JPWO2019044927A1 - 改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン - Google Patents

改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン Download PDF

Info

Publication number
JPWO2019044927A1
JPWO2019044927A1 JP2019539596A JP2019539596A JPWO2019044927A1 JP WO2019044927 A1 JPWO2019044927 A1 JP WO2019044927A1 JP 2019539596 A JP2019539596 A JP 2019539596A JP 2019539596 A JP2019539596 A JP 2019539596A JP WO2019044927 A1 JPWO2019044927 A1 JP WO2019044927A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
hsv
protein
modified
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2019539596A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7145863B2 (ja
Inventor
泰亮 森
泰亮 森
知裕 西村
知裕 西村
清水 裕之
裕之 清水
みゆき 松本
みゆき 松本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KM Biologics Co Ltd
Original Assignee
KM Biologics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KM Biologics Co Ltd filed Critical KM Biologics Co Ltd
Publication of JPWO2019044927A1 publication Critical patent/JPWO2019044927A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7145863B2 publication Critical patent/JP7145863B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • A61K39/245Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/20Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55561CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55572Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16611Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16611Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16634Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/16011Herpesviridae
    • C12N2710/16611Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16671Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質であって、野生型HSV gBのドメインIV及びドメインIに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ(非中和エピトープ)のうち、少なくとも1つのエピトープが不活性化(脱エピトープ化)された、改変型HSV gBタンパク質。

