CN107223130A - 作为疫苗载体的三片段沙粒病毒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及在其基因组中具有开放阅读框(“ORF”)重排的沙粒病毒。特别地，本文描述的是修饰的沙粒病毒基因组片段，其中所述沙粒病毒基因组片段被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带病毒ORF。本文还描述的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段、或两个L片段和一个S片段。本文描述的沙粒病毒可以适合于疫苗和/或治疗疾病和/或用于免疫治疗。

Description

作为疫苗载体的三片段沙粒病毒
本申请要求2014年11月13日提交的美国临时申请号62/079,493的优先权，通过引用将其全部合并在本文中。
1.引言
本申请涉及在其基因组中具有开放阅读框(“ORF”)重排的沙粒病毒。特别地，本文描述的是修饰的沙粒病毒基因组片段，其中所述沙粒病毒基因片段被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带病毒ORF。本文还描述的是三片段的沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段、或两个L片段和一个S片段。本文描述的沙粒病毒可以适合于疫苗和/或治疗疾病和/或用于免疫治疗。
2.背景
2.1淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒研究与人类疾病
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)是沙粒病毒科的成员，是病毒感染研究中的原型小鼠模型病毒。自1930年代分离出该病毒以来(Rivers and McNair Scott,1935,Science,81(2105):439-440)，利用这一病毒的研究已经揭示了病毒免疫学和病理方面的许多关键概念(在Zinkernagel,2002,Curr Top Microbiol Immunol,263:1-5；Oldstone,2002,Curr Top Microbiol Immunol,263:83-117中概述)。LCMV已经广泛用于研究病毒分子生物学和免疫反应，特别是在持续感染的情况下。LCMV的天然宿主是小鼠，然而几项报告显示LVMC可能也是被忽视的人类病原体(Barton,1996,Clin.Infect.Dis,22(1):197；Wright et al.,1997,Pediatrics 100(1):E9)。此外，已经在全世界的啮齿动物群体中发现沙粒病毒科的许多其他成员。除了可以在非洲找到的旧世界的沙粒病毒Lassa病毒(LASV)之外，几种新世界沙粒病毒如Junin(JUNV)、Guanarito或Machupo在南美洲的各种啮齿动物群体中是普遍的(Johnson et al.,1966,Am J Trop Med Hyg,15(1):103-106；Teshet al.,1993,Am J Trop Med Hyg 49(2):227-235；Mills et al.,1994,Trop Med Hyg 51(5):554-562)。在传播给人类时，这些病毒中的许多可能导致与高死亡率相关的病毒性出血热(Geisbert and Jahrling,2004,Nat Med 10(12Suppl):S110-121)。
2.2淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的基因组架构
沙粒病毒是有包膜的病毒。它们的基因组由两段负义的单链RNA组成(L：7.2kb，S：3.4kb)。每个片段以相反方向编码两个病毒基因。短片段(S片段)编码病毒糖蛋白(GP)前体(GP-C；75kDa)和核蛋白(NP；63kDa)(Salvato et al.,1988,Virology 164(2):517-522)。长片段(L片段)表达RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp；L蛋白；大约200kDa)和基质蛋白Z(蛋白Z)，一种RING指蛋白(11kDa)(附图1A)(Salvato et al.,1988,Virology 164(2):517-522)。GP前体GP-C翻译后裂解为GP-1和GP-2，其它们保持非共价缔合(Buchmeier and Oldstone1979,Virology 99(1):111-120)。GP-1和GP-2的三聚体在病毒粒的表面组装为刺突，对于通过与细胞表面受体的相互作用介导进入宿主细胞是关键的。病毒对宿主细胞的结合与进入长期以来被认为由LCMV GP与细胞受体α-肌萎缩糖蛋白(α-Dystroglycan)的相互作用介导，因为α-肌萎缩糖蛋白是LCMV的唯一的细胞受体(Cao et al.,1998,Science,282(5396):2079-2081)。直到最近，三种其他的人类分子(来自TAM家族的Axl和Tyro3与树突状细胞特异性细胞内粘附分子3-抓握非整合素(dendritic cell-specific intracellularadhesion molecule 3-grabbing nonintegrin))被推断为LCMV和LCMV的近亲LASV的另外的受体，它们允许LCMV独立于α-肌萎缩糖蛋白进入细胞(Shimojima and Kawaoka 2012,JVet Med,74(10):1363-1366；Shimojima et al.,2012,J Virol 86(4):2067-2078)。NP结合病毒RNA，形成核衣壳，其充当病毒L蛋白的模板。与病毒L蛋白缔合的核衣壳形成所谓的核糖核蛋白复合物，其在复制和转录中都是活性的，代表了病毒感染性的最小单位。已经显示的是，NP和L蛋白是病毒RNA转录和复制所必需的最小反式作用因子(Lee et al.,2000,JVirol 74(8):3470-3477)。每个片段上的两个基因由非编码基因间区域(IGR)分隔，侧翼是5'和3'非翻译区(UTR)。IGR形成稳定的发夹结构，已经显示涉及病毒mRNA转录的结构依赖性终止(Pinschewer et al.,2005,J Virol 79(7):4519-4526)。URT的末端核苷酸显示了高度的互补性，引起二级结构的形成。已知这些锅柄(panhandle)结构充当了转录和复制的病毒启动子，通过定点诱变分析它们揭示了序列和结构依赖性，不耐受哪怕微小的序列改变(Perez and de la Torre,2003,Virol 77(2):1184-1194)。
2.3反向遗传系统
负链病毒如LCMV的分离的和纯化的RNA不能直接充当mRNA，即，当导入细胞时不能被翻译。因此用病毒RNA转染细胞不能引起传染性病毒颗粒的产生。为了在培养的感受细胞中从cDNA产生负链RNA病毒的传染性病毒颗粒，病毒RNA片段必需用转录和复制所需的最小因子进行反式互补。借助于数年前公开的迷你基因组系统，最终可以分析涉及转录、复制和病毒颗粒形成的病毒顺式作用元件和反式作用因子(Lee et al.,2000,J Virol 74(8):3470-3477；Lee et al.,2002,J Virol 76(12):6393-6397；Perez and de la Torre2003,J Virol 77(2):1184-1194；Pinschewer et al.,2003,J Virol77(6):3882-3887；Pinschewer et al.,2005,J Virol 79(7):4519-4526.)。对于其他沙粒病毒如LASV和Tacaribe病毒，已经建立了反向遗传系统(Lopez et al.,2001,J Virol 75(24):12241-12251；Hass et al.,2004,J Virol78(24):13793-13803)。分别利用pol-I/-II或T7/pol-II驱动的质粒，两份出版物显示了从cDNA完全地回收传染性的LCMV(也称为“病毒拯救”)(Flatz et al.,2006,Proc Natl Acad Sci U S A 103(12):4663-4668；Sanchez and dela Torre,2006,Virology 350(2):370-380)。
2.4表达目的基因的重组LCMV
表达目的外源基因的重组负链RNA病毒的产生已经被追求了很长时间。对其他病毒已经公开了不同的策略(Garcia-Sastre et al.,1994,J Virol 68(10):6254-6261；Percy et al.,1994,J Virol 68(7):4486-4492；Flick and Hobom,1999,Virology 262(1):93-103；Machado et al.,2003,Virology 313(1):235-249)。过去已经显示，有可能向双片段的LCMV颗粒中引入其他外源基因(Emonet et al.,2009,PNAS,106(9):3473-3478)。两个目的外源基因被插入到LCMV的双片段基因组中，产生具有两个S片段和一个L片段的三片段LCMV颗粒(r3LCMV)。在Emonet等人(2009)公开的三片段病毒中，NP和GP保持在S片段中它们各自的天然位置，因而在侧翼UTR中它们的天然启动子之下表达(附图1B)。然而，本申请显示，Emonet等人公开的三片段LCMV颗粒主要组装为双片段颗粒(即，沙粒病毒仅包装一个而不是两个S片段)，引起减弱的生长和重组两个S片段的强选择压力。在本申请中进一步显示，这样的重组是可再生产地存在的，引起表型回复为野生型病毒和转基因损失。
2.5复制缺陷性沙粒病毒
近来，已经显示了传染性沙粒病毒颗粒可以被工程化以含有基因组，具有在感染的细胞中扩增和表达它的遗传材料的能力，但不能在正常的、未遗传工程化的细胞中产生进一步的子代(即，传染性、复制缺陷性沙粒病毒颗粒)(国际公开No.WO 2009/083210A1和国际公开No.WO2014/140301A1)。
3.发明概述
本申请涉及在其基因组中具有其ORF的重排的沙粒病毒。特别地，本申请涉及沙粒病毒基因组片段，其被工程化以在野生型位置之外的位置携带沙粒病毒ORF。本申请还提供了三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段或两个L片段和一个S片段，它们不重组成复制型的双片段沙粒病毒颗粒。本申请表明，三片段沙粒病毒颗粒可以被工程化以改善遗传稳定性和确保持续的转基因表达。
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体是传染性的，即，能够进入宿主细胞或将它的遗传材料注入宿主细胞。在某些更具体的实施方式中，本文提供的病毒载体是传染性的，即，能够进入宿主细胞或将它的遗传材料注入宿主细胞，随后在所述宿主细胞内部扩增和表达它的遗传信息。在某些实施方式中，所述病毒载体是传染性、复制缺陷性沙粒病毒病毒载体，其被工程化以含有基因组，具有在感染的细胞中扩增和表达它的遗传信息的能力，但是不能在正常的、未遗传工程化的细胞中产生进一步的传染性子代颗粒。在某些实施方式中，所述传染性沙粒病毒病毒载体是复制型的，能够在正常的、未遗传工程化的细胞中产生进一步的传染性子代颗粒。在某些更具体的实施方式中，这样的复制型病毒载体相对于衍生所述复制型病毒载体的野生型病毒是减毒的。
3.1非天然的开放阅读框
因而，在一方面，本文提供的是沙粒病毒基因组片段。在某些实施方式中，所述基因组片段被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带病毒ORF。在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段选自：
(i)S片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)S片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(vi)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(vii)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(viii)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ix)L片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(x)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(xi)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(xii)L片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒3'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的3'UTR。在某些实施方式中，所述沙粒病毒5'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的5'UTR。
本文还提供的是本文提供的沙粒病毒基因组片段的分离的cDNA。本文还提供的是包含沙粒病毒基因组片段的cDNA的DNA表达载体。
本文还提供的是宿主细胞，其包含所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒基因组片段的cDNA、或包含所述沙粒病毒基因组片段的cDNA的载体。
本文还提供的是沙粒病毒颗粒，其包含所述沙粒病毒基因组片段和第二沙粒病毒基因组片段，从而所述沙粒病毒颗粒包含S片段和L片段。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒是传染性的和复制型的。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒是减毒的。在其他实施方式中，所述沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性子代。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或功能上灭活。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在其他实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的仅一个被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在更具体的实施方式中，编码GP的ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在其他实施方式中，编码NP的ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在某些实施方式中，编码Z蛋白的ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在其他实施方式中，编码L蛋白的ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
在某些实施方式中，所述异源ORF编码报告蛋白。在某些实施方式中，所述异源ORF编码衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在其他实施方式中，所述编码抗原的异源ORF选自人类免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎表面抗原，大片状带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核分枝杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不受来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF的影响。
本文还提供的是生产沙粒病毒基因组片段的方法。在某些实施方式中，所述方法包括转录所述沙粒病毒基因组片段的cDNA。
本文还提供的是产生沙粒病毒颗粒的方法。在某些实施方式中，所述产生沙粒病毒颗粒的方法包括：
(i)向宿主细胞中转染沙粒病毒基因组片段的cDNA；
(ii)向所述宿主细胞中转染包含第二沙粒病毒基因组片段的cDNA的质粒；
(iii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
(iv)收获所述沙粒病毒颗粒。
在某些实施方式中，L片段和S片段的转录利用双向启动子进行。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括向宿主细胞中转染编码沙粒病毒聚合酶的一个或更多个核酸。在再更具体的实施方式中，所述聚合酶是L蛋白。在其他实施方式中，所述方法进一步包括向所述宿主细胞中转染编码NP的一个或更多个核酸。
在某些实施方式中，L片段和S片段的转录各自处在选自以下构成的组的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
在另一个实施方式中，本文提供的是包含沙粒病毒颗粒的疫苗，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或功能上灭活；或其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少一个ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的另一种生物体的异源ORF替换；或其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的仅一个被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在更具体的实施方式中，所述疫苗进一步包含药学上可接受的载体。
在另一个实施方式中，本文提供的是包含沙粒病毒颗粒的药物组合物，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或功能上灭活；或其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少一个ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的另一种生物体的异源ORF替换；或其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的仅一个被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在更具体的实施方式中，所述药学上可接受的载体进一步包含药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段或所述沙粒病毒颗粒衍生自LCMV。在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒衍生自LCMV MP毒株、Armstrong毒株、或Armstrong Clone 13毒株。在其他实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段或所述沙粒病毒颗粒衍生自Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ Clone 3毒株。
3.2三片段沙粒病毒
在一个方面，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段。所述三片段沙粒病毒颗粒的增殖在缺乏I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因1(RAG1)、已经用104PFU的所述三片段沙粒病毒颗粒感染的小鼠中在持续感染70天之后不产生复制型的双片段病毒颗粒。在某些实施方式中，在仅一个而不是两个独立片段上联合两个沙粒病毒ORF的、两个S片段的片段内重组取消病毒启动子活性。
在另一个方面，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含两个L片段和一个S片段。在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒的增殖在缺乏I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因1(RAG1)、已经用104PFU的所述三片段沙粒病毒颗粒感染的小鼠中在持续感染70天之后不产生复制型的双片段病毒颗粒。在某些实施方式中，在仅一个而不是两个独立片段上联合两个沙粒病毒ORF的、两个L片段的片段内重组取消病毒启动子活性。
在某些实施方式中，两个S片段之一选自：
(i)S片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)S片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(vi)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
在某些实施方式中，两个L片段之一选自：
(xiii)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(xiv)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(xv)L片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(xvi)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(xvii)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(xviii)L片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒3'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的3'UTR。在其他实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒5'URT是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的5'UTR。
在某些实施方式中，所述两个S片段包含(i)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF；或(ii)一个或两个重复的沙粒病毒ORF；或(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个异源ORF和一个重复的沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，所述两个L片段包含(i)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF；或(ii)一个或两个重复的沙粒病毒ORF；或(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个异源ORF和一个重复的沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，所述异源ORF编码衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在其他实施方式中，所述编码抗原的异源ORF选自人类免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎表面抗原，大片状带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核分枝杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，至少一个异源ORF编码荧光蛋白。在其他实施方式中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒包含所有四种沙粒病毒ORF。在某些实施方式中所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的和复制型的。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒缺乏四种沙粒病毒ORF中的一种或更多种。在其他实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性子代。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒缺乏四种沙粒病毒ORF中的一种，其中所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性的子代。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒缺乏GF ORF。
在进一步的方面中，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段。在某些实施方式中，第一个S片段被工程化以在沙粒病毒3'UTR控制下的位置中携带编码GP的ORF，以及在沙粒病毒5'UTR控制下的位置中携带编码第一目的基因的ORF。在某些实施方式中，第二个S片段被工程化以在沙粒病毒3'UTR控制下的位置中携带编码NP的ORF，以及在沙粒病毒5'UTR控制下的位置中携带编码第二目的基因的ORF。
在又一个方面中，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段。在某些实施方式中，第一个S片段被工程化以在沙粒病毒5'UTR控制下的位置中携带编码GP的ORF，以及在沙粒病毒3'UTR控制下的位置中携带编码第一目的基因的ORF。在某些实施方式中，第二个S片段被工程化以在沙粒病毒5'UTR控制下的位置中携带编码NP的ORF，以及在沙粒病毒3'UTR控制下的位置中携带编码第二目的基因的ORF。
在某些实施方式中，所述目的基因编码衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在其他实施方式中，所述目的基因编码选自人类免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎表面抗原，大片状带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核分枝杆菌抗原和肿瘤相关抗原的抗原。在又一个实施方式中，至少一个目的基因编码荧光蛋白。在具体的实施方式中，所述荧光蛋白是GFP或RFP。
本文还提供的是所述三片段沙粒病毒颗粒的基因组的分离的cDNA。本文还提供的是DNA表达载体，其包含所述三片段沙粒病毒颗粒的基因组的cDNA。本文还提供的是一种或更多种DNA表达载体，它们单独地或总体地包含所述三片段沙粒病毒的cDNA。
本文还提供的是宿主细胞，其包含所述三片段沙粒病毒颗粒、所述三片段沙粒病毒颗粒的基因组的cDNA、或包含所述三片段沙粒病毒颗粒的基因组的cDNA的载体。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是减毒的。
本文还提供的是产生所述三片段沙粒病毒颗粒的方法。在某些实施方式中，所述产生沙粒病毒颗粒的方法包括：
(i)向宿主细胞中转染一个L片段和两个S片段的一种或更多种cDNA；
(ii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
(iii)收获所述沙粒病毒颗粒。
本文还提供的是产生所述三片段沙粒病毒颗粒的方法。在某些实施方式中，所述产生三片段沙粒病毒颗粒的方法包括：
(i)向宿主细胞中转染两个L片段和一个S片段的一种或更多种cDNA；
(ii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
(iii)收获所述沙粒病毒颗粒。
在某些实施方式中，所述一个L片段和所述两个S片段的转录利用双向启动子进行。在某些实施方式中，所述两个L片段和所述一个S片段的转录利用双向启动子进行。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括向宿主细胞中转染编码沙粒病毒聚合酶的一个或更多个核酸。在再更具体的实施方式中，所述聚合酶是L蛋白。在其他实施方式中，所述方法进一步包括向所述宿主细胞中转染编码NP蛋白的一个或更多个核酸。
在某些实施方式中，所述一个L片段和所述两个S片段的转录各自处在选自以下构成的组的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
在某些实施方式中，所述两个L片段和一个S片段的转录各自处在选自以下构成的组的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒具有与双片段沙粒病毒颗粒相同的向性。在其他实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是复制缺陷的。
在另一个实施方式中，本文提供的是包含三片段沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体的疫苗。
在另一个实施方式中，本文提供的是包含三片段沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒衍生自LCMV。在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒衍生自LCMV MP毒株、Armstrong毒株、或Armstrong Clone 13毒株。在其他实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒衍生自Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ Clone 3毒株。
3.3通称和缩写
缩写 通称
APC 抗原递呈细胞
art 人工的
CAT 氯霉素乙酰转移酶
CMI 细胞介导的免疫
CD8 分化群8
CD4 分化群4
GFP 绿色荧光蛋白
GP 糖蛋白
IGR 基因间的区域
JUNV Junin病毒
LCMV 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
L protein RNA-依赖性RNA聚合酶
L segment 长片段
MHC 主要组织相容性复合体
Z protein 基质蛋白Z
nat 天然的
NP 核蛋白
ORF 开放阅读框
RFP 红色荧光蛋白
r2JUNV 重组的双片段JUNV
r3JUNV 重组的三片段JUNV
r2LCMV 重组的双片段LCMV
r3LCMV 重组的三片段LCMV
S segment 短片段
UTR 非翻译区
VSV 水泡性口膜炎病毒
4.附图的简要说明
附图1：重组的三片段病毒显示了与野生型LCMV相比受损的生长，独立于基因组中GP ORF的位置。(A-C)双片段和三片段LCMV的基因组架构的示意图。野生型LCMV的双片段基因组由编码GP和NP的一个S片段以及编码Z蛋白和L蛋白的一个L片段组成(A)。两个片段的侧翼都是各自的5'和3'UTR。重组的三片段LCMV(r3LCMV)的基因组由一个L和两个S片段组成，有一个位置来将目的基因(在此为GFP)插入到每一个S片段中。(B)r3LCMV-GFPnatural(nat)具有处于它们天然位置的全部病毒基因，而r3LCMV/GFPartificial(art)中的GP ORF被人工并置于3'UTR并在3'UTR的控制下表达。(D)以0.01的感染复数(moi)感染的BHK-21细胞中标明的病毒的生长动力学(野生型LCMV：灰色三角形；r3LCMV-GFPnat：黑色圆形；r3LCMV-GFPart：白色正方形)。在标明的感染后时间点采集上清液，通过病灶形成分析来测定病毒滴度。符号和柱条代表每个组的三个副本的平均值±SEM。误差线被遮挡在符号大小中。
附图2:三片段的病毒制品含有大部分双片段的复制缺陷性颗粒(r2LCMV)。(A)r2LCMV(白色柱条)、r3LCMV-GFP/RFPart(黑色柱条，GFP-GP，RFP-NP)和r3LCMV-GFP/RFPnat(灰色柱条，GP-GFP，RFP-NP)在野生型BHK-21细胞上生长，在野生型非补充BHK-21细胞(BHK21)、表达GP的BHK-21细胞(BHK-GP)或表达NP的BHK-21细胞(BHK-NP)上测定上清液的感染性。BHK-21和BHK-GP细胞上的滴度通过染色NP-阳性病毒病灶来测定。NP-补充BHK-21细胞上的滴度通过计数GP-阳性病灶来测定。将滴度正常化为在BHK-21细胞上评估时获得的平均滴度，因而表示为其倍数。柱条代表每组6个副本的平均值±SEM。ns.：不是统计学上显著的(p≥0.05)；**：根据单因素方差分析(1-way ANOVA)然后使用r2LCMV作为参考的Dunnett后测验，p<0.01。(B)r2LCMV(左图)和r3LCMV-GFP/RFPart(中间图和右图)是在野生型BHK-21细胞(BHK21；左图和中间图)或表达NP的BHK-21细胞(BHK-NP，右图)上生长的，通过流式细胞计在感染后12小时评估荧光。r2LCMV感染的细胞用作门选对照。每种条件显示了一个代表性的图。(C)在用r3LCMV-GFP/RFPart对BHK-21或BHK-NP细胞感染后12小时GFP+、RFP+或GFP+RFP+双阳性细胞的定量。柱条代表每组三个副本的平均值±SEM。ns.：不是统计学上显著的(p≥0.05)；***：p<0.001，根据未配对的双尾学生T细胞检验。
附图3：在S片段的IGR中带有部分密码子优化的GP ORF或遗传标签的重组三片段病毒的设计和生长动力学。(A)遗传工程化的S片段的示意图，其中GP的255个C-末端碱基对是密码子优化的，NP被替换为GFP(GP ORF称为“WE/WET”)。r3LCMV-WEWET/GFPnat的生长动力学在BHK-21细胞上进行，如附图1B中详述的，其由两个S和一个L片段组成，具有(A)中所示的含GP的S片段的修饰。在以moi＝0.01感染后标明的时间点采集上清液，通过病灶形成分析来测定病毒滴度(B)。符号和柱条代表每组三个副本的平均值±SEM。误差线被遮挡在符号大小中。(C)编码NP的S片段的示意图，其中IGR的一个碱基对被删除以遗传地“标记”这个非编码RNA元件。删除的G残基(通过箭头指示)位于IGR的关键的茎-环结构的外部。以0.01的moi，在BHK-21细胞上进行三片段病毒的生长动力学比较，其在编码NP的S片段的IGR中有或者没有遗传标记(r3LCMV-GFPnat：黑色圆形；r3LCMV-GFPnat IGR*：白色圆形)。在标明的感染后时间点采集上清液，通过病灶形成分析来测定病毒滴度。符号和柱条代表每组三个副本的平均值±SEM。显示了来自两个独立实验之一的代表性的数据。
附图4：在免疫缺陷小鼠中r3LCMV-GFPnat而非r3LCMV-GFPart的持续感染达到与双片段野生型病毒相当的水平，并引起GFP表达的损失。(A)AGRAG小鼠用1×104PFU的r3LCMV-GFPnat(黑色圆形)、r3LCMV-GFPart(白色方形)或对照的双片段r2LCMV(灰色三角形)静脉内地感染，随时间监视病毒血症。符号代表每组3-7只小鼠的平均值±SEM。(B)显示了用1×104PFU的r3LCMV-GFPnat或r3LCMV-GFPart静脉内感染AGRAG小鼠后第127天的LCMV病毒血症。进行免疫病灶分析来检测核蛋白NP(灰色圆形)或GFP(白色圆形)。符号代表单个小鼠。ns.：不是统计学上显著的(p≥0.05)；***：通过未配对的双尾学生T细胞检验，p<0.001。(C-E)来自用r3LCMV-GFPnat、r3LCMV-GFPart或r2LCMV感染的AGRAG小鼠的血液在感染后120天通过流式细胞计分析GFP+细胞的存在。使用(C)中阐述的门选策略鉴定单核细胞和巨噬细胞。在(D)中显示了每个组的一个代表性的FACS图，以及GFP表达的一个代表性的直方图覆盖。(E)CD11b+GR1-单核细胞/巨噬细胞群体中GFP+群体的定量。符号代表单个小鼠。
附图5：小鼠的r3LCMV-GFPnat持续感染产生S片段重组和功能性全长转基因的损失。从1×104PFU r3LCMV-GFPnat或r3LCMV-GFPart静脉内感染后127天的AGRAG小鼠血清分离病毒RNA。逆转录病毒RNA，带有NP和GP序列的cDNA用适当的基因特异性引物进行PCR扩增。(A)在RNA模板的在先逆转录之后获得的(+RT，泳道1-8)或没有逆转录获得的(-RT，阴性对照，泳道9-12)PCR产物的DNA电泳。天然动物的血清用作独立的阴性对照(n，泳道8)，编码野生型LCMV S片段的质粒DNA用作阳性对照(p，泳道17)。泳道1-3的扩增子进行Sanger测序。(B)从动物#3(r3LCMV-GFPnat，#3)获得的代表性的cDNA序列显示了重组的S片段，组合了NP和GP序列、两个IGR(粗体)和C-末端GFP部分(灰色高亮)(SEQ ID NO：17)。(C)感染后127天分离的三种重组的病毒S片段序列的示意图，它们的每一个主宰了一个代表性的AGRAG小鼠中的病毒群体。来自携带NP的S片段的标记的IGR用星号(*)标出。测序了的延伸用双箭头(<-->)标出。碱基对(bp)长度指标描述了上述GFP残余和截短的(缩短)IGR元件。
附图6:在S片段上具有两个IGR的重组病毒的生长动力学类似于双片段病毒。BHK-21细胞以0.01的moi用带有野生型S片段的双片段LCMV(灰色三角形)、用三片段r3LCMV-GFPnat(黑色圆形)、或用r2LCMV_2IGRs(白色钻形)感染，所述r2LCMV_2IGRs带有与从感染的AGRAG小鼠恢复的重组产物相应的一个S片段(比较附图5)。在标明的时间点采集上清液，通过病灶形成分析来测定病毒滴度。符号和柱条代表每组三个副本的平均值±SEM。误差线被遮挡在符号大小中。ns.：不是统计学上显著的(p≥0.05)；＊＊＊：p<0.001(单因素ANOVA，和随后的Bonferroni’s后测验用于多重比较)。
附图7:可解释r3LCMV-GPnat转基因损失的重组事件模型以及r3LCMV-GPart遗传稳定性的假说机制。这个模型自身基于LCMV转录终止的序列数据(Meyer and Southern,1993,J Virol,67(5):2621-2627)，并与IGR作为转录终止信号的反向遗传学证据(Pinschewer et al.,2005,J Virol,79(7):4519-4526)结合。合在一起，这些发现表明在完成IGR的发夹结构时结构依赖性的聚合酶暂停。发现重组的S片段中两个IGR之间的GFP残余来源于一个或两个S片段，支持了在基因组或反基因组合成期间(以下分别为情形A和B)在聚合酶暂停时发生聚合酶模板切换(也称为拷贝选择)的模型。(A)在反基因组合成期间，RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)在基因组S片段模板的3'UTR处启动，然后读取通过NP ORF和IGR。在IGR的末端，聚合酶由于二级结构而暂停(“结构依赖性聚合酶暂停”)。聚合酶的停止促进了拷贝选择，在可选择的模板上继续RNA复制(在此是：编码GP的S片段基因组)。模板切换必须在GP终止密码子的上游发生，显然最有可能靶向靠近IGR发夹或在IGR发夹底部的序列。聚合酶继续读取通过第二模板的GFP的C-末端，然后聚合酶合成第二IGR、GP ORF和5'UTR。(B)在基因组合成期间，RdRp在含有GP的反基因组S片段模板的3'末端启动RNA合成，合成5'UTR、GP以及大部分或所有的IGR，随后是结构依赖性聚合酶暂停。发生拷贝选择，切换到含NP的S片段的IGR附近的GFP ORF的C-末端部分。因而复制添加了GFP的片段，随后是全长的IGR、NP和3'UTR。(C–D)类似于情形(A)和(B)的模板切换也可以在r3LCMV-GFPart的基因组或反基因组合成期间发生。这个过程还可以将NP和GP ORF组合到一个RNA片段上。然而，后者由两个3'UTR组成，而不是3'UTR和5'UTR，它们仅一起形成功能性的病毒启动子。因而这样的分子不能被RdRp扩增，因而不形成重组的复制型病毒。
附图8:产生了具有类似于r3LCMV-GFPart的基因组架构(参见附图1C)的r3LCMV-OVAart疫苗载体，但是具有两个卵清蛋白(OVA)基因，代替前一病毒中的相应的GFP基因。用104PFU的r3LCMV-OVAart，或用108个颗粒的基于复制缺陷性E1删除的腺病毒5的表达OVA的载体肌内注射地(i.m.)免疫C57BL/6小鼠。8天后动物进行安乐死，分析响应于免疫接种引发的T细胞反应。A:使用加载SIINFEKL肽的I类MHC四聚体测定脾脏中OVA特异性CD8+T细胞的频率。在B220阴性的CD8+淋巴细胞中测定表位特异性细胞频率。B：使用SIINFEKL肽用于再刺激，通过细胞内的细胞因子分析来分析OVA特异性CD8+T细胞的功能。柱条代表每组五只小鼠的平均值+/-SEM。*：p<0.05；**：p>0.01，根据非配对双尾学生t检验。
附图9：三片段的LCMV诱导多功能记忆CD8+T细胞。C57BL/6小鼠用1×105PFUr3LCMV OVA或1×108PFU rAd-OVA i.v.感染。在感染后25天取得脾脏，通过细胞内的细胞因子染色分析OVA特异性CD8+T细胞的功能。r3LCMV-OVA(黑色柱条)或rAd-OVA(白色柱条)诱导的OVA特异性T细胞的细胞因子分布(IFN-γ、TNF-α和IL-2)显示为CD8+T细胞的百分比(A)或每个脾脏的绝对数量(B)。符号和柱条代表每组五只小鼠的平均值±SEM。非配对双尾学生t检验用于统计分析，产生的p值通过乘以比较的数目(n＝7)来校正用于多重比较。显示了两个相似实验中代表性的一个。
附图10：编码抗原的LCMV诱导了针对外源和自身抗原的特异性T细胞反应。C57BL/6小鼠用1×105PFU的编码大鼠、人类或小鼠Her2肽(分别为A、B和C)的r3LCMV i.v.感染。在感染后九天取得脾脏，通过细胞内的细胞因子染色和流式细胞计分析功能性抗原特异性CD8+T细胞的诱导。r3LCMV诱导的Her2特异性CD8+T细胞的细胞因子分布(IFN-γ、TNF-α和IL-2)以CD8+T细胞的％来显示。符号和柱条代表每组三只小鼠的平均值±SEM。
附图11：在r3LCMV感染时诱导了干扰素-α，但在用重组的腺病毒或牛痘病毒感染时没有。C57BL/6小鼠用1×105PFU的r3LCMV OVA、1×108PFU的rAd-OVA或1×106PFU的rVacc-OVA i.v.感染。在标明的感染后时间点采集血液，通过ELISA测定血清中干扰素-α的水平。符号和柱条代表每组四只下式的平均值±SEM。***：p<0.001(双因素ANOVA，随后是Bonferroni’s后检验用于多重比较)。显示了来自两个独立实验之一的代表性的数据。
附图12：与r3JUNV-GFPnat和r2JUNV-wt对比的r3JUNV-GFPart的细胞培养物生长。r3JUNV-GFPart和r3JUNV-GFPnat类似于附图1中示意性说明的相应r3LCMV载体来构建。为了避免它们的细胞培养物生长性质，293T细胞以0.01的感染复数(MOI)用r2LCMV-wt、r3JUNV-GFPart和r3JUNV-GFPnat感染，在标明的时间点收获上清液。上清液中的传染单位(FFU)通过免疫病灶分析来测定。符号和柱条代表每组三个副本的平均值±SEM，被遮挡在符号大小中。
附图13：三片段JUNV是在体内显著地减毒的，在GFP损失时仅引起可检测的病毒血症。(A)AGRAG小鼠用7×104PFU的r3JUNV-GFPnat(灰色正方形)、r3JUNV-GFPart(白色三角形)或对照的双片段r2JUNV毒株Candid#1(黑色圆形)i.v.感染，监视随时间的病毒血症。符号代表单个小鼠(n＝3-7每组)。(B)在用7×104PFU的r3JUNV-GFPnat或r3JUNV-GFPart静脉内感染AGRAG小鼠后120天测定JUNV病毒血症。进行免疫病灶分析来检测核蛋白NP(灰色圆形)或GFP(白色圆形)。用于接种小鼠病毒储备的用作分析中的染色对照。符号分别代表单个小鼠和接种物。
附图14：基于三片段LCMV和JUNV的疫苗载体的同源和异源的初免-强化组合诱导了强的P1A自身抗原特异性CD8+T细胞反应。(A)在实验的第0和35天，BALB/c小鼠用8.5×104PFU的r3JUNV-P1Aart(r3JUNV-P1A)和r3LCMV-P1Aart(r3LCMV-P1A)以图表中标明的同源或异源组合静脉内地免疫。与抗CD8a抗体组合使用加载P1A表位的MHC I类四聚体对表位特异性CD8+T细胞进行染色。计算外周血的CD8+T细胞部分中P1A-四聚体结合细胞的频率(A)，以及每微升外周血的P1A四聚体结合CD8+T细胞的绝对数量(B)。符号表示每组3-5只小鼠的平均值+/-SEM以及时间点。
发明的详细说明
4.1具有非天然位置的开放阅读框的沙粒病毒
本文提供的是ORF重排的沙粒病毒。在某些实施方式中，这样的沙粒病毒是复制型的和传染性的。本文提供了这样的沙粒病毒的基因组序列。在一个方面，本文提供的是沙粒病毒基因组片段，其中所述沙粒病毒基因组片段被工程化以在一位置携带沙粒病毒ORF，所述位置(即，非天然位置)不同于野外分离的病毒，如LCMV-MP(参见SEQ ID NO：4和5)中所述ORF的相应基因存在的位置(本文称为“野生型位置”)。在一个实施方式中，所述沙粒病毒颗粒是LCMV。
所述野生型沙粒病毒基因组片段和ORF是本领域已知的。特别地，沙粒病毒基因组由S片段和L片段组成。S片段带有编码GP和NP的ORF。L片段编码L蛋白和Z蛋白。两个片段的侧翼都是各自的5'和3'UTR(参见附图1A)。在SEQ ID NO：1-10中提供了说明性的野生型沙粒病毒基因组片段。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组片段可以被工程化以在野生型位置之外的位置携带两个或更多个沙粒病毒ORF。在其他实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段可以被工程化以在野生型位置之外的位置携带两个沙粒病毒ORF、或三个沙粒病毒ORF、或四个沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒基因组片段可以是：
(i)沙粒病毒S片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)沙粒病毒S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)沙粒病毒S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)沙粒病毒S片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)沙粒病毒S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(vi)沙粒病毒S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(vii)沙粒病毒L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(viii)沙粒病毒L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ix)沙粒病毒L片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(x)沙粒病毒L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(xi)沙粒病毒L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(xii)沙粒病毒L片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
在某些实施方式中，本文描述的沙粒病毒基因组片段的非天然位置中的ORF可以处在沙粒病毒3'UTR或沙粒病毒5'UTR的控制下。在更具体的实施方式中，所述沙粒病毒3'UTR是沙粒病毒S片段的3'UTR。在另一个具体的实施方式中，所述沙粒病毒3'UTR是沙粒病毒L片段的3'UTR。在更具体的实施方式中，所述沙粒病毒5'UTR是沙粒病毒S片段的5'UTR。在其他具体实施方式中，所述5'UTR是L片段的5'UTR。
在其他实施方式中，本文描述的沙粒病毒基因组片段的非天然位置中的ORF可以处于沙粒病毒的保守末端序列元件(5'-和3'末端19-20-nt区域)的控制下(参见，例如Perez&de la Torre,2003,J Virol.77(2):1184–1194)。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组片段的非天然位置中的ORF可以处于5'UTR的启动子元件的控制下(参见，例如，Albarino et al.,2011,J Virol.,85(8):4020-4)。在另一个实施方式中，沙粒病毒基因组片段的非天然位置中的ORF可以处于3'UTR的启动子元件的控制下(参见，例如，Albarino et al.,2011,J Virol.,85(8):4020-4)。在更具体的实施方式中，所述5'UTR的启动子元件是S片段或L片段的5'URT的启动子元件。在另一个具体的实施方式中，所述3'UTR的启动子元件是S片段或L片段的3'URT的启动子元件。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组片段的非天然位置中的ORF可以处于截短的沙粒病毒3'UTR或截短的沙粒病毒5'UTR的控制下(参见，例如，Perez&de la Torre,2003,JVirol.77(2):1184–1194；Albarino et al.,2011,J Virol.,85(8):4020-4)。在更具体的实施方式中，所述截短的3'URT是沙粒病毒S片段或L片段的3'UTR。在更具体的实施方式中，所述截短的5’UTR是沙粒病毒S片段或L片段的5’UTR。
