化合物を、送達剤の中に封入し、包囲し、または封入してもよいことを意味する。有利には、カプセル化は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を用いて、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定され得る。例えば、本明細書の医薬組成物または化合物のうち少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％超は、送達剤中にカプセル化される。
いくつかの実施形態では、制御放出製剤としては、限定するものではないが、トリブロックコポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、製剤は、２つの異なるタイプのトリブロックコポリマー（国際出願番号ＷＯ２０１２１３１１０４およびＷＯ２０１２１３１１０６；その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含んでもよい。
別の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子または急速に除去された脂質ナノ粒子にカプセル化されてもよく、次いで、この脂質ナノ粒子または急速に除去される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載されるかおよび／もしくは当該技術分野で公知のポリマー、ヒドロゲルおよび／または外科用シーラントにカプセル化されてもよい。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲルまたは外科用シーラントは、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、外科用シーラント、例えば、フィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーラント、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）であってもよい。
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に注入されたときにゲルを形成し得る当該技術分野で公知の任意のポリマーにカプセル化され得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリクスにカプセル化されてもよい。
いくつかの実施形態では、制御放出および／または標的送達のためのＲＮＡワクチン製剤はまた、少なくとも１つの制御放出コーティングを含んでもよい。制御放出コーティングとしては、限定するものではないが、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）およびセルロース誘導体、例えば、エチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））も挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン制御放出および／または標的送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性ポリエステルとしては、限定するものではないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン制御放出および／または標的送達製剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８４０４２２２号に記載されるような少なくとも１つのＰＥＧおよび／またはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含んでもよい。
別の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン制御放出送達製剤は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号に記載される制御放出ポリマー系であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、本明細書中で「治療用ナノ粒子ＲＲＮＡワクチン」と呼ばれる治療用ナノ粒子にカプセル化されてもよい。治療用ナノ粒子は、限定するものではないが、国際出願番号ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３、ＷＯ２０１０００５７２１、ＷＯ２０１０００５７２３、ＷＯ２０１２０５４９２３、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１号、および同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号および同第８，３１８，２１１号（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの本明細書で記載され、かつ当該技術分野で公知の方法によって製剤化され得る。別の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ２０１２０１４０７９０号に記載されている方法によって同定され得る。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、持続放出のために製剤化され得る。本明細書で使用する「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。期間としては、限定するものではないが、時間、日、週、月および年が挙げられる。非限定的な例として、徐放性ナノ粒子は、ポリマーおよび治療剤、例えば、限定するものではないが、本発明のポリヌクレオチド（例えば、国際出願第２０１００７５０７２号および米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号、第２０１１０２１７３７７号、および同第２０１２０２０１８５９号、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。別の非限定的な例において、徐放性製剤は、限定するものではないが、結晶、巨大分子ゲルおよび／または微粒子懸濁液などの持続的なバイオアベイラビリティを可能にする剤を含んでもよい（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０２９５号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、標的特異的であるように製剤化され得る。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含んでもよい（国際出願番号ＷＯ２０１１０８４５１８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、国際出願番号ＷＯ２００８１２１９４９、ＷＯ２０１０００５７２６、ＷＯ２０１０００５７２５、ＷＯ２０１１０８４５２１および米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号および米国特許出願公開第２０１００１０４６５５号（その各々が、その全体が参照によって本明細書にくみこまれる）に記載されているナノ粒子に製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子はポリマーマトリクスを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、２つ以上のポリマー、例えば、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはそれらの組合わせを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ジブロックコポリマーは、ＰＥＧを、ポリマー、例えば、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはそれらの組合わせと組み合わせて含んでもよい。別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、欧州特許公開番号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているジブロックコポリマーを含んでもよい。さらに別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、国際出願番号ＷＯ２０１３１２００５２（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような高Ｘジブロックコポリマーであってもよい。
非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと）。別の非限定的な例において、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡとのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（それらの各々の内容が、その全体として参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２４６，９６８号および国際出願番号ＷＯ２０１２１６６９２３を参照のこと）。さらに別の非限定的な例において、治療用ナノ粒子は、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号に記載されているようなステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号および第８，２８７，９１０号および米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号を参照；その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
さらに別の非限定的な例において、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む（例えば、熱感受性ヒドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ ａｓ ａ Ｔｇｆ−β１ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３ ２０（１２）：１９９５−２０００におけるＴＧＦ−ベータ１遺伝子送達ビヒクルとして；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３ ２０（６）：８８４−８８８ならびに；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７ １１８：２４５−２５３（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）の制御された遺伝子送達ビヒクルとして用いられた）。本発明のＲＮＡワクチンは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子中に配合してもよい。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号および第８，２８７，９１０号および米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号を参照；その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、非ポリマーミセルおよびブロックコポリマーを含むポリイオン複合体に含まれてもよい。（例えば、米国特許出願公開第２０１２００７６８３６号を参照のこと；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアクリルポリマーを含んでもよい。アクリルポリマーとしては、限定するものではないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートおよびそれらの組合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのポリ（ビニルエステル）ポリマーを含んでもよい。ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであってもよい。非限定的な例として、ランダムコポリマーは、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０３２８２９号または米国特許出願公開第２０１３０１２１９５４号に記載されているような構造を有してもよい。一態様では、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載のポリヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。別の態様では、本発明で使用され得るポリ（ビニルエステル）ポリマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものに記載されているポリマーであってもよい。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのジブロックコポリマーを含んでもよい。ジブロックコポリマーは、限定するものではないが、ポリ（乳酸）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１３０４４２１９参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）であり得る。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、癌を処置するために使用され得る（国際出願番号ＷＯ２０１３０４４２１９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載されるか、および／または当該技術分野で公知の少なくとも１つのカチオンポリマーを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、限定するものではないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（ベータ−アミノエステル）（例えば、米国特許第８，２８７，８４９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）およびそれらの組合わせなどの少なくとも１つのアミノ酸含有ポリマーを含んでもよい。
別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、国際出願番号ＷＯ２０１３０５９４９６（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているようなアミンカチオン性脂質を含んでもよい。一態様では、カチオン性脂質は、アミノ−アミン部分を有してもまたはアミノ−アミド部分を有してもよい。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン側鎖を含み得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性ポリエステルとしては、限定するものではないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含んでもよい。
別の実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドのコンジュゲーションを含んでもよい。標的リガンドは、限定するものではないが、モノクローナル抗体のような当該技術分野で公知の任意のリガンドであってもよい（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ ６６：６７３２−６７４０；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌を標的化するために使用され得る水溶液中に製剤化され得る（そのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１１０８４５１３号および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２９４７１７号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチン、例えば、少なくとも１つのＲＮＡワクチンを含む治療用ナノ粒子は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｄｏｂｉｎｓｋｉらの米国特許第８，４０４，７７９号に記載された方法を用いて製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、合成ナノキャリアにカプセル化されても、連結されても、および／または会合されてもよい。合成ナノキャリアとしては、限定するものではないが、国際出願番号ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３、ＷＯ２０１２１３５０１、ＷＯ２０１２１４９２５２、ＷＯ２０１２１４９２５５、ＷＯ２０１２１４９２５９、ＷＯ２０１２１４９２６５、ＷＯ２０１２１４９２６８、ＷＯ２０１２１４９２８２、ＷＯ２０１２１４９３０１、ＷＯ２０１２１４９３９３、ＷＯ２０１２１４９４０５、ＷＯ２０１２１４９４１１、ＷＯ２０１２１４９４５４およびＷＯ２０１３０１９６６９、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号、および同第２０１２０２４４２２２号（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。合成ナノキャリアは、当該技術分野で公知の方法および／または本明細書に記載の方法を用いて製剤化してもよい。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３号およびＷＯ２０１２１３５０１号および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号、および同第２０１２０２４４２２号に記載される方法によって製剤化してもよい。別の実施形態では、合成ナノキャリア製剤は、国際出願番号ＷＯ２０１１０７２２１８および米国特許第８，２１１，４７３号（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって凍結乾燥してもよい。さらに別の実施形態では、限定するものではないが、合成ナノキャリアを含む本発明の製剤は、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２３０５６８号に記載されている方法によって凍結乾燥されても、または再構成されてもよい。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを放出する反応基を含んでもよい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１２０９５２５５２および米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、その合成ナノキャリアの送達からの免疫応答を増強する免疫刺激剤を含んでもよい。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、免疫系のＴｈ１ベースの応答を増強し得るＴｈ１免疫刺激剤を含んでもよい（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１０１２３５６９および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２２３２０１号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、標的放出のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、ポリヌクレオチドを特定のｐＨおよび／または所望の時間間隔後に放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、ＲＮＡワクチンを２４時間後および／またはｐＨ４．５で放出するように製剤化され得る（国際出願番号ＷＯ２０１０１３８１９３およびＷＯ２０１０１３８１９４ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号および同第ＵＳ２０１１００２７２１７号（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの制御放出および／または持続放出のために製剤化され得る。非限定的な例として、持続放出のための合成ナノキャリアは、当該技術分野で公知であるか、本明細書に記載されるか、および／または国際出願番号ＷＯ２０１０１３８１９２および米国特許出願公開第２０１００３０３８５０号（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法によって製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、製剤が結晶性側鎖（ＣＹＳＣ）ポリマーである少なくとも１つのポリマーを含む、制御放出および／または持続放出用に製剤化してもよい。ＣＹＳＣポリマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３９９，００７号に記載されている。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、ワクチンとしての使用のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをカプセル化してもよい。