CN107921117A - Hpv疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文提供了适于用作针对肿瘤疾病或癌症的疫苗的遗传修饰的沙粒病毒。本发明还涉及预防或治疗某些导致肿瘤疾病或癌症的感染(例如感染致瘤病毒)的药物组合物和方法。特别的，本文提供了预防或治疗由人乳头瘤病毒(HPV)感染导致的或与之相关的疾病和病况(例如宫颈癌、生殖器癌、头颈癌和皮肤癌)的药物组合物、疫苗和方法。本文还提供了用于治疗肿瘤疾病(例如由致瘤病毒感染引起的肿瘤疾病)的免疫疗法。

Description

HPV疫苗
本申请要求2016年5月3日提交的美国临时申请号62/331,158、2015年11月12日提交的美国临时申请号62/254,410和2015年6月10日提交的美国临时申请号62/173,805的优先权益，其全部内容在此引入作为参考。
1.介绍
本发明涉及适于作为针对肿瘤疾病或癌症的疫苗的遗传修饰的沙粒病毒。本发明还涉及用于治疗或预防某些导致肿瘤疾病或癌症的感染(例如致瘤病毒感染)的药物组合物和方法致瘤病毒。特别的，本文提供了用于治疗或预防由人乳头瘤病毒(HPV)感染导致的和与之相关的疾病和病况(例如宫颈癌，生殖器癌，头颈癌和皮肤癌)的药物组合物、疫苗和方法。本文还提供了用于治疗肿瘤疾病(例如由致瘤病毒感染引起的肿瘤疾病)的免疫疗法致瘤病毒。
2.背景
2.1医疗需求
肿瘤疾病，例如癌症，可以由感染性介质(例如病毒或所谓的致瘤病毒)引起。致瘤病毒可以是DNA病毒，例如腺病毒；RNA病毒，例如丙型肝炎病毒；或逆转录病毒，例如人T-嗜淋巴细胞病毒。
人乳头瘤病毒(HPV)是来自乳头瘤病毒家族的DNA病毒，其已被发现与几种类型的癌症相关。虽然大多数HPV感染是亚临床的，不导致体征，但是亚临床感染可能在某些人群中变成临床的并导致良性乳头瘤(例如疣或鳞状细胞乳头瘤)或癌症。已鉴定了超过170个HPV类型并按数字命名(Bzhalava等，2013，Virology 445(1–2)：224–31)。目前对HPV感染没有特效药。
大约十几种HPV类型(包括16、18、31和45型)被称为“高风险”类型，因为它们导致宫颈癌，肛门癌，外阴癌，阴道癌和阴茎癌(Parkin等，2002，CA Cancer J Clin 2005；55：74–108)。据估算全部宫颈癌的99.7％是由高风险致瘤HPV类型导致的(Ault，2006，Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology 2006：1–5)，包括HPV 16型和HPV18型，二者之和占宫颈癌的约70％(参见世界卫生组织关于HPV和宫颈癌的网站和疾病控制中心关于的HPV“红皮书”)。一些类型的HPV，特别的16型，已被发现与HPV阳性口咽癌(OSCC)相关，后者是头颈癌的一种形式(D’Souza等，2007，N.Engl.J.Med.，356(19)：1944–56)。总之，HPV 16型是最有问题的基因型，与所有宫颈癌的至少一半和大多数(大约90％)的位于其它肛门与生殖器部位和口腔的HPV相关癌症有关(Peng等，2014，Cell Biosci.，4(1)：11)。
据估算2002年全世界约5.2％的新发生癌症(561,200新癌症病例)是由HPV导致的，使得HPV成为最重要的癌症感染性诱因之一(Parkin，2006，Int.J.Cancer 118(12)：3030–44)。宫颈癌是全球女性癌症中第二大致死性形式，每年诊断出近50万名妇女(Parkin等，2005，CA CANCER J Clin；55：74–108)。
在发达国家，已经建立了用于细胞学(Pap)筛选前期病变，高级别宫颈上皮内瘤形成(CIN)的有效国家计划。这种细胞学筛查通常伴随着通过锥形或环形电外科手术切除术(LEEP)消融浸润前期病变，使美国宫颈癌发病率降低约70-80％，从而目前每年约有5000例宫颈癌死亡(Roden等，2006，Nat Rev Cancer；6：753-763)。在宫颈癌已经确定的情况下，主要的治疗是根治性子宫切除术和外科减瘤，然后是放化疗。即使经历了这种具有显著不良副作用的常规疗法，晚期宫颈癌患者的预后仍然不佳。因此，已确定的宫颈癌的治疗仍然迫切需要特异性靶向癌细胞而使正常细胞不受影响的新型治疗剂。
另外，治疗性疫苗对于确保持续HPV感染患者中的病毒清除也是有价值的，后者提供了子宫颈癌(鳞状细胞癌和腺癌)的必要但不充分的原因(zur Hausen等，2002，NatureRev Cancer 2002；2：342-350；Schiffman等，1993，J Natl Cancer Inst，85：958-964；Walboomers等，1999，J Pathol，189：12-19)。致瘤HPV感染的分子检测最近已被许可作为细胞学筛查的辅助手段(Schiffman等，2007，Lancet，370：890-907)，且HPV感染阳性的患者可从治疗性疫苗中显著获益。
2.2HPV疫苗
预防致瘤HPV感染(Rard等，2006，Nat Rev Cancer，6：753-763)、HPV相关宫颈瘤和生殖器疣的两个预防性多价HPV L1病毒样颗粒(VLP)疫苗，即，和已被美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准。据信这些疫苗通过诱导中和抗体应答来预防HPV相关疾病，但是它们不改变先前已存在的HPV感染的过程(Hung等人，2008，Expert Opin Biol Ther.，8(4)：421-439)。因此，对于开发可用于治疗性消除慢性HPV感染以及用于治疗确定的HPV相关癌症的有效的免疫治疗剂仍然存在迫切的医疗需求。
HPV早期蛋白(E1-E7)在整个病毒生命周期中表达，仅存在于感染的细胞中，并参与调节疾病进展。已知蛋白E6和E7作为促进肿瘤生长和恶性转化的致瘤基因发挥作用。已经报道这些病毒致瘤蛋白的表达对维持宫颈癌细胞的转化表型是必需的(Goodwin等，2000，Proc Natl Acad Sci USA 97：12513–12518；Goodwin等，2001，Cell GrowthDiffer.，12：525–534)。
2.3表达感兴趣的基因的重组LCMV
长期以来一直追求表达感兴趣的外源基因的重组负链RNA病毒的产生。针对其他病毒已经公布了不同的策略(Garcia-Sastre等，1994，J Virol 68(10)：6254-6261；Percy等，1994，J Virol 68(7)：4486-4492；Flick和Hobom，1999，Virology 262(1)：93-103；Machado等，2003，Virology 313(1)：235-249)。在过去已经表明，有可能将另外的外源基因引入到双区段(segment)LCMV颗粒的基因组中(Emonet等，2009，PNAS，106(9)：3473-3478)。将两个感兴趣的外源基因插入到LCMV的双区段基因组中，产生具有两个S区段和一个L区段的三区段LCMV颗粒(r3LCMV)。在由Emonet等(2009)发表的三区段病毒中，NP和GP都保持在它们各自的S区段的天然位置，因此在其侧翼UTR中的天然启动子下表达。
2.4复制缺陷的沙粒病毒载体
已经报道了使用感染性的复制缺陷型沙粒病毒作为表达抗原的载体(参见Flatz等人，2010，Nat.Med.，16(3)：339-345；Flatz等人，2012，J.Virol.，86(15)，7760-7770)。这些感染性的复制缺陷型沙粒病毒可感染宿主细胞，即附着于宿主细胞并将其遗传物质释放到宿主细胞中。然而，由于编码病毒蛋白例如GP蛋白的开放阅读框(ORF)的缺失或功能性失活，所以它们是复制缺陷型的，即，沙粒病毒不能在非补充细胞中产生进一步的感染性后代颗粒。相反，ORF被感兴趣的抗原的核苷酸序列取代。在Flatz 2010中，作者使用感染性的复制缺陷型沙粒病毒作为载体来表达OVA(SIINFEKL表位)。在Flatz 2012中，作者使用复制缺陷型沙粒病毒作为载体来表达HIV/SIV Env。
本文提供了感染性的沙粒病毒载体，包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段，以治疗或预防肿瘤疾病，例如由致瘤病毒感染引起的肿瘤疾病。
3.发明概述
本文提供了具有编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体。在某些实施方式中，致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方式中，病毒载体是感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其可以是双区段的或三区段的沙粒病毒病毒载体。在某些实施方式中，病毒载体是三区段的沙粒病毒病毒载体，其可以是能够复制的(replication-competent)或复制缺陷的(replication-deficient)。从而，在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体。在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体。
本文还提供了在其基因组中具有ORF重排(rearrangement)的沙粒病毒。特别的，本文提供了被工程化以在与野生型位置不同的位置处携带沙粒病毒ORF和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列的沙粒病毒基因组区段。在某些实施方式中，致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
本文还提供了沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或包含编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列的沙粒病毒基因组区段，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒(HPV)、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。特别的，本文提供了包含编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原的核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段。
在某些实施方式中，如本文提供的沙粒病毒病毒载体是感染性的，即，能够进入宿主细胞或将其遗传材料注射入宿主细胞。在某些更具体的实施方式中，如本文提供的沙粒病毒病毒载体是感染性的，即，能够进入宿主细胞或将其遗传材料注射入宿主细胞，并伴随着其遗传信息在宿主细胞内的扩增和表达。在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体是一种感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组。在某些实施方式中，感染性的沙粒病毒病毒载体是能够复制的并能够在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒。
本文还提供了用于治疗肿瘤疾病(例如由致瘤病毒感染引起的肿瘤疾病，例如由人乳头瘤病毒(HPV)、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒引起的肿瘤疾病)的免疫疗法。在某些实施方式中，免疫疗法用于由HPV导致的肿瘤疾病的治疗和/或HPV感染的治疗。该免疫疗法包括对对象施用如本文所述的沙粒病毒病毒载体，包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体的药物组合物，包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体的免疫原性组合物或包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体的疫苗。
3.1致瘤病毒抗原和HPV抗原
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或本文提供的沙粒病毒基因组区段包含编码第一HPV抗原的第一核苷酸序列。
在某些实施方式中，第一核苷酸序列进一步编码第二HPV抗原。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段进一步包含编码第二HPV抗原的第二核苷酸序列。
在某些实施方式中，第一和/或第二核苷酸序列编码多个HPV抗原。在一个更具体的实施方式中，包含本文提供的第一核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多HPV抗原。在另一具体实施方式中，包含本文提供的第二核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多HPV抗原。在又一实施方式中，包含第一和第二核苷酸序列其中第一核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多HPV抗原，且第二核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多HPV抗原。
在某些实施方式中，第一抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
在某些实施方式中，第二抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
在某些实施方式中，第一和/或第二抗原是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82的抗原。
在某些实施方式中，第一抗原是HPV16抗原，且第二抗原是HPV18抗原。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段进一步编码2、3、4、5个或更多HPV抗原。在具体实施方式中，沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段编码一个、两个或三个HPV16抗原和一个、两个或三个HPV18抗原。在一个更具体的实施方式中，沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段编码两个HPV16抗原和两个HPV18抗原。在某些实施方式中，这些HPV抗原选自：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，第一抗原选自：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，第一和第二抗原选自：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段，
其中第一和第二抗原不相同。
在某些具体实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段进一步编码HPV蛋白E7融合HPV蛋白E6融合HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7，其中一个HPV蛋白E7来自毒株HPV16，另一个来自毒株HPV18，且一个HPV蛋白E6来自毒HPV 18株，另一个来自毒株HPV18。
在某些实施方式中，第一或第二抗原是在Rb结合位点具有突变的HPV蛋白E7。
在某些实施方式中，第一或第二抗原是在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV蛋白E7。
在某些实施方式中，第一或第二抗原是在锌结合域具有突变的HPV蛋白E6。
在某些实施方式中，第一或第二抗原是在锌指基序具有突变的HPV蛋白E6。
在某些实施方式中，第一和第二抗原彼此直接融合。
在某些实施方式中，第一和第二抗原彼此通过肽接头融合。
在某些实施方式中，第一和第二抗原通过自裂解肽彼此分隔。
在某些实施方式中，自裂解肽是猪捷申病毒-1 2A肽、Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段进一步包含编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的第三核苷酸序列。
在某些实施方式中，免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
·钙网蛋白(CRT)或其片段；
·泛素或其片段；
·粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；
·恒定链(CD74)或其抗原性片段；
·结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；
·单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；
·CD40配体或其抗原性片段；
·Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
在某些实施方式中，免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
·钙网蛋白(CRT)或其片段；
·泛素或其片段；和
·粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段。
在某些实施方式中，免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第一抗原或通过肽接头融合至第一抗原。
在某些实施方式中，免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第二抗原或通过肽接头融合至第二抗原。
在某些实施方式中，第一抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
在某些实施方式中，第二抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
在某些实施方式中，自裂解肽是猪捷申病毒-1 2A肽、Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段进一步包含编码人酪氨酸酶分泌信号、人生长激素分泌信号或组织纤溶酶原激活物信号序列的核苷酸序列。
在某些实施方式中，得到的融合蛋白与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，得到的融合蛋白与SEQ ID NO：34的氨基酸序列的融合蛋白的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，得到的融合蛋白与SEQ ID NO：36的氨基酸序列的融合蛋白的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，得到的融合蛋白与SEQ ID NO：38的氨基酸序列的融合蛋白的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段包含编码HPV16 E7/E6多肽的核酸序列，其与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段包含编码HPV16 E7/HPV18 E6多肽的核酸序列，其与SEQ ID NO：34的氨基酸序列的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段包含编码HPV18 E7/HPV16 E6多肽的核酸序列，其与SEQ ID NO：36的氨基酸序列的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段包含编码HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7多肽的核酸序列，其与SEQ ID NO：38的氨基酸序列的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
3.2复制缺陷的沙粒病毒
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体是一种感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体。
在某些实施方式中，本文提供了感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
在某些实施方式中，本文提供了感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。
在某些实施方式中，本文提供了感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组，其中一个沙粒病毒开放式阅读框至少部分去除并被取代为编码第一HPV抗原的第一核苷酸序列。
在某些实施方式中，本文提供了感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组，其中一个沙粒病毒开放式阅读框至少部分去除或功能性失活且其中沙粒病毒载体的基因组编码HPV16 E6或其抗原性片段、HPV16 E7或其抗原性片段、HPV18 E6或其抗原性片段和HPV18 E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，沙粒病毒载体编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白。在某些实施方式中，沙粒病毒载体编码HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白。在某些实施方式中，沙粒病毒载体编码HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白。在某些实施方式中，沙粒病毒载体编码HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白。
在某些实施方式中，HPV16 E6或其抗原性片段、HPV16 E7或其抗原性片段、HPV18E6或其抗原性片段和HPV18 E7或其抗原性片段由1、2、3或4个异源核苷酸序列编码。
在某些实施方式中，所述载体编码信号肽融合一种或多种HPV16 E6或其抗原性片段、HPV16 E7或其抗原性片段、HPV18 E6或其抗原性片段和HPV18 E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，所述载体编码两个或多个HPV16 E6或其抗原性片段、HPV16E7或其抗原性片段、HPV18 E6或其抗原性片段和HPV18 E7或其抗原性片段之间的肽接头。
在某些实施方式中，所述载体进一步包含编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的核苷酸序列。特别的，在某些实施方式中，沙粒病毒包含编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述载体编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原(HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6、HPV18 E7)或其抗原性片段和免疫调节肽、多肽或蛋白之间的肽接头。
在某些实施方式中，沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或Junin病毒。
在某些实施方式中，编码感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13株或MP株。
在某些实施方式中，病毒载体被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组，其中一个沙粒病毒开放式阅读框被功能性失活。
在某些实施方式中，本文提供的感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体包括病毒载体，其中编码沙粒病毒的糖蛋白(“GP”)、核蛋白(“NP”)、基质蛋白Z(“Z蛋白”)或RNA依赖性RNA聚合酶L(“L蛋白”)的病毒开放式阅读框(“ORF”)被去除或功能性失活。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除或功能性失活。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF中只有一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在一个更具体的实施方式中，编码GP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它实施方式中，编码NP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在一些实施方式中，编码Z蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它实施方式中，编码L蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，异源ORF编码报告蛋白。在一些实施方式中，异源ORF编码源自感染性的生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在其它实施方式中，异源ORF编码选自人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎表面抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核杆菌抗原和肿瘤相关抗原的抗原。
在某些实施方式中，感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的生长或传染性不受来自非沙粒病毒生物体的异源ORF的影响。
3.3沙粒病毒基因组区段
在某些实施方式中，本文提供了在其基因组中具有ORF重排的沙粒病毒。特别的，本文提供了被工程化以在与野生型位置不同的位置处携带沙粒病毒ORF和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的如本文所述的第一核苷酸序列的沙粒病毒基因组区段。在某些实施方式中，致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
在某些实施方式中，本文提供了被工程化以在与野生型位置不同的位置处携带沙粒病毒ORF和编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列的沙粒病毒基因组区段，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒(HPV)、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。特别的，在某些实施方式中，沙粒病毒基因组区段包含编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原的核苷酸序列3.1。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组区段选自：
(i)S区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ii)S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iii)S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iv)S区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(v)S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(vi)S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(vii)L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(viii)L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ix)L区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(x)L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(xi)L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
(xii)L区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
在某些实施方式中，沙粒病毒3’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的3’UTR。在某些实施方式中，沙粒病毒5’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的5’UTR。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组区段来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(“LCMV”)或Junin病毒。在具体实施方式中，沙粒病毒基因组区段来源于LCMV。LCMV可以是MP株、Armstrong株或Armstrong克隆13株。在具体实施方式中，沙粒病毒基因组区段来源于Junin病毒。Junin病毒可以是Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3株。
本文还提供了沙粒病毒病毒载体，其包含沙粒病毒基因组区段和第二沙粒病毒基因组区段，从而沙粒病毒病毒载体包含S区段和L区段。
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的。在一些实施方式中，沙粒病毒病毒载体是减毒的。在其它实施方式中，沙粒病毒病毒载体是感染性的但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(“LCMV”)或Junin病毒。在具体实施方式中，沙粒病毒病毒载体来源于LCMV。LCMV可以是MP株、Armstrong株或Armstrong克隆13株。在具体实施方式中，沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒。Junin病毒可以是Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3株。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段包括病毒载体，其中编码沙粒病毒糖蛋白(“GP”)、核蛋白(“NP”)、基质蛋白Z(“Z蛋白”)或RNA依赖性RNA聚合酶L(“L蛋白”)的病毒开放式阅读框(“ORF”)被去除或功能性失活。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除或功能性失活。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF中只有一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在一个更具体的实施方式中，编码GP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它实施方式中，编码NP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在一些实施方式中，编码Z蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它实施方式中，编码L蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，异源ORF编码报告蛋白。在一些实施方式中，异源ORF编码抗原源自感染性的生物体，肿瘤或过敏原。在其它实施方式中，异源ORF编码抗原选自人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎表面抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体的生长或传染性不受来自非沙粒病毒生物体的异源ORF的影响。
3.4三区段的沙粒病毒病毒载体
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体是具有编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列的三区段的沙粒病毒病毒载体。在某些实施方式中，致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体。在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体。本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体还包括编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒(HPV)、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。特别的，在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体包含编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原的核苷酸序列3.1。
在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体包含不重组进入能够复制的双区段的沙粒病毒颗粒的一个L区段和两个S区段或两个L区段和一个S区段。如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体具有改进的遗传稳定性和持续的转基因表达。从而，在某些实施方式中，在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因1(RAG1)并感染104PFU的三区段沙粒病毒病毒载体的小鼠中，持续感染70天后，三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒病毒载体。此外，在某些实施方式中，将两种沙粒病毒ORF整合到只有一个区段而非两个分隔区段的两个S区段或两个L区段的区段间重组会去除病毒启动子的活性。
在某些实施方式中，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含一个L区段和两个S区段和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，且其中在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因1(RAG1)并感染104PFU的三区段沙粒病毒病毒载体的小鼠中，持续感染70天后，三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒病毒载体。三区段的沙粒病毒病毒载体还包括编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒(HPV)、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。特别的，在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体包含编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含两个L区段和一个S区段和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，且其中在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因1(RAG1)并感染104PFU的三区段沙粒病毒病毒载体的小鼠中，持续感染70天后，三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒病毒载体。三区段的沙粒病毒病毒载体还包括编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒(HPV)、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。特别的，在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体包含编码如本文包括第3.1节所述的HPV抗原的核苷酸序列。
本文还提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含如本文所述的沙粒病毒基因组区段和如本文所述的第二沙粒病毒基因组区段，从而沙粒病毒病毒载体包含S区段和L区段。
在某些实施方式中，包含本文提供的一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体包括沙粒病毒病毒载体，其中两个S区段之一选自：
(i)S区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ii)S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iii)S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iv)S区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(v)S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
(vi)S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
在某些实施方式中，包含本文提供的两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体包括沙粒病毒病毒载体，其中两个L区段之一选自：
(xiii)L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(xiv)L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(xv)L区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(xvi)L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(xvii)L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
(xviii)L区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体3’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的3’UTR。在其它实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体5’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的5’UTR。
在某些实施方式中，两个S区段包含(i)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF；或(ii)一个或两个复制的沙粒病毒ORF；或(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个异源ORF和一个复制的沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，两个L区段包含(i)来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF；或(ii)一个或两个复制的沙粒病毒ORF；或(iii)来自沙粒病毒之外的生物体的一个异源ORF和一个复制的沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，异源ORF编码抗原源自感染性生物体、肿瘤或过敏原。在其它实施方式中，异源ORF编码抗原选自人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎表面抗原、水痘带状疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、结核杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，至少一个异源ORF编码荧光蛋白。在其它实施方式中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体包含全部4个沙粒病毒ORF。在一些实施方式中三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体缺失了4个沙粒病毒ORF的一个或多个。在其它实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体缺失了4个沙粒病毒ORF中的1个，其中三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
在一些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体缺失GP ORF。
在一个进一步的方面，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含一个L区段和两个S区段。在某些实施方式中，第一S区段被工程化以携带在沙粒病毒3’UTR控制下的位置编码GP的ORF和在沙粒病毒5’UTR控制下的位置编码第一HPV抗原的ORF。在一些实施方式中，第二S区段被工程化以携带在沙粒病毒3’UTR控制下的位置编码NP的ORF和在沙粒病毒5’UTR控制下的位置编码第二HPV抗原的ORF。
在又一方面，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含一个L区段和两个S区段。在某些实施方式中，第一S区段被工程化以携带在沙粒病毒5’UTR控制下的位置编码GP的ORF和在沙粒病毒3’UTR控制下的位置编码第一HPV抗原的ORF。在一些实施方式中，第二S区段被工程化以携带在沙粒病毒5’UTR控制下的位置编码NP的ORF和在沙粒病毒3’UTR控制下的位置编码第二HPV抗原的ORF。
在某些实施方式中，第一抗原是HPV16抗原，且第二抗原是HPV18抗原。
在某些实施方式中，本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体编码一个、两个或三个HPV16抗原和一个、两个或三个HPV18抗原。
在某些实施方式中，本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体编码两个HPV16抗原和两个HPV18抗原，其中抗原选自：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，第一和第二抗原选自：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段，
且其中第一和第二抗原不相同。
在某些实施方式中，第一抗原选自：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，HPV抗原是HPV16 E7/E6多肽，其与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，HPV抗原是HPV16 E7/HPV18 E6多肽，其与SEQ ID NO：34的氨基酸序列的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，HPV抗原是HPV18 E7/HPV16 E6多肽，其与SEQ ID NO：36的氨基酸序列的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，HPV抗原是HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7多肽，其与SEQ ID NO：38的氨基酸序列的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的。在一些实施方式中，沙粒病毒病毒载体是减毒的。在其它实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体与双区段的沙粒病毒颗粒具有相同趋性。在其它实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是复制缺陷型的。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(“LCMV”)或Junin病毒。在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体来源于LCMV。LCMV可以是MP株、Armstrong株或Armstrong克隆13株。在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒。Junin病毒可以是Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3株。
3.5产生病毒载体的核酸、宿主细胞和方法
在某些实施方式中，本文提供了分离的核酸，包括cDNA，其中核酸编码如上所述的病毒载体。在某些实施方式中，本文提供了包含所述核酸的表达载体。本文还提供了包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞。
在某些实施方式中，本文提供了如本文提供的沙粒病毒基因组区段的分离的cDNA。本文还提供了包含如本文提供的沙粒病毒基因组区段的cDNA的DNA表达载体。
本文还提供了包含本文提供的沙粒病毒基因组区段、沙粒病毒基因组区段的cDNA或包含沙粒病毒基因组区段的cDNA的载体的宿主细胞。
在某些实施方式中，本文提供了用于产生感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的方法，其包含：
(i)向宿主细胞中转染如上所述的核酸；
(ii)在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
(iii)收获感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体；
其中宿主细胞表达被缺失或功能性失活基因组区段的开放式阅读框。
本文还提供了产生沙粒病毒基因组区段的方法。在某些实施方式中，该方法包括转录沙粒病毒基因组区段的cDNA。
本文还提供了产生沙粒病毒病毒载体的方法。在某些实施方式中产生沙粒病毒病毒载体的方法包括：
(i)向宿主细胞中转染沙粒病毒基因组区段的cDNA；
(ii)向宿主细胞中转染包含第二沙粒病毒基因组区段cDNA的质粒；
(iii)在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
(iv)收获沙粒病毒病毒载体。
在某些实施方式中，L区段和S区段的转录使用双向启动子。
在某些实施方式中，该方法进一步包括向宿主细胞中转染一个或多个编码沙粒病毒聚合酶的核酸。在更具体的实施方式中，聚合酶是L蛋白。在其它实施方式中，该方法进一步包括向宿主细胞中转染一个或多个编码NP的核酸。
在某些实施方式中，L区段和S区段的转录分别处于选自下述的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
本文还提供了产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法。在某些实施方式中产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法包括：
(i)将一个或更多的一个L区段和两个S区段的cDNA转染入宿主细胞；
(ii)在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
(iii)收获沙粒病毒病毒载体。
本文还提供了产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法。在某些实施方式中，产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法包括：
(xix)将一个或更多的两个L区段和一个S区段的cDNA转染入宿主细胞；
(xx)在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
(xxi)收获沙粒病毒病毒载体。
在某些实施方式中，一个L区段和两个S区段的转录使用双向启动子。在一些实施方式中，两个L区段和一个S区段的转录使用双向启动子。
在某些实施方式中，该方法进一步包括向宿主细胞中转染一个或多个编码沙粒病毒聚合酶的核酸。在更具体的实施方式中，聚合酶是L蛋白。在其它实施方式中，该方法进一步包括向宿主细胞中转染一个或多个编码NP蛋白的核酸。
在某些实施方式中，一个L区段和两个S区段的转录分别处于选自下述的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
在某些实施方式中，两个L区段和一个S区段的转录分别处于选自下述的启动子的控制下：
(i)RNA聚合酶I启动子；
(ii)RNA聚合酶II启动子；和
(iii)T7启动子。
3.6药物组合物，疫苗和治疗方法
在某些实施方式中，本文提供了包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在某些实施方式中，本文提供了包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体的免疫原性组合物。
在某些实施方式中，本文提供了包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体的疫苗。
本文还提供了治疗或预防患者中人乳头瘤病毒感染的方法。在某些实施方式中，该方法包括对患者施用如本文所述的沙粒病毒病毒载体，如本文所述的药物组合物，如本文所述的免疫原性组合物或如本文所述的疫苗。
在某些实施方式中，该方法导致患者中已存在的HPV滴度的降低。
在某些实施方式中，该方法诱导患者中的抗原特异性CD8+T细胞的应答。
在某些实施方式中，HPV感染是有症状的。
在某些实施方式中，HPV感染是无症状的。
在某些实施方式中，该方法降低HPV感染的严重程度或频率或预防HPV感染的临床表现。
在某些实施方式中，临床表现选自：宫颈癌，肛门癌，外阴癌，阴道癌，阴茎癌、HPV阳性口咽癌(OSCC)、普通疣、跖疣、甲下或月经疣、生殖器疣、尖锐湿疣或性病疣、呼吸道乳头状瘤病和疣状表皮发育不良。
在某些实施方式中，本文提供了治疗或预防患者人乳头瘤病毒感染的方法，其中所述方法包括对患者施用如本文所述的第一病毒载体、如本文所述的第一药物组合物、如本文所述的第一免疫原性组合物或如本文所述的第一疫苗和对患者施用如本文所述的第二病毒载体、如本文所述的第二药物组合物、如本文所述的第二免疫原性组合物或如本文所述的第二疫苗。
在某些实施方式中，本文提供了诱导患者中免疫应答的方法。该方法可以包括对患者施用如本文所述的第一沙粒病毒病毒载体，和在一段时间后对患者施用不同的如本文所述的第二沙粒病毒病毒载体。
在某些实施方式中，第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗和第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗是同源的(例如，源自相同病毒)。
在某些实施方式中，第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗和第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗是异源的(例如，源自不同病毒)。
在某些实施方式中，第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗来源于LCMV，第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗来源于Junin病毒。
在某些实施方式中，第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗来源于Junin病毒，第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗来源于LCMV。
在某些实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体表达相同抗原。在某些实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体表达不同抗原。
3.7习惯用法和缩写
4.序列表描述
SEQ ID NO：1淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒区段S，全序列。基因组区段是RNA，SEQID NO：1中的序列显示为DNA；然而，将SEQ ID NO：1中的所有胸腺嘧啶(“T”)替换为尿嘧啶(“U”)即提供了RNA序列。
SEQ ID NO：2淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13区段S，全序列(GenBank：DQ361065.2)。基因组区段是RNA，SEQ ID NO：2中的序列显示为DNA；然而，将SEQ ID NO：2中的所有胸腺嘧啶(“T”)替换为尿嘧啶(“U”)即提供了RNA序列。
SEQ ID NO：3淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13区段L，全序列(GenBank：DQ361066.1)。基因组区段是RNA，SEQ ID NO：3中的序列显示为DNA；然而，将SEQ ID NO：3中的所有胸腺嘧啶(“T”)替换为尿嘧啶(“U”)即提供了RNA序列。
SEQ ID NO：4淋巴细胞性脉络丛脑膜炎株MP区段L，全序列。基因组区段是RNA，SEQID NO：4中的序列显示为DNA；然而，将SEQ ID NO：4中的所有胸腺嘧啶(“T”)替换为尿嘧啶(“U”)即提供了RNA序列。
SEQ ID NO：5淋巴细胞性脉络丛脑膜炎株MP区段S，全序列。基因组区段是RNA，SEQID NO：5中的序列显示为DNA；然而，将SEQ ID NO：5中的所有胸腺嘧啶(“T”)替换为尿嘧啶(“U”)即提供了RNA序列。
SEQ ID NO：6LCMV的MP株的NP蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO：7LCMV的MP株的GP蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO：8LCMV的MP株的L蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO：9LCMV的MP株的Z蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO：10在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的氨基酸序列，连接至小鼠钙网蛋白。
SEQ ID NO：12在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的氨基酸序列，连接至小鼠泛素。
SEQ ID NO：13在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的氨基酸序列，与小鼠GM-CSF共表达，由编码自裂解肽(2A肽)的核苷酸序列分隔。
SEQ ID NO：14编码在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15编码在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列，连接至小鼠钙网蛋白。
SEQ ID NO：16编码在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列，连接至小鼠泛素。
SEQ ID NO：17编码在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列，与小鼠GM-CSF共表达，由编码自裂解肽(2A肽)的核苷酸序列分隔。
SEQ ID NO：18GSG。
SEQ ID NO：19Junin病毒Candid#1L区段。
SEQ ID NO：20Junin病毒Candid#1S区段。
SEQ ID NO：21HK1-E7E6-GMCSF的核苷酸序列
SEQ ID NO：22E7E6-GMCSF抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：23HK1-E7E6-VP22的核苷酸序列
SEQ ID NO：24E7E6-VP22抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：25HK1-E7E6-CD40L的核苷酸序列
SEQ ID NO：26E7E6-CD40L抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：27HK1-Flt3L-E7E6的核苷酸序列
SEQ ID NO：28Flt3L-E7E6抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：29HK1-Flt3L-E7E6shuffle的核苷酸序列
SEQ ID NO：30Flt3L-E7E6shuffle抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：31HK1-li-E7E6的核苷酸序列
SEQ ID NO：32li-E7E6抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：33编码具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6融合蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35编码具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV18E7-HPV16E6融合蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO：36具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV18E7-HPV16E6融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：37编码具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6_HPV16E6-HPV18E7融合蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6_HPV16E6-HPV18E7融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39表达HPV16 E7E6融合蛋白：S区段1(包含GP)的核苷酸序列的三区段的基于r3LCMVart的载体。
SEQ ID NO：40表达HPV16 E7E6融合蛋白：S区段2(包含GP)的三区段的基于r3LCMVart的载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41表达HPV16 E7E6融合蛋白：L区段的三区段的基于r3LCMVart的载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42表达HPV16 E7E6融合蛋白：S区段1(包含NP)的三区段的基于r3JUNVart的载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43表达HPV16 E7E6融合蛋白：S区段2(包含GP)的三区段的基于r3JUNVart的载体的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44表达HPV16 E7E6融合蛋白：L区段的三区段的基于r3JUNVart的载体的核苷酸序列。
5.附图简述
图1A：野生型沙粒病毒基因组包含一个短的(1；～3.4kb)和一个大的(2；～7.2kb)RNA区段。短区段携带编码核蛋白(3)和糖蛋白(4)的开放式阅读框。大区段编码RNA依赖性RNA聚合酶L(5)和基质蛋白Z(6)。野生型沙粒病毒可以通过缺失糖蛋白基因和插入非糖蛋白基因的选择抗原(7)变为复制缺陷的疫苗载体，针对所述选择抗原(7)诱导免疫应答。
图1B：双区段和三区段的LCMV的基因组组成(organization)的图示。野生型LCMV的双区段的基因组包含一个编码GP和NP的S区段和一个编码Z蛋白和L蛋白的L区段(i)。两个区段侧翼是各自的5’和3’UTR。重组三区段的LCMV(r3LCMV)的基因组包含一个L和两个S区段，并具有能将感兴趣的基因(此处为GFP)插入每个S区段的一个位点。r3LCMV-GFP天然的(nat)具有位于其天然位置的所有病毒基因(ii)，而r3LCMV-GFP人工的(art)中的GP ORF被人工并排至3’UTR并受3’UTR控制进行表达(iii)。
图2A和2B：产生了不同载体构建体用于HPV抗原和组合HPV抗原的表达，单独或组合多种免疫调节性肽、多肽或蛋白。CRT：钙网蛋白；Ub：泛素；GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；li：恒定链；.S1：来自人酪氨酸酶的分泌信号；VP22：单纯性疱疹病毒1蛋白VP22；S2：来自人生长激素的分泌信号；CD40L：CD40配体；tpa：组织纤溶酶原激活物信号序列，Flt3L：Fms-相关酪氨酸激酶3配体；sh：根据Kim等，Nat.Commun.2014的重排(shuffled)的E7E6序列；VSVG：疱疹性口炎病毒G糖蛋白信号序列。
图3：为了分析载体复制，使用表达LCMV GP的悬浮293细胞进行生长曲线。以3x105个细胞/ml的细胞密度播种相应的细胞，并以0.001的MOI以单独的载体(HK1-E7E6，HK1-E7E6-CRT，HK1-E7E6-Ub和HK1-E7E6-GMCSF)感染。使用表达绿色荧光蛋白(HK1-GFP)的相应rLCMV载体作为对照。每24小时抽取样品并通过焦点形成单位分析进行分析。与HK1-GFP相比，所有测试的载体展现出相似的生长动力学和峰值滴度，表明单独的E7E6转基因不比载体报道基因GFP更大程度地干扰载体复制。
图4：表达LCMV GP的HEK293细胞用单独的构建体(HK1-E7E6(组1)，HK1-E7E6-GMCSF(组2)，HK1-E7E6-CRT(组3)和HK1-E7E6-Ub(第4组))以0.001的感染倍数(MOI)感染或用HK1-GFP对照载体(组5)感染。感染后96小时分析细胞。在SDS凝胶上分离蛋白，转移到硝酸纤维素膜上，用抗HPV E7抗体和适当的第二抗体检测HPV E7蛋白的表达。根据科学网关蛋白质分子量计算器(Science Gateway Protein Molecular Weight Calculator)计算转基因的期望大小(HK1-E7E6：～30kDa；HK1-mE7E6-GMCSF：～48kDa/30kDa；HK1-mE7E6-CRT：～78kDa；HK1-mE7E6-Ub：～38kDa)。对于所有测试的构建体都检测到由红色箭头指示的特异性条带，然而，观察到显著不同的表达水平，HK1-E7E6和HK1-E7E6-Ub-感染的细胞表现出最低的抗原水平。
图5：在第0、41和102天，通过静脉内注射2-8x105FFU(初免：2x105，加强：8x105)的HK1-E7E6来免疫C57BL/6小鼠(每组n＝5)三次。随后在实验的第10、38、48、73和109天通过来自血液的四聚体染色(H-2Db/HPV16E7 49-57(RAHYNIVTF))分析E7特异性CD8+T细胞应答。四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示为占总CD8+T细胞池(pool)的百分比。符号显示五只小鼠的平均值+/-SEM。
图6：通过静脉内注射1x104FFU的HK1-E7E6，HK1-E7E6-CRT，HK1-E7E6-Ub和HK1-E7E6-GMCSF免疫一次C57BL/6小鼠(每组n＝5)。原初小鼠用作对照。随后在免疫后第9天通过四聚体染色(H-2Db/HPV16 E7 49-57(RAHYNIVTF))分析E7特异性CD8+T细胞应答。四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示为占总CD8+T细胞池的百分比。
图7：在第0天和第28天，通过肌肉内注射1x105FFU的HK1-E7E6(组1和2)、HK1-GFP(组3)或HK1-E7E6-GMCSF(组5)或1x107PFU的Ad5-E7E6(组4)免疫C57BL/6小鼠(每组n＝5)。对照小鼠(组6)在第0天和第28天接受两次0.9％NaCl注射。最后一次接种后7天，分离来自免疫小鼠的脾细胞并用HPV16 E6aa50-57肽或E7aa49-57肽(均为1μg/ml)在GolgiPlug(1μl/ml)存在下于37℃过夜进行刺激。将细胞用缀合有PE的抗小鼠CD8a抗体染色，洗涤，透化并用CytoFix/CytoPerm固定。随后，洗涤细胞并用FITC缀合的抗小鼠IFN-γ抗体进行细胞内染色。洗涤后，用FACSCalibur获得细胞并用CellQuest软件分析。(A)代表性的流式细胞图像。(B)流式细胞数据汇总。
图8：在第0天和第10天，使用不同剂量(103，3x104，106FFU)的HK1-E7E6-GMCSF(1)，HK1-E7E6-VP22(2)，HK1-E7E6-CD40L(3)，HK1-Flt3L-E7E6(4)，HK1-Flt3L-E7E6shuffle(5)，HK1-li-E7E6(6)或制剂缓冲液(模拟感染)(7)通过静脉内(iv)或肌肉内(im)注射C57BL/6小鼠(如所示)。随后在实验的第8和18天通过四聚体染色(H-2Db/HPV16 E7 49-57(RAHYNIVTF))分析E7特异性CD8+T细胞应答。四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示为占总CD8+T细胞池的百分比。
图9A和9B：在第0天和第28天，通过肌内注射1x105FFU的HK1-E7E6(组1和2)，HK1-GFP(组3)或HK1--E7E6-GMCSF(组5)或1x107PFU的Ad5-E7E6(组4)免疫两次C57BL/6小鼠(每组n＝5)。对照小鼠(组6)在第0天和第28天接受两次0.9％NaCl注射。在第55天，来自第1、3、4、5和6组的小鼠用相同的方案进一步加强。在第35天，皮下注射5×104个TC-1肿瘤细胞。每周两次心跳监测肿瘤生长。(A)无肿瘤动物的数量(B)用数字卡尺测量的肿瘤大小。用以下公式计算肿瘤体积：[最大直径×(垂直直径)2]×3.14/6。
图10：免疫接种后TC-1荷瘤小鼠的外周血中E7特异性CD8+T细胞的分析。在第1天向5-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)注射1×105个TC-1肿瘤细胞。然后在第4天和14天对荷瘤小鼠通过眼眶后途径静脉内接种PBS(G1)，106FFU HK1-E7E6(G2)，106FFU HK1-E7E6-GMCSF(G3)，106FFU HK1-E7E6-CD40L(G4)，105FFU r3LCMV-E7E6(G5)。在第13和23天，通过尾静脉取样血液收获PBMC，通过四聚体染色(载有HPV16 E7aa49-57肽的H-2Db四聚体)分析E7特异性CD8+T细胞应答。A.第13天PBMC的HPV16E7四聚体染色的代表性流式细胞图像。B.第13天外周血中HPV16 E7四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。C.第23天PBMC的HPV16 E7四聚体染色的代表性流式细胞图像。D.第23天的外周血中HPV16 E7四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。
图11：免疫接种后TC-1荷瘤小鼠的外周血中NP特异性CD8+T细胞的分析。在第1天向5-8周龄雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)注射1×105个TC-1肿瘤细胞。然后在第4天和14天对荷瘤小鼠通过后眼眶途径静脉内接种PBS(G1)，106FFU HK1-E7E6(G2)，106FFU HK1-E7E6-GMCSF(G3)，106FFU HK1-E7E6-CD40L(G4)，105FFU r3LCMV-E7E6(G5)。在第13天和第23天，通过尾静脉取样血液收获PBMC，通过四聚体染色(负载LCMV NP肽的H-2Db四聚体)分析LCMV NP特异性CD8+T细胞应答。A.第13天PBMC的LCMV NP四聚体染色的代表性流式细胞图像。B.第13天外周血中LCMV NP四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。C.第23天PBMC的LCMV NP四聚体染色的代表性流式细胞图像。D.第23天外周血中LCMV NP四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。
图12A-C：在第1天向5-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)注射1×105个TC-1肿瘤细胞。然后在第4天和14天对荷瘤小鼠通过后眼眶途径静脉内接种PBS(G1)，106FFUHK1-E7E6(G2)，106FFU HK1-E7E6-GMCSF(G3)，106FFU HK1-E7E6-CD40L(G4)，105FFUr3LCMV-E7E6(G5)。图12A和12B显示了在指定日期用数字卡尺测量的肿瘤大小。用以下公式计算肿瘤体积：[最大直径×(垂直直径)2]×3.14/6。图12C显示接种疫苗后小鼠的存活率。
图13：接种后TC-1荷瘤小鼠的外周血中E7特异性CD8+T细胞的分析。在第1天向5-8周龄雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)注射1×105个TC-1肿瘤细胞。然后在第4天和14天对荷瘤小鼠通过后眼眶途径静脉内接种PBS(G1)，1x107PFU的Ad5-E7E6(G2)，106FFU HK1-E7E6(G3)。在第14天和第24天，通过尾静脉取样血液收获PBMC，通过四聚体染色(载有HPV16E7aa49-57肽的H-2Db四聚体)分析E7特异性CD8+T细胞应答。A.第14天PBMC的HPV16 E7四聚体染色的代表性流式细胞图像。B.第14天外周血中HPV16E7四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。C.第24天PBMC的HPV16 E7四聚体染色的代表性流式细胞图像。D.第24天外周血中HPV16E7四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。
图14：接种后TC-1荷瘤小鼠的外周血中NP特异性CD8+T细胞的分析。在第1天向5-8周龄雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)注射1×105个TC-1肿瘤细胞。然后在第4天和14天对荷瘤小鼠通过后眼眶途径静脉内接种PBS(G1)，1x107PFU的Ad5-E7E6(G2)和106FFU HK1-E7E6(G3)。在第14和24天，通过尾静脉取样血液收获PBMC，通过四聚体染色(载有LCMVNP肽的H-2Db四聚体)分析NP特异性CD8+T细胞应答。A.第14天PBMC的LCMV NP四聚体染色的代表性流式细胞图像。B.第14天外周血中LCMV NP四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。C.第43天PBMC的LCMV NP四聚体染色的代表性流式细胞图像。D.第24天外周血中LCMV NP四聚体(+)CD8(+)T细胞的总结。
图15A和15B：在第1天向5-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)注射1x105个TC-1肿瘤细胞。然后在第4天和14天对荷瘤小鼠通过后眼眶途径静脉内接种PBS(G1)，1x107PFU的Ad5-E7E6(G2)和106FFU HK1-E7E6(G3)。图15A显示了在指定日期用数字卡尺测量的肿瘤大小。用以下公式计算肿瘤体积：[最大直径×(垂直直径)2]×3.14/6。图15B显示接种疫苗后小鼠的存活率。
图16：在第0天通过静脉内注射105FFU的HK1-E7E6或rJUNV-E7E6免疫C57BL/6小鼠。随后在免疫后第8天通过四聚体染色((H-2Db/HPV16 E7 49-57(RAHYNIVTF))分析E7特异性CD8+T细胞应答。四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示为占总CD8+T细胞池的百分比。符号显示个体小鼠。
