CN105980570A - Cmv疫苗 - Google Patents
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Abstract
本文提供适于作为疫苗用于预防和治疗巨细胞病毒感染和再活化的遗传修饰的沙粒病毒载体。本文还提供用于治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物和方法。具体地说，本文提供治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物、疫苗和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年12月3日提交的美国临时申请号61/911,135和2014年9月26日提交的美国临时申请号62/055,699的优先权的权益。所述2个申请通过引用以其整体结合到本文中。
1.引言
本发明总的来说涉及适宜作为用于预防和治疗巨细胞病毒感染和再活化的疫苗的修饰的沙粒病毒。本发明还涉及用于治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物和方法。具体地说，本文提供治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物、疫苗和方法。
2.背景
2.1医学需要
人巨细胞病毒(HCMV)是一种无处不在的β-疱疹病毒，通常在健康个体中引起慢性潜伏性无症状感染，在发达世界中整体年龄调整的CMV血清阳性率超过50％(Bate等,Clin.Infect.Dis.,2010,50(11):1439；La Rosa和Diamond,Future Virol.,2012,7(3):279))。然而，在免疫应答受损的患者中，尤其在移植物接受者、感染HIV的人和先天感染的新生儿中，CMV引起可观的发病率和死亡率，因此呈现出一个重要的公共卫生问题。
HCMV感染是发达世界中先天病毒感染的最常见的原因。每年约40,000名先天受感染的婴儿在美国出生。先天性CMV感染可能导致多种神经发育性失能，并表现为儿童听力损失最常见的感染原因。与唐氏综合征或胎儿酒精综合征相比因先天性CMV感染更多儿童患有长期后遗症的事实表明HCMV的巨大公共健康影响(Cannon等，BMC Public Health，2005，5:70)。
除了其作为围产期感染的影响以外，HCMV也是移植患者中的感染性并发症的重要原因，引起局限性肺炎、肝炎、胃肠溃疡、视网膜炎和死亡。虽然现今在大多数情况下，可通过用成本密集、常规使用的抗病毒药物抢先疗法来防止终末器官疾病的这些严重形式，但是CMV感染的后期再活化仍是一个问题。此外，CMV引发间接作用，例如移植排斥、在心脏或肺移植或免疫抑制后动脉粥样硬化加快。
此外，CMV感染和/或再活化还与HIV患者以及允许进入重症监护病房的患者的死亡率显著相关。
2.2 HCMV免疫和疫苗开发
先天性CMV的重大公共健康影响引导美国医学研究所将CMV疫苗的开发在其最新报告“21世纪的疫苗”中列为最优先考虑的事项。虽然疫苗开发努力已持续了几十年，但迄今为止仍没有可用的已获许可的CMV疫苗。有效疫苗的开发已被证实是困难的，因为在了解CMV流行病学和传播方面仍有关键性的差距。
CMV在健康的有免疫能力的宿主中很少引起疾病，其中针对CMV的免疫提供若干保护水平，并在维持无症状感染中起必不可少的作用。然而，人免疫系统不能够清除感染，且尽管宿主免疫，但CMV通常建立可持续终身的慢性感染。相比之下，在免疫抑制后和在未发育完全的宿主中容易发生不受控制的CMV病毒血症和危急生命的症状。
在临床试验中已研究了基于不同技术的若干疫苗候选物。已证实了用诱导CMV特异性抗体应答的活的减毒疫苗候选物和糖蛋白疫苗候选物两者通过疫苗接种引起的部分保护。还表明了用抗体的被动免疫提供某种保护。然而，一旦潜伏性感染建立，则CMV特异性T细胞的强诱导似乎是控制再活化和疾病必需的。
2.3 HCMV疫苗抗原
一些数据表明抑制CMV进入宿主细胞的中和抗体在防止水平和垂直病毒传播中起重要作用。基于中和成纤维细胞感染的研究把主要包膜糖蛋白B(gB)定义为中和抗体的优势靶标之一。在人CMV疫苗候选物中加入gB得到临床II期数据的进一步支持，该数据表明，基于gB的亚基疫苗与MF59佐剂组合能够在血清反应阴性女性中赋予部分保护(Pass,J.Clin.Virol.,2009,46(Suppl 4):S73；Pass等,N.Eng.J.Med.,2009,360(12):1191)。
虽然基于重组gB的疫苗候选物诱导预防HCMV感染的高滴度的中和抗体，但是其它HCMV抗原可诱导抑制特定细胞类型(例如上皮和内皮细胞)的HCMV感染的较高滴度的抗体。有效防止HCMV感染的疫苗策略将取决于诱导抑制病毒进入各种细胞类型的有效中和抗体的能力。最新研究显示由糖蛋白gH/gL(UL75/UL115)、UL128、UL130和UL131A形成的五聚体复合体是HCMV进入上皮和内皮细胞所必需的，并且是HCMV血清反应阳性个体中有效中和抗体的靶标(Ryckman等,J.Virol.,2008,82(1):60；Wang和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102:18153；Wussow,等,J.Virol.,2013,87(3):1322)。
用于诱导防止由细胞毒性T细胞介导的CMV疾病的潜在疫苗抗原是被膜蛋白(tegument protein)pp65，其是一种免疫显性CD8+T细胞抗原(Wills等,J.Virol.,1996,70(11):7569)。pp65特异性CD8+T细胞频率与移植患者中CMV的免疫控制有关(Pipeling等,J.Infect.Dis.,2011,204(11):1663)，且pp65特异性T细胞的适应性转移显得在造血干细胞移植物接受者中具有治疗用途(Peggs等,Clin Infect Dis 2011,52(1):49；Einsele等,Blood,2002,99(11):3916；Micklethwaite等,Blood,2008,112(10):3974)。总之，这些研究结果表明，被设计成防止移植患者的CMV疾病的CMV疫苗需要加入pp65。
3.发明概述
本发明涉及包含选自以下核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体：
a.编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
g.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是感染性的，即能够进入宿主细胞或将其遗传物质注入宿主细胞中。在某些更具体的实施方案中，本文提供的病毒载体是感染性的，即能够进入宿主细胞或将其遗传物质注入宿主细胞中，接着在宿主细胞内扩增并表达其遗传信息。
在某些实施方案中，CMV糖蛋白gB或其抗原片段选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:30SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:63。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或至少900个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV糖蛋白gB特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，gB抗原包含与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:63的gB抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，pp65抗原包含与SEQ ID NO:36的pp65抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或至少500个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV pp65特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，糖蛋白gH包含与选自SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:52的糖蛋白gH或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700或至少750个氨基酸长。在某些实施方案中，片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV糖蛋白gH特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，糖蛋白gL包含与SEQ ID NO:41的糖蛋白gL或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、150、200、250或至少300个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV糖蛋白gL特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，UL128包含与SEQ ID NO:43的UL128或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、至少150个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答时，其中所得抗体与人CMV UL128特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，UL130包含与SEQ ID NO:46的UL130或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、150、200、至少250个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV UL130特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，UL131A包含与SEQ ID NO:48的UL131A或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原片段为至少10，25，50，75，至少100个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV UL131A特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。
在某些实施方案中，病毒载体包含以下至少两种：
a.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的2种核苷酸序列被编码自切割肽或导致通过“核糖体跳跃(ribosome skipping)”释放上游氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
在某些实施方案中，病毒载体包含以下至少3种：
a.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的3种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”释放上游氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
在某些实施方案中，病毒载体包含以下至少4种：
a.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的4种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”释放上游氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
在某些实施方案中，病毒载体包含：
a.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中上述a至e的5种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”释放上游氨基酸序列的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
在某些实施方案中，自切割肽(或核糖体跳跃序列)可获自来自病毒科微小RNA病毒科(Picornaviridae)的成员的2A蛋白。在某些具体的实施方案中，自切割肽(或核糖体跳跃序列)获自(或来源于)猪捷申病毒(Porcine teschovirus)-1 2A、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasignavirus)2A或口蹄疫病毒2A肽。
在某些实施方案中，沙粒病毒的可读框(ORF)缺失或功能性失活。在一个具体的实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白GP的ORF缺失或功能性失活。在某些实施方案中，基因的功能性失活消除任何翻译产物。在某些实施方案中，功能性失活是指允许某些翻译的遗传变异，然而翻译产物不再有功能，并且不能代替野生型蛋白质。
在某些实施方案中，病毒载体可在被病毒载体感染的细胞中扩增并表达其遗传信息，但是病毒载体不能在非补给细胞(non-complementing cell)中产生更多的感染性子代颗粒。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是感染性的，即能够进入宿主细胞或将其遗传物质注入宿主细胞中。在某些更具体的实施方案中，本文提供的病毒载体是感染性的，即能够进入宿主细胞或将其遗传物质注入宿主细胞中，接着在宿主细胞内扩增并表达其遗传信息。
在某些实施方案中，编码感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)克隆13毒株或LCMV MP毒株。SEQ ID NO:32和33分别给出克隆13的S区段和L区段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本文提供病毒载体，其基因组是或如下来源于克隆13的基因组(SEQ ID NO:32和33)：通过缺失克隆13基因组的ORF(例如GP蛋白的ORF)并将其用编码抗原(例如CMV抗原)的异源ORF置换使得其余的LCMV基因组与克隆13的核苷酸序列(SEQ IDNO:32和33)有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性。
在某些实施方案中，本文提供病毒载体，其基因组如下来源于LCMV毒株MP的基因组(SEQ ID NO:49和53)：通过缺失LCMV毒株MP基因组的ORF(例如GP蛋白的ORF)并将其用编码抗原(例如CMV抗原)的异源ORF置换使得其余的LCMV基因组与LCMV毒株MP的核苷酸序列(SEQ ID NO:49和53)有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、至少99.9％或100％同一性。
在一个更具体的实施方案中，病毒载体包含基因组区段，其中基因组区段包含与SEQ ID NO:31的核苷酸1639-3315或SEQ ID NO:32的1640-3316的序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体含有包含编码这样的表达产物的核苷酸序列的基因组区段，所述表达产物的氨基酸序列与由SEQ IDNO:31的1639-3315或SEQ ID NO:32的1640-3316编码的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性。
本发明还涉及包含编码其中糖蛋白gB的胞质域缺失的CMV糖蛋白gB的核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒。在具体的实施方案中，gB的胞质域缺失。在其它具体的实施方案中，gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。在更多的其它具体实施方案中，gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。在某些实施方案中，异源蛋白质是水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。在某些实施方案中，沙粒病毒的生长或感染性不受异源氨基酸影响。在具体的实施方案中，gB蛋白的跨膜结构域缺失。
本文还提供编码包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽的融合蛋白的核酸。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域缺失。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。在更多的其它具体实施方案中，gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。在某些实施方案中，异源蛋白质是VSV的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。在某些实施方案中，gB蛋白的跨膜结构域缺失。
本文还提供包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽的融合蛋白。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域缺失。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。在更多的其它具体实施方案中，gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。在某些实施方案中，异源蛋白质是VSV的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。在某些实施方案中，gB蛋白的跨膜结构域缺失。
本文还提供分离的核酸，其中核酸编码沙粒病毒基因组区段，其中基因组区段的1个ORF缺失或功能性失活且其中基因组区段包含以下的一个或任何组合：
a.编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
g.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，由分离的核酸编码的基因组区段是短区段，其中编码GP的ORF缺失。在某些实施方案中，基因组区段包含CMV糖蛋白gB或其片段。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域缺失。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。在具体的实施方案中，异源蛋白质是VSV的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。在某些实施方案中，gB蛋白的跨膜结构域缺失。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。
一方面，本文提供用于产生感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的方法，所述方法包括：
a.将本文所述核酸转染至宿主细胞中；
b.在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
c.收获感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒；
其中宿主细胞表达在基因组区段上缺失或功能性失活的ORF。在某些实施方案中，在步骤a中还将拯救病毒颗粒所需的任何其它核酸转染至宿主细胞中。所述其它核酸可以是：第二沙粒病毒基因组区段的cDNA，编码L ORF的核酸和/或编码N ORF的核酸。
另一方面，本文提供包含本文所述病毒载体和药学上可接受的载体的组合物，例如药物组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物。本文还提供包含两种或更多种不同的本文所述病毒载体(即其中病毒载体编码不同的CMV抗原)的组合物(例如疫苗组合物)。在某些实施方案中，药物组合物包含本文所述核酸或融合蛋白。
又一方面，本文提供治疗或预防患者的CMV感染或再活化的方法，所述方法包括将本文所述病毒载体、药物组合物、免疫原性组合物或疫苗给予患者。再一方面，本文提供本文所述病毒载体、药物组合物、免疫原性组合物或疫苗用于治疗或预防患者的CMV感染或再活化的用途。在某些实施方案中，表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒能够防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染。在某些实施方案中，一种或多种表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒能够防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染。
在某些实施方案中，给予患者表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导持久的免疫应答。
在某些实施方案中，本文提供治疗和或预防患者的CMV感染或再活化的方法，所述方法包括给予患者两种或更多种表达CMV抗原或其片段的复制缺陷型沙粒病毒。在一个更具体的实施方案中，各复制缺陷型沙粒病毒表达不同的CMV抗原或其片段。在其它实施方案中，各复制缺陷型沙粒病毒表达CMV抗原或其衍生物。在一些实施方案中，其衍生物是CMV抗原片段。在又一个实施方案中，本文提供包含两种或更多种各自表达不同CMV抗原或其片段的复制缺陷型沙粒病毒的组合物。
3.1惯例和缩略语
4.序列表描述
下列序列是可与本文所述方法和组合物一起使用的说明性氨基酸序列和核苷酸序列。在某些情况下，使用DNA序列描述病毒基因组区段的RNA序列。RNA序列可容易地从DNA序列推导。
SEQ ID NO:1是HK1-HgB(FL)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段为RNA，以DNA显示SEQ ID NO:1的序列；然而，将SEQ ID NO:1中的全部胸苷(“T”)换为尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:2是HgB(FL)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是HgB(FL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是HK1-HgB(dTM)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:4的序列；然而，将SEQ ID NO:4的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:5是HgB(dTM)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是HgB(dTM)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是HK1-HgB(1-706)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:7的序列；然而，将SEQ ID NO:7的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:8是HgB(1-706)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是HgB(1-706)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是HK1-HgB(1-691)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:10的序列；然而，将SEQ ID NO:10的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:11是HgB(1-691)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是HgB(1-691)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是HK1-HgB(1-447)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:13的序列；然而，将SEQ ID NO:13的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:14是HgB(1-447)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是HgB(1-447)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是的HK1-HgB(dCt)基因组区段核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:16的序列；然而，将SEQ ID NO:16的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:17是HgB(dCt)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是HgB(dCt)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是HK1-HgB(VSV-G-1)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:19的序列；然而，将SEQ ID NO:19的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:20是HgB(VSV-G-1)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21是HgB(VSV-G-1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是HK1-HgB(VSV-G-2)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:22的序列；然而，将SEQ ID NO:22的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:23是HgB(VSV-G-2)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是HgB(VSV-G-2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是HK1-HgB(H3-1)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:25的序列；然而，将SEQ ID NO:25的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:26是HgB(H3-1)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是HgB(H3-1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是HK1-HgB(H3-2)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:28的序列；然而，将SEQ ID NO:28的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:29是HgB(H3-2)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是HgB(H3-2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒区段S，全序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:31的序列；然而，将SEQ ID NO:31的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:32是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13区段S，全序列(GenBank：DQ361065.2)。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:32的序列；然而，将SEQ ID NO:32的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:33是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13区段L，全序列(GenBank：DQ361066.1)。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:33的序列；然而，将SEQ ID NO:33的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:34是HK1-Hpp65基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:34的序列；然而，将SEQ ID NO:34的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:35是Hpp65cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是Hpp65的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是HK1-HgH基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:37的序列；然而，将SEQ ID NO:37的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:38是HgH cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39是HgH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是HgL cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41是HgL的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是HUL128cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是HUL128的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是HK1-HUL130基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:44的序列；然而，将SEQ ID NO:44的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:45是HUL130cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是HUL130的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是HUL131A cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是HUL131A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎毒株MP区段L，全序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:49的序列；然而，将SEQ ID NO:49的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:50是HK1-HgH(dTM)基因组区段的核苷酸序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:50的序列；然而，将SEQ ID NO:50的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:51是HgH(dTM)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是HgH(dTM)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎毒株MP区段S，全序列。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:53的序列；然而，将SEQ ID NO:53的胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:54是LCMV的MP毒株的NP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是LCMV的MP毒株的GP蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56是LCMV的MP毒株的L蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57是LCMV的MP毒株的Z蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58是编码HCMV毒株Merlin gB的LCMV克隆13S-区段的序列；全长野生型。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:58的序列；然而，将SEQ ID NO:58的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:59是HCMV毒株Merlin gB(FL)ORF的cDNA序列。
