KR102609106B1

KR102609106B1 - 사이토메갈로바이러스의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신

Info

Publication number: KR102609106B1
Application number: KR1020217021286A
Authority: KR
Inventors: 마사하루 도리카이; 히로아키 모리; 도모히로 니시무라; 다카히로 가타야마; 고스케 하제야마; 미유키 마쓰모토; 히로유키 시미즈; 나오키 이노우에
Original assignee: 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2023-12-05
Also published as: CN113164585B; EP3895730A4; JPWO2020121983A1; EP3895730A1; KR20210101274A; JP7179872B2; AU2019397719A1; AU2019397719B2; CA3121915A1; US20220023416A1; CN113164585A; WO2020121983A1

Abstract

본 발명의 과제는, CMV의 선천성 감염을 예방 및 치료할 수 있는 유효한 백신을 제공하는 것이다. 본 발명의 사이토메갈로바이러스(CMV)의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신은, CMV의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원과, 펜타머(Pentamer) 항원을 포함한다.

Description

사이토메갈로바이러스의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신

본 발명은, 사이토메갈로바이러스의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신에 관한 것이다.

사이토메갈로바이러스(CMV) 감염증에는, 크게 2개가 있다. 첫 번째는 임산부가 초감염된 경우에 태아가 발증하는 선천성 CMV 감염증이며, 두 번째는, 이식, AIDS, 선천성 면역 부전 등의 면역 억제 상태의 환자에 있어서 발증하는 CMV 폐렴, 장염, 망막염 등의 장기 장해이다. 이 중, 선천성 CMV 감염증은, TORCH 증후군의 하나이며, 태아에 기형 또는 위중한 임상 증상을 일으키는 중요한 선천성 감염증이다. 임산부가 CMV에 초감염된 경우, 대략 40%에서 태반을 통해 태아의 선천성 감염이 발생한다(본 명세서에 있어서는, 「선천성 감염」이라는 용어와 「경태반 감염」이라는 용어를 같은 의미로 사용하고 있다). 또, 사산의 약 15%가 선천성 CMV 감염에 의한 것이라는 보고도 있다. 선천성 감염아의 연간 발생 건수는, 일본에서 3000명 이상, 미국에서 약 4만명이며, 증후성은 일본에서 약 1000명, 미국에서 약 8000명이라고도 하며, 이 중 약 90%가 중추 신경 장해나 난청 등의 후유 장해가 남는다.

일본에 있어서의 CMV 항체 보유율은 구미제국에 비해 높고, 일본인 성인의 80%~90%는 CMV 항체 양성이며, 대부분의 사람이 유유아기에 감염된다. 그러나, 최근의 경향으로서, 젊은 층의 CMV 항체 보유율은 90%대에서 60%대로 저하 경향을 나타내고 있어, 선천성 CMV 감염증의 예방 대책의 필요성은 더욱 높아지고 있다(비특허문헌 1).

미국 의학 연구소(the Institute of Medicine)는, 선천성 CMV 감염증이 선진국에 있어서의 선천성의 중추 신경 장해의 원인으로서 다운증후군을 능가하는 임팩트를 가지고 있으며, 장해가 남은 선천성 감염아의 생애에 미치는 QOL의 저하와 사회경제적 손실을 QALYs(quality-adjusted life years)로서 산출하면, CMV 백신은, 가장 의료 경제 효과가 높은 카테고리로 분류된다고 분석하고 있다(비특허문헌 2).

감염증을 일으키는 병원체는, 종래형 백신으로 충분한 효과를 얻을 수 있는 Class I군 병원체와, 종래형 백신 또는 병원체 감염력으로는 충분한 방어 면역을 획득할 수 없는 Class II군 병원체로 크게 구별되는데, CMV는 후자로 분류된다. Class II군 병원체의 극복이 어려운 이유로서, 그들이 가지는 교묘한 면역 도피 기구가 지적되고 있다. 인류는 지금까지 Class I군 병원체에 대한 수많은 유효한 백신을 개발하여, 그들이 일으키는 감염증의 위협에 이겨내 왔다. 그리고 향후의 백신 개발의 초점은, Class II군 병원체로 옮겨지고 있다.

선천성 CMV 감염증의 피해를 최소한으로 억제하기 위해, 임산부 스크리닝에서 미감염 임산부를 동정(同定)하여, 생활 상의 주의를 계도하는 일도 행해지고 있지만, 충분하지는 않다. 또한 초감염 임산부를 동정하여, CMV 항체 고역가 면역 글로불린을 임산부에 투여함으로써 태아로의 감염 예방이나 중증화의 경감에 유효했다는 보고도 있는 것 같지만, 현재로서는 유효성에 의문이 나오고 있다(비특허문헌 3). 한편, 저분자약으로서 간시클로버(ganciclovir)도 시판되어 있지만, 그 효과는 한정적이며, 부작용의 문제도 있다. 현시점에 있어서 CMV 백신은 존재하지 않고, 또 상술한 바와 같이 충분히 유효한 치료법도 없는 점에서, 그 언맷 니즈는 높은 것으로 생각된다.

CMV 백신 개발에 관해서는, 지금까지 복수의 제약 기업이나 학계에 있어서 약독 생백신이나 서브유닛 백신, DNA 백신 등을 이용한 검토가 시도되어 왔지만, 모두 T세포 면역, B세포 면역 모두 응답이 불충분하여, 결과적으로 백신으로서 실용에 견딜 수 있는 효과는 얻어지지 않았다.

그 중에서 Sanofi사의 백신은, CMV 당단백질의 gB를 항원으로 한 서브유닛 백신인데, 미감염 성인 여성을 대상으로 한 임상 시험에 있어서 약 50% 정도의 감염 예방 효과를 나타냈다. 효과가 한정적이었기 때문에, 개발은 사실상 중단되어 있지만, 「gB 항원만으로 일정한 효과를 나타낼 수 있다(그러나 충분하지는 않다)」는 의의가 있는 지견이 얻어졌다(비특허문헌 4).

CMV의 백신 후보품의 효과의 실험적 증명에 대해서는, CMV의 종특이성에 대한 고려가 필요해진다. CMV에는 종특이성이 있기 때문에, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)를 이용한 동물 실험은 기본적으로 불가능하다. 동물 실험은 마우스, 래트, 모르모트, 원숭이 등을 이용하여 행해지는데, 각종 동물종에 고유의 CMV를 이용하여 실시된다. 경태반 감염에 대해서는, 모르모트만이, 모체로의 바이러스 감염을 일으키게 함으로써, 특수한 처치를 하지 않고도 태아로의 감염을 확인할 수 있는 동물 모델계이며, 모르모트의 경태반 감염 시험계는 널리 이용되고 있다(비특허문헌 5).

gB 백신의 경태반 감염에 대한 효과에 관해서는, 재조합 GPCMV의 gB 단백질+아쥬반트의 암컷 모르모트로의 투여에 의해, 암컷 모르모트의 초감염이 억제되고, 또, 태아로의 경태반 감염도 억제된 것이 보고되고 있다(비특허문헌 6).

비특허문헌 7에서는, GPCMV의 gB 단백질을 도입한 아데노바이러스 벡터 백신을 이용하여, 모르모트의 경태반 감염 모델에 있어서 태아로의 경태반 감염을 gB가 억제하는 것이 나타나 있다.

한편, CMV의 주요 항원으로서 최근 몇 년에 큰 주목을 모으고 있는 것이 펜타머(Pentamer) 항원이다. 펜타머는 CMV의 세포 지향성 결정 인자이며, 인간 CMV에서는 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131(gH/gL/UL128/UL130/UL131)의 5개의 서브유닛으로 구성되는 분자이다.

펜타머의 경태반 감염에 있어서의 기여에 관해서는, 펜타머 유전자를 결실(缺失)한 GPCMV는 상피·내피 세포로의 감염성과 경태반 감염능을 소실하고 있고, 결실한 유전자를 이소성으로 발현시킴으로써 그들이 부활하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 8).