Description

本発明は、改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチンに関する。
単純ヘルペスウイルス(Herpes simplex virus;HSV)は、向神経性の病原体であり、粘膜上皮に初感染後は知覚神経に移行し、三叉神経節又は仙骨神経節にて終生潜伏感染する。潜伏しているHSVはときに再活性化し、様々な病態を引き起こす(非特許文献1)。
HSVには2つの血清型(HSV−1、HSV−2)が知られており、HSV−1は主に口唇・角膜ヘルペス、HSV−2は主に性器ヘルペスの原因となる。しかし近年、性行動の多様化等から、しばしばHSV−1が性器ヘルペス、HSV−2が口唇ヘルペスの原因となることもある。日本における抗体陽性者(既感染者)比率は、HSV−1で60〜80%、HSV−2は10%であり、HSV−2に限ったとしてもワクチンの潜在需要は1000万人と推測される(非特許文献2)。また、米国における抗体陽性者(既感染者)比率は、HSV−1が57%、HSV−2が20%(そのうち約10%が顕在性の性器ヘルペス)となっている(非特許文献3)。
HSVの細胞への感染成立には、吸着と侵入の2段階で5つのエンベロープ糖タンパク質(glycoprotein)が関与していることが知られている。この5つのエンベロープ糖タンパク質はそれぞれ、エンベロープ糖タンパク質B(gB)、エンベロープ糖タンパク質C(gC)、エンベロープ糖タンパク質D(gD)、エンベロープ糖タンパク質H(gH)、エンベロープ糖タンパク質L(gL)と呼ばれている(非特許文献4)。
まず、吸着過程は、gB及びgCが細胞表面のヘパラン硫酸に結合することがきっかけとなる(非特許文献5、6)。この過程はHSVが細胞に侵入する際必須ではないが、より効率的な侵入に関与していると考えられている。次に、侵入過程では、gB及びgDがそれぞれの宿主細胞受容体と結合し、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜が融合することによって開始される。
宿主細胞受容体としてgB受容体とgD受容体が知られている。gB受容体として、NM−IIA(非特許文献7、8)及びMAG(非特許文献9)が同定されている。gD受容体として、ネクチン1(非特許文献10)、HVEM(非特許文献11)、及び3−O−硫酸化ヘパラン硫酸(非特許文献12)が同定されている。また、gH/gLのヘテロダイマーは、gB及びgDと相互作用し膜融合において重要な役割を果たしていることが知られている(非特許文献13)。
2006年にHSV−1 gBの構造が解かれた結果、gBは5つのドメインをもった3量体を形成していることが明らかになった(非特許文献14)。また、gBの構造は膜融合タンパク質として知られているVSV(Vesicular stomatitis virus)のgGと似た構造をとっており、このことはgBがHSVの膜融合タンパク質であることを裏付けている。また、gBは他のヘルペスウイルスにおいても高度に保存されており、その機能はヘルペスウイルスに共通するものであると考えられている。
感染症を引き起こす病原体は、従来型ワクチンで十分な効果を得ることが出来るClass I群病原体と、従来型ワクチンや病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得出来ないClass II群病原体とに大別される。Class II群病原体の防御が難しい理由として、それらが有する巧妙な免疫逃避機構が指摘されている(非特許文献15)。HSVはClass II群病原体に分類されるが、これはHSVが免疫逃避機構を有し、宿主の免疫反応を巧妙にくぐり抜けているからであると考えられている。HSVワクチン開発に関しては、これまで弱毒生ワクチンやアジュバント不活化ワクチンを用いた検討が試みられてきたが、いずれもT細胞免疫、及びB細胞免疫共に応答が不十分であり、自然感染後に得られる不十分な免疫応答のレベルと大差無いものであった。
Roizman, B.ら、Herpes simplex viruses, p. 2501-2602. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), 「Fields Virology」, 5th ed. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, P.A. 2007 Hashido M1ら、An epidemiologic study of herpes simplex virus type 1 and 2 infection in Japan based on type-specific serological assays, Epidemiol Infect. 1998 Mar; 120(2):179-86 Decision Resources; Emerging Vaccines 2008 ウイルス 2010 第60巻第2号,pp.187-196 Herold, B. C.ら、Glycoprotein C-independent binding of herpes simplex virus to cells requires cell surface heparan sulphate and glycoprotein B. J Gen Virol 1994 75 (Pt 6):1211-22 Herold, B. C.ら、Glycoprotein C of herpes simplex virus type 1 plays a principal role in the adsorption of virus to cells and in infectivity. J Virol 1991 65:1090-8 Arii, J.ら、Non-muscle myosin IIA is a functional entry receptor for herpes simplex virus-1. Nature 2010 467:859-62 Satoh, T.ら、PILRalpha is a herpes simplex virus-1 entry coreceptor that associates with glycoprotein B. Cell 2008 132:935-44 Suenaga, T.ら、Myelin-associated glycoprotein mediates membrane fusion and entry of neurotropic herpesviruses. Proc Natl Acad Sci U S A 2010 107:866-71 Geraghty, R. J.ら、Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science 1998 280:1618-20 Montgomery, R. I.ら、Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell (1996)87:427-36 Shukla, D.,ら、A novel role for 3-O-sulfated heparan sulfate in herpes simplex virus 1 entry. Cell 1999 99:13-22 Eisenberg RJら、Herpes virus fusion and entry: a story with many characters. Viruses 2012 4:800-832 10.3390/v4050800 SCIENCE 2006 313, 14, 217-220 Vaccine 26 (2008) 6189-6199 The Journal of Immunology, 1997,159 279-289.
上述したように、HSVの治療にはアシクロビル等の抗ウイルス薬が用いられている。しかし、これらの抗ウイルス薬は、ウイルスを完全に除去することはできず、また服用を中止するとウイルスが再活性化する。そのため、HSVの感染そのものを防御する予防用ワクチン或いは再発症状を軽減緩和する治療用ワクチンの開発が望まれるが、現在、有効なワクチンは存在せず、そのアンメットニーズは高い。
本発明は、免疫誘導に際して、野生型HSV gBに比べて、HSV gBに対する高い中和活性を示す中和抗体の含有割合が高い抗体を誘導でき、HSV感染症の予防及び/治療に利用し得る、改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むワクチンを提供することを課題とする。
本発明者らは、HSVの主要な防御抗原の一つとして知られているgBタンパクに関して、網羅的なB細胞エピトープ解析を行い、防御活性発現において有益なエピトープ(中和エピトープ)と無益又は有害なエピトープ(非中和エピトープ)とに分類することを試みた。そして、無益又は有害なエピトープを脱エピトープ化し、有益なエピトープを免疫的に際立たせることによって、その中和抗体誘導能や感染防御能を増強させた改変型HSV gBタンパク質、及び当該改変型HSV gBタンパク質を含むワクチンを完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
(1)単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、野生型HSV gBのドメインIV及びドメインIに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ(非中和エピトープ)のうち、少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gBタンパク質。
(2)非中和エピトープは、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープである、(1)の改変型HSV gBタンパク質。
(3)非中和エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567、R602、S631、又はD199に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、(1)又は(2)の改変型HSV gBタンパク質。
(4)改変は、アミノ酸残基の置換、及び/又はアミノ酸残基の欠損によって行われる改変を含む、(1)〜(3)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(5)改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む、(4)の改変型HSV gBタンパク質。
(6)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(1)〜(5)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(7)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(1)〜(6)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(8)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(7)の改変型HSV gBタンパク質。
(9)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(8)の改変型HSV gBタンパク質。
(10)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含む、(7)の改変型HSV gBタンパク質。
(11)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、(6)〜(10)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(12)糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602N、D603A、A604Tのアミノ酸残基置換によって行われる、(11)の改変型HSV gBタンパク質。
(13)改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、(5)〜(12)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(14)前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199N、D200A、及びH201Tのアミノ酸残基置換によって行われる、(13)の改変型HSV gBタンパク質。
(15)前記改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、(4)〜(14)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(16)(1)〜(15)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
(17)単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換又は欠失させた、改変型HSV gBタンパク質。
(18)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(17)の改変型HSV gBタンパク質。
(19)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、(17)又は(18)の改変型HSV gBタンパク質。
(20)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、(17)〜(19)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(21)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(17)〜(20)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質。
(22)改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるS631に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、(17)〜(21)のいずれか改変型HSV gBタンパク質。
(23)(18)〜(22)のいずれかの改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
