JP2023076457A - 複数のサイトメガロウイルス（ｃｍｖ）抗原を発現し、その使用のためのｍｖａベクター - Google Patents

Abstract

【課題】複数のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原を共発現させて、ＨＣＭＶ感染に対する強力な体液性及び細胞性免疫応答を刺激するための発現システムが開示される。【解決手段】当該発現システムは、サブユニットが同時に共発現されるように、１つ以上の連結配列によって連結されたＨＣＭＶ抗原の複数のサブユニットをコードする複数の核酸配列が挿入されたベクターを包含し得る。当該発現システム又はベクターを含むワクチン組成物、及び前記ワクチン組成物を使用してＨＣＭＶ感染を予防又は治療する方法も開示される。【選択図】 図１

Description

優先権主張
この出願は、図面を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された米国仮出願第６２／６７０，６０７号の優先権を主張する。

政府の利益に関する声明
本発明は、国立アレルギー感染症研究所によって授与された助成金番号Ａｌ１０３９６０及びＡｌ６３３５６の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

発育中の胎児のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染は、永続的な先天性欠損症の最も一般的な感染原因であり（非特許文献１、２）、米国で現在試験されているすべての新生児状態よりも先天性疾患を誘発する（非特許文献３）。毎年、米国だけで５０００人以上の子供が子宮内ＨＣＭＶ感染による長期的な病状に罹患している（非特許文献４）。これは最も一般的には聴覚及び認知障害を起こすが、これはまた脳の石灰化、小頭症、死産など、より深刻な結果につながる場合がある（非特許文献１、２）。このように、ＨＣＭＶが主要な健康上の懸念として認識されているにもかかわらず（非特許文献５）、ほとんどの女性は先天性ＨＣＭＶ感染を認識せず（非特許文献６）、先天性ＨＣＭＶ感染又は疾患を予防又は治療するための介入は未明である（非特許文献７）。多くのＨＣＭＶワクチン戦略が開発されているが（非特許文献８）、生弱毒化ワクチン株Ｔｏｗｎｅ又はＭＦ５９アジュバントと組み合わせた組換え糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に基づく２つのアプローチのみが、出産可能年齢の女性のＨＣＭＶ感染を予防する有効性について評価されている（非特許文献９、１０）。Ｔｏｗｎｅは、子供が敢えてケアを受けた母親の感染を防ぐことができなかったが（非特許文献１１）、ｇＢ／ＭＦ５９は、産後のＨＣＭＶ血清反応陰性（ＨＣＭＶ^－）の若い女性の感染を予防する５０％の有効性を示した（非特許文献１２）。さらに、ｇＢ／ＭＦ５９は、固形臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶウイルス血症及び抗ウイルス療法の必要性を低減する有効性を示した。これにより、ｇＢ抗体価はウイルス量の減少と逆相関した（非特許文献１３）。ＨＣＭＶ^－の思春期の少女ではｇＢ／ＭＦ５９ワクチンでは５０％の有効率を再現できなかったが（非特許文献１４）、ｇＢ／ＭＦ５９は母体のＨＣＭＶ感染のリスクを減らすことができる唯一の有望なワクチン候補である。
他のウイルスワクチンの開発に関して（非特許文献１５）、先天性ＨＣＭＶワクチンの開発において特に強調されているのは、ｉｎ ｖｉｔｒｏエンベロープ糖タンパク質複合体媒介ウイルス侵入を防止する中和抗体（ＮＡｂ）の誘導である（非特許文献１６、１７）。過去数年間、ＨＣＭＶは、エンベロープ糖タンパク質複合体の異なるセットに依存する線維芽細胞（ＦＢ）及び上皮細胞（ＥＣ）の感染に異なる侵入経路を利用することが認識されている（非特許文献１８～２０）。ＦＢとＥＣの両方のＨＣＭＶ感染は、ｇＭ／ｇＮ、ｇＢ、及びｇＨ／ｇＬ／ｇＯで構成される糖タンパク質複合体に依存しているようであるが（非特許文献２１～２３）、ＥＣ感染にはさらにｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、及びＵＬ１３１Ａで構成される五量体複合体（ＰＣ）が必要である（非特許文献２４～２６）。ＨＣＭＶエントリーのためのこれらのエンベロープ糖タンパク質要件と一致して、ｇＢ又はｇＨのＮＡｂターゲティングエピトープは、ＦＢ感染とＥＣ感染の両方を効果的に妨害する可能性があり（非特許文献２７～３１）、及び同様の阻害能力は、ｇＯ又はｇＭ／ｇＮを標的とするＮＡｂによって媒介されるようである（２３、４３）。対照的に、ＰＣのＵＬ１２８／１３０／１３１Ａサブユニットの四次立体配座エピトープを主に認識するＮＡｂは、ＥＣ侵入をブロックする非常に高い効力を付与するが、ＦＢ感染を防ぐことはできない（非特許文献２７～２９、２０）。どの糖タンパク質の組み合わせがＨＣＭＶＮＡｂ誘導を最適に促進できるかは不明であるが、前臨床ワクチン研究では、ｇＢとｇＨ／ｇＬがＦＢ感染とＥＣ感染の両方に対して高力価ＮＡｂを刺激できることが一貫して示されている（非特許文献２８、３２）。これにより、ＰＣは著しく免疫原性を示し、ＥＣの侵入を阻止するＮＡｂを誘発する（非特許文献２８、３１、３３、８４）。ただし、ＰＣはＵＬ１２８／１３０／１３１Ａサブユニットのエピトープを標的とするＮＡｂを誘発し、さらにｇＨのエピトープを標的とするＮＡｂを誘発するため（非特許文献２７、２８）、ＰＣだけでも、ＥＣ及びＦＢのＨＣＭＶ感染を防ぐ強力なＮＡｂを誘発できる（非特許文献２０，２８、３１）。

Ｂｒｉｔｔ， Ｗ． ２００８． Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２５：４１７－４７０． Ｍａｎｉｃｋｌａｌ， Ｓ．， Ｖ． Ｃ． Ｅｍｅｒｙ， Ｔ． Ｌａｚｚａｒｏｔｔｏ， Ｓ． Ｂ． Ｂｏｐｐａｎａ， ａｎｄ Ｒ． Ｋ． Ｇｕｐｔａ． ２０１３． Ｔｈｅ "ｓｉｌｅｎｔ" ｇｌｏｂａｌ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２６：８６－１０２． Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｃ．， ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． ２００８． Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ， ２００６． ＭＭＷＲ． Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｅｅｋｌｙ ｒｅｐｏｒｔ ５７：１０１２－１０１５． Ｃａｎｎｏｎ， Ｍ Ｊ．， ａｎｄ Ｋ． Ｆ． Ｄａｖｉｓ． ２００５． Ｗａｓｈｉｎｇ ｏｕｒ ｈａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ． ＢＭＣ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ５：７０． Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｋ． Ｒ．， Ｊ． Ｓ． Ｄｕｒｃｈ， ａｎｄ Ｒ． Ｓ． Ｌａｗｒｅｎｃｅ． ２０００． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ２１ ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ： Ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｍａｋｉｎｇ， Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ２１ ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ： Ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｍａｋｉｎｇ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ （ＤＣ）． Ｃａｎｎｏｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｋ． Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ， Ｄ． Ｌｅｖｉｓ， Ｍ． Ｒ． Ｓｃｈｌｅｉｓｓ， Ｒ． Ｔｈａｃｋｅｒａｙ， ａｎｄ Ｒ． Ｆ． Ｐａｓｓ． ２０１２． Ａｗａｒｅｎｅｓｓ ｏｆ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｃｈｉｌｄ－ｔｏ－ｍｏｔｈｅｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ． Ｐｒｅｖ Ｍｅｄ ５４：３５１ －３５７． Ｒａｗｌｉｎｓｏｎ， Ｗ． Ｄ．， Ｓ． Ｂ． Ｂｏｐｐａｎａ， Ｋ． Ｂ． Ｆｏｗｌｅｒ， Ｄ． Ｗ． Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ， Ｔ． Ｌａｚｚａｒｏｔｔｏ， Ｓ． Ａｌａｉｎ， Ｋ． Ｄａｌｙ， Ｓ． Ｄｏｕｔｒｅ， Ｌ． Ｇｉｂｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． Ｇｉｌｅｓ， Ｊ． Ｇｒｅｅｎｌｅｅ， Ｓ． Ｔ． Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｇ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｌ． Ｈｕｉ， Ｃ． Ａ． Ｊｏｎｅｓ， Ｐ． Ｐａｌａｓａｎｔｈｉｒａｎ， Ｍ． Ｒ． Ｓｃｈｌｅｉｓｓ， Ａ． Ｗ． Ｓｈａｎｄ， ａｎｄ Ｗ． Ｊ． ｖａｎ Ｚｕｙｌｅｎ． ２０１７． Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔｅ： ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １７：ｅ１７７－ｅ１８８． Ｔａｎ， Ｔ．， Ｔ． Ｄａｌｂｙ， Ｋ． Ｆｏｒｓｙｔｈ， Ｓ． Ａ． Ｈａｌｐｅｒｉｎ， Ｕ． Ｈｅｉｎｉｎｇｅｒ， Ｄ． Ｈｏｚｂｏｒ， Ｓ． Ｐｌｏｔｋｉｎ， Ｒ． Ｕｌｌｏａ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ， ａｎｄ Ｃ． Ｈ． Ｗｒｓｉｎｇ ｖｏｎ Ｋｏｎｉｇ． ２０１５． Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ Ｇｌｏｂｅ： Ｒｅｃｅｎｔ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｒｏｍ ２０００ ｔｏ ２０１３． Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ ３４：ｅ２２２－２３２． Ａｎｄｅｒｈｏｌｍ， Ｋ． Ｍ．， Ｃ． Ｊ． Ｂｉｅｒｌｅ， ａｎｄ Ｍ． Ｒ． Ｓｃｈｌｅｉｓｓ． ２０１６． Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ． Ｄｒｕｇｓ ７６：１６２５－１６４５． Ｓｃｈｌｅｉｓｓ， Ｍ． Ｒ． ２０１６． Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ２：１９８－２０７． Ａｄｌｅｒ， Ｓ． Ｐ．， Ｓ． Ｅ． Ｓｔａｒｒ， Ｓ． Ａ． Ｐｌｏｔｋｉｎ， Ｓ． Ｈ． Ｈｅｍｐｆｌｉｎｇ， Ｊ． Ｂｕｉｓ， Ｍ． Ｌ． Ｍａｎｎｉｎｇ， ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｂｅｓｔ． １９９５． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｗｏｍｅｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｂｅａｒｉｎｇ ａｇｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １７１ ：２６－３２． Ｐａｓｓ， Ｒ． Ｆ．， Ｃ． Ｚｈａｎｇ， Ａ． Ｅｖａｎｓ， Ｔ． Ｓｉｍｐｓｏｎ， Ｗ． Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｍ． Ｌ． Ｈｕａｎｇ， Ｌ． Ｃｏｒｅｙ， Ｊ． Ｈｉｌｌ， Ｅ． Ｄａｖｉｓ， Ｃ． Ｆｌａｎｉｇａｎ， ａｎｄ Ｇ． Ｃｌｏｕｄ． ２００９． Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６０：１１９１－１１９９． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｐ． Ｄ．， Ａ． Ｓｔａｎｔｏｎ， Ｅ． ＭｃＣａｒｒｅｌｌ， Ｃ． Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． Ｏｓｍａｎ， Ｍ． Ｈａｒｂｅｒ， Ａ． Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ， Ｇ． Ｊｏｎｅｓ， Ｄ． Ｃ． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｊ． Ｏ’Ｂｅｉｒｎｅ， Ｄ． Ｔｈｏｒｂｕｒｎ， Ｄ． Ｐａｔｃｈ， Ｃ． Ｅ． Ａｔｋｉｎｓｏｎ， Ｓ． Ｐｉｃｈｏｎ， Ｐ． Ｓｗｅｎｙ， Ｍ． Ｌａｎｚｍａｎ， Ｅ． Ｗｏｏｄｆｏｒｄ， Ｅ． Ｒｏｔｈｗｅｌｌ， Ｎ． Ｏｌｄ， Ｒ． Ｋｉｎｙａｎｊｕｉ， Ｔ． Ｈａｑｕｅ， Ｓ． Ａｔａｂａｎｉ， Ｓ． Ｌｕｃｋ， Ｓ． Ｐｒｉｄｅａｕｘ， Ｒ． Ｓ． Ｍｉｌｎｅ， Ｖ． Ｃ． Ｅｍｅｒｙ， ａｎｄ Ａ． Ｋ． Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ． ２０１１． Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ＭＦ５９ ａｄｊｕｖａｎｔ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ： ａ ｐｈａｓｅ ２ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３７７：１２５６－１２６３． Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｄ． Ｉ．， Ｆ． Ｍ． Ｍｕｎｏｚ， Ｓ． Ｔ． Ｃａｌｌａｈａｎ， Ｒ． Ｒｕｐｐ， Ｓ． Ｈ． Ｗｏｏｔｔｏｎ， Ｋ． Ｍ．Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｃ． Ｂ． Ｔｕｒｌｅｙ， Ｌ． Ｒ． Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ， Ｓ． Ｍ． Ｐａｔｅｌ， Ｍ． Ｍ． ＭｃＮｅａｌ， Ｓ． Ｐｉｃｈｏｎ， Ｃ． Ａｍｅｇａｓｈｉｅ， ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｂｅｌｌａｍｙ． ２０１６． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ （ｇＢ） ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ ｇｉｒｌｓ： Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ ３４：３１３－３１９． Ｐｌｏｔｋｉｎ， Ｓ． Ａ． ２０１３． Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ： ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ５６：１４５８－１４６５． Ｓｃｈｌｅｉｓｓ， Ｍ． Ｒ． ２００８． Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２５：３６１ －３８２． Ｔｉｓｃｈｅｒ， Ｂ． Ｋ．， Ｂ． Ｂ． Ｋａｕｆｅｒ， Ｍ． Ｓｏｍｍｅｒ， Ｆ． Ｗｕｓｓｏｗ， Ａ． Ｍ． Ａｒｖｉｎ， ａｎｄ Ｎ． Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅｒ． ２００７． Ａ ｓｅｌｆ－ｅｘｃｉｓａｂｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ｖａｒｉｃｅｌｌａ－ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ａｌｌｏｗｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｅｇｕｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＯＲＦ９． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１ ： １３２００－１３２０８． Ｇａｒｄｎｅｒ， Ｔ． Ｊ．， ａｎｄ Ｄ． Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ． ２０１６． Ｖｉｒｉｏｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ： ａ Ｓｔｉｃｋｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｋｅｓ ａ Ｓｌｉｃｋ Ｇｅｔａｗａｙ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ： ＭＭＢＲ ８０：６６３－６７７． Ｈｅｌｄｗｅｉｎ， Ｅ． Ｅ． ２０１６． ｇＨ／ｇＬ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｔ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８：１ －８． Ｗｕｓｓｏｗ， Ｆ．， Ｆ． Ｃｈｉｕｐｐｅｓｉ， Ｈ． Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｄｉａｍｏｎｄ． ２０１７． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ （Ｂａｓｅｌ） ５． Ｗｉｌｌｅ， Ｐ． Ｔ．， Ａ． Ｊ． Ｋｎｏｃｈｅ， Ｊ． Ａ． Ｎｅｌｓｏｎ， Ｍ． Ａ． Ｊａｒｖｉｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ． ２０１０． Ａ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇＯ－ｎｕｌｌ ｍｕｔａｎｔ ｆａｉｌｓ ｔｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ ｇＨ／ｇＬ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｄ ｉｓ ｕｎａｂｌｅ ｔｏ ｅｎｔｅｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：２５８５－２５９６． Ｗｉｌｌｅ， Ｐ． Ｔ．， Ｔ． Ｗ． Ｗｉｓｎｅｒ， Ｂ． Ｒｙｃｋｍａｎ， ａｎｄ Ｄ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ． ２０１３． Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ （ＨＣＭＶ） ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇＢ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｉｎ ｔｒａｎｓ ａｃｔｉｎｇ ａｓ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ａｓ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． ｍＢｉｏ ４：ｅ００３３２－００３１３． Ｚｈｏｕ， Ｍ．， Ｊ． Ｍ． Ｌａｎｃｈｙ， ａｎｄ Ｂ． Ｊ． Ｒｙｃｋｍａｎ． ２０１５． Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ ａｌｌ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｗｈｅｒｅａｓ ｇＨ／ｇｌ＿／ＵＬ１２８－１３１ ｂｒｏａｄｅｎｓ ｖｉｒｕｓ ｔｒｏｐｉｓｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ． Ｈａｈｎ， Ｇ．， Ｍ． Ｇ． Ｒｅｖｅｌｌｏ， Ｍ． Ｐａｔｒｏｎｅ， Ｅ． Ｐｅｒｃｉｖａｌｌｅ， Ｇ． Ｃａｍｐａｎｉｎｉ， Ａ． Ｓａｒａｓｉｎｉ， Ｍ． Ｗａｇｎｅｒ， Ａ． Ｇａｌｌｉｎａ， Ｇ． Ｍｉｌａｎｅｓｉ， Ｕ． Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ， Ｆ． Ｂａｌｄａｎｔｉ， ａｎｄ Ｇ． Ｇｅｒｎａ． ２００４． Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＵＬ１３１－１２８ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：１００２３－１００３３． Ｐｏｔｚｓｃｈ， Ｓ．， Ｎ． Ｓｐｉｎｄｌｅｒ， Ａ． Ｋ． Ｗｉｅｇｅｒｓ， Ｔ． Ｆｉｓｃｈ， Ｐ． Ｒｕｃｋｅｒ， Ｈ． Ｓｔｉｃｈｔ， Ｎ． Ｇｒｉｅｂ， Ｔ． Ｂａｒｏｔｉ， Ｆ． Ｗｅｉｓｅｌ， Ｔ． Ｓｔａｍｍｉｎｇｅｒ， Ｌ． Ｍａｒｔｉｎ－Ｐａｒｒａｓ， Ｍ． Ｍａｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｈ． Ｗｉｎｋｌｅｒ． ２０１１． Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ７：ｅ１００２１７２ Ｗａｎｇ， Ｄ．， ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ． ２００５． Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｔｒｏｐｉｓｍ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２：１８１５３－１８１５８． Ｃｈｉｕｐｐｅｓｉ， Ｆ．， Ｆ． Ｗｕｓｓｏｗ， Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃ． Ｂｉａｎ， Ｍ． Ｚｈｕｏ， Ａ． Ｒａｊａｋｕｍａｒ， Ｐ． Ａ． Ｂａｒｒｙ， Ｗ． Ｊ． Ｂｒｉｔｔ， Ｒ． Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｄｉａｍｏｎｄ． ２０１５． Ｖａｃｃｉｎｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇＨ／ｇＬ Ｐｅｎｔａｍｅｒ Ｐｏｔｅｎｔｌｙ Ｂｌｏｃｋ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８９：１１８８４－１１８９８． Ｈｅｌｄｗｅｉｎ， Ｅ． Ｅ． ２０１６． ｇＨ／ｇＬ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｔ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８：１ －８． Ｍａｃａｇｎｏ， Ａ．， Ｎ． Ｌ． Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ， Ｆ． Ｖａｎｚｅｔｔａ， Ｅ． Ｄａｎｄｅｒ， Ａ． Ｓａｒａｓｉｎｉ， Ｍ． Ｇ． Ｒｅｖｅｌｌｏ， Ｇ． Ｇｅｒｎａ， Ｆ． Ｓａｌｌｕｓｔｏ， ａｎｄ Ａ． Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ． ２０１０． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８－１３１Ａ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４： １００５－１０１３． Ｐｏｔｚｓｃｈ， Ｓ．， Ｎ． Ｓｐｉｎｄｌｅｒ， Ａ． Ｋ． Ｗｉｅｇｅｒｓ， Ｔ． Ｆｉｓｃｈ， Ｐ． Ｒｕｃｋｅｒ， Ｈ． Ｓｔｉｃｈｔ， Ｎ． Ｇｒｉｅｂ， Ｔ． Ｂａｒｏｔｉ， Ｆ． Ｗｅｉｓｅｌ， Ｔ． Ｓｔａｍｍｉｎｇｅｒ， Ｌ． Ｍａｒｔｉｎ－Ｐａｒｒａｓ， Ｍ． Ｍａｃｈ， ａｎｄ Ｔ． Ｈ． Ｗｉｎｋｌｅｒ． ２０１１． Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ７：ｅ１００２１７２ Ｗｕｓｓｏｗ， Ｆ．， Ｆ． Ｃｈｉｕｐｐｅｓｉ， Ｊ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｊ． Ｃａｍｐｏ， Ｅ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃ． Ｆｌｅｃｈｓｉｇ， Ｍ． Ｎｅｗｅｌｌ， Ｅ． Ｔｒａｎ， Ｊ． Ｏｒｔｉｚ， Ｃ． Ｌａ Ｒｏｓａ， Ａ． Ｈｅｒｒｍａｎｎ， Ｊ． Ｌｏｎｇｍａｔｅ， Ｒ． Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ， Ｐ． Ａ． Ｂａｒｒｙ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｄｉａｍｏｎｄ． ２０１４． Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇＨ／ｇＬ ｐｅｎｔａｍｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘ． ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １０：ｅ１００４５２４． Ｌｏｏｍｉｓ， Ｒ． Ｊ．， Ａ． Ｅ． Ｌｉｌｊａ， Ｊ． Ｍｏｎｒｏｅ， Ｋ． Ａ． Ｂａｌａｂａｎｉｓ， Ｌ． Ａ． Ｂｒｉｔｏ， Ｇ． Ｐａｌｌａｄｉｎｏ， Ｍ． Ｆｒａｎｔｉ， Ｃ． Ｗ． Ｍａｎｄｌ， Ｓ． Ｗ． Ｂａｒｎｅｔｔ， ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ｍａｓｏｎ． ２０１３． Ｖｅｃｔｏｒｅｄ ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇＨ ａｎｄ ｇＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ３１ ：９１９－９２６． Ｗｅｎ， Ｙ．， Ｊ． Ｍｏｎｒｏｅ， Ｃ． Ｌｉｎｔｏｎ， Ｊ． Ａｒｃｈｅｒ， Ｃ． Ｗ． Ｂｅａｒｄ， Ｓ． Ｗ． Ｂａｒｎｅｔｔ， Ｇ． Ｐａｌｌａｄｉｎｏ， Ｐ． Ｗ． Ｍａｓｏｎ， Ａ． Ｃａｒｆｉ， ａｎｄ Ａ． Ｅ． Ｌｉｌｊａ． ２０１４． Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ Ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ ３２：３７９６－３８０４． Ｗｕｓｓｏｗ， Ｆ ， Ｙ． Ｙｕｅ， Ｊ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｊ． Ｄ． Ｄｅｅｒｅ， Ｊ． Ｌｏｎｇｍａｔｅ， Ａ． Ｈｅｒｒｍａｎｎ， Ｐ． Ａ． Ｂａｒｒｙ， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｄｉａｍｏｎｄ． ２０１３． Ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＵＬ１２８ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７ ： １３２２－１３３２．