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、ワクチン剤形のための少なくとも１つの抗原および賦形剤を含んでもよい（国際出願番号ＷＯ２０１１１５０２６４および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２９３７２３号（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形は、同じまたは異なる抗原および賦形剤を有する少なくとも２つの合成ナノキャリアを含んでもよい（国際出願番号ＷＯ２０１１１５０２４９および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２９３７０１号（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ワクチン剤形は、本明細書に記載されるか、当該技術分野で公知であるか、および／または国際出願番号ＷＯ２０１１１５０２５８および米国特許出願公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法によって選択してもよい。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでもよい。非限定的な例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−クロライド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ホスフェートまたはジメチルジオクタデシルアンモニウム−アセテート（ＤＤＡ）およびマイコバクテリアの総脂質抽出物の無極性画分またはその無極性画分の一部を含んでもよい（例えば、米国特許第８，２４１，６１０号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。別の実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびアジュバントを含んでもよい。非限定的な例として、合成ナノキャリアおよびアジュバントは、国際出願番号ＷＯ２０１１１５０２４０および米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法によって製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、ウイルス由来のペプチド、断片または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをカプセル化し得る。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、限定するものではないが、それらの各々が参照によって本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１２０２４６２１、ＷＯ２０１２０２６２９、ＷＯ２０１２０２４６３２および米国特許出願公開第ＵＳ２０１２００６４１１０号、同第ＵＳ２０１２００５８１５３号および同第ＵＳ２０１２００５８１５４号に記載されているナノキャリアを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、体液性および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドに結合され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号ＷＯ２０１３０１９６６９を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、双性イオン性脂質にカプセル化されてもよいし、結合されてもよいし、および／または会合されてもよい。双性イオン性脂質の非限定的な例および双性イオン性脂質を使用する方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２１６６０７号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一態様では、双性イオン性脂質は、本明細書に記載のリポソームおよび脂質ナノ粒子に使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９７１００号に記載されているようにコロイドナノキャリア中に製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、経口投与のために最適化され得る。ナノ粒子は、限定されるものではないが、キトサンまたはその誘導体などの少なくとも１つのカチオン性バイオポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０２８２３４３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２（その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号に開示されているアミノ脂質）を含む。ＬＮＰ投与の活性および／または安全性（ＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数およびサイトカイン誘導のうちの１つ以上を調べることによって測定される）は、このような脂質の取り込みによって、改善することができる。ＫＬ５２を含むＬＮＰは、静脈内および／または１回以上の用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与は、ＭＣ３を含むＬＮＰと比較して同等または改善されたｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、より小さいＬＮＰを用いてＲＮＡワクチンを送達してもよい。このような粒子は、０．１ｕｍ未満から１００ｎｍまでの直径、例えば、限定するものではないが、０．１ｕｍ未満、１．０ｕｍ未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、および９７５ｕｍ未満の直径を含んでもよい。
別の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍおよび／または約７０〜約９０ｎｍの直径を含み得る、より小さいＬＮＰを用いて送達されてもよい。
いくつかの実施形態では、そのようなＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーを含む方法を用いて合成される。例示的なマイクロ流体ミキサーとしては、限定するものではないが、ｓｌｉｔ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔｉａｌ ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒが挙げられ得、これには、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）が製造するもの、および／またはスタガードヘリンボーンマイクロミキサー（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ：ＳＨＭ）（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，ＩＶ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１２．２８：３６３３−４０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２．１：ｅ３７；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２．１３４（１６）：６９４８−５１（その各々は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを含むＬＮＰ生成の方法は、少なくとも２つの入力ストリームを混合することをさらに包含し、ここで、混合は、微細構造誘起カオス移流（ＭＩＣＡ）によって起こる。この方法によれば、流体ストリームは、ヘリングボーンパターン内に存在するチャネルを通って流れ、回転流を引き起こし、流体を互いに折り畳む。この方法はまた、流体混合のための表面を備えてもよく、この表面が流体の循環中に向きを変える。ＳＨＭを用いてＬＮＰを生成する方法には、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号および同第２０１２／０２７６２０９号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に開示されているものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ−Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）、またはＩｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ ＧｅｒｍａｎｙのＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）もしくはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）などのマイクロミキサーを使用して作製された脂質ナノ粒子に製剤化してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、マイクロ流体技術を用いて作製された脂質ナノ粒子中に製剤化してもよい（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６ ４４２：３６８−３７３；およびＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７−６５１（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。非限定的な例として、制御されたマイクロ流体製剤は、低レイノルズ数でマイクロチャネル内の定常圧力駆動流のストリームを混合するための受動的方法を含む（例えば、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７−６５１（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ、ＵＫ）などのマイクロミキサーチップを用いて作製された脂質ナノ粒子に製剤化してもよい。マイクロミキサーチップは、２つ以上の流動ストリームを分割再結合機構で迅速に混合するために使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、それぞれが、本明細書にその全体が参照によって組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０６３４６８または米国特許第８，４４０，６１４号に記載されている薬物カプセル化マイクロスフェアを使用して送達するために製剤化してもよい。マイクロスフェアは、国際出願番号ＷＯ２０１３０６３４６８（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物を含んでもよい。別の態様では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）は、本発明のＲＮＡワクチンを細胞に送達するのに有用である（国際出願番号ＷＯ２０１３０６３４６８（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定するものではないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｍｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、および／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有し得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍより大きい直径を有してもよい。
一態様では、脂質ナノ粒子は、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０５９９２２に記載されている限界サイズの脂質ナノ粒子であってもよい。限界サイズの脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含んでもよく；ここで脂質二重層は、限定するものではないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸ジアシルフォスファチジルコリンおよび１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）のようなリン脂質を含んでもよい。別の態様では、限界サイズ脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧなどのポリエチレングリコール−脂質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、国際出願番号ＷＯ２０１３０６３５３０（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている送達方法を用いてＲＮＡワクチンを特定の位置に送達、局在化および／または濃縮してもよい。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンを対象に送達する前に、それと同時に、またはその後に、空のポリマー粒子を対象に投与してもよい。空のポリマー粒子は、対象と接触したときに一度は容積の変化を受け、対象の特定の位置に固定されるか、埋め込まれるか、固定されるか、または閉じ込められるようになる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、活性物質放出系（例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１０２５４５号を参照のこと）において製剤化されてもよい。活性物質放出系は、１）触媒的に活性な核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド阻害剤鎖に結合した少なくとも１つのナノ粒子、および２）治療的に活性な物質に結合した少なくとも１つの基質分子に結合した化合物（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）を含んでもよく、この場合、治療的に活性な物質は、触媒的に活性な核酸による基質分子の切断によって放出される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、非細胞材料を含む内部コアおよび細胞膜を含む外部表面を備えるナノ粒子中に製剤化してもよい。細胞膜は、細胞に由来してもよいし、またはウイルスに由来する膜に由来してもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１３０５２１６７に記載された方法によって製造してもよい。別の非限定的な例として、本明細書にその全体が参考として組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０５２１６７に記載のナノ粒子を用いて、本明細書に記載のＲＮＡワクチンを送達してもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、多孔質ナノ粒子支持脂質二重層（プロトセル）中に製剤化され得る。プロトセルは、国際出願番号ＷＯ２０１３０５６１３２に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、米国特許第８，４２０，１２３号および同第８，５１８，９６３号、ならびに欧州特許第２０７３８４８Ｂ１号（その各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているかまたは記載されている方法によって製造されたポリマーナノ粒子に製剤化してもよい。非限定的な例として、ポリマーナノ粒子は、米国特許第８，５１８，９６３号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたナノ粒子、または記載された方法によって製造されたナノ粒子のように高いガラス転移温度を有し得る。別の非限定的な例として、経口および非経口製剤用のポリマーナノ粒子は、欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法によって製造してもよい。
別の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、画像化に使用されるナノ粒子に製剤化されてもよい。ナノ粒子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号に記載されているようなリポソームナノ粒子であってもよい。非限定的な例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカ−１−イル｝−酢酸および中性の完全に飽和したリン脂質成分を含んでもよい（例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明で使用することができるナノ粒子は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１３０３４８号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって形成される。
本発明のナノ粒子は、限定するものではないが、その欠乏が貧血から神経管欠損への健康上の危険につながる可能性のある栄養素などの栄養素をさらに含んでもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際出願番号ＷＯ２０１３０７２９２９に記載されているナノ粒子を参照のこと）。非限定的な例として、栄養素は、第一鉄、第二鉄塩または元素鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミンまたは微量栄養素の形態の鉄であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、膨潤性ナノ粒子中に製剤化されてもよい。膨潤性ナノ粒子は、限定するものではないが、米国特許第８，４４０，２３１号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたものであってもよい。非限定的な実施形態として、膨潤性ナノ粒子は、肺系への本発明のＲＮＡワクチンの送達に使用され得る（例えば、米国特許第８，４４０，２３１号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
本発明のＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、米国特許第８，４４９，９１６号（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどのポリ酸無水物ナノ粒子に製剤化してもよい。
本発明のナノ粒子および微粒子は、マクロファージおよび／または免疫応答を調節するために幾何学的に操作され得る。１つの態様において、幾何学的に操作された粒子は、限定されるものではないが肺送達のような標的送達のために本発明のポリヌクレオチドを取り込むために、様々な形状、サイズおよび／または表面電荷を有し得る（例えば、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１３０８２１１１を参照のこと）。幾何学的に操作した粒子の他の物理的特徴としては、限定するものではないが、開窓、角度付きアーム、非対称性および表面粗さ、細胞および組織との相互作用を変化させることができる電荷が挙げられ得る。非限定的な例として、本発明のナノ粒子は、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願番号ＷＯ２０１３０８２１１１号に記載されている方法によって製造してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１３０９０６０１号に記載されているような水溶性ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、良好な水溶性を示すために、小型でかつ双性イオン性のリガンドを有する無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さな流体力学的直径（ＨＤ）、時間、ｐＨ、および塩分に対する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合を有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載されている方法によって開発してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定するものではないが、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているようなステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された方法によって作製することができる。
別の実施形態では、ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリクスを含んでもよい。ポリマーマトリクスは、２つ以上のポリマー、たとえば、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタアクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートまたはこれらの組合わせを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、高密度核酸層を有するナノ粒子−核酸ハイブリッド構造であってもよい。非限定的な例として、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載される方法によって作製され得る。ナノ粒子は、限定されるものではないが、本明細書に記載されるか、および／または当該技術分野で公知のポリヌクレオチドなどの核酸を含んでもよい。