SEQ ID NO:60是HCMV毒株Merlin gB(FL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是编码HCMV毒株Merlin gB序列的LCMV克隆13S-区段的序列；跨膜区缺失(dTM)。该基因组区段是RNA，以DNA显示SEQ ID NO:61的序列；然而，将SEQ ID NO:61的全部胸苷(“T”)换成尿苷(“U”)来提供RNA序列。
SEQ ID NO:62是HCMV毒株Merlin gB(dTM)ORF的cDNA序列。
SEQ ID NO:63是HCMV毒株Merlin gB(dTM)的氨基酸序列。
5.附图简述
图1：野生型沙粒病毒的基因组由短(1；～3.4kb)和大(2；～7.2kb)RNA区段组成。短区段携带编码核蛋白(3)和糖蛋白(4)的ORF。大区段编码依赖于RNA的RNA聚合酶L(5)和基质蛋白Z(6)。通过缺失糖蛋白基因，并插入针对其诱导免疫应答的精选抗原(7)而不是糖蛋白基因，野生型沙粒病毒可提供复制缺陷型疫苗载体。
图2：(改编自等，2011)在各种不同的rLCMV-gB载体中表达的gB蛋白的抗原位点；AS-1/5是指糖蛋白B的抗原位点1-5。TM表示gB的跨膜结构域。勾除剪刀表示位于gB胞外域内的弗林蛋白酶切割位点中的突变。载体名称中的“H”(例如HK1-HgB(FL))表示人CMV gB序列；载体名称中的“GP”(例如HK1-GPgB(FL))表示豚鼠CMV gB序列。
图3A：产生用于表达完整五聚体复合物或仅其部分的膜锚定(野生型)或非锚定(跨膜结构域缺失)形式的不同的rLCMV-PC载体。以各颜色表示的箭头表示2A自切割序列。使2A核苷酸序列摆动以避免在质粒克隆时或在载体骨架的情况下的同源重组。
图3B：产生用于表达完整五聚体复合物或仅其部分的膜锚定(野生型)或非锚定(跨膜结构域缺失)形式的不同rLCMV-PC载体。出于上文列出的原因，使分隔各PC组分的2A自切割序列摆动。或者，使IRES序列置于2个可读框(ORF)之间导致下游ORF翻译。另外，使蛋白质标签(V5)与各五聚体复合物蛋白融合以利于蛋白质印迹法中的检测。2A*：来源于来自病毒科微小RNA病毒科的成员的2A蛋白的2A肽(例如猪捷申病毒-1 2A、明脉扁刺蛾β四体病毒2A)。
图4：表达LCMV GP的HEK 293悬浮培养物用rLCMV载体HK1-HgB(FL)、HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(706)、HK1-HgB(691)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)、HK1-HgB(H3-1)和HK1-HgB(H3-2)感染(MOI为0.001)。表达绿色荧光蛋白(HK1-GFP)的相应的rLCMV载体用作对照。(A)在病灶形成单位(FFU)测定中通过在温育72小时或96小时后统计染色病灶，来监测病毒感染。通过计算每毫升病灶形成单位的数目(FFU/ml)，使用结果求出病毒滴度。(B)为了评价载体颗粒的感染性，从备料中分离载体RNA，并采用定量实时PCR(qPCR)，测定基因组当量的量。使各个结果与(A)中确定的FFU滴度相关联以计算载体构建体的具体感染性。
图5：为了分析载体复制，使用表达LCMV GP的悬浮HEK 293细胞绘制生长曲线。以3x105个细胞/ml的细胞密度接种各细胞，并用各载体(HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(H3-2)和HK1-HgB(691))以0.001的MOI感染。每24小时抽取样品并通过FFU测定法分析。所有测试的载体显示与HK1-GFP相比的类似的生长动力学和峰值滴度，表明各gB转基因不干扰载体复制至比小报道基因GFP更大的程度。
图6：表达LCMV GP的HEK 293细胞用各rLCMV-gB构建体(HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)、HK1-HgB(H3-1)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(FL)、HK1-HgB(dTM))以0.001的感染复数(MOI)感染。感染后96小时分析细胞。将蛋白质在SDS凝胶上分离，转移到硝化纤维膜上，用转基因特异性第一抗体(人CMV gB的小鼠单克隆抗体)和合适的第二抗体检测gB蛋白表达。预期全长gB的未切割前体在～160kDa处形成条带，而切割的gB含有通过二硫键与跨膜组分(估计分子量为55kDa)连接的表面组分(估计分子量为116kDa)。然而，由于单克隆第一抗体的使用，预期在印迹上只观察得到代表未切割gB蛋白和gB的较小切割产物的2条带。正如预期的一样，全长gB(泳道7)在～160kDa处形成条带，而所有其余的构建体显示较小的条带，这可通过gB胞质域的至少部分的缺失或交换来解释。类似地，全长gB(泳道7)条带的跨膜部分在～60kDa(比预期的略高)处形成条带，所有gB衍生物显示较小的切割产物。一般来说与所有其它载体相比，HK1-gB(FL)和HK1-gB(dTM)显示较弱的gB条带。
图7：在用6.7x104FFU/剂的HK1-GPgB-dTM、HK1-GPgB-dTMuc、HK1-GPgB-FL的每一种和用9.2x105FFU/剂的HK1-GFP实验的第0、21和42天，使C57BL/6小鼠皮下免疫3次。在实验的第21、42和63天收集免疫小鼠的血清，通过ELISA测定抗GPgB IgG抗体滴度。显示了终点GMT。
图8A和B：在实验的第0、21和42天通过肌内途径(图8A)或通过皮下注射(图8B)用不同浓度(7.4x101、2.2x103、6.7x104和2x106FFU/剂)的HK1-GPgB-dTM使C57BL/6小鼠免疫3次。在实验的第21、42和63天收集免疫小鼠的血清，通过ELISA测定抗GPgB IgG抗体滴度。显示了终点GMT。
图8C：在第0和28天通过肌内(第1和2组)或皮内(第3和4组)途径用5.6x105(第1和3组)或3.2x103(第2和4组)FFU/剂的HK1-HgB(dCt)使C57BL/6小鼠免疫。在第28、56和70天收集免疫小鼠的血清，通过ELISA测量抗HCMVgB IgG抗体滴度。显示了单克隆抗体当量浓度(μg/ml)；单克隆抗gB抗体(mIgG1)用于标准曲线制作。
图8D：在第0和28天通过肌内(第1和2组)或皮内(第3和4组)途径，用6.7x105(第1和3组)或3.5x103(第2和4组)FFU/剂的HK1-Hpp65使C57BL/6小鼠免疫。在第38天，用根据Shedlock D.等(Human Vaccines&Immunotherapeutics 2012；8:11,1-14)产生的肽库重新刺激脾细胞，通过流式细胞术分析CD8+T细胞应答。对照细胞只用培养基刺激。在用培养基(泳道1-4)或特定的肽(泳道5-8)温育后，使细胞染色用于CD8+T细胞的流式细胞分析。分析了IL-2、IFN-g和TNF的表达。
图9：在第0和21天，用1x105FFU/剂的HK1-HgB(691)、HK1-HgB(706)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(H3-1)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)、HK1-HgB(dTM)和重组gB/佐剂肌内使C57BL/6小鼠免疫。在实验的第0、21、42、63、84和105天收集免疫小鼠的血清，通过ELISA测量抗HCMVgB IgG抗体滴度。显示了终点GMT。
图10：在第0和21天，用1x105FFU/剂的HK1-HgB(691)、HK1-HgB(706)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(H3-1)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)、HK1-HgB(dTM)和重组gB/佐剂肌内使C57BL/6小鼠免疫。将第42天收集的血清与含有豚鼠补体(终浓度：5％)和GFP标记的HCMV毒株TS15-rN的培养基混合。将血清/培养基混合物在37℃下温育60分钟，然后转移到含有ARPE-19细胞的384孔板的孔中。在第4天拍摄代表性显微照片，在感染后第7天定量测定GFP。对GFP值与血清浓度作图，应用4参数曲线拟合分析以测定导致50％抑制的合适稀释度。提供了对数倒数中和滴度(IC50)。
图11：在第0和21天，用1x105FFU/剂的HK1-HgB(691)、HK1-HgB(706)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(dTM)和重组gB/佐剂肌内使C57BL/6小鼠免疫。通过HCMVgB特异性IgG亚类ELISA分析第42天收集的血清。HCMVgB特异性IgG亚类的百分比计算为各亚类终点滴度GMT除以全部亚类的总终点滴度GMT的比率。
图12：在第0、21和42天，用不同浓度(1.54x107、1.54x106、1.54x105和1.54x104FFU/剂)的HK1-GPgB-dTM肌内使Hartley豚鼠(4只动物/组)免疫。在实验的第0、21、42和63天收集免疫动物的血清，通过GPgB特异性IgG ELISA分析抗gB抗体滴度。显示了终点GMT。单独的实心圆表示GPCMV阳性对照血清。
图13：在第0、21和42天，用不同浓度(1.54x107、1.54x106、1.54x105和1.54x104FFU/剂)的HK1-GPgB-dTM肌内使Hartley豚鼠(4只动物/组)免疫。在实验第63天收集的免疫动物血清中抗GPgB抗体的中和活性通过噬斑减少测定法测定。
图14：将表达LCMV GP的HEK 293悬浮细胞用rLCMV载体HK1-Hpp65(MOI＝0.001)感染。表达GFP的rLCMV载体(HK1-GFP)用作对照。在规定时间点抽取样品，通过FFU测定法(A)分析以计算每样品单位体积病灶形成单位(FFU)的数目(FFU/ml)，并通过qPCR以计算载体构建体的具体感染性(B)。
图15：将表达LCMV GP的HEK 293悬浮细胞用HK1-Hpp65或阴性对照载体HK1-GFP感染，感染后96小时收获并裂解，在SDS凝胶上分离，转移到硝化纤维膜上并用抗pp65第一抗体和合适的碱性磷酸酶缀合的第二抗体探测。预期人CMV pp65蛋白在65kDa范围形成条带，相当于蛋白质印迹中HK1-Hpp65的主带。
图16：(A)和(B)用1x104目标剂量的HK1-Hpp65(第1组)或HK3-Hpp65(第2组)给15组C57BL/6小鼠肌内接种疫苗(总计100μL/小鼠；50μL/大腿)。未接种疫苗小鼠(第7组)用作对照。为了测定T细胞应答，通过流式细胞术分析细胞因子。在免疫后第10天，处死5只小鼠/组，将脾细胞的单细胞悬液用根据Shedlock D.等(Human Vaccines&Immunotherapeutics2012；8:11,1-14)产生的肽库再刺激。在5小时刺激时间后，使细胞染色用于CD4+和CD8+T细胞的流式细胞分析。针对表面标志物CD3、CD4和CD8使细胞染色。在30分钟的表面染色后，将细胞用2％PFA透化(15分钟)并用皂苷处理以确保细胞表面保持可渗透性。在30分钟胞内染色(IL-2、IFN-g和TNF-a)后，样品经洗涤并用FACS Gallios测量。报告了表达细胞因子的CD4+(A)或CD8+T(B)细胞的频率。(C)在实验的第0和28天，用1x104目标剂量的HK1-HgB(dTM)通过肌内途径给10只C57BL/6小鼠组接种疫苗2次。在实验的第56天，用1x104目标剂量的HK1-Hpp65(第3组)或HK3-Hpp65(第4组)，给小鼠肌内接种疫苗。未接种疫苗小鼠(第7组)用作对照。在实验的第66天，通过流式细胞术，经测量细胞因子，分析T细胞应答。将来自处死小鼠(5只/组)的脾细胞的单细胞悬液用同一肽库再刺激。在5小时刺激时间后，使细胞染色用于CD8+T细胞的流式细胞分析。针对表面标志物CD3、CD4和CD8使细胞染色。在30分钟表面染色后，将细胞用2％PFA透化(15分钟)并用皂苷处理以确保细胞表面保持可渗透性。在30分钟胞内染色(IL-2、IFN-g和TNF-a)后，样品经洗涤并用FACS Gallios测量。报告了表达细胞因子的CD8+T细胞的频率。
图17：在实验的第0和28天，1x104目标剂量的HK1-GPgB(dTM)和HK3-GPgB(dTM)，给C57BL/6小鼠肌内接种疫苗(总计100μL/小鼠；50μL/大腿)。在各疫苗剂量之前(第0、28天)以及在最后一次(第二次)注射后4周(第56天)，得到来自各动物的血清。通过ELISA测试所有血清的GPgB特异性IgG抗体的水平；ELISA数据表示为几何平均GPgB特异性IgG终点滴度。
图18：在实验的第0和28天，用1x104目标剂量的HK1-HgB(dTM)和HK3-HgB(dTM)给C57BL/6小鼠肌内接种疫苗(总计100μL/小鼠；50μL/大腿)。在各疫苗剂量之前(第0、28天)以及在最后一次(第二次)注射后4周(第56天)，得到来自各动物的血清。通过ELISA测试所有血清的HgB特异性IgG抗体的水平；ELISA数据表示为几何平均HgB特异性IgG终点滴度。
图19：以500,000个细胞/孔的密度将HEK 293T细胞接种在M6孔培养孔中。次日，将细胞用不同的LCMV毒株以0.05的感染复数感染。在规定的时间点收获上清液，并通过免疫聚焦测定法(immunofocus assay)测定病毒滴度。符号表示2个孔的均值。
图20：在第0和28天，用不同剂量(2.0x102、4.4x104和4.5x106FFU/剂)的HK1-HgB(dCt)，肌内使5只新西兰白兔组免疫。在第0、28和42天收集血清，并通过ELISA测量抗HCMVgB IgG抗体滴度。显示了终点GMT。
图21A：在第0、21和42天，用1x105FFU/剂的HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)和重组gB/佐剂肌内使C57BL/6小鼠免疫。在第21、42、63、91、119、147和175天收集免疫小鼠的血清，并通过ELISA测量抗HCMVgB IgG抗体滴度。显示了终点GMT。
图21B：在第0、21和105天，用1x105FFU/剂的HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(dCt)和重组gB/佐剂肌内使C57BL/6小鼠免疫。在第21、42、63、84、105和126天收集免疫小鼠的血清，并通过ELISA测量抗HCMVgB IgG抗体滴度。显示了终点GMT。
图22：在第0和28天，用9x104FFU/剂的仅HK1-HgB(dCt)或9x104FFU/剂的仅HK1-Hpp65或用9x104FFU/剂的HK1-HgB(dCt)和HK1-Hpp65的每一种一起肌内使10只C57BL/6小鼠组免疫。(A)在第49天收集免疫小鼠的血清，并通过ELISA测量抗HCMVgB IgG抗体滴度。(B)为了测定T细胞应答，通过流式细胞术分析细胞因子。在免疫后第49天，处死小鼠，将脾细胞的单细胞悬液用根据Shedlock D.等(Human Vaccines&Immunotherapeutics 2012；8:11,1-14)产生的肽库再刺激。对照细胞只用培养基刺激。在与培养基(泳道1和2)或特定的肽(泳道3和4)一起温育后，使细胞染色用于CD8+T细胞的流式细胞分析。分析了IL-2、IFN-g和TNF的表达。
图23：在交配之前，用1.54x106FFU/剂的HK1-GPgB-dTM或HK1-GPpp65肌内使Hartley豚鼠(11只动物/组)免疫3次(在第0、21和42天)。对照动物(10/组)接受缓冲液而不是rLCMV载体构建体。在实验的第63天后使动物交配。在妊娠后45天左右，豚鼠皮下用1x105pfu的豚鼠CMV攻击。在分娩时测量幼仔死亡率，并通针对病毒血症和幼仔死亡比率对治疗组进行比较，来测定保护率，*表示显著(p<0.05)降低。
图24：在第0天，用7.65x105以及7.65x103FFU/剂的HK3-Hpp65或小鼠类似物HK3-Mpp65大脑内给IFNα/β和γ受体缺陷型AG129小鼠(A)以及T和B细胞缺陷型RAG-/-小鼠接种。小鼠对照组接受100FFU/剂的野生型LCMV或仅稀释剂。随后监测小鼠的病征，在规定日期收集脑组织，并针对感染性病毒的存在进行分析。
图25：在实验的第0、31和72天(第1组)/第0、31和70天(第2组)/第0、34和70天(第3组)，用8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)(第1组)、8x105FFU/剂的HK1-GPpp65(第2组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65每一种(第3组)，肌内使Hartley豚鼠(18只动物/组)免疫。另外，在第0、46和76天，用在完全弗氏佐剂中配制的50μg亚基gB蛋白(第4组)，皮下使Hartley豚鼠(18只动物/组)免疫。在实验的第0、28、52、103和155天收集免疫动物的血清，并使用具有指定抗gB抗体滴度的血清库作为参比标准，通过GPgB特异性IgG ELISA分析抗gB抗体滴度。
图26：在第0、31和72天(第1组)/第0、31和70天(第2组)/第0、34和70天(第3组)，用8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)(第1组)、8x105FFU/剂的HK1-GPpp65(第2组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65每一种(第3组)，肌内使Hartley豚鼠(18只动物/组)免疫。另外，在第0、46和76天，在完全弗氏佐剂中配制的50μg亚基gB蛋白(第4组)，皮下使Hartley豚鼠(18只动物/组)免疫。在第103天收集免疫动物的血清，分析实验的血清的中和活性。点线表示检测限。在测定中无法达到检测限的血清样品被专门指定为20的值用于作图和统计计算。
图27：从用8x105FFU/剂的HK1-GFP(第1组)、8x105FFU/剂的HK1-GPpp65(第2组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65每一种(第3组)肌内免疫的Hartley豚鼠中分离脾细胞，并通过ELISPOT测定法分析。在2剂疫苗后，处死各疫苗组的3只动物，并且在3次疫苗剂量后处死各疫苗组的另外3只动物。使用Prism6作为超过各动物响应全部pp65肽库的DMSO对照的“曲线下面积”，计算各动物的pp65特异性脾细胞应答的幅度。(A)用2剂(圆形)或3剂(方框)疫苗的数据点表示每只动物的平均点数(误差棒表示组均值和±SEM)。(B)接种HK1-GFP(圆形)、HK1-GPpp65(正方形)或HK1-GPgB(dCt)/HK1-GPpp65(三角形)疫苗的动物的数据点表示每只动物的平均点数(误差棒表示组均值和±SEM)。图中所示P值应用Mann-Whitney U检验计算(Wilcoxon,Biometrics Bulletin,1945,1:80-83；Mann&Whitney,Annals of mathematical Statistics,1947,18:50-60)。
图28：在交配之前，用8x105FFU/剂的HK1-GFP(第1组)、HK1-GPgB(dCt)(第2组)、HK1-GPpp65(第3组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65每一种的组合(第4组)，肌内使Hartley豚鼠免疫3次。在最后一次疫苗剂量后约一个月，允许动物交配。通过触诊证实并监测母豚鼠的妊娠。在妊娠期的第三个三个月内，用105噬斑形成单位的唾腺传代的豚鼠CMV攻击妊娠母鼠，随后监测直到分娩。在分娩时测量幼仔死亡率，并通过针对幼仔死亡的比率对治疗组进行比较，来测定保护率。
6.发明详述
本文提供用于治疗或预防受试者被CMV感染或受试者中CMV再活化的方法和组合物。更具体地说，本文提供包含编码CMV抗原的核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒。可将这些病毒给予受试者用于治疗或预防CMV感染或再活化。在第6.3节中更详细的描述了用于本发明的感染性复制缺陷型沙粒病毒载体的产生。
本文提供遗传修饰的沙粒病毒，其中沙粒病毒：
·是感染性的；
·不能在非补给细胞(即不表达在复制缺陷型沙粒病毒中缺失的功能并使之成为复制缺陷型的细胞)中形成感染性子代病毒；
·能够复制其基因组并表达其遗传信息；和
·编码CMV抗原或其片段。
本文所述遗传修饰的沙粒病毒是感染性的，即，它可以附着在宿主细胞上，并将其遗传物质释放到宿主细胞中。本文所述遗传修饰的沙粒病毒是复制缺陷型的，即沙粒病毒不能够在非补给细胞中产生另外的感染性子代颗粒。具体地说，沙粒病毒的基因组被修饰(例如通过ORF的缺失或功能性失活)使得携带修饰基因组的病毒不再能产生感染性子代病毒。非补给细胞是通过修饰病毒基因组不提供已从复制缺陷型沙粒病毒中消除的功能的细胞(例如如果编码GP蛋白的ORF缺失或功能性失活，则非补给细胞不提供GP蛋白)。然而，本文提供的遗传修饰的沙粒病毒能够在补给细胞中产生感染性子代病毒。补给细胞是提供(外在(in trans))通过修饰病毒基因组已从复制缺陷型沙粒病毒中消除的功能的细胞(例如如果编码GP蛋白的ORF缺失或功能性失活，则补给细胞提供GP蛋白)。补给功能性(例如GP蛋白)的表达可通过本领域技术人员已知的任何方法实现(例如瞬时或稳定表达)。本文所述遗传修饰的沙粒病毒可在被病毒感染的细胞中扩增并表达其遗传信息。本文提供的遗传修饰的沙粒病毒包含编码CMV抗原的核苷酸序列，例如但不限于第6.2节中描述的CMV抗原。
在某些实施方案中，本文提供遗传修饰的沙粒病毒,其中沙粒病毒基因组的ORF(ORF)缺失或功能性失活使得病毒不能在非补给细胞中产生其它的感染性子代病毒颗粒。包含其中ORF缺失或功能性失活的遗传修饰的基因组的沙粒病毒颗粒可在补给细胞(即在表达缺失或功能性失活的沙粒病毒ORF的细胞中)产生(参见第6.3节)。在宿主细胞感染时，所得沙粒病毒颗粒的遗传物质可转移到其中遗传物质可表达和扩增的宿主细胞中。另外，本文提供的遗传修饰的沙粒病毒颗粒的基因组编码可在宿主细胞中表达的CMV抗原。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白(GP)基因的ORF缺失以产生用于本发明的复制缺陷型沙粒病毒。在一个具体的实施方案中，复制缺陷型沙粒病毒含有包含编码CMV抗原的核苷酸序列的基因组区段。因此，在某些实施方案中，本文提供的遗传修饰的沙粒病毒颗粒包含以下基因组区段：a)存在于基因组区段的野生型形式中的ORF缺失或功能性失活；和b)编码(有义或反义)CMV抗原(参见第6.3节)。
在某些实施方案中，由插入复制缺陷型沙粒病毒基因组的核酸编码的抗原可编码例如CMV抗原或CMV抗原的组合，包括但不限于：
a.编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
g.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
在第6.2节中提供本文所述抗原的详细描述。
在某些实施方案中，本文所述的按照的本发明使用的沙粒病毒可以是旧世界病毒(Old World virus)，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。本文第6.1节提供本文所述沙粒病毒的更详细描述。
本文提供编码所述复制缺陷型沙粒病毒的基因组的核酸。在某些方面，感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒含有包含以下核苷酸序列的基因组区段：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50。
本文提供编码一种或多种产生本文所述病毒载体所需组分的表达质粒。准确地讲，本文提供编码LCMV S区段的表达载体，其中GP蛋白的ORF已从S区段中缺失并且被其羧基端截短的人CMV糖蛋白gB的ORF置换(例如具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ IDNO:18有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列)。
本文提供包含本文所述载体质粒的一种或两种的试剂盒。在某些实施方案中，本文提供包含以下的试剂盒：a)编码LCMV载体的S区段的表达质粒；b)编码LCMV载体的L区段的表达质粒；和c)编码补给功能性的表达质粒。在一个具体的实施方案中，本文提供包含以下的试剂盒：a)编码LCMV S区段的表达载体，其中GP蛋白的ORF已从S区段中缺失并且被其羧基端截短的人CMV糖蛋白gB的ORF置换(例如具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ IDNO:18有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列)；b)编码LCMV载体的L区段的表达质粒；和c)编码LCMV GP蛋白的表达质粒(或表达LCMV GP蛋白的细胞系)。
本文还提供细胞系、培养被本文提供的核酸、载体和组合物感染的细胞的培养物和方法。第6.4节提供本文所述核酸、载体系统和细胞系的更详细描述。
本发明涉及适宜作为疫苗的这类遗传修饰的复制缺陷型沙粒病毒和在疫苗接种和治疗或预防CMV所致感染或CMV再活化中使用这类沙粒病毒的方法。第6.5节提供使用本文所述这类沙粒病毒的方法的更详细的描述。
在某些实施方案中，用本文所述的表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒免疫提供持久的免疫应答。在某些实施方案中，在两次免疫之后可实现最大抗体水平。在另一个实施方案中，可给予第三次免疫用于加强作用。在更具体的实施方案中，本文提供在疫苗接种中使用感染性复制缺陷型沙粒病毒用于治疗和/或预防CMV所致感染或CMV再活化的给药方案。第6.5节提供使用本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的给药方案的更详细的描述。
