CN115894708B - 一种人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽及其应用。所述人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽包含两个、三个或四个人巨细胞病毒抗原表位肽或由它们组成，其中所述抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。根据优化和筛选的HCMV重叠的T细胞表位，Th细胞表位和B细胞表位，本发明获得了四种HCMV优势抗原表位，其覆盖引起有效细胞免疫的PP65、PP150、IE1蛋白和引起有效体液免疫的gB、gH蛋白。包含该表位嵌合肽的疫苗在小鼠模型中具有良好的免疫原性及安全性，能够在短时间内引起体液免疫和细胞免疫反应。此外，该疫苗制备快速简便，成本较低，可在短时间内实现大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于免疫预防和治疗领域。具体地，本发明涉及一种人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽及其应用。
背景技术
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)感染可能是最普遍的人类感染。虽然发达国家卫生条件的改善、儿童与成人之间较少的密切接触降低了巨细胞病毒的流行率，但低收入和中等收入国家几乎100％的成年人都在年轻时被感染。巨细胞病毒感染T细胞并改变它们的反应，这被怀疑有助于动脉硬化和免疫衰老，并可能通过非调节作用促进癌症。然而，其最重要的医学意义在于，它是世界上最常见的先天性感染，最常见的是导致听力损失，在某些情况下也会导致小头症、智力发育迟缓、肝脾肿大和血小板减少性紫癜。一般来说，每200到30个新生儿中就有1个感染了经母亲传播的巨细胞病毒。胎儿感染的严重程度取决于母亲HCMV的血清学阳性或阴性。血清阴性孕妇感染胎儿的预后最差，但血清阳性母亲感染胎儿也可能造成严重后果。
此外，巨细胞病毒是移植最常见的感染。实体器官移植患者接受来自血清阳性供者的移植可能会发生疾病，而血清阳性的移植受体可能由于免疫抑制而重新激活HCMV。这些感染可能导致严重的疾病和移植排斥反应。HCMV感染是移植最常见的感染并发症，无论是实体器官还是造血干细胞移植。在实体器官，包括肾、肝、肺等移植的情况下，最危险的情况是HCMV血清阴性的受体从HCMV血清阳性的供者那里接受器官。在这种情况下，巨细胞病毒感染几乎是肯定的，发生疾病是常见的。以肾脏移植为例，如果不采取抗病毒预防措施，血清阴性的肾接受者中约有三分之一的人会出现巨细胞病毒病。有趣的是，即使是血清学阳性的受者在接受来自血清学阴性供者的器官移植时也可能患上巨细胞病毒病。由于从血清阴性供者那里接受器官的血清阳性受者患巨细胞病毒病的机率更低，这表明血清阳性受者的问题是在免疫抑制的影响下新毒株的重复感染，而不是重新激活，而造血干细胞移植(HSCT)后的情况则不同，其在免疫抑制的影响下的重新激活似乎是更加危险的。由于HCMV的潜伏不仅发生在循环T细胞中，还发生在淋巴结、内皮细胞、巨噬细胞等部位，因此出现再激活问题也就不足为奇了。抗病毒预防和/或治疗在移植中心常规进行，以预防严重的巨细胞病毒疾病，并取得了相当大的成功，但不是完全成功。疫苗接种在减轻巨细胞病毒疾病的严重程度方面取得了一些早期成功。
巨细胞病毒疫苗的开发始于20世纪70年代，当时病毒对子宫内婴儿和移植受者造成的损失变得明显。两种疫苗株是从实验室分离的病毒AD-169和Towne开始减毒的。AD169减毒株很快就被放弃了，但Towne减毒株继续在实体器官移植受者和正常男性和女性志愿者中进行广泛的试验。肾移植受者使用Towne减毒株后，对严重的巨细胞病毒疾病和移植物排斥反应具有高度的保护作用。然而，对HCMV感染的保护在统计学上没有显著性差异。正在研究的Towne株疫苗可以保护人类免受未减毒巨细胞病毒的攻击，但自然获得的免疫保护效力比注射疫苗后获得的免疫保护效力更高。此外，弱化毒株所得的减毒活疫苗未能保护妇女避免感染巨细胞病毒。
下一个重要的进展是HCMV表面蛋白的纯化，其称为糖蛋白B或gB，因为它与其他疱疹病毒的糖蛋白同源。当其与MF59水包油佐剂联合使用时，在6个月的时间内三次注射后，人体产生了良好水平的中和抗体。在自然暴露于巨细胞病毒的年轻女性中，该方案与安慰剂一同进行了两次测试，在这两种情况下，受试者与之前相比均能有效对抗巨细胞病毒感染，但抗体和疗效迅速消退。加强注射确实恢复了抗体水平。此外，当gB亚单位蛋白与刺激toll样受体(TLR)4的AS01佐剂结合时，在人体内引发了更高、更持久的抗gB抗体水平，但佐剂疫苗从未进行过有效性测试。值得注意的是，正在研究中的gB亚单位疫苗在实体器官移植患者中对巨细胞病毒病具有显著的保护作用，提示抗体在这种情况下的重要性。gB是一种三聚体融合蛋白的事实表明可能存在一种免疫原性更强的融合前形式，但这还没有被证实。
