CN112512569A - 表达多个巨细胞病毒(cmv)抗原的mva载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
所公开的是一种共表达多个人巨细胞病毒(HCMV)抗原以激发针对HCMV感染的有效的体液和细胞免疫应答的表达系统。该表达系统可包括被插入多个核酸序列的载体，该多个核酸序列编码通过一个或多个连接序列连接的HCMV抗原的多个亚单位，使得该亚单位同时被共表达。所公开的还有包含该表达系统或载体的疫苗组合物以及使用该疫苗组合物预防或治疗HCMV感染的方法。
Description
优先权声明
本申请要求于2018年5月11日提交的美国临时申请号62/670,607的优先权，其通过引用整体并入本文，包括附图。
政府权益声明
本发明在国家过敏症和传染病研究所授予的批准号AI103960和AI63356的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景
发育中的胎儿的人巨细胞病毒(HCMV)感染是永久性出生缺陷的最常见感染原因(6，44)，导致的先天性疾病多于美国目前所有已检测的新生儿病症的总和(13)。仅在美国，每年就有超过5000名儿童遭受宫内HCMV感染引发的长期医疗病症(11)，最常见导致听觉和认知障碍，但也可能导致更严重的后果，包括脑钙化，小头畸形，和死产(6，44)。然而，尽管认识到HCMV是主要的健康问题(66)，但大多数女性并未意识到先天性HCMV感染(12)，并且预防或治疗先天性HCMV传播或疾病的干预措施仍然难以捉摸(55)。尽管已经开发了许多HCMV疫苗策略(70)，但只有对基于减毒活疫苗株(strain)Towne或与MF59佐剂结合的重组糖蛋白B(gB)的两种方法针对预防育龄女性HCMV感染的功效进行了评估(2，60)。虽然Towne无法预防其子女参加日托的母亲的感染(1)，但gB/MF59对预防产后HCMV血清反应阴性(HCMV-)的年轻女性的感染显示了50％的功效(51)。此外，gB/MF59在实体器官移植接受对象中显示了降低HCMV病毒血症的功效和抗病毒治疗的需要，由此gB抗体滴度(titers)与病毒载量(load)的降低呈负相关(26)。尽管gB/MF59疫苗无法在HCMV-的青春期少女中重现50％的功效(4)，但gB/MF59仍然是唯一可以降低母体HCMV感染风险的有前景的疫苗候选物。
至于其他病毒疫苗的开发(53)，开发先天性HCMV疫苗的侧重点一直致力于中和抗体(NAb)的诱导，其预防体外包膜(envelope)糖蛋白复合物介导的病毒进入(59，70)。在过去的几年中，已经认识到HCMV利用不同的进入途径感染成纤维细胞(FB)和上皮细胞(EC)，这取决于不同组的包膜糖蛋白复合物(22，28，80)。尽管FB和EC的HCMV感染似乎都取决于由gM/gN，gB，和gH/gL/gO组成的糖蛋白复合物(78，79，89)，但EC感染还需要由gH，gL，UL128，UL130，和UL131A组成的五聚体复合物(PC)(27，57，74)。与HCMV进入的这些包膜糖蛋白需求一致，靶向gB或gH的表位的NAb可有效地干扰FB和EC感染(15，33，43，54，81)，并且相似的抑制能力似乎由靶向gO或gM/gN的NAb介导(23，43)。相比之下，主要识别PC的UL128/130/131A亚单位的四级构象(conformational)表位的NAb，尽管具有极高的阻断EC进入的能力，却无法预防FB感染(15，33，43，80)。虽然尚不清楚哪种糖蛋白组合可以最佳地促进HCMV NAb诱导，但临床前疫苗研究已经不断证实gB和gH/gL可以激发针对FB和EC感染的高滴度NAb(33，42)，由此PC是明显的免疫原性的以诱发阻断EC进入的NAb(33，77，81，85)。但是，因为PC诱发靶向UL128/130/131A亚单位的表位的NAb，还会诱发靶向gH的表位的NAb(15，33)，因此仅PC即可诱发预防EC和FB的HCMV感染的有效的NAb(33，80，81)。
虽然体液和细胞免疫应答均被认为对于预防先天性HCMV感染是重要的(30，41，58)，但是HCMV疫苗的开发由于对免疫相关的保护知之甚少，复杂的免疫逃避机制，和易受HCMV感染的动物模型的缺乏而受到阻碍(5，29，31，61)。此外，鉴于原发性感染或再感染或病毒再激活导致的复发性感染使得孕妇发生先天性HCMV感染，目前正在积极讨论有效的HCMV疫苗的可行性和潜在的健康影响(7，52)。然而，尽管预先存在的HCMV免疫力(immunity)的保护尚不明确，但自然获得的母体HCMV免疫力被认为针对先天性HCMV感染和疾病提供实质性保护(21，30，52)。在此前提下，假设通过能够诱发稳健的孕前(preconceptional)HCMV免疫力的疫苗可以降低先天性感染的发生率和先天性疾病的严重性(52，58)。
除了是先天性感染的主要原因，HCMV也是移植接受对象并发症的常见原因。此外，HCMV与其他疾病(如动脉粥样硬化，免疫衰老，和儿童急性淋巴细胞白血病)有关。因此，非常需要开发激发稳健的体液和细胞免疫应答以潜在地预防不同目标群体中与HCMV相关的疾病的多抗原性HCMV疫苗候选物。本发明满足了该领域的需求。
概要
一方面，本公开涉及同时共表达多个HCMV抗原的表达系统。表达系统可包括载体，该载体被插入编码通过一个或多个连接序列连接的多个HCMV抗原的多个核酸序列，使得多个HCMV抗原可同时被共表达。载体可以是病毒载体，如MVA载体。在一些实施例中，连接序列是内部核糖体进入位点(IRES)或编码介导核糖体跳跃(skipping)的2A肽的核酸序列。在一些实施例中，载体在多个核酸序列之前插入单启动子，使得该单启动子控制多个核酸序列的表达。在一些实施例中，编码多个HCMV抗原的多个核酸序列仅被插入至一个MVA插入位点。在一些实施例中，编码多个HCMV抗原的多个核酸序列被插入至两个或更多个MVA插入位点。在一些实施例中，针对疫苗病毒表达可对HCMV抗原基因序列进行密码子优化以增强其在MVA内的稳定性。
另一方面，提供了预防HCMV感染的疫苗组合物。疫苗组合物可包括能够同时共表达多个HCMV抗原的载体，以及药学上可接受的运载体，佐剂，添加剂，或其组合。在一些实施例中，两个或更多个HCMV抗原通过一个或多个连接序列连接，使得多个HCMV抗原可同时被共表达。在一些实施例中，连接序列包括IRES和编码2A肽的核酸序列。在一些实施例中，载体在多个核酸序列之前插入单启动子，使得该单启动子控制多个核酸序列的表达。
另一方面，提供了预防或治疗HCMV感染的方法。此类方法可包括用有效量的病毒载体感染细胞，该病毒载体包含编码通过一个或多个连接序列连接的多个HCMV抗原的多个核酸。
在另一个实施例中，提供了诱导稳健的HCMV特异性体液和细胞免疫应答以预防或治疗受试者的HCMV感染的方法。此类方法可包括向受试者施用治疗有效量的疫苗，其中该疫苗包含能够同时共表达多个HCMV抗原的载体，以及药学上可接受的运载体，佐剂，添加剂(例如，CD40L)，或其组合。
根据上述实施例，病毒载体是被修饰的痘苗安卡拉(MVA)，并且被表达的HCMV抗原包括包膜五聚体复合物(PC；UL128，UL130，UL131A，糖蛋白L(gL)，和糖蛋白H(gH))的全部五个亚单位，糖蛋白B(gB)，磷蛋白65(pp65)，和/或即早(immediate early)1和2蛋白(IE1和IE2)。其他重要的免疫靶标，如糖蛋白gM，gN，或gO，或其抗原性片段，或任何其他HCMV抗原或其片段，也可被包含在表达系统中。
附图简要说明
图1A-1B示出了表达多个HCMV抗原的MVABAC-TK衍生的重组体的BAC序列的无缝(seamless)去除。图1A是BAC载体去除的图示。通过在大肠杆菌中进行伴随(En passant)诱变，将胸苷激酶(TK)基因序列和mRFP表达盒的基因组拷贝(duplication)插入BAC载体序列(cat，OriS，repE，sopA/B/C，cos，loxP，GFP标志物)，在MVABAC-TK衍生的重组MVAB-7Ag1中的抗性标志物(cat)和OriS细菌复制(replication)起点之间。在来自BHK细胞中的重组BAC载体的病毒重建后，基因组拷贝介导细菌载体序列的自发去除，并且TK基因被无缝地复原(restored)，从而产生MVA-7Ag1。mH5＝被修饰的H5启动子，P11＝痘苗P11启动子，B＝BAC载体。图1B示出了通过PCR确认BAC去除。用MVAB-7Ag1(有BAC)，MVA-7Ag1(无BAC)，或亲本MVA感染BHK细胞，并使用位于TK基因侧翼的引物(图1A所示的P1和P2)通过PCR研究从被感染的细胞中分离的DNA以确认TK基因的基因座(预期的1598bp的片段)的复原，以及对cat和sopA具有特异性的引物对(见图1A)以验证残余载体序列的去除(分别为预期的580bp和476bp的片段)。未被感染的BHK细胞在PCR分析中用作其他对照。
图2A-2F示出了同时表达HCMV的PC亚单位，gB和pp65的MVA载体。使用MVABAC-TK生成了不同的重组MVA载体，它们共表达HCMV的全部五个PC亚单位(gH，gL，UL128，UL130，UL131A)，gB，和pp65。在MVAB-7Ag1-4载体中(图1A-1D)，将由UL128/130/131A，gH/gL，和pp65组成的P2A连接的，多顺反子的单个抗原表达构建体如所示插入基因间区域(IGR)64/65和69/70以及MVA缺失3位点(Del3)。将gBΔTM(无TM的gB)的表达盒插入IGR 44/45，7/8，122/123，或148/149中以分别生成MVAB-7Ag1(图2A)，MVAB-7Ag2(图2B)，MVAB-7Ag3(图2C)，或MVAB-7Ag4(图2D)。在MVAB-7Ag5(图2E)和MVAB-7Ag6(图2F)中，将由全部五个PC亚单位组成的P2A连接的多顺反子的表达构建体插入IGR 69/70，并将pp65/gBΔTM的P2A连接的表达构建体引入Del3位点或重构的(restructured)Del3位点(Del3 res.)以分别生成MVAB-7Ag5(图2E)和MVAB-7Ag6(图2F)。IGR的MVA基因名称基于登录号(Accession Nr.)U94848。抗原之间的P2A信号序列使用不同的编码序列(P2A1-P2A5)。mH5＝被修饰的H5启动子；B＝BAC载体。
图3示出了对照载体。使用与用于MVAB-7Ag1的构建相同的插入位点和表达构建体，用MVABAC-TK生成了MVA载体，表达全部五个PC亚单位与gB(MVAB-PC/gB)，PC亚单位与pp65(MVAB-PC/pp65)，或仅表达PC亚单位(MVAB-PC)，gB(MVAB-gB)，或pp65(MVAB-pp65)的MVA(图2A)。
图4A-4C示出了七抗原性MVA疫苗载体对HCMV抗原表达的稳定性测试。如图2A-2D所示，包含密码子优化的HCMV基因序列的七抗原性疫苗载体MVAB-7Ag1，MVAB-7Ag2，MVAB-7Ag3，和MVAB-7Ag4的不同克隆(#)在BHK细胞上经过10次病毒传代以低感染复数(multiplicity)繁殖。使用10次病毒传代(1-10)的病毒感染BHK细胞，并用对各抗原具有特异性的多克隆(UL131A)和单克隆(gH，UL130，pp65，gB)抗体通过免疫印迹(Immunoblot)评估被感染的BHK细胞的全细胞裂解物。用先前生成的被MVA-gB和MVA-PC载体感染的BHK细胞(81)以及未被感染的细胞作为对照。检测痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。PP＝前体蛋白；CT＝C-末端裂解产物。
图5A和5B示出了含有未密码子优化的HCMV抗原的七抗原性MVA载体对HCMV抗原表达的稳定性测试。包含密码子优化的PC亚单位基因序列和未密码子优化的pp65和gB基因序列的MVAB-7Ag1NCO(#67和#68)和MVAB-7Ag3NCO载体的两个不同的克隆在BHK细胞上经过10次病毒传代以低感染复数繁殖。使用10次病毒传代(1-10)的病毒感染BHK细胞，并用对各抗原具有特异性的多克隆(UL131A，gL，UL128)和单克隆(gH，UL130，pp65，gB)抗体通过免疫印迹评估被感染的细胞的全细胞裂解物。用被先前生成的MVA-gB和MVA-PC载体感染的BHK细胞(81)以及未被感染的BHK细胞作为对照。检测痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。请注意，由于未知原因，在MVAB-7Ag3NCO的第4和第6代中仅检测到非常少量的蛋白。PP＝前体蛋白；CT＝C-末端裂解产物。
图6A和6B示出了MVAB-7Ag1和对照载体对HCMV抗原表达的比较。图6A示出了免疫印迹分析。使用对HCMV抗原具有特异性的多克隆(gL，UL128，UL131A)和单克隆(gH，UL130，gB，pp65)抗体通过免疫印迹评估了被MVA-7Ag1(图2A；在6A中表示为MVAB-PC/gB/pp65)或仅表达抗原亚群(subsets)的对照载体(MVAB-PC/gB，MVAB-PC/pp65，图3)感染的BHK细胞的细胞裂解物。检测痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。PP＝前体蛋白；CT＝gB C-末端裂解产物。图6B示出了流式细胞术分析。使用单克隆NAb通过细胞表面流式细胞术分析评估被MVAB-7Ag1或对照载体感染的活的，非透性化(non-permeabilized)BHK细胞，该单克隆NAb靶向由UL128/130/131A(1B2，12E2)或UL130/131A(54E11)形成的构象表位，UL128(13B5)内的表位，或gH(18F10，21E9，62-11，2-80)内的表位。X轴表示荧光强度的log10，y轴表示细胞计数。在图6A和6B中被表达荧光标志物Venus(MVA-Venus)的MVA感染的BHK细胞或未被感染的细胞作为对照进行了分析。
图7示出了MVAB-7Ag1在CEF中病毒繁殖后的抗原表达的稳定性。如图2A所示，含有密码子优化的HCMV基因序列的MVAB-7Ag1载体在CEF细胞上经过10次病毒传代以低感染复数繁殖。使用初始接种体(0)和10次病毒传代(1-10)的病毒感染BHK细胞，并用对各抗原具有特异性的多克隆和单克隆抗体通过免疫印迹评估被感染的BHK细胞的全细胞裂解物。分析了被MVA-Venus感染的BHK细胞或未被感染的细胞作为对照。检测痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。PP＝gB前体蛋白；CT＝C-末端裂解产物。