本発明の改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むワクチンによって免疫誘導した場合、野生型HSV gBで免疫誘導した場合に比べて、血清中に中和活性の高い中和抗体が相対的に多く含まれ得る。すなわち、本発明の改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むワクチンはイムノ・リフォーカスを誘導し、HSVに対する強い防御効果をもたらすことが可能である。したがって、HSV感染症に対して高い予防・治療効果が期待できる。
実施例2のgBとそのプロテアーゼ切断断片を用いたSDS−PAGE及びWestern Blottingの結果を示す図である。 実施例2の競合ELISAにより取得した抗gB抗体を分類し得られた相関図である。 実施例3のアラニンスキャングによるgB抗体のエピトープの同定結果のMOE図である。 実施例5の改変型gBタンパク質の設計戦略のための模式図を示す図である。 実施例5の改変型gBタンパク質の設計戦略のための結晶構造の簡略図を示す図である。 実施例5のbcev19のマウス免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例5のbcev50のマウス免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例5のbcev19のマウス感染防御試験の生存率の結果を示す図である。 実施例5のbcev19のマウス感染防御試験の症状スコアの結果を示す図である。 実施例5のbcev50のマウス感染防御試験の生存率の結果を示す図である。 実施例5のbcev50のマウス感染防御試験の症状スコアの結果を示す図である。 実施例5のbcev19のイムノ・リフォーカスの解析結果を示す図である。 実施例5のbcev50のイムノ・リフォーカスの解析結果を示す図である。 実施例5のゲル濾過クロマトグラフィーによるbcev19、bcev19’、bcev50及びbcev50’の性状解析の結果を示す図である。 実施例5のマウス免疫原性試験のbcev19とbcev19’の比較結果を示す図である。 実施例5のマウス免疫原性試験のbcev50とbcev50’の比較結果を示す図である。 HSV−1由来gBのアミノ酸配列(配列番号2)及びHSV−2由来gBのアミノ酸配列(配列番号3)を多重整列した比較結果を示した図であり、斜体部はリーダー配列を示し、下線部はHSV−1由来gBのドメインIIの383−388番目のアミノ酸残基(I383−R388)、及び、HSV−2由来gBのドメインIIの386−391番目のアミノ酸残基(I386−R391)を示す。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本発明の改変型HSV gBタンパク質は、単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質であって、野生型gBのドメインIV及びドメインIに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ(非中和エピトープ)のうち、少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gBタンパク質である。
本発明は、本発明者らが提案する仮説、HSV gB抗原において「デコイ領域」が存在することに基づくものである。「デコイ領域」は、英語の「Decoy(おとり)」に由来し、病原体が宿主の免疫反応から逃れる免疫逃避機構の一つと考えられる。「デコイ領域」は、中和抗体活性の無い又は低い抗体を誘導する抗原領域であり、この欺瞞的刷り込み(Deceptive Inprinting;「免疫偏向」ともいう)によって、中和抗体が産生しないよう、又は産生量が少ないように、病原体が宿主の免疫反応から逃れる機構であると考えられる。
これまで、HSVにおいてデコイ領域の存在は確認されておらず、デコイ領域の概念すらなかった。本発明者らは、ヒト抗体ライブラリーを用いて実施した抗HSV gB抗体の網羅的探索によって得られた抗gBモノクローナル抗体に対して、詳細なエピトープマッピング解析を行った。その結果、はじめてHSV gBのドメインIV及びドメインIは、無益又は有害なエピトープが集中しているデコイ領域であることを明らかにした。さらにこのデコイ領域において、非中和エピトープを脱エピトープ化することによって、有益なエピトープを免疫的に際立たせることによって、中和活性の高い抗体を誘導できる改変型HSV gBタンパク質を得るに到った。
「野生型HSV gB」とは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するHSV−1由来のエンベロープ糖タンパク質B(gB)、又は配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するHSV−2由来のgBの全長を指し、両者を多重整列して比較した結果、その配列同一性は、約87%である(図17)。gBの立体構造も解析されており、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及びエクトドメインからなることは知られている。HSV−1由来のgBの結晶構造は、例えばScience 313:217−220(2006)及びJ.Virol.84:12924−12933(2010)によって報告されている。一方、HSV−2由来のgBの結晶構造は、報告されていないが、上記HSV−1由来のgBの結晶方法にしたがって、同様に解析することができる。「野生型HSV gBのエクトドメイン」は、可溶性の、抗原性を有する、野生型HSV gBの細胞外領域を意味する。野生型HSV gBのエクトドメインの一例は、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるHSV−2の333株由来の野生型gBエクトドメイン1−705である。
gBの結晶構造においては、それぞれ上部(Crown)と下部(Bottom)に位置するドメインIV及びドメインIは、中間部(Middle)に位置するドメインIIよりも「目立つ」ため、抗原提示性が高く、実際に血液中の抗体においても、本発明者らが調べたところ、ドメインIV及びドメインIに対する抗体の割合が高く、ドメインIIに対する抗体の割合が低い。しかし一方で、本発明者らの研究によれば、野生型HSV gBドメインIIには、中和抗体を誘導するエピトープ(本明細書においては「中和エピトープ」という)しか存在しないのに対して、野生型HSV gBのドメインIV及びドメインIには、中和エピトープと、非中和抗体を誘導するエピトープ(本明細書においては「非中和エピトープ」という)との両方が存在することがわかった。非中和抗体は、抗原(すなわち、ウイルス)と結合するものの、ウイルスの活性を抑えることができないため、特にワクチンの製造においては非中和抗体ではなく中和抗体の産生を誘導できることが重要とされている。
本発明の改変型HSV gBタンパク質は、中和抗体の産生にあまり有益でない、「目立つ」ドメインIV及びドメインIを脱エピトープ化し「目立たなく」することで、中和エピトープを有するドメインIIを「目立たせる」ことにより、中和活性の高い抗体を誘導することができる。
「改変型HSV gBタンパク質」(「HSV gBの改変タンパク質」又は「改変体」ともいう。)とは、野生型HSV gBに対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠失又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質等の野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。本発明の改変型HSV gBタンパク質は、野生型タンパク質よりも中和抗体誘導活性が高い。
「中和抗体誘導活性」とは、抗原タンパク質の中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質を被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価(neutralizing antibody titer)で評価され得る。「中和抗体」とは、ウイルス粒子の感染性を失わせることができる抗体をいい、例えば被検ウイルスのプラーク数を50%減少させるのに必要な抗体の濃度(NT50)にてその抗体の中和活性の強度を評価する。
「脱エピトープ化」とは、野生型HSV gBにおいてエピトープとして抗体産生に寄与していた部位をエピトープとして機能しないように改変することをいう。脱エピトープ化の方法としては、エピトープの部位にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へと置換する方法、エピトープの部位にあるアミノ酸残基を欠損(欠失)させる方法、及びエピトープの部位にあるアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖を導入する方法等が挙げられる。脱エピトープ化の方法としては、糖鎖を導入する方法、特にN型糖鎖(N−グリコシド結合糖鎖)を導入する方法が好ましい。これにより、糖鎖を導入した部分のみならず、その嵩高さによって周辺のエピトープをも同時にマスキング可能な点で有効である。gBと相互作用する抗体やレセプター等のタンパク質とのサイズ比を考えると、数アミノ酸程度のごく狭い範囲で結合が形成されるような、点と点の相互作用による可能性が低いと予想される。gBとレセプターとの結合においては、広範囲のアミノ酸が協調的に結合を形成するような面と面での相互作用網が形成されていると考えられる。糖鎖導入は、自身の嵩高さによって周辺残基を広範囲に隠し、同時に結合相手のアクセスを阻害するのに有効な脱エピトープ化の方法であると考えられる。また、糖鎖は抗糖鎖抗体が誘導され難いという報告もあり、改変による新たな免疫原性の出現可能性を低く抑えることが可能であると考えられる。
野生型gBのドメインIV及びドメインIに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ(非中和エピトープ)の一例としては、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域、さらに好ましくは当該アミノ酸残基からの距離が1nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。ここで「アミノ酸残基からの距離」とは、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面の形状に関わらず、上記アミノ酸残基からの直線距離をいう。非中和エピトープは無益又は有害の抗体の産生を誘導し、中和抗原の産生に有益でないため、これらの脱エピトープ化は、無益又は有害の抗体の産生を低減し、また、有益なエピトープを際立たせることで、中和抗体の産生を増加できる。結晶方法は特に限定されないがJ.Virol.84:12924−12933(2010)に記載の結晶方法が挙げられる。例えば、gBの結晶を、15%PEG4000−0.3M NaCl−0.1Mクエン酸ナトリウム(pH5.5)を用いて成長させることができる。
非中和エピトープとして、また配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。これらのエピトープが非中和エピトープであることが本発明者らによって証明されているため、これらのエピトープの脱エピトープ化は、防御活性発現において無益又は有害の抗体の産生を低減できる。また、これらのエピトープの脱エピトープ化は、有益なエピトープを際立たせることで、中和抗体の産生割合を増加させることができる。
脱エピトープのための改変は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠損、及び/又はアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む。
上記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列における199番目のアスパラギン酸残基(D199)、567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、及び631番目のセリン残基(S631)に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含むことが好ましい。配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含むことが好ましく、該糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567N、P568S、G569S、S631N、H632T、及びQ633Tのアミノ酸残基置換によって行われることが好ましい。配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含むことがさらに好ましい。改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含むことが好ましく、該糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602N、D603A、A604Tのアミノ酸残基置換によって行われることが好ましい。改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含むことが好ましく、該糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199N、D200A、及びH201Tのアミノ酸残基置換によって行われることが好ましい。
糖鎖の導入方法は、通常の方法であればよく特に限定されないが、たとえば、N型糖鎖を導入する場合、野生型gBタンパク質のcDNA(GenBank:M15118.1、配列番号4)をテンプレートとし、N型糖鎖を導入する目的部位の3つの連続したアミノ酸配列が、N−X−S/T(Xはプロリン以外の任意のアミノ酸)となるように、プライマーを設計し、PCRによって変異を導入する。糖鎖導入のための変異は、たとえば、配列番号1に記載のアミノ酸配列における以下の変異が挙げられる:(D199N、D200A、H201T)、(R567N、P568S、G569S)、(S631N、H632A、Q633T)、及び(S631N、H632T、Q633T)。目的の改変型gBタンパク質の核酸配列、さらに必要あれば6×His等のタグを連結した核酸配列を適切なベクターにクローニングし、発現させることによってgB改変体を得ることができる。そして、gB改変体の目的部位のアスパラギンに通常の方法によってN型糖鎖を付加する。
非中和エピトープの改変はさらに、エピトープである荷電アミノ酸残基を特徴のないアミノ酸残基、たとえばアラニン残基への置換を含んでもよい。この方法はN型糖鎖の導入とは異なり、ピンポイントで脱エピトープ化することができる利点がある。たとえば、アラニン置換として、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換を含むことが好ましい。
