CN113164585A - 用于预防或治疗巨细胞病毒的先天性感染的疫苗 - Google Patents

用于预防或治疗巨细胞病毒的先天性感染的疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于，提供能够预防和治疗CMV的先天性感染的有效的疫苗。本发明的用于预防或治疗巨细胞病毒(CMV)的先天性感染的疫苗包含CMV的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原和五聚体(Pentamer)抗原。

Description

用于预防或治疗巨细胞病毒的先天性感染的疫苗
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗巨细胞病毒的先天性感染的疫苗。
背景技术
巨细胞病毒(CMV)感染症主要有两种。第1种是在孕妇初次感染时胎儿发病的先天性CMV感染症，第2种是在移植、AIDS、先天性免疫缺陷病等处于免疫抑制状态的患者中发病的CMV肺炎、肠炎、视网膜炎等器官损伤。其中，先天性CMV感染症是TORCH综合征之一，是引起胎儿畸形或严重的临床症状的重要的先天性感染症。孕妇在首次感染CMV时，约40％通过胎盘而出现胎儿的先天性感染(本说明书中，以相同含义使用“先天性感染”这一术语和“经胎盘感染”这一术语)。另外，也有报道称死产中约15％是由先天性CMV感染所致。每年先天性感染儿童人数在日本为3000人以上，在美国为约4万人，据称有症状者在日本有约1000人、在美国有约8000人，其中约90％有中枢神经系统疾病、听力损伤等后遗症。
日本的CMV抗体携带率高于欧美各国，日本成年人的80％～90％为CMV抗体阳性，几乎所有人在婴幼儿期被感染。然而，作为最近的趋势，显示出年轻人的CMV抗体携带率从90％左右降低至60％左右，先天性CMV感染症的预防对策的必要性进一步增高(非专利文献1)。
美国医学研究所(the Institute of Medicine)认为：在发达国家，先天性CMV感染症作为先天性的中枢神经系统疾病的原因影响已超过唐氏综合症，若以影响到有后遗症的先天性感染儿童的人生的QOL降低和社会经济损失作为质量调整寿命年(QALYs：quality-adjusted life years)进行计算，据分析认为CMV疫苗属于医疗经济效应最高的一类(非专利文献2)。
引起感染症的病原体大致分为：通过传统型疫苗能够获得足够的效果的I类病原体、以及通过传统型疫苗或病原体感染经历无法获得足够的免疫防御的II类病原体，CMV属于后者。作为难以克服II类病原体的理由，已经指出了它们所具有的独特的免疫逃逸机制。人类已经开发出许多针对I类病原体有效的疫苗，并战胜了由它们所引起的感染症的威胁。此外，未来疫苗开发的重点正向II类病原体转移。
为了将先天性CMV感染症所造成的损害减小到最小限度，也进行了通过孕妇筛查来鉴定未感染孕妇、提高日常生活上的防护，但这还不够。进而还有对初次感染孕妇进行鉴定并通过向孕妇给予CMV抗体高效价免疫球蛋白而有效预防胎儿的感染、减轻重症化的报道，但目前对有效性存在质疑(非专利文献3)。另一方面，也有作为低分子药的更昔洛韦(ganciclovir)在市场上销售，但其效果有限，也存在副作用的问题。目前尚不存在CMV疫苗，而且如上所述也没有充分有效的治疗方法，因此其需求很高。
关于CMV疫苗开发，一直以来多家制药企业、学术界也尝试使用了减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等的研究，但任意情况的T细胞免疫、B细胞免疫的应答均不充分，结果无法获得作为疫苗而耐受实际使用的效果。
其中，Sanofi公司的疫苗是以CMV糖蛋白的gB作为抗原的亚单位疫苗，在以未感染成年女性为对象的临床试验中显示出约50％左右的感染预防效果。由于效果是有限的，因此开发实际上被中断，但得到了“单独gB抗原可以显示出一定的效果(但不充分)”这一有意义的见解(非专利文献4)。
对于候补CMV疫苗的效果的实验性证明，需要考虑CMV的种属特异性。CMV具有种属特异性，因此使用了人巨细胞病毒(HCMV)的动物实验基本上是不可能的。虽使用小鼠、大鼠、豚鼠、猴子等进行了动物实验，但是使用各种动物种属特异性的CMV而实施了动物实验。对于经胎盘感染，仅豚鼠为通过使母体感染病毒、在不进行特殊处理的情况下也能够确认胎儿感染的动物模型系统，广泛利用了豚鼠的经胎盘感染试验系统(非专利文献5)。
关于gB疫苗对经胎盘感染的效果，报道了：通过向雌豚鼠给予重组GPCMV的gB蛋白+佐剂而抑制了雌豚鼠的初次感染，另外，胎儿的经胎盘感染也得到抑制(非专利文献6)。
非专利文献7中示出了：使用整合了GPCMV的gB蛋白的腺病毒载体疫苗，在豚鼠的经胎盘感染模型中，gB抑制了胚胎的经胎盘感染。
另一方面，作为CMV的主要抗原，近年来受到广泛关注的是五聚体(Pentamer)抗原。五聚体是CMV的细胞趋向性决定因子，人CMV是由gH、gL、UL128、UL130和UL131(gH/gL/UL128/UL130/UL131)这5个亚单位构成的分子。
关于五聚体在经胎盘感染中所起的作用，报道了：缺失了五聚体基因的GPCMV已失去对上皮·内皮细胞的感染性和经胎盘感染能力，通过异位表达所缺失的基因而使这些能力恢复(非专利文献8)。
另外，关于五聚体疫苗的效果，报道了：对向小鼠给予表达五聚体的载体疫苗MVA-PC而诱导的单克隆抗体进行了详细地解析，结果与抗gH抗体相比，抗五聚体抗体在上皮和内皮细胞系中的中和能力明显高，被认为在经胎盘感染中重要的细胞滋养层中的中和能力也是同样的(非专利文献9)。
另一方面，也有相反的报告。非专利文献10中指出：人胎盘中的滋养层祖细胞是CMV的靶标，在CMV感染该细胞时，五聚体的贡献几乎观察不到，而gB的贡献则明确观察到。
另外，非专利文献11中指出：使用离体的胎盘感染试验系统，在GPCMV感染胎盘组织和增殖中五聚体的贡献几乎观察不到。
如此，尽管有零散报道表明五聚体作为疫苗抗原是有用的，但五聚体在经胎盘感染中的作用尚不清楚，现状是关于五聚体疫苗对经胎盘感染的抑制效果这一点仍未定论。
对于五聚体和gB的组合使用的效果，专利文献1中报道了在以猴子为对象的感染防御试验中五聚体和gB的组合使用是有效的，但对于经胎盘感染的影响没有给出任何启示。另外，虽然显示出五聚体+gB的组合使用组优于五聚体单独组和非免疫组，但由于未设定gB单独组，因此无法准确显示出组合使用的效果。
另外，非专利文献12中，在体外对抗gB单克隆抗体和抗五聚体单克隆抗体的组合使用效果进行验证，尽管认为在中和能力和抑制耐药菌株出现方面组合使用具有优点，但尚未证实组合使用对生物体中的感染防御能力的效果。
进而，专利文献2中给出了用gB+五聚体的2价疫苗进行免疫、从而可以使某些细胞因子的产生高于单独组的数据，但组合使用组在中和能力方面并无优势，而且也没有进行感染实验。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2017153954号
专利文献2：日本特表2017-515503号公报
专利文献3：国际公开第2003004647号
非专利文献
非专利文献1:Azuma H et al.,“Cytomegalovirus seropositivity inpregnant women in Japan during 1996-2009”J Jpn Soc Perin Neon Med 46(2010)1273-1279
非专利文献2:Kathleen R.Stratton et al.,“Vaccines for the 21stcentury:a Tool for Decisionmaking”The National Academies Press,2000
非专利文献3:Revello MG et al.,“Randomized trial of hyperimmuneglobulin to prevent congenital cytomegalovirus”N Engl J Med 370(2014)1316-1326
非专利文献4:Rieder F et al.,“Cytomegalovirus vaccine:phase IIclinical trial results”Clin Microbiol Infect 20Suppl 5(2014)95-102
非专利文献5:Yamada S et al.,“Characterization of the guinea pigcytomegalovirus genome locus that encodes homologs of human cytomegalovirusmajor immediate-early genes,UL128,and UL130”Virology 391(2009)99-106
非专利文献6:Schleiss MR et al.,“Glycoprotein B(gB)vaccines adjuvantedwith AS01 or AS02 protect female guinea pigs against cytomegalovirus(CMV)viremia and offspring mortality in a CMV-challenge model”Vaccine 32(2014)2756-2762
非专利文献7:Hashimoto K et al.,“Effects of immunization of pregnantguinea pigs with guinea pig cytomegalovirus glycoprotein B on viral spread inthe placenta”Vaccine 31(2013)3199-3205
非专利文献8:Coleman S et al.,“A Homolog Pentameric Complex DictatesViral Epithelial Tropism,Pathogenicity and Congenital Infection Rate inGuinea Pig Cytomegalovirus”PLoS Pathog 12(2016)e1005755
非专利文献9:Flavia Chiuppesi et al.,“Vaccine-Derived NeutralizingAntibodies to the Human Cytomegalovirus gH/gL Pentamer Potently Block PrimaryCytotrophoblast Infection”J Virol 89(2015)11884-11898
非专利文献10:Martin Zydek et al.,“HCMV Infection of Human TrophoblastProgenitor Cells of the Placenta Is Neutralized by a Human MonoclonalAntibody to Glycoprotein B and Not by Antibodies to the Pentamer Complex”Viruses 6(2014)1346-1364
非专利文献11:Yamada S et al.,“An Ex vivo culture model for placentalcytomegalovirus infection using slices of Guinea pig placental tissue”Placenta 37(2016)85-88
非专利文献12:Patel HD et al.,“In Vitro Characterization of HumanCytomegalovirus-Targeting Therapeutic Monoclonal Antibodies LJP538 andLJP539”Antimicrob Agents Chemother 60(2016)4961-4971
非专利文献13:Burke HG et al.,“Crystal Structure of the HumanCytomegalovirus Glycoprotein B”PLoS Pathog 11(2015)e1005227
非专利文献14:Ciferri C et al.,“Structural and biochemical studies ofHCM VgH/gL/gO and Pentamer reveal mutually exclusive cell entry complexes”Proc Natl Acad Sci USA 112(2015)1767-1772
非专利文献15:Kanai K et al.,“Re-evaluation of the genome sequence ofguinea pig cytomegalovirus”J Gen Virol 92(Pt 5)(2011)1005-1020
非专利文献16:Yamada S et al.,“Guinea pig cytomegalovirus GP129/131/133,homologues of human cytomegalovirus UL128/130/131A,are necessary forinfection of monocytes and macrophages”J Gen Virol 95(Pt 6)(2014)1376-1382
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，对于预防CMV感染而言，不存在尤其能够抑制CMV的先天性感染的有效的CMV疫苗。因此，本发明的目的在于，提供能够预防和治疗CMV的先天性感染的有效的疫苗。
用于解决问题的方案
本发明人等发现：通过组合使用作为CMV的主要抗原的gB与五聚体并制成2价疫苗，从而能够强烈抑制豚鼠的先天性CMV感染，以至完成了本发明。
即，本发明涉及以下的各发明。
[1]一种用于预防或治疗CMV的先天性感染的疫苗，其包含巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原和五聚体抗原。
[2]根据[1]的疫苗，其中，gB蛋白抗原为CMV gB蛋白的胞外域。
[3]根据[2]的疫苗，其中，gB蛋白抗原为具有序列号1中记载的氨基酸序列的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。
[4]根据[1]～[3]中的任一疫苗，其中，五聚体抗原由人巨细胞病毒(HCMV)的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成。
[5]根据[4]的疫苗，其中，五聚体抗原为具有序列号2、序列号3、序列号4、序列号5和序列号6中记载的氨基酸序列的人巨细胞病毒(HCMV)的五聚体蛋白的胞外域。
[6]一种用于预防或治疗HCMV的先天性感染的疫苗试剂盒，其包含如下疫苗：
包含人巨细胞病毒(HCMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原的疫苗、及
包含由HCMV的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体抗原的疫苗。
[7]HCMV的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原以及由HCMV的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体抗原在制造用于预防或治疗人巨细胞病毒(HCMV)的先天性感染的疫苗或疫苗试剂盒中的应用。
发明的效果
根据本发明，在CMV的先天性感染防御中，通过组合使用gB蛋白抗原和五聚体抗原，从而可以提供具有超过各自单独给予所带来的效果的感染抑制效果的疫苗。由此，可以期待CMV疫苗的实用化。
附图说明
图1是示出通过SDS-PAGE进行的GPCMV-gB的性状解析的结果的图。
图2是示出通过HPLC凝胶过滤分析进行的GPCMV-gB的性状解析的结果的图。
图3是示出通过SDS-PAGE进行的GPCMV-五聚体的性状解析的结果的图。
图4是示出通过HPLC凝胶过滤分析进行的GPCMV-五聚体的性状解析的结果的图。
图5是示出通过SDS-PAGE进行的HCMV-gB的性状解析的结果的图。
图6是示出通过HPLC凝胶过滤分析进行的HCMV-gB的性状解析的结果的图。
图7是示出通过SDS-PAGE进行的HCMV-五聚体的性状解析的结果的图。
图8是示出通过HPLC凝胶过滤分析进行的HCMV-五聚体的性状解析的结果的图。
图9是示出对GPCMV-gB、GPCMV-五聚体或GPCMV-gB和GPCMV-五聚体2价的免疫血清中所含的GPCMV-gB结合抗体效价进行评价的结果的图。
图10是示出对GPCMV-gB、GPCMV-五聚体或GPCMV-gB和GPCMV-五聚体2价的免疫血清中所含的GPCMV-五聚体结合抗体效价进行评价的结果的图。
图11是示出对HCMV-gB、HCMV-五聚体或HCMV-gB和HCMV-五聚体2价的免疫血清中所含的HCMV-gB结合抗体效价进行评价的结果的图。
图12是示出对HCMV-gB、HCMV-五聚体或HCMV-gB和HCMV-五聚体2价的免疫血清中所含的HCMV-五聚体结合抗体效价进行评价的结果的图。
图13是示出：使用HCMV既往感染者PBMC，用HCMV-gB、HCMV-五聚体或HCMV-gB和HCMV-五聚体的2价进行刺激时的产生IFNγ供体的比例的图。
具体实施方式
本发明的疫苗的一实施方式为用于预防或治疗CMV的先天性感染的疫苗，其包含巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原和五聚体抗原。即，本实施方式的疫苗是包含2种抗原蛋白的2价疫苗。
巨细胞病毒(CMV)包括任意的CMV株，例如可列举出人巨细胞病毒(HCMV)、豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)、小鼠巨细胞病毒(MCMV)、大鼠巨细胞病毒(RCMV)和罗猴巨细胞病毒(RhCMV)等。
CMV的gB蛋白可以是野生型CMV gB蛋白，也可以是改变型CMV gB蛋白。
野生型CMV gB蛋白是指源自任意的CMV株的gB蛋白，例如可列举出具有序列号7中记载的氨基酸序列的源自HCMV AD169株的gB蛋白(GenBank的注册号：GenBank ACCESSIONNo.:X17403.1)、具有序列号8中记载的氨基酸序列的源自GPCMV 22122株的gB蛋白(GenBank的注册号：AB592928.1)等。
作为改变型CMV gB蛋白，例如可列举出具有用于防止形成聚集体的改变的变体、具有用于改善抗体诱导能力或中和抗体诱导能力的改变的变体等。“中和抗体诱导能力”是指能够诱导针对抗原蛋白的中和抗体的能力，可以通过将抗原蛋白接种于待检动物中而得到的免疫血清中的中和抗体效价(neutralizing antibody titer)进行评价。“中和抗体”是指能使病毒颗粒的感染性消失的抗体，例如可以通过使待检病毒的蚀斑数量减少50％所需的抗体的浓度(NT50)来评价该抗体的中和活性的高低。