图8A和8B示出了在BAC载体去除后，MVA-7Ag1(图8A)和MVA-7Ag5(图8B)抗原表达的稳定性。去除了BAC序列(BAC去除见图1)且具有密码子优化的HCMV基因序列的MVA-7Ag1和MVA-7Ag5在CEF细胞上经过10次病毒传代以低感染复数繁殖。使用初始接种体(0)和10次病毒传代(1-10)的病毒感染BHK细胞，并用对各抗原具有特异性的多克隆和单克隆抗体通过免疫印迹评估被感染的BHK细胞的全细胞裂解物。分析了被MVA-Venus感染的BHK细胞或未被感染的细胞作为对照。检测痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。PP＝gB前体蛋白；CT＝C-末端裂解产物。
图9A-9F示出了由MVAB-7Ag1和对照载体在小鼠中诱导的NAb应答。每四周通过腹膜内(i.p.)途径用MVAB-7Ag1(在此图小图中命名为MVAB-PC/gB/pp65)或对照载体(MVAB-PC/gB，MVAB-PC/pp65，MVAB-PC，MVAB-gB，MVAB-pp65)对C57BL/6小鼠(N＝4-5)进行三次疫苗接种，并且在不存在(-)或存在(+)5％豚鼠血清作为补体来源的情况下，测量针对HCMV株TB40/E(图9A，9B)，TR(图9C，9D)，Towne(图9E)，和AD169(图9F)的ARPE-19细胞和MRC-5细胞上的疫苗组的HCMV特异性血清NAb滴度(NT50；几何平均滴度(GMT))。线(Bars)表示具有95％置信区间的几何均值。使用单向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验，计算比较各组的差异的统计显著性(NS＝p＞0.05)，而使用双向ANOVA，然后进行Sidak多重比较检验，计算存在或不存在补体的情况下NAb滴度之间的差异。
图10A-10D示出了体液免疫应答介导ADCC和由MVAB-7Ag1和对照载体诱导的结合抗体。针对ADCC和结合抗体评估了用如图9所述的MVAB-7Ag1(MVA-PC/gB/pp65)或对照载体进行了免疫的C57BL/6小鼠免疫血清。图10A-10B示出了ADCC。通过使用ADCC替代(surrogate)报告基因试验来研究被免疫的小鼠血清样品的连续稀释与被TB40/E(图10A)或TR(图10B)感染的ARPE-19细胞结合后诱导ADCC的能力。线表示重复(duplicates)的标准偏差。图10C-10D示出了结合抗体。使用纯化的gB和PC蛋白通过ELISA评估gB特异性(10C)和PC特异性(10D)结合IgG终点滴度。虚线表示分析出的最低血清稀释。线表示具有95％置信区间的几何均值。使用单向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验，计算比较各组的差异的统计显著性(NS＝p＞0.05)。
图11A-11C示出了由MVAB-7Ag1和对照载体诱导的T细胞应答。对用MVAB-7Ag1(MVAB-PC/gB/pp65)和对照载体免疫的C57BL/6小鼠的免疫血清的T细胞应答进行评估。利用先前描述的HCMV的pp65(图11A)，gB(图11B)，和PC亚单位(图11C)的小鼠H2-b限制性免疫反应性肽通过IFNγ-ELISPOT测定离体T细胞应答。水平线表示组均值，线表示标准偏差。使用单向ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验，研究组之间的差异(NS＝p＞0.05)。请注意在图11C中，除一只小鼠外，所有动物的IFNγ应答均高于阈值，因此不能评估各组之间的差异。
图12A-12D示出了由MVA-7Ag1在小鼠中诱导的HCMV免疫应答的持久性。用标准或低剂量(LD)的MVA-7Ag1(MVA-PC/gB/pp65)，或仅用标准剂量的对照载体MVA-PC和MVA-Venus对Balb/c小鼠进行三次间隔四周的腹膜内免疫(三角形)。图12A-12C示出了NAb滴度。在免疫后30周内的指定时间点，在不存在(12A)或存在(12B)5％豚鼠补体的MRC-5细胞上以及在不存在补体的ARPE-19细胞上(12C)针对HCMV株TB40/E测量预防50％感染(NT50)的NAb滴度。图12D示出了由痘苗载体诱导的离体T细胞应答。在第30周进行额外的加强免疫后，利用pp65和gB肽库通过IFNγ-ELISPOT测定被免疫的小鼠的离体T细胞应答。图12A-12C中的线表示具有95％置信区间的几何均值。图12D中的线表示具有标准偏差的均值。使用单向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验，计算比较各组的差异的统计显著性。
图13A-13C示出了病毒传代后MVA-7Ag1的免疫原性。用在CEF上经过10次病毒传代之前和之后所衍生的MVA-7Ag1对Balb/c小鼠(n＝8)进行三次间隔四周的腹膜内免疫(三角形)。图13A-13B示出了在不存在豚鼠补体的ARPE-19细胞上，和在不存在和存在5％豚鼠补体的MRC-5FB上针对TB40/E测量NT50滴度。图13C示出了使用pp65和gB库通过IFNγ-ELISPOT确认被免疫的动物的T细胞应答。A和B中的虚线表示分析出的最低血清稀释。图13A和13B中的线表示几何均值的95％置信区间。图13C中的线表示具有标准偏差的均值。使用单向方差分析(ANOVA)，然后进行Sidak多重比较检验，计算图13A和13B中比较各组的差异的统计显著性。通过多重t检验计算图13C中组之间的差异(NS＝p＞0.05)。
图14A-14C示出了由MVA-7Ag4，MVA-7Ag5，和MVA-7Ag6在小鼠中诱导的HCMV免疫应答。用MVA-7Ag4，MVA-7Ag5，或MVA-7Ag6对Balb/c小鼠进行三次间隔四周的腹膜内免疫(三角形)，并且在不存在补体的ARPE-19细胞上(14A)，和在不存在或存在5％豚鼠补体的MRC-5FB上(14B)针对HCMV株TB40/E测量预防50％感染(NT50)的NAb滴度。图14C示出了使用pp65和gB库通过IFNγ-ELISPOT确认被免疫的动物的T细胞应答。图14A和14B中的虚线表示分析出的最低血清稀释。图14A和14B中的线表示几何均值的95％置信区间。图14C中的线表示具有标准偏差的均值。通过多重t检验计算组之间的差异(NS＝p＞0.05)。
图15A和15B示出了由MVA-7Ag1诱发的人MHC限制性T细胞应答。用MVA-7Ag1或MVA-Venus作为对照对表达人HLA-A*0201(A2 Tg，15A)或HLA-B*0702(B7 Tg，15B)I类分子的转基因C57BL/6小鼠(n＝5)进行两次间隔四周的免疫。加强免疫后一周，使用pp65和gB特异性肽库，pp65的HLA-A*0201或HLA-B*0702限制性免疫显性肽表位，或gB或PC的小鼠H2-b限制性肽池(pools)通过IFNγ-ELISPOT测定抗原特异性T细胞应答。线表示具有标准偏差的均值。使用双向ANOVA，然后进行Sidak多重比较检验，计算组之间差异的显著性。
图16A-16G示出了由MVA-7Ag1诱发的HLA-B*0702限制性多功能CD8+T细胞。图16A-16C示出了用MVA-7Ag1，MVAB-pp65(n＝5)，或MVA-Venus(n＝1)对HLA-B*0702(B7)转基因小鼠(n＝5)进行两次间隔四周的免疫。免疫一周后，在用pp65和PC特异性肽库，或HLA-B*0702限制性免疫显性pp65肽表位进行刺激后，通过多细胞因子-ICS评估抗原特异性T细胞应答。图中所示出的是在用不同的刺激物刺激来自B7 Tg免疫的小鼠的脾细胞后，分泌IFNγ(图16A)，TNFα(图16B)，或IL2(图16C)的CD8+T细胞的百分比。图16D-16F示出了在MVA-7Ag1，MVAB-pp65，或MVA-Venus免疫的B7小鼠中，用HLA-B*0702限制性pp65肽表位(图16D)，pp65特异性肽库(图16E)，或PC特异性肽库(图16F)进行体外刺激后，产生IFN-γ，TNF-α，和IL-2细胞因子的所有组合的抗原特异性CD8+T细胞的频率。水平线表示中值。图16G是饼图，示出了在MVA-7Ag1或MVAB-pp65免疫的B7小鼠中，对pp65表位，pp65库或PC库的总多功能应答中的每个多功能亚群的相对贡献。每个饼图表示被免疫的小鼠中对三种不同抗原刺激的平均应答。在每个饼图下示出了响应肽刺激的CD8+T细胞的平均总百分比。图例中表示了多功能亚群和函数(Fn°)。使用多重t检验计算组之间差异的显著性。
图17A-17G示出了由MVA-7Ag1诱发的HLA-A*0201限制性多功能CD8+T细胞。用MVA-7Ag1，MVAB-pp65(n＝5)，或MVA-Venus(n＝1)对HLA-A*0201(A2)转基因小鼠(n＝5)进行两次间隔四周的免疫。免疫一周后，在用pp65和PC特异性肽库，或HLA-A*0201限制性免疫显性pp65肽表位进行刺激后，通过多细胞因子-ICS评估抗原特异性T细胞应答。图中所示出的是在用不同的刺激物刺激来自A2 Tg免疫的小鼠的脾细胞后，分泌IFNγ(图17A)，TNFα(图17B)，或IL-2(图17C)的CD8+T细胞的百分比。图17D-17F示出了在MVA-7Ag1，MVAB-pp65，或MVA-Venus免疫的B7小鼠中，用HLA-A*0201限制性肽表位(图17D)，pp65特异性肽库(图17E)，或PC特异性肽库(图17F)进行体外刺激后，产生IFN-γ，TNF-α，和IL-2细胞因子的所有组合的抗原特异性CD8+T细胞的频率。水平线表示中值。图17G是饼图，示出了在MVA-7Ag1或MVAB-pp65免疫的A2小鼠中，对pp65表位，pp65库或PC库的总多功能应答中的每个多功能亚群的相对贡献。每个饼图表示被免疫的小鼠中对三种不同抗原刺激的平均应答。在每个饼图下示出了响应肽刺激的CD8+T细胞的平均总百分比。图例中表示了多功能亚群和函数(Fn°)。使用多重t检验计算组之间差异的显著性。
图18A-18D说明了表达八抗原性HCMV抗原的MVA的构建。所示出的是同时表达HCMV的PC亚单位，gB，pp65，和IE1的MVAB-8Ag1(图18A)，MVAB-8Ag2(图18B)，MVAB-8Ag3(图18C)，和MVAB-8Ag4(图18D)的构建。将这八个HCMV抗原的P2A连接的，多顺反子的单个抗原表达构建体如所示插入MVABAC-TK中不同的IGR(44/45，64/65，69/70，148/149)和MVA Del3位点。对不同的HCMV抗原之间的P2A信号序列使用不同的编码序列(P2A1-6)。mH5＝痘苗修饰的H5启动子；B＝BAC载体。
图19示出了MVAB-8Ag1表达HCMV抗原的示例，所示出的是用于比较使用多克隆和单克隆抗体检测被MVAB-8Ag1或MVAB-7Ag1的不同克隆感染的BHK细胞中HCMV抗原表达的免疫印迹。被MVA-Venus感染的BHK细胞和未被感染的细胞作为对照。检测痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。
图20示出了MVAB-8Ag2的HCMV抗原表达。所示出的是用于检测被MVAB-8Ag2或作为对照的MVA-Venus感染的BHK细胞中HCMV抗原的免疫印迹。单克隆和多克隆抗体被用于抗原检测。PP＝前体蛋白；CT＝C-末端裂解产物。
图21示出了八抗原载体MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4的HCMV抗原表达。所示出的是用于检测被MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4表达的八个HCMV抗原的免疫印迹。用MVAB-8Ag4或来自两种不同储备溶液(stocks)(S1和S1)的MVAB-8Ag3感染BHK细胞，并使用单克隆(gH，gB，pp65，UL130，IE1)和多克隆(UL128，gL，UL131A)抗体通过免疫印迹分析了被感染的BHK细胞的全细胞裂解物。分析了被七抗原载体MVA-7Ag5或MVA-Venus感染的细胞或未被感染的细胞，作为对照。箭头表示HCMV亚单位的大致(approximate)预期蛋白大小。PP＝前体蛋白；CT＝C-末端裂解产物。
图22示出了病毒繁殖后MVAB-8Ag3的HCMV抗原表达。所示出的是用于比较在CEF上病毒传代之前(P0)和10次传代之后(P10)衍生的MVAB-8Ag3的HCMV抗原表达的免疫印迹。分析了MVA-Venus感染的细胞或未被感染的细胞，作为对照。分析了痘苗病毒BR5蛋白以作为上样对照。箭头表示各HCMV抗原的大概预期蛋白质大小。
图23A-23E示出了由八抗原载体MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4在小鼠中诱导的NAb和HLA限制性T细胞应答。图23A和23B示出了NAb应答。C57BL/6小鼠相隔一月接受两剂次MVAB-8Ag3，MVAB-8Ag4，或MVA-7Ag5(作为对照)，并且在不存在(C-)或存在(C+)5％豚鼠补体的情况下。测量针对ARPE-19细胞或MRC-5成纤维细胞上的HCMV株TB40/E的血清NAb滴度(NT50)。使用多重t检验在疫苗组之间未检测到显著差异(NS＝p＞0.05)。线表示几何均值的95％置信区间。图23C-23E示出了由八抗原载体MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4在HLA-B*0702转基因(B7Tg)C57BL/6小鼠(N＝3)中诱导的细胞介导的应答。用HLA-B*07限制性表位，或pp65特异性或PC特异性肽库体外刺激用MVAB-8Ag3，MVAB-8Ag4，或MVA-7Ag5(作为对照)进行了免疫的B7Tg小鼠的脾细胞。进行细胞内细胞因子染色以量化肽刺激后分泌IFN-γ，TNF-α，或IL-2的CD8+T细胞的百分比。用DMSO进行模拟刺激。线表示具有标准偏差的均值。
图24示出了P2A序列的示例。如图2，3，和18所示，本文使用不同的DNA序列(P2A1-P2A6)编码HCMV抗原之间的P2A信号肽。较低的6行示出了具有已突变核苷酸的不同P2A信号序列。顶行示出了P2A肽的氨基酸序列。