在某些实施方案中，将表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予血清反应阴性受试者诱导可检出的抗体滴度持续最低至少4周。在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予受CMV感染所染的受试者提高抗体滴度达至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在某些实施方案中，首次抗原暴露诱导来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％的功能性(中和性)和最小抗体滴度。在更具体的实施方案中，首次中和性几何平均抗体滴度在免疫后至少4周内提高直到至少1:50、至少1:100、至少1:200或至少1:1000的峰值。在另一个实施方案中，用表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒免疫在单次给予疫苗后，产生免疫后持续至少4周、至少8周、至少12周、至少6月、至少12月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年的高滴度的抗体。
在另外又一个实施方案中，第二次抗原暴露提高抗体滴度达至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在另一个实施方案中，第二次抗原暴露诱导来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％的功能性(中和性)和最小抗体滴度。在更具体的实施方案中，第二次中和性几何平均抗体滴度在免疫后至少4周内提高直到至少1:50、至少1:100、至少1:200或至少1:1000的峰值。在另一个实施方案中，用表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒的第二次免疫产生免疫后持续至少4周、至少8周、至少12周、至少6月、至少12月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年的高滴度的抗体。
在另外又一个实施方案中，第三次加强免疫提高抗体滴度达至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在另一个实施方案中，加强免疫诱导来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％的功能性(中和性)和最小抗体滴度。在更具体的实施方案中，第三次加强免疫诱导来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％的功能性(中和性)和最小抗体滴度。在另一个实施方案中，第三次加强免疫延长免疫后的抗体滴度达至少4周、至少8周、至少12周、至少6月、至少12月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。
在某些实施方案中，表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导T细胞非依赖性或T细胞依赖性应答。在其它实施方案中，表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导T细胞应答。在其它实施方案中，表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导T辅助细胞应答。在另一个实施方案中，表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导Th1-定向应答或Th2-定向应答。
在更具体的实施方案中，IgG1抗体相对于IgG2占优势表明Th1-定向应答。在其它实施方案中，IgG1:IgG2的比率大于1:1、大于2:1、大于3:1或大于4:1。在另一个实施方案中，IgG3抗体占优势表明表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在一些实施方案中，表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导CD8+T细胞应答。在其它实施方案中，表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导调节T细胞应答。在更具体的实施方案中，调节T细胞应答保持免疫耐受。在另一个实施方案中，表达CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导CD4+和CD8+T细胞应答两者。
在某些实施方案中，表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导高滴度的中和抗体。在另一个实施方案中，与蛋白质复合物组分的表达相比，表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒分别诱导高滴度的中和抗体。
在其它实施方案中，表达CMV抗原的两种或多种感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导高滴度的中和抗体。在一个更具体的实施方案中，与表达一种CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，表达CMV抗原的两种或多种感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导较高滴度的中和抗体。
在另一个实施方案中，与表达一种CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，表达2、3、4、5或更多种CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导较高滴度的中和抗体。
6.1表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒载体
用于本文提供的方法和组合物的沙粒病毒可具有旧世界病毒，例如拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、Mobala病毒、Mopeia病毒或Ippy病毒或新世界病毒，例如Amapari病毒、Flexal病毒、Guanarito病毒、胡宁病毒、拉丁美洲病毒、马休波病毒、Oliveros病毒、巴拉那病毒、Pichinde病毒、Pirital病毒、萨比亚病毒、Tacaribe病毒、Tamiami病毒、Bear Canyon病毒或Whitewater Arroyo病毒。遗传修饰的沙粒病毒可按第6.3节所述产生。
野生型沙粒病毒基因组由短(～3.4kb)和大(～7.2kb)RNA区段组成。短区段携带编码核蛋白NP和糖蛋白GP基因的ORF。大区段编码依赖于RNA的RNA聚合酶L和基质蛋白Z基因。可通过用一种或多种针对其诱导免疫应答的CMV抗原取代糖蛋白基因，使野生型沙粒病毒成为复制缺陷型以产生疫苗载体。
表达本文所述CMV抗原或CMV抗原的组合的感染性复制缺陷型沙粒病毒载体可用于针对CMV感染或再活化使受试者免疫(以预防方式)或治疗(以免疫治疗方式)受试者。在一个具体的实施方案中，使用gB和pp65的组合。
已知沙粒病毒疾病和野生型沙粒病毒感染的免疫抑制产生于不受抑制的病毒复制。通过自其基因组缺失例如颗粒释放所需的Z基因或靶细胞感染所需的GP基因，破坏沙粒病毒载体的复制，即产生感染性子代病毒颗粒的能力，通过给予例如疫苗接受者或意外传播给参与医学或生物技术应用的人员或动物的接种物，可限制感染细胞的总数。因此，由于载体颗粒有意或意外传播的结果，破坏沙粒病毒载体的复制防止了发病机制。在本发明中，一个重要方面包括利用为了表达CMV抗原以有益方式破坏复制的上述必要性。在某些实施方案中，通过其基因组的遗传修饰使沙粒病毒颗粒成为复制缺陷型。对基因组的这类修饰可包括：
·ORF(例如编码GP、NP、L或Z蛋白的ORF)的缺失；
·ORF(例如编码GP、NP、L或Z蛋白的ORF)的功能性失活。例如，这可通过引入错义或无义突变来实现。
·ORF序列的变化(例如S1P切割位点与另一蛋白酶的切割位点交换)；
·基因组区段之一的5’或3’端的诱变；
·基因间区(即L或S基因组区段)的诱变。
在某些实施方案中，表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，其中病毒的S区段通过用编码CMV抗原的ORF替换编码GP蛋白的ORF来修饰。
在某些实施方案中，可设计野生型沙粒病毒载体基因组(图1)以至少保留两个区段的5’和3’非翻译区(UTR)和/或同样基因间区(IGR)的必需调节元件。虽不受理论束缚，但是用于在被感染的细胞中表达基因的最小反式作用因子作为可被表达的ORF保留在载体基因组中，但它们可不同地位于基因组中，并且可置于不同于天然的启动子的控制下，或可自内部核糖体进入位点表达。在某些实施方案中，编码CMV抗原的核酸自内源沙粒病毒启动子之一(即S区段的5’UTR、3’UTR；L区段的5’UTR、3’UTR)转录。在其它实施方案中，编码CMV抗原的核酸自可被病毒依赖于RNA的RNA聚合酶、被细胞RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III读出的异源引入的启动子序列表达，例如分别为天然存在于病毒UTR的病毒启动子序列、28S核糖体RNA启动子、β-肌动蛋白启动子或5S核糖体RNA启动子的复制。在某些实施方案中，编码CMV抗原的核糖核酸通过它们自身或通过与沙粒病毒蛋白质ORF融合作为连读来转录和翻译，并且在病毒转录物序列中可在合适的位置处引入一个或多个，例如2、3或4个内部核糖体进入位点，来提高宿主细胞中蛋白质的表达。
在某些实施方案中，所产生的编码一种或多种CMV抗原的载体可以LCMV的特定毒株为基础。LCMV的毒株包括克隆13、MP毒株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在某些实施方案中，所产生的编码一种或多种CMV抗原的载体可以LCMV克隆13为基础。在其它实施方案中，所产生的编码一种或多种CMV抗原的载体可以LCMV MP毒株为基础。LCMV克隆13的S区段的序列以SEQ IDNO:32列出。在某些实施方案中，LCMV克隆13的S区段的序列是SEQ ID NO:31所示序列。LCMV克隆13的L区段的序列以SEQ ID NO:33列出。LCMV毒株MP的S区段的序列以SEQ ID NO:53列出。LCMV毒株MP的L区段的序列以SEQ ID NO:49列出。
在某些实施方案中，本文描述了包含选自SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53的核苷酸序列或其片段或其组合的感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒。
在某些实施方案中，本文描述了包含选自以下核苷酸序列或核苷酸序列的组合的感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒：
·编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
·编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
6.2CMV抗原
在某些实施方案中，用于本文所述方法和组合物的抗原是CMV抗原。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种所述CMV抗原的ORF作为单一转录物转录。在某些实施方案中，编码该转录物上的CMV抗原的ORF被编码自切割肽或核糖体跳跃序列的核酸分隔开。在某些实施方案中，自切割肽(或核糖体跳跃序列)可获自来自病毒科微小RNA病毒科的成员的2A蛋白。在某些具体的实施方案中，自切割肽获自(或来源于)猪捷申病毒-1 2A、明脉扁刺蛾β四体病毒2A、口蹄疫病毒2A肽或马A型鼻炎病毒2A肽。在某些具体的实施方案中，获自(或来源于)猪捷申病毒-1 2A的2A肽具有最高切割效率。在某些实施方案中，在2A肽的上游或下游与本文所述CMV抗原组合的2A肽具有高切割效率。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被核糖体跳跃序列分隔开来。在更具体的实施方案中，核糖体跳跃序列是顺式作用水解酶元件序列。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被获自(或来源于)马铃薯Y病毒科的烟草蚀纹病毒(TEV)的自切割蛋白酶分隔开来。
在某些实施方案中，将Gly-Ser-Gly接头2A肽的N端和C端。在更具体的实施方案中，将Gly-Ser-Gly接头插入2A肽的N端。在更具体的实施方案中，将Gly-Ser-Gly接头插入2A肽的C端。在某些实施方案中，Gly-Ser-Gly接头改进通过2A肽切割的效率。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被内部核糖体进入位点分隔开来。在某些实施方案中，内部核糖体进入位点在上游启动子控制下起作用。在某些实施方案中，内部核糖体进入位点获自(或来源于)脑心肌炎病毒。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被2A肽和弗林蛋白酶切割位点分隔开来。在某些实施方案中，2A肽侧接弗林蛋白酶切割位点。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点位于编码CMV抗原的ORF和2A肽之间。在某些实施方案中，在2A肽的上游加入弗林蛋白酶切割位点。在某些实施方案中，在2A肽的下游加入弗林蛋白酶切割位点。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点与编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF、自切割肽及其组合一起定位于载体中。在某些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点共有序列为R-X-K-/R-R。在一个更具体的实施方案中，弗林蛋白酶切割位点被反式高尔基体网络中的弗林蛋白酶蛋白质切割。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶切割位点切除2A肽序列。在又一个实施方案中，弗林蛋白酶切割位点切除C端的自切割肽序列。例如，参见Fang等,Molecular Therapy.2007；15(6):1153-1159。
某些实施方案，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被2A肽和标签分隔开来。在某些实施方案中，标签与2A肽连接。在某些实施方案中，标签位于2A肽和弗林蛋白酶切割位点之间。在某些实施方案中，标签位于编码CMV抗原的下游ORF的C端或N端。在某些实施方案中，标签位于编码CMV抗原的上游ORF的C端或N端。在某些实施方案中，标签与编码2、3、4种或更多种CMV抗原的ORF、2A肽、弗林蛋白酶切割位点或其组合一起位于载体中。在某些实施方案中，标签是肽标签。在更具体的实施方案中，标签是V5氨基酸标签。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被2A肽和间隔序列分隔开来。在某些实施方案中，间隔序列位于2A肽的上游。在某些实施方案中，间隔序列位于编码CMV抗原的ORF之间。在某些实施方案中，间隔序列位于2A肽的上游和标签之间。在某些实施方案中，间隔序列位于上游2A肽和下游弗林蛋白酶切割位点之间。在某些实施方案中，间隔序列与编码CMV抗原的ORF、自切割肽、弗林蛋白酶切割位点、标签或其组合一起位于载体中。在某些实施方案中，间隔序列提高切割效率。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV抗原的ORF被编码以下的核苷酸序列分隔开来：自切割肽、通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列或导致核糖体结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”(IRES)翻译的序列元件。
在某些实施方案中，人CMV的任何毒株或人CMV的任何临床分离株可用于本发明以获得用于产生本文所述沙粒病毒载体的抗原。这类CMV毒株包括AD-169、Merlin、C327A(GenBank M60929)、C076A(GenBank M85228)和C194A(GenBank 60926)。可用于本文公开的组合物和方法的其它人CMV毒株和人CMV抗原序列列于Meyer-Koenig等,1998,J InfectDis 177:1162-1169；Shedlock等,2012,Human Vaccines&Immunotherapuetics 8:1-14；以及Chou和Dennison 1991,J Infect Dis 163:1229-34。列于Meyer-Koenig等,1998,JInfect Dis 177:1162-1169；Shedlock等,2012,Human Vaccines&Immunotherapuetics 8:1-14；以及Chou和Dennison 1991,J Infect Dis 163:1229-344的序列和毒株通过引用结合到本文中。
在某些实施方案中，CMV抗原可为CMV抗原直向同源物(ortholog)，例如哺乳动物(即非人灵长类动物、猪、狗、猫或马)CMV抗原。
(a)gB抗原
在某些实施方案中，抗原是CMV主要包膜糖蛋白gB或其片段。在某些实施方案中，抗原是CMV主要包膜糖蛋白gB的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700或更多个氨基酸的片段。在某些实施方案中，gB的跨膜结构域缺失。在一些实施方案中，gB的胞质域缺失。在某些实施方案中，抗原是gB的抗原片段。在某些实施方案中，糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域缺失。
在具体的实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5和AS-4。(参见图2)。在某些实施方案中，gB抗原包含抗原位点AS-2、AS-5、AS-4和AS-1。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4、AS-1和AS-3。在某些实施方案中，抗原包含gB跨膜结构域。在某些实施方案中，抗原包含gB胞质域。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4和AS-1以及gB跨膜结构域。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4、AS-1和AS-3以及gB跨膜结构域。在某些实施方案中，抗原包含gB胞外域。
在某些实施方案中，抗原是CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽之间的融合蛋白。在某些实施方案中，抗原为至少10、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或至少900个氨基酸长。在某些实施方案中，gB的一个或多个结构域被异源蛋白质的一个或多个结构域取代。在某些实施方案中，gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。在某些实施方案中，gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域取代。在某些实施方案中，gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。在某些实施方案中，gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。在某些实施方案中，异源蛋白质是RNA病毒的糖蛋白。在某些实施方案中，异源蛋白质是VSV的糖蛋白。在具体的实施方案中，异源蛋白质是VSV-G。在更具体的实施方案中，异源蛋白质是野生型VSV的VSV-G蛋白。在其它具体的实施方案中，异源蛋白质是VSV毒株AV1或AV2的VSV-G蛋白。在其它具体的实施方案中，异源蛋白质是VSV印地安那血清型的VSV-G蛋白。在其它具体的实施方案中，异源蛋白质是VSV毒株MARM U、MARM M、MRr或MRb的VSV-G蛋白。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在某些实施方案中，抗原包含与SEQ ID NO:21或SEQID NO:24有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5和AS-4和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4和AS-1和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4、AS-1和AS-3和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB跨膜结构域和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB胞质域和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4和AS-1以及gB跨膜结构域和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4、AS-1和AS-3以及gB跨膜结构域和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB胞外域和来源于VSV-G的异源跨膜区和胞质区。
在某些实施方案中，抗原是CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽之间的融合蛋白。在某些实施方案中，抗原为至少10、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或至少900个氨基酸长。在某些实施方案中，gB的一个或多个结构域被异源蛋白质的一个或多个结构域取代。在某些实施方案中，异源蛋白质是流感病毒的糖蛋白。在具体的实施方案中，异源蛋白质是流感病毒的血凝素蛋白(Flu-HA)。在更具体的实施方案中，异源蛋白质是甲型流感病毒的血凝素蛋白。在其它具体的实施方案中，异源蛋白质是乙型流感病毒的血凝素蛋白。在其它具体的实施方案中，异源蛋白质是丙型流感病毒的血凝素蛋白。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:29有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在某些实施方案中，抗原包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:30有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5和AS-4和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4和AS-1和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4、AS-1和AS-3和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB跨膜结构域和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB胞质域和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4和AS-1以及gB跨膜结构域和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB抗原位点AS-2、AS-5、AS-4、AS-1和AS-3以及gB跨膜结构域和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。在某些实施方案中，抗原包含gB胞外域和来源于Flu-HA的异源跨膜区和胞质区。
在某些实施方案中，gB蛋白来自CMV毒株Merlin。SEQ ID NO:58-63给出了如本文所述可用于病毒载体组合物及其用途的说明性序列。在某些实施方案中，抗原包含与SEQID NO:60或SEQ ID NO:63有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
(b)截短的gB抗原
在某些实施方案中，gB蛋白的羧基端被截短。在某些实施方案中，gB蛋白羧基端的截短可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134个氨基酸长。在另一个实施方案中，gB蛋白羧基端的截短可为1-10、10-20、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130或120-134个氨基酸长。在其它实施方案中，gB蛋白羧基端的截短可为10-134、20-134、30-134、40-134、50-134、60-134、70-134、80-134、90-134、100-134、110-134或120-134个氨基酸长。
在某些实施方案中，羧基端截短的gB蛋白包含在截短的gB蛋白的全长内与SEQ IDNO:3有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，gB蛋白在氨基酸772与906之间有截短，并且包含在截短的gB蛋白的全长内与SEQ ID NO:3有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，羧基端截短的gB蛋白包含与SEQ ID NO:18有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，gB蛋白在羧基端有缺失。在某些实施方案中，羧基端的缺失可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133个氨基酸长。在另一个实施方案中，gB蛋白羧基端的缺失可为1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130或130-133个氨基酸长。在其它实施方案中，gB蛋白羧基端的缺失可为10-133、20-133、30-133、40-133、50-133、60-133、70-133、80-133、90-133、100-133、110-133或120-133氨基酸长。
在其它实施方案中，羧基端截短的gB蛋白仍锚定在CMV病毒粒的膜上。
(c)pp65抗原
在某些实施方案中，抗原是CMV被膜蛋白pp65或其片段。在某些实施方案中，抗原是CMV被膜蛋白pp65或其片段的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500或更多个氨基酸的片段。在某些实施方案中，抗原是pp65的抗原片段。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:35有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在某些实施方案中，抗原包含与SEQ ID NO:36有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
(d)五聚体复合物抗原
在某些实施方案中，抗原是CMV糖蛋白gH或其片段。在某些实施方案中，抗原是CMV糖蛋白gH或其片段的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700或更多个氨基酸的片段。在某些实施方案中，gH没有跨膜结构域。在某些实施方案中，抗原只含gH胞外域。在某些实施方案中，抗原是gH的抗原片段。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:38有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:51有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，抗原是糖蛋白gH片段的衍生物。在某些实施方案中，抗原是其C端膜锚定序列缺失的gH的抗原片段gH(dTM)。
在某些实施方案中，抗原是CMV糖蛋白gL或其片段。在某些实施方案中，抗原是CMV糖蛋白gL或其片段的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250或更多个氨基酸的片段。在某些实施方案中，抗原是gL的抗原片段。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:40有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。
在某些实施方案中，抗原是五聚体复合物蛋白或其片段。在某些实施方案中，抗原是CMV或其片段的五聚体复合物蛋白的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150或更多个氨基酸的片段。在某些更具体的实施方案中，五聚体复合物蛋白是CMV UL128或其片段。在某些实施方案中，抗原是UL128的抗原片段。在某些更具体的实施方案中，五聚体复合物蛋白是CMV UL130或其片段。在某些实施方案中，抗原是UL130的抗原片段。在某些更具体的实施方案中，五聚体复合物蛋白是CMV UL131A或其片段。在某些实施方案中，抗原是UL131A的抗原片段。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:42有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在某些实施方案中，抗原由与SEQID NO:45有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在某些实施方案中，抗原由与SEQ ID NO:47有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。