本文还提供的是沙粒病毒颗粒，其包含第一基因组片段和第二沙粒病毒基因组片段，所述第一基因组片段被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF，从而所述沙粒病毒颗粒包含S片段和L片段。在具体的实施方式中，处在ORF的野生型位置之外的位置中的ORF是沙粒病毒ORF之一。
在某些具体的实施方式中，所述沙粒病毒颗粒可以包含所有四个沙粒病毒ORF的全体。在具体的实施方式中，所述第二沙粒病毒基因组片段被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF。在另一个具体的实施方式中，所述第二沙粒病毒基因组片段可以是野生型基因组片段(即，包含处在野生型位置的片段上的ORF)。
在某些实施方式中，所述第一沙粒病毒基因组片段是L片段，所述第二沙粒病毒基因组片段是S片段。在其他实施方式中，所述第一沙粒病毒基因组片段是S片段，所述第二沙粒病毒基因组片段是L片段。
包含处在ORF的野生型位置之外的位置的ORF的基因组片段与第二基因组片段的沙粒病毒颗粒的非限制性实例在表1中列出。
表1
沙粒病毒颗粒
*位置1处于沙粒病毒S片段5’UTR的控制下；位置2处于沙粒病毒S片段3'URT的控制下；位置3处于沙粒病毒L片段5’UTR的控制下；位置4处于沙粒病毒L片段3'UTR的控制下。
位置1 位置2 位置3 位置4
GP NP L Z
GP Z L NP
GP Z NP L
GP L NP Z
GP L Z NP
NP GP L Z
NP GP Z L
NP L GP Z
NP L Z GP
NP Z GP L
NP Z L GP
Z GP L NP
Z GP NP L
Z NP GP L
Z NP L GP
Z L NP GP
Z L GP NP
L NP GP Z
L NP Z GP
L GP Z NP
L GP NP Z
L Z NP GP
L Z GP NP
本文还提供的是被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA。在更具体的实施方式中，本文提供的是表1中所列沙粒病毒基因组的cDNA或cDNA的集合。
在某些实施方式中，被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA是DNA表达载体的部分或被掺入DNA表达载体中。在具体的实施方式中，被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA是DNA表达载体的部分或被掺入DNA表达载体中，所述DNA表达载体有助于本文描述的沙粒病毒基因组片段的生产。在另一个实施方式中，本文描述的cDNA可以被掺入质粒中。cDNA或核酸与表达系统的更详细的说明在章节4.5.1中提供。生产cDNA的技术是分子生物学和DNA操作与生产的惯常和常规的技术。可以使用熟练技术人员已知的任何克隆技术。这样的技术是公知的，熟练的技术人员可从实验手册中获得，例如，Sambrook and Russell,MolecularCloning:A laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory N.Y.(2001)。
在某些实施方式中，被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA被导入(例如，转染入)宿主细胞中。因而，在某些实施方式中，本文提供的是宿主细胞，其包含被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA(即，基因组片段的cDNA)。在其他实施方式中，本文描述的cDNA是DNA表达载体的部分或被掺入DNA表达载体中，并被导入宿主细胞。因而，在某些实施方式中，本文提供的是宿主细胞，其包含被掺入载体中的本文描述的cDNA。在其他实施方式中，本文描述的沙粒病毒基因组片段被导入宿主细胞中。
在某些实施方式中，本文描述的是一种产生沙粒病毒基因组片段的方法，其中所述方法包括转录沙粒病毒基因组片段的cDNA。在某些实施方式中，在体外或体内的沙粒病毒基因组片段转录期间可以存在病毒聚合酶蛋白。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组片段的转录使用双向的启动子进行。在其他实施方式中，沙粒病毒基因组片段的转录使用双向的表达盒进行(参见，例如，Ortiz- et al.,2013,J Gen Virol.,94(Pt 6):1175–1188)。在更具体的实施方式中，所述双向的表达盒包含聚合酶I和聚合酶II启动子，其分别从对侧读取到插入的沙粒病毒基因组片段的两个末端。在再更具体的实施方式中，所述具有pol-I和pol-II启动子的双向的表达盒从对侧读取到L片段和S片段。
在其他实施方式中，本文描述的沙粒病毒基因组片段的cDNA的转录包含启动子。启动子的具体实例包括RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子、SP6启动子或T3启动子。
在某些实施方式中，生产沙粒病毒基因组片段的方法可以进一步包括向宿主细胞中导入沙粒病毒基因组片段的cDNA。在某些实施方式中，所述生产沙粒病毒基因组片段的方法可以进一步包括向宿主细胞中导入沙粒病毒基因组片段的cDNA，其中所述宿主细胞表达用于生产所述沙粒病毒基因组片段的所有其他元件；以及从所述宿主细胞的上清液中纯化所述沙粒病毒基因组片段。这样的方法是本领域技术人员公知的。
本文提供的是细胞系、培养物和培养被本文提供的核酸、载体和组合物感染的细胞的方法。本文描述的核酸、载体系统和细胞系的更详细的说明在章节4.5中提供。
在某些实施方式中，本文描述的沙粒病毒颗粒产生传染性的和复制型的沙粒病毒颗粒。在具体的实施方式中，本文描述的沙粒病毒颗粒是减毒的。在特定的实施方式中，所述沙粒病毒颗粒被减毒，从而所述病毒保持了，至少部分地保持了传播的能力，并且可以在体内复制，但仅产生低的病毒负载，产生非致病的亚临床水平的感染。这种减毒病毒可以用作免疫原性组合物。本文提供的是免疫原性组合物，其包含如章节4.7描述的具有非天然位置上的ORF的沙粒病毒。
4.1.1具有非天然位置上的开放阅读框的复制缺陷性沙粒病毒颗粒
在某些实施方式中，本文提供的是沙粒病毒颗粒，其中(i)ORF处在所述ORF的野生型位置之外的位置中；和(ii)编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的ORF被移除或功能上灭活，从而产生的病毒不能进一步产生传染性子代病毒颗粒。包含一个或更多个ORF已被删除或功能灭活的遗传修饰的基因组的沙粒病毒颗粒可以在补充细胞(即，表达被删除或功能灭活的沙粒病毒ORF的细胞)中产生。产生的沙粒病毒颗粒的遗传材料可以在感染宿主细胞时传递到所述宿主细胞中，在其中所述遗传材料可以被表达和扩增。此外，本文描述的遗传修饰的沙粒病毒颗粒的基因组可以编码来自沙粒病毒颗粒之外的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在另一个实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少一个ORF、至少两个ORF、至少三个ORF或至少四个ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在具体的实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的仅一个被移除或用来自沙粒病毒颗粒之外的生物体的异源ORF替换。在更具体的实施方式中，沙粒病毒基因组片段的编码GP的ORF被移除。在另一个具体的实施方式中，沙粒病毒基因组片段的编码NP的ORF被移除。在更具体的实施方式中，沙粒病毒基因组片段的编码Z蛋白的ORF被移除。在又一个具体的实施方式中，编码L蛋白的ORF被移除。
因而,在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒颗粒包含一基因组片段，其(i)被工程化以在非天然位置携带ORF；(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被移除；(iii)被移除的ORF被来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
在某些实施方式中，所述异源ORF的长度是8到100个核苷酸、15到100个核苷酸、25到100个核苷酸、50到200个核苷酸、50到400个核苷酸、200到500个核苷酸、或400到600个核苷酸、500到800个核苷酸。在其他实施方式中，所述异源ORF的长度是750到900个核苷酸、800到100个核苷酸、850到1000个核苷酸、900到1200个核苷酸、1000到1200个核苷酸、1000到1500个核苷酸、或10到1500个核苷酸、1500到2000个核苷酸、1700到2000个核苷酸、2000到2300个核苷酸、2200到2500个核苷酸、2500到3000个核苷酸、3000到3200个核苷酸、3000到3500个核苷酸、3200到3600个核苷酸、3300到3800个核苷酸、4000个核苷酸到4400个核苷酸、4200到4700个核苷酸、4800到5000个核苷酸、5000到5200个核苷酸、5200到5500个核苷酸、5500到5800个核苷酸、5800到6000个核苷酸、6000到6400个核苷酸、6200到6800个核苷酸、6600到7000个核苷酸、7000到7200个核苷酸、7200到7500个核苷酸、或7500个核苷酸。在一些实施方案中，所述异源ORF编码肽或多肽，其长度为5到10个氨基酸、10到25个氨基酸、25到50个氨基酸、50到100个氨基酸、100到150个氨基酸、150到200个氨基酸、200到250个氨基酸、250到300个氨基酸、300到400个氨基酸、400到500个氨基酸、500到750个氨基酸、750到1000个氨基酸、1000到1250个氨基酸、1250到1500个氨基酸、1500到1750个氨基酸、1750到2000个氨基酸、2000到2500个氨基酸，或超过2500个或更多个氨基酸。在某些实施方式中，所述异源ORF编码多肽，其长度不超过2500个氨基酸。在具体的实施方式中，所述异源ORF不含有终止密码子。在某些实施方式中，所述异源ORF是密码子优化的。在某些实施方式中，所述核苷酸组合物、核苷酸组合物或两者可以是优化的。这种优化的技术是本领域已知的，可以用于优化异源ORF。
来自沙粒病毒之外的生物体的任何异源ORF可以被包括在沙粒病毒基因组片段中。在一个实施方式中，所述异源ORF编码报告蛋白。报告蛋白的更详细的说明见章节4.3。在另一个实施方式中，所述异源ORF编码能够引发免疫应答的传染性病原体的抗原或与任何疾病相关的抗原。在具体的实施方式中，所述抗原来源于传染性生物体、肿瘤(即，癌症)、或过敏原。异源ORF的更详细的说明见章节4.3。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒的生长和感染性不受来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF的影响。
本领域技术人员已知的技术可以用于产生包含沙粒病毒基因组片段的沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒基因组片段被工程化以在野生型位置之外的位置携带沙粒病毒ORF。例如，反向遗传学技术可以用于产生这样的沙粒病毒颗粒。在其他实施方式中，复制缺陷的沙粒病毒颗粒(即，被工程化以在野生型位置之外的位置携带沙粒病毒ORF的沙粒病毒基因组片段，其中编码GP、NP、Z蛋白、L蛋白的ORF被删除)可以在补充细胞中产生。
在某些实施方式中，根据当前的应用使用的沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒可以是旧世界的病毒，例如，LCMV。
在某些实施方式中，当前的应用涉及适合用作疫苗的本文描述的沙粒病毒颗粒，以及在疫苗接种和例如感染或癌症的治疗或预防中使用这样的沙粒病毒颗粒的方法。使用本文描述的沙粒病毒颗粒的方法的更详细的说明在章节4.6中提供。
在某些实施方式中，本文提供的是试剂盒，其在一个或更多个容器中包含本文描述的一种或更多种cDNA。在具体的实施方式中，试剂盒在一个或两个或更多个容器包含本文描述的沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒。所述试剂盒可以进一步包含一种或更多种以下的：适合于挽救沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒的宿主细胞、适合于将质粒cDNA转染到宿主细胞中的试剂、辅助病毒、编码病毒蛋白质的质粒和/或一种或更多种特异于修饰的沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒或其cDNA的引物。
在某些实施方式中，当前的应用涉及适合用作药物组合物的本文描述的沙粒病毒颗粒，以及在疫苗接种和例如感染和癌症的治疗或预防中使用这样的沙粒病毒颗粒的方法。使用本文描述的沙粒病毒颗粒的方法的更详细的说明在章节4.7中提供。
4.2三片段沙粒病毒颗粒
本文提供的是ORF重排的三片段沙粒病毒颗粒。在一个方面，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段或两个L片段和一个S片段。在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒不重组成复制型的双片段沙粒病毒颗粒。更具体地，在某些实施方式中，所述基因组片段的两个(例如，分别为两个S片段或两个L片段)不能以某种方式重组来产生可以替换两个亲本片段的单个病毒片段。在具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒包含在ORF的野生型位置之外的位置上的ORF。在又一个具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒包含所有四种沙粒病毒ORF。因而，在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是复制型的和传染性的。在其他实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒缺乏四种沙粒病毒ORF中的一种。因而，在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性子代。
在某些实施方式中，编码本文描述的三片段沙粒病毒颗粒的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处在沙粒病毒3'UTR或沙粒病毒5'UTR的控制下。在更具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒3'UTR是沙粒病毒S片段的3'UTR。在另一个具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒3'UTR是三沙粒病毒L片段的3'UTR。在更具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒5'UTR是沙粒病毒S片段的5'UTR。在其他具体实施方式中，所述5’UTR是L片段的5’UTR。
在其他实施方式中，编码本文描述的三片段沙粒病毒颗粒的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于沙粒病毒的保守末端序列元件(5'-和3'末端19-20-nt区域)的控制下(参见，例如Perez&de la Torre,2003,J Virol.77(2):1184–1194)。
在某些实施方式中，编码所述三片段沙粒病毒颗粒的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于5’UTR的启动子元件的控制下(参见，例如，Albarino et al.,2011,J Virol.,85(8):4020-4)。在另一个实施方式中，编码所述三片段沙粒病毒颗粒的GP、NP、Z蛋白、L蛋白的ORF可以处于3'UTR的启动子元件的控制下(参见，例如，Albarino et al.,2011,JVirol.,85(8):4020-4)。在更具体的实施方式中，所述5’UTR的启动子元件是S片段或L片段的5’UTR启动子元件。在另一个具体的实施方式中，所述3'UTR的启动子元件是S片段或L片段的3'URT的启动子元件。
在某些实施方式中，编码所述三片段沙粒病毒颗粒的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于截短的沙粒病毒3'UTR或截短的沙粒病毒5'UTR的控制下(参见，例如Perez&de laTorre,2003,J Virol.77(2):1184–1194；Albarino et al.,2011,J Virol.,85(8):4020-4)。在更具体的实施方式中，所述截短的3'URT是沙粒病毒S片段或L片段的3'UTR。在更具体的实施方式中，所述截短的5'UTR是沙粒病毒S片段或L片段的5'UTR。
本文还提供的是所述三片段沙粒病毒颗粒的cDNA。在更具体的实施方式中，本文提供的是如表2或表3所列编码三片段沙粒病毒颗粒的DNA核苷酸序列或DNA核苷酸序列的集合。
在某些实施方式中，编码所述三片段沙粒病毒基因组的核酸是一个或更多个DNA表达载体的部分或掺入一个或更多个DNA表达载体中。在具体的实施方式中，编码三片段沙粒病毒颗粒的基因组的核酸是一个或更多个DNA表达载体的部分或被掺入一个或更多个DNA表达载体中，所述DNA表达载体有助于本文描述的三片段沙粒病毒颗粒的生产。在另一个实施方式中，本文描述的cDNA可以被掺入质粒中。cDNA和表达系统的更详细的说明在章节4.5.1中提供。生产cDNA的技术是分子生物学和DNA操作与生产的惯常和常规的技术。可以使用熟练技术人员已知的任何克隆技术。这样的技术是公知的，熟练的技术人员可从实验手册中获得，例如，Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory N.Y.(2001)。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒的cDNA被导入(例如，转染如)宿主细胞中。因而，在某些实施方式中，本文提供的是宿主细胞，其包含三片段沙粒病毒颗粒的cDNA(即，三片段沙粒病毒颗粒的基因组片段的cDNA)。在其他实施方式中，本文描述的cDNA是DNA表达载体的部分或可以被掺入DNA表达载体中，并被导入宿主细胞。因而，在某些实施方式中，本文提供的是宿主细胞，其包含被掺入载体中的本文描述的cDNA。在其他实施方式中，本文描述的所述三片段沙粒病毒基因组片段(即，L片段和/或S片段或片段)被导入宿主细胞。
在某些实施方式中，本文描述的是生产三片段沙粒病毒颗粒的方法，其中所述方法包括转录所述三片段沙粒病毒颗粒的cDNA。在某些实施方式中，在体外或体内的三片段沙粒病毒颗粒的转录期间可以存在病毒聚合酶蛋白。在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段的转录使用双向的启动子进行。
在其他实施方式中，沙粒病毒基因组片段的转录使用双向的表达盒进行(参见，例如，Ortiz- et al.,2013,J Gen Virol.,94(Pt 6):1175–1188)。在更具体的实施方式中，所述双向的表达盒包含聚合酶I和聚合酶II启动子，其分别从对侧读取到插入的沙粒病毒基因组片段的两个末端。
在其他实施方式中，本文描述的沙粒病毒基因组片段的cDNA的转录包含启动子。启动子的具体实例包括RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子、SP6启动子或T3启动子。
在某些实施方式中，产生三片段沙粒病毒颗粒的方法可以进一步包括向宿主细胞中导入三片段沙粒病毒颗粒的cDNA。在某些实施方式中，所述生产三片段沙粒病毒颗粒的方法可以进一步包括向宿主细胞中导入三片段沙粒病毒颗粒的cDNA，其中所述宿主细胞表达用于生产所述三片段沙粒病毒颗粒的所有其他元件；以及从所述宿主细胞的上清液中纯化所述三片段沙粒病毒颗粒。这样的方法是本领域技术人员公知的。
本文提供的是细胞系、培养物和培养被本文提供的核酸、载体和组合物感染的细胞的方法。本文描述的核酸、载体系统和细胞系的更详细的说明在章节4.5中提供。
在某些实施方式中，本文描述的三片段沙粒病毒颗粒产生传染性的和复制型的沙粒病毒颗粒。在具体的实施方式中，本文描述的沙粒病毒颗粒是减毒的。在特定的实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒被减毒，从而所述病毒保持了，至少部分地保持了复制能力，并且可以在体内复制，但仅产生低的病毒负载，产生非致病的亚临床水平的感染。这种减毒病毒可以用作免疫原性组合物。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒具有与双片段沙粒病毒颗粒相同的向性。
本文还提供的是试剂盒，其在一个或更多个容器中包含本文描述的一种或更多种cDNA。在具体的实施方式中，试剂盒在一个或两个或更多个容器包含本文描述的三片段沙粒病毒颗粒。所述试剂盒可以进一步包含一种或更多种以下的：适合于挽救三片段沙粒病毒颗粒的宿主细胞、适合于将质粒cDNA转染到宿主细胞中的试剂、辅助病毒、编码病毒蛋白质的质粒和/或一种或更多种特异于修饰的沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒或编码它们的核酸的寡核苷酸引物。
本文还提供的是免疫原性组合物，其包含小节4.6和4.7中描述的三片段沙粒病毒颗粒。
4.2.1包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒
在一个方面，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其包含一个L片段和两个S片段。在某些实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的增殖不产生复制型的双片段病毒颗粒。在具体的实施方式中，在缺少I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因(RAG1)、用104PFU的所述三片段沙粒病毒颗粒感染的小鼠中，在至少10天、至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、或至少100天的持续感染之后，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的增殖不产生复制型的双片段病毒颗粒(参见章节4.8.13)。在其他实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的增殖在至少10次传代、至少20次传代、至少30次传代、至少40次传代或至少50次传代之后不产生复制型的双片段病毒颗粒。
所有病毒基因处于它们相应的野生型位置的三片段沙粒病毒颗粒是本领域已知的(例如，Emonet et al.,2011J.Virol.,85(4):1473；Popkin et al.,2011,J.Virol,85(15):7928)。特别地，所述三片段沙粒病毒基因组由一个L片段和两个S片段组成，其中异源ORF(例如，GFP)被插入到每个S片段上的一个位置中。更具体地，一个S片段分别编码GP和GFP。其他S片段分别编码GFP和NP。L片段编码L蛋白和Z蛋白。所有片段的侧翼都是各自的5'和3'UTR。
在某些实施方式中，本文提供的三片段沙粒病毒颗粒的两个S片段的片段内的重组，其将两个沙粒病毒ORF统一到一个片段而不是两个单独的片段上，产生非功能的启动子(即，以下结构的基因组片段：5’UTR-----------5’UTR或3'UTR------------3'UTR)，其中形成基因组的一个末端的每个UTR是同一基因组的另一个末端的反转的重复序列。
在某些实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置上携带沙粒病毒ORF。在其他实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒被工程化以在野生型位置之外的位置上携带两个沙粒病毒ORF、或三个沙粒病毒ORF、或四个沙粒病毒ORF、或五个沙粒病毒ORF、或六个沙粒病毒ORF。在具体的实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒包含所有四种沙粒病毒ORF的全体。因而，在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的和复制型的三片段沙粒病毒颗粒。在具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒的两个S片段被工程化以在野生型位置之外的位置携带它们的ORF之一。在更具体的实施方式中，所述两个S片段包含S片段ORF的全体。在某些具体的实施方式中，所述L片段被工程化以在野生型位置之外的位置携带ORF，或所述L片段可以是野生型基因组片段。
在某些实施方式中，所述两个S片段之一可以是：
(i)沙粒病毒S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)沙粒病毒S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)沙粒病毒S片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)沙粒病毒S片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)沙粒病毒S片段，其中编码L的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(vi)沙粒病毒S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
在某些实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒可以包含双份的ORF(即，两个野生型S片段ORF，例如，GP或NP)。在具体的实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒可以包含一个双份的ORF(例如，(GP，GP))或两个双份的ORF(例如，(GP，GP)与(NP，NP))。
下文的表2是包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的基因组架构的示例，其中三片段沙粒病毒基因组中两个S片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒，并且取消沙粒病毒启动子活性(即，产生的重组S片段由两个3'UTR组成，而不是由3'UTR和5'UTR组成)。
表2A
包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒
位置1处在沙粒病毒S片段5’UTR的控制下；位置2处在沙粒病毒S片段3'UTR的控制下；位置3处在沙粒病毒S片段5’UTR的控制下；位置4处在沙粒病毒S片段3'UTR的控制下；位置5处在沙粒病毒L片段5'UTR的控制下；位置6处在沙粒病毒L片段3'UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF。
在某些实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR。在具体的实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒S片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。例如，包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒，其中三片段沙粒病毒基因组中两个S片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒，并且取消沙粒病毒启动子活性(即，产生的重组S片段由两个5'UTR组成，而不是由3'UTR和5'UTR组成)。
在某些实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒中S片段和L片段的片段间重组，恢复了功能性的片段，其具有处在仅一个片段上、而不是两个独立的片段上的两个病毒基因。在其他实施方式中，所述包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒中S片段和L片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒。
下文的表2B是包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的基因组架构的示例，其中三片段沙粒病毒基因组中S片段和L片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒，并且取消沙粒病毒启动子活性(即，产生的重组S片段由两个3'UTR组成，而不是由3'UTR和5'UTR组成)。
表2B
包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒
位置1处在沙粒病毒S片段5’UTR的控制下；位置2处在沙粒病毒S片段3'UTR的控制下；位置3处在沙粒病毒S片段5’UTR的控制下；位置4处在沙粒病毒S片段3'UTR的控制下；位置5处在沙粒病毒L片段5'UTR的控制下；位置6处在沙粒病毒L片段3'UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF。
在某些实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR。在具体的实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒S片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。例如，包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒，其中三片段沙粒病毒基因组中两个S片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒，并且取消沙粒病毒启动子活性(即，产生的重组S片段由两个5'UTR组成，而不是由3'UTR和5'UTR组成)。
在某些实施方式中，本领域技术人员可以构建具有表2A或2B中说明的和如本文描述的架构的沙粒病毒基因组，然后使用章节4.8中描述的分析来测定所述三片段沙粒病毒颗粒是否是遗传稳定的，即，不产生此处讨论的复制型的双片段病毒颗粒。
4.2.2包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒
在一个方面，本文提供的是包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒。在某些实施方式中，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的增殖不产生复制型的双片段病毒颗粒在具体的实施方式中，在缺少I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因(RAG1)、用104PFU的所述三片段沙粒病毒颗粒感染的小鼠中，在至少10天、至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、或至少100天的持续感染之后，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的增殖不产生复制型的双片段病毒颗粒(参见章节4.8.13)。在其他实施方式中，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的增殖在至少10次传代、至少20次传代、至少30次传代、至少40次传代或至少50次传代之后不产生复制型的双片段病毒颗粒。
在某些实施方式中，本文提供的三片段沙粒病毒颗粒的两个L片段的片段内的重组，其将两个沙粒病毒ORF统一到一个片段而不是两个单独的片段上，产生非功能的启动子(即，以下结构的基因组片段：5’UTR-----------5’UTR或3'UTR------------3'UTR)，其中形成基因组的一个末端的每个UTR是同一基因组的另一个末端的反转的重复序列。
在某些实施方式中，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置上携带沙粒病毒ORF。在其他实施方式中，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒被工程化以在野生型位置之外的位置上携带一个沙粒病毒ORF、或三个沙粒病毒ORF、或四个沙粒病毒ORF、或五个沙粒病毒ORF、或六个沙粒病毒ORF。在具体的实施方式中，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒包含所有四种沙粒病毒ORF的全体。因而，在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的和复制型的三片段沙粒病毒颗粒。在具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒的两个L片段被工程化以在野生型位置之外的位置携带它们的ORF之一。在更具体的实施方式中，所述两个L片段包含L片段ORF的全体。在某些具体的实施方式中，所述S片段被工程化以在野生型位置之外的位置携带它们的ORF之一，或所述S片段可以是野生型基因组片段。
在某些实施方式中，两个L片段之一可以是：
(i)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)L片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(vi)L片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
在某些实施方式中，所述包含一个L片段和两个L片段的三片段沙粒病毒颗粒可以包含双份的ORF(即，两个野生型L片段ORF，例如，Z蛋白或L蛋白)。在具体的实施方式中，所述包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒可以包含一个双份的ORF(例如，(Z蛋白，Z蛋白))或两个双份的ORF(例如，(Z蛋白，Z蛋白)和(L蛋白，L蛋白))。
下文的表3是包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的基因组架构的示例，其中三片段沙粒病毒基因组中两个L片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒，并且取消沙粒病毒启动子活性(即，推定产生的重组L片段将由两个3'UTR或两个5'UTR组成，而不是由3'UTR和5'UTR组成)。根据表3，可以预测相似的组合用于产生由两个5'UTR组成而不是由3'UTR和5'UTR组成的沙粒病毒颗粒。
表3
包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒
*位置1处在沙粒病毒L片段5'UTR的控制下；位置2处在沙粒病毒L片段3'UTR的控制下；位置3处在沙粒病毒L片段5'UTR的控制下；位置4处在沙粒病毒L片段3'UTR的控制下；位置5处在沙粒病毒S片段5'UTR的控制下；位置6处在沙粒病毒S片段3'UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF。
在某些实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR。在具体的实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒S片段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。
在某些实施方式中，包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的L片段和S片段的片段间重组恢复功能性片段，其具有处在仅一个片段上而不是两个独立片段上的两个病毒基因。在其他实施方式中，包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒中L片段和L片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒。
下文的表3B是包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒的基因组架构的示例，其中三片段沙粒病毒基因组中L片段和S片段的片段间重组不产生复制型的双片段病毒颗粒，并且取消沙粒病毒启动子活性(即，产生的重组S片段将由两个3'UTR组成，而不是由3'UTR和5'UTR组成)。
表3B
包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒
*位置1处在沙粒病毒L片段5'UTR的控制下；位置2处在沙粒病毒L片段3'UTR的控制下；位置3处在沙粒病毒L片段5'UTR的控制下；位置4处在沙粒病毒L片段3'UTR的控制下；位置5处在沙粒病毒S片段5'UTR的控制下；位置6处在沙粒病毒S片段3'UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF。
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
NP Z *ORF GP L *ORF
NP Z GP *ORF *ORF L
NP Z *ORF GP L *ORF
NP Z GP *ORF *ORF L
NP L *ORF GP Z *ORF
NP L GP *ORF *ORF Z
NP L *ORF GP Z *ORF
NP L GP *ORF *ORF Z
GP Z *ORF NP L *ORF
GP Z NP *ORF *ORF L
GP Z *ORF NP L *ORF
GP L NP *ORF *ORF Z
GP L *ORF NP Z *ORF
GP L NP *ORF *ORF Z
在某些实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒S片段或L片段IGR。在具体的实施方式中，位置一和位置二之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR；位置二和位置三之间的IGR可以是沙粒病毒L片段IGR；位置五和位置六之间的IGR可以是沙粒病毒S片段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。
在某些实施方式中，本领域技术人员可以构建具有表3A或3B中说明的和如本文描述的架构的沙粒病毒基因组，然后使用章节4.8中描述的分析来测定所述三片段沙粒病毒颗粒是否是遗传稳定的，即，不产生此处讨论的复制型的双片段病毒颗粒。
4.2.3复制缺陷的三片段沙粒病毒颗粒
在某些实施方式中，本文提供的是三片段沙粒病毒颗粒，其中(i)ORF处在所述ORF的野生型位置之外的位置上；和(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被移除或功能上灭活，从而产生的病毒不能产生进一步的传染性子代病毒颗粒(即，是复制缺陷的)。在某些实施方式中，所述第三沙粒病毒片段可以是S片段。在其他实施方式中，所述第三沙粒病毒片段可以是L片段。在更具体的实施方式中，所述第三沙粒病毒片段可以被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF，或所述第三沙粒病毒片段可以是野生型沙粒病毒基因组片段。在又更具体的实施方式中，所述第三沙粒病毒片段缺乏编码GP、NP、Z蛋白或L基因的沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，三片段基因组片段可以是S或L片段杂交物(即，基因组片段可以是S片段和L片段的组合)。在其他实施方式中，所述杂交片段是包含L片段IGR的S片段。在另一个实施方式中，所述杂交片段是包含S片段IGR的L片段。在其他实施方式中，所述杂交片段是具有L片段IGR的S片段UTR。在另一个实施方式中，所述杂交片段是具有S片段IGR的L片段UTR。在具体的实施方式中，所述杂交片段是具有L片段IGR的S片段5'UTR或具有L片段IGR的S片段3'UTR。在其他具体实施方式中，所述杂交片段是具有S片段IGR的L片段5'UTR或具有S片段IGR的L片段3'UTR。
A包含一个或更多个ORF已被删除或功能灭活的遗传修饰的基因组的三片段沙粒病毒颗粒可以在补充细胞(即，表达被删除或功能灭活的沙粒病毒ORF的细胞)中产生。产生的沙粒病毒颗粒的遗传材料可以在感染宿主细胞时传递到所述宿主细胞中，在其中所述遗传材料可以被表达和扩增。此外，本文描述的遗传修饰的沙粒病毒颗粒的基因组可以编码来自沙粒病毒颗粒之外的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在另一个实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少一个ORF、至少两个ORF、至少三个ORF或至少四个ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在具体的实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的仅一个被移除或用来自沙粒病毒颗粒之外的生物体的异源ORF替换。在更具体的实施方式中，沙粒病毒基因组片段的编码GP的ORF被移除。在另一个具体的实施方式中，沙粒病毒基因组片段的编码NP的ORF被移除。在更具体的实施方式中，沙粒病毒基因组片段的编码Z蛋白的ORF被移除。在又一个具体的实施方式中，编码L蛋白的ORF被移除。
在某些实施方式中，本文提供的是包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒，其中(i)ORF处在所述ORF的野生型位置之外的位置上；和(ii)编码GP或NP的ORF被移除或功能上灭活，从而产生的病毒是复制缺陷的和非传染性的。在具体的实施方式中，一个ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在另一个具体的实施方式中，两个ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在其他具体实施方式中，三个ORF比移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在具体的实施方式中，编码GP的ORF比移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在其他具体实施方式中，编码NP的ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在又更具体的实施方式中，编码NP的ORF和编码GP的ORF被移除并用来自沙粒病毒颗粒之外的生物体的一个或两个异源ORF替换。因而，在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒包含(i)一个L片段和两个S片段；(ii)在ORF的野生型位置之外的位置上的ORF；(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或更多个异源ORF。
在某些实施方式中，本文提供的是包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒颗粒，其中(i)ORF处于所述ORF是野生型位置之外的位置上；和(ii)编码Z蛋白和/或L蛋白的ORF被移除或功能上灭活，从而产生的病毒是复制缺陷的和无传染性的。在具体的实施方式中，一个ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在另一个具体的实施方式中，两个ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在具体的实施方式中，编码Z蛋白的ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在其他具体实施方式中，编码L蛋白的ORF被移除并用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。在又更具体的实施方式中，编码Z蛋白的ORF和编码L蛋白的ORF被移除或用来自沙粒病毒颗粒之外的生物体的异源ORF替换。因而，在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒包含(i)两个L片段和一个S片段；(ii)在ORF的野生型位置之外的位置上的ORF；(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF。
因而，在某些实施方式中，本文提供的所述三片段沙粒病毒颗粒包含三片段沙粒病毒颗粒(即，一个L片段和两个S片段，或两个L片段和一个S片段)，其(i)被工程化以在非天然位置携带ORF，(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被移除；(iii)被移除的ORF用来自沙粒病毒之外的生物体的一个或更多个异源ORF替换。
在某些实施方式中，所述异源ORF的长度是8到100个核苷酸、15到100个核苷酸、25到100个核苷酸、50到200个核苷酸、50到400个核苷酸、200到500个核苷酸、或400到600个核苷酸、500到800个核苷酸。在其他实施方式中，所述异源ORF的长度是750到900个核苷酸、800到100个核苷酸、850到1000个核苷酸、900到1200个核苷酸、1000到1200个核苷酸、1000到1500个核苷酸，或10到1500个核苷酸、1500到2000个核苷酸、1700到2000个核苷酸、2000到2300个核苷酸、2200到2500个核苷酸、2500到3000个核苷酸、3000到3200个核苷酸、3000到3500个核苷酸、3200到3600个核苷酸、3300到3800个核苷酸、4000个核苷酸到4400个核苷酸、4200到4700个核苷酸、4800到5000个核苷酸、5000到5200个核苷酸、6000到6400个核苷酸、6200到6800个核苷酸、6600到7000个核苷酸、7000到7200个核苷酸、7200到7500个核苷酸、或7500个核苷酸。在一些实施方案中，所述异源ORF肽或多肽，其长度为5到10个氨基酸、10到25个氨基酸、25到50个氨基酸、50到100个氨基酸、100到150个氨基酸、150到200个氨基酸、200到250个氨基酸、250到300个氨基酸、300到400个氨基酸、400到500个氨基酸、500到750个氨基酸、750到1000个氨基酸、1000到1250个氨基酸、1250到1500个氨基酸、1500到1750个氨基酸、1750到2000个氨基酸、2000到2500个氨基酸，或超过2500个或更多个氨基酸。在某些实施方式中，所述异源ORF编码多肽，其长度不超过2500个氨基酸。在具体的实施方式中，所述异源ORF不含有终止密码子。在某些实施方式中，所述异源ORF是密码子优化的。在某些实施方式中，所述核苷酸组合物、核苷酸组合物或两者可以是优化的。这种优化的技术是本领域已知的，可以用于优化异源ORF。
来自沙粒病毒之外的生物体的任何异源ORF可以被包括在所述三片段沙粒病毒颗粒中。在一个实施方式中，所述异源ORF编码报告蛋白。报告蛋白的更详细的说明在章节4.3中描述。在另一个实施方式中，所述异源ORF编码能够引发免疫应答的传染性的病原体的抗原或与任何疾病相关的抗原。在具体的实施方式中，所述抗原来源于传染性生物体、肿瘤(即，癌症)、或过敏原。异源ORF的更详细的说明见章节4.3。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒的生长和感染性不受来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF的影响。
本领域技术人员已知的技术可以用于产生包含沙粒病毒基因组片段的沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒基因组片段被工程化以在野生型位置之外的位置携带沙粒病毒ORF。例如，反向遗传学技术可以用于产生这样的沙粒病毒颗粒。在其他实施方式中，复制缺陷的沙粒病毒颗粒(即，被工程化以在野生型位置之外的位置携带沙粒病毒ORF的沙粒病毒基因组片段，其中编码GP、NP、Z蛋白、L蛋白的ORF被删除)可以在补充细胞中产生。
在某些实施方式中，根据当前的应用使用的三片段沙粒病毒颗粒可以是旧世界的病毒，例如，LCMV。
在某些实施方式中，当前的应用涉及适合用作疫苗的本文描述的沙粒病毒颗粒，以及在疫苗接种和例如感染和癌症的治疗或预防中使用这样的沙粒病毒颗粒的方法。使用本文描述的沙粒病毒颗粒的方法的更详细的说明在章节4.6中提供。
在某些实施方式中，当前的应用涉及适合用作药物组合物的本文描述的沙粒病毒颗粒，以及在疫苗接种或例如感染或癌症的治疗或预防中使用这样的沙粒病毒颗粒的方法。使用本文描述的沙粒病毒颗粒的方法的更详细的说明在章节4.6中提供。
4.3表达异源ORF的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒
在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段以及相应的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以包含异源ORF。在其他实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段和相应的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以包含目的基因。在更具体的实施方式中，所述异源ORF或所述目的基因编码抗原。在更具体的实施方式中，所述异源ORF或所述目的基因编码报告蛋白或荧光蛋白。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒可以包含一个或更多个异源ORF或一个或更多个目的基因。在其他实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒可以包含至少一个异源ORF、至少两个异源ORF、至少三个异源ORF、或更多个异源ORF。在其他实施方式中，所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒包含至少一个目的基因、至少两个目的基因、至少三个目的基因、或更多个目的基因。
各种各样的抗原可以由本申请的沙粒病毒基因组片段、沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒表达。在一个实施方式中，所述异源ORF编码能够引发免疫应答的传染性病原体的抗原或与任何疾病相关的抗原。在某些实施方式中，所述异源ORF可以编码衍生自病毒、细菌、真菌、寄生虫的抗原，或可在肿瘤或肿瘤相关疾病(即，癌症)、自身免疫性疾病、退化性疾病、遗传性疾病、物质依赖性、肥胖症或变应性疾病中表达。
在某些实施方式中，所述异源ORF编码病毒抗原。病毒抗原的非限制性实例包括来自以下的抗原：腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒和禽腺病毒)、疱疹病毒科(例如，单纯性疱疹病毒1、单纯性疱疹病毒2、单纯性疱疹病毒5、单纯性疱疹病毒6、Epstein-Barr病毒、HHV6-HHV8和巨细胞病毒)、光滑病毒科(例如，光滑病毒、肠细菌MS2噬菌体、allolevirus)、痘病毒科(例如，脊索痘病毒亚科(chordopoxyirinae)、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒(capripoxvirus)、野兔痘病毒(leporiipoxvirus)、猪痘病毒(suipoxvirus)、软疣痘病毒(molluscipoxvirus)、和昆虫痘病毒科)、乳多空病毒科(例如，多瘤病毒和乳头状瘤病毒)、副粘病毒科(例如，副粘病毒、副流感病毒1、麻疹病毒(mobillivirus)(例如，麻疹病毒(mobillivirus))、腮腺炎病毒(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒(mumps virus))、肺病毒科(pneumonovirinae)(例如，肺病毒(pneumovirus)、人类呼吸道合胞体病毒)、人类呼吸道合胞体病毒和偏肺病毒(metapneumovirus)(例如，禽肺病毒和人类偏肺病毒)、小RNA病毒科(例如，肠病毒、鼻病毒、肝病毒(例如，人类甲型肝炎病毒)、心病毒(cardiovirus)和口疮病毒(apthovirus))、呼肠孤病毒科(例如，正呼肠弧病毒、环状病毒(orbivirus)、轮状病毒、多角体病毒(cypovirus)、斐济病毒(fijivirus)、植物呼肠弧病毒(phytoreovirus)和水稻病毒(oryzavirus))、逆转录病毒科(例如，哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽类C型逆转录病毒、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒(例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)1和HIV-2(例如，HIV gp160)、泡沫病毒(spumavirus))、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒)、肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)、披膜病毒科(togaviridae)(例如，甲病毒(例如，辛德毕斯病毒)和风疹病毒(rubivirus)(例如，风疹病毒(rubella virus))、弹状病毒科(rhabdoviridae)(例如，水泡性病毒(vesiculovirus)、狂犬病毒、流行热病毒(ephemerovirus)、质型弹状病毒(cytorhabdovirus)和核型弹状病毒(necleorhabdovirus))、沙粒病毒科(例如，沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊皮病毒(Ippy virus)和拉沙病毒)以及冠状病毒科(例如，冠状病毒和环曲病毒)。在具体的实施方式中，所述病毒抗原是HIV gp120、gp41、HIVNef、RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白、HTLV tax、单纯性疱疹病毒糖蛋白(例如，gB、gC、gD和gE)或乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎病毒E蛋白或冠状病毒刺突蛋白。在一个实施方式中，所述病毒抗原不是HIV抗原。
在其他实施方式中，所述异源ORF编码细菌抗原(例如，细菌外壳蛋白)。在其他实施方式中，所述异源ORF编码寄生虫抗原(例如，原生动物抗原)。在又其他的实施方式中，异源核苷酸序列编码真菌抗原。
细菌抗原的非限制性实例包括来自以下细菌的抗原：水螺菌属家族(Aquaspirillum family)、固氮螺菌属家族(Azospirillum family)、固氮菌科家族(Azotobacteraceae family)、类杆菌科家族(Bacteroidaceae family)、巴尔通氏体属物种(Bartonella species)、蛭弧菌属家族(Bdellovibrio family)、弯曲杆菌属物种(Campylobacter species)、衣原体物种(Chlamydia species)(例如，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、梭状芽胞杆菌属(clostridium)、肠杆菌科家族(Enterobacteriaceae family)(例如柠檬酸细菌属物种(Citrobacter species)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、欧文氏菌物种(Enviniaspecies)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Hafnia物种(Hafnia species)、克雷伯杆菌属物种(Klebsiella species)、摩根氏菌属物种(Morganella species),普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属物种(Salmonellaspecies)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、披毛菌属家族(Gardinella family)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、盐杆菌科家族(Halobacteriaceae family)、螺杆菌属家族(Helicobacter family)、Legionallaceae家族(Legionallaceae family)、李斯特菌属物种(Listeria species)、甲基球菌科家族(Methylococcaceae family)、分枝杆菌属(mycobacteria)(例如，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、奈瑟氏球菌科家族(Neisseriaceae family)、海洋螺菌属家族(Oceanospirillum family)、巴斯德菌科家族(Pasteurellaceae family)、肺炎球菌属物种(Pneumococcus species)、假单胞菌属物种(Pseudomonas species)、根瘤菌科家族(Rhizobiaceae family)、螺菌属家族(Spirillum family)、无毛螺旋体科家族(Spirosomaceae family)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，甲氧西林抗性金黄葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)和葡萄球菌致热源(Staphylococcus pyrogenes))、链球菌属(Streptococcus)(例如，肠炎链球菌(Streptococcus enteritidis)、Streptococcus fasciae和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae))、蝙蝠弧菌属螺旋杆菌家族(Vampirovibr Helicobacter Family)、耶尔森氏菌属家族(Yersinia family)、,炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)和蝙蝠弧菌属家族(Vampirovibrio family)。
寄生虫抗原的非限制性实例包括来自寄生虫例如阿米巴、疟原虫、疟原虫属、克氏锥虫的抗原。真菌抗原的非限制性实例包括来自以下真菌的抗原：犁头霉属物种(AbsidiaSpecies)(例如，伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)和分枝犁头霉(Absidia ramosa))、曲霉属物种(Aspergillus Species)(例如，黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲菌(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)和土曲霉(Aspergillus terreus))、蛙生蛙粪霉(Basidiobolus ranarum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌属物种(Candida Species)(例如，白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克尔念珠菌(Candida kerr)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、伪热带念珠菌(Candida pscudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida quillermondii)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、类星形念珠菌(Candida stellatoidea)和热带假丝酵母(Candidatropicalis))、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、耳霉属物种(Conidiobolusspecies)、新型隐球菌(Cryptococcus neoforms)、小克银汉霉物种(Cunninghamellaspecies)、皮肤真菌、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、微小毛霉菌(Mucor pusillus)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、波氏假性阿利什霉(Pseudallescheria boydii)、西伯鼻孢子菌(Rhinosporidium seeberi)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii)、根霉属物种(Rhizopus species)(例如，少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizopusoryzae)和小孢根霉(Rhizopus microsporus))、酵母菌属物种(Saccharomyces species)、申克孢子丝菌(Sporthrix schenckii)、接合菌、以及例如接合菌(Zygomycetes)、子囊菌(Ascomycetes)、担子菌(Basidiomycetes)、半知菌(Deuteromycetes)和卵菌(Oomycetes)的分类。
在某些实施方式中，异源ORF编码肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肿瘤抗原或肿瘤相关抗原包括来自肿瘤相关疾病的抗原，包括急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、儿童期肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症、卡波西肉瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外的(参见胆管细胞癌)、膀胱癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑肿瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、视神经原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤、类癌肿瘤、类癌胃肠道肿瘤、未知原发癌、中枢神经系淋巴瘤、原发性、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性支气管炎、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、Ewing氏肿瘤家族中的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌(胃癌)、胃肠类癌肿瘤、胃肠道基质瘤、生殖细胞肿瘤：颅外、性腺外或卵巢妊娠期的滋养细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质瘤、儿童期脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波斯肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、成淋巴细胞性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌、非小细胞、小细胞、艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、原发性中枢神经系统、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、眼内(眼)、merkel细胞癌、间皮瘤、成人恶性、间皮瘤、隐匿性原发的转移性的鳞状颈部癌症、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、成人急性骨髓性白血病、儿童急性骨髓瘤、多发性骨髓瘤(骨髓癌)、骨髓增生性疾病、慢性鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨骼恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤形成/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童期、唾液腺癌、肉瘤、Ewing肿瘤家族、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、精液综合征、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑素瘤)、merkel细胞皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌-见皮肤癌(非黑色素瘤)、隐匿性原发的转移性鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤的-参见蕈样真菌病和Sézary综合征、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的儿童期移行细胞、妊娠滋养细胞瘤、未知原发部位癌症、成人未知原发部位癌症、儿童输尿管和肾盂移行细胞癌、咽喉癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、支气管肿瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤；儿童脊索瘤、结肠直肠癌、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病(成人/儿童)、小细胞肺癌、髓性上皮瘤、口腔癌、乳头状瘤病、中间分化的松果体实质性肿瘤、涉及染色体15上的NUT基因的呼吸道癌、脊髓肿瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、阴道癌；外阴癌和威尔姆斯肿瘤。
肿瘤或肿瘤相关抗原的非限制性实例包括亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CPSF、cyclin D1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、glypican-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、肠道羧基酯酶、alpha-甲胎蛋白、Kallikrein 4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、VEGF、或WT1、EGF-R、CEA、CD52、gp 100蛋白、MELANA/MART1、NY-ESO-1、p53MAGE1、MAGE3和CDK4、alpha-辅肌动蛋白-4、ARTC1、BCR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、beta-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、CLPP、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延长因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARalpha融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TGF-betaRII、磷酸丙糖异构酶、Lengsin、M-CSF、MCSP、或mdm-2。
在某些实施方式中，所述异源ORF编码呼吸道病原体抗原。在具体的实施方式中，所述呼吸道病原体是病毒，如RSV、冠状病毒、人类偏肺病毒、副流感病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、腺病毒、鼻病毒或PRRSV。呼吸道病毒抗原的非限制性实例包括呼吸道合胞体病毒F、G和M2蛋白，冠状病毒(SARS、HuCoV)刺突蛋白(S)、人类偏肺病毒融合蛋白、副流感病毒融合蛋白和血细胞凝集素蛋白(F，HN)、亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)附着糖蛋白(G和F)、腺病毒衣壳蛋白、鼻病毒蛋白、PRRSV野生型或修饰的GP5和M蛋白。
在具体的实施方式中，所述呼吸道病原体是细菌，例如炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)、金黄葡萄球菌(staphylococcus aureus)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitides)和流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)。呼吸道细菌抗原的非限制性实例包括炭疽杆菌保护性抗原PA、结核分枝杆菌分枝杆菌抗原85A和热激蛋白(Hsp65)、百日咳杆菌百日咳类毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)、肺炎链球菌分离酶A和表面粘附素A(PsaA)、鼠疫耶尔森菌F1和V亚基，以及来自金黄色葡萄球菌、土拉曼弗朗西斯菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、绿脓假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌的蛋白质。
在某些实施方式中，所述异源ORF编码T细胞表位。在其他实施方式中，所述异源ORF编码细胞因子或生长因子。
在其他实施方式中，所述异源ORF编码自身免疫性疾病中表达的抗原。在更具体的实施方式中，所述自身免疫性疾病可以是I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮和银屑病。自身免疫性疾病抗原的非限制性实例包括Ro60、dsDNA或RNP。
在其他实施方式中，ORF编码变应性疾病中表达的抗原。在更具体的实施方式中，所述变应性疾病包括但不限于季节性和常年性鼻结膜炎、哮喘和湿疹。变应性抗原的非限制性实例包括Bet v 1和Fel d 1。
在其他实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒进一步包含报告蛋白。所述报告蛋白能够与本文描述的抗原同时表达。理想地，表达在正常光或其他波长的光下是可见的。在某些实施方式中，报告蛋白产生的效应的强度被用于直接测量和监视所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。
报告基因将是本领域技术人员容易识别的。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒是荧光蛋白。在其他实施方式中，所述报告基因是GFP。当暴露于UV或蓝光时GFP发生亮绿色的光。
报告蛋白的非限制性实例包括各种酶，例如，但不限于β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、荧光素酶或RFP。
在某些实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒具有作为载体用于用于疫苗接种的期望的性质(参见，例如，章节4.6)。在另一个实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒能够在宿主(例如，小鼠、兔、山羊、驴、人类)中诱导免疫应答。在其他实施方式中，本文描述的表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒诱导先天免疫反应。在其他实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒诱导适应性免疫反应。在更具体的实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒同时诱导先天免疫反应和适应性免疫反应。
在另一个实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒诱导T细胞反应。在又更具体的实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒诱导CD8+T细胞反应。在其他实施方式中，带有目的外源基因的沙粒病毒颗粒诱导高频率和功能性的强力的CD8+T细胞反应。表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒诱导CD8+T细胞反应，其特异于相应的目的外源基因的一个或多个表位。
在某些实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒可以诱导T辅助细胞1分化、CD4+T细胞的记忆形成和/或引发耐久的抗体反应。这些抗体可以是中和性的、调理性的、对肿瘤细胞有毒的，或具有其他有利的生物学特征。在其他实施方式中，表达异源ORF的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒具有对树突状细胞的强趋向性，并在感染时活化它们。这强化了抗原递呈细胞的抗原呈递。
在某些实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的所述沙粒病毒基因组片段、所述沙粒病毒颗粒或所述三片段沙粒病毒颗粒诱导低的或不可检测的针对LCMV的中和抗体滴度，以及针对相应的外源转基因的高的保护性的中和抗体反应。表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的、形成颗粒的沙粒病毒主干或三片段沙粒病毒颗粒具有很低的能力诱导针对沙粒病毒主干部件的免疫性。
4.4沙粒病毒颗粒和三片段沙粒病毒颗粒的产生
一般地，沙粒病毒颗粒可以通过对LCMV描述的标准反向遗传技术重组地产生(参见，Flatz et al.,2006,Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668；Sanchez et al.,2006,Virology 350:370；Ortiz-Riano et al.,2013,J Gen Virol.94:1175-88，通过引用将其合并在本文中)。为了产生本文提供的沙粒病毒颗粒，这些技术可以如下所述地应用。病毒的基因组可以分别如章节4.1和章节4.2中描述的修饰。
4.4.1非天然位置开放阅读框
包含被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带病毒ORF的基因组片段的沙粒病毒颗粒的产生可以通过本领域技术人员已知的任何反向遗传技术来重组地产生。
(i)传染性的和复制型的沙粒病毒颗粒
在某些实施方式中，所述产生沙粒病毒颗粒的方法包括(i)向宿主细胞中转染第一沙粒病毒基因组片段的cDNA；(ii)向宿主细胞转染第二沙粒病毒基因组片段的cDNA；(iii)向宿主细胞中转染表达沙粒病毒的最小反式作用因子NP和L的质粒；(iv)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和(v)收获所述沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施方式中，所述cDNA包含在质粒内。
一旦从cDNA中产生，沙粒病毒颗粒(即，传染性的和复制型的)可以增殖。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒可以在任何宿主细胞中增殖，所述宿主细胞容许病毒生长到容许本文描述的病毒的运用的滴度。在一个实施方式中，所述宿主细胞容许所述沙粒病毒颗粒生长到与对相应的野生型测定的滴度可比较的滴度。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒可以在宿主细胞中增殖。可以使用的宿主细胞的具体实例包括BHK-21、HEK 293、VERO或其他。在具体的实施方式中，所述沙粒病毒颗粒可以在细胞系中增殖。
在某些实施方式中，所述宿主细胞被保持在培养物中，并用一种或更多种质粒转染。在适合于在哺乳动物细胞中表达的一个或更多个表达盒的控制下，质粒表达要产生的沙粒病毒基因组片段，例如，所述表达盒由聚合酶I启动子和终止子组成。
可以用于产生沙粒病毒颗粒的质粒可包括：i)编码S基因组片段，例如pol-I S的质粒，ii)编码L基因组片段，例如pol-I L的质粒。在某些实施方式中，编码指导病毒L和S片段的细胞内合成的沙粒病毒聚合酶的质粒可以掺入转染混合物中。例如，可以存在编码L蛋白的质粒和/或编码NP的质粒(分别为pC-L和pC-NP)。L蛋白和NP是病毒RNA转录和复制所必需的最小反式作用因子。做为选择，与NP和L蛋白一起，病毒L和S片段的细胞内合成可以使用表达盒进行，具有分别从对侧阅读到两个独立质粒的L和S片段cDNA的pol-I和pol-II启动子。
在某些实施方式中，所述沙粒病毒基因组片段处在启动子的控制下。一般地，可以使用RNA聚合酶I驱动的表达盒、RNA聚合酶II驱动的表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶驱动的表达盒。在某些实施方式中，编码沙粒病毒基因组片段的质粒可以是相同的，即，基因组序列和反式作用因子可以从一个质粒通过启动子转录。启动子的具体实例包括RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子、SP6启动子或T3启动子。
此外，质粒可以具有哺乳动物选择标志物，例如，嘌呤霉素抗性，处在适合于哺乳动物细胞中基因表达的表达盒的控制下，例如，上述的聚合酶II表达盒，或者所述病毒基因转录产物可以跟随着内部核糖体进入位点，例如，脑心肌炎病毒的，随后是哺乳动物抗性标志物。对于在E.coli中生产，所述质粒另外具有细菌选择标志物，例如，氨苄西林抗性盒。
用质粒转染宿主细胞可以使用任何常用的策略来进行，例如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔。数天以后，以滴定浓度添加适合的选择试剂，例如，嘌呤霉素。根据标准过程分离存活的克隆并进行亚克隆，使用针对目的病毒蛋白质的抗体、用Western印迹或流式细胞计过程鉴定高表达的克隆。
为了回收本文描述的沙粒病毒颗粒，设想以下过程。第一天：细胞，一般是在M6-孔平板上80％汇合的，用如上所述的质粒的混合物转染。为此，可以利用任何常用的策略，例如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养的上清液(沙粒病毒载体制品)，等分并保存在4℃、-20℃或-80℃，取决于使用前要保存沙粒病毒载体多久。通过免疫病灶分析来评估沙粒病毒载体制品的传染性滴度。做为选择，转染的细胞和上清液可以在转染后3-5天传代到更大的容器中(例如，T75组织培养烧瓶)，传代后五天收获培养物上清液。
本申请进一步涉及异源ORF的表达，其中编码基因组片段的质粒被修饰以掺入异源ORF。异源ORF可以使用限制酶掺入到质粒中。
(ii)传染性的、复制缺陷的沙粒病毒颗粒
传染性的、复制缺陷的沙粒病毒颗粒可以如上所述拯救。然而，一旦从cDNA中产生，本文提供的传染性的复制缺陷性沙粒病毒可以在补充细胞中增殖。补充细胞是提供功能的细胞，所述功能是通过对其基因组的修饰从复制缺陷性沙粒病毒中消除的(例如，如果编码GP蛋白的ORF被删除或功能灭活，补充细胞就提供GP蛋白)。
由于沙粒病毒载体中一个或更多个ORF的去除或功能性灭活(在此，糖蛋白GP的删除作为例子)，沙粒病毒载体可以在反式提供了删除的病毒基因，例如，当前实施例中为GP的细胞中产生和扩增。通过用表达目的病毒基因的一个或更多个质粒(补充质粒，称为C-质粒)转染细胞系如BHK-21、HEK 293、VERO或其他来产生这样的补充细胞系，以下称为C-细胞。在适合于哺乳动物细胞中表达的一个或更多个表达盒的控制下，例如，哺乳动物聚合酶II启动子，如具有多腺苷酸化信号的EF1alpha启动子，C-质粒表达要生产的沙粒病毒载体中删除的病毒基因。此外，补充质粒可以具有哺乳动物选择标志物，例如，嘌呤霉素抗性，处在适合于哺乳动物细胞中基因表达的表达盒的控制下，例如，上述的聚合酶II表达盒，或者所述病毒基因转录产物可以跟随着内部核糖体进入位点，例如，脑心肌炎病毒之一，随后是哺乳动物抗性标志物。对于在E.coli中生产，质粒另外具有细菌选择标志物，例如，氨苄西林抗性盒。
可以使用的细胞，例如BHK-21、HEK 293、MC57G或其他可以保持在培养物中，使用任一种常用的策略如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔用补充质粒转染。数天以后，以滴定浓度添加适合的选择试剂，例如，嘌呤霉素。根据标准过程分离存活的克隆并进行亚克隆，使用针对目的病毒蛋白质的抗体、用Western印迹或流式细胞计过程鉴定高表达的C-细胞克隆。作为对使用稳定转染的C-细胞的替代，在下文使用C-细胞的每个步骤中，正常细胞的短暂转染可以补充缺失的病毒基因。此外，辅助病毒可以用于反式提供缺失的功能。
质粒可以是两种类型：i)两个质粒，称为TF-质粒，用于在C-细胞中细胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子，在当前实施例中来源于例如LCMV的NP和L蛋白；和ii)质粒，称为GS-质粒，用于在C-细胞中细胞内表达沙粒病毒载体基因组片段，例如，具有设计的修饰的片段。TF-质粒在适合于哺乳动物细胞中蛋白质表达的表达盒的控制下表达相应的沙粒病毒载体的NP和L蛋白，一般地，为哺乳动物聚合酶II启动子，例如CMV或EF1alpha启动子，它们的任一优选地与多腺苷酸化信号组合。GS-质粒表达载体的小(S)和大(L)基因组片段。一般地，可以使用聚合酶I驱动的表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶(T7-)驱动的表达盒，后者优选地具有3'-末端核酶，用于加工主转录产物以产生正确的末端。在使用基于T7的系统情况下，必需通过在恢复过程中包括类似TF-质粒而构建的、提供T7的其他表达质粒，或构建C-细胞来以稳定的方式另外表达T7，以提供C-细胞中T7的表达。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是同一个，即，基因组序列和反式作用因子可以通过T7、polI和polII启动子从一个质粒转录。
为了回收沙粒病毒载体，可以使用以下过程。第一天：C-细胞，一般是在M6-孔平板上80％汇合的，用两个TF-质粒加两个GS-质粒的混合物转染。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是同一个，即，基因组序列和反式作用因子可以通过T7、polI和polII启动子从一个质粒转录。为此，可以利用的任一种常用的策略，例如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养的上清液(沙粒病毒载体制品)，等分并保存在4℃、-20℃或-80℃，取决于使用前要保存沙粒病毒载体多久。然后在C-细胞上通过免疫病灶分析来评估沙粒病毒载体制品的传染性滴度。做为选择，转染的细胞和上清液可以在转染后3-5天传代到更大的容器中(例如，T75组织培养烧瓶)，传代后五天收获培养上清液。
本发明进一步涉及抗原在细胞培养物中的表达，其中所述细胞培养物用表达抗原的传染性的复制缺陷性沙粒病毒感染。当用于在培养的细胞中表达抗原时，可以使用以下两个过程：
i)以一或更多，例如二、三或四的感染复数(MOI)用本文描述的沙粒病毒载体制品感染目的细胞类型，引起感染后不久在所有细胞中所述抗原的产生。
ii)做为选择，可以使用更低的MOI，可以根据病毒驱动的抗原表达水平选择单独的细胞克隆。随后，由于沙粒病毒载体的非细胞溶解特征，单独的克隆可以无限地扩展。与途径无关，随后可以从培养物上清液或从细胞自身采集(和纯化)抗原，取决于产生的抗原的性质。然而，本发明不局限于这两种策略，也可以考虑使用传染性的复制缺陷性沙粒病毒作为载体驱动抗原表达的其他方式。
4.4.2三片段沙粒病毒颗粒的产生
三片段沙粒病毒颗粒可以通过本领域已知的反向遗传技术重组地产生，例如，Emonet et al.,2008,PNAS,106(9):3473-3478；Popkin et al.,2011,J.Virol.,85(15):7928–7932所描述的，通过引用将其合并在本文中。本文提供的三片段沙粒病毒颗粒的产生可以如章节4.2中描述的修改。
(i)传染性的和复制型的三片段沙粒病毒颗粒
在某些实施方式中，产生三片段沙粒病毒颗粒的方法包括(i)向宿主细胞中转染一个L片段和两个S片段、或者两个L片段和一个S片段的cDNA；(ii)向宿主细胞中转染表达沙粒病毒的最小反式作用因子NP和L的质粒；(iii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和(iv)收获所述沙粒病毒颗粒。
一旦从cDNA中产生，所述三片段沙粒病毒颗粒(即，传染性的和复制型的)可以增殖。在某些实施方式中，三片段沙粒病毒颗粒可以在任何宿主细胞中增殖，所述宿主细胞容许病毒生长到容许本文描述的病毒的运用的滴度。在一个实施方式中，所述宿主细胞容许所述三片段沙粒病毒颗粒生长到与对相应的野生型测定的滴度可比较的滴度。
在某些实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒可以在宿主细胞中增殖。可以使用的宿主细胞的具体实例包括BHK-21、HEK 293、VERO或其他。在具体的实施方式中，所述三片段沙粒病毒颗粒可以在细胞系中增殖。
在某些实施方式中，所述宿主细胞被保持在培养物中，并用一种或更多种质粒转染。在适合于在哺乳动物细胞中表达的一个或更多个表达盒的控制下，质粒表达要产生的沙粒病毒基因组片段，例如，所述表达盒由聚合酶I启动子和终止子组成。
在具体的实施方式中，所述宿主细胞被保持在培养物中，并用一种或更多种质粒转染。在适合于在哺乳动物细胞中表达的一个或更多个表达盒的控制下，质粒表达要产生的病毒基因，例如，所述表达盒由聚合酶I启动子和终止子组成。
可以用于生产包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒的质粒可以包括：1)两个质粒，各自编码S基因组片段，例如pol-I S，ii)编码L基因组片段例如pol-I L的质粒。包含两个L片段和一个S片段的三片段沙粒病毒需要的质粒是：i)两个质粒，各自编码L基因组片段，例如，pol-L，ii)编码S基因组片段例如pol-I S的质粒。
在某些实施方式中，编码指导病毒的L和S片段的细胞内合成的沙粒病毒聚合酶的质粒可以掺入转染混合物中。例如，编码L蛋白的质粒和/或编码NP的质粒(分别为pC-L和pC-NP)。L蛋白和NP是病毒RNA转录和复制所必需的最小反式作用因子。做为选择，与NP和L蛋白一起，病毒L和S片段的细胞内合成可以使用表达盒进行，具有分别从对侧阅读到两个独立质粒的L和S片段cDNA的pol-I和pol-II启动子。
此外，质粒可以具有哺乳动物选择标志物，例如，嘌呤霉素抗性，处在适合于哺乳动物细胞中基因表达的表达盒的控制下，例如，上述的聚合酶II表达盒，或者所述病毒基因转录产物可以跟随着内部核糖体进入位点，例如，脑心肌炎病毒的，随后是哺乳动物抗性标志物。对于在E.coli中生产，所述质粒另外具有细菌选择标志物，例如，氨苄西林抗性盒。
用质粒转染BHK-21细胞可以使用任何常用的策略来进行，例如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔。数天以后，以滴定浓度添加适合的选择试剂，例如，嘌呤霉素。根据标准过程分离存活的克隆并进行亚克隆，使用针对目的病毒蛋白质的抗体、用Western印迹或流式细胞计过程鉴定高表达的克隆。
一般地，可以使用聚合酶I驱动的表达盒、RNA聚合酶II驱动的盒或T7噬菌体RNA聚合酶驱动的盒，后者优选地具有3'噬菌体RNA聚合酶末端核酶，用于加工主转录产物以产生正确的末端。在某些实施方式中，编码沙粒病毒基因组片段的质粒可以是相同的，即，基因组序列和反式作用因子可以从一个质粒通过T7、polI和polII启动子转录。
为了回收沙粒病毒三片段沙粒病毒载体，设想以下的过程。第一天：细胞，一般是在M6-孔平板上80％汇合的，用如上所述的质粒的混合物转染。为此，可以利用任何常用的策略，例如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养的上清液(沙粒病毒载体制品)，等分并保存在4℃、-20℃或-80℃，取决于使用前要保存沙粒病毒载体多久。通过免疫病灶分析来评估沙粒病毒载体制品的传染性滴度。做为选择，转染的细胞和上清液可以在转染后3-5天传代到更大的容器中(例如，T75组织培养烧瓶)，传代后五天收获培养上清液。
本申请此外涉及异源ORF和/或目的基因的表达，其中编码基因组片段的质粒被修改以掺入异源ORF和/或目的基因。异源ORF和/或目的基因可以使用限制酶掺入到质粒中。
(ii)传染性的、复制缺陷的三片段沙粒病毒颗粒
传染性的、复制缺陷的三片段沙粒病毒颗粒可以如上所述拯救。然而，一旦从cDNA中产生，本文提供的传染性的复制缺陷性沙粒病毒可以在补充细胞中增殖。补充细胞是提供功能的细胞，所述功能是通过对其基因组的修饰从复制缺陷性沙粒病毒中消除的(例如，如果编码GP蛋白的ORF被删除或功能灭活，补充细胞就提供GP蛋白)。
由于沙粒病毒载体中一个或更多个ORF的去除或功能性灭活(在此，糖蛋白GP的删除作为例子)，沙粒病毒载体可以在反式提供了删除的病毒基因，例如，当前实施例中为GP的细胞中产生和扩增。通过用表达目的病毒基因的一个或更多个质粒(补充质粒，称为C-质粒)转染哺乳动物细胞系如BHK-21、HEK 293、VERO或其他(在此BHK-21作为例子)来产生这样的补充哺乳动物细胞系，以下称为C-细胞。在适合于哺乳动物细胞中表达的一个或更多个表达盒的控制下，例如，哺乳动物聚合酶II启动子，如具有多腺苷酸化信号的CMV或EF1alpha启动子，C-质粒表达要生产的沙粒病毒载体中删除的病毒基因。此外，补充质粒可以具有哺乳动物选择标志物，例如，嘌呤霉素抗性，处在适合于哺乳动物细胞中基因表达的表达盒的控制下，例如，上述的聚合酶II表达盒，或者所述病毒基因转录产物可以跟随着内部核糖体进入位点，例如，脑心肌炎病毒之一，随后是哺乳动物抗性标志物。对于在E.coli中生产，质粒另外具有细菌选择标志物，例如，氨苄西林抗性盒。
可以使用的细胞，例如BHK-21、HEK 293、MC57G或其他可以保持在培养物中，使用任一种常用的策略如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔用补充质粒转染。数天以后，以滴定浓度添加适合的选择试剂，例如，嘌呤霉素。根据标准过程分离存活的克隆并进行亚克隆，使用针对目的病毒蛋白质的抗体、用Western印迹或流式细胞计过程鉴定高表达的C-细胞克隆。作为对使用稳定转染的C-细胞的替代，在下文使用C-细胞的每个步骤中，正常细胞的短暂转染可以补充缺失的病毒基因。此外，辅助病毒可以用于反式提供缺失的功能。
可以使用两种类型的质粒：i)两个质粒，称为TF-质粒，用于在C-细胞中细胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子，在当前实施例中来源于例如LCMV的NP和L蛋白；和ii)质粒，称为GS-质粒，用于在C-细胞中细胞内表达沙粒病毒载体基因组片段，例如，具有设计的修饰的片段。TF-质粒在适合于哺乳动物细胞中蛋白质表达的表达盒的控制下表达相应的沙粒病毒载体的NP和L蛋白，一般地，为哺乳动物聚合酶II启动子，例如CMV或EF1alpha启动子，它们的任一优选地与多腺苷酸化信号组合。GS-质粒表达载体的小(S)和大(L)基因组片段。一般地，可以使用聚合酶I驱动的表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶(T7-)驱动的表达盒，后者优选地具有3'-末端核酶，用于加工主转录产物以产生正确的末端。在使用基于T7的系统情况下，必需通过在恢复过程中包括类似TF-质粒而构建的、提供T7的其他表达质粒，或构建C-细胞来以稳定的方式另外表达T7，以提供C-细胞中T7的表达。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是同一个，即，基因组序列和反式作用因子可以通过T7、polI和polII启动子从一个质粒转录。
为了回收沙粒病毒载体，可以使用以下过程。第一天：C-细胞，一般是在M6-孔平板上80％汇合的，用两个TF-质粒加两个GS-质粒的混合物转染。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是同一个，即，基因组序列和反式作用因子可以通过T7、polI和polII启动子从一个质粒转录。为此，可以利用的任一种常用的策略，例如基于磷酸钙、脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养物上清液(沙粒病毒载体制品)，等分并在4℃、-20℃、-80℃保存，取决于使用前要保存沙粒病毒载体多久。然后在C-细胞上通过免疫病灶分析来评估沙粒病毒载体制品的传染性滴度。做为选择，转染的细胞和上清液可以在转染后3-5天传代到更大的容器中(例如，T75组织培养烧瓶)，传代后五天收获培养上清液。
本发明进一步涉及抗原在细胞培养物中的表达，其中所述细胞培养物用表达抗原的传染性的复制缺陷性三片段沙粒病毒感染。当用于在培养的细胞中表达CMV抗原时，可以使用以下两个过程：
i)以一或更多，例如二、三或四的感染复数(MOI)用本文描述的沙粒病毒载体制品感染目的细胞类型，引起感染后不久在所有细胞中所述抗原的产生。
ii)做为选择，可以使用更低的MOI，可以根据病毒驱动的抗原表达水平选择单独的细胞克隆。随后，由于沙粒病毒载体的非细胞溶解特征，单独的克隆可以无限地扩展。与途径无关，随后可以从培养物上清液或从细胞自身采集(和纯化)抗原，取决于产生的抗原的性质。然而，本发明不局限于这两种策略，也可以考虑使用传染性的复制缺陷性沙粒病毒作为载体驱动CMV抗原表达的其他方式。
4.5核酸、载体系统和细胞系
在某些实施方式中，本文提供的是包含或由章节4.1和章节4.2分别描述的沙粒病毒基因组片段或三片段沙粒病毒颗粒组成的cDNA。
4.5.1非天然位置开放阅读框
在一个实施方式中，本文提供的是编码章节4.1中描述的沙粒病毒基因组片段的核酸。在更具体的实施方式中，本文提供的是如表1所列的DNA核苷酸序列或DNA核苷酸序列的集合。包含这样的核酸的宿主细胞也在章节4.1中提供。
在具体的实施方式中，本文提供的是被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA，其中所述沙粒病毒基因组片段编码如章节4.1中描述的异源ORF。
在一个实施方式中，本文提供的是编码被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的DNA表达载体系统。具体地，本文提供的是DNA表达载体系统，其中一个或更多个载体编码本文描述的沙粒病毒颗粒的两个沙粒病毒基因组片段，即，L片段和S片段。这样的载体系统可以编码(一个或更多个独立的DNA分子)。
在另一个实施方式中，本文提供的是沙粒病毒S片段的cDNA，其被工程化以在野生型位置之外的位置携带ORF，是DNA表达系统的部分或被掺入DNA表达系统中。在其他实施方式中，沙粒病毒L片段的cDNA，其被工程化以在野生型位置之外的位置携带ORF，是DNA表达系统的部分或被掺入DNA表达系统中。在某些实施方式中，是沙粒病毒基因组片段的cDNA，其被工程化以携带(i)在ORF的野生型位置之外的位置上的ORF；和(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF已被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
在某些实施方式中，本文提供的cDNA可以来源于特定毒株的LCMV。LCMV的毒株包括克隆13、MP毒株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN和它们的衍生物。在具体的实施方式中，所述cDNA来源于LCMV克隆13。在其他具体实施方式中，所述cDNA来源于LCMV MP毒株。
在某些实施方式中，被产生以编码本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的载体可以基于LCMV的具体毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP毒株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN和它们的衍生物。在某些实施方式中，本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以基于LCMV克隆13。在其他实施方式中，被产生以编码本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的载体LCMV MP毒株。LCMV克隆13的S片段的序列如SEQ ID NO：2所列。在某些实施方式中，LCMV克隆13的S片段的序列是SEQ ID NO：1中列出的序列。LCMV克隆13的L片段的序列如LEQ IDNO：5所列。LCMV毒株MP的S片段的序列如SEQ ID NO：53所列。LCMV毒株MP的L片段的序列如LEQ ID NO：4所列。
在另一个实施方式中，本文提供的是细胞，其中所述细胞包含本章节中的上述cDNA或载体系统。本文还提供了来源于这类细胞的细胞系、包含这类细胞的培养物、培养感染的这类细胞的方法。在某些实施方式中，本文提供的是细胞，其中所述细胞包含被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段的cDNA。在某些实施方式中，所述细胞包含S片段和/或L片段。
4.5.2三片段沙粒病毒颗粒
在一个实施方式中，本文提供的是编码章节4.2中描述的三片段沙粒病毒颗粒的核酸。在更具体的实施方式中，本文提供的是DNA核苷酸序列或DNA核苷酸序列的集合，例如，如表2或表3中所列的。包含这样的核酸的宿主细胞也在章节4.2中提供。
在具体的实施方式中，本文提供的是由三片段沙粒病毒颗粒的cDNA组成的cDNA，所述三片段沙粒病毒颗粒被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF。在其他实施方式中，是三片段沙粒病毒颗粒的cDNA，所述三片段沙粒病毒颗粒被工程化以(i)在ORF的野生型位置之外的位置携带沙粒病毒ORF；和(ii)其中所述三片段沙粒病毒颗粒编码如章节4.2中描述的异源ORF。