图17：在第0天通过静脉内注射105FFU的HK1-E7E6或rJUNV-E7E6免疫C57BL/6小鼠(n＝4每组)。随后在第35天通过相同途径对小鼠静脉注射105FFU的同源或异源载体进行加强。在实验的第8、28和42天通过四聚体染色(H-2Db/HPV16 E7 49-57(RAHYNIVTF))分析E7特异性CD8+T细胞应答。显示了接种小鼠血液中抗原特异性CD8+T细胞的百分比(A)以及绝对计数(B)。符号代表每组四只小鼠的平均值+/-SEM。(C)通过多重学生t检验进行第42天(加强后第7天)频率的比较。
图18：在实验的第0天和第35天用105FFU的表达E7E6(r3LCMV-E7E6)的复制载体或者用105FFU的表达E7E6(HK1-E7E6)的非复制载体静脉内免疫C57BL/6小鼠。使用负载E7表位的MHC I类四聚体组合抗CD8a抗体对表位特异性CD8+T细胞进行染色。计算外周血中CD8+T细胞区域内E7-四聚体结合细胞的频率。
图19：在第0天，通过静脉内注射8.5x104FFU的r3LCMV-E7E6或1.5x105FFU的类似的基于Junin Candid#1病毒(r3JUNV-E7E6)的能够复制的载体免疫接种C57BL/6小鼠(每组4只动物)。随后在第35天将小鼠用如图所示的同源或异源载体进行静脉内加强。使用负载E7表位的MHC I类四聚体组合抗CD8a抗体进行四聚体染色分析表位特异性CD8+T细胞应答。计算外周血中CD8+T细胞区域内的E7-四聚体结合细胞的频率(A)和每微升外周血中E7四聚体结合CD8+T细胞的绝对数量(B)。符号表示每组4只小鼠和时间点的平均值+/-SEM。
6.发明详述
本文提供了用于预防或治疗与肿瘤疾病相关的疾病和病况(例如癌症)的方法和组合物。本文提供了用于治疗或预防与肿瘤疾病相关的疾病和病况(例如癌症)的使用疫苗方法和组合物。特别的，本文提供了沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，用于作为疫苗来预防或治疗肿瘤相关病毒导致的疾病和病况。该疫苗可以是表达肿瘤相关病毒抗原的感染性的复制缺陷型沙粒病毒，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段。
本文提供了用于预防或治疗肿瘤疾病(例如癌症)的方法和组合物。本文提供了用于治疗或预防肿瘤疾病(例如癌症)的使用疫苗方法和组合物。特别的，本文提供了感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段，用于作为疫苗来预防或治疗肿瘤疾病，例如癌症。更具体的，这些疫苗可以用于预防或治疗由致瘤病毒例如人乳头瘤病毒(HPV)感染导致的癌症。该疫苗可以是表达致瘤病毒抗原例如HPV的感染性的复制缺陷型沙粒病毒，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段。
在某些具体实施方式中，本文提供了遗传修饰的沙粒病毒，其中沙粒病毒：
i)是感染性的；
ii)在非补足细胞(即，不表达复制缺陷的沙粒病毒中缺失的功能性并导致其为复制缺陷的的细胞)中不能形成感染性的后代病毒；
iii)不嫩复制其基因组和表达其遗传信息；且
iv)编码致瘤病毒抗原，例如HPV病毒或其片段，单独或组合免疫调节性肽、多肽或蛋白。
在某些具体实施方式中，用于所提供的方法和组合物的沙粒病毒是基因工程化的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或是基因工程化的Junin病毒。在某些具体实施方式中，LCMV或Junin病毒通过开放式阅读框(ORF)的功能失活进行遗传修饰(例如，缺失)，从而得到的病毒在非补足细胞(即，不能反过来提供功能性失活ORF的细胞)中不能产生进一步感染性的后代病毒颗粒。得到的感染性的复制缺陷LCMV或Junin病毒可以被用作载体以表达致瘤病毒抗原，例如HPV。用于本文提供的组合物和方法的沙粒病毒载体的产生和增殖详述于第6.1，6.2，6.3和6.4节。
沙粒本文提供的病毒载体被基因工程化以包含异源核苷酸序列，其表达异源肽或蛋白。在某些实施方式中，异源序列编码肿瘤抗原。在某些实施方式中，异源序列编码致瘤病毒抗原。在某些具体实施方式中，异源序列编码HPV抗原。在某些具体实施方式中，异源序列编码一个或多个致瘤病毒的2、3、4个或更多抗原。在某些实施方式中，用于本方法的沙粒病毒载体还编码免疫调节性肽或蛋白。在某些实施方式中，沙粒病毒载体还编码信号肽或蛋白。不受理论的限制，该信号肽利于其中表达抗原和/或免疫调节性蛋白或肽的细胞外部的蛋白(例如，HPV抗原和/或免疫调节性蛋白或肽)的运输。用于本文提供的组合物和方法的异源序列详述于第6.5节。
包含沙粒本文提供的病毒载体的药物组合物、免疫原性组合物和疫苗描述于第6.6节。
本文提供了使用沙粒病毒载体进行预防或治疗肿瘤疾病(例如，非恶性赘生物或癌症)的方法。特别的，本文提供了预防或治疗对象中癌症的方法，包括对对象施用表达HPV抗原或其片段的一种或多种沙粒病毒。在具体实施方式中，本文提供了预防或治疗对象中癌症的方法，包括对对象施用单独的或组合一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白、接头或信号序列的表达HPV抗原或其片段。在某些实施方式中，用如本文所述的表达HPV抗原或其片段的沙粒病毒进行免疫能提供细胞毒性T细胞应答。在某些实施方式中，可以进行第二或第三免疫用于加强效果。在某些实施方式中，第二或第三免疫使用同源载体。在某些实施方式中，第二或第三免疫使用异源载体。在某些实施方式中，第一免疫使用旧世界沙粒病毒载体，第二免疫使用旧世界沙粒病毒载体。在某些实施方式中，第一免疫使用旧世界沙粒病毒载体，第二免疫使用新世界沙粒病毒载体。在某些实施方式中，第一免疫使用新世界沙粒病毒载体，第二免疫使用旧世界沙粒病毒载体。在某些实施方式中，第一免疫使用新世界沙粒病毒载体，第二免疫使用新世界沙粒病毒载体。使用如本文所述的沙粒病毒的肿瘤疾病治疗和/或预防方法的更详细描述见第Error！Reference source not found.节。
6.1复制缺陷型沙粒病毒载体
如本文所述的感染性的复制缺陷型病毒可以如国际专利申请公开号WO 2009/083210(申请号PCT/EP2008/010994)中描述的进行生产，后者在此全文引入作为参考。
用于本文提供的方法和组合物的沙粒病毒可以是旧世界病毒，例如Lass病毒，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，Mobal病毒，Mopei病毒或Ippy病毒；或新世界病毒，例如Amapari病毒，Flexal病毒，Guanarito病毒，Junin病毒，Latino病毒，Machupo病毒，Oliveros病毒，Paran病毒，Pichinde病毒，Pirital病毒，Sabi病毒，Tacaribe病毒，Tamiami病毒，Bear Canyon病毒或Whitewater Arroyo病毒。
如本文所述的遗传修饰的沙粒病毒是感染性的，即，其能够附着于宿主细胞并将其遗传材料释放入宿主细胞。如本文所述的遗传修饰的沙粒病毒是复制缺陷的，即，沙粒病毒在非补足细胞中不能产生进一步的感染性后代颗粒。特别的，沙粒病毒的基因组是修饰的(例如，通过缺失或功能失活开放式阅读框或产生感染性的颗粒所需的病毒基因组的另一遗传元件)，从而携带修饰的基因组的病毒不再能够在非补足细胞中产生感染性的后代病毒。非补足细胞是不提供功能的细胞，所述功能已从复制缺陷的沙粒病毒中通过修饰其基因组进行了消除。例如，如果编码GP蛋白的开放式阅读框被缺失或功能性失活，则非补足细胞不提供GP蛋白。然而，如本文提供的遗传修饰的沙粒病毒能够在补足细胞中产生感染性的后代病毒。非补足细胞是不提供功能的细胞，所述功能已从复制缺陷的沙粒病毒中通过修饰其基因组进行了消除。例如，如果编码GP蛋白的开放式阅读框被缺失或功能性失活，则补足细胞即提供GP蛋白。补足功能的表达(例如，GP蛋白)可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行(例如，瞬时或稳定转染，使用合适的表达载体)。
如本文所述的遗传修饰的沙粒病毒能够在被该病毒感染的细胞中扩增并表达其遗传信息。特别的，如本文所述的，遗传修饰的沙粒病毒能够在补足细胞或非补足细胞中扩增并表达其遗传信息。如本文提供的遗传修饰的感染性的复制缺陷型沙粒病毒包含编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列。该序列及其排列描述于第6.5节。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白(GP)基因的开放式阅读框(ORF)被缺失以产生用于本文提供的组合物和方法的复制缺陷的沙粒病毒。异源核苷酸序列(第6.5节)被插入缺失ORF的位置处。从而，在某些实施方式中，本文提供的遗传修饰的沙粒病毒病毒载体包含基因组区段，其a)具有存在于野生型形式的基因组区段的开放式阅读框的缺失或功能失活；且b)编码一个或多个致瘤病毒抗原(例如，HPV E6、HPV E7和/或HPV E6/E7融合蛋白)和/或免疫调节性肽、多肽或蛋白。
通常，沙粒病毒病毒载体可以通过如描述用于LCMV的标准反向遗传技术进行重组表达(Flatz等，2006,，Proc Natl Acad Sci USA 103：4663-4668；Sanchez等，2006，Virology 350：370；Ortiz-Riano等，2013 J Gen Virol.94：1175-88)。如本文所述的感染性的复制缺陷型病毒载体可以如国际专利申请公开号WO 2009/083210(申请号PCT/EP2008/010994)的描述进行生产，其全文引入作为参考。拯救病毒的基因组如第6.5节所述进行修饰。这些修饰可以为：i)去除或功能性失活4个沙粒病毒开放式阅读框(糖蛋白(GP)；核蛋白(NP)；基质蛋白Z；RNA依赖性RNA聚合酶L)中的一个或多个(例如，2、3或4个)，以防止在非补足细胞中形成感染性的颗粒，但仍允许沙粒病毒载体感染的宿主细胞中的基因表达；和ii)可以引入编码一个或多个异源抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列或接头的核酸。
由于沙粒病毒载体中的一种或多种病毒基因的去除或功能性失活(这里，糖蛋白GP的缺失将被视为一个例子)，沙粒病毒载体可以在反向(in trans)提供缺失的病毒基因(例如本实施例中的GP)的细胞中产生并扩增。这种补足细胞系(以下称为C细胞)是通过用一种或多种用于表达感兴趣的病毒基因的质粒(互补质粒，称为C-质粒)转染哺乳动物细胞系例如BHK-21，HEK293，VERO或其它(此处以HEK293为例))来产生的。C-质粒在适于在哺乳动物细胞中表达的一个或多个表达盒(例如哺乳动物聚合酶II启动子如具有聚腺苷酸化信号的CMV或EF1α启动子)控制下表达要产生的沙粒病毒载体中缺失的病毒基因。此外，互补质粒在哺乳动物细胞中适于基因表达的表达盒(例如如上所述的聚合酶II表达盒)的控制下具有哺乳动物选择标记，例如嘌呤霉素抗性，或者病毒基因转录物伴随着由内部核糖体进入位点，如脑心肌炎病毒的，伴随着哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，质粒另外具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
为了产生C细胞，可以使用的细胞(例如BHK-21，HEK293，MC57G)保持在培养中，并使用任何常用策略例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔转染C-质粒。几天后，以滴定浓度加入合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，使用蛋白质印迹或流式细胞术用针对感兴趣的病毒蛋白的抗体鉴定高表达的C细胞克隆。作为使用稳定转染的C细胞的替代方法，正常细胞的瞬时转染可在下文将使用C细胞的每个步骤中补充缺失的病毒基因。另外，可以使用辅助病毒来反向提供缺失的功能。在其他某些实施方式中，本领域已知的其他方法可用于产生稳定的细胞系，例如慢病毒转导。
为了产生沙粒病毒载体，可以使用的质粒可以是两种类型：i)两种质粒，称为TF-质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子，载体来源于例如来自本发明实施例中的LCMV或Junin病毒的NP和L蛋白；和ii)称为GS-质粒的质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒载体基因组区段，例如具有设计修饰的区段。TF-质粒在哺乳动物细胞中适于蛋白表达的表达盒的控制下表达相应的沙粒病毒载体的NP和L蛋白质，典型地例如哺乳动物聚合酶II启动子如CMV或EF1α启动子，其中之一优先地与聚腺苷酸化信号组合。从GS-质粒转录载体的小(S)和大(L)基因组区段。典型地，可以使用聚合酶I驱动的表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶(T7-)驱动的表达盒，后者优选地用3'-末端核酶处理初级转录物以产生正确的末端。在使用基于T7的系统的情况下，必须通过或者在恢复过程中包括额外的与TF-质粒类似构建的提供T7的表达质粒，或者构建C-细胞以另外以稳定的方式表达T7来表达T7，来提供T7在C细胞中的表达。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。
为了回收沙粒病毒载体，可以使用以下程序。第一天：用两种TF-质粒加两种GS-质粒的混合物转染C-细胞，后者典型的在M6-孔板中铺满80％。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。为此可以利用任何常用的策略，如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。在另一个实施方式中，C细胞，例如P5A3细胞也可以悬浮培养，并以确定的细胞密度转染。
3-5天后：收获培养物上清液(沙粒病毒载体制剂)，等分并在4℃、-20℃或-80℃保存，取决于使用前应存储多长时间的沙粒病毒载体。然后通过对C细胞进行免疫聚集测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。在另一个实施方式中，3-5天后，将转染的细胞和上清液转移到更大的培养瓶中。3天后，收获培养物上清液(沙粒病毒载体制剂)，等分并在4℃，-20℃或-80℃保存，取决于在使用前应该保存多长时间的沙粒病毒载体。然后，通过对C细胞进行免疫聚集测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。
一旦由cDNA产生，本文提供的感染性复制缺陷型沙粒病毒可以在补足细胞中增殖。补足细胞是提供通过修饰其基因组而从感染性复制缺陷型沙粒病毒中消除的功能的细胞(例如，如果编码GP蛋白的开放阅读框被缺失或功能性失活，补充细胞即提供GP蛋白)。
本文提供了用于在细胞培养物中表达异源抗原的组合物和方法，其中细胞培养物被感染有表达异源序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒。当用于在培养细胞中表达异源序列时，可以使用以下两种方法：
i)将感兴趣的细胞类型用本文所述的沙粒病毒载体制备物以感染倍数(MOI)为一或多个(例如2、3或4)进行感染，导致已经感染不久之后在所有细胞中产生异源序列。
ii)或者，可以使用较低的MOI，并且可以针对其病毒驱动的异源序列表达水平选择单个细胞克隆。随后，由于沙粒病毒载体的非细胞溶解性质，个体克隆可以无限扩增。不考虑方法，根据所产生的异源序列的性质，随后可以从培养物上清液或从细胞本身收集(和纯化)异源序列。然而，本文提供的组合物和方法不限于这两种策略，可以考虑使用感染性复制缺陷型沙粒病毒作为载体驱动异源序列表达的其他方式。
或者，可以使用由三种质粒组成的拯救系统：(1)第一质粒在转染的细胞中通过聚合酶II转录并随后翻译来表达蛋白NP；(2)第二质粒通过聚合酶I的转录产生LCMV基因组的(负链)L-片段，并通过聚合酶II以聚合酶I的相反方向从相同模板转录产生L蛋白；(3)第三质粒通过聚合酶I的转录产生LCMV基因组的S区段(编码抗原编码序列，而非LCMV糖蛋白)。使用每种质粒3μg用于C细胞的电穿孔，然后是将细胞接种在6孔板中并在37℃温育。温育后，将来自转染物的细胞和上清液与新鲜接种的C细胞合并，在感染后的限定时间点从细胞和碎片中收集和清除(clear)载体。一旦载体已经产生，可以将编码致瘤病毒抗原和/或免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸(参见第6.5节)插入质粒中，从中通过本领域技术人员已知的任何技术转录感染性的复制缺陷的载体的基因组区段。
由于沙粒病毒载体中的一种或多种病毒基因的去除或功能性失活(这里用糖蛋白GP的缺失做为一个例子)，沙粒病毒载体可以在反向提供缺失或功能性失活的病毒基因(例如，GP)的细胞中产生和扩增。所得到的病毒本身具有感染性，但是由于缺乏缺失的或功能性失活的病毒基因(例如GP)，其不能在非补足细胞中产生进一步的感染性后代颗粒。补足细胞可通过稳定转染，瞬时转染或通过表达缺失功能的辅助病毒感染来提供所缺失的功能。
在某些实施方式中，补足细胞提供了已经从沙粒病毒载体基因组中缺失或功能性失活的病毒基因。在具体的实施方式中，补足细胞提供来自病毒株的病毒基因，该病毒株与用于产生沙粒病毒载体基因组的病毒株相同。在另一个实施方式中，补足细胞提供来自与用于产生沙粒病毒载体基因组的病毒株不同的病毒株的病毒基因。例如，补足细胞中提供的病毒基因是从LCMV的MP菌株获得的，并且编码具有SEQ ID NO：6、7、8或9的氨基酸序列的蛋白。
在具体的实施方式中，补足细胞提供LCMV的MP菌株的GP，并且沙粒病毒载体包含本文所述的人HPV抗原的ORF来代替编码GP蛋白的ORF。在甚至更具体的实施方式中，补足细胞提供LCMV的MP菌株的GP，并且所述沙粒病毒载体获自LCMV克隆13，并且包含如本文所述的人HPV抗原的ORF来代替编码GP蛋白的ORF。在一个更具体的实施方式中，GP蛋白与SEQ IDNO：7的氨基酸序列的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
6.2在非天然位置具有开放式阅读框的沙粒病毒
本文提供了具有其ORF重排的沙粒病毒。在某些实施方式中，这种沙粒病毒具有复制能力和感染性。在某些实施方式中，这样的沙粒病毒是复制缺陷型和感染性的。本文提供了这种沙粒病毒的基因组序列。在一个方面，本文提供了沙粒病毒基因组区段，其中沙粒病毒基因组区段被改造为携带在不同于野外分离的病毒中发现的相应基因的位置的位置处的沙粒病毒ORF。在一个实施方式中，沙粒病毒病毒载体是LCMV。另一方面，本文提供的沙粒病毒基因组区段包含编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列。6.5节描述了这些序列及其排列。
野生型沙粒病毒基因组区段和ORF是本领域已知的。特别的，沙粒病毒基因组包含S区段和L区段。S区段携带编码GP和NP的ORF。L区段编码L蛋白和Z蛋白。两个区段侧翼均有对应的5’和3’UTRs。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组区段可以被工程化以在与野生型位置不同的位置处携带两种或多种沙粒病毒ORF。在其它实施方式中，沙粒病毒基因组区段可以被工程化以在与野生型位置不同的位置处携带2个沙粒病毒ORF或3个沙粒病毒ORF或4个沙粒病毒ORF。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白(“GP”)、核蛋白(“NP”)、基质蛋白Z(“Z蛋白”)或RNA依赖性RNA聚合酶L(“L蛋白”)的开放式阅读框(ORF)被去除(例如缺失)以产生用于本文提供的组合物和方法的复制缺陷的沙粒病毒。可以插入异源核苷酸序列(第6.5节)代替缺失的沙粒病毒ORF。从而，在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒基因组区段包含基因组区段，其a)具有存在于野生型形式的基因组区段的开放式阅读框的缺失或功能失活；和b)编码一个或多个致瘤病毒(例如，HPV E6、HPV E7和/或HPV E6/E7融合蛋白)抗原和/或免疫调节性肽、多肽或蛋白。
在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒基因组区段可以是：
(i)沙粒病毒S区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ii)沙粒病毒S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iii)沙粒病毒S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iv)沙粒病毒S区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(v)沙粒病毒S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(vi)沙粒病毒S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(vii)沙粒病毒L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(viii)沙粒病毒L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ix)沙粒病毒L区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(x)沙粒病毒L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(xi)沙粒病毒L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
(xii)沙粒病毒L区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
在某些实施方式中，位于如本文所述的沙粒病毒基因组区段非天然位置的ORF可以处于沙粒病毒3’UTR或沙粒病毒5’UTR的控制下。在更具体的实施方式中，沙粒病毒3’UTR是沙粒病毒S区段的3’UTR。在另一具体实施方式中，沙粒病毒3’UTR是沙粒病毒L区段的3’UTR。在更具体的实施方式中，沙粒病毒5’UTR是沙粒病毒S区段的5’UTR。在其它具体实施方式中，5’UTR是L区段的5’UTR。
在其它实施方式中，位于如本文所述的沙粒病毒基因组区段非天然位置的ORF可以处于沙粒病毒保守末端序列元件(5’和3’端19-20-nt区域)的控制下(参见例如，Perez&de la Torre，2003，J Virol.77(2)：1184–1194)。
在某些实施方式中，位于沙粒病毒基因组区段非天然位置的ORF可以处于5’UTR启动子元件的控制下(参见例如，Albarino等，2011，J Virol.，85(8)：4020-4)。在另一实施方式中，位于沙粒病毒基因组区段非天然位置的ORF可以处于3’UTR启动子元件的控制下(参见例如，Albarino等，2011，J Virol.，85(8)：4020-4)。在更具体的实施方式中，5’UTR启动子元件是S区段或L区段的5’UTR启动子元件。在另一具体实施方式中，3’UTR的启动子元件是S区段或L区段的3’UTR启动子元件。
在某些实施方式中，位于沙粒病毒基因组区段非天然位置的ORF可以处于截短的沙粒病毒3’UTR或截短的沙粒病毒5’UTR的控制下(参见例如，Perez&de la Torre，2003，JVirol.77(2)：1184–1194；Albarino等，2011，J Virol.，85(8)：4020-4)。在更具体的实施方式中，截短的3’UTR是沙粒病毒S区段或L区段的3’UTR。在更具体的实施方式中，截短的5’UTR是沙粒病毒S区段或L区段的5’UTR。
本文还提供了沙粒病毒病毒载体，其包含被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的第一基因组区段和第二沙粒病毒基因组区段，从而沙粒病毒病毒载体包含S区段和L区段。在具体实施方式中，位于与野生型ORF位点不同的位置的ORF是一个沙粒病毒ORF。
在某些具体实施方式中，沙粒病毒病毒载体可以包含全部4个沙粒病毒ORF的完整补充。在具体实施方式中，第二沙粒病毒基因组区段被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF。在另一具体实施方式中，第二沙粒病毒基因组区段可以是野生型基因组区段(即，包含野生型位置中的区段上的ORF)。
在某些实施方式中，第一沙粒病毒基因组区段是L区段，第二沙粒病毒基因组区段是S区段。在其它实施方式中，第一沙粒病毒基因组区段是S区段，第二沙粒病毒基因组区段是L区段。
包含在与野生型ORF位点不同的位置具有ORF的基因组区段和第二基因组区段的沙粒病毒病毒载体的非限制性示例见于表1。
表1
沙粒病毒病毒载体
*位置1处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置2处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下；位置3处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置4处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下。
位置1 位置2 位置3 位置4
GP NP L Z
GP Z L NP
GP Z NP L
GP L NP Z
GP L Z NP
NP GP L Z
NP GP Z L
NP L GP Z
NP L Z GP
NP Z GP L
NP Z L GP
Z GP L NP
Z GP NP L
Z NP GP L
Z NP L GP
Z L NP GP
Z L GP NP
L NP GP Z
L NP Z GP
L GP Z NP
L GP NP Z
L Z NP GP
L Z GP NP
在某些实施方式中，本文提供了可适用作疫苗的沙粒病毒基因组区段和在免疫接种和例如感染和癌症的治疗或预防中使用所述沙粒病毒基因组区段的方法。例如，在某些实施方式中，本文提供的具有编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列的沙粒病毒基因组区段可以被用作疫苗用于本文提供的方法或作为本文提供的组合物的组分。使用如本文所述的沙粒病毒基因组区段的方法的更详细描述见第6.7节。
在某些实施方式中，本文提供了可适用作药物组合物的沙粒病毒基因组区段和在免疫接种和例如感染和癌症的治疗或预防中使用所述沙粒病毒基因组区段的方法。例如，在某些实施方式中，本文提供的具有编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列的沙粒病毒基因组区段可以被用于本文提供的方法或作为本文提供的组合物的组分。使用如本文所述的沙粒病毒基因组区段的方法的更详细描述见第6.7节。
本文还提供了沙粒病毒基因组区段的cDNA，其被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF。在更具体的实施方式中，本文提供了沙粒病毒基因组cDNA或一系列cDNA，如表1中所示。
在某些实施方式中，被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒基因组区段的cDNA是DNA表达载体的一部分或被整合入DNA表达载体中。在具体实施方式中，被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒基因组区段的cDNA是DNA表达载体的一部分或被整合入DNA表达载体中，其有利于产生如本文所述的沙粒病毒基因组区段。在另一实施方式中，如本文所述的cDNA可以被引入质粒中。对cDNA或核酸和表达系统更详细的描述见第6.8节，产生cDNA的技术是分子生物学和DNA操作和生产的常规和惯用技术。可以使用本领域技术人员已知的任何克隆技术。这些技术是本领域技术人员熟知的并可以从实验室手册中获得，例如，Sambrook和Russell，Molecular Cloning：Alaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory N.Y.(2001)。
在某些实施方式中，被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒基因组区段的cDNA被导入(例如，转染)宿主细胞。从而，在本文提供的一些实施方式中，宿主细胞包含被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒基因组区段的cDNA(即，基因组区段cDNA)。在其它实施方式中，如本文所述的cDNA是DNA表达载体的一部分或可被整合入DNA表达载体中并导入宿主细胞。从而，在一些实施方式中，本文提供了包含如本文所述的被引入载体中的cDNA的宿主细胞。在其它实施方式中，如本文所述的沙粒病毒基因组区段被导入宿主细胞。
在某些实施方式中，本文描述了产生沙粒病毒基因组区段的方法，其中所述方法包括转录沙粒病毒基因组区段的cDNA。在某些实施方式中，病毒聚合酶蛋白可以在沙粒病毒基因组区段的体外或体内转录过程中存在。
在某些实施方式中，使用双向启动子进行沙粒病毒基因组区段的转录。在其它实施方式中，使用双向表达盒进行沙粒病毒基因组区段的转录(参见例如Ortiz-等，2013，J Gen Virol.，94(Pt 6)：1175–1188)。在更具体的实施方式中，双向表达盒包含聚合酶I和聚合酶II启动子，其分别从相对侧阅读至插入的沙粒病毒基因组区段的两个端点。在更具体的实施方式中，具有pol-I和pol-II启动子的双向表达盒从相对侧阅读至L区段和S区段。
在其它实施方式中，如本文所述的沙粒病毒基因组区段的cDNA的转录包含启动子。启动子的具体实例包括RNA聚合酶I启动子，RNA聚合酶II启动子，RNA聚合酶III启动子，T7启动子，SP6启动子或T3启动子。
在某些实施方式中，产生沙粒病毒基因组区段的方法可进一步包括向宿主细胞中导入沙粒病毒基因组区段的cDNA。在某些实施方式中，产生沙粒病毒基因组区段的方法可进一步包括向宿主细胞中导入沙粒病毒基因组区段的cDNA，其中宿主细胞表达用于产生沙粒病毒基因组区段的所有其它元件；和从宿主细胞上清液中纯化沙粒病毒基因组区段。该方法是本领域技术人员熟知的。
本文提供了感染本文提供的核酸、载体和组合物的细胞的细胞系、培养物和方法。如本文所述的核酸、载体系统和细胞系的更详细描述见第6.8节。
在某些实施方式中，如本文所述的沙粒病毒病毒载体导致感染性的和能够复制的沙粒病毒病毒载体。在具体实施方式中，如本文所述的沙粒病毒病毒载体是减毒的。在一个具体实施方式中，沙粒病毒病毒载体是减毒的从而病毒至少部分保持传播的能力并能在体内复制，但只能产生导致非致病性的亚临床水平的感染的低病毒负载。该减毒病毒可以被用作免疫原性组合物。本文提供了包含在非天然位点具有ORF的沙粒病毒的免疫原性组合物，如第6.6节所述。
在某些实施方式中，本文提供了可适用作疫苗的沙粒病毒病毒载体和在免疫接种和例如感染和癌症的治疗或预防中使用所述沙粒病毒病毒载体的方法。例如，在某些实施方式中，本文提供的具有编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体可以被用于本文提供的方法或作为本文提供的组合物的组分。使用如本文所述的沙粒病毒病毒载体的方法的更详细描述见第6.7节。
在某些实施方式中，本文提供了可适用作药物组合物的沙粒病毒病毒载体和在免疫接种和例如感染和癌症的治疗或预防中使用所述沙粒病毒病毒载体的方法。例如，在某些实施方式中，本文提供的具有编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列的沙粒病毒病毒载体可以被用于本文提供的方法或作为本文提供的组合物的组分。使用如本文所述的沙粒病毒病毒载体的方法的更详细描述见第6.7节。
(a)在非天然位置具有开放式阅读框的复制缺陷的沙粒病毒颗粒
在某些实施方式中，本文提供了沙粒病毒病毒载体，其中(i)ORF位于与野生型ORF位点不同的位置；和(ii)编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的ORF已被去除(例如，缺失)或功能性失活，从而得到的病毒不能产生进一步感染性的后代病毒颗粒。包含其中一个或多个ORF被缺失或功能性失活的遗传修饰的基因组的沙粒病毒病毒载体可以在补足细胞中产生(即，表达被缺失或功能性失活的沙粒病毒ORF的细胞)。得到的沙粒病毒病毒载体的遗传材料可以通过感染宿主细胞被转移至宿主细胞，其中遗传材料可以表达和扩增。此外，如本文所述的遗传修饰的沙粒病毒病毒载体基因组可以编码来自不同于沙粒病毒病毒载体的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在另一实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少1种ORF、至少2种ORF、至少3种ORF或至少4种ORF可以被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF，包括如第6.5节中所述的异源ORF6.5。在具体实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的4种ORF中只有一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒病毒载体的生物体的异源ORF，包括如第6.5节中所述的异源ORF。在更具体的实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的GP的ORF被去除。在另一具体实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的NP的ORF被去除。在更具体的实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的Z蛋白的ORF被去除。在又一具体实施方式中，编码L蛋白的ORF被去除。
从而，在某些实施方式中，本文提供的沙粒病毒病毒载体包含基因组区段，其(i)被工程化以在非天然位置携带沙粒病毒ORF；(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被去除；(iii)被去除的ORF被替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF，包括如第6.5节中所述的异源ORF。
在某些实施方式中，异源ORF为8-100个核苷酸长、15-100个核苷酸长、25-100个核苷酸长、50-200个核苷酸长、50-400个核苷酸长、200-500个核苷酸长或400-600个核苷酸长、500-800个核苷酸长。在其它实施方式中，异源ORF为750-900个核苷酸长、800-1000个核苷酸长、850-1000个核苷酸长、900-1200个核苷酸长、1000-1200个核苷酸长、1000-1500个核苷酸或1200-1500个核苷酸长、1500-2000个核苷酸长、1700-2000个核苷酸长、2000-2300个核苷酸长、2200-2500个核苷酸长、2500-3000个核苷酸长、3000-3200个核苷酸长、3000-3500个核苷酸长、3200-3600个核苷酸长、3300-3800个核苷酸长、4000个核苷酸至4400个核苷酸长、4200-4700个核苷酸长、4800-5000个核苷酸长、5000-5200个核苷酸长、5200-5500个核苷酸长、5500-5800个核苷酸长、5800-6000个核苷酸长、6000-6400个核苷酸长、6200-6800个核苷酸长、6600-7000个核苷酸长、7000-7200个核苷酸长、7200-7500个核苷酸长或7500个核苷酸长或更长。在一些实施方式中，异源ORF编码5-10个氨基酸长、10-25个氨基酸长、25-50个氨基酸长、50-100个氨基酸长、100-150个氨基酸长、150-200个氨基酸长、200-250个氨基酸长、250-300个氨基酸长、300-400个氨基酸长、400-500个氨基酸长、500-750个氨基酸长、750-1000个氨基酸长、1000-1250个氨基酸长、1250-1500个氨基酸长、1500-1750个氨基酸长、1750-2000个氨基酸长、2000-2500个氨基酸长或多于2500或更多个氨基酸长的肽或多肽。在一些实施方式中，异源ORF编码不超过2500个氨基酸长的多肽。在具体实施方式中，异源ORF不含终止密码子。在某些实施方式中，异源ORF是密码子优化的。在某些实施方式中，核苷酸的组成、核苷酸对的组成或两者可以是优化的。此种优化的技术是本领域已知的并可用于优化异源ORF。
沙粒病毒基因组区段中可包括来自任何非沙粒病毒的生物体的异源ORF。在一个实施方式中，异源ORF编码报告蛋白。报告蛋白更详细地描述于6.5节。在另一实施方式中，异源ORF编码感染性病原体的抗原或与能够引发免疫应答的任何疾病相关的抗原。在具体实施方式中，抗原来源于感染性的生物体、肿瘤(即，癌症)或过敏原。异源ORF更详细地描述于6.5节。
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体的生长和感染性不受来自非沙粒病毒生物体的异源ORF的影响。
本领与技术人员已知的技术可被用于生产沙粒病毒病毒载体，其包含工程化以在与野生型位置不同的位置携带沙粒病毒ORF的沙粒病毒基因组区段。例如，反向遗传技术可用于产生该沙粒病毒病毒载体。在其它实施方式中，复制缺陷的沙粒病毒病毒载体(即，工程化以在与野生型位置不同的位置携带沙粒病毒ORF的沙粒病毒基因组区段，其中编码GP、NP、Z蛋白、L蛋白的ORF被缺失)可以在补足细胞中产生。
在某些实施方式中，按照本申请使用的沙粒病毒基因组区段或沙粒病毒病毒载体可以是旧世界病毒，例如，LCMV。
在某些实施方式中，本申请涉及如本文所述的适于用作疫苗的沙粒病毒病毒载体和使用该沙粒病毒病毒载体的免疫接种和疗或预防例如感染或癌症的方法。使用如本文所述的沙粒病毒病毒载体的方法的更详细描述见第6.7节。
在某些实施方式中，本文提供了试剂盒，其在一个或多个容器中包含一种或多种如本文所述的cDNA。在具体实施方式中，试剂盒在一个或两个或多个容器中包含如本文所述的沙粒病毒基因组区段或沙粒病毒病毒载体。试剂盒可进一步包含一个或多个如下组分：适于拯救沙粒病毒基因组区段或沙粒病毒病毒载体的宿主细胞、适于将质粒cDNA转染至宿主细胞的试剂、辅助病毒、编码病毒蛋白的质粒和/或一种或多种特异性针对修饰的沙粒病毒基因组区段或沙粒病毒病毒载体或其cDNA的引物。
在某些实施方式中，本申请涉及如本文所述的适于用作药物组合物的沙粒病毒病毒载体和使用该沙粒病毒病毒载体的免疫接种和治疗或预防例如感染和癌症的方法。使用如本文所述的沙粒病毒病毒载体的方法的更详细描述见第6.7节。
6.3三区段的沙粒病毒病毒载体
本文提供了具有其ORF重排的三区段的沙粒病毒病毒载体。
在一方面，本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体包含编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列。该序列及其重排描述于6.5节。
在另一方面，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含一个L区段和两个S区段或两个L区段和一个S区段。在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体不重组入能够复制的双区段的沙粒病毒颗粒。在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体在与野生型ORF位点不同的位置包含ORF。在又一具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体包含所有4种沙粒病毒ORF。从而，在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是能够复制的和感染性的。在其它实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体缺少4种沙粒病毒ORF之一。从而，在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的，但也是复制缺陷的(即，不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代)。
在某些实施方式中，编码如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于沙粒病毒3’UTR或沙粒病毒5’UTR的控制下。在更具体的实施方式中，三区段的沙粒病毒3’UTR是沙粒病毒S区段的3’UTR。在另一具体实施方式中，三区段的沙粒病毒3’UTR是三区段的沙粒病毒L区段的3’UTR。在更具体的实施方式中，三区段的沙粒病毒5’UTR是沙粒病毒S区段的5’UTR。在其它具体实施方式中，5’UTR是L区段的5’UTR。
在其它实施方式中，编码如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于沙粒病毒保守末端序列元件的控制下(5’-和3’端19-20-nt区域)(参见例如，Perez&de la Torre，2003，J Virol.77(2)：1184–1194)。
在某些实施方式中，编码三区段的沙粒病毒病毒载体的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于5’UTR启动子元件的控制下(参见例如，Albarino等，2011，J Virol.，85(8)：4020-4)。在另一实施方式中，编码三区段的沙粒病毒病毒载体的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于3’UTR启动子元件的控制下(参见例如，Albarino等，2011，J Virol.，85(8)：4020-4)。在更具体的实施方式中，5’UTR的启动子元件是S区段或L区段的5’UTR启动子元件。在另一具体实施方式中，3’UTR的启动子元件是S区段或L区段的3’UTR启动子元件。
在某些实施方式中，编码三区段的沙粒病毒病毒载体的GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF可以处于截短的沙粒病毒3’UTR或截短的沙粒病毒5’UTR的控制下(参见例如，Perez&dela Torre，2003，J Virol.77(2)：1184–1194；Albarino等，2011，J Virol.，85(8)：4020-4)。在更具体的实施方式中，截短的3’UTR是沙粒病毒S区段的3’UTR或L区段。在更具体的实施方式中，截短的5’UTR是沙粒病毒S区段的5’UTR或L区段。
本文还提供了三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA。在更具体的实施方式中，本文提供了编码三区段的沙粒病毒病毒载体的DNA核苷酸序列或一系列DNA核苷酸序列，如表2或表3所示。
在某些实施方式中，编码三区段的沙粒病毒基因组的核酸是一个或多个DNA表达载体的一部分或被整合入一个或多个DNA表达载体中。在具体实施方式中，编码三区段的沙粒病毒病毒载体的基因组的核酸是一个或多个DNA表达载体的一部分或被整合入一个或多个DNA表达载体中，其有利于产生如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体。在另一实施方式中，如本文所述的cDNA可以被引入质粒中。对cDNA和表达系统更详细的描述见第6.8节，产生cDNA的技术是分子生物学和DNA操作和生产的常规和惯用技术。可以使用本领域技术人员已知的任何克隆技术。这些技术是本领域技术人员熟知的并可以从实验室手册中获得，例如，Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory N.Y.(2001)。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒的cDNA被导入(例如，转染)宿主细胞。从而，在本文提供的一些实施方式中，宿主细胞包含三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA(即，三区段的沙粒病毒病毒载体的基因组区段的cDNA)。在其它实施方式中，如本文所述的cDNA是DNA表达载体的一部分或可被整合入DNA表达载体中并导入宿主细胞。从而，在一些实施方式中，本文提供了包含如本文所述的整合入载体的cDNA的宿主细胞。在其它实施方式中，如本文所述的三区段的沙粒病毒基因组区段(即，L区段和/或S区段或多区段)被导入宿主细胞。
在某些实施方式中，本文描述了产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法，其中所述方法包括转录三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA。在某些实施方式中，病毒聚合酶蛋白可以在三区段的沙粒病毒病毒载体的体外或体内转录过程中存在。在某些实施方式中，沙粒病毒基因组区段的转录使用双向启动子。
在其它实施方式中，沙粒病毒基因组区段的转录使用双向表达盒(参见例如Ortiz-等，2013，J Gen Virol.，94(Pt 6)：1175–1188)。在更具体的实施方式中，双向表达盒包含聚合酶I和聚合酶II启动子，其分别从相对侧阅读至插入的沙粒病毒基因组区段的两个端点。
在其它实施方式中，如本文所述的沙粒病毒基因组区段的cDNA的转录包括启动子。启动子的具体示例包括RNA聚合酶I启动子，RNA聚合酶II启动子，RNA聚合酶III启动子，T7启动子，SP6启动子或T3启动子。
在某些实施方式中，产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法可进一步包括向宿主细胞中导入三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA。在某些实施方式中，产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法可进一步包括向宿主细胞中导入三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA，其中宿主细胞表达用于产生三区段的沙粒病毒病毒载体的所有其它元件；和从宿主细胞上清液中纯化三区段的沙粒病毒病毒载体。该方法是本领域技术人员熟知的。
本文提供了感染本文提供的核酸、载体和组合物的细胞的细胞系、培养物和方法。如本文所述的核酸、载体系统和细胞系的更详细描述见第6.8节。
在某些实施方式中，如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体导致感染性的和能够复制的沙粒病毒病毒载体。在具体实施方式中，如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体是减毒的。在一个具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是减毒的从而病毒至少部分保持传播的能力并能在体内复制，但只能产生导致非致病性的亚临床水平的感染的低病毒负载。该减毒病毒可以被用作免疫原性组合物。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体与双区段的沙粒病毒颗粒具有相同趋性。
本文还提供了试剂盒，其在一个或多个容器中包含一种或多种如本文所述的cDNA。在具体实施方式中，试剂盒在一个或两个或多个容器中包含如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体。试剂盒可进一步包含一个或多个如下组分：适于拯救三区段的沙粒病毒病毒载体的宿主细胞、适于将质粒cDNA转染至宿主细胞的试剂、辅助病毒、编码病毒蛋白的质粒和/或一种或多种特异性针对修饰的沙粒病毒基因组区段或沙粒病毒病毒载体或其编码核酸的引物。
本文还提供了免疫原性组合物，其包含如6.6节所述的三区段的沙粒病毒病毒载体。
在某些实施方式中，本文提供了可以适于用作疫苗的三区段的沙粒病毒病毒载体，和使用该沙粒病毒病毒载体的免疫接种和治疗或预防例如感染和癌症的方法。例如，在某些实施方式中，本文提供的具有其ORF重排和编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列的三区段的沙粒病毒病毒载体可以被用作疫苗用于本文提供的方法或作为本文提供的组合物的组分。使用如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体的方法的更详细描述见第6.7节。
在某些实施方式中，本文提供了可以适于用作药物组合物的三区段的沙粒病毒病毒载体和使用该沙粒病毒病毒载体的免疫接种和疗或预防例如感染或癌症的方法。例如，在某些实施方式中，本文提供的具有其ORF重排和编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列的三区段的沙粒病毒病毒载体可以被用于本文提供的方法或作为本文提供的组合物的组分。使用如本文所述的沙粒病毒病毒载体的方法的更详细描述见第6.7节。
(a)包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体
在一方面，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其包含一个L区段和两个S区段。在某些实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒载体。在具体实施方式中，在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因(RAG1)并已感染104PFU三区段的沙粒病毒病毒载体的小鼠中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖在至少10天、至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天或至少100天持续感染后不产生能够复制的双区段的病毒颗粒。在其它实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖在至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或至少50代后不产生能够复制的双区段的病毒载体。
在一方面，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体进一步包含编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列。该序列及其排列描述于6.5节。
在其对应野生型位置处具有所有病毒基因的三区段的沙粒病毒病毒载体是本领域已知的(例如，Emonet等，2011J.Virol.，85(4)：1473；Popkin等，2011，J.Virol，85(15)：7928)。特别的，三区段的沙粒病毒基因组包含一个L区段和两个S区段，其中异源ORF(第6.5节)被插入每个S区段上的一个位置。更具体的，一个S区段分别编码GP和HPV抗原，另一个S区段分别编码HPV抗原和NP。L区段编码L蛋白和Z蛋白。所有区段侧翼都有对应的5’和3’UTR。
在某些实施方式中，将两种沙粒病毒ORF整合到只有一个区段而非两个分隔区段的两个S区段的区段间重组导致非功能性启动子(即，如下结构的基因组区段：5’UTR-----------5’UTR或3’UTR------------3’UTR)，其中每个形成基因组一端的UTR是同一基因组另一端的反转重复序列。
在某些实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体被工程化以在与ORF野生型位置不同的位置处携带沙粒病毒ORF。在其它实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体被工程化以在与野生型位置不同的位置携带2个沙粒病毒ORF或3个沙粒病毒ORF或4个沙粒病毒ORF或5个沙粒病毒ORF或6个沙粒病毒ORF。在具体实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体包含所有4个沙粒病毒ORF的全部补充(complement)。从而，在一些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体。在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体的两个S区段被工程化以在与野生型位置不同的位置携带其ORF之一。在更具体的实施方式中，两个S区段包含S区段ORF的全部补充。在某些具体实施方式中，L区段被工程化以在与野生型位置不同的位置携带ORF，或L区段可以是野生型基因组区段。
在某些实施方式中，两个S区段之一可以是：
(i)沙粒病毒S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ii)沙粒病毒S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iii)沙粒病毒S区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iv)沙粒病毒S区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(v)沙粒病毒S区段，其中编码L的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
(vi)沙粒病毒S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
在某些实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体可包含双重ORF(即，两个野生型S区段ORF例如GP或NP)。在具体实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体可包含一个双重ORF(例如，(GP，GP))或两个双重ORF(例如，(GP，GP)和(NP，NP))。
下表2A描述了包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的基因组的组织，其中三区段的沙粒病毒基因组的两个S区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒载体并消除沙粒病毒启动子活性(即，得到的重组S区段由2个3’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成)。
表2A
包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体位置1处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置2处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下；位置3处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置4处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下；位置5处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置6处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF。
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
*ORF GP *ORF NP Z L
*ORF NP *ORF GP Z L
*ORF NP *ORF GP L Z
*ORF NP *ORF Z L GP
*ORF NP Z GP *ORF Z
*ORF NP Z GP Z *ORF
*ORF NP *ORF L Z GP
*ORF L *ORF NP Z GP
*ORF L Z NP *ORF GP
*ORF L *ORF GP Z NP
*ORF L Z GP *ORF NP
*ORF Z L NP *ORF GP
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
*ORF Z *ORF GP L NP
*ORF Z L GP *ORF NP
L GP *ORF NP *ORF Z
L GP *ORF *ORF Z NP
L GP *ORF Z *ORF NP
L *ORF Z GP *ORF NP
L GP *ORF NP *ORF Z
L GP *ORF Z *ORF NP
L GP Z NP *ORF *ORF
L GP Z NP *ORF *ORF
L *ORF Z NP *ORF GP
L NP *ORF Z *ORF GP
L NP Z *ORF GP *ORF
L *ORF Z *ORF GP NP
L NP Z GP *ORF *ORF
L NP *ORF Z *ORF GP
L *ORF Z NP *ORF GP
L Z *ORF GP *ORF NP
L Z *ORF NP *ORF GP
Z GP *ORF NP *ORF L
Z GP *ORF *ORF L NP
Z GP *ORF L *ORF NP
Z *ORF L GP *ORF NP
Z GP *ORF NP *ORF L
Z GP *ORF L *ORF NP
Z GP L NP *ORF *ORF
Z GP L NP *ORF *ORF
Z *ORF L NP *ORF GP
Z NP *ORF *ORF L GP
Z NP *ORF GP *ORF L
Z NP *ORF *ORF L GP
Z NP *ORF L *ORF GP
Z NP L GP *ORF *ORF
Z *ORF L GP *ORF NP
Z NP *ORF GP *ORF L
Z NP *ORF L *ORF GP
Z *ORF L NP *ORF GP
Z L *ORF GP *ORF NP
在某些实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR。在具体实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒S区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒S区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。例如，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒基因组的两个S区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒载体并消除沙粒病毒启动子活性(即，得到的重组S区段由2个5’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成)。
在某些实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体中的S区段和L区段的区段间重组回复了功能性区段，其中两个病毒基因仅在一个区段而非两个分隔的区段上。在其它实施方式中，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体中的S区段和L区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒颗粒。
下表2B描述了包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的基因组的组织，其中三区段的沙粒病毒基因组中的S区段和L区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒颗粒并消除沙粒病毒启动子活性(即，得到的重组区段由2个3’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成)。
表2B
包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体位置1处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置2处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下；位置3处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置4处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下；位置5处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置6处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF.
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
L GP *ORF NP Z *ORF
L GP Z *ORF *ORF NP
L GP *ORF NP Z *ORF
L GP Z *ORF *ORF NP
L NP *ORF GP Z *ORF
L NP Z *ORF *ORF GP
L NP *ORF GP Z *ORF
L NP Z *ORF *ORF GP
Z GP *ORF NP L *ORF
Z GP L *ORF *ORF NP
Z GP *ORF NP L *ORF
Z NP L *ORF *ORF GP
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
Z NP *ORF GP L *ORF
Z NP L *ORF *ORF GP
在某些实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR。在具体实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒S区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒S区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。例如，包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒基因组的两个S区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒颗粒并消除沙粒病毒启动子活性(即，得到的重组S区段由2个5’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成)。
在某些实施方式中，本领域技术人员能够以表2A或2B所示的和如本文所述的组织方式构建沙粒病毒基因组，并使用如Error！Reference source not found.节所述的分析方法来测定三区段的沙粒病毒病毒载体是否遗传稳定，即，不产生如本文讨论的能够复制的双区段的病毒颗粒。
(b)包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体
在一方面，本文提供了包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体。在某些实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒颗粒。在具体实施方式中，在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因(RAG1)并已感染104PFU三区段的沙粒病毒病毒载体的小鼠中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖在至少10天、至少20天、至少30天、至少40天或至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天持续感染后不产生能够复制的双区段的病毒颗粒。在其它实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖在至少10代、20代、30代、40代或50代后不产生能够复制的双区段的病毒颗粒。
在一方面，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体进一步包含编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列。该序列及其排列描述于6.5节。
在某些实施方式中，将两种沙粒病毒ORF整合到只有一个区段而非两个分隔区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的两个L区段的区段间重组导致非功能性启动子(即，如下结构的基因组区段：5’UTR-----------5’UTR或a 3’UTR------------3’UTR)，其中每个形成基因组一端的UTR是同一基因组另一端的反转重复序列。
在某些实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体被工程化以在与ORF野生型位置不同的位置处携带沙粒病毒ORF。在其它实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体被工程化以在与野生型位置不同的位置携带2个沙粒病毒ORF或3个沙粒病毒ORF或4个沙粒病毒ORF或5个沙粒病毒ORF或6个沙粒病毒ORF。在具体实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体包含所有4个沙粒病毒ORF的完全补充。从而，在一些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体。在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体的两个L区段被工程化以在与野生型位置不同的位置携带其ORF之一。在更具体的实施方式中，两个L区段包含L区段ORF的完全补充。在某些具体实施方式中，S区段被工程化以在与野生型位置不同的位置携带其ORF之一，或S区段可以是野生型基因组区段。
在某些实施方式中，两个L区段之一可以是：
(i)L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(ii)L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iii)L区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
(iv)L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
(v)L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
(vi)L区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
在某些实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体可以包含双重ORF(即，2个野生型L区段ORF例如，Z蛋白或L蛋白)。在具体实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体可以包含一个双重ORF(例如，(Z蛋白，Z蛋白))或两个双重ORF(例如，(Z蛋白，Z蛋白)和(L蛋白，L蛋白))。
下表3描述了包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的基因组的组织，其中三区段的沙粒病毒基因组的两个L区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒载体并消除沙粒病毒启动子活性(即，推测得到的重组L区段由2个3’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成)。基于表3可以预测用于产生由2个5’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成的沙粒病毒病毒载体的相似组合。
表3
包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体*位置1处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置2处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下；位置3处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置4处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下；位置5处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置6处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF。
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
ORF* Z ORF* L NP GP
ORF* Z ORF* L GP NP
ORF* Z GP L ORF* NP
ORF* Z ORF* GP NP L
ORF* Z GP ORF* NP L
ORF* Z NP ORF* GP L
ORF* ORF* NP Z GP L
ORF* Z GP NP ORF* L
ORF* Z NP GP ORF* L
ORF* L ORF* Z NP GP
ORF* L ORF* Z GP NP
ORF* L ORF* GP NP Z
ORF* L GP Z ORF* NP
ORF* L ORF* GP NP Z
ORF* L NP Z ORF* GP
ORF* L GP NP ORF* Z
ORF* L NP GP ORF* Z
ORF* GP ORF* L NP Z
ORF* GP NP L ORF* Z
ORF* GP ORF* Z NP L
ORF* GP NP Z ORF* L
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
ORF* NP ORF* L GP Z
ORF* NP GP L ORF* Z
ORF* NP GP Z ORF* L
ORF* NP ORF* Z GP L
ORF* L ORF* Z NP GP
ORF* L ORF* Z GP NP
ORF* L ORF* NP GP Z
ORF* L ORF* GP NP Z
ORF* L NP Z ORF* GP
ORF* Z ORF* GP NP L
ORF* Z GP L ORF* NP
ORF* Z NP GP ORF* L
ORF* Z GP NP ORF* L
ORF* GP ORF* L NP Z
ORF* GP ORF* L Z NP
ORF* GP ORF* Z GP L
ORF* GP NP L ORF* Z
GP L ORF* Z ORF* NP
GP L ORF* NP ORF* Z
GP Z ORF* L ORF* NP
GP Z ORF* L ORF* NP
GP Z ORF* NP ORF* L
GP NP ORF* Z ORF* L
NP L ORF* Z ORF* GP
NP L ORF* GP ORF* Z
NP L ORF* Z ORF* GP
在某些实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒S或L区段IGR。在具体实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒S区段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。
在某些实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的L区段和S区段的区段间重组回复功能区段，其中两个病毒基因仅位于一个区段而非两个分隔的区段上。在其它实施方式中，包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体中的L区段和S区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒颗粒.。
下表3B显示了包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体的基因组的组织，其中三区段的沙粒病毒基因组中的L区段和S区段的区段间重组不产生能够复制的双区段的病毒颗粒并消除沙粒病毒启动子活性(即，得到的重组区段由2个3’UTR组成而不是3’UTR和5’UTR组成)。
表3B
包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体*位置1处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置2处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下；位置3处于沙粒病毒L区段5’UTR的控制下；位置4处于沙粒病毒L区段3’UTR的控制下；位置5处于沙粒病毒S区段5’UTR的控制下；位置6处于沙粒病毒S区段3’UTR的控制下。
*ORF表示被插入的异源ORF.
