JP7271794B2 - サイトメガロウイルスのgBとペンタマーとの融合タンパク質及び該融合タンパク質を含むワクチン - Google Patents
サイトメガロウイルスのgBとペンタマーとの融合タンパク質及び該融合タンパク質を含むワクチン Download PDFInfo
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Description
[1] サイトメガロウイルス(CMV)のエンベロープ糖タンパク質B(gBタンパク質)とペンタマーとの融合タンパク質。
[2] 3つのgBタンパク質構成分子からなるgBタンパク質のホモ三量体と、5つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも1つのgBタンパク質構成分子と少なくとも1つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって、タンパク質複合体を形成している、[1]に記載の融合タンパク質。
[3] 少なくとも2つのgBタンパク質構成分子と、少なくとも2つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、[2]に記載の融合タンパク質。
[4] 3つのgBタンパク質構成分子と、5つのペンタマー構成分子のうちのいずれか3つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、[2]又は[3]に記載の融合タンパク質。
[5] 3つのgBタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるgL、UL128及びUL130とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、[2]~[4]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[6] 3つのgBタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるUL128、UL130及びUL131とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、[2]~[4]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[7] 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも1つの融合は、gBタンパク質構成分子のN末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、[2]~[6]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[8] 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも2つの融合は、gBタンパク質構成分子のN末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、[3]~[6]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[9] 3つの遺伝子工学的な融合がすべて、gBタンパク質構成分子のN末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、[4]~[6]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[10] gBタンパク質構成分子とペンタマー構成分子との間にリンカー及び/又はタグを有する、[2]~[9]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[11] リンカーが配列番号22記載のアミノ酸配列単位を1~3回繰り返したアミノ酸配列からなるリンカーである、[10]に記載の融合タンパク質。
[12] gBタンパク質がCMV gBタンパク質のエクトドメインである、[1]~[11]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[13] gBタンパク質が配列番号15に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、[12]に記載の融合タンパク質。
[14] gBタンパク質が、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと80%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、[12]又は[13]に記載の融合タンパク質。
[15] gBタンパク質がドメインIVを欠失したgBタンパク質改変体である、[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[16] gBタンパク質が配列番号16に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、[15]に記載の融合タンパク質。
[17] gBタンパク質が、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと80%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、[15]又は[16]に記載の融合タンパク質。
[18] gBタンパク質が、野生型gBタンパク質に比べて、凝集体の形成を低減させ、ホモ三量体構造の割合を増加させる改変が導入されたgBタンパク質改変体である、[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[19] gBタンパク質が配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、[18]に記載の融合タンパク質。
[20] gBタンパク質が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと80%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、[18]又は[19]に記載の融合タンパク質。
[21] gBタンパク質が、野生型gBタンパク質に比べて、ヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入されたgBタンパク質改変体である、[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[22] gBタンパク質が配列番号31に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、[21]に記載の融合タンパク質。
[23] gBタンパク質が、配列番号31に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと80%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、[21]又は[22]に記載の融合タンパク質。
[24] ペンタマーが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgH、gL、UL128、UL130及びUL131からなる、[1]~[23]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[25] gHがgHタンパク質のエクトドメインである、[24]に記載の融合タンパク質。
[26] ペンタマーが、
配列番号4に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるgH、