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、コアのナノ構造に埋め込まれていてもよく、またはそのナノ構造の内部もしくは表面上に少なくとも１つのペイロードを担持または会合させることができる低密度の多孔質３−Ｄ構造またはコーティングでコーティングされてもよい。少なくとも１つのナノ粒子を含むナノ構造の非限定的な例は、国際出願番号ＷＯ２０１３１２３５２３に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物、例としては、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、または他のカチオン性ペプチドもしくはタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、例としては、ＨＩＶ−結合ペプチド、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来または類似体ペプチド、ペスチウイルスＥｒｎｓ、ＨＳＶ、ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡまたはタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド（複数可）、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド（複数可）、アンテナペディア由来ペプチド（特にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、ヒストン、カチオン性多糖類、例えばキトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル］］−Ｎ，Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノール−アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−アルファ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロライド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシオキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロライド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピルオキシメチルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピルオキシスクシニリルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、またはカチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、例えば、変性ポリアミノ酸、例えば、ベータ−アミノ酸ポリマーもしくは逆ポリアミドなど、変性ポリエチレン、例えば、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロマイド））など、変性アクリレート、例えば、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチル）メチルアクリレート））など、変性アミドアミン、例えば、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など、変性ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、例えば、ジアミン末端修飾１，４−ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなど、デンドリマー、例えば、ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭベースのデンドリマーなど、ポリイミン（複数可）、例えば、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）など、ポリアリルアミン、糖骨格ベースのポリマー、例えば、シクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサンなど、シラン骨格系のポリマー、例えば、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなど、１つ以上のカチオン性ブロック（例えば、上記のカチオン性ポリマーから選択される）と１つ以上の親水性または疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組合せからなるブロックポリマー、などと会合されてもよい。
他の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と会合していない。
マルチマー複合体
本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、ｍＲＮＡ分子間に非共有結合（例えば、水素結合）結合を有する多量体複合体としてアセンブルしてもよい。これらのタイプの多量体構造によって、治療用組成物中のｍＲＮＡの均一な分布が可能になる。ＲＮＡなどの複数の核酸が、例えば、脂質ベースの製剤中で製剤化される場合、その製剤による全核酸の比較的均一な分布が達成され得る。しかし、混合物中の他の核酸に対する特定の核酸の分布は、均一ではない。例えば、核酸混合物が２つの別個のｍＲＮＡ配列から構成される場合、脂質粒子または他の製剤のいくつかは、単一のｍＲＮＡ配列を収容し、他のものは他のｍＲＮＡ配列を収容し、少数がｍＲＮＡ配列の両方を収容する。治療上の状況では、このｍＲＮＡの不均一な分布は、患者に送達されるｍＲＮＡの投与量が投与によって異なるため望ましくない。極めて驚くべきことに、本明細書に記載の多量体構造によって、製剤全体にわたって均一な分布を有する核酸を有する製剤の製造を可能になった。個々の核酸間の非共有結合相互作用が、製剤中の核酸のそのような均一な分布を生じ得ることは驚くべきことであった。さらに、多量体核酸複合体は、ｍＲＮＡ発現活性などの活性を妨害しない。
いくつかの実施形態では、ワクチンを構成するＲＮＡポリヌクレオチドの多量体構造は、脂質ナノ粒子などの組成物全体に均一に分布している。均一に分布しているとは、本明細書中で複数の核酸（それぞれ固有のヌクレオチド配列を有する）の文脈で使用される場合、その製剤中の各核酸のお互いに対する分布を指す。製剤中の核酸の分布は、当該技術分野で公知の方法を用いて評価することができる。核酸が、製剤の特定領域内で他の核酸と約１：１の比で近接して会合する場合、核酸は別の核酸に対して均一に分布している。いくつかの実施形態では、核酸が製剤の特定の領域内で他の核酸に対して約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、または１：２の比で位置する場合、その核酸は別の核酸に対して均一に分布している。
本明細書で使用する多量体構造は、互いに連結して多量体構造を形成する一連の少なくとも核酸である。いくつかの実施形態では、多量体構造は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上の核酸から構成される。他の実施形態では、多量体構造は、１０００以下、９００以下、５００以下、１００以下、７５以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下または１００以下の核酸から構成される。さらに他の実施形態では、多量体構造は、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、５５〜１００、６０〜１００、６５〜１００、７０〜１００、７５〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、５０〜５００、５０〜８００、５０〜１，０００または１００〜１，０００の核酸を有する。好ましい実施形態では、多量体構造は３〜５個の核酸から構成される。
いくつかの実施形態では、多量体構造中の核酸数の上限は、二量体化可能領域の長さに依存する。ｍＲＮＡ間の２０ヌクレオチド超の空間は、下流のプロセシングのためにマルチｍＲＮＡ複合体を完全に保つための特異性および十分な力を提供し得、従っていくつかの実施形態では好ましい。いくつかの実施形態では、多量体構造の４〜５個の核酸がワクチンに望ましい場合がある。
多量体構造は、部分Ａおよび部分Ｂから構成される第１の連結領域を有する第１のｍＲＮＡ、ならびに部分Ｃおよび部分Ｄから構成される第２の連結領域を有する第２のｍＲＮＡから構成される自己集合多量体ｍＲＮＡ構造であってもよく、ここで、第１の連結領域の少なくとも部分Ａおよび第２の連結領域の少なくとも部分Ｃは、互いに対して相補的である。好ましくは、核酸は、連結領域中の非共有結合を介して互いに連結される。以下は例示的な連結領域であり、Ｘは０〜１００ヌクレオチドのいずれかの核酸配列であり、ＡおよびＢは１つ以上の他の核酸に相補的な相補的部分である。
Figure 0006921833
本明細書中で使用される場合、連結領域とは、他の連結領域の１つ以上の領域に相補的な１つ以上の領域または部分を有する核酸配列を指す。１つの相補的領域をそれぞれが有する一対の連結領域は、互いに少なくとも７０％相補的であり得る。いくつかの実施形態では、一対の連結領域は、互いに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的である。連結領域は、場合によっては部分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、．．．と呼ばれる小部分から構成されてもよく．．．、これは、この小部分が他の小部分と相補的であり得るように互いの間で相補性のさらに短い領域を有する。例えば、２つのｍＲＮＡの単純な多量体構造は、それぞれ相補性の単一の領域を有する連結領域を有し得る。２つの連結領域は、塩基対形成を介して互いに非共有結合相互作用を形成し得る。各核酸の連結領域が少なくとも２つの部分を有し、各部分が別の核酸連結領域上の部分と相補性を有する、より複雑な多量体構造も考えられる。異なる相補性を有する複数の部分を有する連結領域は、３、４、５またはそれ以上の核酸のより大きな多量体複合体の生成を可能にする。
いくつかの実施形態における連結領域は、５〜１００ヌクレオチド長である。他の実施形態では、連結領域は１０〜２５ヌクレオチド長である。
本明細書で使用する「相補性領域」という用語は、第２の核酸鎖上の第２の領域と実質的に相補的な第１の核酸鎖上の領域を指す。一般に、相補性領域を共有する２つの核酸は、適切な条件の下で（例えば、核酸塩基対形成を介して）ハイブリダイズして二本鎖構造を形成し得る。相補性の領域は、サイズが変化し得る。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが約２塩基対〜約１００塩基対の範囲である。いくつかの実施形態では、相補性領域は、約５塩基対〜約７５塩基対の長さの範囲である。いくつかの実施形態では、相補性の領域は、約１０塩基対〜約５０塩基対の長さの範囲である。いくつかの実施形態では、相補性領域は、約２０塩基対〜約３０塩基対の長さの範囲である。
相補性領域にわたる２つの核酸間で共有される核酸塩基の数は変化し得る。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、相補性領域にわたって１００％の相補塩基対（例えば、ミスマッチなし）を共有する。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、相補性領域にわたって、少なくとも９９．９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％または少なくとも７０％の相補性塩基対を共有する。いくつかの実施形態では、２つの核酸間で共有される相補性領域は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の塩基対のミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、２つの核酸間で共有される相補性領域には、１０を超える塩基対ミスマッチが含まれる。
本明細書で使用する場合、「非共有結合」という用語は、電子の共有を伴わない分子間の化学的相互作用（例えば、結合）を指す。一般に、非共有結合は、荷電した分子間の電磁相互作用によって形成される。非共有結合の例としては、限定するものではないが、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合、ファンデルワールス力（例えば双極子−双極子相互作用、ロンドン分散力など）、π−効果（π−π相互作用、カチオン−π相互作用、アニオン−π相互作用）、および疎水性効果が挙げられる。
いくつかの実施形態では、多量体分子の核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）間に形成される少なくとも１つの非共有結合は、ワトソン−クリック塩基対形成の結果である。「ワトソン−クリック塩基対形成」または「塩基対形成」という用語は、ヌクレオチド塩基の特定の対（「相補塩基対」）間の水素結合の形成を指す。例えば、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）との間に２つの水素結合が形成され、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間に３つの水素結合が形成される。２つのポリヌクレオチド間の結合の強さを評価する１つの方法は、２つのポリヌクレオチドのグアニン塩基とシトシン塩基との間に形成される結合の割合（「ＧＣ含量」）を定量することによる。いくつかの実施形態では、多量体分子（例えば、多量体ｍＲＮＡ分子）の２つの核酸間の結合のＧＣ含量は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である。いくつかの実施形態では、多量体分子（例えば、多量体ｍＲＮＡ分子）の２つの核酸間の結合のＧＣ含量は、１０％〜７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％である。相補的塩基対の結合による核酸二重鎖の形成はまた、「ハイブリダイゼーション」と呼んでもよい。
いくつかの実施形態では、２つの核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）がハイブリダイズして多量体分子を形成する。ハイブリダイゼーションは、２つのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ分子）の間の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の非共有結合の形成から生じ得る。いくつかの実施形態では、約２つの非共有結合と約１０の非共有結合との間が２つの核酸分子の間に形成される。いくつかの実施形態では、約５〜約１５の非共有結合が２つの核酸分子の間に形成される。いくつかの実施形態では、約１０〜約２０の非共有結合が２つの核酸分子の間に形成される。いくつかの実施形態では、約１５〜約３０の非共有結合が、２つの核酸分子の間に形成される。いくつかの実施形態では、約２０〜約５０の非共有結合が２つの核酸分子の間に形成される。いくつかの実施形態では、２つの核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の間に形成される非共有結合の数は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の非共有結合である。
いくつかの実施形態では、自己集合多量体ｍＲＮＡ構造は、少なくとも２〜１００のｍＲＮＡから構成され、各ｍＲＮＡは、連結領域および安定化核酸を有し、ここでこの安定化核酸は、各連結領域に相補的な領域を有する、ヌクレオチド配列を有する。本明細書に用いられる安定化核酸は、複数の連結領域を有し、かつ少なくとも２、ただしさらに好ましくは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の他の核酸との非共有相互作用を形成し得る任意の核酸である。例えば、安定化核酸は、以下の構造を有してもよい：
Ｌ１Ｘ１Ｌ２Ｘ２Ｌ３Ｘ３Ｌ４Ｘ４Ｌ５Ｘ５Ｌ６Ｘ６、ここで、Ｌは連結領域に相補的な核酸配列であり、ｘは０〜５０ヌクレオチド長の任意の核酸配列である。そのような構造は以下のように見える場合がある：
Figure 0006921833
いくつかの実施形態では、多量体ｍＲＮＡ分子は、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡを含み、ここで第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、スプリントを通じてお互いに非共有結合されている。本明細書で使用する「スプリント」という用語は、第１の核酸との相補性の第１領域、および第２の核酸との相補性の第２の領域を有するオリゴヌクレオチドを指す。スプリントは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドであっても、またはＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、スプリントは、１つ以上の修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに非共有結合している。いくつかの実施形態では、スプリントは、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに非共有結合している。いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）間の非共有結合は、各分子の非コード領域において形成される。本明細書で使用する「非コード領域」という用語は、タンパク質に翻訳されないポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の位置を指す。非コード領域の例は、調節領域（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、プロモーター配列、エンハンサー配列）および非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、非コード領域は非翻訳領域（ＵＴＲ）である。
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが翻訳されない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは転写開始部位で開始し、開始コドンまで続くが開始コドンを含まない；一方、３’ＵＴＲは終止コドンのすぐ後に始まり、転写終結シグナルまで続く。
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始する過程に関与することが一般的に知られているＫｏｚａｋ配列のような特徴を保持している。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここでＲは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、その後に別の’Ｇ’が続く。５’ＵＴＲも、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲをポリヌクレオチドの領域に組み込んでもよいことができることを理解すべきである。さらに、任意の既知遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域の変異体ではない人工ＵＴＲを提供することも、本発明の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置されてもよいし、または向きもしくは位置が変更されてもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで逆転、短縮、延長、作製されてもよい。本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、ＵＴＲ配列に関するものであり、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの形で変化したことを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示したように、向きもしくは位置の変化によって野生型もしくは天然のＵＴＲに対して改変されてもよく、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位によって改変されてもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を産生する任意のこれらの変化は変異体ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲなどの二重、三重または四重のＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用する「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列にコード化されているものである。
パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用される「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変異体が１回、２回、または３回以上反復されるような反復パターンまたは交互パターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
いくつかの実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特性の特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達中のある時期に発現されるタンパク質のファミリーに属する場合がある。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲは、同じまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲとスワッピングして、新しいポリヌクレオチドを作製してもよい。本明細書中で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、最も広い意味において使用され、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。非翻訳領域は、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、第１の核酸）のＵＴＲは、別のポリヌクレオチド（第２の核酸）のＵＴＲとの相補性の領域を有するように操作または修飾される。例えば、２つのＵＴＲがハイブリダイズして多量体分子を形成するように、（例えば、多量体分子中の）結合しようとする２つのポリヌクレオチドのＵＴＲヌクレオチド配列を、相補性の領域を含むように修飾してもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＭ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、多量体配列の形成を可能にするように修飾される。いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ１から選択されるＨＣＭＶタンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲを修飾して、多量体配列の形成を可能にする。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ糖タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲを修飾して、多量体配列の形成を可能にする。いくつかの実施形態では、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｇＯ、ｇＭおよびｇＭから選択されるＨＣＭＶ糖タンパク質をコードするＲＮＡポリヌクレオチドの５’ＵＴＲを修飾して、多量体配列の形成を可能にする。これらの実施形態のいずれかにおいて、多量体は、二量体、三量体、五量体、六量体、七量体、八量体 九量体または十量体であってもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、多量体は均一な多量体であってもよく、すなわち、同じＨＣＭＶ抗原ポリペプチドをコードする配列を有する二量体、三量体、五量体などを含んでもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、多量体は、異なるＨＣＭＶ抗原ポリペプチド、例えば２つの異なる抗原ポリペプチド、３つの異なる抗原ポリペプチド、４つの異なる抗原ポリペプチド、５つの異なる抗原ポリペプチド、などをコードする配列を有する二量体、三量体、五量体などを含む異種多量体であってもよい。多量体分子（例えば、二量体、三量体、五量体など）の形成のための修飾された５’ＵＴＲ配列を有する例示的なＨＣＭＶ核酸は、配列番号１９〜２６を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、カチオン性またはポリカチオン性化合物、例としては、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、または他のカチオン性ペプチドもしくはタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、例としては、ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来または類似体ペプチド、ペスチウイルスＥｒｎｓ、ＨＳＶ、ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡまたはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド（複数可）、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド（複数可）、アンテナペディア由来ペプチド（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、ヒストン、カチオン性多糖類、例えば、キトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル］］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノール−アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−アルファ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロライド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロライド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピルオキシメチルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピルオキシスクシニリルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、またはカチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、例えば、変性ポリアミノ酸、例えば、ベータアミノ酸−ポリマー、または逆転ポリアミドなど、変性ポリエチレン、例えば、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロマイド）など）、変性アクリレート、例えばｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチル）メチルアクリレート））など、変性アミドアミン、例えば、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など、変性ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、例えば、ジアミン末端変性１，４−ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなど、デンドリマー、例えば、ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭベースのデンドリマーなど、ポリイミン（複数可）、例えば、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）など、ポリアリルアミン、糖骨格ベースのポリマー、例えば、シクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサンなど、シラン骨格ベースのポリマー、例えば、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなど、１つ以上のカチオン性ブロック（例えば、上記のカチオン性ポリマーから選択される）の、および１つ以上の親水性または疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）の組合せからなるブロックポリマー；等と会合させてもよい。
他の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、カチオン性またはポリカチオン性化合物と会合されていない。
ワクチン投与の形式
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらとしては、限定するものではないが、皮内、筋肉内および／または皮下投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを、それを必要とする対象に投与することを包含する方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および一般的な状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに依存して、対象によって異なるであろう。ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、典型的には、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位投与形態で製剤化される。しかし、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者についての特定の治療上有効な、予防的に有効な、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重篤度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および使用される特定の化合物の排泄速度；治療の持続時間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；医学分野で周知の同様の要因を含む種々の要因に依存する。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、所望の治療、診断、予防または画像化効果を得るために、１日あたり、１日１回以上、１週あたり、１か月あたりなど、対象の体重あたり、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇなどを送達するのに十分な投与レベルで投与してもよい（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願番号ＷＯ２０１３０７８１９９に記載されている単位用量の範囲を参照のこと）。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日毎、毎週、２週毎、３週毎、４週毎、２カ月毎、３カ月毎、６ヶ月毎、などで送達されてもよい。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそれ以上の投与）を用いて送達してもよい。複数の投与が使用される場合、本明細書に記載されているような分割投薬レジメンを使用してもよい。例示的な実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な投与レベルで投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで１回または２回（またはそれ以上）投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、２回（例えば、０日目および７日目、０日目および１４日目、０日目および２１日目、０日目および２８日目、０日目および６０日目、０日目および９０日目、０日目および１２０日目、０日目および１５０日目、０日目および１８０日目、０日目および３カ月後、０日目および６カ月後、０日目および９カ月後、０日目および１２カ月後、０日目および１８カ月後、０日目および２年後、０日目および５年後、または０日目および１０年後）に、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇという総用量または総用量を送達するのに十分な投与レベルで投与されてもよい。より高いおよびより低い投与量および投与頻度が、本開示によって包含される。例えば、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、３回投与されても、または４回投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン組成物は、２回（例えば、０日目および７日目、０日目および１４日目、０日目および２１日目、０日目および２８日目、０日目および６０日目、０日目および９０日目、０日目および１２０日目、０日目および１５０日目、０日目および１８０日目、０日および３カ月後、０日および６カ月後、０日および９カ月後、０日目および１２カ月後、０日目および１８カ月後、０日目および２年後、０日目および５年後、または０日目および１０年後）に、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇまたは０．４００ｍｇという総用量で、またはその総用量を送達するのに十分な用量レベルで、投与され得る。
いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法で使用するＲＮＡワクチンは、対象にワクチン接種するのに有効な量で、１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの核酸ワクチンの単回投与で対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法で使用するＲＮＡワクチンは、対象にワクチン接種するのに有効な量で１０μｇ〜４００μｇの核酸ワクチンの単回投与で対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法において使用するためのＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１０μｇの単回投与で対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法において使用するためのＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、２μｇの単回用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法において使用するためのＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、１０μｇの２つの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象にワクチン接種する方法において使用するためのＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、対象に２μｇの２投与量を投与される。
本明細書に記載のＨＣＭＶワクチンは、複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。ＲＮＡポリヌクレオチドは、ワクチン内で等しい量で存在しても、または異なる量で存在してもよい。例えば、ワクチンは、ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＨまたはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＬ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１２８またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３０、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドＵＬ１３１Ａまたはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチド；および／またはＨＣＭＶ抗原ポリペプチドｇＢ、またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａの比は、約１：１：１：１：１である。他の実施形態では、ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａの比は、約４：２：１：１：１である。いくつかの実施形態では、ｇＢ−ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａの比は、約１：１：１：１：１：１である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、等モル濃度のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、等モル濃度のｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、等しい質量のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、等しい質量のｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを含む。
本明細書に記載のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン医薬組成物は、鼻腔内、気管内または注射（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内および皮下）のような、本明細書に記載の投与形態に製剤化されてもよい。
ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチン製剤および使用方法
本開示のいくつかの態様は、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンが、対象において抗原特異的免疫応答を生成（例えば、抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに特異的な抗体の産生）するのに有効な量で製剤化されるＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効なＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの用量である。対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法も本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供されるＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価を測定することによって特徴付けられる。抗体価とは、対象内の抗体、例えば特定の抗原（例えば、抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド）または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体価は、典型的には、陽性の結果をもたらす最大希釈の逆数として表される。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、例えば、抗体価を決定するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態では、抗体価を用いて、対象が感染したか否かを評価するか、または免疫が必要であるかどうかを決定する。いくつかの実施形態では、抗体価は、自己免疫応答の強さを決定するため、ブースター免疫化が必要であるかどうかを決定するため、以前のワクチンが有効であったかどうかを決定するため、任意の最近のまたは以前の感染を特定するために用いられる。本開示によれば、抗体価を使用して、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによって対象において誘導される免疫応答の強度を決定してもよい。
いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１対数増大する。例えば、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、または少なくとも３対数増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して１、１．５、２、２．５または３対数増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して１〜３対数増大する。例えば、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して１〜１．５、１〜２、１〜２．５、１〜３、１．５〜２、１．５〜２．５、１．５〜３、２〜２．５、２〜３、または２．５〜３対数増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して少なくとも２倍増大する。例えば、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍増大する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して２〜１０倍増大する。例えば、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、対照に対して２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９、または９〜１０倍増大され得る。