位置1 位置2 位置3 位置4 位置5 位置6
NP Z *ORF GP L *ORF
NP Z GP *ORF *ORF L
NP Z *ORF GP L *ORF
NP Z GP *ORF *ORF L
NP L *ORF GP Z *ORF
NP L GP *ORF *ORF Z
NP L *ORF GP Z *ORF
NP L GP *ORF *ORF Z
GP Z *ORF NP L *ORF
GP Z NP *ORF *ORF L
GP Z *ORF NP L *ORF
GP L NP *ORF *ORF Z
GP L *ORF NP Z *ORF
GP L NP *ORF *ORF Z
在某些实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒S区段或L区段IGR。在具体实施方式中，位置1和位置2之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR；位置2和位置3之间的IGR可以是沙粒病毒L区段IGR；且位置5和位置6之间的IGR可以是沙粒病毒S区段IGR。在某些实施方式中，其他组合也是可能的。
在某些实施方式中，本领域技术人员能够以表3A或3B所示的和如本文所述的组织方式构建沙粒病毒基因组，并使用如Error！Reference source not found.节所述的分析方法来测定三区段的沙粒病毒病毒载体是否遗传稳定，即，不产生如本文讨论的能够复制的双区段的病毒颗粒。
(c)复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体
在某些实施方式中，本文提供了三区段的沙粒病毒病毒载体，其中(i)ORF处于与野生型ORF位点不同的位置；和(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被去除或功能性失活从而得到的病毒不能产生进一步感染性的后代病毒颗粒(即，是复制缺陷的)。在某些实施方式中，第三沙粒病毒区段可以是S区段。在其它实施方式中，第三沙粒病毒区段可以是L区段。在更具体的实施方式中，第三沙粒病毒区段可以被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF，或第三沙粒病毒区段可以是野生型沙粒病毒基因组区段。在更具体的实施方式中，第三沙粒病毒区段缺失了编码沙粒病毒GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF。
在一方面，本文提供的复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体进一步包含编码感兴趣的抗原、免疫调节性肽、多肽或蛋白、信号序列和/或接头的异源核苷酸序列。该序列及其排列描述于6.5节。
在某些实施方式中，三区段的基因组区段可以是S或L区段的杂合(hybrid)(即，可以是组合的S区段和L区段的基因组区段)。在其它实施方式中，杂合区段是包含L区段IGR的S区段。在另一实施方式中，杂合区段是包含S区段IGR的L区段。在其它实施方式中，杂合区段是具有L区段IGR的S区段UTR。在另一实施方式中，杂合区段是具有S区段IGR的L区段UTR。在具体实施方式中，杂合区段是具有L区段IGR的S区段5’UTR或具有L区段IGR的S区段3’UTR。在其它具体实施方式中，杂合区段是具有S区段IGR的L区段5’UTR或具有S区段IGR的L区段3’UTR。
包含其中一个或多个ORF被去除(例如缺失)或功能性失活的遗传修饰的基因组的三区段的沙粒病毒病毒载体可以在补足细胞中产生(即，表达被缺失或功能性失活的沙粒病毒ORF的细胞)。得到的沙粒病毒病毒载体的遗传材料可以通过感染宿主细胞被转移至宿主细胞，其中遗传材料可以表达和扩增。此外，如本文所述的遗传修饰的沙粒病毒病毒载体基因组可以编码来自不同于沙粒病毒病毒载体的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在另一实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的至少1种ORF、至少2种ORF、至少3种ORF或至少4种ORF可以被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF 6.5。在具体实施方式中，编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的4种ORF中只有一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒病毒载体的生物体的异源ORF。在更具体的实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的GP的ORF被去除。在另一具体实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的NP的ORF被去除。在更具体的实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的Z蛋白的ORF被去除。在又一具体实施方式中，编码L蛋白的ORF被去除。
在某些实施方式中，本文提供了包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中(i)ORF处于与野生型ORF位点不同的位置；和(ii)编码GP或NP的ORF被去除或功能性失活，从而得到的病毒是复制缺陷的和非感染性的。在具体实施方式中，一个ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在另一具体实施方式中，2个ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它具体实施方式中，3个ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在具体实施方式中，编码GP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它具体实施方式中，编码NP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在更具体的实施方式中，编码NP的ORF和编码GP的ORF被去除并替换为来自沙粒病毒之外的生物体的一个或两个异源ORF病毒载体。从而，在某些实施方式中三区段的沙粒病毒病毒载体包含(i)一个L区段和两个S区段；(ii)处于与野生型ORF位点不同位置的ORF；(iii)一个或多个来自非沙粒病毒生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，本文提供了包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中(i)ORF处于与野生型ORF位点不同的位置；和(ii)编码Z蛋白和/或L蛋白的ORF被去除或功能性失活，从而得到的病毒是复制缺陷的和非感染性的。在具体实施方式中，1个ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在另一具体实施方式中，2个ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在具体实施方式中，编码Z蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在其它具体实施方式中，编码L蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。在更具体的实施方式中，编码Z蛋白的ORF和编码L蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒病毒载体的生物体的异源ORF。从而，在某些实施方式中三区段的沙粒病毒病毒载体包含(i)两个L区段和一个S区段；(ii)处于与野生型ORF位点不同的位置的ORF；(iii)来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
从而，在某些实施方式中，本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体包含三区段的沙粒病毒病毒载体(即，一个L区段和两个S区段或两个L区段和一个S区段)，其i)被工程化以在非天然位置携带ORF；ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被去除；和iii)被去除的ORF被替换为一个或多个来自沙粒病毒之外的生物体的异源ORF(第6.5节)。
在某些实施方式中，异源ORF是8-100个核苷酸长、15-100个核苷酸长、25-100个核苷酸长、50-200个核苷酸长、50-400个核苷酸长、200-500个核苷酸长或400-600个核苷酸长、500-800个核苷酸长。在其它实施方式中，异源ORF是750-900个核苷酸长、800-100个核苷酸长、850-1000个核苷酸长、900-1200个核苷酸长、1000-1200个核苷酸长、1000-1500个核苷酸或1200-1500个核苷酸长、1500-2000个核苷酸长、1700-2000个核苷酸长、2000-2300个核苷酸长、2200-2500个核苷酸长、2500-3000个核苷酸长、3000-3200个核苷酸长、3000-3500个核苷酸长、3200-3600个核苷酸长、3300-3800个核苷酸长、4000个核苷酸-4400个核苷酸长、4200-4700个核苷酸长、4800-5000个核苷酸长、5000-5200个核苷酸长、5200-5500个核苷酸长、5500-5800个核苷酸长、5800-6000个核苷酸长、6000-6400个核苷酸长、6200-6800个核苷酸长、6600-7000个核苷酸长、7000-7200个核苷酸长、7200-7500个核苷酸长或7500个核苷酸长或更长。在一些实施方式中，异源ORF编码5-10个氨基酸长、10-25个氨基酸长、25-50个氨基酸长、50-100个氨基酸长、100-150个氨基酸长、150-200个氨基酸长、200-250个氨基酸长、250-300个氨基酸长、300-400个氨基酸长、400-500个氨基酸长、500-750个氨基酸长、750-1000个氨基酸长、1000-1250个氨基酸长、1250-1500个氨基酸长、1500-1750个氨基酸长、1750-2000个氨基酸长、2000-2500个氨基酸长或多于2500个氨基酸长的肽或多肽。在一些实施方式中，异源ORF编码不超过2500个氨基酸长的多肽。在具体实施方式中，异源ORF不含终止密码子。在某些实施方式中，异源ORF是密码子优化的。在某些实施方式中核苷酸组分、核苷酸对组分或二者可以被优化。此种优化的技术是本领域已知的并可用于优化异源ORF。
三区段的沙粒病毒病毒载体中可包括来自不同于沙粒病毒的生物体的任何异源ORF。从而，在某些实施方式中，本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体包含a)野生型沙粒病毒中存在的开放式阅读框的缺失或功能失活；和b)编码一个或多个致瘤病毒抗原(例如，HPV E6、HPV E7和/或HPVE6/E7融合蛋白)和/或免疫调节性肽、多肽或蛋白。异源ORF更详细地描述于第6.5节。
在一个实施方式中，异源ORF编码报告蛋白。报告蛋白更详细地描述于6.5节。
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体的生长和感染性不受来自非沙粒病毒生物体的异源ORF的影响。
本领与技术人员已知的技术可被用于生产沙粒病毒病毒载体，其包含工程化以在与野生型位置不同的位置携带沙粒病毒ORF的沙粒病毒基因组区段。例如，反向遗传技术可用于产生该沙粒病毒病毒载体。在其它实施方式中，复制缺陷的沙粒病毒病毒载体(即，工程化以在与野生型位置不同的位置携带沙粒病毒ORF的沙粒病毒基因组区段，其中编码GP、NP、Z蛋白、L蛋白的ORF被缺失)可以在补足细胞中产生。
在某些实施方式中，根据本申请使用的三区段的沙粒病毒病毒载体可以是旧世界病毒，例如，LCMV。
6.4沙粒病毒病毒载体和三区段的沙粒病毒病毒载体的产生
一般，沙粒病毒病毒载体可以通过如针对LCMV描述的标准反向遗传技术进行重组生产(参见Flatz等，2006，Proc Natl Acad Sci USA 103：4663-4668；Sanchez等，2006，Virology 350：370；Ortiz-Riano等，2013，J Gen Virol.94：1175-88，其在此引入作为参考)。为了产生本文提供的沙粒病毒病毒载体，这些技术可以按照如下描述进行。病毒基因组可以如第6.2或6.3节所述进行修饰。
(a)非天然位置开放式阅读框
包含被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带病毒ORF的基因组区段的沙粒病毒病毒载体的产生可以通过本领域技术人员已知的任何标准反向遗传技术进行重组生产。
(i)感染性的和能够复制的沙粒病毒病毒载体
在某些实施方式中，产生沙粒病毒病毒载体的方法包括(i)向宿主细胞中转染第一沙粒病毒基因组区段的cDNA；(ii)向宿主细胞中转染第二沙粒病毒基因组区段的cDNA；(iii)向宿主细胞中转染表达沙粒病毒最小反向作用因子NP和L的质粒；(iv)在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和(v)收获沙粒病毒病毒载体。在某些更具体的实施方式中，cDNA包含在质粒中。
一旦由cDNA产生，沙粒病毒病毒载体(即，感染性的和能够复制的)可以增殖。在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体可以在允许病毒生长至能够使用如本文所述的病毒的滴度的任何宿主细胞中增殖。在一个实施方式中，宿主细胞允许沙粒病毒病毒载体生长至可以与对应的野生型所确定的滴度相比较的滴度。
在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体可在宿主细胞中增殖。可以使用的宿主细胞的具体例子包括BHK-21、HEK 293、VERO或其它。在具体实施方式中，沙粒病毒病毒载体可在细胞系中增殖。
在某些实施方式中，宿主细胞保持在培养物中并用一种或多种质粒转染。质粒在一个或多个适于在哺乳动物细胞中表达的表达盒的控制下表达待产生的沙粒病毒基因组区段，例如，包括聚合酶I启动子和终止子。
可用于产生沙粒病毒病毒载体的质粒可以包括：i)编码S基因组区段例如pol-I S的质粒，ii)编码L基因组区段例如pol-I L的质粒。在某些实施方式中，编码引导病毒L和S区段胞内合成的沙粒病毒聚合酶的质粒可以被引入转染混合物。例如，可以存在编码L蛋白的质粒和/或编码NP的质粒(分别为pC-L和pC-NP)。L蛋白和NP是病毒RNA转录和复制所必须的最小反向作用因子。可选的，可以使用具有分别从相对侧阅读至两个分离的质粒的L区段和S区段cDNA的pol-I和pol-II启动子的双向表达盒进行病毒L和S区段与NP和L蛋白一起的胞内合成。
在某些实施方式中，沙粒病毒基因组区段处于启动子控制下。典型的，可以使用RNA聚合酶I-驱动的表达盒，RNA聚合酶II-驱动的盒或T7噬菌体RNA聚合酶驱动的盒。在某些实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的质粒可以是相同的，即，基因组序列和反式作用因子可以通过启动子从一个质粒转录。启动子的具体示例包括RNA聚合酶I启动子，RNA聚合酶II启动子，RNA聚合酶III启动子，T7启动子，SP6启动子或T3启动子。
此外，质粒可以具有哺乳动物选择标记，例如，嘌呤霉素抗性，其处于适于在哺乳动物细胞中进行基因表达的表达盒的控制下，例如，如上述的聚合酶II表达盒；或病毒基因转录物伴随着内核糖体进入位点，例如脑心肌炎病毒的内核糖体进入位点，伴随着哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，质粒另外具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
用质粒转染宿主细胞可以可以使用常规使用的任何策略进行，例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。几天后，以滴定浓度加入合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，使用蛋白质印迹或流式细胞术用针对感兴趣的病毒蛋白的抗体鉴定高表达的克隆。
为了回收如本文所述的沙粒病毒病毒载体，设计了下述流程。第一天：细胞，典型的在M6-孔板中铺满80％，使用质粒混合物进行转染，如上所述。为此可以利用任何常用的策略，例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养物上清液(沙粒病毒载体制剂)，等分并在4℃、-20℃或-80℃保存，取决于使用前应存储多长时间的沙粒病毒载体。然后通过免疫聚集测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。可选的，在转染后3-5天可将转染的细胞和上清液传代到更大的培养瓶中(例如，T75组织培养瓶)，并在直至传代后5天收获培养上清液。
本申请更进一步提供了异源ORF的表达，其中编码基因组区段的质粒被修饰以包含异源ORF。异源ORF更详细的描述见于第6.5节。异源ORF可以使用限制性酶整合入质粒中。
(ii)感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体
感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体可以如上所述进行拯救。然而，一旦由cDNA产生，本文提供的感染性的复制缺陷型沙粒病毒即可在补足细胞中增殖。非补足细胞是不提供功能的细胞，所述功能已从复制缺陷的沙粒病毒中通过修饰其基因组进行了消除(例如，如果编码GP蛋白的ORF被缺失或功能性失活，补足细胞即提供GP蛋白)。
由于沙粒病毒载体中的一种或多种ORF的去除或功能性失活(这里，糖蛋白GP的缺失将被视为一个例子)，沙粒病毒载体可以在反向(in trans)提供缺失的病毒基因(例如本实施例中的GP)的细胞中产生并扩增。这种补足细胞系(以下称为C细胞)是通过用一种或多种用于表达感兴趣的病毒基因的质粒(互补质粒，称为C-质粒)转染哺乳动物细胞系例如BHK-21，HEK293，VERO或其它来产生的。C-质粒在适于在哺乳动物细胞中表达的一个或多个表达盒(例如哺乳动物聚合酶II启动子如具有聚腺苷酸化信号的CMV或EF1α启动子)控制下表达要产生的沙粒病毒载体中缺失的病毒基因。此外，互补质粒具有哺乳动物选择标记，例如，嘌呤霉素抗性，其处于适于在哺乳动物细胞中进行基因表达的表达盒的控制下，例如，如上述的聚合酶II表达盒；或病毒基因转录物伴随着内核糖体进入位点，例如脑心肌炎病毒的内核糖体进入位点，伴随着哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，质粒另外具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
将可以使用的细胞(例如BHK-21，HEK293，MC57G)保持在培养中，并使用任何常用策略例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔转染C-质粒。几天后，以滴定浓度加入合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，使用蛋白质印迹或流式细胞术用针对感兴趣的病毒蛋白的抗体鉴定高表达的C细胞克隆。作为使用稳定转染的C细胞的替代方法，正常细胞的瞬时转染可在下文将使用C细胞的每个步骤中补充缺失的病毒基因。另外，可以使用辅助病毒来反向提供缺失的功能。
质粒可以是两种类型：i)两种质粒，称为TF-质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子，其来源于例如来自本发明实施例中的LCMV的NP和L蛋白；和ii)称为GS-质粒的质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒载体基因组区段，例如具有设计修饰的区段。TF-质粒在哺乳动物细胞中适于蛋白表达的表达盒的控制下表达相应的沙粒病毒载体的NP和L蛋白质，典型地例如哺乳动物聚合酶II启动子如CMV或EF1α启动子，其中之一优先地与聚腺苷酸化信号组合。GS-质粒表达载体的小(S)和大(L)基因组区段。典型地，可以使用聚合酶I驱动的表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶(T7-)驱动的表达盒，后者优选地用3'-末端核酶处理初级转录物以产生正确的末端。在使用基于T7的系统的情况下，必须通过或者在恢复过程中包括额外的与TF-质粒类似构建的提供T7的表达质粒，或者构建C-细胞以另外以稳定的方式表达T7来表达T7，来提供T7在C细胞中的表达。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。
为了回收沙粒病毒载体，可以使用下述流程。第一天：用两种TF-质粒加两种GS-质粒的混合物转染C-细胞，后者典型的在M6-孔板中铺满80％。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。为此可以利用任何常用的策略，如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养物上清液(沙粒病毒载体制剂)，等分并在4℃、-20℃或-80℃保存，取决于使用前应存储多长时间的沙粒病毒载体。然后通过对C细胞的免疫聚集测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。可选的，在转染后3-5天可将转染的细胞和上清液传代到更大的培养瓶中(例如，T75组织培养瓶)，并在直至传代后5天收获培养上清液。
本文提供了在细胞培养物中的抗原表达，其中细胞培养物被感染表达抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒。当用于在培养细胞中表达抗原时，可以使用以下两种方法：
i)将感兴趣的细胞类型用本文所述的沙粒病毒载体制备物以感染倍数(MOI)为一或多个(例如2、3或4)进行感染，导致已经感染不久之后在所有细胞中产生抗原。
ii)可选的，可以使用较低的MOI，并且可以针对其病毒驱动的抗原表达水平选择单个细胞克隆。随后，由于沙粒病毒载体的非细胞溶解性质，个体克隆可以无限扩增。不考虑方法，根据所产生的抗原的性质，随后可以从培养物上清液或从细胞本身收集(和纯化)抗原。然而，本发明不限于这两种策略，可以考虑使用感染性复制缺陷型沙粒病毒作为载体驱动抗原表达的其他方式。
(b)三区段的沙粒病毒病毒载体的产生
三区段的沙粒病毒病毒载体可以通过本领域已知的反向遗传技术重组产生，例如Emonet等，2008，PNAS，106(9)：3473-3478；Popkin等，2011，J.Virol.，85(15)：7928–7932描述的技术，其在此引入作为参考。本文提供的三区段的沙粒病毒病毒载体的产生可以如第6.3节所述进行修饰。
(i)感染性的和能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体
在某些实施方式中，产生三区段的沙粒病毒病毒载体的方法包括：(i)向宿主细胞中转染一个L区段和两个S区段或两个L区段和一个S区段的cDNA；(ii)向宿主细胞中转染表达沙粒病毒最小反向作用因子NP和L的质粒；(iii)在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和(iv)收获沙粒病毒病毒载体。
一旦由cDNA产生，三区段的沙粒病毒病毒载体(即，感染性的和能够复制的)可以增殖。在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体可以在允许病毒生长至能够使用如本文所述的病毒的滴度的任何宿主细胞中增殖。在一个实施方式中，宿主细胞允许三区段的沙粒病毒病毒载体生长至可以与对应的野生型所确定的滴度相比较的滴度。
在某些实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体可在宿主细胞中增殖。可以使用的宿主细胞的具体例子包括BHK-21，HEK 293，VERO或其他。在具体实施方式中，三区段的沙粒病毒病毒载体可在细胞系中增殖。
在某些实施方式中，宿主细胞保持在培养物中并用一种或多种质粒转染。质粒在一个或多个适于在哺乳动物细胞中表达的表达盒的控制下表达待产生的沙粒病毒基因组区段，例如，包括聚合酶I启动子和终止子。
在具体实施方式中，宿主细胞保持在培养物中并用一种或多种质粒转染。质粒在一个或多个适于在哺乳动物细胞中表达的表达盒的控制下表达待产生的病毒基因，例如，包括聚合酶I启动子和终止子。
可用于产生包含一个L区段和两个S区段的三区段的沙粒病毒的质粒可以包括：i)分别编码S基因组区段例如pol-I S的两个质粒，ii)编码L基因组区段例如pol-I L的质粒。包含两个L区段和一个S区段的三区段的沙粒病毒所需质粒是：i)分别编码L基因组区段例如pol-L的两个质粒，ii)编码S基因组区段例如pol-I S的质粒。
在某些实施方式中，编码引导病毒L和S区段胞内合成的沙粒病毒聚合酶的质粒可以被引入转染混合物。例如，编码L蛋白的质粒和/或编码NP的质粒(分别为pC-L和pC-NP)。L蛋白和NP是病毒RNA转录和复制所必须的最小反向作用因子。可选的，可以使用具有分别从相对侧阅读至两个分离的质粒的L区段和S区段cDNA的pol-I和pol-II启动子的双向表达盒进行病毒L和S区段与NP和L蛋白一起的胞内合成。
此外，质粒具有哺乳动物选择标记，例如，嘌呤霉素抗性，其处于适于在哺乳动物细胞中进行基因表达的表达盒的控制下，例如，如上述的聚合酶II表达盒；或病毒基因转录物伴随着内核糖体进入位点，例如脑心肌炎病毒的内核糖体进入位点，伴随着哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，质粒另外具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
用质粒转染BHK-21细胞可以使用常规使用的任何策略进行，例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。几天后，以滴定浓度加入合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，使用蛋白质印迹或流式细胞术用针对感兴趣的病毒蛋白的抗体鉴定高表达的克隆。
典型的，可以使用RNA聚合酶I-驱动的表达盒，RNA聚合酶II-驱动的盒或T7噬菌体RNA聚合酶驱动的盒，后者优选具有3’端核酶用于处理初级转录物以产生正确的末端。在某些实施方式中，编码沙粒病毒基因组区段的质粒可以是相同的，即，基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。
为了回收沙粒病毒三区段的沙粒病毒载体，设计了下述流程。第一天：细胞，典型的在M6-孔板中铺满80％，使用质粒混合物进行转染，如上所述。为此可以利用任何常用的策略，例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养物上清液(沙粒病毒载体制剂)，等分并在4℃、-20℃或-80℃保存，取决于使用前应存储多长时间的沙粒病毒载体。然后通过免疫聚集测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。可选的，在转染后3-5天可将转染的细胞和上清液传代到更大的培养瓶中(例如，T75组织培养瓶)，并在直至传代后5天收获培养上清液。
本申请更进一步涉及异源ORF的表达，其中编码基因组区段的质粒被修饰以包含异源ORF。异源ORF更详细的描述见于第6.5节。异源ORF可以使用限制性酶整合入质粒中。
(ii)感染性的复制缺陷型三区段的沙粒病毒病毒载体
感染性的复制缺陷型三区段的沙粒病毒病毒载体可以如上所述进行拯救。然而，一旦由cDNA产生，本文提供的感染性的复制缺陷型沙粒病毒可以在补足细胞中增殖。非补足细胞是不提供功能的细胞，所述功能已从复制缺陷的沙粒病毒中通过修饰其基因组进行了消除(例如，如果编码GP的ORF蛋白被缺失或功能性失活，补足细胞即提供GP蛋白)。
由于沙粒病毒载体中的一种或多种ORF的去除或功能性失活(这里，糖蛋白GP的缺失将被视为一个例子)，沙粒病毒载体可以在反向(in trans)提供缺失的病毒基因(例如本实施例中的GP)的细胞中产生并扩增。这种补足细胞系(以下称为C细胞)是通过用一种或多种用于表达感兴趣的病毒基因的质粒(互补质粒，称为C-质粒)转染哺乳动物细胞系例如BHK-21，HEK293，VERO或其它(在此将用BHK-21作为一个例子)来产生的。C-质粒在适于在哺乳动物细胞中表达的一个或多个表达盒(例如哺乳动物聚合酶II启动子如具有聚腺苷酸化信号的CMV或EF1α启动子)控制下表达要产生的沙粒病毒载体中缺失的病毒基因。此外，互补质粒具有哺乳动物选择标记，例如，嘌呤霉素抗性，其处于适于在哺乳动物细胞中进行基因表达的表达盒的控制下，例如，如上述的聚合酶II表达盒；或病毒基因转录物伴随着内核糖体进入位点，例如脑心肌炎病毒的内核糖体进入位点，伴随着哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，质粒另外具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
为了产生C细胞，可以使用的细胞(例如BHK-21，HEK293，MC57G)保持在培养中，并使用任何常用策略例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔转染C-质粒。几天后，以滴定浓度加入合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，使用蛋白质印迹或流式细胞术用针对感兴趣的病毒蛋白的抗体鉴定高表达的C细胞克隆。作为使用稳定转染的C细胞的替代方法，正常细胞的瞬时转染可在下文将使用C细胞的每个步骤中补充缺失的病毒基因。另外，可以使用辅助病毒来反向提供缺失的功能。
可以使用两种类型的质粒：i)两种质粒，称为TF-质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子，其来源于例如来自本发明实施例中的LCMV的NP和L蛋白；和ii)称为GS-质粒的质粒，用于在C细胞中胞内表达沙粒病毒载体基因组区段，例如具有设计修饰的区段。TF-质粒在哺乳动物细胞中适于蛋白表达的表达盒的控制下表达相应的沙粒病毒载体的NP和L蛋白质，典型地例如哺乳动物聚合酶II启动子如CMV或EF1α启动子，其中之一优先地与聚腺苷酸化信号组合。GS-质粒表达载体的小(S)和大(L)基因组区段。典型地，可以使用聚合酶I驱动的表达盒或T7噬菌体RNA聚合酶(T7-)驱动的表达盒，后者优选地用3'-末端核酶处理初级转录物以产生正确的末端。在使用基于T7的系统的情况下，必须通过或者在恢复过程中包括额外的与TF-质粒类似构建的提供T7的表达质粒，或者构建C-细胞以另外以稳定的方式表达T7来表达T7，来提供T7在C细胞中的表达。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。
为了回收沙粒病毒载体，可以使用以下程序。第一天：用两种TF-质粒加两种GS-质粒的混合物转染C-细胞，后者典型的在M6-孔板中铺满80％。在某些实施方式中，TF和GS质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以通过T7，polI和polII启动子从一个质粒转录。为此可以利用任何常用的策略，如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。
3-5天后：收获培养物上清液(沙粒病毒载体制剂)，等分并在4℃、-20℃或-80℃保存，取决于使用前应存储多长时间的沙粒病毒载体。然后通过对C细胞进行免疫聚集测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。可选的，在转染后3-5天可将转染的细胞和上清液传代到更大的培养瓶中(例如，T75组织培养瓶)，并在直至传代后5天收获培养上清液。
本发明更进一步涉及在细胞培养物中的抗原表达，其中细胞培养物被感染表达抗原的感染性的复制缺陷型三区段的沙粒病毒。当用于在培养细胞中表达CMV抗原时，可以使用以下两种方法：
i)将感兴趣的细胞类型用本文所述的沙粒病毒载体制备物以感染倍数(MOI)为一或多个(例如2、3或4)进行感染，导致已经感染不久之后在所有细胞中产生抗原。
ii)可选的，可以使用较低的MOI，并且可以针对其病毒驱动的抗原表达水平选择单个细胞克隆。随后，由于沙粒病毒载体的非细胞溶解性质，个体克隆可以无限扩增。不考虑方法，根据所产生的抗原的性质，随后可以从培养物上清液或从细胞本身收集(和纯化)抗原。然而，本发明不限于这两种策略，可以考虑使用感染性复制缺陷型沙粒病毒作为载体驱动CMV抗原表达的其他方式。
6.5异源序列
(a)致瘤病毒抗原和HPV抗原
在某些实施方式中，如本文所述的沙粒病毒病毒载体所涵盖的异源序列编码抗原。在某些实施方式中，用于本文描述的方法和组合物的致瘤病毒抗原是DNA病毒、RNA病毒或逆转录病毒抗原。在某些更具体的实施方式中，抗原自身是致瘤的。
在某些实施方式中，异源核苷酸序列来源于致瘤病毒。
在某些实施方式中，用于本文描述的方法和组合物的抗原可以是除了乙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒抗原之外的任何致瘤病毒抗原。
在某些实施方式中，致瘤病毒抗原是人乳头瘤病毒抗原，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒抗原，例如潜伏期相关核抗原，Epstein-Barr病毒抗原，例如EBV-EA、EBV-MA或EBV-VCA，Merkel细胞多瘤病毒抗原，例如MCV T抗原或人T-嗜淋巴细胞病毒抗原，例如HTLV-1Tax抗原。
在某些具体实施方式中，用于本文所述的方法和组合物的抗原是HPV抗原。
在某些实施方式中，人HPV的任何毒株或人HPV的任何临床分离物都可以被用于获得异源序列以产生用于本文所述组合物和方法的沙粒病毒。在某些实施方式中，异源序列获得自HPV毒株并编码其抗原，例如包括HPV基因型1(HPV1)、HPV基因型2(HPV2)、HPV基因型3(HPV3)、HPV基因型4(HPV4)、HPV基因型6(HPV6)、HPV基因型7(HPV7)、HPV基因型8(HPV8)、HPV基因型10(HPV10)、HPV基因型11(HPV11)、HPV基因型13(HPV13)、HPV基因型16(HPV16)、HPV基因型18(HPV18)、HPV基因型22(HPV22)、HPV基因型26(HPV26)、HPV基因型31(HPV31)、HPV基因型32(HPV32)、HPV基因型33(HPV33)、HPV基因型35(HPV35)、HPV基因型39(HPV39)、HPV基因型42(HPV42)、HPV基因型44(HPV44)、HPV基因型45(HPV45)、HPV基因型51(HPV51)、HPV基因型52(HPV52)、HPV基因型53(HPV53)、HPV基因型56(HPV56)、HPV基因型58(HPV58)、HPV基因型59(HPV59)、HPV基因型60(HPV60)、HPV基因型63(HPV63)、HPV基因型66(HPV66)、HPV基因型68(HPV68)、HPV基因型73(HPV73)或HPV基因型82(HPV82)或其他基因型的毒株。在某些实施方式中，毒株包括HPV的“高风险”基因型，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73和HPV82。
在某些实施方式中，抗原可以是同源乳头瘤病毒抗原，例如，哺乳动物(即，非人灵长类，猪，狗，猫或马)乳头瘤病毒抗原。
在某些实施方式中，沙粒病毒的开放式阅读框(ORF)被缺失并取代为编码致瘤病毒抗原的异源序列。
更具体的，一个或多个，例如，4个沙粒病毒ORF(糖蛋白(GP)；核蛋白(NP)；基质蛋白Z；RNA依赖性RNA聚合酶L)的2，3或4个被去除或突变以防止在正常细胞中形成感染性的颗粒，但仍允许沙粒病毒载体感染细胞中的基因表达。可以引入异源序列，例如编码一个或多个蛋白的异源核酸。这些异源核酸转录自4个沙粒病毒启动子S区段5’UTR和3’UTR和L区段5’UTR和3’UTR的一个或多个，例如，2或3个，或来自另外引入的启动子序列，后者可以被病毒RNA依赖性RNA聚合酶，细胞RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III所阅读，例如分别在病毒UTR，28S核糖体RNA启动子，β肌动蛋白启动子或5S核糖体RNA启动子中天然发现的双重病毒启动子序列。编码蛋白或调节宿主基因表达的核糖核酸或者通过其自身，或者通过融合至沙粒病毒蛋白ORF作为连读(read-through)进行转录和翻译。宿主细胞中的蛋白表达可通过在病毒转录序列合适的位置引入一个或多个，例如，2、3或4个内核糖体进入位点来进行增强。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码DNA病毒抗原、RNA病毒抗原或逆转录病毒抗原的异源序列。
在某些更具体的实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码除了乙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒抗原之外的任何致瘤病毒抗原的异源序列。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码致瘤病毒抗原的异源序列，例如人乳头瘤病毒抗原，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒抗原，例如潜伏期相关核抗原，Epstein-Barr病毒抗原，例如EBV-EA、EBV-MA或EBV-VCA，Merkel细胞多瘤病毒抗原，例如MCV T抗原或人T-嗜淋巴细胞病毒抗原，例如HTLV-1Tax抗原。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码一种或多种HPV抗原的异源序列。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV任何毒株或任何HPV临床分离物的抗原的异源序列。该毒株包括HPV基因型1(HPV1)、HPV基因型2(HPV2)、HPV基因型3(HPV3)、HPV基因型4(HPV4)、HPV基因型6(HPV6)、HPV基因型7(HPV7)、HPV基因型8(HPV8)、HPV基因型10(HPV10)、HPV基因型11(HPV11)、HPV基因型13(HPV13)、HPV基因型16(HPV16)、HPV基因型18(HPV18)、HPV基因型22(HPV22)、HPV基因型26(HPV26)、HPV基因型31(HPV31)、HPV基因型32(HPV32)、HPV基因型33(HPV33)、HPV基因型35(HPV35)、HPV基因型39(HPV39)、HPV基因型42(HPV42)、HPV基因型44(HPV44)、HPV基因型45(HPV45)、HPV基因型51(HPV51)、HPV基因型52(HPV52)、HPV基因型53(HPV53)、HPV基因型56(HPV56)、HPV基因型58(HPV58)、HPV基因型59(HPV59)、HPV基因型60(HPV60)、HPV基因型63(HPV63)、HPV基因型66(HPV66)、HPV基因型68(HPV68)、HPV基因型73(HPV73)或HPV基因型82(HPV82)或其他基因型。在某些实施方式中，毒株包括HPV的“高风险”基因型，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV任何毒株或任何HPV临床分离物的抗原的异源序列，其中抗原的氨基酸序列与下述抗原的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，例如HPV基因型1(HPV1)、HPV基因型2(HPV2)、HPV基因型3(HPV3)、HPV基因型4(HPV4)、HPV基因型6(HPV6)、HPV基因型7(HPV7)、HPV基因型8(HPV8)、HPV基因型10(HPV10)、HPV基因型11(HPV11)、HPV基因型13(HPV13)、HPV基因型16(HPV16)、HPV基因型18(HPV18)、HPV基因型22(HPV22)、HPV基因型26(HPV26)、HPV基因型31(HPV31)、HPV基因型32(HPV32)、HPV基因型33(HPV33)、HPV基因型35(HPV35)、HPV基因型39(HPV39)、HPV基因型42(HPV42)、HPV基因型44(HPV44)、HPV基因型45(HPV45)、HPV基因型51(HPV51)、HPV基因型52(HPV52)、HPV基因型53(HPV53)、HPV基因型56(HPV56)、HPV基因型58(HPV58)、HPV基因型59(HPV59)、HPV基因型60(HPV60)、HPV基因型63(HPV63)、HPV基因型66(HPV66)、HPV基因型68(HPV68)、HPV基因型73(HPV73)或HPV基因型82(HPV82)或其他基因型的E6和/或E7抗原。在某些实施方式中，毒株包括HPV的“高风险”基因型，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码一种或多种HPV抗原的异源序列。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV早期(E)或晚期(L)蛋白的异源序列。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1或HPV蛋白L2的异源序列。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1或HPV蛋白L2中的2、3、4，5或更多种的融合蛋白的异源序列。在某些具体实施方式中，异源序列是HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7。在某些具体实施方式中，异源序列是HPV蛋白E7融合HPV蛋白E6融合HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7，其中一个HPV蛋白E7来自毒株HPV16，另一个来自毒株HPV18，且一个HPV蛋白E6来自毒HPV 18株，另一个来自毒株HPV18。在某些具体实施方式中，异源序列是HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7的重排的序列。在某些具体实施方式中，HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7的序列表达为蛋白E7在蛋白E6上游。在某些具体实施方式中，HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7的序列表达为蛋白E6在蛋白E7上游。在某些实施方式中，E7蛋白在Rb结合位点和锌指基序具有突变。在某些实施方式中，E6蛋白在锌指基序具有突变。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原的异源序列，所述抗原与HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1或HPV蛋白L2抗原的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原的异源序列，所述抗原与HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原的异源序列，所述抗原与HPV蛋白E6融合HPV蛋白E7的重排的序列的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些具体实施方式中、HPV蛋白E6序列融合HPV蛋白E7序列表达为蛋白E7在蛋白E6上游。在某些具体实施方式中、HPV蛋白E6序列融合HPV蛋白E7序列表达为蛋白E6在蛋白E7上游。在某些实施方式中，E7蛋白序列在Rb结合位点和锌指基序具有突变。在某些实施方式中，E6蛋白序列在锌指基序具有突变。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原(例如HPV蛋白E6和/或E7抗原)的异源核苷酸序列。HPV蛋白E6是致瘤蛋白。例如，已报道蛋白E6结合肿瘤抑制物p53并导致p53的蛋白酶体降解(Ganguly等，2009，J.Biosci.34(1)，113–123)。HPV蛋白E7也是致瘤蛋白。例如，已显示E7结合作为肿瘤抑制蛋白的视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)并使其功能失活(Ganguly等，2009，J.Biosci.34(1)，113–123)。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原(例如HPV蛋白E6和/或E7抗原或其片段)的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，E6蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，E6蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，E6蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150或158个氨基酸长。在某些实施方式中，E7蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，E7蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，E7蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或98个氨基酸长。在某些实施方式中，E7蛋白片段在Rb结合位点和锌指基序具有突变。在某些实施方式中，E6蛋白片段在锌指基序具有突变。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV16蛋白E6、HPV16蛋白E7、HPV18蛋白E6和HPV18蛋白E7的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的一个、两个、三个或全部四个可以是重排的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以直接融合一个或两个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以通过接头或自裂解肽融合一个或两个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以融合一个或两个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列可以是以本领域技术人员已知的任何方式排列，例如，HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以位于一个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的上游或下游。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以融合信号肽。在某些更具体的实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV16 E6/HPV16 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV18 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段的异源核苷酸序列。在某些更具体的实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码两个融合蛋白的异源核苷酸序列，其中第一融合蛋白是HPV16 E6/HPV16 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E7/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV18 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段，且第二融合蛋白是选自HPV16 E6/HPV16 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E7/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV18 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段的不同融合蛋白。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列进一步编码免疫调节性肽、多肽或蛋白。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列进一步编码信号序列(例如源自VSVG)。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码HPV16 E6/E7融合蛋白的重排的序列和HPV18 E6/E7融合蛋白的重排的序列的异源核苷酸序列。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白，其直接彼此融合。在某些具体实施方式中，异源序列编码HPV16E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白，其彼此通过肽接头或自裂解肽融合。在某些具体实施方式中，异源序列编码HPV16 E6/E7融合蛋白，其位于HPV18 E6/E7融合蛋白上游。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列编码HPV16 E6/E7融合蛋白，其位于HPV18 E6/E7融合蛋白下游。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列编码HPV16 E6/E7融合蛋白融合信号肽。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列编码HPV18 E6/E7融合蛋白融合信号肽。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列进一步编码免疫调节性肽、多肽或蛋白。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码与HPV16 E6/E7融合蛋白的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗原和与HPV18 E6/E7融合蛋白的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗原的异源序列。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原的异源序列，所述抗原与HPV16 E6/E7融合蛋白的重排的序列的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码抗原的异源序列，所述抗原与HPV18 E6/E7融合蛋白的重排的序列的氨基酸序列的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些具体实施方式中，HPV16 E6/E7融合蛋白或HPV18 E6/E7融合蛋白的E6蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，E6蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，E6蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150或158个氨基酸长。在某些实施方式中，HPV16 E6/E7融合或HPV18 E6/E7融合的E7蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，E7蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，E7蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或98个氨基酸长。
在某些实施方式中，编码HPV16 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列和编码HPV18E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列位于病毒基因组的相同位置。在某些实施方式中，编码HPV16 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列和编码HPV18 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列位于病毒基因组的不同位置。在某些实施方式中，编码HPV16 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列和编码HPV18 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列在相同病毒上表达。在某些实施方式中，编码HPV16 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列和编码HPV18 E6/E7融合蛋白的异源核苷酸序列在不同病毒上表达。
在某些具体实施方式中，HPV16蛋白E6融合蛋白E7的异源核苷酸序列表达为蛋白E7位于蛋白E6上游。在某些具体实施方式中，HPV18蛋白E6融合蛋白E7的异源核苷酸序列表达为蛋白E6位于蛋白E7上游。在某些实施方式中，HPV16 E6/E7融合蛋白或HPV18 E6/E7融合蛋白的E7蛋白在Rb结合位点和锌指基序具有突变。在某些实施方式中，HPV16 E6/E7融合蛋白或HPV18 E6/E7融合蛋白的E6蛋白在锌指基序具有突变。
在某些实施方式中，编码致瘤病毒抗原的异源序列进一步编码信号肽。更具体的，异源序列编码融合信号肽的抗原，从而得到的表达产物从表达其的细胞中分泌。所述信号肽可以融合抗原N端或C端。本领域技术人员已知的任何信号肽可用于本文提供的组合物和方法。特别的，信号肽是人分泌蛋白的信号肽。更具体的，信号肽是人酪氨酸酶分泌信号，人生长激素分泌信号，人组织纤溶酶原激活物信号序列或VSVG信号序列。
异源核苷酸序列可编码多于一个抗原。在某些实施方式中，异源核苷酸序列编码一个或多个不同致瘤病毒的2、3、4、5个或更多抗原。特别的，异源核苷酸序列可编码HPV一个株的第一抗原和来自HPV不同株的相似抗原的第二抗原。例如，异源核苷酸序列可编码来自HPV一个株的蛋白E6(例如，HPV 16株)，和来自另一株的蛋白E6(例如，HPV 18株)和/或来自HPV一个株的蛋白E7(例如，HPV 16株)，和来自另一株的蛋白E7(例如，HPV 18株)。在某些实施方式中，异源核苷酸序列编码相同致瘤病毒或一个或多个不同致瘤病毒的2、3、4、5或更多的不同抗原。特别的，异源核苷酸序列可编码HPV一个株的第一抗原和来自HPV相同株或不同株的相似抗原的第二抗原。例如，异源核苷酸序列可编码来自HPV一个株的蛋白E6(例如，HPV 16株)，和来自相同株或另一株的蛋白E7(例如，HPV 18株)。作为另一示例，异源核苷酸序列可编码来自两株HPV的蛋白E6(例如，HPV 16和18株)，和来自两个株的蛋白E7(例如，HPV 16和18株)。
在某些实施方式中，编码致瘤病毒抗原的异源序列进一步编码接头或自裂解肽。接头或自裂解肽可用于同时表达两个或多个基因。更具体的，异源序列编码与另一抗原或免疫调节性肽、多肽或蛋白直接融合或通过接头序列融合的抗原。在另一具体实施方式中，异源序列编码通过自裂解肽连接至另一抗原或免疫调节性肽、多肽或蛋白的抗原。所述接头或自裂解肽可以融合抗原N端或C端。本领域技术人员已知的任何接头肽或自裂解肽可用于本文提供的组合物和方法。可以此种方式融合或连接任何数量的抗原或免疫调节性肽、多肽或蛋白。例如，在一个具体实施方式中，第一HPV抗原直接融合至第二HPV抗原或通过肽接头融合至第二抗原。在另一具体实施方式中，第二HPV抗原直接融合第三HPV抗原或通过肽接头融合第三抗原。在另一具体实施方式中，第一HPV抗原和第二HPV抗原通过自裂解肽彼此分隔。在另一具体实施方式中，第二HPV抗原和第三HPV抗原通过自裂解肽彼此分隔。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多如本文所述的HPV抗原的ORF作为单独转录物进行转录。在某些实施方式中，编码该转录物上的HPV抗原的ORF被编码自裂解肽或核糖体跳跃(ribosome-skipping)序列的核酸所分隔。在某些实施方式中，自裂解肽可以获得自细小RNA病毒科多种病毒的2A蛋白。在某些具体实施方式中，自裂解肽获得自(或衍生自)猪捷申病毒-1 2A，Thosea asign病毒2A，口蹄疫病毒2A肽或马鼻炎病毒2A肽。在某些具体实施方式中，获得自(或衍生自)猪捷申病毒-1 2A的2A肽具有最高的裂解效率。在某些实施方式中，2A肽组合2A肽上游或下游的如本文所述的HPV抗原具有高裂解效率。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF被核糖体跳跃序列所分隔。在更具体的实施方式中，核糖体跳跃序列是顺式作用的水解酶元件序列。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF被获得自(或衍生自)马铃薯Y病毒科的烟草蚀纹病毒(TEV)的自裂解蛋白酶所分隔。
在某些实施方式中，在2A肽的N端和/或C端插入Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头。在更具体的实施方式中，在2A肽的N端插入Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头。在更具体的实施方式中，在2A肽的C端插入Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头。在某些实施方式中，Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头改善了2A肽的裂解效率。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF被内核糖体进入位点所分隔。在某些实施方式中，内核糖体进入位点在上游启动子控制下发挥作用。在某些实施方式中，内核糖体进入位点获得自(或衍生自)脑心肌炎病毒。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF被2A肽和弗林裂解位点所分隔。在某些实施方式中，2A肽侧翼具有弗林裂解位点。在某些实施方式中，弗林裂解位点位于编码HPV抗原的ORF和2A肽之间。在某些实施方式中，弗林裂解位点被加入到2A肽上游。在某些实施方式中，弗林裂解位点被加入到2A肽下游。在某些实施方式中，弗林裂解位点位于具有编码两个、三个或四个或更多HPV抗原的ORF、自裂解肽及其组合的载体中。在某些实施方式中，弗林裂解位点共有序列为R-X-K-/R-R。在一个更具体的实施方式中，弗林裂解位点在高尔基体外侧网络中被弗林裂解。在另一实施方式中，弗林裂解位点去除了2A肽序列。在又一实施方式中，弗林裂解位点去除了C端的自裂解肽序列。例如，参见Fang等，2007，Molecular Therapy 15(6)：1153-1159。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF被2A肽和标签所分隔。在某些实施方式中，标签连接2A肽。在某些实施方式中，标签位于2A肽和弗林裂解位点之间。在某些实施方式中，标签位于下游编码HPV抗原的ORF的C端或N端。在某些实施方式中，标签位于上游编码HPV抗原的ORF的C端或N端。在某些实施方式中，标签位于具有编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF、2A肽、弗林裂解位点或其组合的载体中。在某些实施方式中，标签是肽标签。在更具体的实施方式中，标签是V5氨基酸标签。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或五个或更多HPV抗原的ORF被2A肽和间隔序列所分隔。在某些实施方式中，间隔序列位于2A肽上游。在某些实施方式中，间隔序列位于编码HPV抗原的ORF之间。在某些实施方式中，间隔序列位于2A肽上游和标签之间。在某些实施方式中，间隔序列位于上游2A肽和下游弗林裂解位点之间。在某些实施方式中，间隔序列位于具有编码HPV抗原的ORF、自裂解肽、弗林裂解位点、标签或其组合的载体中。在某些实施方式中，间隔序列增加裂解效率。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码一个、两个、三个或四个或更多HPV抗原的异源序列。
(b)免疫调节性序列
在某些实施方式中，用于本文所述的方法和组合物的抗原与免疫调节性元件一起施用，例如，免疫调节性肽、多肽或蛋白。
在某些实施方式中，被感染性的复制缺陷的沙粒病毒涵盖的异源核苷酸序列进一步编码免疫调节性肽、多肽或蛋白。免疫调节肽、多肽或蛋白可以是钙网蛋白(CRT)或其片段；泛素或其片段；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；恒定链(CD74)或其抗原性片段；结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；CD40配体或其抗原性片段；或Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
在某些实施方式中，编码免疫调节肽、多肽或蛋白的序列和编码抗原的序列位于病毒基因组相同位置。例如，编码免疫调节肽、多肽或蛋白的序列和编码抗原的序列位于感染性的复制缺陷型沙粒病毒的功能性失活(例如，缺失)的ORF的位置。在某些实施方式中，编码免疫调节肽、多肽或蛋白的序列和编码抗原的序列位于病毒基因组不同位置。在某些实施方式中，编码免疫调节肽、多肽或蛋白的序列和编码第一抗原的序列位于感染性的复制缺陷型沙粒病毒的不同基因组区段。
在某些实施方式中，沙粒病毒的一个ORF被缺失并取代为编码一个、两个、三个或四个或更多HPV抗原和免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源序列。
在某些实施方式中，编码免疫调节肽、多肽或蛋白的异源序列，进一步编码信号肽。更具体的，异源序列编码融合信号肽的免疫调节性肽、多肽或蛋白，从而得到的表达产物从表达其的细胞中分泌。该信号肽可以融合免疫调节肽、多肽或蛋白的N端或C端。本领域技术人员已知的任何信号肽可用于本文提供的组合物和方法。特别的，信号肽是人分泌蛋白的信号肽。更具体的，信号肽是人酪氨酸酶分泌信号、人生长激素分泌信号或组织纤溶酶原激活物信号序列。
在某些实施方式中，编码免疫调节肽、多肽或蛋白的异源序列进一步编码接头或自裂解肽。更具体的，异源序列编码直接融合或通过接头序列融合抗原或另一免疫调节性肽、多肽或蛋白的免疫调节性肽、多肽或蛋白。在另一具体实施方式中，异源序列编码通过自裂解肽连接抗原或另一免疫调节性肽、多肽或蛋白的免疫调节性肽、多肽或蛋白。该接头或自裂解肽可以融合免疫调节肽、多肽或蛋白的N端或C端。本领域技术人员已知的任何接头肽或自裂解肽可用于本文提供的组合物和方法。任何数量的免疫调节性肽、多肽或蛋白可以按照此种方式融合或连接抗原或另一免疫调节性肽、多肽或蛋白。例如，在一个具体实施方式中，免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第一抗原或通过肽接头融合至第一抗原。在另一具体实施方式中，免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第二抗原或通过肽接头融合至第二抗原。在另一具体实施方式中，第一抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。在另一具体实施方式中，第二抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白作为单独转录物进行转录。在某些实施方式中，编码该转录物上的HPV抗原的ORF和免疫调节性序列被编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核酸所分隔。在某些实施方式中，自裂解肽可以获得自细小RNA病毒科多种病毒的2A蛋白。在某些具体实施方式中，自裂解肽获得自(或衍生自)猪捷申病毒-1 2A，Thosea asign病毒2A，口蹄疫病毒2A肽或马鼻炎病毒2A肽。在某些具体实施方式中，获得自(或衍生自)猪捷申病毒-1 2A的2A肽具有最高的裂解效率。在某些实施方式中，2A肽组合2A肽上游或下游的如本文所述的HPV抗原具有高裂解效率。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白被核糖体跳跃序列所分隔。在更具体的实施方式中，核糖体跳跃序列是顺式作用的水解酶元件序列。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白被获得自(或衍生自)马铃薯Y病毒科的烟草蚀纹病毒(TEV)的自裂解蛋白酶所分隔。
在某些实施方式中，在2A肽的N端和/或C端插入Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头。在更具体的实施方式中，在2A肽的N端插入Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头。在更具体的实施方式中，在2A肽的C端插入Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头。在某些实施方式中，Gly-Ser-Gly，NDAQAPKS或SDRYLNRR接头改善了2A肽的裂解效率。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白被内核糖体进入位点所分隔。在某些实施方式中，内核糖体进入位点在上游启动子控制下发挥作用。在某些实施方式中，内核糖体进入位点获得自(或衍生自)脑心肌炎病毒。
在某些实施方式中编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白被2A肽和弗林裂解位点所分隔。在某些实施方式中，2A肽侧翼具有弗林裂解位点。在某些实施方式中，弗林裂解位点位于编码HPV抗原的ORF和2A肽之间。在某些实施方式中，弗林裂解位点被加入到2A肽上游。在某些实施方式中，弗林裂解位点被加入到2A肽下游。在某些实施方式中，弗林裂解位点位于具有编码两个、三个或四个或更多HPV抗原的ORF、自裂解肽及其组合的载体中。在某些实施方式中，弗林裂解位点共有序列为R-X-K-/R-R。在一个更具体的实施方式中，弗林裂解位点在高尔基体外侧网络中被弗林裂解。在另一实施方式中，弗林裂解位点去除了2A肽序列。在又一实施方式中，弗林裂解位点去除了C端的自裂解肽序列。例如，参见Fang等，2007，Molecular Therapy 15(6)：1153-1159。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白被2A肽和标签所分隔。在某些实施方式中，标签连接2A肽。在某些实施方式中，标签位于2A肽和弗林裂解位点之间。在某些实施方式中，标签位于下游编码HPV抗原的ORF的C端或N端。在某些实施方式中，标签位于上游编码HPV抗原的ORF的C端或N端。在某些实施方式中，标签位于具有编码两个、三个、四个或更多HPV抗原的ORF、2A肽、弗林裂解位点或其组合的载体中。在某些实施方式中，标签是肽标签。在更具体的实施方式中，标签是V5氨基酸标签。
在某些实施方式中，编码两个、三个、四个或五个或更多HPV抗原的ORF和免疫调节肽、多肽或蛋白被2A肽和间隔序列所分隔。在某些实施方式中，间隔序列位于2A肽上游。在某些实施方式中，间隔序列位于编码HPV抗原的ORF之间。在某些实施方式中，间隔序列位于2A肽上游和标签之间。在某些实施方式中，间隔序列位于上游2A肽和下游弗林裂解位点之间。在某些实施方式中，间隔序列位于具有编码HPV抗原的ORF、自裂解肽、弗林裂解位点、标签或其组合的载体中。在某些实施方式中，间隔序列增加裂解效率。
在某些实施方式中，ORF编码2、3、4或5个或更多HPV抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白被核苷酸序列所分隔，所述核苷酸序列编码：自裂解肽，导致通过“核糖体跳跃”释放上游氨基酸序列的氨基酸序列，或导致结合核糖体和下游序列翻译的序列元件，例如“内核糖体进入位点”(IRES)。
(c)示例性插入
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码一个、两个、三个或四个或更多如本文所述的HPV抗原和免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸序列。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码两个、三个或四个或更多如本文所述的HPV抗原的核酸序列，其通过自裂解肽或核糖体跳跃序列与免疫调节肽、多肽或蛋白分隔。在某些实施方式中，自裂解肽(或核糖体跳跃序列)可以获得自细小RNA病毒科多种病毒的2A蛋白。在某些具体实施方式中，自裂解肽(或核糖体跳跃序列)获得自(或衍生自)猪捷申病毒-1 2A，Thosea asign病毒2A或口蹄疫病毒2A肽。
在某些实施方式中，异源核苷酸序列编码一个或多个的：
·HPV抗原或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·重排的HPV16蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E6/HPV18蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7/HPV18蛋白E6融合蛋白或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6/HPV16蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；或
·HPV18蛋白E7/HPV16蛋白E6融合蛋白或其抗原性片段。
在某些实施方式中，异源核苷酸序列进一步编码或感染性的复制缺陷的沙粒病毒基因组进一步包含第二异源核苷酸序列，其编码
·钙网蛋白(CRT)或其片段；
·泛素或其片段；
·粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；
·恒定链(CD74)或其抗原性片段；
·结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；
·单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；
·CD40配体或其抗原性片段；或
·Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
在某些实施方式中，钙网蛋白蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，钙网蛋白蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，钙网蛋白蛋白片段是至少20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400或417个氨基酸长。在某些实施方式中，泛素蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，泛素蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，泛素蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70或76个氨基酸长。在某些实施方式中，GM-CSF蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，GM-CSF蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，GM-CSF蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120或127个氨基酸长。在某些实施方式中，恒定链(CD74)蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，恒定链(CD74)蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，恒定链(CD74)蛋白片段是至少20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220或232个氨基酸长。在某些实施方式中，结核分枝杆菌热休克蛋白70蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，结核分枝杆菌热休克蛋白70蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，结核分枝杆菌热休克蛋白70蛋白片段是至少20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500，520，540，560，580，600，620，640，660，680，700或701个氨基酸长。在某些实施方式中，单纯性疱疹病毒1蛋白VP22蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，单纯性疱疹病毒1蛋白VP22蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，单纯性疱疹病毒1蛋白VP22蛋白片段是至少20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300或301个氨基酸长。在某些实施方式中，CD40配体蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，CD40配体蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，CD40配体蛋白片段是至少20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260或261个氨基酸长。在某些实施方式中，Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体蛋白片段是N端截短片段。在某些实施方式中，Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体蛋白片段是C端截短片段。在某些实施方式中，Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体蛋白片段是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150或153个氨基酸长。
在具体实施方式中，异源核苷酸序列编码HPV 16蛋白E6或其片段。在更具体的实施方式中，异源核苷酸序列编码的抗原是在锌指基序中具有一个或多个突变的HPV 16蛋白E6。锌指基序中的突变防止结合肿瘤蛋白p53。肿瘤蛋白p53具有抗癌功能，因其能够在DNA具有持续损伤时激活DNA修复蛋白，因其能够通过将细胞周期保持在DNA损伤识别的G1/S调节点来阻止生长，以及因其能够启动凋亡，如果DNA损伤被证明是不可修复的话。在具体实施方式中，抗原是HPV 16蛋白E7或其片段。在更具体的实施方式中，抗原是在Rb结合位点和锌指基序具有一个或多个突变的HPV 16蛋白E7。突变防止结合视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)。致瘤蛋白结合并失活pRb，其可能导致癌症，因为pRb的一个功能是通过抑制细胞周期进程防止过度细胞生长，直至细胞准备好分裂。在具体实施方式中，抗原是HPV 18蛋白E6或其片段。在更具体的实施方式中，抗原是在锌指基序具有一个或多个突变的HPV 18蛋白E6。在具体实施方式中，抗原是HPV 18蛋白E7或其片段。在更具体的实施方式中，抗原是在Rb结合位点和锌指基序具有一个或多个突变的HPV 18蛋白E7。
在某些实施方式中，抗原是HPV16蛋白E7/E6融合蛋白、HPV18蛋白E7/E6融合蛋白、HPV16蛋白E7/HPV18蛋白E6融合蛋白或HPV18蛋白E7/HPV 16蛋白E6融合蛋白，其中E6蛋白在锌指基序具有一个或多个突变，且蛋白E7在Rb结合位点和锌指基序具有一个或多个突变。
在某些实施方式中，抗原是HPV16蛋白E7/E6融合蛋白、HPV18蛋白E7/E6融合蛋白、HPV16蛋白E7/HPV18蛋白E6融合蛋白或HPV18蛋白E7/HPV 16蛋白E6融合蛋白，其与免疫调节性肽、多肽或蛋白共同表达，其中免疫调节肽、多肽或蛋白是钙网蛋白(CRT)或其片段；泛素或其片段；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；恒定链(CD74)或其抗原性片段；结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；CD40配体或其抗原性片段；或Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段，其中E6蛋白在锌指基序具有一个或多个突变，且蛋白E7在Rb结合位点和锌指基序具有一个或多个突变。
在一个实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码HPV抗原的核酸序列。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E6或其片段的基因的基因产物的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150或158个氨基酸的片段。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E7或其片段的基因的基因产物的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或98个氨基酸的片段。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 18蛋白E6或其片段的基因的基因产物的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150或158个氨基酸的片段。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 18蛋白E7或其片段的基因的基因产物的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或98个氨基酸的片段。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E6和HPV 16蛋白E7间的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E7和HPV 18蛋白E6间的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 18蛋白E7和HPV 16蛋白E6间的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 18蛋白E6和HPV 18蛋白E7间的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV16 E7、HPV18 E6，HPV16 E6和HPV18 E7的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，1000或更多个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ ID NO：14的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E6和HPV16蛋白E7和钙网蛋白间的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，500，600或至少676个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ ID NO：15的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E6和HPV 16蛋白E7和泛素间的融合蛋白。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300或至少332个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ ID NO：16的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E6和HPV 16蛋白E7和GM-CSF间的融合蛋白，由编码自裂解肽(2A肽)的核苷酸序列分隔。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300，350或至少383个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ ID NO：17的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E7和HPV 18蛋白E6间的融合蛋白，其具有N端VSVG信号序列和C端肽接头伴随着编码自裂解肽(2A肽)和GM-CSF的核苷酸序列。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400或至少428个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ ID NO：33的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 18蛋白E7和HPV 16蛋白E6间的融合蛋白，其具有N端VSVG信号序列和C端肽接头伴随着编码自裂解肽(2A肽)和GM-CSF的核苷酸序列。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400或至少435个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ ID NO：35的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是HPV 16蛋白E7、HPV 18蛋白E6、HPV 16蛋白E6和HPV 18蛋白E7间的融合蛋白，其具有N端VSVG信号序列和C端肽接头伴随着编码自裂解肽(2A肽)和GM-CSF的核苷酸序列。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为编码抗原的核酸序列，所述抗原是至少10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650或至少681个氨基酸长。在某些实施方式中，编码沙粒病毒糖蛋白的ORF被取代为核酸序列，其与SEQ IDNO：37的同一性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