配列番号5に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるgL、
配列番号6に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL128、
配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL130、及び
配列番号8に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL131
を含むヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のペンタマータンパク質である、[24]又は[25]に記載の融合タンパク質。
[27] ペンタマーが、
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるgHと80%以上の配列同一性を有するgH、
配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるgLと80%以上の配列同一性を有するgL、
配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるUL128と80%以上の配列同一性を有するUL128、
配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるUL130と80%以上の配列同一性を有するUL130、及び
配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるUL131と80%以上の配列同一性を有するUL131
を含むHCMVのペンタマータンパク質である、[24]~[26]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[28] [1]~[27]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸断片。
[29] [28]に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
[30] [28]に記載の核酸断片又は[29]に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
[31] [1]~[27]のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、CMVの感染を予防又は治療するためのワクチン。
[32] CMVの感染がCMVの先天性感染である、[31]に記載のワクチン。
本発明の融合タンパク質は、サイトメガロウイルス(CMV)のエンベロープ糖タンパク質B(gBタンパク質)とペンタマーとの融合タンパク質である。当該融合タンパク質は、3つのgBタンパク質構成分子からなるgBタンパク質のホモ三量体と、5つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも1つのgBタンパク質構成分子と少なくとも1つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによってタンパク質複合体を形成したものである。ここで、構成分子とは、gBタンパク質のホモ三量体又はペンタマーのヘテロ五量体を構成するタンパク質をいい、サブユニットともいう。当該融合タンパク質は抗原としてCMVの予防及び治療に有用なワクチンの作製に用いられる。
配列番号4に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるgH、
配列番号5に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるgL、
配列番号6に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL128、
配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL130、及び
配列番号8に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL131
を含むHCMVのペンタマータンパク質であってよい。ここで、1以上のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加は、例えば、1~50個、1~40個、1~30個、1~20個、1~15個、1~10個、1~5個、1~3個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加であってよい。
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるgHと80%以上の配列同一性を有するgH、
配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるgLと80%以上の配列同一性を有するgL、
配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるUL128と80%以上の配列同一性を有するUL128、
配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるUL130と80%以上の配列同一性を有するUL130、及び
配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるUL131と80%以上の配列同一性を有するUL131
を含むHCMVのペンタマータンパク質であってよい。ここで、80%以上の配列同一性は、例えば85%以上、90%以上、93%以上、95%以上又は98%以上の配列同一性であってよい。
配列番号10に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるGP75、
配列番号11に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるGP115、
配列番号12に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるGP129、
配列番号13に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるGP131、及び
配列番号14に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるGP133
を含むGPCMVのペンタマータンパク質であってよい。ここで、1以上のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加は、例えば、1~50個、1~40個、1~30個、1~20個、1~15個、1~10個、1~5個、1~3個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加であってよい。
配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるGP75と80%以上の配列同一性を有するGP75、
配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるGP115と80%以上の配列同一性を有するGP115、
配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるGP129と80%以上の配列同一性を有するGP129、
配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるGP131と80%以上の配列同一性を有するGP131、及び
配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるGP133と80%以上の配列同一性を有するGP133