또, 펜타머 백신의 효과에 관해서는, 펜타머를 발현시킨 벡터 백신 MVA-PC를 마우스에 투여하여 유도된 모노크로날 항체에 대해 상세하게 해석한 결과, 항gH 항체에 비해 항펜타머 항체의 상피 및 내피 세포계에서의 중화능이 분명하게 높고, 경태반 감염에 있어서 중요하다고 생각되는 영양막 세포에서의 중화능에 대해서도 동일했던 것이 보고되고 있다(비특허문헌 9).

그 반면에 상반되는 보고도 있다. 비특허문헌 10에서는, 인간의 태반에 있어서의 영양아 전구세포는 CMV의 타깃이며, 당세포로의 CMV의 감염에는 펜타머의 기여는 거의 보이지 않고, gB의 기여는 명확하게 보인다고 되어 있다.

또, 비특허문헌 11에서는, ex vivo의 태반 감염 시험계를 이용하여, GPCMV의 태반 조직으로의 감염 및 증식에는 펜타머의 기여가 거의 보이지 않는다고 되어 있다.

이와 같이, 펜타머의 백신 항원으로서의 유용성을 시사하는 보고는 산견되지만, 경태반 감염에 있어서의 펜타머의 역할이 명백하지 않고, 펜타머 백신의 경태반 감염에 대한 억제 효과에 대해서는 아직 결론이 나와 있다고는 할 수 없는 상황에 있다.

펜타머와 gB의 병용의 효과에 대해서는, 특허문헌 1에 있어서, 원숭이를 대상으로 한 감염 방어 시험에 있어서, 펜타머와 gB의 병용이 유효했다고 하는 보고가 되어 있지만, 경태반 감염으로의 영향에 대해서는 어떠한 시사도 주지 않았다. 또, 펜타머 단독군 및 비면역군과 비교해서, 펜타머+gB의 병용군이 우수한 것은 나타나 있지만, gB 단독군이 설정되어 있지 않기 때문에, 정확히는 병용의 효과를 나타내고 있지 않다.

또, 비특허문헌 12에서는, 항gB 모노크로날 항체와 항펜타머 모노크로날 항체의 병용 효과에 대해 in vitro로 검증하여, 중화능과 내성주 출현 억제에 관해서 병용의 이점이 있다고 되어 있지만, 생체에 있어서의 감염 방어능에 대해 병용의 효과를 증명하고 있지는 않다.

또한, 특허문헌 2에서는, gB+펜타머의 2가 백신으로 면역함으로써, 몇 개의 사이토카인의 산생이 단독군보다 높다는 데이터가 있는데, 중화능에서는 병용군은 우위는 아니고, 또, 감염 실험도 되어 있지 않다.

국제 공개 제2017/153954호 일본국 특허공표 2017-515503호 공보 국제 공개 제2003/004647호

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상술한 바와 같이, CMV의 감염 예방에 있어서, 특히 CMV의 선천성 감염을 억제할 수 있는 유효한 CMV 백신이 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명은, CMV의 선천성 감염을 예방 및 치료할 수 있는 유효한 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, CMV의 주요한 항원인 gB와 펜타머를 병용하여 2가 백신으로 함으로써, 모르모트에 있어서의 선천성 CMV 감염을 강하게 억제할 수 있음을 발견하여, 본 발명의 완성에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하의 각 발명에 관한 것이다.

[1] 사이토메갈로바이러스(CMV)의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원과, 펜타머 항원을 포함하는, CMV의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신.

[2] gB 단백질 항원이 CMV gB 단백질의 엑토도메인(ectodomain)인, [1]의 백신.

[3] gB 단백질 항원이 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 gB 단백질의 엑토도메인인, [2]의 백신.

[4] 펜타머 항원이, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 백신.

[5] 펜타머 항원이, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 펜타머 단백질의 엑토도메인인, [4]의 백신.

[6] 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원을 포함하는 백신과,

HCMV의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는 펜타머 항원을 포함하는 백신

을 포함하는, HCMV의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신 키트.

[7] 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신 또는 백신 키트의 제조에 있어서의, HCMV의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원, 그리고, HCMV의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는 펜타머 항원의 사용.

본 발명에 의하면, CMV의 선천성 감염 방어에 있어서, gB 단백질 항원과 펜타머 항원을 병용함으로써, 각각의 단독 투여에 의한 효과를 웃도는 감염 억제 효과를 가지는 백신을 제공할 수 있다. 이에 의해, CMV 백신의 실용화를 기대할 수 있다.

도 1은, SDS-PAGE에 의한 GPCMV-gB의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는, HPLC 겔 여과 분석에 의한 GPCMV-gB의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은, SDS-PAGE에 의한 GPCMV-Pentamer의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는, HPLC 겔 여과 분석에 의한 GPCMV-Pentamer의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는, SDS-PAGE에 의한 HCMV-gB의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은, HPLC 겔 여과 분석에 의한 HCMV-gB의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은, SDS-PAGE에 의한 HCMV-Pentamer의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은, HPLC 겔 여과 분석에 의한 HCMV-Pentamer의 성상 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는, GPCMV-gB, GPCMV-Pentamer 또는 GPCMV-gB와 GPCMV-Pentamer 2가의 면역 혈청에 포함되는 GPCMV-gB 결합 항체가를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은, GPCMV-gB, GPCMV-Pentamer 또는 GPCMV-gB와 GPCMV-Pentamer 2가의 면역 혈청에 포함되는 GPCMV-Pentamer 결합 항체가를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은, HCMV-gB, HCMV-Pentamer 또는 HCMV-gB와 HCMV-Pentamer 2가의 면역 혈청에 포함되는 HCMV-gB 결합 항체가를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는, HCMV-gB, HCMV-Pentamer 또는 HCMV-gB와 HCMV-Pentamer 2가의 면역 혈청에 포함되는 HCMV-Pentamer 결합 항체가를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은, HCMV 기감염자 PBMC를 이용하여, HCMV-gB, HCMV-Pentamer 또는 HCMV-gB와 HCMV-Pentamer의 2가로 자극한 경우의 IFNγ 산생 도너의 비율을 나타내는 도면이다.

본 발명의 백신의 일 실시 형태는, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원과, 펜타머 항원을 포함하는, CMV의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신이다. 즉, 본 실시 형태의 백신은 2종류의 항원 단백질을 포함하는 2가 백신이다.

사이토메갈로바이러스(CMV)는, 임의의 CMV주를 포함하고, 예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 모르모트 사이토메갈로바이러스(GPCMV), 마우스 사이토메갈로바이러스(MCMV), 래트 사이토메갈로바이러스(RCMV) 및 리서스 원숭이 사이토메갈로바이러스(RhCMV) 등을 들 수 있다.

CMV의 gB 단백질은, 야생형 CMV gB 단백질이어도, 개변형 CMV gB 단백질이어도 된다.

야생형 CMV gB 단백질이란, 임의의 CMV주에서 유래하는 gB 단백질을 의미하고, 예를 들면 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 HCMV AD169주 유래의 gB 단백질(GenBank의 등록 번호：GenBank ACCESSION No.：X17403.1), 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가지는 GPCMV 22122주에서 유래하는 gB 단백질(GenBank의 등록 번호：AB592928.1) 등을 들 수 있다.

개변형 CMV gB 단백질로서는, 예를 들면, 응집체가 형성하지 않도록 하기 위한 개변을 가지는 개변체, 항체 유도능 또는 중화 항체 유도능을 향상시키기 위한 개변을 가지는 개변체 등을 들 수 있다. 「중화 항체 유도능」이란, 항원 단백질에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 능력을 말하고, 항원 단백질을 피검동물에 접종함으로써 얻어지는 면역 혈청 중의 중화 항체가(neutralizing antibody titer)로 평가될 수 있다. 「중화 항체」란, 바이러스 입자의 감염성을 소실시킬 수 있는 항체를 말하며, 예를 들면 피검 바이러스의 플라크 수를 50% 감소시키는데 필요한 항체의 농도(NT50)에서 그 항체의 중화 활성의 높이를 평가할 수 있다.