这些示例性实施例中存在的免疫调节性肽、多肽或蛋白是鼠源序列。将产生编码人序列的相似构建体用于人疫苗开发。
在其它实施方式中，如本文所述的沙粒病毒基因组区段或沙粒病毒病毒载体进一步包含报告蛋白。报告蛋白能够与如本文所述的抗原在相同时间表达。理想的，表达在正常光或其它波长的光下可见。在某些实施方式中，由报告蛋白产生的效果的强度可用于直接测量和监控沙粒病毒颗粒或三区段的沙粒病毒颗粒。
报告基因将很容易地被本领域技术人员识别。在某些实施方式中，沙粒病毒颗粒是荧光蛋白。在其它实施方式中，报告基因是GFP。GFP在暴露于UV或类似蓝色时发射亮绿色光。报告蛋白非限制性的例子包括多种酶，例如但不限于β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，新霉素磷酸转移酶，萤光素酶或RFP。
6.6免疫原性组合物和疫苗
本文提供了包含如本文所述的沙粒病毒病毒载体的疫苗、免疫原性组合物和药物组合物，包括如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段。该疫苗和药物组合物可以按照本领域标准流程进行制剂。该组合物可用于疾病的治疗和预防方法。
在具体实施方式中，本文所述的组合物用于治疗HPV感染或易感或HPV再激活的对象。在另一个具体的实施方式中，本文提供的组合物可以用于在给予组合物的宿主中诱导免疫应答。本文所述的免疫原性组合物可以用作疫苗，并且可以相应地配制成药物组合物。在一个具体的实施方式中，本文所述的免疫原性组合物用于预防或治疗对象(例如人对象)HPV感染或对象(例如人对象)中的HPV的再激活。
在某些实施方式中，本文提供的组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，这样的免疫原性组合物还包含佐剂。佐剂还可以在施用所述沙粒病毒载体之前、同时或之后与本文所述的沙粒病毒载体(包括如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)联合施用，但彼此分开。在一些实施方式中，术语“佐剂”是指当与本文描述的组合物联合或作为其一部分施用时放大、增强和/或加强对本文所述的沙粒病毒病毒载体的免疫应答的化合物，但是当该化合物单独施用时不会产生对沙粒病毒载体的免疫应答。在一些实施方式中，佐剂产生对沙粒病毒病毒载体的免疫应答并且不产生变态反应或其它不利反应。佐剂可通过几种机制增强免疫应答，包括例如淋巴细胞募集、B和/或T细胞的刺激以及巨噬细胞的刺激。当本文提供的疫苗或免疫原性组合物包含佐剂或与一种或多种佐剂一起施用时，可使用的佐剂包括但不限于无机盐佐剂或无机盐凝胶佐剂、微粒(particulate)佐剂、小微粒(microparticulate)佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐(明矾)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-O-酰化的单磷酰脂质A(MPL)(见GB 2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨酯80(Tween 80；ICL Americas，Inc)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，作为国际公开号WO2007/109812公开)、咪唑喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，作为国际公开号WO2007/109813公开)和皂苷如QS21(参见Kensil等，Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(Powell&Newman编，Plenum Press，NY，1995))；美国专利号5,057,540)。在一些实施方式中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是水包油乳剂(例如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂例如单磷酰脂质A组合(参见Stoute等，1997，N.Engl.J.Med.，336，86-91)。
组合物包含如本文所述的沙粒病毒，包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或如本文所述的沙粒病毒基因组区段，其单独使用或与药学上可接受的载体一起使用。可以使用遗传工程化的沙粒病毒悬浮液或分散液，特别是等渗水悬浮液或分散液。药物组合物可以是灭菌的和/或可以包含赋形剂，例如防腐剂，稳定剂，润湿剂和/或乳化剂，增溶剂，调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且以本身(per se)已知的方式制备，例如通过常规分散和悬浮方法的手段。在某些实施方式中，这样的分散体或混悬液可以包含粘度调节剂。将悬浮液或分散体保持在约2-8℃的温度下，或者优选更长时间的储存可以被冷冻，然后在使用前不久解冻。对于注射，疫苗或免疫原性制备物可以配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中。该溶液可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。
在某些实施方式中，本文所述的组合物另外包含防腐剂。在其他实施方式中，本文所述的药物组合物不包含防腐剂。
药物组合物包含约103至约1011个基因工程沙粒病毒的焦点形成单位。用于肠胃外施用的单位剂量形式是例如安瓿或小瓶，例如含有约103-1010个焦点形成单位(例如补足细胞系中的焦点形成单位)或105-1015个基因工程沙粒病毒物理颗粒的小瓶。
在另一实施方式中，本文提供的疫苗或免疫原性组合物被配制为适于通过(包括但不限于)口服，真皮内，肌内，腹膜内，静脉内，局部，皮下，经皮，鼻内和吸入途径以及经由划痕(刮过皮肤的顶层，例如使用分叉的针)对对象施用。特别的，可以使用皮下，肌内或静脉内途径。在一方面，将疫苗或免疫原性组合物配制为用于静脉内对对象施用。
对于鼻内或通过吸入施用，本文提供的使用制剂可以方便地以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾剂形式进行配制，并使用合适的推进剂如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量量的阀来确定。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物和适宜的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
活性成分的剂量取决于接种类型和对象的年龄，体重，个体状况，个体药代动力学数据和施用方式。
本文还提供了遗传工程化的沙粒病毒用于制备药物制剂形式的疫苗的方法和用途，所述药物制剂包含基因工程化的沙粒病毒作为活性成分。如本文提供的药物组合物以本身已知的方式制备，例如通过常规的混合和/或分散方法。
6.7治疗方法
本文提供了用于治疗和/或预防肿瘤疾病例如癌症的方法。这些方法包括向需要治疗和/或预防肿瘤疾病例如癌症的对象施用有效量的本文所述的沙粒病毒(参见6.1，6.2，6.3和6.4节)。本文还提供用于治疗和/或预防致瘤病毒感染的方法，其中所述方法包括向需要治疗和/或预防致瘤病毒感染的对象施用有效量的表达致瘤病毒的至少一种抗原的沙粒病毒。所述致瘤病毒可以是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。所述致瘤病毒抗原可以是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒抗原。
在一个实施方式中，本文提供治疗和/或预防对象中的HPV感染的方法，包括向对象施用如本文所述表达HPV抗原的沙粒病毒(参见6.1，6.2，6.3，6.4和6.5节)。在具体实施方式中，用于治疗和/或预防HPV感染的方法包括向有需要的对象施用有效量的沙粒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，其表达本文所述的至少一种HPV抗原。对象可以是哺乳动物，例如但不限于人类，小鼠，大鼠，豚鼠，家养动物，例如但不限于牛，马，绵羊，猪，山羊，猫，狗，仓鼠，驴。在一个具体的实施方式中，对象是人。
在另一实施方式中，本文提供了用于在对象中诱导抗HPV感染或其临床表现的免疫应答的方法，包括向对象施用沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段其表达HPV抗原或其组合物。
在另一实施方式中，对其施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的对象患有HPV感染或再激活、对其易感或存在风险。在另一具体实施方式中，对其施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的对象感染HPV或感染HPV再激活、对其易感或存在风险。
在另一实施方式中，对其施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的对象在皮肤或粘膜角蛋白细胞中患有HPV感染、对其易感或存在风险。在具体实施方式中，对其施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的对象在身体一个或多个器官患有HPV感染、对其易感或存在风险，包括但不限于皮肤，子宫，生殖器，呼吸道的区域。
在另一实施方式中，对其施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的对象患有下述征状，包括但不限于宫颈癌，肛门癌，外阴癌，阴道癌，阴茎癌、HPV阳性口咽癌(OSCC)、普通疣、跖疣、甲下或月经疣、生殖器疣、尖锐湿疣或性病疣、呼吸道乳头状瘤病和疣状表皮发育不良。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)对患有HPV感染、对其易感或存在风险的任何年龄组的对象进行施用。在具体实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于具有损害的免疫系统的对象，妊娠对象，正在进行器官或骨髓移植的对象，服用免疫抑制药物的对象，正在进行血液透析的对象，患有癌症的对象或患有HPV或HPV再激活、对其易感染或存在感染风险的对象。在一个更具体的实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于由于HIV感染而具有损害的免疫系统的对象，其患有HPV或HPV再激活、对其易感染或存在感染风险。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于散播性HPV感染风险增加的对象。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)施用于具有HPV休眠感染的对象。在具体实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于具有HPV休眠感染的对象，所述HPV可以在免疫系统损害(compromise)后再活化。因此，本文提供了用于防止HPV再激活的方法。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于感染一种或多种HPV基因型或有感染风险的对象。在某些实施方式中，一个或多个所述基因型包括HPV基因型1(HPV1)、HPV基因型2(HPV2)、HPV基因型3(HPV3)、HPV基因型4(HPV4)、HPV基因型6(HPV6)、HPV基因型7(HPV7)、HPV基因型8(HPV8)、HPV基因型10(HPV10)、HPV基因型11(HPV11)、HPV基因型13(HPV13)、HPV基因型16(HPV16)、HPV基因型18(HPV18)、HPV基因型22(HPV22)、HPV基因型26(HPV26)、HPV基因型31(HPV31)、HPV基因型32(HPV32)、HPV基因型33(HPV33)、HPV基因型35(HPV35)、HPV基因型39(HPV39)、HPV基因型42(HPV42)、HPV基因型44(HPV44)、HPV基因型45(HPV45)、HPV基因型51(HPV51)、HPV基因型52(HPV52)、HPV基因型53(HPV53)、HPV基因型56(HPV56)、HPV基因型58(HPV58)、HPV基因型59(HPV59)、HPV基因型60(HPV60)、HPV基因型63(HPV63)、HPV基因型66(HPV66)、HPV基因型68(HPV68)、HPV基因型73(HPV73)或HPV基因型82(HPV82)或其他基因型。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于感染一种或多种“高风险”基因型的HPV(例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73和HPV82)或具有感染风险的对象。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)被施用于赋予(confer)针对HPV感染或HPV再激活的细胞介导的免疫(CMI)的对象。不受理论限制，在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)感染和表达宿主(例如巨噬细胞)的抗原呈递细胞(APC)中感兴趣的抗原，用于在主要组织相容性复合体(MHC)I类上直接呈递抗原。在另一实施方式中，对对象施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)IFN-γ和CD8+T细胞大量应答(CD8+T细胞产生IFN-γ)以治疗或预防HPV感染或HPV再激活。
在另一实施方式中，与不存在所述治疗的发展HPV感染或HPV再激活的风险相比，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的施用将个体发展HPV感染或HPV再激活的风险降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
在另一实施方式中，与不存在所述治疗的HPV感染或HPV再激活的征状的临床表现相比，表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)的施用将HPV感染或HPV再激活的征状或临床表现降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
HPV感染的临床表现包括但不限于宫颈癌，肛门癌，外阴癌，阴道癌，阴茎癌、HPV阳性口咽癌(OSCC)、普通疣、跖疣、甲下或月经疣、生殖器疣、尖锐湿疣或性病疣、呼吸道乳头状瘤病和疣状表皮发育不良。
在另一实施方式中，与不存在所述治疗的针对HPV感染或HPV再激活的细胞介导免疫(CMI)应答相比，在具有未成熟新生儿免疫系统的对象中施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)诱导针对HPV感染或HPV再激活的细胞介导免疫(CMI)应答至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
在另一实施方式中，在对象中施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)诱导HPV抗原特异性免疫应答，导致在外周血中检测到增加数量的抗原特异性CD8+T细胞。在某些实施方式中，在对象中施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)诱导HPV抗原特异性CD8+T细胞的增加，其中HPV抗原特异性CD8+T细胞包含总的CD8+T细胞群的大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。在某些实施方式中，HPV抗原特异性CD8+T细胞的百分比可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定，例如通过四聚体染色测定。
由在对象中施用表达如本文所述的HPV抗原或其组合物的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段)所诱导的针对HPV感染或HPV再激活的细胞介导的免疫(CMI)应答功能的变化可通过本领域技术人员已知的任何测定来测量，包括但不限于流式细胞术(参见，例如，Perfetto等，2004，Nat Rev Immun.，4(8)：648-55)，淋巴细胞增殖测定法(参见，例如，Bonilla等，2008，Ann Allergy Asthma Immunol.，101：101-4；和Hicks等，1983，Am J Clin Pathol.，80：159-63)，测量淋巴细胞活化的测定法，包括测定T淋巴细胞的细胞因子活化后测定表面标记物表达的变化(参见，例如，Caruso等，1997，Cytometry，27：71-6)，ELISPOT测定(参见，例如，Czerkinsky等，1983，J ImmunolMethods.，65：109-121；和Hutchings等，1989，J Immunol Methods，120：1-8)或天然杀伤细胞细胞毒性测定法(参见，例如，Bonilla等，2005，Ann Allergy Asthma Immunol.May；94(5Suppl 1)：S1-63)。
(a)联合治疗
在一个实施方式中，本文提供了治疗和/或预防对象中HPV感染的方法，包括对对象施用表达如本文所述的HPV抗原的两种或多种沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段。见第6.1-6.5节。在具体实施方式中，治疗和/或预防HPV感染的方法包括施用表达如本文所述的HPV抗原的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，例如，其中编码S基因组区段GP的ORF取代为编码HPV抗原的核苷酸序列，其中HPV抗原可以是但不限于：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；或
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
以及表达如本文所述的HPV抗原的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段例如，其中编码S基因组区段GP的ORF取代为编码HPV抗原的核苷酸序列，其中HPV抗原可以是但不限于：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；或
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
在某些实施方式中，本文提供了用于治疗和/或预防感染的方法，包括施用表达如本文所述的HPV抗原的两种沙粒病毒病毒载体构建体或两种沙粒病毒基因组区段。在具体实施方式中，两种沙粒病毒病毒载体，包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体或复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体或沙粒病毒基因组区段，表达不同的HPV抗原。在其它实施方式中，两种沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段具有不同的沙粒病毒骨架。在其它实施方式中，两种沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段表达不同的HPV抗原并具有不同的沙粒病毒骨架。
在某些实施方式中，本文提供了治疗和/或预防HPV感染的方法，包括施用表达如本文所述的HPV抗原的3种或更多沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段。在另一实施方式中，本文提供了治疗和/或预防HPV感染的方法，包括施用4种或更多沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段、5种或更多沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段，6种或更多沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段或7种沙粒病毒病毒载体构建体或沙粒病毒基因组区段，其分别表达如本文所述的HPV抗原。在某些实施方式中，每种不同的沙粒病毒病毒载体表达不同的如本文所述的HPV抗原。在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于LCMV。在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于Junin病毒。在某些实施方式中，沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于组合的LCMV和Junin病毒。
在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16蛋白E7/E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16蛋白E7/E6融合蛋白和免疫调节性肽、多肽或蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16蛋白E7/E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16蛋白E7/E6融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16蛋白E7/E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段所诱发的抗原特异性CD8+T细胞应答而言，施用表达HPV16蛋白E7/E6融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发10％、50％、100％、150％或200％更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。
在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白和免疫调节性肽、多肽或蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段所诱发的抗原特异性CD8+T细胞应答而言，施用表达HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发10％、50％、100％、150％或200％更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。
在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白和免疫调节性肽、多肽或蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段所诱发的抗原特异性CD8+T细胞应答而言，施用表达HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发10％、50％、100％、150％或200％更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。
在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18E7融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白和免疫调节性肽、多肽或蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用单独表达HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16E6/HPV18 E7融合蛋白的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段所诱发的抗原特异性CD8+T细胞应答而言，施用表达HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白和GM-CSF的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发10％、50％、100％、150％或200％更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。
在具体实施方式中，如本文所述的HPV抗原与如本文所述的信号肽和/或接头共同表达。在具体实施方式中，如本文所述的HPV抗原和免疫调节性肽、多肽或蛋白与如本文所述的信号肽和/或接头共同表达。
在另一实施方式中，为编码如本文所述的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的一种或多种HPV抗原所产生的载体可基于LCMV克隆13或LCMV MP株。(参见，例如，6.8节)。
在另一实施方式中，为编码如本文所述的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的一种或多种HPV抗原所产生的载体可基于LCMV克隆13或LCMV MP株。(参见，例如，6.8节)。
在另一实施方式中，为编码如本文所述的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的一种或多种HPV抗原所产生的载体可基于Junin病毒。
在另一实施方式中，为编码如本文所述的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的一种或多种HPV抗原所产生的载体可基于Junin病毒。
(b)治疗方案
HPV抗原可以是任何如本文所述的HPV抗原。不受理论的限制，施用第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段并随后施用第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段产生初免-加强效果。
在某些实施方式中，本文提供了治疗和/或预防感染的方法，包括相继施用两种或多种沙粒病毒载体构建体，其分别表达相同或不同HPV抗原。每次施用的时间间隔可以是约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约18个月或约24个月。
在某些实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是同源的。在某些实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是异源的。
在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是旧世界沙粒病毒，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是旧世界沙粒病毒。在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是旧世界沙粒病毒，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是新世界沙粒病毒。在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是新世界沙粒病毒，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是新世界沙粒病毒。在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是新世界沙粒病毒，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是旧世界沙粒病毒。
在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于LCMV，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于LCMV。在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于LCMV，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于Junin病毒。在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于Junin病毒，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于Junin病毒。在某些具体实施方式中，第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段沙粒病毒来源于Junin病毒，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段来源于LCMV。
在某些实施方式中，本文提供了治疗和/或预防肿瘤疾病例如癌症的方法，其中第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段被首先施用作为“初免”，且第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段被施用作为“加强”。第一和第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段可表达相同或不同肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是人乳头瘤病毒抗原，Kaposi肉瘤相关疱疹病毒抗原，例如潜伏期相关核抗原，Epstein-Barr病毒抗原，例如EBV-EA，EBV-MA或EBV-VCA，Merkel细胞多瘤病毒抗原，例如MCV T抗原或人T-嗜淋巴细胞病毒抗原，例如HTLV-1 Tax抗原。肿瘤抗原还可以是甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，CA-125，MUC-1，上皮肿瘤抗原(ETA)，酪氨酸酶，黑素瘤相关抗原(MAGE)或ras和p53异常产物。肿瘤疾病可以是良性肿瘤相关疾病，例如子宫肌瘤和黑色素痣，潜在恶性赘生物，例如原位癌或恶性赘生物，例如癌症。在某些具体实施方式中，“初免”施用使用源自LCMV的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，“加强”使用源自Junin病毒的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段。在某些具体实施方式中，“初免”施用使用源自Junin病毒的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，“加强”使用源自LCMV的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段。
在某些实施方式中，较之施用单独表达HPV抗原或其片段的沙粒病毒病毒的载体，施用表达HPV抗原或其片段的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，伴随着施用表达HPV抗原或其片段的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，得到更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用表达E7/E6融合蛋白的单独的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/E6融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，伴随着施用表达HPV16 E7/E6融合蛋白的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段得到更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些实施方式中，与第一施用相比，第二施用后抗原特异性CD8+T细胞数增加了50％、100％、150％或200％。在某些实施方式中，施用表达HPV16 E7/E6融合蛋白的第三沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段比施用两种连续的表达HPV16 E7/E6融合蛋白的沙粒病毒病毒的载体得到更强的抗原特异性CD8+T细胞应答。在某些实施方式中，第三施用后比第一施用后的抗原特异性CD8+T细胞数增加了约50％、约100％、约150％、约200％或约250％(参见图5)。
在某些实施方式中，本文提供了治疗和/或预防感染的方法，包括施用两种或多种沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段，其中所述两种或多种沙粒病毒病毒载体是同源的且其中每次施用之间的时间间隔为约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约18个月或约24个月。
在某些实施方式中，较之施用表达HPV抗原或其片段的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和表达HPV抗原或其片段的第二同源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV抗原或其片段的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和表达HPV抗原或其片段的第二异源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的CD8+T细胞应答。
在某些具体实施方式中，表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是LCMV，且表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二同源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是LCMV。在某些具体实施方式中，表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是Junin病毒，且表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二同源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是Junin病毒。
在某些具体实施方式中，表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是LCMV，且表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二异源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是Junin病毒。在某些具体实施方式中，表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是Junin病毒，且表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二异源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段是LCMV。
在某些具体实施方式中，较之表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的施用第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段沙粒病毒和表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二同源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或其HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二异源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发更强的CD8+T细胞应答。在某些具体实施方式中，较之施用表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二同源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段而言，施用表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和表达HPV16 E7/E6融合蛋白、HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白、HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白或其HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白的第二异源沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段诱发约20％、约40％、约60％、约80％、约100％、约120％、约140％、约160％、约180％或约200％更强的CD8+T细胞应答。(参见图14)。
在某些实施方式中，本文提供了治疗和/或预防感染的方法，包括施用两种或多种沙粒病毒载体构建体，其中所述两种或多种沙粒病毒载体构建体是异源的且其中每次施用之间的时间间隔为约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约18个月或约24个月。
在又一实施方式中，本文提供了组合使用的表达如本文所述的HPV抗原的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和一种或多种复制缺陷的病毒载体。在一个更具体的实施方式中，所述复制缺陷的病毒载体选自痘病毒，腺病毒，甲病毒，单纯性疱疹病毒，副粘液病毒，弹状病毒，脊髓灰质炎病毒，腺相关病毒和仙台病毒及其混合物。在具体实施方式中，痘病毒是修饰的疫苗Ankara。
在又一实施方式中，本文提供了组合使用的表达如本文所述的HPV抗原的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段和一种或多种表达HPV抗原的复制缺陷的病毒的载体。在一个更具体的实施方式中，复制缺陷的病毒载体选自痘病毒，腺病毒，甲病毒，单纯性疱疹病毒，副粘液病毒，弹状病毒，脊髓灰质炎病毒，腺相关病毒和仙台病毒及其混合物。在具体实施方式中，痘病毒是修饰的疫苗Ankara。
在另一实施方式中，表达如本文所述的HPV抗原的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段在施用表达如本文所述的HPV抗原的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段之前或之后施用。例如表达HPV抗原的第一沙粒病毒病毒载体在第二沙粒病毒病毒载体的第一施用前或后约30-60分钟进行施用。
在另一实施方式中，表达疫苗抗原的第一沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段在施用表达疫苗抗原的第二沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段之前施用。在某些实施方式中，施用第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体之间存在约1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、5天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年。
在另一实施方式中，两种沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或两种沙粒病毒基因组区段在一个治疗方案中以约1:1-1:1000的摩尔比例范围进行施用，特别的包括:1:1比例、1:2比例、1:5比例、1:10比例、1:20比例、1:50比例、1:100比例、1:200比例、1:300比例、1:400比例、1:500比例、1:600比例、1:700比例、1:800比例、1:900比例、1:1000比例。
在另一实施方式中，施用表达如本文所述的HPV抗原的两种或多种沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或两种或多种沙粒病毒基因组区段的对象易受HPV感染或再激活或具有HPV感染或再激活风险。在另一实施方式中，施用表达如本文所述的HPV抗原的两种或多种沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或两种或多种沙粒病毒基因组区段的对象感染HPV或HPV再激活、易受HPV感染或再激活或具有HPV感染或再激活风险。
可以采用本文提供的方法治疗的对象易受HPV感染或再激活或具有HPV感染或再激活风险。
在另一实施方式中，所述表达如本文所述的HPV抗原的两种或多种沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段进一步表达至少另一免疫刺激性肽、多肽或蛋白。在某些实施方式中，免疫刺激性肽、多肽或蛋白是钙网蛋白(CRT)或其片段；泛素或其片段；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；恒定链(CD74)或其抗原性片段；结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；CD40配体或其抗原性片段；或Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
还提供了使用沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体，复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的异源初免-加强方法，其中两种沙粒病毒病毒载体源自不同沙粒病毒(例如，LCMV和Junin病毒)。这些沙粒病毒病毒载体可表达抗原，例如致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原。在具体实施方式中，致瘤病毒是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。
6.8核酸、载体系统和细胞系
在一个实施方式中，本文描述了编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的大基因组区段(L区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且基因组区段包含如6.5节所述的异源核苷酸序列，例如编码HPV抗原的异源核苷酸序列。
在一个实施方式中，本文描述了编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV抗原的核苷酸序列。在另一实施方式中，本文描述了编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体(包括感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体和复制缺陷的三区段的沙粒病毒病毒载体)或沙粒病毒基因组区段的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中糖蛋白基因的ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV抗原的异源核苷酸序列。在某些更具体的实施方式中，HPV抗原是如6.5节所述的抗原。
在某些实施方式中，本文提供的核酸序列可以是源自LCMV的特定毒株。LCMV毒株包括克隆13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在具体实施方式中，核酸来源于LCMV克隆13。在其它具体实施方式中，核酸来源于LCMV MP株或Junin病毒。
在一个更具体的实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的序列的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的序列。在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)与SEQ ID NO：1的核苷酸1639-3315的序列同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的核苷酸序列；和(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)与SEQ ID NO：1的核苷酸1639-3315的序列同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的核苷酸序列；(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列；和(iii)编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码表达产物的核苷酸序列，所述表达产物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1639-3315编码的氨基酸序列的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％；和(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码表达产物的核苷酸序列，所述表达产物的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1639-3315编码的氨基酸序列的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％；(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列；和(iii)编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)与SEQ ID NO：2的核苷酸1640-3316的序列同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的核苷酸序列；和(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)与SEQ ID NO：2的核苷酸1640-3316的序列同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的核苷酸序列；和(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列；和(iii)编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码表达产物的核苷酸序列，所述表达产物的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1640-3316编码的氨基酸序列的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％；和(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码表达产物的核苷酸序列，所述表达产物的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1640-3316编码的氨基酸序列的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％；(ii)编码HPV抗原的异源核苷酸序列和(iii)编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源核苷酸序列。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码至少一个自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列；和(ii)编码两个、三个或四个或更多HPV抗原的核苷酸序列。在具体实施方式中，编码自裂解肽的核苷酸序列编码捷申病毒2A。在某些实施方式中，本文提供了编码2、3、4或更多HPV抗原的核酸，其通过一个或多个编码自裂解肽或核糖体跳跃序列(例如，T2A)的核苷酸序列分隔。在某些实施方式中，本文提供了编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白的核酸，其通过一个或多个编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列分隔。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码至少一个自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列；(ii)编码两个、三个或四个或更多HPV抗原的异源核苷酸序列；和(iii)编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源核苷酸序列。在具体实施方式中，编码自裂解肽的核苷酸序列编码捷申病毒2A。在某些实施方式中，本文提供了编码由一个或多个编码自裂解肽或核糖体跳跃序列(例如，T2A)的核苷酸序列分隔的2、3、4或5种HPV抗原的核酸。在某些实施方式中，本文提供了编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV16 E6/E7融合蛋白分隔。在其它实施方式中，本文提供了编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV18 E6/E7融合蛋白分隔。在某些实施方式中，本文提供了编码HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白分隔。在其它实施方式中，本文提供了编码HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白分隔。在某些实施方式中，本文提供了编码HPV18 E7/HPV16E6融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白分隔。在其它实施方式中，本文提供了编码HPV18 E7/HPV16 E6融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV18E7/HPV16 E6融合蛋白分隔。在某些实施方式中，本文提供了编码HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白分隔。在其它实施方式中，本文提供了编码HPV16 E7/HPV18 E6/HPV16E6/HPV18 E7融合蛋白和一种或多种免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸，后者通过一种或多种编码自裂解肽或核糖体跳跃序列的核苷酸序列与HPV16 E7/HPV18 E6HPV16 E6/HPV18E7融合蛋白分隔。
在另一实施方式中，本文提供了编码沙粒病毒基因组区段的核酸，其包含(i)编码至少一种自裂解肽(或核糖体跳跃序列)的核苷酸序列；(ii)编码两个、三个或四个或更多HPV抗原的异源核苷酸序列；(iii)编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的异源核苷酸序列和(iv)编码信号序列的核苷酸序列，包括人酪氨酸酶分泌信号，包括人生长激素分泌信号，组织纤溶酶原激活物信号序列。
在一个实施方式中，本文描述了包含一个或多个载体的载体系统，所述载体一起编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒颗粒的基因组。特别的，本文提供了载体系统，其中一个或多个载体编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的两种沙粒病毒基因组区段，即L区段和S区段。该载体系统可以(在一个或多个分离的DNA分子上)编码：
·沙粒病毒S基因组区段，其被修饰从而携带该修饰的S基因组区段的沙粒病毒颗粒不能产生感染性的后代病毒颗粒；和包含编码(正义或反义)HPV抗原的核苷酸序列的沙粒病毒L基因组区段；
·沙粒病毒L基因组区段，其被修饰从而携带该修饰的L基因组区段的沙粒病毒颗粒不能产生感染性的后代病毒颗粒；和包含编码(正义或反义)HPV抗原的核苷酸序列的沙粒病毒S基因组区段；
·沙粒病毒S基因组区段，其被修饰从而携带该修饰的S基因组区段的沙粒病毒颗粒不能产生感染性的后代病毒颗粒，且其中沙粒病毒S基因组区段包含编码(正义或反义)HPV抗原的异源核苷酸序列；和野生型沙粒病毒L基因组区段；或
·沙粒病毒L基因组区段，其被修饰从而携带该修饰的L基因组区段的沙粒病毒颗粒不能产生感染性的后代病毒颗粒，且其中沙粒病毒L基因组区段包含编码(正义或反义)HPV抗原的异源核苷酸序列；和野生型沙粒病毒S基因组区段。
在某些实施方式中，本文描述了沙粒病毒(例如，LCMV或Junin病毒)基因组区段的cDNA，其中编码S基因组区段GP的ORF被取代为异源核苷酸序列，后者编码：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·重排的HPV16蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；或
·重排的HPV18蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段。
在某些实施方式中，本文描述了沙粒病毒(例如，LCMV或Junin病毒)基因组区段的cDNA，其中编码S基因组区段GP的ORF被取代为异源核苷酸序列，后者编码：
·HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E7或其抗原性片段；
·HPV16蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·重排的HPV16蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；
·HPV18蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段；或
·重排的HPV18蛋白E6/蛋白E7融合蛋白或其抗原性片段和免疫调节性肽、多肽或蛋白或其片段。
在某些实施方式中，异源核苷酸序列进一步编码下述，或感染性的复制缺陷的沙粒病毒基因组进一步包含编码下述的第二异源核苷酸序列：
·钙网蛋白(CRT)或其片段；
·泛素或其片段；
·粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；
·恒定链(CD74)或其抗原性片段；
·结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；
·单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；
·CD40配体或其抗原性片段；或
·Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
在某些实施方式中，本文描述了编码沙粒病毒(例如，LCMV或Junin病毒)基因组区段的核酸序列，其中编码S基因组区段GP的ORF被取代为编码一种或多种HPV抗原序列(例如，上述段落所列举的一种或多种)的异源核苷酸序列，其通过编码自裂解肽(或核糖体跳跃序列)的核苷酸序列分隔。在具体实施方式中，编码自裂解肽的核苷酸序列编码捷申病毒2A。
在另一实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含本节上文中描述的核酸或载体系统。还提供了源自所述细胞的细胞系、包含所述细胞的培养物和培养所述感染细胞的方法。在某些实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的大基因组区段(L区段)的核酸，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且基因组区段包含编码HPV抗原的核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV 16蛋白E6或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV 16蛋白E7或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV 18蛋白E6或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV 18蛋白E7或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV18 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段和HPV18 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码钙网蛋白或其免疫调节性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段和HPV18 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码钙网蛋白或其免疫调节性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码泛素或其免疫调节性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段和HPV18 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码泛素或其免疫调节性片段的异源核苷酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码GM-CSF或其免疫调节性片段的异源核苷酸序列。在其它更具体的实施方式中，短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白，GM-CSF和自裂解肽的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，自裂解肽是2A肽。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16蛋白E6、HPV16蛋白E7、HPV18蛋白E6和HPV18蛋白E7的核酸序列。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的核酸序列。在某些实施方式中，一个、两个、三个或全部四个HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段，可以是重排的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以直接融合一个或两个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以通过接头或自裂解肽融合一个或两个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以融合一个或两个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的序列可以以本领域技术人员已知的任何方式排列，例如，HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以位于一个不同的HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段的上游或下游。HPV16蛋白E6或其抗原性片段、HPV16蛋白E7或其抗原性片段、HPV18蛋白E6或其抗原性片段和HPV18蛋白E7或其抗原性片段中的每一个都可以融合信号肽。在某些其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/HPV16E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV18 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段的核酸序列。在某些其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码两种融合蛋白的核酸序列，其中第一融合蛋白为HPV16 E6/HPV16 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV18 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段；第二融合蛋白是选自HPV16E6/HPV16 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E6/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV16 E7/HPV18 E6融合蛋白或其抗原性片段、HPV16 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段、或HPV18 E6/HPV18 E7融合蛋白或其抗原性片段的不同融合蛋白。在某些其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含进一步编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的核酸序列。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白的核酸序列。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白的重排的序列和HPV18 E6/E7融合蛋白的重排的序列的核酸序列。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白的核酸序列，其直接彼此融合。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白和HPV18 E6/E7融合蛋白的核酸序列，其彼此通过肽接头或自裂解肽融合。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白的核酸序列，其位于HPV18 E6/E7融合蛋白上游。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白的核酸序列，其位于HPV18 E6/E7融合蛋白下游。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV16 E6/E7融合蛋白的核酸序列，其融合信号肽。在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码HPV18 E6/E7融合蛋白融合信号肽的核酸序列。在某些具体实施方式中，异源核苷酸序列进一步编码免疫调节性肽、多肽或蛋白。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段和HPV18 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码GM-CSF或其免疫调节性片段的异源核苷酸序列。在其它更具体的实施方式中，短基因组区段包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段和HPV18 E7/E6融合蛋白或其抗原性片段并编码GM-CSF和自裂解肽的异源核苷酸序列。在某些实施方式中，自裂解肽是2A肽。
在其它实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含编码如本文所述的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的短基因组区段(S区段)的核酸序列，其中基因组区段的一个ORF被缺失或功能性失活，且其中短基因组区段包含编码一种或多种HPV抗原的异源核苷酸序列，所述抗原通过一个或多个自裂解肽(或核糖体跳跃序列)分隔。在具体实施方式中，所述一个或多个自裂解肽是T2A肽。
在另一实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含两种如本文所述的核酸或载体系统。本文还提供了源自所述细胞的细胞系、包含所述细胞的培养物和培养所述感染细胞的方法。
在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列的核酸。在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列的表达载体。在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列的宿主细胞。
在某些实施方式中，本文提供了包含编码与SEQ ID NO：6，7，8或9的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。在某些实施方式中，本文提供了包含编码与SEQ ID NO：6，7，8或9的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列的核苷酸序列的表达载体。在某些实施方式中，本文提供了包含编码与SEQ ID NO：6，7，8或9的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列的核苷酸序列的宿主细胞。
在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：6，7，8或9的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列的分离的蛋白。在某些实施方式中，本文提供了表达包含与SEQ ID NO：6，7，8或9的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列的蛋白的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞在细胞培养基中培养。
在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列的核酸。在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列的表达载体。在某些实施方式中，本文提供了包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核苷酸序列的宿主细胞。
在某些实施方式中，本文提供了cDNA，其包含分别如6.2节和6.3节所述的沙粒病毒基因组区段或三区段的沙粒病毒病毒载体，或由其组成。
(a)非天然位置开放式阅读框
在一个实施方式中，本文提供了编码如6.2节所述沙粒病毒基因组区段的核酸。在更具体的实施方式中，本文提供了如表1所示的DNA核苷酸序列或一系列DNA核苷酸序列。第6.2节还提供了包含该核酸的宿主细胞。
在具体实施方式中，本文提供了工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒基因组区段的cDNA，其中沙粒病毒基因组区段编码如6.5节所述的异源ORF。
在一个实施方式中，本文提供了DNA表达载体系统，其编码工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒基因组区段。特别的，本文提供了DNA表达载体系统，其中一个或多个载体编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体的两种沙粒病毒基因组区段，即，L区段和S区段。该载体系统可编码(一个或多个分离的DNA分子)。
在另一实施方式中，本文提供了被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒S区段的cDNA，其是DNA表达系统的一部分或被整合在内。在其它实施方式中，被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒L区段的cDNA是DNA表达系统的一部分或被整合在内。在某些实施方式中，是沙粒病毒基因组区段的cDNA，其被工程化以(i)在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF；且(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被去除并取代为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，本文提供的cDNA可以是源自LCMV的特定毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在具体实施方式中，cDNA来源于LCMV克隆13。在其它具体实施方式中，cDNA来源于LCMV MP株。
在某些实施方式中，所述产生的编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体或三区段的沙粒病毒病毒载体的载体可基于LCMV的具体毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP株、Arm CA1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在某些实施方式中，如本文所述的沙粒病毒病毒载体或三区段的沙粒病毒病毒载体可基于LCMV克隆13。在其它实施方式中，所产生的编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体或三区段的沙粒病毒病毒载体的载体是LCMV MP株。LCMV克隆13的S区段的序列如SEQ ID NO：2所列。在某些实施方式中，LCMV克隆13的S区段的序列是SEQ ID NO：1所示的序列。LCMV克隆13的L区段的序列如SEQ ID NO：5所列。LCMV株MP的S区段的序列如SEQ ID NO：53所列。LCMV株MP的L区段的序列如SEQ ID NO：4所列。
在另一实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含本节前文所述的cDNA或载体系统。本文还提供了源自所述细胞的细胞系，包含所述细胞的培养物，培养所述感染细胞的方法。在某些实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含沙粒病毒基因组区段的cDNA，其被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF。在一些实施方式中，所述细胞包含S区段和/或L区段。
(b)三区段的沙粒病毒病毒载体
在一个实施方式中，本文提供了编码如6.3节所述的三区段的沙粒病毒病毒载体的核酸。在更具体的实施方式中，本文提供了如表2或表3所示的DNA核苷酸序列或一系列DNA核苷酸序列。第6.3节还提供了包含该核酸的宿主细胞。在具体实施方式中，本文提供了如所述的编码三区段的沙粒病毒病毒载体的核酸，其中三区段的沙粒病毒病毒载体编码如6.5节所述的异源ORF。
在具体实施方式中，本文提供了包含工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA的cDNA。在其它实施方式中，是三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA，其被工程化以(i)在与野生型ORF位点不同的位置携带沙粒病毒ORF；且(ii)其中三区段的沙粒病毒病毒载体编码如6.3节所述的异源ORF。
在一个实施方式中，本文提供了一起编码如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体的DNA表达载体系统。特别的，本文提供了DNA表达载体系统，其中一个或多个载体编码如本文所述的三区段的沙粒病毒病毒载体的三个沙粒病毒基因组区段，即，一个L区段和两个S区段或两个L区段和一个S区段。该载体系统可编码(一个或多个分离的DNA分子)。
在另一实施方式中，本文提供了沙粒病毒S区段的cDNA，其被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF，且其是DNA表达系统的一部分或被整合在内。在其它实施方式中，被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF的沙粒病毒L区段的cDNA是DNA表达系统的一部分或被整合在内。在某些实施方式中，是三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA，其被工程化以(i)在与野生型ORF位点不同的位置携带ORF；且(ii)编码GP、NP、Z蛋白或L蛋白的ORF被去除并取代为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
在某些实施方式中，本文提供的cDNA可以是源自LCMV的特定毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP株、Arm CA 1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在具体实施方式中，cDNA来源于LCMV克隆13。在其它具体实施方式中，cDNA来源于LCMV MP株。
在某些实施方式中，所述产生的编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体或三区段的沙粒病毒病毒载体的载体可基于LCMV的具体毒株。LCMV的毒株包括克隆13、MP株、Arm CA1371、Arm E-250、WE、UBC、Traub、Pasteur、810885、CH-5692、Marseille#12、HP65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、Douglas、GR01、SN05、CABN及其衍生物。在某些实施方式中，如本文所述的沙粒病毒病毒载体或三区段的沙粒病毒病毒载体可基于LCMV克隆13。在其它实施方式中，所产生的编码如本文所述的沙粒病毒病毒载体或三区段的沙粒病毒病毒载体的载体是LCMV MP株。LCMV克隆13的S区段的序列如SEQ ID NO：2所列。在某些实施方式中，LCMV克隆13的S区段的序列是SEQ ID NO：1所示的序列。LCMV克隆13的L区段的序列如SEQ ID NO：5所列。LCMV株MP的S区段的序列如SEQ ID NO：53所列。LCMV株MP的L区段的序列如SEQ ID NO：4所列。
在另一实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含本节前文所述的cDNA或载体系统。本文还提供了源自所述细胞的细胞系，包含所述细胞的培养物，培养所述感染细胞的方法。在某些实施方式中，本文提供了细胞，其中所述细胞包含三区段的沙粒病毒病毒载体的cDNA。在一些实施方式中，所述细胞包含S区段和/或L区段。
6.9分析
检测沙粒病毒载体感染性的分析：本领域技术人员已知的任何分析可用于检测沙粒病毒载体制备物的感染性。例如，可以通过“焦点形成单位分析”(FFU分析)来确定病毒/载体滴度。简而言之，补足细胞，例如表达LCMV GP蛋白的HEK293细胞，被铺板(plate)并用不同稀释度的病毒/载体样品接种。孵育期后，为了使细胞形成单层并使病毒附着于细胞，将单层用甲基纤维素覆盖。当进一步孵育平板时，原始感染的细胞释放病毒后代。由于甲基纤维素覆盖，新病毒的传播仅限于邻近的细胞。因此，每个感染性颗粒产生被称为焦点的感染细胞的圆形区域。通过使用抗LCMV-NP的抗体和基于HRP的显色反应，可以使这样的焦点(Foci)可视化并据此可计数。病毒/载体的滴度可以以每毫升的焦点形成单位(FFU/mL)计算。
为了确定携带转基因的载体的感染滴度(FFU/mL)，通过使用相应的转基因特异性抗体而不是抗LCMV-NP抗体来修饰该分析。
血清ELISA：可以通过抗原特异性血清ELISA(酶联免疫吸附分析)确定动物(例如小鼠，豚鼠)接种疫苗后的体液免疫应答。简而言之，将板用抗原(例如重组蛋白)包被，封闭以避免抗体的非特异性结合，并与连续稀释的血清一起孵育。孵育后，可以使用例如酶偶联的抗物种(例如小鼠，豚鼠)特异性抗体(检测总IgG或IgG亚类)和随后的颜色反应来检测结合的血清抗体。可以将抗体滴度确定为例如终点几何平均滴度。
ARPE-19细胞中的中和试验：使用来自ATCC的ARPE-19细胞和GFP-标记的病毒，通过以下细胞试验确定血清中诱导抗体的中和活性。另外使用补充的豚鼠血清作为外源补体的来源。在用于中和之前的一天或两天，在384孔板中以6.5x103个细胞/孔(50μl/孔)接种开始分析。在没有细胞的96孔无菌组织培养板中于37℃进行中和1h。中和孵育步骤后，将混合物加入到细胞中，并再孵育4天用于使用平板读数器的GFP检测。在每个平板上使用阳性中和人血清作为分析阳性对照以检查所有结果的可靠性。滴度(EC50)使用4参数逻辑曲线拟合来确定。作为额外的测试，用荧光显微镜检查孔。
噬斑减少分析：简言之，通过使用标记有绿色荧光蛋白的GPCMV分离物，使用5％兔血清作为外源补体来源，进行豚鼠巨细胞病毒的噬斑减少(中和)分析，噬斑通过荧光显微镜计数。中和滴度被定义为与对照(免疫前)血清样品相比导致噬斑减少50％的血清的最高稀释度。
豚鼠肺成纤维(GPL)细胞的中和试验：简言之，在具有补充兔血清(1％)作为外源补体来源的GPL完全培养基中制备测试和对照(接种疫苗前)血清的系列稀释液。稀释系列范围为1:40至1:5120。将血清稀释液与带有eGFP标记的病毒(每孔100-200pfu)在37℃孵育30分钟，然后转移到含有融汇(confluent)的GPL细胞的12孔板中。样品一式三份处理。在37℃孵育2小时后，用PBS洗涤细胞，重新补料GPL完全培养基并在37℃/5％CO2下孵育5天。荧光显微镜观察噬斑，计数，并与对照孔比较。与对照相比导致噬斑数量减少50％的血清稀释度被指定为中和滴度。
qPCR：根据制造商提供的方案，使用QIAamp病毒RNA微量试剂盒(QIAGEN)分离LCMVRNA基因组。通过在StepOnePlus Real Time PCR系统(Applied Biosystems)上使用IIIOne-Step qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)和部分LCMV NP编码区特异性引物和探针(FAM报告子和NFQ-MGB猝灭剂)进行定量PCR来检测LCMV RNA基因组等同物。反应的温度谱为：60℃ 30分钟，95℃ 2分钟，然后是95℃ 15秒、56℃ 30秒的45个循环。通过将样品结果与由对应含有引物和探针结合位点的LCMV NP编码序列的片段的分光光度定量的、体外转录的RNA片段的log10稀释系列制备的标准曲线进行比较来定量RNA。
蛋白质印迹：使用RIPA缓冲液(Thermo Scientific)在感染后的指定时间点裂解在组织培养瓶或悬浮液中生长的感染细胞，或者直接使用而不用细胞裂解。用还原剂和NuPage LDS样品缓冲液(NOVEX)将样品加热至99℃达10分钟，然后冷冻至室温，然后上样到4-12％SDS-凝胶上进行电泳。使用Invitrogens iBlot凝胶转移装置将蛋白质印迹在膜上并通过Ponceau染色显现。最后，用针对感兴趣的蛋白的一抗和碱性磷酸酶缀合的二抗探测制备物，然后用1步NBT/BCIP溶液(INVITROGEN)染色。
用于检测抗原特异性CD8+T细胞增殖的MHC-肽多聚体染色分析：本领域技术人员已知的任何试验可用于测试抗原特异性CD8+T细胞应答。例如，可以使用MHC-肽四聚体染色分析法(参见例如Altman等，1996，Science；274：94-96；和Murali-Krishna等，1998，Immunity，8：177-187)。简而言之，该分析包括以下步骤，使用四聚体分析来检测抗原特异性T细胞的存在。为了使T细胞检测其特异性的肽，它必须识别肽和定制为抗原特异性T细胞(通常为荧光标记的)的MHC分子四聚体。然后通过荧光标记通过流式细胞术检测四聚体。
用于检测抗原特异性CD4+T细胞增殖的ELISPOT分析：技术人员已知的任何分析法可用于测试抗原特异性CD4+T细胞应答。例如，可以使用ELISPOT分析法(参见例如Czerkinsky等，1983，J Immunol Methods.；65：109-121；和Hutchings等，1989，J ImmunolMethods.；120：1-8)。简而言之，该分析包括以下步骤：用抗细胞因子抗体包被免疫印迹板。细胞在免疫印迹板中孵育。细胞分泌细胞因子，然后被洗掉。然后用第二生物素化的抗细胞因子抗体包被平板并用抗生物素蛋白-HRP系统可视化。
用于检测CD8+和CD4+T细胞应答功能的胞内细胞因子分析：本领域技术人员已知的任何分析可用于测试CD8+和CD4+T细胞应答的功能。例如，可以使用结合流式细胞术的胞内细胞因子分析法(参见例如Suni等，1998，J Immunol Methods.；212：89-98；Nomura等，2000，Cytometry；40：60-68；和Ghanekar等，2001，Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology；8：628-63)。简而言之，该分析包括以下步骤：通过特定的肽或蛋白激活细胞，加入蛋白转运抑制剂(例如布雷菲德菌素A)以将细胞因子保留在细胞内。洗涤后，可将其他细胞标记物的抗体加入细胞中。然后将细胞固定并透化。加入抗细胞因子抗体，并可通过流式细胞术分析细胞。