対照は、いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与されていない対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照は、生弱毒化ＨＣＭＶワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。弱毒化ワクチンは、生存可能な（生存している）病原体の病原性を低下させることによって産生されるワクチンである。弱毒化されたウイルスは、生存している未改変のウイルスに比べてそれを無害化するか、または弱毒化するように変更される。いくつかの実施形態では、対照は、不活性化ＨＣＭＶワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価である。組換えタンパク質ワクチンは、典型的には、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたタンパク質抗原、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量と比較して低減される用量である。本明細書で提供される「ケアの標準」は、医学的または心理学的処置ガイドラインを指し、一般的であっても、または特定的であってもよい。「ケアの標準」は、所定の状態の処置に関わる医療専門家間の科学的証拠および協力に基づいた適切な処置を規定している。これは、特定のタイプの患者、病気または臨床環境について医師／臨床医が従うべき診断および治療プロセスである。本明細書で提供される「ケア用量の標準」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、ＨＣＭＶまたはＨＣＭＶに関連する状態を処置または予防するためのケアガイドラインの標準に従いながら、対象に投与して、ＨＣＭＶまたはＨＣＭＶ関連状態を処置または予防する、組換えもしくは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの用量を指す。
いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、組換えまたは精製されたＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量の少なくとも２倍の低下と等しい用量である。例えば、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍の低下に対して等しい用量であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における少なくとも１００倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍の低下に等しい用量である。いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンは、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２５０、５００または１０００倍の低下に等しい用量である。いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンを投与された対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたはタンパク質ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照の対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価に対して等しい。いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量において、２倍〜１０００倍（例えば、２倍〜１００倍、１０倍〜１０００倍）の低下に等しい用量であり、ここでこの対象で産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照の対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンとは、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における、２〜１０００倍、２〜９００倍、２〜８００倍、２〜７００倍、２〜６００倍、２〜５００倍、２〜４００倍、２〜３００倍、２〜２００倍、２〜１００倍、２〜９０倍、２〜８０倍、２〜７０倍、２〜６０倍、２〜５０倍、２〜４０倍、２〜３０倍、２〜２０倍、２〜１０倍、２〜９倍、２〜８倍、２〜７倍、２〜６倍、２〜５倍、２〜４倍、２〜３倍、３〜１０００倍、３〜９００倍、３〜８００倍、３〜７００倍、３〜６００倍、３〜５００倍、３〜４００倍、３〜３００倍、３〜２００倍、３〜１００倍、３〜９０倍、３〜８０倍、３〜７０倍、３〜６０倍、３〜５０倍、３〜４０倍、３〜３０倍、３〜２０倍、３〜１０倍、３〜９倍、３〜８倍、３〜７倍、３〜６倍、３〜５倍、３〜４倍、４〜１０００倍、４〜９００倍、４〜８００倍、４〜７００倍、４〜６００倍、４〜５００倍、４〜４００倍、４〜３００倍、４〜２００倍、４〜１００倍、４〜９０倍、４〜８０倍、４〜７０倍、４〜６０倍、４〜５０倍、４〜４０倍、４〜３０倍、４〜２０倍、４〜１０倍、４〜９倍、４〜８倍、４〜７倍、４〜６倍、４〜５倍、４〜４倍、５〜１０００倍、５〜９００倍、５〜８００倍、５〜７００倍、５〜６００倍、５〜５００倍、５〜４００倍、５〜３００倍、５〜２００倍、５〜１００倍、５〜９０倍、５〜８０倍、５〜７０倍、５〜６０倍、５〜５０倍、５〜４０倍、５〜３０倍、５〜２０倍、５〜１０倍、５〜９倍、５〜８倍、５〜７倍、５〜６倍、６〜１０００倍、６〜９００倍、６〜８００倍、６〜７００倍、６〜６００倍、６〜５００倍、６〜４００倍、６〜３００倍、６〜２００倍、６〜１００倍、６〜９０倍、６〜８０倍、６〜７０倍、６〜６０倍、６〜５０倍、６〜４０倍、６〜３０倍、６〜２０倍、６〜１０倍、６〜９倍、６〜８倍、６〜７倍、７〜１０００倍、７〜９００倍、７〜８００倍、７〜７００倍、７〜６００倍、７〜５００倍、７〜４００倍、７〜３００倍、７〜２００倍、７〜１００倍、７〜９０倍、７〜８０倍、７〜７０倍、７〜６０倍、７〜５０倍、７〜４０倍、７〜３０倍、７〜２０倍、７〜１０倍、７〜９倍、７〜８倍、８〜１０００倍、８〜９００倍、８〜８００倍、８〜７００倍、８〜６００倍、８〜５００倍、８〜４００倍、８〜３００倍、８〜２００倍、８〜１００倍、８〜９０倍、８〜８０倍、８〜７０倍、８〜６０倍、８〜５０倍、８〜４０倍、８〜３０倍、８〜２０倍、８〜１０倍、８〜９倍、９〜１０００倍、９〜９００倍、９〜８００倍、９〜７００倍、９〜６００倍、９〜５００倍、９〜４００倍、９〜３００倍、９〜２００倍、９〜１００倍、９〜９０倍、９〜８０倍、９〜７０倍、９〜６０倍、９〜５０倍、９〜４０倍、９〜３０倍、９〜２０倍、９〜１０倍、１０〜１０００倍、１０〜９００倍、１０〜８００倍、１０〜７００倍、１０〜６００倍、１０〜５００倍、１０〜４００倍、１０〜３００倍、１０〜２００倍、１０〜１００倍、１０〜９０倍、１０〜８０倍、１０〜７０倍、１０〜６０倍、１０〜５０倍、１０〜４０倍、１０〜３０倍、１０〜２０倍、２０〜１０００倍、２０〜９００倍、２０〜８００倍、２０〜７００倍、２０〜６００倍、２０〜５００倍、２０〜４００倍、２０〜３００倍、２０〜２００倍、２０〜１００倍、２０〜９０倍、２０〜８０倍、２０〜７０倍、２０〜６０倍、２０〜５０倍、２０〜４０倍、２０〜３０倍、３０〜１０００倍、３０〜９００倍、３０〜８００倍、３０〜７００倍、３０〜６００倍、３０〜５００倍、３０〜４００倍、３０〜３００倍、３０〜２００倍、３０〜１００倍、３０〜９０倍、３０〜８０倍、３０〜７０倍、３０〜６０倍、３０〜５０倍、３０〜４０倍、４０〜１０００倍、４０〜９００倍、４０〜８００倍、４０〜７００倍、４０〜６００倍、４０〜５００倍、４０〜４００倍、４０〜３００倍、４０〜２００倍、４０〜１００倍、４０〜９０倍、４０〜８０倍、４０〜７０倍、４０〜６０倍、４０〜５０倍、５０〜１０００倍、５０〜９００倍、５０〜８００倍、５０〜７００倍、５０〜６００倍、５０〜５００倍、５０〜４００倍、５０〜３００倍、５０〜２００倍、５０〜１００倍、５０〜９０倍、５０〜８０倍、５０〜７０倍、５０〜６０倍、６０〜１０００倍、６０〜９００倍、６０〜８００倍、６０〜７００倍、６０〜６００倍、６０〜５００倍、６０〜４００倍、６０〜３００倍、６０〜２００倍、６０〜１００倍、６０〜９０倍、６０〜８０倍、６０〜７０倍、７０〜１０００倍、７０〜９００倍、７０〜８００倍、７０〜７００倍、７０〜６００倍、７０〜５００倍、７０〜４００倍、７０〜３００倍、７０〜２００倍、７０〜１００倍、７０〜９０倍、７０〜８０倍、８０〜１０００倍、８０〜９００倍、８０〜８００倍、８０〜７００倍、８０〜６００倍、８０〜５００倍、８０〜４００倍、８０〜３００倍、８０〜２００倍、８０〜１００倍、８０〜９０倍、９０〜１０００倍、９０〜９００倍、９０〜８００倍、９０〜７００倍、９０〜６００倍、９０〜５００倍、９０〜４００倍、９０〜３００倍、９０〜２００倍、９０〜１００倍、１００〜１０００倍、１００〜９００倍、１００〜８００倍、１００〜７００倍、１００〜６００倍、１００〜５００倍、１００〜４００倍、１００〜３００倍、１００〜２００倍、２００〜１０００倍、２００〜９００倍、２００〜８００倍、２００〜７００倍、２００〜６００倍、２００〜５００倍、２００〜４００倍、２００〜３００倍、３００〜１０００倍、３００〜９００倍、３００〜８００倍、３００〜７００倍、３００〜６００倍、３００〜５００倍、３００〜４００倍、４００〜１０００倍、４００〜９００倍、４００〜８００倍、４００〜７００倍、４００〜６００倍、４００〜５００倍、５００〜１０００倍、５００〜９００倍、５００〜８００倍、５００〜７００倍、５００〜６００倍、６００〜１０００倍、６００〜９００倍、６００〜８００倍、６００〜７００倍、７００〜１０００倍、７００〜９００倍、７００〜８００倍、８００〜１０００倍、８００〜９００倍、または９００〜１０００倍の低下と等しい用量である。いくつかの実施形態では、上記のように、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照の対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。いくつかの実施形態では、有効量は、組換えＨＣＭＶタンパク質ワクチンの標準のケア用量における２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、５００倍、５１０倍、５２０倍、５３０倍、５４０倍、５５０倍、５６０倍、５７０倍、５８０倍、５９０倍、６００倍、６１０倍、６２０倍、６３０倍、６４０倍、６５０倍、６６０倍、６７０倍、６８０倍、６９０倍、７００倍、７１０倍、７２０倍、７３０倍、７４０倍、７５０倍、７６０倍、７７０倍、７８０倍、７９０倍、８００倍、８１０倍、８２０倍、８３０倍、８４０倍、８５０倍、８６０倍、８７０倍、８８０倍、８９０倍、９００倍、９１０倍、９２０倍、９３０倍、９４０倍、９５０倍、９６０倍、９７０倍、９８０倍、９９０倍、または１０００倍の低下と等しい（または少なくとも等しい）用量である。いくつかの実施形態では、上記のように、対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価は、組換えまたは精製ＨＣＭＶタンパク質ワクチンまたは生弱毒化もしくは不活性化ＨＣＭＶワクチンの標準のケア用量を投与された対照の対象において産生された抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチド抗体価と等しい。
いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量とは、５０〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、５０〜１０００、５０〜９００、５０〜８００、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜１０００、６０〜９００、６０〜８００、６０〜７００、６０〜６００、６０〜５００、６０〜４００、６０〜３００、６０〜２００、６０〜１００、６０〜９０、６０〜８０、６０〜７０、７０〜１０００、７０〜９００、７０〜８００、７０〜７００、７０〜６００、７０〜５００、７０〜４００、７０〜３００、７０〜２００、７０〜１００、７０〜９０、７０〜８０、８０〜１０００、８０〜９００、８０〜８００、８０〜７００、８０〜６００、８０〜５００、８０〜４００、８０〜３００、８０〜２００、８０〜１００、８０〜９０、９０〜１０００、９０〜９００、９０〜８００、９０〜７００、９０〜６００、９０〜５００、９０〜４００、９０〜３００、９０〜２００、９０〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜９００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量のＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、合計で２回対象に投与される２５〜５００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量とは、合計で２回対象に投与される２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、２５〜５０、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、１５０〜５００、１５０〜４００、１５０〜３００、１５０〜２００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、２５０〜５００、２５０〜４００、２５０〜３００、３００〜５００、３００〜４００、３５０〜５００、３５０〜４００、４００〜５００または４５０〜５００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、ＨＣＭＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量とは、合計で２回対象に投与される２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μｇの総用量である。
いくつかの実施形態では、対象においてＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによって誘導される抗原特異的免疫応答は、抗ＨＣＭＶ抗原ポリペプチドに特異的な抗体の産生である。いくつかの実施形態では、このような抗体は、感染した宿主においてＨＣＭＶを中和し得る。いくつかの実施形態では、対象におけるＨＣＭＶ ＲＮＡワクチンによって誘導される抗原特異的免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞応答である。このようなＴ細胞応答は、ＨＣＭＶ感染に対して免疫化された動物（例えば、マウスまたはヒト）に免疫を提供し得る。
本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成要素の構成および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施されることも、実行されることも可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明のためのものであり、限定的であると見なされるべきではない。「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む、包含する）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含する）」、または「有する」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む、含有する）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（包含する、含む）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙された項目およびその等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
実施例１：ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば、ポリヌクレオチドおよび／またはその部分もしくは領域の製造は、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」と題された国際出願ＷＯ２０１４／１５２０２７に教示された方法を利用して達成され得る。
精製方法には、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＷＯ２０１４／１５２０３０およびＷＯ２０１４／１５２０３１に教示されている方法が挙げられ得る。
ポリヌクレオチドの検出および特徴付け方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１４４０３９に教示されるように実施してもよい。
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、およびＲＮＡ不純物の検出からなる群より選択される手順を用いて達成され得、ここで特徴付けは、ＲＮＡ転写配列の決定、ＲＮＡ転写物の純度の決定、またはＲＮＡ転写物の電荷異種性の決定を包含する。そのような方法は、その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、ＷＯ２０１４／１４４７１１およびＷＯ２０１４／１４４７６７に教示されている。
実施例２：キメラポリヌクレオチド合成
序
本開示によれば、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分は、三リン酸化学結合を用いて結合されても、または連結されてもよい。
この方法によれば、第１の領域または１００ヌクレオチド以下の部分は、５’一リン酸および末端３’ｄｅｓＯＨまたはブロックされたＯＨと化学的に合成される。その領域が８０ヌクレオチドより長い場合、それはライゲーションのために２つの鎖として合成され得る。
第１の領域または部分が、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、５’一リン酸塩の変換に続き、３’末端のキャッピングが続く場合がある。
一リン酸塩保護基は、当該技術分野で公知の任意のいずれから選択されてもよい。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または一部は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを用いて合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用し得るＲＮＡポリメラーゼを含んでもよい。あるいは、最大１３０ヌクレオチドまでのキャップを化学的に合成し、ＩＶＴ領域または一部に連結してもよい。
ライゲーション法の場合、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼとのライゲーション、続いてＤＮＡｓｅによる処理は、連結をただちに回避すべきであることに留意のこと。
キメラポリヌクレオチド全体は、リン酸−糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分はリン酸−糖骨格を含むことが好ましい。
次いで、任意の公知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソリュリンク、または当業者に公知であるその他のバイオコンジュゲートケミストリーを使用して、ライゲーションを行う。
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して作製される。このようなセグメントとしては、以下が挙げられる：
（ａ）正常３’ＯＨを含んでいる、キャッピングされ保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）、
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含んでもよく、正常３’ＯＨを含んでいる、５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）、
（ｃ）コルジセピンを含んでおりまたは３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば尾部）のための５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）。
合成（化学的またはＩＶＴ）後、セグメント３（ＳＥＧ．３）は、コルジセピン、次にピロホスファターゼで処理して、５’一リン酸が生成される。
次にＲＮＡリガーゼを使用して、セグメント２（ＳＥＧ．２）がＳＥＧ．３にライゲートされる。次にライゲートされたポリヌクレオチドを精製して、ピロホスファターゼで処理して、二リン酸を切断する。次に処理されたＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を精製して、ＳＥＧ．１が５’末端にライゲートされる。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを実施してもよい。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲートされるか、または結合されたセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）、および３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表されてもよい。
各ステップの収率は、９０〜９５％程度であってもよい。
