CN106102769A - 人疱疹病毒三聚糖蛋白B、包含三聚gB的蛋白复合体及其作为疫苗的用途 - Google Patents

人疱疹病毒三聚糖蛋白B、包含三聚gB的蛋白复合体及其作为疫苗的用途 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供修饰的人疱疹病毒糖蛋白B(gB)蛋白，其掺入独特的用于产生模拟其天然构象的蛋白以增强其免疫原性的独特机制。所述修饰的疱疹病毒gB蛋白在疱疹病毒gB的胞外结构域中的弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头。当表达时，所述gB亚基三重关联以产生同源三聚复合体，模拟gb蛋白的天然构象。还提供包含修饰的疱疹病毒gB蛋白的同源三聚复合体与疱疹病毒gH和gL蛋白的蛋白复合体。还提供编码所述修饰的疱疹病毒gB蛋白的核酸、通过给予包含修饰的疱疹病毒gB蛋白或编码修饰的疱疹病毒gB蛋白的核酸或含有修饰的疱疹病毒gB蛋白的同源三聚复合体与疱疹病毒gH和gL蛋白的蛋白复合体的疫苗诱导或抑制受试者中的免疫应答的方法。

Description

人疱疹病毒三聚糖蛋白B、包含三聚gB的蛋白复合体及其作为 疫苗的用途
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年12月11日提交的美国临时专利申请号61/914,903的权益，并依赖其提交日期，所述临时专利申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
政府利益
本发明部分上在来自健康服务统一服务大学(Uniformed Services University ofthe Health Services) (USUHS Dean研究和教育捐助)的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定的权利。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交并因此通过引用以其整体结合的序列表。所述ASCII拷贝创建于2014年12月11日，命名为HMJ-143-PCT_SL.txt，103,345字节大。
发明背景
人巨细胞病毒(HCMV)是一种无所不在的病原体，在免疫受损宿主中引起严重疾病。在发达世界HCMV为最常见的子宫内获得的病毒感染，并且为新生儿先天性缺陷的主要原因。在美国和欧洲据估计所有活产婴儿的0.2%-1.2%感染HCMV。先天性的HCMV感染为儿童感觉神经听觉丧失的主要原因，并且为儿童中枢神经系统损伤的主要感染性原因。
除了新生婴儿，该病毒还可在免疫抑制患者，例如器官移植受体和HIV-阳性个体中引起严重疾病。HCMV在这些患者中可成为机会病原体并引起具有高发病率和死亡率的严重疾病。
HCMV为疱疹病毒科家族的有包膜的、双链DNA β-疱疹病毒。疱疹病毒科家族的糖蛋白B (gB)为具有融合-活性形式的共享三聚结构和融合后发夹三聚体的III型融合蛋白。HCMV gB由UL55基因编码并在受感染细胞中作为906-氨基酸前体分子合成。氨基-端信号序列将新生多肽引导至内质网(ER)，在此处gB折叠并迅速缔合为由相同的分子形成的二硫键-依赖性大分子复合体。从ER转运之后，HCMV gB进入高尔基体，在此处其经受糖基化并通过由宿主枯草杆菌蛋白酶样酶，弗林蛋白酶，蛋白质水解为氨基端和羧基端片段，分别为gp115和gp55，而加工。gB-gp 115和-gp55的单体形式的这两个片段通过分子内二硫键维持在一起。成熟产物然后被递送至受感染细胞的表面，在这里其在内体小泡和质膜之间再循环并最终掺入病毒体中。近来，基于相关病毒中的gB蛋白，单纯疱疹病毒1 (HSV-1) gB和埃巴病毒（Epstein Barr virus）(EBV) gB (其为同源三聚体(29-32))的3D晶体学结构，天然HCMV gB被假定为同源三聚体。正在开发多种疫苗，包括减毒活疫苗和亚单位疫苗，以靶向HCMV-相关疾病。例如，基于gB在介导病毒-宿主细胞融合以及因此病毒进入中的关键作用认为gB是一个主要的用于诱发中和抗体的疫苗靶抗原。事实上人血清中显著部分的中和抗体对gB表位特异。为了努力开发有效疫苗用于预防HCMV感染，其他人已经尝试利用该针对gB的体液反应。例如，重组gB蛋白描述于Spaete等人, A recombinant subunit vaccine approach to HCMV vaccine development (开发HCMV疫苗的重组亚单位疫苗方法),Transplantation Proceedings, Vol 23, No 3, Suppl 3 (June), 1991: pp 90-96和WO2012/049317中，其藉此通过引用以其整体结合。基于对以类似方式制备的gB蛋白的分析，认为该重组gB蛋白由大部分二聚的gB和较少量单体和三聚gB构成。该重组gB蛋白通过在弗林蛋白酶切割位点突变编码gB的基因致使该位点无效并删除跨膜结构域因此留下胞外和胞内结构域而产生。
基于该重组gB蛋白的疫苗被用在2期临床试验中。Pass等人，Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection (母源巨细胞病毒感染的疫苗预防), N EnglJ Med 2009; 360:1191-1199。在HCMV-血清阴性妇女给予生育后的1年内，在第0、1和6月给予HCMV-血清阴性妇女三剂量的HCMV疫苗或安慰剂。使用抗除糖蛋白之外的HCMV蛋白的IgG抗体的测定，在42-月的时间内按季检验（in quarterly test）确定妇女中的HCMV感染。感染通过病毒培养或免疫印迹确认。初级终点为直至检出HCMV感染的时间。234名受试者随机分配接受HCMV疫苗，230名受试者接受安慰剂。最少1年的随访(follow-up)后，49名确认感染，疫苗组18名，安慰剂组31名。Kaplan-Meier分析显示在42-月时间内疫苗组比安慰剂组更可能保持未感染(P=0.02)。基于每100人-年的感染率疫苗功效为50% (95%置信区间，7比73（7 to 73）)。在疫苗组受试者的婴儿之中发生一例先天性感染，在安慰剂组发生三例感染。
然而，没有用于预防HCMV的疫苗候选进入III期临床试验。尽管HCMV感染期间gB的天然构象经预测为三聚体，尚未有报道成功产生重组三聚gB。
同样，埃巴病毒(EBV)，也称为人疱疹病毒4，为一种主要的全球性的发病率和死亡率源，其为在免疫抑制患者中造成诸如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金疾病的一个亚类和淋巴细胞增生综合征等病理实体的原因。EBV为感染B细胞和上皮细胞的γ-疱疹病毒，其具有双链线性DNA基因组。开发用以靶向EBV感染的疫苗已经聚焦于糖蛋白350 (gp350) (E.M. Sokal等人, J. Infect. Dis. 196: 1749 (2007))；然而，没有用于预防EBV的疫苗候选曾靶向EBV gB，其天然构象在EBV感染期间显示为三聚体。(Backovic M, Longnecker R, Jardetzky TS. 2009. Structure of a trimericvariant of the Epstein-Barr virus glycoprotein B (埃巴病毒糖蛋白B的三聚变体的结构). Proc Natl Acad Sci U S A 106: 2880-5.)