在一个实施方式中，本文提供的是DNA表达载体系统，其一起编码本文描述的三片段沙粒病毒颗粒。具体地，本文提供的是DNA表达载体系统，其中一个或更多个载体编码三个沙粒病毒基因组片段，即，本文描述的三片段沙粒病毒颗粒的一个L片段和两个S片段、或两个L的和一个S片段。这样的载体系统可以编码(一个或更多个独立的DNA分子)。
在另一个实施方式中，本文提供的是沙粒病毒S片段的cDNA，其被工程化以在野生型位置之外的位置携带ORF，是DNA表达系统的部分或被掺入DNA表达系统中。在其他实施方式中，沙粒病毒L片段的cDNA，其被工程化以在野生型位置之外的位置携带ORF，是DNA表达系统的部分或被掺入DNA表达系统中。在某些实施方式中，是三片段沙粒病毒颗粒的cDNA，其被工程化以携带(i)在ORF的野生型位置之外的位置上的ORF；和(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF已被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
在某些实施方式中，本文提供的cDNA可以来源于特定毒株的LCMV。LCMV的毒株包括克隆13、MP毒株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN和它们的衍生物。在具体的实施方式中，所述cDNA来源于LCMV克隆13。在其他具体实施方式中，所述cDNA来源于LCMV MP毒株。
在某些实施方式中，被产生以编码本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的载体可以基于LCMV的具体毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP毒株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN和它们的衍生物。在某些实施方式中，本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以基于LCMV克隆13。在其他实施方式中，被产生以编码本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的载体LCMV MP毒株。LCMV克隆13的S片段的序列如SEQ ID NO：2所列。在某些实施方式中，LCMV克隆13的S片段的序列是SEQ ID NO：1中列出的序列。LCMV克隆13的L片段的序列如LEQ IDNO：5所列。LCMV毒株MP的S片段的序列如SEQ ID NO：53所列。LCMV毒株MP的L片段的序列如LEQ ID NO：4所列。
在另一个实施方式中，本文提供的是细胞，其中所述细胞包含本章节中的上述cDNA或载体系统。本文还提供了来源于这类细胞的细胞系、包含这类细胞的培养物、培养感染的这类细胞的方法。在某些实施方式中，本文提供的是细胞，其中所述细胞包含三片段沙粒病毒颗粒的cDNA。在某些实施方式中，所述细胞包含S片段和/或L片段。
4.6使用方法
疫苗已经成功用于预防和/或治疗传染性疾病，例如，用于脊髓灰质炎病毒和麻疹的那些。然而，在已建立的慢性疾病，包括慢性感染和癌症的情况下，治疗性免疫是很少成功的。产生沙粒病毒颗粒和/或三片段沙粒病毒颗粒的能力代表了新的疫苗策略。
在一个实施方式中，本文提供的是治疗受试者的感染和/或癌症的方法，包括向所述受试者施用本文描述的一种或更多种类型的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒，或其组合。在具体的实施方式中，本文描述的治疗感染和/或癌症的方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的一种或更多种沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒，或其组合。所述受试者可以是哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、驯养的动物，例如但不限于牛、马、绵羊、猪、山羊、猫、狗、仓鼠、驴。在具体的实施方式中，所述受试者是人。人类受试者可以是男性、女性、成年人、儿童、老年人(65岁或更高)，以及患有多种疾病的那些人(即，多疾病受试者)。在某些实施方式中，受试者是在用化学治疗、放射治疗、手术和/或生物试剂治疗之后疾病进展的受试者。
在另一个实施方式中，本文提供的是在受试者中诱导针对衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用表达衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原或其组合的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。
施用本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的受试者患有、或敏感于、或有风险感染、发生癌症或过敏、或展现前癌组织病变，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒表达衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在另一个具体的实施方式中，施用沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的所述受试者感染了、敏感于、有风险、或被诊断患有感染、癌症、前癌组织病变或过敏，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒表达本文描述的衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原或其组合。
在另一个实施方式中，施用沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的受试者患有、或敏感于、或有风险于肺系统、中枢神经系统、淋巴系统、胃肠系统或循环系统等中的感染、癌症、前癌病变或过敏，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒表达本文描述的衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原或其组合。在具体的实施方式中，施用沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的受试者患有、或敏感于、或有风险于身体的一个或更多个器官，包括但不限于脑、肝脏、肺、眼睛、耳、肠、食道、子宫、鼻咽或唾液腺中的感染、癌症、前癌病变或过敏，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒表达本文描述的衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原或其组合。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给的受试者遭受的症状包括但不限于发烧、盗汗、疲倦、不适、不安、咽喉炎、腺体肿胀、关节疼痛、肌肉疼痛、食欲不振、腹泻、胃肠溃疡、胃肠出血、呼吸急促、肺炎、口溃疡、视力问题、肝炎、黄疸、脑炎、癫痫、昏迷、瘙痒、红斑、着色过度、淋巴结改变或听力损失。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症、或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给任何年龄组的受试者，其患有、敏感于、或有风险感染、癌症或过敏。在具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给免疫系统受损的受试者、怀孕的受试者、经历了器官或骨髓移植的受试者、服用免疫抑制药物的受试者、经历血液透析的受试者、患有癌症的受试者，或患有、敏感于或有风险感染、癌症或过敏的受试者。在更具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17岁的儿童的、患有、敏感于或有风险感染、癌症或过敏的受试者。在又一个具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者，所述受试者是患有、敏感于或有风险感染、癌症或过敏的婴儿。在又一个具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者，所述受试者是患有、敏感于或有风险感染、癌症或过敏的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月大小的婴儿。在又一个具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给患有、敏感于或有风险感染、癌症或过敏的老年受试者。在更具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给65、66、67、68、69、70、71、72、73 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90岁的老年受试者。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给具有传播的感染、癌症或过敏的增高风险的受试者。在具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给具有新生的和因而不成熟的免疫系统的新生儿期的受试者。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给患有潜伏感染、癌症或过敏的受试者。在具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒被施用给患有在免疫系统受损时可能被重激活的潜伏感染、潜伏静止的或潜伏过敏的受试者。因而，本文提供的是预防感染、癌症或过敏的重激活的方法。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给患有复发性感染、癌症或过敏的受试者。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给具有感染、癌症或过敏的遗传倾向性的受试者。在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者。在另一个实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给有风险因素的受试者。示范性的风险因素包括衰老、烟草、日光暴露、辐射暴露、化学暴露、家族史、酒精、不良饮食缺少身体活动或过重。
在另一个实施方式中，施用表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒降低感染、癌症或过敏的症状。在另一个实施方式中，施用表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒降低无症状的感染、癌症或过敏。
在另一个实施方式中，表达衍生自本文描述的传染性生物体的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者或动物，所述受试者或动物感染了一种或更多种毒株的流感病毒、传染性囊病病毒、轮状病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡贫血病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒、禽腺病毒或禽肺病毒、引发SARS的病毒、人呼吸道合胞体病毒、人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、人副流感3病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗河病病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、汉坦病毒、里夫特山谷热病毒、拉沙热病毒、单纯性疱疹病毒和黄热病病毒。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自癌症的抗原或其组合物的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给患有一种或更多种类型的癌症的受试者。在其他实施方式中，可以靶向对本文描述的疫苗的治疗敏感的任何类型的癌症。在更具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自癌症的抗原或其组合物的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者，所述受试者患有例如黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、肝细胞癌、宫颈癌和胃癌、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；鼻咽癌(鼻后侧的咽喉上部的癌症)、白细胞、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自过敏原的抗原或其组合物的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给患有一种或更多种过敏症的受试者。在更具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自过敏原的抗原或其组合物的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给患有例如，季节性过敏、常年过敏、鼻结膜炎、哮喘、湿疹、食物过敏的受试者。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒施用给受试者赋予了对抗感染、癌症或过敏原的细胞介导的免疫(CMI)。不受理论的限制，在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症、过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒在宿主(例如，巨噬细胞、树突状细胞或B细胞)的抗原递呈细胞(APC)中感染并表达目的抗原，用于指导抗原在I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递。在另一个实施方式中，表达本文描述的压缩传染性生物体、癌症、过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒向受试者施用诱导多功能细胞溶解，以及与高量级的CMV特异性CD4+和CD8+T细胞反应共同产生的IFN-γ和TNF-α，来治疗或预防感染、癌症或过敏。
在另一个实施方式中，与没有治疗时发生感染、癌症或过敏的风险相比，施用表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒降低个体发生感染、癌症、过敏的风险达到至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或更高。
在另一个实施方式中，与没有治疗时感染、癌症或过敏的症状表现表现相比，施用表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒降低个感染、癌症、过敏的症状达到至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或更高。
在某些实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒优选地在多个部位(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或14个部位以多次注射施用(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、40、45或50次注射)。在某些实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒在6个月、12个月、24个月或48个月的时间内在两个或更多个独立的注射中施用。在某些实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒在选定的日期施用第一剂量，在第一剂量之后至少2个月施用第二剂量，以及在第一剂量之后至少6个月施用第三次。
在一个实例中，在多个身体部位进行皮肤注射以降低局部皮肤反应的程度。在给定的疫苗接种当天，在剂量(例如，至少0.4ml、0.2ml或0.1ml)的3到5次独立的皮内注射中，患者接受从一个注射器施用的指定的细胞总剂量，针头刺入距离最近的注射的末端间隔至少约5cm(例如，至少4.5、5、6、7、8、9或厘米)。在随后的疫苗接种日，注射部位以顺时针方向或逆时针方向旋转到不同的肢体。
在另一个实施方式中，在新生的因而免疫系统的受试者中施用表达CMV抗原或其组合的传染性复制缺陷性沙粒病毒诱导针对感染、癌症或过敏的细胞介导的免疫(CMI)反应，超过不存在这种治疗时对感染、癌症或过敏的CMI反应至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
在某些实施方式中，向受试者使用本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒诱导可检测的抗体滴度持续最小至少四周。在另一个实施方式中，向受试者施用本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒提高抗体滴度至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。
在某些实施方式中，初次抗原暴露引发功能性、(中和性)和最小抗体滴度是来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在更具体的实施方式中，初次中和性几何平均抗体滴度在免疫后至少4周提高到至少1:50、至少1:100、至少1:200或至少1:1000的峰值。在另一个实施方式中，用本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒免疫产生高滴度的抗体，其在所述疫苗的单次施用之后、或在两次或更多次连续免疫之后，持续免疫后至少4周、至少8周、至少12周、至少6个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。
在又一个实施方式中，第二次抗原暴露提高抗体滴度至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在另一个实施方式中，第二次抗原暴露引发功能性、(中和性)和最小抗体滴度是来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在更具体的实施方式中，第二次中和性几何平均抗体滴度在免疫后至少4周提高到至少1:50、至少1:100、至少1:200或至少1:1000的峰值。在另一个实施方式中，用本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒第二次免疫产生高滴度的抗体，其持续免疫后至少4周、至少8周、至少12周、至少6个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。
在又一个实施方式中，第三次强化免疫提高抗体滴度至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在另一个实施方式中，所述强化免疫引发功能性、(中和性)和最小抗体滴度是来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在更具体的实施方式中，所述第三次强化免疫引发功能性、(中和性)和最小抗体滴度是来自感染-免疫人类受试者的平均对照血清的至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。在另一个实施方式中，第三次强化免疫延长抗体滴度达免疫后至少4周、至少8周、至少12周、至少6个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。
在某些实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发T细胞独立性或T细胞依赖性反应。在其他实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发T细胞反应。在其他实施方式中，本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发T辅助细胞反应。在另一个实施方式中，本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发Th1定向的反应或Th2定向的反应。
在更具体的实施方式中，所述Th1定向的反应是通过IgG1抗体对比IgG2的优势来显示的。在其他实施方式中，IgG1:IgG2的比例是大于1:1、大于2:1、大于3:1或大于4:1。在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的传染性沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒是通过IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD或IgE抗体的优势显示的。
在某些实施方式中，所述表达CMV抗原或其片段的传染性的复制缺陷性沙粒病毒引发CD8+T细胞反应。在另一个实施方式中，表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒同时引发CD4+和CD8+T细胞反应，与抗体组合或不组合。
在某些实施方式中，本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发高滴度的中和抗体。在另一个实施方式中，与单独地表达蛋白质复合成分相比，本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发更高滴度的中和抗体。
在另一个实施方式中，与表达一个衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒相比，表达一个、两个、三个、四个、五个或更多个衍生自传染性生物体、癌症或过敏的抗原的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒引发更高滴度的中和抗体。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括共同施用所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒与至少一种其他疗法。在某些实施方式中，所述共同施用是同时的。在另一个实施方式中，在所述其他疗法的施用之前施用所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。在其他实施方式中，在所述其他疗法的施用之后施用所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒和所述其他疗法的施用是约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒和所述其他疗法的施用之间的间隔时间是约1天、1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒和所述其他疗法的施用之间的间隔时间是约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月。
在某些实施方式中，施用表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒降低患者血液样品或血清样品中检测到的抗体的数量。在某些实施方式中，施用表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒降低尿液、唾液、血液、泪液、精液、脱落细胞样品或乳汁中检测到的传染性生物体、癌症或过敏的数量。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以进一步包含报告蛋白。在更具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原和报告蛋白或组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者用于治疗和/或预防感染、癌症或过敏。在又一个具体的实施方式中，所述报告蛋白可以用于体内、原位和实时地监视基因表达、蛋白定位和疫苗递送。
在另一个实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原或组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以进一步包含荧光蛋白。在更具体的实施方式中，表达本文描述的衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原和报告蛋白或组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒被施用给受试者用于治疗和/或预防感染、癌症或过敏。在又一个具体的实施方式中，所述荧光蛋白可以是报告蛋白，可以用于体内、原位和实时地监视基因表达、蛋白定位和疫苗递送。
通过施用表达衍生自传染性生物体、癌症、过敏原的抗原或其组合的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒，在受试者中诱导的针对感染、癌症或过敏的CMI反应功能方面的改变，可以通过本领域技术人员已知的任何分析，包括但不限于流式细胞计(参见，例如，Perfetto S.P.et al.,2004,Nat Rev Immun.,4(8):648-55)，淋巴细胞增殖分析(参见，例如，Bonilla F.A.et al.,2008,Ann Allergy Asthma Immunol,101:101-4和Hicks M.J.etal.,1983,Am J Clin Pathol.,80:159-63)，测量淋巴细胞活化的分析，包括在测量T淋巴细胞的细胞因子之后测定表面标志物表达的变化(参见，例如，Caruso A.et al.,Cytometry.1997；27:71-6)，ELISPOT分析(参见，例如Czerkinsky C.C.et al.,1983,JImmunol Methods,65:109-121和Hutchings P.R.et al.,1989,J Immunol Methods,120:1-8)，或天然杀伤细胞细胞毒性分析(参见，例如，Bonilla F.A.et al.,2006,Ann AllergyAsthma Immunol.,94(5Suppl 1):S1-63)来测量。
癌症患者的成功治疗可以作为延长预期生存、诱导抗肿瘤免疫应答、改善特定的癌症特征来评估。可以改善的癌症特征的实例包括肿瘤大小(例如，T0、T或T1-4)、转移状态(例如，M0、M1)、可见肿瘤的数量、淋巴结牵连(例如，N0、N1-4，Nx)、级别(即，1、2、3或4级)、分期(即，0、I、II、III或IV期)、细胞或体液中某些标志物的存在或浓度(例如，AFP、B2M、beta-HCG、BTA、CA 15-3、CA 27.29、CA 125、CA72.4、CA 19-9、降钙素、CEA、嗜铬粒蛋白A(chromgrainin A)、EGFR、激素受体、HER2、HCG、免疫球蛋白、NSE、NMP22、PSA、PAP、PSMA、S-100、TA-90和甲状腺球蛋白)和/或相关的病理(例如，腹腔积液或水肿)或症状(例如，恶病质、发烧、厌食或疼痛)。如果可通过百分比测量，所述改善可以是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，存活、或肿瘤的体积或线性维度)。
在另一个实施方式中，本文描述的是使用本文描述的表达衍生自传染性生物体、癌症或过敏原的抗原的沙粒病毒颗粒(例如，LCMV)的方法，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少一个ORF被编码衍生自传染性生物体、癌症、过敏原的抗原或其抗原片段的核苷酸序列替代。
4.7组合物、施用和剂量
本申请还涉及包含本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)和药物组合物。这样的疫苗、免疫原性组合物和药物组合物可以根据本领域的标准过程来配制。
对本领域的普通的技术人员而明显的是，对本文描述的方法和应用的适合的修改和适应是显而易见的，可以不背离本发明的范围或其任何实施方式来进行。
在另一个实施方式中，本文提供的是包含本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的组合物。这样的组合物可以用于治疗和预防疾病的方法。在具体的实施方式中，本文描述的组合物用于治疗被感染的或对感染敏感的受试者。在其他实施方式中，本文描述的组合物用于治疗对癌症或肿瘤发生敏感、或展现了癌症或肿瘤发生的症状特征、或被诊断患有癌症的受试者。在另一个具体的实施方式中，本文提供的免疫原性组合物可以用于在施用了所述组合物的宿主中诱导免疫应答。本文描述的免疫原性组合物可以用作疫苗，因而可以被配制为药物组合物。在具体的实施方式中，本文描述的免疫原性组合物被用于预防受试者(例如，人类受试者)的感染或癌症。在其他实施方式中，所述疫苗、免疫原性组合物或药物组合物适合于兽医学和/或人类施用。
在某些实施方式中，本文提供的是包含本文描述的沙粒病毒载体的免疫原性组合物。在某些实施方式中，这样的免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，这样的免疫原性组合物进一步包含佐剂。用于与本文描述的组合物共同施用的佐剂可以在所述组合物的施用之前、伴随地或之后施用。在某些实施方式中，术语“佐剂”是指一种化合物，但与本文描述的组合物一起施用或作为本文描述的组合物的部分施用时，增大、增强和/或强化对沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的免疫应答，最重要的，对它载有的基因产物的免疫应答，但是当所述化合物单独施用时不产生针对沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的免疫应答或针对后者载有的基因产物的免疫应答。在某些实施方式中，所述佐剂产生针对所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒或其载有的基因产物的免疫应答，不产生过敏或其他不良反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括，例如，淋巴细胞征募、刺激B细胞和/或T细胞以及刺激巨噬细胞或树突状细胞。当本发明的疫苗或免疫原性组合物包含佐剂，或与一种或更多种佐剂一起施用时，可以使用的佐剂包括但不限于矿物盐佐剂或矿物盐凝胶佐剂、颗粒佐剂、微粒佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐(白矾)(例如，氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3De-O-酰化的单磷酰基脂质A(MPL)(参见GB 2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨酯80(Tween80；ICL Americas,Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请NO.PCT/US2007/064857，作为国际公开No.WO2007/109812公开)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请NO.PCT/US2007/064858，作为国际申请WO2007/109813公开)和皂角苷，例如，QS21(参见eds.Powell&Newman,Plenum Press,NY)；美国专利No.5,057,540)。在某些实施方式中，所述佐剂是弗氏佐剂(完全的或不完全的)。其他佐剂是水包油乳剂(例如，角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂组合，例如单磷酰基脂质A(参见Stoute et al.,1997,N.Engl.J.Med.336,86-91)。
所述组合物包含单独的本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒，或与药学上可接受的载体一起。可以使用沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的悬浮液或分散体，特别是等渗的水悬浮液。所述药物组合物可以灭菌和/或可以包含赋形剂，例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲液，按照本领域已知的方式制备，例如，通过常规的分散和悬浮加工的方式。在某些实施方式中，这样的分散体或悬浮液可以包含粘度调节剂。所述悬浮液或分散体保持在约2℃到8℃，约优选地为了更久的保存，可以冷冻，然后在使用之前解冻，或作为选择可以冻干用于保存。对于注射剂，所述疫苗或免疫原性制品可以配制在水性溶液中，优选地配制在生理学相容的缓冲液中，例如，Hanks’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液。该溶液可包含配方的药剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在某些实施方式中，本文描述的组合物另外包含防腐剂，例如，汞衍生物硫柳汞。在具体的实施方式中，本文描述的药物组合物包含0.001％到0.01％的硫柳汞。在其他实施方式中，本文描述的药物组合物不包含防腐剂。
所述药物组合物包含约103到约1011个病灶形成单位的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。
在一个实施方式中，药物组合物的施用是胃肠外施用。胃肠外施用可以是静脉内的或皮下的施用。因而，用于胃肠外施用的单位剂量形式是，例如，安瓿瓶或小瓶，例如，含有约103到1010个病灶形成单位或105到1015个物理颗粒的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。
在另一个实施方式中，通过包括但不限于口服的、真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、局部的、皮下的、经皮的、鼻内的和吸入的途径，以及通过破皮(刮去皮肤的顶层，例如，使用分叉针头)，本文提供的是疫苗或免疫原性组合物被施用给受试者。具体地可以使用皮下的或静脉内的途径。
对于鼻内施用或吸入施用，使用适合的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他适合的气体，以气溶胶喷雾的形式从增压的包装物或喷雾器方便地递送用于根据本发明使用的制品。对于加压的气雾剂来说，剂量单位可以通过提供一阀来递送计量的数量来确定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明胶的药囊和药筒可以配制为含有化合物的粉末混合物和适当的粉末基剂，例如乳糖或淀粉。
活性成分的剂量取决于疫苗接种的类型和受试者、他们的年龄、体重、个体条件、个体药物动力学数据和施用方式。在某些实施方式中，采用体外分析来帮助鉴定最佳的剂量范围。有效的剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。
在某些实施方式中，包含沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的所述疫苗、免疫原性组合物或药物组合物可以用作活疫苗接种。活沙粒病毒颗粒的示范性的剂量可以是10到100或更高PFU的活病毒每剂量。在某些实施方式中，沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的适合的剂量是102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu，可以按照常常需求的时间间隔施用给受试者一次、两次、三次或更多次。在另一个实施方式中，配制活的沙粒病毒，使得0.2mL的剂量含有活沙粒病毒颗粒的106.5-107.5个荧光溶血灶单位。在另一个实施方式中，配制灭活疫苗，使得它含有约15μg到约100μg、约15μg到约75μg、约15μg到约50μg、或约15μg到约30μg的沙粒病毒。
在某些实施方式中，对于向儿童施用，以至少一个月的间隔给予的，两个剂量的本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒或其组合被施用给儿童。在向成年人施用的具体实施方式中，给予单次剂量的本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒或其组合。在另一个实施方式中，以至少一个月的间隔给予的，两个剂量的本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒或其组合被施用给成年人。在另一个实施方式中，幼童(六个月到九岁)可以按照一个月间隔给予的两个剂量第一次施用本文描述的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒或其组合。在特定的实施方式中，在第一年疫苗接种接受仅一个剂量的儿童应当在第二年接受两个剂量。在某些实施方式中，4周间隔施用的两个剂量对于第一次施用本文描述的免疫原性组合物的2-8岁的儿童是优选的。在某些实施方式中，对于6-35个月的儿童，一半的剂量(0.25ml)可以是优选的，相比之下0.5ml对于超过3岁的受试者可以是优选的。
在某些实施方式中，所述组合物可以在包括治疗有效量的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的单次剂量中施用给受试者。在某些实施方式中，所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒可以在包含治疗有效量的沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒以及各处于治疗有效量下的一种或更多种药物组合物的单次剂量中施用给患者。
在某些实施方式中，所述组合物作为单次剂量施用给患者，随后是三到六周后的第二剂量。根据这些实施方式，强化接种可以在第二次接种之后六到十二个月的间隔时间施用给所述受试者。在某些实施方式中，所述强化接种可以使用不同的沙粒病毒或其组合。在某些实施方式中，本文描述的相同组合物的施用可以重复，并分隔至少1天、2天、3天、4天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
本文还提供的是所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒用于制造药物制品形式的疫苗的过程和用途，所述药物制品包含沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒作为活性成分。本申请的药物组合物按照本身已知的方式制备，例如，通过常规的混合和/或分散过程的方式。
4.8分析
4.8.1沙粒病毒检测分析
熟练的技术人员可以使用本领域已知的技术检测本文描述的沙粒病毒基因组片段或三片段沙粒病毒颗粒。例如，可以使用RT-PCR、用特异于要检测的沙粒病毒的引物来检测和定量被工程化以在ORF的野生型位置之外的位置携带ORF的沙粒病毒基因组片段或三片段沙粒病毒颗粒。Western印迹、ELISA、放射免疫分析、免疫沉淀、免疫组织化学或免疫细胞化学与FACS一起，可以用于定量沙粒病毒基因组片段或三片段沙粒病毒颗粒的基因产物。
4.8.2测量感染性的分析
熟练的技术人员已知的任何分析可以用于测量沙粒病毒载体制品的感染性。例如，可以通过“病灶形成单位分析”(FFU分析)进行病毒/载体滴度的测定。简言之，平铺补充细胞，例如，MC57细胞，用不同稀释度的病毒/载体样品接种。在潜伏期之后，容许细胞形成单层和容许病毒附着到细胞，单层用甲基纤维素覆盖。当进一步孵育平板时，原始感染的细胞释放病毒子代。由于甲基纤维素的覆盖，新病毒的传播被限于邻近的细胞。因此，每个传染性的颗粒产生称为病灶的感染细胞的圆形区域。使用针对LCMV-NP或所述沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒表达的其他蛋白的抗体以及基于HRP的显示反应，这样的病灶可以变为可见的和可计数的。病毒/载体的滴度可以按每毫升的病灶形成单位(FFU/mL)来计算。
4.8.3沙粒病毒颗粒的生长
本文描述的沙粒病毒颗粒的生长可以通过本领域已知的或本文描述的任何方法(例如，细胞培养)来评估。病毒生长可以通过将本文描述的沙粒病毒颗粒的连续稀释物接种到细胞培养物(例如，Vero细胞或BHK-21细胞)中来测定。在孵育病毒指定的时间之后，使用标准方法分离病毒。
4.8.4血清ELISA
在动物(例如，小鼠、豚鼠)的疫苗接种时体液免疫应答的测定可以通过抗原特异性血清ELISA(酶联免疫吸附分析)来进行。简言之，平板用抗原(例如，重组蛋白)包被，封闭来避免抗体的非特异性结合，与血清的连续稀释物孵育。在孵育之后，可以检测结合的血清-抗体，例如，使用酶联的抗物种(例如，小鼠、豚鼠)特异性抗体(检测总IgG或IgG子类)和随后的颜色反应。可以测定抗体滴度，例如，作为终点几何平均滴度。
4.8.5测量诱导的抗体的中和活性的分析
血清中的中和抗体的测定使用以下细胞分析、用来自ATCC的ARPE-19细胞和GFP标签的病毒来进行。此外，使用补充的豚鼠血清作为外源补体的来源。分析开始于在用于中和之前一天或两条在384孔板中播种6.5×103细胞/孔(50μl/孔)。在37℃下在密钥细胞的96孔无菌组织培养平板中进行中和1小时。在中和孵育步骤之后，将混合物添加到细胞，另外孵育4天，用于使用平板读取器检测GFP。阳性中和性人类血清用作每个平板上的分析阳性对照来检查所有结果的可靠性。使用4参数逻辑曲线拟合来确定滴度(EC50)。作为附加测试，用荧光显微镜检查反应孔。
4.8.6蚀斑减数分析
简言之，LCMV的空斑减数(中和)分析可以使用绿色荧光蛋白标记的复制型或缺陷的LCMV进行，5％兔血清可以用作外源补体的来源，蚀斑通过荧光显微镜计数。中和滴度可以定义为与对照(免疫前)血清样品相比引起蚀斑的50％、75％、90％或95％减少的最高血清稀释度。
根据厂家提供的方案，使用QIAamp病毒RNA mini试剂盒(QIAGEN)分离qPCR LCMVRNA基因组。使用III One-Step qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)以及特异于部分LCMV NP编码区域、或沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的另一个基因组延伸的引物和探针(FAM报告物和NFQ-MGB淬灭剂)，在StepOnePlus Real Time PCR系统(Applied Biosystems)上通过定量PCR检测LCMV RNA基因组等价物。反应的温度分布可以是：60℃30分钟，95℃2分钟，随后是95℃15秒、56℃30秒的45个循环。通过将样品结果与标准曲线比较可以定量RNA，所述标准曲线是从光谱光度定量的、体外转录的RNA片段的log10稀释度系列制备的，所述RNA片段相应于含有引物和探针结合位点的LCMV NP编码序列、或沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒的另一个基因组延伸的片段。
4.8.7 Western印迹
在组织培养烧瓶或悬浮液中生长的感染的细胞使用RIPA缓冲液(ThermoScientific)在感染后标明的时间点裂解，或没有细胞裂解直接使用。样品与还原剂和NuPage LDS样品缓冲液(NOVEX)加热到99℃10分钟，冷却到室温，之后加载到4-12％SDS-凝胶上电泳。使用Invitrogens iBlot Gel转移设备将蛋白点印到膜上，通过Ponceau染色来显现。最后，用针对目的蛋白的第一抗体和碱性磷酸酶结合的第二抗体探测制品，之后用1-Step NBT/BCIP溶液(INVITROGEN)染色。
4.8.8 MHC-肽多聚体染色分析，用于检测抗原特异性CD8+T细胞增殖
熟练的技术人员已知的任何分析可以用于测试抗原特异性CD8+T细胞反应。例如，可以使用MHC-肽四聚体染色分析(参见，例如，Altman J.D.et al.,Science.1996；274:94-96；and Murali-Krishna K.et al.,Immunity.1998；8:177-187)。简要地说，所述分析包括以下步骤，四聚体分析用于检测抗原特异性T细胞的存在。为了检测T细胞特异的肽，必需识别肽和为限定的抗原特异性定制的MHC分子四聚体，以及T细胞的MHC单体型(一般是荧光标记的)。然后通过荧光标记用流式细胞计检测四聚体。
4.8.9用于检测抗原特异性CD4+T细胞增殖的ELISPOT分析
熟练的技术人员已知的任何分析可以用于测试抗原特异性CD4+T细胞反应。例如，可以使用ELISPOT分析(参见，例如，Czerkinsky C.C.et al.,J Immunol Methods.1983；65:109-121和Hutchings P.R.et al.,J Immunol Methods.1989；120:1-8)。简要地说，所述分析包括以下步骤：免疫斑点平板用抗细胞因子抗体包被。细胞在所述免疫斑点板上孵育。细胞分泌细胞因子，然后被洗去。平板然后用第二个生物素化的、抗细胞因子抗体包被，用抗生物素蛋白-HRP系统显现。
4.8.10检测CD8+和CD4+T细胞反应的功能的细胞内细胞因子分析
熟练的技术人员已知的任何分析可以用于测试CD8+和CD4+T细胞反应的功能。例如，可以使用与流式细胞计组合的细胞内细胞因子分析(参见，例如Suni M.A.et al.,JImmunol Methods.1998；212:89-98；Nomura L.E.et al.,Cytometry.2000；40:60-68和Ghanekar S.A.et al.,Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2001；8:628-63)。简要地说，所述分析包括以下步骤：通过特异性肽或蛋白质活化细胞、添加蛋白质转运的抑制物(例如，布雷菲德菌素A)来将细胞因子保持在细胞内。在限定的孵育期之后，一般5小时，进行洗涤步骤，可以将针对其他细胞标志物的抗体添加到细胞。然后固定细胞并透性化。添加结合了荧光团的抗细胞因子抗体，细胞可以通过流式细胞计来分析。
4.8.11确认病毒载体的复制缺陷性的分析
测定传染性和复制型病毒颗粒的浓度的熟练的技术人员已知的任何分析也可以用于测量样品中的复制缺陷性病毒颗粒。例如，使用非补充细胞的FFU分析可以用于这个目的。
此外，基于蚀斑的分析是用于测定病毒样品中按照蚀斑形成单位(PFU)的病毒浓度的标准方法。具体地，非补充宿主细胞的汇合的单层用变化的稀释度的病毒感染，用半固体培养基例如琼脂覆盖，以防止病毒感染的任意传播。当病毒成功地感染并在固定的细胞单层内的细胞中复制自身，并传播到周围的细胞时，形成病毒蚀斑(参见，例如Kaufmann,S.H.；Kabelitz,D.(2002).Methods in Microbiology Vol.32:Immunology ofInfection.Academic Press.ISBN 0-12-521532-0)。蚀斑形成可能花费2-14天，取决于被分析的病毒。蚀斑一般人工地计数，该结果与用于制备平板的稀释因数一起用于计算每样品单位体积的蚀斑形成单位的数量(PFU/mL)。PFU/mL结果代表样品内传染性的复制型颗粒的数量。当使用C-细胞时，相同的分析可以用于滴定复制缺陷性沙粒病毒颗粒或三片段沙粒病毒颗粒。
4.8.12病毒抗原表达的分析
熟练的技术人员已知的任何分析可以用于测量病毒抗原的表达。例如，可以进行FFU分析。为了检测，使用针对相应的病毒抗原的单克隆或单克隆抗体制品(转基因特异性FFU)。
4.8.13动物模型
为了研究本文描述的沙粒病毒颗粒的重组和感染性，可以使用体内动物模型。在某些实施方式中，可以用于研究三片段沙粒病毒颗粒的重组和感染性的动物模型包括小鼠、豚鼠、兔和猴。在优选的实施方式中，可以用于研究沙粒病毒的重组和感染性的动物模型包括小鼠。在更具体的实施方式中，可以用于研究沙粒病毒颗粒的重组和感染性的小鼠是I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因1(RAG1)三缺陷的。
在某些实施方式中，所述动物模型可以用于测定沙粒病毒感染性和转基因稳定性。在某些实施方式中，病毒RNA可以从动物模型的血清中分离。这些技术是本领域技术人员容易了解的。病毒RNA可以被逆转录，带有沙粒病毒ORF的cDNA可以用基因特异性引物PCR扩增。流式细胞计也可以用于研究沙粒病毒感染性和转基因稳定性。
5.实施例
这些实施例表明，基于LCMV病毒的载体技术可以用于成功地开发(1)具有ORF的野生型位置之外的位置的病毒ORF的沙粒病毒基因组片段，和(2)不产生复制型的双片段病毒颗粒的三片段沙粒病毒颗粒。
5.1材料和方法
5.1.1细胞
BHK-21细胞培养在高葡萄糖Dulbecco’s Eagle培养基(DMEM；Sigma)中，其补充有10％热钝化的胎牛血清(FCS；Biochrom)、10mM HEPES(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)和1×胰蛋白胨磷酸盐肉汤。MC57细胞维持在最小必需培养基(MEM；Sigma)中，其补充有5％热钝化的FCS、2mM L－谷氨酰胺(Gibco)和青霉素-链霉素(100’000U/ml青霉素和50mg/l氯霉素；Gibco)。两种细胞系都在湿润的5％CO2孵育箱中在37℃下培养。