可通过取代糖蛋白GP、基质蛋白Z、核蛋白NP或聚合酶蛋白L的ORF(ORF)的核酸序列，将编码CMV抗原的核酸序列引入感染性复制缺陷型沙粒病毒的基因组。在其它实施方案中，编码CMV抗原的核酸序列与糖蛋白GP、基质蛋白Z、核蛋白NP或聚合酶蛋白L的ORF(ORF)融合。编码CMV抗原的核苷酸序列，一旦插入感染性复制缺陷型沙粒病毒的基因组，便可在4种沙粒病毒启动子(S区段的5’UTR和3’UTR和L区段的5’UTR和3’UTR)以及可与可被病毒依赖于RNA的RNA聚合酶、细胞RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III读出的调节元件一起插入的核糖核酸控制下转录和/或表达，例如分别为天然存在于病毒UTR的病毒启动子序列、28S核糖体RNA启动子、β-肌动蛋白启动子或5S核糖体RNA启动子的复制。编码CMV抗原的核酸可通过它们自己或通过分别与沙粒病毒ORF和基因融合作为连读和/或与一个或多个例如2、3或4个内部核糖体进入位点组合，来转录和/或表达。
在一个实施方案中，抗原是可用于预防感染性疾病的抗原。在一个具体的实施方案中，抗原来源于CMV。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gH或gL的核酸序列取代。在更具体的实施方案中，编码gH和gL的核酸序列被编码2A肽的核酸序列分隔开来。在其它实施方案中，编码gH和gL的核酸序列被编码2A肽和间隔物的核酸序列分隔开来。在更具体的实施方案中，编码gH和gL的核酸序列被编码2A肽的核酸序列和弗林蛋白酶切割位点分隔开来。在某些实施方案中，编码gH和gL的核酸序列被与标签(例如V5氨基酸标签)融合的2A肽和位于2A肽上游的弗林蛋白酶切割位点分隔开来。在某些实施方案中，编码gH和gL的核酸序列被2A肽、与标签(例如V5氨基酸标签)融合的弗林蛋白酶切割位点和间隔物分隔开来。在具体的实施方案中，间隔物是2A肽的上游。在另一更具体的实施方案中，间隔物是介于2A肽和标签间的2A肽的上游。
在某些实施方案中，编码糖蛋白gH(dTM)和糖蛋白gL的核酸序列被编码自切割肽的核酸序列分隔开来。在某些实施方案中，编码糖蛋白gH(dTM)和糖蛋白gL的核酸序列被2A肽分隔开来。在某些实施方案中，编码糖蛋白gH(dTM)和糖蛋白gL的核酸序列通过与标签(例如V5)融合的2A肽连接。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列被自切割肽分隔开来。在某些实施方案中，编码CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列通过2A肽连接。在某些实施方案中，编码CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列通过与标签融合的2A肽连接。在某些实施方案中，编码CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列通过与V5氨基酸标签融合的2A肽连接。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列被自切割肽、通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”(IRES)的翻译的序列元件分隔开来。在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列被自切割肽、通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”(IRES)的翻译的序列元件分隔开来。
在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列被自切割肽和弗林蛋白酶切割位点分隔开来。在某些实施方案中，编码2、3、4或5种或更多种CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列被与标签(例如V5氨基酸标签)融合的自切割肽和弗林蛋白酶切割位点分隔开来。在某些实施方案中，编码CMV五聚体复合物蛋白的核酸序列被与标签(例如V5氨基酸标签)融合的自切割肽、弗林蛋白酶切割位点和间隔物分隔开来。在具体的实施方案中，间隔物为自切割肽的上游。
(e)编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF的取代
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码1、2、3、4或5种或更多种本文所述CMV抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被以下取代：被自切割肽或核糖体跳跃序列分隔开的编码2、3、4或5种或更多种本文所述CMV抗原的核酸序列。在某些实施方案中，自切割肽(或核糖体跳跃序列)可获自来自病毒科微小RNA病毒科的成员的2A蛋白。在某些具体的实施方案中，自切割肽(或核糖体跳跃序列)获自(或来源于)猪捷申病毒-1 2A、明脉扁刺蛾β四体病毒2A或口蹄疫病毒2A肽。
在一个实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码CMV抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是CMV的主要包膜糖蛋白gB或其片段的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gB的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于主要包膜糖蛋白gB或gB的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是gB和VSV-G之间的融合蛋白的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码为至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600或至少700个氨基酸长的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码与SEQ ID NO:21或24有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是gB和流感病毒血凝素之间的融合蛋白的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600或至少700个氨基酸长的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被与SEQ ID NO:26或29有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码与SEQ ID NO:27或30有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是CMV被膜蛋白pp65基因的基因产物或其片段的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码pp65的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于pp65或pp65的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是CMV的糖蛋白gH或其片段的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、600、700或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gH的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于gH或gH的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是CMV的糖蛋白gL或其片段的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gL的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于gL或gL的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码CMV的五聚体复合物蛋白UL128或其片段的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200、250或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码UL128的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于UL128或UL128的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是CMV的五聚体复合物蛋白UL130或其片段的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150、200或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码UL130的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于UL130或UL130的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码是CMV的五聚体复合物蛋白UL131A或其片段的基因的基因产物的至少10、15、20、25、50、75、100、150或更多个氨基酸的片段的抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码UL131A的抗原片段的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码包括但不限于UL131A或UL131A的片段的抗原的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由自切割肽或核糖体跳跃序列或导致核糖体结合和下游序列(例如IRES)翻译的序列元件分隔开的编码2、3、4或5种五聚体复合物蛋白或其至少10、15、20、25、50、75、100、150或更多个氨基酸的片段的核酸序列取代。在具体的实施方案中，自切割肽或核糖体跳跃序列是捷申病毒2A(T2A)肽。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gH、gL、UL128、UL130和UL131A的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gH和gL的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由自切割肽或核糖体跳跃序列或导致核糖体结合和下游序列(例如IRES)翻译的序列元件分隔开的编码gH、gL、UL128、UL130和UL131A的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由T2A分隔开的编码gH、gL、UL128、UL130和UL131A的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的可读框被由T2A分隔开的编码gH和gL的核酸序列取代。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gH、gL、UL128、UL130和UL131A的胞外域的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gH和gL的胞外域的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由自切割肽或核糖体跳跃序列或导致核糖体结合和下游序列(例如IRES)翻译的序列元件分隔开的编码gH、gL、UL128、UL130和UL131A的胞外域的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由T2A分隔开的编码gH和gL的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由T2A分隔开的编码gH和gL的胞外域的核酸序列取代。
在某些其它实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由自切割肽或核糖体跳跃序列或导致核糖体结合和下游序列(例如IRES)翻译的序列元件分隔开的编码2、3、4、5、6或7种CMV抗原、CMV抗原与异源序列的融合蛋白或其至少10、15、20、25、50、75、100、150或更多个氨基酸的片段的核酸序列取代。在具体的实施方案中，自切割肽是捷申病毒2A(T2A)肽。
在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码gB或其抗原片段、pp65或其抗原片段、gH或其抗原片段、gL或其抗原片段、UL128或其抗原片段、UL130或其抗原片段和UL131A或其抗原片段的一种或多种的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由自切割肽或核糖体跳跃序列或导致核糖体结合和下游序列(例如IRES)翻译的序列元件分隔开的编码gB或其抗原片段、pp65或其抗原片段、gH或其抗原片段、gL或其抗原片段、UL128或其抗原片段、UL130或其抗原片段和UL131A或其抗原片段的一种或多种的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由T2A分隔开的编码gB或其抗原片段、pp65或其抗原片段、gH或其抗原片段、gL或其抗原片段、UL128或其抗原片段、UL130或其抗原片段和UL131A或其抗原片段的一种或多种的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被编码一拷贝以上的本文的CMV抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由自切割肽或核糖体跳跃序列或导致核糖体结合和下游序列(例如IRES)翻译的序列元件分隔开的编码一拷贝以上的本文的CMV抗原的核酸序列取代。在某些实施方案中，编码沙粒病毒的糖蛋白的ORF被由T2A分隔开的编码一拷贝以上的本文的CMV抗原的核酸序列取代。
6.3表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的产生
总的来讲，沙粒病毒颗粒可通过针对LCMV描述的标准反向遗传技术重组产生(L.Flatz,A.Bergthaler,J.C.de la Torre和D.D.Pinschewer,Proc Natl Acad Sci USA103:4663-4668,2006；A.B.Sanchez和J.C.de la Torre,Virology 350:370,2006；E.Ortiz-Riano,B.Y.Cheng,J.C.de la Torre,L.Martinez-Sobrido.J Gen Virol.94:1175-88,2013)。为了产生用于本发明的感染性复制缺陷型沙粒病毒，可采用这些技术，然而，按第6.1节所述修饰被拯救病毒的基因组。这些修饰可以是：i)除去4种沙粒病毒ORF(糖蛋白(GP)；核蛋白(NP)；基质蛋白Z；依赖于RNA的RNA聚合酶L)的一种或多种，例如2、3或4种或使之功能性失活以防止在正常细胞中形成感染性颗粒，但是在沙粒病毒载体感染的宿主细胞中仍允许基因表达；和ii)可导入编码CMV抗原的核酸。可按国际专利申请公布号WO2009/083210(申请号PCT/EP2008/010994)产生本文所述的感染性复制缺陷型病毒，所述申请通过引用以其整体结合到本文中。
一旦自cDNA产生，本文提供的感染性复制缺陷型沙粒病毒可在补给细胞中繁殖。补给细胞是通过修饰其基因组提供复制已从缺陷型沙粒病毒中消除的功能性的细胞(例如如果编码GP蛋白的ORF缺失或功能性失活，则补给细胞提供GP蛋白)。
由于沙粒病毒载体中病毒基因的一个或多个的去除或功能性失活(此处糖蛋白GP的缺失可作为实例)，沙粒病毒载体可在外在提供缺失的病毒基因(例如本实例的GP)的细胞中产生并扩增。通过用于表达目标病毒基因的一种或多种质粒(补给质粒，称为C质粒)转染哺乳动物细胞系例如BHK-21、HEK 293、VERO或其它细胞系(此处可以BHK-21作为实例)，来产生这类补给细胞系，此后称为C细胞。C质粒表达在适宜在哺乳动物细胞中表达的一种或多种表达盒(例如哺乳动物聚合酶II启动子例如具有多腺苷酸化信号的CMV或EF1α启动子)的控制下产生的沙粒病毒载体中缺失的病毒基因。另外，补给质粒的特征在于在适于哺乳动物细胞中的基因表达的表达盒(例如上述聚合酶II表达盒)的控制下的哺乳动物选择标记(例如嘌罗霉素抗性)，或者病毒基因转录物后面是内部核糖体进入位点(例如脑心肌炎病毒之一)，接着是哺乳动物抗性标记。对于在大肠杆菌(E.coli)中生产，质粒的特征另外在于细菌选择标记，例如氨苄西林抗性盒。
将可使用的细胞，例如BHK-21、HEK 293、MC57G或其它细胞保持在培养中，并采用任何常用策略(例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔)的任一种，用补给质粒转染。几天后，以滴定的浓度加入合适的选择剂，例如嘌罗霉素。按照标准规程分离存活的克隆并亚克隆，采用蛋白质印迹或流式细胞方法，用针对目标病毒蛋白质的抗体鉴定高表达的C细胞克隆。作为稳定转染的C细胞使用的备选方法，正常细胞的瞬时转染可补充下面将使用C细胞的各步骤中的遗失病毒基因。另外，可使用辅助病毒外在提供遗失的功能性。
可使用的质粒可具有两种类型：i)二质粒，称为TF-质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子，来源于例如本实例中的LCMV的NP和L蛋白；和ii)质粒，称为GS-质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒载体基因组区段，例如含规定修饰的区段。TF-质粒在适于在哺乳动物细胞中进行蛋白质表达的表达盒的控制下表达各个沙粒病毒载体的NP和L蛋白，所述表达盒通常例如哺乳动物聚合酶II启动子，例如CMV或EF1α启动子，其任一个优先与多腺苷酸化信号组合。GS-质粒表达载体的小(S)和大(L)基因组区段。通常，可使用聚合酶I驱动表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶(T7-)驱动表达盒，后者优先与3’端核酶一起用于加工初级转录物以产生正确的末端。在使用基于T7的系统的情况下，必须通过在恢复过程中包括类似于TF-质粒构建的额外的表达质粒、提供T7，来提供T7在C细胞中的表达，或者构建以稳定方式额外表达T7的C细胞。在某些实施方案中，TF和GS质粒可相同，即基因组序列和反式作用因子可通过来自一个质粒的T7、polI和polII启动子转录。
为了回收沙粒病毒载体，可采用下列程序。第1天：通常在M6孔板中80％汇合的C细胞用两种TF-质粒加两种GS-质粒的混合物转染。在某些实施方案中，TF和GS质粒可相同，即基因组序列和反式作用因子可通过来自一个质粒的T7、polI和polII启动子转录。为此，可采用常用策略(例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔)的任一种。
3-5天后：收获培养上清液(沙粒病毒载体制备物)，等分，并根据沙粒病毒载体在用前将保存多久而保存在4℃、-20℃或-80℃下。然后通过对C细胞的免疫聚焦测定法，评价沙粒病毒载体制备物的感染滴度。
本发明此外涉及细胞培养物中CMV抗原的表达，其中细胞培养物用表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒感染。当CMV抗原在培养的细胞中表达时，可采用下列2个程序：
i)将本文所述沙粒病毒载体制备物以1或更大的(例如2、3或4)的感染复数(MOI)感染目标细胞类型，导致在感染后来不久在全部细胞中产生CMV抗原。
ii)或者，可使用更低的MOI，并且可针对其病毒驱动的CMV抗原表达的水平，选择各细胞克隆。随后各克隆可因沙粒病毒载体的非细胞溶解性质而无限扩增。不论方法，随后可从培养上清液或从细胞本身收集(并纯化)CMV抗原，这取决于所产生的CMV抗原的性质。然而，本发明不限于这两种策略，并且可考虑使用感染性复制缺陷型沙粒病毒作为载体驱动CMV抗原表达的其它方式。
6.4核酸、载体系统和细胞系
在一个实施方案中，本文描述了本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的大基因组区段(L区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且基因组区段包含编码CMV抗原的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本文描述了编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码CMV抗原的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本文描述了编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中糖蛋白基因的ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码CMV抗原的核苷酸序列。在某些更具体的实施方案中，CMV抗原是第6.2节中描述的抗原。
在某些实施方案中，本文提供的核酸序列可来源于LCMV的特定毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP毒株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在具体的实施方案中，核酸来源于LCMV克隆13。在其它具体的实施方案中，核酸来源于LCMV MP毒株。
在一个更具体的实施方案中，本文提供编码包含与以下序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的序列的沙粒病毒基因组区段的核酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:50。在另一个实施方案中，本文提供编码包含以下的沙粒病毒基因组区段的核酸：(i)与SEQ ID NO:31的核苷酸1639-3315的序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码CMV抗原的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供编码包含以下的沙粒病毒基因组区段的核酸：(i)编码其氨基酸序列与由SEQ ID NO:31的1639-3315编码的氨基酸序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的表达产物的核苷酸序列；和(ii)编码CMV抗原的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供编码包含以下的沙粒病毒基因组区段的核酸：(i)与SEQ ID NO:32的核苷酸1640-3316的序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码CMV抗原的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供编码包含以下的沙粒病毒基因组区段的核酸：(i)编码其氨基酸序列与SEQ ID NO:32的1640-3316编码的氨基酸序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的表达产物的核苷酸序列；和(ii)编码CMV抗原的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供编码包含以下的沙粒病毒基因组区段的核酸：(i)编码至少一个自切割肽(或核糖体跳跃序列)的核苷酸序列；和(ii)编码2、3、4、5或更多种CMV抗原的核苷酸序列。在具体的实施方案中，编码自切割肽的核苷酸序列编码捷申病毒2A。在某些实施方案中，本文提供编码被编码自切割肽的一个或多个核苷酸序列(或核糖体跳跃序列)(例如T2A)分隔开的2、3、4或5种五聚体复合物蛋白的核酸。在某些其它实施方案中，本文提供编码被编码自切割肽的一个或多个核苷酸序列(或核糖体跳跃序列)分隔开的一种或多种gB蛋白或其片段和一种或多种其它CMV抗原的核酸。在其它实施方案中，本文提供编码被编码自切割肽的一个或多个核苷酸序列(或核糖体跳跃序列)分隔开的一种或多种pp65蛋白或其片段和一种或多种其它CMV抗原的核酸。在具体的实施方案中，本文提供编码被编码自切割肽的一个或多个核苷酸序列(或核糖体跳跃序列)分隔开的一种或多种五聚体蛋白质或其片段和一种或多种其它CMV抗原的核酸。
在一个实施方案中，本文描述了包含一起编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的基因组的一种或多种载体的载体系统。准确地讲，本文提供其中一种或多种载体编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的两个沙粒病毒基因组区段，即L区段和S区段的载体系统。这类载体系统可编码(在一个或多个单独的DNA分子上)：
经修饰的沙粒病毒S基因组区段使得携带这种修饰的S基因组区段的沙粒病毒颗粒无法产生感染性子代病毒颗粒和包含编码(有义或反义)CMV抗原的核苷酸序列的沙粒病毒L基因组区段；
经修饰的沙粒病毒L基因组区段使得携带这种修饰的L基因组区的沙粒病毒颗粒段无法产生感染性子代病毒颗粒和包含编码(有义或反义)CMV抗原的核苷酸序列的沙粒病毒S基因组区段；
经修饰的沙粒病毒S基因组区段使得携带这种修饰的S基因组区段的沙粒病毒颗粒无法产生感染性子代病毒颗粒且其中沙粒病毒S基因组区段包含编码(有义或反义)CMV抗原的核苷酸序列和野生型沙粒病毒L基因组区段；或
经修饰的沙粒病毒L基因组区段使得携带这种修饰的L基因组区的沙粒病毒颗粒段无法产生感染性子代病毒颗粒且其中沙粒病毒L基因组区段包含编码(有义或反义)CMV抗原的核苷酸序列和野生型沙粒病毒S基因组区段。
在某些实施方案中，本文描述了编码沙粒病毒(例如LCMV)基因组区段的核酸序列，其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码以下的核苷酸序列取代：
·编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
·编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
·编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本文描述了编码沙粒病毒(例如LCMV)基因组区段的核酸序列，其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码被编码自切割肽的核苷酸序列(或核糖体跳跃序列)分隔开的一个或多个CMV抗原序列(例如以上段落列出的一个或多个核苷酸序列)取代。在具体的实施方案中，编码自切割肽的核苷酸序列编码捷申病毒2A。
在另一个实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含在本节上文描述的核酸或载体系统。本文还提供来源于这类细胞的细胞系、包含这类细胞的培养物和培养被感染的这类细胞的方法。在某些实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的大基因组区段(L区段)的核酸，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且基因组区段包含编码CMV抗原的核苷酸序列。
在其它实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码CMV抗原gB或其抗原片段的核苷酸序列。
在其它实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码包含CMV抗原gB的至少一个结构域和VSV-G的异源结构域的融合蛋白的核苷酸序列。
在其它实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码包含CMV抗原gB的至少一个结构域和Flu-HA的异源结构域的融合蛋白的核苷酸序列。
在其它实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码CMV抗原pp65或其抗原片段的核苷酸序列。
在其它实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码CMV抗原gH、gL、UL128、UL130、UL131A的一种或多种或其抗原片段的核苷酸序列。在具体的实施方案中，基因组区段包含编码被一个或多个自切割肽(或核糖体跳跃序列)分隔开的包含gH、gL、UL128、UL130、UL131A的CMV抗原组别的一种或多种或其抗原片段的核苷酸序列。在更具体的实施方案中，一个或多个自切割肽为T2A肽。
在其它实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含编码本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码被一个或多个自切割肽(或核糖体跳跃序列)分隔开的一种或多种CMV抗原的核苷酸序列。在具体的实施方案中，一个或多个自切割肽为T2A肽。
在另一个实施方案中，本文提供这样的细胞，其中细胞包含本文所述的2种核酸或载体系统。本文还提供来源于这类细胞的细胞系、包含这类细胞的培养物和培养被感染的这类细胞的方法。