改変型HSV gBタンパク質として、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれに糖鎖導入され、さらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換された、gBタンパク質が好ましい。改変型HSV gBタンパク質の別の例としては、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれに糖鎖導入され、さらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換された、gBタンパク質がより好ましい。
本発明の改変型HSV gBタンパク質は、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型gBタンパク質のcDNAをテンプレートとし、目的の変異を導入するためのプライマーを設計して、PCRによって変異が導入された核酸を得て、発現プロモータと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。また、糖鎖導入による改変体の場合は、上述のとおりに得ることができる。
作製された改変型HSV gBタンパク質は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
HSV感染症は、HSV−1及びHSV−2による感染症を含み、例えば、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、性器ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス、並びに、HSVに起因する口内炎、皮膚疾患、脳炎、髄膜炎、及び脊髄炎が挙げられる。
本発明のHSVワクチンは、本発明の改変型HSV gBタンパク質を含む。
本実施形態のHSVワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状(凍結乾燥粉末、乾燥粉末)、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。
本実施形態のHSVワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤(例えば、チメロサール)、等張化剤、pH調整剤、等が、更に適宜配合されてもよい。
本実施形態のHSVワクチンの免疫原性をさらに高めるために、アジュバントを更に含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント(AS03、MF59等)、CpG及び3−O−脱アシル化−4’−モノホスホリル lipid A(MPL)等のToll様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ−グルタミン酸等のポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリン等の多糖類が挙げられる。
本実施形態のHSVワクチンは、本発明の改変型HSV gBタンパク質と、必要に応じて、担体、アジュバント等とを混合することにより得ることができる。アジュバントは、用時に混合するものであってもよい。
本実施形態のHSVワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。
本実施形態のHSVワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによって投与する方法であってもよい。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例1 抗gB抗体の単離
HSV−2の333株に由来するgBのエクトドメイン1−705aa(gB1−705)のcDNA(配列番号4)をpCAGGS1−dhfr−neoにクローニングした。gBのC末端にはStrep TagIIが付加されるようにデザインした。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システム(ライフテクノロジー社)を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、4〜6日で培養上清を回収した。gBを含む培養上清は、培地中に含まれるビオチンを除くためにUF膜で濃縮した。濃縮した培養上清は、StrepTactinカラムを使った精製を行い、精製gB2を取得した。gBの370から457aaまでのアミノ酸をコードする遺伝子をPCRにより増幅し、pET43.1b(+)にクローニングし、gB370−457発現プラスミドを構築した。このプラスミドには精製を容易にするため、Nus−Tag遺伝子とHis−Tag遺伝子が付加されている。プラスミドをRosetta2(Novagen)に形質転換した。LB培地中で37℃にて対数増殖期中期まで培養した後、1mM IPTGで発現誘導し、25℃オーバーナイトで培養した。可溶性タンパクの抽出にはBugBuster mixを用いた。得られたタンパクは、Ni NTA Agarose(QIAGEN)を用いて精製した。
扁桃腺や脾臓由来のヒトB細胞由来のmRNAからヒトVH及びVL cDNAを使用して調製されたscFv−phageディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、HSV−2のgBへの反応性を有するscFvクローンを44クローン単離した。単離したscFv遺伝子のVH鎖及びVL鎖遺伝子のDNA塩基配列をBig Dye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を用いて決定した。いずれのクローンも独立した配列を有しており、そのエピトープにバリエーションがあることが期待された。44クローン以外にも複数scFvクローンが取得されたが、その殆どが、D1又はD2に似た配列を有していた(データは示さず)。D1及びD2はVH5ファミリーであり、生体内の抗体のポピュレーションとしては、少ないものである。
実施例2 抗gB抗体の分類
<抗体断片scFv−hFcの調製>
単離したscFv遺伝子の可変領域をヒトFc遺伝子と連結し、pCAGベクターにクローニングし、scFv−hFc発現プラスミドを構築した。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、4〜6日で培養上清を回収した。培養上清は、Ab Rapid PuRe 10(プロテノバ)を用いてscFv−hFcの精製を行った。また、各scFv遺伝子がクローニングされているファージミドベクターを有する大腸菌TG1株を2×YTCG培地(37℃)で培養し、M13K07ヘルパーファージをmoi=20で感染させた後、2×YTCK培地(25℃)、オーバーナイトでファージの発現を行った。得られたscFv−phageは20%−PEG−2.5M NaClによる濃縮を行った。
取得したscFv−phage及びscFv−hFcの結合活性はELISAによって評価した。gB1−705をPBSで1μg/mLに希釈し、MaxiSorp plate(Nunc)に50μL入れ、4℃でオーバーナイトもしくは室温で1〜2時間インキュベートすることによって組換えgBを固相化した。固相化後、プレートをPBSで洗浄し、取得したscFv−phage、IgGをプレートのウェルに100μL加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、検出抗体anti−M13/HRP(GEヘルスケア)、もしくはanti−hFc/HRP(コスモバイオ)をプレートのウェルに100μL加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMBをプレートのウェルに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス)で吸光度(O.D.450nm/650nm)を測定した(データ示さず)。
<gBとそのプロテアーゼ切断断片を用いたWestern Blottingによる抗gB抗体の分類>
得られた抗gB抗体44クローンをグルーピングするために、材料としてgB1−705をトリプシン又はキモトリプシンで消化したgB断片、gB1−705及びその切断変異体を用いてWestern blottingを実施した。
500ngの変性又は未変性のgB1−705を8−16%SDS−PAGEへLoadし電気泳動した。変性状態のgB1−705は、gB1−705に2% 2−メルカプトエタノールを加え、96℃で5分間煮沸することで得た。非変性状態のgB1−705はこれらの操作を行わず、直接Loadした。トリプシン又はキモトリプシンで消化したgB断片は、以下のように得た。0.5M Tris−HCl(pH8.0)に500ngのgB1−705とトリプシン1ng、5ng若しくは1000ng、又はキモトリプシン1ngを加え、37℃、1時間又は3時間静置し酵素処理し、2%2−メルカプトエタノール(Wako)を添加したSDS−PAGEローディングバッファーを加え、96℃で5分間煮沸することで反応を停止させた。各検体を8−16%SDS−PAGEへLoadし電気泳動し、ゲルをニトロセルロース膜(MILLIPORE)へ転写し、2%スキムミルク/PBS−Tを用いてBlockingした。PBS−Tによる洗浄の後、各scFv−hFcを1μg/mL 2%スキムミルク−PBS−Tで室温、30分反応させた。再度の洗浄の後、2%スキムミルク−PBS−T中anti−hFc/HRPを反応させ、Immobilon Western Detection Regent(Millipore)で発色させた。SDS−PAGEのバンドの検出には、銀染色を行った。
結果を図1に示す。図1のSDS−PAGE及びWestern Blottingの各レーンの検体は以下のとおりである。SDS−PAGEにおいて、レーン1:非還元未変性gB1−705、レーン2:煮沸のみのgB1−705、レーン3:煮沸かつ変性剤で変性させたgB1−705、レーン4:煮沸かつ変性剤で変性させたgB370−457、レーン5:37℃で1時間1ng(1:500)のトリプシンで処理して煮沸かつ変性剤で変性させたgB1−705、レーン6:37℃で3時間5ng(1:100)のトリプシンで処理したgB1−705、レーン7:37℃で3時間100ng(1:5)のトリプシンで処理して煮沸かつ変性剤で変性させたgB1−705、レーン8:37℃で1時間1ng(1:500)のキモトリプシンで処理して煮沸かつ変性剤で変性させたgB1−705、レーンM:BenchMark prestained Ladder、及びレーンM´:Magic Western standardとしている。
gB1−705を非還元で煮沸なしでSDS−PAGEで分析すると、約300kDa付近にバンドを検出した(レーン1)。一方、gB1−705を煮沸することで、約100kDa付近にバンドを検出した(レーン2)。これは、それぞれgBの3量体と単量体を意味しており、煮沸することで3量体から単量体になることから、S−S結合を介して3量体を形成しているのではないことが示唆された。
トリプシン又はキモトリプシンによる処理によって、gBはそれぞれ断片化した。これらのgBと抗体E7 scFv−hFcの反応性をWestern blottingで検出した。E7 scFv−hFcは、非還元で煮沸していないgB1−705(レーン1)、煮沸したgB1−705(レーン2)、還元で煮沸したgB1−705(レーン3)及びプロテアーゼ処理したgB断片(レーン5、6、7)に反応性を示した(図1)。同様の反応パターンは抗体E17及びE31で観察された(表1)。これらのことは抗体E7、E17及びE31 scFv−hFcが連続エピトープであることを示唆している。抗体A17、D1、D2、D3、D37、D48及びE15 scFv−hFcは、非還元で煮沸していないgB1−705、煮沸したgB1−705、還元で煮沸したgB1−705及びプロテアーゼ処理したgB断片に反応性を示したが、それらのgB断片との反応性はE7、E17、E31とは異なるパターンを示した(表1)。D1及びD2間の反応パターン、D3及びD37間の反応パターンが同じであり、それぞれ同一又は近傍のエピトープを認識していることが示唆される。
gB断片の反応性のパターンから6つのグループに分類できた。E41、F13、F18、F19、F22、F30及びF78 scFv−hFcは、非還元で煮沸していないgB1−705のみに反応性を示した(表1)。これらの抗体クローンは、3量体特異的であり、不連続エピトープであることが示唆される。F7、F11、F12、F33、F52、F65、F67、F68、F69、F76、F80、F87、G39、G64、G76、H15、H34、H57、H61、H65、G10、G25及びG65は、非還元で煮沸していないgB1−705だけでなく煮沸したgB1−705への反応性を示した(表1)。これらの抗体クローンは、3量体特異的ではないが、ある程度の立体構造を認識する不連続エピトープであることが示唆される。E8、E35、E82及びE88は、非還元で煮沸していないgB1−705、煮沸したgB1−705及び還元で煮沸したgB1−705への反応性を示したが、プロテアーゼによる切断断片への反応性は確認できなかった(表1)。これらの抗体クローンは、完全に変性状態のgBとの反応性を有することから連続エピトープであることが示唆されるが、その領域はプロテアーゼによる影響を受けやすいのかもしれない。以上のgB及びgB断片を用いたWestern blottingによる解析により、取得した抗gB抗体44クローンは9つのグループに分類されることがわかった。このうち、30クローンが不連続エピトープ、14クローンが連続エピトープであることが示唆された。
<競合ELISAによる取得抗体の分類>
さらに取得抗体44クローンのグルーピングを行うために、各抗gBクローンのscFv−phage及びscFv−hFcを用いた競合ELISAを実施した。
取得したscFv−phageとscFv−hFc間の競合をELISAによって評価した。gB1−705をPBSで1μg/mLに希釈し、MaxiSorp plateに50μL入れ、4℃、オーバーナイトでインキュベートすることによってgB1−705を固相化した。固相化後、プレートをPBSで洗浄し、取得したscFv−hFcをプレートのウェルに50μL加え、25℃でインキュベーションした。1時間後、scFv−phageをプレートのウェルに50μL加え、25℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、検出抗体anti−M13/HRPをプレートのウェルに100μL加え、25℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMBをプレートのウェルに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度(O.D.450nm/650nm)を測定した。