根据厂家的方案，表达NP的BHK-21细胞通过用质粒转染BHK-21细胞来产生，所述质粒表达处在真核EF1-α启动子控制下的NP并编码嘌呤霉素抗性基因。在转染后48小时，将4μg/ml嘌呤霉素添加到培养基中。再48小时后，细胞传代到T150烧瓶中。一旦开始显现分离的克隆，收获细胞并连续稀释到96孔平板中来获得单独的克隆。光学地检查反应孔中从单个克隆到细胞群体的生长，一旦形成汇合的单层，相应的细胞传代到6孔平板中。表达NP的BHK-21细胞培养在有4μg/ml嘌呤霉素的BHK-21培养基中。
早先描述了表达GP的BHK-21细胞。简要地说，BHK-21细胞用质粒稳定地转染，所述质粒表达密码子优化的LCMV-GP cDNA和嘌呤霉素抗性盒。通过向培养基添加4μg/ml嘌呤霉素来选择表达GP的克隆，通过如对表达NP的BHK-21细胞所描述的连续稀释来获得单独的克隆。
5.1.2质粒
早先已经描述了pol-I L、pC-NP和pC-L质粒。对于编码GFP或RFP作为报告基因以及NP或GP的pol-I S质粒的产生，我们使用pol-I Bbs/Bsm克隆质粒作为基础(pol-I 5’-BsmBI_IGR_BbsI_3’)。这个质粒编码病毒S片段的5'非翻译区(5’UTR)，之后是两个BsmBI限制位点、基因间区域(IGR)、两侧是BbsI限制位点和S片段的3'UTR的NP rest和CAT开放阅读框(ORF)。pol-I S质粒编码处在它的天然5'的GP和处在3'位置反义方向的GFP(pol-I 5’-GP_IGR_GfP-3’)，该质粒通过BsmBI位点特异性限制插入GP并连接到pol-I Bbs/Bsm质粒来克隆。在第二个步骤中，通过BbsI消化和连接来插入GFP。为了获得编码处在人工的3'方向的GP的pol-I S质粒(pol-I 5’-GFP_IGR_GP-3’)，在3'位置通过BbsI消化将GP插入到pol-IBbs/Bsm质粒中，用BsmBI限制/连接在5'位置插入GFP。编码GFP或RFP与NP的pol-I S(pol-I5’-GFP_IGR_NP-3’或pol-I 5’RFP_IGR_NP-3’)通过使用BbsI消化来插入NP并连接到pol-IBbs/Bsm克隆质粒，以及通过BsmBI克隆插入GFP或RFP来克隆。带有LCMV毒株WE的GP以及LCMV毒株克隆13(Cl13)的NP的pol-I质粒，通过Bbs和Bsm位点特异性限制/连接，在相应的位点将相应的基因插入到pol-I Bbs/Bsm克隆质粒中来克隆。
编码WE/WET融合GP的S片段通过用称为“WET”的密码子优化的序列替换WE ORF的最后255个碱基对来获得。通过在第一步骤中使用一个WE特异性引物(SEQ ID NO：11)和带有与WET序列互补的突出的WE特异性融合引物(SEQ ID NO：12)PCR扩增WE GP的片段来实现。并行的，通过使用WET特异性引物(SEQ ID NO：13)和与WE序列互补的WET特异性融合引物(SEQ ID NO：14)进行PCR来扩增WET序列。在第三个PCR反应中，通过使用两种提及的融合引物进行PCR融合，来融合两种PCR产物。产生的WE/WET融合片段用BsmBI消化，并连接到已经用同样的限制酶消化的pol-I BsmBI_IGR_GFP-3’质粒中。
通过使用SacI和XmaI的位点特异性限制/连接将合成的DNA片段(由GenScript基因合成)插入到编码野生型S片段的质粒中处于pol-I启动子(pol-I GP_IGR_NP)的控制下，产生pol-I GP_IGR_GFPrest_IGR_NP，来克隆编码体内重组的病毒r3LCMV-GFPnat#3的重组的S片段的pol-I质粒。
5.1.3细胞的DNA转染和重组病毒的拯救
以4×105个细胞/孔的密度将BHK-21细胞播种到6孔平板中，24小时后根据厂家的说明书使用lipofectamine(3μl/μgDNA；Invitrogen)或jetPRIME(2μl/μg DNA；Polyplus)用不同数量的DNA转染。对于完全从质粒DNA拯救重组双片段病毒，两种最小病毒反式作用因子NP和L从pol-II驱动的质粒(0.8μg pC-NP，1μg pC-L)释放，用1.4μg的pol-I L和0.8μg的pol-I S共转染。对于拯救由一个L和两个L片段组成的三片段r3LCMV来说，0.8μg的两种pol-I驱动的S片段都被包括在转染混合物中。转染后72小时，收获上清液，在BHK-21细胞上传代进一步扩增病毒。上清液中的病毒滴度通过病灶形成分析来测定。
5.1.4病毒和病毒的生长动力学
最初衍生自野生型LCMV Armstrong的野生型Cl13LCMV早先已经被描述。野生型和重组病毒的储备物通过以0.01的感染复数(moi)感染BHK-21细胞来产生，感染后48小时收获上清液。病毒的生长曲线在体外以6孔格式进行。将BHK-21细胞以6×105个细胞/孔的密度播种，感染24小时后通过将细胞与500μl的病毒接种物一起以0.01的moi在37℃和5％CO2下在摇床上孵育90分钟。添加新鲜培养基，细胞在37℃/5％CO2下孵育72到96小时。在给定时间点(通常为18、24、48、72小时)采集上清液，通过病灶形成分析来分析病毒滴度。
5.1.5病灶形成分析
接下来，通过病灶形成分析来测定LCMV的滴度。LCMV是非细胞裂解型的病毒，其不裂解它的宿主细胞，因而不产生蚀斑。尽管如此，这项工作中的单位将表示为更常用的术语蚀斑形成单位(PFU)，而不是正确的术语病灶形成单位(FFU)。如果没有另外声明，MC57细胞被用于病灶形成分析。细胞以1.6×105个细胞每孔的密度播种到24孔平板中，与在MEM/2％FCS中制备的200μl的10倍病毒连续稀释物混合。在37℃孵育2-4小时之后，每个反应孔添加200μl的粘性培养基(2×补充的DMEM中的2％甲基纤维素)，来确保病毒颗粒仅传播到邻近的细胞。在37℃下48小时之后，拂去上清液，通过添加200μl的PBS中的4％多聚甲醛(PFA)在室温下30分钟来固定细胞(所有后续步骤在室温下进行)。细胞用200μl每反应孔的BSS/1％Triton X-100(Merck Millipore)渗透20分钟，随后用PBS/5％FCS封闭60分钟。对于抗-NP染色，大鼠抗LCMV-NP单克隆抗体用作第一染色抗体，PBS/2.5％FCS中1:30的稀释度，60分钟。对于抗-GFP染色，使用纯化的大鼠抗GFP抗体(Biolegend 338002)，PBS/2.5％FCS中1:2000的稀释度。平板用自来水洗涤三次，以PBS/2.5％FCS中1:100的稀释度添加第二HRP-山羊抗大鼠IgG，并孵育1小时。平板再次用自来水洗涤三次。添加颜色反应(0.5g/l DAB(Sigma D-5637)，PBS/0.015％H2O2中的0.5g/l硫酸镍铵)，在10分钟后用自来水停止反应。染色的病灶人工地计数，根据稀释度计算最终的滴度。
对于细胞的抗-GP染色，平板用50％MeOH/50％丙酮固定5分钟，并用PBS洗涤。如所描述的进行封闭。第一抗体抗-GP GP83.4(从杂交瘤产生的)在PBS/2.5％FCS中1：10稀释，孵育60分钟。用自来水三次洗涤之后，以PBS/2.5％FCS中1:50的稀释度添加第二HRP-兔抗小鼠IgG抗体，孵育60分钟。用自来水再洗涤三次之后，如上所述添加颜色反应。
为了测定血液中小鼠的病毒血症，一滴血液(相对于50μl体积)采集到950μl的PBS-肝素(Na-肝素,Braun，最终1IE/ml)中，翻转混合，保存在-80℃待用。
5.1.6小鼠
早先已经描述了AGRAG小鼠(IFNα/βR-/-,IFNγR-/-,RAG-/-)，繁育并收容在特定的无病原体(SPF)条件下。它们是在瑞士苏黎士大学的Labortierkunde研究所育种的。所有的动物实验都是根据瑞士的动物保护法和日内瓦和巴塞尔各自负责的州政府的许可，在日内瓦和巴塞尔大学进行的。以每只小鼠1×104PFU的剂量静脉内进行小鼠的感染。
5.1.7病毒RNA的制备和测序
根据厂家的说明书使用QIAamp病毒RNA Mini试剂盒(Qiagen)，从细胞培养物上清液或从感染的小鼠的血清中提取病毒RNA。使用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen)和特异于LCMV NP的引物(SEQ ID NO：15)根据厂家的方案进行逆转录反应。使用2μl来自RT步骤的cDNA，NP-和GP-特异性引物(SEQ ID NO：16)，进行PCR扩增。使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(NEB)进行PCR反应。在2％琼脂糖凝胶上分析扩增的产物，从2％琼脂糖凝胶上切下，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化，送至DNA Sanger测序(Microsynth)，使用NP-和GP-特异性引物。
5.1.8流式细胞计
用针对CD11c(N418)、CD11b(M1/70)、CD19(6D5)、NK1.1(PK136)、CD90.2(30-H12)和GR-1(RB6-8C5)的抗体对血液进行染色。使用FlowJo软件(Tree Star,Ashland，OR)在BDLSR Fortessa流式细胞计上分析用特定抗体染色的表面分子的表达，以及GFP和RFP表达。
5.1.9统计分析
使用Graphpad Prism软件(版本6.0d)，通过双尾非配对t检验，或单因素ANOVA，随后的Dunnett’s或Bonferroni’s后测试用于多重比较(版本6.0d)，来确定统计显著性。p>0.5的p值被认为是不显著的，而p<0.5的p值被认为是显著的(*)，p<0.01(**)和p<0.001(***)是高度显著的。
5.2结果
5.2.1与野生型LCMV相比，重组的三片段病毒生长到更低的
滴度
野生型LCMV的基因组由负极性的两个单链RNA片段(一个L，一个S片段)组成(附图1A)。近年来已经显示，有可能向LCMV颗粒中存在的正常双片段基因组中引入其他的外源基因。NP和GP基因被分隔在两个S片段类似物上，目的基因插入到LCMV的每个产生的S片段中，产生具有三个RNA片段(两个S+一个L)的复制型病毒颗粒。当前公开的唯一策略将NP和GP保持在它们在S片段中的天然位置上，因而将GFP或其他转基因置于相应的自由位点(r3LCMV-GFPnat)(附图1B)。这是将S片段的遗传改组取消得到的基因组的生存力的可能风险最小化的直观方法。然而，这项研究猜测，应该还可能的是将GP并置于3'UTR，使它从通常驱动NP的启动子元件表达(r3LCMV-GFPart；附图1C)。通过重组cDNA克隆产生了相应的表达质粒，所有三种病毒构建体从质粒DNA中完全地拯救。用三种病毒进行生长曲线比较(附图1D)。所有三种病毒显示了感染后48小时的最高滴度，三片段病毒的峰值滴度比野生型病毒低10-100倍。野生型LCMV达到3.4×106PFU/ml，r3LCMV-GFPnat峰值是2.7×104PFU/ml，r3LCMV-GFPart为2.2×105PFU/ml。不论它们类似地降低的峰值滴度，r3LCMV-GFPnat展现了在早期时间点期间比r3LCMV-GFPart稍微更高的无细胞感染性。
5.2.2三片段病毒颗粒的包装比双片段病毒低效
这些观察表明，添加第二个S片段损害和延迟了病毒生长。假说是，病毒适应性(viral fitness)的这种降低可能是由于全部三个RNA片段低效地包装入病毒颗粒，因而形成过多的双片段颗粒，当感染新鲜细胞时，它不能生产性地复制。对于这些实验，使用了具有两种不同报告基因的r3LCMVs，即，GFP与GP一起在一个S片段上，NP靠近RFP在第二个S片段上。这产生名为r3LCMV-GFP/RFPnat和r3LCMV-GFP/RFPart的两种病毒，它们的不同仅在于相应S片段上GFP和GP的排列。BHK-21用r3LCMV-GFP-RFPnat或双片段r2LCMV感染，在正常的BHK-21细胞上进行病灶形成分析，或并行地，使用稳定转染的BHK-21细胞，其表达GP(BHK-GP)或NP(BHK-NP)作为细胞基础来反式补充缺乏相应仅有的病毒基因组。将野生型和GP补充细胞染色用于表达核蛋白的病毒病灶，而将NP-补充细胞染色用于GP-阳性病灶。从而，野生型BHK-21细胞上的免疫病灶形成仅检测三片段病毒粒。不受理论的限制，BHK-GP细胞应当复制三片段病毒粒以及含有L片段和表达NP的S片段(但不是表达GP的S)的双片段病毒.反之，BHK-NP细胞应当复制三片段LCMV，以及另外复制由L和表达GP的S片段(但不是表达NP的S片段)组成的NP缺陷病毒粒。与在wt BHK-21细胞上测试感染性时相比，当在BHK-GP或BHK-NP细胞上评估时，r3LCMV-GFP/RFPnat和r3LCMV-GFP/RFPart的传染性滴度是一致地更高的。相反，不论用于评估其感染性的细胞基底，r2LCMV的滴度是类似的。为了校正每种细胞株对LCMV的可感染性方面潜在固有差异，将BHK-21细胞上的每种病毒滴度标准化为1显示，BHK-GP以及BHK-NP滴度表示为其倍数。由此反映了在病毒可感染性方面与潜在的克隆固有差异相关的细胞克隆相关的滴度差异。在任一种补充细胞上，对于r3LCMV-GFP/RFPnat和r3LCMV-GFP/RFPart，观察到大约五到十倍的滴度差异，其显著更高于r2LCMV。这表明由两个三片段病毒形成的大部分病毒颗粒仅含有两个S片段之一，分别仅编码表达NP的片段(仅NP的颗粒)或表达GP的片段(仅GP的颗粒)。滴度方面5倍或更大的差异表明，仅NP的颗粒以及仅GP的颗粒各自在数量上超过三片段颗粒大约五倍，三片段颗粒仅构成了病毒粒中的小于百分之10，这与在非补充细胞上生长时延迟的生长和病毒峰值滴度的降低是一致的。通过流式细胞计进一步验证了这些发现。非补充BHK-21细胞或BHK-NP细胞用r3LCMV-GFP/RFPart或r2LCMV感染作为门选对照，用流式细胞计评估GFP和RFP的荧光强度(附图2B)。由于野生型BHK-21细胞不提供最小反式作用因子，仅有至少含L片段和表达NP的S片段的病毒粒可以在细胞进入之后启动传染周期，产生荧光信号(RFP)。因而，在BHK-21的感染时观察到RFP+GFP-细胞的群体，反应了仅有NP的颗粒。RFP+GFP+双阳性细胞是真实的三片段颗粒的证据。根据还观察到门选的RFP-GFP+细胞，而具有比RFP-GFP-细胞更高的RFP MFI，表明它们代表了三片段颗粒感染的早期阶段，该解释也得到了该群体和RFP+GFP+双阳性群体的连续性的支持。然而，当在BHK-NP细胞上生长三片段r3LCMV-GFP/RFPart时，由此代替了这种最小反式作用因子，我们观察到与非补充BHK-21细胞的感染相比更高超过10倍数量的RFP-GFP+细胞。反之，以可比较的丰度检测到RFP+GFP-(仅NP颗粒的证据)和GFP+RFP+双阳性细胞(三片段颗粒)(附图2C)。这些结果在单细胞水平确认了病灶形成分析所获得的发现，因而证实了三片段病毒制品含有大部分双片段的复制缺陷性颗粒。这些发现为r3LCMV-GFP/RFPnat和r3LCMV-GFP/RFPart的减弱的生长提供了可能的解释，提供了对三片段病毒的显然相当低效的随机包装的洞察。
5.2.3重组病毒的克隆和拯救来跟踪体内重组
由于三片段病毒显示了受损的生长动力学，如附图1所见，假设的是，对于病毒在仅一个S片段上重组它们的NP和GP的遗传信息应当有高的选择压力。据推测，沙粒病毒的片段内重组引起了北美洲进化枝的系统进化，因而看起来有一种可能的机制，借此三片段病毒可以重新建立功能性的双片段基因组。不受理论的限制，考察两种三片段病毒的基因组架构，假设r3LCMV-GFPnat的选择压力可能有利于IGR区域中的重组事件，将GP和NP带至同一片段上，同时除去GFP。在r3LCMV-GFPart的群体中，选择压力应当是同样高的，然而，如果不是不可能，GP的改组和它紧挨3'UTR的位置应当使得这种病毒非常难以将它的两个S片段组合成一个功能性的片段(参见下文的附图7)。鉴于鉴定RNA重组的注意事项以及为了将其从可能的cDNA污染中可靠地辨别出来，我们克隆了携带GFP和重组GP ORF的S片段，在该重组GP ORF中末端的255个核苷酸是密码子优化的。产生的GP具有与野生型WE毒株GP不同的核苷酸序列但相同的翻译产物(WE/WET-GP，附图3A)。然而，这种重组的WE/WET GP ORF既不作为传染性的双片段病毒存在，实验室也不拥有与NP相关联的cDNA构建体。因此，在与NP的同一片段上含有WE/WET的任何可能的双片段病毒被认为是片段间重组的明显证据，在相应的分析中将这种病毒从可能污染的cDNA或RNA区分开来。为了测试嵌合的GP是否影响病毒适应性，带有WE/WET融合GP的重组的三片段病毒(r3LCMV-WEWET/GFPnat)的细胞培养生长曲线，与带有野生型WE GP的三片段病毒(r3LCMV-WE/GFPnat)进行比较(附图3B)。两种病毒的生长动力学和峰值滴度是可比较的(r3LCMV-WE/GFPnat：1.7×106PFU/ml，r3LCMV-WEWET/GFPnat：2.3×106PFU/ml)。因而嵌合的WEWET糖蛋白不会可检测地影响病毒生长。
为了测试可能的重组事件是否可能在包含IGR的S片段的NP和GP基因之间发生。因此，在编码NP的S片段的基因间区域中引入了单个核苷酸删除，充当遗传标签。选择这个核苷酸删除是因为它位于一延伸中，其不同于在序列上和长度在在毒株之间都不保守的大部分S片段IGR。在重组事件的情况下，这个“标记的”(在整个附图和文本中都标记为*)基因间区域应当容许鉴定S片段IGR序列的遗传学来源。删除的胞嘧啶的位置(用箭头指出)和产生的带有NP的S片段的示意图在附图3C中示出。为了测试IGR中引入的删除是否对病毒生长有影响，拯救了有或没有该单个核苷酸删除的重组r3LCMV-GFPnat。在BHK-21细胞上进行生长曲线实验(moi＝0.01)。具有野生型IGR的三片段病毒(r3LCMV-GFPnat)和具有突变的IGR的比较物(r3LCMV-GFPnat IGR*)以相似的速率生长，到达不可区分的峰值滴度(附图3D)。因此，在携带NP的S片段上IGR的标签对于病毒适应性没有可检测的影响，这认可了它在随后的体内实验中的用途。
5.2.4在小鼠中r3LCMV-GFPnat而非r3LCMV-GFPart的持续感染
达到与双片段wt病毒相当的水平，并引起GFP表达的损失
在证据重组r3LCMV-GFPnat时，目的是研究三片段病毒是否在体内重组。为此，AGRAG小鼠用r3LCMV-GFPnat、r3LCMV-GFPart或作为对照的双片段r2LCMV感染。AGRAG小鼠在编码干扰素-α/β受体、干扰素-γ受体和RAG1的基因中带有靶向删除，产生免疫缺陷表型，以及在用三片段LCMV感染后建立慢性病毒血症。随时间采集血液样品，通过病灶形成分析评估病毒滴度(附图4A)。在感染后5天内，双片段LCMV的携带者显示了处于5×105PFU/ml血液的范围内的高滴度病毒血症，随后在104-105PFU/ml范围内的稳定的病毒血症直到感染后至少50天。用三片段LCMV感染的小鼠显示了约5×103PFU/ml血液的病毒负载直到第20天，与细胞培养中减弱的生长相符(与附图1D比较)。从第30天往后，r3LCMV-GFPnat的携带者展现了病毒负载的升高，这在感染r3LCMV-GFPart的动物中未观察到，到第50天产生病毒血症方面超过10倍的差异。为了确定主要病毒群体仍然带有GFP报告基因，因而引起感染的细胞中的GFP表达，用感染后第127天采集的r3LCMV-GFPnat和r3LCMV-GFPart携带者的血液样品进行病毒病灶形成分析，对核蛋白或报告基因GFP染色(附图4B)。从r3LCMV-GFPart携带者分离的血液的染色产生了与抗-NP和抗-GFP抗体检测相当数量的病灶(两种评估都独立地显示了103PFU/ml范围内的病毒滴度)，与表达GFP的病灶相比，至少更高100倍数量的总(NP+)r3LCMV-GFPnat病灶是明显的。基于抗-NP检测测出了至少104PFU/ml的病毒滴度，而三只小鼠中的两只未能显示任何可检测的GFP阳性感染，一只小鼠具有处于100PFU/ml范围内的GFP阳性病灶的残余部分，相应于我们的分析的检测下限。还通过荧光显微镜评估了感染的细胞的GFP表达(数据未显示)。在分析来自r3LCMV-GFPnat携带者的血液时，GFP荧光病灶是实际上不可检测的，而来自r3LCMV-GFPart携带者的GFP阳性病灶的人工计数与抗-NP病灶形成分析获得的滴度结果是匹配的。在感染后120天通过对感染的小鼠的PBMC的流式细胞计分析进一步验证了报告基因表达。我们发现在r3LCMV-GFPart感染的动物中超过10％的CD11b+GR1-单核细胞/巨噬细胞是GFP阳性的，而来自r3LCMV-GFPnat的血液仅显示了背景水平的GFP，其与用非荧光r2LCMV感染的动物是可比较的(附图4C-E)。这一发现进一步支持了在其天然位置具有GP的三片段病毒随着时间失去报告基因表达，而处在人工的3’UTR并列位置中的GP的转位防止转基因损失的假说。
5.2.5具有处于天然位置的GP的三片段病毒可以重组它们的两个S片段，产生单个S片段具有位于转基因序列残留物两侧的部分或完整的IGR重复件
附图4显示了在感染r3LCMV-GFPnat的小鼠中提高的病毒血症和报告基因表达的损失。因此，假设重组事件可以解释这一实验结果。片段间重组应当将GP和NP组合到同一S片段上，避免在病毒复制周期中需要第二个S片段。这样的事件则可能解释了野生型病毒水平的病毒血症，同时损失报告基因表达。为了测试这种可能性，从感染小鼠的血清分离病毒RNA，一对结合NP和GP序列的引物分别用于通过RT-PCR选择性地仅扩增推断的重组RNA分子，其在一个RNA片段上以反义方向携带NP和GP ORF。通过凝胶电泳分析产生的PCR片段(附图5A)。所有r3LCMV-GFPnat携带者的血清得到了RT依赖性PCR产物，而r3LCMV-GFPart携带者和天然对照没有显示特异性条带。在模拟RT处理的RNA样品上进行对照PCR反应，来排除作为PCR产物的来源的cDNA污染。三个单独的r3LCMV-GFPnat携带者的测序结果在附图5C中示意性呈现。三只小鼠含有不同序列的病毒RNA片段但又具有类似的模式：在一个RNA片段上发现处于反义方向的GP和NP的C-末端部分。在它们之间，两个基因间区域，即，表达NP的基因间区域和原始的表达GP的片段的基因间区域至少部分地保留了，被来自三片段病毒的亲本S片段中的GFP报告基因之一或两者的片段分隔。在从单独小鼠中回收的三种RNA种类之间GFP片段的方向和长度是变化的，这是独立的重组事件的证明。为了进一步支持这种观点，以采样间不超过三周的间隔时间，从同一小鼠采集的两份连续样品中恢复了精确相同的重组的RNA序列。根据所获得的重组的S片段序列，我们提出了一种分子机制，在附图7中示意性列出，在附图的图例中描述，借助这种机制，r3LCMV-GFPnat重组它的两个S片段，产生转基因损失和表型回复到野生型病毒。附图7中的示意图还解释了，根据所提出的S片段重组的机制，r3LCMV-GFPart为什么不能重组并将它的NP和GP ORF结合到一个功能性S片段上。
5.2.6在S片段上具有两个IGR的重组r2LCMV是活的，生长到与在S片段中仅具有一个IGR的双片段LCMV相似的滴度。
上述测序数据显示了在重组的S片段中病毒遗传元件的一致模式，在这之中IGR的(至少部分)加倍是特别值得注意的和特征性的。然而，在一个S片段上具有基因间区域的重复的沙粒病毒是未知的。然而，双重茎环在旧世界沙粒病毒Mopeia中天然地存在。因此，我们将带有两个IGR和残余GFP的r3LCMV-GFPnat携带者#3的重排的S片段克隆到pol-I驱动的S片段表达质粒中，并拯救了相应的病毒。这个病毒(r2LCMV_2IGRs)在BHK-21细胞上的生长动力学与三片段r3LCMV-GFPnat和双片段r2LCMV相比较(附图6)。r2LCMV_2IGRs的传染性无细胞滴度在早期时间点超过了r3LCMV-GFPnat的，达到与r2LCMV相同的峰值滴度(分别为1.7×107PFU/ml vs.1.6×107PFU/ml)。重要的是，r2LCMV_2IGRs生长到比它的亲本三片段r3LCMV-GFPnat显著更高的峰值滴度，证明尽管在这一过程中有IGR的加倍，片段间重组仍有选择优势。
5.2.7表达卵清蛋白(OVA)的重组r3LCMV诱导快速的、强的和多功能的OVA特异性CD8+T细胞反应。
为了测试r3LCMVart载体递送技术用于疫苗接种目的的实用性，我们产生了r3LCMV-OVAart疫苗载体，具有与r3LCMV-GFPart类似的基因组架构(附图1C)，但是在后来的病毒中具有两个卵清蛋白(OVA)基因而不是相应的GFP基因。我们用104PFU的r3LCMV-OVAart肌内注射(i.m.)免疫C57Bl/6小鼠，八天后分析脾脏中的T细胞反应。为了与广泛使用的载体平台比较，我们用108个颗粒的也表达OVA的、复制缺陷性E1删除的基于腺病毒5的载体(rAd5-OVA)免疫第二组C57BL/6小鼠。识别免疫决定性OVA衍生的SIINFEKL表位的OVA特异性CD8+T细胞的频率在r3LCMV-OVAart疫苗组中处在CD8+T细胞的10％的范围内，这显著更高于rAd5-OVA组(附图8A)。通过细胞内细胞因子分析测定的，r3LCMV-OVAart诱导的CD8+T细胞反应不仅有更高的数量级，还有更高的功能，显示大部分SIINFEKL-反应性r3LCMV-OVAart诱导的CD8+T细胞响应于肽刺激产生IFN-γ，以及相当比例的共同产生的TNF-α和/或IL-2。这证明了r3LCMV-OVAart载体技术用于疫苗递送的实用性。
5.2.8三片段的LCMV诱导多功能记忆CD8+T细胞。
为了回答r3LCMV载体是否诱导功能性CD8+T细胞记忆的问题，我们用10e5PFU的r3LCMV-OVAart i.v.免疫C57BL/6小鼠，并在第25天分析脾脏中的OVA-特异性(SIINFEKL-特异性)CD8+T细胞反应。参考对照组的小鼠通过相同的途径用10e8个病毒颗粒(vp)的、表达OVA的重组E1删除的腺病毒载体(rAd)免疫。在SIINFEKL肽刺激下，在标准的细胞内细胞因子分析中评估肽刺激时产生IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的OVA特异性CD8+T细胞。测得了如图表中标明的细胞因子生产细胞的频率(附图9A)和绝对数量(附图9B)。与rAd-OVA免疫小鼠相比，r3LCMV-OVAart免疫的小鼠展现了共同产生OVA特异性CD8+T细胞的多功能IFN-γ/TNF-α和IFN-γ/TNF-α/IL-2的显著更高的频率和数量。
5.2.9编码抗原的LCMV诱导了针对外源和自体抗原的特异性T细胞反应。
为了研究r3LCMVart载体是否可以用于诱导针对肿瘤表达的自体抗原的CD8+T细胞反应，我们用表达大鼠(TYVPANASL)、人(TYLPTNASL)或小鼠(TYLPANASL)的Her2衍生的CD8+T细胞表位的r3LCMVart载体免疫BALB/c小鼠(附图10)。九天后，我们在细胞内细胞因子分析中测量了相应的肽的刺激下产生IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的特异性CD8+T细胞。附图10展现了在相关肽的刺激下表位特异性CD8+T细胞的频率，作为产生标明的细胞因子组合的CD8+T细胞的百分比。在用培养基再刺激时产生细胞因子的CD8+T细胞的频率是无意义的。结果证明，r3LCMVart载体有能力诱导相当频率的肿瘤自体抗原反应性CD8+T细胞反应。
5.2.10在r3LCMVart感染时诱导干扰素-α，但在用重组腺病毒或牛痘病毒载体感染时不被诱导。
I型干扰素可以具有多种免疫刺激性和抗肿瘤作用。因此，I型干扰素诱导可以代表病毒载体疫苗的有利特征。我们进行了ELISA测量来测定24、48或72小时之前用r3LCMV-OVAart、rAd-OVA或表达OVA的重组牛痘病毒(rVacc)免疫的小鼠血清中干扰素-α的浓度(附图11)。r3LCMVart诱导可检测的和持续的(至少48小时)全身性干扰素-α反应，rAd和rVacc都不诱导。这证明了r3LCMVart载体诱导强的先天免疫反应的能力。
5.2.11与r3JUNV-GFPnat和亲本Junin毒株Candid#1对比的r3JUNV-GFPart的细胞培养物生长
与携带附图1B中所列基因组的r3LCMV-GFPnat和r3LCMV-GFPart载体类似，我们工程化了r3JUNV-GFPnat和r3JUNV-GFPart，由三片段的基于Junin疫苗毒株Candid#1的载体组成，在它们相应两个S片段的每一个中携带GFP基因(r3JUNV-GFPnat和r3JUNV-GFPart)。我们测试了它们在293T细胞中的生长性质，以0.01的感染复数感染所述细胞，随着时间采集上清液(附图12)。我们发现r3JUNV-GFPart比它的亲本双片段Junin疫苗毒株Candid#1生长更慢(附图12)。然而它比r3JUNV-GFPnat生长更快(附图12)。三片段的基于Junin病毒的载体的这种不同的生长行为与r3LCMV-GFPnat和r3LCMV-GFPart载体是相似的(附图1D)。
5.2.12三片段的JUNV是在体内显著减毒的，r3JUNV-GFPnat而不是r3JUNV-GFPart在延长的体内复制期间丢失GFP表达。
为了研究r3JUNV-GFPnat和r3JUNV-GFPart的遗传稳定性，我们用7×10e4PFU的任一种这些GFP表达载体感染AGRAG小鼠(IFNα/βR-/-，IFNγR-/-，RAG-/-)。为了比较，第三组用野生型双片段Candid#1病毒感染。后一病毒在感染后第20天在所有感染的小鼠的血液中是容易检测的(附图13A)，而三片段的病毒维持了不可检测至少40天。这一发现证明了作为基因组重构的结果的减弱的体内生长，将我们在附图4A中用r3LCMV-GFP载体的发现扩展到基于Junin的载体。在40天后，在每个组的几只动物中，r3JUNV-GFPnat和r3JUNV-GFPart也变为可检测(附图13A)。重要的是，然而某些r3JUNV-GFPnat感染的小鼠达到了野生型Candid#1感染的小鼠的范围内的病毒负载，而病毒血症的r3JUNV-GFPart感染的小鼠保持了比Candid#1感染的对照更低的病毒负载。
为了确定这些病毒血症动物中的主要病毒群体是否仍然携带GFP报告基因，由此引起感染的细胞中的GFP表达，我们用感染后120天采集的r3JUNV-GFPnat和r3JUNV-GFPart携带者的血液样品进行了病毒病灶形成分析。我们比较了维持GFP表达的病毒的传染性滴度(抗-GFP，附图13B)，以及总的Junin病毒感染性(anti-NP，附图13B)。r3JUNV-GFPart滴度处在通过抗-GFP或抗-NP免疫病灶分析所测定时的相似范围内，证明了大部分病毒群体维持了GFP表达。反之，在具有最高的病毒血症的四只r3JUNV-GFPnat感染的动物的血液中(与野生型Candid#1相比)，抗GFP传染性滴度至少10倍低于通过NP染色测定的总传染性滴度。这证明了r3JUNV-GFPart稳定地在体内维持了GFP转基因，而r3JUNV-GFPnat没有。
5.2.13基于三片段LCMV和JUNV的疫苗载体的同源和异源的初免-强化组合诱导了强的P1A自身抗原特异性CD8+T细胞反应。
接下来，我们研究了基于r3LCMVart和r3JUNVart的载体是否可以用于同源和异源的初免-强化组合，用于诱导肿瘤自身抗原特异性CD8+T细胞反应。我们构建了基于r3LCMVart和r3JUNVart的载体，它们表达P815小鼠肥大细胞瘤衍生的自体抗原P1A(SEQ ID NO：24)(r3LCMV-P1Aart(SEQ ID NO：18、19、20)和r3JUNV-P1Aart(SEQ ID NO：21、22、23))。这些疫苗构建体如附图14中所列的在同源和异源的初免-强化组合中i.v.免疫BALB/c小鼠。当在同源的初免-强化疫苗接种中施用时，r3LCMV-P1Aart和r3JUNV-P1Aart都诱导了P1A表位特异性CD8+T细胞，是使用了加载LPYLGWLVF肽的H-2Ld-四聚体从血液测定的。在实验的第63天，表位特异性CD8+T细胞的平均频率分别是1.2％(r3JUNV-P1Aart)和3.9％(r3LCMV-P1Aart)。另外，以异源方式用r3JUNV-P1Aart初免并用r3LCMV-P1Aart强化的动物产生了甚至更高的反应，在第63天是平均表位特异性CD8+T细胞频率是19.5％。r3LCMV-P1Aart初免和r3JUNV-P1Aart强化的动物的频率(3.1％)与经历r3LCMV-P1Aart的同源初免-强化免疫接种的动物是相当的。
6.等同
本文公开的病毒、核酸、方法、宿主细胞和组合物在范围上不受本文描述的具体实施方式的限制。实际上，除了描述的那些之外，根据上述说明书和附图，病毒、核酸、方法、宿主细胞和组合物的各种修改对本领域技术人员而言是显而易见的。这种修改也将落在附随的权利要求的范围之中。
在此引用各种出版物、专利和专利申请，它们的公开内容通过将它们完全引用而合并在本文中。
在此引用各种出版物、专利和专利申请，它们的公开内容通过将它们完全引用而合并在本文中。
7.序列表
序列表
<110> 日内瓦大学
<120> 作为疫苗载体的三片段沙粒病毒
<130> 103931PC
<140> to be assigned
<141> on even date herewith
<150> US 62/079,493
<151> 2014-11-13
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3376
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV片段S完整基因组序列的cDNA序列
<400> 1
cgcaccgggg atcctaggct ttttggattg cgctttcctc tagatcaact gggtgtcagg 60
ccctatccta cagaaggatg ggtcagattg tgacaatgtt tgaggctctg cctcacatca 120
tcgatgaggt gatcaacatt gtcattattg tgcttatcgt gatcacgggt atcaaggctg 180
tctacaattt tgccacctgt gggatattcg cattgatcag tttcctactt ctggctggca 240
ggtcctgtgg catgtacggt cttaagggac ccgacattta caaaggagtt taccaattta 300
agtcagtgga gtttgatatg tcacatctga acctgaccat gcccaacgca tgttcagcca 360
acaactccca ccattacatc agtatgggga cttctggact agaattgacc ttcaccaatg 420
attccatcat cagtcacaac ttttgcaatc tgacctctgc cttcaacaaa aagacctttg 480
accacacact catgagtata gtttcgagcc tacacctcag tatcagaggg aactccaact 540
ataaggcagt atcctgcgac ttcaacaatg gcataaccat ccaatacaac ttgacattct 600
cagatcgaca aagtgctcag agccagtgta gaaccttcag aggtagagtc ctagatatgt 660
ttagaactgc cttcgggggg aaatacatga ggagtggctg gggctggaca ggctcagatg 720
gcaagaccac ctggtgtagc cagacgagtt accaatacct gattatacaa aatagaacct 780
gggaaaacca ctgcacatat gcaggtcctt ttgggatgtc caggattctc ctttcccaag 840
agaagactaa gttcttcact aggagactag cgggcacatt cacctggact ttgtcagact 900
cttcaggggt ggagaatcca ggtggttatt gcctgaccaa atggatgatt cttgctgcag 960
agcttaagtg tttcgggaac acagcagttg cgaaatgcaa tgtaaatcat gatgccgaat 1020
tctgtgacat gctgcgacta attgactaca acaaggctgc tttgagtaag ttcaaagagg 1080
acgtagaatc tgccttgcac ttattcaaaa caacagtgaa ttctttgatt tcagatcaac 1140
tactgatgag gaaccacttg agagatctga tgggggtgcc atattgcaat tactcaaagt 1200
tttggtacct agaacatgca aagaccggcg aaactagtgt ccccaagtgc tggcttgtca 1260
ccaatggttc ttacttaaat gagacccact tcagtgatca aatcgaacag gaagccgata 1320
acatgattac agagatgttg aggaaggatt acataaagag gcaggggagt acccccctag 1380
cattgatgga ccttctgatg ttttccacat ctgcatatct agtcagcatc ttcctgcacc 1440
ttgtcaaaat accaacacac aggcacataa aaggtggctc atgtccaaag ccacaccgat 1500
taaccaacaa aggaatttgt agttgtggtg catttaaggt gcctggtgta aaaaccgtct 1560
ggaaaagacg ctgaagaaca gcgcctccct gactctccac ctcgaaagag gtggagagtc 1620
agggaggccc agagggtctt agagtgtcac aacatttggg cctctaaaaa ttaggtcatg 1680
tggcagaatg ttgtgaacag ttttcagatc tgggagcctt gctttggagg cgctttcaaa 1740
aatgatgcag tccatgagtg cacagtgcgg ggtgatctct ttcttctttt tgtcccttac 1800
tattccagta tgcatcttac acaaccagcc atatttgtcc cacactttgt cttcatactc 1860
cctcgaagct tccctggtca tttcaacatc gataagctta atgtccttcc tattctgtga 1920
gtccagaagc tttctgatgt catcggagcc ttgacagctt agaaccatcc cctgcggaag 1980
agcacctata actgacgagg tcaacccggg ttgcgcattg aagaggtcgg caagatccat 2040
gccgtgtgag tacttggaat cttgcttgaa ttgtttttga tcaacgggtt ccctgtaaaa 2100
gtgtatgaac tgcccgttct gtggttggaa aattgctatt tccactggat cattaaatct 2160
accctcaatg tcaatccatg taggagcgtt ggggtcaatt cctcccatga ggtcttttaa 2220
aagcattgtc tggctgtagc ttaagcccac ctgaggtgga cctgctgctc caggcgctgg 2280
cctgggtgaa ttgactgcag gtttctcgct tgtgagatca attgttgtgt tttcccatgc 2340
tctccccaca atcgatgttc tacaagctat gtatggccat ccttcacctg aaaggcaaac 2400
tttatagagg atgttttcat aagggttcct gtccccaact tggtctgaaa caaacatgtt 2460
gagttttctc ttggccccga gaactgcctt caagaggtcc tcgctgttgc ttggcttgat 2520
caaaattgac tctaacatgt tacccccatc caacagggct gcccctgcct tcacggcagc 2580
accaagacta aagttatagc cagaaatgtt gatgctggac tgctgttcag tgatgacccc 2640
cagaactggg tgcttgtctt tcagcctttc aagatcatta agatttggat acttgactgt 2700
gtaaagcaag ccaaggtctg tgagcgcttg tacaacgtca ttgagcggag tctgtgactg 2760
tttggccata caagccatag ttagacttgg cattgtgcca aattgattgt tcaaaagtga 2820
tgagtctttc acatcccaaa ctcttaccac accacttgca ccctgctgag gctttctcat 2880
cccaactatc tgtaggatct gagatctttg gtctagttgc tgtgttgtta agttccccat 2940
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cttagacaag gacatcttgt tgctcaatgg tttctcaaga caaatgcgca atcaaatgcc 3360
taggatccac tgtgcg 3376
<210> 2
<211> 3377
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV克隆13片段S完整序列 (GenBank: DQ361065.2)
<400> 2
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat gggtcagatt gtgacaatgt ttgaggctct gcctcacatc 120
atcgatgagg tgatcaacat tgtcattatt gtgcttatcg tgatcacggg tatcaaggct 180
gtctacaatt ttgccacctg tgggatattc gcattgatca gtttcctact tctggctggc 240
aggtcctgtg gcatgtacgg tcttaaggga cccgacattt acaaaggagt ttaccaattt 300
aagtcagtgg agtttgatat gtcacatctg aacctgacca tgcccaacgc atgttcagcc 360
aacaactccc accattacat cagtatgggg acttctggac tagaattgac cttcaccaat 420
gattccatca tcagtcacaa cttttgcaat ctgacctctg ccttcaacaa aaagaccttt 480
gaccacacac tcatgagtat agtttcgagc ctacacctca gtatcagagg gaactccaac 540
tataaggcag tatcctgcga cttcaacaat ggcataacca tccaatacaa cttgacattc 600
tcagatgcac aaagtgctca gagccagtgt agaaccttca gaggtagagt cctagatatg 660
tttagaactg ccttcggggg gaaatacatg aggagtggct ggggctggac aggctcagat 720
ggcaagacca cctggtgtag ccagacgagt taccaatacc tgattataca aaatagaacc 780
tgggaaaacc actgcacata tgcaggtcct tttgggatgt ccaggattct cctttcccaa 840
gagaagacta agttcctcac taggagacta gcgggcacat tcacctggac tttgtcagac 900
tcttcagggg tggagaatcc aggtggttat tgcctgacca aatggatgat tcttgctgca 960
gagcttaagt gtttcgggaa cacagcagtt gcgaaatgca atgtaaatca tgatgaagaa 1020
ttctgtgaca tgctgcgact aattgactac aacaaggctg ctttgagtaa gttcaaagag 1080
gacgtagaat ctgccttgca cttattcaaa acaacagtga attctttgat ttcagatcaa 1140
ctactgatga ggaaccactt gagagatctg atgggggtgc catattgcaa ttactcaaag 1200
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aacatgatta cagagatgtt gaggaaggat tacataaaga ggcaggggag taccccccta 1380
gcattgatgg accttctgat gttttccaca tctgcatatc tagtcagcat cttcctgcac 1440
cttgtcaaaa taccaacaca caggcacata aaaggtggct catgtccaaa gccacaccga 1500
ttaaccaaca aaggaatttg tagttgtggt gcatttaagg tgcctggtgt aaaaaccgtc 1560
tggaaaagac gctgaagaac agcgcctccc tgactctcca cctcgaaaga ggtggagagt 1620
cagggaggcc cagagggtct tagagtgtca caacatttgg gcctctaaaa attaggtcat 1680
gtggcagaat gttgtgaaca gttttcagat ctgggagcct tgctttggag gcgctttcaa 1740
aaatgatgca gtccatgagt gcacagtgcg gggtgatctc tttcttcttt ttgtccctta 1800
ctattccagt atgcatctta cacaaccagc catatttgtc ccacactttg tcttcatact 1860
ccctcgaagc ttccctggtc atttcaacat cgataagctt aatgtccttc ctattctgtg 1920
agtccagaag ctttctgatg tcatcggagc cttgacagct tagaaccatc ccctgcggaa 1980
gagcacctat aactgacgag gtcaacccgg gttgcgcatt gaagaggtcg gcaagatcca 2040
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gcctgggtga attgactgca ggtttctcgc ttgtgagatc aattgttgtg ttttcccatg 2340
ctctccccac aatcgatgtt ctacaagcta tgtatggcca tccttcacct gaaaggcaaa 2400
ctttatagag gatgttttca taagggttcc tgtccccaac ttggtctgaa acaaacatgt 2460
tgagttttct cttggccccg agaactgcct tcaagaggtc ctcgctgttg cttggcttga 2520
tcaaaattga ctctaacatg ttacccccat ccaacagggc tgcccctgcc ttcacggcag 2580
caccaagact aaagttatag ccagaaatgt tgatgctgga ctgctgttca gtgatgaccc 2640
ccagaactgg gtgcttgtct ttcagccttt caagatcatt aagatttgga tacttgactg 2700
tgtaaagcaa gccaaggtct gtgagcgctt gtacaacgtc attgagcgga gtctgtgact 2760
gtttggccat acaagccata gttagacttg gcattgtgcc aaattgattg ttcaaaagtg 2820
atgagtcttt cacatcccaa actcttacca caccacttgc accctgctga ggctttctca 2880
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tatatacccc tgaagcctgg ggcctttcag acctcatgat cttggccttc agcttctcaa 3000
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<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV毒株MP片段L完整序列
<400> 4
gcgcaccggg gatcctaggc atttttgttg cgcattttgt tgtgttattt gttgcacagc 60
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tgatcttgca tctttcaaga ttttcataga gtctataccg gaacgcttat caacagtggt 6600
cttgagagat tcgcaaagtc tgaagtactc agattcctca aagactttct catcttggct 6660
agaatactct aaaagtttaa acagaaggtc tctgaacttg aaattcaccc actctggcat 6720
aaagctgtta tcataatcac accgaccatc cactattggg accaatgtga tacccgcaat 6780
ggcaaggtct tctttgatac aggctagttt attggtgtcc tctataaatt tcttctcaaa 6840