개변형 CMV gB 단백질은, 야생형 CMV gB 단백질에 대해, 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 연속된 아미노산 잔기 영역이, 치환, 결손(결실) 또는 부가된 단백질을 말하며, 아미노산 잔기의 치환 또는 결손에 의해 당쇄 도입된 단백질 등의 야생형에 존재하지 않는 단백질 수식이 된 단백질도 포함한다.

CMV의 gB 단백질 항원은, gB 단백질의 전체 길이여도, gB 단백질의 일부의 단편이어도 된다. 단편으로서는, 예를 들면 CMV의 gB 단백질의 엑토도메인 또는 엑토도메인의 일부 영역을 들 수 있다. gB 단백질의 전체 길이로서는, 예를 들면, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지는 HCMV gB 단백질을 들 수 있다(GenBank의 등록 번호：GenBank ACCESSION No.：X17403.1). 단, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열 중, 1번째부터 24번째의 아미노산 서열은, 리더 서열이다. 엑토도메인으로서는, 예를 들면, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열 중, 25번째부터 706번째의 아미노산 서열을 가지는 HCMV gB 단백질의 단편을 들 수 있다.

또, 이들 gB 단백질 항원은, 아미노산 치환 등에 의해 성상이 개선된 것이어도 된다. 예를 들면, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열 중, 1번째부터 706번째의 아미노산 서열을 가지는 HCMV gB 단백질의 엑토도메인을 베이스로 하고, 비특허문헌 13을 참고로, 156번째의 아미노산 잔기를 히스티딘 잔기(His)로, 157번째의 아미노산 잔기를 아르기닌 잔기(Arg)로, 239번째의 아미노산 잔기를 글루탐산 잔기(Glu)로, 240번째의 아미노산 잔기를 알라닌 잔기(Ala)로, 456번째의 아미노산 잔기를 트레오닌 잔기(Thr)로, 458번째의 아미노산 잔기를 글루타민 잔기(Gln)로 치환한 HCMV gB 단백질 엑토도메인 개변체(서열 번호 1)를 들 수 있다.

CMV의 gB 단백질 항원은, CMV를 이용하여 단백질 정제에 의해 제작해도 되고, 유전자 공학의 수법에 의해 제작할 수 있다. 제작 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 야생형 gB 단백질의 cDNA를 템플릿으로 하여, 프라이머를 설계하고, PCR에 의해 핵산을 얻어, 발현 프로모터와 기능적으로 연결하고, 경우에 따라 태그도 연결하여, 적절한 발현 벡터에 도입하여, 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 제작된 CMV gB 단백질 항원은, 필요에 따라 정제해도 된다. 정제 방법은 특별히 한정되지 않지만, 어피니티 크로마토그래피 컬럼 등에 의한 정제를 들 수 있다.

개변형 gB 단백질 항원이 변이 도입에 의한 개변체인 경우, 목적의 변이를 도입하기 위한 프라이머를 설계하고, PCR에 의해 변이가 도입된 핵산을 얻어, 발현 프로모터와 기능적으로 연결하고, 경우에 따라 태그도 연결하여, 적절한 발현 벡터에 도입하여, 발현시킴으로써 얻을 수 있다.

또, 개변형 gB 단백질 항원이 당쇄 도입(당쇄 수식)에 의한 개변체인 경우는, 통상의 방법이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, N형 당쇄를 도입하는 경우, 야생형 gB 단백질의 cDNA를 템플릿으로 하여, N형 당쇄를 도입하는 목적 부위의 3개가 연속된 아미노산 서열이, N-X-S/T(X는 프롤린 이외의 임의의 아미노산)가 되도록, 프라이머를 설계하고, PCR에 의해 변이를 도입한다. 목적의 개변형 gB 단백질의 핵산 서열, 또한 필요하면 6×His 등의 태그를 연결한 핵산 서열을 적절한 벡터에 클로닝하여, 발현시킴으로써 개변형 CMV gB 단백질을 얻을 수 있다. 그리고, gB 개변체의 목적 부위의 아스파라긴에 통상의 방법에 의해 N형 당쇄를 부가한다.

CMV의 펜타머는, 오량체 복합체, 또는 단순히 오량체라고도 한다. 야생형 CMV 펜타머여도, 개변형 CMV 펜타머여도 된다.

야생형 CMV 펜타머란, 임의의 CMV주에서 유래하는 펜타머를 의미하며, 예를 들면 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는 오량체, 모르모트 사이토메갈로바이러스(GPCMV)의 GP75(gH), GP115(gL), GP129(UL128), GP131(UL130) 및 GP133(UL131)로 이루어지는 오량체 등을 들 수 있다.

HCMV 펜타머는, 예를 들면 서열 번호 2(gH), 서열 번호 3(gL), 서열 번호 4(UL128), 서열 번호 5(UL130) 및 서열 번호 6(UL131)에 기재된 아미노산 서열을 가지는 HCMV Merlin주 유래의 펜타머 단백질(GenBank의 등록 번호：GenBank ACCESSION No.：AY446894.2)(단, UL128의 염기 서열에는 변이를 포함하고 있기 때문에, 다른 CMV주의 서열 정보를 베이스로 수정을 추가하고 있다) 등을 들 수 있다.

GPCMV 펜타머는, 예를 들면 서열 번호 10(GP75), 서열 번호 11(GP115), 서열 번호 12(GP129), 서열 번호 13(GP131) 및 서열 번호 14(GP133)에 기재된 아미노산 서열을 가지는 GPCMV 22122주 유래의 펜타머 단백질(GenBank의 등록 번호：GenBank ACCESSION No.：AB592928.1)(단, GP133의 염기 서열에는 변이를 포함하고 있기 때문에, 다른 CMV주의 서열 정보를 베이스로 수정을 추가하고 있다) 등을 들 수 있다.

개변형 CMV 펜타머로서는, 예를 들면, 응집체가 형성하지 않도록 하기 위한 개변을 가지는 개변체, 항체 유도능 또는 중화 항체 유도능을 향상시키기 위한 개변을 가지는 개변체 등을 들 수 있다. 개변형 CMV 펜타머는, 야생형 CMV 펜타머를 구성하는 5개의 단백질 중 적어도 1개가 개변 단백질인 펜타머를 말하고, 야생형 CMV 펜타머를 구성하는 단백질에 대해, 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 연속된 아미노산 잔기 영역이, 치환, 결손(결실) 또는 부가된 단백질을 말하며, 아미노산 잔기의 치환 또는 결손에 의해 당쇄 도입된 단백질 등의 야생형에 존재하지 않는 단백질 수식이 된 단백질도 포함한다.

CMV 펜타머 항원은, CMV를 이용하여 단백질 정제에 의해 제작해도 되고, 유전자 공학의 수법에 의해 제작할 수 있다. 제작 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 야생형 CMV 펜타머를 구성하는 5개의 단백질의 cDNA를 템플릿으로 하여, 프라이머를 설계하고, PCR에 의해 핵산을 얻어, 발현 프로모터와 기능적으로 연결하고, 경우에 따라 태그도 연결하며, 적절한 발현 벡터에 도입하여, 발현시키고, 폴딩시켜 오량체 구조를 형성시킴으로써 얻을 수 있다. CMV 펜타머 항원은, 필요에 따라 분비형 단백으로서 발현시킬 수도 있다. 예를 들면, gH를 전체 길이(서열 번호 9)가 아닌, 엑토도메인(서열 번호 2)의 단편으로서 발현시킴으로써, 분비형 단백으로서의 발현이 가능해진다. 제작된 CMV 펜타머 항원은, 필요에 따라 정제해도 된다. 정제 방법은 특별히 한정되지 않지만, 어피니티 크로마토그래피 컬럼 등에 의한 정제를 들 수 있다.