改变型CMV gB蛋白是指：相对于野生型CMV gB蛋白，至少一个氨基酸残基或连续的氨基酸残基区域发生了置换、缺损(缺失)或添加而成的蛋白质，还包括通过氨基酸残基的置换或缺损而导入了糖链的蛋白质等发生了野生型中不存在的蛋白质修饰的蛋白质。
CMV的gB蛋白抗原可以是gB蛋白的全长，也可以是gB蛋白的一部分片段。作为片段，例如可列举出CMV的gB蛋白的胞外域或胞外域的一部分区域。作为gB蛋白的全长，例如可列举出具有序列号7中记载的氨基酸序列的HCMV gB蛋白(GenBank的注册号：GenBankACCESSION No.:X17403.1)。其中，序列号7中记载的氨基酸序列中，第1位至第24位的氨基酸序列为前导序列。作为胞外域，例如可列举出具有序列号7中记载的氨基酸序列中的第25位至第706位的氨基酸序列的HCMV gB蛋白的片段。
另外，这些gB蛋白抗原也可以是通过氨基酸置换等而改善了性状者。例如可列举出：以具有序列号7中记载的氨基酸序列中的第1位至第706位的氨基酸序列的HCMV gB蛋白的胞外域为基础，参考非专利文献13将第156位的氨基酸残基置换为组氨酸残基(His)、将第157位的氨基酸残基置换为精氨酸残基(Arg)、将第239位的氨基酸残基置换为谷氨酸残基(Glu)、将第240位的氨基酸残基置换为丙氨酸残基(Ala)、将第456位的氨基酸残基置换为苏氨酸残基(Thr)、将第458位的氨基酸残基置换为谷氨酰胺残基(Gln)的HCMV gB蛋白胞外域变体(序列号1)。
CMV的gB蛋白抗原可以使用CMV通过蛋白质纯化而制作，也可以通过基因工程的方法而制作。制作方法没有特别限定，例如可以通过如下方式得到：将野生型gB蛋白的cDNA作为模板，设计引物，通过PCR得到核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也与标签连接，导入至适合的表达载体中，进行表达，从而得到。制作的CMV gB蛋白抗原可以根据需要进行纯化。纯化方法没有特别限定，可列举出利用亲和色谱柱等的纯化。
在改变型gB蛋白抗原为通过突变导入而得的变体的情况下，可以通过如下方式得到：设计用于导入目标突变的引物，通过PCR得到导入了突变的核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也与标签连接，导入至适合的表达载体中，进行表达，从而得到。
另外，在改变型gB蛋白抗原为通过糖链导入(糖链修饰)而得的变体的情况下，为通常的方法即可，没有特别限定，例如，导入N型糖链时，以野生型gB蛋白的cDNA作为模板，以使要导入N型糖链的目标位点的3个连续的氨基酸序列为N-X-S/T(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)的方式设计引物，通过PCR导入突变。将目标改变型gB蛋白的核酸序列、另外必要时将连接有6×His等标签的核酸序列克隆至适合的载体上，进行表达，从而能够得到改变型CMV gB蛋白。然后，利用通常的方法将N型糖链添加至gB变体的目标位点的天冬酰胺。
CMV的五聚体也称为五聚体复合体或简称为五聚体。可以是野生型CMV五聚体，也可以是改变型CMV五聚体。
野生型CMV五聚体是指源自任意的CMV株的五聚体，例如可列举出：由人巨细胞病毒(HCMV)的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体；由豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)的GP75(gH)、GP115(gL)、GP129(UL128)、GP131(UL130)和GP133(UL131)组成的五聚体等。
HCMV五聚体例如可列举出具有序列号2(gH)、序列号3(gL)、序列号4(UL128)、序列号5(UL130)和序列号6(UL131)中记载的氨基酸序列的源自HCMV Merlin株的五聚体蛋白(GenBank的注册号：GenBank ACCESSION No.:AY446894.2)(其中，UL128的碱基序列中包含突变，因此以其它CMV株的序列信息为基础进行了修正)等。
GPCMV五聚体例如可列举出：具有序列号10(GP75)、序列号11(GP115)、序列号12(GP129)、序列号13(GP131)和序列号14(GP133)中记载的氨基酸序列的源自GPCMV 22122株的五聚体蛋白(GenBank的注册号：GenBank ACCESSION No.:AB592928.1)(其中，GP133的碱基序列中包含突变，因此以其它CMV株的序列信息为基础进行了修正)等。
作为改变型CMV五聚体，例如可列举出具有用于防止形成聚集体的改变的变体、具有用于改善抗体诱导能力或中和抗体诱导能力的改变的变体等。改变型CMV五聚体是指：构成野生型CMV五聚体的5个蛋白质中至少1个为改变蛋白的五聚体，是指：相对于构成野生型CMV五聚体的蛋白质，至少一个氨基酸残基或连续的氨基酸残基区域发生了置换、缺损(缺失)或添加而成的蛋白质，还包括通过氨基酸残基的置换或缺损而导入了糖链的蛋白质等发生了野生型中不存在的蛋白质修饰的蛋白质。
CMV五聚体抗原可以使用CMV通过蛋白质纯化而制作，也可以通过基因工程的方法而制作。制作方法没有特别限定，例如可以通过如下方式得到：将构成野生型CMV五聚体的5个蛋白质的cDNA作为模板，设计引物，通过PCR得到核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也与标签连接，导入至适合的表达载体中，进行表达，使其折叠，形成五聚体结构，从而得到。CMV五聚体抗原也可以根据需要表达为分泌型蛋白。例如，通过将gH表达为胞外域(序列号2)的片段而不是全长(序列号9)，从而能够表达为分泌型蛋白。制作的CMV五聚体抗原可以根据需要进行纯化。纯化方法没有特别限定，可列举出利用亲和色谱柱等的纯化。
改变型CMV五聚体抗原为通过突变导入而得的变体、或通过糖链导入(糖链修饰)而得的变体时，可以如上所述地进行制作。
本实施方式的疫苗例如可以以1：10～10：1的质量比含有CMV的gB蛋白抗原和CMV五聚体抗原，优选以等质量含有。对于疫苗中的蛋白质抗原的含量，只要CMV的gB蛋白抗原和CMV五聚体抗原分别为0.1～1000μg即可，优选为1～100μg。
本实施方式的疫苗的剂型例如可以是液态、粉末状(冷冻干燥粉末、干燥粉末)、胶囊状、片剂、冷冻状态。
本实施方式的CMV疫苗可以包含对于药物而言可接受的载体。作为上述载体，可以没有限制地使用在疫苗制造中通常使用的载体，具体而言，可列举出盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合。疫苗可以进一步适宜配混乳化剂、保存剂(例如，硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂、灭活剂(例如，福尔马林)等。
为了进一步提高本实施方式的疫苗的免疫原性，也可以进一步包含佐剂。作为佐剂，例如可列举出铝佐剂或包含角鲨烯的水包油型乳浊佐剂(AS03、MF59等)、CpG和3-O-脱酰化-4’-单磷酰基脂A(MPL)等Toll样受体的配体、皂苷系佐剂、聚γ-谷氨酸等聚合物系佐剂、壳聚糖和菊糖等多糖类。
本实施方式的疫苗可以通过将CMV gB蛋白抗原和CMV五聚体抗原和根据需要的载体、佐剂等混合而得到。佐剂也可以在使用时进行混合。
本实施方式的疫苗的给药途径例如可以是经皮给予、舌下给予、滴眼给予、皮内给予、肌肉给予、经口给予、经肠给予、经鼻给予、静脉内给予、皮下给予、腹腔内给予、从口至肺的吸入给予。
本实施方式的疫苗的给予方法可以是例如通过注射器、经皮的贴片、微针、能移植的缓释性装置、带有微针的注射器、无针装置、喷雾进行给予的方法。
根据本实施方式的疫苗，能够预防或治疗CMV的经胎盘感染。经胎盘感染的预防是：通过对母体给予疫苗从而抑制CMV向胎儿的垂直感染；或者是抑制由于先天性感染而产生的各种症状的表现。这些可以通过使用了胎儿的羊水、新生儿的体液的基于核酸扩增法的检测、新生儿的头部超声波检测、头部CT检测、头部MRI检测、或听觉筛查等来进行评价。经胎盘感染的治疗是：通过对先天性感染儿给予疫苗，从而抑制由于先天性感染而产生的各种症状的表现、发展。这些可以通过先天性感染儿的听力检查、视力检查、其它身体检查、精神发育检查等来进行评价。本实施方式的疫苗优选以育龄女性或女童为对象进行给予。从群体免疫的观点出发，也考虑以男性、男童、老年人为对象。另外，给药次数为1次至3次，其中，希望隔开2个月至几年的间隔进行多次接种。也可以测定血液中的抗体效价并将抗体为阴性或者抗体效价低的人作为接种对象。
本发明的疫苗试剂盒是用于预防或治疗HCMV的经胎盘感染的疫苗试剂盒，其包含如下疫苗：包含HCMV gB蛋白抗原的疫苗及包含由HCMV的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体抗原的疫苗。即，是包含含有HCMV gB蛋白抗原的1价疫苗及含有HCMV五聚体抗原的1价疫苗这2种疫苗的疫苗试剂盒。
2种疫苗可以混合后给予，也可以分别进行给予。分别进行给予的情况下，不限定顺序而依次给予即可，例如，在第1种给予后15分钟以内给予第2种。
实施例
[材料/方法]
<GPCMV-gB的制备和性状解析>
为了使用豚鼠经胎盘感染模型系统进行评价，使用对豚鼠显示出感染性的豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)。由于重组GPCMV gB蛋白有时包含聚集体，因此制作了不包含聚集体的、性状得到改善的改变GPCMV gB蛋白。
人工合成了编码在源自GPCMV 22122株的gB的胞外域(1-656aa)添加了前导序列、且导入了氨基酸突变以改善性状的gB(序列号15)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo(专利文献3)中。设计成在gB的C末端添加有His-tag。表达时使用Expi293表达系统(LifeTechnologies Ltd.)。将表达质粒转染至细胞，回收了培养4～6天的上清液。从包含GPCMVgB的培养上清液中，使用Ni NTA Agarose(QIAGEN公司)进行纯化，对PBS+0.5M精氨酸进行透析，得到改变GPCMV gB蛋白的胞外域(以下称为“GPCMV-gB”)的纯化品。
对于GPCMV-gB的纯化品，如下所述实施了性状解析。分别将进行了基于二硫苏糖醇(DTT)的还原处理的待检体(DTT(+))和未进行的待检体(DTT(-))在8～16％SDS-PAGE梯度凝胶上电泳，用Bullet CBB Stain One(nacalai tesque公司)进行染色。将该结果示于图1。图1中的泳道1、2分别是标记物(Bench Mark Prestained Invitogen10748-010)、以及纯化的GPCMV-gB 2μg/泳道，确认泳道2中GPCMV-gB的条带为主条带。另外，使用Superdex200 Increase 5/150GL(GE Healthcare公司)，使用PBS作为流动相，以流速0.4mL/分钟进行HPLC凝胶过滤分析，结果确认所期待的三聚物的峰几乎为单峰(图2)。
<GPCMV-五聚体的制备和性状解析>
接着，制备了源自GPCMV 22122株的五聚体的胞外域。不存在关于GPCMV五聚体的胞外域的可溶性表达的报告例，因此参考HCMV五聚体的胞外域的可溶性表达的报告例(非专利文献14)，如下所述进行设计，构建了表达质粒。
人工合成编码gH的胞外域(1-698aa、序列号16)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。设计成在gH的C末端添加有His-tag。进而，分别人工合成编码作为HCMV的gL的直系同源物的GP115(1-258aa、序列号11)的基因、编码作为HCMV的UL128的直系同源物的GP129(1-179aa、序列号12)的基因、编码作为HCMV的UL130的直系同源物的GP131(1-192aa、序列号13)的基因、编码作为HCMV的UL131的直系同源物的GP133(1-127aa、序列号14)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。利用与GPCMV-gB同样的方法进行表达和纯化，得到GPCMV五聚体的胞外域(以下称为“GPCMV-五聚体”)纯化品。
与GPCMV-gB同样地实施了性状解析，结果通过SDS-PAGE分别确认到构成GPCMV-五聚体的各种构成成分的条带(图3)。另外，在HPLC凝胶过滤分析中，作为主峰，确认到所期待的五聚体(Pentamer)的峰(图4)。
<GPCMV/豚鼠免疫原性试验>
使用制作的GPCMV-gB和GPCMV-五聚体，实施了豚鼠免疫原性试验。针对4周龄、雌性Hartley豚鼠，以25μg/只的方式用生理盐水(大冢制药)制备各抗原(GPCMV-gB、GPCMV-五聚体或GPCMV-gB+GPCMV-五聚体)，作为佐剂使用10v/v％的Alum(Invivogen)和50μg/只的CpG ODN1826(Invivogen)。对Hartley豚鼠(雌性，3只/组)以2周间隔3次肌肉接种(100μL、后肢和两足)制备的抗原液，在末次免疫2周后，在异氟醚吸入麻醉下通过心脏采血而采集全血。将得到的血液在加入了凝固促进剂的分离管中进行血清分离，进行56℃、30分钟灭活处理，作为免疫血清，使用这些免疫血清实施了中和抗体诱导能力解析(中和抗体效价解析)和结合抗体诱导能力解析(结合抗体效价解析)。
<用于中和抗体效价解析的豚鼠的细胞和GPCMV>
病毒的培养和成纤维细胞系的中和抗体效价解析使用从ATCC购入的GPL细胞(CCL158)。细胞培养用培养基是在F12(×1)营养培养基(+)L-谷氨酰胺培养基(Gibco，Cat.No.11765-054)中添加10％FBS(Hyclone)、100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉菌(Gibco，Cat.No.15140-122)而制备，用于细胞的扩增、维持、解析，均在37℃、5％的CO2浓度的条件下进行培养。
如下进行了中和抗体效价解析中使用的豚鼠源巨噬细胞的制备。回收脾细胞，进行离心并收集细胞，悬浮于10～20mL的1×RBC(将NH4Cl 8.26g，NaHCO3 1.19g，EDTA·Na20.378g溶解于灭菌水100mL中，将pH调节至7.3，过滤灭菌后进行冷藏保存，在使用时用灭菌水稀释10倍)中使红细胞溶血。离心后，重复多次将细胞悬浮于1×PBS中进行离心的操作，将得到的细胞作为单核细胞，加入包含10％DMSO和50％FBS的培养基在-80℃保存，或者原样状态下分化为巨噬细胞而使用。对于中和抗体效价解析中使用的豚鼠源巨噬细胞，在100nM TPA存在下将单核细胞以1.5～2.5×105个/孔/96孔板培养2天，去除上清液后，将附着于孔板上的细胞用作巨噬细胞。
按照如下步骤制作了中和抗体效价解析中使用的病毒。首先，将从购自ATCC的GPCMV 22122株(VR-682)感染细胞中提取的DNA作为模板进行PCR扩增，将由此得到的GPCMV基因组的碱基序列(非专利文献15)的2642-4247区域和13030-14482区域克隆到pBluescript II KS(+)中。接着，对于该质粒，将8.6kb的F质粒复制子(BAC)和GFP表达盒克隆到GPCMV碱基序列3992与3993之间。将得到的质粒与GPCMV 22122株基因组DNA一起导入到GPL细胞中，将出现的表达GFP的病毒传代5次，然后利用希尔特(Hirt)法从该感染细胞中回收环状DNA，利用电穿孔法导入至大肠杆菌DH10B中，得到pBAC-GPCMVΔ9K。该将BAC DNA导入GPL细胞中，由此制作了表达GFP且克隆化的GPCMV-BACΔ9K(非专利文献16)。
如下制备了中和抗体效价解析用的纯化病毒库。在密度为70～80％左右的GPL细胞中加入十分之一量的GPCMV-BACΔ9K感染GPL细胞，进行数天培养直至60～70％的细胞由于细胞病变作用而剥离，然后回收培养液，在室温下进行10分钟1700×g的离心分离，回收其上清液，在先加入了5mL的含20％蔗糖的PBS的超离心用30mL离心管中，缓慢地进行叠加使其不与蔗糖层混合，以70000×g进行2小时超离心(转子：日立工机P32ST)。去除上清液，将颗粒悬浮于上层的上清液的50～100分之1量的PBS中，然后进行分注，作为中和抗体效价解析用的纯化病毒库保存在-80℃，在使用时将各分注用光。
如下确定了中和抗体效价解析用的纯化病毒库的病毒效价。将保存在-80℃的纯化病毒的分注融化，用PBS制作稀释系列后，使其感染播种于24孔板且达到80～90％的GPL细胞，培养1～2天。在荧光倒置显微镜下对表达GFP的GPCMV的斑点进行计数。需要说明的是，预先确认了该基于GFP表达的效价确定法与使用针对GPCMV的单克隆抗体的免疫染色法得到的结果相同。
<GPCMV/成纤维细胞中和抗体效价解析>
使用了GPL细胞的中和抗体效价解析使用斑点数减少活性(Focus reduction活性)来进行。解析使用将在96孔板(Corning 3596)中以2×104个细胞/孔播种的GPL细胞培养一夜的孔板。使用培养基将各免疫血清(抗GPCMV-gB血清、抗GPCMV-五聚体血清、或GPCMV-gB+GPCMV-五聚体血清)进行系列稀释而制成规定的浓度，使加入约135PFU的GPCMV-BACΔ9K株并制成50μL的混合液在37℃下反应30分钟。作为阴性对照，同样地使代替血清而加入了培养基的反应液进行反应。以20μL/孔接种于解析孔板的细胞中，然后在37℃下培养2小时，吸附于细胞上。去除反应液，加入培养基并培养2天。使用荧光显微镜对表达GFP的斑点数进行计数，以不含抗体的反应液的结果作为基准，由利用各免疫血清得到的细胞数的比例的抑制率判定中和抗体效价。将结果示于表1。
<GPCMV/巨噬细胞中和抗体效价解析试验＞
使用了巨噬细胞的中和抗体效价解析使用感染细胞数减少活性来进行。解析时，使用利用上述方法在96孔板(Corning 3596)中由单核细胞分化的巨噬细胞。使用培养基将各免疫血清系列稀释而制成规定的浓度，将加入约1350PFU的GPCMV-BACΔ9K株并制成50μL的混合液在37℃下反应30分钟。作为阴性对照，同样地使代替血清而加入了培养基的反应液进行反应。以20μL/孔接种于解析孔板的细胞中，然后在37℃下培养2小时，吸附于巨噬细胞上。去除反应液，加入培养基并培养2天。使用荧光显微镜对表达GFP的巨噬细胞进行计数，以不含抗体的反应液的结果作为基准，由利用各免疫血清得到的细胞数的比例的抑制率判定中和能力。将结果示于表1。
[表1]
表1 50％抑制所需的血清稀释倍率
Figure BDA0003103949140000171
<GPCMV/结合抗体效价解析>