actagctggt gtgcttctaa cgaagcactc aagaagaatg agggaattgt caatcagttt 6900
ataaccatca ggaatgatca aaggcagtcc cgggcacaca atcccagact ctattagaat 6960
tgcctcaaca gatttatcat catggttgtg tatgcagccg ctcttgtcag cactgtctat 7020
ctctatacaa cgcgacaaaa gtttgagtcc ctctatcaat accattctgg gttctctttg 7080
ccctaaaaag ttgagcttct gccttgacaa cctctcatct tgttctatgt ggtttaagca 7140
caactctctc aactccgaaa tagcctcatc cattgcgcat caaaaagcct aggatcctcg 7200
gtgcg 7205
<210> 5
<211> 3359
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV毒株MP片段S完整序列
<400> 5
cgcaccgggg atcctaggct ttttggattg cgctttcctc agctccgtct tgtgggagaa 60
tgggtcaaat tgtgacgatg tttgaggctc tgcctcacat cattgatgag gtcattaaca 120
ttgtcattat cgtgcttatt atcatcacga gcatcaaagc tgtgtacaat ttcgccacct 180
gcgggatact tgcattgatc agctttcttt ttctggctgg caggtcctgt ggaatgtatg 240
gtcttgatgg gcctgacatt tacaaagggg tttaccgatt caagtcagtg gagtttgaca 300
tgtcttacct taacctgacg atgcccaatg catgttcggc aaacaactcc catcattata 360
taagtatggg gacttctgga ttggagttaa ccttcacaaa tgactccatc atcacccaca 420
acttttgtaa tctgacttcc gccctcaaca agaggacttt tgaccacaca cttatgagta 480
tagtctcaag tctgcacctc agcattagag gggtccccag ctacaaagca gtgtcctgtg 540
attttaacaa tggcatcact attcaataca acctgtcatt ttctaatgca cagagcgctc 600
tgagtcaatg taagaccttc agggggagag tcctggatat gttcagaact gcttttggag 660
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gccagacaaa ctaccaatat ctgattatac aaaacaggac ttgggaaaac cactgcaggt 780
acgcaggccc tttcggaatg tctagaattc tcttcgctca agaaaagaca aggtttctaa 840
ctagaaggct tgcaggcaca ttcacttgga ctttatcaga ctcatcagga gtggagaatc 900
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acacagctgt tgcaaagtgc aatgtaaatc atgatgaaga gttctgtgat atgctacgac 1020
tgattgatta caacaaggct gctttgagta aattcaaaga agatgtagaa tccgctctac 1080
atctgttcaa gacaacagtg aattctttga tttctgatca gcttttgatg agaaatcacc 1140
taagagactt gatgggagtg ccatactgca attactcgaa attctggtat ctagagcatg 1200
caaagactgg tgagactagt gtccccaagt gctggcttgt cagcaatggt tcttatttga 1260
atgaaaccca tttcagcgac caaattgagc aggaagcaga taatatgatc acagaaatgc 1320
tgagaaagga ctacataaaa aggcaaggga gtacccctct agccttgatg gatctattga 1380
tgttttctac atcagcatat ttgatcagca tctttctgca tcttgtgagg ataccaacac 1440
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gtagttgtgg tgcatttaaa gtaccaggtg tggaaaccac ctggaaaaga cgctgaacag 1560
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ttagagtgtt acgacatttg gacctctgaa gattaggtca tgtggtagga tattgtggac 1680
agttttcagg tcggggagcc ttgccttgga ggcgctttca aagatgatac agtccatgag 1740
tgcacagtgt ggggtgacct ctttcttttt cttgtccctc actattccag tgtgcatctt 1800
gcatagccag ccatatttgt cccagacttt gtcctcatat tctcttgaag cttctttagt 1860
catctcaaca tcgatgagct taatgtctct tctgttttgt gaatctagga gtttcctgat 1920
gtcatcagat ccctgacaac ttaggaccat tccctgtgga agagcaccta ttactgaaga 1980
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tgttaagctt ggcattgtgc cgaattgatt gttcagaagt gatgagtcct tcacatccca 2820
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gtccacaagg gaatacacag tttggttgag gcttctgagt ctctgtaaat ctttgtcatc 3120
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gtcactcagt ggatttccaa gtcaaatgcg caatcaaaat gcctaggatc cactgtgcg 3359
<210> 6
<211> 552
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV的MP毒株的NP蛋白的氨基酸序列
<400> 6
Met Ser Leu Ser Lys Glu Val Lys Ser Phe Gln Trp Thr Gln Ala Leu
1 5 10 15
Arg Arg Glu Leu Gln Gly Phe Thr Ser Asp Val Lys Ala Ala Val Ile
20 25 30
Lys Asp Ala Thr Ser Leu Leu Asn Gly Leu Asp Phe Ser Glu Val Ser
35 40 45
Asn Val Gln Arg Ile Met Arg Lys Glu Lys Arg Asp Asp Lys Asp Leu
50 55 60
Gln Arg Leu Arg Ser Leu Asn Gln Thr Val Tyr Ser Leu Val Asp Leu
65 70 75 80
Lys Ser Thr Ser Lys Lys Asn Val Leu Lys Val Gly Arg Leu Ser Ala
85 90 95
Glu Glu Leu Met Ser Leu Ala Ala Asp Leu Glu Lys Leu Lys Ala Lys
100 105 110
Ile Met Arg Ser Glu Arg Pro Leu Thr Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Ala Gln Gln Leu Asp Gln Arg Ser Gln Ile Leu Gln Met Val
130 135 140
Gly Met Arg Arg Pro Gln Gln Ser Ala Asn Gly Val Val Arg Val Trp
145 150 155 160
Asp Val Lys Asp Ser Ser Leu Leu Asn Asn Gln Phe Gly Thr Met Pro
165 170 175
Ser Leu Thr Met Ala Cys Met Ala Lys Gln Ser Gln Thr Ser Leu Asn
180 185 190
Asp Val Val Gln Ala Leu Thr Asp Leu Gly Leu Leu Tyr Thr Val Lys
195 200 205
Tyr Pro Asn Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Asp Lys His Pro Val
210 215 220
Leu Gly Val Ile Thr Glu Gln Gln Ser Ser Ile Asn Ile Ser Gly Tyr
225 230 235 240
Asn Phe Ser Leu Gly Ala Ala Val Lys Ala Gly Ala Ala Leu Leu Asp
245 250 255
Gly Gly Asn Met Leu Glu Ser Ile Leu Ile Lys Pro Ser Asn Ser Glu
260 265 270
Asp Leu Leu Lys Ala Val Leu Gly Ala Lys Lys Lys Leu Asn Met Phe
275 280 285
Asp Arg Asn Pro Tyr Glu Asn Ile Leu Tyr Lys Val Cys Leu Ser Gly
290 295 300
Glu Gly Trp Pro Tyr Ile Ala Cys Arg Thr Ser Val Val Gly Arg Ala
305 310 315 320
Trp Glu Asn Thr Thr Ile Asp Leu Thr Asn Glu Arg Pro Met Ala Asn
325 330 335
Ser Pro Lys Pro Ala Pro Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gln Val Gly Leu
340 345 350
Ser Tyr Ser Gln Thr Met Leu Leu Lys Asp Leu Met Gly Gly Ile Asp
355 360 365
Pro Asn Ala Pro Thr Trp Ile Asp Ile Glu Gly Arg Phe Asn Asp Pro
370 375 380
Val Glu Ile Ala Ile Phe Gln Pro Gln Asn Gly Gln Tyr Ile His Phe
385 390 395 400
Tyr Arg Glu Pro Thr Asp Gln Lys Gln Phe Lys Gln Asp Ser Lys Tyr
405 410 415
Ser His Gly Met Asp Leu Ala Asp Leu Phe Asn Ala Gln Pro Gly Leu
420 425 430
Thr Ser Ser Val Ile Gly Ala Leu Pro Gln Gly Met Val Leu Ser Cys
435 440 445
Gln Gly Ser Asp Asp Ile Arg Lys Leu Leu Asp Ser Gln Asn Arg Arg
450 455 460
Asp Ile Lys Leu Ile Asp Val Glu Met Thr Lys Glu Ala Ser Arg Glu
465 470 475 480
Tyr Glu Asp Lys Val Trp Asp Lys Tyr Gly Trp Leu Cys Lys Met His
485 490 495
Thr Gly Ile Val Arg Asp Lys Lys Lys Lys Glu Val Thr Pro His Cys
500 505 510
Ala Leu Met Asp Cys Ile Ile Phe Glu Ser Ala Ser Lys Ala Arg Leu
515 520 525
Pro Asp Leu Lys Thr Val His Asn Ile Leu Pro His Asp Leu Ile Phe
530 535 540
Arg Gly Pro Asn Val Val Thr Leu
545 550
<210> 7
<211> 498
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV的MP毒株的GP蛋白的氨基酸序列
<400> 7
Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile
20 25 30
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly Met Tyr Gly Leu Asp Gly
50 55 60
Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Arg Phe Lys Ser Val Glu Phe Asp
65 70 75 80
Met Ser Tyr Leu Asn Leu Thr Met Pro Asn Ala Cys Ser Ala Asn Asn
85 90 95
Ser His His Tyr Ile Ser Met Gly Thr Ser Gly Leu Glu Leu Thr Phe
100 105 110
Thr Asn Asp Ser Ile Ile Thr His Asn Phe Cys Asn Leu Thr Ser Ala
115 120 125
Leu Asn Lys Arg Thr Phe Asp His Thr Leu Met Ser Ile Val Ser Ser
130 135 140
Leu His Leu Ser Ile Arg Gly Val Pro Ser Tyr Lys Ala Val Ser Cys
145 150 155 160
Asp Phe Asn Asn Gly Ile Thr Ile Gln Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Asn
165 170 175
Ala Gln Ser Ala Leu Ser Gln Cys Lys Thr Phe Arg Gly Arg Val Leu
180 185 190
Asp Met Phe Arg Thr Ala Phe Gly Gly Lys Tyr Met Arg Ser Gly Trp
195 200 205
Gly Trp Thr Gly Ser Asp Gly Lys Thr Thr Trp Cys Ser Gln Thr Asn
210 215 220
Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn Arg Thr Trp Glu Asn His Cys Arg
225 230 235 240
Tyr Ala Gly Pro Phe Gly Met Ser Arg Ile Leu Phe Ala Gln Glu Lys
245 250 255
Thr Arg Phe Leu Thr Arg Arg Leu Ala Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu
260 265 270
Ser Asp Ser Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Lys
275 280 285
Trp Met Ile Leu Ala Ala Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Lys Cys Asn Val Asn His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg
305 310 315 320
Leu Ile Asp Tyr Asn Lys Ala Ala Leu Ser Lys Phe Lys Glu Asp Val
325 330 335
Glu Ser Ala Leu His Leu Phe Lys Thr Thr Val Asn Ser Leu Ile Ser
340 345 350
Asp Gln Leu Leu Met Arg Asn His Leu Arg Asp Leu Met Gly Val Pro
355 360 365
Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp Tyr Leu Glu His Ala Lys Thr Gly
370 375 380
Glu Thr Ser Val Pro Lys Cys Trp Leu Val Ser Asn Gly Ser Tyr Leu
385 390 395 400
Asn Glu Thr His Phe Ser Asp Gln Ile Glu Gln Glu Ala Asp Asn Met
405 410 415
Ile Thr Glu Met Leu Arg Lys Asp Tyr Ile Lys Arg Gln Gly Ser Thr
420 425 430
Pro Leu Ala Leu Met Asp Leu Leu Met Phe Ser Thr Ser Ala Tyr Leu
435 440 445
Ile Ser Ile Phe Leu His Leu Val Arg Ile Pro Thr His Arg His Ile
450 455 460
Lys Gly Gly Ser Cys Pro Lys Pro His Arg Leu Thr Ser Lys Gly Ile
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Cys Ser Cys Gly Ala Phe Lys Val Pro Gly Val Glu Thr Thr Trp Lys
485 490 495
Arg Arg
<210> 8
<211> 2201
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV的MP毒株的L蛋白的氨基酸序列
<400> 8
Met Asp Glu Ala Ile Ser Glu Leu Arg Glu Leu Cys Leu Asn His Ile
1 5 10 15
Glu Gln Asp Glu Arg Leu Ser Arg Gln Lys Leu Asn Phe Leu Gly Gln
20 25 30
Arg Glu Pro Arg Met Val Leu Ile Glu Gly Leu Lys Leu Leu Ser Arg
35 40 45
Cys Ile Glu Ile Asp Ser Ala Asp Lys Ser Gly Cys Ile His Asn His
50 55 60
Asp Asp Lys Ser Val Glu Ala Ile Leu Ile Glu Ser Gly Ile Val Cys
65 70 75 80
Pro Gly Leu Pro Leu Ile Ile Pro Asp Gly Tyr Lys Leu Ile Asp Asn
85 90 95
Ser Leu Ile Leu Leu Glu Cys Phe Val Arg Ser Thr Pro Ala Ser Phe
100 105 110
Glu Lys Lys Phe Ile Glu Asp Thr Asn Lys Leu Ala Cys Ile Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Ala Ile Ala Gly Ile Thr Leu Val Pro Ile Val Asp Gly Arg
130 135 140
Cys Asp Tyr Asp Asn Ser Phe Met Pro Glu Trp Val Asn Phe Lys Phe
145 150 155 160
Arg Asp Leu Leu Phe Lys Leu Leu Glu Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Lys
165 170 175
Val Phe Glu Glu Ser Glu Tyr Phe Arg Leu Cys Glu Ser Leu Lys Thr
180 185 190
Thr Val Asp Lys Arg Ser Gly Ile Asp Ser Met Lys Ile Leu Lys Asp
195 200 205
Ala Arg Ser Phe His Asn Asp Glu Ile Met Lys Met Cys His Asp Gly
210 215 220
Val Asn Pro Asn Met Asn Cys Asp Asp Val Val Leu Gly Ile Asn Ser
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Arg Phe Arg Arg Asp Leu Glu Thr Gly Lys Leu Lys Arg
245 250 255
Ser Phe Gln Lys Ile Asn Pro Gly Asn Leu Ile Lys Glu Phe Ser Glu
260 265 270
Leu Tyr Glu Thr Leu Ala Asp Ser Asp Asp Ile Ser Ala Leu Ser Lys
275 280 285
Glu Ala Val Glu Ser Cys Pro Leu Met Arg Phe Ile Thr Ala Asp Thr
290 295 300
His Gly Tyr Glu Arg Gly Ser Glu Thr Ser Thr Glu Tyr Glu Arg Leu
305 310 315 320
Leu Ser Met Leu Asn Lys Val Lys Ser Leu Lys Leu Leu Asn Thr Arg
325 330 335
Arg Arg Gln Leu Leu Asn Leu Asp Val Leu Cys Leu Ser Ser Leu Ile
340 345 350
Lys Gln Ser Lys Leu Lys Gly Ser Lys Asn Asp Lys His Trp Val Gly
355 360 365
Cys Cys Tyr Gly Ser Val Asn Asp Arg Leu Val Ser Phe His Ser Thr
370 375 380
Lys Glu Glu Phe Ile Arg Leu Leu Arg Asn Arg Arg Lys Ser Lys Ala
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Val Ser Leu Glu Asp Leu Phe Arg Thr Ser Ile Asn Glu
405 410 415
Phe Ile Leu Lys Val Gln Arg Cys Leu Ser Val Val Gly Leu Ser Phe
420 425 430
Gly His Tyr Gly Leu Ser Glu His Leu Glu His Glu Cys His Ile Pro
435 440 445
Phe Ile Glu Phe Glu Asn Phe Met Arg Ser Gly Thr His Pro Ile Met
450 455 460
Tyr Tyr Thr Lys Phe Glu Asp Tyr Asp Phe Gln Pro Asn Thr Glu Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asn Met His Ser Leu Lys Arg Leu Ser Ser Val Cys Leu Ala
485 490 495
Leu Thr Asn Ser Met Lys Thr Ser Ser Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn
500 505 510
Gln Leu Gly Ser Val Arg Tyr Gln Val Val Glu Cys Lys Glu Val Phe
515 520 525
Cys Gln Val Ile Lys Leu Asp Ser Glu Glu Tyr His Leu Leu Tyr Gln
530 535 540
Lys Thr Gly Glu Ser Ser Arg Cys Tyr Ser Ile Gln Gly Pro Asn Gly
545 550 555 560
His Leu Ile Ser Phe Tyr Ala Asp Pro Lys Arg Phe Phe Leu Pro Ile
565 570 575
Phe Ser Asp Glu Val Leu His Asn Met Ile Asp Thr Met Ile Ser Trp
580 585 590
Ile Arg Ser Cys Pro Asp Leu Lys Asp Ser Ile Asp Asp Val Glu Ile
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Ala Leu Arg Thr Leu Leu Leu Leu Met Leu Thr Asn Pro Thr Lys Arg
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Asn Gln Lys Gln Val Gln Asn Ile Arg Tyr Leu Val Met Ala Ile Val
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Ser Asp Phe Ser Ser Thr Ser Leu Met Asp Lys Leu Lys Glu Asp Leu
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Ile Thr Pro Ala Glu Lys Val Val Tyr Lys Leu Leu Arg Phe Leu Ile
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Lys Thr Val Phe Gly Thr Gly Glu Lys Val Leu Leu Ser Ala Lys Phe
675 680 685
Lys Phe Met Leu Asn Val Ser Tyr Leu Cys His Leu Ile Thr Lys Glu
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Thr Pro Asp Arg Leu Thr Asp Gln Ile Lys Cys Phe Glu Lys Phe Phe
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Glu Pro Lys Ser Glu Phe Gly Phe Phe Val Asn Pro Lys Glu Ser Ile
725 730 735
Thr Pro Glu Glu Glu Cys Val Phe Tyr Asp Gln Met Lys Lys Phe Thr
740 745 750
Gly Lys Glu Val Asp Cys Gln Arg Thr Thr Pro Gly Val Asn Leu Glu
755 760 765
Met Met Val Ser Ser Phe Asn Asn Gly Thr Leu Ile Phe Lys Arg Leu
770 775 780
Asn Ser Leu Asp Pro Met Thr Asn Ser Gly Cys Ala Thr Ala Leu Asp
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Leu Ala Ser Asn Lys Ser Val Val Val Asn Lys His Leu Asn Gly Glu
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Arg Leu Leu Glu Tyr Asp Phe Asn Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ser
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Gln Ile Thr Glu Ser Phe Met Arg Lys Gln Lys Tyr Lys Leu Asn His
835 840 845
Ser Asp Tyr Glu Tyr Lys Val Ser Lys Leu Val Ser Arg Leu Val Ile
850 855 860
Gly Ser Lys Glu Thr Glu Ala Gly Lys Leu Glu Gly Asp Ser Ala Asp
865 870 875 880
Ile Cys Phe Asp Gly Glu Glu Glu Thr Ser Phe Phe Lys Asn Leu Glu
885 890 895
Asp Lys Val Asn Ser Thr Ile Lys Arg Tyr Glu Arg Ser Lys Lys Thr
900 905 910
Asn Glu Gly Glu Asn Glu Val Gly Phe Glu Asn Thr Lys Gly Leu His
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His Leu Gln Thr Ile Leu Ser Gly Lys Met Ala Tyr Leu Arg Lys Val
930 935 940
Ile Leu Ser Glu Ile Ser Phe His Leu Val Glu Asp Phe Asp Pro Ser
945 950 955 960
Cys Leu Thr Asn Asp Asp Met Lys Phe Ile Cys Glu Ala Ile Glu Thr
965 970 975
Ser Thr Glu Leu Ser Pro Leu Tyr Phe Thr Ser Ala Val Lys Glu Gln
980 985 990
Cys Gly Leu Asp Glu Met Ala Lys Asn Leu Cys Arg Lys Phe Phe Ser
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Glu Gly Asp Trp Phe Ser Cys Met Lys Met Ile Leu Leu Gln Met
1010 1015 1020
Asn Ala Asn Ala Tyr Ser Gly Lys Tyr Arg His Met Gln Arg Gln
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Gly Leu Asn Phe Lys Phe Asp Trp Asp Lys Leu Glu Glu Asp Val
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Arg Ile Ser Glu Arg Glu Ser Asn Ser Glu Ser Leu Ser Lys Ala
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Leu Ser Leu Thr Lys Cys Met Ser Ala Ala Leu Lys Asn Leu Cys
1070 1075 1080
Phe Tyr Ser Glu Glu Ser Pro Thr Ser Tyr Thr Ser Val Gly Pro
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Asp Ser Gly Arg Leu Lys Phe Ala Leu Ser Tyr Lys Glu Gln Val
1100 1105 1110
Gly Gly Asn Arg Glu Leu Tyr Ile Gly Asp Leu Arg Thr Lys Met
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Phe Thr Arg Leu Ile Glu Asp Tyr Phe Glu Ser Phe Ser Ser Phe
1130 1135 1140
Phe Ser Gly Ser Cys Leu Asn Asn Asp Lys Glu Phe Glu Asn Ala
1145 1150 1155
Ile Leu Ser Met Thr Ile Asn Val Arg Glu Gly Leu Leu Asn Tyr
1160 1165 1170
Ser Met Asp His Ser Lys Trp Gly Pro Met Met Cys Pro Phe Leu
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Phe Leu Met Leu Leu Gln Asn Leu Lys Asp Asp Gln Tyr Val Arg
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Ser Gly Lys Asp His Ile Ser Thr Leu Leu Thr Trp His Met His
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Lys Leu Val Glu Val Pro Phe Pro Val Val Asn Ala Met Met Lys
1220 1225 1230
Ser Tyr Ile Lys Ser Lys Leu Lys Leu Leu Arg Gly Ser Glu Thr
1235 1240 1245
Thr Val Thr Glu Arg Ile Phe Arg Glu Tyr Phe Glu Leu Gly Ile
1250 1255 1260
Val Pro Ser His Ile Ser Ser Leu Ile Asp Met Gly Gln Gly Ile
1265 1270 1275
Leu His Asn Ala Ser Asp Phe Tyr Gly Leu Ile Ser Glu Arg Phe
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Ile Asn Tyr Cys Ile Gly Val Ile Phe Gly Glu Arg Pro Glu Ser
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Tyr Thr Ser Ser Asp Asp Gln Ile Thr Leu Phe Asp Arg Arg Leu
1310 1315 1320
Ser Glu Leu Val Asp Ser Asp Pro Glu Glu Val Leu Val Leu Leu
1325 1330 1335
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1340 1345 1350
Pro Lys Ser Val Val Gly Arg Phe Ala Ala Glu Phe Lys Ser Arg
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1385 1390 1395
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Leu Leu Lys Tyr Ala Asn Phe Pro Leu Asp Pro Phe Leu Leu Asn
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Gln Lys Leu Leu Ser Glu Ala Ile Asn Lys Ser Ala Phe Gln Ser
1580 1585 1590
Cys Ile Ser Ser Gly Phe Ile Gly Leu Cys Lys Thr Leu Gly Ser
1595 1600 1605
Arg Cys Val Arg Asn Lys Asn Arg Asp Asn Leu Tyr Ile Arg Lys
1610 1615 1620
Val Leu Glu Asp Leu Ala Met Asp Ala His Val Thr Ala Ile His
1625 1630 1635
Arg His Asp Gly Ile Met Leu Tyr Ile Cys Asp Arg Gln Ser His
1640 1645 1650
Pro Glu Ala His Cys Asp His Ile Ser Leu Leu Arg Pro Leu Leu
1655 1660 1665
Trp Asp Tyr Ile Cys Ile Ser Leu Ser Asn Ser Phe Glu Leu Gly
1670 1675 1680
Val Trp Val Leu Ala Glu Pro Val Lys Gly Lys Asn Glu Gly Ser
1685 1690 1695
Ser Ser Leu Lys His Leu Asn Pro Cys Asp Tyr Val Ala Arg Lys
1700 1705 1710
Pro Glu Ser Ser Arg Leu Leu Glu Asp Lys Ile Ser Leu Asn His
1715 1720 1725
Val Ile Gln Ser Val Arg Arg Leu Tyr Pro Lys Ile Tyr Glu Asp
1730 1735 1740
Gln Leu Leu Pro Phe Met Ser Asp Met Ser Ser Lys Asn Met Arg
1745 1750 1755
Trp Ser Pro Arg Ile Lys Phe Leu Asp Leu Cys Val Leu Ile Asp
1760 1765 1770
Ile Asn Ser Glu Ser Leu Ser Leu Ile Ser His Val Val Lys Trp
1775 1780 1785
Lys Arg Asp Glu His Tyr Thr Val Leu Phe Ser Asp Leu Val Asn
1790 1795 1800
Ser His Gln Arg Ser Asp Ser Ser Leu Val Asp Glu Phe Val Val
1805 1810 1815
Ser Thr Arg Asp Val Cys Lys Asn Phe Leu Lys Gln Val Tyr Phe
1820 1825 1830
Glu Ser Phe Val Arg Glu Phe Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Gly
1835 1840 1845
Ser Phe Ser Trp Phe Pro His Lys Asp Met Met Pro Ser Glu Asp
1850 1855 1860
Gly Ala Glu Ala Leu Gly Pro Phe Gln Ser Phe Ile Leu Lys Val
1865 1870 1875
Val Asn Lys Asn Met Glu Arg Pro Met Phe Arg Asn Asp Leu Gln
1880 1885 1890
Phe Gly Phe Gly Trp Phe Ser Tyr Arg Leu Gly Asp Ile Val Cys
1895 1900 1905
Asn Ala Ala Met Leu Ile Lys Gln Gly Leu Thr Asn Pro Lys Ala
1910 1915 1920
Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Trp Asp Tyr Met Ile Asn Asn Thr
1925 1930 1935
Glu Gly Val Leu Glu Phe Ser Ile Thr Val Asp Phe Thr His Asn
1940 1945 1950
Gln Asn Asn Thr Asp Cys Leu Arg Lys Phe Ser Leu Ile Phe Leu
1955 1960 1965
Val Lys Cys Gln Leu Gln Gly Pro Gly Val Ala Glu Phe Leu Ser
1970 1975 1980
Cys Ser His Leu Phe Lys Gly Glu Val Asp Arg Arg Phe Leu Asp
1985 1990 1995
Glu Cys Leu His Leu Leu Arg Ser Asp Ser Ile Phe Lys Val Asn
2000 2005 2010
Asp Gly Val Phe Asp Ile Arg Ser Glu Glu Phe Glu Asp Tyr Met
2015 2020 2025
Glu Asp Pro Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Glu Leu Glu Leu Ile
2030 2035 2040
Gly Ser Arg Lys Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ser Leu Asp Phe Glu
2045 2050 2055
Arg Ile Gly Pro Glu Trp Glu Pro Val Pro Leu Thr Val Arg Met
2060 2065 2070
Gly Ala Leu Phe Glu Gly Arg Ser Leu Val Gln Asn Ile Val Val
2075 2080 2085
Lys Leu Glu Thr Lys Asp Met Arg Val Phe Leu Ala Glu Leu Glu
2090 2095 2100
Gly Tyr Gly Asn Phe Asp Asp Val Leu Gly Ser Leu Leu Leu His
2105 2110 2115
Arg Phe Arg Thr Gly Glu His Leu Gln Gly Ser Glu Ile Ser Thr
2120 2125 2130
Ile Leu Gln Glu Leu Cys Ile Asp Arg Ser Ile Leu Leu Val Pro
2135 2140 2145
Leu Ser Leu Val Pro Asp Trp Phe Thr Phe Lys Asp Cys Arg Leu
2150 2155 2160
Cys Phe Ser Lys Ser Lys Asn Thr Val Met Tyr Glu Thr Val Val
2165 2170 2175
Gly Lys Tyr Arg Leu Lys Gly Lys Ser Cys Asp Asp Trp Leu Thr
2180 2185 2190
Lys Ser Val Val Glu Glu Ile Asp
2195 2200
<210> 9
<211> 90
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV的MP毒株的Z蛋白的氨基酸序列
<400> 9
Met Gly Gln Gly Lys Ser Lys Glu Gly Arg Asp Ala Ser Asn Thr Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ile Leu Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Gly Pro Leu Asn Cys
20 25 30
Lys Ser Cys Trp Gln Arg Phe Asp Ser Leu Val Arg Cys His Asp His
35 40 45
Tyr Leu Cys Arg His Cys Leu Asn Leu Leu Leu Ser Val Ser Asp Arg
50 55 60
Cys Pro Leu Cys Lys His Pro Leu Pro Thr Lys Leu Lys Ile Ser Thr
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ser Pro Pro Pro Tyr Glu Glu
85 90
<210> 10
<211> 4604
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
<220>
<223> LCMV克隆13 编码HCMV毒株Merlin gB的S-片段
(全长野生型)
<400> 10
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat ggaatccagg atctggtgcc tggtagtctg cgttaacttg 120
tgtatcgtct gtctgggtgc tgcggtttcc tcatcttcta ctcgtggaac ttctgctact 180
cacagtcacc attcctctca tacgacgtct gctgctcact ctcgatccgg ttcagtctct 240
caacgcgtaa cttcttccca aacggtcagc catggtgtta acgagaccat ctacaacact 300
accctcaagt acggagatgt ggtgggggtc aataccacca agtaccccta tcgcgtgtgt 360
tctatggccc agggtacgga tcttattcgc tttgaacgta atatcgtctg cacctcgatg 420
aagcccatca atgaagacct ggacgagggc atcatggtgg tctacaaacg caacatcgtc 480
gcgcacacct ttaaggtacg agtctaccag aaggttttga cgtttcgtcg tagctacgct 540
tacatccaca ccacttatct gctgggcagc aacacggaat acgtggcgcc tcctatgtgg 600
gagattcatc atatcaacag ccacagtcag tgctacagtt cctacagccg cgttatagca 660
ggcacggttt tcgtggctta tcatagggac agctatgaaa acaaaaccat gcaattaatg 720
cccgacgatt attccaacac ccacagtacc cgttacgtga cggtcaagga tcaatggcac 780
agccgcggca gcacctggct ctatcgtgag acctgtaatc tgaattgtat ggtgaccatc 840
actactgcgc gctccaaata tccttatcat tttttcgcca cttccacggg tgacgtggtt 900
gacatttctc ctttctacaa cggaaccaat cgcaatgcca gctactttgg agaaaacgcc 960
gacaagtttt tcatttttcc gaactacact attgtctccg actttggaag accgaattct 1020
gcgttagaga cccacaggtt ggtggctttt cttgaacgtg cggactcggt gatctcctgg 1080
gatatacagg acgaaaagaa tgtcacttgt caactcactt tctgggaagc ctcggaacgc 1140
accattcgtt ccgaagccga ggactcgtat cacttttctt ctgccaaaat gaccgccact 1200
ttcttatcta agaagcaaga ggtgaacatg tccgactctg cgctggactg cgtacgtgat 1260
gaggctataa ataagttaca gcagattttc aatacttcat acaatcaaac atatgaaaaa 1320
tatggaaacg tgtccgtctt tgaaaccact ggtggtttgg tagtgttctg gcaaggtatc 1380
aagcaaaaat ctctggtgga actcgaacgt ttggccaacc gctccagtct gaatcttact 1440
cataatagaa ccaaaagaag tacagatggc aacaatgcaa ctcatttatc caacatggaa 1500
tcggtgcaca atctggtcta cgcccagctg cagttcacct atgacacgtt gcgcggttac 1560