在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:53有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的核酸。在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:53有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的表达载体。在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:49或SEQ IDNO:53有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的宿主细胞。
在某些实施方案中，本文提供包含编码与SEQ ID NO:54、55、56或57有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:54、55、56或57有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的表达载体。在某些实施方案中，本文提供包含编码与SEQ ID NO:54、55、56或57有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的宿主细胞。
在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:54、55、56或57有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的分离的蛋白质。在某些实施方案中，本文提供表达包含与SEQ ID NO:54、55、56或57有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白质的宿主细胞。在某些实施方案中，将宿主细胞在细胞培养基中培养。
在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的核酸。在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的表达载体。在某些实施方案中，本文提供包含与SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:33有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的宿主细胞。
6.5使用方法
在一个实施方案中，本文提供治疗受试者的感染的方法，所述方法包括将一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予受试者。在一个具体的实施方案中，治疗本文所述感染的方法包括将有效量的一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予有需要的受试者。受试者可以是哺乳动物，例如但不限于人类、小鼠、大鼠、豚鼠、驯养动物，例如但不限于牛、马、绵羊、猪、山羊、猫、狗、仓鼠、驴。在一个具体的实施方案中，受试者是人。
在另一个实施方案中，本文提供用于在受试者中诱导针对CMV的免疫应答的方法，所述方法包括将表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予受试者。
在另一个实施方案中，向其给予表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物的受试者患有、易患CMV感染或再活化或有患CMV感染或再活化的风险。在另一个具体的实施方案中，向其给予表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物的受试者感染上、易感CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化风险。
在另一个实施方案中，向其给予表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物的受试者尤其在肺系统、中枢神经系统、淋巴系统、胃肠系统或循环系统患有、易患CMV感染或有CMV感染的风险。在一个具体的实施方案中，向其给予表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物的受试者在一个或多个身体器官中患有、易患CMV感染或有CMV感染的风险，所述器官包括但不限于脑、肝、肺、眼、耳、肠、食管或唾腺。
在另一个实施方案中，向其给予表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物的受试者患有包括但不限于以下的症状：发热、盗汗、疲乏、不适、不安、咽喉痛、腺体肿胀、关节痛、肌肉痛、食欲不振、体重减轻、腹泻、胃肠溃疡、胃肠出血、呼吸浅短、肺炎、口腔溃疡、视力问题、肝炎、黄疸、脑炎、癫痫发作、昏迷或听力损失。
在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予患有、易患CMV感染或有CMV感染风险的任何年龄组的受试者。在一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予免疫系统受损的受试者、妊娠受试者、进行器官或骨髓移植的受试者、服用免疫抑制药的受试者、进行血液透析的受试者、患有癌症的受试者或患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险的受试者。在一个更具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险、因HIV感染所致免疫系统受损的受试者。在再一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予是患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险、年龄为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁的儿童的受试者。在再一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予是患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险的婴儿的受试者。在再一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予是患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险、年龄为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月的婴儿的受试者。在再一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险的年长受试者。
在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予有高风险传播性CMV感染的受试者。在一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予具有不成熟新生儿免疫系统的新生儿期的受试者。
在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予具有被CMV潜伏感染的受试者。在一个具体的实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予具有被CMV潜伏感染、在免疫系统受损时可再活化的受试者。因此，本文提供用于防止CMV再活化的方法。
在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予感染CMV的一个或多个毒株的受试者。在某些实施方案中，这些毒株的一个或多个包括AD169、Towne、Merlin、Toledo、FIX、PH、TR、Davis、TB40/E、3157、6397、711、5234或其它毒株。
在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予受试者赋予针对CMV感染或CMV再活化的细胞介导免疫(CMI)。虽不受理论束缚，但是在另一个实施方案中，表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物在宿主的抗原呈递细胞(APC)(例如巨噬细胞)中感染并表达目标抗原用于在主要组织相容性复合体(MHC)I和II类上的抗原直接呈递。在另一个实施方案中，将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物给予受试者诱导共同产生多功能IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4+和CD8+T细胞应答(IFN-γ由CD4+和CD8+T细胞产生，TNF-α由CD4+T细胞产生)以治疗或预防CMV感染或CMV再活化。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时发生被CMV感染或CMV再活化的风险相比，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物降低可能发生被CMV感染或CMV再活化的个体的风险达至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高，。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时CMV感染或CMV再活化的症状的表现相比，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物减轻CMV感染或CMV再活化的症状达至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高，。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时针对CMV感染或CMV再活化的细胞介导免疫(CMI)应答相比，在具有不成熟新生儿免疫系统的受试者中给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物诱导针对CMV感染或CMV再活化的细胞介导免疫(CMI)应答达至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
在某些实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物减少在唾腺或其它组织样品中检出的包含体的数目。在某些实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物减少在患者血样中检出的抗CMV抗体的数目。在某些实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物降低通过CMVpp65抗原血症试验在外周血白细胞中检出的CMV pp65的量。在某些实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物降低在尿液、唾液、血液、泪液、精液或母乳中检出的CMV的量。在某些实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物降低从尿液、喉拭子、支气管灌洗或组织样品中培养的病毒的水平。在某些实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物降低通过定量或定性PCR试验检出的病毒的水平。
受试者中通过给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物诱导的针对CMV感染或CMV再活化的细胞介导免疫(CMI)应答功能的变化可通过技术人员已知的任何测定法测量，包括但不限于流式细胞术(参见例如Perfetto S.P.等,Nat RevImmun.2004；4(8):648-55)；淋巴细胞增殖测定法(参见例如Bonilla F.A.等,Ann AllergyAsthma Immunol.2008；101:101-4；和Hicks M.J.等,Am J Clin Pathol.1983；80:159-63)；测量淋巴细胞活化的测定法，包括在激活T淋巴细胞的细胞因子后测定表面标志物表达的变化(参见例如Caruso A.等,Cytometry.1997；27:71-6)；ELISPOT测定法(参见例如Czerkinsky C.C.等,J Immunol Methods.1983；65:109-121；和Hutchings P.R.等,JImmunol Methods.1989；120:1-8)或天然杀伤细胞细胞毒性测定法(参见例如BonillaF.A.等,Ann Allergy Asthma Immunol.2005May；94(5Suppl 1):S1-63)。
在另一个实施方案中，本文描述了与表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒(例如LCMV)一起使用的方法，其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码以下的核苷酸序列取代：
a.编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；或
g.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予育龄受试者。参见第6.2节。在具体的实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予血清反应阴性育龄受试者。在又一个实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予打算生育的育龄受试者。
在另一个实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予育龄受试者。参见第6.2节。在具体的实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予血清反应阴性育龄受试者。在另外又一个实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予打算生育的育龄受试者。
在另一个实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括将表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予妊娠受试者。在具体的实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括有效量的表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予妊娠受试者。
在另一个实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予妊娠受试者。在具体的实施方案中，本文提供防止CMV从母亲至未出生婴儿的传播和/或感染的方法，所述方法包括有效量的一种或多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予妊娠受试者。
在另一个实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒减轻有症状的先天性CMV感染。在另一个实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒减轻无症状的先天性CMV感染。
在另一个实施方案中，给予一种或多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒减轻有症状的先天性CMV感染。在另一个实施方案中，给予一种或多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒减轻无症状的先天性CMV感染。
在另一个实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒减轻先天性CMV感染的表现达至少约10％、至少约20％、至少25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少80％、至少90％或更高。在另一个具体的实施方案中，给予表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒降低患先天性CMV感染的新生儿的死亡率。
在另一个实施方案中，给予一种或多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒减轻先天性CMV感染的表现达至少约10％、至少约20％、至少25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少80％、至少90％或更高。在另一个具体的实施方案中，给予一种或多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒降低患先天性CMV感染的新生儿的死亡率。
先天性CMV的所述表现包括但不限于智力迟钝、失明和感音神经性聋、小头畸形、脉络膜视网膜炎、颅内钙化、肝脾大、肝炎、黄疸、高直接胆红素血症、血小板减少、瘀点、羊水过少、羊水过多、早熟、宫内发育迟缓、非免疫性水肿、胎儿腹水、张力过低和贫血。
6.6组合物、给药和剂量
本发明此外涉及包含本文所述基因工程沙粒病毒的疫苗、免疫原性组合物和药物组合物。可按照本领域的标准程序配制这类疫苗和药物组合物。
在另一个实施方案中，本文提供包含本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒的组合物。这类组合物可用于治疗和预防疾病的方法。在一个具体的实施方案中，将本文所述组合物用于治疗染上或易感CMV感染或CMV再活化的受试者。在另一个具体的实施方案中，本文提供的免疫原性组合物可用来在向其给予组合物的宿主中诱导免疫应答。本文所述免疫原性组合物可用作疫苗，并因此可配制成药物组合物。在一个具体的实施方案中，将本文所述免疫原性组合物用于预防受试者(例如人类受试者)被CMV感染或受试者(例如人类受试者)中的CMV再活化。
在某些实施方案中，本文提供包含本文所述沙粒病毒载体(或不同沙粒病毒载体的组合)的免疫原性组合物。在某些实施方案中，这类免疫原性组合物另包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，这类免疫原性组合物另包含佐剂。可在给予所述组合物之前、同时或之后给予用于与本文所述组合物组合给予的佐剂。在一些实施方案中，术语“佐剂”是指与本文所述组合物联合或作为本文所述组合物的部分给予时增加、提高和/或加强感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的免疫应答的化合物，但当该化合物单独给予时不产生对感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂产生对感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的免疫应答，并且不产生反态反应或其它不良反应。佐剂可通过若干机制(包括例如淋巴细胞募集、B和/或T细胞刺激和巨噬细胞刺激)提高免疫应答。当本发明的疫苗或免疫原性组合物包含佐剂或与一种或多种佐剂一起给予时，可使用的佐剂包括但不限于天然盐佐剂或天然盐凝胶佐剂、粒子佐剂、微粒佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见GB 2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween 80；ICL Americas、Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见以国际公布号WO2007/109812公开的国际申请号PCT/US2007/064857)、咪唑并喹喔啉化合物(参见以国际公布号WO2007/109813公开的国际申请号PCT/US2007/064858)和皂苷，例如QS21(参见Kensil等，载于Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(Powell和Newman编辑,Plenum Press,NY,1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是任选与免疫刺激剂(例如单磷酰脂质A)组合的水包油乳液(例如角鲨烯或花生油)(参见Stoute等,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。
组合物包含单独的本文所述感染性复制缺陷型沙粒病毒或连同药学上可接受的载体。可以使用基因工程沙粒病毒的混悬液或分散体，尤其是等渗的水性混悬液或分散体。药物组合物可被灭菌和/或可包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、稳定剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且按本身已知的方式制备，例如通过常规分散和悬浮方法。在某些实施方案中，这类分散体或混悬液可包含粘度调节剂。将混悬液或分散体保持在2-8℃左右的温度下或优先可冷冻以用于较长期储存，然后在用前不久融化。对于注射，可在水性溶液中，优选在生理上相容的缓液(例如Hanks溶液、林格氏液或生理盐水缓冲液)中配制疫苗或免疫原制备物。溶液剂中可含有调配剂(formulatory agent)，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
在某些实施方案中，本文所述组合物另外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体的实施方案中，本文所述药物组合物包含0.001％-0.01％硫柳汞。在其它实施方案中，本文所述药物组合物不含防腐剂。
药物组合物包含约103至约1011病灶形成单位的基因工程沙粒病毒。胃肠外给药的单位剂型为例如安瓿或小瓶，例如小瓶含有约103-1010病灶形成单位或105-1015个物理颗粒的基因工程沙粒病毒。
在另一个实施方案中，通过包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、局部、皮下、经皮、鼻内和吸入途径，以及通过划痕(例如使用分岔针通过皮肤顶层刻痕)，将本文提供的疫苗或免疫原性组合物给予受试者。具体地讲，可使用皮下或静脉内途径。
对于鼻内或通过吸入给药，可适宜地在使用合适的抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)的同时以从喷雾器(pressurizedpack)或雾化器提供的喷雾剂的形式递送按照本发明使用的制剂。在压缩气雾剂的情况下，可通过提供递送计量的阀确定剂量单位。可配制含有化合物和合适的粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物的例如明胶的药囊和药盒用于吸入器或吹入器。
活性成分的剂量取决于疫苗接种的类型和受试者及其年龄、体重、个体条件、各药代动力学数据和给药方式。
本发明还涉及基因工程沙粒病毒用于制备呈包含基因工程沙粒病毒作为活性成分的药物制剂形式的疫苗的方法和用途。本发明的药物组合物以本身已知的方式制备，例如通过常规混合和/或分散过程。
6.7 LCMV载体的优化产生
由于沙粒病毒载体中病毒基因的一个或多个的去除或功能性失活(此处将以糖蛋白GP的缺失作为实例)，因此可在“外在”提供缺失或功能性失活病毒基因(例如GP)的细胞中产生并扩增沙粒病毒载体。所得病毒本身是感染性的但因缺失或功能性失活病毒基因(例如GP)的缺乏所致不能够在非补给细胞中产生另外的感染性子代颗粒。补给细胞可通过稳定转染、瞬时转染或通过用表达遗失功能性的辅助病毒感染，提供遗失的功能性。
在某些实施方案中，补给细胞提供来自沙粒病毒载体基因组缺失或功能性失活的病毒基因。在一个具体的实施方案中，补给细胞提供来自是与用于产生沙粒病毒的基因组载体的病毒毒株相同的病毒毒株的病毒基因。在另一个实施方案中，补给细胞提供来自不同于用来产生沙粒病毒的基因组载体的病毒毒株的病毒毒株的病毒基因。例如，补给细胞中提供的病毒基因获自LCMV的MP毒株并编码具有SEQ ID NO:54、55、56或57的氨基酸序列的蛋白质。
在一个具体的实施方案中，补给细胞提供LCMV的MP毒株的GP且沙粒病毒载体包含本文所述人CMV抗原的ORF替换编码GP蛋白的ORF。在甚至更具体的实施方案中，补给细胞提供LCMV的MP毒株的GP，且沙粒病毒载体获自LCMV克隆13并包含本文所述人CMV抗原的ORF替换编码GP蛋白的ORF。在甚至更具体的实施方案中，GP蛋白与SEQ ID NO:55的氨基酸序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性。
6.8联合疗法
6.8(a)方法
在一个实施方案中，本文提供治疗和/或预防受试者的CMV感染的方法，所述方法包括给予受试者两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒。参见例如第6.2节。在具体的实施方案中，用于治疗和/或预防CMV感染的方法包括给予表达本文所述CMV抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒，例如其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码CMV抗原的核苷酸序列取代，其中CMV抗原可以是但不限于：
a)编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b)编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c)编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d)编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e)编码CMV糖蛋白UL128或其抗原片段的核苷酸序列；
f)编码CMV糖蛋白UL130或其抗原片段的核苷酸序列；
g)编码CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段的核苷酸序列，
和表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒，例如其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码CMV抗原的核苷酸序列取代，其中CMV抗原可以是但不限于：
a)编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b)编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c)编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d)编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e)编码CMV糖蛋白UL128或其抗原片段的核苷酸序列；
f)编码CMV糖蛋白UL130或其抗原片段的核苷酸序列；
g)编码CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防CMV感染的方法，所述方法包括给予表达选自以下第一CMV抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒：本文所述的CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段；CMV糖蛋白gH或其抗原片段；CMV糖蛋白gL或其抗原片段；CMV糖蛋白UL128或其抗原片段；CMV糖蛋白UL130或其抗原片段；或CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段和表达选自以下第二CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒：编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段；CMV糖蛋白gH或其抗原片段；CMV糖蛋白gL或其抗原片段；CMV糖蛋白UL128或其抗原片段；CMV糖蛋白UL130或其抗原片段；或CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段。
在某些实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予表达本文所述CMV抗原的2种沙粒病毒载体构建体。在一个具体的实施方案中，2种沙粒病毒载体构建体表达不同的CMV抗原。
在某些实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予表达本文所述CMV抗原的两种或更多种沙粒病毒载体构建体。在一个具体的实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予表达本文所述CMV抗原的3种或更多种沙粒病毒载体构建体。在另一个实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予本文所述各表达CMV抗原的4种或更多种沙粒病毒载体构建体、5种或更多种沙粒病毒载体构建体、6种或更多种沙粒病毒载体构建体或7种沙粒病毒载体构建体。在某些实施方案中，沙粒病毒载体构建体可以是LCMV。
在某些实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予本文所述各自表达不同的CMV抗原的两种或更多种沙粒病毒载体构建体。在一个具体的实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予本文所述各自表达不同的CMV抗原的3种或更多种沙粒病毒载体构建体。在另一个实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防感染的方法，所述方法包括给予本文所述各自表达不同的CMV抗原的4种或更多种沙粒病毒载体构建体、5种或更多种沙粒病毒载体构建体、6种或更多种沙粒病毒载体构建体或7种沙粒病毒载体构建体。在某些实施方案中，沙粒病毒载体构建体可以是LCMV。