その結果に基づき、抗体の相関図を作成した(図2)。抗体E41、F18、F19、F13、F78、F22及びF30が含まれるグループは、非還元で煮沸していないgB1−705のみに反応性を示すグループであるが、他のグループとは異なり、競合ELISAの結果から抗体E41、F18、F19、F13及びF78のグループとF22及びF30のグループに分類されることが確認された。一方、他のグループは上述したグループからさらに細分化されることはなかった。よって、抗gBクローンは、計10グループに分類された。またD48はgB370−457との反応性を有していたことからgBの370aaから457aaの中にエピトープが存在することが示唆された。
実施例3 アラニンスキャングによるgB抗体のエピトープの同定
gBのエクトドメインである1−705aa中の荷電アミノ酸残基(187箇所)をそれぞれアラニンに改変した遺伝子をPCRによって構築し、pCAGGS1−dhfr−neoにクローニングした。発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システムを用いた。取得したgBアラニン置換体の発現量と、アラニン置換体と抗体断片との結合活性をELISAによって評価した。
gBアラニン置換体を含む培養上清をMaxiSorp plateに入れ、室温で1時間インキュベートすることによってgBアラニン置換体を固相化した。固相化後、プレートをPBSTで洗浄し、検出抗体StrepTactin/HRP(IBA)をプレートのウェルに100μL加え、室温でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMBをプレートのウェルに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度(O.D.450nm/650nm)を測定し、発現量を求めた。
一方、gBアラニン置換体を含む培養上清をStreptactinを固定化したMaxiSorp plateに入れ、室温で1時間インキュベートすることによってgBアラニン置換体を固相化した。固相化後、プレートをPBSTで洗浄し、抗体断片をプレートのウェルに100μL加え、室温でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、検出抗体anti−human Fc/HRP(コスモバイオ)をプレートのウェルに100μL加え、室温でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMBをプレートのウェルに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで発色値(O.D.450nm/650nm)を測定し、結合活性を求めた。アラニン置換していない野生型gB1−705と比較して発現量あたりの反応性が変化しているかどうかでエピトープ候補を選出した。さらに、精査が必要な抗体の場合には、gBアラニン置換体の精製品を用いたELISAでエピトープ候補の絞りこみを行った。
アラニン置換体と抗体断片との結合活性に基づき、それぞれの抗体のエピトープを予測し、その結果を表2に示す。gB3量体のCrown部分を形成するドメインIVに対する抗体が28クローン存在し、最も数が多かった。続いて、Bottom部分を形成するドメインIに対する抗体が8クローン存在しており、Middle部分を形成するドメインIIに対する抗体が1クローンしか存在しなかった。エピトープを同定できた抗体の中には、アミノ酸配列上、離れた位置であるものが多い。MOE(図3)でHSV1のgBをテンプレートとして、HSV2のgBをモデリングし、その位置を確認したが、構造上近接したアミノ酸同士であった(データ示さず)。唯一ドメインIIを認識するD48は、R391とD362が同定されたが、D48がgB37−457と反応していることをから、R391がエピトープのキーである可能性が高い。また44クローン中7クローン(E82、E88、F7、F65、F80、G10、G76)のエピトープは同定に至らなかったが、これまでの競合ELISA等のグルーピングによって同グループにエピトープを同定できたクローンが存在するため、その近傍のアミノ酸残基がエピトープである可能性が高い。例えば、E82及びE88のエピトープは同定できなかったが、E8及びE35のエピトープは、R532、R613、H632であることがわかっている。E82及びE88は、E8及びE35と競合ELISAで競合するため、E82及びE88のエピトープは、R532、R613、H632の近傍であることが予想される。エピトープを同定できなかった抗体は、今回の解析が荷電アミノ酸残基に限定しているという意味で荷電アミノ酸以外のアミノ酸残基がエピトープの可能性が高いと考えられる。
実施例4 中和試験によるgBのCrown部分とBottom部分に中和エピトープと非中和エピトープの存在の解析
<細胞とウイルス>
ウイルスの培養、感染価測定、中和抗体価測定にはVero細胞(CCL.81)をATCCから購入して使用した。中和試験及び感染防御能解析にはHuman herpesvirus 2(HSV−2)MS株[VR−540]を使用した。HSV−1はATCCからKOS株(VR−1493)を購入し使用した。Vero細胞は、10%FBS含有MEM培地でフルシートになるまで培養し、HSV−2 MS株及びHSV−1 KOS株をm.o.i=0.01〜1で接種し、2−3日間2%FBS含有MEM培地で培養後、3回の凍結融解により細胞内のウイルスを培地中に放出させた。遠心後、上清を回収し、HSV−2ウイルスバンク及びHSV−1ウイルスバンクとした。
<ウイルス中和試験>
取得した抗gB クローンの中和活性をウイルス中和試験により評価した。中和試験はプラーク数減少活性(プラークリダクション活性)測定とcell to cell感染拡大抑制活性測定の2種類の方法を用いて行った。対象とするウイルスはHSV−2 MS株とHSV−1 KOS株の2種を用いた。プラークリダクション活性測定は、被験抗体を所定の濃度になるように調製し約100PFUのHSV−2 MS株又はHSV−1 KOS株と混合後、37℃1時間反応させた。48ウェルプレートにフルシートになったVero細胞に反応液を播種し、30℃で1時間吸着後に1%メチルセルロース含有培地で24時間培養後、メタノールとエタノールを1対1で混合した50%メタノール/50%エタノール(−20℃)で、−20℃で30分間不活化及び固定を行った。その後、抗HSV gBモノクローナル抗体を37℃で1時間反応させ、抗mouse IgG−HRP(Dako P0447)とTMBH(MOS TMBH−1000)で免疫染色し、ELISPOTアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラーク数をカウントした。
Cell to Cell感染拡大抑制活性測定は、48ウェルプレートにフルシートになったVero細胞に約100PFUのHSV−2 MS株又はHSV−1 KOS株を接種し、30℃で1時間吸着後、所定濃度の被験抗体を含有した1%メチルセルロース培地(抗体濃度は5μg/mL、25μg/mL及び125μg/mL)を添加し、HSV−2 MS株は約40時間、HSV−1 KOS株は約48時間培養後、50%メタノール/50%エタノール(−20℃)で、−20℃で30分間不活化及び固定を行った。その後、抗HSV gBモノクローナル抗体を37℃で1時間反応させ、抗mouse IgG−HRP(Dako P0447)とTMBHで免疫染色し、ELISPOTアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラークサイズの平均値を解析した。
結果を表3に示す。取得した44クローンは、中和抗体と非中和抗体の2つに大別され、中和抗体の中には、HSV−1とHSV−2の両方を中和するクローン、どちらか一方のみを中和する型特異的なクローン、プラーク数減少活性は強いがcell to cell感染拡大抑制活性は無い(弱い)クローン、プラーク数減少活性もcell to cell感染拡大抑制活性も共に強いクローン等が存在していた。また、この中和のパターンは、これまでのグルーピングの結果と連動していることが確認された(表3、図2)。
プラーク数減少活性は、5μg/mL、25μg/mL及び125μg/mLで解析し、5μg/mL以下まで中和能が認められるものを「++」、25μg/mL以下まで中和能が認められるものを「+」、125μg/mL以下で中和能が認められるものを「±」とした。Cell to Cell感染拡大抑制は、5μg/mL、10μg/mL及び20μg/mLで解析を行い、5μg/mL以下まで中和能が認められるものを「++」、10μg/mL以下まで中和能が認められるものを「+」、20μg/mL以下まで中和能が認められるものを「±」とした。測定は全てduplicateで実施した。
表2から、gB2抗原上のドメインIV及びドメインIに対する抗体が全体の抗体に占める割合が大きかったが、ドメインIV及びドメインIに対する抗体は、一部中和活性を有するものの、大部分が中和活性を示さなかった非中和抗体であった(表3)。これに対して、ドメインIIに対する抗体が全体の抗体に占める割合が小さかったものの、中和抗体であった。各gB抗体のエピトープの同定結果のMOE図(図3)には、これらのエピトープの位置を図示している。これらの結果から、ドメインIV及びドメインIには中和エピトープと非中和エピトープ、ドメインIIに中和エピトープが存在しており、また、ドメインIV及びドメインIには、「目立つ」抗原エピトープが多く存在することが分かった。
実施例5 ワクチン抗原の設計と評価
<改変型gB抗原設計の戦略>
抗HSV2−gB抗体の網羅的取得、並びにそれらのエピトープマッピング及び機能分類を行った結果、gB2抗原上のドメインIV及びドメインIに中和エピトープと非中和エピトープ、ドメインIIに中和エピトープが存在することが分かった。防御活性発現の観点から、中和エピトープを有益なエピトープとし、非中和エピトープを無益又は有害なエピトープとし、gBドメインI及びドメインIVに存在する非中和エピトープを脱エピトープ化することによる改変型gB抗原を設計した。ベースとなる野生型gBはエクトドメインgB1−705であり、StrepTactin精製用にC末端側にStreptagIIを付加している(図4(A))。
まずは、N型糖鎖付加によるgBの改変である。N型糖鎖はO型糖鎖と異なり、コンセンサス配列であるNXT又はNXS(Xはプロリン以外の任意のアミノ酸)の配列に付与される。糖ペプチドに対しては一般的に抗体ができにくく、糖鎖の嵩高さによって、その周辺にも抗体ができにくくなる(非特許文献16)。HSV2−gBのドメインIVは、レセプターとの結合に重要な領域と考えられているが、ウイルス膜表面から最も遠い位置にあり、表面に露呈しているため抗体が結合しやすい。実際、前述の結果のようにヒト血清中には、ドメインIVを認識する抗体が多く含まれていることが示唆されている。そこでドメインIVの非中和エピトープ3カ所にN型糖鎖を導入することとした(図4(B)及び図5)。一方、ドメインIは、gBの根元に位置しており、宿主細胞との融合に重要な領域であるが、エクトドメインのみを発現させた場合には、本来ウイルス膜表面と接触していた領域が表面に露呈する。また、ワクチンの製造に際して、gBのエクトドメインのみを用いたワクチン抗原デザインを想定している。従って、ウイルス膜と接している領域が新たに露呈してくる可能性があり、その非中和エピトープ領域1カ所にN型糖鎖を導入することとした(図4(B)及び図5)。野生型のgBに元々付加されている糖鎖は、HSV−1 gB(PDB No.3NWF)を参考に、N115、N371、N649に位置すると思われる(図4(B))。新たに糖鎖導入の位置として、D199、R567、R602、S631が選定された。
次は、アラニン置換によるgBの改変である。抗体のエピトープとして荷電アミノ酸残基が含まれることが多い。そこで、荷電アミノ酸残基を特徴のないアミノ酸残基へ置換する、脱エピトープ化の方法がとられることがある。この方法はN型糖鎖の導入とは異なり、ピンポイントで脱エピトープ化することができる利点がある。ドメインIVは非中和エピトープ以外にも中和エピトープも存在しており、1カ所アラニン置換(R613A)を行うこととした(図4(B)及び図5)。
<改変型gB1−705の調製>
野生型HSV−2の333株に由来するgBのエクトドメイン(1−705aa)のcDNA(配列番号4)をpCAGGS1−dhfr−neoにクローニングした。gBのC末端にはStrep TagIIが付加されるようにデザインした。この配列をテンプレートに、以下の変異を導入した改変体を設計した。
改変体bcev1−3:D199N、D200A、H201T
改変体bceg13:R567N、P568S、G569S
改変体bcev11:D199N、D200A、H201T、R613A
改変体bcev12:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A
改変体bcev13:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A、S631N、H632A、Q633T
改変体bcev19:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A、S631N、H632T、Q633T
改変体bcev19’:R567N、P568S、G569S、R613A、S631N、H632T、Q633T
改変体bcev50:D199N、D200A、H201T、R567N、P568S、G569S、R613A、R602N、D603A、A604T、S631N、H632T、Q633T
改変体bcev50’:R567N、P568S、G569S、R613A、R602N、D603A、A604T、S631N、H632T、Q633T
発現には、FreeStyle293又はExpi293発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、4〜6日で培養上清を回収した。gBを含む培養上清は、培地中に含まれるbiotinの影響を抑えるためにUF膜で濃縮した。濃縮した培養上清は、StrepTactinカラムを使った精製を行い、精製gBを取得した。
取得した精製gB1−705の性状は、SDS−PAGE及びゲル濾過クロマトグラフィーによって、多量体状態を確認した。ゲル濾過クロマトグラフィーについては、カラムはSuperdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)を使用し、濃度100μg/mLの各改変型gB精製品をアプライした。流速は0.4mL/minで泳動BufferはD−PBSを使用し、A280を検出した。
6種類の改変型gBの改変部位及びその特徴を表4に示す。