关于巨细胞病毒疫苗的可行性还有几个未解的问题，但也有一些明确的答案。巨细胞病毒通过接触唾液、性分泌物和移植获得。原则上，可以从HCMV保护中受益的人群有四种：育龄妇女血清阴性、育龄妇女血清阳性、HCMV血清阳性个体捐赠的实体器官(SO)受体和血清造血干细胞(HSC)受体。两种移植人群的巨细胞病毒血症的发病率是最高的。但是抗病毒预防是昂贵的且不是完全有效的，并且不能无限期地持续下去。在理想情况下，巨细胞病毒疫苗应在移植前接种，但对于获得新的免疫系统的HSC试验患者移植后应继续接种。虽然不是100％确定，但似乎SO试验受者需要HCMV抗体，而HSCT受者需要增强T细胞对HCMV的免疫。
在北美、欧洲及亚洲等地区，许多妇女怀孕时没有巨细胞病毒抗体，所以巨细胞病毒疫苗接种是合理的。如果疫苗诱导保护的持续时间足够长，将为妇女提供强有力的间接保护，以防止大多数孕妇在怀孕期间胎儿的宫内感染。因为无法阻断母婴传播，故通过接种疫苗加以预防是必要的。
发明内容
鉴于现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一种新型人巨细胞病毒嵌合多肽疫苗，其是以人巨细胞病毒编码蛋白表位肽为基础的多肽类疫苗，可用于预防和/或治疗孕妇和器官移植患者的HCMV病毒血症。基于上述目的，本发明首先通过生物信息学软件对HCMV抗原表位进行了预测，并从预测得到的表位优化和筛选了4种HCMV优势抗原表位，进而以原核系统表达获得了以人巨细胞病毒编码蛋白优势抗原表位肽为基础的嵌合多肽疫苗。
一方面，本发明提供了一种人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽，其包含两种、三种或四种人巨细胞病毒抗原表位肽或由它们组成，其中所述抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
根据本发明的一个实施方案，所述人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽包含四种人巨细胞病毒抗原表位肽或由它们组成，其中所述抗原表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
另一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗人巨细胞病毒感染或其相关疾病的药物组合物，其包含根据本发明的人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物为疫苗。
根据本发明的一个实施方案，所述药学上可接受的载体为pET28a载体或pET28a-SUMO载体。在本发明的优选实施方案中，当所述抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.4时，所述药学上可接受的载体为pET28a载体；当所述抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.3时，所述药学上可接受的载体为pET28a-SUMO载体
根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物为肌肉注射剂。
再一方面，本发明还提供了根据本发明的人巨细胞病毒抗原表位嵌合肽或药物组合物在制备预防和/或治疗人巨细胞病毒感染或其相关疾病的药物中的用途。
根据本发明的一个实施方案，所述人巨细胞病毒感染相关疾病为孕妇人巨细胞病毒血症。
根据本发明的一个实施方案，所述人巨细胞病毒感染相关疾病为器官移植患者的人巨细胞病毒血症。
本发明提供了人巨细胞病毒编码蛋白优势抗原表位，并以原核系统表达了以人巨细胞病毒编码蛋白优势抗原表位为基础的嵌合肽，作为新型人巨细胞病毒疫苗，其覆盖引起有效细胞免疫的PP65、PP150、IE1蛋白和引起有效体液免疫的gB、gH蛋白。其在小鼠模型和临床人群样本上均具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞和体液免疫反应。实验结果显示，三次免疫后14天，杀伤T细胞和辅助T细胞均能够明显被激活。该疫苗的制备方法快速、简便，可在短期内实现大规模生产，从而用于预防和/或治疗人巨细胞病毒的潜伏感染以及感染导致的疾病。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1A-图1D显示本发明获得的四种人巨细胞病毒优势抗原表位的基因表达载体构建图，其中图1A为优势抗原表位1的基因表达载体构建图；图1B为优势抗原表位2的基因表达载体构建图；图1C为优势抗原表位3的基因表达载体构建图；图1D为优势抗原表位4的基因表达载体构建图。
图2A-图2D显示本发明获得的四种人巨细胞病毒优势抗原表位基因扩增的菌落PCR验证结果。