개변형 CMV 펜타머 항원이 변이 도입에 의한 개변체, 또는 당쇄 도입(당쇄 수식)에 의한 개변체인 경우는, 상술한 바와 같이 제작할 수 있다.

본 실시 형태의 백신은, 예를 들면, 1:10~10:1의 질량비로 CMV의 gB 단백질 항원과 CMV 펜타머 항원을 함유해도 되고, 등질량으로 함유하는 것이 바람직하다. 백신에 있어서의 단백질 항원의 함유량은, CMV의 gB 단백질 항원 및 CMV 펜타머 항원은, 각각 0.1~1000μg이면 되고, 1~100μg인 것이 바람직하다.

본 실시 형태의 백신의 제형은, 예를 들면, 액상, 분말상(동결건조 분말, 건조 분말), 캡슐형, 정제, 동결 상태여도 된다.

본 실시 형태의 CMV 백신은, 의약으로서 허용될 수 있는 담체를 포함하고 있어도 된다. 상기 담체로서는, 백신 제조에 통상 이용되는 담체를 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로는, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 등장(等張) 수성 완충액 및 그들의 조합을 들 수 있다. 백신은, 유화제, 보존제(예를 들면, 티메로살), 등장화제, pH조정제, 불활화제(예를 들면, 포르말린) 등이, 추가로 적절히 배합되어도 된다.

본 실시 형태의 백신의 면역원성을 더 높이기 위해, 아쥬반트를 추가로 포함하는 것도 가능하다. 아쥬반트로서는, 예를 들면, 알루미늄 아쥬반트 또는 스쿠알렌을 포함하는 수중유형 유탁 아쥬반트(AS03, MF59 등), CpG 및 3-O-탈아실화-4'-모노포스포릴 lipid A(MPL) 등의 Toll 유사 수용체의 리간드, 사포닌계 아쥬반트, 폴리γ-글루탐산 등의 폴리머계 아쥬반트, 키토산 및 이눌린 등의 다당류를 들 수 있다.

본 실시 형태의 백신은, CMV gB 단백질 항원 및 CMV 펜타머 항원과, 필요에 따라, 담체, 아쥬반트 등과 혼합함으로써 얻을 수 있다. 아쥬반트는, 사용 시에 혼합하는 것이어도 된다.

본 실시 형태의 백신의 투여 경로는, 예를 들면, 경피 투여, 설하 투여, 점안 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 경장 투여, 경비 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 입으로부터 폐로의 흡입 투여여도 된다.

본 실시 형태의 백신의 투여 방법은, 예를 들면, 시린지, 경피적 패치, 마이크로 니들, 이식 가능한 서방성 디바이스, 마이크로 니들이 달린 시린지, 무침(無針) 장치, 스프레이에 의해 투여하는 방법이어도 된다.

본 실시 형태의 백신에 의하면, CMV의 경태반 감염을 예방 또는 치료할 수 있다. 경태반 감염의 예방이란, 모체에 백신을 투여함으로써, 태아로의 CMV의 수직 감염을 억제하는 것, 혹은, 선천성 감염에 의해 발생하는 각종 증상의 발현을 억제하는 것이다. 이들은, 태아의 양수나 신생아의 체액을 이용한 핵산 증폭법에 의한 검사나, 신생아의 두부 초음파 검사, 두부 CT 검사, 두부 MRI 검사, 또는 청각 스크리닝 등에 의해 평가할 수 있다. 경태반 감염의 치료란, 선천성 감염아에 백신을 투여함으로써, 선천성 감염에 의해 발생하는 각종 증상의 발현이나 진전을 억제하는 것이다. 이들은, 선천성 감염아의 청력 검사, 시력 검사, 그 외의 신체학적 검사나 정신 발달 검사 등에 의해 평가할 수 있다. 본 실시 형태의 백신은, 임신 가능 연령의 여성 혹은 여자 아동을 대상으로 투여하는 것이 바람직하다. 집단 면역의 관점으로부터, 남성이나 남자 아동, 고령자까지를 대상으로 하는 것도 생각할 수 있다. 또, 투여 횟수는 1회부터 3회, 단, 2개월부터 수년의 간격을 두고 복수 회 접종하는 것이 바람직하다. 혈중의 항체가를 측정하여, 항체가 음성이거나 혹은 항체가가 낮은 사람을 접종 대상으로 할 수도 있다.

본 발명의 백신 키트는, HCMV gB 단백질 항원을 포함하는 백신과, HCMV의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는 펜타머 항원을 포함하는 백신을 포함하는, HCMV의 경태반 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신 키트이다. 즉, HCMV gB 단백질 항원을 포함하는 1가 백신과, HCMV 펜타머 항원을 포함하는 1가 백신의 2종류의 백신을 포함하는 백신 키트이다.

2종류의 백신은, 혼합하여 투여해도 되고, 따로 따로 투여해도 된다. 따로 따로 투여하는 경우는, 차례를 불문하고 순서대로 투여하면 되고, 예를 들면 1종류째의 투여 후 15분 이내에 2종류째를 투여한다.

실시예

[재료·방법]

＜GPCMV-gB의 조제 및 성상 해석＞

모르모트 경태반 감염 모델계를 이용하여 평가하기 위해, 모르모트에 감염성을 나타내는 모르모트 사이토메갈로바이러스(GPCMV)를 이용했다. 재조합 GPCMV gB 단백질은 응집체를 포함하는 경우가 있기 때문에, 응집체를 포함하지 않는, 성상 개선한 개변 GPCMV gB 단백질을 제작했다.

GPCMV 22122주에서 유래하는 gB의 엑토도메인(1-656aa)에 리더 서열을 부가하고, 추가로 성상 개선을 위한 아미노산 변이를 도입한 gB(서열 번호 15)를 코딩하는 유전자를 인공 합성하여, pCAGGS1-dhfr-neo(특허문헌 3)에 클로닝했다. gB의 C말단에는 His-tag가 부가되도록 디자인했다. 발현에는, Expi293 발현 시스템(라이프 테크놀로지스사)을 이용했다. 발현 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하여, 4~6일에 배양 상청을 회수했다. GPCMV gB를 포함하는 배양 상청으로부터, Ni NTA Agarose(QIAGEN사)를 이용하여 정제하고, PBS+0.5M Arginine에 대해 투석을 행하여, 개변 GPCMV gB 단백질의 엑토도메인(이하, 「GPCMV-gB」라 부른다)의 정제품을 얻었다.

GPCMV-gB의 정제품에 대해, 이하와 같이 성상 해석을 실시했다. 디티오트레이톨(DTT)에 의한 환원 처리를 행한 검체(DTT(+))와, 행하지 않은 검체(DTT(-))를 각각 8~16% SDS-PAGE 그라디언트 젤로 영동(泳動)하고, Bullet CBB Stain One(nacalai tesque사)으로 염색했다. 그 결과는 도 1에 나타낸다. 도 1에 있어서의 레인 1, 2는 각각 마커(Bench Mark Prestained Invitogen 10748-010), 및, 정제한 GPCMV-gB 2μg/레인이며, 레인 2에 있어서 GPCMV-gB의 밴드가 메인 밴드로서 확인되었다. 또, Superdex200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare사)을 이용하고, 이동상으로서 PBS를 이용하여, 유속 0.4mL/분으로 HPLC 겔 여과 분석을 행한 결과, 기대된 삼량체의 피크가 거의 싱글 피크로서 확인되었다(도 2).

＜GPCMV-Pentamer의 조제 및 성상 해석＞

다음에, GPCMV 22122주에서 유래하는 펜타머의 엑토도메인을 조제했다. GPCMV 펜타머의 엑토도메인의 가용성 발현에 관해서는 보고예가 없었기 때문에, HCMV 펜타머의 엑토도메인의 가용성 발현의 보고예(비특허문헌 14)를 참고로, 이하에 설명하는 바와 같이 디자인하여, 발현 플라스미드를 구축했다.