确定病毒载体复制缺陷的分析：本领域技术人员已知的确定感染性的和能够复制的病毒颗粒浓度的任何分析也可用作检测样品中的复制缺陷型病毒颗粒。例如，使用非补足细胞的FFU分析可用于此目的。
此外，基于噬斑的分析是用于确定病毒样品中根据噬斑形成单位(PFU)的病毒浓度的标准方法。具体而言，用不同稀释度的病毒感染融汇的单层非补足宿主细胞，并用例如琼脂的半固体培养基覆盖，以防止病毒感染任意扩散。当病毒在固定的细胞单层内的细胞中成功感染并复制时，形成病毒噬斑(参见例如Kaufmann，SH；Kabelitz，D.(2002).Methodsin Microbiology Vol.32：Immunology of Infection.Academic Press.ISBN 0-12-521532-0)。噬斑形成可能需要3-14天，这取决于分析的病毒。通常手动计数噬斑，并将结果结合用于制备板的稀释因子来计算每个样本单位体积(PFU/mL)的噬斑形成单位的数量。PFU/mL结果表示样品中感染性的能够复制的颗粒的数量。
病毒抗原表达分析：技术人员已知的任何分析可用于测量病毒抗原的表达。例如，可以进行FFU分析。为了检测，使用针对对应病毒抗原的单克隆或多克隆抗体制备物(转基因特异性FFU)。此外，可以进行蛋白质印迹。
动物模型可以在动物模型中测试包含表达本文所述的HPV抗原或其组合物的感染性的复制缺陷型沙粒病毒的疫苗的安全性、耐受性和免疫原性效果。在某些实施方式中，可用于测试本文使用的疫苗及其组合物的安全性、耐受性和免疫原性效果的动物模型包括小鼠，豚鼠，大鼠和猴。在一个优选的实施方式中，可用于测试本文使用的疫苗及其组合物的安全性、耐受性和免疫原性效果的动物模型包括小鼠。
7.实施例
这些实施例表明基于沙粒病毒的载体技术可成功地用于通过将抗原包含在沙粒病毒载体中来开发针对HPV感染的新型疫苗，并且此类疫苗的施用可以诱导高水平的抗原特异性CD8+T细胞应答以控制HPV感染。
7.1沙粒病毒载体基因组的设计
参考已建立的方法(美国专利申请公开号US 2010/0297172A1；和Flatz等，2010，Nat Med.March；16(3)：339-345)，设计了rLCMV和rJUNV疫苗载体，其表达HPV 16型(HPV主要致瘤基因型，包括突变(Cassetti等，2004，Vaccine 22：520-527))蛋白E6和E7的融合物以消除抗原的致瘤潜力。由于产生针对HPV感染细胞的T细胞免疫所需的表位在HPV E6和E7中都是线性的，因此可以将两种肿瘤相关抗原(TAA)作为融合蛋白引入单个载体中。
图1显示了包括短(1；～3.4kb)和大(2；～7.2kb)RNA片段的野生型沙粒病毒的基因组。短片段携带编码核蛋白(3)和糖蛋白(4)的开放阅读框。大片段编码RNA依赖性RNA聚合酶L(5)和基质蛋白Z(6)。野生型沙粒病毒可通过缺失糖蛋白基因并插入替代糖蛋白基因的诱导免疫应答的选择性抗原(7)来成为复制缺陷型疫苗载体。
表达E7E6的rLCMV载体的设计：为了产生表达单独的E7/E6融合蛋白或与免疫调节肽、多肽或蛋白融合的rLCMV疫苗载体，设计了各种rLCMV载体构建体。图2A和2B显示了单独表达HPV16 E7和E6融合蛋白或与各种免疫调节肽、多肽或蛋白质组合产生的不同载体构建体。
以下序列是可用于本文所述的方法和组合物的说明性氨基酸序列和核苷酸序列。在一些情况下，使用DNA序列来描述病毒基因组区段的RNA序列。RNA序列可以容易地从DNA序列推导出来。示例性序列是：
-编码在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的重组LCMV(HK1-E7E6，SEQ ID NO：10)，
-编码连接至热休克蛋白钙网蛋白的在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16E7/E6融合蛋白的重组LCMV(HK1-E7E6-CRT，SEQ ID NO：11)，
-编码连接至泛素的在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16E7/E6融合蛋白的重组LCMV(HK1-E7E6-Ub，SEQ ID NO：12)，
-编码与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF共表达并由编码自裂解肽(2A肽)的核苷酸序列分隔的在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的重组LCMV(HK1-E7E6-GMCSF，SEQ ID NO：13)，
7.2载体表征
为了分析产生的载体的复制，使用表达LCMV GP的悬液HEK293细胞进行生长曲线测定。用感染倍数(MOI)为0.001的单个E7/E6载体(HK1-E7E6，HK1-E7E6-CRT，HK1-E7E6-Ub和HK1-E7E6-GMCSF)或表达绿色荧光蛋白(HK1-GFP)的载体感染相应的细胞。每24小时抽取一次样品并通过焦点形成单位(FFU)测定进行分析。如图3所示，对应结果表明，与HK1-GFP相比，所有测试的载体展现出相似的生长动力学和峰值滴度，表明单独的E7/E6转基因不比载体报道基因GFP更大程度地干扰载体复制。
(a)转基因表达
蛋白质印迹实验证实所有测试的构建体均存在HPV E7E6抗原。如图4所示，用单独的构建体HK1-E7E6(组1)，HK1-E7E6-GMCSF(组2)，HK1-E7E6-CRT(组3)和HK1-E7E6-Ub(组4))以0.001的MOI或HK1-GFP对照载体(组5)感染HEK 293细胞。感染后96小时分析细胞。将蛋白质在SDS凝胶上分离，转移到硝酸纤维素膜上，用抗HPV E7抗体和适当的第二抗体检测HPV E7蛋白的表达。根据科学网关蛋白质分子量计算器(HK1-E7E6：～30kDa；HK1-mE7E6-GMCSF：～48kDa/30kDa；HK1-mE7E6-CRT：～78kDa；HK1-mE7E6-Ub：～38kDa)计算转基因的期望大小。对于所有测试的构建体都检测到由箭头指示的特定条带。然而，观察到显著不同的表达水平，HK1-E7E6和HK1-E7E6-Ub感染的细胞表现出最低的抗原水平。
(b)免疫原性
为了考察HK1-E7E6在同源初免—加强设置中诱导CD8+T细胞应答的能力，在第0、41和102天，用HK1-E7/E6对C57BL/6小鼠接种三次。随后在实验的第10、38、48、73和109天通过四聚体染色分析抗原(E7)特异性CD8+T细胞应答。获得的数据(图5)表明用HK1-E7E6单次免疫后诱导了显著的抗原特异性CD8+T细胞应答。这些免疫反应被认为在相同的疫苗载体再给药时可以显著增强，即被加强，这可以重复进行。
随后通过评估在用HK1-E7E6，HK1-E7E6-CRT，HK1-E7E6-Ub和HK1-E7E6-GMCSF进行静脉内免疫接种后小鼠中抗原特异性CD8+T细胞的诱导频率来比较不同测试疫苗的免疫原性。次优的载体剂量(1×104FFU)被用于允许构建体的分化。原初小鼠用作对照。
随后通过四聚体染色分析抗原-(E7-)特异性CD8+T细胞应答。图6显示通过静脉内注射1x104FFU的HK1-E7E6，HK1-E7E6-CRT，HK1-E7E6-Ub和HK1-E7E6-GMCSF免疫一次的C57BL/6小鼠(每组n＝5)的结果。原初小鼠用作对照。随后在免疫后第9天通过四聚体染色(H-2Db/HPV16 E7 49-57(RAHYNIVTF))分析E7特异性CD8+T细胞应答。四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示为总CD8+T细胞池的百分比。该数据表明，与其他测试的载体构建体相比，HK1-E7E6-GMCSF诱导相当高的抗原特异性CD8+T细胞应答。
随后进一步分析选定的测试疫苗的免疫原性，并通过评估疫苗接种后小鼠中抗原特异性CD8+T细胞应答的诱导进行比较。用HK1-E7E6，HK1-E7E6-GMCSF或作为不相关的阴性对照载体的HK1-GFP免疫C57BL/6小鼠。使用表达HPV16 E7E6融合蛋白(具有Rb结合位点和E6锌结合域突变)的重组腺病毒5(Ad5)载体Ad5-E7E6作为基准载体。对照小鼠接受注射0.9％NaCl。第二次注射后七天，从接种小鼠分离脾细胞并用HPV16 E6或HPV16 E7肽刺激。随后通过双重免疫荧光分析法分析产生IFN-γ的CD8+T细胞的百分比。
图7显示了由疫苗诱导的肽特异性CD8+T细胞应答的检测。在第0天和第28天肌内注射1x105FFU的HK1-E7E6(组1和2)，HK1-GFP(组3)或HK1-E7E6-GMCSF(组5)或1×107PFU的Ad5-E7E6(组4)，免疫两次C57BL/6小鼠(每组n＝5)。对照小鼠(组6)在第0天和第28天接受两次0.9％NaCl注射。最后一次接种后7天，分离免疫小鼠的脾细胞并在GolgiPlug(1μl/ml)存在下于37℃过夜用HPV16 E6aa50-57肽或E7aa49-57肽刺激(全部为1μg/ml)。将细胞用缀合有PE的抗小鼠CD8a抗体染色，洗涤，透化并用CytoFix/CytoPerm固定。随后，洗涤细胞并用FITC缀合的抗小鼠IFN-γ抗体进行胞内染色。洗涤后，用FACSCalibur获得细胞并用CellQuest软件分析。
该数据显示了组1、2、4和5中的强的HPV16 E7特异性CD8+T细胞应答，即在用HK1-E7E6，HK1-E7E6-GMCSF或Ad5-E7/E6免疫接种的小鼠中的强应答。在用HK1-E7E6-GMCSF或Ad5-E7E6免疫的小鼠中观察到弱的HPV16 E6特异性CD8+T细胞应答，表明与E7相比E6的免疫原性较弱。
为了进一步考察和比较编码不同免疫刺激序列的测试载体的免疫原性，通过静脉内注射HK1-E7E6-GMCSF，HK1-E7E6-VP22，HK1-E7E6-CD40L，HK1-Flt3L-E7E6，HK1-Flt3L-E7E6shuffle或HK1-li-E7E6构建体分析了抗原特异性CD8+T细胞的诱导频率。此外，使用了不同的载体剂量来进一步研究诱导反应的剂量依赖性。假感染的小鼠用作对照。为了分析不同免疫途径的效果，一个对照组肌肉注射了106FFU的HK1-E7E6-GMCSF。随后在实验的第8和18天通过四聚体染色(H-2Db/HPV16 E7 49-57(RAHYNIVTF))分析在血液中循环的E7特异性CD8+T细胞的频率。四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示为测试样品中总CD8+T细胞的百分比。
图8显示了上述实验的结果，其表明，在106FFU的剂量下，可以用所有测试的构建体实现在～4％-11％范围内的E7特异性CD8+频率。该结果进一步表明，与肌内注射相比，可以通过静脉内免疫诱导显著更高的CD8+T细胞应答。
(c)保护功效
随后在TC-1模型(Lin等人，1996，Cancer Res.；56(1)：21-6)中研究了疫苗候选物的保护功效，其是开发治疗性HPV疫苗最常用的模型之一。在本实验中使用了来源于小鼠原代上皮细胞的TC-1肿瘤细胞，其用HPV-16 E6和E7和c-Ha-ras致瘤基因共转化。免疫的小鼠在第二次接种后通过皮下注射TC-1肿瘤细胞进行攻击。攻击后对某些处理组进行第三次接种，以进一步增强免疫力。通过评估无肿瘤小鼠的数量以及每5天测量动物的肿瘤体积来评估保护效力。比较了接种的动物和未接种的对照动物的平均肿瘤体积。
图9A和9B显示了在第0天和第28天两次通过肌内注射1x105FFU的HK1-E7E6(组1和2)，HK1-GFP(组3)或HK1-E7E6-GMCSF(组5)或1x107PFU的Ad5-E7E6(组4)免疫C57BL/6小鼠(每组n＝5)。对照小鼠(组6)在第0天和第28天接受两次0.9％NaCl注射。在第55天，来自第1、3、4、5和6组的小鼠用相同的方案进一步加强。在第35天，皮下注射5×104个TC-1肿瘤细胞。每周两次心跳监测肿瘤生长。
结果表明所观察到的诱导的E7特异性CD8+T细胞应答与接种小鼠中的抗肿瘤效果良好相关。用HK1-E7E6或HK1-E7E6-GMCSF免疫显著降低平均肿瘤体积以及实验组中的荷瘤小鼠的百分比。观察到的结果与用Ad5-E7E6接种后观察到的效果相当。
(d)治疗功效
为了进一步评估疫苗候选物的治疗功效，用测试载体接种携带TC-1肿瘤的小鼠，随后分析在血液中循环的E7特异性CD8+T细胞的频率。图10显示了在第1天注射1×105个TC-1肿瘤细胞、随后在第4和14天免疫接种缓冲液(G1)，106FFU HK1-E7E6(G2)，106FFU HK1-E7E6-GMCSF(G3)，106FFU HK1-E7E6-CD40L(G4)或105FFU r3LCMV-E7E6的C57BL/6小鼠的结果。在第13天(A，B)和第23天(C，D)通过四聚体染色分析E7特异性CD8+T细胞。结果证明，用所有测试的载体构建体静脉内免疫后，E7特异性CD8+T细胞的频率高。
为了还考察抗载体免疫应答的诱导，在用指定的测试载体接种疫苗后，在荷瘤小鼠中分析了LCMV NP特异性CD8+T细胞频率。该分析的结果显示在图11中，其显示了用所有载体构建体静脉内免疫后NP特异性CD8+T细胞的高频率。
为了分析E7特异性CD8+T细胞应答对肿瘤控制的影响，监测了免疫接种小鼠的体重(数据未显示)以及相应动物的肿瘤体积和总存活率。图12A显示了在第1天注射1×105个TC-1肿瘤细胞、随后在第4天和第14天用PBS(G1)，106FFU HK1-E7E6(G2)，106FFU HK1-E7E6-GMCSF(G3)，106FFU HK1-E7E6-CD40L(G4)或105FFU r3LCMV-E7E6(G5)免疫接种的C57BL/6小鼠肿瘤接种后约55天的肿瘤体积结果。图12B显示了相同的C57BL/6小鼠在肿瘤接种后80天延长观察的肿瘤体积结果。图12C显示了接种疫苗后小鼠的总存活率。相应的结果表明在用表达HPV E7E6的LCMV载体接种的所有组中都控制了肿瘤生长，注射这些载体的小鼠具有更好的总存活率。然而，用HK1-E7E6(G2)免疫所赋予的保护稍微低于其他测试的构建体。
作为对抗载体免疫应答的进一步研究，使用上述相同的方法分析了用PBS(G1)，1x107PFU的Ad5-E7E6(G2)和106FFU HK1-E7E6(G3)接种后携带TC-1肿瘤的小鼠的外周血中E7特异性CD8+T细胞和LCMV NP特异性CD8+T细胞的形成。这个分析的结果显示在图13和14，它们再次证明了在用HK1-E7E6LCMV载体静脉内免疫后的高频率的E7特异性CD8+T细胞和LCMV NP特异性CD8+T细胞。另外，表达HPV E7E6的LCMV载体在免疫后甚至表现出较之表达HPV E7E6的基于腺的载体而言更高百分比的E7特异性CD8+T细胞。
还在用PBS(G1)，1x107PFU的Ad5-E7E6(G2)和106FFU HK1-E7E6(G3)接种的小鼠中监测了肿瘤体积和总存活率。图15A显示肿瘤接种后80天的肿瘤体积结果。图15B显示了接种疫苗后小鼠的总存活率。这些结果显示表达HPV E7E6的LCMV载体能够控制肿瘤生长并导致与表达HPV E7E6的基于腺的载体相比的更好的总存活率。
7.3初免-加强免疫
由于针对肿瘤生长的赛跑，快速诱导强抗肿瘤免疫应答对于癌症免疫疗法的成功开发是重要的挑战。为了实现这些目标，可能需要重复的初免—加强免疫策略。尽管已经证明复制缺陷型LCMV载体可以在同源初免—加强免疫接种中有效地再施用，但是异源初免—加强免疫接种方案可以提供明显的优势，例如允许接种之间更短的间隔，或者导致甚至更强的功效。可以使用基于Junin病毒或Mopeia病毒等沙粒病毒家族各种其它成员的复制缺陷形式的疫苗载体。
为了考察对应载体诱导针对HPV抗原的CD8+T细胞应答的能力，产生了编码在Rb结合位点和E6锌结合域具有突变的HPV16 E7E6融合蛋白的基于Junin病毒疫苗株Candid#1的复制缺陷的糖蛋白缺陷型载体(rJUNV-E7E6)。通过静脉内注射105FFU的rJUNV-E7E6或HK1-E7E6，将C57BL/6小鼠接种一次。免疫8天后，通过血液的四聚体染色分析抗原-(E7表位-)特异性CD8+T细胞应答的诱导。图16中显示的结果表明，rJUNV-E7E6诱导了与基于rLCMV的HK1-E7E6疫苗类似量级的CD8+T细胞应答。
为了研究同源与异源初免-加强免疫对抗原特异性CD8+T细胞应答的诱导的影响，在第0天通过静脉内注射105FFU的HK1-E7E6或rJUNV-E7E6免疫C57BL/6小鼠。35天后，用相应的同源或异源载体(105FFU i.v.)加强小鼠。在实验的第8、28和42天通过四聚体染色分析抗原-(E7表位-)特异性CD8+T细胞应答的诱导。图17中的结果表明，与HK1-E7E6同源初免-加强免疫相比，异源rJUNV-E7E6初免-HK1-E7E6加强诱导显著更高的E7特异性CD8+T细胞频率(未配对双尾学生t检验，p<0.05)。此外，数据显示与用相同糖蛋白假型化(pseudotyped)的rLCMV载体相似，rJUNV-E7E6载体(用来自生产细胞的LCMV-GP假型化)可以在同源初免-加强免疫接种中有效地再施用(比较图5)。
7.4能够复制的三区段的沙粒病毒病毒载体
在试图诱导由于复制感染引发的炎症而引起更强的效应T细胞应答时，产生了表达HPV 16型蛋白E6和E7融合体的复制型三区段LCMV载体。通过评估小鼠静脉注射对应载体后抗原特异性CD8+T细胞应答的诱导，比较了非复制型双区段载体(HK1-E7E6)和类似的复制型三区段载体(r3LCMV-E7E6)的免疫原性。在实验的第0天和第35天用105FFU的r3LCMV-E7E6或HK1-E7E6免疫C57BL/6小鼠。使用负载E7表位的MHCI类四聚体与抗CD8a抗体组合对表位特异性CD8+T细胞进行染色。计算外周血中CD8+T细胞区室(compartment)内E7-四聚体结合细胞的频率。图18显示了这些实验的结果，这些实验证明，与非复制载体相比，可以通过复制载体来诱导4-5倍更高的E7特异性CD8+的频率。
为了考察使用能够复制的载体进行同源与异源初免—加强免疫的效果，在用r3LCMV-E7E6和基于Junin Candid#1病毒(r3JUNV-E7E6)的同源或异源组合的相似的能够复制的载体接种后的小鼠中分析了抗原特异性CD8+T细胞应答的诱导。图19显示了这些实验的结果，这些实验证明基于能够复制的三区段的LCMV和JUNV的疫苗载体的同源和异源初免—加强组合诱导强的HPV E7特异性CD8+T细胞应答。
表1：序列
序列表
<110> 霍欧奇帕生物科技股份公司
<120> HPV疫苗
<130> 104659PC
<140> PCT/EP2016/xxxxxx
<141> 2016-06-09
<150> 62/173,805
<151> 2015-06-10
<150> 62/254,410
<151> 2015-11-12
<150> 62/331,158
<151> 2016-05-03
<160> 44
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3376
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒区段S
<400> 1
cgcaccgggg atcctaggct ttttggattg cgctttcctc tagatcaact gggtgtcagg 60
ccctatccta cagaaggatg ggtcagattg tgacaatgtt tgaggctctg cctcacatca 120
tcgatgaggt gatcaacatt gtcattattg tgcttatcgt gatcacgggt atcaaggctg 180
tctacaattt tgccacctgt gggatattcg cattgatcag tttcctactt ctggctggca 240
ggtcctgtgg catgtacggt cttaagggac ccgacattta caaaggagtt taccaattta 300
agtcagtgga gtttgatatg tcacatctga acctgaccat gcccaacgca tgttcagcca 360
acaactccca ccattacatc agtatgggga cttctggact agaattgacc ttcaccaatg 420
attccatcat cagtcacaac ttttgcaatc tgacctctgc cttcaacaaa aagacctttg 480
accacacact catgagtata gtttcgagcc tacacctcag tatcagaggg aactccaact 540
ataaggcagt atcctgcgac ttcaacaatg gcataaccat ccaatacaac ttgacattct 600
cagatcgaca aagtgctcag agccagtgta gaaccttcag aggtagagtc ctagatatgt 660
ttagaactgc cttcgggggg aaatacatga ggagtggctg gggctggaca ggctcagatg 720
gcaagaccac ctggtgtagc cagacgagtt accaatacct gattatacaa aatagaacct 780
gggaaaacca ctgcacatat gcaggtcctt ttgggatgtc caggattctc ctttcccaag 840
agaagactaa gttcttcact aggagactag cgggcacatt cacctggact ttgtcagact 900
cttcaggggt ggagaatcca ggtggttatt gcctgaccaa atggatgatt cttgctgcag 960
agcttaagtg tttcgggaac acagcagttg cgaaatgcaa tgtaaatcat gatgccgaat 1020
tctgtgacat gctgcgacta attgactaca acaaggctgc tttgagtaag ttcaaagagg 1080
acgtagaatc tgccttgcac ttattcaaaa caacagtgaa ttctttgatt tcagatcaac 1140
tactgatgag gaaccacttg agagatctga tgggggtgcc atattgcaat tactcaaagt 1200
tttggtacct agaacatgca aagaccggcg aaactagtgt ccccaagtgc tggcttgtca 1260
ccaatggttc ttacttaaat gagacccact tcagtgatca aatcgaacag gaagccgata 1320
acatgattac agagatgttg aggaaggatt acataaagag gcaggggagt acccccctag 1380
cattgatgga ccttctgatg ttttccacat ctgcatatct agtcagcatc ttcctgcacc 1440
ttgtcaaaat accaacacac aggcacataa aaggtggctc atgtccaaag ccacaccgat 1500
taaccaacaa aggaatttgt agttgtggtg catttaaggt gcctggtgta aaaaccgtct 1560
ggaaaagacg ctgaagaaca gcgcctccct gactctccac ctcgaaagag gtggagagtc 1620
agggaggccc agagggtctt agagtgtcac aacatttggg cctctaaaaa ttaggtcatg 1680
tggcagaatg ttgtgaacag ttttcagatc tgggagcctt gctttggagg cgctttcaaa 1740
aatgatgcag tccatgagtg cacagtgcgg ggtgatctct ttcttctttt tgtcccttac 1800
tattccagta tgcatcttac acaaccagcc atatttgtcc cacactttgt cttcatactc 1860
cctcgaagct tccctggtca tttcaacatc gataagctta atgtccttcc tattctgtga 1920
gtccagaagc tttctgatgt catcggagcc ttgacagctt agaaccatcc cctgcggaag 1980
agcacctata actgacgagg tcaacccggg ttgcgcattg aagaggtcgg caagatccat 2040
gccgtgtgag tacttggaat cttgcttgaa ttgtttttga tcaacgggtt ccctgtaaaa 2100
gtgtatgaac tgcccgttct gtggttggaa aattgctatt tccactggat cattaaatct 2160
accctcaatg tcaatccatg taggagcgtt ggggtcaatt cctcccatga ggtcttttaa 2220
aagcattgtc tggctgtagc ttaagcccac ctgaggtgga cctgctgctc caggcgctgg 2280
cctgggtgaa ttgactgcag gtttctcgct tgtgagatca attgttgtgt tttcccatgc 2340
tctccccaca atcgatgttc tacaagctat gtatggccat ccttcacctg aaaggcaaac 2400
tttatagagg atgttttcat aagggttcct gtccccaact tggtctgaaa caaacatgtt 2460
gagttttctc ttggccccga gaactgcctt caagaggtcc tcgctgttgc ttggcttgat 2520
caaaattgac tctaacatgt tacccccatc caacagggct gcccctgcct tcacggcagc 2580
accaagacta aagttatagc cagaaatgtt gatgctggac tgctgttcag tgatgacccc 2640
cagaactggg tgcttgtctt tcagcctttc aagatcatta agatttggat acttgactgt 2700
gtaaagcaag ccaaggtctg tgagcgcttg tacaacgtca ttgagcggag tctgtgactg 2760
tttggccata caagccatag ttagacttgg cattgtgcca aattgattgt tcaaaagtga 2820
tgagtctttc acatcccaaa ctcttaccac accacttgca ccctgctgag gctttctcat 2880
cccaactatc tgtaggatct gagatctttg gtctagttgc tgtgttgtta agttccccat 2940
atatacccct gaagcctggg gcctttcaga cctcatgatc ttggccttca gcttctcaag 3000
gtcagccgca agagacatca gttcttctgc actgagcctc cccactttca aaacattctt 3060
ctttgatgtt gactttaaat ccacaagaga atgtacagtc tggttgagac ttctgagtct 3120
ctgtaggtct ttgtcatctc tcttttcctt cctcatgatc ctctgaacat tgctgacctc 3180
agagaagtcc aacccattca gaaggttggt tgcatcctta atgacagcag ccttcacatc 3240
tgatgtgaag ctctgcaatt ctcttctcaa tgcttgcgtc cattggaagc tcttaacttc 3300
cttagacaag gacatcttgt tgctcaatgg tttctcaaga caaatgcgca atcaaatgcc 3360
taggatccac tgtgcg 3376
<210> 2
<211> 3377
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13区段S, 全序列 (GenBank:DQ361065.2).
<400> 2
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat gggtcagatt gtgacaatgt ttgaggctct gcctcacatc 120
atcgatgagg tgatcaacat tgtcattatt gtgcttatcg tgatcacggg tatcaaggct 180
gtctacaatt ttgccacctg tgggatattc gcattgatca gtttcctact tctggctggc 240
aggtcctgtg gcatgtacgg tcttaaggga cccgacattt acaaaggagt ttaccaattt 300
aagtcagtgg agtttgatat gtcacatctg aacctgacca tgcccaacgc atgttcagcc 360
aacaactccc accattacat cagtatgggg acttctggac tagaattgac cttcaccaat 420
gattccatca tcagtcacaa cttttgcaat ctgacctctg ccttcaacaa aaagaccttt 480
gaccacacac tcatgagtat agtttcgagc ctacacctca gtatcagagg gaactccaac 540
tataaggcag tatcctgcga cttcaacaat ggcataacca tccaatacaa cttgacattc 600
tcagatgcac aaagtgctca gagccagtgt agaaccttca gaggtagagt cctagatatg 660
tttagaactg ccttcggggg gaaatacatg aggagtggct ggggctggac aggctcagat 720
ggcaagacca cctggtgtag ccagacgagt taccaatacc tgattataca aaatagaacc 780
tgggaaaacc actgcacata tgcaggtcct tttgggatgt ccaggattct cctttcccaa 840
gagaagacta agttcctcac taggagacta gcgggcacat tcacctggac tttgtcagac 900
tcttcagggg tggagaatcc aggtggttat tgcctgacca aatggatgat tcttgctgca 960
gagcttaagt gtttcgggaa cacagcagtt gcgaaatgca atgtaaatca tgatgaagaa 1020
ttctgtgaca tgctgcgact aattgactac aacaaggctg ctttgagtaa gttcaaagag 1080
gacgtagaat ctgccttgca cttattcaaa acaacagtga attctttgat ttcagatcaa 1140
ctactgatga ggaaccactt gagagatctg atgggggtgc catattgcaa ttactcaaag 1200
ttttggtacc tagaacatgc aaagaccggc gaaactagtg tccccaagtg ctggcttgtc 1260
accaatggtt cttacttaaa tgagacccac ttcagtgacc aaatcgaaca ggaagccgat 1320
aacatgatta cagagatgtt gaggaaggat tacataaaga ggcaggggag taccccccta 1380
gcattgatgg accttctgat gttttccaca tctgcatatc tagtcagcat cttcctgcac 1440
cttgtcaaaa taccaacaca caggcacata aaaggtggct catgtccaaa gccacaccga 1500
ttaaccaaca aaggaatttg tagttgtggt gcatttaagg tgcctggtgt aaaaaccgtc 1560
tggaaaagac gctgaagaac agcgcctccc tgactctcca cctcgaaaga ggtggagagt 1620
cagggaggcc cagagggtct tagagtgtca caacatttgg gcctctaaaa attaggtcat 1680
gtggcagaat gttgtgaaca gttttcagat ctgggagcct tgctttggag gcgctttcaa 1740
aaatgatgca gtccatgagt gcacagtgcg gggtgatctc tttcttcttt ttgtccctta 1800
ctattccagt atgcatctta cacaaccagc catatttgtc ccacactttg tcttcatact 1860
ccctcgaagc ttccctggtc atttcaacat cgataagctt aatgtccttc ctattctgtg 1920
agtccagaag ctttctgatg tcatcggagc cttgacagct tagaaccatc ccctgcggaa 1980
gagcacctat aactgacgag gtcaacccgg gttgcgcatt gaagaggtcg gcaagatcca 2040
tgccgtgtga gtacttggaa tcttgcttga attgtttttg atcaacgggt tccctgtaaa 2100
agtgtatgaa ctgcccgttc tgtggttgga aaattgctat ttccactgga tcattaaatc 2160
taccctcaat gtcaatccat gtaggagcgt tggggtcaat tcctcccatg aggtctttta 2220
aaagcattgt ctggctgtag cttaagccca cctgaggtgg acctgctgct ccaggcgctg 2280
gcctgggtga attgactgca ggtttctcgc ttgtgagatc aattgttgtg ttttcccatg 2340
ctctccccac aatcgatgtt ctacaagcta tgtatggcca tccttcacct gaaaggcaaa 2400
ctttatagag gatgttttca taagggttcc tgtccccaac ttggtctgaa acaaacatgt 2460
tgagttttct cttggccccg agaactgcct tcaagaggtc ctcgctgttg cttggcttga 2520
tcaaaattga ctctaacatg ttacccccat ccaacagggc tgcccctgcc ttcacggcag 2580
caccaagact aaagttatag ccagaaatgt tgatgctgga ctgctgttca gtgatgaccc 2640
ccagaactgg gtgcttgtct ttcagccttt caagatcatt aagatttgga tacttgactg 2700
tgtaaagcaa gccaaggtct gtgagcgctt gtacaacgtc attgagcgga gtctgtgact 2760
gtttggccat acaagccata gttagacttg gcattgtgcc aaattgattg ttcaaaagtg 2820
atgagtcttt cacatcccaa actcttacca caccacttgc accctgctga ggctttctca 2880
tcccaactat ctgtaggatc tgagatcttt ggtctagttg ctgtgttgtt aagttcccca 2940
tatatacccc tgaagcctgg ggcctttcag acctcatgat cttggccttc agcttctcaa 3000
ggtcagccgc aagagacatc agttcttctg cactgagcct ccccactttc aaaacattct 3060
tctttgatgt tgactttaaa tccacaagag aatgtacagt ctggttgaga cttctgagtc 3120
tctgtaggtc tttgtcatct ctcttttcct tcctcatgat cctctgaaca ttgctgacct 3180
cagagaagtc caacccattc agaaggttgg ttgcatcctt aatgacagca gccttcacat 3240
ctgatgtgaa gctctgcaat tctcttctca atgcttgcgt ccattggaag ctcttaactt 3300
ccttagacaa ggacatcttg ttgctcaatg gtttctcaag acaaatgcgc aatcaaatgc 3360
ctaggatcca ctgtgcg 3377
<210> 3
<211> 7229
<212> DNA
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13区段L, 全序列 (GenBank: DQ361066.1)
<400> 3
gcgcaccggg gatcctaggc gtttagttgc gctgtttggt tgcacaactt tcttcgtgag 60
gctgtcagaa gtggacctgg ctgatagcga tgggtcaagg caagtccaga gaggagaaag 120
gcaccaatag tacaaacagg gccgaaatcc taccagatac cacctatctt ggccctttaa 180
gctgcaaatc ttgctggcag aaatttgaca gcttggtaag atgccatgac cactaccttt 240
gcaggcactg tttaaacctt ctgctgtcag tatccgacag gtgtcctctt tgtaaatatc 300
cattaccaac cagattgaag atatcaacag ccccaagctc tccacctccc tacgaagagt 360
aacaccgtcc ggccccggcc ccgacaaaca gcccagcaca agggaaccgc acgtcaccca 420
acgcacacag acacagcacc caacacagaa cacgcacaca cacacacaca cacacccaca 480
cgcacgcgcc cccaccaccg gggggcgccc ccccccgggg ggcggccccc cgggagcccg 540
ggcggagccc cacggagatg cccatcagtc gatgtcctcg gccaccgacc cgcccagcca 600
atcgtcgcag gacctcccct tgagtctaaa cctgcccccc actgtttcat acatcaaagt 660
gctcctagat ttgctaaaac aaagtctgca atccttaaag gcgaaccagt ctggcaaaag 720
cgacagtgga atcagcagaa tagatctgtc tatacatagt tcctggagga ttacacttat 780
ctctgaaccc aacaaatgtt caccagttct gaatcgatgc aggaagaggt tcccaaggac 840
atcactaatc ttttcatagc cctcaagtcc tgctagaaag actttcatgt ccttggtctc 900
cagcttcaca atgatatttt ggacaaggtt tcttccttca aaaagggcac ccatctttac 960
agtcagtggc acaggctccc actcaggtcc aactctctca aagtcaatag atctaatccc 1020
atccagtatt cttttggagc ccaacaactc aagctcaaga gaatcaccaa gtatcaaggg 1080
atcttccatg taatcctcaa actcttcaga tctgatatca aagacaccat cgttcacctt 1140
gaagacagag tctgtcctca gtaagtggag gcattcatcc aacattcttc tatctatctc 1200
acccttaaag aggtgagagc atgataaaag ttcagccaca cctggattct gtaattggca 1260
cctaaccaag aatatcaatg aaaatttcct taaacagtca gtattattct gattgtgcgt 1320
aaagtccact gaaattgaaa actccaatac cccttttgtg tagttgagca tgtagtccca 1380
cagatccttt aaggatttaa atgcctttgg gtttgtcagg ccctgcctaa tcaacatggc 1440
agcattacac acaacatctc ccattcggta agagaaccac ccaaaaccaa actgcaaatc 1500
attcctaaac ataggcctct ccacattttt gttcaccacc tttgagacaa atgattgaaa 1560
ggggcccagt gcctcagcac catcttcaga tggcatcatt tctttatgag ggaaccatga 1620
aaaattgcct aatgtcctgg ttgttgcaac aaattctcga acaaatgatt caaaatacac 1680
ctgttttaag aagttcttgc agacatccct cgtgctaaca acaaattcat caaccagact 1740
ggagtcagat cgctgatgag aattggcaag gtcagaaaac agaacagtgt aatgttcatc 1800
ccttttccac ttaacaacat gagaaatgag tgacaaggat tctgagttaa tatcaattaa 1860
aacacagagg tcaaggaatt taattctggg actccacctc atgttttttg agctcatgtc 1920
agacataaat ggaagaagct gatcctcaaa gatcttggga tatagccgcc tcacagattg 1980
aatcacttgg ttcaaattca ctttgtcctc cagtagcctt gagctctcag gctttcttgc 2040
tacataatca catgggttta agtgcttaag agttaggttc tcactgttat tcttcccttt 2100
ggtcggttct gctaggaccc aaacacccaa ctcaaaagag ttgctcaatg aaatacaaat 2160
gtagtcccaa agaagaggcc ttaaaaggca tatatgatca cggtgggctt ctggatgaga 2220
ctgtttgtca caaatgtaca gcgttatacc atcccgattg caaactcttg tcacatgatc 2280
atctgtggtt agatcctcaa gcagcttttt gatatacaga ttttccctat ttttgtttct 2340
cacacacctg cttcctagag ttttgcaaag gcctataaag ccagatgaga tacaactctg 2400
gaaagctgac ttgttgattg cttctgacag cagcttctgt gcaccccttg tgaatttact 2460
acaaagtttg ttctggagtg tcttgatcaa tgatgggatt ctttcctctt ggaaagtcat 2520
cactgatgga taaaccacct tttgtcttaa aaccatcctt aatgggaaca tttcattcaa 2580
attcaaccag ttaacatctg ctaactgatt cagatcttct tcaagaccga ggaggtctcc 2640
caattgaaga atggcctcct ttttatctct gttaaatagg tctaagaaaa attcttcatt 2700
aaattcacca tttttgagct tatgatgcag tttccttaca agctttctta caacctttgt 2760
ttcattagga cacagttcct caatgagtct ttgtattctg taacctctag aaccatccag 2820
ccaatctttc acatcagtgt tggtattcag tagaaatgga tccaaaggga aattggcata 2880
ctttaggagg tccagtgttc tcctttggat actattaact agggagactg ggacgccatt 2940
tgcgatggct tgatctgcaa ttgtatctat tgtttcacaa agttgatgtg gctctttaca 3000
cttgacattg tgtagcgctg cagatacaaa ctttgtgaga agagggactt cctcccccca 3060
tacatagaat ctagatttaa attctgcagc gaacctccca gccacacttt ttgggctgat 3120
aaatttgttt aacaagccgc tcagatgaga ttggaattcc aacaggacaa ggacttcctc 3180
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cagttcttct gcactaagcc tccctacttt tagaacattc ttttttgatg ttgactttag 3060
gtccacaagg gaatacacag tttggttgag gcttctgagt ctctgtaaat ctttgtcatc 3120
cctcttctct ttcctcatga tcctctgaac attgctcacc tcagagaagt ctaatccatt 3180
cagaaggctg gtggcatcct tgatcacagc agctttcaca tctgatgtga agccttgaag 3240
ctctctcctc aatgcctggg tccattgaaa gcttttaact tctttggaca gagacatttt 3300
gtcactcagt ggatttccaa gtcaaatgcg caatcaaaat gcctaggatc cactgtgcg 3359
<210> 6
<211> 558
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> LCMV的MP株的NP蛋白
<400> 6
Met Ser Leu Ser Lys Glu Val Lys Ser Phe Gln Trp Thr Gln Ala Leu
1 5 10 15
Arg Arg Glu Leu Gln Gly Phe Thr Ser Asp Val Lys Ala Ala Val Ile
20 25 30
Lys Asp Ala Thr Ser Leu Leu Asn Gly Leu Asp Phe Ser Glu Val Ser
35 40 45
Asn Val Gln Arg Ile Met Arg Lys Glu Lys Arg Asp Asp Lys Asp Leu
50 55 60
Gln Arg Leu Arg Ser Leu Asn Gln Thr Val Tyr Ser Leu Val Asp Leu
65 70 75 80
Lys Ser Thr Ser Lys Lys Asn Val Leu Lys Val Gly Arg Leu Ser Ala
85 90 95
Glu Glu Leu Met Ser Leu Ala Ala Asp Leu Glu Lys Leu Lys Ala Lys
100 105 110
Ile Met Arg Ser Glu Arg Pro Leu Thr Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Ala Gln Gln Leu Asp Gln Arg Ser Gln Ile Leu Gln Met Val
130 135 140
Gly Met Arg Arg Pro Gln Gln Ser Ala Asn Gly Val Val Arg Val Trp
145 150 155 160
Asp Val Lys Asp Ser Ser Leu Leu Asn Asn Gln Phe Gly Thr Met Pro
165 170 175
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Asp Val Val Gln Ala Leu Thr Asp Leu Gly Leu Leu Tyr Thr Val Lys
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210 215 220
Leu Gly Val Ile Thr Glu Gln Gln Ser Ser Ile Asn Ile Ser Gly Tyr
225 230 235 240
Asn Phe Ser Leu Gly Ala Ala Val Lys Ala Gly Ala Ala Leu Leu Asp
245 250 255
Gly Gly Asn Met Leu Glu Ser Ile Leu Ile Lys Pro Ser Asn Ser Glu
260 265 270
Asp Leu Leu Lys Ala Val Leu Gly Ala Lys Lys Lys Leu Asn Met Phe
275 280 285
Val Ser Asp Gln Val Gly Asp Arg Asn Pro Tyr Glu Asn Ile Leu Tyr
290 295 300
Lys Val Cys Leu Ser Gly Glu Gly Trp Pro Tyr Ile Ala Cys Arg Thr
305 310 315 320
Ser Val Val Gly Arg Ala Trp Glu Asn Thr Thr Ile Asp Leu Thr Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Met Ala Asn Ser Pro Lys Pro Ala Pro Gly Ala Ala Gly
340 345 350
Pro Pro Gln Val Gly Leu Ser Tyr Ser Gln Thr Met Leu Leu Lys Asp
355 360 365
Leu Met Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ala Pro Thr Trp Ile Asp Ile Glu
370 375 380
Gly Arg Phe Asn Asp Pro Val Glu Ile Ala Ile Phe Gln Pro Gln Asn
385 390 395 400
Gly Gln Tyr Ile His Phe Tyr Arg Glu Pro Thr Asp Gln Lys Gln Phe
405 410 415
Lys Gln Asp Ser Lys Tyr Ser His Gly Met Asp Leu Ala Asp Leu Phe
420 425 430
Asn Ala Gln Pro Gly Leu Thr Ser Ser Val Ile Gly Ala Leu Pro Gln
435 440 445
Gly Met Val Leu Ser Cys Gln Gly Ser Asp Asp Ile Arg Lys Leu Leu
450 455 460
Asp Ser Gln Asn Arg Arg Asp Ile Lys Leu Ile Asp Val Glu Met Thr
465 470 475 480
Lys Glu Ala Ser Arg Glu Tyr Glu Asp Lys Val Trp Asp Lys Tyr Gly
485 490 495
Trp Leu Cys Lys Met His Thr Gly Ile Val Arg Asp Lys Lys Lys Lys
500 505 510
Glu Val Thr Pro His Cys Ala Leu Met Asp Cys Ile Ile Phe Glu Ser
515 520 525
Ala Ser Lys Ala Arg Leu Pro Asp Leu Lys Thr Val His Asn Ile Leu
530 535 540
Pro His Asp Leu Ile Phe Arg Gly Pro Asn Val Val Thr Leu
545 550 555
<210> 7
<211> 498
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> LCMV的MP株的GP蛋白
<400> 7
Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile
20 25 30
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly Met Tyr Gly Leu Asp Gly
50 55 60
Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Arg Phe Lys Ser Val Glu Phe Asp
65 70 75 80
Met Ser Tyr Leu Asn Leu Thr Met Pro Asn Ala Cys Ser Ala Asn Asn
85 90 95
Ser His His Tyr Ile Ser Met Gly Thr Ser Gly Leu Glu Leu Thr Phe
100 105 110
Thr Asn Asp Ser Ile Ile Thr His Asn Phe Cys Asn Leu Thr Ser Ala
115 120 125
Leu Asn Lys Arg Thr Phe Asp His Thr Leu Met Ser Ile Val Ser Ser
130 135 140
Leu His Leu Ser Ile Arg Gly Val Pro Ser Tyr Lys Ala Val Ser Cys
145 150 155 160
Asp Phe Asn Asn Gly Ile Thr Ile Gln Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Asn
165 170 175
Ala Gln Ser Ala Leu Ser Gln Cys Lys Thr Phe Arg Gly Arg Val Leu
180 185 190
Asp Met Phe Arg Thr Ala Phe Gly Gly Lys Tyr Met Arg Ser Gly Trp
195 200 205
Gly Trp Thr Gly Ser Asp Gly Lys Thr Thr Trp Cys Ser Gln Thr Asn
210 215 220
Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn Arg Thr Trp Glu Asn His Cys Arg
225 230 235 240
Tyr Ala Gly Pro Phe Gly Met Ser Arg Ile Leu Phe Ala Gln Glu Lys
245 250 255
Thr Arg Phe Leu Thr Arg Arg Leu Ala Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu
260 265 270
Ser Asp Ser Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Lys
275 280 285
Trp Met Ile Leu Ala Ala Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val
290 295 300
Ala Lys Cys Asn Val Asn His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg
305 310 315 320
Leu Ile Asp Tyr Asn Lys Ala Ala Leu Ser Lys Phe Lys Glu Asp Val
325 330 335
Glu Ser Ala Leu His Leu Phe Lys Thr Thr Val Asn Ser Leu Ile Ser
340 345 350
Asp Gln Leu Leu Met Arg Asn His Leu Arg Asp Leu Met Gly Val Pro
355 360 365
Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys Phe Trp Tyr Leu Glu His Ala Lys Thr Gly
370 375 380
Glu Thr Ser Val Pro Lys Cys Trp Leu Val Ser Asn Gly Ser Tyr Leu
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Asn Glu Thr His Phe Ser Asp Gln Ile Glu Gln Glu Ala Asp Asn Met
405 410 415
Ile Thr Glu Met Leu Arg Lys Asp Tyr Ile Lys Arg Gln Gly Ser Thr
420 425 430
Pro Leu Ala Leu Met Asp Leu Leu Met Phe Ser Thr Ser Ala Tyr Leu
435 440 445
Ile Ser Ile Phe Leu His Leu Val Arg Ile Pro Thr His Arg His Ile
450 455 460
Lys Gly Gly Ser Cys Pro Lys Pro His Arg Leu Thr Ser Lys Gly Ile
465 470 475 480
Cys Ser Cys Gly Ala Phe Lys Val Pro Gly Val Glu Thr Thr Trp Lys
485 490 495
Arg Arg
<210> 8
<211> 2209
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> LCMV的MP株的L蛋白
<400> 8
Met Asp Glu Ala Ile Ser Glu Leu Arg Glu Leu Cys Leu Asn His Ile
1 5 10 15
Glu Gln Asp Glu Arg Leu Ser Arg Gln Lys Leu Asn Phe Leu Gly Gln
20 25 30
Arg Glu Pro Arg Met Val Leu Ile Glu Gly Leu Lys Leu Leu Ser Arg
35 40 45
Cys Ile Glu Ile Asp Ser Ala Asp Lys Ser Gly Cys Ile His Asn His
50 55 60
Asp Asp Lys Ser Val Glu Ala Ile Leu Ile Glu Ser Gly Ile Val Cys
65 70 75 80
Pro Gly Leu Pro Leu Ile Ile Pro Asp Gly Tyr Lys Leu Ile Asp Asn
85 90 95
Ser Leu Ile Leu Leu Glu Cys Phe Val Arg Ser Thr Pro Ala Ser Phe
100 105 110
Glu Lys Lys Phe Ile Glu Asp Thr Asn Lys Leu Ala Cys Ile Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Ala Ile Ala Gly Ile Thr Leu Val Pro Ile Val Asp Gly Arg
130 135 140
Cys Asp Tyr Asp Asn Ser Phe Met Pro Glu Trp Val Asn Phe Lys Phe
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Arg Asp Leu Leu Phe Lys Leu Leu Glu Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Lys
165 170 175
Val Phe Glu Glu Ser Glu Tyr Phe Arg Leu Cys Glu Ser Leu Lys Thr
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Thr Val Asp Lys Arg Ser Gly Ile Asp Ser Met Lys Ile Leu Lys Asp
195 200 205
Ala Arg Ser Phe His Asn Asp Glu Ile Met Lys Met Cys His Asp Gly
210 215 220
Val Asn Pro Asn Met Asn Cys Asp Asp Val Val Leu Gly Ile Asn Ser
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Arg Phe Arg Arg Asp Leu Glu Thr Gly Lys Leu Lys Arg
245 250 255
Ser Phe Gln Lys Ile Asn Pro Gly Asn Leu Ile Lys Glu Phe Ser Glu
260 265 270
Leu Tyr Glu Thr Leu Ala Asp Ser Asp Asp Ile Ser Ala Leu Ser Lys
275 280 285
Glu Ala Val Glu Ser Cys Pro Leu Met Arg Phe Ile Thr Ala Asp Thr
290 295 300
His Gly Tyr Glu Arg Gly Ser Glu Thr Ser Thr Glu Tyr Glu Arg Leu
305 310 315 320
Leu Ser Met Leu Asn Lys Val Lys Ser Leu Lys Leu Leu Asn Thr Arg
325 330 335
Arg Arg Gln Leu Leu Asn Leu Asp Val Leu Cys Leu Ser Ser Leu Ile
340 345 350
Lys Gln Ser Lys Leu Lys Gly Ser Lys Asn Asp Lys His Trp Val Gly
355 360 365
Cys Cys Tyr Gly Ser Val Asn Asp Arg Leu Val Ser Phe His Ser Thr
370 375 380
Lys Glu Glu Phe Ile Arg Leu Leu Arg Asn Arg Arg Lys Ser Lys Ala
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Val Ser Leu Glu Asp Leu Phe Arg Thr Ser Ile Asn Glu
405 410 415
Phe Ile Leu Lys Val Gln Arg Cys Leu Ser Val Val Gly Leu Ser Phe
420 425 430
Gly His Tyr Gly Leu Ser Glu His Leu Glu His Glu Cys His Ile Pro
435 440 445
Phe Ile Glu Phe Glu Asn Phe Met Arg Ser Gly Thr His Pro Ile Met
450 455 460
Tyr Tyr Thr Lys Phe Glu Asp Tyr Asp Phe Gln Pro Asn Thr Glu Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asn Met His Ser Leu Lys Arg Leu Ser Ser Val Cys Leu Ala
485 490 495
Leu Thr Asn Ser Met Lys Thr Ser Ser Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn
500 505 510
Gln Leu Gly Ser Val Arg Tyr Gln Val Val Glu Cys Lys Glu Val Phe
515 520 525
Cys Gln Val Ile Lys Leu Asp Ser Glu Glu Tyr His Leu Leu Tyr Gln
530 535 540
Lys Thr Gly Glu Ser Ser Arg Cys Tyr Ser Ile Gln Gly Pro Asn Gly
545 550 555 560
His Leu Ile Ser Phe Tyr Ala Asp Pro Lys Arg Phe Phe Leu Pro Ile
565 570 575
Phe Ser Asp Glu Val Leu His Asn Met Ile Asp Thr Met Ile Ser Trp
580 585 590
Ile Arg Ser Cys Pro Asp Leu Lys Asp Ser Ile Asp Asp Val Glu Ile
595 600 605
Ala Leu Arg Thr Leu Leu Leu Leu Met Leu Thr Asn Pro Thr Lys Arg
610 615 620
Asn Gln Lys Gln Val Gln Asn Ile Arg Tyr Leu Val Met Ala Ile Val
625 630 635 640
Ser Asp Phe Ser Ser Thr Ser Leu Met Asp Lys Leu Lys Glu Asp Leu
645 650 655
Ile Thr Pro Ala Glu Lys Val Val Tyr Lys Leu Leu Arg Phe Leu Ile
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Lys Thr Val Phe Gly Thr Gly Glu Lys Val Leu Leu Ser Ala Lys Phe
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Lys Phe Met Leu Asn Val Ser Tyr Leu Cys His Leu Ile Thr Lys Glu
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Thr Pro Asp Arg Leu Thr Asp Gln Ile Lys Cys Phe Glu Lys Phe Phe
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Glu Pro Lys Ser Glu Phe Gly Phe Phe Val Asn Pro Lys Glu Ser Ile
725 730 735
Thr Pro Glu Glu Glu Cys Val Phe Tyr Asp Gln Met Lys Lys Phe Thr
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Gly Lys Glu Val Asp Cys Gln Arg Thr Thr Pro Gly Val Asn Leu Glu
755 760 765
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785 790 795 800
Cys Ala Thr Ala Leu Asp Leu Ala Ser Asn Lys Ser Val Val Val Asn
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Leu Val Ser Ala Val Ser Gln Ile Thr Glu Ser Phe Met Arg Lys Gln
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850 855 860
Val Ser Arg Leu Val Ile Gly Ser Lys Glu Thr Glu Ala Gly Lys Leu
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Glu Gly Asp Ser Ala Asp Ile Cys Phe Asp Gly Glu Glu Glu Thr Ser
885 890 895
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Glu Arg Ser Lys Lys Thr Asn Glu Gly Glu Asn Glu Val Gly Phe Glu
915 920 925
Asn Thr Lys Gly Leu His His Leu Gln Thr Ile Leu Ser Gly Lys Met
930 935 940
Ala Tyr Leu Arg Lys Val Ile Leu Ser Glu Ile Ser Phe His Leu Val
945 950 955 960
Glu Asp Phe Asp Pro Ser Cys Leu Thr Asn Asp Asp Met Lys Phe Ile
965 970 975
Cys Glu Ala Ile Glu Thr Ser Thr Glu Leu Ser Pro Leu Tyr Phe Thr
980 985 990
Ser Ala Val Lys Glu Gln Cys Gly Leu Asp Glu Met Ala Lys Asn Leu
995 1000 1005
Cys Arg Lys Phe Phe Ser Glu Gly Asp Trp Phe Ser Cys Met Lys Met
1010 1015 1020
Ile Leu Leu Gln Met Asn Ala Asn Ala Tyr Ser Gly Lys Tyr Arg His
1025 1030 1035 1040
Met Gln Arg Gln Gly Leu Asn Phe Lys Phe Asp Trp Asp Lys Leu Glu
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Glu Asp Val Arg Ile Ser Glu Arg Glu Ser Asn Ser Glu Ser Leu Ser
1060 1065 1070
Lys Ala Leu Ser Leu Thr Lys Cys Met Ser Ala Ala Leu Lys Asn Leu
1075 1080 1085
Cys Phe Tyr Ser Glu Glu Ser Pro Thr Ser Tyr Thr Ser Val Gly Pro
1090 1095 1100
Asp Ser Gly Arg Leu Lys Phe Ala Leu Ser Tyr Lys Glu Gln Val Gly
1105 1110 1115 1120
Gly Asn Arg Glu Leu Tyr Ile Gly Asp Leu Arg Thr Lys Met Phe Thr
1125 1130 1135
Arg Leu Ile Glu Asp Tyr Phe Glu Ser Phe Ser Ser Phe Phe Ser Gly
1140 1145 1150
Ser Cys Leu Asn Asn Asp Lys Glu Phe Glu Asn Ala Ile Leu Ser Met
1155 1160 1165
Thr Ile Asn Val Arg Glu Gly Leu Leu Asn Tyr Ser Met Asp His Ser
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Lys Trp Gly Pro Met Met Cys Pro Phe Leu Phe Leu Met Leu Leu Gln
1185 1190 1195 1200
Asn Leu Lys Leu Gly Asp Asp Gln Tyr Val Arg Ser Gly Lys Asp His
1205 1210 1215
Ile Ser Thr Leu Leu Thr Trp His Met His Lys Leu Val Glu Val Pro
1220 1225 1230
Phe Pro Val Val Asn Ala Met Met Lys Ser Tyr Ile Lys Ser Lys Leu
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Lys Leu Leu Arg Gly Ser Glu Thr Thr Val Thr Glu Arg Ile Phe Arg
1250 1255 1260
Glu Tyr Phe Glu Leu Gly Ile Val Pro Ser His Ile Ser Ser Leu Ile
1265 1270 1275 1280
Asp Met Gly Gln Gly Ile Leu His Asn Ala Ser Asp Phe Tyr Gly Leu
1285 1290 1295
Ile Ser Glu Arg Phe Ile Asn Tyr Cys Ile Gly Val Ile Phe Gly Glu
1300 1305 1310
Arg Pro Glu Ser Tyr Thr Ser Ser Asp Asp Gln Ile Thr Leu Phe Asp
1315 1320 1325
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Val Asp Ser Asp Pro Glu Glu Val Leu Val
1330 1335 1340
Leu Leu Glu Phe His Ser His Leu Ser Gly Leu Leu Asn Lys Phe Ile
1345 1350 1355 1360
Ser Pro Lys Ser Val Val Gly Arg Phe Ala Ala Glu Phe Lys Ser Arg
1365 1370 1375
Phe Tyr Val Trp Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Thr Lys Phe Val Ser
1380 1385 1390
Ala Ala Leu His Asn Val Lys Cys Lys Glu Pro His Gln Leu Cys Glu
1395 1400 1405
Thr Ile Asp Thr Ile Ala Asp Gln Ala Val Ala Asn Gly Val Pro Val
1410 1415 1420
Ser Leu Val Asn Cys Ile Gln Lys Arg Thr Leu Asp Leu Leu Lys Tyr
1425 1430 1435 1440
Ala Asn Phe Pro Leu Asp Pro Phe Leu Leu Asn Thr Asn Thr Asp Val
1445 1450 1455
Lys Asp Trp Leu Asp Gly Ser Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Arg Leu Ile
1460 1465 1470
Glu Glu Leu Cys Pro Ser Glu Thr Lys Val Met Arg Arg Leu Val Arg
1475 1480 1485
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Leu Asp Leu Phe Asn Arg Asp Lys Lys Glu Ala Ile Leu Gln Leu Gly
1505 1510 1515 1520
Asn Ile Leu Gly Leu Glu Glu Asp Leu Ser Gln Leu Ala Asn Ile Asn
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Trp Leu Asn Leu Asn Glu Leu Phe Pro Leu Arg Met Val Leu Arg Gln
1540 1545 1550
Lys Val Val Tyr Pro Ser Val Met Thr Phe Gln Glu Glu Arg Ile Pro
1555 1560 1565
Ser Leu Ile Lys Thr Leu Gln Asn Lys Leu Cys Ser Lys Phe Thr Arg
1570 1575 1580
Gly Ala Gln Lys Leu Leu Ser Glu Ala Ile Asn Lys Ser Ala Phe Gln
1585 1590 1595 1600
Ser Cys Ile Ser Ser Gly Phe Ile Gly Leu Cys Lys Thr Leu Gly Ser
1605 1610 1615
Arg Cys Val Arg Asn Lys Asn Arg Asp Asn Leu Tyr Ile Arg Lys Val
1620 1625 1630
Leu Glu Asp Leu Ala Met Asp Ala His Val Thr Ala Ile His Arg His
1635 1640 1645
Asp Gly Ile Met Leu Tyr Ile Cys Asp Arg Gln Ser His Pro Glu Ala
1650 1655 1660
His Cys Asp His Ile Ser Leu Leu Arg Pro Leu Leu Trp Asp Tyr Ile
1665 1670 1675 1680
Cys Ile Ser Leu Ser Asn Ser Phe Glu Leu Gly Val Trp Val Leu Ala
1685 1690 1695
Glu Pro Val Lys Gly Lys Asn Glu Gly Ser Ser Ser Leu Lys His Leu
1700 1705 1710
Asn Pro Cys Asp Tyr Val Ala Arg Lys Pro Glu Ser Ser Arg Leu Leu
1715 1720 1725
Glu Asp Lys Ile Ser Leu Asn His Val Ile Gln Ser Val Arg Arg Leu
1730 1735 1740
Tyr Pro Lys Ile Tyr Glu Asp Gln Leu Leu Pro Phe Met Ser Asp Met
1745 1750 1755 1760
Ser Ser Lys Asn Met Arg Trp Ser Pro Arg Ile Lys Phe Leu Asp Leu
1765 1770 1775
Cys Val Leu Ile Asp Ile Asn Ser Glu Ser Leu Ser Leu Ile Ser His
1780 1785 1790
Val Val Lys Trp Lys Arg Asp Glu His Tyr Thr Val Leu Phe Ser Asp
1795 1800 1805
Leu Val Asn Ser His Gln Arg Ser Asp Ser Ser Leu Val Asp Glu Phe
1810 1815 1820
Val Val Ser Thr Arg Asp Val Cys Lys Asn Phe Leu Lys Gln Val Tyr
1825 1830 1835 1840
Phe Glu Ser Phe Val Arg Glu Phe Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Gly
1845 1850 1855
Ser Phe Ser Trp Phe Pro His Lys Asp Met Met Pro Ser Glu Asp Gly
1860 1865 1870
Ala Glu Ala Leu Gly Pro Phe Gln Ser Phe Ile Leu Lys Val Val Asn
1875 1880 1885
Lys Asn Met Glu Arg Pro Met Phe Arg Asn Asp Leu Gln Phe Gly Phe
1890 1895 1900
Gly Trp Phe Ser Tyr Arg Leu Gly Asp Ile Val Cys Asn Ala Ala Met
1905 1910 1915 1920
Leu Ile Lys Gln Gly Leu Thr Asn Pro Lys Ala Phe Lys Ser Leu Arg
1925 1930 1935
Asn Leu Trp Asp Tyr Met Ile Asn Asn Thr Glu Gly Val Leu Glu Phe
1940 1945 1950
Ser Ile Thr Val Asp Phe Thr His Asn Gln Asn Asn Thr Asp Cys Leu
1955 1960 1965
Arg Lys Phe Ser Leu Ile Phe Leu Val Lys Cys Gln Leu Gln Gly Pro
1970 1975 1980
Gly Val Ala Glu Phe Leu Ser Cys Ser His Leu Phe Lys Gly Glu Val
1985 1990 1995 2000
Asp Arg Arg Phe Leu Asp Glu Cys Leu His Leu Leu Arg Ser Asp Ser
2005 2010 2015
Ile Phe Lys Val Asn Asp Gly Val Phe Asp Ile Arg Ser Glu Glu Phe
2020 2025 2030
Glu Asp Tyr Met Glu Asp Pro Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Glu Leu
2035 2040 2045
Glu Leu Ile Gly Ser Arg Lys Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ser Leu Asp
2050 2055 2060