发明概述
本公开内容提供新的和改善的用于增强对疱疹病毒感染的免疫应答的策略。这些改善的策略涉及通过在疱疹病毒gB多肽胞外结构域中的弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头而创建修饰的疱疹病毒gB。插入肽接头除去弗林蛋白酶识别序列，以致修饰的疱疹病毒gB的表达导致产生提供增强的免疫原性的同源三聚gB复合体。不意在受任何理论束缚，认为这样的接头序列可允许修饰的疱疹病毒gB多肽经受天然构象折叠并形成同源三聚体。
另一个方面为编码所述修饰的疱疹病毒gB多肽的重组核酸，和使用该重组核酸在细胞中表达修饰的疱疹病毒gB多肽的方法。又一个方面涉及通过给予受试者包含修饰的疱疹病毒gB多肽或编码该多肽的核酸的疫苗组合物在受试者中诱导免疫应答的方法，其中疱疹病毒gB多肽在受试者中诱导免疫应答。所述疫苗组合物可任选包含其它疱疹病毒抗原，包括但不限于一种或多种糖蛋白H (gH)、糖蛋白L (gL)、糖蛋白350 (gp350)、UL128、UL130、UL131或其组合。
另一个方面涉及包含疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、疱疹病毒gH糖蛋白和疱疹病毒gL糖蛋白的蛋白复合体，其中所述疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体包括三个修饰的疱疹病毒gB多肽的三聚体。在某些实施方案中，所述疱疹病毒gH和gL糖蛋白包括疱疹病毒gH/gL融合蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白复合体进一步包含一种或多种疱疹病毒UL128、UL130或UL131多肽。
还提供制造蛋白复合体的方法，包括体外孵育第一种蛋白和至少第二种蛋白以形成蛋白复合体。在一个实施方案中，所述制造蛋白复合体的方法包括体外孵育疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、疱疹病毒gH糖蛋白和疱疹病毒gL糖蛋白（其中疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体包括三个修饰的疱疹病毒gB多肽的三聚体），和形成蛋白复合体。在某些实施方案中，疱疹病毒gH和gL糖蛋白包括疱疹病毒gH/gL融合蛋白。在某些实施方案中，所述方法进一步包括孵育一种或多种疱疹病毒UL128、UL130或UL131多肽。因此，在某些实施方案中，所述方法包括孵育修饰的疱疹病毒gB蛋白的同源三聚复合体、疱疹病毒gH/gL融合蛋白，和任选地疱疹病毒UL128、疱疹病毒UL130和疱疹病毒UL131多肽。
还提供通过给予受试者包含疱疹病毒蛋白复合体的疫苗组合物在受试者中诱导免疫应答的方法，其中疱疹病毒蛋白复合体在受试者中诱导免疫应答。所述疱疹病毒蛋白复合体包含疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、疱疹病毒gH糖蛋白和疱疹病毒gL糖蛋白，其中所述疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体包括三个修饰的疱疹病毒gB多肽的三聚体。在某些实施方案中，疱疹病毒gH和gL糖蛋白包括疱疹病毒gH/gL融合蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白复合体进一步包含一种或多种疱疹病毒UL128、UL130或UL131多肽。因此，在某些实施方案中，所述蛋白复合体包含修饰的疱疹病毒gB蛋白的同源三聚复合体、疱疹病毒gH/gL融合蛋白和任选地疱疹病毒UL128、疱疹病毒UL130和疱疹病毒UL131A多肽。
附图简述
并入和组成本说明书的一部分的附图说明某些实施方案，并与书面描述一起，用于解释本文所公开的构想（construct）和方法的某些原理。
图1A显示使用抗-His单克隆抗体在完全还原条件下的HCMV gB的蛋白质印迹分析。
图1B显示使用抗-His单克隆抗体在部分还原条件下的HCMV gB的蛋白质印迹分析。
图2A显示使用抗-HCMV gB单克隆抗体在修饰的天然条件下的蛋白质印迹。
图2B显示使用抗-HCMV gB单克隆抗体在还原条件下的蛋白质印迹。
图3描绘野生型HCMV gB与本公开内容的修饰的HCMV gB之间的差异示意图。
图4显示本公开内容的修饰的HCMV gB (“三聚体”)比非三聚的对照HCMV gB(“Sino”)明显更具免疫原性，所述非三聚的对照HCMV gB基本上与Pass等人, Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection (母源巨细胞病毒感染的疫苗预防), N Engl J Med 2009; 360:1191-1199在II期临床试验中使用的相同。修饰的HCMV gB与对照蛋白之间的显著性，学生-检验（Student-t test）的p< 0.05。
图5显示第0、21和42天时用三聚HCMV gB免疫的兔中HCMV gB-特异性IgG的血清滴度。
图6A-B显示使用MRC-5成纤维细胞(A)和ARPE-19上皮细胞(B)的来自用三聚HCMVgB免疫的兔的血清对活HCMV的体外中和活性。来自CMV-免疫患者的人血清用作阳性对照(“人血清”)。
图7A显示使用抗-His单克隆抗体在还原条件下的三聚EBV gB的蛋白质印迹分析。
图7B-C显示使用抗-His单克隆抗体(B)或抗-EBV gB抗体(C)在非还原条件下的三聚EBV gB的蛋白质印迹分析。
图8描绘野生型EBV gB与本公开内容的修饰的EBV gB之间的差异示意图。
图9A-B显示使用抗-His单克隆抗体(A)或抗-HCMV gH抗体(B)在还原条件下的HCMV gH/gL异源二聚体的蛋白质印迹分析。
图10显示在非还原条件下的HCMV gB/gH/gL蛋白复合体的蛋白质印迹分析。
发明详述
应理解的是下列详述为了给予读者对本发明方面的某些实施方案、特征和细节的更全面理解而提供，不应解释为对本发明范围的限制。
定义 为了使本发明更易理解，首先定义某些术语。额外的定义贯穿详述阐明。
术语“肽接头”指连接两个蛋白或蛋白的片段的短的非天然肽序列。
术语“疱疹病毒gH/gL融合蛋白”指包含疱疹病毒gH蛋白与疱疹病毒gL蛋白连接的重组融合蛋白。可用连接肽将疱疹病毒gH蛋白与疱疹病毒gL蛋白连接。
术语“修饰的胞外结构域”指经工程改造使得氨基酸序列不是天然氨基酸序列的人疱疹病毒糖蛋白B的胞外结构域。如本文所使用的，人疱疹病毒糖蛋白B的胞外结构域通过在弗林蛋白酶切割位点插入肽接头修饰，有效地除去弗林蛋白酶识别序列。这样的人疱疹病毒的实例包括，但不限于，CMV (巨细胞病毒)、HSV-1 (单纯疱疹病毒-1)、HSV-2 (单纯疱疹病毒-2)、VZV (水痘-带状疱疹病毒)、EBV (埃巴病毒)和HSHV (卡波西肉瘤-相关疱疹病毒)。
术语“修饰的疱疹病毒gB”和“修饰的疱疹病毒gB多肽”可交换地使用，指包含修饰的胞外结构域的人疱疹病毒糖蛋白B多肽。
术语“修饰的HCMV gB”和“修饰的HCMV gB多肽”可交换地使用，指包含修饰的胞外结构域的人CMV糖蛋白B多肽。
术语“修饰的EBV gB”和“修饰的EBV gB多肽”可交换地使用，指包含修饰的胞外结构域的人埃巴病毒糖蛋白B多肽。
术语“前导序列”指引导重组蛋白被细胞分泌的重组蛋白N-端的短肽序列。
术语“同源三聚体”、“同源三聚体复合体”和“同源三聚复合体”可交换地使用，指三个多肽，例如三个修饰的疱疹病毒或HCMV gB多肽的缔合。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意指与药事管理（pharmaceutical administration）相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和剂用于药学活性物质的用途为本领域所熟知。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂不是天然存在的。
当用在多肽或核酸的语境中时，术语“分离的”是指基本上摆脱其天然环境的并因此可与可能天然存在的(that might happen to occur naturelly)多肽或核酸区分的多肽或核酸。例如，分离的多肽或核酸基本上不含细胞材料或来自衍生所述分离的多肽或核酸的细胞或组织源的其它多肽或核酸。该术语还指其中分离的多肽或核酸纯到足以用于药物组合物的制备物；或至少70-80% (w/w)纯；或至少80-90% (w/w)纯；或至少90-95。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换地使用，指氨基酸的聚合物。
当用在核酸的语境中时术语“重组”意指具有非天然连接在一起的核苷酸序列的核酸并且可通过人工组合两个以其它方式分隔开的序列区段制成。该人工组合常常通过化学合成或，更通常地，通过人工操作分离的核酸区段，例如经由基因工程技术完成。重组核酸包括包含扩增的或组装的核酸的核酸载体，其可用于转化或转染合适的宿主细胞。包含重组核酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后在重组宿主细胞中表达基因以产生“重组多肽”。重组核酸还可提供非编码功能(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
与Pass等人, Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection(母源巨细胞病毒感染的疫苗预防), N Engl J Med 2009; 360:1191-1199先前检验的非-三聚gB相比，同源三聚疱疹病毒gB，由于其多聚形式以及通过同源三聚疱疹病毒gB可能表达独特构象的中和表位，很可能诱发更高的总gB-特异性IgG应答和更多样化的对抗疱疹病毒的中和抗体。因此，需要新的和改善的用于增强免疫应答的构建体，特别是可用于增强响应疱疹病毒感染的免疫应答的疱疹病毒gB构建体，其包括但不限于HCMV gB构建体。
修饰的疱疹病毒/HCMV gB 编码野生型HCMV gB的核酸序列在SEQ ID NO: 1中列出。野生型HCMV gB的多肽序列在SEQ ID NO: 2中列出。野生型HCMV gB作为906个氨基酸的前体蛋白表达。最初的22个氨基酸包含天然信号肽，其将前体蛋白送至内质网(ER)加工。当蛋白在ER中折叠时天然信号肽被切去。野生型HCMV gB的多肽序列由胞外结构域(SEQ IDNO: 1的氨基酸23-750)、跨膜结构域和胞内结构域(一起，SEQ ID NO: 1的氨基酸751-906)组成。
从ER转运之后，HCMV gB进入高尔基体，在此处其经受糖基化并被宿主酶，弗林蛋白酶，在胞外结构域中于SEQ ID NO: 1的氨基酸460-461处切割。该蛋白水解加工产生两个多肽片段，gp116和gp55。这两个片段通过二硫键保持共价缔合以形成gB亚基。认为三个HCMV gB亚基缔合以创建介导病毒-宿主细胞融合的同源三聚体复合体(29-32)。
本公开内容涉及用于产生修饰的疱疹病毒gB多肽的新策略。本公开内容描述用于产生修饰的HCMV gB多肽的策略；然而，应理解该策略不限于HCMV并且可跨人疱疹病毒广泛应用，所述人疱疹病毒共享在胞外结构域中包含弗林蛋白酶切割位点的同源gB结构。这样的人疱疹病毒的实例包括，但不限于，CMV、HSV-1 (单纯疱疹病毒-1)、HSV-2 (单纯疱疹病毒-2)、VZV (水痘-带状疱疹病毒)、EBV (埃巴病毒)和HSHV (卡波西肉瘤-相关疱疹病毒)。CMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV的gB多肽的核苷酸和氨基酸序列为已知的。