GP75의 엑토도메인(1-698aa, 서열 번호 16)을 코딩하는 유전자를 인공 합성하여, pCAGGS1-dhfr-neo에 클로닝했다. GP75의 C말단에는 His-tag가 부가되도록 디자인했다. 또한, HCMV의 gL의 오르소로그인 GP115(1-258aa, 서열 번호 11)를 코딩하는 유전자, HCMV의 UL128의 오르소로그인 GP129(1-179aa, 서열 번호 12)를 코딩하는 유전자, HCMV의 UL130의 오르소로그인 GP131(1-192aa, 서열 번호 13)을 코딩하는 유전자, HCMV의 UL131의 오르소로그인 GP133(1-127aa, 서열 번호 14)을 코딩하는 유전자를, 각각 인공 합성하여, pCAGGS1-dhfr-neo에 클로닝했다. 발현 및 정제는 GPCMV-gB와 동일한 방법으로 행하여, GPCMV 펜타머의 엑토도메인(이하, 「GPCMV-Pentamer」라 부른다) 정제품을 얻었다.

GPCMV-gB와 동일하게 성상 해석을 실시한 바, SDS-PAGE에서는 GPCMV-Pentamer를 구성하는 각종 구성 성분의 밴드가 각각 확인되었다(도 3). 또, HPLC 겔 여과 분석에 있어서는, 기대된 오량체(펜타머)의 피크가 메인 피크로서 확인되었다(도 4).

＜GPCMV/모르모트 면역원성 시험＞

제작한 GPCMV-gB 및 GPCMV-Pentamer를 이용하여, 모르모트 면역원성 시험을 실시했다. 4주령, 암컷의 Hartley 모르모트에 대해, 각 항원(GPCMV-gB, GPCMV-Pentamer 또는 GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer)은 25μg/마리가 되도록, 생리 식염수(오오츠카 제약)로 조제하고, 아쥬반트로서 10v/v%의 Alum(Invivogen) 및 50μg/마리의 CpG ODN1826(Invivogen)을 사용했다. 조제한 항원액을 2주간 간격으로 3회, Hartley 모르모트(암컷 3마리/군)에 근육내 접종(100μL, 뒷다리 및 양다리)하고, 최종 면역의 2주일 후에 이소플루란 흡입 마취 하에서의 심장 채혈에 의해 전체 채혈했다. 얻어진 혈액은 응고 촉진제를 넣은 분리관에서 혈청 분리하고, 56℃, 30분간 비동화 처리를 행한 것을 면역 혈청으로 하고, 이들 면역 혈청을 이용하여 중화 항체 유도능 해석(중화 항체가 해석) 및 결합 항체 유도능 해석(결합 항체가 해석)을 실시했다.

＜중화 항체가 해석을 위한 모르모트의 세포와 GPCMV＞

바이러스의 배양과 선유아세포계의 중화 항체가 해석에는 ATCC로부터 구입한 GPL 세포(CCL 158)를 사용했다. 세포 배양용 배지는 F12(x1) Nutrient Mixture(+)L-glutamine 배지(Gibco, Cat. No.11765-054)에 10% FBS(Hyclone), 100Units/mL Penicillin, 100μg/mL Streptomycin(Gibco, Cat. No.15140-122)을 첨가하여 조제하고, 세포의 확장, 유지, 해석에 사용하여, 모두 37℃, 5%의 CO₂ 농도의 조건 하에서 배양했다.

중화 항체가 해석에 이용하는 모르모트 유래 매크로퍼지의 조제는 이하와 같이 행했다. 비장 세포를 회수하고, 원심하여 세포를 모으고, 10~20mL의 1×RBC(NH₄Cl 8.26g, NaHCO₃ 1.19g, EDTA·Na₂ 0.378g을 멸균수 100mL에 용해하여, pH를 7.3으로 맞추고, 여과 멸균 후 냉장 보존하고, 사용 시에 멸균수로 10배 희석한 것)에 현탁하여 적혈구를 용혈시켰다. 원심 후, 세포를 1×PBS에 현탁하고 원심하는 것을 복수 반복하고, 얻어진 세포를 단구로 하여 -80℃에서 10% DMSO와 50% FBS를 포함하는 배지를 첨가하여 보존, 혹은, 그대로 매크로퍼지에 분화시켜 사용했다. 중화 항체가 해석에 이용하는 모르모트 유래 매크로퍼지는, 단구 1.5~2.5×10⁵개/웰/96웰 플레이트를 100nM TPA 존재 하에서 2일 배양하고, 상청을 제거한 후, 플레이트에 부착되어 있는 세포를 매크로퍼지로서 사용했다.

중화 항체가 해석에 이용하는 바이러스는, 이하의 순번으로 제작했다. 우선, pBluescript II KS(+)에, ATCC로부터 구입한 GPCMV 22122주(VR-682) 감염 세포로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭하여 얻은 GPCMV 게놈의 염기 서열(비특허문헌 15)의 2642-4247 영역 및 13030-14482 영역을 클로닝했다. 다음에, 이 플라스미드에, 8.6kb의 F 플라스미드 레플리콘(BAC)과 GFP 발현 카세트를, GPCMV 염기 서열 3992와 3993 사이에 클로닝했다. 얻어진 플라스미드를 GPCMV 22122주 게놈 DNA와 함께 GPL 세포에 유전자 도입하고, 출현한 GFP 발현 바이러스를 5회 계대 후, 그 감염 세포로부터 Hirt법에 의해 환상 DNA를 회수하고, 일렉트로포레이션법으로 대장균 DH10B에 유전자 도입하여, pBAC-GPCMVΔ9K를 얻었다. 이 BAC DNA를 GPL 세포에 유전자 도입함으로써, GFP를 발현하여 클론화된 GPCMV-BACΔ9K를 작출했다(비특허문헌 16).

중화 항체가 해석용의 정제 바이러스 뱅크는 이하와 같이 조제했다. 70~80% 정도의 밀도가 된 GPL 세포에, 10분의 1 양의 GPCMV-BACΔ9K 감염 GPL 세포를 첨가하고, 60~70%의 세포가 세포 변성 효과에 의해 박리될 때까지 수일간 배양 후, 배양액을 회수하여, 실온에서 1700×g의 원심을 10분간 행하고, 그 상청을 회수하여, 5mL의 20% 자당 함유 PBS를 최초로 첨가한 초원심용 30mL 원심관에, 자당층과 혼합하는 일이 없도록 천천히 중층하여, 70,000×g으로 2시간 초원심(로터：히타치 공기 P32ST)했다. 상청을 제거하고, 펠릿을 상층한 상청의 50~100분의 1 양의 PBS에 현탁 후, 분주(分注)하고, 중화 항체가 해석용의 정제 바이러스 뱅크로서 -80℃에서 보존하고, 사용 시에는 각 분주를 일회용으로 했다.

중화 항체가 해석용의 정제 바이러스 뱅크의 바이러스 역가는, 이하와 같이 결정했다. -80℃에서 보존한 정제 바이러스의 분주를 융해하고, PBS로 희석계열을 제작 후, 24웰 플레이트에 파종하여 80~90%로 되어 있는 GPL 세포에 감염시켜, 1~2일 배양했다. 형광 도립 현미경 하에서, GFP를 발현하는 GPCMV의 포커스를 계수했다. 또한, 이 GFP 발현에 의거하는 역가 결정법과, GPCMV에 대한 모노크로날 항체를 이용한 면역 염색법은 같은 결과가 되는 것은 미리 확인되었다.