在具体的实施方案中，抗原是CMV包膜糖蛋白gB或其片段。(参见例如第6.2(a)节)。在更具体的实施方案中，抗原是带有羧基端截短的CMV包膜糖蛋白gB。(参见例如第6.2(b)节)。
在某些实施方案中，抗原是CMV被膜蛋白pp65或其片段。(参见例如第6.2(c)节)。
在某些实施方案中，抗原是CMV五聚体复合物蛋白。在另一个实施方案中，CMV五聚体复合物抗原是gH、gH(dTM)、gL、UL128、UL131A或UL130或其组合。(参见例如第6.2(d)节)。
在某些实施方案中，所产生的编码一种或多种本文所述CMV抗原的载体包含本文所述编码CMV抗原的一种或多种核酸及其组合。在具体的实施方案中，本文所述CMV抗原被本文所述不同的接头、间隔物和切割位点分隔开来。
在另一个实施方案中，所产生的编码第一感染性复制缺陷型沙粒病毒的一种或多种本文所述CMV抗原的载体可以LCMV克隆13或LCMV MP毒株为基础。(参见例如第7.1节)。
在另一个实施方案中，所产生的编码第二感染性复制缺陷型沙粒病毒的一种或多种本文所述CMV抗原的载体可以LCMV克隆13或LCMV MP毒株为基础。(参见例如第7.1节)。
在一个具体的实施方案中，本文提供治疗和/或预防受试者的感染的方法，所述方法包括给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在一个具体的实施方案中，本文提供治疗和/或预防受试者的感染的方法，所述方法包括序贯给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在一个具体的实施方案中，本文提供治疗和/或预防受试者的感染的方法，所述方法包括同时给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在另一个实施方案中，表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒是主要的疫苗抗原和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒是次要的疫苗抗原。
在一个具体的实施方案中，本文提供治疗和/或预防试者的CMV感染的方法，所述方法包括给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。(例如第6.2(b)节)。
在一个具体的实施方案中，本文提供治疗和/或预防试者的CMV感染的方法，所述方法包括序贯给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。(有关截短的gB蛋白参见例如第6.2(b)节)。
在一个具体的实施方案中，本文提供治疗和/或预防试者的CMV感染的方法，所述方法包括同时给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。(有关截短的gB蛋白参见例如第6.2(b)节)。
在另一个实施方案中，表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒是主要的疫苗抗原，表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒是次要的疫苗抗原。
在某些实施方案中，与给予表达CMV抗原例如仅表达糖蛋白gB(或其片段)或仅表达被膜蛋白pp65的单一感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，在疫苗接种之后给予表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒提供对CMV的更好的保护作用。在其它实施方案中，与给予表达CMV抗原例如仅表达糖蛋白gB(或其片段)或仅表达被膜蛋白pp65的单一感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，给予表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导更大的免疫应答。在另一个实施方案中，与给予表达CMV抗原例如仅表达糖蛋白gB(或其片段)或仅表达被膜蛋白pp65的单一感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，给予表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导更大的CD8+T细胞应答。在其它实施方案中，与给予表达CMV抗原例如仅表达糖蛋白gB(或其片段)或仅表达被膜蛋白pp65的单一感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，给予表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其片段或CMV被膜蛋白pp65的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导更高滴度的中和抗体。
在某些实施方案中，如通过ELISA、中和抗体测定法和动物模型所测，与表达CMV糖蛋白gB(其中gB的跨膜结构域缺失)的感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，在疫苗接种之后给予表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的感染性复制缺陷型沙粒病毒(参见第6.2(b)节)提供对CMV的更好的保护作用。参见第6.9节。在其它实施方案中，与表达CMV糖蛋白gB(其中gB的跨膜结构域缺失)的感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导更大的免疫应答。在某些实施方案中，与表达CMV糖蛋白gB(其中gB的跨膜结构域缺失)的感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的感染性复制缺陷型沙粒病毒诱导更大的CD8+T细胞应答。在其它实施方案中，与表达CMV糖蛋白gB(其中gB的跨膜结构域缺失)的感染性复制缺陷型沙粒病毒相比，表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的复制缺陷型沙粒病毒诱导更高滴度的中和抗体。(参见例如图12、13和25、26)。
在另外又一个实施方案中，本文提供组合使用的表达本文所述CMV抗原的复制缺陷型沙粒病毒和一种或多种复制缺陷型病毒载体。在一个更具体的实施方案中，复制缺陷型病毒载体选自痘病毒、腺病毒、甲病毒、单纯疱疹病毒、副黏病毒、棒状病毒、脊髓灰质炎病毒、腺伴随病毒和仙台病毒及其混合物。在一个具体的实施方案中，痘病毒是改良安卡拉株疫苗。
在另外又一个实施方案中，本文提供组合使用的表达本文所述CMV抗原的复制缺陷型沙粒病毒和一种或多种表达CMV抗原的复制缺陷型病毒载体。在一个更具体的实施方案中，复制缺陷型病毒载体选自痘病毒、腺病毒、甲病毒、单纯疱疹病毒、副黏病毒、棒状病毒、脊髓灰质炎病毒、腺伴随病毒和仙台病毒及其混合物。在一个具体的实施方案中，痘病毒是改良安卡拉株疫苗。
在另一个实施方案中，在表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒之前或之后给予表达本文所述CMV抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒。例如在首次给予第二感染性复制缺陷型沙粒病毒之前或之后约30-60分钟给予表达CMV抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在另一个实施方案中，在表达疫苗抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒之前给予表达疫苗抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒。在某些实施方案中，在给予第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和第二感染性复制缺陷型沙粒病毒之间有约1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、5天、1周、2周、1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、1年的一段时间。
在另一个实施方案中，2种感染性复制缺陷型沙粒病毒在治疗方案中以范围为约1:1-1:1000的摩尔比率给予，具体地说包括：1:1比率、1:2比率、1:5比率、1:10比率、1:20比率、1:50比率、1:100比率、1:200比率、1:300比率、1:400比率、1:500比率、1:600比率、1:700比率、1:800比率、1:900比率、1:1000比率。
在另一个实施方案中，向其给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的受试者患有、易患CMV感染或再活化或有患CMV感染或再活化的风险。在另一个实施方案中，向其给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的受试者染上、易感CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险。
在另一个实施方案中，向其同时给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的受试者患有、易患CMV感染或再活化或有患CMV感染或再活化的风险。在另一个实施方案中，向其同时给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的受试者染上、易感CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险。
在另一个实施方案中，向其序贯给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的受试者患有、易患CMV感染或再活化或有患CMV感染或再活化的风险。在另一个实施方案中，受向其序贯给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的受试者染上、易感CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险。
在另一个实施方案中，进一步给予与至少一种其它药物组合的所述两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒用于治疗和/或预防CMV。用于治疗和/或预防CMV的治疗药物包括但不限于缬更昔洛韦、更昔洛韦、膦甲酸、西多福韦或马立巴韦。
在另一个实施方案中，进一步给予与至少一种其它免疫调节剂组合的所述两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒。在一个更具体的实施方案中，进一步给予与至少一种Th1特异性佐剂组合的所述两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒。在一个更具体的实施方案中，Th-1特异性佐剂是卡介苗(BCG)。
在另一个实施方案中，给药方案可包括可包括将表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予有症状的受试者。在另外又一个实施方案中，给药方案可包括将表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予免疫系统受损的受试者，尤其移植物接受者、感染HIV的人、妊娠受试者、患有癌症的受试者。在另一个实施方案中，将两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒给予是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁的儿童、患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化风险的受试者。
在另一个实施方案中，给药方案可包括将表达CMV抗原的第一复制缺陷型沙粒病毒给予是儿童的受试者，并且将表达CMV抗原的第二复制缺陷型沙粒病毒给予是青少年的同一受试者。在一个具体的实施方案中，给药方案可包括将表达本文所述CMV抗原的第一复制缺陷型沙粒病毒给予年龄为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁的受试者，并且将表达CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予年龄为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25岁的同一受试者。
在另一个实施方案中，给药方案可包括将表达CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予青春期前的受试者。在另一个实施方案中，给药方案可包括将表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予12-18岁的青春期男性。在另一个实施方案中，给药方案可包括将表达CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予12-18岁的女性。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时感染CMV或CMV再活化的症状的表现相比，给予两种或更多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒降低个体将发生CMV感染或CMV再活化的风险达至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时感染CMV或CMV再活化的症状的表现相比，给予单独给予的两种或更多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒降低个体将发生CMV感染或CMV再活化的风险达至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时感染CMV或CMV再活化的症状的表现相比，给予序贯给予的两种或更多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒降低个体将发生CMV感染或CMV再活化的风险达至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
6.8(b)组合物
本发明此外涉及包含本文所述基因工程沙粒病毒的疫苗、免疫原性组合物和药物组合物。可按照本领域的标准程序配制这类疫苗和药物组合物。
在一个实施方案中，本文提供包含两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的组合物。参见例如第6.2节。在一个具体的实施方案中，本文所述组合物包括给予受试者表达本文所述CMV抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒，例如，其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码CMV抗原的核苷酸序列取代。CMV抗原可以是但不限于：
a)编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b)编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c)编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d)编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e)编码CMV糖蛋白UL128或其抗原片段的核苷酸序列；
f)编码CMV糖蛋白UL130或其抗原片段的核苷酸序列；
g)编码CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段的核苷酸序列；
和表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物，例如，其中编码S基因组区段的GP的ORF被编码CMV抗原的核苷酸序列取代。CMV抗原可以是但不限于：
a)编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b)编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c)编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d)编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e)编码CMV糖蛋白UL128或其抗原片段的核苷酸序列；
f)编码CMV糖蛋白UL130或其抗原片段的核苷酸序列；
g)编码CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，本文提供用于治疗和/或预防CMV感染的方法，所述方法包括给予表达选自以下第一CMV抗原的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒：本文所述的CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段；CMV糖蛋白gH或其抗原片段；CMV糖蛋白gL或其抗原片段；CMV糖蛋白UL128或其抗原片段；CMV糖蛋白UL130或其抗原片段；或CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段，和表达第二CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒，其选自编码以下的核苷酸序列：CMV糖蛋白gB或其抗原片段；CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段；CMV糖蛋白gH或其抗原片段；CMV糖蛋白gL或其抗原片段；CMV糖蛋白UL128或其抗原片段；CMV糖蛋白UL130或其抗原片段；或CMV糖蛋白UL131A或其抗原片段。
在某些实施方案中，本文提供适于治疗和/或预防CMV感染的方法的组合物，所述方法包括给予2种表达本文所述CMV抗原的沙粒病毒构建体。在一个具体的实施方案中，2种沙粒病毒载体构建体表达CMV抗原。
在某些实施方案中，本文提供包含两种或更多种表达本文所述CMV抗原的沙粒病毒载体构建体的组合物。在具体的实施方案中，本文提供包含3种或更多种表达本文所述CMV抗原的沙粒病毒载体构建体的组合物。在另一个实施方案中，本文提供包含4种或更多种表达CMV抗原的沙粒病毒载体构建体、5种或更多种表达CMV抗原的沙粒病毒载体构建体、6种或更多种表达CMV抗原的沙粒病毒载体构建体或7种各自表达本文所述CMV抗原的沙粒病毒载体构建体或其组合的组合物。在某些实施方案中，沙粒病毒可以是LCMV。
在具体的实施方案中，抗原是CMV主要包膜糖蛋白gB或其片段。(参见例如第6.2(a)节)。在更具体的实施方案中，抗原是羧基端截短的CMV主要包膜糖蛋白gB。(有关截短的gB蛋白参见例如第6.2(b)节)。
在某些实施方案中，抗原是CMV被膜蛋白pp65或其片段。(参见例如第6.2(c)节)。
在某些实施方案中，抗原是CMV五聚体复合物蛋白。在另一个实施方案中，CMV五聚体复合物抗原是gH、gH(dTM)、gL、UL128、UL131A或UL130或其组合。(参见例如第6.2(d)节)。
在某些实施方案中，所产生的编码一种或多种本文所述CMV抗原的载体包含一种或多种编码本文所述CMV抗原的核酸及其组合。在具体的实施方案中，本文所述CMV抗原被本文所述的不同接头、间隔物和切割位点分隔开来。
在另一个实施方案中，所产生的编码第一感染性复制缺陷型沙粒病毒的本文所述一种或多种CMV抗原的载体可以LCMV克隆13或LCMV MP毒株为基础。(参见例如第7.1节)。
在另一个实施方案中，所产生的编码第二感染性复制缺陷型沙粒病毒的本文所述一种或多种CMV抗原的载体可以LCMV克隆13或LCMV MP毒株为基础。(参见例如第7.1节)。
在一个具体的实施方案中，本文提供适于治疗和/或预防受试者的CMV感染的方法的组合物，所述方法包括给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物。
在一个具体的实施方案中，本文提供适于治疗和/或预防受试者的感染的方法的组合物，所述方法包括序贯给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在一个具体的实施方案中，本文提供适于治疗受试者的感染的方法的组合物，所述方法包括同时给予受试者表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在另一个实施方案中，表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物是主要的疫苗抗原，表达CMV糖蛋白gB或其抗原片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒是次要的疫苗抗原。
在一个具体的实施方案中，本文提供包含表达CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物和表达羧基端截短的CMV糖蛋白的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物的组合物。(有关截短的gB蛋白参见例如第6.2(b)节)。
在另外又一个实施方案中，本文提供组合使用的表达本文所述CMV抗原的复制缺陷型沙粒病毒组合物和一种或多种复制缺陷型病毒载体组合物。在一个更具体的实施方案中，复制缺陷型病毒载体组合物可以是但不限于：痘病毒、腺病毒、甲病毒、单纯疱疹病毒、副黏病毒、棒状病毒、脊髓灰质炎病毒、腺伴随病毒、和仙台病毒及其混合物。在一个具体的实施方案中、痘病毒是改良安卡拉株疫苗。
在另一个实施方案中，2种感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物的摩尔比率范围为约1:1-1:1000，更具体地说包括：1:1比率、1:2比率、1:5比率、1:10比率、1:20比率、1:50比率、1:100比率、1:200比率、1:300比率、1:400比率、1:500比率、1:600比率、1:700比率、1:800比率、1:900比率、1:1000比率。
在另一个实施方案中，适于将组合物给予其中给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物的受试者患有、易患CMV感染或再活化或有患CMV感染或再活化的风险。在另一个实施方案中，向其给予两种或更多种表达本文所述CMV抗原或其组合物的感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物的受试者染上、易感CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化的风险。
在另一个实施方案中，所述两种或更多种感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物另包含用于治疗和/或预防CMV感染或CMV再活化的至少一种其它药物。治疗药物包括但不限于缬更昔洛韦、更昔洛韦、膦甲酸、西多福韦或马立巴韦。
在另一个实施方案中，组合物是适于给予有症状的受试者的表达本文所述CMV抗原或其片段的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物。在另外又一个实施方案中，组合物是适于给予免疫系统受损的受试者，尤其移植物接受者、感染HIV的人、妊娠受试者或患有癌症的受试者的表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物或其片段。在另一个实施方案中，两种或更多种表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物适于给予患有、易患CMV感染或CMV再活化或有CMV感染或CMV再活化风险、年龄为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁的受试者。
在另一个实施方案中，组合物是适于给予是儿童的受试者的表达CMV抗原的第一复制缺陷型沙粒病毒和给予是青少年的同一受试者的表达CMV抗原的第二复制缺陷型沙粒病毒。在一个具体的实施方案中，给药方案可包括给予是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁的受试者表达本文所述CMV抗原的第一复制缺陷型沙粒病毒，并给予是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25岁的同一受试者表达CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。
在另一个实施方案中，组合物是适于给予青春期前的受试者的表达CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒。在另一个实施方案中，给药方案可包括将表达本文所述CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予12-18岁的青春期男性。在另一个实施方案中，给药方案可包括将表达CMV抗原的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒给予12-18岁的女性。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时感染CMV或CMV再活化的症状的表现相比，两种或更多种表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物降低个体将发生CMV感染或CMV再活化的风险达至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时感染CMV或CMV再活化的症状的表现相比，单独给予的两种或更多种表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物降低个体将发生CMV感染或CMV再活化的风险达至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
在另一个实施方案中，与在这类治疗不存在时感染CMV或CMV再活化的症状的表现相比，序贯给予的两种或更多种表达本文所述CMV抗原或其片段的感染性复制缺陷型沙粒病毒组合物降低个体将发生CMV感染或CMV再活化的风险达至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
在另一个实施方案中，本发明提供包含协同组合的两种或更多种表达CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒的疫苗组合物。
在具体的实施方案中，本文提供包含表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的感染性复制缺陷型沙粒病毒的药物组合物(有关截短的gB蛋白参见例如第6.2(b)节)。在另一个实施方案中，本文提供包含表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB或CMV被膜蛋白pp65的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB或CMV被膜蛋白pp65的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒的药物组合物。
在其它实施方案中，药物组合物包含表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的感染性复制缺陷型沙粒病毒，所述羧基端截短的CMV糖蛋白gB在截短的gB蛋白的全长内与SEQ IDNO:3的氨基酸序列可有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在更具体的实施方案中，CMV糖蛋白gB在SEQ ID NO:3的氨基酸773-906的区域中有截短。在一个具体的实施方案中，截短的gB蛋白由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，截短可以是可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134个氨基酸长的糖蛋白gB。有关截短的gB蛋白参见第6.2(b)节。
在某些实施方案中，本文提供包含表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB的感染性复制缺陷型沙粒病毒的免疫原性组合物(有关截短的gB蛋白参见例如第6.2(b)节)。在另一个实施方案中，本文提供包含表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB或CMV被膜蛋白pp65的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒和表达羧基端截短的CMV糖蛋白gB或CMV被膜蛋白pp65的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒的免疫原性组合物。
在其它实施方案中，免疫原性组合物包含在其它gB的全长内与SEQ ID NO:3的氨基酸序列可为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在更具体的实施方案中，免疫原性组合物在SEQ ID NO:3的氨基酸773-906区域具有截短或缺失。在另外其它的实施方案中，截短或缺失为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134个氨基酸长。在某些实施方案中，免疫原性组合物另包含药学上可接受的载体。
6.9测定法