実施例３．ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡ調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）の２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ホットスタート・レディミックスを使用して実施される。このシステムは、２×ＫＡＰＡレディミックス１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ−１００ｎｇ；および２５．０μｌに希釈されたｄＨ２０を含む。反応条件は、９５℃で５分間、９８℃で２０秒間を２５サイクル、次に５８℃で１５秒間、次に７２℃で４５秒間、次に７２℃で５分間、次に４℃で終結する。
反応物は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲマイクロキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って清浄にされる（最高５μｇ）。より大規模の反応では、より大容量の製品を使用した清浄化が必要になる。清浄化に続いて、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してｃＤＮＡを定量化し、アガロースゲル電気泳動法によって分析して、ｃＤＮＡが予想サイズであることを確認する。次に、インビトロ転写反応に進む前に、ｃＤＮＡを配列解析に供する。
実施例４．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応は、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを生じる。このような均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含んでもよい。投入するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物は、天然および非天然ＮＴＰを使用して自社で作製する。
典型的なインビトロ転写反応物は、以下を含む：
鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
１０×転写緩衝液（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン） ２．０μｌ
カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ） ７．２μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤、 ２０Ｕ
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
ｄＨ２０ 最大２０．０μｌおよび
３７℃で３〜５時間インキュベーション。
粗製ＩＶＴ混合物は、翌日の清浄化のために４℃で一晩保存されてもよい。次に１ＵのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅを使用して、元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間のインキュベーション後、ｍＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、製造業者の説明書に従って精製する。このキットは、最大５００μｇまでのＲＮＡを精製し得る。清浄化に続いて、ＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動法によって分析して、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡ分解が起きていないことを確認する。
実施例５：酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングは、以下のようにして実施され、ここで混合物は、６０μｇ〜１８０μｇのＩＶＴ ＲＮＡおよび最大７２μｌのｄＨ２０を含む。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、ＲＮＡを変性して、次に即座に氷に移動する。
次にプロトコールは、１０×キャッピング緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭのＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２０（２８μｌまで）を混合すること；および６０μｇのＲＮＡでは３７℃で３０分間、または１８０μｇのＲＮＡでは最大２時間のインキュベーションを含む。
次にポリヌクレオチドは、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、製造業者の説明書に従って精製される。清浄化に続いて、ＲＮＡは、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動法によって分析して、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡ分解が起きていないことを確認する。ＲＮＡ生成物はまた、逆転転写ＰＣＲを実施して、配列決定のためのｃＤＮＡを生成することで、配列決定してもよい。
実施例６．ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡ中のポリ−Ｔなしでは、最終生成物の浄化前に、ポリ−Ａテーリング反応を実施しなくてはならない。これは、Ｃａｐｐｅｄ ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テーリング緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；最大１２３．５μｌのｄＨ２０を混合し、３７℃で３０分間のインキュベーションすることによって実施する。ポリＡ尾部が、転写物中に既にあれば、次にテーリング反応をスキップして、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）による清浄化に、直接進めてもよい（最大５００μｇ）。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現される組換え酵素である。
ポリＡテーリング反応の処理能力または完全性が、常に正確なサイズのポリＡ尾部をもたらすとは限らないことを理解すべきである。したがって、およそ４０〜２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５というポリＡ尾部は、本発明の範囲内である。
実施例７．天然５’キャップおよび５’キャップ類似体
ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、製造業者のプロトコールに従って、５’−グアノシンキャップ構造を生成してもよい：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ｔｈｅＡＲＣＡｃａｐ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成してもよい（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を使用して：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から生成されてもよく、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを使用する５’末端から３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化がそれに続く。キャップ３構造は、キャップ２構造から生成されてもよく、２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを使用し、５’末端から４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化がそれに続く。酵素は、好ましくは、組換え源に由来する。
哺乳類細胞にトランスフェクトされる場合、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間にわたり、または例えば、２４、３６、４８、６０、７２または７２時間を超えるなど、１８時間を超えて安定性を有する。
実施例８．キャッピングアッセイ
タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示される任意のキャップを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞にトランスフェクトされてもよい。トランスフェクションの６、１２、２４および３６時間後に、培養培地中に分泌されるタンパク質量は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。培地中により高レベルのタンパク質を分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力があるキャップ構造がある合成ポリヌクレオチドに相当する。
純度解析合成
本明細書に教示される任意のキャップを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して、純度について比較され得る。電気泳動による単一の統合されたバンドがあるポリヌクレオチドは、複数バンドまたは縞のバンドがあるポリヌクレオチドと比較して、より高純度の生成物に相当する。単一ＨＰＬＣピークがある合成ポリヌクレオチドもまた、より高純度の生成物に相当する。キャッピング反応が高効率であるほど、さらに純粋なポリヌクレオチド集団が得られる。
サイトカイン解析
本明細書に教示されるキャップのいずれかを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数濃度で細胞にトランスフェクトされ得る。トランスフェクションの６、１２、２４および３６時間後、培養培地中に分泌されるＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ベータなどの炎症促進性サイトカインの量は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る。培地中へのより高レベルの炎症促進性サイトカイン分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含むポリヌクレオチドに相当する。
キャッピング反応効率
本明細書に教示される任意のキャップを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後に、ＬＣ−ＭＳによってキャッピング反応効率について分析され得る。キャップされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理によって、ＬＣ−ＭＳによって検出可能である遊離ヌクレオチドおよびキャップされた５’−５三リン酸キャップ構造の混合をもたらす。ＬＣ−ＭＳスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全ポリヌクレオチドのパーセントとして表され得、キャッピング反応効率に対応する。キャップ構造の反応効率が高いほど、ＬＣ−ＭＳによればキャップされた生成物の量がさらに高くなる。
実施例９．修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド（２０μｌ容量中の２００〜４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ生成物（２００〜４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上のウェルに負荷して、製造業者のプロトコールに従って１２〜１５分間泳動する。
実施例１０．Ｎａｎｏｄｒｏｐ修飾ＲＮＡ定量化およびＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の修飾ポリヌクレオチドを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ吸光度読み取りのために使用して、化学合成またはインビトロ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量する。
実施例１１．リピドイドを使用する修飾ｍＲＮＡの製剤
ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとリピドイドとを設定比率で混合することで、インビトロ実験のために製剤化した後に細胞に添加する。インビボ製剤は、身体全体にわたる循環を促進するための追加の成分の添加を必要とし得る。これらのリピドイドが、インビボ研究に適した粒子を形成する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤のための標準製剤過程を、出発点として使用してもよい。粒子形成後、ポリヌクレオチドを添加して、複合体と一体化させる。カプセル化効率は、標準色素排除アッセイを使用して決定する。
実施例１２．ｈＣＭＶワクチン−ｈＣＭＶ糖タンパク質配列
ｈＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列のうちの少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｈＣＭＶワクチンは、下に列挙されるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つ、または下に列挙されるｍＲＮＡ配列の少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書に記載される配列の各々は、化学修飾された配列またはヌクレオチドの修飾を含まない非修飾の配列を包含する。
５’ＵＴＲは太字である。
３’ＵＴＲは下線を付す。
ｈＣＭＶ−ｇＨ：ｈＣＭＶ、糖タンパク質Ｈ（Ｍｅｒｌｉｎ株）
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 ｈＣＭＶ−ｇＨ：ｈＣＭＶ、糖タンパク質Ｈ（Ｍｅｒｌｉｎ株）
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 ｈＣＭＶ−ｇＨＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｈ−ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ−ｇＨＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｈ−ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ−ｇＬ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｌ
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 ｈＣＭＶ−ｇＬ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｌ
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 ｈＣＭＶ−ｇＬＦＬＡＧ、糖タンパク質Ｌ−ＦＬＡＧ
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 ｈＣＭＶ−ｇＬＦＬＡＧ、糖タンパク質Ｌ−ＦＬＡＧ
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 ｈＣＭＶ＿ｇＢ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｂ
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 ｈＣＭＶ＿ｇＢ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｂ
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 ｈＣＭＶ＿ｇＢＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｂ−ＦＬＡＧ
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 ｈＣＭＶ＿ｇＢＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｂ−ＦＬＡＧ
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実施例１３：ｈＣＭＶワクチン−ｈＣＭＶ変異体糖タンパク質配列
ｈＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列の少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｈＣＭＶワクチンは、以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つ、または以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。
ｈＣＭＶ−ｇＨｔｒｕｎｃ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（細胞外ドメイン）
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 ｈＣＭＶ−ｇＨｔｒｕｎｃ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（細胞外ドメイン）
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 ｈＣＭＶ−ｇＨｔｒｕｎｃＦＬＡＧ、糖タンパク質Ｈ細胞外ドメイン
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 ｈＣＭＶ−ｇＨｔｒｕｎｃＦＬＡＧ、糖タンパク質Ｈ細胞外ドメイン
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 ｈＣＭＶｇＨｔｒｕｎｃ６ＸＨｉｓ、糖タンパク質Ｈ細胞外ドメイン−６ＸＨｉｓタグ
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 ｈＣＭＶｇＨｔｒｕｎｃ６ＸＨｉｓ、糖タンパク質Ｈ細胞外ドメイン−６ＸＨｉｓタグ
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 ｈＣＭＶ＿ＴｒｇＢ、糖タンパク質Ｂ（細胞外ドメイン）
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 ｈＣＭＶ＿ＴｒｇＢ、糖タンパク質Ｂ（細胞外ドメイン）
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 ｈＣＭＶ＿ＴｒｇＢＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｂ細胞外ドメイン−ＦＬＡＧ
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 ｈＣＭＶ＿ＴｒｇＢＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ糖タンパク質Ｂ細胞外ドメイン−ＦＬＡＧ
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 ｈＣＭＶ−ＴｒｇＢ６ＸＨｉｓ、ｈＣＭＶ糖タンパク質細胞外ドメイン−６ＸＨｉｓタグ
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 ｈＣＭＶ−ＴｒｇＢ６ＸＨｉｓ、ｈＣＭＶ糖タンパク質細胞外ドメイン−６ＸＨｉｓタグ
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実施例１４：ｈＣＭＶワクチン−ｈＣＭＶ ＵＬ配列
ｈＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列の少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｈＣＭＶワクチンは、以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つまたは以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。
ｈＣＭＶ＿ＵＬ１２８
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 ｈＣＭＶ＿ＵＬ１２８
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 hＣＭＶ−１２８ＦＬＡＧ、ＵＬ１２８−ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ−１２８ＦＬＡＧ、ＵＬ１２８−ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３０
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３０
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３０ＦＬＡＧ、ＵＬ１３０−ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３０ＦＬＡＧ、ＵＬ１３０−ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３１Ａ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３１Ａ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３１ＡＦＬＡＧ、ＵＬ１３１Ａ−ＦＬＡＧ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３１ＡＦＬＡＧ、ＵＬ１３１Ａ−ＦＬＡＧ