atcaaccggg cgctggcgca aatcgcagaa gcctggtgtg tggatcaacg gcgcacccta 1620
gaggtcttca aggaactcag caagatcaac ccgtcagcca ttctctcggc catttacaac 1680
aaaccgattg ccgcgcgttt catgggtgat gtcttgggcc tggccagctg cgtgaccatc 1740
aaccaaacca gcgtcaaggt gctgcgtgat atgaacgtga aggagtcgcc aggacgctgc 1800
tactcacgac ccgtggtcat ctttaatttc gccaacagct cgtacgtgca gtacggtcaa 1860
ctgggcgagg acaacgaaat cctgttgggc aaccaccgca ctgaggaatg tcagcttccc 1920
agcctcaaga tcttcatcgc cgggaactcg gcctacgagt acgtggacta cctcttcaaa 1980
cgcatgattg acctcagcag tatctccacc gtcgacagca tgatcgccct ggatatcgac 2040
ccgctggaaa ataccgactt cagggtactg gaactttact cgcagaaaga gctgcgttcc 2100
agcaacgttt ttgacctcga agagatcatg cgcgaattca actcgtacaa gcagcgggta 2160
aagtacgtgg aggacaaggt agtcgacccg ctaccgccct acctcaaggg tctggacgac 2220
ctcatgagcg gcctgggcgc cgcgggaaag gccgttggcg tagccattgg ggccgtgggt 2280
ggcgcggtgg cctccgtggt cgaaggcgtt gccaccttcc tcaaaaaccc cttcggagcg 2340
ttcaccatca tcctcgtggc catagctgta gtcattatca cttatttgat ctatactcga 2400
cagcggcgtt tgtgcacgca gccgctgcag aacctctttc cctatctggt gtccgccgac 2460
gggaccaccg tgacgtcggg cagcaccaaa gacacgtcgt tacaggctcc gccttcctac 2520
gaggaaagtg tttataattc tggtcgcaaa ggaccgggac caccgtcgtc tgatgcatcc 2580
acggcggctc cgccttacac caacgagcag gcttaccaga tgcttctggc cctggcccgt 2640
ctggacgcag agcagcgagc gcagcagaac ggtacagatt ctttggacgg acggactggc 2700
acgcaggaca agggacagaa gcccaaccta ctagaccgac tgcgacatcg caaaaacggc 2760
taccgacact tgaaagactc tgacgaagaa gagaacgtct gaagaacagc gcctccctga 2820
ctctccacct cgaaagaggt ggagagtcag ggaggcccag agggtcttag agtgtcacaa 2880
catttgggcc tctaaaaatt aggtcatgtg gcagaatgtt gtgaacagtt ttcagatctg 2940
ggagccttgc tttggaggcg ctttcaaaaa tgatgcagtc catgagtgca cagtgcgggg 3000
tgatctcttt cttctttttg tcccttacta ttccagtatg catcttacac aaccagccat 3060
atttgtccca cactttatct tcatactccc tcgaagcttc cctggtcatt tcaacatcga 3120
taagcttaat gtccttccta ttttgtgagt ccagaagctt tctgatgtca tcggagcctt 3180
gacagcttag aaccatcccc tgcggaagag cacctataac tgacgaggtc aacccgggtt 3240
gcgcattgaa gaggtcggca agatccatgc cgtgtgagta cttggaatct tgcttgaatt 3300
gtttttgatc aacgggttcc ctgtaaaagt gtatgaactg cccgttctgt ggttggaaaa 3360
ttgctatttc cactggatca ttaaatctac cctcaatgtc aatccatgta ggagcgttgg 3420
ggtcaattcc tcccatgagg tcttttaaaa gcattgtctg gctgtagctt aagcccacct 3480
gaggtggacc tgctgctcca ggcgctggcc tgggtgagtt gactgcaggt ttctcgcttg 3540
tgagatcaat tgttgtgttt tcccatgctc tccccacaat cgatgttcta caagctatgt 3600
atggccatcc ttcacctgaa aggcaaactt tatagaggat gttttcataa gggttcctgt 3660
ccccaacttg gtctgaaaca aacatgttga gttttctctt ggccccgaga actgccttca 3720
agagatcctc gctgttgctt ggcttgatca aaattgactc taacatgtta cccccatcca 3780
acagggctgc ccctgccttc acggcagcac caagactaaa gttatagcca gaaatgttga 3840
tgctggactg ctgttcagtg atgaccccca gaactgggtg cttgtctttc agcctttcaa 3900
gatcattaag atttggatac ttgactgtgt aaagcaagcc aaggtctgtg agcgcttgta 3960
caacgtcatt gagcggagtc tgtgactgtt tggccataca agccatagtt agacttggca 4020
ttgtgccaaa ttgattgttc aaaagtgatg agtctttcac atcccaaact cttaccacac 4080
cacttgcacc ctgctgaggc tttctcatcc caactatctg taggatctga gatctttggt 4140
ctagttgctg tgttgttaag ttccccatat atacccctga agcctggggc ctttcagacc 4200
tcatgatctt ggccttcagc ttctcaaggt cagccgcaag agacatcagt tcttctgcac 4260
tgagcctccc cactttcaaa acattcttct ttgatgttga ctttaaatcc acaagagaat 4320
gtacagtctg gttgagactt ctgagtctct gtaggtcttt gtcatctctc ttttccttcc 4380
tcatgatcct ctgaacattg ctgacctcag agaagtccaa cccattcaga aggttggttg 4440
catccttaat gacagcagcc ttcacatctg atgtgaagct ctgcaattct cttctcaatg 4500
cttgcgtcca ttggaagctc ttaacttcct tagacaagga catcttgttg ctcaatggtt 4560
tctcaagaca aatgcgcaat caaatgccta ggatccactg tgcg 4604
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WE-特异性引物
<400> 11
aatcgtctct aaggatgggt cagattgtga caatg 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WE特异性融合引物，带有与WET特异性引物互补的突出
<400> 12
aatcgtctct aaggatgggt cagattgtga caatg 35
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WET-特异性引物
<400> 13
ctcggtgatc atgttatctg cttcttgttc gatttga 37
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与WE序列互补的WET特异性融合引物
<400> 14
aatcgtctct ttctttatct cctcttccag atgg 34
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 特异于LCMV NP的引物
<400> 15
ggctcccaga tctgaaaact gtt 23
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NP-和GP-特异性引物
<400> 16
gctggcttgt cactaatggc tc 22
<210> 17
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 获自动物#3（r3LCMV-GFPnat #3）的代表性的cDNA序列，显示了组合NP和GP序列的重组S片段
<400> 17
aagaagcaga taacatgatc accgagatgc tgaggaagga ctacatcaag agacagggca 60
gcacccccct ggccctcatg gatctgctca tgttcagcac cagcgcctac ctcatcagca 120
tcttcctgca cctggtgaag atccccaccc acagacacat caagggcggc agctgcccca 180
agccccacag actcaccaac aagggcatct gcagctgcgg cgccttcaag gtgcccggcg 240
taaaaaccat ctggaagagg agataaagaa cagcgcctcc ctgactctcc acctcgaaag 300
aggtggagag tcagggaggc ccagagggtc ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt 360
gatcccggcg gcggtcacga actccagcag gaagaacagc gcctccctga ctctccacct 420
cgaaagaggt ggagagtcag ggaggcccag aggtcttaga gtgtcacaac atttgggcct 480
ctaaaaatta ggtcatgtgg cagaatgttg tgaacagttt tcagatctgg gagcc 535
<210> 18
<211> 2555
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> r3LCMV-P1A（含有NP）的S片段1
<400> 18
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat gagcgacaac aagaagcccg acaaggccca ctctggcagc 120
ggcggagatg gcgacggcaa cagatgtaac ctgctgcaca gatacagcct ggaagagatc 180
ctgccctacc tgggctggct ggtgttcgcc gtcgtgacaa caagcttcct ggccctgcag 240
atgttcatcg acgccctgta cgaggaacag tacgagaggg acgtggcctg gatcgccaga 300
cagagcaaga gaatgagcag cgtggacgag gacgaggatg atgaggacga cgaagatgac 360
tactacgacg atgaggatga cgacgacgac gccttctacg atgacgagga cgatgaagag 420
gaagaactgg aaaacctgat ggacgacgag tccgaggatg aggccgagga agagatgagc 480
gtggaaatgg gcgctggcgc cgaagagatg ggagccggcg ctaactgtgc ttgcgtgcca 540
ggacaccacc tgagaaagaa cgaagtgaag tgccggatga tctacttctt ccacgacccc 600
aactttctgg tgtccatccc cgtgaacccc aaagaacaga tggaatgcag atgcgagaac 660
gccgacgaag aggtggccat ggaagaagaa gaggaagagg aagaagaaga agaagaggaa 720
gaaatgggca accccgacgg cttcagcccc tgaagaacag cgcctccctg actctccacc 780
tcgaaagagg tggagagtca gggaggccca gagggtctta gagtgtcaca acatttgggc 840
ctctaaaaat taggtcatgt ggcagaatgt tgtgaacagt tttcagatct gggagccttg 900
ctttggaggc gctttcaaaa atgatgcagt ccatgagtgc acagtgcggg gtgatctctt 960
tcttcttttt gtcccttact attccagtat gcatcttaca caaccagcca tatttgtccc 1020
acactttatc ttcatactcc ctcgaagctt ccctggtcat ttcaacatcg ataagcttaa 1080
tgtccttcct attttgtgag tccagaagct ttctgatgtc atcggagcct tgacagctta 1140
gaaccatccc ctgcggaaga gcacctataa ctgacgaggt caacccgggt tgcgcattga 1200
agaggtcggc aagatccatg ccgtgtgagt acttggaatc ttgcttgaat tgtttttgat 1260
caacgggttc cctgtaaaag tgtatgaact gcccgttctg tggttggaaa attgctattt 1320
ccactggatc attaaatcta ccctcaatgt caatccatgt aggagcgttg gggtcaattc 1380
ctcccatgag gtcttttaaa agcattgtct ggctgtagct taagcccacc tgaggtggac 1440
ctgctgctcc aggcgctggc ctgggtgagt tgactgcagg tttctcgctt gtgagatcaa 1500
ttgttgtgtt ttcccatgct ctccccacaa tcgatgttct acaagctatg tatggccatc 1560
cttcacctga aaggcaaact ttatagagga tgttttcata agggttcctg tccccaactt 1620
ggtctgaaac aaacatgttg agttttctct tggccccgag aactgccttc aagagatcct 1680
cgctgttgct tggcttgatc aaaattgact ctaacatgtt acccccatcc aacagggctg 1740
cccctgcctt cacggcagca ccaagactaa agttatagcc agaaatgttg atgctggact 1800
gctgttcagt gatgaccccc agaactgggt gcttgtcttt cagcctttca agatcattaa 1860
gatttggata cttgactgtg taaagcaagc caaggtctgt gagcgcttgt acaacgtcat 1920
tgagcggagt ctgtgactgt ttggccatac aagccatagt tagacttggc attgtgccaa 1980
attgattgtt caaaagtgat gagtctttca catcccaaac tcttaccaca ccacttgcac 2040
cctgctgagg ctttctcatc ccaactatct gtaggatctg agatctttgg tctagttgct 2100
gtgttgttaa gttccccata tatacccctg aagcctgggg cctttcagac ctcatgatct 2160
tggccttcag cttctcaagg tcagccgcaa gagacatcag ttcttctgca ctgagcctcc 2220
ccactttcaa aacattcttc tttgatgttg actttaaatc cacaagagaa tgtacagtct 2280
ggttgagact tctgagtctc tgtaggtctt tgtcatctct cttttccttc ctcatgatcc 2340
tctgaacatt gctgacctca gagaagtcca acccattcag aaggttggtt gcatccttaa 2400
tgacagcagc cttcacatct gatgtgaagc tctgcaattc tcttctcaat gcttgcgtcc 2460
attggaagct cttaacttcc ttagacaagg acatcttgtt gctcaatggt ttctcaagac 2520
aaatgcgcaa tcaaatgcct aggatccact gtgcg 2555
<210> 19
<211> 2375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> r3LCMV-P1A（含有GP）的S片段2
<400> 19
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat gagcgacaac aagaagcccg acaaggccca ctctggcagc 120
ggcggagatg gcgacggcaa cagatgtaac ctgctgcaca gatacagcct ggaagagatc 180
ctgccctacc tgggctggct ggtgttcgcc gtcgtgacaa caagcttcct ggccctgcag 240
atgttcatcg acgccctgta cgaggaacag tacgagaggg acgtggcctg gatcgccaga 300
cagagcaaga gaatgagcag cgtggacgag gacgaggatg atgaggacga cgaagatgac 360
tactacgacg atgaggatga cgacgacgac gccttctacg atgacgagga cgatgaagag 420
gaagaactgg aaaacctgat ggacgacgag tccgaggatg aggccgagga agagatgagc 480
gtggaaatgg gcgctggcgc cgaagagatg ggagccggcg ctaactgtgc ttgcgtgcca 540
ggacaccacc tgagaaagaa cgaagtgaag tgccggatga tctacttctt ccacgacccc 600
aactttctgg tgtccatccc cgtgaacccc aaagaacaga tggaatgcag atgcgagaac 660
gccgacgaag aggtggccat ggaagaagaa gaggaagagg aagaagaaga agaagaggaa 720
gaaatgggca accccgacgg cttcagcccc tgaagaacag cgcctccctg actctccacc 780
tcgaaagagg tggagagtca gggaggccca gagggtctca gcgtcttttc cagacggttt 840
ttacaccagg caccttaaat gcaccacaac tacaaattcc tttgttggtt aatcggtgtg 900
gctttggaca tgagccacct tttatgtgcc tgtgtgttgg tattttgaca aggtgcagga 960
agatgctgac tagatatgca gatgtggaaa acatcagaag gtccatcaat gctagggggg 1020
tactcccctg cctctttatg taatccttcc tcaacatctc tgtaatcatg ttatcggctt 1080
cctgttcgat ttggtcactg aagtgggtct catttaagta agaaccattg gtgacaagcc 1140
agcacttggg gacactagtt tcgccggtct ttgcatgttc taggtaccaa aactttgagt 1200
aattgcaata tggcaccccc atcagatctc tcaagtggtt cctcatcagt agttgatctg 1260
aaatcaaaga attcactgtt gttttgaata agtgcaaggc agattctacg tcctctttga 1320
acttactcaa agcagccttg ttgtagtcaa ttagtcgcag catgtcacag aattcttcat 1380
catgatttac attgcatttc gcaactgctg tgttcccgaa acacttaagc tctgcagcaa 1440
gaatcatcca tttggtcagg caataaccac ctggattctc cacccctgaa gagtctgaca 1500
aagtccaggt gaatgtgccc gctagtctcc tagtggagaa cttagttttc tcttgggaaa 1560
ggagaatcct ggacatccca aaaggacctg catatgtgca gtggttttcc caggttctat 1620
tttgtataat caggtattgg taactcgtct ggctacacca ggtggtcttg ccatctgagc 1680
ctgtccagcc ccagccactc ctcatgtatt tccccccgaa ggcagttcta aacatatcta 1740
ggactctacc tctgaaggtt ctacactggc tctgagcact ttgtgcatct gagaatgtca 1800
agttgtattg gatggttatg ccattgttga agtcgcagga tactgcctta tagttggagt 1860
tccctctgat actgaggtgt aggctcgaaa ctatactcat gagtgtgtgg tcaaaggtct 1920
ttttgttgaa ggcagaggtc agattgcaaa agttgtgact gatgatggaa tcattggtga 1980
aggtcaattc tagtccagaa gtccccatac tgatgtaatg gtgggagttg ttggctgaac 2040
atgcgttggg catggtcagg ttcagatgtg acatatcaaa ctccactgac ttaaattggt 2100
aaactccttt gtaaatgtcg ggtcccttaa gaccgtacat gccacaggac ctgccagcca 2160
gaagtaggaa actgatcaat gcgaatatcc cacaggtggc aaaattgtag acagccttga 2220
tacccgtgat cacgataagc acaataatga caatgttgat cacctcatcg atgatgtgag 2280
gcagagcctc aaacattgtc acaatctgac ccatcttgtt gctcaatggt ttctcaagac 2340
aaatgcgcaa tcaaatgcct aggatccact gtgcg 2375
<210> 20
<211> 7229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> r3LCMV-P1A的L片段
<400> 20
gcgcaccggg gatcctaggc gtttagttgc gctgtttggt tgcacaactt tcttcgtgag 60
gctgtcagaa gtggacctgg ctgatagcga tgggtcaagg caagtccaga gaggagaaag 120
gcaccaatag tacaaacagg gccgaaatcc taccagatac cacctatctt ggccctttaa 180
gctgcaaatc ttgctggcag aaatttgaca gcttggtaag atgccatgac cactaccttt 240
gcaggcactg tttaaacctt ctgctgtcag tatccgacag gtgtcctctt tgtaaatatc 300
cattaccaac cagattgaag atatcaacag ccccaagctc tccacctccc tacgaagagt 360
aacaccgtcc ggccccggcc ccgacaaaca gcccagcaca agggaaccgc acgtcaccca 420
acgcacacag acacagcacc caacacagaa cacgcacaca cacacacaca cacacccaca 480
cgcacgcgcc cccaccaccg gggggcgccc ccccccgggg ggcggccccc cgggagcccg 540
ggcggagccc cacggagatg cccatcagtc gatgtcctcg gccaccgacc cgcccagcca 600
atcgtcgcag gacctcccct tgagtctaaa cctgcccccc actgtttcat acatcaaagt 660
gctcctagat ttgctaaaac aaagtctgca atccttaaag gcgaaccagt ctggcaaaag 720
cgacagtgga atcagcagaa tagatctgtc tatacatagt tcctggagga ttacacttat 780
ctctgaaccc aacaaatgtt caccagttct gaatcgatgc aggaagaggt tcccaaggac 840
atcactaatc ttttcatagc cctcaagtcc tgctagaaag actttcatgt ccttggtctc 900
cagcttcaca atgatatttt ggacaaggtt tcttccttca aaaagggcac ccatctttac 960
agtcagtggc acaggctccc actcaggtcc aactctctca aagtcaatag atctaatccc 1020
atccagtatt cttttggagc ccaacaactc aagctcaaga gaatcaccaa gtatcaaggg 1080
atcttccatg taatcctcaa actcttcaga tctgatatca aagacaccat cgttcacctt 1140
gaagacagag tctgtcctca gtaagtggag gcattcatcc aacattcttc tatctatctc 1200
acccttaaag aggtgagagc atgataaaag ttcagccaca cctggattct gtaattggca 1260
cctaaccaag aatatcaatg aaaatttcct taaacagtca gtattattct gattgtgcgt 1320
aaagtccact gaaattgaaa actccaatac cccttttgtg tagttgagca tgtagtccca 1380
cagatccttt aaggatttaa atgcctttgg gtttgtcagg ccctgcctaa tcaacatggc 1440
agcattacac acaacatctc ccattcggta agagaaccac ccaaaaccaa actgcaaatc 1500
attcctaaac ataggcctct ccacattttt gttcaccacc tttgagacaa atgattgaaa 1560
ggggcccagt gcctcagcac catcttcaga tggcatcatt tctttatgag ggaaccatga 1620
aaaattgcct aatgtcctgg ttgttgcaac aaattctcga acaaatgatt caaaatacac 1680
ctgttttaag aagttcttgc agacatccct cgtgctaaca acaaattcat caaccagact 1740
ggagtcagat cgctgatgag aattggcaag gtcagaaaac agaacagtgt aatgttcatc 1800
ccttttccac ttaacaacat gagaaatgag tgacaaggat tctgagttaa tatcaattaa 1860
aacacagagg tcaaggaatt taattctggg actccacctc atgttttttg agctcatgtc 1920
agacataaat ggaagaagct gatcctcaaa gatcttggga tatagccgcc tcacagattg 1980
aatcacttgg ttcaaattca ctttgtcctc cagtagcctt gagctctcag gctttcttgc 2040
tacataatca catgggttta agtgcttaag agttaggttc tcactgttat tcttcccttt 2100
ggtcggttct gctaggaccc aaacacccaa ctcaaaagag ttgctcaatg aaatacaaat 2160
gtagtcccaa agaagaggcc ttaaaaggca tatatgatca cggtgggctt ctggatgaga 2220
ctgtttgtca caaatgtaca gcgttatacc atcccgattg caaactcttg tcacatgatc 2280
atctgtggtt agatcctcaa gcagcttttt gatatacaga ttttccctat ttttgtttct 2340
cacacacctg cttcctagag ttttgcaaag gcctataaag ccagatgaga tacaactctg 2400
gaaagctgac ttgttgattg cttctgacag cagcttctgt gcaccccttg tgaatttact 2460
acaaagtttg ttctggagtg tcttgatcaa tgatgggatt ctttcctctt ggaaagtcat 2520
cactgatgga taaaccacct tttgtcttaa aaccatcctt aatgggaaca tttcattcaa 2580
attcaaccag ttaacatctg ctaactgatt cagatcttct tcaagaccga ggaggtctcc 2640
caattgaaga atggcctcct ttttatctct gttaaatagg tctaagaaaa attcttcatt 2700
aaattcacca tttttgagct tatgatgcag tttccttaca agctttctta caacctttgt 2760
ttcattagga cacagttcct caatgagtct ttgtattctg taacctctag aaccatccag 2820
ccaatctttc acatcagtgt tggtattcag tagaaatgga tccaaaggga aattggcata 2880
ctttaggagg tccagtgttc tcctttggat actattaact agggagactg ggacgccatt 2940
tgcgatggct tgatctgcaa ttgtatctat tgtttcacaa agttgatgtg gctctttaca 3000
cttgacattg tgtagcgctg cagatacaaa ctttgtgaga agagggactt cctcccccca 3060
tacatagaat ctagatttaa attctgcagc gaacctccca gccacacttt ttgggctgat 3120
aaatttgttt aacaagccgc tcagatgaga ttggaattcc aacaggacaa ggacttcctc 3180
cggatcactt acaaccaggt cactcagcct cctatcaaat aaagtgatct gatcatcact 3240
tgatgtgtaa gcctctggtc tttcgccaaa gataacacca atgcagtagt tgatgaacct 3300
ctcgctaagc aaaccataga agtcagaagc attatgcaag attccctgcc ccatatcaat 3360
aaggctggat atatgggatg gcactatccc catttcaaaa tattgtctga aaattctctc 3420
agtaacagtt gtttctgaac ccctgagaag ttttagcttc gacttgacat atgatttcat 3480
cattgcattc acaacaggaa aggggacctc gacaagctta tgcatgtgcc aagttaacaa 3540
agtgctaaca tgatctttcc cggaacgcac atactggtca tcacctagtt tgagattttg 3600
tagaaacatt aagaacaaaa atgggcacat cattggtccc catttgctgt gatccatact 3660
atagtttaag aacccttccc gcacattgat agtcattgac aagattgcat tttcaaattc 3720
cttatcattg tttaaacagg agcctgaaaa gaaacttgaa aaagactcaa aataatcttc 3780
tattaacctt gtgaacattt ttgtcctcaa atctccaata tagagttctc tatttccccc 3840
aacctgctct ttataagata gtgcaaattt cagccttcca gagtcaggac ctactgaggt 3900
gtatgatgtt ggtgattctt ctgagtagaa gcacagattt ttcaaagcag cactcataca 3960
ttgtgtcaac gacagagctt tactaaggga ctcagaatta ctttccctct cactgattct 4020
cacgtcttct tccagtttgt cccagtcaaa tttgaaattc aagccttgcc tttgcatatg 4080
cctgtatttc cctgagtacg catttgcatt catttgcaac agaatcatct tcatgcaaga 4140
aaaccaatca ttctcagaaa agaactttct acaaaggttt tttgccatct catcgaggcc 4200
acactgatct ttaatgactg aggtgaaata caaaggtgac agctctgtgg aaccctcaac 4260
agcctcacag ataaatttca tgtcatcatt ggttagacat gatgggtcaa agtcttctac 4320
taaatggaaa gatatttctg acaagataac ttttcttaag tgagccatct tccctgttag 4380
aataagctgt aaatgatgta gtccttttgt atttgtaagt ttttctccat ctcctttgtc 4440
attggccctc ctacctcttc tgtaccgtgc tattgtggtg ttgacctttt cttcgagact 4500
tttgaagaag cttgtctctt cttctccatc aaaacatatt tctgccaggt tgtcttccga 4560
tctccctgtc tcttctccct tggaaccgat gaccaatcta gagactaact tggaaacttt 4620
atattcatag tctgagtggc tcaacttata cttttgtttt cttacgaaac tctccgtaat 4680
ttgactcaca gcactaacaa gcaatttgtt aaagtcatat tccagaagtc gttctccatt 4740
tagatgctta ttaaccacca cacttttgtt actagcaaga tctaatgctg tcgcacatcc 4800
agagttagtc atgggatcta ggctgtttag cttcttctct cctttgaaaa ttaaagtgcc 4860
gttgttaaat gaagacacca ttaggctaaa ggcttccaga ttaacacctg gagttgtatg 4920
ctgacagtca atttctttac tagtgaatct cttcatttgc tcatagaaca cacattcttc 4980
ctcaggagtg attgcttcct tggggttgac aaaaaaacca aattgacttt tgggctcaaa 5040
gaacttttca aaacatttta tctgatctgt tagcctgtca ggggtctcct ttgtgatcaa 5100
atgacacagg tatgacacat tcaacataaa tttaaatttt gcactcaaca acaccttctc 5160
accagtacca aaaatagttt ttattaggaa tctaagcagc ttatacacca ccttctcagc 5220
aggtgtgatc agatcctccc tcaacttatc cattaatgat gtagatgaaa aatctgacac 5280
tattgccatc accaaatatc tgacactctg tacctgcttt tgatttctct ttgttgggtt 5340
ggtgagcatt agcaacaata gggtcctcag tgcaacctca atgtcggtga gacagtcttt 5400
caaatcagga catgatctaa tccatgaaat catgatgtct atcatattgt ataagacctc 5460
atctgaaaaa attggtaaaa agaacctttt aggatctgca tagaaggaaa ttaaatgacc 5520
atccgggcct tgtatggagt agcaccttga agattctcca gtcttctggt ataataggtg 5580
gtattcttca gagtccagtt ttattacttg gcaaaacact tctttgcatt ctaccacttg 5640
atatctcaca gaccctattt gattttgcct tagtctagca actgagctag ttttcatact 5700
gtttgttaag gccagacaaa cagatgataa tcttctcagg ctctgtatgt tcttcagctg 5760
ctctgtgctg ggttggaaat tgtaatcttc aaacttcgta taatacatta tcgggtgagc 5820
tccaattttc ataaagttct caaattcagt gaatggtatg tggcattctt gctcaaggtg 5880
ttcagacagt ccgtaatgct cgaaactcag tcccaccact aacaggcatt tttgaatttt 5940
tgcaatgaac tcactaatag atgccctaaa caattcctca aaagacacct ttctaaacac 6000
ctttgacttt tttctattcc tcaaaagtct aatgaactcc tctttagtgc tgtgaaagct 6060
taccagccta tcattcacac tactatagca acaacccacc cagtgtttat cattttttaa 6120
ccctttgaat ttcgactgtt ttatcaatga ggaaagacac aaaacatcca gatttaacaa 6180
ctgtctcctt ctagtattca acagtttcaa actcttgact ttgtttaaca tagagaggag 6240
cctctcatat tcagtgctag tctcacttcc cctttcgtgc ccatgggtct ctgcagttat 6300
gaatctcatc aaaggacagg attcgactgc ctccctgctt aatgttaaga tatcatcact 6360
atcagcaagg ttttcataga gctcagagaa ttccttgatc aagccttcag ggtttacttt 6420
ctgaaagttt ctctttaatt tcccactttc taaatctctt ctaaacctgc tgaaaagaga 6480
gtttattcca aaaaccacat catcacagct catgttgggg ttgatgcctt cgtggcacat 6540
cctcataatt tcatcattgt gagttgacct cgcatctttc agaattttca tagagtccat 6600
accggagcgc ttgtcgatag tagtcttcag ggactcacag agtctaaaat attcagactc 6660
ttcaaagact ttctcatttt ggttagaata ctccaaaagt ttgaataaaa ggtctctaaa 6720
tttgaagttt gcccactctg gcataaaact attatcataa tcacaacgac catctactat 6780
tggaactaat gtgacacccg caacagcaag gtcttccctg atgcatgcca atttgttagt 6840
gtcctctata aatttcttct caaaactggc tggagtgctc ctaacaaaac actcaagaag 6900
aatgagagaa ttgtctatca gcttgtaacc atcaggaatg ataagtggta gtcctgggca 6960
tacaattcca gactccacca aaattgtttc cacagactta tcgtcgtggt tgtgtgtgca 7020
gccactcttg tctgcactgt ctatttcaat gcagcgtgac agcaacttga gtccctcaat 7080
cagaaccatt ctgggttccc tttgtcccag aaagttgagt ttctgccttg acaacctctc 7140
atcctgttct atatagttta aacataactc tctcaattct gagatgattt catccattgc 7200
gcatcaaaaa gcctaggatc ctcggtgcg 7229
<210> 21
<211> 2628
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> r3JUNV-P1A（含有NP）的S片段1
<400> 21
gcgcaccggg gatcctaggc gattttggtt acgctataat tgtaactgtt ttctgtttgg 60
acaacatcaa aaacatccat tgcacaatga gcgacaacaa gaagcccgac aaggcccact 120
ctggcagcgg cggagatggc gacggcaaca gatgtaacct gctgcacaga tacagcctgg 180
aagagatcct gccctacctg ggctggctgg tgttcgccgt cgtgacaaca agcttcctgg 240
ccctgcagat gttcatcgac gccctgtacg aggaacagta cgagagggac gtggcctgga 300
tcgccagaca gagcaagaga atgagcagcg tggacgagga cgaggatgat gaggacgacg 360
aagatgacta ctacgacgat gaggatgacg acgacgacgc cttctacgat gacgaggacg 420
atgaagagga agaactggaa aacctgatgg acgacgagtc cgaggatgag gccgaggaag 480
agatgagcgt ggaaatgggc gctggcgccg aagagatggg agccggcgct aactgtgctt 540
gcgtgccagg acaccacctg agaaagaacg aagtgaagtg ccggatgatc tacttcttcc 600
acgaccccaa ctttctggtg tccatccccg tgaaccccaa agaacagatg gaatgcagat 660
gcgagaacgc cgacgaagag gtggccatgg aagaagaaga ggaagaggaa gaagaagaag 720
aagaggaaga aatgggcaac cccgacggct tcagcccctg agacctcctg agggtcccca 780
ccagcccggg cactgcccgg gctggtgtgg ccccccagtc cgcggcctgg ccgcggactg 840
gggaggcact gcttacagtg cataggctgc cttcgggagg aacagcaagc tcggtggtaa 900
tagaggtgta ggttcctcct catagagctt cccatctagc actgactgaa acattatgca 960
gtctagcaga gcacagtgtg gttcactgga ggccaacttg aagggagtat ccttttccct 1020
ctttttctta ttgacaacca ctccattgtg atatttgcat aagtgaccat atttctccca 1080
gacctgttga tcaaactgcc tggcttgttc agatgtgagc ttaacatcaa ccagtttaag 1140
atctcttctt ccatggaggt caaacaactt cctgatgtca tcggatcctt gagtagtcac 1200
aaccatgtct ggaggcagca agccgatcac gtaactaaga actcctggca ttgcatcttc 1260
tatgtccttc attaagatgc cgtgagagtg tctgctacca tttttaaacc ctttctcatc 1320
atgtggtttt ctgaagcagt gaatgtactg cttacctgca ggttggaata atgccatctc 1380
aacagggtca gtggctggtc cttcaatgtc gagccaaagg gtgttggtgg ggtcgagttt 1440
ccccactgcc tctctgatga cagcttcttg tatctctgtc aagttagcca atctcaaatt 1500
ctgaccgttt ttttccggct gtctaggacc agcaactggt ttccttgtca gatcaatact 1560
tgtgttgtcc catgacctgc ctgtgatttg tgatctagaa ccaatataag gccaaccatc 1620
gccagaaaga caaagtttgt acaaaaggtt ttcataagga tttctattgc ctggtttctc 1680
atcaataaac atgccttctc ttcgtttaac ctgaatggtt gattttatga gggaagagaa 1740
gttttctggg gtgactctga ttgtttccaa catgtttcca ccatcaagaa tagatgctcc 1800
agcctttact gcagctgaaa gactgaagtt gtaaccagaa atattgatgg agctttcatc 1860
tttagtcaca atctgaaggc agtcatgttc ctgagtcagt ctgtcaaggt cacttaagtt 1920
tggatacttc acagtgtata gaagcccaag tgaggttaaa gcttgtatga cactgttcat 1980
tgtctcacct ccttgaacag tcatgcatgc aattgtcaat gcaggaacag agccaaactg 2040