图3A-图3E显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位1蛋白表达和纯化的结果。
图4A-图4D显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位2蛋白表达和纯化的结果。
图5A-图5C显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位3蛋白表达和纯化的结果。
图6A-图6D显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位4蛋白表达和纯化的结果。
图7为疫苗首次免疫小鼠后42天内，小鼠体重的变化情况，其中箭头所指为疫苗注射时间。
图8为疫苗免疫三针后(14天/针)，流式细胞术检测小鼠脾脏CD3+/CD4+T细胞中IL2、IL4和TNF-α的表达情况。
图9为疫苗免疫三针后(14天/针)，流式细胞术检测小鼠脾脏CD3+/CD8+T细胞中IL2、IFN-γ和TNF-α的表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
人巨细胞病毒优势抗原表位的筛选
1.采用生物信息学方法对5个HCMV编码膜蛋白的B细胞、Th细胞和CTL细胞表位进行预测。HCMV的膜蛋白序列来源于美国国家生物技术中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
具体地，选取PP65、PP150、IE、gB和gH五种蛋白，分别使用DNAstar、IEDB(score>0.5)和TMHMM软件进行B细胞抗原表位预测；使用SYFPEITHI(score>20)、IEDB(rank<1)、NetMHCII pan和NetMHCII软件对HCMV膜蛋白进行Th细胞抗原表位预测；使用IEDB、SYFPEITHI和NetMHCI软件对HCMV膜蛋白进行CTL细胞抗原表位预测。
1.1 Th抗原表位的筛选
利用四种软件：SYFPEITHI、IEDB、NetMHCII pan及NetMHCII筛选和预测了21种膜蛋白及设定的IE、gB、gH、PP65、PP150等病毒编码蛋白的Th表位，从中选取重叠结果。选择了6个HLA等位基因，包括HLA-DRB1*01:01、HLA-DRB1*03:01、HLA-DRB1*04:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*11:01和HLA-DRB1*15:01。筛选标准设定为SYFPEITHI评分>20，IEDB评分<1.00，NetMHC II pan评分<10，NetMHC II评分<10。配体的长度设定为15，其他设置均为默认值。
1.2 21个膜蛋白及其它病毒编码蛋白Th抗原表位预测结果
利用四种软件筛选21个膜蛋白及参考文献设定的IE1、IE2、PP65、PP150等病毒编码蛋白的Th表位：SYFPEITHI、IEDB、NetMHCII pan及NetMHCII，使用它们同时预测并从中选取重叠结果。选择6个HLA等位基因，包括HLA-DRB1*01:01、HLA-DRB1*03:01、HLA-DRB1*04:01、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*11:01、HLA-DRB1*15:01。筛选标准设定为SYFPEITHI评分>20，IEDB评分<1.00，NetMHC II pan评分<10，NetMHC II评分<10。配体的长度设定为15，其他设置均为默认值。
1.3 B抗原表位的筛选
利用软件TMHMM、ABCpred、IEDB和DNAstar预测B细胞抗原表位。鉴于膜外蛋白是B细胞表位的前体条件，利用TMHMM软件预测出17个HCMV病毒编码膜糖蛋白的非跨膜区作为筛选表位的区段。用ABCpred作为第二个HCMV病毒编码B细胞抗原表位预测软件，参数设置为：肽段长度16个氨基酸，阈值选择大于等于0.8分，得到的肽段作为此软件预测的结果，以此结果为基准，综合其他软件进行筛选，排除掉与其他软件预测结果不相重叠的肽段。通过在线软件IEDB中的Bepipred法进行预测，参数为默认参数，将得到的结果与ABCpred软件预测出来的结果进行对比，保留两个软件预测结果相一致的肽段。采用DNAstar中的Protean模块进行预测，选择的参数有二级结构中的β-转角和无规卷曲、亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数，选择同时满足大于或等于以上四种参数的肽段，作为本软件预测的结果。然后将此结果与通过上述三种软件得到的结果进行比对，进一步排除与本软件不重叠的那部分表位，得到最终预测筛选表位，视为HCMV病毒编码B细胞优势抗原表位。