体液性免疫反応と細胞性免疫反応の両方が先天性ＨＣＭＶ感染を予防するために重要であると考えられているが（３０、４１、５８）、ＨＣＭＶワクチンの開発は、防御の免疫相関が十分に理解されていないこと、複雑な免疫回避メカニズム、及びＨＣＭＶ感染の影響を受けやすい動物モデルがないことによって妨げられている（５、２９、３１、６１）。さらに、効果的なＨＣＭＶワクチンの実現可能性と潜在的な健康への影響は、一次感染又は再感染又はウイルス再活性化に起因する再発感染の結果として先天性ＨＣＭＶ感染が妊婦に発生する可能性があるという難問に照らして、現在活発に議論されている（７、５２）。それでも、既存のＨＣＭＶ免疫による明確に定義されていない保護にもかかわらず、自然に獲得された母体のＨＣＭＶ免疫は、先天性ＨＣＭＶ感染及び疾患に対する実質的な保護を提供すると考えられている（２１、３０、５２）。この前提の下で、先天性感染の発生率と先天性疾患の重症度は、強力な先天性ＨＣＭＶ免疫を誘発することができるワクチンによって減少する可能性があると仮定されている（５２、５８）。

ＨＣＭＶは、先天性感染の主な原因であるだけでなく、移植レシピエントの合併症の一般的な原因でもある。さらに、ＨＣＭＶは、アテローム性動脈硬化症、免疫老化、及び小児急性リンパ芽球性白血病などの他の疾患に関連している。したがって、強力な体液性及び細胞性免疫応答を刺激して、異なる標的集団におけるＨＣＭＶ関連疾患を潜在的に予防する多抗原性ＨＣＭＶワクチン候補の開発が非常に望ましい。本発明は、この分野のニーズを満たす。

要約
一態様では、本開示は、複数のＨＣＭＶ抗原を同時に共発現させるための発現システムに関する。発現システムは、複数のＨＣＭＶ抗原を同時に発現させることができるように、１つ又は複数の連結配列によって連結された、複数のＨＣＭＶ抗原をコードする複数の核酸配列が挿入されたベクターを包含し得る。ベクターは、ＭＶＡベクターなどのウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、連結配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はリボソームスキッピングを媒介する２Ａペプチドをコードする核酸配列である。いくつかの実施形態において、ベクターは、単一のプロモーターが複数の核酸配列の発現を制御するように、複数の核酸配列の前に単一のプロモーターと共に挿入される。いくつかの実施形態において、複数のＨＣＭＶ抗原をコードする複数の核酸配列は、１つのＭＶＡ挿入部位のみに挿入される。いくつかの実施形態において、複数のＨＣＭＶ抗原をコードする複数の核酸配列は、２つ以上のＭＶＡ挿入部位に挿入される。いくつかの実施形態において、ＨＣＭＶ抗原遺伝子配列は、ワクチンウイルス発現についてコドン最適化されて、ＭＶＡ内でのそれらの安定性を増強することができる。

別の態様では、ＨＣＭＶ感染を予防するためのワクチン組成物が提供される。ワクチン組成物は、複数のＨＣＭＶ抗原を同時に共発現することができるベクター、及び医薬的に許容可能な担体、アジュバント、添加剤、又はそれらの組み合わせを包含し得る。いくつかの実施形態において、２つ以上のＨＣＭＶ抗原は、１つ以上の連結配列によって連結され、その結果、複数のＨＣＭＶ抗原は、同時に共発現され得る。いくつかの実施形態では、連結配列は、ＩＲＥＳ及び２Ａペプチドをコードする核酸配列を包含する。いくつかの実施形態において、ベクターは、単一のプロモーターが複数の核酸配列の発現を制御するように、複数の核酸配列の前に単一のプロモーターと共に挿入される。

別の態様では、ＨＣＭＶ感染を予防又は治療する方法が提供される。そのような方法は、有効量のウイルスベクターで細胞を感染させることを含み得、ウイルスベクターは、１つ以上の連結配列によって連結された、複数のＨＣＭＶ抗原をコードする複数の核酸を含む。

別の実施形態では、対象におけるＨＣＭＶ感染を予防又は治療するための強力なＨＣＭＶ特異的体液性及び細胞性免疫応答を誘導する方法が提供される。そのような方法は、治療有効量のワクチンを対象に投与することを包含し得る。ここで、ワクチンは、複数のＨＣＭＶ抗原を同時に共発現することができるベクター、及び医薬的に許容可能な担体、アジュバント、添加剤（例えば、ＣＤ４０Ｌ）又はそれらの組み合わせを含む。

上記の実施形態によれば、ウイルスベクターは改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であり、且つ発現されたＨＣＭＶ抗原は、エンベロープペンタマー複合体の５つのサブユニットすべて（ＰＣ；ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）、及び糖タンパク質Ｈ（ｇＨ））、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、リン酸化タンパク質６５（ｐｐ６５）、及び／又は最初期の１及び２タンパク質（ＩＥ１及びＩＥ２）を包含する。糖タンパク質ｇＭ、ｇＮ、又はｇＯ又はそれらの抗原性フラグメント、又はいずれの他のＨＣＭＶ抗原又はそのフラグメントなどの他の重要な免疫標的もまた、発現システムに含まれ得る。