所述策略涉及创建用于在疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV)gB的胞外结构域中的弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头的核酸构建体以使得编码的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB形成三重缔合的亚基以产生gB三聚复合体。令人惊讶地，根据本公开内容产生的修饰的HCMV gB多肽均一且一致地（uniformlyand consistently）形成同源三聚复合体。不受理论限制，认为突变HCMV gB中的弗林蛋白酶切割位点以便致使所述位点无效，如先前所实施 (参见Spaete等人)，限制HCMV gp116和gp55片段的移动，从而干扰该片段形成同源三聚复合体的能力。这可解释先前所描述的重组HCMV gB蛋白不能折叠为同源三聚体。另一方面，用肽接头替代弗林蛋白酶切割位点允许gB多肽形成三聚复合体，所述三聚复合物与认为在细胞中天然形成的同源三聚体类似。
在某些实施方案中，本公开内容的修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB多肽包含修饰的野生型疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB的胞外结构域并且不包含野生型疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB的跨膜结构域或胞内结构域。修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB一般保留相应天然疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB的一个或多个特征，例如介导病毒-宿主细胞融合的能力，或诱发能够识别天然疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB的抗体(包括，但不限于，病毒中和抗体)的能力。可利用常规方法学评估修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV) gB的一个或多个特征。
举例来说，而非限制，所述多核苷酸序列可包含编码非天然疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和 HSHV) gB前导序列的前导序列(例如，对于修饰的HCMV gB多肽所述前导序列不是SEQ ID NO: 1的氨基酸1-22)的核酸。在其它实施方案中，所述多核苷酸序列包含编码含有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸。在进一步的实施方案中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3，其含有编码IgG κ前导序列的核苷酸。在一个实施方案中，所述IgG κ前导序列具有氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO: 6)。
在一个方面，修饰的HCMV gB用核酸构建体创建，所述核苷酸构建体编码野生型HCMV gB的胞外结构域(SEQ ID NO: 1的氨基酸23-750)但用肽接头，例如((Gly4Ser)3 (SEQID NO: 5))替代弗林蛋白酶切割序列(SEQ ID NO: 1的氨基酸457-461)。编码修饰的HCMVgB的核酸序列在SEQ ID NO: 3中列出。修饰的HCMV gB的多肽序列在SEQ ID NO: 4中列出。在一个实施方案中，修饰的HCMV gB仅包含胞外结构域，其包括以肽接头连接在一起的gp116和gp55片段。与通过现有技术方法产生的传统非-三聚HCMV gB蛋白相比，当表达时该修饰的HCMV gB构建体均一地形成同源三聚复合体。该用于创建修饰的HCMV gB的策略可用如下描述的不同长度和组成的其它肽接头来开发。该用于创建修饰的HCMV gB的策略可导致其中修饰的HCMV gB包含至少70%，例如至少75%、80%、85%或90%同源三聚体的组合物。
在另一个方面，所述修饰的HCMV gB可以在不缺失弗林蛋白酶识别序列RTKRS(SEQ ID NO: 19)的任何氨基酸残基的情况下在氨基酸残基460与461之间的弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头而创建。在又一个方面，在弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头可与缺失弗林蛋白酶识别序列RTKRS (SEQ ID NO: 19)的1、2、3、4或5个氨基酸残基相结合。
在进一步的方面，所述修饰的HCMV gB可在肽接头的氨基末端包含野生型HCMV gB的氨基酸残基23-460的部分序列，并在肽接头的羧基末端包含野生型HCMV gB的氨基酸残基461-750的部分序列。
在缺失或不缺失部分或全部酶识别序列的情况下，用于在蛋白内的切割位点插入肽接头，以实现正确的蛋白折叠的所述策略可以用除疱疹病毒糖蛋白B之外的蛋白来开发，所述蛋白包括其它病毒、细菌、寄生虫、自身免疫和肿瘤抗原蛋白。因此，一个方面涉及包含破坏野生形式的多肽中存在的酶切割序列，例如弗林蛋白酶切割序列的肽接头的重组多肽。该平台可用于创建当在宿主细胞中表达时在不经酶切割的情况下取得正确天然折叠模式的重组多聚蛋白。例如，通过在对多聚体形成负有责任的切割位点插入肽接头可创建同源或异源二聚体、同源或异源三聚体或四聚体。编码的蛋白构建体将在不被宿主细胞酶切割的情况下形成适当的自然存在的多聚体。在一个方面，考虑编码修饰的蛋白的重组核酸，和使用该重组核酸在细胞中表达修饰的蛋白的方法。在又一个方面，考虑通过给予受试者包含修饰的蛋白或编码该修饰的蛋白的核酸的疫苗组合物在受试者中诱导免疫应答的方法，其中所述修饰的蛋白在受试者中诱导免疫应答。
修饰的EBV gB
编码野生型EBV gB的核酸序列在SEQ ID NO: 7中列出。野生型EBV gB的多肽序列在SEQ ID NO: 8中列出。与HCMV gB同样，gB的蛋白水解加工产生两个区段，其通过二硫键保持共价缔合以形成gB亚基。
在一个方面，修饰的EBV gB包括核酸构建体，其编码野生型EBV gB的胞外结构域(SEQ ID NO: 8的氨基酸23-732)但用肽接头，例如((Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 5))替换弗林蛋白酶切割序列(SEQ ID NO: 8的氨基酸429-433)。编码修饰的EBV gB的核酸序列在SEQID NO: 9中列出。修饰的EBV gB的多肽序列在SEQ ID NO: 10中列出。在一个实施方案中，修饰的EBV gB仅包含胞外结构域，其包括以肽接头连接在一起的两个片段。当表达时该修饰的EBV gB构建体将会均一地形成同源三聚复合体。用于创建修饰的EBV gB的所述策略可用如下所述的不同长度和组成的其它肽接头开发。用于创建修饰的EBV gB的所述策略可导致其中修饰的EBV gB包含至少70%，例如至少75%、80%、85%或90%同源三聚体的组合物。
在另一个方面，所述修饰的EBV gB可以在不缺失弗林蛋白酶识别序列RRRRD (SEQID NO: 20)的任何氨基酸残基的情况下在氨基酸残基432与433之间的弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头而创建。在又一个方面，在弗林蛋白酶切割位点处插入肽接头可与缺失弗林蛋白酶识别序列RRRRD (SEQ ID NO: 20)的1、2、3、4或5个氨基酸残基相结合。
在进一步的方面，所述修饰的EBV gB可在肽接头的氨基末端包含野生型EBV gB的氨基酸残基23-432的部分序列，并在肽接头的羧基末端包含野生型EBV gB的氨基酸残基433-732的部分序列。
肽接头序列 在修饰的疱疹病毒gB多肽(例如，HCMV gB、HSV-1 gB、HSV-2 gB、VZVgB、EBV gB或HSHV gB)中，接头序列在弗林蛋白酶切割位点处插入。例如，当野生型HCMV gB被弗林蛋白酶酶切割时天然形成的gp116和gp55片段在本发明修饰的HCMV gB中通过肽接头连接。应理解所述肽接头为天然蛋白序列中天然不存在的非天然序列。
在一个实施方案中，所述接头序列为具有5-70个氨基酸，特别地6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个氨基酸长的多肽。在另一个实施方案中，所述接头序列为具有10-25个氨基酸的多肽。接头序列优选包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸。在一个实施方案中，接头序列15个氨基酸长并且具有氨基酸序列(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:5)。
其它适合的肽接头为美国专利号4,751,180、4,935,233和5,073,627中描述的那些，所述专利的每一借此通过引用以其整体结合。编码期需接头序列的DNA序列可代替，例如，编码天然弗林蛋白酶切割位点(例如，在HCMV中RTKRS (SEQ ID NO: 19)或在EBV中RRRRD (SEQ ID NO: 20))的一个或多个氨基酸的DNA序列，并在所述DNA序列的相同阅读框中，使用本领域已知的常规技术插入。例如，可在待插入的全长多核苷酸序列中在编码天然弗林蛋白酶切割位点的序列处连接化学合成的编码接头的寡核苷酸。
蛋白复合体 本公开内容还提供包含疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、疱疹病毒gH糖蛋白和疱疹病毒gL糖蛋白的蛋白复合体，其中疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体包括三个修饰的疱疹病毒gB多肽的三聚体。在某些实施方案中，疱疹病毒gH和gL糖蛋白为疱疹病毒gH/gL融合蛋白的一部分。在其它实施方案中，所述蛋白复合体进一步包含疱疹病毒UL128、UL130或UL131多肽中的一种或多种。还提供包含蛋白复合体和药学上可接受的载体和/或佐剂的疫苗组合物。
蛋白复合体中的蛋白通过非共价蛋白-蛋白相互作用连接，包括但不限于氢键和盐桥。所述蛋白复合体具有与个体蛋白装配和相互作用所引起的排列或形状对应的四级结构，因此可用于诱导针对gB/gH/gL蛋白复合体上的构象表位的中和抗体。如本文所使用的，蛋白复合体不指如疱疹病毒表面上所存在的天然蛋白复合体。相反，蛋白复合体通过体外孵育个体蛋白形成，以创建重建的蛋白复合体。尚无报道证明这些疱疹病毒蛋白，以其天然构象，在体外共孵育时组装为天然复合体。
本公开内容描述用于产生如上所讨论的疱疹病毒gB/gH/gL蛋白复合体的策略，其可应用于任何人疱疹病毒，包括，但不限于，CMV、HSV-1 (单纯疱疹病毒-1)、HSV-2 (单纯疱疹病毒-2)、VZV (水痘-带状疱疹病毒)、EBV (埃巴病毒)和HSHV (卡波西肉瘤-相关疱疹病毒)。CMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV的gB、gH和gL多肽的核苷酸和氨基酸序列为已知的。
核酸，克隆和表达系统 本公开内容进一步提供编码所公开的修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB多肽的分离核酸。所述核酸可包括DNA或RNA并且可为完全或部分合成或重组的。如本文所列出的对核苷酸序列的提及包括具有特定序列的DNA分子，并包括具有其中U取代T的特定序列的RNA分子，除非上下文另有需要。
本公开内容还提供包含至少一个编码修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB的核酸的质粒、载体、噬菌粒、转录或表达盒形式的构建体。本公开内容进一步提供包含一种或多种如上的构建体的宿主细胞。