用于测量沙粒病毒载体感染性的测定法：技术人员已知的任何测定法可用来测量沙粒病毒载体制备物感染性。例如，病毒/载体滴度的测定可通过“病灶形成单位测定法”(FFU测定法)进行。简单地说，将补给细胞(例如表达LCMV GP蛋白的HEK 293细胞)铺板，并接种不同稀释度的病毒/载体样品。在温育期后，允许细胞形成单层，并允许病毒与细胞连接，将单层用甲基纤维素覆盖。当使板进一步温育时，原始感染细胞释放病毒子代。由于甲基纤维素覆盖层，新病毒的铺展局限于邻近的细胞。因此，各感染性颗粒产生感染细胞的圆形区称为病灶。可使这类病灶可见，并籍此使用针对LCMV-NP的抗体和基于HRP的颜色反应使之可数。病毒/载体的滴度可以每毫升病灶形成单位(FFU/mL)计算。
为了测定携带转基因的载体的感染滴度(FFU/mL)，通过使用各自的转基因特异性抗体而不是抗LCMV-NP抗体来改进该测定法。
血清ELISA：动物(例如小鼠、豚鼠)疫苗接种时体液免疫应答的测定可通过抗原特异性血清ELISA(酶联免疫吸附测定法)进行。简单地说，将板用抗原(例如重组蛋白质)包被、封闭以避免抗体的非特异性结合，并与连续稀释的血清一起温育。在温育后，例如使用酶偶联的抗物种(例如小鼠、豚鼠)特异性抗体(检测总的IgG或IgG亚类)和随后的颜色反应，可检测结合的血清-抗体。抗体滴度可测定为例如终点几何平均滴度。
ARPE-19细胞中的中和测定法:使用来自ATCC的ARPE-19细胞和GFP标记的病毒，以下列细胞测定法进行血清中诱导抗体的中和活性的测定。另外使用补充的豚鼠血清作为外源补体的来源。该测定始于用前1或2天在384孔板中接种6.5x103个细胞/孔(50μl/孔)用于中和。中和在96孔无菌组织培养板中在无细胞时在37℃下进行1小时。在中和温育步骤后，将混合物加入细胞中，再温育4天用于用读板仪进行GFP检测。阳性中和人血清用作各板上的测定阳性对照以检查所有结果的可靠性。滴度(EC50)采用4参数曲线曲线拟合测定。作为另外的测试，用荧光显微镜检查各孔。
噬斑减少测定法：简单地说，通过使用用绿色荧光蛋白标记的GPCMV的分离株进行用于豚鼠巨细胞病毒的噬斑减少(中和)测定法，使用5％兔血清作为外源补体的来源，并通过荧光显微镜清点噬斑。中和滴度定义为与对照(免疫前)血清样品的相比，导致噬斑50％减少的血清的最高稀释度。
豚鼠肺成纤维细胞(GPL)中的中和测定法：简单地说，在以补充兔血清(1％)作为外源补体来源的GPL完全培养基中制备连续稀释的试验血清和对照(接种前)血清。稀释系列跨越1:40-1:5120。使血清稀释液与eGFP标记的病毒(100-200pfu/孔)在37℃下温育30分钟，然后转移到含有汇合的GPL细胞的12孔板中。一式三份对样品进行加工。在37℃下温育2小时后，将细胞用PBS洗涤，重新供给GPL完全培养基，并在37℃/5％CO2下温育5天。噬斑通过荧光显微镜进行观察，计数，并与对照孔进行比较。导致与对照相比噬斑数减少50％的血清稀释度指定为中和滴度。
qPCR：按照生产商提供的方案，使用QIAamp病毒RNA mini Kit(QIAGEN)，分离LCMVRNA基因组。通过用IIIOne-Step qRT-PCR Kit(Invitrogen)和对LCMV NP编码区的部分有特异性的引物和探针(FAM报道分子和NFQ-MGB Quencher)在StepOnePlus Real Time PCR System(Applied Biosystems)中进行的定量PCR，检测LCMVRNA基因组当量。反应的温度概况为：在60℃下30分钟，在95℃下2分钟，接着在95℃下15秒钟45个循环，在56℃下30秒钟。通过将样品结果与标准曲线进行比较，来定量测定RNA，所述标准曲线从分光光度定量的体外转录的RNA片段(相当于含有引物和探针结合位点的LCMVNP编码序列的片段)的log10稀释系列制备。
蛋白质印迹法：使用RIPA缓冲液(Thermo Scientific)，使生长在组织培养瓶或悬液中的受感染细胞在感染后的规定时间点裂解，或受感染细胞直接使用而无需细胞裂解。将样品与还原剂和NuPage LDS样品缓冲液(NOVEX)一起加热至99℃10分钟，冷却到室温后，加载到4-12％SDS-凝胶中用于电泳。使用Invitrogens iBlot Gel转移装置将蛋白质印在膜上，并通过Ponceau染色观察。最后，将制备物用针对目标蛋白质的第一抗体和碱性磷酸酶缀合的第二抗体探测，接着用1-Step NBT/BCIP溶液(INVITROGEN)染色。
用于检测抗原特异性CD8+T细胞增殖的MHC-肽多聚体染色测定法：技术人员已知的任何测定法可用来测试抗原特异性CD8+T细胞应答。例如，可采用MHC-肽四聚物染色测定法(参见例如Altman J.D.等,Science.1996；274:94-96；和Murali-Krishna K.等,Immunity.1998；8:177-1877)。简单地说，该测定法包括下列步骤，采用四聚物测定法检测抗原特异性T细胞的存在。为了T细胞检测对之有特异性的肽，必须同时识别该肽和针对抗原特异性T细胞(通常荧光标记的)定制的MHC分子的四聚物。然后通过荧光标记的流式细胞术，检测四聚物。
用于检测抗原特异性CD4+T细胞增殖的ELISPOT测定法：技术人员已知的任何测定法可用来测试抗原特异性CD4+T细胞应答。例如，可采用ELISPOT测定法(参见例如Czerkinsky C.C.等,J Immunol Methods.1983；65:109-121；和Hutchings P.R.等,JImmunol Methods.1989；120:1-88)。简单地说，该测定法包括下列步骤：将免疫斑点板(immunospot plate)用抗细胞因子抗体包被。使细胞在免疫斑点板上温育。细胞分泌细胞因子，然后洗出细胞。然后将板用第二生物化抗细胞因子抗体包被，并用抗生物素蛋白-HRP系统观察。
用于检测CD8+和CD4+T细胞应答的功能性的胞内细胞因子测定法：技术人员已知的任何测定法可用来测试CD8+和CD4+T细胞应答的功能性。例如，可采用与流式细胞术联合的胞内细胞因子测定法(参见例如Suni M.A.等,J Immunol Methods.1998；212:89-98；Nomura L.E.等,Cytometry.2000；40:60-68；和Ghanekar S.A.等,Clinical andDiagnostic Laboratory Immunology.2001；8:628-63)。简单地说，该测定法包括下列步骤：通过抑制蛋白质转运的特殊肽或蛋白质(例如布雷菲德菌素A)激活细胞，加入所述肽以使细胞因子保留在细胞内。在洗涤后，可将抗其它细胞标志物的抗体加入细胞中。然后使细胞固定并透化。加入抗细胞因子抗体，并可通过流式细胞术分析细胞。
用于证实病毒载体复制缺陷的测定法：技术人员已知的测定感染性和可复制病毒颗粒的浓度的任何测定法也可用来测量样品中的复制缺陷型病毒颗粒。例如，用非补给细胞的FFU测定法(如[00225]中所述)可用于此目的。
此外，基于噬斑的测定法是用来测定以噬斑形成单位(PFU)为单位的病毒样品中的病毒浓度的标准方法。具体地讲，非补给宿主细胞的汇合单层用不同稀释度的病毒感染，并用半固体培养基(例如琼脂)覆盖以防止病毒感染不加区别的扩散。当病毒成功感染并且在固定细胞单层内的细胞中自我复制时，形成病毒噬斑(参见例如Kaufmann,S.H.；Kabelitz,D.(2002).Methods in Microbiology第32卷:Immunology ofInfection.Academic Press.ISBN 0-12-521532-0)。噬斑形成可耗时3-14天，这取决于被分析的病毒。一般对噬斑进行手工计数，结果以及用于制备板的稀释因子用来计算每样品单位体积噬斑形成单位的数目(PFU/mL)。PFU/mL结果表示样品内感染性可复制颗粒的数目。
用于病毒抗原表达的测定法：技术人员已知的任何测定法可用于测量病毒抗原的表达。例如，可进行FFU测定法(如[00225]所述)。对于检测，使用针对各病毒抗原的单克隆或多克隆抗体制备物(转基因特异性FFU)。
此外，可进行蛋白质印迹法(如[00231]所述)。
动物模型：可在动物模型中测试包含表达本文所述CMV抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒或其组合物的疫苗的安全性、耐受性和免疫原性有效性。在某些实施方案中，可用来测试本文所用疫苗和其组合物的安全性、耐受性和免疫原性有效性的动物模型包括小鼠、豚鼠、大鼠和猴。在一个优选的实施方案中，可用来测试本文所述疫苗和其组合物的安全性、耐受性和免疫原性有效性的动物模型包括小鼠。
豚鼠模型：通过CMV的物种特异性难以实现HCMV疫苗的免疫原性和功效的临床前评价。然而，在豚鼠中，豚鼠CMV(GPCMV)不跨越胎盘引起类似于人类感染的先天感染(Bourne N等,JID 1996；Schleiss M等,JID2003)。此外，豚鼠胎盘的结构以及三月期样妊娠期与人的类似。另外，如在人类中一样，发生母体抗体的经胎盘传代。根据这些特征，豚鼠模型常用于评价疫苗策略。
为了研究针对先天性CMV感染的保护功效，可用试验疫苗候选物使Hartley豚鼠免疫，随后可允许免疫豚鼠交配。可通过触诊证实并监测豚鼠母的妊娠。可用GPCMV攻击妊娠母鼠，并且可在分娩时测量幼仔死亡率，并测定保护率。
在某些实施方案中，在人CMV抗原中加入来自其它病毒的异源结构域导致较高抗体水平的诱导。为了测试中和抗体的产生，可如下进行该测定法：在第0、21和42天使雌性豚鼠免疫3次。在最后一次疫苗剂量后2周，允许经免疫的豚鼠交配。在孕期40-50天用GPCMV攻击妊娠豚鼠。可通过ELISA和中和测定法分析接种疫苗的动物的血清，并可在攻击后获得血样用于通过实时PCR检测病毒血症。可监测母鼠直到分娩，并可详细分析后代的存活和条件。
在某些实施方案中，人CMV抗原中加入来自其它病毒的异源结构域导致较高抗体水平的诱导。
7.实施例
7.1沙粒病毒载体基因组/载体构建的设计
按照已确立的方法(美国专利申请公布号US 2010/0297172A1；和Flatz L.等,NatMed.2010March；16(3):339-345)，设计表达各CMV抗原或其某些结构域的rLCMV疫苗载体(图1)。
表达CMV gB的rLCMV载体的设计：为了产生表达CMV的gB抗原的rLCMV疫苗载体，设计编码gB蛋白的选定部分的各种rLCMV-gB载体构建体(图2)。代表性构建体包括编码以下的rLCMV载体：
·全长野生型gB(HK1-HgB(FL)，SEQ ID NO:1)，
·跨膜区缺失的(dTM)gB，其中氨基酸1-698与氨基酸775-906融合(HK1-HgB(dTM)，SEQ ID NO:4)，
·由gB的N端706个氨基酸组成的C端截短的gB(HK1-HgB(1-706)，SEQ ID NO:7)，
·由gB的N端691个氨基酸组成的C端截短的gB(HK1-HgB(1-691)，SEQ ID NO:10)，
·由gB的N端447个氨基酸组成的C端截短的gB(HK1-HgB(1-447)，SEQ ID NO:13)，
·由编码gB的胞外域和跨膜区的gB的N端772个氨基酸接着773位的人工精氨酸残基组成的C端截短的gB(HK1-HgB(dCt)，SEQ ID NO:16)，
·由gB的N端751个氨基酸接着水泡性口炎病毒G蛋白的C端49个氨基酸组成的gB构建体(HK1-HgB(VSVG-1)，SEQ ID NO:19)，
·由GB的N端706氨基酸接着水泡性口炎病毒G蛋白的C端49氨基酸组成的gB构建体(HK1-HgB(VSVG-2)，SEQ ID NO:22)，
·由gB的N端751个氨基酸接着流感血凝素H3的C端37个氨基酸组成的C端截短的gB(HK1-HgB(H3-1)，SEQ ID NO:25)，
·由gB的N端706个氨基酸接着流感血凝素H3的C端37个氨基酸组成的C端截短的gB(HK1-HgB(H3-2)，SEQ ID NO:28)。
由于CMV的物种特异性妨碍表达人CMV抗原的疫苗的动物功效研究，因此不仅产生编码人CMV(HCMV)的gB序列的rLCMV载体，而且还产生表达以下某些构建体的豚鼠CMV(GPCMV)的类似序列的相应载体：例如HK1-GPgB(FL)、HK1-GPgB(FLuc)、HK1-GPgB(dTM)、HK1-GPgB(dTMuc)、HK1-GPgB(1-706)、HK1-GPgB(1-691)、HK1-GPgB(1-447)、HK1-GPgB(dCt)。设计了类似于HK1-GPgB(FL)的HK1-GPgB(FLuc)，只是通过突变使位于gB的胞外域的弗林蛋白酶切割位点灭活。设计了类似于HK1-GPgB(dTM)的HK1-GPgB(dTMuc)，只是通过突变使位于gB的胞外域的弗林蛋白酶切割位点灭活。编码GPCMV抗原的载体构建体能够使在表现CMV疫苗开发金标准的豚鼠模型中的临床前免疫原性和功效研究成为可能。类似地，产生了允许各载体设计的快速和有成本效益预筛选的表达小鼠CMV gB的类似序列的构建体。
类似地，构建了表达来自人CMV的全长T细胞抗原pp65的rLCMV载体(HK1-Hpp65，SEQ ID NO:34)。另外，产生了表达豚鼠CMV(GPCMV)的类似序列的相应载体(HK1-GPpp65)。
另外，设计了表达由糖蛋白gH/gL、UL128、UL130和UL131A形成的CMV的五聚体复合物(PC)的不同部分的rLCMV载体。为了产生表达完整复合体的rLCMV载体，设计了编码被捷申病毒2A肽(T2A)序列分割开的5种蛋白质的多蛋白载体(图3)(Donnelly MLL等,2001；GaoSY等,2012；Kim JH等,2011)。选择自切割2A肽，因为它们的尺寸相对小，且显示2A肽的上游和下游基因间的高切割效率(Donnelly MLL等,2001；Gao SY等,2012；Kim JH等,2011)。
代表性构建体包含
·编码仅糖蛋白gH的载体(HK1-HgH，SEQ ID NO:37)
·编码糖蛋白gH的跨膜结构域缺失形式的载体(HK1-HgH(dTM)，SEQ ID NO:50)。
rLCMV载体构建体的衍生：rLCMV载体在cDNA序列衍生于其中的LCMV毒株和用于其拯救的质粒系统中可能不同。克隆13或MP毒株LCMV是用于载体衍生的2种可能的毒株。如图16-18所示，使用Hpp65、HgBdTM和GPgBdTM作为转基因，评价了比较rLCMV载体骨架、克隆13和MP对免疫应答诱导的研究。4种不同的方法/质粒系统可用于载体拯救。在一种方法中，病毒载体的短(S)和长(L)基因组区段的转录受鼠特异性RNA聚合酶I启动子和终止子的控制。聚合酶和NP蛋白在聚合酶II启动子的控制下从各构建体中表达。cDNA系统中GP被CMV抗原取代，接着在外在提供LCMV GP蛋白的鼠细胞中的4种质粒转染导致载体颗粒的形成，可从转染细胞上清液收获所述载体颗粒。在Flatz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006,103:4663中采用了该方法。
在第2种系统中，S(包括CMV抗原)和L区段的转录在T7启动子的控制下，这需要引入第5种质粒，其编码驱使从T7启动子表达的T7聚合酶。使用RNA聚合酶II启动子，病毒反式作用因子(NP和L)再次从不同质粒中共表达。该系统改编自Sanchez和de la Torre，Virology 2006July，350(2):370。
在第3种系统中，病毒载体的短(S)和长(L)基因组区段的转录受人RNA聚合酶I启动子和合适终止子控制。使用RNA聚合酶II启动子，病毒反式作用因子(NP和L)再次从不同质粒中共表达。
在第4种系统中，病毒载体的短(S)和长(L)基因组区段的转录受人RNA聚合酶I启动子和合适终止子控制。在同一质粒上，病毒反式作用因子的转录受聚合酶II启动子驱使，该启动子被设计成以相反方向定位以驱动来自NP的正链RNA和来自同一模板的L ORF的转录。之前使用这类方法产生重组流感病毒，该方法描述于Hoffmann E等,2000。上述所有rLCMV载体可按照已确立的方法产生(美国专利申请公布号US 2010/0297172A1；和FlatzL.等,Nat Med.2010March；16(3):339-345))。也可采用其它方法；例如还可使用不同的质粒系统、不同的细胞和不同的转染方法产生本文提供的沙粒病毒载体。
7.2载体表征
表达CMV gB的rLCMV载体的表征：所产生的载体构建体的表征包括病毒复制和宿主细胞的特定感染性的分析(图4)。
图4显示载体构建体HK1-HgB(FL)、HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(706)、HK1-HgB(691)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)、HK1-HgB(H3-1)和HK1-HgB(H3-2)的病毒滴度和感染性。各载体构建体显示与表达绿色荧光蛋白的对照LCMV载体(HK1-GFP)相当的类似峰值滴度和感染性，表明了因转基因的大小和性质所致对载体产生没有消极影响。
为了分析载体复制，使用表达LCMV GP的悬浮HEK 293细胞，绘制生长曲线。各细胞以3x105个细胞/ml的细胞密度接种，并以0.001的MOI用各载体(HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(H3-2)和HK1-HgB(691))感染。每24小时抽取样品，并通过FFU测定法分析(图5)。与HK1-GFP相比，所有测试的载体显示类似的生长动力学和峰值滴度，表明各gB转基因不干扰载体复制至比小报道基因GFP更大的程度。
对于所有所测试的构建体，采用蛋白质印迹实验以证实gB抗原的存在，图6显示了示例性数据。预期全长gB的未切割前体在～160kDa处形成条带，而切割的gB由通过二硫键与跨膜组分(估计分子量为55kDa)连接的表面组分(估计分子量为116kDa)组成。然而，由于单克隆第一抗体的使用，预期在印迹上只可观察到代表未切割gB蛋白和gB的较小切割产物的2条带。全长gB(泳道7)在～160kDa的预期范围内形成条带，而所有其余的构建体显示较小的条带，这可通过gB胞质域的至少一部分缺失或交换来解释。类似地，在～60kDa(比预期的略高)处的全长gB(泳道7)条带的跨膜部分和所有gB衍生物显示较小的切割产物。一般来说与所有其它的相比，HK1-gB(FL)和HK1-gB(dTM)显示较弱的gB条带。
HK1-GPgB(FL)、HK1-GPgB(dTM)和HK1-GPgB(dTMuc)的免疫原性的比较：接下来，分析并比较了小鼠中HK1-GPgB(FL)、HK1-GPgB(dTM)和HK1-GPgB(dTMuc)的免疫原性(图7)。在实验的第0、21和42天，用6.7x104FFU/剂的各载体皮下使C57BL/6小鼠免疫。在实验的第21、42和63天收集免疫小鼠的血清，通过ELISA测量抗gB抗体滴度。表达绿色荧光蛋白的类似rLCMV载体(HK1-GFP)用作对照。以9.2x105FFU/注射的浓度使用对照载体。
在小鼠中皮下注射后，HK1-GPgB(dTM)和HK1-GPgB(dTMuc)比HK1-GPgB(FL)诱导显著更高的抗体滴度。
通过肌内或皮下途径以不同浓度给予的HK1-GPgB(dTM)疫苗载体的免疫原性的比较：接下来，系统分析了当以不同的剂量和不同的注射途径给予时HK1-GPgB-dTM的免疫原性(图8A和B)。
这些分析表明与皮下给予相比，在肌内注射HK1-GPgB-dTM诱导更高的抗体应答(图8A)。在所测试的免疫剂量中，2x106和6.7x104FFU/剂的疫苗剂量导致相当的高抗体滴度。
肌内和皮内途径的免疫的比较。在采用肌内和皮内途径用不同浓度的HK1-HgB(dCt)(图8C)或HK1-Hpp65(图8D)免疫后，对体液以及CD8+T细胞应答的诱导进行了分析。各个结果表明以5.6x105FFU剂量的皮内途径相比，通过肌内诱导显著更高滴度的抗原特异性抗体(图8C，第1和3组)，表明了当疫苗通过皮内途径给予时，无法实现剂量利用效果(dosesparing effect)。类似地，与6,7x105FFU剂量的皮内免疫相比，在肌内注射后观察到较高的CD8+T细胞应答(图8D，第1和3组)。
HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(1-706)、HK1-HgB(1-691)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(H3-1)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)和与佐剂混合的重组gB蛋白的免疫原性的比较：在小鼠中分析了HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(1-706)、HK1-HgB(1-691)、HK1-HgB(dCt)、HK1-HgB(H3-1)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HK1-HgB(VSVG-2)和与佐剂混合的重组gB蛋白的免疫原性。在实验的第0和21天，用1x105FFU/剂的各载体或5μg的1:1与佐剂混合的重组gB蛋白，肌内使C57BL/6小鼠免疫。在各疫苗剂量前在第0、21天以及以3周的间隔在实验的第42、63、84和105天，收集免疫小鼠的血清。针对抗HCMVgB IgG抗体的水平通过ELISA，并针对中和抗体的存在在ARPE-19细胞中通过中和测定法，测试了所产生的血清。
各ELISA数据的统计分析(图9)显示重组gB蛋白(与佐剂混合)和所有测试的rLCMV-gB构建体相当的抗体诱导。另外，所得结果表明在2次免疫后已实现非常持久的免疫应答，因为在第二次免疫后抗体水平达到平台。
所诱导抗体的功能性：为了测试所诱导抗体的功能性，在ARPE-19细胞中通过中和测定法，对接种疫苗的动物的血清进行了进一步的分析。在上皮ARPE-19细胞中，测量了在第42天收集的存在于免疫小鼠血清中的诱导抗体的中和活性(图10)。各个结果表明同与佐剂混合的重组亚基gB蛋白相比，所有测试的rLCMV-gB构建体诱导更高的HCMV中和抗体水平。然而，与所有其它测试的rLCMV-gB载体相比，HgB(dTM)诱导显著更低的HCMV中和抗体水平。
各IgG亚类的分析：通过HCMVgB特异性IgG亚类ELISA，分析在第42天收集的选定实验组(用HK1-HgB(dTM)、HK1-HgB(1-706)、HK1-HgB(1-691)、HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)和与佐剂混合的重组gB蛋白接种疫苗)的血清(图11)。各分析显示通过rLCMV-gB构建体IgG2c的占主导的诱导，而与佐剂混合的重组gB蛋白主要诱导IgG1。该数据表明通过rLCMV-gB载体的偏重1型的免疫应答诱导，这似乎与由gB亚基蛋白质诱导的偏重2型的显著不同。
豚鼠的免疫原性：在实验的第0、21和42天，通过用不同浓度(1.54x107、1.54x106、1.54x105和1.54x104FFU/剂)的HK1-GPgB-dTM肌内注射，使Hartley豚鼠中HK1-GPgB(dTM)免疫。出于对照目的，1只动物不接受疫苗或缓冲液。在实验的第0、21、42和63天收集免疫动物的血清，通过GPgB特异性IgG ELISA分析抗GPgB抗体滴度。GPCMV阳性血清用作对照。
ELISA数据显示，早在单次肌内免疫(初免)后，HK1-GPgB(dTM)以剂量依赖性方式，诱导相当程度的抗GPgB抗体应答(图12)。当在初免后3周再次给予同一载体时，可有效地加强这些应答，并且对于HK1-GPgB(dTM)的3个最高剂量(1.54x107、1.54x106、1.54x105)在2次注射后达到IgG应答的平台。所达到的值类似于所用的对照血清(用1x105pfu GPCMV得到30dpi)。通过最低剂量组(1.54x104)诱导显著较低的应答。
通过噬斑减少测定法，针对病毒中和抗体的存在对各个血清进行进一步分析(图13)。结果显示在用HK1-GPgB(dTM)免疫时，在豚鼠中诱导中和抗体。各个数据表明诱导稳固的中和抗体所需要的HK1-GpgB(dTM)的≥1.54x105范围的最低剂量。根据可获得的数据，选择1.54x106FFU的剂量以研究在GPCMV感染的先天模型中HK1-GpgB(dTM)的保护作用(对照图23)。
表达CMV pp65的rLCMV载体的表征：为了表征所产生的HK1-Hpp65载体的生长动力学和感染性，将表达LCMV GP的HEK 293悬浮细胞用HK1-Hpp65以MOI＝0.001感染。在感染后的规定时间点(2小时、24小时、48小时、72小时和96小时)，抽取细胞上清液的样品，并通过FFU测定法和qPCR分析(图14)。
图14中的数据显示载体构建体HK1-Hpp65和对照载体HK1-GFP的相当的复制动力学、峰值滴度和感染性，表明了pp65抗原不会消极影响载体生长或感染性。在较后的时间点上观察到较低的颗粒感染性比率。
为了证实pp65抗原的表达，将表达LCMV GP的HEK 293悬浮细胞用HK1-Hpp65或阴性对照载体HK1-GFP感染，在感染后96小时收获并裂解，随后使用单克隆抗HCMV pp65第一抗体和合适的碱性磷酸酶缀合的第二抗体通过蛋白质印迹法进行分析(图15)。
接下来，在C57BL/6小鼠中分析HK1-Hpp65和HK3-Hpp65的免疫原性以检查不同的LCMV载体骨架(HK1(克隆13)、HK3(MP))的作用。用1x104FFU目标剂量的HK1-Hpp65(第1组)或HK3-Hpp65(第2组)，给C57BL/6小鼠i.m.接种(50μL/大腿；共100μL/小鼠)。未接种疫苗的小鼠用作对照(第7组)。在注射后第10天通过流式细胞术测定细胞免疫应答的诱导，分析CD4+和CD8+T细胞的细胞因子产生(IL-2、IFN-g、TNF-a)。使用Hpp65肽库(根据ShedlockD.J.等；Human Vaccines&Immunotherapeutics2012)用于脾细胞的再刺激。
在单次肌内注射后，HK1-Hpp65和HK3-Hpp65诱导相当程度的HCMV特异性CD8+(andCD4+)T细胞应答。单次注射后10天分析的CD8+T细胞应答的频率高于针对CD4+T细胞应答所观察到的(分别为图16A和B)。根据载体骨架(HK1或HK3)，在所观察到的CD4+T细胞的诱导中没有差异。相比之下，与HK3-Hpp65相比，通过HK1-pp65诱导更高的CD8+T细胞应答。(C)在之前用HK1-HgB(dTM)免疫2次(之前8和4周；即实验的第0和28天)的小鼠中，在用HK1-Hpp65(第3组)和HK3-Hpp65(第4组)的单次肌内注射(实验的第56天)后10天(实验的第66天)，观察到相似程度的HCMV特异性CD8+T细胞应答。各个结果表明由于之前用相同的载体骨架免疫所致，载体-免疫不损害抗原特异性CD8+T细胞应答的诱导。
还使用GPgBdTM(图17)和HgBdTM(图18)作为转基因，评价了rLCMV载体骨架、HK1(克隆13)或HK3(MP)对免疫应答诱导的作用。
为了检查不同的载体骨架对GPgB-dTM构建体的免疫原性的作用，在第0和28天用各载体的1x104FFU的目标剂量给C57BL/6小鼠i.m.接种疫苗。在各疫苗剂量之前(第0、28天)以及在最后一次(第二次)注射后4周(第56天)得到各动物的血清。通过ELISA测试所有血清的GPgB特异性IgG抗体的水平；ELISA数据表示为几何平均GPgB特异性IgG终点滴度。图17中提供的数据的统计分析表明通过HK1-GPgB(dTM)的应答诱导优于HK3-GPgB(dTM)。
为了检查不同的载体骨架对HgB-dTM构建体的免疫原性的作用，在第0和28天用各载体的1x104FFU的目标剂量给C57BL/6小鼠i.m.接种疫苗。在各疫苗剂量之前(第0、28天)以及在最后一次(第二次)注射后4周(第56天)得到各动物的血清。通过ELISA测试所有血清的HgB特异性IgG抗体的水平；ELISA数据表示为几何平均HgB特异性IgG终点滴度。图18中提供的数据的统计分析表明通过HK1-HgB(dTM)和HK3-HgB(dTM)的应答诱导无显著不同。
为了测定与HEK 293T细胞一起使用的最佳LCMV毒株，如图19所示，以500,000个细胞/孔的密度将HEK 293T细胞接种在M6孔培养孔中。次日，以0.05的感染复数通过MP、Pasteur、克隆13和WE54毒株使之感染。在规定的时间点收获上清液，并通过免疫聚焦测定法测定病毒滴度。符号表示2个孔的均值。
兔中HK1-HgB(dCt)的免疫原性：在实验的第0和28天，用不同浓度(2.0x102、4.4x104和4.5x106FFU/剂)的HK1-HgB(dCt)通过肌内注射使新西兰白兔免疫。在实验的第0、28和42天收集免疫动物的血清，并通过HgB特异性IgG ELISA分析抗HgB抗体滴度。
ELISA数据显示早在单次肌内免疫(初免)后，较高剂量(4.4x104和4.5x106FFU/剂)的HK1-HgB(dCt)以剂量依赖性方式诱导相当程度的抗HgB抗体应答(图20)。当在初免后4周给予同一载体时这些应答可被有效加强。与在第28和42天的4.4x104FFU/剂相比，注射4.5x106FFU/剂的HK1-HgB(dCt)诱导统计显著性较高的抗体应答。
抗体应答的持续时间和不同免疫时间表的比较：有关在用HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)和与佐剂混合的重组gB蛋白(图21A)或HK1-HgB(H3-2)、HK1-HgB(VSVG-1)、HgB(dTM)、HK1-HgB(dCt)和与佐剂混合的重组gB蛋白(图21B)免疫时诱导的抗体应答的水平以及持续时间，对不同的注射时间表进行了比较。在实验的第0、21和42天(图21A)或在第0、21和105天(图21B)，用1x105FFU/剂的各载体或5μg与佐剂1:1混合的重组gB蛋白肌内使C57BL/6小鼠免疫。在实验的第21、42、63、91、119、147和175天(图21A)或第21、42、63、84、105和126天(图21B)，收集免疫小鼠的血清。通过ELISA测试所产生的血清的抗HCMVgB IgG抗体的水平。各ELISA数据表明，通过2次免疫可实现最大抗体水平，且诱导的体液应答非常持久。
通过同时注射2种载体无负干扰：为了研究不同LCMV载体构建体的潜在干扰，在用仅HK1-HgB(dCt)、仅HK1-Hpp65或同时注射的HK1-HgB(dCt)和HK1-Hpp65免疫后，分析了B细胞和CD8+T细胞应答的诱导。在第0和28天用9x104FFU/剂的仅HK1-HgB(dCt)、9x104FFU/剂的仅HK1-Hpp65或9x104FFU/剂的HK1-HgB(dCt)和HK1-Hpp65每一种一起肌内使C57BL/6小鼠免疫。在第1次注射后49天，监测抗HCMVgB抗体(图22A)或pp65特异性CD8+T细胞应答(图22B)的诱导。在单价(仅HK1-HgB(dCt)或HK1-Hpp65)和二价(HK1-HgB(dCt)和HK1-Hpp65)疫苗之间可观察到在抗HCMVgB抗体水平(图22A)或pp65特异性CD8+T细胞应答(图22B)方面无显著差异，表明了当两种rLCMV载体混合并共注射时没有负干扰。