図面の簡単な説明
図１Ａ－１Ｂは、複数のＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ由来の組換え体のＢＡＣ配列のシームレスな除去を示す。図１Ａは、ＢＡＣベクター除去の図解である。チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子配列とｍＲＦＰ発現カセットのゲノム複製は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）でのＥｎ ｐａｓｓａｎｔ変異誘発により、ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ由来の組換えＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１における耐性マーカー（ｃａｔ）とＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ－のＯｒｉＳ細菌複製起点の間のＢＡＣベクター配列（ｃａｔ、ＯｒｉＳ、ｒｅｐＥ、ｓｏｐＡ／Ｂ／Ｃ、ｃｏｓ、ｌｏｘＰ、ＧＦＰマーカー）に挿入された。ＢＨＫ細胞における組換えＢＡＣベクターからのウイルス再構成後、ゲノム重複は細菌ベクター配列の自発的除去を媒介し、ＴＫ遺伝子はシームレスに回復し、ＭＶＡ－７Ａｇ１をもたらした。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター、Ｐ１１＝ワクシニアＰ１１プロモーター、Ｂ＝ＢＡＣベクター。図１Ｂは、ＰＣＲによるＢＡＣ除去の確認を示す。ＢＨＫ細胞をＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＢＡＣあり）、ＭＶＡ－７Ａｇ１（ＢＡＣなし）又は親ＭＶＡに感染させ、感染細胞から単離されたＤＮＡは、ＴＫ遺伝子に隣接するプライマー（図１Ａに示すＰ１及びＰ２）を使用したＰＣＲによって調査され、ＴＫ遺伝子座（１５９８ｂｐの予想されるフラグメント）の回復を確認し、ｃａｔとｓｏｐＡに特異的なプライマーペア（図１Ａを参照）を確認して、残留ベクター配列の除去を確認する（それぞれ５８０ｂｐと４７６ｂｐの予想されるフラグメント）。感染していないＢＨＫ細胞をＰＣＲ分析の追加コントロールとして使用した。 図２Ａは、ＨＣＭＶのＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５を同時に発現するＭＶＡベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを共発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター（図１Ａ－１Ｄ）では、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ、ｇＨ／ｇＬ、及びｐｐ６５で構成されるＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトが、示されているように遺伝子間領域（ＩＧＲ）６４／６５及び６９／７０とＭＶＡ削除３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（図２Ａ）を生成するため、ｇＢΔＴＭ（ＴＭを含まないｇＢ）の発現カセットを、ＩＧＲ ４４／４５、７／８、１２２／１２３、又は１４８／１４９のいずれかに挿入した。ＩＧＲのＭＶＡ遺伝子指定は、アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づいていた。異なるコーディング配列（Ｐ２Ａ１－Ｐ２Ａ５）は、抗原間のＰ２Ａシグナル配列に使用された。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクター。 図２Ｂは、ＨＣＭＶのＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５を同時に発現するＭＶＡベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを共発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター（図１Ａ－１Ｄ）では、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ、ｇＨ／ｇＬ、及びｐｐ６５で構成されるＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトが、示されているように遺伝子間領域（ＩＧＲ）６４／６５及び６９／７０とＭＶＡ削除３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ２（図２Ｂ）を生成するため、ｇＢΔＴＭ（ＴＭを含まないｇＢ）の発現カセットを、ＩＧＲ ４４／４５、７／８、１２２／１２３、又は１４８／１４９のいずれかに挿入した。ＩＧＲのＭＶＡ遺伝子指定は、アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づいていた。異なるコーディング配列（Ｐ２Ａ１－Ｐ２Ａ５）は、抗原間のＰ２Ａシグナル配列に使用された。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクター。 図２Ｃは、ＨＣＭＶのＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５を同時に発現するＭＶＡベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを共発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター（図１Ａ－１Ｄ）では、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ、ｇＨ／ｇＬ、及びｐｐ６５で構成されるＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトが、示されているように遺伝子間領域（ＩＧＲ）６４／６５及び６９／７０とＭＶＡ削除３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３（図２Ｃ）を生成するため、ｇＢΔＴＭ（ＴＭを含まないｇＢ）の発現カセットを、ＩＧＲ ４４／４５、７／８、１２２／１２３、又は１４８／１４９のいずれかに挿入した。ＩＧＲのＭＶＡ遺伝子指定は、アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づいていた。異なるコーディング配列（Ｐ２Ａ１－Ｐ２Ａ５）は、抗原間のＰ２Ａシグナル配列に使用された。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクター。 図２Ｄは、ＨＣＭＶのＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５を同時に発現するＭＶＡベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを共発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター（図１Ａ－１Ｄ）では、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ、ｇＨ／ｇＬ、及びｐｐ６５で構成されるＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトが、示されているように遺伝子間領域（ＩＧＲ）６４／６５及び６９／７０とＭＶＡ削除３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ４（図２Ｄ）を生成するため、ｇＢΔＴＭ（ＴＭを含まないｇＢ）の発現カセットを、ＩＧＲ ４４／４５、７／８、１２２／１２３、又は１４８／１４９のいずれかに挿入した。ＩＧＲのＭＶＡ遺伝子指定は、アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づいていた。異なるコーディング配列（Ｐ２Ａ１－Ｐ２Ａ５）は、抗原間のＰ２Ａシグナル配列に使用された。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクター。 図２Ｅは、ＨＣＭＶのＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５を同時に発現するＭＶＡベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを共発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター（図１Ａ－１Ｄ）では、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ、ｇＨ／ｇＬ、及びｐｐ６５で構成されるＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトが、示されているように遺伝子間領域（ＩＧＲ）６４／６５及び６９／７０とＭＶＡ削除３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ５（図２Ｅ）は、５つのＰＣサブユニットすべてで構成されるＰ２Ａリンクポリシストロン発現コンストラクトがＩＧＲ ６９／７０に挿入され、ｐｐ６５／ｇＢΔＴＭのＰ２Ａ結合発現コンストラクトをＤｅｌ３サイト又は再構築されたＤｅｌ３サイト（Ｄｅｌ３ ｒｅｓ．）に導入して、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ５（図２Ｅ）を生成した。ＩＧＲのＭＶＡ遺伝子指定は、アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づいていた。異なるコーディング配列（Ｐ２Ａ１－Ｐ２Ａ５）は、抗原間のＰ２Ａシグナル配列に使用された。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクター。 図２Ｆは、ＨＣＭＶのＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５を同時に発現するＭＶＡベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを共発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター（図１Ａ－１Ｄ）では、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ、ｇＨ／ｇＬ、及びｐｐ６５で構成されるＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトが、示されているように遺伝子間領域（ＩＧＲ）６４／６５及び６９／７０とＭＶＡ削除３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ６（図２Ｆ）は、５つのＰＣサブユニットすべてで構成されるＰ２Ａリンクポリシストロン発現コンストラクトがＩＧＲ ６９／７０に挿入され、ｐｐ６５／ｇＢΔＴＭのＰ２Ａ結合発現コンストラクトをＤｅｌ３サイト又は再構築されたＤｅｌ３サイト（Ｄｅｌ３ ｒｅｓ．）に導入して、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ６（図２Ｆ）を生成した。ＩＧＲのＭＶＡ遺伝子指定は、アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づいていた。異なるコーディング配列（Ｐ２Ａ１－Ｐ２Ａ５）は、抗原間のＰ２Ａシグナル配列に使用された。ｍＨ５＝変更されたＨ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクター。 図３は、コントロールベクターを示す。ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫを使用して、ＭＶＡベクトルが生成された。５つのＰＣサブユニットすべてをｇＢ（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ）と一緒に発現するか、ＰＣサブユニットをｐｐ６５（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５）と一緒に発現するか、又はＭＶＡがＰＣサブユニット（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）のみ、ｇＢ（ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ）、又はｐｐ６５（ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）、を発現した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１の構築に使用されたものと同一の挿入部位及び発現コンストラクトを使用した（図２Ａ）。 図４Ａ－４Ｃは、７つの抗原性ＭＶＡワクチンベクターによるＨＣＭＶ抗原発現の安定性試験を示す。コドン最適化ＨＣＭＶ遺伝子配列を含有した図２Ａ－２Ｄに示すように、７つの抗原ワクチンベクターＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ２、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３、及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ４の異なるクローン（＃）は、ＢＨＫ細胞での１０回のウイルス継代を介して低い感染多重度で増殖した。１０継代（１－１０）のウイルスを使用してＢＨＫ細胞を感染させ、感染したＢＨＫ細胞の全細胞溶解物を、個々の抗原に特異的なポリクローナル（ＵＬ１３１Ａ）及びモノクローナル（ｇＨ、ＵＬ１３０、ｐｐ６５、ｇＢ）抗体を用いたイムノブロットによって評価した。以前に生成されたＭＶＡ－ｇＢ及びＭＶＡ－ＰＣベクター（８１）に感染したＢＨＫ細胞、並びに感染していない細胞をコントロールとして使用した。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールのために検出された。ＰＰ＝前駆体タンパク質；ＣＴ＝Ｃ末端切断産物。 図５Ａ及び５Ｂは、コドン最適化されていないＨＣＭＶ抗原を用いた７つの抗原性ＭＶＡベクターによるＨＣＭＶ抗原発現の安定性試験を示す。コドン最適化ＰＣサブユニット遺伝子配列と非コドン最適化ｐｐ６５及びｇＢ遺伝子配列を含有したＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１^ＮＣＯ（＃６７及び＃６８）及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３^ＮＣＯベクターの２つの異なるクローンは、ＢＨＫ細胞での１０回のウイルス継代を介して低い感染多重度で増殖した。ＢＨＫ細胞での１０回のウイルス継代を介して低い感染多重度で増殖しました。１０継代（１－１０）のウイルスを使用してＢＨＫ細胞を感染させ、感染細胞の全細胞溶解物を、個々の抗原に特異的であるポリクローナル（ＵＬ１３１Ａ、ｇＬ、ＵＬ１２８）及びモノクローナル（ｇＨ、ＵＬ１３０、ｐｐ６５、ｇＢ）抗体を用いたイムノブロットによって評価した。以前に生成されたＭＶＡ－ｇＢ及びＭＶＡ－ＰＣベクター（８１）に感染したＢＨＫ細胞、並びに感染していないＢＨＫ細胞をコントロールとして使用した。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールのために検出された。理由は不明だが、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３^ＮＣＯの継代４及び６では全体的に非常に少量のタンパク質しか検出されなかったことに注意されたい。ＰＰ＝前駆体タンパク質；ＣＴ＝Ｃ末端切断産物。 図６Ａは、ＭＶＡＢ－７Ａｇ１とコントロールベクターによるＨＣＭＶ抗原発現の比較を示す。図６Ａはイムノブロット分析を示す。ＭＶＡ－７Ａｇ１（図２Ａ；ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として示される６Ａ）又は抗原サブセットのみを発現するコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡＢ－ＰＣ／ｐｐ６５、図３）に感染したＢＨＫ細胞の細胞溶解物又は単一抗原（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５、図３）は、ＨＣＭＶ抗原に特異的なポリクローナル（ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３１Ａ）及びモノクローナル（ｇＨ、ＵＬ１３０、ｇＢ、ｐｐ６５）抗体を使用したイムノブロットによって評価された。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールとして検出された。ＰＰ＝前駆体タンパク質；ＣＴ＝ｇＢ Ｃ末端切断産物。図６Ｂは、フローサイトメトリー分析を示す。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１又はコントロールベクターに感染した、透過処理されていない生ＢＨＫ細胞は、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ（１Ｂ２、１２Ｅ２）又はＵＬ１３０／１３１Ａ（５４Ｅ１１）によって形成された立体配座エピトープ、ＵＬ１２８（１３Ｂ５）内のエピトープ、又はｇＨ内のエピトープ（１８Ｆ１０、２１Ｅ９、６２－１１、２－８０）を標的とするモノクローナルＮＡｂを使用した細胞表面フローサイトメトリー分析によって評価された。Ｘ軸は蛍光強度のｌｏｇ１０を表し、ｙ軸はセル数を表す。蛍光マーカーＶｅｎｕｓ（ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ）を発現するＭＶＡに感染したＢＨＫ細胞、又は感染していない細胞を、図６Ａ及び６Ｂのコントロールとして分析した。 図６Ｂは、ＭＶＡＢ－７Ａｇ１とコントロールベクターによるＨＣＭＶ抗原発現の比較を示す。ＭＶＡ－７Ａｇ１（図２Ａ；ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として示される６Ａ）又は抗原サブセットのみを発現するコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡＢ－ＰＣ／ｐｐ６５、図３）に感染したＢＨＫ細胞の細胞溶解物又は単一抗原（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５、図３）は、ＨＣＭＶ抗原に特異的なポリクローナル（ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３１Ａ）及びモノクローナル（ｇＨ、ＵＬ１３０、ｇＢ、ｐｐ６５）抗体を使用したイムノブロットによって評価された。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールとして検出された。ＰＰ＝前駆体タンパク質；ＣＴ＝ｇＢ Ｃ末端切断産物。図６Ｂは、フローサイトメトリー分析を示す。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１又はコントロールベクターに感染した、透過処理されていない生ＢＨＫ細胞は、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ（１Ｂ２、１２Ｅ２）又はＵＬ１３０／１３１Ａ（５４Ｅ１１）によって形成された立体配座エピトープ、ＵＬ１２８（１３Ｂ５）内のエピトープ、又はｇＨ内のエピトープ（１８Ｆ１０、２１Ｅ９、６２－１１、２－８０）を標的とするモノクローナルＮＡｂを使用した細胞表面フローサイトメトリー分析によって評価された。Ｘ軸は蛍光強度のｌｏｇ１０を表し、ｙ軸はセル数を表す。蛍光マーカーＶｅｎｕｓ（ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ）を発現するＭＶＡに感染したＢＨＫ細胞、又は感染していない細胞を、図６Ａ及び６Ｂのコントロールとして分析した。 図７は、ＣＥＦにおけるＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１のウイルス増殖後の抗原発現の安定性を示している。コドン最適化ＨＣＭＶ遺伝子配列を有する図２Ａに示されるＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１ベクターは、ＣＥＦ細胞上の１０回のウイルス継代を介して低い感染多重度で増殖した。最初の接種物（０）及び１０回のウイルス継代（１－１０）からのウイルスを使用してＢＨＫ細胞を感染させ、感染したＢＨＫ細胞の全細胞溶解物を個々の抗原に特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体を用いたイムノブロットによって評価した。ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓに感染したＢＨＫ細胞又は感染していない細胞をコントロールとして分析した。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールのために検出された。ＰＰ＝ｇＢ前駆体タンパク質；ＣＴ＝Ｃ末端切断産物。 図８Ａ及び８Ｂは、ＢＡＣベクター除去後のＭＶＡ－７Ａｇ１（図８Ａ）及びＭＶＡ－７Ａｇ５（図８Ｂ）による抗原発現の安定性を示す。ＢＡＣ配列が除去されたＭＶＡ－７Ａｇ１及びＭＶＡ－７Ａｇ５（ＢＡＣの除去については図１を参照）及びコドン最適化ＨＣＭＶ遺伝子配列は、ＣＥＦ細胞での１０回のウイルス継代を介して低い感染多重度で増殖した。最初の接種物（０）及び１０回のウイルス継代（１－１０）からのウイルスを使用してＢＨＫ細胞を感染させ、感染したＢＨＫ細胞の全細胞溶解物を個々の抗原に特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体を用いたイムノブロットによって評価した。ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓに感染したＢＨＫ細胞又は感染していない細胞をコントロールとして分析した。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールのために検出された。ＰＰ＝ｇＢ前駆体タンパク質；ＣＴ＝Ｃ末端切断産物。 図９Ａは、マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４－５）は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ここでは図のパネルではＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として指定）又はコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で４週間ごとに３回ワクチン接種された。そして、ＨＣＭＶ特異的血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０；幾何平均力価（ＧＭＴ））は、補体の供給源としての５％モルモット血清の非存在下（－）又は存在下（＋）、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（図９Ａ、９Ｂ）に対するＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞のワクチン群について測定された。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された一方、補体の存在下又は非存在下でのＮＡｂ力価の差は、二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図９Ｂは、マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４－５）は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ここでは図のパネルではＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として指定）又はコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で４週間ごとに３回ワクチン接種された。そして、ＨＣＭＶ特異的血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０；幾何平均力価（ＧＭＴ））は、補体の供給源としての５％モルモット血清の非存在下（－）又は存在下（＋）、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（図９Ａ、９Ｂ）に対するＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞のワクチン群について測定された。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された一方、補体の存在下又は非存在下でのＮＡｂ力価の差は、二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図９Ｃは、マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４－５）は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ここでは図のパネルではＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として指定）又はコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で４週間ごとに３回ワクチン接種された。そして、ＨＣＭＶ特異的血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０；幾何平均力価（ＧＭＴ））は、補体の供給源としての５％モルモット血清の非存在下（－）又は存在下（＋）、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（図９Ａ、９Ｂ）、ＴＲ（図９Ｃ、９Ｄ）、Ｔｏｗｎｅ（図９Ｅ）、及びＡＤ１６９（図９Ｆ）に対するＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞のワクチン群について測定された。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された一方、補体の存在下又は非存在下でのＮＡｂ力価の差は、二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図９Ｄは、マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４－５）は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ここでは図のパネルではＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として指定）又はコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で４週間ごとに３回ワクチン接種された。そして、ＨＣＭＶ特異的血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０；幾何平均力価（ＧＭＴ））は、補体の供給源としての５％モルモット血清の非存在下（－）又は存在下（＋）、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（図９Ａ、９Ｂ）、ＴＲ（図９Ｃ、９Ｄ）、Ｔｏｗｎｅ（図９Ｅ）、及びＡＤ１６９（図９Ｆ）に対するＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞のワクチン群について測定された。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された一方、補体の存在下又は非存在下でのＮＡｂ力価の差は、二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図９Ｅは、マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４－５）は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ここでは図のパネルではＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として指定）又はコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で４週間ごとに３回ワクチン接種された。そして、ＨＣＭＶ特異的血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０；幾何平均力価（ＧＭＴ））は、補体の供給源としての５％モルモット血清の非存在下（－）又は存在下（＋）、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（図９Ａ、９Ｂ）、ＴＲ（図９Ｃ、９Ｄ）、Ｔｏｗｎｅ（図９Ｅ）、及びＡＤ１６９（図９Ｆ）に対するＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞のワクチン群について測定された。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された一方、補体の存在下又は非存在下でのＮＡｂ力価の差は、二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図９Ｆは、マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝４－５）は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ここでは図のパネルではＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５として指定）又はコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で４週間ごとに３回ワクチン接種された。そして、ＨＣＭＶ特異的血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０；幾何平均力価（ＧＭＴ））は、補体の供給源としての５％モルモット血清の非存在下（－）又は存在下（＋）、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（図９Ａ、９Ｂ）、ＴＲ（図９Ｃ、９Ｄ）、Ｔｏｗｎｅ（図９Ｅ）、及びＡＤ１６９（図９Ｆ）に対するＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５細胞のワクチン群について測定された。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された一方、補体の存在下又は非存在下でのＮＡｂ力価の差は、二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図１０Ａ－１０Ｄは、ＡＤＣＣを媒介する体液性免疫応答と、ＭＶＡＢ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導される結合抗体を示す。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＭＶＡ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）又は図９に記載されているコントロールベクターで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫血清を、ＡＤＣＣ及び結合抗体について評価した。図１０Ａ－１０ＢはＡＤＣＣを示す。免疫化されたマウス血清サンプルの段階希釈を、ＡＤＣＣ代理レポーターアッセイを使用して、ＴＢ４０／Ｅ（図１０Ａ）又はＴＲ（図１０Ｂ）に感染したＡＲＰＥ－１９細胞への結合後にＡＤＣＣを誘導する能力について調べた。バーは、重複の標準偏差を表す。図１０Ｃ－１ＯＤは結合抗体を示す。ｇＢ特異的（１０Ｃ）及びＰＣ特異的（１ＯＤ）結合ｌｇＧエンドポイント力価は、精製されたｇＢ及びＰＣタンパク質を使用したＥＬＩＳＡによって評価された。点線は、分析された最小血清希釈率を示す。バーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）を使用して計算された。 図１１Ａ－１１Ｃは、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターによって誘導されたＴ細胞応答を示す。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）及びコントロールベクターで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫血清をＴ細胞応答について評価した。Ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答は、ＨＣＭＶのｐｐ６５（図１１Ａ）、ｇＢ（図１１Ｂ）、及びＰＣサブユニット（図１１Ｃ）の以前に記載されたマウスＨ２－ｂ制限免疫反応性ペプチドを利用するＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴによって決定された。水平線はグループ平均を表し、バーは標準偏差を表す。一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して、グループ間の差異を調査した（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）。図１１Ｃでは、１匹のマウスを除いて、すべての動物がしきい値よりも高いＩＦＮγ応答を示したため、グループ間の差異を評価できなかったことに注意されたい。 図１２Ａは、マウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＣＭＶ免疫応答の持続性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスはｉ．ｐ．標準又は低用量（ＬＤ）のＭＶＡ－７Ａｇ１（ＭＶＡ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）、又は標準用量のみのコントロールベクターＭＶＡ－ＰＣ及びＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで４週間間隔で３回（三角形）免疫した。図１２Ａ－１２ＣはＮＡｂ力価を示す。免疫後３０週間の示された時点で、５０％感染を予防したＮＡｂ力価（ＮＴ５０）を、５％モルモット補体の非存在下（１２Ａ）又は存在下（１２Ｂ）のＭＲＣ－５細胞上、及び補体の非存在下（１２Ｃ）のＡＲＰＥ－１９細胞上の、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対して測定した。図１２Ａ～１２Ｃのバーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して計算された。 図１２Ｂは、マウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＣＭＶ免疫応答の持続性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスはｉ．ｐ．標準又は低用量（ＬＤ）のＭＶＡ－７Ａｇ１（ＭＶＡ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）、又は標準用量のみのコントロールベクターＭＶＡ－ＰＣ及びＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで４週間間隔で３回（三角形）免疫した。図１２Ａ－１２ＣはＮＡｂ力価を示す。免疫後３０週間の示された時点で、５０％感染を予防したＮＡｂ力価（ＮＴ５０）を、５％モルモット補体の非存在下（１２Ａ）又は存在下（１２Ｂ）のＭＲＣ－５細胞上、及び補体の非存在下（１２Ｃ）のＡＲＰＥ－１９細胞上の、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対して測定した。３０週目に追加の追加免疫を行った後、ｐｐ６５及びｇＢペプチドライブラリーを利用したＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴにより、免疫したマウスのｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答を測定した。図１２Ａ～１２Ｃのバーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して計算された。 図１２Ｃは、マウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＣＭＶ免疫応答の持続性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスはｉ．ｐ．標準又は低用量（ＬＤ）のＭＶＡ－７Ａｇ１（ＭＶＡ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）、又は標準用量のみのコントロールベクターＭＶＡ－ＰＣ及びＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで４週間間隔で３回（三角形）免疫した。図１２Ａ－１２ＣはＮＡｂ力価を示す。免疫後３０週間の示された時点で、５０％感染を予防したＮＡｂ力価（ＮＴ５０）を、５％モルモット補体の非存在下（１２Ａ）又は存在下（１２Ｂ）のＭＲＣ－５細胞上、及び補体の非存在下（１２Ｃ）のＡＲＰＥ－１９細胞上の、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対して測定した。３０週目に追加の追加免疫を行った後、ｐｐ６５及びｇＢペプチドライブラリーを利用したＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴにより、免疫したマウスのｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答を測定した。図１２Ａ～１２Ｃのバーは、９５％信頼区間の幾何平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して計算された。 図１２Ｄは、マウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＣＭＶ免疫応答の持続性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスはｉ．ｐ．標準又は低用量（ＬＤ）のＭＶＡ－７Ａｇ１（ＭＶＡ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）、又は標準用量のみのコントロールベクターＭＶＡ－ＰＣ及びＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで４週間間隔で３回（三角形）免疫した。図１２Ａ－１２ＣはＮＡｂ力価を示す。免疫後３０週間の示された時点で、５０％感染を予防したＮＡｂ力価（ＮＴ５０）を、５％モルモット補体の非存在下（１２Ａ）又は存在下（１２Ｂ）のＭＲＣ－５細胞上、及び補体の非存在下（１２Ｃ）のＡＲＰＥ－１９細胞上の、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対して測定した。図１２Ｄは、ワクシニアベクターによって誘導されたｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞応答を示す。３０週目に追加の追加免疫を行った後、ｐｐ６５及びｇＢペプチドライブラリーを利用したＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴにより、免疫したマウスのｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答を測定した。図１２Ｄのバーは、標準偏差のある平均を表す。各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して計算された。 図１３Ａ－１３Ｃは、ウイルス継代後のＭＶＡ－７Ａｇ１の免疫原性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８）は、ＣＥＦでの１０回のウイルス継代の前後に由来するＭＶＡ－７Ａｇ１で、４週間間隔で３回（三角形）ｉ．ｐ免疫された。図１３Ａ－１３Ｂは、モルモット補体の非存在下でのＡＲＰＥ－１９細胞、及び５％モルモット補体の非存在下及び存在下でのＭＲＣ－５ ＦＢでＴＢ４０／Ｅに対して測定されたＮＴ５０力価を示す。図１３Ｃは、ｐｐ６５及びｇＢライブラリーを使用してＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴを介して免疫化された動物について確認されたＴ細胞応答を示す。ＡとＢの点線は、分析された最小血清希釈率を示す。図１３Ａ及び１３Ｂのバーは、幾何平均の９５％の信頼区間（ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）を表す。図１３Ｃのバーは、標準偏差のある平均値を表す。図１３Ａと１３Ｂの各グループを比較する差異の統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。図１３Ｃのグループ間の差は、多重ｔ検定によって計算された（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）。 図１４Ａ－１４Ｃは、マウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ４、ＭＶＡ－７Ａｇ５、及びＭＶＡ－７Ａｇ６によって誘導されるＨＣＭＶ免疫応答を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＭＶＡ－７Ａｇ４、ＭＶＡ－７Ａｇ５、又はＭＶＡ－７Ａｇ６で、４週間間隔で３回（三角形）ｉ．ｐ．免疫した。そして、５０％感染を予防したＮＡｂ力価（ＮＴ５０）を、補体の非存在下でのＡＲＰＥ－１９細胞（１４Ａ）で、及び５％モルモット補体の非存在下又は存在下でのＭＲＣ－５細胞（１４Ｂ）で、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対して測定した。図１４Ｃは、ｐｐ６５及びｇＢライブラリーを使用してＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴを介して免疫化された動物について確認されたＴ細胞応答を示す。図１４Ａ及び１４Ｂの点線は、分析された最小血清希釈率を示す。図１４Ａ及び１４Ｂのバーは、幾何平均の９５％の信頼区間（ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）を表す。図１４Ｃのバーは、標準偏差のある平均値を表す。グループ間の差は、多重ｔ検定によって計算された（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）。 図１５Ａ及び１５Ｂは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を示す。ヒトＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２ Ｔｇ、１５Ａ）又はＨＬＡ－Ｂ＊０７０２（Ｂ７ Ｔｇ、１５Ｂ）クラスＩ分子を発現するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）を、ＭＶＡ－７Ａｇ１で、又はコントロールとしてＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで、４週間間隔で２回免疫した。追加免疫の１週間後、抗原特異的Ｔ細胞応答は、ｐｐ６５及びｇＢ特異的ペプチドライブラリー、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１もしくはＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限免疫優勢ペプチドエピトープ、又はｇＢ又はＰＣのマウスＨ２－ｂ制限ペプチドのプール、を使用してＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによって決定された。バーは、標準偏差のある平均値を表す。グループ間の差の有意性は、二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。 図１６Ａは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ａは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２（Ｂ７）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）がＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で４週間間隔で２回免疫されたことを示す。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図に示されているのは、さまざまな刺激でＢ７ Ｔｇ免疫マウスから脾細胞を刺激した後のＩＦＮγ（図１６Ａ）を分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合である。水平バーは中央値を表す。ペプチド刺激に応答するＣＤ８＋ Ｔ細胞の平均合計パーセンテージは、各円グラフの下に示されている。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１６Ｂは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ｂは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２（Ｂ７）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）がＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で４週間間隔で２回免疫されたことを示す。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図に示されているのは、さまざまな刺激でＢ７ Ｔｇ免疫マウスから脾細胞を刺激した後のＴＮＦα（図１６Ｂ）を分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合である。ペプチド刺激に応答するＣＤ８＋ Ｔ細胞の平均合計パーセンテージは、各円グラフの下に示されている。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１６Ｃは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ｃは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２（Ｂ７）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）がＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で４週間間隔で２回免疫されたことを示す。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図に示されているのは、さまざまな刺激でＢ７ Ｔｇ免疫マウスから脾細胞を刺激した後のＩＬ２（図１６Ｃ）を分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合である。ペプチド刺激に応答するＣＤ８＋ Ｔ細胞の平均合計パーセンテージは、各円グラフの下に示されている。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１６Ｄは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ｄ－１６Ｆは、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡＢ－ｐｐ６５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫したＢ７マウスにおいて、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限ｐｐ６５ペプチドエピトープ（図１６Ｄ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２サイトカインのすべての組み合わせを産生する抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示す。水平バーは中央値を表す。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１６Ｅは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ｅは、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡＢ－ｐｐ６５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫したＢ７マウスにおいて、ｐｐ６５特異的ペプチドライブラリー（図１６Ｅ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２サイトカインのすべての組み合わせを産生する抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示す。水平バーは中央値を表す。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１６Ｆは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ｆは、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡＢ－ｐｐ６５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫したＢ７マウスにおいて、ＰＣ特異的ペプチドライブラリー（図１６Ｆ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２サイトカインのすべての組み合わせを産生する抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示す。水平バーは中央値を表す。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１６Ｇは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。図１６Ｇは、ＭＶＡ－７Ａｇ１又はＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５で免疫したＢ７マウスのｐｐ６５_{ｅｐｉｔｏｐｅ}、ｐｐ６５_{ｌｉｂｒａｒｙ}、又はＰＣ_{ｌｉｂｒａｒｙ}に対する全多機能応答の中での各多機能サブセットの相対的な寄与を示す円グラフである。各円グラフは、３つの異なる抗原刺激に対する免疫化されたマウス全体の平均応答を表す。ペプチド刺激に応答するＣＤ８＋ Ｔ細胞の平均合計パーセンテージは、各円グラフの下に示されている。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ａは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図に示されているのは、異なる刺激でＡ２ Ｔｇ免疫マウスから脾細胞を刺激した後のＩＦＮγ（図１７Ａ）を分泌するＣＤＳ＋ Ｔ細胞のパーセンテージである。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ｂは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図に示されているのは、異なる刺激でＡ２ Ｔｇ免疫マウスから脾細胞を刺激した後のＴＮＦα（図１７Ｂ）を分泌するＣＤＳ＋ Ｔ細胞のパーセンテージである。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ｃは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図に示されているのは、異なる刺激でＡ２ Ｔｇ免疫マウスから脾細胞を刺激した後のＩＬ－２（図１７Ｃ）を分泌するＣＤＳ＋ Ｔ細胞のパーセンテージである。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ｄは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図１７Ｄは、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫したＢ７マウスにおいて、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限ペプチドエピトープ（図１７Ｄ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２サイトカインのすべての組み合わせを産生する抗原特異的ＣＤＳ＋ Ｔ細胞の頻度を示す。水平バーは中央値を表す。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ｅは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図１７Ｅは、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫したＢ７マウスにおいて、ｐｐ６５特異的ペプチドライブラリー（図１７Ｅ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２サイトカインのすべての組み合わせを産生する抗原特異的ＣＤＳ＋ Ｔ細胞の頻度を示す。水平バーは中央値を表す。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ｆは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図１７Ｆは、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫したＢ７マウスにおいて、ＰＣ特異的ペプチドライブラリー（図１７Ｆ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２サイトカインのすべての組み合わせを産生する抗原特異的ＣＤＳ＋ Ｔ細胞の頻度を示す。水平バーは中央値を表す。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１７Ｇは、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限多機能ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２）トランスジェニックマウス（ｎ＝５）は、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５（ｎ＝５）又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ（ｎ＝１）で、４週間間隔で２回免疫された。免疫の１週間後、ｐｐ６５及びＰＣ特異的ペプチドライブラリー、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ｐｐ６５ペプチドエピトープで刺激した後、マルチサイトカイン－ＩＣＳによって抗原特異的Ｔ細胞応答を評価した。図１７Ｇは、ＭＶＡ－７Ａｇ１又はＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５で免疫したＡ２マウスのｐｐ６５_{ｅｐｉｔｏｐｅ}、ｐｐ６５_{ｌｉｂｒａｒｙ}、又はＰＣ_{ｌｉｂｒａｒｙ}に対する全多機能応答における各多機能サブセットの相対的な寄与を示す円グラフである。各円グラフは、３つの異なる抗原刺激に対する免疫化されたマウス全体の平均応答を表す。ペプチド刺激に応答するＣＤＳ＋ Ｔ細胞の平均合計パーセンテージは、各円グラフの下に示されている。多機能サブセットと機能（Ｆｎ°）は凡例に示されている。グループ間の差の有意性は、多重ｔ検定を使用して計算された。 図１８Ａは、８つの抗原性ＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡの構築を示している。示されているのは、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１（図１８Ａ）のＰＣサブユニットｇＢ、ｐｐ６５、及び ＨＣＭＶのＩＥ１を同時に発現する構造である。これらの８つのＨＣＭＶ抗原のＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトは、示されているように、異なるＩＧＲ（４４／４５、６４／６５、６９／７０、１４８／１４９）及びＭＶＡ^ＢＡＣ－ＴＫのＭＶＡ Ｄｅｌ３部位に挿入された。異なるＨＣＭＶ抗原間のＰ２Ａシグナル配列には、異なるコード配列（Ｐ２Ａ１－６）を使用した。ｍＨ５＝ワクシニア改変Ｈ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクトル。 図１８Ｂは、８つの抗原性ＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡの構築を示している。示されているのは、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ２（図１８Ｂ）、ｐｐ６５、及び ＨＣＭＶのＩＥ１を同時に発現する構造である。これらの８つのＨＣＭＶ抗原のＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトは、示されているように、異なるＩＧＲ（４４／４５、６４／６５、６９／７０、１４８／１４９）及びＭＶＡ^ＢＡＣ－ＴＫのＭＶＡ Ｄｅｌ３部位に挿入された。異なるＨＣＭＶ抗原間のＰ２Ａシグナル配列には、異なるコード配列（Ｐ２Ａ１－６）を使用した。ｍＨ５＝ワクシニア改変Ｈ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクトル。 図１８Ｃは、８つの抗原性ＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡの構築を示している。示されているのは、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３（図１８Ｃ）のＰＣサブユニットｇＢ、ｐｐ６５、及び ＨＣＭＶのＩＥ１を同時に発現する構造である。これらの８つのＨＣＭＶ抗原のＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトは、示されているように、異なるＩＧＲ（４４／４５、６４／６５、６９／７０、１４８／１４９）及びＭＶＡ^ＢＡＣ－ＴＫのＭＶＡ Ｄｅｌ３部位に挿入された。異なるＨＣＭＶ抗原間のＰ２Ａシグナル配列には、異なるコード配列（Ｐ２Ａ１－６）を使用した。ｍＨ５＝ワクシニア改変Ｈ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクトル。 図１８Ｄは、８つの抗原性ＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡの構築を示している。示されているのは、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４（図１８Ｄ）のＰＣサブユニットｇＢ、ｐｐ６５、及び ＨＣＭＶのＩＥ１を同時に発現する構造である。これらの８つのＨＣＭＶ抗原のＰ２Ａ結合、ポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトは、示されているように、異なるＩＧＲ（４４／４５、６４／６５、６９／７０、１４８／１４９）及びＭＶＡ^ＢＡＣ－ＴＫのＭＶＡ Ｄｅｌ３部位に挿入された。異なるＨＣＭＶ抗原間のＰ２Ａシグナル配列には、異なるコード配列（Ｐ２Ａ１－６）を使用した。ｍＨ５＝ワクシニア改変Ｈ５プロモーター；Ｂ＝ＢＡＣベクトル。 図１９は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１によるＨＣＭＶ抗原発現の例を示す。検出のためにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を使用して、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１又はＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１の異なるクローンに感染したＢＨＫ細胞におけるＨＣＭＶ抗原発現を比較するための免疫ブロットを示す。ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓに感染したＢＨＫ細胞と感染していない細胞をコントロールとして使用した。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質がローディングコントロールのために検出された。 図２０は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ２によるＨＣＭＶ抗原発現を示す。示されているのは、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ２又はコンロールとしてのＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓに感染したＢＨＫ細胞におけるＨＣＭＶ抗原の検出のためのイムノブロットである。抗原検出にはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を使用した。ＰＰ＝前駆体タンパク質；ＣＴ＝Ｃ末端切断産物。 図２１は、８つの抗原ベクターＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４によるＨＣＭＶ抗原発現を示す。ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４によって発現される８つのＨＣＭＶ抗原を検出するためのイムノブロットが示される。ＢＨＫ細胞を２つの異なるストック（Ｓ１及びＳ１）からのＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３又はＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４に感染させ、感染したＢＨＫ細胞の全細胞溶解物をモノクローナル（ｇＨ、ｇＢ、ｐｐ６５、ＵＬ１３０、ＩＥ１）及びポリクローナル（ＵＬ１２８、ｇｌ、ＵＬ１３１Ａ）抗体を使用したイムノブロットで分析した。７抗原ベクターＭＶＡ－７Ａｇ５又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓに感染した細胞、又は感染していない細胞をコントロールのために分析した。矢印は、ＨＣＭＶサブユニットのおおよその予想タンパク質サイズを示す。ＰＰ＝前駆体タンパク質 ＣＴ＝Ｃ末端切断産物。 図２２は、ウイルス増殖後のＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３によるＨＣＭＶ抗原発現を示す。示されているのは、ＣＥＦでのウイルス継代の前（ＰＯ）と後（Ｐ１０）に由来するＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３によるＨＣＭＶ抗原発現を比較するためのイムノブロットである。ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ感染細胞又は非感染細胞をコンロールについて分析した。ワクシニアウイルスＢＲ５タンパク質をローディングコントロールについて分析した。矢印は、個々のＨＣＭＶ抗原のおおよその予想タンパク質サイズを示す。 図２３Ａ～２３Ｅは、マウスにおいて８つの抗原ベクターＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４によって誘導されたＮＡｂ及びＨＬＡ制限Ｔ細胞応答を示す。図２３Ａ及び２３ＢはＮＡｂ応答を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４、又はＭＶＡ－７Ａｇ５（コントロールとして）を１か月間隔で２回接種し、血清ＮＡｂ力価（ＮＴ５０）は、５％モルモット補体の非存在下（Ｃ－）又は存在下（Ｃ＋）でＡＲＰＥ－１９細胞又はＭＲＣ－５線維芽細胞上のＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対して測定された。複数のｔ検定を使用してワクチングループ間で有意差は決定されなかった（ＮＳ＝ｐ＞０．０５）。バーは、幾何平均の９５％信頼区間を表す。図２３Ｃ－２３Ｅは、ＨＬＡ－^Ｂ＊０７０２トランスジェニック（Ｂ７ Ｔｇ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３）において８つの抗原ベクターＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４によって誘導される細胞性応答を示す。ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４、又はＭＶＡ－７Ａｇ５（コントロールとして）で２回免疫したＢ７ Ｔｇマウスの脾細胞を、ＨＬＡ－Ｂ＊０７制限エピトープ、又はｐｐ６５特異的又はＰＣ特異的ペプチドライブラリーでｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した。細胞内サイトカイン染色を実施して、ペプチド刺激後にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、又はＩＬ－２を分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を定量化した。模擬刺激はＤＭＳＯで行った。バーは、標準偏差の平均値を表す。 図２４は、Ｐ２Ａシーケンスの例を示す。図２、３、及び１８に示すように、本明細書では、異なるＤＮＡ配列（Ｐ２Ａ１～Ｐ２Ａ６）を使用して、ＨＣＭＶ抗原間のＰ２Ａシグナルペプチドをコード化した。下の６行は、ヌクレオチドが変異した異なるＰ２Ａシグナル配列を示す。一番上の行は、Ｐ２Ａペプチドのアミノ酸配列を示す。