还提供制造这些核酸所编码的修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB多肽的方法。修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV)gB蛋白可使用重组技术产生。重组蛋白的产生和表达为本领域所熟知并且可使用常规程序进行，例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册) (第4版，2012), Cold Spring Harbor Press中公开的那些。例如，修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的表达可通过在适当条件下培养包含编码疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或 HSHV) gB蛋白的核酸的重组宿主细胞达成。通过表达产生之后修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白可使用任何适当的技术分离和/或纯化，然后适当使用。
用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统为本领域所熟知。与本申请中所公开的构建体相容的任何蛋白表达系统均可用于产生修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白。
可选择或构建合适的载体，以致其包含适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷化序列、增强子序列、标志基因和其它适当的序列。
本公开内容的进一步的方面提供包含如本文所公开的核酸的宿主细胞。又进一步的方面提供包括将这样的核酸引入宿主细胞中的方法。引入可利用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用反转录病毒或其它病毒例如，牛痘，或对于昆虫细胞，杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。这些技术为本领域所熟知。参见例如， Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学中的通用方案), Ausubel等人编辑, John Wiley & Sons (2010)。在引入DNA之后可接着选择方法(例如，抗生素抗性)以选择包含载体的细胞。
疫苗组合物 本申请中所描述的修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB多肽和编码其的核酸以及疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB/gH/gL蛋白复合体为开发在受试者中取得增强的免疫原性的疫苗提供了改善的平台。与先前公开的非-三聚gB相比，由于其多聚形式以及通过三聚gB可能表达独特构象的中和表位，修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB的同源三聚复合体或包含修饰的疱疹病毒gB的同源三聚复合体的蛋白复合体很可能诱发更高的总gB-特异性IgG应答和更多样化的对抗HCMV的中和抗体。因此，一个实施方案涉及包含编码修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的核酸和至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。另一个实施方案涉及包含修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的同源三聚复合体、至少一种药学上可接受的赋形剂和任选佐剂的组合物。又一个实施方案涉及包含蛋白复合体的组合物，其中所述蛋白复合体包含修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的同源三聚复合体、疱疹病毒gH/gL融合蛋白、至少一种药学上可接受的赋形剂，和任选佐剂。这些组合物统称为“疫苗组合物”。在某些实施方案中，所述疫苗组合物不包含佐剂。
药学上可接受的赋形剂可选自，例如，稀释剂例如淀粉、微晶纤维素、磷酸二钙、乳糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、甲基糊精；粘合剂例如聚维酮（povidone）、羟丙基甲基纤维素、二羟基丙基纤维素和羧甲基纤维素钠；和崩解剂例如交聚维酮、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲纤维素钠，和前述任何的混合物。药学上可接受的赋形剂可进一步选自润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、甘油富马酸酯(glycerine fumerate)和助流剂例如胶体二氧化硅，及其混合物。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂选自微晶纤维素、淀粉、滑石、聚维酮、交聚维酮、硬脂酸镁、胶体二氧化硅、十二烷基硫酸钠和前述任何的混合物。赋形剂可为晶内的、晶间的或其混合物。
所述疫苗组合物可根据本领域的任何适合方法配制为冷冻干燥的或液体的制备物。液体形式制备物的非限制性实例包括溶液、悬液、糖浆、膏剂（slurries）或乳剂。合适的液体载体包括任何合适的有机或无机溶剂，例如，水、醇、盐溶液、缓冲盐溶液、生理盐溶液、右旋糖溶液、水丙二醇溶液等，优选以无菌形式。配制后，可将疫苗组合物纳入无菌容器，然后密封并低温(例如，4℃)储存，或可将其冷冻干燥。
疫苗组合物可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与活性多肽的游离氨基形成的)并且其为与无机酸，例如，盐酸或磷酸，或有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。从游离羧基形成的盐也可从无机碱，例如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等有机碱衍生。
所述疫苗组合物可任选包含增强疫苗的保护功效的剂，例如佐剂。佐剂包括起作用以增加对修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白、包含其的同源三聚复合体或包含同源三聚体复合体的蛋白复合体的免疫应答的任何一种或多种化合物，从而减少疫苗中必需的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB (或编码其的核酸)的量，和/或产生保护性免疫应答所必需的给予频率。佐剂可包括例如，乳化剂、胞壁酰二肽、阿夫立定、水性佐剂例如氢氧化铝、基于壳聚糖的佐剂和各种皂苷中的任一种，油类以及本领域已知的其它物质，例如，爱菲金（Amphigen）、LPS、细菌细胞壁提取物、细菌DNA、CpG序列、合成的寡核苷酸及其组合(Schijns等人(2000) Curr. Opin. Immunol.12:456)、Mycobacterialphlei (M. phlei)细胞壁提取物(MCWE) (美国专利号4,744,984)、M. phlei DNA (M-DNA)和M. phlei细胞壁复合体(MCC)。可用作乳化剂的化合物包括天然和合成的乳化剂，以及阴离子、阳离子和非离子化合物。在合成的化合物之中，阴离子乳化剂包括，例如，月桂酸和油酸的钾、钠和铵盐，脂肪酸的钙、镁和铝盐，和有机磺酸盐例如十二烷基硫酸钠。合成的阳离子剂包括，例如，十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrhethylammonlun bromide），而合成的非离子剂通过甘油酯(例如单硬脂酸甘油酯)、聚氧乙烯甘油酯和醚以及山梨醇脂肪酸酯(例如，山梨醇单棕榈酸酯)及其聚氧乙烯衍生物(例如，聚氧乙烯山梨醇单棕榈酸酯)例示。天然乳化剂包括阿拉伯树胶、明胶、卵磷脂和胆固醇。
其它合适的佐剂可用油组分形成，所述油组分例如单一油、油混合物、油包水乳剂或水包油乳剂。所述油可为矿物油、植物油或动物油。矿物油为从矿脂经由蒸馏技术获得的液体烃类，并且在本领域也称为液体石蜡、液体矿脂或白矿物油。合适的动物油包括，例如，鳕鱼肝油、大比目鱼油、鲱鱼油、橘棘鲷(orange roughy)油和鲨鱼肝油，其所有均市售可得。合适的植物油包括，例如，低芥菜籽油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油等。弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)为疫苗制备物中普遍使用的两种常见佐剂，并且也适合用于本发明中。FCA和FIA二者均为矿物油包水乳剂；然而，FCA还包含杀死的分枝杆菌属(Mycobacterium sp)。
所述疫苗组合物中还可使用免疫调节细胞因子以增强疫苗功效，例如，作为佐剂。这样的细胞因子的非限制实例包括干扰素α (IFN-α)、白细胞介素-2 (IL-2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其组合。
所述疫苗组合物可任选进一步包含来自疱疹病毒的其它抗原以进一步增强疫苗的保护功效。在一个实施方案中，额外的疱疹病毒抗原衍生自与修饰的gB蛋白相同的病毒物种。例如，如果疫苗组合物包含修饰的HCMV gB蛋白，那么额外的抗原也为HCMV抗原。在另一个非限制性实例中，如果疫苗组合物包含修饰的EBV gB蛋白，那么额外的抗原也为EBV抗原。这样的疱疹病毒抗原的非限制性实例包括糖蛋白H (gH)、糖蛋白L (gL)、糖蛋白350(gp350)、UL128、UL130、UL131或其组合。这些疱疹病毒抗原的核酸和氨基酸序列为已知的。
所述非限制性的其它抗原的任一种均可根据PCT/US2013/052270多聚化，所述专利通过引用以其整体结合到本文中。在一个实施方案中，所述疫苗组合物可包含至少一种、两种、三种、四种或至多五种其它抗原。在另一个实施方案中，这些抗原的每一均可多聚化以创建包含单一目的抗原的多个拷贝的多聚融合蛋白(例如，使用相同抗原的两个、三个或四个拷贝的同源二聚体、同源三聚体或四聚体)，或以创建包含两个或多个不同目的抗原的多聚融合蛋白(例如，异源二聚体、异源三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或八聚体)。优选地，如果疫苗组合物包含HCMV gB的同源三聚复合体，那么该疫苗组合物还包含HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131的五聚复合体或具有或不具有UL128/UL130/UL131的HCMV gH/gL融合蛋白。还优选，如果疫苗组合物包含EBV gB的同源三聚复合体，那么该疫苗组合物还包含EBV gp350的四聚体和EBV gH/gL融合蛋白的单体。
在某些实施方案中，如本文所描述的，疱疹病毒gH/gL融合蛋白包含连接gH蛋白与gL蛋白的肽接头序列。在某些实施方案中，疱疹病毒gH和gL蛋白来自选自HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和HSHV的疱疹病毒。这些疱疹病毒gH和gL蛋白的氨基酸序列为已知的。在一个实施方案中，HCMV gH/gL融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 25的序列。