2.对针对PP65、PP150、IE1、gB和gH五种蛋白的B细胞表位、Th细胞表位和CTL细胞表位的重合部分进行进一步筛选。
将5种蛋白，即PP150、PP65、IE、gH和gB中能够同时被B细胞，CTL细胞和Th细胞识别的表位作为优势抗原表位1、2、3和4，其氨基酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示，获得的重叠优势抗原表位1、2、3和4的核苷酸序列分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，由此可在大肠杆菌原核表达系统得到相应嵌合蛋白。
利用SYFPEITHI、IEDB和NetMHC三种在线软件对蛋白潜在的CD8+T细胞抗原表位进行预测，本实施例选择HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*26:01共6个覆盖率可达到57.6％中国人的MHC-I类分子优势基因位点。筛选标准设定为：SYFPEITHI评分>20，IEDB评分<0.1，NetMHC评分<10。每个抗原表位的肽段长度设定为9个氨基酸，其他设置均为默认值。
实施例2
人巨细胞病毒优势抗原表位的表达
1.载体构建与扩增
1.1载体构建
如图1A-图1D所示，分别构建包含实施例1获得的4种优势抗原表位基因的基因表达载体。
1.2 PCR扩增
采用表1所示PCR扩增反应体系和表2所示的引物，在表3所示PCR扩增反应条件下进行PCR扩增。
表1 PCR扩增反应体系
表2引物
表3 PCR扩增反应条件
扩增片段的电泳检测以及回收步骤参照试剂盒说明书(DNA回收试剂盒，天根生化科技有限公司)。
1.3菌落PCR验证
取100μl转化的菌液涂布含有氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单克隆进行小摇。取菌液采用表1所示的反应体系和表2所示的引物进行菌落PCR实验，菌落PCR验证结果见图2A-图2D。其中图2A显示优势抗原表位1基因扩增的菌落PCR验证结果；图2B显示优势抗原表位2基因扩增的菌落PCR验证结果；图2C显示优势抗原表位3基因扩增的菌落PCR验证结果；图2D显示优势抗原表位4基因扩增的菌落PCR验证结果。从图2A-图2D中可以看出，四种载体已构建完成且成功挑选出单克隆菌落。
2.表达验证
2.1优势抗原表位1的蛋白(即P1)表达验证，包括：小量表达SDS-PAGE检测；大量表达及破菌SDS-PAGE检测；纯化蛋白SDS-PAGE检测；复性纯化蛋白SDS-PAGE检测；酶切。
2.2优势抗原表位2的蛋白(即P2)表达验证，包括：小量表达SDS-PAGE检测；大量表达及破菌SDS-PAGE检测、纯化蛋白SDS-PAGE检测、复性纯化及酶切蛋白SDS-PAGE检测。
2.3优势抗原表位3的蛋白(即P3)表达验证，包括：小量表达SDS-PAGE检测；大量表达及破菌SDS-PAGE检测；上清纯化及酶切重组蛋白SDS-PAGE检测。
2.4优势抗原表位4的蛋白(即P4)表达验证，包括：小量表达SDS-PAGE检测；大量表达及破菌SDS-PAGE检测；纯化蛋白SDS-PAGE检测；复性纯化及酶切蛋白SDS-PAGE检测。
图3A-图3E为本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位1蛋白表达和纯化的结果，其中箭头所指均为重组蛋白。
图3A为小量表达SDS-PAGE检测中阳性菌株全菌蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：宿主菌全菌蛋白，泳道2：IPTG诱导全菌蛋白；
图3B为大量表达及破菌SDS-PAGE检测中大量表达的菌体破碎上清及沉淀SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：诱导表达破碎后的上清蛋白，泳道2：诱导表达破碎后的不溶蛋白；
图3C为纯化蛋白SDS-PAGE检测中纯化包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：纯化包涵体蛋白；
图3D为复性纯化蛋白SDS-PAGE检测中洗脱浓缩蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：洗脱浓缩蛋白；
图3E为酶切后纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：酶切后纯化蛋白，泳道2：酶切前纯化蛋白。
图4A-图4D显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位2蛋白表达和纯化的结果，其中箭头所指均为重组蛋白。
图4A为小量表达SDS-PAGE检测中阳性菌株全菌蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：宿主菌全菌蛋白，泳道2：IPTG诱导全菌蛋白；