を含むGPCMVのペンタマータンパク質であってよい。ここで、80%以上の配列同一性は、例えば85%以上、90%以上、93%以上、95%以上又は98%以上の配列同一性であってよい。
本発明の核酸断片は、本発明のCMVのgBとペンタマーとの融合タンパク質をコードする核酸断片であり、本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸断片を含む組換え発現ベクターであり、本発明の形質転換体は、本発明の核酸断片又は本発明の組換え発現ベクターが導入された形質転換体である。
本発明のワクチンは、本発明の融合タンパク質を含む。一実施形態のワクチンは、サイトメガロウイルス(CMV)のエンベロープ糖タンパク質B(gBタンパク質)とペンタマーとの融合タンパク質を抗原として含むCMVの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンである。すなわち、本実施形態のワクチンは2種類の抗原タンパク質の機能を併せ持つ融合タンパク質からなるサブユニットワクチンである。
<抗原調製>
AD169株に由来するHCMV gBのエクトドメイン(配列番号15)をコードする遺伝子を人工合成し、pCAGGS1-dhfr-neo(特許文献3)にクローニングした。C末端には9アミノ酸のHis-tag(配列番号30)が付加されるように設計した。これをベースに、I132H、Y133R、T215E、W216A、R432T及びR434Qのアミノ酸置換を行ったもの(配列番号3)をgB1-682-fm3Mv9(以下、「gBv9」と呼ぶ)とした(特許文献4)。gBv9を発現する際は、N末端にHCMV-gBのシグナル配列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(配列番号19)を挿入した。
UL130(配列番号7)のシグナル配列(1-25アミノ酸)を除き、同じ位置にMRLPAQLLGLLMLWVPGSSG(配列番号21)のアミノ酸配列を挿入した「シグナルペプチド置換UL130」、又は、
UL131(配列番号8)のシグナル配列(1-18アミノ酸)を除き同じ位置にMRLPAQLLGLLMLWVPGSSG(配列番号21)のアミノ酸配列を挿入した「シグナルペプチド置換UL131」
のC末端側に5アミノ酸のリンカー(GGGGS)(配列番号22)を介してgBv9を付加した融合タンパク質をコードするDNA断片をPCRによって作製し、pCAGGS1-dhfr-neoにクローニングした。このうち、シグナルペプチド置換UL128とgBv9を連結したものをN-UL128-gB、シグナルペプチド置換UL130とgBv9を連結したものをN-UL130-gB、シグナルペプチド置換UL131とgBv9を連結したものをN-UL131-gBとした。
UL128(配列番号6)のシグナル配列(1-27アミノ酸)を除いたシグナル除去UL128、又は、
UL130(配列番号7)のシグナル配列(1-25アミノ酸)を除いたシグナル除去UL130、又は、
UL131(配列番号8)シグナル配列(1-18アミノ酸)を除いたシグナル除去UL131
を連結し、さらにそのC末端側に9アミノ酸のHis-tag(配列番号30)を付加した融合タンパク質をコードするDNA断片をPCRによって作製し、pCAGGS1-dhfr-neoにクローニングした。このうち、シグナル除去UL128とgBv9を連結したものをC-UL128-gB、シグナル除去UL130とgBv9を連結したものをC-UL130-gB、シグナル除去UL131とgBv9を連結したものをC-UL131-gBとした。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはSuperdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)を使用し、濃度100μg/mLの各精製品をアプライした。流速は0.4mL/minで移動相はD-PBS(Wako)を使用し、波長280nmの吸光度を測定した。
ゲル濾過クロマトグラフィーの結果を図1~3に示す。全ての発現物において、凝集体が確認された。しかし、N-UL128-gB、N-UL130-gB、N-UL131-gB及びN-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gBを発現した場合に比べ、C-UL128-gB、C-UL130-gB、C-UL131-gB及びC-UL128-gB/C-UL130-gB/及びC-UL131-gBを発現した場合、並びに、Δd4-UL128-gB、Δd4-UL130-gB、Δd4-UL131-gB及びΔd4-UL128-gB/Δd4-UL130-gB/Δd4-UL131-gBを発現した場合は、凝集体含量が増加していることが確認された。このことからUL128、UL130又はUL131をHCMVgBタンパク質と融合する場合、HCMV gBタンパク質のN末端側に融合した方が凝集体を形成しにくく、凝集体以外の含量が増加すると示唆された。
<抗原調製>
実施例1の検討によりUL128、UL130、又はUL131をgBのN末端側に融合すると凝集体含量の低下が認められたため、UL128、UL130、又はUL131をgBのN末端側に融合させた次のような各gB-ペンタマー構成タンパク質融合体をデザインした。
UL128(配列番号6)にC162Sアミノ酸置換を加え、更にC末端側に5アミノ酸のリンカー(GGGGS)(配列番号22)を介してgBv9を付加したものをUL128(C162S)-gBとした。
UL128(配列番号6)にC162Sアミノ酸置換を加え、更にC末端側に15アミノ酸のリンカー(GGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号23)を介してgBΔd4を付加したものをUL128(C162S)-Δd4とした。
UL128(配列番号6)、UL130(配列番号7)又はUL131(配列番号8)遺伝子のC末端側に15アミノ酸のリンカー(GGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号23)を介してgBΔd4を付加し、このうち、N末端側がUL128のものをUL128-Δd4、N末端側がUL130のものをUL130-Δd4、N末端側がUL131のものをUL131-Δd4とした。
gBv9のS128aa-L138aaを欠損させ、末端のR127とG139をグリシンリンカーGGGでつなぎ、W216aa-Y218aaを欠損させ、N型糖鎖を4か所導入(D77N、I79T/E544N、P546T/L588N、P589G/K609N、R610T、M611T)したものをgBVC37(配列番号31)とした(特許文献4)。gBVC37を発現する際はN末端に HCMV-gBのシグナル配列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(配列番号19)を挿入した。
UL128(配列番号6)にC162Sアミノ酸置換を加え、C末端側に5アミノ酸のリンカー(GGGGS)(配列番号22)を介してgBVC37を付加したものをUL128(C162S)-VC37とした。
UL128(配列番号6)、UL130(配列番号7)又はUL131(配列番号8)遺伝子のC末端側に5アミノ酸のリンカー(GGGGS)(配列番号22)を介してgBVC37を付加し、このうち、N末端側がUL128のものをUL128-VC37、N末端側がUL130のものをUL130-VC37、N末端側がUL131のものをUL131-VC37とした。
N-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB、
UL128(C162S)-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB、
UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37、
UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、
UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、
gH/gL/UL128/UL130/UL131(ペンタマー)、
gBv9
の計7種類であった。gH/gL/UL128/UL130/UL131はHCMVペンタマーのエクトドメインに相当し、以下「ペンタマー」と呼ぶ。発現はHCMV gBタンパク質と同様の方法で行い、各gB-ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清を得た。また、ペンタマーの精製はHCMV gBタンパク質と同様の方法で行った。
gBv9、ペンタマーを抗原として、モルモット(Hartley)に免疫を行った。各抗原は5μg/匹になるように、生理食塩水(大塚製薬)で調製し、アジュバントとして10v/v%のAlum(Invivogen vac-alu250)及び50μg/匹のCpG ODN1826(ユーロフィン)を使用した。調製した抗原液を2週間間隔で3回、モルモット(雌 3匹/群)に筋肉内接種(100μL/片足、両足投与)し、最終免疫の2週間後にイソフルラン吸入麻酔下での心臓採血により全採血した。得られた血液は凝固促進剤入り分離管で血清分離した。血清分離後、3匹分の血清をプールし、gBv9免疫血清とペンタマー免疫血清を得た。これを用いて、gB-ペンタマー構成タンパク質融合体の、gBv9免疫血清及びペンタマー免疫血清に対する反応性評価を行った。
取得したgB-ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清の、各種免疫血清に対する反応性(結合活性)をELISAによって評価した。Rabbit anti 6 His Ab(BETHYL A190-114)をPBS(SIGMA)で1μg/mLに希釈し、MaxiSorp plate(Nunc)に100μL入れ、4℃でオーバーナイトインキュベートすることによって固相化した。固相化後、plateをPBSで洗浄し、1%BSA/PBS液を300μL/well添加し、1時間以上静置してブロッキングを行った。ブロッキング後に1%BSA/PBS液を捨て、取得した培養上清を10倍希釈し、plateのwellに100μL加え、室温でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、各種免疫血清をplateのwellに100μL加え、室温でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、検出抗体HRP-Rabbit anti Guinea Pig IgG(Invitrogen 614620)をplateのwellに100μL加え、室温でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB(SIGMA T-4444)をplateのwellに100μL加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス)で発色値(O.D.450nm/650nm)を測定した。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはSuperdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)を使用し、濃度100μg/mLの各精製品を50μLアプライした。流速は0.4mL/minで泳動BufferはD-PBS(Wako)を使用し、波長280nmの吸光度を測定した。
HCMV-gB免疫血清(gBv9免疫血清)及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を図4に示す。図4によれば、UL128(C162S)-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB、UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37、UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、N-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gBのいずれの組み合わせのgB-ペンタマー構成タンパク質融合体もHCMV-gB免疫血清及びペンタマー免疫血清両方に対する反応性を有していた。また、UL128に対してC162Sの点変異を導入した場合、ペンタマー免疫血清に対する反応性の向上が認められた。さらに、gB-ペンタマー構成タンパク質融合体のgB部分がgBv9のものに比べ、gB部分をgBVC37若しくはgBΔd4としたgB-ペンタマー構成タンパク質融合体の方がペンタマー免疫血清との反応が大きかった。
<抗原調製>
実施例2の検討により、HCMV gBタンパク質若しくはペンタマーに相当する領域に変異を導入したgB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを3種組み合わせて共発現することで、gB及びペンタマーとしての構造を保ったgB-ペンタマー構成タンパク質融合体を発現できていることが示された。よってHCMV gBタンパク質又はペンタマーの構成タンパク質又はgB-ペンタマー構成タンパク質融合体のうち3種以上のタンパク質を組み合わせて共発現させることを目的として、さらに次の各gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドをデザインした。
取得したgB-ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清若しくは精製品の、各種免疫血清に対する反応性(結合活性)を実施例2と同様の方法により評価した。ただし、培養上清は100倍に希釈したものを使用している点、また培養上清の代わりに精製品を用いて試験を行う場合は1μg/mLで固相抗体と反応させている点が実施例2と異なる。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはSuperdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)を使用し、濃度100μg/mLの各精製品を50μLアプライした。流速は0.4mL/minで泳動BufferはD-PBS(Wako)を使用し、波長280nmの吸光度を検出した。
取得したgB-ペンタマー構成タンパク質融合体を実施例2と同様の方法により免疫し、免疫血清を取得した。この血清を用いて、HCMVのgBタンパク質、ペンタマーに対する結合抗体価及び中和抗体価を評価した。
<抗原調製>
実施例3-1の検討により各種gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを5種組み合わせて共発現してもgB、ペンタマーとしての構造を保っていることが示されたため、さらにgLのC144及びUL128のC162の点変異の影響を精査すべく、次の各gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドをデザインした。gL(配列番号5)にC144Sアミノ酸置換を加えC末端側に15アミノ酸のリンカー(GGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号23)、Δd4を付加した融合タンパク質をコードするDNA断片をPCRによって作製し、該DNA断片をpCAGGS1-dhfr-neoにクローニングしたものをgL(C144S)-Δd4とした。発現時には各種gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL(C144S)-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131の計3種類であった。また、精製はHCMV gBタンパク質と同様の方法で行い、各gB-ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品を得た。