用PBS(Wako)将GPCMV-gB或GPCMV-五聚体稀释至1μg/mL，在MaxiSorp plate(Nunc)中加入50μL，在4℃下孵育过夜，由此进行固相化。固相化后，用PBS清洗孔板，将100μL各免疫血清(抗GPCMV-gB血清、抗GPCMV-五聚体血清、或GPCMV-gB+GPCMV-五聚体血清)的稀释液加入孔板的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST进行清洗，将100μL的检测抗体山羊抗豚鼠IgG HRP二抗(ROCKLAND公司Cat.606-103-129)加入孔板的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST进行清洗，将100μL TMB(SIGMA公司Cat.T-4444)加入孔板的孔中，由此使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(Molecular Devices,LLC.)测定了显色值(O.D.450nm/650nm)。将测定的结果示于图9和图10。GPCMV-gB+GPCMV-五聚体免疫血清对GPCMV-gB和GPCMV-五聚体均显示出高结合抗体效价。由该结果认为，在GPCMV-gB+GPCMV-五聚体免疫组中，诱导了针对这2种抗原的免疫应答。
<豚鼠经胎盘感染试验>
利用以下的方法研究了各种抗原对豚鼠的经胎盘感染的防御能力。首先，对非妊娠雌豚鼠(Hartley、4周龄)免疫上述得到的GPCMV-gB和GPCMV-五聚体。
作为组的构成，设为GPCMV-gB组、GPCMV-五聚体组、GPCMV-gB+GPCMV-五聚体组合使用组、和作为对照组的生理盐水组这4组的构成(各组40只)。各抗原为25μg/只，佐剂使用Alum+CpG。以2周的间隔进行共计3次的肌肉给药，自第3次给药起2周后回收抗血清，针对各组，合并了40只量的抗血清。从合并的抗血清中，利用蛋白A柱色谱法进行抗体级分的纯化。将洗脱后相对于PBS进行透析而得者作为抗体级分。
<豚鼠IgG的定量>
为了确定抗体级分的给药量，通过IgG定量ELISA对各种豚鼠抗血清中的IgG浓度进行了定量。
按照以下的步骤实施了IgG定量ELISA。将抗豚鼠IgG(H&L)(GOAT)抗体(ROCKLAND公司Cat.606-1102)用PBS(Wako)稀释至1μg/mL，加入MaxiSorp plate(Nunc)中100μL，在4℃下孵育过夜，由此进行固相化。固相化后，用PBS清洗孔板，将100μL的各种抗血清的稀释液加入孔板的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST进行清洗，将100μL的HRP标记抗豚鼠IgG抗体(自备品)加入孔板的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST进行清洗，将100μL TMB(SIGMA公司Cat.T-4444)加入孔板的孔中，由此使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(Molecular Devices,LLC.)测定了显色值(O.D.450nm/650nm)。使用抗HSV gD抗体(自备品)作为标准品制作标准曲线，从而对抗血清中的IgG浓度进行了定量。
其结果，对于抗血清中的IgG浓度，GPCMV-gB组为2.71mg/mL、GPCMV-五聚体组为2.94mg/mL、GPCMV-gB+GPCMV-五聚体组合使用组为3.44mg/mL，对照组为1.56mg/mL。
血清中IgG浓度为1.6～3.4mg/mL，因此为了在1次给药中给予1只量的IgG，假定以2mL/每只进行给予，使用Amicon Ultra(Merck公司UFC903024)进行蛋白质浓缩，制备了15～30mg/mL的IgG纯化品。
向妊娠豚鼠给予IgG纯化品，第二天感染GPCMV(各组4只)。自感染起1周后追加给予了抗体级分。
向Hartley豚鼠(妊娠4周龄)的腹腔内给予IgG纯化品各2mL。第二天以成为1×106PFU/个体的方式皮下接种了野生型GPCMV。为了补充被代谢的抗体，在1周后对腹腔内追加给予IgG纯化品各1mL。在感染3周后实施安乐死，然后解剖，采集了母体的器官(脾脏、肝脏、肾脏、肺、唾液腺、胎盘)、胚胎的器官(肝脏、肺、大脑)。从将各器官切碎后进行匀浆而得的待检体中，使用Maxwell16 Tissue DNAPurificaion Kit(Promega公司)纯化病毒DNA，通过定量PCR计算出病毒拷贝数。将每5×105个细胞中检测出1个拷贝以上的病毒拷贝数的待检体判定为“有感染”。需要说明的是，在表2所示的条件下实施定量PCR。将使用的引物和探针示于表3。
[表2]
表2.定量PCR条件
Figure BDA0003103949140000201
#2×master mix：TaqMan Universal PCR(Applied)或Brilliant II QPCR(Agilent)MasterMix循环条件：在50℃下2分钟、95℃下10分钟、[95℃下30秒、60℃下1分钟]×50
[表3]
表3.引物和探针
Figure BDA0003103949140000202
[结果/考察]
将结果示于表4。括号内的数值表示相对于评价的待检体数(母体与胚胎为只数，胎盘为个数)的、病毒阳性的待检体数。由表4，gB+五聚体组对胚胎的先天性感染的抑制效果最高。接下来较高的是五聚体组，gB组几乎未观察到效果。gB+五聚体组合使用组最强烈地抑制了对胚胎的感染，因此，预期“组合使用了gB和五聚体的亚单位疫苗”这一新的方向性作为面向CMV疫苗的实用化的方法是有效的。
[表4]
表4.感染率(感染的有无)的比较
Figure BDA0003103949140000211
根据以上，gB+五聚体组合使用组中，尽管对豚鼠母体的初次感染几乎未显示出效果，但显著抑制了对胎儿的感染。该抑制效果与gB和五聚体各自的单独组相比高。此次的结果是首次使用动物疾病模型示出通过使抗gB抗体和抗五聚体抗体共存而能够更有效地抑制病毒由母体向胎儿的转移的例子，强烈示出gB+五聚体的组合使用疗法对于人的先天性感染抑制也是有效的可能性。
[对人的应用/人体用疫苗抗原的制作]
通过上述实施例证实了对豚鼠给予组合使用抗原对于预防经胎盘感染是有效的，启示出组合使用抗原作为人体用CMV疫苗候补是有效的。因此，为了应用于人而制作了HCMV的gB和五聚体抗原。
<HCMV-gB的制备和性状解析>
基于源自AD169株的HCMV-gB的胞外域，制作导入了氨基酸突变以改善性状的改变HCMV-gB蛋白“gB1-682-fm3Mv9”(以下称为“HCMV-gB”)(序列号1)，利用与GPCMV-gB同样的方法进行表达和纯化。
性状解析也与GPCMV-gB同样地进行。确认SDS-PAGE中HCMV-gB的条带为主条带(图5)。另外，在HPLC凝胶过滤分析中，作为主峰，确认到所期待的三聚物的峰(图6)。
<HCMV-五聚体的制备和性状解析>
接着，制作了源自Merlin株的HCMV五聚体的胞外域。作为构成HCMV五聚体的胞外域的蛋白质，使用源自Merlin株的UL128(序列号4)、UL130(序列号5)、UL131(序列号6)、gL(序列号3)、和gH(序列号9)。
使用人工基因合成和基因工程的方法，分别将构成HCMV五聚体的胞外域的各蛋白质的基因序列克隆到pCAGGS1.dhfr.neo载体中，制作了野生型UL128表达质粒、野生型UL130表达质粒、野生型UL131表达质粒、野生型gL表达质粒、野生型gH表达质粒。接着，为了制作分泌型CMV五聚体，而对野生型gH表达质粒进行了改变。参考非专利文献14，进行了如下改变：使gH的C末端的位置第716位及之后的氨基酸缺损，在该位置添加LGG连接体和His标签。
表达和纯化利用与GPCMV-gB同样的方法进行，得到HCMV五聚体的胞外域(以下，称为“HCMV-五聚体”)纯化品。
与GPCMV-gB同样地实施了性状解析，结果通过SDS-PAGE分别确认了构成HCMV-五聚体的各种构成成分的条带(图7)。另外，HPLC凝胶过滤分析中，作为主峰，确认到所期待的五聚体(Pentamer)的峰(图8)。
<HCMV/豚鼠免疫原性试验>
使用制作的HCMV-gB和HCMV-五聚体，实施了豚鼠免疫原性试验。针对4周龄、雌性Hartley豚鼠，以25μg/只的方式用生理盐水(大冢制药)制备各抗原(抗HCMV-gB血清、抗HCMV-五聚体血清、或HCMV-gB+HCMV-五聚体血清)，作为佐剂，使用10v/v％的Alum(Invivogen)和50μg/只的CpG ODN1826(eurofins)。对Hartley豚鼠(雌性，3只/组)以2周间隔3次肌肉接种(100μL、后肢两脚)所制备的抗原液，在末次免疫的2周后，在异氟醚吸入麻醉下通过心脏采血而采集全血。将得到的血液在加入了凝固促进剂的分离管中进行血清分离，进行了56℃、30分钟灭活处理，作为免疫血清，使用这些免疫血清实施了结合抗体诱导能力解析(结合抗体效价解析)。
<HCMV/结合抗体效价解析>
用PBS(Wako)将HCMV-gB或HCMV-五聚体稀释至1μg/mL，在MaxiSorp plate(Nunc)中加入50μL，在4℃下孵育过夜，由此进行固相化。固相化后，用PBS清洗孔板，在孔板的孔中加入100μL的各免疫血清(抗HCMV-gB血清、抗HCMV-五聚体血清、或HCMV-gB+HCMV-五聚体血清)的稀释液，在室温下孵育。1小时后，用PBST进行清洗，将100μL的检测抗体山羊抗豚鼠IgG HRP二抗(ROCKLAND公司Cat.606-103-129)加入孔板的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST进行清洗，将100μL TMB(SIGMA公司Cat.T-4444)加入培养板的孔中，由此使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(Molecular Devices,LLC.)测定了显色值(O.D.450nm/650nm)。将测定的结果示于图11和图12。HCMV-gB+HCMV-五聚体免疫血清相对于HCMV-gB和HCMV-五聚体均显示出高结合抗体效价。由该结果认为，在HCMV-gB+HCMV-五聚体免疫组中，诱导了针对这2种抗原的免疫应答。
<针对HCMV既往感染者PBMC的IFNγ诱导能力的评价>
细胞免疫的评价使用PBMC(CTL公司Cat.CTL-CP1)。PBMC使用通过CTL公司的数据确认具有HCMV感染经历的21位供体来源待检体。
将CTL抗-聚集体洗涤液(20×)(CTL公司Cat.CTL-AA-001)在设定在37℃的水浴中加热10分钟，使其完全解冻，在19mL的RPMI1640培养基(gibco公司Cat.21870-076)中加入CTL抗-聚集体洗涤液(20×)1mL制成CTL抗-聚集体洗涤液(1×)。制备的CTL抗-聚集体洗涤液(1×)在37℃、5％CO2条件下静置20分钟以上至使用之前，并且在1小时以内使用。在CTL-测试培养基(CTL公司Cat.CTLT-010)中添加L-谷氨酰胺(100×)(Wako公司Cat.073-05391)1％(v/v)，在37℃、5％CO2条件下静置20分钟以上，直至使用。
将加入了PBMC的小瓶在设定为37℃的水浴加热8分钟，然后将小瓶颠倒混合2次，使PBMC悬浮。将小瓶中的细胞溶液全部移至50mL管中，进而将CTL抗-聚集体洗涤液(1×)1mL放入小瓶中，完全回收了细胞溶液。边缓慢地旋转50mL管边用15秒加入CTL抗-聚集体洗涤液(1×)3mL，进而平稳地加入CTL抗-聚集体洗涤液(1×)5mL而制成细胞溶液。以快速加速、快速减速设定将细胞溶液离心分离(330×g、10分钟、室温)，去除离心分离后的上清液，通过轻敲使细胞悬浮。添加CTL抗-聚集体洗涤液(1×)10mL，颠倒混合2次。以快速加速、快速减速设定将细胞溶液离心分离(330×g、10分钟、室温)，去除离心后的上清液，通过轻敲使细胞悬浮。用1×L-谷氨酰胺-CTL-测试培养基将细胞稀释至3×106个细胞/mL～5×106个细胞/mL的范围内的浓度。
以300μL/孔的D-PBS(-)(Wako公司Cat.045-29795)将Human IFN-γELISpotPLUS(MABTECH公司Cat.3420-4HST-2)中随附的孔板清洗4次，然后以300μL/孔添加1×L-谷氨酰胺-CTL-测试培养基，在室温下静置30分钟以上。从孔板中去除CTL-测试培养基，以100μL/孔添加细胞悬浮液。进而，分别以100μL/孔添加HCMV-gB、HCMV-五聚体、HCMV-gB抗原和HCMV-五聚体抗原的混合、将Human IFN-γELISpotPLUS中随附的阳性对照(mAB CD3-2)用1×L-谷氨酰胺-CTL-测试培养基稀释而得者、及作为阴性对照的1×L-谷氨酰胺-CTL-测试培养基，使其悬浮。用铝箔覆盖孔板，在37℃、5％CO2条件下培养12～24小时。
用0.5％FBS(CORNING公司Cat.35-076-CV)-PBS将Human IFN-γELISpotPLUS中随附的检测抗体(7-B6-1-biotin)稀释至1μg/mL，制作了检测抗体液。从孔板中与培养基一起去除细胞，用300μL/孔的D-PBS(-)清洗5次。以100μL/孔添加检测抗体液，在室温下静置2小时。用0.5％FBS-PBS将Human IFN-γELISpotPLUS中随附的Streptavidin-HRP稀释1000倍，制作了Streptavidin-HRP溶液。从孔板中去除检测抗体液，用300μL/孔的D-PBS(-)清洗5次后，以100μL/孔添加Streptavidin-HRP溶液，在室温下静置1小时。使Human IFN-γELISpotPLUS中随附的Ready-to-use TMB通过0.22μm过滤器，制作了Ready-to-use TMB溶液。从孔板中去除Streptavidin-HRP溶液，用300μL/孔的D-PBS(-)清洗5次。以100μL/孔在孔板中添加Ready-to-use TMB溶液，在室温下以5～30分的范围内静置直至观察到清晰的斑点后，用300μL/孔的纯水清洗3次。从板架上取下板条(strip wells)，用纯水冲洗孔板底面的PVDF膜侧，将微孔板干燥一夜。用CTL公司酶联免疫斑点分析仪进行图像拍摄，用CTL公司ImmunoSpot S5 verse分析仪进行斑点数的计数。将与全部待检体的阴性对照(对照)孔的斑点数均值相比观察到5倍以上的斑点数的待检体判定为“由抗原刺激引起的IFNγ诱导反应阳性”。将由判定结果得到的酶联免疫斑点阳性率(全部供体中的“由抗原刺激引起的IFNγ诱导反应阳性”供体的比例)示于图13。
[结果/考察]
与用HCMV-gB或HCMV-五聚体进行刺激的情况相比，将HCMV-gB和HCMV-五聚体混合进行刺激的情况，在更多的供体中观察到IFNγ诱导。由该结果认为，在HCMV既往感染者中，存在对HCMV-gB和HCMV-五聚体中的任一抗原无法诱导IFNγ的群体，并且，通过组合使用HCMV-gB和HCMV-五聚体作为疫苗进行给予，从而不仅对于对两种抗原中的任意种具有细胞免疫诱导能力的群体诱导细胞免疫，对于仅能对任一抗原诱导细胞免疫的群体也能够诱导细胞免疫。
序列表
<110> KM生物医薬股份公司（KM Biologics Co., Ltd.）
<120> 用于预防或治疗巨细胞病毒的先天性感染的疫苗（A vaccine for preventingor treating transplacental infection of
CMV）
<130> FP19-1095-00
<150> JP2018-230640
<151> 2018-12-10
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 706
<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> gB1-682-fm3Mv9
<400> 1
Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile
1 5 10 15
Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr
20 25 30
Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln
35 40 45
Thr Arg Ser Val Tyr Ser Gln His Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser
50 55 60
His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp
65 70 75 80
Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met
85 90 95
Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr
100 105 110
Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val
115 120 125
Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln
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Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr Ala Tyr His Arg Thr Thr Tyr
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Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile
165 170 175
His His Ile Asn Lys Phe Ala Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val
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Ile Gly Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn
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Lys Thr Met Gln Leu Ile Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr
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Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Glu Ala