在豚鼠模型中LCMV载体保护幼仔免于先天性CMV感染：通过CMV的物种特异性，难以实现针对HCMV疫苗的先天性CMV感染保护功效的临床前评价。然而，豚鼠CMV(GPCMV)的确跨越胎盘引起类似于人类感染的先天感染(Bourne N等,JID 1996；Schleiss M等,JID2003)。另外，豚鼠中胎盘的结构以及三月期样孕期和母体抗体经胎盘通过与人的相似。根据这些特征，豚鼠模型是用于评价针对先天感染的CMV疫苗功效的最佳可得的动物模型。
在第0、21和42天用HK1-GPgB(dTM)、HK1-GPpp65或缓冲液(对照组)，肌内使Hartley豚鼠免疫3次。在最后1次疫苗剂量后约2周，允许免疫豚鼠交配。在妊娠～45天用GPCMV攻击妊娠豚鼠，随后监测直到分娩。后代的存活分析显示在交配前用仅HK1-GPgB(dTM)(p＝0.026)或HK1-GPpp65(p＝0.032)免疫的母鼠中幼仔死亡率显著降低(图23)。可预期在用表达gB和pp65的rLCMV载体构建体的组合接种后较高的保护率。参见例如图28。
为了测定rLCMV载体的安全性(毒力和病毒复制)，在第0天用HK3-Hpp65或HK3-Mpp65(一种复制缺陷型LCMV载体，来源于表达小鼠CMV的pp65抗原的LCMV的MP毒株)，给高度易感LCMV感染的特定小鼠大脑内接种。随后针对病征监测小鼠。如果生病，则分析在第28天或更早收集的脑组织中复制病毒的存在。
在大脑内接种不同剂量的HK3-Hpp65或HK3-Mpp65后28天，在AG129小鼠中无法观察到疾病和病毒复制，所述小鼠是IFNα/β和γ受体缺陷型，因此高度易感LCMV感染(图24A)。相比之下，接种野生型LCMV的AG129小鼠显示疾病病征，因此在第7天使之安乐死。
类似地，在大脑内接种不同剂量的HK3-Hpp65或HK3-Mpp65后28天，在T和B细胞缺陷型RAG-/-小鼠中无法观察到病毒复制，该小鼠也高度易感LCMV感染(图24B)。在接种野生型LCMV的RAG-/-小鼠中，可观察到高剂量的复制病毒。
豚鼠中HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65的免疫原性
在实验的第0、31和72天(第1组)/第0、31和70天(第2组)/第0、34和70天(第3组)，通过用8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)(第1组)、8x105FFU/剂的HK1-GPpp65(第2组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65每一种(第3组)肌内注射，使Hratley豚鼠(18只动物/组)免疫。另外，在第0、46和76天，通过用在完全弗氏佐剂(第4组)中配制的50μg亚基gB蛋白使Hartley豚鼠(18只动物/组)免疫。在实验的第0、28、52、103和155天收集免疫动物的血清，使用具有规定抗gB抗体滴度的血清库作为参比标准，通过GPgB特异性IgG ELISA分析抗GPgB抗体滴度。
ELISA数据显示早在单次免疫后，HK1-GPgB(dCt)便诱导相当程度的抗GPgB抗体应答(图25)。在第一疫苗接种后1个月再次给予相同载体时，可有效地加强这些应答。通过用仅HK1-GPgB(dCt)免疫诱导的抗GPgB抗体应答与在用与HK1-GPpp65组合的HK1-GPgB(dCt)接种后诱导的应答处于相同的范围。重要的是，与用在完全弗氏佐剂中配制的亚基gB蛋白免疫后相比，在用HK1-GPgB(dCt)免疫后刺激显著较高水平的抗GPgB抗体。
中和数据
在GPL细胞中通过中和测定法针对病毒中和抗体的存在，对各血清进行进一步分析(图26)。结果显示，在用仅HK1-GPgB(dCt)(第1组)或与HK1-GPpp65组合的HK1-GPgB(dCt)(第3组)免疫时，在豚鼠中诱导中和抗体。与ELISA数据(图25)一致，与在完全弗氏佐剂中配制的亚基gB蛋白相比，HK1-GPgB(dCt)显著(P<0.0001，未配对t检验)诱导较高水平的中和抗体。出乎意料地，HK1-GPgB(dCt)与HK1-GPpp65的组合(第3组)显著(P＝0.0003，未配对t检验)比仅HK1-GPgB(dCt)(第1组)诱导更强效的中和血清。
T细胞数据
为了分析接种疫苗的动物中pp65特异性T细胞应答的诱导，从用8x105FFU/剂的HK1-GFP(第1组)、8x105FFU/剂的HK1-GPpp65(第2组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65(第3组)每一种肌内免疫的Hartley豚鼠中分离脾细胞。在2剂疫苗后，将各疫苗组(第1组、第2组和第3组)的3只动物处死(分别在第2剂疫苗后43、40和37天将动物处死)。在第3剂后7天处死各疫苗组的其它3只动物，以分析与2个剂量的疫苗相比第3次疫苗剂量是否进一步加强pp65特异性T细胞应答。
使用用于再刺激的pp65肽库，通过ELISPOT测定法分析分离的脾细胞。设计各个肽(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以在9个氨基酸长的片段中以5个氨基酸重叠跨越pp65(共140种肽)。将肽分配在含有11或12种肽的库中。对于各个肽库，各动物反应的幅度是在肽再刺激的脾细胞和用DMSO(溶媒)对照再刺激的脾细胞之间是累积不同的(“曲线下面积”)。
如图27A所示，在用仅HK1-GPpp65接种的动物(第2组)中以及在用与HK1-GPgB(dCt)组合的HK1-GPpp65接种的动物(第3组)中诱导pp65特异性IFN-γ的脾细胞的产生。在2个疫苗组中，与2次剂量相比，在3次疫苗剂量后观察到产生较高平均数目的pp65特异性IFN-γ的脾细胞。
虽然在2或3剂的疫苗后，小组大小(n＝3)妨碍疫苗组间的直接统计比较，但是可在综合疫苗接种组间进行统计分析，即综合各疫苗(第1组、第2组和第3组)的2剂量组和3剂量组的数据(图27B)。各个分析显示与HK1-GFP对照(第1组)相比，用HK1-GPpp65接种的动物(第2组)每只动物的pp65特异性脾细胞数目显著增加。类似地，与HK1-GFP对照(第1组)相比，HK1-GPgB(dCt)/HK1-GPpp65疫苗组(第3组)的pp65特异性脾细胞数目也显著增加。未能观察到疫苗组2和3之间的统计显著性差异，表明gB不干扰pp65应答。
保护数据
LCMV载体在豚鼠模型中保护幼仔免于先天性CMV感染。通过CMV的物种特异性，难以进行针对HCMV疫苗的先天性CMV感染的保护功效的临床前评价。然而，豚鼠CMV(GPCMV)的确跨越胎盘引起类似于人类感染的先天感染(Bourne N等,JID 1996；Schleiss M等,JID2003)。另外，豚鼠中胎盘的结构以及三月期样孕期和母体抗体经胎盘通过与人的类似。根据这些特征，豚鼠模型是用于评价针对先天感染的CMV疫苗功效的最佳可得的动物模型。
用8x105FFU/剂的HK1-GFP(第1组)、8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)(第2组)、8x105FFU/剂的HK1-GPpp65(第3组)或8x105FFU/剂的HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65每一种(第4组)肌内使Hartley豚鼠(18只动物/组)免疫3次(在第0、～30和～70天)。在最后一次疫苗剂量后约1个月，允许免疫豚鼠交配。通过触诊证实并监测母豚鼠的妊娠。在妊娠期的第三个三个月内用GPCMV攻击妊娠母鼠，随后监测直到分娩。后代的存活分析(图28)显示与对照组相比，用仅HK1-GPgB(dCt)或HK1-GPpp65免疫的母鼠中幼仔死亡率降低。用HK1-GPgB(dCt)接种赋予比HK1-GPpp65更好的保护。在用HK1-GPgB(dCt)和HK1-GPpp65的组合后，可观察到甚至更高的保护率。对照组(第1组)中的高死亡率表示严酷的挑战条件。
等同内容和通过引用的结合：本文所述实施方案只是示例性的，本领域技术人员应认识到或能够只是采用例行实验便能够确定本文所述具体方法的多种等同方法。所有这类等同方法被视为在本发明的范围内，并且被随后的实施方案所涵盖。本文引用的所有参考文献(包括专利申请、专利和出版物)均通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的到如同各个出版物或专利或专利申请具体而单独指明通过引用以其整体予以结合用于所有目的的相同程度。
Claims (90)
1.经改造以含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被除去并被选自以下核苷酸序列取代：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
2.权利要求1的病毒载体，其中所述糖蛋白gB或其抗原片段包含与SEQ ID NO:3、SEQID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQID NO:24、SEQ ID NO:
27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:63有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1的病毒载体，其中所述pp65抗原与SEQ ID NO:36的pp65抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
4.权利要求1的病毒载体，其中所述糖蛋白gH与选自SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:52的gH抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
5.权利要求1的病毒载体，其中所述糖蛋白gL与SEQ ID NO:41的gL抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
6.权利要求1的病毒载体，其中所述UL128与SEQ ID NO:43的UL128抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
7.权利要求1的病毒载体，其中所述UL130与SEQ ID NO:46的UL130抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
8.权利要求1的病毒载体，其中所述UL131A与SEQ ID NO:48的UL131A抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
9.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少两种：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的2种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
10.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少3种：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的3种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
11.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少4种：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的4种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
12.权利要求1的病毒载体，其包含：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中上述a至e的5种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。
13.权利要求9、10、11或12的病毒载体，其中所述核苷酸序列的表达产生抗原性蛋白质复合物，其比蛋白质复合物组分分别表达诱导更高滴度的中和抗体。
14.权利要求9、10、11或12的病毒载体，其中所述自切割肽(或“核糖体跳跃”序列)是猪捷申病毒-1 2A、明脉扁刺蛾β四体病毒2A或口蹄疫病毒2A肽。
15.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。
16.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中编码沙粒病毒的糖蛋白的可读框缺失或功能性失活。
17.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中编码感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13毒株。
18.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中编码感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒MP毒株。
19.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述病毒载体包含基因组区段，其中所述基因组区段包含与SEQ ID NO:31的核苷酸1639-3315或SEQ ID NO:32的1640-3316的序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
20.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述病毒载体含有包含编码这样的表达产物的核苷酸序列的基因组区段，所述表达产物的氨基酸序列与由SEQ ID NO:31的1639-3315或SEQ ID NO:32的1640-3316编码的氨基酸序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性。
21.包含编码巨细胞病毒糖蛋白gB的核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域被异源肽取代；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源肽取代。
22.权利要求21的病毒载体，其中所述异源肽包含病毒蛋白质的胞质域和跨膜结构域。
23.权利要求21的病毒载体，其中所述异源肽是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。
24.权利要求21或23的病毒载体，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。
25.权利要求21或23的病毒载体，其中所述gB蛋白的羧基端被截短。
26.权利要求1-24中任一项的病毒载体，其中所述沙粒病毒的生长或感染性不受异源核酸影响。
27.包含编码巨细胞病毒糖蛋白gB的核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域缺失；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域缺失。
28.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。
29.免疫原性组合物，其包含权利要求1-27中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。
30.疫苗，其包含权利要求1-27中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。
31.治疗或预防患者的巨细胞病毒感染的方法，其中所述方法包括给予患者权利要求1-27中任一项的病毒载体、权利要求28的药物组合物、权利要求29的免疫原性组合物或权利要求30的疫苗。
32.权利要求1-27中的免任一项的病毒载体、权利要求28的药物组合物、权利要求29疫原性组合物或权利要求30的疫苗用于治疗或预防患者的巨细胞病毒感染的用途。
33.权利要求32的用途，其中所述权利要求1-27中任一项的病毒载体、权利要求28的药物组合物、权利要求29的免疫原性组合物或权利要求30的疫苗适于肌内注射。
34.核酸，其包含编码包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽的融合蛋白的核苷酸序列。
35.权利要求34的核酸，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域被异源肽的胞质域取代；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源肽的胞质域和跨膜结构域取代。
36.权利要求34或35的核酸，其中所述异源蛋白质是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。
37.权利要求34或35或36的核酸，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。
38.融合蛋白，其包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽。
39.权利要求38的融合蛋白，其中所述糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。
40.权利要求38或39的融合蛋白，其中所述异源蛋白质是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。
41.权利要求38或39或40的融合蛋白，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。
42.药物组合物，其包含权利要求34或35或36或37的核酸或权利要求38或39或40或41的融合蛋白。
43.分离的核酸，其中所述核酸编码沙粒病毒基因组区段，其中基因组区段的一个可读框缺失或功能性失活且其中所述基因组区段包含以下的一个或多个：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
44.权利要求43的分离的核酸，其中所述基因组区段是短区段，其中编码GP的可读框缺失。
45.权利要求43或44的分离的核酸，其中所述基因组区段包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽。
46.权利要求45的分离的核酸，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。
47.权利要求46的分离的核酸，其中所述异源蛋白质是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。
48.权利要求47的分离的核酸，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。
49.用于产生感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的方法，所述方法包括：
a.将权利要求43、44、45、46、47或48中任一项的核酸转染至宿主细胞中；
b.将宿主细胞在适于病毒形成的条件下维持；和
c.收获感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体；
其中所述宿主细胞表达基因组区段缺失或功能性失活的可读框。
50.重组LCMV毒株MP。
51.分离的核酸，其编码选自以下氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:54至少99％或100％同一性；(ii)与SEQ ID NO:55至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；(iii)与SEQ ID NO:56至少96％、97％、98％、99％或100％同一性；和(iv)与SEQ ID NO:57至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
52.表达载体，其包含编码选自以下氨基酸序列的核酸：(i)与SEQ ID NO:54至少99％或100％同一性；(ii)与SEQ ID NO:55至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；(iii)与SEQ ID NO:56至少96％、97％、98％、99％或100％同一性；和(iv)与SEQ ID NO:57至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
53.宿主细胞，其包含编码选自以下氨基酸序列的核酸：(i)与SEQ ID NO:54至少99％或100％同一性；(ii)与SEQ ID NO:55至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；(iii)与SEQ ID NO:56至少96％、97％、98％、99％或100％同一性；和(iv)与SEQ ID NO:57至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
54.分离的蛋白质，其包含选自以下氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:54至少99％或100％同一性；(ii)与SEQ ID NO:55至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；(iii)与SEQ ID NO:56至少96％、97％、98％、99％或100％同一性；和(iv)与SEQ ID NO:57至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
55.与包含选自以下氨基酸序列的蛋白质免疫特异性结合的抗体：(i)与SEQ ID NO:54至少99％或100％同一性；(ii)与SEQ ID NO:55至少94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；(iii)与SEQ ID NO:56至少96％、97％、98％、99％或100％同一性；和(iv)与SEQ ID NO:57至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
56.分离的核酸，其包含SEQ ID NO:49或53的核苷酸序列。
57.表达载体，其包含权利要求56的核酸。
58.宿主细胞，其包含权利要求56的核酸或权利要求57的表达载体。
59.重组病毒载体，其包含权利要求56的核苷酸序列。
60.疫苗组合物HCMV gB蛋白，其中HCMV gB的胞质域缺失。
61.权利要求60的疫苗，其中所述截短的HCMV gB包含gB毒株Merlin的N端772个氨基酸(SEQ ID NO:60)但不含gB毒株Merlin的剩余的C端氨基酸。
62.权利要求60的疫苗，其中所述截短的HCMV gB基本上由gB毒株Merlin的N端772个氨基酸(SEQ ID NO:60)组成。
63.权利要求60的疫苗，其中所述截短的HCMV gB基本上由gB毒株Merlin的N端772个氨基酸(SEQ ID NO:60)接着773位的精氨酸残基组成。
64.权利要求60的疫苗，其中所述截短的HCMV gB包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、至少99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
65.权利要求1的沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框是糖蛋白(GP)可读框。
66.经改造以含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被去除并被编码CMV抗原或其抗原片段的核苷酸序列取代，其中将沙粒病毒病毒载体给予受试者诱导针对CMV抗原或其抗原片段的持久的免疫应答。
67.权利要求66的沙粒病毒病毒载体，其中所述持久免疫应答诱导针对CMV糖蛋白gB或其抗原片段的可检出的抗体滴度。
68.权利要求66的沙粒病毒病毒载体，其中所述持久免疫应答诱导针对CMV抗原或其抗原片段的可检出的抗体滴度达至少最少4周。
69.权利要求66或66的沙粒病毒病毒载体，其中所述持久免疫应答提高针对CMV抗原或其抗原片段的抗体滴度达至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。
70.经改造以含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被去除并被编码CMV抗原或其抗原片段的核苷酸序列取代，其中所述沙粒病毒病毒载体适于防止先天性CMV感染。
71.权利要求70的沙粒病毒病毒载体，其中所述先天性CMV感染是有症状的。
72.权利要求70的沙粒病毒病毒载体，其中所述先天性CMV感染是无症状的。
73.权利要求70-72中任一项的沙粒病毒病毒载体，其中所述沙粒病毒载体降低受试者的先天性CMV感染达至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。
74.权利要求70-73中任一项的沙粒病毒病毒载体，其中所述沙粒病毒病毒载体减轻先天性CMV的表现。
75.权利要求74的沙粒病毒载体，其中所述表现包括因先天性CMV感染所致的智力迟钝、失明和感音神经性聋、小头畸形、脉络膜视网膜炎、颅内钙化、肝脾大、肝炎、黄疸、高直接胆红素血症、血小板减少、瘀点、羊水过少、羊水过多、早熟、宫内发育迟缓、非免疫性水肿、胎儿腹水、张力过低和贫血。
76.药物组合物，其包含经改造含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的第一感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被去除并被选自以下的核苷酸序列取代：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
和经改造含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的第二感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被去除并被选自以下的第二核苷酸序列取代：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。
77.权利要求76的药物组合物，其中所述第一和第二核酸序列不相同。
78.权利要求76或77的药物组合物，其中所述第一核酸序列编码CMV主要包膜糖蛋白gB或其片段，且其中所述第二核酸序列编码CMV被膜蛋白pp65或其片段。
79.权利要求76或77的药物组合物，其中所述第一CMV抗原是CMV被膜蛋白pp65或其片段，且其中所述第二CMV抗原是CMV主要包膜糖蛋白gB或其片段。
80.权利要求76或77的药物组合物，其中所述第一核酸序列编码羧基端截短的CMV主要包膜糖蛋白gB，且其中所述第二核酸序列编码CMV被膜蛋白pp65或其片段。
81.权利要求76或77的药物组合物，其中所述第一CMV抗原是CMV被膜蛋白pp65或其片段，且其中所述第二CMV抗原是羧基端截短的CMV主要包膜糖蛋白gB。
82.权利要求80或81的药物组合物，其中羧基端截短的糖蛋白gB在截短的全长gB内与SEQ ID NO:3的氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或至少100％同一性，其中截短处于SEQ ID NO:3的氨基酸772-906的区域中。
83.权利要求82的药物组合物，其中所述截短或缺失为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134个氨基酸长。
84.权利要求76或77的药物组合物，其中所述第一核酸序列编码CMV五聚体复合物抗原或其片段，且其中所述第二核酸序列编码CMV抗原五聚体复合物抗原或其片段。
85.权利要求76或77的药物组合物，其中所述第一核酸和所述第二核酸包含(c)-(g)的两种或更多种。
86.权利要求76-85中任一项的药物组合物，其中所述组合物适于肌内给予。
87.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少两种：
a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；
b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；
c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；
d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和
e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，
其中选自上述a至e的3种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列、弗林蛋白酶切割位点、肽标签或序列间隔物分隔开来。
88.免疫原性组合物，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、98％或至少99％同一性的多肽，其中所述多肽在SEQ ID NO:3的氨基酸772-906区域中具有截短或缺失，其中测定在多肽全长内的百分比同一性。
89.权利要求88的免疫原性组合物，其中所述截短或缺失为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、29、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134个氨基酸长。
90.权利要求49的方法，所述方法另包括在步骤a中将以下转染至宿主细胞中：第二沙粒病毒基因组区段的cDNA、编码L蛋白ORF的核酸和/或编码NP蛋白ORF的核酸。
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