実施例2と同様の方法により、gBΔd4又はペンタマー又はgH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131又はsalineをモルモット(Hartley)に免疫し、gBΔd4免疫血清及びペンタマー免疫血清及びgH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清及びsaline免疫血清を得た。
取得したgB-ペンタマー構成タンパク質融合体について、gBΔd4、ペンタマー(PC)、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131(Δd4/PC)及びsaline免疫血清に対する反応性(結合活性)を実施例2と同様の方法によって評価した。これを図16~19に示す。この結果から、gLのC144及びUL128のC162の点変異は血清との反応性に影響しないことが示唆された。
取得したgH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、及び、gH(His-)/gL(C144S)-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131の精製品の性状をゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはSuperdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)を使用し、濃度100μg/mLの各精製品を50μLアプライした。流速は0.4mL/minで泳動BufferはD-PBS(Wako)を使用し、波長280nmの吸光度を検出した。結果を図20に示す。この結果及び図12(d)から、gLのC144及びUL128のC162の点変異導入は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離パターンに変化を及ぼさないことが示された。
取得したgH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL(C144S)-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/ UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131融合タンパク質の粒子径分布を動的光散乱によって評価した。各組換えタンパクをPBS(SIGMA)で0.2又は0.3mg/mLに希釈し、Zetasizer Nano ZS(Malvern)により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度25.0℃であった。これを図21に示す。なお、図21の(a)、(b)、(c)のピークは3回の結果を示し、表に示す数字は3回の平均値である。この結果から、gLのC144及びUL128のC162の点変異導入は、粒子径分布に影響を及ぼさないことが示された。
<抗原調製>
各種gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4の計2種類であった。また、精製は全てHCMVのgBタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはSuperdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)を使用し、濃度100μg/mLの各精製品を50μLアプライした。流速は0.4mL/minで泳動BufferはD-PBS(Wako)を使用し、波長280nmの吸光度を検出した。結果を図28に示す。この結果から、UL128のC162の点変異導入は、ゲルろ過クロマトグラフィーによるピークの溶出位置には変化を及ぼさないことが示された。
取得したgH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4融合タンパク質の粒子径分布を動的光散乱によって評価した。各組換えタンパクをPBS(SIGMA)で0.2又は0.3mg/mLに希釈し、Zetasizer Nano ZS(Malvern)により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度25.0℃であった。これを図29に示す。なお、図29のピークは3回の結果を示し、表に示す数字は3回の平均値である。この結果から、UL128のC162の点変異導入は、粒子径分布に影響を及ぼさないことが示された。
<抗原調製>
各種gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、gBv9、ペンタマー、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131及びgH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4の計4種類であった。また、精製は全てHCMVのgBタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
実施例2と同様の方法により、gBv9、ペンタマー、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、又は、salineをモルモット(Hartley)に免疫し、gBv9免疫血清、ペンタマー免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清及びsaline免疫血清を得た。
取得したgB-ペンタマー構成タンパク質融合体について、gBv9免疫血清、ペンタマー免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清及びsaline免疫血清に対する反応性(結合活性)を実施例2と同様の方法によって評価した。結合抗体価の評価結果を図30に示す。この結果から、gB-ペンタマー構成タンパク質融合体を投与することにより、gB抗体及びペンタマー抗体を誘導しうると考えられた。
取得したgBv9免疫血清、ペンタマー免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清及びsaline免疫血清を用いて、実施例3-1と同様の方法によって、中和抗体価を評価した。ただし、MRC-5細胞を用いた線維芽細胞中和試験、ARPE-19細胞を用いた上皮細胞中和試験のいずれもウイルスとしてARPE-19細胞にて継代馴化したHCMV AD-169株を使用した点が実施例3-1と異なる。中和抗体価の評価結果を図31に示す。
<gB-ペンタマー融合タンパク質の安定性評価>
各種gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、gBv9、ペンタマー、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131の計6種類であった。また、精製は全てHCMVのgBタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
<抗原調製>
刺激抗原として、実施例4と同様の手順でgBv9、ペンタマー、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4を発現精製した。