225 230 235 240
Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Leu Thr Ile Thr Thr
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Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp
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Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile
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Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser
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Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser
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Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met
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Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu
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Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln
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Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg
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Ser Ser Leu Asn Ile Thr His Thr Thr Gln Arg Ser Thr Ser Asp Asn
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Asn Thr Thr His Leu Ser Ser Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr
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Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg
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Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr
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Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu
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Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val
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Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val
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Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg
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Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly
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Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu
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Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala
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Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser
625 630 635 640
Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu
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Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg
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Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser
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Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Leu
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Pro Pro
705
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<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> gH胞外域
<400> 2
Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Ile Leu Ala Val Cys Leu
1 5 10 15
Phe Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Val Ser Glu
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Pro Leu Asp Lys Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg Pro
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Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Ser Ser
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Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn Phe
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Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys Leu
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Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu Thr
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Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu Val
115 120 125
Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Phe Ser Gln Gln Leu Lys Ala
130 135 140
Gln Asp Ser Leu Gly Glu Gln Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile Asp
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Leu Ser Ile Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His Gly
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Gln Thr Cys Ile Leu Phe Asp Gly His Asp Leu Leu Phe Ser Thr Val
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Val Lys Ile Thr Leu Thr Glu Asp Phe Phe Val Val Thr Val Ser Ile
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Asp Asp Asp Thr Pro Met Leu Leu Ile Phe Gly His Leu Pro Arg Val
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Leu Phe Lys Ala Pro Tyr Gln Arg Asp Asn Phe Ile Leu Arg Gln Thr
260 265 270
Glu Lys His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Asp Gln Leu Asn Arg
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His Ser Tyr Leu Lys Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ala Leu Asp Phe
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Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Leu Leu Arg Asn Ser Phe His Arg Tyr
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Ala Val Asp Val Leu Lys Ser Gly Arg Cys Gln Met Leu Asp Arg Arg
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Thr Val Glu Met Ala Phe Ala Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Ala Ala Ala
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Arg Gln Glu Glu Ala Gly Ala Gln Val Ser Val Pro Arg Ala Leu Asp
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Arg Gln Ala Ala Leu Leu Gln Ile Gln Glu Phe Met Ile Thr Cys Leu
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Ser Gln Thr Pro Pro Arg Thr Thr Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala Val
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Asp Leu Ala Lys Arg Ala Leu Trp Thr Pro Asn Gln Ile Thr Asp Ile
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Thr Ser Leu Val Arg Leu Val Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Asn Gln Gln
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Gln Glu Leu Tyr Leu Met Gly Ser Leu Val His Ser Met Leu Val His
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Thr Thr Glu Arg Arg Glu Ile Phe Ile Val Glu Thr Gly Leu Cys Ser
485 490 495
Leu Ala Glu Leu Ser His Phe Thr Gln Leu Leu Ala His Pro His His
500 505 510
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Asp His Ser Leu Glu Arg Leu Thr Arg Leu Phe Pro Asp Ala Thr Val
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Pro Ala Thr Val Pro Ala Ala Leu Ser Ile Leu Ser Thr Met Gln Pro
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Ser Thr Leu Glu Thr Phe Pro Asp Leu Phe Cys Leu Pro Leu Gly Glu
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Ser Phe Ser Ala Leu Thr Val Ser Glu His Val Ser Tyr Ile Val Thr
580 585 590
Asn Gln Tyr Leu Ile Lys Gly Ile Ser Tyr Pro Val Ser Thr Thr Val
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Val Gly Gln Ser Leu Ile Ile Thr Gln Thr Asp Ser Gln Thr Lys Cys
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Asn Ile Ser Leu Glu Asn Cys Ala Phe Cys Gln Ser Ala Leu Leu Glu
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Tyr Asp Asp Thr Gln Gly Val Ile Asn Ile Met Tyr Met His Asp Ser
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Asp Asp Val Leu Phe Ala Leu Asp Pro Tyr Asn Glu Val Val Val Ser
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Ser Pro Arg Thr His Tyr Leu Met Leu Leu Lys Asn Gly Thr Val Leu
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Glu Val Thr Asp Val Val Val Asp Ala Thr Asp
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<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> gL
<400> 3
Met Cys Arg Arg Pro Asp Cys Gly Phe Ser Phe Ser Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
Ile Leu Leu Trp Cys Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Val Ser Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu Cys Pro
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Glu Leu Thr Arg Arg Cys Leu Leu Gly Glu Val Phe Glu Gly Asp Lys
50 55 60
Tyr Glu Ser Trp Leu Arg Pro Leu Val Asn Val Thr Gly Arg Asp Gly
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Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Tyr Arg Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala
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Tyr Asn Asn Pro Asp Gln Leu Arg Ala Leu Leu Thr Leu Leu Ser Ser