疫苗组合物可使用本领域技术人员所熟知的技术制备，包括，但不限于，混合、超声处理和微流体化(microfluidation)。佐剂可构成疫苗组合物的约10%-约80% (v/v)，更优选约20%-约50% (v/v)，并且更优选约20%-约30% (v/v)，或这些范围内的任何整数。
所述疫苗组合物可给予任何动物，并且优选为哺乳动物例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴子、奶牛、马、猪等。最优选人。
疫苗组合物可通过输注或注射(例如，静脉内、肌内、皮内、皮下、鞘内、十二指肠内、腹膜内等)给予。疫苗组合物也可鼻内、阴道、经直肠、口服、扁桃体内(intratonsilar)或透皮给予。另外，疫苗组合物可通过“无针”递送系统给予。
疫苗组合物的有效量可取决于任意数量的变量，包括但不限于，患者的物种、品种、大小、高度、重量、年龄、整体健康，制剂类型或给予模式或方式。适当的有效量可由本领域技术人员使用常规优化技术和从业者的熟练和明智（skilled and informed）的判断以及对本领域技术人员显而易见的其它因素常规确定。优选地，治疗有效剂量的本文所述的疫苗组合物将会提供治疗性预防益处而不引起对受试者的大量毒性。
所述疫苗组合物可按照任何适合诱导和/或支持对抗疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB或包含gB/gH/gL的疱疹病毒蛋白复合体的免疫应答的时间表来给予患者。例如，可给予患者疫苗组合物作为初次免疫，如本文所描述和例示，接着给予二次免疫，或增强剂，以支持和/或维持保护性免疫。
疫苗给于时间表，其包括初次免疫和增强剂给予，可持续如患者所需要那样长，例如，在数年的过程中，至在患者的一生中。初次疫苗和增强剂给予的频率和给予的剂量可定制和/或调整以满足个体患者的具体需求，如给药医师根据本领域的任何合适手段所确定的。
疫苗组合物可预防地(暴露在目的抗原或病原体之前)或治疗地(暴露于目的抗原或病原体之后)给予。
诱导免疫应答的方法 在另一个方面，包含1) 修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白(或编码修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的核酸)的同源三聚体复合体或2) 其中所述蛋白复合体包含修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的同源三聚复合体以及疱疹病毒gH和gL蛋白(例如，疱疹病毒gH/gL融合蛋白)的蛋白复合体的组合物可用在诱导免疫应答的方法中。免疫应答可在先前未曾暴露于HCMV或其它疱疹病毒的天真的(naïve)受试者中诱导。或者，免疫应答可在先前曾暴露于疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV)的受试者中诱导并用于增强现有免疫应答。
在一个实施方案中，增强免疫应答的方法包括给予受试者包含1) 修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的同源三聚体复合体或2) 其中所述蛋白复合体包含修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的同源三聚复合体以及疱疹病毒gH和gL蛋白(例如，疱疹病毒gH/gL融合蛋白)的蛋白复合体的组合物，其中所述疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的同源三聚体复合体或蛋白复合体诱导对抗HCMV或其它疱疹病毒的免疫应答。在另一个实施方案中，所述增强免疫应答的方法包括给予受试者包含编码修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白的核酸构建体的组合物，如本申请中所描述的，其中修饰的疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV) gB蛋白在受试者中表达并且其同源三聚体复合体在受试者中诱导对抗疱疹病毒(例如，HCMV、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或HSHV)的免疫应答。
在这些诱导或抑制免疫应答的方法中，免疫应答可使用本领域常规方法测量，例如本申请中所公开的那些。这些常规方法包括，但不限于，测量抗体应答，例如定向对抗重组载体所编码的蛋白的抗体应答，和测量细胞增殖，其包括，例如，通过测量氘化胸苷掺入或细胞因子(例如，IFN-γ)产生。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所公开的那些相似或相当的方法和材料可用在本发明的实践或检验中，下文仍描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版、专利申请、专利和其它参考通过引用以其整体结合。如果冲突，应以包括定义的本说明书为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的并且不意在限制。
实施例
实施例1 - 三聚HCMV gB蛋白的表达
用于产生三聚HCMV gB的质粒的构建 为了检验三聚HCMV糖蛋白B是否可提供有效的和可重现的用于增强对HCMV感染的免疫应答的手段，设计重组核酸质粒(SEQ ID NO: 3)以编码SEQ ID NO: 1的氨基酸23-750，其中弗林蛋白酶切割位点(SEQ ID NO: 1的氨基酸457-461之间的RTKRS (SEQ ID NO: 19))的编码序列用(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 5)接头的编码序列代替。不意在受理论束缚，认为(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 5)接头的引入允许适当的蛋白折叠因此形成同源三聚HCMV糖蛋白B复合体。重组核酸还包含编码5’末端上指导蛋白分泌入细胞上清液中的IgG κ前导序列的核酸，和编码3’末端上帮助纯化和免疫组织化学分析的His6 (SEQ ID NO: 26)序列的核酸。将重组核酸(SEQ ID NO: 3)克隆入pOptiVEC载体(Life Technologies, Carlsbad, CA)，并通过测序验证。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(株DG44)的转染 CHODG44细胞维持在“CD DG44”培养基(Life Technologies, Carlsbad, CA)中，并将2 × 107细胞用于转染。用PvuI线性化之后将30 μg重组核酸构建体重悬在1.2 ml OptiPro (Life Technologies, Carlsbad, CA)SFM培养基中，接着加入30 μl FreeStyle Max Reagent (Life Technologies, Carlsbad,CA)，温和混匀并室温孵育10 min。将DNA-FreeStyle Max Reagent (Life Technologies,Carlsbad, CA)复合体缓慢加入包含2 × 107 DG44细胞的烧瓶中并温和摇动。细胞在37℃、5% CO2下孵育48小时。将细胞1,200 rpm离心并维持在CD OptiCHO (Life Technologies,Carlsbad, CA)无血清培养基中。使用甲氨蝶呤(MTX, Sigma, St. Louis, MO)选择高重组蛋白-分泌细胞，MTX的浓度从50 nM逐渐增加至4 μM。
修饰的HCMV gB蛋白用抗-His抗体的免疫组织化学分析MTX选择后，将表达修饰的HCMV gB的CHO细胞装载到“Fibercell”盒(FiberCell Systems, Inc., Frederick, MD)中，每日收集浓缩的上清液。通过使用Centriprep® Centrifugal Filter Unit, 30,000MW截留(Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA) 3,000 rpm离心30 min进一步浓缩上清液。使用钴柱(Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA)按照制造商的说明进行亲和纯化。简言之，将浓缩的上清液与等体积的平衡缓冲液混合，加入钴纯化柱中。柱在温和搅拌下4℃孵育60 min并用洗涤缓冲液洗涤3次。用洗脱缓冲液洗脱修饰的HCMV gB蛋白并通过在3-8% NuPAGE® Tris-Acetate Mini Gels (Life Technologies, Carlsbad, CA)上于完全还原或部分还原的条件下电泳分析，并用抗-His单克隆抗体(Life Technologies,Carlsbad, CA)印迹。
在(用十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇和煮沸10分钟)完全还原的条件下，使用抗-His抗体的蛋白质印迹分析显示120 kDa带，如图1A中所示。该120 kDa带与单体HCMV gB一致，因为完全还原条件使任何天然寡聚体断裂为其单体形式。这些结果证明在其非天然形式下，本公开内容的修饰的HCMV gB为单体。
在(用十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇和70℃加热10分钟)部分还原的条件下（所述部分还原条件允许检测天然形式的HCMV gB），使用抗-His抗体的蛋白质印迹分析显示一致的更高分子量的带，大约360 kDa，如图1B中所示。该约360 kDa的带与HCMV gB的天然同源三聚形式一致。
修饰的HCMV gB蛋白用抗-gB抗体的免疫组织化学分析 还于变性或修饰的天然条件下，在3-8% NuPAGE® Tris-Acetate Mini Gels (Life Technologies, Carlsbad, CA)上通过电泳分析修饰的HCMV gB蛋白，并用抗-CMV gB抗体(2F12, Virusys, Taneytown,MD;或LS-C64457, LifeSpan BioSciences, Seattle, WA)印迹。
在变性条件下（所述变性条件使任何天然寡聚体断裂成其单体形式），将修饰的HCMV gB在包含50 mM DTT的上样缓冲液中煮沸10分钟。然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜并用抗-gB单克隆抗体(2F12, Virusys, Taneytown, MD; 或LS-C64457, LifeSpanBioSciences, Seattle, WA)印迹。如图2B中所示，印迹显示120 kDa的带，其与单体HCMVgB对应。这些结果证明本公开内容的修饰的HCMV gB在非天然形式下为单体。
在修饰的天然条件（所述条件允许检测天然形式的HCMV糖蛋白B），将修饰的HCMVgB与包含LDS (十二烷基硫酸锂)但无DTT的上样缓冲液混合并在天然电泳缓冲液(runningbuffer)中解析。然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜并用抗-gB单克隆抗体(LS-C64457,LifeSpan BioSciences, Seattle, WA)印迹。如图2A中所示，印迹显示均一的约360 kDa的带，与HCMV gB的天然同源三聚形式一致。
实施例2 –用三聚HCMC gB蛋白免疫小鼠