＜GPCMV/선유아세포 중화 항체가 해석＞

GPL 세포를 이용한 중화 항체가 해석은, 포커스수 감소 활성(포커스 축소 활성)을 이용하여 행했다. 해석에는, 96웰 플레이트(Corning 3596)에 2×10⁴세포/웰로 파종한 GPL 세포를 하룻밤 배양한 플레이트를 사용했다. 각 면역 혈청(항GPCMV-gB 혈청, 항GPCMV-Pentamer 혈청, 또는 GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer 혈청)을, 배지를 이용하여 단계 희석하여 소정의 농도가 되도록 조제하고, 약 135PFU의 GPCMV-BACΔ9K주를 첨가하여 50μL로 한 혼합액을, 37℃에서 30분 반응시켰다. 음성 대조군으로서 혈청 대신에 배지를 첨가한 반응액을 동일하게 반응시켰다. 해석 플레이트의 세포에 20μL/웰을 접종 후, 37℃에서 2시간 배양하고, 세포에 흡착시켰다. 반응액을 제거하고, 배지를 첨가하여 2일간 배양했다. GFP 발현 포커스수를, 형광 현미경을 이용하여 계수하고, 항체를 포함하지 않는 반응액에서의 결과를 기준으로, 각 면역 혈청에 의한 세포 수의 비율의 억제율로부터, 중화 항체가를 판정했다. 결과를 표 1에 나타낸다.

＜GPCMV/매크로퍼지 중화 항체가 해석 시험＞

매크로퍼지를 이용한 중화 항체가 해석은, 감염 세포 수 감소 활성을 이용하여 행했다. 해석에는, 상술한 방법으로 96웰 플레이트(Corning 3596)에서 단구로부터 분화시킨 매크로퍼지를 이용했다. 각 면역 혈청을, 배지를 이용하여 단계 희석하여 소정의 농도가 되도록 조제하고, 약 1350PFU의 GPCMV-BACΔ9K주를 첨가하여 50μL로 한 혼합액을, 37℃에서 30분 반응시켰다. 음성 대조군으로서 혈청 대신에 배지를 첨가한 반응액을 동일하게 반응시켰다. 해석 플레이트의 세포에 20μL/웰을 접종 후, 37℃에서 2시간 배양하고, 매크로퍼지에 흡착시켰다. 반응액을 제거하고, 배지를 첨가하여 2일간 배양했다. GFP 발현 매크로퍼지를, 형광 현미경을 이용하여 계수하고, 항체를 포함하지 않는 반응액에서의 결과를 기준으로, 각 면역 혈청에 의한 세포 수의 비율의 억제율로부터, 중화능을 판정했다. 결과를 표 1에 나타낸다.

＜GPCMV/결합 항체가 해석＞

GPCMV-gB 또는 GPCMV-Pentamer를 PBS(Wako)로 1μg/mL로 희석하고, MaxiSorp plate(Nunc)에 50μL 넣고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트함으로써 고상화했다. 고상화 후, 플레이트를 PBS로 세정하고, 각 면역 혈청(항GPCMV-gB 혈청, 항GPCMV-Pentamer 혈청, 또는 GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer 혈청)의 희석액을 플레이트의 웰에 100μL 첨가하여 실온에서 인큐베이트했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, 검출 항체 goat anti-Guinea Pig IgG HRP secondary antibody(ROCKLAND사 Cat.606-103-129)를 플레이트의 웰에 100μL 첨가하여, 실온에서 인큐베이트했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, TMB(SIGMA사 Cat.T-4444)를 플레이트의 웰에 100μL 첨가함으로써 발색시켰다. 30분 후, 1N 황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더(몰레큘러 디바이스사)로 발색치(O.D.450nm/650nm)를 측정했다. 측정한 결과를 도 9, 및 도 10에 나타낸다. GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer 면역 혈청은, GPCMV-gB 및 GPCMV-Pentamer 어느 것에 대해서나 높은 결합 항체가를 나타내고 있었다. 이 점에서, GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer 면역군에서는, 이들 2종의 항원 양쪽 모두에 대한 면역 응답이 유도된 것으로 생각할 수 있다.

＜모르모트 경태반 감염 시험＞

이하의 방법으로 모르모트의 경태반 감염에 대한 각종 항원의 방어능의 검토를 행했다. 우선, 상기 얻어진 GPCMV-gB 및 GPCMV-Pentamer를 비임신 암컷 모르모트(Hartley, 4주령)에 면역했다.

군 구성으로서는, GPCMV-gB군, GPCMV-Pentamer군, GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer 병용군, 및 대조군으로서 생리 식염수군의 4군 구성(각 군 40마리)으로 했다. 각 항원을 25μg/마리로, 아쥬반트에는 Alum+CpG를 이용했다. 2주 간격으로 합계 3회의 근육내 투여를 행하고, 3회째의 투여로부터 2주 후에 항혈청을 회수하여, 각 군에 대해 40마리분의 항혈청을 풀했다. 풀한 항혈청으로부터 Protein A 컬럼 크로마토그래피에 의한 항체 획분의 정제를 행했다. 용출 후 PBS에 대해 투석한 것을 항체 획분으로 했다.

＜모르모트 IgG의 정량＞

항체 획분의 투여량을 결정하기 위해서 각종 모르모트 항혈청 중의 IgG 농도를 IgG 정량 ELISA에 의해 정량했다.

IgG 정량 ELISA는 이하의 순번으로 실시했다. Anti-GUINEA PIG IgG(H&L)(GOAT) Antibody(ROCKLAND사 Cat.606-1102)를 PBS(Wako)로 1μg/mL로 희석하고, MaxiSorp plate(Nunc)에 100μL 넣고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트함으로써 고상화했다. 고상화 후, 플레이트를 PBS로 세정하고, 각종 항혈청의 희석액을 플레이트의 웰에 100μL 첨가하여, 실온에서 인큐베이션했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, HRP 표지 항모르모트 IgG 항체(자가 조제품)를 플레이트의 웰에 100μL 첨가하여, 실온에서 인큐베이트했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, TMB(SIGMA사 Cat.T-4444)를 플레이트의 웰에 100μL 첨가함으로써 발색시켰다. 30분 후, 1N 황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더(몰레큘러 디바이스사)로 발색치(O.D.450nm/650nm)를 측정했다. 표준품으로서 항HSV gD 항체(자가 조제품)를 이용하여, 검량선을 작성함으로써 항혈청 중의 IgG 농도를 정량했다.

그 결과, 항혈청 중의 IgG 농도는, GPCMV-gB군이 2.71mg/mL, GPCMV-Pentamer군이 2.94mg/mL, GPCMV-gB+GPCMV-Pentamer 병용군이 3.44mg/mL, 및 대조군이 1.56mg/mL였다.

혈청 중 IgG 농도가 1.6~3.4mg/mL였기 때문에, 1회의 투여로 1마리분의 IgG를 투여하기 위해, 2mL/마리씩의 투여를 상정하고, Amicon Ultra(머크사 UFC903024)를 이용하여 단백질 농축을 행하여, 15~30mg/mL의 IgG 정제품을 조제했다.

IgG 정제품을 임신 모르모트에 투여하고, 다음날, GPCMV를 감염시켰다(각 군 4마리). 감염으로부터 1주일 후에 항체 획분을 추가 투여했다.

Hartley 모르모트(임신 4주령)의 복강내에 IgG 정제품을 2mL씩 투여했다. 다음날, 야생형 GPCMV를 1×10⁶PFU/개체가 되도록 피하 접종했다. 대사된 항체를 보충할 목적으로, 1주일 후에 복강내에 IgG 정제품을 1mL씩 추가 투여했다. 감염 3주 후에 안락사 후, 해부하여, 모체의 장기(비장, 간장, 신장, 폐, 침샘, 태반), 태아의 장기(간장, 폐, 뇌)를 채집했다. 각 장기를 잘게 자른 후 호모지네이트로 한 검체로부터 바이러스 DNA를 Maxwell16 Tissue DNAPurificaion Kit(Promega사)를 이용하여 정제하고, 정량 PCR에 의해 바이러스 카피 수를 산출했다. 5×10⁵개의 세포당 1카피 이상의 바이러스 카피 수가 검출된 검체는 「감염 있음」으로 판정했다. 또한, 정량 PCR은 표 2에 나타내는 조건으로 실시했다. 사용한 프라이머 및 프로브는 표 3에 나타낸다.