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Asp Thr Ala Pro Arg Trp Met Thr Val Met Arg Gly Tyr Ser Glu Cys
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Gly Asp Gly Ser Pro Ala Val Tyr Thr Cys Val Asp Asp Leu Cys Arg
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Gly Tyr Asp Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Gly Arg Ser Ile Phe Thr Glu
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Val Ala Ile Arg Asn Glu Ala Thr Arg Thr Asn Arg Ala Val Arg Leu
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Pro Leu Leu Arg His Leu Asp Lys Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Pro Glu
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<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> UL128
<400> 4
Met Ser Pro Lys Asp Leu Thr Pro Phe Leu Thr Ala Leu Trp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly His Ser Arg Val Pro Arg Val Arg Ala Glu Glu Cys Cys Glu
20 25 30
Phe Ile Asn Val Asn His Pro Pro Glu Arg Cys Tyr Asp Phe Lys Met
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Cys Asn Arg Phe Thr Val Ala Leu Arg Cys Pro Asp Gly Glu Val Cys
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Tyr Ser Pro Glu Lys Thr Ala Glu Ile Arg Gly Ile Val Thr Thr Met
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Thr His Ser Leu Thr Arg Gln Val Val His Asn Lys Leu Thr Ser Cys
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Asn Tyr Asn Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Asp Gly Arg Ile Arg Cys Gly
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Lys Val Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Leu Leu Gly Ala Ala Gly Ser Val
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Pro Tyr Arg Trp Ile Asn Leu Glu Tyr Asp Lys Ile Thr Arg Ile Val
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Gly Leu Asp Gln Tyr Leu Glu Ser Val Lys Lys His Lys Arg Leu Asp
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Val Cys Arg Ala Lys Met Gly Tyr Met Leu Gln
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<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> UL130
<400> 5
Met Leu Arg Leu Leu Leu Arg His His Phe His Cys Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ala Val Trp Ala Thr Pro Cys Leu Ala Ser Pro Trp Ser Thr Leu Thr
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Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Pro Trp Ser Lys Leu Thr Tyr Ser Lys
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Pro His Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Pro Phe Leu Tyr Pro Ser Pro
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Pro Arg Ser Pro Leu Gln Phe Ser Gly Phe Gln Arg Val Ser Thr Gly
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Pro Glu Cys Arg Asn Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Asn Arg Glu Gly
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Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val Gln Ile Ser Val Glu Asp Ala
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Lys Ile Phe Gly Ala His Met Val Pro Lys Gln Thr Lys Leu Leu Arg
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Phe Val Val Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Gln Met Cys Val Met Lys Leu
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Glu Ser Trp Ala His Val Phe Arg Asp Tyr Ser Val Ser Phe Gln Val
180 185 190
Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asn Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr
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His Pro Asn Leu Ile Val
210
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<211> 129
<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> UL131
<400> 6
Met Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val
1 5 10 15
Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg
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Val Pro His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr
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Arg Tyr Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His
50 55 60
Tyr Asp Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile
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Asn Val Thr Glu Val Ser Leu Leu Ile Ser Asp Phe Arg Arg Gln Asn
85 90 95
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Asn
<210> 7
<211> 906
<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> HCMV AD169 gB
<400> 7
Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile
1 5 10 15
Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr
20 25 30
Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln
35 40 45
Thr Arg Ser Val Tyr Ser Gln His Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser
50 55 60
His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp
65 70 75 80
Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met
85 90 95
Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr
100 105 110
Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val
115 120 125
Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln
130 135 140
Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr Ala Tyr Ile Tyr Thr Thr Tyr
145 150 155 160
Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile
165 170 175
His His Ile Asn Lys Phe Ala Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val
180 185 190
Ile Gly Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn
195 200 205
Lys Thr Met Gln Leu Ile Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr
210 215 220
Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp
225 230 235 240
Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Leu Thr Ile Thr Thr
245 250 255
Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp
260 265 270
Val Val Tyr Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser
275 280 285
Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr
290 295 300
Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ala Ala Pro Glu Thr His Arg
305 310 315 320
Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly
405 410 415
Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln
420 425 430
Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg
435 440 445
Ser Ser Leu Asn Ile Thr His Arg Thr Arg Arg Ser Thr Ser Asp Asn
450 455 460
Asn Thr Thr His Leu Ser Ser Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr
465 470 475 480
Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg
485 490 495
Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr
500 505 510
Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu
515 520 525
Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val
530 535 540
Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val
545 550 555 560
Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg
565 570 575
Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly
580 585 590
Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu
595 600 605
Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala
610 615 620
Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser
625 630 635 640
Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu
645 650 655
Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg
660 665 670
Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser
675 680 685
Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Leu
690 695 700
Pro Pro Tyr Leu Lys Gly Leu Asp Asp Leu Met Ser Gly Leu Gly Ala
705 710 715 720
Ala Gly Lys Ala Val Gly Val Ala Ile Gly Ala Val Gly Gly Ala Val
725 730 735
Ala Ser Val Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Leu Lys Asn Pro Phe Gly
740 745 750
Ala Phe Thr Ile Ile Leu Val Ala Ile Ala Val Val Ile Ile Thr Tyr
755 760 765
Leu Ile Tyr Thr Arg Gln Arg Arg Leu Cys Thr Gln Pro Leu Gln Asn
770 775 780
Leu Phe Pro Tyr Leu Val Ser Ala Asp Gly Thr Thr Val Thr Ser Gly
785 790 795 800
Ser Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu Ser
805 810 815
Val Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Ala
820 825 830
Ser Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met Leu
835 840 845
Leu Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn Gly
850 855 860
Thr Asp Ser Leu Asp Gly Gln Thr Gly Thr Gln Asp Lys Gly Gln Lys
865 870 875 880
Pro Asn Leu Leu Asp Arg Leu Arg His Arg Lys Asn Gly Tyr Arg His
885 890 895
Leu Lys Asp Ser Asp Glu Glu Glu Asn Val