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実施例１５：ｈＣＭＶワクチン−ｈＣＭＶ ＵＬ多量体配列
ｈＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列の少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｈＣＭＶワクチンは、以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つまたは以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。
ｈＣＭＶ ｇＨペンタ
Figure 0006921833
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 ｈＣＭＶ ｇＨペンタ
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 ｈＣＭＶ ｇＬペンタ
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 ｈＣＭＶ ｇＬペンタ
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 ｈＣＭＶ ｇＬ二量体
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 ｈＣＭＶ ｇＬ二量体
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 ｈＣＭＶ ＵＬ１２８ペンタ
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 ｈＣＭＶ ＵＬ１２８ペンタ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３０ペンタ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３０ペンタ
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 ｈＣＭＶＵＬ１３０三量体
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 ｈＣＭＶＵＬ１３０三量体
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３１Ａペンタ
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 ｈＣＭＶ−ＵＬ１３１Ａペンタ
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 ｈＣＭＶＵＬ１３１Ａ三量体
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 ｈＣＭＶＵＬ１３１Ａ三量体
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実施例１６：ｈＣＭＶワクチン−ｈＣＭＶ ＵＬ融合配列
ｈＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列の少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｈＣＭＶワクチンは、以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つまたは以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。
ｈＣＭＶ＿ｐｐ６５−ＩＥ１、ｈＣＭＶ ＵＬ８３−ＵＬ１２３融合
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 ｈＣＭＶ＿ｐｐ６５−ＩＥ１、ｈＣＭＶ ＵＬ８３−ＵＬ１２３融合
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 ｈＣＭＶ＿ｐｐ６５−ＩＥ１ＦＬＡＧ、ｈＣＭＶ ＵＬ８３−ＵＬ１２３ ＦＬＡＧタグ
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 ｈＣＭＶ＿ｐｐ６５−ＩＥ１、ｈＣＭＶ ＵＬ８３−ＵＬ１２３融合
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実施例１７：ｈＣＭＶワクチン−ｈＣＭＶコンカテマー配列
ｈＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列の少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｈＣＭＶワクチンは、以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つまたは以下に列挙するｍＲＮＡ配列の少なくとも１つの断片を含む少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。
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 ５’−ＵＴＲ：太字
３’−ＵＴＲ：下線
ｈＣＭＶＵＬ１２８−２Ａ−ＵＬ１３１（ＯＲＦ−ＵＬ１２８−フリン−リンカー−Ｐ２Ａ−ＵＬ１３０ フリン−リンカー−Ｆ２Ａ−ＵＬ１３１Ａ）
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実施例１８：免疫原性研究
本研究は、ＭＣＭＶから得られたｇＨおよびｇＬ糖タンパク質またはＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む候補ＣＭＶワクチンのマウスにおける免疫原性を試験するように設計されている。
マウスは、筋肉内（ＩＭ）経路または皮内（ＩＤ）経路を介して０および４週目にワクチン接種される。１つの群は未接種のままであり、１つは不活性化ＭＣＭＶを投与される。１週間、３週間（投与前）および５週間に各マウスから血清を採取する。個々の採血物を、抗ｇＨおよび抗ｇＬ活性または抗ＵＬ１２８、抗ＵＬ１３０、および抗ＵＬ１３１Ａについて、ＥＬＩＳＡアッセイによって、３つの時点全てから試験し、５週目からプールしたサンプルのみを、不活性化ＭＣＭＶを用いたウェスタンブロットによって試験する。
ＥＬＩＳＡイムノアッセイ
抗体産生は、ＥＬＩＳＡによってサンプル中で測定される。適切に希釈したサンプルを、抗体のエピトープに対して指向される捕獲抗体でプレコーティングした９６ウェルプレートに入れた。典型的には、血清サンプルをアッセイのために１：１００に希釈した。インキュベーションおよび洗浄プロトコールは、慣用的な方法を用いて行った。データは波長４５０ｎｍで読み取られる。データを報告し、プロットする。
実施例１９：ＭＣＭＶ抗原投与
この研究は、ｇＨおよびｇＬまたはＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１ＡをコードするｍＲＮＡを含むマウスＣＭＶワクチンを使用して、致死の抗原投与に対する候補ＣＭＶワクチンのマウスにおける有効性を試験するように設計される。ＣＭＶ感染の厳密な種特異性のために、ＨＣＭＶ感染および免疫の研究に利用可能な動物モデルはない。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）感染は、ＨＣＭＶ感染をシミュレートする最も広く使用されるマウスモデルである。現在の研究では、ＭＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ抗原の免疫原性および防御効力が研究されている。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に群に分ける。その群を、（１）１０μｇのｇＢ（陽性対照）、（２）１０μｇのｇＨおよびｇＬ ｍＲＮＡ（別々の配列の組合わせ）、（３）１０μｇのｇＨ−ｇＬコンカテマーｍＲＮＡ（単一配列）、（４）１０μｇのＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ ｍＲＮＡ（別々の配列の組合わせ）、（５）１０μｇのＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１ＡコンカテマーｍＲＮＡ（単一配列）、（６）１０μｇのｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１ＡコンカテマーｍＲＮＡ（単一配列）および（７）ＰＢＳ、を用いてそれぞれ免疫する。マウスを右大腿四頭筋への注射（ＩＭ）または皮内投与（ＩＤ）により２回（２８日目に第２の用量）免疫化し、腹腔内注射により、致死量（５×ＬＤ５０、２００μｌ／マウス）のＳＧ−ＭＣＭＶ（Ｓｍｉｔｈ株、１０５ＰＦＵ）を抗原投与する。この感染は、マウスにおいて全身性ウイルス複製を引き起こし、抗原投与後１週間以内に全てのワクチン接種を受けていないマウスを死滅させる。
エンドポイントは、感染後５日目、死亡または安楽死である。＞３０％の体重減少、極度の嗜眠または麻痺によって決定される重症病状を示す動物は安楽死させる。ＤＮＡワクチンの防御効果は、体温、体重減少、および生存の感染症状を総合的に用いて評価する。マウスを秤量し、毎日評価して、体重減少、見かけの身体状態（逆立った毛と傷ついた皮膚）、体温、行動をモニターする。動物の苦痛を最小化または回避するために、全ての場合において、クロロホルム（過剰吸入）後に頸部脱臼によってマウスを人道的に安楽死させる。
実施例２０：ＭＣＭＶ中和アッセイ
マウスを、実施例１８の方法に従って免疫する。マウス血清サンプルを、２回目の免疫の３週間後に収集する。血清サンプルは、使用するまで−２０℃で保存する。ＭＣＭＶに対して指向される中和抗体は、例えば、Ｇｅｏｆｆｒｏｙ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ ｉｓ ｉｎｎｏｃｕｏｕｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅｍ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９６；１４：１６８６−１６９４に記載されているように、プラーク減少アッセイによって決定する。補体除去血清（３０μｌ）をＭＥＭで２倍連続希釈する。各希釈液を３０μｌのＭＥＭ中１００ＰＦＵのＭＣＭＶと混合し、次いで４℃で１時間、３７℃で１時間インキュベーションする。混合物を３Ｔ３単層上に重層し、ＰＦＵを標準プラークアッセイによって計算する。中和力価は、プラーク数の５０％の減少を達成するために必要とされる最も高い血清希釈として表す。
実施例２１：ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
マウスをｇＨもしくはｇＬで免疫化するか、またはｇＨ／ｇＬ ｍＲＮＡを用いて２回（０日目および２８日目）、ＩＭで１０μｇの用量で同時免疫する。２回目の免疫化の２週間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために脾細胞を単離する。イムノスポットを、製造業者の説明書に従ってラット抗マウスＩＦＮ−γｍＡｂでコーティングし、４℃で一晩インキュベーションし、次いで２００μｌのブロッキング溶液でブロックする。続いて、２×１０５個のリンパ球を三連でウェルに添加し、１０μｇ／ｍｌの対応するｇＨもしくはｇＬペプチドまたはｇＨ／ｇＬポリペプチド混合物（同時免疫群用）で刺激する。１８時間後、リンパ球を捨て、ビオチン標識抗マウスＩＦＮ−γＡｂ抗体を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションする。次に、希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート溶液を添加し、室温で２時間インキュベーションする。最後に、プレートを１００μｌのＡＥＣ基質溶液で処理し、暗所で、室温で２０分間インキュベーションする。非物質化水で洗浄することにより反応を停止させる。スポットは、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーによって定量化する。
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 終止配列を示す
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実施例２２：ＨｅＬａ細胞におけるｈＣＭＶ五量体複合体をコードするｍＲＮＡワクチン構築物の発現
ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａを含むｈＣＭＶ五量体複合体のサブユニットをコードするｍＲＮＡワクチン構築物の発現を試験した（図１Ｂ）。各サブユニットをコードするｍＲＮＡを、４：２：１：１：１のｇＨ：ｇＬ：ＵＬ１２８：ＵＬ１３０：ＵＬ１３１Ａ比で混合した。ＨｅＬａ細胞をトランスフェクションするために使用したｍＲＮＡの総量は２μｇであった。トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞を、２４時間インキュベートした後、五量体複合体サブユニットおよび完全な五量体の表面発現のためフローサイトメーター上で蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて分析した（図２Ａ〜２Ｄ）。ｇＨ、ＵＬ１２８、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ複合体、または完全な五量体に特異的な抗体を、タンパク質の表面発現の検出に使用した。ＨｅＬａ細胞では、ｇＨ、ＵＬ１２８、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ複合体、および完全な五量体複合体の表面発現を検出した（図２Ａ〜２Ｄ）。
五量体サブユニットをコードするｍＲＮＡの異なる組合わせも試験して、コアサブユニットの全てが完全な五量体複合体の表面発現を必要とするか否かを決定した（図３Ａ〜３Ｂ）。示されたｍＲＮＡの組合わせを用いて上記のように実験を行った。完全な五量体複合体に特異的な抗体を使用した（８Ｉ２１）。結果によって、五量体複合体がＵＬ１２８、ＵＬ１３０、またはＵＬ１３１Ａのいずれの非存在下でも細胞表面上に発現しないことが示される。
次に、ｇＬを含むまたは含まないｇＨ糖タンパク質の表面発現を試験した。実験は、ｇＨ、ｇＨおよびｇＬをコードするｍＲＮＡ構築物、または五量体複合体をコードする構築物を用いて上記のように行った。ｇＨ（３Ｇ１６）に特異的な抗体を使用した。結果によって、ｇＨ単独の発現は、細胞表面上でｇＨ発現を導かないことが示された。しかし、ｇＨがｇＬと複合体を形成する場合、五量体複合体中の全てのサブユニットが発現されるときと同様に、ＨｅＬａ細胞の表面上に同様のレベルのｇＨが検出された（図４Ａ〜４Ｂ）。
ｇＢの細胞内発現および表面発現も、ｇＢに特異的な抗体を用いて試験した。図５Ａは、細胞内ｇＢ発現を示す。ｇＢの表面発現をフローサイトメーターでＦＡＣＳにより測定し、ｇＢの表面発現を検出した（図５Ｂ）。ｇＢ表面発現の定量化を図５Ｃに示す。さらに、ｇＢをコードするｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来の細胞溶解物に対して行ったイムノブロットを図５Ｄに示す。トランスフェクトされていないＨｅＬａ細胞溶解物を陰性対照として使用し、再構成された全長ｇＢタンパク質を陽性対照として使用した。図５Ｄの中間レーンに示すように、タンパク質分解切断後の全長のｇＢ（前駆体）および成熟ｇＢの両方が検出された。
実施例２３：ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物による免疫後の高力価の抗五量体抗体
五量体複合体サブユニットおよび／またはｇＢ抗原をコードする候補ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物の免疫原性をマウスで試験した。免疫スケジュールおよびｍＲＮＡ製剤は、以下の表４に示す。
マウスを群（５匹のマウス／群）に分け、筋肉内（ＩＭ）経路を介して０日目、２１日目および４２日目にワクチン接種した。１群のマウスに対照としての空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をワクチン接種した。他の群のマウスには、五量体複合体、ｇＢ抗原、五量体複合体およびｇＢ抗原の両方、または五量体タンパク質複合体もしくはＭＦ５９と組み合わせたｇＢタンパク質抗原のいずれかをコードするｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物を与えた。ｍＲＮＡワクチン構築物が与えられた場合、異なる調製手順を用いた。「プレミックス」ｍＲＮＡをプレミックスし、次いで製剤化するが、「ポストミックス」ｍＲＮＡは個別に製剤化し、次いで混合した。五量体複合体の全てのサブユニットをコードするｍＲＮＡを、表４に示されるように異なる比で製剤化した：ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａは、４：２：１：１：１または１：１：１：１：１であった。ｇＢ＋五量体を１：１：１：１：１：１で製剤化した。使用される用量スケジュールを表４に示す。
マウス血清を−１日目（投与前）、２０、４１、６２、および８４日目に各マウスから採取した。全ての時点からの個々の採血を、ｈＣＭＶ五量体でコーティングしたプレート上で行ったＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。典型的には、血清サンプルをアッセイのために１：１００に希釈した。インキュベーションおよび洗浄プロトコールは、慣用的な方法を用いて行った。データは４５０ｎｍの波長で読み取った。データを報告し、プロットした（図６および図７）。図６は、抗五量体特異的ＩｇＧが、ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物によって誘導されたことを示す。しかし、３回目の免疫の後には、ブースター効果はほとんどまたは全く観察されなかった。ＩｇＧ応答は、一回の免疫後６〜９週間維持された。五量体複合体サブユニットをコードするｍＲＮＡにｇＢをコードするｍＲＮＡを追加することは、抗五量体ＩｇＧ産生に干渉しなかった。異なる五量体複合体サブユニットをコードする、異なるモル比のｍＲＮＡは、異なるＩｇＧ誘導レベルを生じなかった。図７によって、ｇＢをコードするｍＲＮＡワクチン構築物が、抗ｇＢ ＩｇＧ応答を誘導したことが示される。ＩｇＧ力価は、３回の免疫化の後、１０μｇ用量でｇＢタンパク質／ＭＦ５９と比較して、ｇＢ ｍＲＮＡについて同様であった。ブースト応答が、ｇＢ ｍＲＮＡまたは抗原の３回目の免疫後に観察された。ｇＢをコードするｍＲＮＡに五量体複合体サブユニットをコードするｍＲＮＡを加えることは、抗ｇＢ ＩｇＧ産生を干渉しなかった。
実施例２４：ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡによる免疫は、マウスにおいて非常に強力な中和抗体を誘発する
中和アッセイは、ｈＣＭＶ臨床分離株ＶＲ１８１４に感染した上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９において行われた。マウスは、実施例２３の方法に従って免疫した。マウス血清サンプルを２回目の免疫の３週間後（４１日目）に収集した。３μｇのｈＣＭＶ ｍＲＮＡ五量体ワクチン構築物で免疫したマウスから採取したマウス血清を希釈し（１：２５６００）、感染細胞に添加した。細胞を、ｈＣＭＶ ＩＥ１タンパク質について染色した（細胞におけるｈＣＭＶの存在の指標として）。結果によって、３μｇのｈＣＭＶ五量体ｍＲＮＡワクチン構築物で免疫したマウスからの血清は、ＡＲＰＥ−１９細胞のｈＣＭＶを中和することができたが、ヒト血清陽性血清または血清なしの対照はＡＲＰＥ−１９細胞のｈＣＭＶを中和しなかったことが示された（図８）。
臨床ｈＣＭＶ分離株ＶＲ１８１４に感染したＡＲＰＥ−１９細胞で測定したマウス血清のｈＣＭＶ中和力価を図９および表５に示す。
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実施例２５：第２世代ｈＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物
ＨＣＭＶ五量体複合体ｍＲＮＡワクチン構築物を修飾して、第二世代ｍＲＮＡ構築物を産生した。第２世代ｍＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列を表６に提供する。第２世代ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン構築物の発現を、ウェスタンブロットによって確認した（図１１Ａ〜１１Ｅ）。さらに、第２世代のｍＲＮＡワクチン構築物を用いてｈＣＭＶ五量体の表面発現を試験するために、ＨｅＬａ細胞を、１．２５μｇの各ｍＲＮＡワクチン構築物（ｇＨ−ｇＬ−Ｕｌ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａを１：１：１：１：１）を用いてトランスフェクトした。次いでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、五量体特異的抗体で染色し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で分析した。蛍光細胞集団は、ｈＣＭＶ五量体の表面発現を示す（図１０）。
五量体およびｇＢをコードする第二世代のｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンもまた、化合物２５脂質と共に製剤化し、製剤の免疫原性を試験した（図２０Ａ〜２０Ｂ）。マウスを、４．２μｇまたは１．４μｇのｍＲＮＡワクチンの総用量で免疫した。免疫後２０日目および４０日目にマウスの血清サンプルを採取し、血清ＩｇＧ力価を、五量体コーティングプレートまたはｇＢコーティングプレートで評価した。第２世代ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンは、高レベルの五量体特異的抗体（図２０Ａ）およびｇＢ特異的（図２０Ｂ）抗体を誘導した。