詳細な説明
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染の予防又は治療に使用するための発現システム、ベクター、ワクチンが本明細書で提供される。以下で詳細に説明する発現システム、ベクター、及びワクチンは、ＨＣＭＶ血清陽性及び血清陰性の妊婦、造血幹細胞（ＨＳＣＴ）及び固形臓器移植（ＳＯＴ）のレシピエントを包含するがこれらに限定されない、さまざまな標的集団におけるＨＣＭＶ感染及び関連疾患を予防又は治療するため、ＨＣＭＶ感染に対する強力な体液性及び細胞性免疫応答を生成するため、使用できる可能性がある。本開示は、ＨＣＭＶ感染に対する強力な体液性及び細胞性免疫応答を刺激するための、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）又は他の発現システム、ベクター、又はワクチンによる複数のＨＣＭＶ抗原又はそのフラグメントの同時発現に関する。例えば、体液性及び細胞性免疫応答には、中和抗体、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はＣＤＶを促進する抗体、及び多機能ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が含まれる。いくつかの実施形態において、７つ以上のＨＣＭＶ抗原は、ＭＶＡによって同時に共発現される。ＭＶＡを使用したこのようなマルチ抗原発現システム又はワクチン戦略は、他の感染症や癌のワクチンを開発するために適用できる。

本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、ＨＣＭＶ抗原は、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのウイルスベクターによって発現され得る。個々のＨＣＭＶ抗原は、共発現されたサブユニットが個々の抗原に「自己切断」され得るように、切断又は自己プロセシング配列によって連結され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の発現システム、ベクター、ワクチンは、１つ以上の発現カセットを包含し、そのそれぞれは、単一のプロモーター及び２つ以上のＨＣＭＶ抗原をコードする配列を包含する。別の実施形態では、ＨＣＭＶ抗原の２つ以上は、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列によって一緒に連結され、その結果、ＨＣＭＶの２つ以上は、単一のプロモーターのみを使用する単一の転写物を介して発現される。その結果、複数のＨＣＭＶ抗原が同時に共発現し、ＨＣＭＶ抗原の発現に必要なプロモーターエレメントと挿入部位の数が制限されます。特定の実施形態において、各発現カセットは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はさらに多くの数のＨＣＭＶ抗原を包含し、その発現は、単一のプロモーターの制御下にある。他の実施形態では、各発現カセットは、１０を超えるＨＣＭＶ抗原を包含する。いくつかの実施形態において、ベクターは、１より多いそのような発現カセットを含包含し得る。

本明細書に記載されているのは、ＨＣＭＶ感染に対する強力な体液性及び細胞性免疫を刺激するための改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）に基づく多抗原性ワクチン戦略である。このようなマルチ抗原ワクチン戦略は、妊婦や移植レシピエントを包含するさまざまな標的集団におけるＨＣＭＶ関連疾患を予防するために潜在的に使用できる可能性がある。より具体的には、提案された本発明は、複数の免疫優勢ＨＣＭＶ抗原を同時に発現するＭＶＡベクターの構築に関する。これは、エンベロープ五量体複合体（ＰＣ）の５つのサブユニットすべて（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、リンタンパク質６５（ｐｐ６５）、前初期タンパク質１（ＩＥ１）、及びＨＣＭＶの即時初期タンパク質２（ＩＥ２）、又はその他のＨＣＭＶタンパク質を包含することができる。これらのベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）テクノロジー、真核細胞での相同組換え、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９手順のいずれかによって構築できる。ＨＣＭＶ抗原は、それらの天然ＤＮＡ配列に基づくことができるか、又はワクシニアウイルス発現のためにコドン最適化することができる。個々のＨＣＭＶ抗原は、１つのＭＶＡ挿入部位にすべて一緒に挿入することも、２つ以上の一般的又は非一般的に使用されるＭＶＡ挿入部位に別々に挿入することもできる。これらの挿入部位には、ＭＶＡ欠失部位１～６、及び１８９個の指定されたＭＶＡ遺伝子（アクセッション番号Ｕ９４８４８）の遺伝子間領域（ＩＧＲ）が含まれる。ＭＶＡベクターからのＨＣＭＶ抗原の発現は、内因性ワクシニアプロモーター、又は改変Ｈ５（ｍＨ５）、ｐＳｙｎ、Ｐ１１、又はｐ７．５プロモーターなどの異所的に挿入された天然、改変、又は人工ワクシニアプロモーターのいずれかによって誘導できる。同時に発現される個々のＨＣＭＶ抗原の２つ以上は、２Ａ切断シグナル又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によってリンクされ、個々の抗原のポリシストロン発現を可能にする。２Ａシグナル配列は、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）の２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）；ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）又はＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、のいずれかをコードすることができる。本明細書で使用されるいくつかの２Ａシグナル配列の例を図２４に示す。２Ａシグナル配列の直前のフューリン切断部位を組み込んで、２Ａ結合ＨＣＭＶポリタンパク質の自己処理後に２Ａペプチドを除去することができる。この開示の例として、ＢＡＣテクノロジーは、５つのＰＣサブユニットすべて、ｇＢ、ＨＣＭＶのｐｐ６５、又はこれらの７つの抗原とＨＣＭＶ ＩＥ１を同時に発現するさまざまな組換えＭＶＡベクターを生成するために使用される。２つ、４つ、又は５つのＭＶＡ挿入部位に挿入されたポリシストロン性及び単一の抗原性発現コンストラクトのさまざまな組み合わせを利用する。

改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）は、感染症及び癌のためのワクチンを開発するために広く使用され、臨床的に展開可能なポックスウイルスベクターである。ＭＶＡは、動物及びヒトにおける優れた安全性の記録、異種ＤＮＡ配列を組み込んで発現する大容量で用途の広い発現システム、及び外来抗原に対する強力な体液性及び細胞性免疫応答を刺激する実証済みの能力を備えている（１７、２０、２５）。

本明細書に記載されているのは、５つすべてのＰＣサブユニット、ｇＢ、及び免疫優勢Ｔ細胞標的リンタンパク質６５（ｐｐ６５）で構成される抗原の組み合わせによって強力なＨＣＭＶ体液性及び細胞性免疫を刺激する改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）に基づく新しいワクチンアプローチである（６９）。さらに、本明細書に提供されるのは、ＭＶＡによるＰＣサブユニット及びｇＢの共発現が、ＨＣＭＶ中和及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するｉｎ ｖｉｔｒｏで測定可能な抗体応答の誘導を改善できることを示す例である。これらの発見は、先天性ＨＣＭＶ感染の後遺症を予防又は軽減するためのマルチ抗原サブユニットワクチン戦略の開発に貢献し、ＰＣとｇＢで構成される抗原の組み合わせによって体液性免疫応答を誘発する有益な効果を示唆している。

実施例に示されているように、ＢＡＣシステムを利用して、７つ又は８つのＨＣＭＶ抗原を単一のＭＶＡベクターにアセンブルした。これにより、細菌ベクター配列の痕跡を残すことなく、ＢＡＣベクターを効率的に除去できる。これらのマルチ抗原ＭＶＡベクターは、５つすべてのＰＣサブユニット、ｇＢ、ｐｐ６５、及びＩＥ１を安定して共発現し、ＦＢ及びＥＣ感染を防ぐ補体非依存性及び補体依存性ＮＡｂ応答、ＡＤＣＣを促進する抗体、及びすべての個々の抗原による抗原特異的マウス及びヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を包含する、マウスで強力なＨＣＭＶ体液性及び細胞性免疫応答を誘発することができる。ＭＶＡベクターによるこれらの免疫優勢ＨＣＭＶ抗原の共発現は、他の人による発見とは対照的に、個々の抗原の免疫原性を有意に妨害しない（３２）。逆に、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるｇＢと一緒のＰＣサブユニットの共発現は、ＨＣＭＶ中和及びＡＤＣＣを媒介するｉｎ ｖｉｔｒｏで測定可能な補体非依存性及び補体依存性抗体応答の誘導を増強する（図９及び１０）。これらの発見は、先天性ＨＣＭＶ感染を予防又は改善するためのマルチ抗原ワクチン戦略の開発を導き、強力な体液性免疫を刺激するサブユニットワクチン製剤にＰＣサブユニットとｇＢの両方を含めることの有益な効果を示唆する可能性がある。

ｇＢ、ｇＨ、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａサブユニットに対する抗体、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞は、先天性ＨＣＭＶ感染を予防するために重要である（２９、３０、６２）。これは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に加えて、これらすべての糖タンパク質による抗体の誘導が先天性ＨＣＭＶワクチン候補に不可欠である可能性があることを示唆している可能性がある。ＨＣＭＶの侵入を防ぎ、補体依存性のウイルス溶解を媒介し、ＡＤＣＣを促進する既存の抗体反応は、粘膜でのＨＣＭＶの獲得、ウイルスの拡散と拡散、及び胎児の母体界面での経胎盤ウイルス感染を妨げる防御の第一線として重要である可能性がある（１５、５２）。しかし、自然のＨＣＭＶ感染によって獲得された母体のＨＣＭＶ免疫は、再発感染の結果として先天性感染に対する不完全な防御しか与えないため（５）、抗体の誘導だけでは、母親又は胎児の感染を完全に防ぐのに十分ではない可能性がある。細胞傷害性Ｔ細胞応答は、母体感染が粘膜で発生した後、ＨＣＭＶ感染を封じ込めて除去するための第２の防御線として重要である可能性がある（３５、３６）。さらに、Ｔ細胞応答は移植患者のＨＣＭＶ再活性化とＨＣＭＶ関連疾患を制御することでよく知られている（３８）。これは、ＨＣＭＶ血清陽性妊婦のＴ細胞免疫を高めることができるワクチン候補が、これらの女性のＨＣＭＶ再活性化の制御を強化し、その結果、発育中の胎児にウイルスを移すリスクを減らす可能性があることを示唆している可能性がある。

いくつかの研究は、一次ＨＣＭＶ感染の結果として自然に獲得されたＨＣＭＶ免疫が再感染に対する実質的な保護を提供し、将来の妊娠における先天性感染のリスクを有意に低減できることを示している（１、７、２１）。さらに、一次感染後の先天性疾患は、一般に、非一次感染後の先天性疾患と比較して重症度が低いと考えられている（５２）。したがって、ＨＣＭＶによって誘発されるものと同様の免疫を誘発することができるワクチン候補は、ワクチン接種されたＨＣＭＶ血清陰性の妊婦において、先天性ＨＣＭＶ感染及び疾患に対する不完全な防御ではあるが、有意な可能性がある。自然に獲得された母体のＨＣＭＶ免疫による保護が不完全であるため、先天性ＨＣＭＶワクチンが効果的であるためには、自然感染中にＨＣＭＶによって誘発される免疫応答とは量的又は質的に異なる免疫反応を刺激する必要があるかもしれないことが示唆されている（５２）。ＨＣＭＶ免疫を殺菌するワクチン刺激は達成するのが難しいかもしれないが（７）、ＨＣＭＶワクチン候補の認可は、不完全な有効率によっても考慮される可能性がある（５２）。

発現システム、ベクター、ワクチン
本明細書に記載の実施形態によれば、ＨＣＭＶ抗原発現システムが本明細書で提供される。一実施形態では、抗原発現システムは、１つ又は複数のＨＣＭＶ抗原又はその抗原性フラグメントを発現することができる発現ベクターをクローン化するためのクローニングベクターを包含し得る。

一実施形態では、クローニングベクターは、細菌の形質転換（例えば、Ｅ．ｃｏｌ）によってウイルスベクター（例えば、ＭＶＡ）又は他の発現ベクターをクローニングするために使用され得るＤＮＡコンストラクトであるＢＡＣである。ウイルス又は発現ベクターは、１つ又は複数のＨＣＭＶ抗原配列を包含し得る。クローニングベクターとしてＢＡＣを使用すると、非常に大きなＤＮＡ配列の安定したクローニングが可能になり、Ｅ． ｃｏｌｉ用に確立された遺伝子技術を使用して簡単に操作できる。いくつかの実施形態において、ＢＡＣクローニングベクターは、発現ベクターをクローニングするために使用される。発現ベクターは、プラスミド、ＢＡＣ、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクター）、ＢＡＣとして構築されたウイルスベクター、又は組換えタンパク質、ウイルスベクター、又はその両方を発現することができるいずれの他の好適なベクターであり得る。

いくつかの実施形態において、発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）は、１つ以上のＨＣＭＶ抗原又はその免疫原性又は抗原性フラグメントを発現することができる。免疫原性タンパク質は、対象に導入されると、対象の免疫細胞によって認識され、それによって免疫反応を刺激するタンパク質である。免疫反応は、そのタンパク質に対する抗体産生（例えば、中和抗体産生）又はＴ細胞産生をもたらす可能性がある。免疫原性タンパク質の機能的又は抗原性フラグメントは、タンパク質の抗原性部分を含有するタンパク質のいずれの部分であるか、又は少なくとも１つのエピトープを含有し得るタンパク質の抗原性部分である。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫原性タンパク質又はその機能的フラグメントは、免疫原性タンパク質サブユニットのセット又はその機能的フラグメントを包含する免疫原性タンパク質複合体であり得る。

一実施形態では、ＢＡＣクローニングベクターを使用して、ウイルス発現ベクターをクローニングする。そのような実施形態において、ＢＡＣベクターは、ウイルスベクターのゲノムに挿入されて、ウイルス－ＢＡＣ構築物又はプラスミドを生成する。次に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｌ）にウイルス－ＢＡＣプラスミドをトランスフェクトして、ウイルスベクターをクローン化する。ウイルスベクターによる感染を受けやすい真核細胞へのウイルス－ＢＡＣクローンのトランスフェクションは、組換えウイルスの再構成をもたらす。次に、得られた再構成されたウイルスベクターを使用して、宿主内の標的組織又は細胞に感染させることができる。

一実施形態では、ウイルスベクターは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であり、これは、ＢＡＣクローニングベクター（「ＭＶＡ－ＢＡＣ」）にクローン化され、１つ以上のＨＣＭＶ抗原又はその免疫原性又は抗原性フラグメントを発現することができる。１９７４－ＭＶＡ株、ＶＲ株又はＡＣＡＭ ３０００株を包含するがこれらに限定されない、本明細書に記載の実施形態に従って、いずれの好適なＭＶＡ株をＢＡＣによってクローン化することができる。

一実施形態では、１つ又は複数のＨＣＭＶ抗原は、ＨＣＭＶ五量体複合体（ＰＣ）の一部である免疫原性タンパク質サブユニット又はその機能的フラグメントのセットを包含する。ＨＣＭＶ ＰＣは、次の５つの免疫原性タンパク質サブユニット又はその機能的フラグメントを包含するＨＣＭＶタンパク質複合体である： ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＬ、及びｇＨ。ＰＣサブユニットの５つすべての共発現は、機能的な発現を得て、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａサブユニット内に存在する立体配座エピトープに対する強力なＮＡｂ応答を刺激するために単一細胞で必要である。したがって、５つすべてのＰＣコンポーネントの共発現によってｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質複合体を組み立てるために１つより多い（＞１）個々のＤＮＡ又はウイルスベクターを導くための現在一般的に受け入れられるアプローチがないため、単一のデリバリーベクターが必要である。