900 905
<210> 8
<211> 900
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GPCMV 22122 gB
<400> 8
Met Arg Pro Val Arg Gly Ile Ala Arg Ser Arg Ile Leu Ser Cys Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Arg Ile Cys Ser Met Ser Met Gly Thr Asp Leu Val Arg Phe Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Ile Met Leu Ile Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Pro Tyr Val Phe Thr
115 120 125
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130 135 140
Val Thr Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Arg Glu Phe Val Ala Leu
145 150 155 160
Pro Met Trp Glu Ile Phe Leu Val Asn Ser Arg Gly Gln Cys Tyr Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Ser Val Trp Leu Tyr Lys Glu Thr Cys Ser Met Asn Cys Ile
225 230 235 240
Val Thr Lys Thr Lys Gly Lys Ser Lys Phe Pro Tyr Asp Met Phe Val
245 250 255
Leu Pro Ser Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Ser
260 265 270
Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gln Arg Glu Lys Phe His Ile Trp Ser
275 280 285
Asn Tyr Ser Ile Leu Lys Asp Phe Gly Ser Arg Ala Leu Glu Ala Arg
290 295 300
Ile Val Pro Lys Met Ala Phe Tyr Glu Arg Glu Asp Val Val Ile Gly
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Asp Met Asp Gly Asn Ala Thr Tyr His Val Thr Thr Gly Gly Leu
405 410 415
Val Ile Val Trp Gln Gly Leu Lys Gln Lys Ser Leu Lys Ala Leu Glu
420 425 430
Ile Ala Ala Asn Glu Ser Ala Val Ser Ala Thr Gly Ser Asn Ser Arg
435 440 445
Arg Lys Arg Ser Leu Pro Asp Glu Ser Thr Gly Asp Ile Ser Tyr Ala
450 455 460
Gln Leu Gln Phe Ala Tyr Asp Thr Leu Arg Thr Tyr Ile Asn Gln Ala
465 470 475 480
Leu Gly His Ile Ala Glu Ala Trp Cys Leu Asp Gln Lys Arg Thr Ala
485 490 495
Glu Val Leu His Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ser
500 505 510
Ala Ile Phe Gly Val Pro Val Ala Ala Arg Val Val Gly Asp Val Ile
515 520 525
Ser Leu Ala Lys Cys Ile Glu Val Asn Gln Ser Thr Val Leu Ile Lys
530 535 540
Gly Asp Met Arg Lys Phe Ser Asp Asp Gly Lys Leu Glu Gly Cys Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Pro Val Val Trp Phe Ser Met Lys Asn Ser Thr Glu Val Arg
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595 600 605
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Asn Tyr Gln Lys Lys Arg Leu Asp Phe Val Val Glu Arg Val Ile Asn
675 680 685
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690 695 700
Gly Ala Ile Gly Lys Gly Ile Gly Glu Ala Val Gly Ala Val Gly Gly
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
Val Ile Thr Val Tyr Arg Arg Gln Arg Arg Ala Met Gln Arg Pro Phe
755 760 765
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770 775 780
Asp Ser Ser Ile Ala Val Ala Tyr Pro Gly Pro Glu Gly Thr Ser Gly
785 790 795 800
Asp Ala Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Glu Ala Pro Tyr Gly Tyr Lys Asp
805 810 815
Leu Ser Val Asp Ala Asp Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Ala Gly Ala
820 825 830
Gly Ala Asp Phe Asn Glu Glu Asp Ala Val Arg Met Leu Arg Ala Ile
835 840 845
Lys Arg Leu Asp Asp Lys Lys Arg Gln Glu Ile Glu Lys Ser Ser Lys
850 855 860
Asp Ser Ala Ser Asn Lys Asn Ser Glu Thr Arg Arg Arg Pro Gly Ile
865 870 875 880
Met Asp Arg Leu Arg Arg Arg Gly Gly Tyr Gln Lys Leu Asn Thr Glu
885 890 895
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900
<210> 9
<211> 742
<212> PRT
<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）
<220>
<223> gH
<400> 9
Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Ile Leu Ala Val Cys Leu
1 5 10 15
Phe Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Val Ser Glu
20 25 30
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35 40 45
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Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn Phe
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Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu Thr
100 105 110
Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu Val
115 120 125
Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Phe Ser Gln Gln Leu Lys Ala
130 135 140
Gln Asp Ser Leu Gly Glu Gln Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile Asp
145 150 155 160
Leu Ser Ile Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His Gly
165 170 175
Trp Thr Glu Ser His Thr Thr Ser Gly Leu His Arg Pro His Phe Asn
180 185 190
Gln Thr Cys Ile Leu Phe Asp Gly His Asp Leu Leu Phe Ser Thr Val
195 200 205
Thr Pro Cys Leu His Gln Gly Phe Tyr Leu Ile Asp Glu Leu Arg Tyr
210 215 220
Val Lys Ile Thr Leu Thr Glu Asp Phe Phe Val Val Thr Val Ser Ile
225 230 235 240
Asp Asp Asp Thr Pro Met Leu Leu Ile Phe Gly His Leu Pro Arg Val
245 250 255
Leu Phe Lys Ala Pro Tyr Gln Arg Asp Asn Phe Ile Leu Arg Gln Thr
260 265 270
Glu Lys His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Asp Gln Leu Asn Arg
275 280 285
His Ser Tyr Leu Lys Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ala Leu Asp Phe
290 295 300
Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Leu Leu Arg Asn Ser Phe His Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Val Asp Val Leu Lys Ser Gly Arg Cys Gln Met Leu Asp Arg Arg
325 330 335
Thr Val Glu Met Ala Phe Ala Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Ala Ala Ala
340 345 350
Arg Gln Glu Glu Ala Gly Ala Gln Val Ser Val Pro Arg Ala Leu Asp
355 360 365
Arg Gln Ala Ala Leu Leu Gln Ile Gln Glu Phe Met Ile Thr Cys Leu
370 375 380
Ser Gln Thr Pro Pro Arg Thr Thr Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala Val
385 390 395 400
Asp Leu Ala Lys Arg Ala Leu Trp Thr Pro Asn Gln Ile Thr Asp Ile
405 410 415
Thr Ser Leu Val Arg Leu Val Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Asn Gln Gln
420 425 430
His Leu Ile Pro Gln Trp Ala Leu Arg Gln Ile Ala Asp Phe Ala Leu
435 440 445
Lys Leu His Lys Thr His Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ala Phe Ala Arg
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Leu Ala Glu Leu Ser His Phe Thr Gln Leu Leu Ala His Pro His His
500 505 510
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515 520 525
Asp His Ser Leu Glu Arg Leu Thr Arg Leu Phe Pro Asp Ala Thr Val
530 535 540
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545 550 555 560
Ser Thr Leu Glu Thr Phe Pro Asp Leu Phe Cys Leu Pro Leu Gly Glu
565 570 575
Ser Phe Ser Ala Leu Thr Val Ser Glu His Val Ser Tyr Ile Val Thr
580 585 590
Asn Gln Tyr Leu Ile Lys Gly Ile Ser Tyr Pro Val Ser Thr Thr Val
595 600 605
Val Gly Gln Ser Leu Ile Ile Thr Gln Thr Asp Ser Gln Thr Lys Cys
610 615 620
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625 630 635 640
Asn Ile Ser Leu Glu Asn Cys Ala Phe Cys Gln Ser Ala Leu Leu Glu
645 650 655
Tyr Asp Asp Thr Gln Gly Val Ile Asn Ile Met Tyr Met His Asp Ser
660 665 670
Asp Asp Val Leu Phe Ala Leu Asp Pro Tyr Asn Glu Val Val Val Ser
675 680 685
Ser Pro Arg Thr His Tyr Leu Met Leu Leu Lys Asn Gly Thr Val Leu
690 695 700
Glu Val Thr Asp Val Val Val Asp Ala Thr Asp Ser Arg Leu Leu Met
705 710 715 720
Met Ser Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Ile Gly Ile Tyr Leu Leu Tyr
725 730 735
Arg Met Leu Lys Thr Cys
740
<210> 10
<211> 723
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GP75
<400> 10
Met Ser Pro Ala Thr Arg Phe Thr Val Ile Ser Cys Leu Val Val Ser
1 5 10 15
Leu Ile Thr Pro Ser Glu Thr Ser Ser Trp Phe Asp Pro Phe Ile Glu
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Trp Ala Arg Ser Ser Pro Asn Met Thr Cys Val Asn Asn Arg Thr Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Ser Val Ser Lys Thr Ile Met Gln Gly Val Asp Leu Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Arg Tyr Tyr Ser Tyr Ile Ile Val Pro Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Thr Ile Trp His Thr Pro Ser Gly Tyr Val Ile Arg Leu Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Thr Pro Arg Phe Glu Glu Cys Thr Leu Phe Pro Asn His Thr
165 170 175
Val Ile Phe Asp Met Thr Val Pro Cys Ser Gln Glu Val Tyr Leu Arg
180 185 190
Gln Thr Gly Lys His Gln Phe Ala Ile Val Leu Thr Phe Thr Pro Ser
195 200 205
Phe Phe Val Leu Asn Ile Gln Thr Ala Gln His Gln His Val Thr Glu
210 215 220
Asn Asp Glu Asp Val Ile Leu Ile Phe Gly Asp Val Arg Ser Ile Asp
225 230 235 240
Val Lys Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Val Leu Thr Leu Arg Gln Ser Tyr
245 250 255
Arg Asp Asp Leu Leu Ile Val Ala Lys Thr Ser Ile Val Asn Ala Thr
260 265 270