发明详述
本文提供了用于预防或治疗人巨细胞病毒(HCMV)感染的表达系统，载体，疫苗。下文详细描述的表达系统，载体，和疫苗产生针对HCMV感染的稳健的体液和细胞免疫应答，因此可被潜在地用于预防或治疗不同目标群体中的HCMV感染和相关的疾病，包括但不限于，HCMV血清反应阳性和血清反应阴性的孕妇以及造血干细胞(HSCT)和实体器官移植(SOT)接受对象。本公开涉及被修饰的痘苗安卡拉(MVA)或其他表达系统，载体，或疫苗对多个HCMV抗原或其片段的同时表达，以激发针对HCMV感染的有效的体液和细胞免疫应答。例如，体液和细胞免疫应答包括中和抗体，促进ADCC，CDC，或CDV的抗体，以及多功能CD4+和CD8+T细胞应答。在一些实施例中，MVA同时共表达七个或更多个HCMV抗原。此类使用MVA的多抗原性表达系统或疫苗策略可被用于开发其他传染病和癌症的疫苗。
在本文公开的一些实施例中，HCMV抗原可通过病毒载体(如被修饰的痘苗安卡拉(MVA))表达。各HCMV抗原可通过剪切或自我加工(self-processing)序列进行连接，使得被共表达的亚单位可被“自我剪切(self-cleaved)”成各抗原。
在一些实施例中，本文描述的表达系统，载体，疫苗包括一个或多个表达盒，每个表达盒包括单启动子和编码两个或更多个HCMV抗原的序列。在另一个实施例中，两个或更多个HCMV抗原通过IRES或2A序列连接在一起，使得两个或更多个HCMV通过仅使用单启动子的单个转录物表达。因此，多个HCMV抗原同时被共表达，同时限制了表达HCMV抗原所需的启动子元件和插入位点的数量。在某些实施例中，每个表达盒包括两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，或甚至更高数量的HCMV抗原，其表达在单启动子的控制下。在其他实施例中，每个表达盒包含多于十个HCMV抗原。在一些实施例中，载体可包含多于一个此类表达盒。
本文所描述的是基于被修饰的痘苗安卡拉(MVA)以激发针对HCMV感染的稳健的体液和细胞免疫力的多抗原性疫苗策略。此类多抗原性疫苗策略可被潜在地用于预防包括孕妇或移植接受对象在内的不同目标群体中与HCMV相关的疾病。更具体地，本发明涉及同时表达多个免疫显性HCMV抗原的MVA载体的构建，该多个免疫显性HCMV抗原可包括HCMV的包膜五聚体复合物(PC)的全部五个亚单位(gH，gL，UL128，UL130，UL131A)，糖蛋白B(gB)，磷蛋白65(pp65)，即早蛋白1(IE1)，和即早蛋白2(IE2)，或任何其他HCMV蛋白。这些载体可通过细菌人工染色体(BAC)技术，真核细胞中的同源重组，或CRISPR/Cas9程序进行构建。HCMV抗原可基于其天然DNA序列，也可以针对痘苗病毒表达进行密码子优化。各HCMV抗原可全部一起插入至仅一个MVA插入位点，也可分别插入至两个或更多个常用或非常用的MVA插入位点。这些插入位点包括MVA缺失位点1至6以及189个已标识的MVA基因(登录号U94848)的任何基因间区域(IGR)。MVA载体的HCMV抗原的表达可通过内源性痘苗启动子或异位插入的天然，被修饰的，或人工痘苗启动子(如被修饰的H5(mH5)，pSyn，P11，或p7.5启动子)诱导。同时被表达的的各HCMV抗原的两个或更多个可通过2A剪切信号或内部核糖体进入位点(IRES)进行连接，以实现各抗原的多顺反子的表达。2A信号序列可编码口蹄疫病毒的2A肽(F2A)，马鼻炎A病毒的2A肽(E2A)，猪捷申病毒-1的2A肽(P2A)，或明脉扁剌蛾病毒的2A肽(T2A)。图24示出了本文使用的一些2A信号序列的示例。在2A连接的HCMV多聚蛋白(polyproteins)的自我加工后，直接位于2A信号序列之前的弗林蛋白酶(Furin)剪切位点可被导入(incorporated)以去除2A肽。作为本公开的示例，利用被插入两个，四个，或五个MVA插入位点的多顺反子的单个抗原性表达构建体的不同组合，BAC技术被用于生成不同的重组MVA载体，该重组MVA载体同时表达HCMV的全部五个PC亚单位，gB，pp65，或这七个抗原以及HCMV IE1。
被修饰的痘苗安卡拉(MVA)是开发传染病和癌症的疫苗的被广泛使用并且在临床上部署的痘病毒载体。MVA在动物和人中具有出色的安全记录，具有导入和表达异源DNA序列的大容量和通用型(versatile)表达系统，并且具有激发针对外来抗原的稳健的体液和细胞免疫应答的已证实的能力(17，20，25)。
本文所描述的是基于被修饰的痘苗安卡拉(MVA)的新型疫苗方法，通过由全部五个PC亚单位，gB，和免疫显性T细胞靶磷蛋白65(pp65)组成的抗原组合激发稳健的HCMV体液和细胞免疫力(69)。另外，本文所提供的是示出了通过MVA的PC亚单位和gB的共表达可改善介导HCMV中和作用(neutralization)以及抗体依赖的细胞的细胞毒作用(ADCC)的体外可测量抗体应答的诱导的示例。这些发现有助于预防或减轻先天性HCMV感染的后遗症的多抗原性亚单位疫苗策略的开发，并且表明被由PC和gB组成的抗原组合诱发体液免疫应答的有益作用。
如工作实施例中所示，利用BAC系统，将七个或八个HCMV抗原组装在单个MVA载体中，由此可有效地去除BAC载体而不留下细菌载体序列的任何痕迹。这些多抗原性MVA载体可稳定地共表达全部五个PC亚单位，gB，pp65，和IE1，并且在小鼠中诱发稳健的HCMV体液和细胞免疫应答，包括补体不依赖和补体依赖的NAb应答，从而预防FB和EC感染，促进ADCC的抗体，以及所有各抗原的抗原特异性小鼠和人MHC限制性T细胞应答。通过MVA载体共表达这些免疫显性HCMV抗原不会显著干扰各抗原的免疫原性，这与其他人的发现相反(32)。反之，通过MVAB-7Ag1共表达PC亚单位与gB增强介导HCMV中和作用与ADCC的体外可测量补体不依赖和补体依赖的抗体应答(图9和10)。这些发现可指导预防或改进先天性HCMV感染的多抗原性疫苗策略的开发，并且表明在亚单位疫苗制剂中包括PC亚单位和gB以激发稳健的体液免疫力的有益作用。
gB，gH，和UL128/130/131A亚单位的抗体以及CD4+T细胞对于预防先天性HCMV感染是重要的(29，30，62)。这可能表明除CD4+T细胞外，所有这些糖蛋白诱导的抗体对于先天性HCMV疫苗候选物可能必不可少。预防HCMV进入，介导补体依赖的病毒溶解(virolysis)，或促进ADCC的预先存在的抗体应答可能是干扰在粘膜的HCMV获取，病毒播散和扩散，以及在母胎界面经胎盘的病毒传播的重要的第一道防线(15，52)。但是，因为通过自然HCMV感染获得的母体HCMV免疫力仅针对复发性感染造成的先天性感染提供不完善的保护(5)，因此仅抗体的诱导可能不足以完全预防母亲或胎儿的感染。一旦母体感染已在粘膜上发生，细胞毒性T细胞应答就可能是重要的抑制和清除HCMV感染的第二道防线(35，36)。此外，众所周知，T细胞应答控制移植患者的HCMV再激活和HCMV相关的疾病(38)。这可能表明能够加强HCMV血清反应阳性的孕妇中T细胞免疫力的疫苗候选物可增强这些女性中HCMV再激活的控制，并且因此，降低将病毒转移至发育中的胎儿的风险。
一些研究表明，由于原发性HCMV感染而自然获得的HCMV免疫力提供针对再感染的实质性保护，并且可以显著降低未来妊娠中先天性感染的风险(1，7，21)。此外，与非原发性感染后的先天性疾病相比，原发性感染后的先天性疾病通常被认为不那么严重(52)。因此，能够诱导与HCMV诱导的免疫力相似的免疫力的疫苗候选物可为接种疫苗的HCMV血清反应阴性的孕妇提供针对先天性HCMV感染和疾病的尽管不完善但重要的保护。因为自然获得的母体HCMV免疫力的不完善的保护，因此一直建议为了使先天性HCMV疫苗有效，可能需要激发与自然感染过程中由HCMV诱导的免疫应答在数量或质量上有所不同的免疫应答(52)。尽管很难实现灭菌HCMV免疫力的疫苗刺激(7)，但鉴于先天性HCMV对健康的影响，甚至可通过不完善的功效考虑HCMV疫苗候选物的许可(52)。
表达系统，载体，和疫苗
根据本文描述的实施例，本文提供了HCMV抗原表达系统。在一个实施例中，抗原表达系统可包括克隆载体，以克隆能够表达一个或多个HCMV抗原或其抗原性片段的表达载体。
在一个实施例中，克隆载体是BAC，其是DNA构建体，可被用于通过细菌(例如，大肠杆菌)的转化克隆病毒载体(例如，MVA)或其他表达载体。病毒或表达载体可包括一个或多个HCMV抗原序列。使用BAC作为克隆载体实现非常大的DNA序列的稳定克隆，并且可容易地使用针对大肠杆菌建立的遗传技术进行操作。在一些实施例中，BAC克隆载体被用于克隆表达载体。表达载体可以是质粒，BAC，病毒载体(例如，腺病毒载体，腺相关病毒载体，RNA病毒载体，慢病毒载体，或逆转录病毒载体)，被构建为BAC的病毒载体，或能够表达重组蛋白，病毒载体，或两者的任何其他合适的载体。
在一些实施例中，表达载体(例如，病毒载体)能够表达一个或多个HCMV抗原或其免疫原性的或抗原性片段。免疫原性的蛋白是当被引入受试者时，被受试者的免疫细胞识别，从而激发免疫反应的蛋白。免疫反应可导致针对该蛋白的抗体产生(例如，中和抗体产生)或T细胞产生。免疫原性的蛋白的功能性或抗原性片段是包含蛋白的抗原性部分的蛋白的任何部分，或可包含至少一个表位的蛋白的抗原性部分。在一些实施例中，一个或多个免疫原性的蛋白或其功能性片段可能是免疫原性的蛋白复合物，其包括一组免疫原性的蛋白亚单位或其功能性片段。
在一个实施例中，BAC克隆载体被用于克隆病毒表达载体。在此类实施例中，将BAC载体插入至病毒载体的基因组以生成病毒-BAC构建体或质粒。然后用病毒-BAC质粒转染细菌宿主(例如，大肠杆菌)以克隆病毒载体。病毒-BAC克隆转染至易被病毒载体感染的真核细胞中，导致重组病毒的重建。然后可将所得的被重建的病毒载体用于感染宿主中的靶组织或细胞。
在一个实施例中，病毒载体是被修饰的痘苗安卡拉(MVA)，其被克隆至BAC克隆载体(“MVA-BAC”)并且能够表达一个或多个HCMV抗原或其免疫原性的或抗原性片段。根据本文描述的实施例，可通过BAC克隆任何合适的MVA株，包括但不限于，1974-MVA株，VR株，或ACAM 3000株。
在一个实施例中，一个或多个HCMV抗原包括一组免疫原性的蛋白亚单位或其功能性片段，它们是HCMV五聚体复合物(PC)的一部分。HCMV PC是HCMV蛋白复合物，包括以下五个免疫原性的蛋白亚单位或其功能性片段：UL128，UL130，UL131A，gL，和gH。在单个细胞中需要全部五个PC亚单位的共表达以获得功能性表达并且激发针对UL128/130/131A亚单位内的构象表位的有效NAb应答。因此，需要单个递送载体，因为目前没有普遍接受的方法通过共表达全部五个PC组分引导＞1的各DNA或病毒载体在体内组装蛋白复合物。
包含UL128，UL130，UL131A，gL，和gH蛋白或其抗原性片段的PC复合物通过本文描述的表达系统和病毒载体的同时共表达导致宿主免疫系统激发中和抗体(NAb)，阻断易感细胞(如上皮和内皮细胞以及成纤维细胞)的HCMV感染。
在其他实施例中，表达载体可包括额外的HCMV蛋白，包括但不限于pp65，gB，IE1，IE2，gM，gN，gO，和本领域已知的其他合适的抗原性HCMV蛋白。这些额外的基因可被插入至具有PC亚单位的第一表达载体中，或可替代地，可被插入至第二表达载体以与第一表达载体组合施用。在一些实施例中，将全部亚单位插入至MVA或MVA-BAC载体的相同插入位点。在其他实施例中，将一个或多个亚单位插入至MVA或MVA-BAC载体的两个或更多个不同的插入位点。在其他实施例中，可通过P2A连接的多顺反子的表达构建体表达抗原基因序列的两个或更多个。
根据本文描述的实施例，提供了免疫方案。免疫方案可包括表达或包含HCMV抗原的质粒，病毒载体，减毒活病毒，纯化蛋白，或病毒样颗粒。免疫方案可通过初免(prime)/加强同源(例如，仅使用相同的疫苗类型)或异源(例如，使用不同的疫苗类型)接种疫苗施用。可用涉及两次或更多次免疫的剂次接种疫苗计划施用免疫方案，其可相隔2周至6个月施用。
在其他实施例中，上述MVA载体可能是初免免疫。在此类情况下，在进行一次或多次(例如，一次，两次，三次，四次，或更多次)连续MVA免疫后，上述初免也可被用作加强载体。可替代地，初免和加强载体可以交替，使得异源免疫将包括以MVA或可替代的载体作为初免，然后以MVA或可替代的载体作为加强，以1至4次为示例。本领域技术人员可以根据本文描述的实施例使用本领域已知的其他合适的免疫计划或方案。
根据一些实施例，将编码两个或更多个HCMV抗原的核酸序列组装成单个载体，并且在编码两个或更多个亚单位的核酸序列之间插入连接序列。例如，HCMV PC亚单位可通过连接序列连接，如内部核糖体进入位点(IRES)(衍生自本领域众所周知的许多不同的RNA病毒)，或编码2A肽的序列，以将一个插入位点或多个插入位点中的亚单位的全部或一部分连接为多顺反子的表达构建体。可使用编码口蹄疫病毒的2A肽(F2A)，马鼻炎A病毒的2A肽(E2A)，猪捷申病毒-1的2A肽(P2A)，质型多角体病毒的2A肽(BmCPV2A)，软化病病毒的2A肽(BmIFV 2A)，或明脉扁剌蛾病毒的2A肽(T2A)的2A信号序列。
在一个实施例中，被插入至病毒或表达载体的HCMV基因序列可基于天然DNA序列。在其他实施例中，可针对病毒或表达载体内的表达和稳定性优化HCMV基因序列。如本文示例中所提供的，可针对痘苗病毒密码子使用优化被插入至多抗原性MVA载体的HCMV基因序列，从而产生具有较低G/C含量的被修饰的基因序列，其可被MVA更好地耐受。被插入至MVA的这些被修饰的HCMV基因序列或天然HCMV基因序列可被“沉默”突变(例如，不影响被编码蛋白的氨基酸序列)，以去除由连续多于四个相同类型的核苷酸组成的序列。已证实这种修饰增强MVA内抗原的稳定性(87)。下面列出了本公开中使用的密码子优化的HCMV抗原序列的一些非限制性示例：
密码子优化的gH序列：
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密码子优化的gL序列：
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密码子优化的UL128序列：
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密码子优化的UL130序列：