attgtttagc tttgaagggt ctttaacatc ccatatcctc accacaccat ttcccccagt 2100
cccttgctgt tgaaatccca gtgttctcaa tatctctgat cttttagcaa gttgtgactg 2160
ggacaagtta cccatgtaaa ccccctgaga gcctgtctct gctcttctta tcttgttttt 2220
taatttctca aggtcagacg ccaactccat cagttcatcc ctccccagat ctcccacctt 2280
gaaaactgtg tttcgttgaa cactcctcat ggacatgagt ctgtcaacct ctttattcag 2340
gtccctcaac ttgttgagat cttcttcccc ctttttagtc tttctgagtg cccgctgcac 2400
ctgtgccact tggttgaagt cgatgctgtc agcaattagc ttggcgtcct tcaaaacatc 2460
tgacttgaca gtctgagtga attggctcaa acctctcctt aaggactgag tccatctaaa 2520
gcttggaacc tccttggagt gtgccatgcc agaagttctg gtgattttga tctagaatag 2580
agttgctcag tgaaagtgtt agacactatg cctaggatcc actgtgcg 2628
<210> 22
<211> 2391
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> r3JUNV-P1A（含有GP）的S片段2
<400> 22
gcgcaccggg gatcctaggc gattttggtt acgctataat tgtaactgtt ttctgtttgg 60
acaacatcaa aaacatccat tgcacaatga gcgacaacaa gaagcccgac aaggcccact 120
ctggcagcgg cggagatggc gacggcaaca gatgtaacct gctgcacaga tacagcctgg 180
aagagatcct gccctacctg ggctggctgg tgttcgccgt cgtgacaaca agcttcctgg 240
ccctgcagat gttcatcgac gccctgtacg aggaacagta cgagagggac gtggcctgga 300
tcgccagaca gagcaagaga atgagcagcg tggacgagga cgaggatgat gaggacgacg 360
aagatgacta ctacgacgat gaggatgacg acgacgacgc cttctacgat gacgaggacg 420
atgaagagga agaactggaa aacctgatgg acgacgagtc cgaggatgag gccgaggaag 480
agatgagcgt ggaaatgggc gctggcgccg aagagatggg agccggcgct aactgtgctt 540
gcgtgccagg acaccacctg agaaagaacg aagtgaagtg ccggatgatc tacttcttcc 600
acgaccccaa ctttctggtg tccatccccg tgaaccccaa agaacagatg gaatgcagat 660
gcgagaacgc cgacgaagag gtggccatgg aagaagaaga ggaagaggaa gaagaagaag 720
aagaggaaga aatgggcaac cccgacggct tcagcccctg agacctcctg agggtcccca 780
ccagcccggg cactgcccgg gctggtgtgg ccccccagtc cgcggcctgg ccgcggactg 840
gggaggcact gcatggggca gttcattagc ttcatgcaag aaataccaac ctttttgcag 900
gaggctctga acattgctct tgttgcagtc agtctcattg ccatcattaa gggtatagtg 960
aacttgtaca aaagtggttt attccaattc tttgtattcc tagcgcttgc aggaagatcc 1020
tgcacagaag aagctttcaa aatcggactg cacactgagt tccagactgt gtccttctca 1080
atggtgggtc tcttttccaa caatccacat gacctacctt tgttgtgtac cttaaacaag 1140
agccatcttt acattaaggg gggcaatgct tcatttcaga tcagctttga tgatattgca 1200
gtattgttgc cacagtatga tgttataata caacatccag cagatatgag ctggtgttcc 1260
aaaagtgatg atcaaatttg gttgtctcag tggttcatga atgctgtggg acatgattgg 1320
catctagacc caccatttct gtgtaggaac cgtgcaaaga cagaaggctt catctttcaa 1380
gtcaacacct ccaagactgg tgtcaatgga aattatgcta agaagtttaa gactggcatg 1440
catcatttat atagagaata tcctgaccct tgcttgaatg gcaaactgtg cttaatgaag 1500
gcacaaccta ccagttggcc tctccaatgt ccactcgacc acgttaacac attacacttc 1560
cttacaagag gtaaaaacat tcaacttcca aggaggtcct tgaaagcatt cttctcctgg 1620
tctttgacag actcatccgg caaggatacc cctggaggct attgtctaga agagtggatg 1680
ctcgtagcag ccaaaatgaa gtgttttggc aatactgctg tagcaaaatg caatttgaat 1740
catgactctg aattctgtga catgttgagg ctctttgatt acaacaaaaa tgctatcaaa 1800
accctaaatg atgaaactaa gaaacaagta aatctgatgg ggcagacaat caatgccctg 1860
atatctgaca atttattgat gaaaaacaaa attagggaac tgatgagtgt cccttactgc 1920
aattacacaa aattttggta tgtcaaccac acactttcag gacaacactc attaccaagg 1980
tgctggttaa taaaaaacaa cagctatttg aacatctctg acttccgtaa tgactggata 2040
ttagaaagtg acttcttaat ttctgaaatg ctaagcaaag agtattcgga caggcagggt 2100
aaaactcctt tgactttagt tgacatctgt atttggagca cagtattctt cacagcgtca 2160
ctcttccttc acttggtggg tataccctcc cacagacaca tcaggggcga agcatgccct 2220
ttgccacaca ggttgaacag cttgggtggt tgcagatgtg gtaagtaccc caatctaaag 2280
aaaccaacag tttggcgtag aggacactaa gccagaagtt ctggtgattt tgatctagaa 2340
tagagttgct cagtgaaagt gttagacact atgcctagga tccactgtgc g 2391
<210> 23
<211> 7115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> r3JUNV-P1A的L片段
<400> 23
gcgcaccggg gatcctaggc gtaacttcat cattaaaatc tcagattctg ctctgagtgt 60
gacttactgc gaagaggcag acaaatgggc aactgcaacg gggcatccaa gtctaaccag 120
ccagactcct caagagccac acagccagcc gcagaattta ggagggtagc tcacagcagt 180
ctatatggta gatataactg taagtgctgc tggtttgctg ataccaattt gataacctgt 240
aatgatcact acctttgttt aaggtgccat cagggtatgt taaggaattc agatctctgc 300
aatatctgct ggaagcccct gcccaccaca atcacagtac cggtggagcc aacagcacca 360
ccaccatagg cagactgcac agggtcagac ccgacccccc ggggggcccc catggggacc 420
ccccgtgggg gaaccccggg ggtgatgcgc cattagtcaa tgtctttgat ctcgactttg 480
tgcttcagtg gcctgcatgt cacccctttc aatctgaact gcccttgggg atctgatatc 540
agcaggtcat ttaaagatct gctgaatgcc accttgaaat ttgagaattc caaccagtca 600
ccaaatttat caagtgaacg gatcaactgc tctttgtgta gatcataaac gaggacaaag 660
tcctcttgct gaaataatat tgtttgtgat gttgttttta gataaggcca tagttggctt 720
aataaggttt ccacactatc aatgtcctct agtgctccaa ttgccttgac tatgacatcc 780
ccagacaact caactctata tgttgacaac ctttcattac ctctgtaaaa gataccctct 840
ttcaagacaa gaggttctcc tgggttatct ggcccaatga ggtcatatgc atacttgtta 900
cttagttcag aataaaagtc accaaagttg aacttaacat ggctcagaat attgtcatca 960
tttgtcgcag cgtagcctgc atcaataaac aagccagcta ggtcaaagct ctcatggcct 1020
gtgaacaatg gtaggctagc gataaccagt gcaccatcca acaatgagtg gcttccctca 1080
gacccagaaa cacattgact cattgcatcc acattcagct ctaattcagg ggtaccgaca 1140
tcatccactc ctagtgaact gacaatggtg taactgtaca ccatctttct tctaagttta 1200
aattttgtcg aaactcgtgt gtgttctact tgaatgatca attttagttt cacagcttct 1260
tggcaagcaa cattgcgcaa cacagtgtgc aggtccatca tgtcttcctg aggcaacaag 1320
gagatgttgt caacagagac accctcaagg aaaaccttga tattatcaaa gctagaaact 1380
acataaccca ttgcaatgtc ttcaacaaac attgctcttg atactttatt attcctaact 1440
gacaaggtaa aatctgtgag ttcagctaga tctacttgac tgtcatcttc tagatctaga 1500
acttcattga accaaaagaa ggatttgaga cacgatgttg acatgactag tgggtttatc 1560
atcgaagata agacaacttg caccatgaag ttcctgcaaa cttgctgtgg gctgatgcca 1620
acttcccaat ttgtatactc tgactgtcta acatgggctg aagcgcaatc actctgtttc 1680
acaatataaa cattattatc tcttactttc aataagtgac ttataatccc taagttttca 1740
ttcatcatgt ctagagccac acagacatct agaaacttga gtcttccact atccaaagat 1800
ctgttcactt gaagatcatt cataaagggt gccaaatgtt cttcaaatag tttggggtaa 1860
tttcttcgta tagaatgcaa tacatggttc atgcctaatt ggtcttctat ctgtcgtact 1920
gctttgggtt taacagccca gaagaaattc ttattacata agaccagagg ggcctgtgga 1980
ctcttaatag cagaaaacac ccactcccct aactcacagg catttgtcag caccaaagag 2040
aagtaatccc acaaaattgg tttagaaaat tggttaactt ctttaagtga tttttgacag 2100
taaataactt taggctttct ctcacaaatt ccacaaagac atggcattat tcgagtaaat 2160
atgtccttta tatacagaaa tccgccttta ccatccctaa cacacttact ccccatactc 2220
ttacaaaacc caatgaagcc tgaggcaaca gaagactgaa atgcagattt gttgattgac 2280
tctgccaaga tcttcttcac gccttttgtg aaatttcttg acagcctgga ctgtattgtc 2340
cttatcaatg ttggcatctc ttctttctct aacactcttc gacttgtcat gagtttggtc 2400
ctcaagacca acctcaagtc cccaaagctc gctaaattga cccatctgta gtctagagtt 2460
tgtctgattt catcttcact acacccggca tattgcagga atccggataa agcctcatcc 2520
cctcccctgc ttatcaagtt gataaggttt tcctcaaaga ttttgcctct cttaatgtca 2580
ttgaacactt tcctcgcgca gttccttata aacattgtct ccttatcatc agaaaaaata 2640
gcttcaattt tcctctgtag acggtaccct ctagacccat caacccagtc tttgacatct 2700
tgttcttcaa tagctccaaa cggagtctct ctgtatccag agtatctaat caattggttg 2760
actctaatgg aaatctttga cactatatga gtgctaaccc cattagcaat acattgatca 2820
caaattgtgt ctatggtctc tgacagttgt gttggagttt tacacttaac gttgtgtaga 2880
gcagcagaca caaacttggt gagtaaagga gtctcttcac ccatgacaaa aaatcttgac 2940
ttaaactcag caacaaaagt tcctatcaca ctctttgggc tgataaactt gtttaattta 3000
gaagataaga attcatggaa gcacaccatt tccagcagtt ctgtcctgtc ttgaaacttt 3060
tcatcactaa ggcaaggaat ttttataagg ctaacctggt catcgctgga ggtataagtg 3120
acaggtatca catcatacaa taagtcaagt gcataacaca gaaattgttc agtaattagc 3180
ccatataaat ctgatgtgtt gtgcaagatt ccctggccca tgtccaagac agacattata 3240
tggctgggga cctggtccct tgactgcaga tactggtgaa aaaactcttc accaacacta 3300
gtacagtcac aacccattaa acctaaagat ctcttcaatt tccctacaca gtaggcttct 3360
gcaacattaa ttggaacttc aacgacctta tgaagatgcc atttgagaat gttcattact 3420
ggttcaagat tcacctttgt tctatctctg ggattcttca attctaatgt gtacaaaaaa 3480
gaaaggaaaa gtgctgggct catagttggt ccccatttgg agtggtcata tgaacaggac 3540
aagtcaccat tgttaacagc cattttcata tcacagattg cacgttcgaa ttccttttct 3600
gaattcaagc atgtgtattt cattgaacta cccacagctt ctgagaagtc ttcaactaac 3660
ctggtcatca gcttagtgtt gaggtctccc acatacagtt ctctatttga gccaacctgc 3720
tccttataac ttagtccaaa tttcaagttc cctgtatttg agctgatgct tgtgaactct 3780
gtaggagagt cgtctgaata gaaacataaa ttccgtaggg ctgcatttgt aaaataactt 3840
ttgtctagct tatcagcaat ggcttcagaa ttgctttccc tggtactaag ccgaacctca 3900
tcctttagtc tcagaacttc actggaaaag cccaatctag atctacttct atgctcataa 3960
ctacccaatt tctgatcata atgtccttga attaaaagat acttgaagca ttcaaagaat 4020
tcatcttctt ggtaggctat tgttgtcaaa ttttttaata acaaacccaa agggcagatg 4080
tcctgcggtg cttcaagaaa ataagtcaat ttaaatggag atagataaac agcatcacat 4140
aactctttat acacatcaga cctgagcaca tctggatcaa aatccttcac ctcatgcatt 4200
gacacctctg ctttaatctc tctcaacact ccaaaagggg cccacaatga ctcaagagac 4260
tctcgctcat caacagatgg attttttgat ttcaacttgg tgatctcaac ttttgtcccc 4320
tcactattag ccatcttggc tagtgtcatt tgtacgtcat ttctaatacc ctcaaaggcc 4380
cttacttgat cctctgttaa actctcatac atcactgata attcttcttg attggttctg 4440
gttcttgaac cggtgctcac aagacctgtt agatttttta atattaagta gtccatggaa 4500
tcaggatcaa gattatacct gccttttgtt ttaaacctct cagccatagt agaaacgcat 4560
gttgaaacaa gtttctcctt atcataaaca gaaagaatat ttccaagttc gtcgagcttg 4620
gggattacca cacttttatt gcttgacaga tccagagctg tgctagtgat gttaggcctg 4680
tagggattgc ttttcagttc acctgtaact ttaagtcttc ctctattgaa gagagaaatg 4740
cagaaggaca aaatctcttt acacactcct ggaatttgag tatctgagga agtcttagcc 4800
tctttggaaa agaatctgtc caatcctctt atcatggtgt cctcttgttc cagtgttaga 4860
ctcccactta gaggggggtt tacaacaaca caatcaaact tgactttggg ctcaataaac 4920
ttctcaaaac actttatttg atctgtcagg cgatcaggtg tctctttggt taccaagtga 4980
cacagataac taacatttaa tagatattta aaccttcttg caaagtaaag atctgcatct 5040
tccccttcac ccaaaattgt ctggaaaagt tccacagcca tcctctgaat cagcacctct 5100
gatccagaca tgcagtcgac ccttaacttt gacatcaaat ccacatgatg gatttgattt 5160
gcatatgcca tcaagaaata tcttagacct tgtaaaaatg tctggttcct tttggaaggg 5220
gaacagagta cagctaacac taacaatctt aatattggcc ttgtcattgt catgagttcg 5280
tggctaaaat ccaaccagct ggtcatttcc tcacacattt caattaacac atcctccgaa 5340
aatataggca ggaaaaatct ctttggatca cagtaaaaag agccttgttc ttccaatacc 5400
ccattgatgg atagatagat agaatagcac cttgacttct cacctgtttt ttggtaaaac 5460
aagagaccaa atgtattctt tgtcagatga aatctttgta cataacactc tcttagtcta 5520
acattcccaa aatatctaga atactctctt tcattgatta acaatcggga ggaaaatgat 5580
gtcttcatcg agttgaccaa tgcaagggaa atggaggaca aaatcctaaa taatttcttc 5640
tgctcacctt ccactaagct gctgaatggc tgatgtctac agattttctc aaattccttg 5700
ttaatagtat atctcatcac tggtctgtca gaaacaagtg cctgagctaa aatcatcaag 5760
ctatccatat cagggtgttt tattagtttt tccagctgtg accagagatc ttgatgagag 5820
ttcttcaatg ttctggaaca cgcttgaacc cacttggggc tggtcatcaa tttcttcctt 5880
attagtttaa tcgcctccag aatatctaga agtctgtcat tgactaacat taacatttgt 5940
ccaacaacta ttcccgcatt tcttaacctt acaattgcat catcatgcgt tttgaaaaga 6000
tcacaaagta aattgagtaa aactaagtcc agaaacagta aagtgtttct cctggtgttg 6060
aaaactttta gacctttcac tttgttacac acggaaaggg cttgaagata acacctctct 6120
acagcatcaa tagatataga attctcatct gactggcttt ccatgttgac ttcatctatt 6180
ggatgcaatg cgatagagta gactacatcc atcaacttgt ttgcacaaaa agggcagctg 6240
ggcacatcac tgtctttgtg gcttcctaat aagatcaagt catttataag cttagacttt 6300
tgtgaaaatt tgaatttccc caactgcttg tcaaaaatct ccttcttaaa ccaaaacctt 6360
aactttatga gttcttctct tatgacagat tctctaatgt ctcctctaac cccaacaaag 6420
agggattcat ttaacctctc atcataaccc aaagaattct ttttcaagca ttcgatgttt 6480
tctaatccca agctctggtt ttttgtgttg gacaaactat ggatcaatcg ctggtattct 6540
tgttcttcaa tattaatctc ttgcataaat tttgatttct ttaggatgtc gatcagcaac 6600
caccgaactc tttcaacaac ccaatcagca aggaatctat tgctgtagct agatctgcca 6660
tcaaccacag gaaccaacgt aatccctgcc cttagtaggt cggactttag gtttaagagc 6720
tttgacatgt cactcttcca ttttctctca aactcatcag gattgaccct aacaaaggtt 6780
tccaatagga tgagtgtttt ccctgtgagt ttgaagccat ccggaatgac ttttggaagg 6840
gtgggacata gtatgccata gtcagacagg atcacatcaa caaacttctg atctgaattg 6900
atctgacagg cgtgtgcctc acaggactca agctctacta aacttgacag aagtttgaac 6960
ccttccaaca acagagagct ggggtgatgt tgagataaaa agatgtccct ttggtatgct 7020
agctcctgtc tttctggaaa atgctttcta ataaggcttt ttatttcatt tactgattcc 7080
tccatgctca agtgccgcct aggatcctcg gtgcg 7115
<210> 24
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P815小鼠肥大细胞瘤衍生的自体抗原P1A的氨基酸序列
<400> 24
Met Ser Asp Asn Lys Lys Pro Asp Lys Ala His Ser Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Asp Gly Asp Gly Asn Arg Cys Asn Leu Leu His Arg Tyr Ser Leu Glu
20 25 30
Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe Ala Val Val Thr Thr
35 40 45
Ser Phe Leu Ala Leu Gln Met Phe Ile Asp Ala Leu Tyr Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Glu Arg Asp Val Ala Trp Ile Ala Arg Gln Ser Lys Arg Met Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Tyr Tyr
85 90 95
Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Ala Phe Tyr Asp Asp Glu Asp Asp
100 105 110
Glu Glu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Met Asp Asp Glu Ser Glu Asp Glu
115 120 125
Ala Glu Glu Glu Met Ser Val Glu Met Gly Ala Gly Ala Glu Glu Met
130 135 140
Gly Ala Gly Ala Asn Cys Ala Cys Val Pro Gly His His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Asn Glu Val Lys Cys Arg Met Ile Tyr Phe Phe His Asp Pro Asn Phe
165 170 175
Leu Val Ser Ile Pro Val Asn Pro Lys Glu Gln Met Glu Cys Arg Cys
180 185 190
Glu Asn Ala Asp Glu Glu Val Ala Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
195 200 205
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Met Gly Asn Pro Asp Gly Phe Ser Pro
210 215 220

Claims (75)

1.一种沙粒病毒基因组片段，其中所述基因组片段被工程化以在开放阅读框(“ORF”)的野生型位置之外的位置携带病毒ORF，其中所述沙粒病毒基因组片段选自：
(i)S片段，其中编码核蛋白(“NP”)的ORF处在沙粒病毒5'非翻译区(“UTR”)的控制下；
(ii)S片段，其中编码基质蛋白Z(“Z蛋白”)的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)S片段，其中编码RNA依赖性RNA聚合酶L(“L蛋白”)的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)S片段，其中编码病毒糖蛋白(“GP”)的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(vi)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(vii)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(viii)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ix)L片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(x)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(xi)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(xii)L片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
2.权利要求1的沙粒病毒基因组片段，其中所述沙粒病毒3'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的3'UTR，和其中所述沙粒病毒5'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的5'UTR。
3.权利要求1的沙粒病毒基因组片段的cDNA。
4.包含权利要求3的cDNA的DNA表达载体。
5.包含权利要求1的沙粒病毒基因组片段、权利要求3的cDNA或权利要求4的载体的宿主细胞。
6.一种沙粒病毒颗粒，包含权利要求1的沙粒病毒基因组片段和第二沙粒病毒基因组片段，从而所述沙粒病毒颗粒包含S片段和L片段。
7.权利要求6的沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒颗粒是传染性的和复制型的。
8.权利要求6的沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒颗粒是减毒的。
9.权利要求6的沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性子代。
10.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或功能上灭活。
11.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的至少一个被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
12.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四个ORF的仅一个被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
13.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码GP的ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
14.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码NP的ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
15.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码Z蛋白的ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
16.权利要求9的沙粒病毒颗粒，其中编码L蛋白的ORF被移除或用来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF替换。
17.权利要求11到16的任一项的沙粒病毒颗粒，其中所述异源ORF编码报告蛋白。
18.权利要求11到17的任一项的沙粒病毒颗粒，其中所述异源ORF编码衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。
19.权利要求18的沙粒病毒颗粒，其中所述异源ORF编码选自人类免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、大片状带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核分枝杆菌抗原和肿瘤相关抗原的抗原。
20.权利要求11到18的任一项的沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不受所述来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF的影响。
21.一种生产权利要求1的沙粒病毒基因组片段的方法，其中所述方法包括转录权利要求3的cDNA。
22.一种产生权利要求6的沙粒病毒颗粒的方法，其中所述方法包括：
(i)向宿主细胞中转染权利要求3的cDNA；
(ii)向所述宿主细胞中转染包含第二沙粒病毒基因组片段的cDNA的质粒；
(iii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
(iv)收获所述沙粒病毒颗粒。
23.权利要求22的方法，其中L片段和S片段的转录使用双向启动子进行。
24.权利要求22的方法，其中所述方法进一步包括向宿主细胞中转染编码沙粒病毒聚合酶的一种或更多种核酸。
25.权利要求22的方法，其中所述沙粒病毒聚合酶是L蛋白。
26.权利要求22或24的方法，其中所述方法进一步包括向所述宿主细胞中转染编码NP蛋白的一种或更多种核酸。
27.权利要求22的方法，其中L片段和S片段的转录各自处在选自以下构成的组的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
28.一种疫苗，包含权利要求10或11到16的沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体。
29.一种药物组合物，包含权利要求10或11到16的沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体。
30.权利要求1的沙粒病毒基因组片段或权利要求6的沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(“LCMV”)。
31.权利要求30的沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒，其中所述LCMV是MP毒株、Armstrong毒株、或Armstrong克隆13毒株。
32.权利要求1的沙粒病毒基因组片段或权利要求6的沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒基因组片段或沙粒病毒颗粒来源于Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3毒株。
33.一种三片段沙粒病毒颗粒，包含一个L片段和两个S片段，其中在用104PFU的所述三片段沙粒病毒颗粒感染的、缺乏I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因1(RAG1)的小鼠中，在70天的持续感染之后，所述三片段沙粒病毒颗粒的增殖不产生复制型的双片段病毒颗粒。
34.权利要求33的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述两个S片段的片段内重组将两个沙粒病毒ORF联合到仅一个片段上、而不是两个独立的片段上，取消病毒启动子活性。
35.一种三片段沙粒病毒颗粒，包含两个L片段和一个S片段，其中在用104PFU的所述三片段沙粒病毒颗粒感染的、缺乏I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组活化基因1(RAG1)的小鼠中，在70天的持续感染之后，所述三片段沙粒病毒颗粒的增殖不产生复制型的双片段病毒颗粒。
36.权利要求35的三片段沙粒病毒颗粒，其中两个L片段的片段内重组将两个沙粒病毒ORF联合到仅一个片段上、而不是两个独立的片段上，取消病毒启动子活性。
37.权利要求33的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述两个S片段之一选自：
(i)S片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)S片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)S片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)S片段，其中编码L的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(vi)S片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
38.权利要求35的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述两个L片段之一选自：
(i)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(ii)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iii)L片段，其中编码L蛋白的ORF处在沙粒病毒5'UTR的控制下；
(iv)L片段，其中编码GP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；
(v)L片段，其中编码NP的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下；和
(vi)L片段，其中编码Z蛋白的ORF处在沙粒病毒3'UTR的控制下。
39.权利要求37或38的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒3'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的3'UTR，和其中所述沙粒病毒5'UTR是沙粒病毒S片段或沙粒病毒L片段的5'UTR。
40.权利要求33的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述两个S片段包含(i)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF；或(ii)一个或两个重复的沙粒病毒ORF；或(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个异源ORF和一个重复的沙粒病毒ORF。
41.权利要求35的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述两个L片段包含(i)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF；或(ii)两个重复的沙粒病毒ORF；或(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个异源ORF和一个重复的沙粒病毒ORF。
42.权利要求40或41的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述异源ORF编码衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。
43.权利要求42的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述异源ORF编码选自人类免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、大片状带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核分枝杆菌抗原和肿瘤相关抗原的抗原。
44.权利要求40或41的三片段沙粒病毒颗粒，其中至少一个异源ORF编码荧光蛋白。
45.权利要求44的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
46.权利要求33到43的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒包含所有四个沙粒病毒ORF，以及其中所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的和复制型的。
47.权利要求33到45的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒缺少四个沙粒病毒ORF的一个或更多个，其中所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性的子代。
48.权利要求33到45的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒缺少四个沙粒病毒ORF中的一个，其中所述三片段沙粒病毒颗粒是传染性的，但是不能在非补充细胞中产生进一步的传染性的子代。
49.权利要求46或47的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述沙粒病毒缺少GP ORF。
50.一种包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒，其中第一个S片段被工程化以携带处在沙粒病毒3'UTR的控制下的位置中的编码GP的ORF，以及处在沙粒病毒5'UTR的控制下的位置中的编码第一目的基因的ORF，第二S片段被工程化以携带处在沙粒病毒3'UTR的控制下的位置中的编码NP的ORF，以及处在沙粒病毒5'UTR的控制下的位置中的编码第二目的基因的ORF。
51.一种包含一个L片段和两个S片段的三片段沙粒病毒颗粒，其中第一个S片段被工程化以携带处在沙粒病毒5'UTR的控制下的位置中的编码GP的ORF，以及处在沙粒病毒3'UTR的控制下的位置中的编码第一目的基因的ORF，第二S片段被工程化以携带处在沙粒病毒5'UTR的控制下的位置中的编码NP的ORF，以及处在沙粒病毒3'UTR的控制下的位置中的编码第二目的基因的ORF。
52.权利要求50或51的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述目的基因编码衍生自传染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。
53.权利要求52的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述目的基因编码选自人类免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、大片状带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核分枝杆菌抗原和肿瘤相关抗原的抗原。
54.权利要求50或51的三片段沙粒病毒颗粒，其中至少一个目的基因编码荧光蛋白。
55.权利要求54的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
56.权利要求33、35、37、38、50或51的任一项的三片段沙粒病毒颗粒基因组的cDNA。
57.包含权利要求56的cDNA的DNA表达载体。
58.一种宿主细胞，包含权利要求33或35的三片段沙粒病毒颗粒、权利要求56的cDNA、或权利要求57的载体。
59.权利要求33到51的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒是减毒的。
60.一种产生权利要求33的三片段沙粒病毒颗粒的方法，其中所述方法包括：
(i)向宿主细胞中转染所述L片段和两个S片段的一种或更多种cDNA；
(ii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
(iii)收获所述沙粒病毒颗粒。
61.一种产生权利要求35的三片段沙粒病毒颗粒的方法，其中所述方法包括：
(i)向宿主细胞中转染两个L片段和一个S片段的一种或更多种cDNA；
(ii)在适合于病毒形成的条件下维持所述宿主细胞；和
(iii)收获所述沙粒病毒颗粒。
62.权利要求60的方法，其中一个L片段和两个S片段的转录使用双向启动子进行。
63.权利要求61的方法，其中两个L片段和一个S片段的转录使用双向启动子进行。
64.权利要求60或61的方法，其中所述方法进一步包括向所述宿主细胞中转染编码沙粒病毒聚合酶的一种或更多种核酸。
65.权利要求62的方法，其中所述沙粒病毒聚合酶是L蛋白。
66.权利要求60、61、62或63的方法，其中所述方法进一步包括向所述宿主细胞中转染编码NP蛋白的一种或更多种核酸。
67.权利要求60的方法，其中L片段和两个S片段的转录各自处在选自以下构成的组的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
68.权利要求61的方法，其中两个L片段和所述S片段的转录各自处在选自以下构成的组的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
69.权利要求33到51的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒具有与双片段沙粒病毒颗粒相同的向性。
70.权利要求33到51的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒是复制缺陷的。
71.一种疫苗，包含权利要求33到51、69或70的任一项的三片段沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体。
72.一种药物组合物，包含权利要求33到51、69或70的任一项的三片段沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体。
73.权利要求33到51、69或70的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒来源于LCMV。
74.权利要求73的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述LCMV是MP毒株、Armstrong毒株、或Armstrong克隆13毒株。
75.权利要求33到51、69或70的任一项的三片段沙粒病毒颗粒，其中所述三片段沙粒病毒颗粒衍生自Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3毒株。
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