JP7145863B2 - 改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン - Google Patents
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Description
(1)単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、野生型HSV gBのドメインIV及びドメインIに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ(非中和エピトープ)のうち、少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gBタンパク質。
(2)非中和エピトープは、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープである、(1)の改変型HSV gBタンパク質。
(3)非中和エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567、R602、S631、又はD199に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、(1)又は(2)の改変型HSV gBタンパク質。
(4)改変は、アミノ酸残基の置換、及び/又はアミノ酸残基の欠損によって行われる改変を含む、(1)~(3)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(5)改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む、(4)の改変型HSV gBタンパク質。
(6)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(1)~(5)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(7)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(1)~(6)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(8)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(7)の改変型HSV gBタンパク質。
(9)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(8)の改変型HSV gBタンパク質。
(10)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含む、(7)の改変型HSV gBタンパク質。
(11)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、(6)~(10)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(12)糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602N、D603A、A604Tのアミノ酸残基置換によって行われる、(11)の改変型HSV gBタンパク質。
(13)改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、(5)~(12)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(14)前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199N、D200A、及びH201Tのアミノ酸残基置換によって行われる、(13)の改変型HSV gBタンパク質。
(15)前記改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、(4)~(14)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(16)(1)~(15)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
(17)単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換又は欠失させた、改変型HSV gBタンパク質。
(18)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(17)の改変型HSV gBタンパク質。
(19)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、(17)又は(18)の改変型HSV gBタンパク質。
(20)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、(17)~(19)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(21)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(17)~(20)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(22)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるS631に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(17)~(21)のいずれか改変型HSV gBタンパク質。
(23)(18)~(22)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
HSV-2の333株に由来するgBのエクトドメイン1-705aa(gB1-705)のcDNA(配列番号4)をpCAGGS1-dhfr-neoにクローニングした。gBのC末端にはStrep TagIIが付加されるようにデザインした。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システム(ライフテクノロジー社)を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、4~6日で培養上清を回収した。gBを含む培養上清は、培地中に含まれるビオチンを除くためにUF膜で濃縮した。濃縮した培養上清は、StrepTactinカラムを使った精製を行い、精製gB2を取得した。gBの370から457aaまでのアミノ酸をコードする遺伝子をPCRにより増幅し、pET43.1b(+)にクローニングし、gB370-457発現プラスミドを構築した。このプラスミドには精製を容易にするため、Nus-Tag遺伝子とHis-Tag遺伝子が付加されている。プラスミドをRosetta2(Novagen)に形質転換した。LB培地中で37℃にて対数増殖期中期まで培養した後、1mM IPTGで発現誘導し、25℃オーバーナイトで培養した。可溶性タンパクの抽出にはBugBuster mixを用いた。得られたタンパクは、Ni NTA Agarose(QIAGEN)を用いて精製した。
<抗体断片scFv-hFcの調製>
単離したscFv遺伝子の可変領域をヒトFc遺伝子と連結し、pCAGベクターにクローニングし、scFv-hFc発現プラスミドを構築した。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、4~6日で培養上清を回収した。培養上清は、Ab Rapid PuRe 10(プロテノバ)を用いてscFv-hFcの精製を行った。また、各scFv遺伝子がクローニングされているファージミドベクターを有する大腸菌TG1株を2×YTCG培地(37℃)で培養し、M13K07ヘルパーファージをmoi=20で感染させた後、2×YTCK培地(25℃)、オーバーナイトでファージの発現を行った。得られたscFv-phageは20%-PEG-2.5M NaClによる濃縮を行った。
得られた抗gB抗体44クローンをグルーピングするために、材料としてgB1-705をトリプシン又はキモトリプシンで消化したgB断片、gB1-705及びその切断変異体を用いてWestern blottingを実施した。
さらに取得抗体44クローンのグルーピングを行うために、各抗gBクローンのscFv-phage及びscFv-hFcを用いた競合ELISAを実施した。
gBのエクトドメインである1-705aa中の荷電アミノ酸残基(187箇所)をそれぞれアラニンに改変した遺伝子をPCRによって構築し、pCAGGS1-dhfr-neoにクローニングした。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システムを用いた。取得したgBアラニン置換体の発現量と、アラニン置換体と抗体断片との結合活性をELISAによって評価した。
<細胞とウイルス>
ウイルスの培養、感染価測定、中和抗体価測定にはVero細胞(CCL.81)をATCCから購入して使用した。中和試験及び感染防御能解析にはHuman herpesvirus 2(HSV-2)MS株[VR-540]を使用した。HSV-1はATCCからKOS株(VR-1493)を購入し使用した。Vero細胞は、10%FBS含有MEM培地でフルシートになるまで培養し、HSV-2 MS株及びHSV-1 KOS株をm.o.i=0.01~1で接種し、2-3日間2%FBS含有MEM培地で培養後、3回の凍結融解により細胞内のウイルスを培地中に放出させた。遠心後、上清を回収し、HSV-2ウイルスバンク及びHSV-1ウイルスバンクとした。