Atgctaagattgttattaagacaccactttcattgtctactattatgcgccgtttgggctacaccctgtctagcatctccgtggtctacgcttacagctaaccagaatcctagtcctttatggtctaaacttacctattccaaacctcacgatgctgctactttctattgccctttcatttaccctagtcctccaagatctcctttacaattctcgggtttccagagagtgttgacaggtcctgaatgcagaaatgagacattgtatctattgtataacagagagggacaaacccttgtcgaaagatcgagtacatgggttaagaaagtaatctggtatctaagtggaagaaatcaaactatacttcaacgaatgccacgaacagcaagtaaaccctccgatggaaatgtacaaatatcagtagaagatgccaagatatttggagcacatatggtacctaagcaaactaaattattgagatttgtggttaacgatggtacaagataccagatgtgtgttatgaaattggagtcgtgggcccatgtattcagagattatagtgtctcatttcaagttagattaacgttcacggaagctaacaaccaaacgtatacattctgtactcatccgaatttgattgtt
密码子优化的UL131A序列：
Atgcgtttatgccgagtatggttatctgtatgtttatgcgctgttgtattgggacaatgtcagcgtgaaacagccgagaagaatgattattatagagtgccacattactgggacgcttgttctagagcattacctgatcaaacaagatataaatatgtggaacaactagttgatcttaccttgaactatcactacgatgcatcgcatggtcttgataactttgatgttctaaagagaattaatgtaacagaggttagtctattgattagtgatttcagaagacagaacagaagaggtggaacaaataaacgtactacctttaacgcggcaggttctctagcacctcacgcccgttcattagagttctctgtgagattgtttgctaat
密码子优化的pp65序列：
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密码子优化的gB序列：
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密码子优化的IE1序列：
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重组载体，如上述的MVA病毒载体；包括上述合适的引物或加强载体的任何其他合适的可替代的载体，可为HCMV疫苗组合物的一部分，其可被用于治疗或预防HCMV感染的方法。如本文所述的疫苗组合物可包含治疗有效量的如本文所述的重组病毒载体，并且根据通常的方法还包含药学上可接受的运载体。可接受的运载体的示例包括生理上可接受的溶液，如无菌生理盐水和无菌缓冲生理盐水。
在一些实施例中，疫苗或药学组合物可与药学有效量的佐剂组合使用以增强抗CMV作用。可激发免疫系统并增加对疫苗应答的任何免疫学佐剂，本身均不具有任何特异性抗原性作用，均可用作佐剂。许多免疫学佐剂模拟进化上保守的分子，称为病原体相关分子模式(PAMP)，并被一组称为Toll样受体(TLR)的免疫受体所识别。根据本文描述的实施例可被使用的佐剂的示例包括弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，双链RNA(TLR3配体)，LPS，LPS类似物(如单磷酰脂质A(MPL))(TLR4配体)，鞭毛蛋白(TLR5配体)，脂蛋白，脂肽，单链RNA，单链DNA，咪唑并喹啉类似物(TLR7和TLR8配体)，CpGDNA(TLR9配体)，Ribi佐剂(单磷酰脂质A/海藻糖二杆菌分枝菌酸酯)，糖脂(α-GalCer类似物)，非甲基化的CpG岛，油乳剂，脂质体，病毒体，皂苷(皂苷的活性部位，如QS21)，胞壁酰二肽，明矾，氢氧化铝，角鲨烯，BCG，细胞因子(如GM-CSF和IL-12)，趋化因子(如MIP1-α和RANTES)，激活细胞表面配体(如CD40L)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)，和胸腺素α1。被使用的佐剂的量可根据症状程度(如皮肤软化，疼痛，红斑，发热，头痛，和肌肉疼痛)，这可能被表达为此类型的疫苗施用后人或动物中的免疫应答的一部分，进行适当地选择。
在进一步的实施例中，如上所述，将多种其他佐剂，药物，或添加剂与本发明的疫苗一起使用，可增强通过施用疫苗或药学组合物达到的治疗作用。药学上可接受的运载体可包含痕量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类添加剂在使用的剂量和浓度上对人或其他哺乳动物受试者应该是无毒的，其示例包括缓冲剂，如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，和其他有机酸，及其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个残基)的多肽(例如，聚精氨酸和三肽)蛋白(例如，血清白蛋白，明胶，和免疫球蛋白)；氨基酸(例如，甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，和精氨酸)；单糖，二糖，和其他糖类(例如，纤维素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖，和糊精)，螯合剂(例如，EDTA)；糖醇(例如，甘露醇和山梨糖醇)；抗衡离子(例如，钠)；非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯和泊洛沙姆)；抗生素；和PEG。
包含本文描述的重组病毒载体的疫苗或药学组合物可用水溶液或冻干制品的形式存储在单位或多剂量容器中，如密封的安瓿瓶或小瓶中。
预防HCMV进入细胞，治疗和预防HCMV感染
上述抗原表达系统可被用于通过预防病毒进入细胞或细胞群以预防HCMV感染的体外，体内，或离体(exvivo)方法。在一些实施例中，用于预防病毒进入细胞或细胞群的方法包括用有效量的能够表达多个HCMV抗原的病毒载体感染该细胞或细胞群的步骤。在其他实施例中，抗原表达系统可被用于通过多个免疫显性抗原激发体液和细胞免疫应答，以预防不同目标群体(如孕妇和移植接受对象)中HCMV感染。在另一个实施例中，表达系统或病毒载体(例如，MVA)可被用于激发免疫应答，该免疫应答干扰原发性HCMV感染，不同HCMV株的再感染，或来自潜伏状态(latency)的病毒再激活。在其他实施例中，表达系统可被用于在HCMV血清反应阴性的受试者中激发HCMV免疫力，或在HCMV血清反应阳性的受试者中加强预先存在的HCMV免疫力。
在其他实施例中，提供了治疗或预防受试者中HCMV感染的方法。此类方法可包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的疫苗。疫苗可包含至少一种活性成分，其中该至少一种活性成分包括能够同时共表达两个或更多个HCMV抗原的病毒载体，如本文所述的那些。
本文描述的表达系统，载体，和疫苗可被用于治疗或预防任何HCMV感染。例如，可预防上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞，其组合，或对HCMV自然史和感染重要的任何其他的细胞类型的HCMV感染。使用本文描述的方法可被治疗或预防的HCMV感染的示例包括但不限于，先天性HCMV感染，免疫系统受损的受试者(例如，器官和骨髓移植接受对象，癌症患者和化疗接受对象，接受免疫抑制药物的患者和HIV感染的患者)中的机会性HCMV感染，以及其他健康受试者中的无症状HCMV感染。
如本文所用，术语“有效量”是指产生想要的作用的组合物的量。例如，可用有效量的病毒载体感染细胞群以研究其体外(例如，细胞培养物)作用或产生想要的离体或体外治疗作用。有效量的组合物可被用于在受试者中产生治疗作用，如预防或治疗目标病症，缓解与该病症有关的症状，或产生想要的生理作用。在此类情况下，组合物的有效量是“治疗有效量”，“治疗有效浓度”，或“治疗有效剂量”。精确的有效量或治疗有效量是在给定的受试者或细胞群中就治疗功效而言将产生最有效结果的组合物的量。该量将取决于多种因素而不同，包括但不限于，组合物的特征(包括活性，药代动力学，药效动力学，和生物利用度)，受试者的生理状况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，全身状况，对给定剂量的反应性，药物的类型)或细胞的生理状况，制剂中一种或多种药学上可接受的运载体的性质，和施用途径。此外，有效或治疗有效量可取决于组合物是单独施用还是与另一种组合物，药物，疗法，或其他治疗方法或方式组合施用而不同。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定有效量或治疗有效量，即通过监测细胞或受试者对组合物施用的应答并相应地调整剂量。有关另外的指导，参见《雷明顿：药学科学与实践》，第二十一版，费城科学大学(USIP)，LippincottWilliams&Wilkins，PA，2005，其据此通过引用并入，如同在本文完全阐述。
病症的“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”可指预防病症，减慢病症的发作或发展速度，降低病症发展的风险，预防或延迟与病症相关的症状的发展，减少或终止与病症相关的症状，产生病症的完全或部分消退，或其一些组合。治疗还可指对病症的防疫性(prophylactic)或预防性治疗。
在一些实施例中，本文描述的疫苗或药学组合物可与其他已知的药学产品(如促进免疫应答的肽和抗菌剂(合成的抗菌剂))组合使用。疫苗或药学组合物可进一步包含其他药物和添加剂。可与本文描述的疫苗或药学组合物结合使用的药物或添加剂的示例包括帮助本发明的重组病毒或MVA或重组转基因蛋白的胞内摄取的药物，脂质体，和有助于转染的其他药物和/或添加剂(例如，碳氟化合物乳化剂，脂质卷(cochleates)，小管，金颗粒，生物可降解微球，和阳离子聚合物)。
在一些实施例中，本文描述的疫苗或药学组合物包含的活性成分的量可选自宽浓度范围，病毒颗粒单元(VPU)，空斑(Plaque)形成单位(PFU)，重量/体积百分比(w/v％)，或活性成分量的其他定量测量，只要它是治疗或药学有效量。根据想要的治疗作用，施用方法(施用途径)，治疗周期，患者的年龄，性别，和其它条件等，该疫苗或药学组合物的剂量可从宽范围内进行适当选择。
在一些方面，当将重组病毒载体作为疫苗或药学组合物的活性成分施用于人受试者时，重组病毒或MVA的剂量可按大约相当于每位患者102至1014PFU的量，优选105至1012PFU的量，更优选106至1010PFU的量施用，以重组病毒的PFU计算。
在其他方面，当将重组病毒载体作为疫苗或药学组合物的活性成分施用于受试者时，就被引入疫苗宿主的可表达DNA的量或被转录的RNA的量而言，剂量可从宽范围内进行选择。剂量还取决于在被使用的任何转移载体中使用的转录和转译启动子的强度。
在一些实施例中，本文描述的疫苗组合物或药学组合物可通过直接注射重组病毒载体悬浮液至局部位置(例如，至肺组织，肝脏，肌肉，或脑)施用，该重组病毒载体悬浮液通过将重组病毒或MVA悬浮于PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)或生理盐水制备，通过鼻腔或呼吸道吸入，或通过血管内(i.v.)(例如，动脉内，静脉内，和门静脉)，皮下(s.c.)，皮内(intracutaneously)(i.c.)，皮内(intradermal)(i.d.)，或腹膜内(i.p.)施用。本发明的疫苗或药学组合物可被施用多于一次。更具体地，在初始施用后，可给予一种或多种额外的接种疫苗作为加强。一种或多种加强施用可增强想要的作用。在疫苗或药学组合物的施用后，可用包含本文描述的重组病毒或MVA的药学组合物进行加强免疫。
以下实施例旨在说明本发明的多种实施例。照此，所讨论的特定实施例不应被解释为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行多种等同，改变，和修改，并且应当理解，此类等同实施例将被包括在本文中。此外，本公开中引用的所有参考文献据此通过引用整体并入，如同在本文完全阐述。
示例
示例1：材料和方法
细胞和病毒。幼仓鼠肾(BHK-21)细胞，ARPE-19细胞，和MRC-5细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。鸡胚成纤维细胞(CEF)获自查尔斯河(Charles River)。如前所述，MVA载体在BHK-21或CEF细胞中繁殖(75，81)。病毒在CEF上繁殖后，制备了所有MVA病毒储备溶液，并按照所述在CEF上滴定(81)。HCMV TB40/E衍生自TB40/Ewt-GFP BAC DNA(48)，TB40/Ewt-GFP BAC DNA是来自Thomas Shenk(普林斯顿大学)的礼物。表达GFP的HCMV株TR获自JayNelson(俄勒冈健康与科学大学)。HCMV株Towne(RC2940)是来自EdwardMocarski的礼物。HCMV株AD169获自John Zaia(希望之城(City of Hope))。病毒在ARPE-19细胞上繁殖后，制备了TB40/E和TR病毒储备溶液，并按照所述在这些细胞上滴定(81)。相比之下，病毒在MRC-5细胞中繁殖后，制备了Towne和AD169病毒储备溶液，并按照所述在这些细胞类型上滴定(81)。
重组MVA载体。使用特异性转移构建体和位点特异性引物进行同源重组在GS1783大肠杆菌细胞中通过伴随诱变生成了MVABAC-TK衍生的重组MVA(72，73，83，85)。表1示出了用于通过伴随诱变介导基因插入的引物以及插入位点的基因组位置。
注意：1.下划线的序列被用于介导重组；2.基于登录号U94848的插入位点和基因组位置。