Tyr Pro Phe Ile Lys Thr Gln Asp Phe Leu Lys Gly Thr Leu Ser Gly
275 280 285
Asn Tyr Leu Asp Phe Asn His Val Tyr Thr Glu Phe Asn Arg Leu Val
290 295 300
Ile His Asn Leu Val Glu Gly Leu Cys Asp Ala Pro Pro Asp Asp Arg
305 310 315 320
Thr Val Ser Met Val Phe Ser Tyr Ala Val Leu Ala Arg Thr Leu Tyr
325 330 335
His Thr Ser Asn Val Thr Ala Arg Leu Glu Asp Val Ala Leu Arg Tyr
340 345 350
Val Arg Leu Thr Leu Ala Arg Thr Phe Leu Gln Gln Cys Phe Asp Val
355 360 365
Gly Pro Arg Tyr Met Arg Phe Pro Thr Ile Asp Gly Ala Leu Ser Val
370 375 380
Leu Leu Lys Leu Ile Arg Asn Ser Arg Asp Val Asp Gly Gly Leu Lys
385 390 395 400
Leu Ser Leu Thr Phe Ala Leu Ile Phe Gly Asn Asn Thr Asp Met Thr
405 410 415
Lys Glu Arg Asp Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Glu Met Lys Ser Ile His
420 425 430
Arg Ala Gly Leu Val Ser Pro Leu Ser Pro Arg Gln Arg Ser Leu Leu
435 440 445
Tyr Met Met Ala Tyr Val Thr His His Thr Thr Ala Phe Pro Asp Ile
450 455 460
Arg Arg Glu Met Leu Ala Met Gln Thr Ser Leu Cys Ser Pro Gln Glu
465 470 475 480
Leu Tyr Asn Trp Ala Pro His Val Ser Ser Ala Gly Leu Thr Met Gln
485 490 495
Glu Met Phe Thr Pro Cys Ser Gly Ser Gly Arg Arg Asp Tyr Ser Glu
500 505 510
Ala Arg Ile Ala Glu Ile Val Gln Leu Asn Pro Leu Thr Thr Lys Thr
515 520 525
Pro Ala Asp Leu Tyr Arg Ile Leu Ala His Phe Asp Arg Ser Asn Leu
530 535 540
Thr Asn Phe Pro Ala Leu Ser Cys Ile Ser His Leu Ser Gly Tyr Val
545 550 555 560
Ala Val Thr Leu Arg Asp Val Thr Tyr Val Val Ser Ser Asn Val Met
565 570 575
Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Val Thr Asn Leu Ala Val Asp Lys Thr
580 585 590
Met Ile Val Thr Val Ser Pro Ala Gln His Pro Cys Glu Lys Thr Glu
595 600 605
Val Ala His Ala Thr Arg Ser Ile Pro Ile Val Lys Asn Ile Thr Ile
610 615 620
Gly Asn Asp Cys Glu Tyr Cys Lys Ser Ala Ile Met Glu Tyr Asp Glu
625 630 635 640
Val Asn Gly Leu Ser Asn Ile Val Tyr Leu Ala Asp Thr Ala Asp Leu
645 650 655
Val Leu Val Thr Asn Leu Asp Asn Arg Ile Leu Ala Ser Ser Pro Arg
660 665 670
Thr Arg Tyr Ile Met Met Thr Ala Asn Gly Thr Leu Met Glu Ile Thr
675 680 685
Ser Val Ile Ile Asp Ile Arg Gln Thr Ser Ile Phe Met Ile Met Leu
690 695 700
Tyr Cys Ser Leu Gly Val Leu Leu Leu Tyr Gly Leu Tyr Arg Leu Leu
705 710 715 720
His Met Ile
<210> 11
<211> 258
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GP115
<400> 11
Met Tyr Glu Cys Met Phe Phe Ser His Arg Leu Thr Ile Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Ile Pro Leu Ile Val Leu Thr Thr Met Ser Ser Leu Ser Glu Ser Leu
20 25 30
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100 105 110
Thr Leu Leu Thr Ile Phe Arg Ser Asp Ser Ala Pro Pro Trp Val Lys
115 120 125
Phe Met Arg Gly Tyr Ser Gln Cys Leu Asp His Pro Ile Ile Tyr Thr
130 135 140
Cys Val Glu Glu Lys Cys Gln Gln Tyr Asn Leu Glu Glu Leu Pro Tyr
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Gly Lys Asp Ile Phe Leu Glu Asn Val Val Gly Phe Asp Leu Gly Ala
165 170 175
Pro Pro His Asn Met Ser Val Leu Ile Ala Val Ser Asn Thr Lys Pro
180 185 190
Lys Ile Thr Lys Val Leu Arg Ile Thr Ser Thr Ser Leu Thr Leu Phe
195 200 205
Asp Ala Leu Tyr Asn Thr Val Leu Thr Phe Phe Arg Ser Ile Gly Ala
210 215 220
Arg Asn Val Asp Val Val Arg Arg Leu Ile Leu Tyr Gln Ala Ser Leu
225 230 235 240
Ser Gly Pro His Arg Asp Ala Pro Ile His Asn Tyr Leu Asn Arg Asp
245 250 255
Leu Ser
<210> 12
<211> 179
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GP129
<400> 12
Met Arg Val Ile Val Leu Leu Val Met Phe Tyr Tyr Thr Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ile Phe Asp Asp Pro Cys Cys Ile Tyr Ser Ser Lys Asp Arg Arg Val
20 25 30
Gln His Ser Thr Thr Ser Asn Asp Thr Trp Arg Leu Val Arg Cys Gly
35 40 45
Asn Thr Leu Met Val Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Ser Phe Cys Glu Phe
50 55 60
Ser Leu Glu Glu Asn Leu Phe Glu Ser Leu Ala Leu Asn Val Ser Arg
65 70 75 80
Gln Glu Leu His Val Leu Ala Pro Glu Cys Lys Phe Gly Pro Val Glu
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Val Gly Ile Asn Lys Gln Val Arg Cys Ile Arg Tyr Pro Arg Met Pro
100 105 110
Ser Val Gln Ser Lys Pro Glu Lys Pro Ser Ile Leu Gly Val Thr Tyr
115 120 125
Arg Val Asp Tyr Thr Val Met Ile Pro Thr Pro His Phe Pro Arg Asp
130 135 140
Phe Asn Gly Leu Leu Cys Thr Phe Leu Glu Lys Asn Asp Thr Phe Tyr
145 150 155 160
Asn Thr Thr Val Asp Val Cys Gly Ser Glu Phe Tyr Ser Val Asp Gly
165 170 175
Asn Gly Lys
<210> 13
<211> 192
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GP131
<400> 13
Met Met Lys Arg Tyr Leu Val Leu Leu Pro Trp Ile Met Phe Tyr Ala
1 5 10 15
Ser Phe Gly Arg Ala Gly Arg Cys Tyr Tyr Pro Ser Thr Pro Ile Pro
20 25 30
Lys Ser Phe Val Lys His Val Asp Thr Thr Arg Ser Leu Pro Glu Cys
35 40 45
Glu Asn Asp Thr Val Ala Val Leu Thr Leu Thr Asn Gly Ala Lys Leu
50 55 60
Tyr Val Asn Met Leu Asn Thr Trp Ile Asp Gly Tyr Ile Thr Thr Leu
65 70 75 80
Gln Tyr Ala Ile Pro Pro Thr Leu Ser Asp Ile Phe Ala Phe Ile Lys
85 90 95
Arg Arg Ile Asp Tyr Gly Ser Thr Gly Thr Ala Ala Ser Thr Leu Pro
100 105 110
Ser Leu Thr Ser Leu Arg Thr Tyr Phe Gly Asp Arg Asp Ser Ser Phe
115 120 125
Leu Trp His Tyr Thr Ile Arg Met Lys Asp Gly Ala Lys Thr Leu Asp
130 135 140
Cys Asp Val Tyr Val Thr Ser Arg Val His Phe Val Leu Asn Ser Tyr
145 150 155 160
Glu Ala Val Gln Thr Val Leu Phe Glu Gly Gly Val Val Ile Ser Arg
165 170 175
His Pro Ala Asp Ser Ile Ala Cys Leu Leu Ile Asn Trp Asn Trp Thr
180 185 190
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GP133
<400> 14
Met Phe Trp Arg Leu Val Tyr Val Tyr Leu Val Ser Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Ala Glu Asp Glu Gly Ile Asp Thr Trp Trp Leu Gly Gly Val
20 25 30
Thr Asp Asn Thr Arg Val Lys Lys Glu Asn Gln Leu Ala His Tyr Ile
35 40 45
Leu Lys Thr Ile Val Leu Thr His His Arg Arg Leu Arg Thr Gly Asp
50 55 60
Glu Cys Thr Glu Gln Leu Ser Asn Asp Leu Asp Ile His Ser Val His
65 70 75 80
Thr Leu Ala Asp Ser Ile Arg Arg Leu Arg Gly Arg Tyr Arg Lys Gly
85 90 95
Leu Val Ser Ile Asp Gly Ile Arg Ile Ser Ile Gln Gln Ser Thr Arg
100 105 110
Thr Gln Gln Lys Gly Leu Trp Ile Ser Ala Arg Ile Asp Arg Ala
115 120 125
<210> 15
<211> 692
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> GPCMV gB胞外域
<400> 15
Met Arg Pro Val Arg Gly Ile Ala Arg Ser Arg Ile Leu Ser Cys Ser
1 5 10 15
Trp Arg Gly Thr Trp Thr Ser Ala Leu Thr Ile Leu Tyr Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Cys Glu Ser Thr Thr Val Thr Pro Thr Thr Val Glu Asp Thr Thr
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65 70 75 80
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85 90 95
Arg Thr Ile Gln Cys Val Pro Phe Asn Pro Arg Val Asn Ser Glu Glu
100 105 110
Gly Ile Met Leu Ile Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Pro Tyr Val Phe Thr
115 120 125
Ala Tyr Thr Tyr Gln Lys Glu Leu Leu Phe Gln Arg Ser Tyr Lys Gly
130 135 140
His Arg Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Arg Glu Phe Val Ala Leu
145 150 155 160
Pro Met Trp Glu Ile Phe Leu Val Asn Ser Arg Gly Gln Cys Tyr Thr
165 170 175
Ser His Gln Arg Val Ile Gly Ala Asp Arg Tyr Ile Ala Tyr His Asn
180 185 190
Asp Asn Glu Val Asn Glu Thr Met Trp Leu Met Arg Asp Asp Met Gly
195 200 205
Asn Asp Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile Thr Val Lys Glu His Ala Arg Thr
210 215 220
Pro Gly Ser Val Ala Phe His Lys Glu Thr Cys Ser Met Asn Cys Ile
225 230 235 240
Val Thr Lys Thr Lys Gly Lys Ser Lys Phe Pro Tyr Asp Met Phe Val
245 250 255
Leu Pro Ser Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Ser
260 265 270
Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gln Arg Glu Lys Phe His Ile Trp Ser
275 280 285
Asn Tyr Ser Ile Leu Lys Asp Phe Gly Ser Arg Ala Leu Glu Ala Arg
290 295 300
Ile Val Pro Lys Met Ala Phe Tyr Glu Arg Glu Asp Val Val Ile Gly
305 310 315 320
Trp Glu Val Asn Asp Gln Ser Asn Val Thr Cys Glu Met Ile Leu Trp
325 330 335
Glu Thr Val Asp Arg Ala Ile Arg Thr Glu Tyr Glu Asn Ala Phe His
340 345 350
Tyr Val Ala Arg Thr Leu Thr Ser Thr Phe Val Glu Asn Lys Tyr Ser
355 360 365
Pro Asp Asn Asn Leu Thr Glu Asp Asp Ile Lys Cys Phe Lys Asn Asp
370 375 380
Ala Gln Lys Lys Ile Glu Glu Val Phe Leu Arg Asp Tyr Asn Glu Thr
385 390 395 400
Tyr Asp Met Asp Gly Asn Ala Thr Tyr His Val Thr Thr Gly Gly Leu
405 410 415
Val Ile Val Trp Gln Gly Leu Lys Gln Lys Ser Leu Lys Ala Leu Glu
420 425 430
Ile Ala Ala Asn Glu Ser Ala Val Ser Ala Thr Gly Ser Asn Ser Arg
435 440 445