本明細書に記載の発現システム及びウイルスベクターによる、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＬ、及びｇＨタンパク質又はそれらの抗原性断片を含むＰＣ複合体の同時共発現は、上皮細胞や内皮細胞、線維芽細胞などの感受性細胞のＨＣＭＶ感染を阻止する宿主の免疫系による宿主による中和抗体（ＮＡｂ）の刺激をもたらす。

他の実施形態では、発現ベクターは、ｐｐ６５、ｇＢ、ＩＥ１、ＩＥ２、ｇＭ、ｇＮ、ｇＯ、及び当技術分野で知られている他の好適な抗原性ＨＣＭＶタンパク質を包含するがこれらに限定されない追加のＨＣＭＶタンパク質を包含し得る。これらの追加の遺伝子は、ＰＣサブユニットを有する第１の発現ベクターに挿入され得るか、あるいは、第１の発現ベクターと組み合わせて投与される第２の発現ベクターに挿入され得る。いくつかの実施形態では、すべてのサブユニットは、ＭＶＡ又はＭＶＡ－ＢＡＣベクターの同じ挿入部位に挿入される。他の実施形態では、１つ又は複数のサブユニットが、ＭＶＡ又はＭＶＡ－ＢＡＣベクターの２つ又は複数の異なる挿入部位に挿入される。他の実施形態において、２つ以上の抗原遺伝子配列は、Ｐ２Ａ結合ポリシストロン発現コンストラクトを介して発現され得る。

本明細書に記載の実施形態によれば、免疫化レジメンが提供される。免疫療法には、プラスミド、ウイルスベクター、弱毒化生ウイルス、精製タンパク質、又はＨＣＭＶ抗原を発現又は含むウイルス様粒子が含まれ得る。免疫化レジメンは、プライム／ブースト同種（例えば、同じワクチンタイプのみを使用）又は異種（例えば、異なるワクチンタイプを使用）ワクチン接種を介して投与することができる。免疫化レジメンは、２週間から６ヶ月間隔で投与することができる２回以上の予防接種を含む用量ワクチン接種スケジュールで投与することができる。

他の実施形態では、上記のＭＶＡベクターは、プライミング免疫化であり得る。そのような場合、前述のプライム（ｐｒｉｍｅｓ）はまた、１つ以上（例えば、１、２、３、４、又はそれ以上）の連続したＭＶＡ免疫化の後のブースターベクターとして使用することができる。あるいは、プライミング及びブースティングベクターは、異種免疫が、例として、１～４回のブーストとしてＭＶＡ又は代替ベクターが続くプライムとしてのＭＶＡ又は代替ベクターを包含するように交互にすることができる。当技術分野で知られている他の好適な免疫化スケジュール又はレジメンは、当技術分野の当業者によって本明細書に記載される実施形態に従って使用され得る。

いくつかの実施形態によれば、２つ以上のＨＣＭＶ抗原をコードする核酸配列は、２つ以上のサブユニットをコードする核酸配列の間に挿入された連結配列を有する単一のベクターに組み立てられる。例えば、ＨＣＭＶ ＰＣサブユニットは、１つの挿入部位又は複数の挿入部位のサブユニットのすべて又は一部をポリシストロン性発現コンストラクトとしてリンクするため、当技術分野で周知のいくつかの異なるＲＮＡウイルスに由来する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの連結配列、又は２Ａペプチドをコードする配列を介して連結され得る。口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）の２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）の２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）の２Ａペプチド、細胞質多面体症の２Ａペプチドをコードする２Ａシグナル配列 ウイルス（ＢｍＣＰＶ ２Ａ）、口蹄疫ウイルスの２Ａペプチド（ＢｍｌＦＶ ２Ａ）、又はＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスの２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）を使用できる

一実施形態では、ウイルス又は発現ベクターに挿入されたＨＣＭＶ遺伝子配列は、天然のＤＮＡ配列に基づくことができる。他の実施形態では、ＨＣＭＶ遺伝子配列は、ウイルス又は発現ベクター内での発現及び安定性について最適化され得る。本明細書の実施例に提供されるように、マルチ抗原ＭＶＡベクターに挿入されたＨＣＭＶ遺伝子配列は、ワクシニアウイルスのコドン使用頻度に合わせて最適化される可能性があり、ＭＶＡにより許容される可能性のある低Ｇ／Ｃ含有量の改変遺伝子配列をもたらす。これらの改変されたＨＣＭＶ遺伝子配列又はＭＶＡに挿入された天然のＨＣＭＶ遺伝子配列は、「サイレント」変異されて（例えば、コードされたタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えずに）、同じタイプの４つ以上のヌクレオチドからなる配列を連続して除去し得る。この修飾は、ＭＶＡ内の抗原の安定性を高めることが示されている（８７）。本開示で使用されるコドン最適化ＨＣＭＶ抗原配列のいくつかの非限定的な例を以下に列挙する：

コドン最適化ｇＨシーケンス：

コドン最適化ｇＬシーケンス：

コドン最適化ＵＬ１２８シーケンス：

コドン最適化ＵＬ１３０シーケンス：

コドン最適化ＵＬ１３１Ａシーケンス：

コドン最適化ｐｐ６５シーケンス：

コドン最適化ｇＢシーケンス：

コドン最適化ＩＥ１シーケンス：

上記のＭＶＡウイルスベクターなどの組換えベクター；又は、上記の適切なプライマー又はブースターベクターを含む他の好適な代替ベクターは、ＨＣＭＶ感染を治療又は予防する方法で使用され得るＨＣＭＶワクチン組成物の一部であり得る。本明細書に記載のワクチン組成物は、本明細書に記載の治療有効量の組換えウイルスベクターを含み得、さらに、標準的な方法による薬学的に許容される担体を含み得る。許容される担体の例には、滅菌生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）及び滅菌緩衝生理食塩水などの生理学的に許容可能な溶液が含まれる。

いくつかの実施形態において、ワクチン又は医薬組成物は、抗ＣＭＶ効果を増強するために、医薬的に有効な量のアジュバントと組み合わせて使用され得る。いずれの特定の抗原効果自体を持たずに
免疫系を刺激し、ワクチンへの応答を増加させる可能性のあるいずれの免疫学的アジュバントを、アジュバントとして使用することができる。多くの免疫アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られる進化的に保存された分子を模倣し、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として知られる免疫受容体のセットによって認識される。本明細書に記載の実施形態に従って使用できるアジュバントの例は、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、二本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ３リガンド）、ＬＰＳ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（ＴＬＲ４リガンド）などのＬＰＳ類似体、フラゲリン（ＴＬＲ５リガンド）、リポタンパク質、リポペプチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、イミダゾキノリン類似体（ＴＬＲ７及びＴＬＲ８リガンド）、ＣｐＧ ＤＮＡ（ＴＬＲ９リガンド）、リビのアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ／トレハロースジコリノイコレート）、グリコリピド（α－ＧａｌＣｅｒアナログ）、非メチル化ＣｐＧアイランド、オイルエマルション、リポソーム、ビロソーム、サポニン（ＱＳ２１などのサポニンの活性画分）、ムラミルジペプチド、ミョウバン、水酸化アルミニウム、スクアレン、ＢＣＧ、ＧＭ ＣＳＦやＩＬ－１２などのサイトカイン、ＭＩＰ１－αやＲＡＮＴＥＳなどのケモカイン、ＣＤ４０Ｌなどの細胞表面リガンドを活性化すること、Ｎ－アセチルムラミン－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＭＯＰ）、及びサイモシンα１を包含する。使用するアジュバントの量は、皮膚の軟化、痛み、紅斑、発熱、頭痛、及び筋肉痛などの症状の程度に応じて好適に選択することができ、これらは、このタイプのワクチンの投与後のヒト又は動物の免疫応答の一部として発現する可能性がある。

さらなる実施形態において、本発明のワクチンと共に様々な他のアジュバント、薬物又は添加剤を使用することは、上記のように、ワクチン又は医薬組成物の投与によって達成される治療効果を増強し得る。医薬的に許容可能な担体は、等張性及び化学的安定性を高める物質などの微量の添加剤を含有し得る。そのような添加剤は、使用される投与量及び濃度においてヒト又は他の哺乳動物対象に対して無毒でなければならず、その例には、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、及びその他の有機酸、及びそれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（例えば、約１０残基未満）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニン及びトリペプチド）タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、及び免疫グロブリン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びアルギニン）；単糖、二糖、及び他の炭水化物（例えば、セルロース及びその誘導体、グルコース、マンノース、及びデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール及びソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート及びポロキサマー）；抗生物質；及びＰＥＧ；が含まれる。

本明細書に記載の組換えウイルスベクターを含有するワクチン又は医薬組成物は、水溶液又は凍結乾燥製品として、密封されたアンプル又はバイアルなどのユニット又は複数回投与容器に保存することができる。

ＨＣＭＶの細胞への侵入の防止、ＨＣＭＶ感染の治療と予防
上記の抗原発現システムは、細胞又は細胞集団へのウイルスの侵入を防ぐことによってＨＣＭＶ感染を防ぐためのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞又は細胞集団へのウイルス侵入を防止するための方法は、複数のＨＣＭＶ抗原を発現することができる有効量のウイルスベクターで細胞又は細胞集団を感染させるステップを包含する。他の実施形態では、抗原発現システムを使用して、複数の免疫優勢抗原による体液性及び細胞性免疫応答を刺激して、妊婦及び移植レシピエントなどの異なる標的集団におけるＨＣＭＶ感染を予防することができる。別の実施形態において、発現システム又はウイルスベクター（例えば、ＭＶＡ）は、一次ＨＣＭＶ感染、異なるＨＣＭＶ株による再感染、又は潜伏からのウイルス再活性化を妨害する免疫応答を刺激するために使用され得る。他の実施形態では、発現システムを利用して、ＨＣＭＶ血清陰性対象におけるＨＣＭＶ免疫を刺激するか、又はＨＣＭＶ血清陽性対象における既存のＨＣＭＶ免疫を増強することができる。

他の実施形態では、対象におけるＨＣＭＶ感染を治療又は予防するための方法が提供される。そのような方法は、本明細書に開示される治療有効量のワクチンを対象に投与することを包含し得る。ワクチンは、少なくとも１つの活性成分を包含し得る。ここで、少なくとも１つの活性成分は、２つ以上のＨＣＭＶ抗原を共発現することができるウイルスベクター、例えば、本明細書に記載されているものなど、を包含する。

本明細書に記載の発現システム、ベクター及びワクチンは、いずれのＨＣＭＶ感染を治療又は予防するために使用することができる。例えば、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、それらの組み合わせ、又はＨＣＭＶの自然史及び感染に重要な他のいずれの細胞型のＨＣＭＶ感染を予防することができる。本明細書に記載の方法を使用して治療又は予防することができるＨＣＭＶ感染症の例には、先天性ＨＣＭＶ感染、免疫系が低下した被験者（臓器及び骨髄移植レシピエント、癌患者及び化学療法レシピエント、免疫抑制薬を投与されている患者及びＨＩＶ感染患者など）における日和見ＨＣＭＶ感染、及びその他の健康な被験者におけるサイレントＨＣＭＶ感染、が含まれ得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果を生み出す組成物の量を指す。例えば、細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその効果を研究するために（例えば、細胞培養）、又はｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｔｒｏで所望の治療効果を生み出すために、有効量のウイルスベクターに感染され得る。有効量の組成物を使用して、標的状態の予防又は治療、状態に関連する症状の緩和、又は所望の生理学的効果の生成など、対象において治療効果を生成することができる。そのような場合、有効量の組成物は、組成物は、「治療有効量」、「治療有効濃度」又は「治療有効用量」である。正確な有効量又は治療有効量は、所与の対象又は細胞集団における治療の有効性に関して最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、様々な要因、組成物の特性（活性、薬物動態、薬力学、及び生物学的利用能を包含する）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及び病期、全身健康状態、所与の投与量に対する応答性、及び投薬の種類を包含する）又は細胞、製剤中の医薬的に許容可能な１つ又は複数の担体の性質、及び投与経路を包含するがこれらに限定されない、に応じて変化するであろう。さらに、有効又は治療的に有効な量は、組成物が単独で投与されるか、又は別の組成物、薬物、療法又は他の治療方法又はモダリティと組み合わせて投与されるかによって異なり得る。臨床及び薬理学の当業者は、ルーチンの実験を通して、すなわち、組成物の投与に対する細胞又は対象の応答を監視し、それに応じて投与量を調整することによって、有効量又は治療有効量を決定することができる。追加のガイダンスについては、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＵＳＩＰ）， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ２００５を参照。これは、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。

状態の「治療すること」又は「治療」は、状態の予防、状態の発症又は発症の速度の遅延、状態の発症のリスクの低減、状態に関連する症状の発症の予防又は遅延、低減又は状態に関連する症状の終了、状態の完全又は部分的な退行の生成、又はそれらの何らかの組み合わせを意味する場合がある。治療はまた、状態の予防的又は予防的治療を意味する場合がある。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン又は医薬組成物は、免疫応答促進ペプチド及び抗菌剤（合成抗菌剤）などの他の既知の医薬品と組み合わせて使用することができる。ワクチン又は医薬組成物は、他の薬物及び添加物をさらに含み得る。本明細書に記載のワクチン又は医薬組成物と組み合わせて使用できる薬物又は添加剤の例には、本発明の組換えウイルス又はＭＶＡ又は組換えトランスジェニックタンパク質の細胞内取り込みを助ける薬物、リポソーム及び他の薬物及び／又はトランスフェクションを促進する添加剤（例えば、フルオロカーボン乳化剤、渦巻状物、尿細管、金色粒子、生分解性ミクロスフェア、及びカチオン性ポリマー）が含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン又は医薬組成物に含まれる有効成分の量は、それが治療的又は薬学的に有効な量である限り、広範囲の濃度、ウイルス粒子単位（ＶＰＵ）、プラーク形成単位（ＰＦＵ）、重量対体積パーセント（ｗ／ｖ％）又は有効成分量の他の定量的測定値から選択できる。ワクチン又は医薬組成物の投与量は、所望の治療効果、投与方法（投与経路）、治療期間、患者の年齢、性別、その他の状態等に応じて、広範囲から適切に選択することができる。

いくつかの態様において、組換えウイルスベクターがワクチン又は医薬組成物の活性成分としてヒト対象に投与される場合、組換えウイルス又はＭＶＡの投与量は、組換えウイルスのＰＦＵとして計算された、患者あたり１０^２から１０^１４ＰＦＵ、好ましくは１０^５から１０^１２ＰＦＵ、より好ましくは１０^６から１０^１０ＰＦＵにほぼ対応する量で投与され得る。

さらなる態様において、組換えウイルスベクターがワクチン又は医薬組成物の有効成分として対象に投与される場合、投与量は、ワクチン宿主に導入される発現可能なＤＮＡの量又は転写されたＲＮＡの量に関して広範囲から選択することができる。投与量はまた、使用されるいずれの転移ベクターで使用される転写及び翻訳プロモーターの強度に依存する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のワクチン組成物又は医薬組成物は、組換えウイルス又はＭＶＡをＰＳＳ（リン酸緩衝生理食塩水）又は生理食塩水中に懸濁することによって調製された組換えウイルスベクター懸濁液を、鼻又は呼吸器への吸入、又は血管内（ｉ．ｖ．）（例えば、動脈内、静脈内、門脈）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、又は腹腔内（ｉ．ｐ．）投与による、局所部位（例えば、肺組織、肝臓、筋肉又は脳へ）に直接注射することによって投与することができる。本発明のワクチン又は医薬組成物は、複数回投与することができる。より具体的には、最初の投与後、１つ又は複数の追加のワクチン接種が追加免疫として与えられ得る。１回以上のブースター投与により、望ましい効果を高めることができる。ワクチン又は医薬組成物の投与後、本明細書に記載の組換えウイルス又はＭＶＡを含有する医薬組成物による追加免疫を実施することができる。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明することを意図している。したがって、議論される特定の実施形態は、本発明の範囲に対する制限として構築されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく様々な同等物、変更、及び修正を行うことができることは明らかであり、そのような同等の実施形態が本明細書に含まれることが理解される。さらに、本開示で引用されたすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例
実施例１： 材料及び方法
細胞及びウイルス。ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ－２１）細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、及びＭＲＣ－５細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。ＭＶＡベクターは、以前に記載されているように、ＢＨＫ－２１又はＣＥＦ細胞で増殖させた（７５、８１）。すべてのＭＶＡウイルスストックは、ＣＥＦでのウイルス増殖後に調製され、記載されているようにＣＥＦで滴定された（８１）。ＨＣＭＶ ＴＢ４０／Ｅは、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋ（プリンストン大学）からの親切な贈り物であるＴＢ４０／Ｅｗｔ－ＧＦＰ ＢＡＣ ＤＮＡ（４８）から誘導された。ＧＦＰを発現するＨＣＭＶ株ＴＲは、Ｊａｙ Ｎｅｌｓｏｎ（Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。ＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ（ＲＣ２９４０）は、Ｅｄｗａｒｄ Ｍｏｃａｒｓｋｉからの親切な贈り物であった。ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９はＪｏｈｎ Ｚａｉａ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）から入手した。ＴＢ４０／Ｅ及びＴＲウイルスストックは、ＡＲＰＥ－１９細胞でのウイルス増殖後に調製し、記載されているようにこれらの細胞で滴定した（８１）。対照的に、Ｔｏｗｎｅ及びＡＤ１６９ウイルスストックは、ＭＲＣ－５細胞でのウイルス増殖後に調製され、記載されているようにこれらの細胞タイプで滴定された（８１）。

組換えＭＶＡベクター。
ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ由来の組換えＭＶＡは、ＧＳ１７８３ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞で、相同組換え用の特定のトランスファーコンストラクトと部位特異的プライマーを使用して、アンパッサン変異誘発により生成された（７２、７３、８３、８５）。表１は、アンパッサン変異誘発による遺伝子挿入を仲介するために使用されたプライマーと、挿入部位のゲノム位置を示す。
表１： プライマー配列

注： １． 下線が引かれた配列は組換えを仲介するために使用された；２． アクセッション番号Ｕ９４８４８に基づく挿入部位とゲノム位置。

ＰＣサブユニット又はｐｐ６５をコードするＨＣＭＶ遺伝子配列は、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ（ＴＢ４０／Ｅ－ＢＡＣ；アクセッション番号ＥＦ９９９９２１）に基づいていた。短縮型の膜貫通型欠失型ｇＢ（ｇＢΔＴＭ）を発現する遺伝子配列は、ＨＣＭＶ株Ｍｅｒｌｉｎに基づいており、Ｍｅｒｌｉｎ ｇＢタンパク質のＮ末端６９８アミノ酸をコードしていた。すべてのＨＣＭＶ遺伝子配列は、ワクシニアウイルスの発現に対してコドン最適化されており、ＭＶＡ内のＨＣＭＶ遺伝子配列の安定性を高めるために、同じヌクレオチドタイプが３つ以上連続して実行された場合はサイレントに変異された（８７）。コドン最適化及びＰ２ＡリンクＨＣＭＶ遺伝子配列はＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成された。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって生成された詳細なシーケンスマップは、すべてのトランスファープラスミドとＢＡＣコンストラクトで利用できる。すべての組換えＢＡＣベクターはＰＣＲ及び制限酵素断片長分析によって検証され、挿入されたすべてのＨＣＭＶ遺伝子発現カセットは、組換えに使用されるフランク（ｆｌａｎｋｓ）を包含するシーケンシングによって検証された。ＢＡＣベクターからのウイルス再構成は、ヘルパーウイルスとして鶏痘ウイルスを使用して記載されているように、ＢＨＫ細胞で実施された（１７、８５）。

ＢＡＣベクター除去。
ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ由来の組換えＭＶＡベクターにおけるＢＡＣ除去は、以前に記載されたように、ＢＡＣ配列に挿入されたゲノム重複の相同組換えに基づく手順によって実施された（１８、７１、８４）。ＢＡＣベクターを含有する本明細書に記載の再構成されたＭＶＡベクターは、太字の上付き文字Ｂで標識されている（例えば、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ２、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ４、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ５、及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ６、ならびにＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１ ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ２ ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３ ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４；ＢＡＣベクター配列が削除されたこれらのコンストラクトの誘導体は上付き文字Ｂなしで命名される（例えば、それぞれ、ＭＶＡ－７Ａｇ１、ＭＶＡ－７Ａｇ４、ＭＶＡ－７Ａｇ５、及びＭＶＡ－７Ａｇ６）。