取得した抗gB クローンの中和活性をウイルス中和試験により評価した。中和試験はプラーク数減少活性(プラークリダクション活性)測定とcell to cell感染拡大抑制活性測定の2種類の方法を用いて行った。対象とするウイルスはHSV-2 MS株とHSV-1 KOS株の2種を用いた。プラークリダクション活性測定は、被験抗体を所定の濃度になるように調製し約100PFUのHSV-2 MS株又はHSV-1 KOS株と混合後、37℃1時間反応させた。48ウェルプレートにフルシートになったVero細胞に反応液を播種し、30℃で1時間吸着後に1%メチルセルロース含有培地で24時間培養後、メタノールとエタノールを1対1で混合した50%メタノール/50%エタノール(-20℃)で、-20℃で30分間不活化及び固定を行った。その後、抗HSV gBモノクローナル抗体を37℃で1時間反応させ、抗mouse IgG-HRP(Dako P0447)とTMBH(MOS TMBH-1000)で免疫染色し、ELISPOTアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラーク数をカウントした。
<改変型gB抗原設計の戦略>
抗HSV2-gB抗体の網羅的取得、並びにそれらのエピトープマッピング及び機能分類を行った結果、gB2抗原上のドメインIV及びドメインIに中和エピトープと非中和エピトープ、ドメインIIに中和エピトープが存在することが分かった。防御活性発現の観点から、中和エピトープを有益なエピトープとし、非中和エピトープを無益又は有害なエピトープとし、gBドメインI及びドメインIVに存在する非中和エピトープを脱エピトープ化することによる改変型gB抗原を設計した。ベースとなる野生型gBはエクトドメインgB1-705であり、StrepTactin精製用にC末端側にStreptagIIを付加している(図4(A))。
野生型HSV-2の333株に由来するgBのエクトドメイン(1-705aa)のcDNA(配列番号4)をpCAGGS1-dhfr-neoにクローニングした。gBのC末端にはStrep TagIIが付加されるようにデザインした。この配列をテンプレートに、以下の変異を導入した改変体を設計した。
改変体bcev1-3:D199N、D200A、H201T
改変体bceg13:R567N、P568S、G569S
改変体bcev11:D199N、D200A、H201T、R613A
改変体bcev12:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A
改変体bcev13:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A、S631N、H632A、Q633T
改変体bcev19:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A、S631N、H632T、Q633T
改変体bcev19’:R567N、P568S、G569S、R613A、S631N、H632T、Q633T
改変体bcev50:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A、R602N、D603A、A604T、S631N、H632T、Q633T
改変体bcev50’:R567N、P568S、G569S、R613A、R602N、D603A、A604T、S631N、H632T、Q633T
目的である、非中和抗体との反応性が低下又は無くなっていることを確認するため、作製した改変体bcev1-3、bceg13、bcev12、bcev19及びbcev50の、44クローンの抗gB2モノクローナル抗体に対する反応性を、ELISAによって評価した。コントロールとして、野生型gB1-705を用いた。gB1-705をPBSで1μg/mLに希釈し、MaxiSorp plateに50μL入れ、4℃でオーバーナイトインキュベートすることによってgB1-705を固相化した。固相化後、プレートをPBSで洗浄し、取得した抗体をプレートのウェルに100μL加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、検出抗体anti-human IgG Fc/HRP(ROCKLAND)をプレートのウェルに100μL加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMBをプレートのウェルに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度(O.D.450nm/650nm)を測定した。
作製した改変型gB抗原bcev19及びbcev50のマウス免疫原性試験を別々に実施した。いずれの実験も抗原量が0.3μg/匹及び1μg/匹にて2週間間隔で3回皮下免疫した。各群の動物例数はいずれもn=4として実験を行なった。
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、改変型gB抗原bcev19及びbcev50の予防的投与における感染防御能を別々に評価した。いずれの実験も陽性対照として野生型gB1-705(gBWT)を用いた。抗原は全て、0.03μg/匹、0.1μg/匹、0.3μg/匹、1μg/匹にて2週間間隔で3回皮下免疫した。最終免疫(3回目)から2週間後に行うウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種6日前にDepo-Proveraを2mg/匹で皮下接種した。麻酔下で5×105PFU/20μL/匹のHSV-2 MS株を経腟接種し、21日間経過観察を行った。生存日数(生存率)及び症状スコアを指標に感染防御能を評価した。症状スコアは、膣病変症状及び全身症状の程度により分類し、それぞれ3段階と2段階のスコアを設定した。次に示す膣病変と全身症状のスコアを合算したものを症状スコアとした。膣病変に対するスコア(0:変化なし、1:部分的な紅斑・腫脹、2:広範囲の腫脹・浮腫、3:潰瘍・出血)。全身症状に対するスコア(0:変化なし、1:立毛、2:後肢麻痺)。また、死亡又は犠牲死させたものはスコア6とした。各群の動物例数をn=10として実験を行ない、グラフ中にはそれらの平均値をプロットした。
マウス免疫原性試験及びマウス感染防御試験において野生型gB(gB1-705)に比して優越性が認められた改変型gB抗原bcev19及びbcev50の免疫血清について、イムノ・リフォーカスが誘導されているか否かをそれぞれgB1-457及びgB111-457を固相化したELISAにより解析した。
gB改変体であるbcev19は、ドメインIにD199N、D200A、H201T、ドメインIVにR613A、R567N、P568S、G569S、S631N、H632T、Q633Tの改変を導入している。またbcev50は、ドメインIにD199N、D200A、H201T、ドメインIVにR613A、R567N、P568S、G569S、S631N、H632T、Q633T、R602N、D603A、A604Tの改変を導入している。我々はbcev19及びbcev50に導入した改変の効果をさらに調べるために、bcev19及びbcev50に含まれるドメインIの改変D199N、D200A、H201Tのみを原体のアミノ酸配列に戻した改変体、それぞれbcev19’及びbcev50’を作出した。
Claims (14)
- 単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567、R602、S631、又はD199に相当するアミノ酸残基を含むエピトープのうち、少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、アミノ酸残基の置換、及び/又はアミノ酸残基の欠損によって行われる改変を含む、請求項1に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む、請求項2に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項5に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567N、P568S、G569S、S631N、H632T、及びQ633Tのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項6に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含む、請求項5に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項4~8のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602N、D603A、A604Tのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項9に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項3~10のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199N、D200A、及びH201Tのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項11に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 前記改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、請求項2~12のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
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