编码PC亚单位或pp65的HCMV基因序列基于HCMV株TB40/E(TB40/E-BAC；登录号EF999921)。表达截短的，跨膜缺失形式的gB(gBΔTM)的基因序列基于HCMV株Merlin，并编码了Merlin gB蛋白的N-末端698个氨基酸。针对痘苗病毒表达对所有HCMV基因序列进行了密码子优化，并连续沉默突变了多于三个相同的核苷酸类型，以增强MVA内HCMV基因序列的稳定性(87)。通过Genescript合成了密码子优化的和P2A连接的HCMV基因序列。由VectorNTI(Invitrogen)生成的详细序列图谱可用于所有转移质粒和BAC构建体。通过PCR和限制性片段长度分析验证了所有重组BAC载体，并通过测序验证了所有被插入的HCMV基因表达盒，其包括被用于重组的侧翼。如所述，使用禽痘病毒作为辅助病毒，在BHK细胞中从BAC载体重建病毒(17，85)。
BAC载体去除。如前所述，MVABAC-TK衍生的重组MVA载体中的BAC去除通过基于被插入至BAC序列的基因组拷贝的同源重组的程序进行(18，71，84)。本文提及的包含BAC载体的被重建的MVA载体用粗体上标B进行标记(例如，MVAB-7Ag1，MVAB-7Ag2，MVAB-7Ag3，MVAB-7Ag4，MVAB-7Ag5，和MVAB-7Ag6以及MVAB-8Ag1 MVAB-8Ag2 MVAB-8Ag3 MVAB-8Ag4；而这些去除了BAC载体序列的构建体的衍生物的命名不含上标B(例如，分别为MVA-7Ag1，MVA-7Ag4，MVA-7Ag5，和MVA-7Ag6)。
使用顺道诱变(72，73)，将对应于MVA(登录号AY603355.1)的碱基对69313-70703并且与MVABAC-TK内BAC载体的任一位点上的～0.7kbp MVA序列同源的～1.4kbp基因组拷贝，同向插入氯霉素抗性标志物(cat)和MVABAC-TK的mini-F复制子(OriS，repE，sopA/B/C，cos，losP)之间(图1A)(83)。将RFP标志物与基因组拷贝一起插入至细菌载体序列，使得重组MVABAC-TK载体内被基因组拷贝分开的每个载体序列(cat和mini-F复制子)均包含荧光标志物(RFP或GFP，由于原始载体构建，GFP标志物已被包含在MVABAC-TK中(83))。在从BAC重建病毒后，通过病毒病灶(foci)识别了其中细菌载体序列的两个部分已被去除的病毒群，该病毒病灶未显示RFP和GFP表达的迹象。进行了空斑纯化以消除含有剩余载体序列的残余病毒后代，并获得纯的，无载体的重组MVA载体。因此用每板20个空斑形成单位(PFU)的MVA感染96孔板形式的汇合(confluent)CEF细胞。感染后3至5天，通过标准解冻/冷冻技术制备了仅示出单个病毒病灶且无RFP和GFP表达迹象的孔中病毒，然后在CEF上相继扩展(expanded)为较大量。使用位于TK插入侧翼的引物(5’-TGG ATG ACA ACT CAA ACA TCTGC-3’和5’-TTT CCT CGT TTG GAT CTC AC-3’)通过PCR测试了被扩展的病毒，以确认BAC载体序列的完全去除，并使用对细菌抗性标志物cat(5’-TGC CAC TCA TCG CAG TAC TG-3’和5’-AGG CAT TTC AGT CAG TTG CTC-3’)或mini-F复制子(5’-TTA ACT CAG TTT CAA TACGGT GCA G-3’和5’-TGG GGT TTC TCA GGC TAT C-3’)的sopA元件具有特异性的引物，以确认不存在任何残余载体序列(图1B)。对从TK位点扩增的PCR片段进行了测序以验证MVA TK基因的基因座的复原(71，84)。
免疫印迹。使用标准程序进行了Western印迹分析以检测MVA感染的BHK或CEF细胞的全细胞裂解物中的HCMV抗原。用兔多克隆抗血清检测了HCMV gL和UL13 1A(81)；使用购自的兔抗GST-UL 128(PTA-8474)检测了UL128；使用由William Britt(阿拉巴马大学伯明翰分校)提供的mAb AP86(65)，mAbp7-17(8)，和mAb28-103(9)分别检测了gH，gB，和pp65。使用MAb 3C5(74)检测了UL130，MAb 3C5是来自Thomas Shenk(普林斯顿大学)的礼物。使用MAb 19C2检测了痘苗病毒B5R(63)。
流式细胞术。如前所述，通过单克隆NAb进行了细胞表面流式细胞术染色以检测由MVAB-7Ag1和对照载体表达的HCMV PC亚单位(15)。简而言之，用MVA载体在MOI 5感染了BHK细胞(70-90％汇合)。感染后4小时，收集了被感染的细胞，在PBS中洗涤，并用25μg/ml NAb于4℃孵育1小时。用PBS洗涤后，将细胞与Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG(LifeTechnologies)以1∶2,000的稀释一起孵育。再次洗涤了细胞，并重悬浮于含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中。使用BD FACSCelesta流式细胞仪(BD)收集了1.5万个事件并使用FlowJo软件(Tree Star)进行了分析。
小鼠和免疫。希望之城的贝克曼研究所的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了分配给此研究的协议98004。所有研究程序均严格按照《实验动物护理和使用指南》和《实验动物人文关怀和使用的公共卫生服务政策》中的建议进行。BALB/c和C57BL/6小鼠购自Jackson实验室。C57BL/6背景上的HLA-A*0201HHD II H-2Db/β2微球蛋白双敲除(50)(A2Tg)和HLA-B*0702H-2KbDb双敲除(56)(B7 Tg)转基因小鼠获自F.Lemonnier(法国巴斯德研究所)并在希望之城动物研究中心饲养。通过i.p.途径使用5×107PFU或1×107PFU(低剂量)的重组MVA载体对小鼠进行了两至三次间隔四周的疫苗接种。通过眶后(retro-orbital)出血收集了用于体液免疫分析的血样。为了评估细胞的免疫应答，根据标准程序分离了脾细胞，并重悬浮于补充有10％FBS，青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，非必需氨基酸，HEPES(全部为Gibco)的RPMI 1640培养基(Corning)中。
中和作用试验。HCMV微量中和作用试验与已发布的报告相似(15，81)。简而言之，取决于试验中所用的细胞类型，使用ARPE-19EC或MRC-5FB的完全生长培养基，将热灭活的血清以75μl体积连续两倍稀释。稀释范围为1∶25至1∶204800。将被稀释的血清与75μl完全生长培养基混合，其中含有大约2400PFU的HCMV TB40/Ewt-GFP衍生的病毒。孵育2小时后，将病毒/血清混合物一式两份(induplicate)(50ul)添加至ARPE-19或MRC-5细胞，该ARPE-19或MRC-5细胞在前一天以1.5×104细胞/孔被接种在含有每孔50μl的完全生长培养基的透明底部聚苯乙烯96孔板(Corning)中。细胞生长48小时并固定在甲醇/丙酮中。使用小鼠抗HCMV IE1 Ab(p63-27(3)；由William Britt(阿拉巴马大学伯明翰分校)提供)和Vectastain ABC试剂盒(VectorLabs)进行免疫染色识别了被感染的细胞。底物是3，3’-二氨基联苯胺(DAB，VectorLabs)。使用配备线性电动载物台(Leica)的DMi8倒置显微镜，通过自动化系统分析了板。使用ImagePro Premier(Media Cybernetics)对使用5X物镜的每个视场的IE1阳性细胞核进行计数。对于每次稀释，计算一式两份的阳性细胞核的平均数。每次稀释的中和作用滴度(NT)百分比计算如下：NT＝[1-(免疫血清的阳性细胞核数)/(免疫前血清的阳性细胞核数)]×100。通过使用最接近50％中和作用的下一个的更高和更低的NT值，确定绘制NT与血浆稀释图的线性斜率，计算出50％中和作用的滴度(NT50)。
ELISA。使用纯化的PC或gB蛋白通过ELISA对被免疫的小鼠的血清中PC和gB特异性结合抗体进行了定量，该纯化的PC或gB蛋白通过哺乳动物细胞中质粒(PC)或MVA(gB)的表达而衍生(15，75)。将微量滴定孔(Costar)用1μg/ml的纯化蛋白包被过夜，并且用1％BSA/PBS封闭孔。充分洗涤后，将两倍血清稀释一式两份地添加至孔中。抗小鼠IgG辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich)以1∶2,000的稀释使用。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Thermo-Fisher)使板显色(developed)，并且使用1M H2SO4终止反应。使用FilterMax F3酶标仪(Molecular Devices)记录450nm处的吸光度。终点滴度计算为最高血清稀释，以产生高于几何均值的吸光度加上3倍于使用5只初始(naive)小鼠100倍稀释的血清获得的吸光度的标准偏差。
肽。pp65和gB的肽库由覆盖(spanning)完整蛋白的重叠的15个氨基酸肽组成。pp65肽库获自NIH(NIIAID艾滋病科的AIDS试剂项目)。gB肽库购自JPT PeptideTechnologies GmbH(德国柏林)。先前描述了人MHC I类限制性免疫显性肽HLA-A*0201pp65(495-503)和HLA-B*0702pp65(265-275)(19)。为了检测小鼠H-2b限制性pp65和gB特异性T细胞，分别使用了先前被识别的11种或17种免疫反应性肽的混合物(64)。为了检测对PC亚单位具有特异性的小鼠H-2b限制性T细胞应答，使用了gH(PHGWKESHTTSGLHR，TQGVINIMYMHDSDD)，gL(LIRYRPVTPEAANSV)，UL128(NKLTSCNYNPLYLEA)，UL130(KLTYSKPHDAATFYC)，和UL131A(LNYHYDAS HGLDNFD)免疫显性肽的混合物(64)。除肽库外，所有肽均在希望之城核心场所(City of Hope Core Facility)合成(14)。
ELISpot。按照制造商的说明进行了IFNγELISpot试验。简而言之，将MilliporeMultiscreen-IP滤板用捕获抗体(小鼠IFN-γ ELISpot开发模块，R&D系统)包被过夜。充分洗涤后，用封闭缓冲液(1％BSA，PBS中5％蔗糖)封闭板2小时。此后，洗涤板，并且将RPMI中2×105个脾细胞添加至每孔并在存在2μg/ml肽和1μg/ml CD28和CD49d共激发Ab(Biolegend)的情况下于37℃孵育过夜。当使用pp65库作为刺激物时，以较低的量(5×104)接种来自Tg小鼠的脾细胞。24小时后，洗涤板，并且添加检测抗体并于4℃孵育过夜。第二天，使用ELISpot蓝色颜色模块(R&D系统)使板显色。使用AID EliSpot Reader对斑点进行计数。从每孔中减去在其中添加2μl DMSO的孔中获得的斑点数。将任意数量的3000个斑点分配给其中斑点数过高而无法计数的孔。
替代ADCC报告基因生物试验。通过小鼠FcγRIV(mFcγRIV)报告基因(Reporter)生物试验(Promega)测量了ADCC。报告基因试验允许测量ADCC而无需从PBMC麻烦地分离NK细胞，并且mFcγRIV的量没有变化(49)。mFcγRIV是小鼠ADCC中涉及的主要受体，它与人FcγRIIIa密切相关，后者是人ADCC中涉及的主要Fc受体(47)。为了进行该试验，用TB40/E在MOI为5感染ARPE-19EC24小时(靶细胞)。将被感染的细胞转移至白色的平底96孔板。额外的24小时后，将来自被免疫的小鼠的混合的(pooled)热灭活血清在试验缓冲液(补充有4％低IgG血清的RPMI 1640)中稀释2倍，并添加至靶细胞。将表达由活化的T-细胞-应答元素的细胞核因子驱动的荧光素酶报告基因的工程化的mFcγRIV细胞添加至每孔，并孵育6小时，然后添加Bio-Glo试剂。使用BioTeck Cytation3光度计使板显色。在不存在血清的情况下，相对于荧光素酶活性计算了倍数诱导(fold induction)。
统计。使用GraphPad Prism软件版本5.0(GraphPad)进行了统计分析。使用单向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验，比较了每组的NAb滴度和IFNγ分泌性T细胞，而使用双向ANOVA，然后进行Sidak的多重比较检验，计算了NAb滴度之间的差异。
示例2：同时表达全部五个PC亚单位，gB，和pp65的MVA载体的构建
使用Cottingham等生成的原MVA BAC(17)，先前生成了含有全部五个PC亚单位均被插入至不同的插入位点的表达盒的重组MVA载体(81，85)。这些第一代MVA-PC载体在小鼠和RM中激发了稳健的HCMV特异性NAb应答，甚至超过了HCMV血清反应阳性的个体的可测量的应答(81)。为了简化疫苗构建并减少表达PC亚单位所需的表达盒和插入位点，最近构建了一种新型MVA BAC，称为MVABAC-TK，将BAC盒插入至胸苷激酶(TK)基因的基因座(82)。通过利用这种新型BAC以及小核糖核酸病毒的2A肽介导的核糖体跳跃机制，生成了仅使用一个或两个MVA插入位点将PC亚单位表达为多顺反子的表达构建体的MVA载体(82)。这些基于新型MVABAC-TK的第二代MVA-PC载体与衍生自原MVABAC的第一代MVA-PC载体在激发小鼠中高滴度和持续性HCMV特异性NAb应答方面一样有效(82)。