アンパッサン突然変異誘発（７２、７３）を使用して、ＭＶＡ（アクセッション番号ＡＹ６０３３５５．１）の塩基対６９３１３～７０７０３に対応し、いずれかの部位の～０．７ｋｂｐ ＭＶＡ配列に相同であった～１．４ｋｂｐのゲノム重複は、クロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）とＭＶＡＢＡＣ－ＴＫのｍｉｎｉ－Ｆレプリコン（ＯｒｉＳ、ｒｅｐＥ、ｓｏｐＡ／Ｂ／Ｃ、ｃｏｓ、ｌｏｓＰ）との間に直接の向きに挿入された（図１Ａ）（８３）。ＲＦＰマーカーは、ゲノム重複とともに細菌ベクター配列に挿入された。そのため、組換えＭＶＡＢＡＣ－ＴＫベクター内のゲノム重複によって分離されたベクター配列の各々（ｃａｔ及びｍｉｎｉ－Ｆレプリコン）には、蛍光マーカーが含まれていた（ＲＦＰ又はＧＦＰのいずれか。これにより、元のベクター構築の結果として、ＧＦＰマーカーはすでにＭＶＡＢＡＣ－ＴＫに含まれていた（８３））。ＢＡＣからウイルスが再構成されると、細菌ベクター配列の両方の部分が除去されたウイルス集団が、ＲＦＰ及びＧＦＰ発現の兆候を示さないウイルス病巣によって同定された。プラーク精製を行って、残りのベクター配列を含有する残留ウイルス子孫を排除し、純粋なベクターフリーの組換えＭＶＡベクターを得た。したがって、９６ウェルプレートフォーマットのコンフルエントなＣＥＦ細胞を、プレートあたり２０プラーク形成単位のＭＶＡ（ＰＦＵ）に感染させた。感染後３～５日で、ＲＦＰ及びＧＦＰ発現の兆候のない単一のウイルス病巣のみを示すウェルからのウイルスを標準的な解凍／凍結技術によって調製し、ＣＥＦ上で連続的に大量に増殖させた。増殖したウイルスは、ＴＫ挿入に隣接するプライマー（５’－ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＣＡ ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣ－３’及び５’－ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＧＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＴＣ ＡＣ－３’）を使用したＰＣＲによってテストされ、ＢＡＣベクター配列の完全な除去が確認された。及びここで、プライマーは、細菌耐性マーカーｃａｔ（５’－ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＡＧ ＴＡＣ ＴＧ－３’及び５’－ＡＧＧ ＣＡＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＴＣ－３’）又はｍｉｎｉ－ＦレプリコンのｓｏｐＡエレメント（５’－ＴＴＡ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＴＴ ＣＡＡ ＴＡＣ ＧＧＴ ＧＣＡ Ｇ－３’及び５’－ＴＧＧ ＧＧＴ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＡＴ Ｃ－３’）に特異的であり、残留ベクター配列が存在しないことを確認する（図１Ｂ）。ＭＶＡ ＴＫ遺伝子座の回復を確認するために、ＴＫ部位から増幅されたＰＣＲフラグメントの配列が決定された（７１、８４）。

イムノブロット。
ＭＶＡに感染したＢＨＫ又はＣＥＦ細胞の全細胞溶解物中のＨＣＭＶ抗原を検出するためのウエスタンブロット分析は、標準的な手順を使用して実行された。ＨＣＭＶ ｇＬ及びＵＬ１３１Ａは、ウサギポリクローナル抗血清で検出された（８１）；ＵＬ１２８は、から購入したＲａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ ＧＳＴ－ＵＬ １２８（ＰＴＡ－８４７４）を使用して検出された；ｇＨ、ｇＢ、及びｐｐ６５は、それぞれ、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂｒｉｔｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から提供されたｍＡｂ ＡＰ８６（６５）、ｍＡｂ ｐ７－１７（８）、及びｍＡｂ ２８－１０３（９）を使用して検出された。ＵＬ１３０は、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋ（プリンストン大学）からの親切な贈り物であるＭＡｂ ３Ｃ５（７４）を使用して検出された。ワクシニアウイルスＢ５Ｒは、ＭＡｂ １９Ｃ２を使用して検出された（６３）。

フローサイトメトリー。
ＭＶＡＢ－７Ａｇ１によって発現されたＨＣＭＶＰＣサブユニット及びモノクローナルＮＡｂによるコントロールベクターを検出するための細胞表面フローサイトメトリー染色は、以前に記載されたように実施された（１５）。簡単に説明すると、ＢＨＫ細胞（７０～９０％コンフルエント）をＭＯＩ ５でＭＶＡベクターに感染させた。感染後４時間で、感染細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、２５μｇ／ｍＬ ＮＡｂで、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１：２，０００の希釈率でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗マウスｌｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにインキュベートした。細胞を再度洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＳＳに再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して１５，０００のイベントを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で分析した。

マウスと免疫化。
シティオブホープのベックマン研究所の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）は、この研究に割り当てられたプロトコル９８００４を承認した。すべての研究手順は、実験動物の管理と使用に関するガイド及び実験動物の人道的管理と使用に関する公衆衛生局の方針の推奨事項に厳密に従って実施された。ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスはジャクソン研究所から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ＨＨＤ ＩＩ Ｈ－２Ｄｂ／２ミクログロブリンダブルノックアウト（５０）（Ａ２ Ｔｇ）及びＨＬＡ－Ｂ＊０７０２ Ｈ－２ＫｂＤｂダブルノックアウト（５６）（８７ Ｔｇ）トランスジェニックマウスは、Ｆ． Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｆｒａｎｃｅ）から得られ、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒで飼育された。マウスに、５ｘ１０^７ＰＦＵ又は１ｘ１０^７ＰＦＵ（低用量）のいずれかを使用して、ｉ．ｐ．ルートを介して組換えＭＶＡベクターを４週間間隔で２又は３回ワクチン接種した。体液性免疫分析のための血液サンプルは、眼窩後部出血によって収集された。細胞性免疫応答を評価するために、脾細胞を標準的な手順に従って単離し、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳ（すべてＧｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に再懸濁した。

中和アッセイ。
ＨＣＭＶマイクロ中和アッセイは、公表された報告と同様に実施された（１５、８１）。簡単に説明すると、熱不活化血清を、アッセイで使用した細胞タイプに応じて、ＡＲＰＥ－１９ＥＣ又はＭＲＣ－５ＦＢ用の完全増殖培地を使用して７５μＬの容量で連続的に２倍に希釈した。希釈は１：２５から１：２０４８００の範囲であった。希釈した血清を、約２４００ＰＦＵのＨＣＭＶ ＴＢ４０／Ｅｗｔ－ＧＦＰ由来ウイルスを含有する７５μＬの完全増殖培地と混合しました。２時間のインキュベーション後、ウイルス／血清混合物を、前日に１．５ｘ１０^４細胞／ウェルで播種したＡＲＰＥ－１９又はＭＲＣ－５細胞に２回（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）（５０μＬ）で、完全増殖培地のウェルあたり５０μＬを含有した透明底ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加した。細胞を４８時間増殖させ、メタノール／アセトンで固定した。感染細胞は、マウス抗ＨＣＭＶ ＩＥ１ Ａｂ（ｐ６３－２７（３）；Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂｒｉｔｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から提供）及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を使用した免疫染色によって同定された。基質は３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）であった。プレートは、リニア電動ステージ（Ｌｅｉｃａ）を備えたＤＭｉ８倒立顕微鏡を使用した自動システムによって分析された。５Ｘ対物レンズを使用した視野あたりのＩＥ１陽性核は、ｌｍａｇｅＰｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用してカウントされた。各希釈について、重複した陽性核の平均数を計算した。各希釈液の中和力価（ＮＴ）は、次のように計算された：
ＮＴ＝［１－（免疫血清での陽性核数）／（免疫前血清での陽性核数）］ｘ１００。
５０％中和を与える力価（ＮＴ５０）は、５０％中和に最も近い次に高い及び低いＮＴ値を使用して、ＮＴ対血漿希釈をプロットするグラフの線形勾配を決定することによって計算された。

ＥＬＩＳＡ。
免疫化されたマウスの血清中のＰＣ及びｇＢ特異的結合抗体は、哺乳動物細胞におけるプラスミド（ＰＣ）又はＭＶＡ（ｇＢ）からの発現を介して誘導された精製ＰＣ又はｇＢタンパク質を使用したＥＬＩＳＡによって定量化された（１５、７５）。マイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｒ）を１μｇ／ｍＬの精製タンパク質で一晩コーティングし、ウェルを１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。徹底的に洗浄した後、２倍の血清希釈液を２つのウェルに加えた。抗マウスｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：２，０００の希釈で使用した。プレートは３，３’、５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で展開し、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を使用して反応を停止した。ＦｉｌｔｅｒＭａｘ Ｆ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を記録した。エンドポイント力価は、幾何平均よりも高い吸光度に、１００倍に希釈した５匹のナイーブマウスの血清を使用して得られた吸光度の標準偏差の３倍を加えた最高の血清希釈として計算した。

ペプチド。
ｐｐ６５及びｇＢのペプチドライブラリーは、タンパク質全体にまたがる重複する１５アミノ酸ペプチドで構成されていた。ｐｐ６５ペプチドライブラリーはＮＩＨ（ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ）から入手した。ｇＢペプチドライブラリーはＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）から購入した。ヒトＭＨＣクラスＩ制限免疫優勢ペプチドＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ｐｐ６５_{（４９５－５０３）}及びＨＬＡ－Ｂ＊０７０２ ｐｐ６５（２６５－２７５）は以前に記載されている（１９）。マウスＨ－２ｂ制限ｐｐ６５及びｇＢ特異的Ｔ細胞を検出するために、以前に同定された１１又は１７の免疫反応性ペプチドの混合物をそれぞれ使用した（６４）。ＰＣサブユニットに特異的なマウスＨ－２ｂ制限Ｔ細胞応答を検出するために、ｇＨ（ＰＨＧＷＫＥＳＨＴＴＳＧＬＨＲ、ＴＱＧＶＩＮＩＭＹＭＨＤＳＤＤ）、ｇＬ（ＬＩＲＹＲＰＶＴＰＥＡＡＮＳＶ）、ＵＬ１２８（ＮＫＬＴＳＣＮＹＮＰＬＹＬＥＡ）、ＵＬ１３０（ＫＬＴＹＳＫＰＨＤＡＡＴＦＹＣ）及びＵＬ１３１Ａ（ＬＮＹＨＹＤＡＳ ＨＧＬＤＮＦＤ）免疫優勢ペプチドの混合物を使用した（６４）。ペプチドライブラリーを除いて、すべてのペプチドはシティオブホープコアファシリティで合成された（１４）。

ＥＬＩＳｐｏｔ。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、製造元の指示に従って実施した。簡単に説明すると、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ－ｌＰフィルタープレートをキャプチャー抗体（マウスＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔ開発モジュール、Ｒ＆Ｄシステム）で一晩コーティングした。徹底的に洗浄した後、プレートをブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ、５％スクロースを含むＰＢＳ）で２時間ブロックした。この後、プレートを洗浄し、ＲＰＭＩ中の２ｘ１０^５脾細胞を各ウェルに加え、２μｇ／ｍＬペプチド及び１μｇ／ｍＬ ＣＤ２８及びＣＤ４９ｄ共刺激抗体（Ａｂ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の存在下で、３７℃で一晩インキュベートした。ｐｐ６５ライブラリーを刺激として使用した場合、Ｔｇマウスからの脾細胞を少量（５ｘ１０^４）で播種した。２４時間後、プレートを洗浄し、検出抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートは翌日、ＥＬＩＳｐｏｔ Ｂｌｕｅ Ｃｏｌａｒ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ＆Ｄシステム）を使用して展開させた。スポットは、ＡＩＤ ＥｌｉＳｐｏｔＲｅａｄｅｒを使用してカウントされた。２μＬのＤＭＳＯを添加したウェルで得られたスポットの数を各ウェルから差し引いた。スポット数が多すぎて数えられないウェルには、任意の数の３０００スポットを割り当てた。

代理ＡＤＣＣ－レポーター遺伝子バイオアッセイ。
ＡＤＣＣは、マウスＦｃγＲＩＶ（ｍＦｃγＲＩＶ）レポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。このレポーターアッセイにより、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を面倒に分離する必要がなく、ｍＦｃγＲＩＶ量を変動させることなくＡＤＣＣを測定できる（４９）。ｍＦｃγＲＩＶはマウスのＡＤＣＣに関与する主要な受容体であり、ヒトのＡＤＣＣに関与する主要なＦｅ受容体であるヒトＦｃγＲｌｌｌａと最も密接に関連している（４７）。このアッセイを実行するために、ＡＲＰＥ－１９ＥＣをＭＯＩ５で２４時間ＴＢ４０／Ｅに感染させた（標的細胞）。感染した細胞を白い平底の９６ウェルプレートに移した。さらに２４時間後、免疫化したマウスからのプールした熱不活化血清をアッセイバッファー（４％低ＩｇＧ血清を添加したＲＰＭＩ １６４０）で２倍に希釈し、標的細胞に添加した。活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する操作されたｍＦｃγＲＩＶ細胞を各ウェルに加え、６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を加えた。プレートは、ＢｉｏＴｅｃｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ３ルミノメーターを使用して展開された。血清の非存在下でのルシフェラーゼ活性と比較して、ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎを計算した。

統計。
統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用した。各グループのＮＡｂ力価とＩＦＮγ分泌Ｔ細胞は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して比較され、ＮＡｂ力価間の差は、二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して計算された。

実施例２： ５つのＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてを同時に発現するＭＶＡベクターの構築
Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．によって生成された元のＭＶＡ ＢＡＣを使用すると（１７）、５つのＰＣサブユニットすべての発現カセットが別々の挿入部位に挿入された組換えＭＶＡベクターが以前に生成された（８１、８５）。これらの第１世代ＭＶＡ－ＰＣベクターは、マウス及びＲＭで強力なＨＣＭＶ特異的ＮＡｂ応答を刺激し、ＨＣＭＶ血清陽性個体で測定可能なものを超えていた（８１）。ワクチンの構築を簡素化し、ＰＣサブユニットを発現するために必要な発現カセットと挿入部位を減らすために、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座に挿入されたＢＡＣカセットを備えたＭＶＡＢＡＣ－ＴＫと呼ばれる新しいＭＶＡ ＢＡＣが最近構築された（８２）。ピコルナウイルスの２Ａペプチドによって媒介されるリボソームスキッピングメカニズムに加えて、この新規ＢＡＣを利用することにより、１つ又は２つのＭＶＡ挿入部位のみを使用するポリシストロン発現コンストラクトとしてＰＣサブユニットを発現するＭＶＡベクターが生成された（８２）。新規ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫに基づくこれらの第２世代ＭＶＡ－ＰＣベクターは、元のＭＶＡＢＡＣに由来する第１世代ＭＶＡ－ＰＣベクターと同じくらい強力で、マウスの高力価で持続的なＨＣＭＶ特異的ＮＡｂ応答を刺激した（８２）。

これらのコンストラクトに基づいて、５つすべてのＰＣサブユニットをｇＢ及びｐｐ６５と共に共発現する異なる組換えＭＶＡベクターが生成された。図２は、このような７つの抗原性ＭＶＡベクターの例を提示する。ベクター構築の２つの概念が主に続いた。本明細書ではＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクターによって表されるベクター構築の第１の概念（図２Ａ－Ｄ）は、４つの別々の挿入部位への７つのＨＣＭＶ抗原の挿入に基づいていた。これらすべてのベクターにおいて、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ及びｇＨ／ｇＬで構成されるＰ２Ａリンクポリシストロン発現コンストラクトは、ＭＶＡ遺伝子６４Ｌと６５Ｌ（ＩＧＲ６４／６５）とＭＶＡ遺伝子６９Ｒと７０Ｌ（ＩＧＲ６９／７０）の間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）にそれぞれ挿入された（ここで言及されているすべてのＭＶＡ遺伝子はアクセッション番号Ｕ９４８４８に基づく）、及びｐｐ６５は、単一の抗原発現コンストラクトとしてＭＶＡ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ３サイト（Ｄｅｌ３）に挿入された。これらのＭＶＡ挿入部位（ＩＧＲ６４／６５（ＩＧＲ３としても知られる）、ＩＧＲ６９／７０（Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒとしても知られる）、及びＤｅｌ３）はすべて、安定した抗原発現を可能にする一般的に使用される挿入部位である（４５、７６、８７）。対照的に、ｇＢはＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクター内の４つの異なるＭＶＡ挿入部位に挿入され、ｇＢ抗原の安定した発現を可能にするＭＶＡゲノム内の追加の挿入部位を特定した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１では、ｇＢ抗原がＭＶＡ遺伝子０４４Ｌと０４５Ｌとの間のＩＧＲに挿入された（ＩＧＲ４４／４５）；ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ２では、ｇＢ抗原がＭＶＡ遺伝子００７Ｒと００８Ｌとの間のＩＧＲに挿入された（ＩＧＲ７／８）；ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３では、ｇＢ抗原がＭＶＡ遺伝子１２２Ｒと１２３Ｌとの間のＩＧＲに挿入された（ＩＧＲ１２２／１２３）；且つＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ４では、ｇＢ抗原がＭＶＡ遺伝子１４８Ｒと１４９Ｌとの間のＩＧＲに挿入された（ＩＧＲ１４８／１４９）。これらの挿入部位のすべては、これまで詳細に特徴付けられていない。抗原の不安定性がこの部位で頻繁に起こり得ることを示す以前の観察のために、一般的に使用される欠失２部位（Ｄｅｌ２）は、組換えベクター構築のために本明細書では利用されなかった（７６）。

本明細書ではＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ５及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ６（図２Ｅ－２Ｆ）で表されるベクター構築の第２の概念は、７つのＨＣＭＶ抗原を２つのＭＶＡ挿入部位のみに挿入することによって特徴づけられた。これらのベクターの両方で、５つのＰＣサブユニットすべてで構成されるＰ２Ａリンクポリシストロン発現コンストラクトが、ＭＶＡ遺伝子６９Ｒと７０Ｌとの間のＩＧＲに挿入された（ＩＧＲ６９／７０；Ｇ１Ｌ／Ｉ８Ｒとしても知られる）。さらに、ベクターｐｐ６５とｇＢの両方に、Ｐ２Ａにリンクしたポリシストロン性発現コンストラクトとして挿入した。ただし、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ５のｐｐ６５／ｇＢ発現カセットは一般的に使用されるＤｅｌ３サイトに挿入されたが、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ６のｐｐ６５／ｇＢ発現カセットは、ＭＶＡ遺伝子１６３Ｒと１６７Ｒの間のＭＶＡ配列を削除することによって生成された再構築されたＤｅｌ３サイト（Ｄｅｌ３ ｒｅｓ．）に挿入された。その結果、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ６のｇＢ／ｐｐ６５発現カセットが１６３Ｒ及び１６７ＲＭＶＡ遺伝子に直接隣接して挿入された。このような再構築されたＤｅｌ３部位は、抗原の安定性の向上を促進するために提案されているが、これは詳細には特徴付けられていない（８６）。アンパッサン突然変異誘発を使用したＰＣＲによってＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ内の異なるＭＶＡ挿入部位にＨＣＭＶ抗原を挿入するために利用されたすべてのプライマー配列、並びにＭＶＡ内のすべての標的挿入部位を表１に示す。

すべての２Ａシグナル配列は、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）の２Ａペプチドに基づいていた。これは、このシグナル配列が、さまざまなマウス及びヒト細胞株及びさまざまな動物モデルで高効率のポリタンパク質切断を媒介することが示されているためである（３４）。異なるＨＣＭＶ抗原間のＰ２Ａ配列には、複数のＰ２Ａシグナル配列の相同組換えを防ぎ、ＭＶＡコンストラクト内の抗原不安定性の可能性を減らすために異なるコード配列が使用された（８１）。すべてのコンストラクトにおいて、ｇＨはその膜貫通ドメイン（ＴＭ）とともに導入され、ＰＣの膜結合型を発現した。これは、ＭＶＡ内のこの形態のＰＣは、少なくとも堅牢なＮＡｂを誘発するために必要な免疫化の数を考慮すると、ｇＨ ＴＭを含まない可溶性形態のＰＣよりも実質的に免疫原性が高いことが以前に示されたためです（１６、８１）。対照的に、完全長のｇＢタンパク質と比較して可溶型のｇＢは免疫原性を高めることができるという証拠があるため、ｇＢはＴＭなしですべてのベクターに挿入された（７５）。そのＴＭなしでｇＢを包含することに関する別の考慮事項は、ｇＢの融合機能を排除し、その結果、細胞傷害の可能性を減らすことであった（７５）。

ＰＣサブユニットとｐｐ６５をコードするＨＣＭＶ遺伝子配列はＴＢ４０／Ｅに基づいた。ｇＢの短縮型膜貫通欠失変異体（ｇＢΔＴＭ）を発現する遺伝子配列は、ＨＣＭＶ株Ｍｅｒｌｉｎに基づいており、Ｍｅｒｌｉｎ ｇＢタンパク質のＮ末端６９８アミノ酸をコードしていた。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－６ベクターに挿入されたすべてのＨＣＭＶ遺伝子配列は、ワクシニアウイルスの発現に対してコドン最適化され、同じヌクレオチドタイプが３つ以上連続して実行されると、ＭＶＡゲノム内でＨＣＭＶ遺伝子配列の安定性を高めるためにサイレントに変異された（８７）。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－６と構造が類似しているが、ｇＢ及びｐｐ６５の非コドン最適化ＨＣＭＶ遺伝子配列（例えば、ＨＣＭＶに由来する未修飾遺伝子配列）を含有するＭＶＡベクターも生成された。非コドン最適化遺伝子配列を含有するこれらのベクターは、本明細書では上付き文字のＮＣＯで標識されている（例えば、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１^ＮＣＯ）。コントロールの場合、５つのＰＣサブユニットすべてをｇＢと一緒に発現するか（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ）、ＰＣサブユニットをｐｐ６５と一緒に発現するか（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５）いずれかのＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ由来の組換えＭＶＡベクター、又はＰＣサブユニット（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）、ｇＢ（ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ）、もしくはｐｐ６５（ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）のみを発現するＭＶＡは、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１の構築に使用されたものと同一の挿入部位及び発現コンストラクトを使用して生成された（図３）。