Phe Glu Arg Ile Gly Pro Glu Trp Glu Pro Val Pro Leu Thr Val Arg
2065 2070 2075 2080
Met Gly Ala Leu Phe Glu Gly Arg Ser Leu Val Gln Asn Ile Val Val
2085 2090 2095
Lys Leu Glu Thr Lys Asp Met Arg Val Phe Leu Ala Glu Leu Glu Gly
2100 2105 2110
Tyr Gly Asn Phe Asp Asp Val Leu Gly Ser Leu Leu Leu His Arg Phe
2115 2120 2125
Arg Thr Gly Glu His Leu Gln Gly Ser Glu Ile Ser Thr Ile Leu Gln
2130 2135 2140
Glu Leu Cys Ile Asp Arg Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ser Leu Val
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Pro Asp Trp Phe Thr Phe Lys Asp Cys Arg Leu Cys Phe Ser Lys Ser
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Lys Asn Thr Val Met Tyr Glu Thr Val Val Gly Lys Tyr Arg Leu Lys
2180 2185 2190
Gly Lys Ser Cys Asp Asp Trp Leu Thr Lys Ser Val Val Glu Glu Ile
2195 2200 2205
Asp
<210> 9
<211> 90
<212> PRT
<213> 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
<220>
<223> LCMV的MP株的Z蛋白
<400> 9
Met Gly Gln Gly Lys Ser Lys Glu Gly Arg Asp Ala Ser Asn Thr Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ile Leu Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Gly Pro Leu Asn Cys
20 25 30
Lys Ser Cys Trp Gln Arg Phe Asp Ser Leu Val Arg Cys His Asp His
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Tyr Leu Cys Arg His Cys Leu Asn Leu Leu Leu Ser Val Ser Asp Arg
50 55 60
Cys Pro Leu Cys Lys His Pro Leu Pro Thr Lys Leu Lys Ile Ser Thr
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ser Pro Pro Pro Tyr Glu Glu
85 90
<210> 10
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白
<400> 10
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
245 250 255
<210> 11
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白，其连接至小鼠钙网蛋白
<400> 11
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Leu
245 250 255
Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Ala Ala Asp
260 265 270
Pro Ala Ile Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Ala Trp Thr
275 280 285
Asn Arg Trp Val Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys Phe Val
290 295 300
Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asp Lys Gly Leu
305 310 315 320
Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Lys Phe Glu
325 330 335
Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr Val Lys
340 345 350
His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu Phe Pro
355 360 365
Ser Gly Leu Asp Gln Lys Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn Ile
370 375 380
Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His Val
385 390 395 400
Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp Ile Arg
405 410 415
Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val Arg Pro
420 425 430
Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu Ser Gly
435 440 445
Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile Lys Asp
450 455 460
Pro Asp Ala Ala Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile Asp
465 470 475 480
Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu His Ile
485 490 495
Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu Met Asp
500 505 510
Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Gly Glu
515 520 525
Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Trp Ile
530 535 540
His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Ala Asn Ile Tyr
545 550 555 560
Ala Tyr Asp Ser Phe Ala Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln Val Lys
565 570 575
Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu Ala Tyr
580 585 590
Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala Ala Glu
595 600 605
Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys Glu Glu
610 615 620
Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp Lys Glu
625 630 635 640
Asp Asp Asp Asp Arg Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Lys Glu
645 650 655
Glu Asp Glu Glu Glu Ser Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu Leu
660 665 670
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白，其连接至小鼠泛素
<400> 12
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gln
245 250 255
Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu
260 265 270
Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu
275 280 285
Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu
290 295 300
Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr
305 310 315 320
Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala
325 330
<210> 13
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白，其与小鼠GM-CSF共表达，由编码自裂解肽(2A肽)的核苷酸序列分隔
<400> 13
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly
245 250 255
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
260 265 270
Glu Asn Pro Gly Pro Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val
275 280 285
Val Tyr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg
290 295 300
Pro Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp
305 310 315 320
Asp Met Pro Val Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu
325 330 335
Phe Ser Phe Lys Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe
340 345 350
Glu Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn
355 360 365
Met Thr Ala Ser Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr
370 375 380
Asp Cys Glu Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu
385 390 395 400
Lys Thr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln
405 410 415
Lys
<210> 14
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列
<400> 14
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagacaacc 60
gacctgtacg gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgctggac aggccgaacc tgacagagcc cactacaaca tcgtgacatt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg ggccctatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaaccg ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
accgagctgc agaccaccat ccacgacatc atcctggaat gcgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttccgggacc tgtgcatcgt gtacagggac 480
ggcaaccctt acgccgtggg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac 540
cggcactact gctacagcct gtacggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgcgacctgc tgatcagatg catcaacggc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga cgcgagactc agctgtga 768
<210> 15
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码连接至小鼠钙网蛋白的在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列
<400> 15
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagacaacc 60
gacctgtacg gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgctggac aggccgaacc tgacagagcc cactacaaca tcgtgacatt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg ggccctatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaaccg ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
accgagctgc agaccaccat ccacgacatc atcctggaat gcgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttccgggacc tgtgcatcgt gtacagggac 480
ggcaaccctt acgccgtggg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac 540
cggcactact gctacagcct gtacggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgcgacctgc tgatcagatg catcaacggc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga agagagacac agctgctgct gtccgtgccc 780
ctgctgctgg gcctgctggg actggctgct gcagatcccg ccatctactt caaagagcag 840
ttcctggacg gcgacgcctg gaccaacaga tgggtggaaa gcaagcacaa gagcgacttc 900
ggcaagttcg tgctgagcag cggcaagttt tacggcgacc tggaaaagga caagggcctg 960
cagacaagcc aggacgccag attctacgcc ctgagcgcca agttcgagcc cttcagcaac 1020
aagggccaga ccctggtggt gcagttcacc gtgaagcacg agcagaacat cgactgcggc 1080
ggaggctacg tgaagctgtt ccctagcggc ctggatcaga aagacatgca cggggactcc 1140
gagtacaaca tcatgttcgg ccccgacatc tgcggccctg gcaccaagaa agtgcacgtg 1200
atcttcaact acaagggcaa gaacgtgctg atcaacaagg acatcaggtg caaggacgac 1260
gagttcaccc acctgtacac cctgatcgtg cggcccgaca acacctacga agtgaagatc 1320
gacaacagcc aggtggaatc cggctctctg gaagatgact gggacttcct gccccccaag 1380
aagatcaagg accccgacgc cgccaagccc gaggactggg atgagagagc caagatcgac 1440
gaccccaccg acagcaagcc tgaagattgg gacaagcctg agcacatccc cgacccagac 1500
gccaagaagc cagaggattg ggacgaagag atggacgggg agtgggagcc ccccgtgatc 1560
cagaacccag agtacaaggg cgagtggaag cccagacaga tcgataaccc cgactataag 1620
ggcacctgga tccaccccga aatcgacaac cctgagtact cccctgacgc caacatctac 1680
gcctacgaca gcttcgccgt gctggggctg gatctgtggc aagtgaagtc cggaacaatc 1740
ttcgacaact tcctgatcac caacgacgag gcctacgccg aggaattcgg caacgagaca 1800
tggggcgtga ccaaggccgc cgagaagcag atgaaggaca agcaggatga ggaacagcgc 1860
ctgaaagagg aagaagagga taagaagcgc aaagaagagg aagaggccga ggacaaagag 1920
gacgacgacg acagggacga ggacgaggat gaagaagatg agaaagaaga ggacgaagaa 1980
gagtccccag gccaggccaa ggacgagctg tgatga 2016
<210> 16
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码连接至小鼠泛素的在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列
<400> 16
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagacaacc 60
gacctgtacg gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgctggac aggccgaacc tgacagagcc cactacaaca tcgtgacatt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg ggccctatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaaccg ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
accgagctgc agaccaccat ccacgacatc atcctggaat gcgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttccgggacc tgtgcatcgt gtacagggac 480
ggcaaccctt acgccgtggg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac 540
cggcactact gctacagcct gtacggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgcgacctgc tgatcagatg catcaacggc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga agagagacac agctgcagat ctttgtgaaa 780
accctgaccg gcaagaccat cacactggaa gtggaaccca gcgacaccat cgagaacgtg 840
aaggccaaga tccaggacaa agagggcatc ccccccgacc agcagagact gatcttcgcc 900
ggaaagcagc tggaagatgg caggaccctg agcgattaca acatccagaa agagtccacc 960
ctgcacctgg tgctgagact gagaggcgcc tga 993
<210> 17
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码与小鼠GM-CSF共表达并由编码自裂解肽(2A肽)的核苷酸序列分隔的在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV16 E7/E6融合蛋白的核苷酸序列
<400> 17
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagacaacc 60
gacctgtacg gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgctggac aggccgaacc tgacagagcc cactacaaca tcgtgacatt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg ggccctatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaaccg ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
accgagctgc agaccaccat ccacgacatc atcctggaat gcgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttccgggacc tgtgcatcgt gtacagggac 480
ggcaaccctt acgccgtggg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac 540
cggcactact gctacagcct gtacggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgcgacctgc tgatcagatg catcaacggc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga agagagactc agctgggcag cggcgccacc 780
aacttcagcc tgctgaaaca ggccggcgac gtggaagaga acccaggccc ttggctgcag 840
aacctgctgt ttctgggaat cgtggtgtac agcctgagcg cccctaccag atcccccatc 900
accgtgacca gaccttggaa gcacgtggaa gccatcaaag aggccctgaa tctgctggac 960
gacatgcccg tgaccctgaa cgaagaggtg gaagtggtgt ccaacgagtt cagcttcaag 1020
aaactgacct gtgtgcagac ccggctgaag atctttgagc agggcctgag aggcaacttc 1080
accaagctga agggcgctct gaacatgacc gccagctact accagaccta ctgccccccc 1140
acccccgaga cagattgcga gacacaagtg accacctacg ccgacttcat cgacagcctg 1200
aaaaccttcc tgaccgacat ccccttcgag tgcaagaaac ccgtgcagaa gtga 1254
<210> 18
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GSG序列
<400> 18
Gly Ser Gly
1
<210> 19
<211> 7115
<212> DNA
<213> Junin病毒
<220>
<223> Junin病毒Candid No.1 L区段
<400> 19
gcgcaccggg gatcctaggc gtaacttcat cattaaaatc tcagattctg ctctgagtgt 60
gacttactgc gaagaggcag acaaatgggc aactgcaacg gggcatccaa gtctaaccag 120
ccagactcct caagagccac acagccagcc gcagaattta ggagggtagc tcacagcagt 180
ctatatggta gatataactg taagtgctgc tggtttgctg ataccaattt gataacctgt 240
aatgatcact acctttgttt aaggtgccat cagggtatgt taaggaattc agatctctgc 300
aatatctgct ggaagcccct gcccaccaca atcacagtac cggtggagcc aacagcacca 360
ccaccatagg cagactgcac agggtcagac ccgacccccc ggggggcccc catggggacc 420
ccccgtgggg gaaccccggg ggtgatgcgc cattagtcaa tgtctttgat ctcgactttg 480
tgcttcagtg gcctgcatgt cacccctttc aatctgaact gcccttgggg atctgatatc 540
agcaggtcat ttaaagatct gctgaatgcc accttgaaat ttgagaattc caaccagtca 600
ccaaatttat caagtgaacg gatcaactgc tctttgtgta gatcataaac gaggacaaag 660
tcctcttgct gaaataatat tgtttgtgat gttgttttta gataaggcca tagttggctt 720
aataaggttt ccacactatc aatgtcctct agtgctccaa ttgccttgac tatgacatcc 780
ccagacaact caactctata tgttgacaac ctttcattac ctctgtaaaa gataccctct 840
ttcaagacaa gaggttctcc tgggttatct ggcccaatga ggtcatatgc atacttgtta 900
cttagttcag aataaaagtc accaaagttg aacttaacat ggctcagaat attgtcatca 960
tttgtcgcag cgtagcctgc atcaataaac aagccagcta ggtcaaagct ctcatggcct 1020
gtgaacaatg gtaggctagc gataaccagt gcaccatcca acaatgagtg gcttccctca 1080
gacccagaaa cacattgact cattgcatcc acattcagct ctaattcagg ggtaccgaca 1140
tcatccactc ctagtgaact gacaatggtg taactgtaca ccatctttct tctaagttta 1200
aattttgtcg aaactcgtgt gtgttctact tgaatgatca attttagttt cacagcttct 1260
tggcaagcaa cattgcgcaa cacagtgtgc aggtccatca tgtcttcctg aggcaacaag 1320
gagatgttgt caacagagac accctcaagg aaaaccttga tattatcaaa gctagaaact 1380
acataaccca ttgcaatgtc ttcaacaaac attgctcttg atactttatt attcctaact 1440
gacaaggtaa aatctgtgag ttcagctaga tctacttgac tgtcatcttc tagatctaga 1500
acttcattga accaaaagaa ggatttgaga cacgatgttg acatgactag tgggtttatc 1560
atcgaagata agacaacttg caccatgaag ttcctgcaaa cttgctgtgg gctgatgcca 1620
acttcccaat ttgtatactc tgactgtcta acatgggctg aagcgcaatc actctgtttc 1680
acaatataaa cattattatc tcttactttc aataagtgac ttataatccc taagttttca 1740
ttcatcatgt ctagagccac acagacatct agaaacttga gtcttccact atccaaagat 1800
ctgttcactt gaagatcatt cataaagggt gccaaatgtt cttcaaatag tttggggtaa 1860
tttcttcgta tagaatgcaa tacatggttc atgcctaatt ggtcttctat ctgtcgtact 1920
gctttgggtt taacagccca gaagaaattc ttattacata agaccagagg ggcctgtgga 1980
ctcttaatag cagaaaacac ccactcccct aactcacagg catttgtcag caccaaagag 2040
aagtaatccc acaaaattgg tttagaaaat tggttaactt ctttaagtga tttttgacag 2100
taaataactt taggctttct ctcacaaatt ccacaaagac atggcattat tcgagtaaat 2160
atgtccttta tatacagaaa tccgccttta ccatccctaa cacacttact ccccatactc 2220
ttacaaaacc caatgaagcc tgaggcaaca gaagactgaa atgcagattt gttgattgac 2280
tctgccaaga tcttcttcac gccttttgtg aaatttcttg acagcctgga ctgtattgtc 2340
cttatcaatg ttggcatctc ttctttctct aacactcttc gacttgtcat gagtttggtc 2400
ctcaagacca acctcaagtc cccaaagctc gctaaattga cccatctgta gtctagagtt 2460
tgtctgattt catcttcact acacccggca tattgcagga atccggataa agcctcatcc 2520
cctcccctgc ttatcaagtt gataaggttt tcctcaaaga ttttgcctct cttaatgtca 2580
ttgaacactt tcctcgcgca gttccttata aacattgtct ccttatcatc agaaaaaata 2640
gcttcaattt tcctctgtag acggtaccct ctagacccat caacccagtc tttgacatct 2700
tgttcttcaa tagctccaaa cggagtctct ctgtatccag agtatctaat caattggttg 2760
actctaatgg aaatctttga cactatatga gtgctaaccc cattagcaat acattgatca 2820
caaattgtgt ctatggtctc tgacagttgt gttggagttt tacacttaac gttgtgtaga 2880
gcagcagaca caaacttggt gagtaaagga gtctcttcac ccatgacaaa aaatcttgac 2940
ttaaactcag caacaaaagt tcctatcaca ctctttgggc tgataaactt gtttaattta 3000
gaagataaga attcatggaa gcacaccatt tccagcagtt ctgtcctgtc ttgaaacttt 3060
tcatcactaa ggcaaggaat ttttataagg ctaacctggt catcgctgga ggtataagtg 3120
acaggtatca catcatacaa taagtcaagt gcataacaca gaaattgttc agtaattagc 3180
ccatataaat ctgatgtgtt gtgcaagatt ccctggccca tgtccaagac agacattata 3240
tggctgggga cctggtccct tgactgcaga tactggtgaa aaaactcttc accaacacta 3300
gtacagtcac aacccattaa acctaaagat ctcttcaatt tccctacaca gtaggcttct 3360
gcaacattaa ttggaacttc aacgacctta tgaagatgcc atttgagaat gttcattact 3420
ggttcaagat tcacctttgt tctatctctg ggattcttca attctaatgt gtacaaaaaa 3480
gaaaggaaaa gtgctgggct catagttggt ccccatttgg agtggtcata tgaacaggac 3540
aagtcaccat tgttaacagc cattttcata tcacagattg cacgttcgaa ttccttttct 3600
gaattcaagc atgtgtattt cattgaacta cccacagctt ctgagaagtc ttcaactaac 3660
ctggtcatca gcttagtgtt gaggtctccc acatacagtt ctctatttga gccaacctgc 3720
tccttataac ttagtccaaa tttcaagttc cctgtatttg agctgatgct tgtgaactct 3780
gtaggagagt cgtctgaata gaaacataaa ttccgtaggg ctgcatttgt aaaataactt 3840
ttgtctagct tatcagcaat ggcttcagaa ttgctttccc tggtactaag ccgaacctca 3900
tcctttagtc tcagaacttc actggaaaag cccaatctag atctacttct atgctcataa 3960
ctacccaatt tctgatcata atgtccttga attaaaagat acttgaagca ttcaaagaat 4020
tcatcttctt ggtaggctat tgttgtcaaa ttttttaata acaaacccaa agggcagatg 4080
tcctgcggtg cttcaagaaa ataagtcaat ttaaatggag atagataaac agcatcacat 4140
aactctttat acacatcaga cctgagcaca tctggatcaa aatccttcac ctcatgcatt 4200
gacacctctg ctttaatctc tctcaacact ccaaaagggg cccacaatga ctcaagagac 4260
tctcgctcat caacagatgg attttttgat ttcaacttgg tgatctcaac ttttgtcccc 4320
tcactattag ccatcttggc tagtgtcatt tgtacgtcat ttctaatacc ctcaaaggcc 4380
cttacttgat cctctgttaa actctcatac atcactgata attcttcttg attggttctg 4440
gttcttgaac cggtgctcac aagacctgtt agatttttta atattaagta gtccatggaa 4500
tcaggatcaa gattatacct gccttttgtt ttaaacctct cagccatagt agaaacgcat 4560
gttgaaacaa gtttctcctt atcataaaca gaaagaatat ttccaagttc gtcgagcttg 4620
gggattacca cacttttatt gcttgacaga tccagagctg tgctagtgat gttaggcctg 4680
tagggattgc ttttcagttc acctgtaact ttaagtcttc ctctattgaa gagagaaatg 4740
cagaaggaca aaatctcttt acacactcct ggaatttgag tatctgagga agtcttagcc 4800
tctttggaaa agaatctgtc caatcctctt atcatggtgt cctcttgttc cagtgttaga 4860
ctcccactta gaggggggtt tacaacaaca caatcaaact tgactttggg ctcaataaac 4920
ttctcaaaac actttatttg atctgtcagg cgatcaggtg tctctttggt taccaagtga 4980
cacagataac taacatttaa tagatattta aaccttcttg caaagtaaag atctgcatct 5040
tccccttcac ccaaaattgt ctggaaaagt tccacagcca tcctctgaat cagcacctct 5100
gatccagaca tgcagtcgac ccttaacttt gacatcaaat ccacatgatg gatttgattt 5160
gcatatgcca tcaagaaata tcttagacct tgtaaaaatg tctggttcct tttggaaggg 5220
gaacagagta cagctaacac taacaatctt aatattggcc ttgtcattgt catgagttcg 5280
tggctaaaat ccaaccagct ggtcatttcc tcacacattt caattaacac atcctccgaa 5340
aatataggca ggaaaaatct ctttggatca cagtaaaaag agccttgttc ttccaatacc 5400
ccattgatgg atagatagat agaatagcac cttgacttct cacctgtttt ttggtaaaac 5460
aagagaccaa atgtattctt tgtcagatga aatctttgta cataacactc tcttagtcta 5520
acattcccaa aatatctaga atactctctt tcattgatta acaatcggga ggaaaatgat 5580
gtcttcatcg agttgaccaa tgcaagggaa atggaggaca aaatcctaaa taatttcttc 5640
tgctcacctt ccactaagct gctgaatggc tgatgtctac agattttctc aaattccttg 5700
ttaatagtat atctcatcac tggtctgtca gaaacaagtg cctgagctaa aatcatcaag 5760
ctatccatat cagggtgttt tattagtttt tccagctgtg accagagatc ttgatgagag 5820
ttcttcaatg ttctggaaca cgcttgaacc cacttggggc tggtcatcaa tttcttcctt 5880
attagtttaa tcgcctccag aatatctaga agtctgtcat tgactaacat taacatttgt 5940
ccaacaacta ttcccgcatt tcttaacctt acaattgcat catcatgcgt tttgaaaaga 6000
tcacaaagta aattgagtaa aactaagtcc agaaacagta aagtgtttct cctggtgttg 6060
aaaactttta gacctttcac tttgttacac acggaaaggg cttgaagata acacctctct 6120
acagcatcaa tagatataga attctcatct gactggcttt ccatgttgac ttcatctatt 6180
ggatgcaatg cgatagagta gactacatcc atcaacttgt ttgcacaaaa agggcagctg 6240
ggcacatcac tgtctttgtg gcttcctaat aagatcaagt catttataag cttagacttt 6300
tgtgaaaatt tgaatttccc caactgcttg tcaaaaatct ccttcttaaa ccaaaacctt 6360
aactttatga gttcttctct tatgacagat tctctaatgt ctcctctaac cccaacaaag 6420
agggattcat ttaacctctc atcataaccc aaagaattct ttttcaagca ttcgatgttt 6480
tctaatccca agctctggtt ttttgtgttg gacaaactat ggatcaatcg ctggtattct 6540
tgttcttcaa tattaatctc ttgcataaat tttgatttct ttaggatgtc gatcagcaac 6600
caccgaactc tttcaacaac ccaatcagca aggaatctat tgctgtagct agatctgcca 6660
tcaaccacag gaaccaacgt aatccctgcc cttagtaggt cggactttag gtttaagagc 6720
tttgacatgt cactcttcca ttttctctca aactcatcag gattgaccct aacaaaggtt 6780
tccaatagga tgagtgtttt ccctgtgagt ttgaagccat ccggaatgac ttttggaagg 6840
gtgggacata gtatgccata gtcagacagg atcacatcaa caaacttctg atctgaattg 6900
atctgacagg cgtgtgcctc acaggactca agctctacta aacttgacag aagtttgaac 6960
ccttccaaca acagagagct ggggtgatgt tgagataaaa agatgtccct ttggtatgct 7020
agctcctgtc tttctggaaa atgctttcta ataaggcttt ttatttcatt tactgattcc 7080
tccatgctca agtgccgcct aggatcctcg gtgcg 7115
<210> 20
<211> 3411
<212> DNA
<213> Junin病毒
<220>
<223> Junin病毒Candid No.1 S区段
<400> 20
gcgcaccggg gatcctaggc gattttggtt acgctataat tgtaactgtt ttctgtttgg 60
acaacatcaa aaacatccat tgcacaatgg ggcagttcat tagcttcatg caagaaatac 120
caaccttttt gcaggaggct ctgaacattg ctcttgttgc agtcagtctc attgccatca 180
ttaagggtat agtgaacttg tacaaaagtg gtttattcca attctttgta ttcctagcgc 240
ttgcaggaag atcctgcaca gaagaagctt tcaaaatcgg actgcacact gagttccaga 300
ctgtgtcctt ctcaatggtg ggtctctttt ccaacaatcc acatgaccta cctttgttgt 360
gtaccttaaa caagagccat ctttacatta aggggggcaa tgcttcattt cagatcagct 420
ttgatgatat tgcagtattg ttgccacagt atgatgttat aatacaacat ccagcagata 480
tgagctggtg ttccaaaagt gatgatcaaa tttggttgtc tcagtggttc atgaatgctg 540
tgggacatga ttggcatcta gacccaccat ttctgtgtag gaaccgtgca aagacagaag 600
gcttcatctt tcaagtcaac acctccaaga ctggtgtcaa tggaaattat gctaagaagt 660
ttaagactgg catgcatcat ttatatagag aatatcctga cccttgcttg aatggcaaac 720
tgtgcttaat gaaggcacaa cctaccagtt ggcctctcca atgtccactc gaccacgtta 780
acacattaca cttccttaca agaggtaaaa acattcaact tccaaggagg tccttgaaag 840
cattcttctc ctggtctttg acagactcat ccggcaagga tacccctgga ggctattgtc 900
tagaagagtg gatgctcgta gcagccaaaa tgaagtgttt tggcaatact gctgtagcaa 960
aatgcaattt gaatcatgac tctgaattct gtgacatgtt gaggctcttt gattacaaca 1020
aaaatgctat caaaacccta aatgatgaaa ctaagaaaca agtaaatctg atggggcaga 1080
caatcaatgc cctgatatct gacaatttat tgatgaaaaa caaaattagg gaactgatga 1140
gtgtccctta ctgcaattac acaaaatttt ggtatgtcaa ccacacactt tcaggacaac 1200
actcattacc aaggtgctgg ttaataaaaa acaacagcta tttgaacatc tctgacttcc 1260
gtaatgactg gatattagaa agtgacttct taatttctga aatgctaagc aaagagtatt 1320
cggacaggca gggtaaaact cctttgactt tagttgacat ctgtatttgg agcacagtat 1380
tcttcacagc gtcactcttc cttcacttgg tgggtatacc ctcccacaga cacatcaggg 1440
gcgaagcatg ccctttgcca cacaggttga acagcttggg tggttgcaga tgtggtaagt 1500
accccaatct aaagaaacca acagtttggc gtagaggaca ctaagacctc ctgagggtcc 1560
ccaccagccc gggcactgcc cgggctggtg tggcccccca gtccgcggcc tggccgcgga 1620
ctggggaggc actgcttaca gtgcataggc tgccttcggg aggaacagca agctcggtgg 1680
taatagaggt gtaggttcct cctcatagag cttcccatct agcactgact gaaacattat 1740
gcagtctagc agagcacagt gtggttcact ggaggccaac ttgaagggag tatccttttc 1800
cctctttttc ttattgacaa ccactccatt gtgatatttg cataagtgac catatttctc 1860
ccagacctgt tgatcaaact gcctggcttg ttcagatgtg agcttaacat caaccagttt 1920
aagatctctt cttccatgga ggtcaaacaa cttcctgatg tcatcggatc cttgagtagt 1980
cacaaccatg tctggaggca gcaagccgat cacgtaacta agaactcctg gcattgcatc 2040
ttctatgtcc ttcattaaga tgccgtgaga gtgtctgcta ccatttttaa accctttctc 2100
atcatgtggt tttctgaagc agtgaatgta ctgcttacct gcaggttgga ataatgccat 2160
ctcaacaggg tcagtggctg gtccttcaat gtcgagccaa agggtgttgg tggggtcgag 2220
tttccccact gcctctctga tgacagcttc ttgtatctct gtcaagttag ccaatctcaa 2280
attctgaccg tttttttccg gctgtctagg accagcaact ggtttccttg tcagatcaat 2340
acttgtgttg tcccatgacc tgcctgtgat ttgtgatcta gaaccaatat aaggccaacc 2400
atcgccagaa agacaaagtt tgtacaaaag gttttcataa ggatttctat tgcctggttt 2460
ctcatcaata aacatgcctt ctcttcgttt aacctgaatg gttgatttta tgagggaaga 2520
gaagttttct ggggtgactc tgattgtttc caacatgttt ccaccatcaa gaatagatgc 2580
tccagccttt actgcagctg aaagactgaa gttgtaacca gaaatattga tggagctttc 2640
atctttagtc acaatctgaa ggcagtcatg ttcctgagtc agtctgtcaa ggtcacttaa 2700
gtttggatac ttcacagtgt atagaagccc aagtgaggtt aaagcttgta tgacactgtt 2760
cattgtctca cctccttgaa cagtcatgca tgcaattgtc aatgcaggaa cagagccaaa 2820
ctgattgttt agctttgaag ggtctttaac atcccatatc ctcaccacac catttccccc 2880
agtcccttgc tgttgaaatc ccagtgttct caatatctct gatcttttag caagttgtga 2940
ctgggacaag ttacccatgt aaaccccctg agagcctgtc tctgctcttc ttatcttgtt 3000
ttttaatttc tcaaggtcag acgccaactc catcagttca tccctcccca gatctcccac 3060
cttgaaaact gtgtttcgtt gaacactcct catggacatg agtctgtcaa cctctttatt 3120
caggtccctc aacttgttga ggtcttcttc ccccttttta gtctttctga gtgcccgctg 3180
cacctgtgcc acttggttga agtcgatgct gtcagcaatt agcttggcgt ccttcaaaac 3240
atctgacttg acagtctgag tgaattggct caaacctctc cttaaggact gagtccatct 3300
aaagcttgga acctccttgg agtgtgccat gccagaagtt ctggtgattt tgatctagaa 3360
tagagttgct cagtgaaagt gttagacact atgcctagga tccactgtgc g 3411
<210> 21
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HK1-E7E6-GMCSF的核苷酸序列
<400> 21
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagacaacc 60
gacctgtacg gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgctggac aggccgaacc tgacagagcc cactacaaca tcgtgacatt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg ggccctatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaaccg ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
accgagctgc agaccaccat ccacgacatc atcctggaat gcgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttccgggacc tgtgcatcgt gtacagggac 480
ggcaaccctt acgccgtggg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac 540
cggcactact gctacagcct gtacggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgcgacctgc tgatcagatg catcaacggc cagaaacccc tgtgccccga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gcggttccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga agagagactc agctgggcag cggcgccacc 780
aacttcagcc tgctgaaaca ggccggcgac gtggaagaga acccaggccc ttggctgcag 840
aacctgctgt ttctgggaat cgtggtgtac agcctgagcg cccctaccag atcccccatc 900
accgtgacca gaccttggaa gcacgtggaa gccatcaaag aggccctgaa tctgctggac 960
gacatgcccg tgaccctgaa cgaagaggtg gaagtggtgt ccaacgagtt cagcttcaag 1020
aaactgacct gtgtgcagac ccggctgaag atctttgagc agggcctgag aggcaacttc 1080
accaagctga agggcgctct gaacatgacc gccagctact accagaccta ctgccccccc 1140
acccccgaga cagattgcga gacacaagtg accacctacg ccgacttcat cgacagcctg 1200
aaaaccttcc tgaccgacat ccccttcgag tgcaagaaac ccgtgcagaa gtga 1254
<210> 22
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7E6-GMCSF抗原的氨基酸序列
<400> 22
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly
245 250 255
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
260 265 270
Glu Asn Pro Gly Pro Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val
275 280 285
Val Tyr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg
290 295 300
Pro Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp
305 310 315 320
Asp Met Pro Val Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu
325 330 335
Phe Ser Phe Lys Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe
340 345 350
Glu Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn
355 360 365
Met Thr Ala Ser Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr
370 375 380
Asp Cys Glu Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu
385 390 395 400
Lys Thr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln
405 410 415
Lys
<210> 23
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HK1-E7E6-VP22的核苷酸序列
<400> 23
atgcatggtg acaccccaac cctgcatgag tacatgctgg acctgcagcc agagacaaca 60
gacctgtatg gctatggcca gctgaatgac agcagtgagg aagaggatga gattgatggc 120
cctgctggac aggcagaacc tgacagagcc cactacaaca ttgtgacatt ctgctgcaag 180
tgtgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccatg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcattgtg ggccccatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaacag ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
actgagctgc agaccaccat ccatgacatc atcctggaat gtgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta tgactttgcc ttcagggacc tgtgcattgt gtacagggat 480
ggcaaccctt atgcagtggg agacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagtgagtac 540
aggcactact gctacagcct gtatggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgtgacctgc tgatcagatg catcaatggc cagaaacccc tgtgccctga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gaggttccac aacatcagag gcagatggac tggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga agggagactc agctgggatc aggaatgacc 780
tcaaggaggt cagtgaagtc tggtccaagg gaggttccca gagatgagta tgaggatctg 840
tactacaccc cttcttcatg catggccagt cctgacagtc cccctgacac ctccagaaga 900
ggtgccctgc agacaagagc cagaccaagg ggggaggtca gatttgtcca gtatgatgag 960
tcagattatg ccctctatgg gggctcatca tctgaagatg atgaacaccc agaggtcccc 1020
aggaccagga gacctgtttc aggggctgtt ttgtcagccc cagggcctgc aagggcccct 1080
cccccccctg ctgggtcagg aggggcagga agaacaccca ccactgcccc cagggccccc 1140
agaacccaga gggtggccac caaggcccct gcagcccctg cagcagagac caccaggggc 1200
aggaaatcag cccagccaga atcagcagca ctcccagatg ccccagcatc aacagctcca 1260
accagatcca agacaccagc acaggggctg gccagaaagc tgcacttcag cacagccccc 1320
ccaaaccctg atgccccatg gacccccagg gtggcaggct tcaacaagag ggtcttctgt 1380
gctgcagttg ggaggctggc agccatgcat gccaggatgg cagctgtcca gctctgggac 1440
atgtcaagac caaggacaga tgaagacctc aatgaactcc ttggcatcac caccatcagg 1500
gtgactgtct gtgagggcaa aaacctgatt cagagggcca atgagttggt gaatccagat 1560
gtggtgcagg atgttgatgc tgccactgca actagaggga ggtctgctgc ctcaagaccc 1620
actgagagac caagagcccc agccaggtct gcttccagac ccagaaggcc agtggagtga 1680
<210> 24
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7E6-VP22抗原的氨基酸序列
<400> 24
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly
245 250 255
Ser Gly Met Thr Ser Arg Arg Ser Val Lys Ser Gly Pro Arg Glu Val
260 265 270
Pro Arg Asp Glu Tyr Glu Asp Leu Tyr Tyr Thr Pro Ser Ser Cys Met
275 280 285
Ala Ser Pro Asp Ser Pro Pro Asp Thr Ser Arg Arg Gly Ala Leu Gln
290 295 300
Thr Arg Ala Arg Pro Arg Gly Glu Val Arg Phe Val Gln Tyr Asp Glu
305 310 315 320
Ser Asp Tyr Ala Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Ser Glu Asp Asp Glu His
325 330 335
Pro Glu Val Pro Arg Thr Arg Arg Pro Val Ser Gly Ala Val Leu Ser
340 345 350
Ala Pro Gly Pro Ala Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ala Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Ala Gly Arg Thr Pro Thr Thr Ala Pro Arg Ala Pro Arg Thr Gln Arg
370 375 380
Val Ala Thr Lys Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Thr Arg Gly
385 390 395 400
Arg Lys Ser Ala Gln Pro Glu Ser Ala Ala Leu Pro Asp Ala Pro Ala
405 410 415
Ser Thr Ala Pro Thr Arg Ser Lys Thr Pro Ala Gln Gly Leu Ala Arg
420 425 430
Lys Leu His Phe Ser Thr Ala Pro Pro Asn Pro Asp Ala Pro Trp Thr
435 440 445
Pro Arg Val Ala Gly Phe Asn Lys Arg Val Phe Cys Ala Ala Val Gly
450 455 460
Arg Leu Ala Ala Met His Ala Arg Met Ala Ala Val Gln Leu Trp Asp
465 470 475 480
Met Ser Arg Pro Arg Thr Asp Glu Asp Leu Asn Glu Leu Leu Gly Ile
485 490 495
Thr Thr Ile Arg Val Thr Val Cys Glu Gly Lys Asn Leu Ile Gln Arg
500 505 510
Ala Asn Glu Leu Val Asn Pro Asp Val Val Gln Asp Val Asp Ala Ala
515 520 525
Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr Glu Arg Pro
530 535 540
Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro Val Glu
545 550 555
<210> 25
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HK1-E7E6-CD40L的核苷酸序列
<400> 25
atgcatggtg acacccctac cctgcatgag tacatgctgg acctgcagcc agagacaaca 60
gacctgtatg gctatggcca gctgaatgac agcagtgagg aagaggatga gattgatggc 120
cctgctggac aggctgaacc tgacagagcc cactacaaca ttgtgacatt ctgctgcaag 180
tgtgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccatg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcattgtg ggccccatct gctctcagaa gccccaccag 300
aaaagaactg ccatgttcca ggacccccag gaaagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360
acagagctgc agaccaccat ccatgacatc atcctggaat gtgtgtactg caagcagcag 420
ctgctgagaa gagaggtgta tgactttgcc ttcagggacc tgtgcatagt gtacagggat 480
ggcaaccctt atgctgtggg ggacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagtgagtac 540
aggcactact gctacagcct gtatggaacc accctggaac agcagtacaa caagcccctg 600
tgtgacctgc tgatcagatg catcaatggc cagaaacccc tgtgccctga ggaaaagcag 660
agacacctgg acaagaagca gaggttccac aacatcagag gcagatggac aggcagatgc 720
atgagctgtt gcagaagcag cagaaccaga agagagactc agctgaatga tgcacaggca 780
ccaaagagtg tggaagagga agtcaacctt catgaagatt ttgttttcat caaaaagctc 840
aagagatgca acaaaggaga aggatctttg tccttgctga actgtgagga gatgagaagg 900
caatttgaag accttgtcaa ggacatcact ttgaacaaag aagagaaaaa agaaaacagc 960
tttgaaatgc aaagaggtga tgaggatcct caaattgcag cacatgttgt cagtgaagcc 1020
aacagcaatg cagcatctgt tctgcagtgg gccaagaaag gatattacac catgaaaagc 1080
aacttggtca tgcttgaaaa tgggaaacag ctgactgtga aaagagaagg actctattat 1140
gtctacactc aagtcacctt ctgctcaaac agggagcctt caagtcaaag accattcatt 1200
gtgggcctct ggctgaagcc cagcagtgga tctgagagaa tcttgctcaa ggcagcaaac 1260
acccacagtt cctcccagct ttgtgagcag cagtctgttc acttgggagg agtgtttgaa 1320
ttgcaagctg gtgcttctgt gtttgtcaat gtgactgaag caagccaagt gatccacaga 1380
gttggcttct catcttttgg cttgctcaaa ctctga 1416
<210> 26
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7E6-CD40L抗原的氨基酸序列
<400> 26
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
100 105 110
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
115 120 125
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
130 135 140
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
145 150 155 160
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
165 170 175
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
180 185 190
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
195 200 205
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
210 215 220
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
225 230 235 240
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Asn
245 250 255
Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu
260 265 270
Asp Phe Val Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly
275 280 285
Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp
290 295 300
Leu Val Lys Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser
305 310 315 320
Phe Glu Met Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val
325 330 335
Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys
340 345 350
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly
355 360 365
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln
370 375 380
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile
385 390 395 400
Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu
405 410 415
Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser
420 425 430
Val His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe
435 440 445
Val Asn Val Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser
450 455 460
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
465 470
<210> 27
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HK1-Flt3L-E7E6的核苷酸序列
<400> 27
atgacagtgc tggccccagc ctggagccca aattcctccc tgttgctgct gttgctgctg 60
ctgagtcctt gcctgagggg gacacctgac tgttacttca gccacagtcc catctcctcc 120
aacttcaaag tgaagttcag agagttgact gaccacctgc tcaaagatta cccagtcact 180
gtggcagtca atcttcagga tgagaagcac tgcaaggcct tgtggagcct cttcctggcc 240
cagaggtgga ttgagcaact gaagactgtg gcagggtcaa agatgcaaac tcttctggag 300
gatgtcaaca ctgagatcca ttttgtcacc tcatgcacct tccagcccct tccagaatgt 360
ctgagatttg tccagaccaa catctcccac ctcctgaagg acacctgcac acagctgctt 420
gctctgaagc cctgcatagg gaaggcctgc cagaatttct ccaggtgcct ggaggtgcag 480
tgccagccag actcctccac cctgctgccc ccaaggagtc ccattgccct ggaagccact 540
gagctcccag agcccaggcc caggcagctg ttgctcctgc tgctgctgct gctgcctctc 600
acactggtgc tgctggcagc tgcctggggc ctcaggtggc aaagggcaag aaggaggggg 660
gagctccacc ctggggtgcc cctcccctcc catcccatgc atggtgacac cccaaccctg 720
catgagtaca tgctggacct gcagccagag acaacagacc tgtatggcta tggccagctg 780
aatgacagca gtgaggaaga ggatgagatt gatggccctg ctggacaggc agaacctgac 840
agagcccact acaacattgt gacattctgc tgcaagtgtg acagcaccct gagactgtgt 900
gtgcagagca cccatgtgga catcagaacc ctggaagatc tgctgatggg caccctgggc 960
attgtgggcc caatctgctc tcagaagccc caccagaaaa gaacagccat gttccaggac 1020
ccccaggaaa gacccagaaa gctgccccag ctgtgcacag agctgcagac caccatccat 1080
gacatcatcc tggaatgtgt gtactgcaag cagcagctgc tgagaagaga ggtgtatgac 1140
tttgccttca gggacctgtg cattgtgtac agggatggca acccttatgc tgtgggggac 1200
aagtgcctga agttctacag caagatcagt gagtacaggc actactgcta cagcctgtat 1260
ggaaccaccc tggaacagca gtacaacaag cccctgtgtg acctgctgat cagatgcatc 1320
aatggccaga aacccctgtg ccctgaggaa aagcagagac acctggacaa gaagcagagg 1380
ttccacaaca tcagaggcag atggacaggc agatgcatga gctgttgcag aagcagcaga 1440
accagaagag agactcagct gtga 1464
<210> 28
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flt3L-E7E6抗原的氨基酸序列
<400> 28
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
20 25 30
Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala
65 70 75 80
Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln
85 90 95
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
100 105 110
Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile
115 120 125
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro
130 135 140
Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln
145 150 155 160
Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala
165 170 175
Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala
195 200 205
Trp Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro
210 215 220
Gly Val Pro Leu Pro Ser His Pro Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu
225 230 235 240
His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly
245 250 255
Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly
260 265 270
Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr
275 280 285
Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr
290 295 300
His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly
305 310 315 320
Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala
325 330 335