D199N、D200A、H201Tの改変を加えたbcev1−3は、ドメインIに糖鎖を導入する変異を付加したもので、その発現量が野生型のgB1−705と比較して約2倍に向上している。本来この領域はウイルス膜表面と接触している状態で安定化していると考えられる。野生型gB1−705は、分泌発現させたことにより本来溶媒接触していないこの領域が露呈されたため、不安定化し、そこに糖鎖が付加されることでbcev1−3は安定化し、結果として発現量が増したと推測される。
bceg13は、ドメインIVのR567N、P568S、G569Sの改変を加えたgBである。bcev1−3とは逆に野生型gB1−705と比較して、発現量が0.3倍になっている。野生型と同様の3量体構造は維持しているため、構造を維持するためにクリティカルな変異ではないが、野生型と比較して、単鎖の構造変化やフォールディングの速さが遅くなっているのかもしれない。
bcev11は、bcev1−3のD199N、D200A、H201Tの変異に加えて、ドメインIVに位置するR613Aを導入した改変体である。bcev11の発現量は、野生型gB1−705と同等であった。
bcev1−3の変異は発現量を向上させていたことを考えるとR613Aの変異は、逆に発現量を低下もしくは、野生型と同等にさせる変異なのかもしれない。
bcev11の性状も野生型と同等であり、3量体を形成していた。
bcev12は、bcev11にさらにR567N、P568S、G569Sの改変を加えたgBである。bceg13の結果を踏まえると、R567N、P568S、G569Sの変異を加えることで発現量が低下するはずであるが、予想外に発現量が野生型と比較して2倍に向上していた。これはD199N、D200A、H201Tの改変を加えたのみのbcev1−3と同等の発現量である。R613Aの変異も発現量低下に寄与するが、R567N、P568S、G569Sも加えることでドメインIVの構造やフォールディング速度がbcev1−3に近づいたのかもしれない。
bcev19は、bcev12にS631N、H632T、Q633Tの変異を導入したgB改変体である。bcev19の発現量は野生型と比較して0.6倍であり、3量体のみならず、微量のmultimerが含まれていた。S631、H632、Q633への別の変異又は、631−633aa以外となる近傍の場所への糖鎖付加も検討したが、性状への大きな改善効果は認められなかった(データ示せず)。
bcev50は、bcev19のドメインIVにR602N、D603A、A604Tの変異を導入したgB改変体である。その発現量はbcev19よりもさらに低下し、野生型と比較して0.3倍であった。性状もbcev19と同様に3量体は含まれるが、multimerも含んでいた。
<改変型gB1−705の結合活性試験>
目的である、非中和抗体との反応性が低下又は無くなっていることを確認するため、作製した改変体bcev1−3、bceg13、bcev12、bcev19及びbcev50の、44クローンの抗gB2モノクローナル抗体に対する反応性を、ELISAによって評価した。コントロールとして、野生型gB1−705を用いた。gB1−705をPBSで1μg/mLに希釈し、MaxiSorp plateに50μL入れ、4℃でオーバーナイトインキュベートすることによってgB1−705を固相化した。固相化後、プレートをPBSで洗浄し、取得した抗体をプレートのウェルに100μL加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、検出抗体anti−human IgG Fc/HRP(ROCKLAND)をプレートのウェルに100μL加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMBをプレートのウェルに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度(O.D.450nm/650nm)を測定した。
結果を表5に示す。
bcev1−3は、D199N、D200A、H201Tの変異を導入することにより、D200、H201をエピトープとするF13、F19、F78との反応性がなくなり、bceg13はR567N、P568S、G569Sの変異を導入することにより、R567をエピトープとするF76、G25との反応性がなくなっていた。
また、bcev1−3の改変、bceg13の改変及びR613Aを導入したbcev12では、各変異箇所をエピトープとする抗体との反応性がほぼ無くなっていた。
bcev12にS631N、H632A、Q633Tの変異を導入したbcev19は、中和抗体22種類との反応を維持していた一方で、非中和抗体との反応は低下していた。
非中和抗体の21種類のうち、ドメインIVを認識するF7、F65、F68、F80、G76、ドメインIを認識するF18、F19、F78の計8種類は反応性が残っていた。
bcev19にR602N、D603A、A604Tの変異を導入したbcev50は、全ての非中和抗体21種類との反応性がなくなっていた。一方、中和抗体23種類のうち、14種類とは反応性を維持していたが、9種類とは反応が低下していた。
これらのことはbcev50を免疫することで、非中和抗体は誘導されにくいが、中和抗体もやや誘導されにくくなっている可能性を意味する。bcev19とbcev50の差はドメインIVにR602N、D603A、A604Tの変異があるかないかである。それにもかかわらずドメインIに対する抗体との反応性に差が生じている。ドメインIVを改変することで、3量体は維持しているが、ドメインIの構造が変化していたのかもしれない。総じて、bcev19及びbcev50は、野生型抗原であるgB1−705と比較して、非中和抗体はできにくくなっており、理想的な免疫応答を誘導し得る新規ワクチン抗原として期待できる。
<bcev19及びbcev50のマウス免疫原性試験>
作製した改変型gB抗原bcev19及びbcev50のマウス免疫原性試験を別々に実施した。いずれの実験も抗原量が0.3μg/匹及び1μg/匹にて2週間間隔で3回皮下免疫した。各群の動物例数はいずれもn=4として実験を行なった。
野生型gB抗原gB1−705(gB WT)を陽性対照、salineを陰性対照として、改変型gB抗原の免疫原性試験を実施した。所定量の抗原を注射用生理食塩水(saline)に溶解し、MPLA(10μg/匹)及びCpG(1μg/匹)と共に、1匹あたり200μL/匹の容量で、BALB/cマウス(5週齢、メス)に2週間間隔で合計3回、背部皮下に免疫した。最終免疫(3回目)から2週間後に、個体毎に採血し血清を調製した。調製した血清を段階希釈し、野生型gB抗原に対する結合抗体価(anti−gB ELISA)及びHSV−2に対する中和抗体価(プラーク数50%減少活性)を評価した。
bcev19の結果を図6に、bcev50の結果を図7に示す。グラフ中、n=4の平均値をプロットし、±SEエラーバーを付記してある。最終免疫から2週間後に採取した血清を用いて、野生型gB抗原に対する結合抗体誘導活性(anti−gB ELISA)及びHSV−2に対する中和抗体誘導活性(プラーク数減少率)を評価した結果、bcev19、bcev50共に、いずれの投与量においても野生型gB抗原(gB1−705)よりも少ない結合抗体活性でより高い中和抗体活性を誘導していることが確認された。
本結果は、野生型gB抗原上の非中和エピトープ(有害・無益なエピトープ)をN型糖鎖付加及びアラニン置換の手法によって脱エピトープ化することによって、残存している中和エピトープ(有益なエピトープ)に対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することが出来た結果であると考えられる。言い換えれば、野生型gB抗原に対する偏った免疫応答(免疫偏向)を、本発明者らによるイムノ・リフォーカス(immune refocusing)戦略によって理想的な形に矯正(免疫矯正)することが出来たものと言える。
<bcev19及びbcev50のマウス感染防御試験>
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、改変型gB抗原bcev19及びbcev50の予防的投与における感染防御能を別々に評価した。いずれの実験も陽性対照として野生型gB1−705(gBWT)を用いた。抗原は全て、0.03μg/匹、0.1μg/匹、0.3μg/匹、1μg/匹にて2週間間隔で3回皮下免疫した。最終免疫(3回目)から2週間後に行うウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種6日前にDepo−Proveraを2mg/匹で皮下接種した。麻酔下で5×10PFU/20μL/匹のHSV−2 MS株を経腟接種し、21日間経過観察を行った。生存日数(生存率)及び症状スコアを指標に感染防御能を評価した。症状スコアは、膣病変症状及び全身症状の程度により分類し、それぞれ3段階と2段階のスコアを設定した。次に示す膣病変と全身症状のスコアを合算したものを症状スコアとした。膣病変に対するスコア(0:変化なし、1:部分的な紅斑・腫脹、2:広範囲の腫脹・浮腫、3:潰瘍・出血)。全身症状に対するスコア(0:変化なし、1:立毛、2:後肢麻痺)。また、死亡又は犠牲死させたものはスコア6とした。各群の動物例数をn=10として実験を行ない、グラフ中にはそれらの平均値をプロットした。
bcev19の結果は、表6(生存日数)、図8(生存率)及び図9(症状スコア)に示す。gB WT、bcev19共に設定した全ての投与量(0.03〜1μg/匹)において、陰性対照群(saline投与群)に比して有意な生存日数延長効果を示したが、gB WT投与群の生存日数中央値(MST)は明確な用量依存性を示さず、saline投与群に対するMST比率はいずれの投与量においても2未満にとどまっていたのに対し、bcev19投与群のMSTはほぼ用量依存性を示しMST比率も0.1μg/匹以上の3用量において>2.8であり、明確な生存率の改善が認められた(表6、図8)。症状スコアについても、gB WT投与群では明確な用量依存性が認められず、最高用量である1μg/匹でもシビアな症状を伴っていたが、bcev19投与群の方は用量依存的かつ顕著な改善効果が認められた(図9)。
bcev50の結果は、表7(生存日数)、図10(生存率)及び図11(症状スコア)に示す。bcev19と同様にbcev50もgB WTに比して、生存日数、生存率、症状スコアのいずれの指標においても、明確な優越性を示した。
<イムノ・リフォーカスの解析>
マウス免疫原性試験及びマウス感染防御試験において野生型gB(gB1−705)に比して優越性が認められた改変型gB抗原bcev19及びbcev50の免疫血清について、イムノ・リフォーカスが誘導されているか否かをそれぞれgB1−457及びgB111−457を固相化したELISAにより解析した。
bcev19の解析結果を図12に、bcev50の解析結果を図13に示す。野生型gB免疫血清と比較して、bcev19免疫血清及びbcev50免疫血清はいずれもgB1−457及びgB111−457に対する結合抗体活性が上昇していることが確認された。本結果は、野生型gB抗原上のデコイ領域であると考えられるドメインIV上に主に存在する非中和エピトープをN型糖鎖付加及びアラニン置換の手法により脱エピトープ化することによって、ドメインI及びII上に多く残存している中和エピトープ(有益なエピトープ)に対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することが出来た結果であると考えられる。言い換えれば、野生型gB抗原上のデコイ領域に対する偏った免疫応答(免疫偏向)を、イムノ・リフォーカス戦略によって理想的な形に矯正(免疫矯正)することが出来たものと考えられる。
<gBドメインIに導入したN型糖鎖の効果>
gB改変体であるbcev19は、ドメインIにD199N、D200A、H201T、ドメインIVにR613A、R567N、P568S、G569S、S631N、H632T、Q633Tの改変を導入している。またbcev50は、ドメインIにD199N、D200A、H201T、ドメインIVにR613A、R567N、P568S、G569S、S631N、H632T、Q633T、R602N、D603A、A604Tの改変を導入している。我々はbcev19及びbcev50に導入した改変の効果をさらに調べるために、bcev19及びbcev50に含まれるドメインIの改変D199N、D200A、H201Tのみを原体のアミノ酸配列に戻した改変体、それぞれbcev19’及びbcev50’を作出した。
Expi293発現システムを用いた一過性発現を実施し、その発現量を比較した(表8)。その結果、bcev19、bcev19’、bcev50、bcev50’の発現量は、それぞれ10.81μg/mL、1.28μg/mL、6.29μg/mL、4.36μg/mLであった。bcev19及びbcev19’の発現量を比較するとbcev19の方がbcev19’よりも8.45倍高く、またbcev50及びbcev50’の発現量を比較するとbcev50の方がbcev50’よりも1.44倍高かった。このことはbcev19及びbcev50におけるD199N、D200A、H201Tが発現量の向上に寄与する変異であることを意味する。またgB1−705にD199N、D200A、H201T の改変を導入したbceg1−3においても同様の結果が得られており、このことを支持している(表4)。
更に、ゲル濾過クロマトグラフィーによるbcev19、bcev19’、bcev50及びbcev50’の性状解析を行った。その結果を図14に示す。bcev19の方がbcev19’よりもネーティブな3量体含量が高く(図14(A))、またbcev50の方がbcev50’よりも3量体含量が高かった(図14(B))。このことは、bcev19及びbcev50におけるD199N、D200A、H201Tが性状改善に寄与する変異であることを意味する。
次に、マウス免疫原性試験において、bcev19とbcev19’、bcev50とbcev50’をそれぞれ比較した。抗原量はいずれも0.3μg/匹及び1μg/匹にて2週間間隔で3回皮下免疫した。各群の動物例数はいずれもn=4として実験を行なった。bcev19とbcev19’の比較を図15に、bcev50とbcev50’の比較を図16にそれぞれ示した(グラフ中にはn=4の平均値をプロットし±SEエラーバーを付記)。最終免疫から2週間後に採取した血清を用いて、野生型gB抗原に対する結合抗体誘導活性(anti−gB ELISA)及びHSV−2に対する中和抗体誘導活性(プラーク数減少率)を評価した結果、どちらの指標においてもbcev19’よりもbcev19の方が、またbcev50’よりもbcev50の方が高い抗体誘導能を示す傾向があることが分かった。
以上の結果から、改変体bcev19及びbcev50に導入した変異のうち、ドメインIのN型糖鎖(D199N、D200A、H201T)は中和抗体誘導能の増強のみならずタンパク発現量の向上及び性状改善にも寄与する変異であることが分かった。
本発明の改変型HSV gBタンパク質は、HSV感染症の予防及び治療に効果的なワクチンの作製に使用できる。