在这些构建体的基础上，生成了共表达全部五个PC亚单位与gB和pp65的不同的重组MVA载体。图2提供了此类七抗原性MVA载体的示例。主要遵循两个载体构建的概念。载体构建的第一个概念(图2A-D)，本文以MVAB-7Ag1-4载体代表，是基于将七个HCMV抗原插入至四个不同的插入位点。在所有这些载体中，将由UL128/130/131A组成的P2A连接的多顺反子的表达构建体和由gH/gL组成的P2A连接的多顺反子的表达构建体分别插入至MVA基因64L和65L之间的基因间区域(IGR)(IGR64/65)与MVA基因69R和70L之间的基因间区域(IGR69/70)(本文提及的所有MVA基因均基于登录号U94848)，并将pp65作为单个抗原表达构建体插入至MVA缺失3位点(Del3)。所有这些MVA插入位点(IGR64/65(也称为IGR3)，IGR69/70(也称为G1L/I8R)，和Del3)都是允许稳定抗原表达的常用插入位点(45，76，87)。相比之下，将gB插入至MVAB-7Ag1-4载体内的四个不同的MVA插入位点，以识别MVA基因组内允许gB抗原稳定表达的额外的插入位点。在MVAB-7Ag1中，将gB抗原插入至MVA基因044L和045L之间的IGR(IGR44/45)；在MVAB-7Ag2中，将gB抗原插入至MVA基因007R和008L之间的IGR(IGR7/8)；在MVAB-7Ag3中，将gB抗原插入至MVA基因122R和123L之间的IGR(IGR122/123)；在MVAB-7Ag4中，将gB抗原插入至MVA基因148R和149L之间的IGR(IGR148/149)。所有这些插入位点先前没有进行详细表征。本文没有将常用的缺失2位点(Del2)用于重组载体构建，因为先前的观察结果显示抗原不稳定性可能经常发生在该位点(76)。
载体构建的第二个概念，本文以MVAB-7Ag5和MVAB-7Ag6代表(图2E-2F)，其特征在于将七个HCMV抗原仅插入至两个MVA插入位点。在这两个载体中，都将由全部五个PC亚单位组成的P2A连接的多顺反子的表达构建体插入至MVA基因69R和70L之间的IGR(IGR69/70；也称为G1L/I8R)。另外，在两个载体中，都将pp65和gB作为P2A连接的多顺反子的表达构建体插入。然而，虽然将MVAB-7Ag5中的pp65/gB表达盒插入至常用的Del3位点，但是将MVAB-7Ag6中的pp65/gB表达盒插入至重构的Del3位点(Del3 res.)，该位点通过删除MVA基因163R和167R之间的MVA序列而产生。因此，将MVAB-7Ag6中的gB/pp65表达盒插入与163R和167R MVA基因直接相邻。已经提出了此类重构的Del3位点以促进增强的抗原稳定性，尽管尚未对其进行详细表征(86)。表1示出了被用于使用顺道诱变通过PCR将HCMV抗原插入至MVABAC-TK内不同MVA插入位点的所有引物序列以及MVA内所有被靶向的插入位点。
所有2A信号序列均基于猪捷申病毒-1的2A肽(P2A)，因为该信号序列已被证实在不同的小鼠和人细胞系以及不同的动物模型中介导高效的多聚蛋白剪切(34)。不同的HCMV抗原之间的P2A序列使用了不同的编码序列，以防止多个P2A信号序列的同源重组，从而降低MVA构建体内抗原不稳定性的可能性(81)。在所有构建体中，均引入了gH及其跨膜结构域(TM)，以表达PC的膜系(membrane-tethered)形式，因为之前已经证实，在MVA内，这种形式的PC的免疫原性大幅高于没有gH TM的可溶性形式的PC的免疫原性，至少在考虑诱发稳健的NAb所需的免疫次数时(16，81)。相比之下，将gB插入没有其TM的所有载体中，因为有证据表明，与全长gB蛋白相比，可溶性形式的gB具有增强的免疫原性(75)。包括没有其TM的gB的另一个考虑是消除gB的融合(fusogenic)功能，并且因此降低其潜在的细胞的细胞毒作用(75)。
编码PC亚单位和pp65的HCMV基因序列基于TB40/E。表达截短的，跨膜缺失的gB变体(gBΔTM)的基因序列基于HCMV株Merlin，并编码了Merlin gB蛋白的N-末端698个氨基酸。针对痘苗病毒表达对被插入至MVAB-7Ag1-6载体中的所有HCMV基因序列进行了密码子优化，并连续沉默突变了多于三个相同的核苷酸类型，以增强MVA基因组内HCMV基因序列的稳定性(87)。还产生了构建与MVAB-7Ag1-6相似但包含gB和pp65的未密码子优化的HCMV基因序列(例如，衍生自HCMV的未被修饰的基因序列)的MVA载体。这些含有未密码子优化的基因序列的载体在本文标签为上标NCO(例如，MVAB-7Ag1NCO)。对于对照，使用与用于MVAB-7Ag1的构建相同的插入位点和表达构建体生成了MVABAC-TK衍生的重组MVA载体，表达全部五个PC亚单位与gB(MVAB-pC/gB)，PC亚单位与pp65(MVAB-pC/pp65)，或仅表达PC亚单位(MVAB-pC)，gB(MVAB-gB)，或pp65(MVAB-pp65)的MVA(图3)。
示例3：通过七抗原MVA载体的HCMV抗原表达的体外表征
由于稳定的抗原表达对于每种病毒疫苗载体都至关重要，因此在BHK细胞或CEF上10次病毒传代后，研究了通过不同的七抗原MVA载体的HCMV抗原表达。BHK细胞和CEF是仅有的两个允许MVA有效繁殖的细胞系，而在其他细胞中，MVA复制由于病毒装配的后期阻滞而失败(67，68)。另外，CEF细胞通常用于产生供人使用的MVA疫苗。在BHK细胞和CEF中的传代分析显示了，除MVAB-7Ag2载体示出了被插入至IGR7/8的gB抗原表达降低(数据未示出，图4)之外，大多数具有密码子优化的HCMV基因序列的七抗原载体(MVAB-7Ag1-6，图2)在10次病毒传代期间均能有效地表达HCMV抗原。图4示出了病毒在BHK细胞上传代后通过MVAB-7Ag1，MVAB-7Ag2，MVAB-7Ag3，和MVAB-7Ag4的HCMV抗原表达的示例。
MVA载体的构建与MVAB-7Ag1-4载体相同，但包含未密码子优化的pp65和gB基因序列(在本文中称为MVAB-7Ag1-4NCO)，也表明了HCMV抗原在病毒传代期间的有效表达，尽管观察到了具有被插入至IGR7/8或IGR122/123的gB基因的MVAB-7Ag3NCO和MVAB-7Ag3NCO在传代后的gB表达降低(数据未示出，图5)。图5示出了MVAB-7Ag1NCO和MVAB-7Ag3NCO的10次病毒传代后HCMV抗原表达的示例，其中未密码子优化的基因序列分别被插入至IGR44/45或IGR122/123。这些观察结果表明了稳定的HCMV抗原表达由MVAB-7Ag1和MVAB-7Ag3-6载体提供(图2)，而不是通过MVA-7Ag2载体提供(图2)。相比之下，含有未密码子优化的pp65和gB序列的MVAB-7Ag1-4载体的对应载体(MVAB-7Ag1-4NCO)的稳定抗原表达仅由具有分别被插入至IGR44/45或IGR148/149的gB的MVAB-7Ag1NCO和MVAB-7Ag4NCO提供。这些结果总体上表明，密码子优化可以增强MVA内HCMV gB基因序列的稳定性，并且MVA基因044L和045L之间的插入位点与MVA基因148R和149L之间的插入位点实现最稳定的gB抗原表达。
为了进一步表征PC亚单位，gB，和pp65从单个MVA载体同时表达时的表达，比较了被感染的BHK细胞中通过MVAB-7Ag1(图2A)和对照载体(图3)的HCMV抗原表达。MVAB-7Ag1(也称为MVAB-PC/gB/pp65)表达了全部七个HCMV抗原，而对照载体仅表达了抗原亚群(PC/gB，PC/pp65，或PC)或单个抗原(gB或pp65)(图6A)。各HCMV抗原的可检测的蛋白大小通常与预期分子量值一致(gH＝～85kDa；gL＝～35kDa；UL128＝～15kDa；UL130＝～38kDa；UL131A＝18kDa；gBΔTM＝～110kDa前体蛋白和～35kDa C-末端剪切产物；pp65＝～65kDa(9，57，75))，原因是一些或大多数被表达的HCMV抗原包含了C-末端P2A肽残留物(remnants)(～2kDa)，这是P2A多聚蛋白加工的结果。与先前的观察结果相似(75，81)，gBΔTM主要以～110kDa的前体形式被检测到，也以～35kDa的C-末端弗林蛋白酶剪切产物被少量检测到。先前已观察到所有表达PC亚单位的载体均检测到UL128的两个蛋白带，并且似乎与P2A连接的多顺反子的表达构建体特别相关(83)。由MVAB-7Ag1和所有对照载体编码的各HCMV蛋白的表达水平通常彼此相当，这表明由MVA共表达PC亚单位与gB和pp65不会显著影响各抗原的表达。此外，病毒在CEF上10次传代后，MVAB-7Ag1内的全部七个HCMV抗原均以相当水平被表达(图7)，这证实病毒传代后，MVAB-7Ag1内的全部七个HCMV基因序列均能稳定地维持在常用于人MVA疫苗生产的细胞类型中。此外，在去除BAC载体后，所有HCMV抗原均由MVA-7Ag1和MVA-7Ag5稳定表达(图8)，这表明在这些载体中去除BAC不会影响HCMV抗原的稳定性。这些结果证实，HCMV的全部五个PC亚单位，gB，和pp65均可由单个MVA载体有效且稳定地共表达。
最近从用第一代MVA-PC载体免疫的小鼠中分离出一组单克隆NAb，其示出了抗原识别和中和作用能力与从HCMV血清反应阳性的个体分离出的人UL128/130/131A亚单位和gH特异性NAb相似(15，43)。小鼠单克隆NAb识别了由UL128/130/131A(1B2，12E2)或UL130/131A(21F6，54E11)形成的不同的四级构象表位(15)，UL128(13B5)的C-末端的连续中和表位(14)，或gH(62-11，62-100，18F10，21E9，2-80)内的不同表位(15)。利用被分离的小鼠NAb，证实了由第二代MVA-PC载体编码的P2A连接的PC亚单位相互组装并形成了PC和gH特异性中和表位(83)。为了验证与gB和pp65一起由MVA共表达的P2A连接的PC亚单位是否保留形成复合物并呈现中和表位的能力，用被分离的NAb对被MVAB-7Ag1(图2A)和对照载体(图3)感染的BHK细胞进行细胞表面流式细胞术染色。如图6B所示，对被MVAB-7Ag1(MVAB-PC/gB/pp65)和表达PC亚单位的所有对照载体(MVAB-PC/gB，MVAB-PC/pp65，MVAB-PC)感染的BHK细胞进行有效染色，对所有NAb强度相似。仅对于MVAB-PC感染的BHK细胞，对所有NAb观察到略低的染色强度。相比之下，对于被仅表达gB或pp65的对照载体(MVAB-gB和MVAB-pp65)感染的BHK细胞，未观察到NAb染色。这些结果表明，与gB和pp65一起由MVA共表达时，五个PC亚单位可以组装成蛋白复合物，被转运至细胞表面，并在UL128/130/131A亚单位和gH内呈现多个中和表位。
示例4：由MVAB-7Ag1在小鼠中诱发的体液免疫应答
为了表征由MVA被共表达时PC亚单位，gB，和pp65的免疫原性，比较了通过MVAB-7Ag1和对照载体在C57BL/6野生型小鼠中的HCMV特异性体液和细胞免疫应答的诱导。通过腹膜内(i.p.)途径，用不同的MVA载体对C57BL/6小鼠进行三次间隔四周的免疫，并在第二次加强免疫后一周评估了HCMV特异性免疫应答。作为更好地衡量T细胞应答程度的额外的对照，包括了先前生成并经过临床评估的共表达pp65和即早1/2融合体蛋白(IE1/2)的MVA疫苗载体。这种MVA疫苗载体，也称为三链体(Triplex)(在本文中称为MVA-pp65/IE)，在I期试验中显示了HCMV血清反应阳性和阴性的成年人中T细胞应答的稳健扩展(39)，目前正在造血细胞移植接受对象的II期试验中进行评估(NCT02506933)。
先前已证实第一代MVA-PC载体诱发EC和FB特异性NAb应答的免疫原性大幅高于仅表达PC亚单位亚群(UL128/130/131A或gH/gL)或gB的MVA载体(81)。这项研究仅使用了热灭活的免疫血清，因此仅评估了补体不依赖的中和应答，尽管已证实靶向gB的抗体在某种程度上通过补体发挥其中和功能(10，42)。因此，为了测定由MVAB-7Ag1共表达PC亚单位和gB介导的HCMV中和作用，在不存在或存在豚鼠补体的情况下，在热灭活的免疫血清中测量了HCMV NAb滴度。
在ARPE-19细胞上针对HCMV株TB40/E和TR(两种所谓的“临床样”HCMV株，表达完整的PC并且可有效地感染EC，内皮细胞，和单核细胞/巨噬细胞)测量了抑制50％HCMV感染的EC特异性NAb滴度(NT50)(46)。如图9A和9B所示，在不存在补体的情况下，MVAB-7Ag1衍生的免疫血清(MVAB-PC/gB/pp65)强烈干扰ARPE-19细胞的HCMV TB40E和TR感染，尽管补体的添加并不能增强MVAB-7Ag1衍生的免疫血清预防ARPE-19细胞的感染的中和作用能力。在不存在或存在补体的情况下，针对MVAB-7Ag1衍生的免疫血清测得的这些EC特异性中和作用能力与针对所有表达PC亚单位的对照载体(MVAB-PC/gB，MVAB-PC-pp65，MVAB-PC)衍生的免疫血清测得的相当。与已知的gB特异性NAb的补体依赖的中和活性一致，MVAB-gB衍生的免疫血清在不存在补体的情况下，仅显示了偏低的阻断ARPE-19细胞的HCMV感染的中和作用能力，而在存在补体的情况下，MVAB-gB衍生的免疫血清阻断ARPE-19细胞的HCMV感染的中和作用能力大幅提高。但是，在不存在或存在针对TB40/E或TR的补体的情况下，针对MVAB-gB衍生的免疫血清测得的ARPE-19特异性中和作用能力显著低于针对MVAB-7Ag1和所有表达PC亚单位的对照载体(MVAB-PC/gB，MVAB-PC-pp65，MVAB-PC)衍生的免疫血清测得的ARPE-19特异性中和作用能力。对照载体MVAB-pp65和MVA-pp65/IE(MVA-Venus)不会诱发可测量的阻断ARPE-19细胞的感染的NAb应答。
在小鼠中的这些观察结果表明，MVAB-7Ag1可以激发针对两种“临床样”HCMV株的有效的EC特异性NAb应答。与由MVA单独表达PC亚单位相比，由MVAB-7Ag1共表达PC亚单位，gB，和pp65既不干扰也不增强对体外可测量的EC特异性NAb应答的诱导。此外，这些结果证实，作为激发EC特异性NAb应答的免疫原，PC优于gB，并且表明由MVAB-7Ag1诱导的EC特异性NAb应答以靶向PC的补体不依赖的NAb应答为主。基于这些体外测量，尽管由干扰EC感染的MVAB-7Ag1载体诱导的gB特异性NAb的补体依赖的中和活性可以被靶向PC的NAb能力掩盖，但当通过MVA进行载体处理时，PC可能足以激发EC特异性NAb应答。
在MRC-5细胞上针对TB40/E和TR，以及另外地针对实验室HCMV株Towne和AD169(在表达完整的PC上均有缺陷，并因此无法有效地感染EC，内皮细胞，和巨噬细胞)测量了由不同疫苗载体在被免疫的C57BL/6小鼠中激发的FB特异性NAb应答(46)。如图9C-9F所示，在不存在补体的情况下，MVAB-7Ag1衍生的免疫血清(MVAB-PC/gB/pp65)有效地中和了所有四种HCMV株的MRC-5FB感染。与ARPE-19细胞的测量相反，在ARPE-19细胞中添加补体不能增强MVAB-7Ag1衍生的免疫血清的中和能力，当在存在补体的情况下在MRC-5细胞上测量NAb滴度时，MVAB-7Ag1衍生的免疫血清针对所有被测试的HCMV株始终显示了增加的中和活性(图9C-9F)。