纯化的非-三聚重组HCMV gB蛋白 从Sino Biological, Inc. (Beijing, P.R.China)购买了共计2 mg HCMV gB蛋白。该HCMV gB蛋白使用编码与胞浆结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸777-907)连接并在C-末端融合多组氨酸标签以帮助蛋白纯化的胞外结构域(SEQID NO: 1的氨基酸1-700)的DNA序列在人胚胎肾(HEK) 293细胞系中产生。弗林蛋白酶切割位点保持完整，但突变以致无效。该HCMV gB蛋白包含818个氨基酸，在还原条件下具有93kDa的预测分子量，但由于糖基化130-140 kDa的分子量。该蛋白的生物活性通过其在功能ELISA测定中结合生物素化人CD209-Fc的能力证实。重要地，该HCMV gB蛋白基本上与临床试验(Pass等人, N Engl J Med 360: 1191-9)中使用的非-三聚HCMV gB蛋白相同。
小鼠 雌性BALB/c小鼠购自国家癌症研究所(Frederick, MD)并且对于所有蛋白免疫在7-10周龄时使用。雌性BALB/c小鼠购自Harlan实验室(Indianapolis, IN)并且对于所有的质粒DNA疫苗接种在4-6周龄时使用。这些研究依照Guide for Care and Use of Laboratory Animals (实验动物护理和使用指南) (实验动物资源研究所，国家研究委员会，1996年修正)中列出的原则进行，并且由健康科学统一服务大学（Uniformed ServicesUniversity of the Health Sciences）和华盛顿大学动物护理和使用委员会机构（Istitutional Animal Care and Use committees）批准。
免疫雌性BALB/c小鼠用3个不同剂量(25、5.0和1.0 µg/小鼠)的修饰的HCMV gB的同源三聚复合体或市售非-三聚HCMV gB蛋白腹腔内(i.p.)免疫。同源三聚或非-三聚HCMVgB吸附在13 μg明矾佐剂(Allhydrogel 2%, Brenntag Biosector, Denmark)上，并与或不与25 μg刺激性30 mer含CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)一起给予。用于ELISA测定的血清样品从在0、14、28和42天自尾静脉所取的血液获得，用于测量gB-特异性IgG的血清滴度。
通过ELISA测量小鼠中gB-特异性IgG和IgG同种型的血清滴度Immulon 4 ELISA板(Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA)用同源三聚HCMV gB (5 μg/ml)/PBS (50μL/孔) 4℃包被过夜。板用PBS + 0.1%吐温20洗涤3次并用PBS + 1% BSA 37℃封闭1 h。加入在PBS + 1% BSA中从1/50血清稀释度开始三倍稀释的来自免疫小鼠的血清样品，4℃孵育过夜，并用PBS + 0.1%吐温20洗涤板3次。然后加入碱性磷酸酶-缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG、IgG3、IgG1、IgG2b或IgG2a抗体(SouthernBiotech, Birmingham, AL) (200 ng/ml终浓度)/ PBS + 1% BSA，并37℃孵育板1 h。然后用PBS + 0.1%吐温20洗涤板5次。然后加入在TM缓冲液(1 M Tris + 0.3 mM MgCl2, pH 9.8)中的1 mg/ml的底物(磷酸对硝基苯酯，二钠；Sigma)用于显色。在Multiskan Ascent® ELISA读板机（Multiskan Ascent®ELISA reader）(Labsystems, Finland)上405 nm处的吸光度下读取颜色。结果在图4中示出，所述结果证明本公开内容的修饰的HCMV gB (“三聚体”)比非-三聚对照HCMV gB(“Sino”)明显更具免疫原性(显著更高的抗-HCMV gB IgG)。
通过竞争ELISA测量血清gB-特异性中和抗体 竞争ELISA改编自我们先前所描述的(Colino J, Duke L, Arjunaraja S, Chen Q, Liu L, Lucas AH, Snapper CM. 2012.Differential Idiotype Utilization for the In Vivo Type 14 CapsularPolysaccharide-Specific Ig Responses to Intact Streptococcus pneumoniaeversus a Pneumococcal Conjugate Vaccine (与肺炎球菌联合疫苗相比体内14型荚膜多糖-特异性IgG对完整肺炎链球菌的应答的差别个体基因型利用率). J Immunol 189:575-86)。简言之，抑制混合物将会通过将不同稀释度的血清与10 µg/ml HCMV gB蛋白混合，并在4℃孵育24 h制备，然后转移至预先用1 µg/ml中和小鼠IgG1抗-HCMV gB mAb LS-C64457 (LifeSpan BioSciences, Inc, Seattle, WA)包被并用PBS-BSA封闭的孔中。来自天真小鼠或用对照蛋白例如EBV gp350，免疫的小鼠的血清将会用作阴性对照(即无抑制)。在最终的检测步骤中，板将会用碱性磷酸酶-缀合的非中和小鼠IgG1抗-gB mAb 2F12(Virusys, Taneytown, MD) 37℃孵育1 h，接着加入在TM缓冲液中以1 mg/ml添加的底物(磷酸对硝基苯酯，二钠)用于显色。将在Multiskan Ascent® ELISA读板机 (Labsystems,Finland)上405 nm处的吸光度下读取颜色直至标准孔的OD405 nm达到预定值。标准曲线将会在抑制混合物中使用已知浓度的中和小鼠IgG1抗-HCMV gB mAb LS-C64457产生，以在使用四参数逻辑回归方法并校正血清稀释度的情况下将每一血清样品的OD405 nm转换为最终的gB-特异性中和抗体的ug/ml浓度。
CMV中和测定 中和活性通过制备1:10稀释度的每一血清样品接着在培养基中另外2倍连续稀释来测定。每一稀释度与等体积的包含4,000 pfu HCMV (毒株BADrUL131-Y4)的培养基混合，37℃孵育1 h然后加入包含ARPE-19 (上皮细胞系（epithelial cell），ATCC)或MRC-5 (成纤维细胞系，ATCC)单层的384-孔板的孔中。每一血清样品一式三份测定并在感染后四天时使用Nikon Eclipse TS100倒置UV显微镜获取代表性的显微照片。感染7天后使用PerkinElmer Victor V1420多标记计数器测量GFP荧光。使用Prism软件通过标绘关于log2血清浓度的每一血清稀释度的三份GFP值的平均值、计算数据的最佳拟合四参数等式和在曲线的中点处内插血清稀释度作为IC50中和滴度计算50%抑制浓度(IC50)值和平均值的标准误差。
统计学 对于重现性，所有研究将会重复至少一次。血清滴度将会表述为几何平均值+/-平均值的标准误差，显著性通过双尾students t-检验测定(认为p<0.05显著)。我们先前确定对于这些研究每组7只小鼠给予适当的统计力。
实施例3 –用三聚HCMC gB蛋白免疫兔
HCMV三聚糖蛋白B (gB)在兔中诱导高度增强的预防成纤维细胞和上皮细胞的体外HCMV感染的gB-特异性IgG应答。用25 ug吸附至氢氧化铝(白矾；0.25 ug白矾/mg蛋白)的三聚HCMV gB皮下免疫12-15周龄的一组4只雄性新西兰白兔。兔在第0天、第21天和第42天免疫并在初次免疫之前和每次免疫之后10天取血清样品。测定HCMV gB-特异性IgG的血清滴度。用三聚HCMV gB初次免疫诱发可检测的HCMV gB-特异性IgG血清滴度，所述滴度在二次免疫之后增强约100倍(图5)。第三次免疫未显示血清滴度的进一步增加。
还使用成纤维细胞(MRC-5)和上皮细胞(ARPE-19) (图6)分析了对抗活HCMV的体外中和活性。来自CMV-免疫患者的人血清用作对照(“人血清”)。当在成纤维细胞(MRC-5)上测定时，观察到来自用三聚HCMV gB免疫的兔的血清中和滴度的诱导并且与在人HCMV-免疫血清中测量的那些相当(图6)。尽管在HCMV三聚gB-免疫兔中也观察到上皮细胞(ARPE-19)的血清中和滴度，其显著低于在人HCMV-免疫血清中所观察到的(图6)，提示额外的HCMV蛋白在介导上皮细胞的保护中的可能作用。
通过ELISA测量兔中gB-特异性IgG同种型的血清滴度Immulon 4 ELISA板(DynexTechnologies, Chantilly, VA)用5 µg/ml HCMV gB蛋白/PBS (50 µl/孔) 4℃包被过夜。然后用PBS + 1%牛血清白蛋白(BSA) (100 µl/孔) 37℃封闭板2 h。然后加入在PBS加1%BSA中从1/50血清稀释度开始三倍连续稀释的血清样品(50 µl/孔)并4℃孵育过夜，接着用PBS + 0.1%吐温-20洗涤3次。然后加入碱性磷酸酶-缀合的多克隆山羊抗兔IgG Ab(Southern Biotechnology) (200 ng/ml, 50 µl/孔)/PBS加1% BSA并将板37℃孵育1 h。然后用PBS + 0.1%吐温-20洗涤板并加入在TM缓冲液(1 M Tris + 0.3 mM MgCl2, pH9.8)中的1 mg/ml的底物(磷酸对硝基苯酯，二钠；Sigma-Aldrich)用于显色（colordevelopment）。在Multiskan Ascent ELISA读板机(Labsystems, Finland)上405 nm处的吸光度下读取颜色。
CMV中和测定 中和活性通过制备1:10稀释度的每一血清样品接着在培养基中另外2倍连续稀释测定。每一稀释度与等体积的包含4,000 pfu HCMV (毒株BADrUL131-Y4)的培养基混合，37℃孵育1 h然后加入包含ARPE-19 (上皮细胞系，ATCC)或MRC-5 (成纤维细胞系，ATCC)单层的384-孔板的孔中。每一血清样品一式三份测定并在感染后4天时使用Nikon Eclipse TS100倒置UV显微镜获取代表性的显微照片。感染7天后使用PerkinElmerVictor V1420多标记计数器测量GFP荧光。使用Prism软件通过标绘关于log2血清浓度的每一血清稀释度的三份GFP值的平均值、计算数据的最佳拟合四参数等式和在曲线的中点处内插血清稀释度作为IC50中和滴度计算50%抑制浓度(IC50)值和平均值的标准误差。
实施例4 –三聚人EBV gB蛋白的表达
用于产生三聚EBV gB的质粒的构建 为了检验同源三聚EBV糖蛋白B是否可提供有效的和可重现的用于增强对EBV感染的免疫应答的手段，设计重组核酸质粒(SEQ ID NO: 9)以编码SEQ ID NO: 8的氨基酸23-732，其中弗林蛋白酶切割位点(SEQ ID NO: 8的氨基酸429-433之间的RRRRD (SEQ ID NO: 20))的编码序列用(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 5)接头的编码序列代替(图8)。不意在受理论束缚，认为(Gly4Ser)3接头的引入允许适当的蛋白折叠因此形成三聚EBV糖蛋白B复合体。EBV gB信号肽(SEQ ID NO: 8的氨基酸1-22)由IgG κ前导序列(SEQ ID NO:6)代替。因此，重组核酸进一步包含编码5’末端上指导蛋白分泌入细胞上清液中的IgG κ前导序列的核酸，和编码3’末端上帮助纯化和免疫组织化学分析的His6(SEQ ID NO: 26)序列的核酸。将重组核酸(SEQ ID NO: 9)克隆入pOptiVEC(LifeTechnologies, Carlsbad, CA)，并通过测序验证。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(株DG44)的转染 CHODG44细胞维持在“CD DG44”培养基(Life Technologies, Carlsbad, CA)中，并将2 × 107细胞用于转染。将30 μg重组核酸构建体用PvuI线性化之后重悬在1.2 ml OptiPro (Life Technologies, Carlsbad, CA)SFM培养基中，接着加入30 μl FreeStyle Max Reagent (Life Technologies, Carlsbad,CA)，温和混匀并室温孵育10 min。将DNA-Freestyle Max Reagent (Life Technologies,Carlsbad, CA)复合体缓慢加入包含2 × 107 DG44细胞的细颈瓶中并温和摇动。细胞在37℃、5% CO2下孵育48小时。将细胞1,200 rpm离心并维持在CD OptiCHO (LifeTechnologies, Carlsbad, CA)无血清培养基中。使用甲氨蝶呤(MTX, Sigma, St. Louis,MO)选择高重组蛋白-分泌细胞，MTX的浓度从50 nM逐渐增加至4 μM。