Claims (23)

  1. 単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、野生型HSV gBのドメインIV及びドメインIに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ(非中和エピトープ)のうち、少なくとも1つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型HSV gBタンパク質。
  2. 前記非中和エピトープは、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項1に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  3. 前記非中和エピトープは、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567、R602、S631、又はD199に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項1又は2に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  4. 前記改変は、アミノ酸残基の置換、及び/又はアミノ酸残基の欠損によって行われる改変を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  5. 前記改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む、請求項4に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  6. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  7. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも2つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  8. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項7に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  9. 前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567N、P568S、G569S、S631N、H632T、及びQ633Tのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項8に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  10. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、及びS631に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含む、請求項7に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  11. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項6〜10のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  12. 前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR602N、D603A、A604Tのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項11に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  13. 前記改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項5〜12のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  14. 前記糖鎖導入は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199N、D200A、及びH201Tのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項13に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  15. 前記改変はさらに、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、請求項4〜14のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  16. 請求項1〜15のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
  17. 単純ヘルペスウイルス(HSV)のエンベロープ糖タンパク質B(gB)の改変タンパク質(改変型HSV gBタンパク質)であって、野生型HSV gBのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号1に記載のアミノ酸配列における567番目のアルギニン残基(R567)、602番目のアルギニン残基(R602)、631番目のセリン残基(S631)、又は199番目のアスパラギン酸残基(D199)に相当するアミノ酸残基からの距離が1.5nm以下の領域に存在する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換又は欠失させた、改変型HSV gBタンパク質。
  18. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199、R567、R602、及びS631に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項17に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  19. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるD199に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項17又は18に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  20. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列における613番目のアルギニン(R613)に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  21. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるR567に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項17〜20のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  22. 前記改変は、配列番号1に記載のアミノ酸配列におけるS631に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項17〜21のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質。
  23. 請求項18〜22のいずれか一項に記載の改変型HSV gBタンパク質を含む、HSVワクチン。
JP2019539596A 2017-08-30 2018-08-29 改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン Active JP7145863B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017165684 2017-08-30
JP2017165684 2017-08-30
PCT/JP2018/032020 WO2019044927A1 (ja) 2017-08-30 2018-08-29 改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019044927A1 true JPWO2019044927A1 (ja) 2020-08-20
JP7145863B2 JP7145863B2 (ja) 2022-10-03