ヒトPBMCを用いた細胞性免疫評価は、Human IFN-γ ELISpotPLUS(MABTECH 3420-4HST-2)を用いたELISpot assayにより行った。ヒトPBMCはCTL社製のうち、HCMV抗原刺激に対するIFNγ誘導が認められるドナー23名のものを選択した。
<GPCMV-gBの調製>
モルモット経胎盤感染モデル系を用いて評価するため、モルモットに感染性を示すモルモットサイトメガロウイルス(GPCMV)を用いた。組換えGPCMV gBタンパク質は凝集体を含む場合があるため、凝集体を含まない、性状改善した改変GPCMV gBタンパク質を作製した。
次に、GPCMV 22122株に由来するペンタマーのエクトドメインを調製した。GPCMVペンタマーのエクトドメインの可溶性発現に関しては報告例がなかったため、HCMVペンタマーのエクトドメインの可溶性発現の報告例(非特許文献14)を参考に、以下に述べるようにデザインし、発現プラスミドを構築した。
次に、GPCMV-gBエクトドメイン改変体(配列番号17)の111-475aaと641-692aaとをGGGSGSGGG(配列番号20)の9アミノ酸でつなぎ、さらに、このC末端にHis-tag配列(配列番号30)を付加したものをGPCMV-Δd4(配列番号32)とし、GPCMV-Δd4をコードするDNA断片をPCRによって作製し、該DNA断片をpCAGGS1-dhfr-neoにクローニングした。また、GP75のエクトドメインをコードする遺伝子のC末端にHis-tagが付加されないものをデザインし、該タンパク質をコードするDNA断片をPCRによって作製し、該DNA断片をpCAGGS1-dhfr-neoにクローニングしたものをGP75(His-)とした。
次に、上記遺伝子をもとに、GP133のC末端側に15アミノ酸のリンカー(GGGGSGGGGSGGGGS)(配列番号23)を介してGPCMV-Δd4を連結した融合タンパク質をコードするDNA断片をPCRによって作製し、該DNA断片をpCAGGS1-dhfr-neoにクローニングしたものを、GP133-Δd4とした。また、GP129-Δd4をベースにGP115とGP129のジスルフィド結合部位を解離させると考えられるC167S改変を加えたものをGP129(C167S)-Δd4とした。発現時には各種gB-ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、GP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4であった。発現及び精製はGPCMV-gBと同様の方法で行い、GP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4(GPCMV-Δd4-ULs)精製品を得た。
Hartleyモルモット(雌、5週齢)に対し、GPCMV-gB、GPCMVペンタマー、GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133及びGP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4(GPCMV-Δd4-ULs)を免疫した。各抗原は0.0016μg/匹になるように生理食塩水(大塚製薬)で調製し、アジュバントとして10v/v%のAlum(Invivogen vac-alu250)及び50μg/匹のCpG ODN1826を使用した。調製した抗原液を2週間間隔で2回、モルモットに筋肉内接種(100μL/片足、後肢両足投与)し、2回免疫の2週後からHartleyモルモット(♂、9週齢以上)と交配を行い、妊娠モルモットを作製した。この時、PBS投与群も同様にして交配を行った。免疫群、PBS群(saline群)ともに、妊娠4週齢時点で野生型GPCMVを1×106pfu/匹皮下投与し、3週後にペントバルビタールナトリウムにて安楽殺後、胎盤を採取した。採取した胎盤はgentleMACS(ミルテニーバイオテク)により破砕し、MagNA Pure96(Roche)にてDNA抽出を行った。得られたDNAは7500FastリアルタイムPCRシステム(Thermo)を用い、表2に示すプローブ、プライマーセット(国際出願PCT/JP2019/047966号)にてGPCMV gp83遺伝子、細胞由来のβactin遺伝子の定量を行った。
<経胎盤感染防御試験>
実施例6と同様の方法により、GPCMV-gB、GPCMVペンタマー、GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133、GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4を発現、調製した。
Claims (32)
- サイトメガロウイルス(CMV)のエンベロープ糖タンパク質B(gBタンパク質)とペンタマーとの融合タンパク質であり、
前記gBタンパク質が、配列番号15、配列番号16、配列番号3又は配列番号31に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと90%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインを含み、
前記ペンタマーが、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるgHと90%以上の配列同一性を有するgH、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるgLと90%以上の配列同一性を有するgL、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるUL128と90%以上の配列同一性を有するUL128、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるUL130と90%以上の配列同一性を有するUL130、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるUL131と90%以上の配列同一性を有するUL131を含む、融合タンパク質。 - 3つのgBタンパク質構成分子からなるgBタンパク質のホモ三量体と、5つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも1つのgBタンパク質構成分子と少なくとも1つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって、タンパク質複合体を形成している、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 少なくとも2つのgBタンパク質構成分子と、少なくとも2つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 3つのgBタンパク質構成分子と、5つのペンタマー構成分子のうちのいずれか3つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項2又は3に記載の融合タンパク質。