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
340 345 350
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
355 360 365
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
370 375 380
Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp
385 390 395 400
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
405 410 415
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
420 425 430
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro
435 440 445
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
450 455 460
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
465 470 475 480
Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
485
<210> 29
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HK1-Flt3L-E7E6shuffle的核苷酸序列
<400> 29
atgacagtgc tggcaccagc ctggagccca aattcctccc tgttgctgct gttgctgctg 60
ctgagtcctt gcctgagggg gacacctgac tgttacttca gccacagtcc catctcctcc 120
aacttcaaag tgaagttcag agagttgact gaccacctgc tcaaagatta cccagtcact 180
gtggctgtca atcttcagga tgagaagcac tgcaaggcct tgtggagcct cttcctggcc 240
cagagatgga tagagcaact gaagactgtg gcagggtcaa agatgcaaac acttctggag 300
gatgtcaaca ctgagatcca ttttgtcacc tcatgcacct tccagcccct gccagaatgt 360
ctgagatttg tccagaccaa catctcccac ctcctgaagg acacctgcac acagctgctt 420
gctctgaagc cctgcattgg gaaggcctgc cagaatttct ccaggtgcct ggaggtgcag 480
tgccagcctg actcctccac cctgctgccc ccaaggagtc ccatagccct ggaagccact 540
gagctcccag agcccaggcc caggcagctg ttgctcctgc tgctgctgct gctgcctctc 600
acactggtgc tgctggcagc agcctggggc ctcagatggc aaagggcaag aaggaggggg 660
gagctccacc ctggggtgcc cctcccctcc catcccatgc accaaaagag aactgcaatg 720
tttcaggacc cacaggagag acccagaaag ttgccacagt tgtgcacaga gctgcaaaca 780
accatccatg acatcatttt ggaatgtgtg tactgcaagc aacagttgct gagaagagag 840
gtgtatgact ttgctttcag ggatttgtgc atagtgtaca gagatgggaa tccatatgct 900
gtctgtgaca aatgtttgaa gttttattca aaaatcagtg agtacagaca catgcatgga 960
gacacaccca cattgcatga atacatgttg gatttgcaac cagagacaac tgatctctac 1020
tgttatgagc aattgaatga cagctcagag gaggaggatg aaatagatgg tccagctgga 1080
caagcagaac cagacagagc ccattacaac attgtgacct tttgttgcaa gtgtgactca 1140
acacttgaca aatgtttgaa gttttattcc aaaatcagtg agtacagaca ttattgttac 1200
agtttgtatg gaacaacatt ggaacagcaa tacaacaaac cattgtgtga tttgttgatc 1260
aggtgcatca actgtcaaaa gccactgtgt cctgaagaaa agcaaagaca tctggacaaa 1320
aagcaaagat tccacaacat cagggggagg tggacaggca gatgcatgtc ttgttgcaga 1380
tcatcaagaa caagaagaga aacccagctg cattacaaca ttgtgacctt ttgttgcaag 1440
tgtgactcca ccctcaggtt gtgtgtccaa agcacacatg ttgacatcag gactttggaa 1500
gacctgttga tgggcacact tggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 1557
<210> 30
<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flt3L-E7E6shuffle抗原的氨基酸序列
<400> 30
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
20 25 30
Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala
65 70 75 80
Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln
85 90 95
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
100 105 110
Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile
115 120 125
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro
130 135 140
Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln
145 150 155 160
Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala
165 170 175
Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala
195 200 205
Trp Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro
210 215 220
Gly Val Pro Leu Pro Ser His Pro Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met
225 230 235 240
Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr
245 250 255
Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys
260 265 270
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
275 280 285
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys
290 295 300
Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Met His Gly
305 310 315 320
Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
325 330 335
Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu
340 345 350
Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His
355 360 365
Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Asp Lys
370 375 380
Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr
385 390 395 400
Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys
405 410 415
Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu
420 425 430
Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg
435 440 445
Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr
450 455 460
Arg Arg Glu Thr Gln Leu His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys
465 470 475 480
Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile
485 490 495
Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro
500 505 510
Ile Cys Ser Gln Lys Pro
515
<210> 31
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HK1-mli-E7E6的核苷酸序列
<400> 31
atggatgacc aaagggacct catctcaaac catgagcaat tgcccatcct gggcaacaga 60
cctagagagc cagaaaggtg cagcagagga gctctgtaca caggtgtttc tgtcctggtg 120
gctctgctct tggctgggca ggccacaact gcttacttcc tgtaccagca acagggcaga 180
ctagacaagc tgaccatcac ctcccagaac ctgcaactgg agagcctcag gatgaagctt 240
cccaaatctg ccaaacctgt gagccagatg aggatggcca ctcccttgct gatgaggcca 300
atgtccatgg acaacatgct ccttgggcct gtgaagaatg tgaccaagta tggcaacatg 360
acccaggacc atgtgatgca tctgctcaca aggtctggac ccctggagta ccctcagctg 420
aaggggacct tcccagagaa tctgaagcat ctgaagaact ccatggatgg agtgaactgg 480
aagatctttg agagctggat gaagcagtgg ctcttgtttg agatgagcaa gaactccctg 540
gaggagaaga agcccacaga ggctccacca aaagagccac tggacatgga agacctttct 600
tctggcctgg gagtgaccag gcaggaactg ggtcaagtca ccctgagtga caggtatttg 660
aacaggagag ccatgcatgg agacacccca accctgcatg agtacatgct ggacctgcag 720
cctgagacaa ctgacctgta tggctatggc cagctgaatg acagcagtga ggaagaggat 780
gagattgatg gccctgctgg acaggctgaa cctgacagag cccactacaa cattgtgaca 840
ttctgctgca agtgtgacag caccctgaga ctgtgtgtgc agagcaccca tgtggacatc 900
agaaccctgg aagatctgct gatgggcacc ctgggcattg tgggccctat ctgctctcag 960
aagccccacc agaaaagaac agccatgttc caggaccccc aggaaagacc cagaaagctg 1020
ccccagctgt gcacagagct gcagaccacc atccatgaca tcatcctgga atgtgtgtac 1080
tgcaagcagc agctgctgag aagagaggtg tatgactttg ccttcaggga cctgtgcatt 1140
gtgtacaggg atggcaaccc ttatgctgtg ggggacaagt gcctgaagtt ctacagcaag 1200
atcagtgagt acaggcacta ctgctacagc ctgtatggaa ccaccctgga acagcagtac 1260
aacaagcccc tgtgtgacct gctgatcaga tgcatcaatg gccagaaacc cctgtgccct 1320
gaggaaaagc agagacacct ggacaagaag cagaggttcc acaacatcag aggcagatgg 1380
acaggcagat gcatgagctg ttgcagaagc agcagaacca gaagggagac tcagctgtga 1440
<210> 32
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mli-E7E6抗原的氨基酸序列
<400> 32
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile
1 5 10 15
Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu
20 25 30
Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala
35 40 45
Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu
50 55 60
Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu
65 70 75 80
Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu
85 90 95
Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys
100 105 110
Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu
115 120 125
Leu Thr Arg Ser Gly Pro Leu Glu Tyr Pro Gln Leu Lys Gly Thr Phe
130 135 140
Pro Glu Asn Leu Lys His Leu Lys Asn Ser Met Asp Gly Val Asn Trp
145 150 155 160
Lys Ile Phe Glu Ser Trp Met Lys Gln Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser
165 170 175
Lys Asn Ser Leu Glu Glu Lys Lys Pro Thr Glu Ala Pro Pro Lys Glu
180 185 190
Pro Leu Asp Met Glu Asp Leu Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Arg Gln
195 200 205
Glu Leu Gly Gln Val Thr Leu Ser Asp Arg Tyr Leu Asn Arg Arg Ala
210 215 220
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
245 250 255
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
260 265 270
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
275 280 285
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
290 295 300
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Pro Ile Cys Ser Gln
305 310 315 320
Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His
340 345 350
Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
355 360 365
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp
370 375 380
Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
405 410 415
Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile
420 425 430
Asn Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp
435 440 445
Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys
450 455 460
Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
465 470 475
<210> 33
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6融合蛋白的核苷酸序列
<400> 33
atgaaatgtc tcctctacct ggcctttctc ttcattggtg tgaattgcat gcatggggac 60
acccccaccc tgcatgaata catgctggat ctgcagcctg aaaccactga tctgtatggc 120
tatggccagc tgaatgacag cagtgaagaa gaggatgaaa ttgatggccc agctggccag 180
gcagaacctg acagagctca ttacaacatt gtgacctttt gctgcaaatg tgacagcact 240
ctgaggctgt gtgtgcagag cacccatgtg gacatcagaa ccctggaaga tctgctgatg 300
ggcaccctgg gcattgtgtg tcctatttgc agtcagaaac ctgccaggtt tgaagatccc 360
accaggagtg gctacaaact gccagacctg tgcacagaac tgaacaccag cctgcaggac 420
attgaaatca cctgtgtgta ttgcaaaaca gtgctggaac tgacagaagt gtttgaaaaa 480
gatctgtttg tggtgtacag agacagcatt ccccatgctg cctgccacaa atgcattgat 540
ttttacagca ggatcagaga actgagacat tacagtgaca gtgtgtatgg ggacactctg 600
gagaagctga ccaacactgg cctgtacaat ctgctgatca ggtgtctgag gtgccagaaa 660
cccctgctga ggcatctgaa tgaaaagagg aggtttcaca acattgctgg ccactacaga 720
ggtcagtgcc acagctgctg caacagagcc aggcaggaaa gactgcagag gagaagagaa 780
actcaggtgg gcagtggtgc aaccaacttc agtctgctga aacaggcagg tgatgtggaa 840
gaaaatccag gcccctggct gcagagcctg cttctgctgg gcactgtggc ctgcagcatc 900
agtgccccag caaggagccc cagccccagc actcagccct gggaacatgt gaatgccatt 960
caggaggcaa ggagactgct gaacctgagc agagacactg ctgcagaaat gaatgaaact 1020
gtggaagtga tcagtgaaat gtttgatctg caggagccca cttgcctgca gaccaggctg 1080
gaactgtaca aacagggcct gagaggaagc ctgaccaagc tgaaaggccc cctgaccatg 1140
atggccagcc attacaaaca gcactgccct cccacacctg aaaccagttg tgcaacccag 1200
atcatcactt ttgagagttt caaggaaaac ctgaaagatt ttctgctggt gattcccttt 1260
gactgttggg agccagtgca ggaatga 1287
<210> 34
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6融合蛋白的氨基酸序列
<400> 34
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
35 40 45
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
50 55 60
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
65 70 75 80
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
85 90 95
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
100 105 110
Lys Pro Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Ser Gly Tyr Lys Leu Pro
115 120 125
Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr
130 135 140
Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Lys
145 150 155 160
Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His
165 170 175
Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser
180 185 190
Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu
195 200 205
Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Leu Arg
210 215 220
His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg
225 230 235 240
Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln
245 250 255
Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
260 265 270
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Trp Leu Gln
275 280 285
Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala
290 295 300
Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile
305 310 315 320
Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu
325 330 335
Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu
340 345 350
Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg
355 360 365
Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His
370 375 380
Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln
385 390 395 400
Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu
405 410 415
Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
420 425
<210> 35
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV18E7-HPV16E6融合蛋白的核苷酸序列
<400> 35
atgaagtgtc tcctctacct ggcctttctc ttcatagggg tcaattgcat gcatggccct 60
aaagctaccc tgcaggatat tgtgctccat ctggaacctc agaatgaaat ccctgtggat 120
ctgctgggcc atggccagct gagtgacagt gaagaagaaa atgatgaaat tgatggagtg 180
aaccatcagc atctgccagc cagaagggca gagcctcaga ggcataccat gctgtgcatg 240
tgctgcaaat gtgaagccag aattgaactg gtggtggaaa gcagtgcaga tgacctgagg 300
gcctttcagc agctgttcct gaacaccctg agctttgtgt gcccttggtg tgccagccag 360
cagcatcaga agagaacagc aatgtttcag gatccacagg aaagtggcag gaagctgcct 420
cagctgtgca ctgaactgca gaccaccatc catgacatca tcctggaatg tgtgtactgc 480
aagcagcagc tgctgaggag ggaagtgtat gatagagacc tgtgcattgt gtacagggat 540
ggcaacccct atgctgtgtg tgataaatgc ctgaaatttt atagcaagat tagtgaatat 600
agacattatt gctacagcct gtatggcacc accctggaac agcagtataa caaaccactg 660
tgtgatctgc tgattaggtg cattaactgc cagaagccac tgcagaggca cctggacaag 720
aaacagaggt tccataacat taggggcagg tggacaggca gatgcatgag ctgctgcaga 780
agcagcagaa ccagaaggga aacccagctg ggcagtggag caactaactt cagcctgctg 840
aaacaggctg gggatgtgga agagaaccca ggcccatggc tgcagagcct gctgctgctg 900
ggcacagtgg catgcagcat tagtgcccct gccagaagcc ctagcccaag cacccagccc 960
tgggagcatg tgaatgctat ccaggaggcc agaagactgc tgaacctgag cagggacact 1020
gcagcagaaa tgaatgaaac tgtggaggtg attagtgaaa tgtttgacct gcaggaaccc 1080
acctgcctgc agaccagact ggaactgtat aaacaggggc tgagaggcag cctgaccaag 1140
ctgaagggcc ccctgaccat gatggcaagc cattataaac agcattgccc ccccacccct 1200
gaaaccagct gtgccaccca gatcattacc tttgaaagct ttaaagaaaa cctcaaggat 1260
tttctgctgg tgattccctt tgactgctgg gaaccagtgc aggaatga 1308
<210> 36
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV18E7-HPV16E6融合蛋白的氨基酸序列
<400> 36
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
20 25 30
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gly His Gly Gln Leu Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
50 55 60
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
65 70 75 80
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
85 90 95
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
100 105 110
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln His Gln Lys Arg Thr Ala Met
115 120 125
Phe Gln Asp Pro Gln Glu Ser Gly Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr
130 135 140
Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys
145 150 155 160
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Arg Asp Leu Cys Ile
165 170 175
Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys
180 185 190
Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr
195 200 205
Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu
210 215 220
Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Gln Arg His Leu Asp Lys
225 230 235 240
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
245 250 255
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Gly Ser
260 265 270
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
275 280 285
Asn Pro Gly Pro Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala
290 295 300
Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro
305 310 315 320
Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu
325 330 335
Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser
340 345 350
Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu
355 360 365
Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro
370 375 380
Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro
385 390 395 400
Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu
405 410 415
Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro
420 425 430
Val Gln Glu
435
<210> 37
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6_HPV16E6-HPV18E7融合蛋白的核苷酸序列
<400> 37
atgaaatgcc tcctctacct ggccttcctc ttcattggtg tcaattgcat gcatggagat 60
acccctaccc tgcatgaata tatgctggat ctgcagcctg aaaccactga cctgtatggc 120
tatggccagc tgaatgatag cagtgaggag gaagatgaga ttgatggccc tgcaggccag 180
gcagaacctg acagggcaca ttacaacatt gtgacctttt gctgcaaatg tgatagcacc 240
ctgagactct gtgtccagag cacccatgtg gatattagga ccctggaaga tctgctgatg 300
ggcaccctgg gcattgtgtg cccaatttgc agccagaagc cagctaggtt tgaagatccc 360
accagaagtg gctacaaact cccagatctc tgcacagagc tgaacaccag cctgcaggat 420
attgagatca cctgtgtgta ctgcaaaaca gtgctagaac tgacagaagt ctttgaaaag 480
gatctgtttg tggtgtatag agacagcatt cctcatgcag cctgccacaa atgcattgat 540
ttctatagca ggatcaggga actgaggcat tacagtgata gtgtgtatgg tgataccctt 600
gaaaagctga ccaacactgg cctgtacaac ctgctgatta ggtgcctgag atgccagaaa 660
ccactcctga ggcatctcaa tgaaaaaagg aggtttcata acattgcagg ccattatagg 720
ggccagtgcc atagctgctg caacagggcc aggcaggaaa gactgcagag aaggagggaa 780
acccaggtgc atcagaaaag gactgcaatg ttccaggatc cacaggaaag tggcaggaaa 840
ctgccacagc tgtgcacaga actgcagacc accatccatg atattatcct ggaatgtgtg 900
tattgcaaac agcagctcct caggagggaa gtgtatgata gggatctgtg cattgtgtat 960
agagatggca acccttatgc agtgtgtgac aaatgcctga aattttatag caaaatcagt 1020
gaatataggc actactgcta tagcctgtat ggcaccaccc tggaacagca gtacaacaaa 1080
cctctgtgtg acctgctgat taggtgcatc aactgccaga aacctctgca gaggcatctg 1140
gataaaaaac agaggtttca taacattagg gggaggtgga ctggcagatg catgagctgc 1200
tgcaggagca gcagaaccag gagggaaacc cagctgcatg gccccaaagc caccctgcag 1260
gatattgtgc tgcatctgga accacagaat gagattccag tggatctgct gggccatggc 1320
cagctcagtg atagtgaaga ggaaaatgat gaaattgatg gggtcaacca tcagcacctg 1380
ccagccagga gagcagagcc ccagagacac accatgctgt gcatgtgctg caaatgtgag 1440
gccaggattg aactggtggt ggaaagcagt gcagatgatc tgagggcctt ccagcagctg 1500
tttctgaaca ccctgagctt tgtgtgccct tggtgtgcca gccagcaggg gagtggtgca 1560
accaacttta gcctgctgaa acaggcaggt gatgtggagg aaaacccagg cccctggctg 1620
cagagcctgc tgctgctggg cacagtggca tgcagcatta gtgccccagc caggagcccc 1680
agccccagca cccagccctg ggagcatgtg aatgcaattc aggaagccag gaggctgctg 1740
aacctgagca gggatactgc agctgagatg aatgaaacag tggaggtgat tagtgagatg 1800
tttgacctcc aggaacccac ctgcctgcag accaggctgg agctctacaa acagggcctg 1860
agaggcagcc tcaccaaact gaagggccca ctgaccatga tggccagcca ttacaaacag 1920
cattgccctc ccacccctga gaccagctgt gccacccaga tcattacctt tgaaagcttt 1980
aaagaaaacc tgaaagactt cctgctggtg attccatttg actgctggga acctgtgcag 2040
gaatga 2046
<210> 38
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有N端VSVG信号序列和C端GSG接头伴随着自裂解肽(来自猪捷申病毒的2A肽)和人GM-CSF的CDS的HPV16E7-HPV18E6_HPV16E6-HPV18E7融合蛋白的氨基酸序列
<400> 38
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
35 40 45
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
50 55 60
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
65 70 75 80
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
85 90 95
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
100 105 110
Lys Pro Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Ser Gly Tyr Lys Leu Pro
115 120 125
Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr
130 135 140
Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Lys
145 150 155 160
Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His
165 170 175
Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser
180 185 190
Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu
195 200 205
Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Leu Arg
210 215 220
His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg
225 230 235 240
Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln
245 250 255
Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln
260 265 270
Asp Pro Gln Glu Ser Gly Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu
275 280 285
Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln
290 295 300
Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr
305 310 315 320
Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr
325 330 335
Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr
340 345 350
Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
355 360 365
Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln
370 375 380
Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys
385 390 395 400
Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu His Gly Pro Lys
405 410 415
Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile
420 425 430
Pro Val Asp Leu Leu Gly His Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu Glu
435 440 445
Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg
450 455 460
Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys Glu
465 470 475 480
Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala
485 490 495
Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys
500 505 510
Ala Ser Gln Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
515 520 525
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Trp Leu Gln Ser Leu Leu
530 535 540
Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro
545 550 555 560
Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala
565 570 575
Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu
580 585 590
Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys
595 600 605
Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu
610 615 620
Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln
625 630 635 640
His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr
645 650 655
Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro
660 665 670
Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
675 680
<210> 39
<211> 2648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达HPV16 E7E6融合蛋白的三区段的基于r3LCMVart的载体的核苷酸序列：S区段1 (包含GP)
<400> 39
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat gcacggcgac acccctaccc tgcacgagta catgctggac 120
ctgcagcccg agacaaccga cctgtacggc tacggccagc tgaacgacag cagcgaggaa 180
gaggacgaga tcgacggccc tgctggacag gccgaacctg acagagccca ctacaacatc 240
gtgacattct gctgcaagtg cgacagcacc ctgagactgt gcgtgcagag cacccacgtg 300
gacatcagaa ccctggaaga tctgctgatg ggcaccctgg gcatcgtggg ccctatctgc 360
tctcagaagc cccaccagaa aagaaccgcc atgttccagg acccccagga aagacccaga 420
aagctgcccc agctgtgcac cgagctgcag accaccatcc acgacatcat cctggaatgc 480
gtgtactgca agcagcagct gctgagaaga gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctg 540
tgcatcgtgt acagggacgg caacccttac gccgtgggcg acaagtgcct gaagttctac 600
agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc tacagcctgt acggaaccac cctggaacag 660
cagtacaaca agcccctgtg cgacctgctg atcagatgca tcaacggcca gaaacccctg 720
tgccccgagg aaaagcagag acacctggac aagaagcagc ggttccacaa catcagaggc 780
agatggaccg gcagatgcat gagctgttgc agaagcagca gaaccagacg cgagactcag 840
ctgtgaagaa cagcgcctcc ctgactctcc acctcgaaag aggtggagag tcagggaggc 900
ccagagggtc ttagagtgtc acaacatttg ggcctctaaa aattaggtca tgtggcagaa 960
tgttgtgaac agttttcaga tctgggagcc ttgctttgga ggcgctttca aaaatgatgc 1020
agtccatgag tgcacagtgc ggggtgatct ctttcttctt tttgtccctt actattccag 1080
tatgcatctt acacaaccag ccatatttgt cccacacttt atcttcatac tccctcgaag 1140
cttccctggt catttcaaca tcgataagct taatgtcctt cctattttgt gagtccagaa 1200
gctttctgat gtcatcggag ccttgacagc ttagaaccat cccctgcgga agagcaccta 1260
taactgacga ggtcaacccg ggttgcgcat tgaagaggtc ggcaagatcc atgccgtgtg 1320
agtacttgga atcttgcttg aattgttttt gatcaacggg ttccctgtaa aagtgtatga 1380
actgcccgtt ctgtggttgg aaaattgcta tttccactgg atcattaaat ctaccctcaa 1440
tgtcaatcca tgtaggagcg ttggggtcaa ttcctcccat gaggtctttt aaaagcattg 1500
tctggctgta gcttaagccc acctgaggtg gacctgctgc tccaggcgct ggcctgggtg 1560
agttgactgc aggtttctcg cttgtgagat caattgttgt gttttcccat gctctcccca 1620
caatcgatgt tctacaagct atgtatggcc atccttcacc tgaaaggcaa actttataga 1680
ggatgttttc ataagggttc ctgtccccaa cttggtctga aacaaacatg ttgagttttc 1740
tcttggcccc gagaactgcc ttcaagagat cctcgctgtt gcttggcttg atcaaaattg 1800
actctaacat gttaccccca tccaacaggg ctgcccctgc cttcacggca gcaccaagac 1860
taaagttata gccagaaatg ttgatgctgg actgctgttc agtgatgacc cccagaactg 1920
ggtgcttgtc tttcagcctt tcaagatcat taagatttgg atacttgact gtgtaaagca 1980
agccaaggtc tgtgagcgct tgtacaacgt cattgagcgg agtctgtgac tgtttggcca 2040
tacaagccat agttagactt ggcattgtgc caaattgatt gttcaaaagt gatgagtctt 2100
tcacatccca aactcttacc acaccacttg caccctgctg aggctttctc atcccaacta 2160
tctgtaggat ctgagatctt tggtctagtt gctgtgttgt taagttcccc atatataccc 2220
ctgaagcctg gggcctttca gacctcatga tcttggcctt cagcttctca aggtcagccg 2280
caagagacat cagttcttct gcactgagcc tccccacttt caaaacattc ttctttgatg 2340
ttgactttaa atccacaaga gaatgtacag tctggttgag acttctgagt ctctgtaggt 2400
ctttgtcatc tctcttttcc ttcctcatga tcctctgaac attgctgacc tcagagaagt 2460
ccaacccatt cagaaggttg gttgcatcct taatgacagc agccttcaca tctgatgtga 2520
agctctgcaa ttctcttctc aatgcttgcg tccattggaa gctcttaact tccttagaca 2580
aggacatctt gttgctcaat ggtttctcaa gacaaatgcg caatcaaatg cctaggatcc 2640
actgtgcg 2648
<210> 40
<211> 2468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达HPV16 E7E6融合蛋白的三区段的基于r3LCMVart的载体的核苷酸序列：S区段2 (包含GP)
<400> 40
gcgcaccggg gatcctaggc tttttggatt gcgctttcct ctagatcaac tgggtgtcag 60
gccctatcct acagaaggat gcacggcgac acccctaccc tgcacgagta catgctggac 120
ctgcagcccg agacaaccga cctgtacggc tacggccagc tgaacgacag cagcgaggaa 180
gaggacgaga tcgacggccc tgctggacag gccgaacctg acagagccca ctacaacatc 240
gtgacattct gctgcaagtg cgacagcacc ctgagactgt gcgtgcagag cacccacgtg 300
gacatcagaa ccctggaaga tctgctgatg ggcaccctgg gcatcgtggg ccctatctgc 360
tctcagaagc cccaccagaa aagaaccgcc atgttccagg acccccagga aagacccaga 420
aagctgcccc agctgtgcac cgagctgcag accaccatcc acgacatcat cctggaatgc 480
gtgtactgca agcagcagct gctgagaaga gaggtgtacg acttcgcctt ccgggacctg 540
tgcatcgtgt acagggacgg caacccttac gccgtgggcg acaagtgcct gaagttctac 600
agcaagatca gcgagtaccg gcactactgc tacagcctgt acggaaccac cctggaacag 660
cagtacaaca agcccctgtg cgacctgctg atcagatgca tcaacggcca gaaacccctg 720
tgccccgagg aaaagcagag acacctggac aagaagcagc ggttccacaa catcagaggc 780
agatggaccg gcagatgcat gagctgttgc agaagcagca gaaccagacg cgagactcag 840
ctgtgaagaa cagcgcctcc ctgactctcc acctcgaaag aggtggagag tcagggaggc 900
ccagagggtc tcagcgtctt ttccagacgg tttttacacc aggcacctta aatgcaccac 960
aactacaaat tcctttgttg gttaatcggt gtggctttgg acatgagcca ccttttatgt 1020
gcctgtgtgt tggtattttg acaaggtgca ggaagatgct gactagatat gcagatgtgg 1080
aaaacatcag aaggtccatc aatgctaggg gggtactccc ctgcctcttt atgtaatcct 1140
tcctcaacat ctctgtaatc atgttatcgg cttcctgttc gatttggtca ctgaagtggg 1200
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tctttgcatg ttctaggtac caaaactttg agtaattgca atatggcacc cccatcagat 1320
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caattagtcg cagcatgtca cagaattctt catcatgatt tacattgcat ttcgcaactg 1500
ctgtgttccc gaaacactta agctctgcag caagaatcat ccatttggtc aggcaataac 1560
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tcctagtgga gaacttagtt ttctcttggg aaaggagaat cctggacatc ccaaaaggac 1680
ctgcatatgt gcagtggttt tcccaggttc tattttgtat aatcaggtat tggtaactcg 1740
tctggctaca ccaggtggtc ttgccatctg agcctgtcca gccccagcca ctcctcatgt 1800
atttcccccc gaaggcagtt ctaaacatat ctaggactct acctctgaag gttctacact 1860
ggctctgagc actttgtgca tctgagaatg tcaagttgta ttggatggtt atgccattgt 1920
tgaagtcgca ggatactgcc ttatagttgg agttccctct gatactgagg tgtaggctcg 1980
aaactatact catgagtgtg tggtcaaagg tctttttgtt gaaggcagag gtcagattgc 2040
aaaagttgtg actgatgatg gaatcattgg tgaaggtcaa ttctagtcca gaagtcccca 2100
tactgatgta atggtgggag ttgttggctg aacatgcgtt gggcatggtc aggttcagat 2160
gtgacatatc aaactccact gacttaaatt ggtaaactcc tttgtaaatg tcgggtccct 2220
taagaccgta catgccacag gacctgccag ccagaagtag gaaactgatc aatgcgaata 2280
tcccacaggt ggcaaaattg tagacagcct tgatacccgt gatcacgata agcacaataa 2340
tgacaatgtt gatcacctca tcgatgatgt gaggcagagc ctcaaacatt gtcacaatct 2400
gacccatctt gttgctcaat ggtttctcaa gacaaatgcg caatcaaatg cctaggatcc 2460
actgtgcg 2468
<210> 41
<211> 7229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达HPV16 E7E6融合蛋白的三区段的基于r3LCMVart的载体的核苷酸序列：L区段
<400> 41
gcgcaccggg gatcctaggc gtttagttgc gctgtttggt tgcacaactt tcttcgtgag 60
gctgtcagaa gtggacctgg ctgatagcga tgggtcaagg caagtccaga gaggagaaag 120
gcaccaatag tacaaacagg gccgaaatcc taccagatac cacctatctt ggccctttaa 180
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cattaccaac cagattgaag atatcaacag ccccaagctc tccacctccc tacgaagagt 360
aacaccgtcc ggccccggcc ccgacaaaca gcccagcaca agggaaccgc acgtcaccca 420
acgcacacag acacagcacc caacacagaa cacgcacaca cacacacaca cacacccaca 480
cgcacgcgcc cccaccaccg gggggcgccc ccccccgggg ggcggccccc cgggagcccg 540
ggcggagccc cacggagatg cccatcagtc gatgtcctcg gccaccgacc cgcccagcca 600
atcgtcgcag gacctcccct tgagtctaaa cctgcccccc actgtttcat acatcaaagt 660
gctcctagat ttgctaaaac aaagtctgca atccttaaag gcgaaccagt ctggcaaaag 720
cgacagtgga atcagcagaa tagatctgtc tatacatagt tcctggagga ttacacttat 780
ctctgaaccc aacaaatgtt caccagttct gaatcgatgc aggaagaggt tcccaaggac 840
atcactaatc ttttcatagc cctcaagtcc tgctagaaag actttcatgt ccttggtctc 900
cagcttcaca atgatatttt ggacaaggtt tcttccttca aaaagggcac ccatctttac 960
agtcagtggc acaggctccc actcaggtcc aactctctca aagtcaatag atctaatccc 1020
atccagtatt cttttggagc ccaacaactc aagctcaaga gaatcaccaa gtatcaaggg 1080
atcttccatg taatcctcaa actcttcaga tctgatatca aagacaccat cgttcacctt 1140
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cctaaccaag aatatcaatg aaaatttcct taaacagtca gtattattct gattgtgcgt 1320
aaagtccact gaaattgaaa actccaatac cccttttgtg tagttgagca tgtagtccca 1380
cagatccttt aaggatttaa atgcctttgg gtttgtcagg ccctgcctaa tcaacatggc 1440
agcattacac acaacatctc ccattcggta agagaaccac ccaaaaccaa actgcaaatc 1500
attcctaaac ataggcctct ccacattttt gttcaccacc tttgagacaa atgattgaaa 1560
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aaaattgcct aatgtcctgg ttgttgcaac aaattctcga acaaatgatt caaaatacac 1680
ctgttttaag aagttcttgc agacatccct cgtgctaaca acaaattcat caaccagact 1740
ggagtcagat cgctgatgag aattggcaag gtcagaaaac agaacagtgt aatgttcatc 1800
ccttttccac ttaacaacat gagaaatgag tgacaaggat tctgagttaa tatcaattaa 1860
aacacagagg tcaaggaatt taattctggg actccacctc atgttttttg agctcatgtc 1920
agacataaat ggaagaagct gatcctcaaa gatcttggga tatagccgcc tcacagattg 1980
aatcacttgg ttcaaattca ctttgtcctc cagtagcctt gagctctcag gctttcttgc 2040
tacataatca catgggttta agtgcttaag agttaggttc tcactgttat tcttcccttt 2100
ggtcggttct gctaggaccc aaacacccaa ctcaaaagag ttgctcaatg aaatacaaat 2160
gtagtcccaa agaagaggcc ttaaaaggca tatatgatca cggtgggctt ctggatgaga 2220
ctgtttgtca caaatgtaca gcgttatacc atcccgattg caaactcttg tcacatgatc 2280
atctgtggtt agatcctcaa gcagcttttt gatatacaga ttttccctat ttttgtttct 2340
cacacacctg cttcctagag ttttgcaaag gcctataaag ccagatgaga tacaactctg 2400
gaaagctgac ttgttgattg cttctgacag cagcttctgt gcaccccttg tgaatttact 2460
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aaattcacca tttttgagct tatgatgcag tttccttaca agctttctta caacctttgt 2760
ttcattagga cacagttcct caatgagtct ttgtattctg taacctctag aaccatccag 2820
ccaatctttc acatcagtgt tggtattcag tagaaatgga tccaaaggga aattggcata 2880
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cttgacattg tgtagcgctg cagatacaaa ctttgtgaga agagggactt cctcccccca 3060
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ctcgctaagc aaaccataga agtcagaagc attatgcaag attccctgcc ccatatcaat 3360
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tagaaacatt aagaacaaaa atgggcacat cattggtccc catttgctgt gatccatact 3660
atagtttaag aacccttccc gcacattgat agtcattgac aagattgcat tttcaaattc 3720
cttatcattg tttaaacagg agcctgaaaa gaaacttgaa aaagactcaa aataatcttc 3780
tattaacctt gtgaacattt ttgtcctcaa atctccaata tagagttctc tatttccccc 3840
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ttgtgtcaac gacagagctt tactaaggga ctcagaatta ctttccctct cactgattct 4020
cacgtcttct tccagtttgt cccagtcaaa tttgaaattc aagccttgcc tttgcatatg 4080
cctgtatttc cctgagtacg catttgcatt catttgcaac agaatcatct tcatgcaaga 4140
aaaccaatca ttctcagaaa agaactttct acaaaggttt tttgccatct catcgaggcc 4200
acactgatct ttaatgactg aggtgaaata caaaggtgac agctctgtgg aaccctcaac 4260
agcctcacag ataaatttca tgtcatcatt ggttagacat gatgggtcaa agtcttctac 4320
taaatggaaa gatatttctg acaagataac ttttcttaag tgagccatct tccctgttag 4380
aataagctgt aaatgatgta gtccttttgt atttgtaagt ttttctccat ctcctttgtc 4440
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atattcatag tctgagtggc tcaacttata cttttgtttt cttacgaaac tctccgtaat 4680
ttgactcaca gcactaacaa gcaatttgtt aaagtcatat tccagaagtc gttctccatt 4740
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ctgacagtca atttctttac tagtgaatct cttcatttgc tcatagaaca cacattcttc 4980
ctcaggagtg attgcttcct tggggttgac aaaaaaacca aattgacttt tgggctcaaa 5040
gaacttttca aaacatttta tctgatctgt tagcctgtca ggggtctcct ttgtgatcaa 5100
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accagtacca aaaatagttt ttattaggaa tctaagcagc ttatacacca ccttctcagc 5220
aggtgtgatc agatcctccc tcaacttatc cattaatgat gtagatgaaa aatctgacac 5280
tattgccatc accaaatatc tgacactctg tacctgcttt tgatttctct ttgttgggtt 5340
ggtgagcatt agcaacaata gggtcctcag tgcaacctca atgtcggtga gacagtcttt 5400
caaatcagga catgatctaa tccatgaaat catgatgtct atcatattgt ataagacctc 5460
atctgaaaaa attggtaaaa agaacctttt aggatctgca tagaaggaaa ttaaatgacc 5520
atccgggcct tgtatggagt agcaccttga agattctcca gtcttctggt ataataggtg 5580
gtattcttca gagtccagtt ttattacttg gcaaaacact tctttgcatt ctaccacttg 5640
atatctcaca gaccctattt gattttgcct tagtctagca actgagctag ttttcatact 5700
gtttgttaag gccagacaaa cagatgataa tcttctcagg ctctgtatgt tcttcagctg 5760
ctctgtgctg ggttggaaat tgtaatcttc aaacttcgta taatacatta tcgggtgagc 5820
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ttcagacagt ccgtaatgct cgaaactcag tcccaccact aacaggcatt tttgaatttt 5940
tgcaatgaac tcactaatag atgccctaaa caattcctca aaagacacct ttctaaacac 6000
ctttgacttt tttctattcc tcaaaagtct aatgaactcc tctttagtgc tgtgaaagct 6060
taccagccta tcattcacac tactatagca acaacccacc cagtgtttat cattttttaa 6120
ccctttgaat ttcgactgtt ttatcaatga ggaaagacac aaaacatcca gatttaacaa 6180
ctgtctcctt ctagtattca acagtttcaa actcttgact ttgtttaaca tagagaggag 6240
cctctcatat tcagtgctag tctcacttcc cctttcgtgc ccatgggtct ctgcagttat 6300
gaatctcatc aaaggacagg attcgactgc ctccctgctt aatgttaaga tatcatcact 6360
atcagcaagg ttttcataga gctcagagaa ttccttgatc aagccttcag ggtttacttt 6420
ctgaaagttt ctctttaatt tcccactttc taaatctctt ctaaacctgc tgaaaagaga 6480
gtttattcca aaaaccacat catcacagct catgttgggg ttgatgcctt cgtggcacat 6540
cctcataatt tcatcattgt gagttgacct cgcatctttc agaattttca tagagtccat 6600
accggagcgc ttgtcgatag tagtcttcag ggactcacag agtctaaaat attcagactc 6660
ttcaaagact ttctcatttt ggttagaata ctccaaaagt ttgaataaaa ggtctctaaa 6720
tttgaagttt gcccactctg gcataaaact attatcataa tcacaacgac catctactat 6780
tggaactaat gtgacacccg caacagcaag gtcttccctg atgcatgcca atttgttagt 6840
gtcctctata aatttcttct caaaactggc tggagtgctc ctaacaaaac actcaagaag 6900
aatgagagaa ttgtctatca gcttgtaacc atcaggaatg ataagtggta gtcctgggca 6960
tacaattcca gactccacca aaattgtttc cacagactta tcgtcgtggt tgtgtgtgca 7020
gccactcttg tctgcactgt ctatttcaat gcagcgtgac agcaacttga gtccctcaat 7080
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atcctgttct atatagttta aacataactc tctcaattct gagatgattt catccattgc 7200
gcatcaaaaa gcctaggatc ctcggtgcg 7229
<210> 42
<211> 2721
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达HPV16 E7E6融合蛋白的三区段的基于r3JUNVart的载体的核苷酸序列：S区段1 (包含NP)
<400> 42
gcgcaccggg gatcctaggc gattttggtt acgctataat tgtaactgtt ttctgtttgg 60
acaacatcaa aaacatccat tgcacaatgc acggcgacac ccctaccctg cacgagtaca 120
tgctggacct gcagcccgag acaaccgacc tgtacggcta cggccagctg aacgacagca 180
gcgaggaaga ggacgagatc gacggccctg ctggacaggc cgaacctgac agagcccact 240
acaacatcgt gacattctgc tgcaagtgcg acagcaccct gagactgtgc gtgcagagca 300
cccacgtgga catcagaacc ctggaagatc tgctgatggg caccctgggc atcgtgggcc 360
ctatctgctc tcagaagccc caccagaaaa gaaccgccat gttccaggac ccccaggaaa 420
gacccagaaa gctgccccag ctgtgcaccg agctgcagac caccatccac gacatcatcc 480
tggaatgcgt gtactgcaag cagcagctgc tgagaagaga ggtgtacgac ttcgccttcc 540
gggacctgtg catcgtgtac agggacggca acccttacgc cgtgggcgac aagtgcctga 600
agttctacag caagatcagc gagtaccggc actactgcta cagcctgtac ggaaccaccc 660
tggaacagca gtacaacaag cccctgtgcg acctgctgat cagatgcatc aacggccaga 720
aacccctgtg ccccgaggaa aagcagagac acctggacaa gaagcagcgg ttccacaaca 780
tcagaggcag atggaccggc agatgcatga gctgttgcag aagcagcaga accagacgcg 840
agactcagct gtgagacctc ctgagggtcc ccaccagccc gggcactgcc cgggctggtg 900
tggcccccca gtccgcggcc tggccgcgga ctggggaggc actgcttaca gtgcataggc 960
tgccttcggg aggaacagca agctcggtgg taatagaggt gtaggttcct cctcatagag 1020
cttcccatct agcactgact gaaacattat gcagtctagc agagcacagt gtggttcact 1080
ggaggccaac ttgaagggag tatccttttc cctctttttc ttattgacaa ccactccatt 1140
gtgatatttg cataagtgac catatttctc ccagacctgt tgatcaaact gcctggcttg 1200
ttcagatgtg agcttaacat caaccagttt aagatctctt cttccatgga ggtcaaacaa 1260
cttcctgatg tcatcggatc cttgagtagt cacaaccatg tctggaggca gcaagccgat 1320
cacgtaacta agaactcctg gcattgcatc ttctatgtcc ttcattaaga tgccgtgaga 1380
gtgtctgcta ccatttttaa accctttctc atcatgtggt tttctgaagc agtgaatgta 1440
ctgcttacct gcaggttgga ataatgccat ctcaacaggg tcagtggctg gtccttcaat 1500
gtcgagccaa agggtgttgg tggggtcgag tttccccact gcctctctga tgacagcttc 1560
ttgtatctct gtcaagttag ccaatctcaa attctgaccg tttttttccg gctgtctagg 1620
accagcaact ggtttccttg tcagatcaat acttgtgttg tcccatgacc tgcctgtgat 1680
ttgtgatcta gaaccaatat aaggccaacc atcgccagaa agacaaagtt tgtacaaaag 1740
gttttcataa ggatttctat tgcctggttt ctcatcaata aacatgcctt ctcttcgttt 1800
aacctgaatg gttgatttta tgagggaaga gaagttttct ggggtgactc tgattgtttc 1860