実施例３： ７つの抗原ＭＶＡベクターによるＨＣＭＶ抗原発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性化
安定した抗原発現はすべてのウイルスワクチンベクターにとって基本的に重要であるため、ＢＨＫ細胞又はＣＥＦでの１０回のウイルス継代後に異なる７抗原ＭＶＡベクターによるＨＣＭＶ抗原発現を調査した。ＢＨＫ細胞とＣＥＦは、効率的なＭＶＡ増殖を可能にする、たった２つの細胞株である一方で、他の細胞では、ウイルスアセンブリのブロックが遅いためにＭＶＡ複製が中断される（６７、６８）。さらに、ＣＥＦ細胞は一般的にヒト用のＭＶＡワクチンを製造するために使用される。ＢＨＫ細胞とＣＥＦでの継代分析により、コドン最適化ＨＣＭＶ遺伝子配列を持つ７つの抗原ベクター（ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－６、図２）のほとんどが、ＩＧＲ７／８に挿入されたｇＢ抗原の発現低下を示したＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ２を除いて（データは示さず、及び図４）、１０回のウイルス継代中にＨＣＭＶ抗原を効率的に発現することが明らかになった。図４は、ＢＨＫ細胞でのウイルス継代後のＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１ ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ２、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３、及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ４によって発現されるＨＣＭＶ抗原の例を示す。

ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクターと構造が同一であるが、コドン最適化されていないｐｐ６５及びｇＢ遺伝子配列（ここではＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４^ＮＣＯと表記）を含むＭＶＡベクターは、ウイルス継代中にＨＣＭＶ抗原の効率的な発現も示したが、ＭＧＢ遺伝子をＩＧＲ７／８又はＩＧＲ１２２／１２３に挿入したＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３^ＮＣＯ及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３^ＮＣＯの継代時にｇＢ発現の低下が観察された（データは示していない、及び図５）。図５は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１^ＮＣＯ及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３^ＮＣＯのウイルス継代１０回でのＨＣＭＶ抗原発現の例を示しており、コドン最適化されていない遺伝子配列がそれぞれＩＧＲ４４／４５又はＩＧＲ１２２／１２３に挿入されている。これらの観察は、安定したＨＣＭＶ抗原発現がＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ３－６ベクター（図２）によって提供されたが、ＭＶＡ－７Ａｇ２ベクター（図２）によっては提供されなかったことを示した。対照的に、コドン最適化されていないｐｐ６５及びｇＢ配列を有するＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４ベクターの対応するベクター（ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１－４^ＮＣＯ）のうち、安定した抗原発現は、ｇＢがそれぞれＩＧＲ４４／４５又はＩＧＲ１４８／１４９に挿入されたＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１^ＮＣＯ及びＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ４^ＮＣＯによってのみ提供された。これらの結果は全体として、コドン最適化がＭＶＡ内のＨＣＭＶ ｇＢ遺伝子配列の安定性を高めることができること、及び、ＭＶＡ遺伝子０４４Ｌと０４５Ｌ及びＭＶＡ遺伝子１４８Ｒと１４９Ｌの間の挿入部位が最も安定したｇＢ抗原発現を可能にすることを示唆している。

単一のＭＶＡベクターとして同時に発現された場合のＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５の発現をさらに特徴づけるために、感染したＢＨＫ細胞におけるＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（図２Ａ）とコントロールベクター（図３）によるＨＣＭＶ抗原発現を比較した。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５とも呼ばれる）は７つすべてのＨＣＭＶ抗原を発現したが、コントロールベクターは抗原サブセット（ＰＣ／ｇＢ、ＰＣ／ｐｐ６５、又はＰＣ）又は単一の抗原（ｇＢ又はｐｐ６５）のみを発現した（図６Ａ）。個々のＨＣＭＶ抗原の検出可能なタンパク質サイズは、一般に予想される分子量値と一致していた（ｇＨ＝～８５ｋＤａ；ｇＬ ～３５ｋＤａ；ＵＬ１２８＝～１５ｋＤａ；ＵＬ１３０＝～３８ｋＤａ；ＵＬ１３１Ａ＝１８ｋＤａ；ｇＢΔＴＭ＝～１１０ｋＤａ前駆体タンパク質及び～３５ｋＤａ Ｃ末端切断産物；ｐｐ６５＝～６５ｋＤａ（９、５７、７５））。発現されたＨＣＭＶ抗原の一部又はほとんどがＰ２Ａポリタンパク質プロセシングの結果としてＣ末端Ｐ２Ａペプチドレムナント（ｒｅｍｎａｎｔｓ）（～２ｋＤａ）を含有していたことを考慮に入れている。以前の観察（７５、８１）と同様に、ｇＢΔＴＭは、主に約１１０ｋＤａの前駆体型として検出され、少量では約３５ｋＤａのＣ末端フューリン切断産物としても検出された。ＰＣサブユニットを発現するすべてのベクターについてＵＬ１２８で検出された２つのタンパク質バンドは以前に観察されており、且つ、Ｐ２Ａにリンクされたポリシストロン発現コンストラクトと特異的に関連しているようである（８３）。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びすべてのコントロールベクターによってコードされる個々のＨＣＭＶタンパク質の発現レベルは、一般に互いに同等であり、ＭＶＡによるｇＢ及びｐｐ６５と一緒のＰＣサブユニットの共発現は、個々の抗原の発現に有意な影響を与えないことを示唆している。さらに、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１内の７つのＨＣＭＶ抗原はすべて、ＣＥＦでの１０回のウイルス継代後に同等のレベルで発現した（図７）。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１内の７つのＨＣＭＶ遺伝子配列すべてが、ヒトＭＶＡワクチンの生産に一般的に使用される細胞型でのウイルス継代時に安定して維持されていることを確認する。さらに、すべてのＨＣＭＶ抗原は、ＢＡＣベクターの除去後にＭＶＡ－７Ａｇ１及びＭＶＡ－７Ａｇ５によって安定して発現された（図８）。これらのベクター内でのＢＡＣ除去は、ＨＣＭＶ抗原の安定性に影響を与えないことを示唆している。これらの結果は、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５すべてが単一のＭＶＡベクターによって効率的かつ安定して共発現できることを確認している。

モノクローナルＮＡｂのパネルは、ＨＣＭＶ血清陽性個体から単離されたヒトＵＬ１２８／１３０／１３１Ａサブユニット及びｇＨ特異的ＮＡｂと同様の抗原認識及び中和効力を示した第１世代ＭＶＡ－ＰＣベクターで免疫されたマウスから最近単離された（１５、４３）。マウスモノクローナルＮＡｂは、ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ（１Ｂ２、１２Ｅ２）又はＵＬ１３０／１３１Ａ（２１Ｆ６、５４Ｅ１１）（１５）、ＵＬ１２８（１３Ｂ５）のＣ末端にある連続中和エピトープによって形成される異なる四次立体配座エピトープを（１４）、又はｇＨ内の異なるエピトープ（６２－１１、６２－１００、１８Ｆ１０、２１Ｅ９、２－８０）を認識した（１５）。単離されたマウスＮＡｂを利用して、第２世代ＭＶＡ－ＰＣベクターによってコードされるＰ２Ａ結合ＰＣサブユニットが互いに集合したこと、ＰＣ及びｇＨ特異的中和エピトープを形成したことが確認された（８３）。ＧＢ及びｐｐ６５と一緒にＭＶＡによって共発現されたときにＰ２Ａ結合ＰＣサブユニットが複合体を形成し、中和エピトープを提示する能力を保持しているかどうかを検証するために、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（図２Ａ）及びコントロールベクター（図３）に感染したＢＨＫ細胞の細胞表面フローサイトメトリー染色は、単離されたＮＡｂを利用して実施された。図６Ｂに示すように、
ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）及びＰＣサブユニットを発現するすべてのコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）に感染したＢＨＫ細胞は効率的にそして、すべてのＮＡｂで同様の強度で染色された。ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣに感染したＢＨＫ細胞のすべてのＮＡｂでわずかに低い染色強度しか観察されなかった。対照的に、ＮＡｂによる染色は、ｇＢ又はｐｐ６５のみを発現するコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ及びＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５）に感染したＢＨＫ細胞では観察されなかった。これらの結果は、ＭＶＡによってｇＢ及びｐｐ６５と共発現した場合、５つのＰＣサブユニットが集合してタンパク質複合体になり、細胞表面に輸送されることを示唆し、且つＵＬ１２８／１３０／１３１Ａサブユニット及びｇＨ内にさまざまな中和エピトープを提示する。

実施例４： マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって誘発される体液性免疫応答
ＭＶＡによって共発現されたときのＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５の免疫原性を特徴づけるために、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおけるコントロールベクターによるＨＣＭＶ特異的な体液性及び細胞性免疫応答の誘導を比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により、異なるＭＶＡベクターで、４週間間隔で３回免疫された。そして、ＨＣＭＶ特異的免疫応答は、２回目の追加免疫の１週間後に評価された。Ｔ細胞応答の大きさをより正確に測定するための追加のコントロールとして、ｐｐ６５を前初期１／２融合タンパク質（ＩＥ１／２）と共発現する以前に生成され臨床的に評価されたＭＶＡワクチンベクターが含まれていた。Ｔｒｉｐｌｅｘ（ここではＭＶＡ－ｐｐ６５／ＩＥと呼ばれる）としても知られるこのＭＶＡワクチンベクターは、第Ｉ相試験でＨＣＭＶ血清陽性及び陰性の成人においてＴ細胞応答の強力な増殖を示した。現在、造血細胞移植レシピエントを対象とした第ＩＩ相試験で評価中である（ＮＣＴ０２５０６９３３）。

第１世代のＭＶＡ－ＰＣベクターは、ＰＣサブユニットサブセット（ＵＬ１２８／１３０／１３１Ａ又はｇＨ／ｇＬ）又はｇＢのみを発現するＭＶＡベクターよりも、ＥＣ及びＦＢ特異的ＮＡｂ応答を誘発する免疫原性が実質的に高いことが以前に示されている（８１）。この研究では、熱不活化免疫血清のみを使用したため、補体非依存性中和応答のみを評価したが、ｇＢを標的とする抗体は、補体を介して中和機能を部分的に発揮することが示されている（１０、４２）。したがって、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるＰＣサブユニットとｇＢの共発現によって媒介されるＨＣＭＶ中和を決定するために、モルモット補体の非存在下又は存在下で、ＨＣＭＶ ＮＡｂ力価を熱不活化免疫血清で測定した。

５０％ＨＣＭＶ感染が阻害された（ＮＴ５０）ＥＣ特異的ＮＡｂ力価を、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ及びＴＲ、無傷のＰＣを発現し、ＥＣ、内皮細胞、且つ単球／マクロファージに効率的に感染できる２つのいわゆる「臨床様」ＨＣＭＶ株に対するＡＲＰＥ－１９細胞で測定されました（４６）。図９Ａ及び９Ｂに示すように、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）は、補体の非存在下でＨＣＭＶ ＴＢ４０Ｅ及びＡＲＰＥ－１９細胞のＴＲ感染を強力に妨害したが、補体の添加は、ＡＲＰＥ－１９細胞の感染を防ぐためのＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清の中和効力を増強しなかった。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清の補体の非存在下又は存在下で測定されたこれらのＥＣ特異的中和能は、ＰＣサブユニットを発現するすべてのコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ－ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）で得られた免疫血清で測定されたものと同等であった。ｇＢ特異的ＮＡｂの既知の補体依存性中和活性と一致して、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢで誘導された免疫血清は、補体の非存在下では、ＡＲＰＥ－１９細胞のＨＣＭＶ感染をブロックする比較的低い中和効力しか示さなかったが、補体の存在下では、ＡＲＰＥ－１９細胞のＨＣＭＶ感染を阻止するＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ由来免疫血清の中和効力が大幅に増加した。しかし、ＴＢ４０／Ｅ又はＴＲに対する補体の非存在下又は存在下でＭＶＡ^Ｂ－ｇＢで得られた免疫血清で測定されたＡＲＰＥ－１９特異的中和能は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びで得られた免疫血清で測定されたものよりも有意に低かった（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ－ｐｐ６５、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）。コントロールベクターＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５及びＭＶＡ－ｐｐ６５／ＩＥ（ＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓ）は、ＡＲＰＥ－１９細胞の感染を阻止する測定可能なＮＡｂ応答を誘発しなかった。

マウスにおけるこれらの観察は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１が２つの「臨床的」ＨＣＭＶ株に対して強力なＥＣ特異的ＮＡｂ応答を刺激できることを示唆している。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５の共発現は、ＭＶＡによるＰＣサブユニットのみの発現と比較した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定可能なＥＣ特異的ＮＡｂ応答の誘導を妨害も増強もしない。さらに、これらの結果は、ＰＣがＥＣ特異的ＮＡｂ応答を刺激する免疫原としてｇＢより優れていることを確認し、且つＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって誘導されるＥＣ特異的ＮＡｂ応答が、ＰＣを標的とする補体非依存性ＮＡｂ応答によって支配されていることを示唆している。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定に基づくと、ＭＶＡによってベクトル化されたＰＣは、ＥＣ固有のＮＡｂ応答を刺激するのに十分である可能性があるが、ＥＣ感染を妨害するＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１ベクターによって誘導されるｇＢ特異的ＮＡｂの補体依存性中和活性は、ＰＣを標的とするＮＡｂの効力によってマスクされる可能性がある。

免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスの異なるワクチンベクターによって刺激されたＦＢ特異的ＮＡｂ応答は、ＴＢ４０／Ｅ及びＴＲに対して、さらに実験室のＨＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ及びＡＤ１６９に対してＭＲＣ－５細胞で測定された。これらは両方とも無傷のＰＣの発現に欠陥があるため、ＥＣ、内皮細胞、及びマクロファージに効率的に感染することができない（４６）。図９Ｃ－９Ｆに示すように、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）は、補体の非存在下で４つすべてのＨＣＭＶ株によるＭＲＣ－５ＦＢ感染を強力に中和した。補体添加がＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来免疫血清の中和能を増強しなかったＡＲＰＥ－１９細胞での測定とは対照的に、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清は、補体の存在下で、ＭＲＣ－５細胞でＮＡｂ力価を測定した場合、テストしたすべてのＨＣＭＶ株に対して一貫して増加した中和活性を示した（図９Ｃ－９Ｆ）。

ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清について測定されたものと同様のＭＲＣ－５特異的ＮＡｂ力価を、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢコントロールベクターで誘導された免疫血清のすべての異なるＨＣＭＶ株に対する補体の非存在下又は存在下で測定した。ｇＢなしでＰＣサブユニットを発現したコントロールＭＶＡベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）で誘導された免疫血清は、補体の非存在下でＮＡｂ力価を測定した場合、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢに由来する免疫血清と同様の中和効力を示してＭＲＣ－５ＦＢ感染を妨害した。ただし、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢで得られた免疫血清とは対照的に、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣで得られた免疫血清は、ＮＡｂ応答がＨＣＭＶ株ＴＲに対して測定された場合にのみ、補体の存在下でＭＲＣ－５特異的中和活性の増強を示した。ただし、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅ、Ｔｏｗｎｅ、又はＡＤ１６９に対してＮＡｂ応答を測定した場合はそうではない。ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢに由来する免疫血清のＡＲＰＥ－１９細胞による測定と同様に、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ由来の免疫血清は、補体の非存在下でＭＲＣ－５ ＦＢ感染を妨害する効力がないか、比較的低いだけであった。しかし、それらは補体の存在下ですべてのＨＣＭＶ株に対して実質的に増加した中和活性を示した。しかし、ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ由来の免疫血清の補体の存在下で測定されたＭＲＣ－５特異的中和能は、それらがＴＢ４０／Ｅ、Ｔｏｗｎｅ、又はＡＤ１６９に対して評価された場合、但し、ＴＲに対して評価されたときではない、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡＢ－ＰＣ／ｇＢベクターで得られた免疫血清で測定されたものと同等の大きさのレベルにしか達しなかった。コントロールベクターＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５、ＭＶＡ－ｐｐ６５／ＩＥ、及びＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓは、検出可能なＭＲＣ－５特異的ＮＡｂを刺激しなかった。

これらの結果は、全体として、ＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５を共発現するＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１と、ＰＣサブユニット及びｇＢのみを共発現するコントロールベクターＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢは、４つの異なるＨＣＭＶ株によるＦＢ感染をｉｎ ｖｉｔｒｏで強力かつ一貫して妨害する、同等の補体非依存性及び補体依存性ＮＡｂ応答を刺激することを示している。対照的に、ＰＣサブユニットのみ（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ）又はｇＢのみ（ＭＶＡ^Ｂ－ｇＢ）を発現するコントロールＭＶＡベクターは、ＰＣサブユニット及びｇＢを共発現するＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢよりも、異なるＨＣＭＶ株に対して全体的に低くより変動性の高い中和活性を与える、ＮＡｂ応答を刺激する。したがって、これらの結果は、サブユニットワクチン製剤におけるＰＣサブユニットとｇＢの組み合わせは、本明細書でＭＶＡによって実証されているように、異種ＨＣＭＶ株によるＦＢ感染をｉｎ ｖｉｔｒｏで妨害するＮＡｂ応答の刺激を増強することができることを示す第１の概念実証を提供する。

実施例５： マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって誘導されるＡＤＣＣ促進応答
ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）及びｇＢを発現するコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ｇ８及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇ８）による補体依存性ＮＡｂの誘導に基づいて、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又はウイルス溶解（ＣＤＶ）及びＡＤＣＣは同様のｌｇＧサブクラスによって促進されるため、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるｇＢの発現は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する可能性があるとの仮説が立てられた。これらの抗体機能はすべて、ＨＣＭＶ感染に対する防御を提供するために重要である可能性がある。この仮説に対処するために、代理ＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して、ＨＣＭＶ ＴＢ４０／Ｅ又はＴＲのいずれかに感染したＡＲＰＥ－１９細胞に結合するワクチン由来免疫血清中のＡＤＣＣ促進抗体応答を測定した。

図１０Ａに示されるように、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇ８で得られた免疫血清は、測定がＴＢ４０／Ｅ感染細胞で行われた場合、ＡＤＣＣを媒介する同等の効力を示した。対照的に、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇ８で得られた免疫血清で測定されたものと比較して、ＴＢ４０／Ｅ特異的ＡＤＣＣを媒介する効力は、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ又はＭＶＡ^Ｂ－ｇＢで得られた免疫血清で測定された。驚いたことに、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５に由来する免疫血清は、ＴＢ４０／Ｅ特異的ＡＤＣＣを促進するようには見えまなかった。これは、ｐｐ６５がＰＣの免疫原性を妨害してＡＤＣＣ促進応答を誘発する可能性があることを示唆している。ＴＢ４０／Ｅ感染細胞を含むさまざまなワクチングループで測定されたものと比較して、同様のレベルのＡＤＣＣが、ＴＲ感染細胞を含むさまざまなワクチングループで決定された（図１０８）。ただし、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇ８で測定されたＴＲ特異的ＡＤＣＣレベルは、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１由来の免疫血清で測定されたものよりも高かったという顕著な違いがある。このことは、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１でのｐｐ６５の発現は、ＰＣサブユニットとｇＢの免疫原性をわずかに妨害して、ＡＤＣＣを促進する体液性免疫応答を誘発する可能性があることを示唆する。重要なことに、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１及びコントロールベクターに由来する免疫血清は、同等レベルのｇＢ特異的及びＰＣ特異的結合抗体を含有し（図１０Ｃ－１ＯＤ）、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１による７つのＨＣＭＶ抗原の共発現は、体液性免疫を刺激するためのｇＢ及びＰＣサブユニットの免疫原性に実質的に影響を与えないことを支持する。ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ及びＭＶＡ^Ｂ－ｇＢに由来する免疫血清と比較した場合、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１に由来する免疫血清については、わずかに低いｇＢ結合抗体しか測定されなかったが、これは統計的有意性に達しなかった。これらの結果は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるＰＣサブユニットとｇＢの共発現が、ＡＤＣＣを促進する抗体応答の刺激を増強できることを示す。ただし、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるｐｐ６５の追加の発現は、ＰＣ及びｇＢの免疫原性をわずかに妨害して、ＨＣＭＶ株に依存するＡＤＣＣ促進応答を刺激する可能性がある。