- 3つのgBタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるgL、UL128及びUL130とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項2~4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 3つのgBタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるUL128、UL130及びUL131とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項2~4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも1つの融合が、gBタンパク質構成分子のN末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、請求項2~6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも2つの融合が、gBタンパク質構成分子のN末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、請求項3~6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 3つの遺伝子工学的な融合がすべて、gBタンパク質構成分子のN末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、請求項4~6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質構成分子とペンタマー構成分子との間にリンカー及び/又はタグを有する、請求項2~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- リンカーが配列番号22記載のアミノ酸配列単位を1~3回繰り返したアミノ酸配列からなるリンカーである、請求項10に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質がCMV gBタンパク質のエクトドメインである、請求項1~11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が配列番号15に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、請求項12に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと90%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、請求項12又は13に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質がドメインIVを欠失したgBタンパク質改変体である、請求項1~11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が配列番号16に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、請求項15に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと90%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、請求項15又は16に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が、野生型gBタンパク質に比べて、凝集体の形成を低減させ、ホモ三量体構造の割合を増加させる改変が導入されたgBタンパク質改変体である、請求項1~11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、請求項18に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと90%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、請求項18又は19に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が、野生型gBタンパク質に比べて、ヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入されたgBタンパク質改変体である、請求項1~11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が配列番号31に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgBタンパク質のエクトドメインである、請求項21に記載の融合タンパク質。
- gBタンパク質が、配列番号31に記載のアミノ酸配列からなるgBタンパク質のエクトドメインと90%以上の配列同一性を有するgBタンパク質のエクトドメインである、請求項21又は22に記載の融合タンパク質。
- ペンタマーが、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgH、gL、UL128、UL130及びUL131からなる、請求項1~23のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- gHがgHタンパク質のエクトドメインである、請求項24に記載の融合タンパク質。
- ペンタマーが、
配列番号4に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるgH、
配列番号5に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるgL、
配列番号6に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL128、
配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL130、及び
配列番号8に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるUL131
を含むヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のペンタマータンパク質である、請求項24又は25に記載の融合タンパク質。 - ペンタマーが、
配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるgHと90%以上の配列同一性を有するgH、
配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるgLと90%以上の配列同一性を有するgL、
配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるUL128と90%以上の配列同一性を有するUL128、
配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるUL130と90%以上の配列同一性を有するUL130、及び
配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるUL131と90%以上の配列同一性を有するUL131
からなるHCMVのペンタマータンパク質である、請求項24~26のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 請求項1~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸断片。
- 請求項28に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
- 請求項28に記載の核酸断片又は請求項29に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
- 請求項1~27のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、CMVの感染を予防又は治療するためのワクチン。
- CMVの感染がCMVの先天性感染である、請求項31に記載のワクチン。
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