在不存在或存在针对所有不同HCMV株的补体的情况下，针对MVAB-PC/gB对照载体衍生的免疫血清测得的MRC-5特异性NAb滴度与针对MVAB-7Ag1衍生的免疫血清测得的相似。当在不存在补体的情况下测定NAb滴度时，表达PC亚单位而不表达gB的对照MVA载体(MVAB-PC/pp65和MVAB-PC)衍生的免疫血清与MVAB-7Ag1和MVAB-PC/gB衍生的免疫血清示出了相似的干扰MRC-5FB感染的中和作用能力。但是，仅当针对HCMV株TR测量了NAb应答时，在补体存在的情况下，与MVAB-7Ag1和MVAB-PC/gB衍生的的免疫血清相比，MVAB-PC/pp65和MVAB-PC衍生的免疫血清显示了增强的MRC-5特异性中和活性，当针对HCMV株TB40/E，Towne，或AD169测量了NAb应答时则没有。与用ARPE-19细胞针对MVAB-gB衍生的免疫血清进行测量相似，在不存在补体的情况下，MVAB-gB衍生的免疫血清没有或只有偏低的干扰MRC-5FB感染的能力，但是在补体存在的情况下，其针对所有HCMV株的中和活性大幅增加。但是，当针对TB40/E，Towne，或AD169进行评估时，在存在补体的情况下，针对MVAB-gB衍生的免疫血清测得的MRC-5特异性中和作用能力仅达到与针对MVAB-7Ag1和MVAB-PC/gB衍生的免疫血清测得的水平相当的程度，当针对TR进行评估时则没有。对照载体MVAB-pp65，MVA-pp65/IE，和MVA-Venus不激发可检测的MRC-5特异性NAb。
这些结果总体示出，共表达PC亚单位，gB，和pp65的MVAB-7Ag1与仅共表达PC亚单位和gB的对照载体MVAB-PC/gB激发相当的补体不依赖和补体依赖的NAb应答，从而有效地和持续地在体外干扰四种不同HCMV株的FB感染。相比之下，仅表达PC亚单位的对照MVA载体(MVAB-PC/pp65和MVAB-PC)或仅表达gB的对照MVA载体(MVAB-gB)与共表达PC亚单位和gB的MVAB-7Ag1和MVAB-PC/gB相比，激发了针对不同的HCMV株的总体上更低且更可变的中和活性的NAb应答。因此，这些结果提供第一个概念证明，示出了在亚单位疫苗制剂中PC亚单位与gB的组合(如本文中用MVA表示)可以增强NAb应答的激发，其在体外干扰异源HCMV株的FB感染。
示例5：由MVAB-7Ag1在小鼠中诱导的促进ADCC的应答
基于由MVAB-7Ag1(MVAB-PC/gB/pp65)和表达gB的对照载体(MVAB-gB和MVAB-PC/gB)诱导补体依赖的NAb，假设通过MVAB-7Ag1的gB的表达可促进抗体依赖的细胞的细胞毒作用(ADCC)，因为补体依赖的细胞毒作用(CDC)或病毒溶解(CDV)和ADCC被类似的IgG亚类促进。所有这些抗体功能对于针对HCMV感染提供保护可能是重要的。为了解决该假设，采用了替代ADCC报告基因试验以测量与被HCMV TB40/E或TR感染的ARPE-19细胞结合的疫苗衍生的免疫血清中的促进ADCC的抗体应答。
如图10A所示，当用TB40/E感染的细胞进行测量时，MVAB-7Ag1和MVAB-PC/gB衍生的免疫血清显示了相当的介导ADCC的能力。相比之下，针对MVAB-PC或MVAB-PC/gB衍生的免疫血清测得的介导TB40/E特异性ADCC的能力与针对MVAB-7Ag1和MVAB-PC/gB衍生的免疫血清测得的相比显著降低。出人意料的是，MVAB-PC/pp65衍生的免疫血清似乎并未促进TB40/E特异性ADCC，这表明pp65在某些情况下可能干扰PC诱发促进ADCC的应答的免疫原性。针对TR感染的细胞的不同疫苗组测得的ADCC水平与针对TB40/E感染的细胞的不同疫苗组测得的ADCC水平相似(图10B)，其显著差异在于针对MVAB-PC/gB测得的TR特异性ADCC水平高于针对MVAB-7Ag1衍生的免疫血清测得的TR特异性ADCC水平。这可能表明MVAB-7Ag1中pp65的表达可在较小程度上干扰PC亚单位和gB诱导促进ADCC的体液免疫应答的免疫原性。重要的是，MVAB-7Ag1和对照载体衍生的免疫血清含有相当水平的gB特异性和PC特异性结合抗体(图10C-10D)，这支持了通过MVAB-7Ag1的七个HCMV抗原的共表达基本上不影响gB和PC亚单位激发体液免疫力的免疫原性。与MVAB-PC/gB和MVAB-gB衍生的免疫血清相比，针对MVAB-7Ag1衍生的免疫血清仅测量到了略低的gB结合抗体，但是，这没有达到统计学意义。这些结果表明，通过MVAB-7Ag1的PC亚单位和gB的共表达可增强激发促进ADCC的抗体应答。但是，通过MVAB-7Ag1的pp65的额外表达可在较小程度上干扰PC和gB激发依赖于HCMV株的促进ADCC的应答的免疫原性。
示例6：由MVAB-7Ag1在小鼠中诱发的HCMV特异性T细胞应答
利用C57BL/6野生型小鼠评估由MVAB-7Ag1一起共表达的PC亚单位，gB，和pp65的免疫原性的一个原因是有关各HCMV抗原的H2-b限制性免疫显性肽的先验知识(64)。这项知识为研究由MVAB-7Ag1表达的全部七个HCMV抗原是否在体内被有效处理以诱发肽特异性T细胞应答提供了机会。
使用H2-b限制性肽，通过IFNγ ELISPOT测定了不同疫苗组的离体T细胞应答。如图11所示，MVAB-7Ag1(MVAB-PC/gB/pp65)激发了T细胞应答，显示了与PC亚单位，gB，和pp65肽的高水平反应性，而从对照载体免疫的小鼠中分离出的T细胞仅与肽刺激物的亚群高水平地反应。令人惊讶的是，从MVAB-pC或MVAB-pC/pp65免疫的小鼠中分离出的T细胞也显示了与gB肽的较低水平的反应性，这表明该实验中H2-b限制性gB肽在较小程度上与由MVAB-7Ag1诱导的PC特异性T细胞应答非特异地反应。从MVAB-7Ag1免疫的小鼠中分离出的T细胞与从对照载体免疫的小鼠中分离出的T细胞的肽再刺激的频率通常彼此相当，这表明通过MVAB-7Ag1的PC亚单位，gB，和pp65的共表达基本上不影响这些抗原诱发T细胞的能力。另外，MVAB-7Ag1免疫的小鼠衍生的pp65特异性T细胞应答的频率与临床上评估的MVA-pp65/IE载体(“三链体”)免疫的小鼠衍生的pp65特异性T细胞应答的频率相当。针对MVAB-7Ag1免疫的小鼠或表达PC亚单位的对照载体(MVAB-PC和MVAB-PC/gB)免疫的小鼠，用PC肽观察到了特别高频率的T细胞再刺激，这表明PC亚单位由MVA表达时可激发高水平的T细胞应答。考虑到尚未将PC亚单位描述为人有效T细胞应答的靶标，这令人惊讶(65)。如所期望的，对照载体MVA-Venus不激发与任何HCMV抗原的H2-b-限制性肽反应的T细胞应答。这些结果表明，由MVAB-7Ag1表达的PC亚单位，gB，和pp65可在体内被有效处理并刺激抗原特异性T细胞。
示例7：由MVA-7Ag1在小鼠中诱导的HCMV免疫应答的持久性
由于持续的NAb的诱导对于HCMV疫苗候选物可能是重要的，因此评估了由MVA-7Ag1在Balb/c小鼠中诱导的NAb应答的持久性。这些小鼠被标准地用于实验室以研究疫苗诱导的体液免疫力，并且这些小鼠被用于证明第一代和第二代MVA-PC载体可以激发有效且持久的HCMV特异性NAb应答(81，83)。用MVA-7Ag1对Balb/c小鼠进行三次间隔四周的腹膜内免疫，使用MVA免疫的标准剂量(5x107PFU)或比标准剂量(5x107PFU)低五倍的剂量。仅表达PC亚单位的MVA载体(MVA-PC)或Venas的MVA载体作为对照。在每次免疫之前和之后，在MRC-5FB和ARPE-19EC上不存在或存在针对TB40/E的补体的情况下，测量了NAb应答(NT50)，并在初次免疫后的30周内进行跟进。
如图12A-12C所示，MVA-7Ag1或对照载体MVA-PC激发了稳健的FB和EC特异性NAb应答，在整个30周的研究期内，该应答均保持了相对稳定。与先前针对第一代和第二代MVA-PC载体的观察结果相似(81，83)，在第一次免疫后立即检测到由MVA-7Ag1(标准剂量和低剂量)或对照载体MVA-PC诱导的NAb应答，在第一次加强免疫后大幅增加，并在第二次加强免疫后保持在相当水平。虽然在MVA-7Ag1疫苗组(标准剂量和低剂量)和MVA-PC免疫的动物之间，在不存在补体的情况下，测得的EC和FB特异性NAb应答通常是相当的，但是在第二次加强免疫后，在存在补体的情况下，在MVA-7Ag1疫苗组(标准剂量和低剂量)中测得的FB特异性NAb应答显著高于用MVA-PC免疫的动物。对照载体MVA-Venus不激发可测量的EC或FB特异性NAb应答。这些结果证实由MVA-7Ag1表达的HCMV抗原可在小鼠中诱发有效且持久的NAb应答，从而MVA-7Ag1内PC亚单位和gB的组合似乎增强诱导持续性阻断FB感染的补体依赖的NAb。
在初次免疫后第30周额外加强免疫后，使用pp65或gB特异性肽库通过IFNγ-ELISPOT测定到被免疫的Balb/c小鼠的抗原特异性T细胞应答(图12D)。当使用pp65肽时，对于使用标准或低剂量的MVA-7Ag1免疫的小鼠，测定到稳健且相当水平的T细胞应答，而对于使用MVA-PC载体或MVA-Venus免疫的动物，则未测定到或仅测定到偏低水平的T细胞应答。相比之下，当使用gB肽时，仅对于一定比例的用标准剂量的MVA-7Ag1免疫的动物检测到稳健的T细胞应答，而对所有用低剂量的MVA-7Ag1或对照载体免疫的动物均未测定到或仅测定到偏低水平的T细胞应答。在后续实验中，对于用病毒在CEF细胞上传代之前(P0)和10次传代之后(P10)衍生的MVA-7Ag1(无BAC载体)免疫的动物，可以确认相似水平和动力学的NAb滴度以及pp65特异性T细胞应答水平(图13)，这表明MVA-7Ag1在通常用于产生用于临床试验的MVA的细胞底物上长期繁殖期间保留了其免疫学特性。总之，这些结果表明，MVA-7Ag1可以激发Balb/c小鼠中稳健且持久的HCMV体液和细胞免疫应答。
示例8：由不同的七抗原MVA载体在小鼠中诱导的HCMV免疫应答的比较
为了评估仅通过两个被分别插入的多顺反子的表达构建体(MVA-7Ag5和MVA-7Ag6)表达七个HCMV抗原的MVA是否可以提供与通过四个被分别插入的表达构建体(MVA-7Ag1-6)表达七个HCMV抗原的MVA相似的免疫原性，比较了Balb/c小鼠中MVA-7Ag5和MVA-7Ag6与HCV-7Ag4的HCMV特异性体液和细胞免疫应答的诱导。用无BAC载体的疫苗载体对Balb/c小鼠进行三次间隔四周的i.p免疫，并在免疫后的不同时间点测定EC和FB NAb应答。
如图14所示，MVA-7Ag5和MVA-7Ag6激发的有效NAb应答均与由MVA-7Ag4诱导的有效NAb应答相当。此外，在用MVA-7Ag4-6载体免疫后，针对不同疫苗载体测得的抗体动力学彼此相当，并且与MVA-7Ag1测得的抗体动力学一致(图12-14)。与由MVA-7Ag1激发的NAb应答相似，在存在补体的情况下针对用MVA-7Ag4-6载体免疫的小鼠测得的FB特异性NAb应答显著高于在不存在补体的情况下针对这些载体测得的FB特异性NAb应答(图14B)。在第二次加强免疫后一周，使用pp65和gB肽库通过IFNγ-ELISPOT测定了T细胞应答。在所有疫苗组之间，用pp65肽测得的T细胞应答水平通常相当，而对于所有疫苗组，用gB库未检测到或仅检测到非常低的T细胞水平(图14C)。这些结果表明，对于MVA，仅从两个不同的插入位点或从四个不同的插入位点表达的七个HCMV抗原在激发HCMV体液和细胞免疫应答方面提供了相当的免疫原性。
示例9：由MVA-7Ag1诱导人MHC限制性T细胞应答
尽管用C57BL/6和Balb/c小鼠进行的免疫研究示出了，由MVA-7Ag1表达的所有HCMV抗原均有效地被小鼠MHC分子呈现，但是尚不清楚抗原是否也能被人MHC分子有效地呈现。为了解决由MVA-7Ag1表达的HCMV抗原是否可以被人MHC呈现，评估了由MVA-7Ag1在两种转基因C57BL/6小鼠品系中的T细胞诱导。这些转基因小鼠在表达小鼠MHC I类分子方面有缺陷，并且包含被共同表达的HLA-A*0201(A2 Tg小鼠)或HLA-B*0702(B7 Tg小鼠)I类分子的转基因(50，56)。在研究对HCMV的细胞免疫应答时，这些转基因小鼠是评估HLA I类限制性T细胞应答的无价工具，因为它们具有在HLA等位基因情境下有效地处理和呈现pp65和其他HCMV蛋白的免疫显性表位的能力(37，40，45，88)。使用IFNγELISpot，当使用pp65特异性肽库时，通过MVA-7Ag1免疫的A2和B7 Tg小鼠的离体刺激可以证实高频率的T细胞应答，并且当使用pp65的HLA-B*0702限制性免疫显性肽表位时，通过MVA-7Ag1免疫的B7 Tg小鼠的离体刺激也可以证实高频率的T细胞应答(图15)。此外，还使用pp65的HLA-A*0201限制性免疫显性肽表位证实了MVA-7Ag1免疫的A2 Tg小鼠的离体T细胞应答，以及使用gB特异性肽库和gB与PC亚单位的小鼠H2-b限制性肽池证实了MVA-7Ag1免疫的A2和B7 Tg小鼠中的离体T细胞应答。通过H-2b限制性肽的MVA-7Ag1免疫的A2和B7 Tg小鼠中可检测到的这些后面的应答可能代表通过小鼠MHC II类呈现的被刺激的CD4+T细胞，或者它们可能代表通过残余小鼠MHC I类分子表达的被激发的CD8+应答(50)。这些结果表明由MVA-7Ag1表达的HCMV抗原可以被人MHC有效地呈现。
由于已经暗示了T细胞的多功能性与预防HCMV感染有关，因此评估了由MVA-7Ag1在A2和B7小鼠中诱导的抗原特异性T细胞是否是多功能的。用MVA-7Ag1或对照载体MVAB-pp65和MVA-Venus对A2和B7小鼠进行免疫，并使用HLA-A*0201和HLA-B*0702限制性pp65肽表位以及pp65和PC肽库通过IFNγ，TNFα，和IL2细胞内流式细胞术染色评估了T细胞应答。如图16A-16C所示，在B7小鼠中，MVA-7Ag1和MVAB-pp65激发了产生IFN-γ，TNFα-，和IL2的pp65-特异性T细胞应答，其中产生IFNγ的pp65特异性T细胞数量最多，而产生IL2的pp65特异性T细胞数量最少。通常，在MVA-7Ag1免疫的B7小鼠中检测到的pp65特异性T细胞比在MVAB-pp65免疫的B7小鼠中检测到的水平更高(图16A-16F)，尽管这并不显著。相比之下，与MVAB-pp65免疫的B7小鼠相比，在MVA-7Ag1免疫的B7小鼠中产生两种或三种细胞因子的多功能pp65特异性T细胞的比例似乎略有降低(图16G)。有趣的是，MVA-7Ag1免疫的B7小鼠还表现出产生IFNγ，TNFα，和IL2的PC特异性T细胞(图16A-16F)，并且B7小鼠中被MVA-7Ag1刺激的约有一半的PC特异性T细胞是多功能的(图16G)。