Arg Lys Arg Ser Leu Pro Asp Glu Ser Thr Gly Asp Ile Ser Tyr Ala
450 455 460
Gln Leu Gln Phe Ala Tyr Asp Thr Leu Arg Thr Tyr Ile Asn Gln Ala
465 470 475 480
Leu Gly His Ile Ala Glu Ala Trp Cys Leu Asp Gln Lys Arg Thr Ala
485 490 495
Glu Val Leu His Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ser
500 505 510
Ala Ile Phe Gly Val Pro Val Ala Ala Arg Val Val Gly Asp Val Ile
515 520 525
Ser Leu Ala Lys Cys Ile Glu Val Asn Gln Ser Thr Val Leu Ile Lys
530 535 540
Gly Asp Met Arg Lys Phe Ser Asp Asp Gly Lys Leu Glu Gly Cys Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Pro Val Val Trp Phe Ser Met Lys Asn Ser Thr Glu Val Arg
565 570 575
Leu Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Thr His Arg
580 585 590
Met Glu Thr Cys Gln Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Phe Val Ala Gly Asp
595 600 605
Ile Gly Tyr Glu Phe Gln Gln Tyr Val Phe Thr Lys Lys Ile Asn Leu
610 615 620
Ser Glu Ile Asp Ile Ile Asp Thr Met Ile Ala Leu Lys Thr Glu Pro
625 630 635 640
Leu Glu Asn Ile Asp Phe Lys Val Leu Glu Leu Tyr Ser Arg Asp Glu
645 650 655
Leu Ala Gln Ala Asn Val Phe Asp Leu Glu Ser Ile Met Arg Glu Tyr
660 665 670
Asn Tyr Gln Lys Lys Arg Leu Asp Phe Val Val Glu Arg Val Ile Asn
675 680 685
Pro Ile Pro Pro
690
<210> 16
<211> 698
<212> PRT
<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）
<220>
<223> gH胞外域
<400> 16
Met Ser Pro Ala Thr Arg Phe Thr Val Ile Ser Cys Leu Val Val Ser
1 5 10 15
Leu Ile Thr Pro Ser Glu Thr Ser Ser Trp Phe Asp Pro Phe Ile Glu
20 25 30
Trp Ala Arg Ser Ser Pro Asn Met Thr Cys Val Asn Asn Arg Thr Gly
35 40 45
Thr Arg Ser Leu Ala Thr Glu Gly Leu Ile Ser Phe Asn Phe Tyr Glu
50 55 60
Ala Ser Arg Thr Val Arg Thr Tyr Gln Val Pro Lys Cys Ile Phe Met
65 70 75 80
Ser Ser Val Ser Lys Thr Ile Met Gln Gly Val Asp Leu Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Arg Tyr Tyr Ser Tyr Ile Ile Val Pro Val
100 105 110
His Ala Ser Phe Gln Ile Phe Ile His Asp Leu Arg Thr Asp Leu Ser
115 120 125
Ser Pro Thr Glu Glu Leu Thr Ser Pro Val Asp Lys Thr Leu Pro Asn
130 135 140
Val Thr Ile Trp His Thr Pro Ser Gly Tyr Val Ile Arg Leu Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Thr Pro Arg Phe Glu Glu Cys Thr Leu Phe Pro Asn His Thr
165 170 175
Val Ile Phe Asp Met Thr Val Pro Cys Ser Gln Glu Val Tyr Leu Arg
180 185 190
Gln Thr Gly Lys His Gln Phe Ala Ile Val Leu Thr Phe Thr Pro Ser
195 200 205
Phe Phe Val Leu Asn Ile Gln Thr Ala Gln His Gln His Val Thr Glu
210 215 220
Asn Asp Glu Asp Val Ile Leu Ile Phe Gly Asp Val Arg Ser Ile Asp
225 230 235 240
Val Lys Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Val Leu Thr Leu Arg Gln Ser Tyr
245 250 255
Arg Asp Asp Leu Leu Ile Val Ala Lys Thr Ser Ile Val Asn Ala Thr
260 265 270
Tyr Pro Phe Ile Lys Thr Gln Asp Phe Leu Lys Gly Thr Leu Ser Gly
275 280 285
Asn Tyr Leu Asp Phe Asn His Val Tyr Thr Glu Phe Asn Arg Leu Val
290 295 300
Ile His Asn Leu Val Glu Gly Leu Cys Asp Ala Pro Pro Asp Asp Arg
305 310 315 320
Thr Val Ser Met Val Phe Ser Tyr Ala Val Leu Ala Arg Thr Leu Tyr
325 330 335
His Thr Ser Asn Val Thr Ala Arg Leu Glu Asp Val Ala Leu Arg Tyr
340 345 350
Val Arg Leu Thr Leu Ala Arg Thr Phe Leu Gln Gln Cys Phe Asp Val
355 360 365
Gly Pro Arg Tyr Met Arg Phe Pro Thr Ile Asp Gly Ala Leu Ser Val
370 375 380
Leu Leu Lys Leu Ile Arg Asn Ser Arg Asp Val Asp Gly Gly Leu Lys
385 390 395 400
Leu Ser Leu Thr Phe Ala Leu Ile Phe Gly Asn Asn Thr Asp Met Thr
405 410 415
Lys Glu Arg Asp Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Glu Met Lys Ser Ile His
420 425 430
Arg Ala Gly Leu Val Ser Pro Leu Ser Pro Arg Gln Arg Ser Leu Leu
435 440 445
Tyr Met Met Ala Tyr Val Thr His His Thr Thr Ala Phe Pro Asp Ile
450 455 460
Arg Arg Glu Met Leu Ala Met Gln Thr Ser Leu Cys Ser Pro Gln Glu
465 470 475 480
Leu Tyr Asn Trp Ala Pro His Val Ser Ser Ala Gly Leu Thr Met Gln
485 490 495
Glu Met Phe Thr Pro Cys Ser Gly Ser Gly Arg Arg Asp Tyr Ser Glu
500 505 510
Ala Arg Ile Ala Glu Ile Val Gln Leu Asn Pro Leu Thr Thr Lys Thr
515 520 525
Pro Ala Asp Leu Tyr Arg Ile Leu Ala His Phe Asp Arg Ser Asn Leu
530 535 540
Thr Asn Phe Pro Ala Leu Ser Cys Ile Ser His Leu Ser Gly Tyr Val
545 550 555 560
Ala Val Thr Leu Arg Asp Val Thr Tyr Val Val Ser Ser Asn Val Met
565 570 575
Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Val Thr Asn Leu Ala Val Asp Lys Thr
580 585 590
Met Ile Val Thr Val Ser Pro Ala Gln His Pro Cys Glu Lys Thr Glu
595 600 605
Val Ala His Ala Thr Arg Ser Ile Pro Ile Val Lys Asn Ile Thr Ile
610 615 620
Gly Asn Asp Cys Glu Tyr Cys Lys Ser Ala Ile Met Glu Tyr Asp Glu
625 630 635 640
Val Asn Gly Leu Ser Asn Ile Val Tyr Leu Ala Asp Thr Ala Asp Leu
645 650 655
Val Leu Val Thr Asn Leu Asp Asn Arg Ile Leu Ala Ser Ser Pro Arg
660 665 670
Thr Arg Tyr Ile Met Met Thr Ala Asn Gly Thr Leu Met Glu Ile Thr
675 680 685
Ser Val Ile Ile Asp Ile Arg Gln Thr Ser
690 695
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPCMV GP83正向引物
<400> 17
cgacgacgac gatgacgaaa ac 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPCMV GP83反向引物
<400> 18
tcctcggtct caacgaaggg tc 22
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPCMV GP83 FAM 探针
<400> 19
atccgagtta ggcagcg 17
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 豚鼠B-肌动蛋白正向引物
<400> 20
tggatcggcg gctcatc 17
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 豚鼠B-肌动蛋白反向引物
<400> 21
catcgtactc ctgcttgctg at 22
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 豚鼠B-肌动蛋白探针
<400> 22
cactctccac cttcc 15

Claims (7)

1.一种用于预防或治疗CMV的先天性感染的疫苗，其包含巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原和五聚体抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中，gB蛋白抗原为CMV gB蛋白的胞外域。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其中，gB蛋白抗原为具有序列号1中记载的氨基酸序列的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其中，五聚体抗原由人巨细胞病毒(HCMV)的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其中，五聚体抗原为具有序列号2、序列号3、序列号4、序列号5和序列号6中记载的氨基酸序列的人巨细胞病毒(HCMV)的五聚体蛋白的胞外域。
6.一种用于预防或治疗HCMV的先天性感染的疫苗试剂盒，其包含如下疫苗：
包含人巨细胞病毒(HCMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原的疫苗、及
包含由HCMV的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体抗原的疫苗。
7.HCMV的包膜糖蛋白B(gB蛋白)抗原以及由HCMV的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体抗原在制造用于预防或治疗人巨细胞病毒(HCMV)的先天性感染的疫苗或疫苗试剂盒中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112888455A (zh) * 2018-10-25 2021-06-01 Km生物医薬股份公司 修饰CMVgB蛋白及包含其的CMV疫苗

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2021287508B2 (en) 2020-06-09 2023-11-09 Km Biologics Co., Ltd. Fusion protein of pentamer and gB of cytomegalovirus, and vaccine containing said fusion protein

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105980570A (zh) * 2013-12-03 2016-09-28 霍欧奇帕生物科技股份公司 Cmv疫苗
CN106460010A (zh) * 2014-05-08 2017-02-22 辉瑞公司 治疗cmv之手段及方法
CN107075486A (zh) * 2014-10-31 2017-08-18 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 表达巨细胞病毒抗原的哺乳动物细胞
WO2017153954A1 (en) * 2016-03-11 2017-09-14 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gb polypeptide

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1551918B (zh) 2001-07-06 2011-04-20 财团法人化学及血清疗法研究所 基因重组伊卡因及其制备方法
MX2013004149A (es) * 2010-10-15 2013-09-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Antigeno gb de citomegalovirus.
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP3681534A1 (en) * 2017-09-13 2020-07-22 Sanofi Pasteur Human cytomegalovirus immunogenic composition

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105980570A (zh) * 2013-12-03 2016-09-28 霍欧奇帕生物科技股份公司 Cmv疫苗
CN106460010A (zh) * 2014-05-08 2017-02-22 辉瑞公司 治疗cmv之手段及方法
CN107075486A (zh) * 2014-10-31 2017-08-18 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 表达巨细胞病毒抗原的哺乳动物细胞
WO2017153954A1 (en) * 2016-03-11 2017-09-14 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gb polypeptide

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIUPPESI等: "Vaccine-Derived Neutralizing Antibodies to the Human Cytomegalovirus gH/gL Pentamer Potently Block Primary Cytotrophoblast Infection.", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
MCVOY等: "A cytomegalovirus DNA vaccine induces antibodies that block viral entry into fibroblasts and epithelial cells.", 《VACCINE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112888455A (zh) * 2018-10-25 2021-06-01 Km生物医薬股份公司 修饰CMVgB蛋白及包含其的CMV疫苗

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