Family

ID=65525717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019539596A Active JP7145863B2 (ja) 2017-08-30 2018-08-29 改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11421002B2 (ja)
EP (1) EP3677593A4 (ja)
JP (1) JP7145863B2 (ja)
CN (1) CN111032681B (ja)
AU (1) AU2018323504B2 (ja)
WO (1) WO2019044927A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117126253A (zh) * 2022-05-27 2023-11-28 江苏瑞科生物技术股份有限公司 Hsv免疫原性重组蛋白、其制备方法和应用、以及用其制备的疫苗

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6128391A (ja) * 1984-07-20 1986-02-08 Chemo Sero Therapeut Res Inst 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド、形質転換酵母および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法
JP2007246531A (ja) * 1986-10-20 2007-09-27 Chiron Corp Hsvの治療的処置に用いるワクチン

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0170169B1 (en) * 1984-07-20 1991-03-20 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Recombinant dna containing a herpes simplex virus gene or a fragment thereof, yeast transformed with said recombinant dna, and method for the production of herpes simplex virus proteins
CA2645507A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 The Regents Of The University Of California Vaccine for viruses that cause persistent or latent infections
EP2308895A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-13 Universität Duisburg-Essen Anti-HSV antibody
JP6679484B2 (ja) * 2013-12-11 2020-04-15 ザ ヘンリー エム. ジャクソン ファウンデーション フォー ザ アドヴァンスメント オブ ミリタリー メディシン インコーポレイテッド ヒトヘルペスウイルス三量体糖タンパク質B、三量体gBを含むタンパク質複合体、及びワクチンとしてのそれらの使用
EP3677677A4 (en) * 2017-08-30 2021-09-22 KM Biologics Co., Ltd. MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HSV GB OR CORRESPONDING ANTIGEN BINDING FRAGMENT

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6128391A (ja) * 1984-07-20 1986-02-08 Chemo Sero Therapeut Res Inst 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド、形質転換酵母および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法
JP2007246531A (ja) * 1986-10-20 2007-09-27 Chiron Corp Hsvの治療的処置に用いるワクチン

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENDER FC ET AL.: "Antigenic and mutational analyses of herpes simplex virus glycoprotein B reveal four functional regi", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 81, no. 8, JPN6018046133, 2007, pages 3827 - 3841, XP002571808, ISSN: 0004786513, DOI: 10.1128/JVI.02710-06 *
CLEVELAND SM ET AL.: "Immunogenic and antigenic dominance of a nonneutralizing epitope over a highly conserved neutralizin", VIROLOGY, vol. 266, no. 1, JPN6018046137, 2000, pages 66 - 78, XP004436184, ISSN: 0004786515, DOI: 10.1006/viro.1999.0041 *
NARA PL ET AL.: "How can vaccines against influenza and other viral diseases be made more effective?", PLOS BIOLOGY, vol. 8, no. 12, JPN6018046139, 2010, pages 1000571 - 1, ISSN: 0004786516 *
YU C ET AL.: "Replacing the decoy epitope of PCV2b capsid protein with a protective epitope enhances efficacy of P", VACCINE, vol. 34, no. 50, JPN6018046135, 2016, pages 6358 - 6366, XP029824211, ISSN: 0004786514, DOI: 10.1016/j.vaccine.2016.10.044 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111032681A (zh) 2020-04-17
EP3677593A1 (en) 2020-07-08
AU2018323504B2 (en) 2022-12-15
AU2018323504A1 (en) 2020-04-09
WO2019044927A1 (ja) 2019-03-07
EP3677593A4 (en) 2021-06-09
JP7145863B2 (ja) 2022-10-03
US20200299334A1 (en) 2020-09-24
CN111032681B (zh) 2024-05-17
US11421002B2 (en) 2022-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Airway memory CD4+ T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses
US9889194B2 (en) Immunogenic composition for MERS coronavirus infection
CN101616688A (zh) 单纯疱疹病毒联合亚单位疫苗及其使用方法
JP7382634B2 (ja) 交差免疫抗原ワクチン及びその調製方法
CN103476788A (zh) 免疫原性屈曲病毒肽
Zhu et al. A highly conserved epitope-vaccine candidate against varicella-zoster virus induces neutralizing antibodies in mice
JP7145863B2 (ja) 改変型HSV gBタンパク質及びこれを含むHSVワクチン
JP7271794B2 (ja) サイトメガロウイルスのgBとペンタマーとの融合タンパク質及び該融合タンパク質を含むワクチン
WO2023001259A1 (zh) 一种可诱导广谱中和活性重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用
CN118076646A (zh) 一种可诱导广谱中和活性重组多组分新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用
CN117305329A (zh) 一种猴痘病毒核酸疫苗及其用途
CN117126292A (zh) 痘病毒重组嵌合抗原、包含其的免疫原性组合物及其应用
CN105085671B (zh) 抗肠道病毒3d蛋白的单克隆免疫球蛋白g抗体及其免疫原性组合物
AU2018323502B2 (en) Modified HSV gD protein and vaccine containing same
US20180250378A1 (en) Combination of therapeutic vaccine and pd-1-related blockade for treating human papillomavirus-associated diseases
WO2016115665A1 (en) Immunoglobulin g monoclonal antibodies against 3d proteins of enteroviruses
CN117126291A (zh) 痘病毒重组嵌合抗原、其亚单位疫苗及其应用
CN118119646A (zh) 一种可诱导广谱中和活性重组五组分新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210615

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220531

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220726

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220906

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220920

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7145863

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150