ＨＣＭＶワクチンは、例えば、以下の配列の少なくとも１つによって、または以下の配列の少なくとも１つの断片もしくはエピトープによってコードされる少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい：
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実施例２６：２Ａペプチド連結五量体サブユニット
ｈＣＭＶ五量体のサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵｌ１３１Ａ）をコードする多価ｍＲＮＡワクチン構築物を設計した。多価ｍＲＮＡでコードされた五量体サブユニットは、２Ａ自己切断ペプチドと連結されており（図１５）、これによって連結サブユニットが個々のサブユニットにプロセシングすることが可能になる。２Ａペプチド連結ｇＨ−ｇＬをコードするｍＲＮＡワクチン構築物１μｇを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を採取し、ウェスタンブロッティングを用いて個々のｇＨまたはｇＬサブユニットを検出することにより、２Ａペプチドの切断を分析した。個々のｇＨおよびｇＬを検出することにより、構築物の首尾よい発現および２Ａペプチドの切断が示された（図１６）。さらに、プロセシングされたｇＨまたはｇＬは、ＨｅＬａ細胞で発現され、二量体化され、Ｈｅｌａ細胞を２Ａ結合ｇＨ−ｇＬをコードする０．５μｇのｍＲＮＡでトランスフェクションした２４時間後に細胞表面に転位した（図１７）。
実施例２７：等モル対等質量の五量体の比較
等モル濃度の五量体サブユニットｍＲＮＡを含有する五量体製剤を、等質量の五量体サブユニットｍＲＮＡを含有する五量体製剤と比較した。図１８は、マウスにおける抗五量体結合抗体および中和抗体の高力価および持続力価を示す。図１８Ａは、抗五量体抗体価を示すグラフを示す。五量体ｍＲＮＡの等モルおよび等質量の製剤が等しく有効であることが判明した。図１８Ｂは、ｈＣＭＶ株ＶＲ１８１４に感染したＡＲＰＥ１９上皮細胞で測定した中和力価を示すグラフを示す。五量体ｍＲＮＡの等モルおよび等質量の製剤を比較し、等しく有効であることが判明した。中和力価は、ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）より約２５倍高いことが判明した。
実施例２８：中和活性は、抗五量体抗体に依存する
中和データを評価し、ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）と比較した。図１９によって、上皮細胞感染に対する中和活性が、抗五量体抗体に依存することが示される。図１９Ａによって、枯渇タンパク質が五量体またはｇＨ／ｇＬ二量体のいずれかであったことが示される。図１９Ｂおよび図１９Ｃは、中和を示すグラフを示す。図１９Ｂは、五量体またはｇＨ／ｇＬ二量体で免疫したマウス由来の血清による中和を示す。図１９Ｃは、五量体またはｇＨ／ｇＬと組み合わせたＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）による中和を示す。
実施例２８：母子（先天性）感染の予防のための第１相臨床試験
第１相臨床試験を実施し、ヒトにおける五量体複合体（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ）＋ｇＢをコードする化学修飾または非修飾ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンの安全性を評価し、ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンが免疫応答を誘導する能力を評価する。１８〜４９歳の間の１２０人のボランティア（女性と男性の両方）が臨床試験に登録されている。ボランティアを、臨床試験の開始前にＣＭＶについて試験する。健常ボランティアのうち６０人はＣＭＶ＋であるが、残りの６０人はＣＭＶ−である。
健康なボランティアを、３つの用量群に分け、各用量群には、異なる用量のｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチン（例えば、低、中、または高）を与える。各投与群（ｎ＝４０）について、ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンを、筋肉内（ＩＭ、ｎ＝２０）または静脈内（ＩＶ、ｎ＝２０）に投与する。従って、１２０人のボランティアを：低用量−ＩＭ（ｎ＝２０）、低用量−ＩＶ（ｎ＝２０）、中用量−ＩＭ（ｎ＝２０）、中用量−ＩＶ（ｎ＝２０）、高用量−ＩＭ（ｎ＝２０）、高用量−ＩＶ（ｎ＝２０）という６群（「投与群」と呼ばれる）に配置する。各投与群において、ボランティアは、安全コホート（ｎ＝４、２名はワクチン接種、および２名はプラセボ投与）；および拡大コホート（ｎ＝１６、１３名はワクチン投与、および３名はプラセボ投与）の２つのコホートに分ける。拡張コホートにおけるボランティアの免疫は、安全コホートの最後の健常人ボランティアに免疫してから７日後に開始する。
ｈＣＭＶワクチンまたはプラセボは、１日目、３１日目、および６１日目に６投与群のボランティアに与えられる。これは二重盲検臨床試験である。ボランティアは最大１年まで追跡される。最初の免疫後１日目、８日目、２２日目、３０日目、４４日目、６ヶ月目、および１年目に血液サンプルを採取する。
血液サンプル中の中和ｈＣＭＶ抗体価を、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いるか、または低サイトメトリー細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを用いて測定する。ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンを１２ヶ月間投与したボランティアでは、持続中和抗体価および強力な既往応答が期待される。ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンによって誘導されるＩｇＧのレベルは、ベースライン（臨床的エンドポイント）の少なくとも４倍上であると予想される。上皮細胞および線維芽細胞の両方で、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ５０）で測定したｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンを受けたボランティアの血液サンプル中の中和抗体価は、Ｃｙｔｏｇａｍ（登録商標）の中和抗体価（臨床エンドポイント）よりも高いと予想される。有効性の早期シグナル（ＥＳＯＥ）は、ボランティアの尿および唾液中のウイルス負荷を、１日、６ヶ月および１２ヶ月のＰＣＲで測定することによっても示され得る。
ワクチンの安全性を示すパラメータを測定する。免疫されたボランティアを、ｈＣＭＶ感染の臨床徴候（臨床エンドポイント）について評価する。生化学的アッセイを実施して、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の凝固パラメータおよび血中濃度を評価する。ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンは安全であると予想される。
いったん安全性および免疫原性が実証されると、第２相臨床試験において標的集団間で試験を行う。いくつかの実施形態では、第１相試験から選択される適切な用量レベルを第２相試験で使用する。
実施例２９：第２相臨床試験のデイケア介護者
ヒトの五量体複合体（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ）＋ｇＢをコードする化学修飾または非修飾のｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンを評価するために第２相臨床試験を以下の集団において実施する：血清陰性および血清陽性（安全コホート）デイケア介護者；託児所に子供がいる血清陰性および血清陽性（安全コホート）の両親；および血清陰性児。
３００人の対象が第２相臨床試験に登録され、実施例２６に記載の第１相臨床試験と同様にグループ分けされる。全ての対象を同じ用量のｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンで免疫する。いくつかの実施形態では、用量反応試験を実施する。対象は、免疫抑制療法の開始の２〜４週間前の１日目にワクチンの初回投与を受け、約１、３および６ヶ月でブースター免疫を受ける。これは二重盲検臨床試験である。対象は１年まで追跡される。最初の免疫の約１日、８日、２２日、３０日、４４日、６月、および１年後に血液サンプルを採取する。
ワクチンの安全性および免疫原性を、実施例２８に記載の第１相試験に記載の方法を用いて評価する。少なくとも７０％のワクチン効力が期待される。この試験の臨床エンドポイントには、ＰＣＲによって検出される尿および／または唾液中の感染が含まれる。ｈＣＭＶ ｍＲＮＡワクチンは、免疫応答を誘導し、中和抗体を生成すると予想される。安全性プロファイルも高いと予想される。
実施例３０：第３相臨床試験−思春期の少年少女
思春期の少年少女で第３相臨床試験が実施されている。必要に応じて、第３相臨床試験は幼児においても実施される。登録前にＣＭＶスクリーニングは行われない。
等価物
当業者は、本明細書に記載された本開示の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または慣用的な実験より少ない実験を用いて確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書に開示される特許文献を含む全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (14)

  1. （ａ）ｈＣＭＶ ｇＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、
    （ｂ）ｈＣＭＶ ｇＬポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｃ）ｈＣＭＶ ＵＬ１２８ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｄ）ｈＣＭＶ ＵＬ１３０ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｅ）ｈＣＭＶ ＵＬ１３１Ａポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、及び
    （ｆ）ｈＣＭＶ ｇＢポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    を含む、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ワクチンであって、
    ２０〜６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を有する少なくとも１つの脂質ナノ粒子中で製剤化され、前記ｍＲＮＡポリヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）は自己複製ＲＮＡでない、ｈＣＭＶワクチン。
  2. （ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’末端キャップ、任意で７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである５’末端キャップをコードする、請求項１に記載のｈＣＭＶワクチン。
  3. 少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含み、任意で（ｉ）前記化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、および２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群より選択される、
    （ｉｉ）前記ワクチンは、さらに、第２の化学修飾を含み、（ａ）〜（ｆ）のオープンリーディングフレーム中のウラシルの８０％が化学修飾を有し、前記化学修飾が任意でウラシルの５位にある、請求項１に記載のｈＣＭＶワクチン。
  4. ワクチン接種を受けた対象におけるワクチン効力が、前記ワクチンの単回投与後に、少なくとも７０％である、請求項１に記載のｈＣＭＶワクチン。
  5. ワクチンの有効量は、
    （ｉ）投与後１〜７２時間で対象の血清中で測定した場合に検出可能なレベルのｈＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａおよび／もしくはｇＢポリペプチドを産生するのに十分である、または
    （ｉｉ）投与後１〜７２時間で対象の血清中で測定した場合にｈＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａおよび／もしくはｇＢポリペプチドに対する中和抗体によって生成される１，０００〜１０，０００倍の中和力価を生成するのに十分である、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のｈＣＭＶワクチン。
  6. 対象において産生される抗ｈＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａおよび／もしくはｇＢポリペプチド抗体価が、
    （i）対照に対して少なくとも１対数、または
    （ii）対照に対して少なくとも２倍、
    増大し、前記対照が、ｈＣＭＶワクチンを投与されていない対象において産生されたｈＣＭＶ ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａおよび／もしくはｇＢポリペプチド抗体価である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｈＣＭＶワクチン。
  7. ワクチンの有効量が、総用量で２５〜２００μｇまたは２５〜１００μｇである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｈＣＭＶワクチン。
  8. 前記イオン化可能なカチオン性脂質が、以下の化合物:
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     を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｈＣＭＶワクチン。
  9. （ｉ）ｈＣＭＶ ｇＨポリペプチドが、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    （ｉｉ）ｈＣＭＶ ｇＬポリペプチドが、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    （ｉｉｉ）ｈＣＭＶ ＵＬ１２８ポリペプチドが、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    （ｉｖ）ｈＣＭＶ ＵＬ１３０ポリペプチドが、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    （ｖ）ｈＣＭＶ ＵＬ１３１Ａポリペプチドが、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｖｉ）ｈＣＭＶ ｇＢタンパク質が、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載のｈＣＭＶワクチン。
  10. （ｉ）ｈＣＭＶ ｇＨポリペプチドが、配列番号５９で同定されるアミノ酸配列を含む、
    （ｉｉ）ｈＣＭＶ ｇＬポリペプチドが、配列番号６１で同定されるアミノ酸配列を含む、
    （ｉｉｉ）ｈＣＭＶ ＵＬ１２８ポリペプチドが、配列番号６３で同定されるアミノ酸配列を含む、
    （ｉｖ）ｈＣＭＶ ＵＬ１３０ポリペプチドが、配列番号６５で同定されるアミノ酸配列を含む、
    （ｖ）ｈＣＭＶ ＵＬ１３１Ａポリペプチドが、配列番号６７で同定されるアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｖｉ）ｈＣＭＶ ｇＢタンパク質が、配列番号６９で同定されるアミノ酸配列を含む、
    請求項９に記載のｈＣＭＶワクチン。
  11. 少なくとも１つの（ａ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１０８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、
    少なくとも１つの（ｂ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１０９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、
    少なくとも１つの（ｃ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１１０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、
    少なくとも１つの（ｄ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号９３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、
    少なくとも１つの（ｅ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１１２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、および／または
    少なくとも１つの（ｆ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号８３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む、
    請求項１に記載のｈＣＭＶワクチン。
  12. （ａ）配列番号１０８内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するＯＲＦを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号１０９内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するＯＲＦを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号１１０内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するＯＲＦを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号９３内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するＯＲＦを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号１１２内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するＯＲＦを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、および
    （ｆ）配列番号８３内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対応するＯＲＦを含む、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド、
    を含み、２０〜６０％のイオン化可能なカチオン性脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を有する少なくとも１つの脂質ナノ粒子中で製剤化され、前記ｍＲＮＡポリヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）は自己複製ＲＮＡでない、ｈＣＭＶワクチン。
  13. 少なくとも１つの（ａ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１０８の４６〜２４３７ヌクレオチドを含む、
    少なくとも１つの（ｂ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１０９の４６〜１０４５ヌクレオチドを含む、
    少なくとも１つの（ｃ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１１０の４６〜７２４ヌクレオチドを含む、
    少なくとも１つの（ｄ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号９３の４６〜８５３ヌクレオチドを含む、
    少なくとも１つの（ｅ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１１２の４６〜５９８ヌクレオチドを含む、および／または
    少なくとも１つの（ｆ）のｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号８３の４６〜２９３２ヌクレオチドを含む、
    請求項１２に記載のｈＣＭＶワクチン。
  14. 各ｍＲＮＡポリヌクレオチドがポリＡ尾部を含み、任意で各ポリＡ尾部が約１００ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のｈＣＭＶワクチン。
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