[결과·고찰]

결과를 표 4에 나타낸다. 괄호 안의 수치는, 평가한 검체 수(모체와 태아는 마리 수이며, 태반은 개수)에 대해 바이러스 양성이 된 검체 수를 나타낸다. 표 4로부터, 태아로의 선천성 감염의 억제 효과는 gB+Pentamer군이 가장 높았다. 그 다음에 Pentamer군이 높고, gB군에서는 거의 효과를 보이지 않았다. gB+Pentamer 병용군이 태아로의 감염을 가장 강력하게 억제한 점에서, CMV 백신의 실용화를 향한 어프로치로서는 「gB 및 펜타머를 병용한 서브유닛 백신」이라는 새로운 방향성이 유효한 것으로 기대된다.

이상으로부터, gB+Pentamer 병용군은, 모르모트 모체의 초감염에는 거의 효과를 나타내지 않았음에도 불구하고, 태아로의 감염을 유의미하게 억제했다. 그 억제 효과는, gB 및 Pentamer 각각의 단독군에 비해 높은 것이었다. 이번 결과는, 모체로부터 태아로의 바이러스의 이행을, 항gB 항체 및 항Pentamer 항체가 공존함으로써, 보다 유효하게 억제할 수 있는 것을, 동물 병태 모델을 이용하여 나타낸 첫 예이며, gB+Pentamer의 병용 요법이 인간의 선천성 감염 억제에도 유효한 가능성을 강하게 시사하는 것이다.

[인간으로의 적용/인체용 백신 항원의 제작]

상기 실시예에서, 모르모트로의 병용 항원의 투여가 경태반 감염 예방에 효과가 있음이 증명되어, 인체용 CMV 백신 후보로서, 병용 항원이 유효한 것으로 시사되었다. 이에, 인간으로의 적용을 위해서, HCMV의 gB 및 펜타머 항원을 제작했다.

＜HCMV-gB의 조제 및 성상 해석＞

AD169주에서 유래하는 HCMV-gB의 엑토도메인을 베이스로 성상 개선을 위한 아미노산 변이를 도입한 개변 HCMV-gB 단백질 「gB1-682-fm3Mv9」(이하, 「HCMV-gB」라 부른다)를 제작하고(서열 번호 1), GPCMV-gB와 동일한 방법으로 발현 및 정제를 행했다.

성상 해석도 GPCMV-gB와 동일하게 행했다. SDS-PAGE에서는 HCMV-gB의 밴드가 메인 밴드로서 확인되었다(도 5). 또, HPLC 겔 여과 분석에 있어서는, 기대된 삼량체의 피크가 메인 피크로서 확인되었다(도 6).

＜HCMV-Pentamer의 조제 및 성상 해석＞

다음에, Merlin주에서 유래하는 HCMV 펜타머의 엑토도메인을 제작했다. HCMV 펜타머의 엑토도메인을 구성하는 단백질로서, Merlin주에서 유래하는 UL128(서열 번호 4), UL130(서열 번호 5), UL131(서열 번호 6), gL(서열 번호 3), 및 gH(서열 번호 9)를 사용했다.

인공 유전자 합성 및 유전자 공학적 수법을 이용하여, HCMV 펜타머의 엑토도메인을 구성하는 각 단백질의 유전자 서열을 pCAGGS1.dhfr.neo 벡터에 각각 클로닝하여, 야생형 UL128 발현 플라스미드, 야생형 UL130 발현 플라스미드, 야생형 UL131 발현 플라스미드, 야생형 gL 발현 플라스미드, 야생형 gH 발현 플라스미드를 제작했다. 다음에, 분비형 CMV 오량체를 제작하기 위해서, 야생형 gH 발현 플라스미드를 개변했다. 비특허문헌 14를 참고로, gH의 C말단의 위치 716번째 이후의 아미노산을 결손시키고, 그 위치에 LGG 링커와 Histag를 부가하는 개변을 행했다.

발현 및 정제는 GPCMV-gB와 동일한 방법으로 행하여, HCMV 펜타머의 엑토도메인(이하, 「HCMV-Pentamer」라 부른다) 정제품을 얻었다.

GPCMV-gB와 동일하게 성상 해석을 실시한 바, SDS-PAGE에서는 HCMV-Pentamer를 구성하는 각종 구성 성분의 밴드가 각각 확인되었다(도 7). 또, HPLC 겔 여과 분석에 있어서는, 기대된 오량체(펜타머)의 피크가 메인 피크로서 확인되었다(도 8).

＜HCMV/모르모트 면역원성 시험＞

제작한 HCMV-gB 및 HCMV-Pentamer를 이용하여, 모르모트 면역원성 시험을 실시했다. 4주령, 암컷의 Hartley 모르모트에 대해, 각 항원(항HCMV-gB 혈청, 항HCMV-Pentamer 혈청, 또는 HCMV-gB+HCMV-Pentamer 혈청)은 25μg/마리가 되도록, 생리 식염수(오오츠카 제약)로 조제하고, 아쥬반트로서 10v/v%의 Alum(Invivogen) 및 50μg/마리의 CpG ODN1826(eurofins)을 사용했다. 조제한 항원액을 2주 간격으로 3회, Hartley 모르모트(암컷 3마리/군)에 근육내 접종(100μL, 양쪽 뒷다리)하고, 최종 면역의 2주 후에 이소플루란 흡입 마취 하에서의 심장 채혈에 의해 전체 채혈했다. 얻어진 혈액은 응고 촉진제를 넣은 분리관에서 혈청 분리하고, 56℃, 30분간 비동화 처리를 행한 것을 면역 혈청으로 하고, 이들 면역 혈청을 이용하여 결합 항체 유도능 해석(결합 항체가 해석)을 실시했다.

＜HCMV/결합 항체가 해석＞

HCMV-gB 또는 HCMV-Pentamer를 PBS(Wako)로 1μg/mL로 희석하고, MaxiSorp plate(Nunc)에 50μL 넣고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트함으로써 고상화했다. 고상화 후, 플레이트를 PBS로 세정하고, 각 면역 혈청(항HCMV-gB 혈청, 항HCMV-Pentamer 혈청, 또는 HCMV-gB+HCMV-Pentamer 혈청)의 희석액을 플레이트의 웰에 100μL 첨가하여 실온에서 인큐베이트했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, 검출 항체 goatanti-Guinea Pig IgG HRP secondary antibody(ROCKLAND사 Cat.606-103-129)를 플레이트의 웰에 100μL 첨가하여, 실온에서 인큐베이트했다. 1시간 후, PBST로 세정하고, TMB(SIGMA사 Cat.T-4444)를 플레이트의 웰에 100μL 첨가함으로써 발색시켰다. 30분 후, 1N 황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더(몰레큘러 디바이스사)로 발색치(O.D.450nm/650nm)를 측정했다. 측정한 결과를 도 11, 및 도 12에 나타낸다. HCMV-gB+HCMV-Pentamer 면역 혈청은, HCMV-gB 및 HCMV-Pentamer 어느 것에 대해서나 높은 결합 항체가를 나타내고 있었다. 이 점에서, HCMV-gB+HCMV-Pentamer 면역군에서는, 이들 2종의 항원 양쪽 모두에 대한 면역 응답이 유도된 것으로 생각할 수 있다.

＜HCMV 기감염자 PBMC에 대한 IFNγ 유도능의 평가＞

세포성 면역의 평가에는 PBMC(CTL사 Cat.CTL-CP1)를 사용했다. PBMC는, CTL사의 데이터에 의해 HCMV 감염력이 있음이 확인된 21명의 도너 유래 검체를 사용했다.