実施例６： マウスにおいてＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって誘発されたＨＣＭＶ特異的Ｔ細胞応答
ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって一緒に共発現された場合のＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５の免疫原性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスを利用する理由の１つは、個々のＨＣＭＶ抗原のＨ２－ｂ制限免疫優勢ペプチドに関する事前の知識であった（６４）。この知識は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって発現される７つのＨＣＭＶ抗原すべてがｉｎ ｖｉｖｏで効率的に処理され、ペプチド特異的Ｔ細胞応答を誘発するかどうかを調査する機会を提供した。

Ｈ２－ｂ制限ペプチドを使用して、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによってさまざまなワクチングループのｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答を測定した。図１１に示すように、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ／ｐｐ６５）はＴ細胞応答を刺激し、ＰＣサブユニットｇＢ及びｐｐ６５のペプチドと高レベルの反応性を示した一方、コントロールベクターで免疫したマウスから分離したＴ細胞は、ペプチド刺激のサブセットとのみ高レベルで反応した。驚くべきことに、ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ－又はＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｐｐ６５免疫マウスから単離されたＴ細胞は、ｇＢペプチドとの反応性も低レベルで示した。Ｈ２－ｂ制限ｇＢペプチドがこの実験でＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって誘導されたＰＣ特異的Ｔ細胞応答と非特異的にわずかに反応したことを示唆している。ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１免疫マウスから単離されたＴ細胞及びコントロールベクター免疫マウスから単離されたＴ細胞のペプチド再刺激の頻度は、一般に互いに同等であった。これは、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によるＰＣサブユニット、ｇＢ、及びｐｐ６５の共発現は、Ｔ細胞を誘発するこれらの抗原の能力に実質的に影響を与えないことを示唆している。さらに、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１免疫マウスに由来するｐｐ６５特異的Ｔ細胞応答の頻度は、臨床的に評価されたＭＶＡ ｐｐ６５／ＩＥベクター（「Ｔｒｉｐｌｅｘ」）で免疫されたマウスに由来する頻度と同等であった。特に高頻度のＴ細胞再刺激は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１で免疫したマウスのＰＣペプチド、又はＰＣサブユニットを発現するコントロールベクター（ＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ及びＭＶＡ^Ｂ－ＰＣ／ｇＢ）で観察された。これは、ＰＣサブユニットがＭＶＡによって発現されると、高レベルのＴ細胞応答を刺激できることを示唆している。ＰＣサブユニットがヒトにおける強力なＴ細胞応答の標的として記載されていないことを考えると、これは驚くべきことである（６５）。予想通り、コントロールベクターＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓは、ＨＣＭＶ抗原のいずれかのＨ２－ｂ制限ペプチドと反応するＴ細胞応答を刺激しなかった。これらの結果は、ＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１によって発現されるＰＣサブユニット、ｇＢ及びｐｐ６５がｉｎ ｖｉｖｏで効率的に処理され、抗原特異的Ｔ細胞を刺激できることを示唆している。

実施例７： マウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘発されるＨＣＭＶ免疫応答の耐久性
持続性ＮＡｂの誘導は、ＨＣＭＶワクチン候補にとって重要である可能性があるので、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘導されたＮＡｂ応答の持続性を評価した。これらのマウスは、ワクチン誘発性の体液性免疫を調査するために実験室で標準的に使用され、これらのマウスは、第１世代及び第２世代のＭＶＡ－ＰＣベクターが強力で耐久性のあるＨＣＭＶ特異的ＮＡｂ応答を刺激できることを実証するために使用された（８１、８３）。Ｂａｌｂ／ｃマウスはｉ．ｐ．標準用量のＭＶＡ免疫（５ｘ１０^７ ＰＦＵ）又は標準用量の５分の１（５ｘ１０^７ ＰＦＵ）を使用して、ＭＶＡ－７Ａｇ１で、４週間間隔で３回免疫した。ＰＣサブユニット（ＭＶＡ－ＰＣ）又はＶｅｎｕｓのみを発現するＭＶＡベクターをコントロールとして使用した。ＮＡｂ応答（ＮＴ５０）は、各免疫の前後にＭＲＣ－５ＦＢ及びＡＲＰＥ－１９ＥＣでＴＢ４０／Ｅに対する補体の非存在下又は存在下で測定され、最初の免疫後３０週間にわたって追跡された。

図１２Ａ～１２Ｃに示されるように、ＭＶＡ－７Ａｇ１又はコントロールベクターＭＶＡ－ＰＣは、３０週間の調査期間全体にわたって比較的安定したままである、強力なＦＢ及びＥＣ特異的ＮＡｂ応答を刺激した。第１世代及び第２世代のＭＶＡ－ＰＣベクター（８１、８３）の以前の観察と同様に、ＭＶＡ－７Ａｇ１（標準及び低用量）又はコントロールベクターＭＶＡ－ＰＣによって誘導されたＮＡｂ応答は、最初の免疫化の直後に検出され、最初の追加免疫の後に大幅に増加し、２回目の追加免疫の後で同等のレベルに留まった。補体の非存在下で決定されたＥＣ及びＦＢ特異的ＮＡｂ応答は、ＭＶＡ－７Ａｇ１ワクチングループ（標準及び低用量）とＭＶＡ－ＰＣ免疫動物の間で一般的に同等であったが、補体の存在下での２回目の追加免疫後に測定されたＦＢ特異的ＮＡｂ応答は、ＭＶＡ－ＰＣで免疫された動物よりもＭＶＡ－７Ａｇ１ワクチン群（標準及び低用量）で有意に高かった。コントロールベクターＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓは、測定可能なＥＣ又はＦＢ固有のＮＡｂ応答を刺激しなかった。これらの結果は、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって発現されるＨＣＭＶ抗原が、マウスにおいて強力で耐久性のあるＮＡｂ応答を誘発できることを確認している。これにより、ＭＶＡ－７Ａｇ１内のＰＣサブユニットとｇＢの組み合わせは、ＦＢ感染をブロックする持続的な補体依存性ＮＡｂの誘導を増強するように見える。

最初の免疫化後３０週での追加の追加免疫の後、免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの抗原特異的Ｔ細胞応答を、ｐｐ６５又はｇＢ特異的ペプチドのライブラリーを使用するＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴによって決定した（図１２Ｄ）。ｐｐ６５ペプチドを使用する場合、標準又は低用量のＭＶＡ－７Ａｇ１で免疫したマウスでは、堅牢で同等のレベルのＴ細胞応答が測定された一方、ＭＶＡ－ＰＣベクター又はＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫した動物では、Ｔ細胞応答が測定されなかったか、比較的低レベルであった。対照的に、ｇＢペプチドを利用した場合、強力なＴ細胞応答は、標準用量のＭＶＡ－７Ａｇ１で免疫された動物の一部でのみ検出され、低用量のＭＶＡ－７Ａｇ１又はコントロールベクターで免疫されたすべての動物について、Ｔ細胞応答のレベルがまったく又は非常に比較的低いことが決定された。フォローアップ実験では、ＣＥＦ細胞でのウイルス継代の前（Ｐ０）及び後（Ｐ１０）に由来するＭＶＡ－７Ａｇ１（ＢＡＣベクターなし）で免疫した動物について、ＮＡｂ力価の同様のレベルと動態及びｐｐ６５特異的Ｔ細胞応答のレベルを確認できた（図１３）。ＭＶＡ－７Ａｇ１は、臨床試験用のＭＶＡを生成するために標準的に使用される細胞基質上での長期増殖中にその免疫学的特性を保持することを示唆している。要約すると、これらの結果は、ＭＶＡ－７Ａｇ１がＢａｌｂ／ｃマウスの堅牢で耐久性のあるＨＣＭＶ体液性及び細胞性免疫応答を刺激できることを示唆している。

実施例８： マウスにおいて異なる７抗原ＭＶＡベクターによって誘発されたＨＣＭＶ免疫応答の比較
２つの別々に挿入されたポリシストロン発現コンストラクト（ＭＶＡ－７Ａｇ５及びＭＶＡ－７Ａｇ６）のみを介して７つのＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡが、４つの別々に挿入された発現コンストラクト（ＭＶＡ－７Ａｇ１－６）を介して７つのＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡと同様の免疫原性を提供できるかどうかを評価するため、ＭＶＡ－７Ａｇ５及びＭＶＡ－７Ａｇ６のＨＣＭＶ特異的な体液性及び細胞性免疫応答の誘導を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＭＶＡ－７Ａｇ４の誘導と比較した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを４週間間隔で３回、ＢＡＣベクターを含まないワクチンベクターでｉ．ｐ免疫し、免疫後のさまざまな時点でＥＣ及びＦＢＮＡｂ応答を測定した。

図１４に示すように、ＭＶＡ－７Ａｇ５とＭＶＡ－７Ａｇ６の両方が、ＭＶＡ－７Ａｇ４によって誘発されたものに匹敵する強力なＮＡｂ応答を刺激した。さらに、ＭＶＡ－７Ａｇ４－６ベクターで免疫した後の異なるワクチンベクターについて決定された抗体動態は、互いに同等であり、ＭＶＡ－７Ａｇ１のものと一致していた（図１２－１４）。ＭＶＡ－７Ａｇ１によって刺激されたＮＡｂ応答と同様に、ＭＶＡ－７Ａｇ４－６ベクターで免疫されたマウスの補体の存在下で決定されたＦＢ特異的ＮＡｂ応答は、これらのベクターの補体の非存在下で測定されたものよりも有意に高かった（図１４Ｂ）。Ｔ細胞応答は、ｐｐ６５－及びｇＢ－ペプチドライブラリーを使用したＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴによる２回目の追加免疫の１週間後に決定された。ｐｐ６５ペプチドで検出されたＴ細胞応答のレベルは、一般的にワクチングループ間で同等であった一方、すべてのワクチングループのｇＢライブラリでは、Ｔ細胞はまったく検出されなかったか、非常に低レベルであった（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＭＶＡについて、２つの別々の挿入部位のみ又は４つの別々の挿入部位から発現された７つのＨＣＭＶ抗原が、ＨＣＭＶの体液性及び細胞性免疫応答を刺激する同等の免疫原性を提供することを示唆している。

実施例９： ＭＶＡ－７Ａｇ１によるヒトＭＨＣ制限Ｔ細胞応答の誘導
Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスを用いた免疫化研究では、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって発現されるすべてのＨＣＭＶ抗原が、マウスＭＨＣ分子によって効率的に提示されることが示されたが、抗原がヒトＭＨＣ分子によっても効率的に提示されるかどうかは不明なままであった。ＭＶＡ－７Ａｇ１によって発現されるＨＣＭＶ抗原がヒトＭＨＣによって提示されるかどうかに対処するために、２つのトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス系統におけるＭＶＡ－７Ａｇ１によるＴ細胞誘導を評価した。これらのトランスジェニックマウスは、マウスＭＨＣクラスＩ分子の発現が不足しており、一般的に発現するＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Ａ２ Ｔｇマウス）又はＨＬＡ－Ｂ＊０７０２（Ｂ７ Ｔｇマウス）クラスＩ分子の導入遺伝子を含有する（５０、５６）。ＨＣＭＶに対する細胞性免疫反応を研究する場合、これらのトランスジェニックマウスは、ＨＬＡ対立遺伝子との関連でｐｐ６５及び他のＨＣＭＶタンパク質の免疫優勢エピトープを効率的に処理及び提示する能力があるため、ＨＬＡクラスＩ制限Ｔ細胞応答を評価するための非常に貴重なツールである（３７、４０、４５、８８）。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを使用すると、高周波Ｔ細胞応答は、ｐｐ６５特異的ペプチドライブラリーを使用する場合のＭＶＡ－７Ａｇ１免疫Ａ２及びＢ７Ｔｇマウス、及びｐｐ６５のＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限免疫優勢ペプチドエピトープを使用する場合のＭＶＡ－７Ａｇ１免疫Ｂ７Ｔｇマウスでの、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激によって確認できる。（図１５）。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答はまた、ｐｐ６５のＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限免疫優勢ペプチドエピトープを使用してＭＶＡ－７Ａｇ１免疫化Ａ２Ｔｇマウスについて、及びｇＢ特異的ペプチドライブラリー及びｇＢ及びＰＣサブユニットのマウスＨ２－ｂ制限ペプチドのプールを有するＭＶＡ－７Ａｇ１免疫化Ａ２及びＢ７Ｔｇマウスにおいて確認された。Ｈ－２ｂ制限ペプチドによってＭＶＡ－７Ａｇ１免疫Ａ２及びＢ７Ｔｇマウスで検出可能なこれらの後者の応答は、マウスＭＨＣクラスＩＩ提示によって刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞を表す可能性があり、又は、それらは、残留マウスＭＨＣクラスＩ分子発現を介して刺激されたＣＤ８＋応答を表す可能性がある（５０）。これらの結果は、ＭＶＡ－７Ａｇ１によって発現されるＨＣＭＶ抗原がヒトＭＨＣによって効率的に提示され得ることを示している。

Ｔ細胞の多機能性はＨＣＭＶ感染の予防に関係しているので、Ａ２及びＢ７マウスでＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘導された抗原特異的Ｔ細胞が多機能であるかどうかを評価した。Ａ２及びＢ７マウスは、ＭＶＡ－７Ａｇ１又はコントロールベクターＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５及びＭＶＡ－Ｖｅｎｕｓで免疫された。そしてＴ細胞応答は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－及びＨＬＡ－Ｂ＊０７０２制限ｐｐ６５ペプチドエピトープとｐｐ６５及びＰＣペプチドライブラリーを使用したＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ２細胞内フローサイトメトリー染色によって評価された。図１６Ａ－１６Ｃに示すように、ＭＶＡ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５は、Ｂ７マウスでＩＦＮγ－、ＴＮＦα－、及びＩＬ２を産生するｐｐ６５特異的Ｔ細胞応答を刺激した。ここで、ＩＦＮγを産生するｐｐ６５特異的Ｔ細胞の量が最も多く、ＩＬ２を産生するｐｐ６５特異的Ｔ細胞の量が最も少ない。一般に、ｐｐ６５特異的Ｔ細胞は、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５免疫Ｂ７マウスよりもＭＶＡ－７Ａｇ１免疫Ｂ７マウスで、高レベルで検出された（図１６Ａ－１６Ｆ）が、これは有意ではなかった。対照的に、２つ又は３つのサイトカインを産生する多機能ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の割合は、ＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５免疫Ｂ７マウスと比較してＭＶＡ－７Ａｇ１免疫Ｂ７マウスでわずかに減少したように見えた（図１６Ｇ）。興味深いことに、ＭＶＡ－７Ａｇ１で免疫したＢ７マウスは、ＩＦＮγ－、ＴＮＦα－、及びＩＬ２を産生するＰＣ特異的Ｔ細胞も発生した（図１６Ａ－１６Ｆ）。そして、Ｂ７マウスでＭＶＡ－７Ａｇ１によって刺激されたＰＣ特異的Ｔ細胞の約半分は多機能であった（図１６Ｇ）。

Ｂ７マウスでＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘導されるｐｐ６５特異的Ｔ細胞応答と比較して、Ａ２マウスでＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘導されたＩＦＮγ－、ＴＮＦα－、ＩＬ２産生ｐｐ６５特異的Ｔ細胞応答は低レベルであり、一般にＡ２マウスでＭＶＡＢ－ｐｐ６５によって誘導されたものよりも低かった（図１７Ａ－１７Ｆ）が、評価した動物の数による差は有意ではなかった。しかし、Ｂ７マウスでＭＶＡ－７Ａｇ１及びＭＶＡ^Ｂ－ｐｐ６５によって誘導されたｐｐ６５特異的Ｔ細胞とは異なり、Ａ２マウスでこれらのベクターによって誘導されたｐｐ６５特異的Ｔ細胞は主に多機能であった（図１７Ｄ－１７Ｇ）。しかし、最も驚くべきことに、印象的なレベルのＩＦＮγ－、ＴＮＦα－、及びＩＬ２産生ＰＣ特異的Ｔ細胞は、Ａ２マウスのＭＶＡ－７Ａｇ１によって誘導された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団全体の最大４５％に達した（図１７Ａ－１７Ｆ）。さらに、Ａ２マウスでＭＶＡ－７Ａｇ１を誘導したこれらの高レベルのＰＣ特異的Ｔ細胞の半分以上が多機能であった（図１７Ｇ）。トランスジェニックマウスにおけるこれらの結果は、ｐｐ６５及びＭＶＡ－７Ａｇ１によって発現されるＰＣサブユニットは、効率的に処理され、さまざまなＨＬＡ分子によって提示されて、多機能Ｔ細胞応答を刺激することができることを示唆している。

実施例１０： ８つのＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡの構築
ＭＶＡＢＡＣ－ＴＫ及びアンパッサン突然変異誘発（７２、８３）を利用して、ＨＣＭＶの５つのＰＣサブユニット（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、及びＵＬ１３１Ａ）、ｇＢ、ｐｐ６５、及びＩＥ１すべてを同時に発現するさまざまなＭＶＡベクター（ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１－４）が生成された（図１８）。２つ、４つ、又は５つの異なるＭＶＡ挿入サイトを利用して、８つのＨＣＭＶ抗原は、Ｐ２Ａにリンクされたポリシストロン性及び単一抗原発現コンストラクトとして異なる組み合わせでＩＧＲ ４４／４５、６４／６５、６９／７０、及び１４８／１４９、及びＤｅｌ３に挿入された。

実施例１１： ＭＶＡ－８ＡｇベクターによるＨＣＭＶ抗原の発現
実施例１０で生成された様々なＭＶＡコンストラクトを、ＢＨＫ細胞におけるＨＣＭＶ抗原発現について試験した。図１９に示すように、ＢＨＫ細胞をＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１の３つの異なるクローン（＃１－３）に感染させ、ＭＣＭＶ抗原発現のイムノブロット分析によってＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１の異なるクローンと比較した。結果は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１がＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ｇＨ、ｇＬ、ｐｐ６５、及びＩＥ１を発現したことを示す。この実験では、ＨＣＭＶ ｇＢ及びＵＬ１３０の発現は調査されなかった。さらに、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ１の抗原発現レベルはＭＶＡ^Ｂ－７Ａｇ１のそれと同等であり、ＭＶＡコンストラクトへのＩＥ１の添加が他の７つのＨＣＭＶ抗原の発現を妨害しないことを示唆している。図２０は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ２が８つのＨＣＭＶ抗原（ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＢ、ｐｐ６５、及びＩＥ１）すべてを発現することをイムノブロット分析によって確認している。図２１は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４によるＨＣＭＶ抗原発現のイムノブロットの例を示す。図２２は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３による８つのＨＣＭＶ抗原の発現、及びＣＥＦでの１０回のウイルス継代後のイムノブロットの例を示す。

実施例１２： マウスで８つのＨＣＭＶ抗原を発現するＭＶＡによって誘発される体液性及び細胞性免疫応答
８つの抗原ベクターＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４によって誘発された体液性免疫反応を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて７つの抗原ベクターＭＶＡ－７Ａｇ５によって誘発されたものと比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをワクチンで、１か月間隔で２回免疫した。そして、補体の非存在下又は存在下でＡＲＰＥ－１９細胞及びＭＲＣ－５線維芽細胞を使用して、ＨＣＭＶ株ＴＢ４０／Ｅに対するブーストの３週間後に血清ＮＡｂ応答を測定した。図２３Ａ－２３Ｂに示すように、８つのＨＣＭＶ抗原を発現する両方のＭＶＡベクターは、コントロールベクターＭＶＡ－７Ａｇ５に匹敵するレベルまで、マウスでＮＡｂ応答を正常に誘導した。８つの抗原ベクターＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４に対する細胞性免疫応答を、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２トランスジェニック（Ｂ７ Ｔｇ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスでＭＶＡ－７Ａｇ５によって誘導されたものと比較した。細胞内サイトカイン染色アッセイにおいて、免疫化されたＢ７ Ｔｇマウスの脾細胞をｐｐ６５特異的ペプチドライブラリー及びｐｐ６５ＨＬＡ－Ｂ＊０７制限エピトープで刺激することにより、８つの抗原をコードするＭＶＡベクターは、ＭＶＡ－７Ａｇ５ベクターによって誘導されるものと同等のＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２ ＣＤ８応答を誘導することが実証された（図２３Ｃ－２３Ｅ）。ＰＣに対する多機能Ｔ細胞応答は、ＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ３及びＭＶＡ^Ｂ－８Ａｇ４で免疫したトランスジェニックマウスでも誘導された（図２３Ｃ－２３Ｅ）。

参考文献
以下にリストされている参考文献、特許及び公開された特許出願、ならびに上記の明細書に引用されているすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

1. １つ以上のベクターを含む発現システム、各ベクターは、１つ以上の発現カセットを含み、各発現カセットは、以下：
   単一のプロモーターと、
   複数のＨＣＭＶ抗原をコードする複数の核酸配列と、
   前記複数の核酸配列のそれぞれの間のリボソームスキッピング又は１つ以上の内部リボソーム侵入部位を媒介する１つ以上の２Ａペプチドシグナル配列と、
   を含み、
   ここで、前記複数のＨＣＭＶ抗原は、当該発現システムによって同時に共発現されると、多機能性の体液性及び細胞性免疫応答を効果的に誘発する、発現システム。
   

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