修饰的EBV gB蛋白用抗-His抗体的免疫组织化学分析MTX选择后，将修饰的EBVgB表达CHO细胞装载到“Fibercell”盒(FiberCell Systems, Inc., Frederick, MD)中，每日收集浓缩的上清液。用M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Thermo Scientific Fisher,Waltham, MA)裂解修饰的EBV gB表达CHO细胞，3500 rpm离心60 min以去除细胞碎片。上清液通过使用Centriprep® Centrifugal Filter Unit (Thermo Scientific Fisher,Waltham, MA), 30,000 MW截留3,000 rpm离心30 min进一步浓缩。使用钴柱(ThermoScientific Fisher, Waltham, MA)按照制造商的说明进行亲和纯化。简言之，将浓缩的上清液与等体积的平衡缓冲液混合，加入钴纯化柱中。柱在温和搅拌下4℃孵育60 min并用洗涤缓冲液洗涤3次。
修饰的EBV gB蛋白用抗-EBV gB抗体的免疫组织化学分析 于变性或修饰的天然条件下，在3-8% NuPAGE® Tris-Acetate Mini Gels (Life Technologies, Carlsbad,CA)上通过电泳分析修饰的EBV gB蛋白并用抗-His单克隆抗体(Life Technologies,Carlsbad, CA)和抗-EBV gB抗体(Virusys, Taneytown, MD)印迹。
在变性条件下（所述变性条件使任何天然寡聚体断裂成其单体形式），将修饰的(“三聚”) EBV gB在包含50 mM DTT的上样缓冲液中煮沸10分钟。然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜并用抗-His单克隆抗体((Life Technologies, Carlsbad, CA)或抗-gB单克隆抗体(Virusys, Taneytown, MD)印迹。如图7A中所示，印迹显示80 kDa的带，其与单体EBV gB对应。这些结果证明修饰的EBV gB在非天然形式下为单体。
在修饰的天然条件下（所述天然条件允许检测天然形式的EBV gB），将修饰的EBVgB与包含LDS (十二烷基硫酸锂)但无DTT的上样缓冲液混合并在天然电泳缓冲液中解析。然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜并用抗-His单克隆抗体(图7B)或抗-gB单克隆抗体(图7C)印迹。如图7B/C中所示，印迹显示均一的约240 kDa的带，其与EBV gB的天然三聚形式一致。
实施例5 –用三聚人EBV gB蛋白的免疫研究
小鼠 雌性BALB/c小鼠将会购自国家癌症研究所(Frederick, MD)并且对于所有蛋白免疫将会在7-10周龄时使用。雌性BALB/c小鼠将会购自Harlan实验室(Indianapolis, IN)并且对于所有的质粒DNA疫苗接种将会在4-6周龄时使用。这些研究将会依照Guide for Care and Use of Laboratory Animals (实验动物护理和使用指南) (实验动物资源研究所，国家研究委员会，1996年修正)中列出的原则进行，并且将会由健康科学统一服务大学和华盛顿大学动物护理和使用委员会机构批准。
免疫雌性BALB/c小鼠将会用3个不同剂量(25、5.0和1.0 µg/小鼠)的修饰的EBVgB的同源三聚复合体或非-三聚EBV gB蛋白腹腔内免疫。同源三聚或非-三聚EBV gB将会吸附在13 μg明矾佐剂(Allhydrogel 2%, Brenntag Biosector, Denmark)上，并与或不与25μg刺激性30 mer含CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)一起给予。用于ELISA测定的血清样品将会从在0、14、28和42天自尾静脉所取的血液获得，用于测量gB-特异性IgG血清滴度。
通过ELISA测量gB-特异性IgG和IgG同种型的血清滴度 Immulon 4 ELISA板(Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA)将会用同源三聚EBV gB (5 μg/ml)/PBS(50 μL/孔) 4℃包被过夜。板将会用PBS + 0.1%吐温20洗涤3次并将用PBS + 1% BSA 37℃封闭1 h。将会加入在PBS + 1% BSA中从1/50血清稀释度开始三倍稀释的来自免疫小鼠的血清样品，4℃孵育过夜，并将用PBS + 0.1%吐温20洗涤板3次。然后将会加入碱性磷酸酶-缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG、IgG3、IgG1、IgG2b或IgG2a抗体(SouthernBiotech,Birmingham, AL) (200 ng/ml终浓度)/ PBS + 1% BSA，并将会37℃孵育板1 h。然后将会用PBS + 0.1%吐温20洗涤板5次。然后将会加入在TM缓冲液(1 M Tris + 0.3 mM MgCl2,pH 9.8)中的1 mg/ml的底物(磷酸对硝基苯酯，二钠；Sigma)用于显色。将会在MultiskanAscent® ELISA读板机(Labsystems, Finland)上405 nm处的吸光度下读取颜色。
EBV中和测定 将会使用NIH的Dr. Jeffery Cohen的实验室中开发的方法(Sashihara J等人, Virology 2009, 391: 249-256)。简言之，血清样品将会以2-倍跨度（2-fold steps）连续稀释(从不稀释至18连续稀释)，并且25 μL稀释样品或对照抗体将会一式三份地加入96孔板的孔中。然后将会向每一孔中加入25 μl B95-8/F EBV病毒并孵育2小时。将会加入50 μl 1 × 105 Raji细胞并37℃孵育1小时，细胞将会通过300 × g离心板5 min并更换培养基而洗涤两次，37℃孵育3天。然后将会离心板，用PBS洗涤细胞一次，并在2%多聚甲醛/PBS中固定。
GFP-表达细胞将会使用FACSCalibur(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)和FlowJo软件(Tree Star Inc., Ashland, OR)定量。基于GFP阳性细胞数目的减少的50%抑制传染性的抗体有效稀释度(EDI50)将会使用GraphPad PRISM®软件(GraphPadSoftware, La Jolla, CA)通过非线性回归分析计算。
统计学 对于重现性，所有研究将会重复至少一次。血清滴度将会表述为几何平均值+/-平均值的标准误差，显著性通过双尾学生t-检验测定(认为p<0.05显著)。我们先前确定对于这些研究每组7只小鼠给予适当的统计力。
实施例6 - HCMV gH/gL融合蛋白的表达
HCMV gH/gL异源二聚体为疱疹病毒家族核心融合机构（machinery）的一部分，所述核心融合机构为HCMV融合和穿透入成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和树突细胞所必需。兔用单独的重组gH/gL疫苗接种诱发对成纤维细胞和上皮细胞的中和抗体，尽管当使用完整的五聚复合体(gH/gL/UL128/130/131A)时对上皮细胞的中和稍微更高(66)。
HCMV gH和gL的编码序列从NCBI下载，参考序列NC_006273.2，版本GI:155573622，该序列因此通过引用以其整体结合，其包括gH核苷酸109224直至111452 (SEQ ID NO:21)、gL核苷酸165022直至165858 (SEQ ID NO: 22)。疱疹病毒gH/gL融合蛋白的构建体使用MacVector设计。野生型HCMV gH (SEQ ID NO: 18)和HCMV gL (SEQ ID NO: 24)的氨基酸序列为已知的。使用编码野生型HCMV gL氨基酸31-278的核酸(SEQ ID NO: 23)，并用IgGκ前导序列(SEQ ID NO:6)替换信号肽1-30。使用编码野生型HCMV gH的氨基酸24-718氨基酸的核酸(SEQ ID NO: 17)并连接至gL的3’末端，由15个氨基酸的接头(Gly4Ser)3序列(SEQID NO:5)隔开，并在gH的3’末端连接His6 (SEQ ID NO: 26)编码序列用于蛋白纯化。gH/gL构建体的氨基酸序列与SEQ ID NO: 25对应。编码gH/gL的DNA由Blue HeronBiotechnology, Inc合成，克隆入pOptiVEC (Invitrogen)，并通过测序验证。用pOptiVEC-gH/gL构建体使用Free-style Max reagent (Invitrogen)转染中国仓鼠卵巢细胞(株DG44) (Invitrogen)，并用逐渐增加直至4 μM浓度的甲氨蝶呤筛选。将上清液浓缩并使用钴亲和纯化(Thermo Scientific)进行纯化，通过蛋白质印迹使用抗-His6 (SEQ ID NO:26)抗体和抗HCMV gH/gL抗体(Santa Cruz Biotech)二者分析。在还原条件下，蛋白质印迹用单克隆抗-His抗体(图9A)或单克隆抗-gH抗体(图9B)证明单体gH/gL为110 KDa的带。
实施例7 - HCMV蛋白复合体gB/gH/gL的产生
HCMV进入成纤维细胞需要三聚gB、gH和gL蛋白的HCMV包膜复合体，而进入内皮、上皮和树突细胞以及白细胞需要UL128/130/131A与gH/gL的额外复合，并联合gB (4, 5, 6 )。
将如实施例1中所产生的纯化的HCMV三聚gB与如实施例6中所产生的纯化的单体gH/gL以1:1的分子比率混合，并室温孵育2小时。随后在非-还原条件下通过蛋白质印迹分析显示分子量约600 kDa的蛋白复合体(图10)，其与一个HCMV三聚gB和两个HCMV单体gH/GL异源二聚体的复合体一致。尚未有报道证明当体外共孵育时这些病毒蛋白，以其天然构象，组装为天然复合体。这可能部分上因先前不可能生产完全三聚的HCMV gB蛋白的这一事实所致，所述完全三聚的HCMV gB蛋白代表天然构象的HCMV gB。HCMV蛋白的该天然复合体（其先前未曾在体外表达过）代表了预防性疫苗设计中的突破。
该蛋白复合体疫苗还具有超出疱疹病毒疫苗的含意，因为同样的原理可用于从其它病毒或细菌病原体的个体蛋白重建蛋白复合体，其可继而用作疫苗以诱导高度有效的针对蛋白复合体中的构象表位的中和抗体。
实施例8 –用HCMV蛋白复合体gB/gH/gL的免疫研究