与由MVA-7Ag1在B7小鼠中诱导的pp65特异性T细胞应答相比，由MVA-7Ag1在A2小鼠中诱导的产生IFNγ，TNFα，IL2的pp65特异性T细胞应答水平较低，并且通常低于由MVAB-pp65在A2小鼠中诱导的(图17A-17F)，尽管差异对所评估的动物数量不显著。但是，与由MVA-7Ag1和MVAB-pp65在B7小鼠中诱导的pp65特异性T细胞不同，由这些载体在A2小鼠中诱导的pp65特异性T细胞主要是多功能的(图17D-17G)。然而，最引人注目的是由MVA-7Ag1在A2小鼠中诱导的产生IFNγ，TNFα，和IL2的PC特异性T细胞的令人印象深刻的水平，高达CD8+T细胞群总数的45％(图17A-17F)。此外，由MVA-7Ag1在A2小鼠中诱导的这些高水平PC特异性T细胞的一半以上是多功能的(图17G)。这些结果在转基因小鼠中表明，由MVA-7Ag1表达的pp65和PC亚单位可以通过不同的HLA分子被有效地处理并呈现以激发多功能T细胞应答。
示例10：表达八个HCMV抗原的MVA的构建
利用MVABAC-TK和伴随诱变(72，83)，生成了多种MVA载体(MVAB-8Ag1-4)，其同时表达了HCMV的全部五个PC亚单位(gH，gL，UL128，UL130，和UL131A)，gB，pp65，和IE1(图18)。利用两个，四个，或五个不同的MVA插入位点，将八个HCMV抗原以不同的组合作为P2A连接的多顺反子的单个抗原表达构建体插入至IGR 44/45，64/65，69/70，和148/149，以及Del3。
示例11：通过MVA-8Ag载体的HCMV抗原表达
测试了示例10中生成的多种MVA构建体在BHK细胞中的HCMV抗原表达。如图19所示，用MVAB-8Ag1的三个不同克隆(#1-3)感染BHK细胞，并通过免疫印迹分析与被MVAB-7Ag1的不同克隆感染的BHK细胞进行HCMV抗原表达的比较。结果表明，MVAB-8Ag1表达了UL128，UL130，gH，gL，pp65，和IE1。在该实验中未研究HCMV gB和UL130的表达。另外，MVAB-8Ag1的抗原表达水平与MVAB-7Ag1的抗原表达水平相当，这表明在MVA构建体中添加IE1不会干扰其他七个HCMV抗原的表达。图20通过免疫印迹分析证实MVAB-8Ag2表达全部八个HCMV抗原(UL128，UL130，UL131A，gH，gL，gB，pp65，和IE1)。图21提供了通过MVAB-8Ag3和MVA MVAB-8Ag4的HCMV抗原表达的免疫印迹示例。图22提供了通过MVAB-8Ag3的八个HCMV抗原表达并在CEF上进行10次病毒传代后的免疫印迹示例。
示例12：由表达八个HCMV抗原的MVA在小鼠中诱发的体液和细胞免疫应答
在C57BL/6小鼠中，将由八抗原载体MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4诱导的体液免疫应答与由七抗原载体MVA-7Ag5诱导的体液免疫应答进行了比较。C57BL/6小鼠相隔一月用疫苗进行两次免疫，并在不存在补体或存在补体的情况下，使用ARPE-19细胞和MRC-5成纤维细胞，在加强免疫后三周针对HCMV株TB40/E测量了血清NAb应答。如图23A-23B所示，表达八个HCMV抗原的两种MVA载体在小鼠中均成功诱导了NAb应答，达到了与对照载体MVA-7Ag5相当的水平。在HLA-B*0702转基因(B7 Tg)C57BL/6小鼠中，将对八抗原载体MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4的细胞介导的免疫应答与由MVA-7Ag5诱导的进行了比较。通过在细胞内细胞因子染色试验中用pp65特异性肽库和pp65 HLA-B*07限制性表位刺激来自被免疫的B7 Tg小鼠的脾细胞，证明了编码八个抗原的MVA载体诱导了与由MVA-7Ag5载体诱导的相当的IFN-γ，TNF-α，和IL-2 CD8应答(图23C-23E)。在MVAB-8Ag3和MVAB-8Ag4免疫的转基因小鼠中也诱导了对PC的多功能T细胞应答(图23C-23E)。
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以下列出的参考文献，专利，和已公开的专利申请，以及在以上说明书中引用的所有参考文献，据此通过引用整体并入，如同在本文完全阐述。
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Claims (29)
1.一种表达系统，包含一个或多个载体，每个载体包含一个或多个表达盒，每个表达盒包含：
单启动子；
编码多个HCMV抗原的多个核酸序列，
介导核糖体跳跃的一个或多个2A肽信号序列或在所述多个核酸序列的每一个之间的一个或多个内部核糖体进入位点；
其中，所述多个HCMV抗原在同时由所述表达系统共表达时有效地诱发多功能体液和细胞免疫应答。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其中，所述多功能体液和细胞免疫应答包括中和抗体，促进ADCC，CDC，或CDV的抗体，以及多功能CD4+和CD8+ T细胞应答。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的表达系统，其中，所述多个HCMV抗原包含包膜五聚体复合物(PC)，所述包膜五聚体复合物包含gH，gL，UL128，UL130，和UL131A，gB，pp65，IE1，IE2，gO，gM，gN，和任何其他HCMV抗原，或其免疫原性的片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的表达系统，其中，将编码所述多个HCMV抗原的所述多个核酸序列插入一个或多个MVA插入位点。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其中，所述MVA插入位点包含在所述MVA基因64L和65L之间的插入位点(IGR64/65)，在所述MVA基因69R和70L之间的插入位点(IGR69/70)，在所述MVA基因044L和045L之间的插入位点(IGR44/45)，在所述MVA基因007R和008L之间的插入位点(IGR7/8)，在所述MVA基因122R和123L之间的插入位点(IGR122/123)，在所述MVA基因148R和149L之间的插入位点(IGR148/149)，MVA缺失1位点(Dell)，MVA缺失2位点(Del2)，MVA缺失3位点(Del3)，MVA缺失4位点(Del4)，MVA缺失5位点(Del5)，MVA缺失6位点(Del6)，和任何所述MVA基因之间的任何其他MVA基因间区域(IGR)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的表达系统，其中，所述一个或多个载体中的每一个是病毒载体，质粒，BAC，或病毒-BAC构建体。
7.根据权利要求6所述的表达系统，其中，所述病毒载体是被修饰的痘苗安卡拉(MVA)载体。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的表达系统，其中，一个或多个2A信号序列编码口蹄疫病毒的2A肽(F2A)，马鼻炎A病毒的2A肽(E2A)，猪捷申病毒-1的2A肽(P2A)，质型多角体病毒的2A肽(BmCPV 2A)，软化病病毒的2A肽(BmIFV 2A)，或明脉扁剌蛾病毒的2A肽(T2A)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的表达系统，其中，所述启动子是痘苗的痘苗病毒mH5启动子，pSyn启动子，p7.5启动子，或p11启动子，或刺激痘苗基因表达的任何其他天然或合成的启动子序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的表达系统，其中，所述表达系统包括：
第一载体，包含第一表达盒，所述第一表达盒包含第一启动子，编码两个或更多个HCMV抗原的两个或更多个核酸序列，以及在所述两个或更多个核酸序列的每一个之间的一个或多个2A信号序列；和
第二载体，包含第二表达盒，所述第二表达盒包含第二启动子，编码一个或多个HCMV抗原的一个或多个核酸序列，以及在所述一个或多个核酸序列的每一个之间的一个或多个2A信号序列；
其中，所述第一和第二载体的所述HCMV抗原由所述表达系统同时表达。
11.根据权利要求10所述的表达系统，其中，所述第一载体的所述两个或更多个HCMV抗原包含UL128，UL130，UL131A，gL，和gH；以及所述第二载体的所述一个或多个HCMV抗原包含pp65，gB，和/或IE1/IE2。
12.根据权利要求10所述的表达系统，进一步包含第三载体，所述第三载体包含第三表达盒，所述第三表达盒包含第三启动子，编码一个或多个HCMV抗原的一个或多个核酸序列，以及在所述一个或多个核酸序列的每一个之间的一个或多个2A信号序列；
其中，所述第一载体，所述第二载体，和所述第三载体的所述HCMV抗原由所述表达系统同时表达。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的表达系统，其中，针对痘苗病毒表达对编码一个或多个HCMV抗原的一个或多个核酸序列进行密码子优化，以增强所述核酸序列在所述MVA基因组内的所述表达或稳定性。
14.根据权利要求13所述的表达系统，其中，所述核酸序列被沉默突变而不影响被编码的氨基酸序列，以避免具有四个或更多个连续的，相同的核苷酸的序列。
15.一种表达系统，包含重组细菌人工染色体(BAC)构建体，所述重组细菌人工染色体(BAC)构建体包含BAC载体和病毒载体基因组，所述病毒载体基因组包含至少一个表达盒，其中每个表达盒包含：
单启动子；
编码两个或更多个HCMV抗原的两个或更多个核酸序列；
在所述两个或多个核酸序列的每一个之间的一个或多个2A信号序列；
其中，所述两个或更多个HCMV抗原由所述表达系统同时表达。
16.根据权利要求15所述的表达系统，其中，将编码所述两个或更多个HCMV抗原的所述核酸序列插入一个或多个插入位点。
17.根据权利要求16所述的表达系统，其中，所述插入位点包括在MVA基因64L和65L之间的插入位点，在所述MVA基因69R和70L之间的插入位点，在所述MVA基因044L和045L之间的插入位点，在所述MVA基因007R和008L之间的插入位点，在所述MVA基因122R和123L之间的插入位点，在所述MVA基因148R和149L之间的插入位点，MVA缺失1位点(Del1)，MVA缺失2位点(Del2)，MVA缺失3位点(Del3)，MVA缺失4位点(Del4)，MVA缺失5位点(Del5)，MVA缺失6位点(Del6)，和任何所述MVA基因之间的任何其他MVA基因间区域(IGR)。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的表达系统，其中，将编码所述两个或更多个HCMV抗原的所述DNA序列插入单个插入位点。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的表达系统，其中，将编码所述两个或更多个HCMV抗原的所述DNA序列插入两个或更多个不同的插入位点。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的表达系统，其中，针对痘苗病毒表达对一个或多个核酸序列进行密码子优化，以增强所述核酸序列在所述MVA基因组内的所述表达或稳定性。
21.根据权利要求20所述的表达系统，其中，所述核酸序列被沉默突变而不影响被编码的氨基酸序列，以避免具有四个或更多个连续的，相同的核苷酸的序列。
22.一种预防或治疗HCMV感染的疫苗组合物，包含能够同时共表达两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，或更多个HCMV抗原的病毒载体；以及药学上可接受的运载体，佐剂，添加剂，或其组合。
23.根据权利要求22所述的疫苗组合物，其中，所述病毒载体包含编码通过连接序列连接的七个或更多个HCMV抗原的七个或更多个核酸序列。
24.根据权利要求23所述的疫苗组合物，其中，所述连接序列是IRES或2A肽序列。
25.一种预防HCMV进入细胞的方法，包括用有效量的病毒载体感染所述细胞，所述病毒载体能够同时共表达七个或更多个HCMV抗原。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述病毒载体包含编码通过连接序列连接的两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，或更多个HCMV抗原的七个或更多个核酸序列。
27.一种在受试者中预防或治疗HCMV感染的方法，包括向所述受试者施用预防或治疗有效量的疫苗，其中，所述疫苗包含能够同时共表达七个或更多个HCMV抗原的病毒载体，以及药学上可接受的运载体，佐剂，添加剂，或其组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述病毒载体包含编码通过连接序列连接的七个，八个，或更多个HCMV抗原的七个，八个，或更多个核酸序列。
29.一种在受试者中预防或治疗HCMV感染或与HCMV相关的疾病的方法，包括施用有效量的包含权利要求1-21中任一项所述的表达系统的组合物或权利要求22-24中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述受试者是HCMV血清反应阳性或血清反应阴性的孕妇或造血干细胞或实体器官移植的接受对象。
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