CTL Anti-Aggregate Wash(20×)(CTL사 Cat.CTL-AA-001)를 37℃로 설정한 워터 배스에서 10분간 데워 완전히 해동하고, 19mL의 RPMI1640 배지(gibco사 Cat.21870-076)에 CTL Anti-Aggregate Wash(20×)를 1mL 첨가하여 CTL Anti-Aggregate Wash(1×)로 했다. 조제한 CTL Anti-Aggregate Wash(1×)는, 사용까지 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 20분 이상 정치하고, 1시간 이내에 사용했다. CTL-Test Medium(CTL사 Cat.CTLT-010)에는 L-Glutamine(100×)(Wako사 Cat.073-05391)을 1%(v/v) 첨가하고, 사용까지 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 20분 이상 정치했다.

PBMC가 들어간 바이알을 37℃로 설정한 워터 배스에서 8분간 데우고, 그 후 바이알을 2회 전도 혼화하여, PBMC를 현탁했다. 바이알 중의 세포 용액을 모두 50mL 튜브에 옮기고, 추가로 CTL Anti-Aggregate Wash(1×) 1mL를 바이알에 넣어, 세포 용액을 완전히 회수했다. 50mL 튜브를 온화하게 돌리면서, CTL Anti-Aggregate Wash(1×) 3mL를 15초에 걸쳐 첨가하고, 추가로 CTL Anti-Aggregate Wash(1×) 5mL를 온화하게 첨가하여 세포 용액으로 했다. 세포 용액을 급속 가속, 급속 감속 설정으로 원심(330×g, 10분, 실온)하고, 원심 후 상청을 제거하여, 탭핑으로 세포를 현탁했다. CTL Anti-Aggregate Wash(1×)를 10mL 첨가하여, 2회 전도 혼화했다. 세포 용액을 급속 가속, 급속 감속 설정으로 원심(330×g, 10분, 실온)하고, 원심 후 상청을 제거하여, 탭핑으로 세포를 현탁했다. 세포를 1×L-Glutamine-CTL-Test Medium으로 3×10⁶세포/mL~5×10⁶세포/mL의 범위 내의 농도로 희석했다.

Human IFN-γ ELISpot^PLUS(MABTECH사 Cat.3420-4HST-2)에 부속된 플레이트를 300μL/웰의 D-PBS(-)(Wako사 Cat.045-29795)로 4회 세정한 후, 1×L-Glutamine-CTL-Test Medium을 300μL/웰 첨가하여, 30분 이상 실온에 정치했다. 플레이트로부터 CTL-Test Medium을 제거하고, 세포 현탁액을 100μL/웰 첨가했다. 추가로 HCMV-gB, HCMV-Pentamer, HCMV-gB 항원과 HCMV-Pentamer 항원의 혼합, Human IFN-γ ELISpot^PLUS에 부속된 양성 대조군(mAB CD3-2)을 1×L-Glutamine-CTL-Test Medium으로 희석한 것, 및 음성 대조군으로서 1×L-Glutamine-CTL-Test Medium을, 각각 100μL/웰 첨가하여 현탁했다. 플레이트를 알루미늄박으로 덮고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 12~24시간 배양했다.

Human IFN-γ ELISpot^PLUS에 부속된 검출 항체(7-B6-1-biotin)를 0.5% FBS(CORNING사 Cat.35-076-CV)-PBS로 1μg/mL로 희석하여, 검출 항체액을 제작했다. 플레이트로부터 배지와 함께 세포를 제거하고, 300μL/웰의 D-PBS(-)로 5회 세정했다. 검출 항체액을 100μL/웰 첨가하여, 실온에서 2시간 정치했다. Human IFN-γ ELISpot^PLUS에 부속된 Streptavidin-HRP를 0.5% FBS-PBS로 1000배로 희석하여, Streptavidin-HRP 용액을 제작했다. 플레이트로부터 검출 항체액을 제거하고, 300μL/웰의 D-PBS(-)로 5회 세정 후, Streptavidin-HRP 용액을 100μL/웰 첨가하여, 실온에서 1시간 정치했다. Human IFN-γ ELISpot^PLUS에 부속된 Ready-to-use TMB를 0.22μm 필터에 통과시켜, Ready-to-use TMB 용액을 제작했다. 플레이트로부터 Streptavidin-HRP 용액을 제거하고, 300μL/웰의 D-PBS(-)로 5회 세정했다. 플레이트에 Ready-to-use TMB 용액을 100μL/웰 첨가하고, 명료한 스폿이 관찰될 때까지 실온에 5~30분의 범위 내에서 정치 후, 300μL/웰의 순수로 3회 세정했다. 플레이트 프레임으로부터 스트립 웰을 떼어내어 플레이트 저면의 PVDF막 측을 순수로 헹구고, 스트립 웰을 하룻밤 건조시켰다. CTL사 ELISPOT 리더로 화상 촬영을 행하고, CTL사 ImmunoSpot S5 verse Analyzer로 스폿 수의 카운트를 행했다. 전체 검체의 음성 대조군(대조) 웰에 있어서의 스폿 수 평균치보다 5배 이상의 스폿 수가 보인 검체를 「항원 자극에 의한 IFNγ 유도 반응 양성」이라고 판정했다. 판정 결과로부터 얻어진 ELISpot 양성률(전체 도너에 있어서의 「항원 자극에 의한 IFNγ 유도 반응 양성」 도너의 비율)을 도 13에 나타낸다.

[결과·고찰]

HCMV-gB 혹은 HCMV-Pentamer로 자극한 경우에 비해, HCMV-gB와 HCMV-Pentamer를 혼합하여 자극한 경우는 보다 많은 도너에서 IFNγ 유도가 보였다. 이점에서, HCMV 기감염자 중에는 HCMV-gB와 HCMV-Pentamer 중, 어느 한쪽의 항원에 대해서는 IFNγ를 유도할 수 없는 집단이 존재하고 있고, 또한 HCMV-gB와 HCMV-Pentamer를 병용하여 백신으로서 투여함으로써, 양쪽 항원 모두에 대한 세포성 면역 유도능도 가지는 집단뿐만 아니라, 어느 한쪽의 항원에 대해서 밖에 세포성 면역을 유도할 수 없는 집단에 대해서도 세포성 면역을 유도할 수 있는 것으로 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> KM Biologics Co., Ltd. <120> A vaccine for preventing or treating transplacental infection of CMV <130> FP19-1095-00 <150> JP2018-230640 <151> 2018-12-10 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 706 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <220> <223> gB1-682-fm3Mv9 <400> 1 Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile 1 5 10 15 Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln 35 40 45 Thr Arg Ser Val Tyr Ser Gln His Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser 50 55 60 His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met 85 90 95 Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr 100 105 110 Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val 115 120 125 Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln 130 135 140 Lys Val Leu Thr Phe Arg 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Sequence <220> <223> GPCMV GP83 Forward Primer <400> 17 cgacgacgac gatgacgaaa ac 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPCMV GP83 Reverse Primer <400> 18 tcctcggtct caacgaaggg tc 22 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPCMV GP83 FAM Probe <400> 19 atccgagtta ggcagcg 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guinea pigs B-actin Forward Primer <400> 20 tggatcggcg gctcatc 17 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guinea pigs B-actin Reverse Primer <400> 21 catcgtactc ctgcttgctg at 22 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guinea pigs B-actin Prober <400> 22 cactctccac cttcc 15

Claims

인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원과, HCMV의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는 펜타머 항원을 포함하는, HCMV의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신.
청구항 1에 있어서,
gB 단백질 항원이 HCMV gB 단백질의 엑토도메인(ectodomain)인, 백신.
청구항 2에 있어서,
gB 단백질 항원이 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 gB 단백질의 엑토도메인인, 백신.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
펜타머 항원이, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 펜타머 단백질의 엑토도메인인, 백신.
인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 엔벨로프 당단백질 B(gB 단백질) 항원을 포함하는 백신과,
HCMV의 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로 이루어지는 펜타머 항원을 포함하는 백신
을 포함하는, HCMV의 선천성 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신 키트.
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