小鼠 雌性BALB/c小鼠将会购自国家癌症研究所(Frederick, MD)并且对于所有蛋白免疫将会在7-10周龄时使用。雌性BALB/c小鼠将会购自Harlan实验室(Indianapolis, IN)并且对于所有的质粒DNA疫苗接种将会在4-6周龄时使用。这些研究将会依照Guide for Care and Use of Laboratory Animals (实验动物护理和使用指南) (实验动物资源研究所，国家研究委员会，1996年修正)中列出的原则进行，并且将会由健康科学统一服务大学和华盛顿大学动物护理和使用委员会机构批准。
免疫雌性BALB/c小鼠将会用3个不同剂量(25、5.0和1.0 µg/小鼠)的如实施例6中所产生的HCMV gB/gH/gL蛋白复合体腹腔内免疫。HCMV gB/gH/gL蛋白复合体将会吸附在13μg明矾佐剂(Allhydrogel 2%, Brenntag Biosector, Denmark)上，并与或不不与25 μg刺激性30 mer含CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)一起给予。用于ELISA测定的血清样品将会从在0、14、28和42天自尾静脉所取的血液获得，用于测量gB、gH和/或gL特异性IgG的血清滴度。
通过ELISA测量gB/gH/gL-特异性IgG和IgG同种型的血清滴度Immulon 4 ELISA板(Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA)将会用HCMV gB/gH/gL蛋白复合体(5 μg/ml)/PBS (50 μL/孔) 4℃包被过夜。板将会用PBS + 0.1%吐温20洗涤3次并将用PBS + 1%BSA 37℃封闭1 h。将会加入在PBS + 1% BSA中从1/50血清稀释度开始三倍稀释的来自免疫小鼠的血清样品，4℃孵育过夜，并将会用PBS + 0.1%吐温20洗涤板3次。然后将会加入碱性磷酸酶-缀合的多克隆山羊抗小鼠IgG、IgG3、IgG1、IgG2b或IgG2a抗体(SouthernBiotech, Birmingham, AL) (200 ng/ml终浓度)/ PBS + 1% BSA，并将会37℃孵育板1 h。然后将会用PBS + 0.1%吐温20洗涤板5次。然后将会加入在TM缓冲液(1 M Tris+ 0.3 mM MgCl2, pH 9.8)中的1 mg/ml的底物(磷酸对硝基苯酯，二钠；Sigma)用于显色。颜色将会在Multiskan Ascent® ELISA读板机(Labsystems, Finland)上405 nm处的吸光度下读取。
CMV中和测定中和活性通过制备1:10稀释度的每一血清样品接着在培养基中另外2倍连续稀释来测定。每一稀释度与等体积的包含4,000 pfu HCMV (毒株BADrUL131-Y4)的培养基混合，37℃孵育1 h然后加入包含ARPE-19 (上皮细胞系，ATCC)或MRC-5 (成纤维细胞系，ATCC)单层的384-孔板的孔中。每一血清样品一式三份测定并在感染后4天时使用Nikon Eclipse TS100倒置UV显微镜获取代表性的显微照片。感染7天后使用PerkinElmerVictor V1420多标记计数器测量GFP荧光。使用Prism软件通过标绘针对log2血清浓度的每一血清稀释度的三份GFP值的平均值、计算数据的最佳拟合四参数等式和在曲线的中点处内插血清稀释度作为IC50中和滴度计算50%抑制浓度(IC50)值和平均值的标准误差。
统计学 对于重现性，所有研究将会重复至少一次。血清滴度将会表述为几何平均值+/-平均值的标准误差，显著性通过双尾学生t-检验测定(认为p<0.05显著)。我们先前确定对于这些研究每组7只小鼠给予适当的统计力。
下列参考在本申请中引用并提供本发明领域的一般信息和提供本申请中讨论的测定和其它细节。下列参考通过引用以其整体结合到本文中。
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Claims (40)

1. 一种包含修饰的胞外结构域或其片段的人疱疹病毒糖蛋白B (gB)多肽，其中所述修饰的胞外结构域包含插入弗林蛋白酶切割位点的肽接头。
2. 权利要求1的人疱疹病毒gB多肽，其中所述人疱疹病毒gB选自人巨细胞病毒(HCMV)gB、HSV-1 (单纯疱疹病毒-1) gB、HSV-2 (单纯疱疹病毒-2) gB、VZV (水痘-带状疱疹病毒) gB、EBV (埃巴病毒) gB和HSHV (卡波西肉瘤-相关疱疹病毒) gB。
3. 权利要求2的人疱疹病毒gB多肽，其中所述人疱疹病毒gB为HCMV gB或EBV gB。
4. 权利要求3的人疱疹病毒gB多肽，其中所述人疱疹病毒gB为HCMV gB并且其中所述修饰的胞外结构域包含插入野生型HCMV氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的弗林蛋白酶切割位点中的肽接头序列。
5.权利要求1-4中任一项的人疱疹病毒gB多肽，其中所述人疱疹病毒gB多肽不包含跨膜结构域或胞内结构域。
6.权利要求1-5中任一项的人疱疹病毒gB多肽，其中所述肽接头约6-约70个氨基酸长。
7.权利要求1-5中任一项的人疱疹病毒gB多肽，其中所述肽接头约15个氨基酸长。
8. 权利要求1-7中任一项的人疱疹病毒gB多肽，其中所述肽接头由氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5)组成。
9.权利要求1-8中任一项的人疱疹病毒gB多肽，进一步在gB多肽的N-端包含前导序列，其中所述前导序列不是天然gB多肽前导序列。
10. 权利要求9的人疱疹病毒gB多肽，其中所述前导序列具有氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO: 6)。
11. 权利要求1-10中任一项的人疱疹病毒gB多肽，其中所述人疱疹病毒gB多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 4。
12.一种疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体，其中所述同源三聚体复合体包含权利要求1-11中任一项的三个人疱疹病毒gB多肽。
13. 权利要求12的疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体，其中所述疱疹病毒为HCMV并且所述同源三聚体复合体具有约360 kDa的分子量(MW)。
14.包含权利要求12或13的疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体和药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物。
15.权利要求14的疫苗组合物，进一步包含至少一种人疱疹病毒抗原。
16. 权利要求14或15的疫苗组合物，其中所述至少一种人疱疹病毒抗原选自糖蛋白H(gH)、糖蛋白L (gL)、糖蛋白350 (gp350)、UL128、UL130、UL131和其组合。
17.权利要求15或16的疫苗组合物，其中所述至少一种人疱疹病毒抗原为多聚体。
18.权利要求14-17中任一项的疫苗组合物，进一步包含佐剂。
19.权利要求14-18中任一项的疫苗组合物，其中至少70%的人疱疹病毒gB多肽为同源三聚体。
20. 一种包含疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、疱疹病毒糖蛋白H (gH)和糖蛋白L(gL)的蛋白复合体，其中所述同源三聚体复合体包含三个人疱疹病毒gB多肽并且每一人疱疹病毒糖蛋白B (gB)多肽包含修饰的胞外结构域或其片段，其中所述修饰的胞外结构域包含插入所述弗林蛋白酶切割位点的肽接头。
21.权利要求20的蛋白复合体，其中所述疱疹病毒gH和疱疹病毒gL形成疱疹病毒gH/gL融合蛋白。
22. 权利要求20或21的蛋白复合体，其中所述人疱疹病毒gB选自人巨细胞病毒(HCMV)gB、HSV-1 (单纯疱疹病毒-1) gB、HSV-2 (单纯疱疹病毒-2) gB、VZV (水痘-带状疱疹病毒) gB、EBV (埃巴病毒) gB和HSHV (卡波西肉瘤-相关疱疹病毒) gB。
23. 权利要求20-22中任一项的蛋白复合体，其中所述人疱疹病毒gB为HCMV gB或EBVgB。
24. 权利要求20-23中任一项的蛋白复合体，其中所述人疱疹病毒gB为HCMV gB并且其中所述修饰的胞外结构域包含插入野生型HCMV氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的所述弗林蛋白酶切割位点中的肽接头序列。
25.权利要求20-24中任一项的蛋白复合体，其中所述人疱疹病毒gB多肽不包含跨膜结构域或胞内结构域。
26.权利要求20-25中任一项的蛋白复合体，其中所述肽接头约6-约70个氨基酸长。
27.权利要求20-26中任一项的蛋白复合体，其中所述肽接头约15个氨基酸长。
28. 权利要求20-27中任一项的蛋白复合体，其中所述肽接头由氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5)组成。
29.权利要求20-28中任一项的蛋白复合体，其中所述人疱疹病毒gB多肽进一步在gB多肽的N-端包含前导序列，其中所述前导序列不是天然gB多肽前导序列。
30. 权利要求29的蛋白复合体，其中所述前导序列具有氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO: 6)。
31. 权利要求21-30中任一项的蛋白复合体，其中所述疱疹病毒gH/gL融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。
32.权利要求20-31中任一项的蛋白复合体，其中所述蛋白复合体进一步包含疱疹病毒UL128、UL130和UL131多肽。
33.包含权利要求20-32中任一项的蛋白复合体和药学上可接受的赋形剂的疫苗组合物。
34.权利要求33的疫苗组合物，进一步包含佐剂。
35.权利要求1-11中任一项的人疱疹病毒gB多肽、权利要求12-13中任一项的疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、权利要求14-19或33-34中任一项的疫苗组合物，或权利要求20-32中任一项的蛋白复合体用于预防和/或治疗患者中的疱疹病毒感染的用途。
36.权利要求1-11中任一项的人疱疹病毒gB多肽、权利要求12-13中任一项的疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、权利要求14-19或33-34中任一项的疫苗组合物，或权利要求20-32中任一项的蛋白复合体用于在患者中诱导对疱疹病毒感染的免疫性的用途。
37.编码权利要求1-11中任一项的人疱疹病毒gB多肽的核酸。
38.包含权利要求37的核酸的重组载体。
39.用于预防或治疗患者中的疱疹病毒感染的方法，包括给予所述患者治疗有效量的权利要求1-11中任一项的人疱疹病毒gB多肽、权利要求12-13中任一项的疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、权利要求14-19或33-34中任一项的疫苗组合物，或权利要求20-32中任一项的蛋白复合体。
40.用于在受试者中诱导对疱疹病毒感染的免疫性的方法，包括给予受试者权利要求1-11中任一项的人疱疹病毒gB多肽、权利要求12-13中任一项的疱疹病毒gB多肽同源三聚体复合体、权利要求14-19或33-34中任一项的疫苗组合物，或权利要求20-32中任一项的蛋白复合体。
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