图4B为大量表达及破菌SDS-PAGE检测中大量表达的菌体破碎上清及沉淀SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：诱导表达破碎后的上清蛋白，泳道2：诱导表达破碎后的不溶蛋白；
图4C为纯化蛋白SDS-PAGE检测中纯化包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：纯化包涵体蛋白；
图4D为复性纯化及酶切蛋白SDS-PAGE检测中洗脱浓缩蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：复性纯化后蛋白，泳道2：酶切后纯化蛋白。
图5A-图5C显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位3蛋白表达和纯化的结果，其中箭头所指均为重组蛋白。
图5A为小量表达SDS-PAGE检测中阳性菌株全菌蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：宿主菌全菌蛋白，泳道2：IPTG诱导全菌蛋白；
图5B为大量表达及破菌SDS-PAGE检测中大量表达的菌体破碎上清及沉淀SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：诱导表达破碎后的上清蛋白，泳道2：诱导表达破碎后的不溶蛋白；
图5C为上清纯化及酶切重组蛋白SDS-PAGE检测中洗脱浓缩蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：酶切后蛋白，泳道2：洗脱浓缩蛋白。
图6A-图6D显示本发明获得的人巨细胞病毒优势抗原表位4蛋白表达和纯化的结果，其中箭头所指均为重组蛋白。
图6A为小量表达SDS-PAGE检测中阳性菌株全菌蛋白SDS-PAGE电泳图，蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：宿主菌全菌蛋白，泳道2：IPTG诱导全菌蛋白；
图6B为大量表达及破菌SDS-PAGE检测中大量表达的菌体破碎上清及沉淀SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：诱导表达破碎后的上清蛋白，泳道2：诱导表达破碎后的不溶蛋白；
图6C为纯化蛋白SDS-PAGE检测中纯化包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：纯化包涵体蛋白；
图6D为复性纯化及酶切蛋白SDS-PAGE检测中洗脱浓缩蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)，泳道1：酶切后纯化蛋白，泳道2：复性纯化后蛋白。
通过以上优势抗原表位1-4的蛋白表达验证结果可以看出，本发明已成功表达P1、P2、P3及P4大肠杆菌重组蛋白并且完成大量表达，以供后续实验进行蛋白疫苗免疫学评价。
实施例3
不同构建大肠杆菌重组蛋白在小鼠模型上的免疫学评价
1.疫苗安全性评估
1.1小鼠体重检测
在免疫实验期间监测小鼠体重，与阴性对照组相比，实验组小鼠体重没有出现明显的下降，结果如图7所示，图中箭头所指日期为疫苗注射日期，共免疫三针。
2.疫苗细胞免疫反应检测
2.1疫苗诱导产生细胞免疫反应
用15μg大肠杆菌系统重组蛋白疫苗P1、P2、P3、P4分别通过肌肉注射形式免疫小鼠，共免疫三次，每次间隔14天，于末次免疫后14天取小鼠脾脏分离淋巴细胞，制备单细胞悬液，用流式细胞术检测T淋巴细胞免疫反应情况。结果图8和9所示。
图8为疫苗免疫三针后(14天/针)，流式细胞术检测小鼠脾脏CD3+/CD4+T细胞中IL2、IL4和TNF-α的表达情况。图9为疫苗免疫三针后(14天/针)，流式细胞术检测小鼠脾脏CD3+/CD8+T细胞中IL2、IFN-γ和TNF-α的表达情况。实验结果表明，与对照组相比，P1、P2、P3、P4均能不同程度激活T淋巴细胞并诱导细胞因子分泌。
以上所述仅是本发明的几个示例性实施例，并非对本发明做任何形式的限制。虽然本发明以较佳的实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案范围内。
Claims (3)
1. 一种人巨细胞病毒抗原表位肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1。
2. 一种基因表达载体，其包含权利要求1所述的人巨细胞病毒抗原表位肽的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
3.根据权利要求2所述的基因表达载体，其中，所述基因表达载体的载体为pET28a。
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