caacatgttt ccaccatcaa gaatagatgc tccagccttt actgcagctg aaagactgaa 1920
gttgtaacca gaaatattga tggagctttc atctttagtc acaatctgaa ggcagtcatg 1980
ttcctgagtc agtctgtcaa ggtcacttaa gtttggatac ttcacagtgt atagaagccc 2040
aagtgaggtt aaagcttgta tgacactgtt cattgtctca cctccttgaa cagtcatgca 2100
tgcaattgtc aatgcaggaa cagagccaaa ctgattgttt agctttgaag ggtctttaac 2160
atcccatatc ctcaccacac catttccccc agtcccttgc tgttgaaatc ccagtgttct 2220
caatatctct gatcttttag caagttgtga ctgggacaag ttacccatgt aaaccccctg 2280
agagcctgtc tctgctcttc ttatcttgtt ttttaatttc tcaaggtcag acgccaactc 2340
catcagttca tccctcccca gatctcccac cttgaaaact gtgtttcgtt gaacactcct 2400
catggacatg agtctgtcaa cctctttatt caggtccctc aacttgttga gatcttcttc 2460
ccccttttta gtctttctga gtgcccgctg cacctgtgcc acttggttga agtcgatgct 2520
gtcagcaatt agcttggcgt ccttcaaaac atctgacttg acagtctgag tgaattggct 2580
caaacctctc cttaaggact gagtccatct aaagcttgga acctccttgg agtgtgccat 2640
gccagaagtt ctggtgattt tgatctagaa tagagttgct cagtgaaagt gttagacact 2700
atgcctagga tccactgtgc g 2721
<210> 43
<211> 2485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达HPV16 E7E6融合蛋白的三区段的基于r3JUNVart的载体的核苷酸序列：S区段2 (包含GP)
<400> 43
gcgcaccggg gatcctaggc gattttggtt acgctataat tgtaactgtt ttctgtttgg 60
acaacatcaa aaacatccat tgcacaatgc acggcgacac ccctaccctg cacgagtaca 120
tgctggacct gcagcccgag acaaccgacc tgtacggcta cggccagctg aacgacagca 180
gcgaggaaga ggacgagatc gacggccctg ctggacaggc cgaacctgac agagcccact 240
acaacatcgt gacattctgc tgcaagtgcg acagcaccct gagactgtgc gtgcagagca 300
cccacgtgga catcagaacc ctggaagatc tgctgatggg caccctgggc atcgtgggcc 360
ctatctgctc tcagaagccc caccagaaaa gaaccgccat gttccaggac ccccaggaaa 420
gacccagaaa gctgccccag ctgtgcaccg agctgcagac caccatccac gacatcatcc 480
tggaatgcgt gtactgcaag cagcagctgc tgagaagaga ggtgtacgac ttcgccttcc 540
gggacctgtg catcgtgtac agggacggca acccttacgc cgtgggcgac aagtgcctga 600
agttctacag caagatcagc gagtaccggc actactgcta cagcctgtac ggaaccaccc 660
tggaacagca gtacaacaag cccctgtgcg acctgctgat cagatgcatc aacggccaga 720
aacccctgtg ccccgaggaa aagcagagac acctggacaa gaagcagcgg ttccacaaca 780
tcagaggcag atggaccggc agatgcatga gctgttgcag aagcagcaga accagacgcg 840
agactcagct gtgagacctc ctgagggtcc ccaccagccc gggcactgcc cgggctggtg 900
tggcccccca gtccgcggcc tggccgcgga ctggggaggc actgcttagt gtcctctacg 960
ccaaactgtt ggtttcttta gattggggta cttaccacat ctgcaaccac ccaagctgtt 1020
caacctgtgt ggcaaagggc atgcttcgcc cctgatgtgt ctgtgggagg gtatacccac 1080
caagtgaagg aagagtgacg ctgtgaagaa tactgtgctc caaatacaga tgtcaactaa 1140
agtcaaagga gttttaccct gcctgtccga atactctttg cttagcattt cagaaattaa 1200
gaagtcactt tctaatatcc agtcattacg gaagtcagag atgttcaaat agctgttgtt 1260
ttttattaac cagcaccttg gtaatgagtg ttgtcctgaa agtgtgtggt tgacatacca 1320
aaattttgtg taattgcagt aagggacact catcagttcc ctaattttgt ttttcatcaa 1380
taaattgtca gatatcaggg cattgattgt ctgccccatc agatttactt gtttcttagt 1440
ttcatcattt agggttttga tagcattttt gttgtaatca aagagcctca acatgtcaca 1500
gaattcagag tcatgattca aattgcattt tgctacagca gtattgccaa aacacttcat 1560
tttggctgct acgagcatcc actcttctag acaatagcct ccaggggtat ccttgccgga 1620
tgagtctgtc aaagaccagg agaagaatgc tttcaaggac ctccttggaa gttgaatgtt 1680
tttacctctt gtaaggaagt gtaatgtgtt aacgtggtcg agtggacatt ggagaggcca 1740
actggtaggt tgtgccttca ttaagcacag tttgccattc aagcaagggt caggatattc 1800
tctatataaa tgatgcatgc cagtcttaaa cttcttagca taatttccat tgacaccagt 1860
cttggaggtg ttgacttgaa agatgaagcc ttctgtcttt gcacggttcc tacacagaaa 1920
tggtgggtct agatgccaat catgtcccac agcattcatg aaccactgag acaaccaaat 1980
ttgatcatca cttttggaac accagctcat atctgctgga tgttgtatta taacatcata 2040
ctgtggcaac aatactgcaa tatcatcaaa gctgatctga aatgaagcat tgcccccctt 2100
aatgtaaaga tggctcttgt ttaaggtaca caacaaaggt aggtcatgtg gattgttgga 2160
aaagagaccc accattgaga aggacacagt ctggaactca gtgtgcagtc cgattttgaa 2220
agcttcttct gtgcaggatc ttcctgcaag cgctaggaat acaaagaatt ggaataaacc 2280
acttttgtac aagttcacta tacccttaat gatggcaatg agactgactg caacaagagc 2340
aatgttcaga gcctcctgca aaaaggttgg tatttcttgc atgaagctaa tgaactgccc 2400
catgccagaa gttctggtga ttttgatcta gaatagagtt gctcagtgaa agtgttagac 2460
actatgccta gggatccact gtgcg 2485
<210> 44
<211> 7115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达HPV16 E7E6融合蛋白的三区段的基于r3JUNVart的载体的核苷酸序列：L区段
<400> 44
gcgcaccggg gatcctaggc gtaacttcat cattaaaatc tcagattctg ctctgagtgt 60
gacttactgc gaagaggcag acaaatgggc aactgcaacg gggcatccaa gtctaaccag 120
ccagactcct caagagccac acagccagcc gcagaattta ggagggtagc tcacagcagt 180
ctatatggta gatataactg taagtgctgc tggtttgctg ataccaattt gataacctgt 240
aatgatcact acctttgttt aaggtgccat cagggtatgt taaggaattc agatctctgc 300
aatatctgct ggaagcccct gcccaccaca atcacagtac cggtggagcc aacagcacca 360
ccaccatagg cagactgcac agggtcagac ccgacccccc ggggggcccc catggggacc 420
ccccgtgggg gaaccccggg ggtgatgcgc cattagtcaa tgtctttgat ctcgactttg 480
tgcttcagtg gcctgcatgt cacccctttc aatctgaact gcccttgggg atctgatatc 540
agcaggtcat ttaaagatct gctgaatgcc accttgaaat ttgagaattc caaccagtca 600
ccaaatttat caagtgaacg gatcaactgc tctttgtgta gatcataaac gaggacaaag 660
tcctcttgct gaaataatat tgtttgtgat gttgttttta gataaggcca tagttggctt 720
aataaggttt ccacactatc aatgtcctct agtgctccaa ttgccttgac tatgacatcc 780
ccagacaact caactctata tgttgacaac ctttcattac ctctgtaaaa gataccctct 840
ttcaagacaa gaggttctcc tgggttatct ggcccaatga ggtcatatgc atacttgtta 900
cttagttcag aataaaagtc accaaagttg aacttaacat ggctcagaat attgtcatca 960
tttgtcgcag cgtagcctgc atcaataaac aagccagcta ggtcaaagct ctcatggcct 1020
gtgaacaatg gtaggctagc gataaccagt gcaccatcca acaatgagtg gcttccctca 1080
gacccagaaa cacattgact cattgcatcc acattcagct ctaattcagg ggtaccgaca 1140
tcatccactc ctagtgaact gacaatggtg taactgtaca ccatctttct tctaagttta 1200
aattttgtcg aaactcgtgt gtgttctact tgaatgatca attttagttt cacagcttct 1260
tggcaagcaa cattgcgcaa cacagtgtgc aggtccatca tgtcttcctg aggcaacaag 1320
gagatgttgt caacagagac accctcaagg aaaaccttga tattatcaaa gctagaaact 1380
acataaccca ttgcaatgtc ttcaacaaac attgctcttg atactttatt attcctaact 1440
gacaaggtaa aatctgtgag ttcagctaga tctacttgac tgtcatcttc tagatctaga 1500
acttcattga accaaaagaa ggatttgaga cacgatgttg acatgactag tgggtttatc 1560
atcgaagata agacaacttg caccatgaag ttcctgcaaa cttgctgtgg gctgatgcca 1620
acttcccaat ttgtatactc tgactgtcta acatgggctg aagcgcaatc actctgtttc 1680
acaatataaa cattattatc tcttactttc aataagtgac ttataatccc taagttttca 1740
ttcatcatgt ctagagccac acagacatct agaaacttga gtcttccact atccaaagat 1800
ctgttcactt gaagatcatt cataaagggt gccaaatgtt cttcaaatag tttggggtaa 1860
tttcttcgta tagaatgcaa tacatggttc atgcctaatt ggtcttctat ctgtcgtact 1920
gctttgggtt taacagccca gaagaaattc ttattacata agaccagagg ggcctgtgga 1980
ctcttaatag cagaaaacac ccactcccct aactcacagg catttgtcag caccaaagag 2040
aagtaatccc acaaaattgg tttagaaaat tggttaactt ctttaagtga tttttgacag 2100
taaataactt taggctttct ctcacaaatt ccacaaagac atggcattat tcgagtaaat 2160
atgtccttta tatacagaaa tccgccttta ccatccctaa cacacttact ccccatactc 2220
ttacaaaacc caatgaagcc tgaggcaaca gaagactgaa atgcagattt gttgattgac 2280
tctgccaaga tcttcttcac gccttttgtg aaatttcttg acagcctgga ctgtattgtc 2340
cttatcaatg ttggcatctc ttctttctct aacactcttc gacttgtcat gagtttggtc 2400
ctcaagacca acctcaagtc cccaaagctc gctaaattga cccatctgta gtctagagtt 2460
tgtctgattt catcttcact acacccggca tattgcagga atccggataa agcctcatcc 2520
cctcccctgc ttatcaagtt gataaggttt tcctcaaaga ttttgcctct cttaatgtca 2580
ttgaacactt tcctcgcgca gttccttata aacattgtct ccttatcatc agaaaaaata 2640
gcttcaattt tcctctgtag acggtaccct ctagacccat caacccagtc tttgacatct 2700
tgttcttcaa tagctccaaa cggagtctct ctgtatccag agtatctaat caattggttg 2760
actctaatgg aaatctttga cactatatga gtgctaaccc cattagcaat acattgatca 2820
caaattgtgt ctatggtctc tgacagttgt gttggagttt tacacttaac gttgtgtaga 2880
gcagcagaca caaacttggt gagtaaagga gtctcttcac ccatgacaaa aaatcttgac 2940
ttaaactcag caacaaaagt tcctatcaca ctctttgggc tgataaactt gtttaattta 3000
gaagataaga attcatggaa gcacaccatt tccagcagtt ctgtcctgtc ttgaaacttt 3060
tcatcactaa ggcaaggaat ttttataagg ctaacctggt catcgctgga ggtataagtg 3120
acaggtatca catcatacaa taagtcaagt gcataacaca gaaattgttc agtaattagc 3180
ccatataaat ctgatgtgtt gtgcaagatt ccctggccca tgtccaagac agacattata 3240
tggctgggga cctggtccct tgactgcaga tactggtgaa aaaactcttc accaacacta 3300
gtacagtcac aacccattaa acctaaagat ctcttcaatt tccctacaca gtaggcttct 3360
gcaacattaa ttggaacttc aacgacctta tgaagatgcc atttgagaat gttcattact 3420
ggttcaagat tcacctttgt tctatctctg ggattcttca attctaatgt gtacaaaaaa 3480
gaaaggaaaa gtgctgggct catagttggt ccccatttgg agtggtcata tgaacaggac 3540
aagtcaccat tgttaacagc cattttcata tcacagattg cacgttcgaa ttccttttct 3600
gaattcaagc atgtgtattt cattgaacta cccacagctt ctgagaagtc ttcaactaac 3660
ctggtcatca gcttagtgtt gaggtctccc acatacagtt ctctatttga gccaacctgc 3720
tccttataac ttagtccaaa tttcaagttc cctgtatttg agctgatgct tgtgaactct 3780
gtaggagagt cgtctgaata gaaacataaa ttccgtaggg ctgcatttgt aaaataactt 3840
ttgtctagct tatcagcaat ggcttcagaa ttgctttccc tggtactaag ccgaacctca 3900
tcctttagtc tcagaacttc actggaaaag cccaatctag atctacttct atgctcataa 3960
ctacccaatt tctgatcata atgtccttga attaaaagat acttgaagca ttcaaagaat 4020
tcatcttctt ggtaggctat tgttgtcaaa ttttttaata acaaacccaa agggcagatg 4080
tcctgcggtg cttcaagaaa ataagtcaat ttaaatggag atagataaac agcatcacat 4140
aactctttat acacatcaga cctgagcaca tctggatcaa aatccttcac ctcatgcatt 4200
gacacctctg ctttaatctc tctcaacact ccaaaagggg cccacaatga ctcaagagac 4260
tctcgctcat caacagatgg attttttgat ttcaacttgg tgatctcaac ttttgtcccc 4320
tcactattag ccatcttggc tagtgtcatt tgtacgtcat ttctaatacc ctcaaaggcc 4380
cttacttgat cctctgttaa actctcatac atcactgata attcttcttg attggttctg 4440
gttcttgaac cggtgctcac aagacctgtt agatttttta atattaagta gtccatggaa 4500
tcaggatcaa gattatacct gccttttgtt ttaaacctct cagccatagt agaaacgcat 4560
gttgaaacaa gtttctcctt atcataaaca gaaagaatat ttccaagttc gtcgagcttg 4620
gggattacca cacttttatt gcttgacaga tccagagctg tgctagtgat gttaggcctg 4680
tagggattgc ttttcagttc acctgtaact ttaagtcttc ctctattgaa gagagaaatg 4740
cagaaggaca aaatctcttt acacactcct ggaatttgag tatctgagga agtcttagcc 4800
tctttggaaa agaatctgtc caatcctctt atcatggtgt cctcttgttc cagtgttaga 4860
ctcccactta gaggggggtt tacaacaaca caatcaaact tgactttggg ctcaataaac 4920
ttctcaaaac actttatttg atctgtcagg cgatcaggtg tctctttggt taccaagtga 4980
cacagataac taacatttaa tagatattta aaccttcttg caaagtaaag atctgcatct 5040
tccccttcac ccaaaattgt ctggaaaagt tccacagcca tcctctgaat cagcacctct 5100
gatccagaca tgcagtcgac ccttaacttt gacatcaaat ccacatgatg gatttgattt 5160
gcatatgcca tcaagaaata tcttagacct tgtaaaaatg tctggttcct tttggaaggg 5220
gaacagagta cagctaacac taacaatctt aatattggcc ttgtcattgt catgagttcg 5280
tggctaaaat ccaaccagct ggtcatttcc tcacacattt caattaacac atcctccgaa 5340
aatataggca ggaaaaatct ctttggatca cagtaaaaag agccttgttc ttccaatacc 5400
ccattgatgg atagatagat agaatagcac cttgacttct cacctgtttt ttggtaaaac 5460
aagagaccaa atgtattctt tgtcagatga aatctttgta cataacactc tcttagtcta 5520
acattcccaa aatatctaga atactctctt tcattgatta acaatcggga ggaaaatgat 5580
gtcttcatcg agttgaccaa tgcaagggaa atggaggaca aaatcctaaa taatttcttc 5640
tgctcacctt ccactaagct gctgaatggc tgatgtctac agattttctc aaattccttg 5700
ttaatagtat atctcatcac tggtctgtca gaaacaagtg cctgagctaa aatcatcaag 5760
ctatccatat cagggtgttt tattagtttt tccagctgtg accagagatc ttgatgagag 5820
ttcttcaatg ttctggaaca cgcttgaacc cacttggggc tggtcatcaa tttcttcctt 5880
attagtttaa tcgcctccag aatatctaga agtctgtcat tgactaacat taacatttgt 5940
ccaacaacta ttcccgcatt tcttaacctt acaattgcat catcatgcgt tttgaaaaga 6000
tcacaaagta aattgagtaa aactaagtcc agaaacagta aagtgtttct cctggtgttg 6060
aaaactttta gacctttcac tttgttacac acggaaaggg cttgaagata acacctctct 6120
acagcatcaa tagatataga attctcatct gactggcttt ccatgttgac ttcatctatt 6180
ggatgcaatg cgatagagta gactacatcc atcaacttgt ttgcacaaaa agggcagctg 6240
ggcacatcac tgtctttgtg gcttcctaat aagatcaagt catttataag cttagacttt 6300
tgtgaaaatt tgaatttccc caactgcttg tcaaaaatct ccttcttaaa ccaaaacctt 6360
aactttatga gttcttctct tatgacagat tctctaatgt ctcctctaac cccaacaaag 6420
agggattcat ttaacctctc atcataaccc aaagaattct ttttcaagca ttcgatgttt 6480
tctaatccca agctctggtt ttttgtgttg gacaaactat ggatcaatcg ctggtattct 6540
tgttcttcaa tattaatctc ttgcataaat tttgatttct ttaggatgtc gatcagcaac 6600
caccgaactc tttcaacaac ccaatcagca aggaatctat tgctgtagct agatctgcca 6660
tcaaccacag gaaccaacgt aatccctgcc cttagtaggt cggactttag gtttaagagc 6720
tttgacatgt cactcttcca ttttctctca aactcatcag gattgaccct aacaaaggtt 6780
tccaatagga tgagtgtttt ccctgtgagt ttgaagccat ccggaatgac ttttggaagg 6840
gtgggacata gtatgccata gtcagacagg atcacatcaa caaacttctg atctgaattg 6900
atctgacagg cgtgtgcctc acaggactca agctctacta aacttgacag aagtttgaac 6960
ccttccaaca acagagagct ggggtgatgt tgagataaaa agatgtccct ttggtatgct 7020
agctcctgtc tttctggaaa atgctttcta ataaggcttt ttatttcatt tactgattcc 7080
tccatgctca agtgccgcct aggatcctcg gtgcg 7115

Claims (273)

1.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
2.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码致瘤病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。
3.感染性的基于复制缺陷型沙粒病毒的病毒载体，其包含编码第一人乳头瘤病毒(HPV)抗原的第一核苷酸序列。
4.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组，其中一个沙粒病毒开放式阅读框至少部分去除或功能性失活，且其中插入编码第一HPV抗原的第一核苷酸序列。
5.权利要求1-4任一项的病毒载体，其中第一核苷酸序列进一步编码第二HPV抗原。
6.权利要求1-4任一项的病毒载体，其中第一核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种HPV抗原。
7.权利要求1-4任一项的病毒载体，其中病毒载体进一步包含编码第二HPV抗原的第二核苷酸序列。
8.权利要求7的病毒载体7，其中第二核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种HPV抗原。
9.前述任一项权利要求的病毒载体，其中第一抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
10.权利要求5或权利要求7的病毒载体，其中第二抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
11.权利要求5-10任一项的病毒载体，其中第一和/或第二抗原是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82抗原。
12.权利要求5-10任一项的病毒载体，其中第一抗原是HPV16抗原，且第二抗原是HPV18抗原。
13.权利要求5-10任一项的病毒载体，其中病毒载体编码一种、两种或三种HPV16抗原和一种、两种或三种HPV18抗原。
14.权利要求5-10任一项的病毒载体，其中病毒载体编码两种HPV16抗原和两种HPV18抗原，其中抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
15.权利要求1-10任一项的病毒载体，其中第一抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
16.权利要求5-10任一项的病毒载体，其中第一和第二抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段，
且其中第一和第二抗原不相同。
17.权利要求5-16任一项的病毒载体，其中第一或第二抗原是在Rb结合位点具有突变的HPV蛋白E7。
18.权利要求17的病毒载体17，其中第一或第二抗原是在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV蛋白E7。
19.权利要求5-16任一项的病毒载体，其中第一或第二抗原是在锌指基序具有突变的HPV蛋白E6。
20.权利要求5-16任一项的病毒载体，其中第一和第二抗原彼此直接融合。
21.权利要求5-16任一项的病毒载体，其中第一和第二抗原彼此通过肽接头融合。
22.权利要求5-16任一项的病毒载体，其中第一和第二抗原通过自裂解肽或导致核糖体跳跃的肽序列彼此分隔。
23.权利要求22的病毒载体，其中自裂解肽是猪捷申病毒-1 2A肽、Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
24.权利要求5-16任一项的病毒载体，进一步包含编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的第三核苷酸序列。
25.权利要求24的病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
a.钙网蛋白(CRT)或其片段；
b.泛素或其片段；
c.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；
d.恒定链(CD74)或其抗原性片段；
e.结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；
f.单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；
g.CD40配体或其抗原性片段；和
h.Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
26.权利要求24的病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
a.钙网蛋白(CRT)或其片段；
b.泛素或其片段；和
c.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段。
27.权利要求24-26任一项的病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第一抗原或通过肽接头融合至第一抗原。
28.权利要求24-26任一项的病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第二抗原或通过肽接头融合至第二抗原。
29.权利要求27或权利要求28的病毒载体，其中肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO：18。
30.权利要求24-26任一项的病毒载体，其中第一抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
31.权利要求24-26任一项的病毒载体，其中第二抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
32.权利要求30或权利要求31的病毒载体，其中自裂解肽为猪捷申病毒-1 2A肽，Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
33.前述任一项权利要求的病毒载体，进一步包含编码分泌信号的核苷酸序列。
34.权利要求33的病毒载体33，其中分泌信号是人酪氨酸酶分泌信号、人生长激素分泌信号或组织纤溶酶原激活物信号序列。
35.权利要求20的病毒载体20，其中得到的融合蛋白与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
36.权利要求20的病毒载体，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ ID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
37.权利要求20的病毒载体，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ ID NO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
38.权利要求20的病毒载体，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ ID NO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
39.前述任一项权利要求的病毒载体，其中沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或Junin病毒。
40.前述任一项权利要求的病毒载体，其中编码沙粒病毒糖蛋白(“GP”)、核蛋白(“NP”)、基质蛋白Z(“Z蛋白”)或RNA依赖性RNA聚合酶L(“L蛋白”)的病毒开放式阅读框(“ORF”)被去除或功能性失活。
41.权利要求40的病毒载体，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除或功能性失活。
42.权利要求40的病毒载体40，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
43.权利要求40的病毒载体，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF中只有一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
44.权利要求40的病毒载体，其中编码GP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
45.权利要求40的病毒载体，其中编码NP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
46.权利要求40的病毒载体，其中编码Z蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
47.权利要求40的病毒载体，其中编码L蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
48.权利要求40-47任一项的病毒载体，其中异源ORF编码报告蛋白。
49.权利要求40-47任一项的病毒载体，其中异源ORF编码源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。
50.权利要求49的病毒载体49，其中编码抗原的异源ORF选自人乳头瘤病毒(HPV)，人免疫缺陷病毒抗原，丙型肝炎病毒抗原，水痘带状疱疹病毒抗原，巨细胞病毒抗原，结核杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
51.前述任一项权利要求的病毒载体，其中编码感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13株或MP株。
52.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码与SEQ IDNO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的HPV16E7/E6多肽的核酸序列。
53.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码与氨基酸序列SEQ ID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的HPV16E7/HPV18E6多肽的核酸序列。
54.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码与氨基酸序列SEQ ID NO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的HPV18E7/HPV16E6多肽的核酸序列。
55.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其包含编码与氨基酸序列SEQ ID NO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％的HPV16E7/HPV18E6/HPV16E6/HPV18E7多肽的核酸序列。
56.权利要求52-55任一项的病毒载体，其中病毒载体被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组，其中病毒的开放式阅读框(“ORF”)被功能性失活。
57.分离的核酸，其中核酸编码前述任一项权利要求的病毒载体。
58.表达载体，包含权利要求57的核酸。
59.宿主细胞，包含权利要求57的核酸或权利要求58的表达载体。
60.用于产生感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的方法，包括：
a.向宿主细胞中转染权利要求57的核酸；
b.在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
c.收获感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体；
其中宿主细胞表达基因组区段的被缺失或功能性失活的开放式阅读框。
61.药物组合物，包含权利要求1-53任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。
62.免疫原性组合物，包含权利要求1-53任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。
63.疫苗，包含权利要求1-53任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。
64.治疗或预防患者人乳头瘤病毒感染的方法，其中所述方法包括对患者施用权利要求1-53任一项的病毒载体，权利要求61的药物组合物，权利要求62的免疫原性组合物或权利要求63的疫苗。
65.权利要求64的方法，其中该方法导致患者中已存在的HPV滴度的降低。
66.权利要求64的方法，其中该方法诱导抗原特异性CD8+T细胞应答。
67.权利要求64的方法，其中HPV感染是有症状的。
68.权利要求64的方法，其中HPV感染是无症状的。
69.权利要求64的方法，其中该方法降低HPV感染的严重程度或频率或预防HPV感染的临床表现。
70.权利要求69的方法，其中临床表现选自：宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、HPV阳性口咽癌(OSCC)、普通疣、跖疣、甲下或月经疣、生殖器疣、尖锐湿疣或性病疣、呼吸道乳头状瘤病和疣状表皮发育不良。
71.治疗或预防患者人乳头瘤病毒感染的方法，其中所述方法包括对患者施用权利要求1-53任一项的第一病毒载体，权利要求61的第一药物组合物，权利要求62的第一免疫原性组合物或权利要求63的第一疫苗；和对患者施用权利要求1-53任一项的第二病毒载体，权利要求61的第二药物组合物，权利要求62的第二免疫原性组合物或权利要求63的第二疫苗。
72.权利要求71的方法71，其中第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗和第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗是同源的。
73.权利要求71的方法71，其中第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗和第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗是异源的。
74.权利要求71的方法，其中第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗来源于LCMV，第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗来源于Junin病毒。
75.权利要求71的方法，其中第一病毒载体、第一药物组合物、第一免疫原性组合物或第一疫苗来源于Junin病毒，第二病毒载体、第二药物组合物、第二免疫原性组合物或第二疫苗来源于LCMV。
76.感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其被工程化以含有能够在受感染的细胞中扩增和表达其遗传信息、但不能在正常细胞而非遗传工程化细胞中产生进一步的感染性后代颗粒的基因组，其中一种沙粒病毒开放式阅读框被至少部分去除或功能性失活，且其中沙粒病毒载体的基因组编码HPV16E6或其抗原性片段、HPV16E7或其抗原性片段、HPV18E6或其抗原性片段和HPV18E7或其抗原性片段。
77.权利要求76的病毒载体76，其中沙粒病毒载体编码HPV16E6/E7融合蛋白和HPV18E6/E7融合蛋白。
78.权利要求76的病毒载体76，其中HPV16E6或其抗原性片段、HPV16E7或其抗原性片段、HPV18E6或其抗原性片段和HPV18E7或其抗原性片段由一种、两种、三种或四种异源核苷酸序列编码。
79.权利要求76的病毒载体76，其中载体编码融合一种或多种HPV16E6或其抗原性片段、HPV16E7或其抗原性片段、HPV18E6或其抗原性片段和HPV18E7或其抗原性片段的信号肽。
80.权利要求76的病毒载体，其中载体编码两种或多种HPV16E6或其抗原性片段、HPV16E7或其抗原性片段、HPV18E6或其抗原性片段和HPV18E7或其抗原性片段之间的肽接头。
81.权利要求76的病毒载体，其中载体进一步包含编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的核苷酸序列。
82.诱导患者中免疫应答的方法，其中所述方法包括对患者施用第一感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体；和在一段时间后对患者施用不同的第二感染性的复制缺陷型沙粒病毒病毒载体(“异源初免-加强”)。
83.权利要求82的方法82，其中第一沙粒病毒病毒载体来源于LCMV，第二沙粒病毒病毒载体来源于Junin。
84.权利要求82的方法82，其中第一沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒，第二沙粒病毒病毒载体来源于LCMV。
85.权利要求82的方法82，其中第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体表达相同抗原。
86.权利要求82的方法，其中第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体表达不同的抗原。
87.权利要求82的方法，其中第一和第二沙粒病毒病毒载体包含编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的核苷酸序列。
88.权利要求87的方法87，其中致瘤病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
89.权利要求87的方法，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。
90.沙粒病毒基因组区段，其中基因组区段被工程化以在与野生型ORF位点不同的位置携带病毒开放式阅读框(“ORF”)和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，且其中沙粒病毒基因组区段选自：
a.S区段，其中编码核蛋白(“NP”)的ORF处于沙粒病毒5’非翻译区(“UTR”)的控制下；
b.S区段，其中编码基质蛋白Z(“Z蛋白”)的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
c.S区段，其中编码RNA依赖性RNA聚合酶L(“L蛋白”)的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
d.S区段，其中编码病毒糖蛋白(“GP”)的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
e.S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
f.S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
g.L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
h.L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
i.L区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
j.L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
k.L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
l.L区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
91.权利要求90的沙粒病毒基因组区段90，其中沙粒病毒3’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的3’UTR，且其中沙粒病毒5’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的5’UTR。
92.权利要求90的沙粒病毒基因组区段，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。
93.权利要求90的沙粒病毒基因组区段，其中所述第一核苷酸序列编码第一人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
94.权利要求90-93任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一核苷酸序列进一步编码第二HPV抗原。
95.权利要求90-93任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种HPV抗原。
96.权利要求90-93任一项的沙粒病毒基因组区段，其中沙粒病毒基因组区段进一步包含编码第二HPV抗原的第二核苷酸序列。
97.权利要求96的沙粒病毒基因组区段，其中第二核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种HPV抗原。
98.权利要求90-97任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
99.权利要求94或权利要求96的沙粒病毒基因组区段，其中第二抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
100.权利要求94-99任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一和/或第二抗原是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82抗原。
101.权利要求94-99任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一抗原是HPV16抗原，第二抗原是HPV18抗原。
102.权利要求94-99任一项的沙粒病毒基因组区段，其中基因组区段编码一种、两种或三种HPV16抗原和一种、两种或三种HPV18抗原。
103.权利要求94-99任一项的沙粒病毒基因组区段，其中基因组区段编码两种HPV16抗原和两种HPV18抗原，其中抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
104.权利要求90-99任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
105.权利要求94或权利要求96的沙粒病毒基因组区段，其中第一和第二抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段，
且其中第一和第二抗原不相同。
106.权利要求94-105任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一或第二抗原是在Rb结合位点具有突变的HPV蛋白E7。
107.权利要求106的沙粒病毒基因组区段，其中第一或第二抗原是在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV蛋白E7。
108.权利要求94-105任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一或第二抗原是在锌指基序具有突变的HPV蛋白E6。
109.权利要求94-105任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一和第二抗原彼此直接融合。
110.权利要求94-105任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一和第二抗原彼此通过肽接头融合。
111.权利要求94-105任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一和第二抗原通过自裂解肽或导致核糖体跳跃的肽序列彼此分隔。
112.权利要求111的沙粒病毒基因组区段，其中自裂解肽是猪捷申病毒-1 2A肽、Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
113.权利要求94-105任一项的沙粒病毒基因组区段，进一步包含编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的第三核苷酸序列。
114.权利要求113的沙粒病毒基因组区段，其中免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
a.钙网蛋白(CRT)或其片段；
b.泛素或其片段；
c.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；
d.恒定链(CD74)或其抗原性片段；
e.结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；
f.单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；
g.CD40配体或其抗原性片段；和
h.Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
115.权利要求114的沙粒病毒基因组区段，其中免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
a.钙网蛋白(CRT)或其片段；
b.泛素或其片段；和
c.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段。
116.权利要求113-115任一项的沙粒病毒基因组区段，其中免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第一抗原或通过肽接头融合至第一抗原。
117.权利要求113-115任一项的沙粒病毒基因组区段，其中免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第二抗原或通过肽接头融合至第二抗原。
118.权利要求116或权利要求117的沙粒病毒基因组区段，其中肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO：18。
119.权利要求113-115任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第一抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
120.权利要求110-115任一项的沙粒病毒基因组区段，其中第二抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
121.权利要求119或权利要求120的沙粒病毒基因组区段，其中自裂解肽为猪捷申病毒-1 2A肽，Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
122.权利要求90-121任一项的沙粒病毒基因组区段，进一步包含编码分泌信号的核苷酸序列。
123.权利要求122的沙粒病毒基因组区段，其中分泌信号是人酪氨酸酶分泌信号、人生长激素分泌信号或组织纤溶酶原激活物信号序列。
124.权利要求109的沙粒病毒基因组区段109，其中得到的融合蛋白与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
125.权利要求109的沙粒病毒基因组区段109，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
126.权利要求109的沙粒病毒基因组区段，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ IDNO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
127.权利要求109的沙粒病毒基因组区段，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ IDNO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
128.权利要求90的沙粒病毒基因组区段，其中所述核酸序列编码HPV16E7/E6多肽，其与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
129.权利要求90的沙粒病毒基因组区段，其中所述核酸序列编码HPV16E7/HPV18E6多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
130.权利要求90的沙粒病毒基因组区段90，其中所述核酸序列编码HPV18E7/HPV16E6多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
131.权利要求90的沙粒病毒基因组区段90，其中所述核酸序列编码HPV16E7/HPV18E6/HPV16E6/HPV18E7多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
132.权利要求90-131任一项的沙粒病毒基因组区段，其中沙粒病毒基因组区段来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(“LCMV”)或Junin病毒。
133.权利要求132的沙粒病毒基因组区段132，其中沙粒病毒基因组区段来源于LCMV。
134.权利要求133的沙粒病毒基因组区段，其中LCMV是MP株、Armstrong株或Armstrong克隆13株。
135.权利要求132的沙粒病毒基因组区段，其中沙粒病毒基因组区段来源于Junin病毒。
136.权利要求135的沙粒病毒基因组区段，其中Junin病毒是Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3株。
137.权利要求90-136任一项的沙粒病毒基因组区段的cDNA。
138.DNA表达载体，包含权利要求137的cDNA。
139.宿主细胞，包含权利要求90的沙粒病毒基因组区段、权利要求137的cDNA或权利要求138的载体。
140.沙粒病毒病毒载体，其包含权利要求90-136任一项的沙粒病毒基因组区段和第二沙粒病毒基因组区段，从而沙粒病毒病毒载体包含S区段和L区段。
141.权利要求140的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的。
142.权利要求140的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体是减毒的。
143.权利要求140的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体是感染性的，但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
144.权利要求143的沙粒病毒病毒载体143，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除或功能性失活。
145.权利要求143的沙粒病毒病毒载体，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF的至少一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
146.权利要求143的沙粒病毒病毒载体，其中编码GP、NP、Z蛋白和L蛋白的四种ORF中只有一种被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
147.权利要求143的沙粒病毒病毒载体，其中编码GP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
148.权利要求143的沙粒病毒病毒载体，其中编码NP的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
149.权利要求143的沙粒病毒病毒载体，其中编码Z蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
150.权利要求143的沙粒病毒病毒载体143，其中编码L蛋白的ORF被去除并替换为来自不同于沙粒病毒的生物体的异源ORF。
151.权利要求145-150任一项的沙粒病毒病毒载体，其中异源ORF编码报告蛋白。
152.权利要求145-150任一项的沙粒病毒病毒载体，其中异源ORF编码源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。
153.权利要求152的沙粒病毒病毒载体，其中编码抗原的异源ORF选自人乳头瘤病毒(HPV)，人免疫缺陷病毒抗原，丙型肝炎病毒抗原，水痘带状疱疹病毒抗原，巨细胞病毒抗原，结核杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
154.权利要求145-152任一项的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体的生长或传染性不受来自非沙粒病毒生物体的异源ORF的影响。
155.权利要求140-154任一项的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体来源于LCMV或Junin病毒。
156.权利要求155的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体来源于LCMV。
157.权利要求156的沙粒病毒病毒载体，其中LCMV是MP株、Armstrong株或Armstrong克隆13株。
158.权利要求155的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒。
159.权利要求158的沙粒病毒病毒载体158，其中Junin病毒是Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3株。
160.产生权利要求90的沙粒病毒基因组区段的方法90，其中所述方法包括转录权利要求137的cDNA。
161.产生权利要求140的沙粒病毒病毒载体的方法，其中所述方法包括：
a.向宿主细胞中转染权利要求137的cDNA；
b.向宿主细胞中转染包含第二沙粒病毒基因组区段cDNA的质粒；
c.在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
d.收获沙粒病毒病毒载体。
162.权利要求161的方法，其中使用双向启动子进行L区段和S区段的转录。
163.权利要求161的方法，其中该方法进一步包括向宿主细胞中转染一种或多种编码沙粒病毒聚合酶的核酸。
164.权利要求161的方法，其中沙粒病毒聚合酶是L蛋白。
165.权利要求161或权利要求163的方法，其中所述方法进一步包括向宿主细胞中转染一种或多种编码NP蛋白的核酸。
166.权利要求161的方法，其中L区段和S区段的转录各自在选自下述的启动子的控制下：
a.RNA聚合酶I启动子；
b.RNA聚合酶II启动子；和
c.T7启动子。
167.疫苗，包含权利要求140-159任一项的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体。
168.药物组合物，包含权利要求140-159任一项的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体。
169.三区段的沙粒病毒病毒载体，包含一种L区段和两种S区段和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，且其中在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因1(RAG1)并感染104PFU的三区段沙粒病毒病毒载体的小鼠中，持续感染70天后，三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒病毒载体。
170.权利要求169的三区段的沙粒病毒病毒载体169，其中将两种沙粒病毒ORF整合到只有一种区段而非两种分隔区段的两种S区段的区段间重组会去除病毒启动子的活性。
171.三区段的沙粒病毒病毒载体，包含两种L区段和一种S区段和编码致瘤病毒抗原或肿瘤相关病毒抗原的第一核苷酸序列，其中致瘤病毒或肿瘤相关病毒不是巨细胞病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒且其中在缺失I型干扰素受体、II型干扰素受体和重组激活基因1(RAG1)并感染104PFU的三区段沙粒病毒病毒载体的小鼠中，持续感染70天后，三区段的沙粒病毒病毒载体的增殖不产生能够复制的双区段的病毒病毒载体。
172.权利要求171的三区段的沙粒病毒病毒载体171，其中，将两种沙粒病毒ORF整合到只有一种区段而非两种分隔区段的两种L区段的区段间重组会去除病毒启动子的活性。
173.权利要求169-172任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中致瘤病毒是人乳头瘤病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、Merkel细胞多瘤病毒或人T-嗜淋巴细胞病毒。
174.权利要求169-172任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中所述第一核苷酸序列编码第一人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
175.权利要求169-174任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一核苷酸序列进一步编码第二HPV抗原。
176.权利要求169-175任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种HPV抗原。
177.权利要求169-175任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体进一步包含编码第二HPV抗原的第二核苷酸序列。
178.权利要求177的三区段的沙粒病毒病毒载体177，其中第二核苷酸序列编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种HPV抗原。
179.权利要求169-178任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
180.权利要求175或权利要求177的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第二抗原选自HPV蛋白E1、HPV蛋白E2、HPV蛋白E3、HPV蛋白E4、HPV蛋白E5、HPV蛋白E6、HPV蛋白E7、HPV蛋白L1和HPV蛋白L2。
181.权利要求169-180任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一和/或第二抗原是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82抗原。
182.权利要求175-180任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一抗原是HPV16抗原，第二抗原是HPV18抗原。
183.权利要求175-180任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中病毒载体编码一种、两种或三种HPV16抗原和一种、两种或三种HPV18抗原。
184.权利要求175-180任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中病毒载体编码两种HPV16抗原和两种HPV18抗原，其中抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
185.权利要求169-180任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
186.权利要求175或权利要求177的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一和第二抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段，
且其中第一和第二抗原不相同。
187.权利要求175-186任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一或第二抗原是在Rb结合位点具有突变的HPV蛋白E7。
188.权利要求187的三区段的沙粒病毒病毒载体187，其中第一或第二抗原是在Rb结合位点和锌指基序具有突变的HPV蛋白E7。
189.权利要求175-186任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一或第二抗原是在锌指基序具有突变的HPV蛋白E6。
190.权利要求175-186任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一和第二抗原彼此直接融合。
191.权利要求175-186任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一和第二抗原彼此通过肽接头融合。
192.权利要求175-186任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一和第二抗原通过自裂解肽或导致核糖体跳跃的肽序列彼此分隔。
193.权利要求192的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中自裂解肽是猪捷申病毒-1 2A肽、Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
194.权利要求175-186任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，进一步包含编码免疫调节性肽、多肽或蛋白的第三核苷酸序列。
195.权利要求194的三区段的沙粒病毒病毒载体194，其中免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
a.钙网蛋白(CRT)或其片段；
b.泛素或其片段；
c.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段；
d.恒定链(CD74)或其抗原性片段；
e.结核分枝杆菌热休克蛋白70或其抗原性片段；
f.单纯性疱疹病毒1蛋白VP22或其抗原性片段；
g.CD40配体或其抗原性片段；和
h.Fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体或其抗原性片段。
196.权利要求195的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白选自：
a.钙网蛋白(CRT)或其片段；
b.泛素或其片段；和
c.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段。
197.权利要求194-196任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第一抗原或通过肽接头融合至第一抗原。
198.权利要求194-196任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中免疫调节肽、多肽或蛋白直接融合至第二抗原或通过肽接头融合至第二抗原。
199.权利要求197或权利要求198的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO：18。
200.权利要求194-196任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
201.权利要求194-196任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第二抗原和免疫调节肽、多肽或蛋白通过自裂解肽彼此分隔。
202.权利要求200或权利要求201的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中自裂解肽是猪捷申病毒-1 2A肽，Thosea asign病毒2A肽或口蹄疫病毒2A肽。
203.权利要求169-202任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，进一步包含编码分泌信号的核苷酸序列。
204.权利要求203的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中分泌信号是人酪氨酸酶分泌信号、人生长激素分泌信号或组织纤溶酶原激活物信号序列。
205.权利要求191的三区段的沙粒病毒病毒载体191，其中得到的融合蛋白与SEQ IDNO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
206.权利要求191的三区段的沙粒病毒病毒载体191，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ ID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
207.权利要求191的三区段的沙粒病毒病毒载体191，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ ID NO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
208.权利要求191的三区段的沙粒病毒病毒载体191，其中得到的融合蛋白与氨基酸序列SEQ ID NO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
209.权利要求169-172任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中所述核酸序列编码HPV16E7/E6多肽，其与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
210.权利要求169-172任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中所述核酸序列编码HPV16E7/HPV18E6多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
211.权利要求169-172任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中所述核酸序列编码HPV18E7/HPV16E6多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
212.权利要求169-172任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中所述核酸序列编码HPV16E7/HPV18E6/HPV16E6/HPV18E7多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
213.权利要求169的三区段的沙粒病毒病毒载体169，其中两种S区段之一选自：
a.S区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
b.S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
c.S区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
d.S区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
e.S区段，其中编码L的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
f.S区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
214.权利要求171的三区段的沙粒病毒病毒载体171，其中两种L区段之一选自：
a.L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
b.L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
c.L区段，其中编码L蛋白的ORF处于沙粒病毒5’UTR的控制下；
d.L区段，其中编码GP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；
e.L区段，其中编码NP的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下；和
f.L区段，其中编码Z蛋白的ORF处于沙粒病毒3’UTR的控制下。
215.权利要求213或214的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒3’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的3’UTR，且其中沙粒病毒5’UTR是沙粒病毒S区段或沙粒病毒L区段的5’UTR。
216.权利要求169的三区段的沙粒病毒病毒载体169，其中两种S区段包含a.来自沙粒病毒之外的生物体的一种或两种异源ORF；或b.一种或两种复制的沙粒病毒ORF；或c.来自沙粒病毒之外的生物体的一种异源ORF和一种复制的沙粒病毒ORF。
217.权利要求171的三区段的沙粒病毒病毒载体171，其中两种L区段包含a.来自沙粒病毒之外的生物体的一种或两种异源ORF；或b.两种复制的沙粒病毒ORF；或c.来自沙粒病毒之外的生物体的一种异源ORF和一种复制的沙粒病毒ORF。
218.权利要求216或217的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中异源ORF编码源自感染性的生物体、肿瘤或过敏原的抗原。
219.权利要求218的三区段的沙粒病毒病毒载体218，其中编码抗原的异源ORF选自人乳头瘤病毒(HPV)，人免疫缺陷病毒抗原，丙型肝炎病毒抗原，水痘带状疱疹病毒抗原，巨细胞病毒抗原，结核杆菌抗原和肿瘤相关抗原。
220.权利要求216或217的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中至少一种异源ORF编码荧光蛋白。
221.权利要求220的三区段的沙粒病毒病毒载体220，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
222.权利要求169-219任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒病毒载体包含所有4种沙粒病毒ORF且其中三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的和能够复制的。
223.权利要求169-221任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒病毒载体缺少四种沙粒病毒ORF中的一种或多种，其中三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
224.权利要求169-221任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒病毒载体缺少四种沙粒病毒ORF中的一种，其中三区段的沙粒病毒病毒载体是感染性的但不能在非补足细胞中产生进一步感染性的后代。
225.权利要求223或224的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒缺少GP ORF。
226.包含一种L区段和两种S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一S区段被工程化以在沙粒病毒3’UTR控制下的位置携带编码GP的ORF并在沙粒病毒5’UTR控制下的位置携带编码第一人乳头瘤病毒(HPV)抗原的ORF，第二S区段被工程化以在沙粒病毒3’UTR控制下的位置携带编码NP的ORF并在沙粒病毒5’UTR控制下的位置携带编码第二HPV抗原的ORF。
227.包含一种L区段和两种S区段的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一S区段被工程化以在沙粒病毒5’UTR控制下的位置携带编码GP的ORF并在沙粒病毒3’UTR控制下的位置携带编码第一人乳头瘤病毒(HPV)抗原的ORF，第二S区段被工程化以在沙粒病毒5’UTR控制下的位置携带编码NP的ORF并在沙粒病毒3’UTR控制下的位置携带编码第二HPV抗原的ORF。
228.权利要求226或227的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一抗原是HPV16抗原，第二抗原是HPV18抗原。
229.权利要求226或227任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中病毒载体编码一种、两种或三种HPV16抗原和一种、两种或三种HPV18抗原。
230.权利要求226或227任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中病毒载体编码两种HPV16抗原和两种HPV18抗原，其中抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
231.权利要求228的三区段的沙粒病毒病毒载体228，其中第一和第二抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段，
且其中第一和第二抗原不相同。
232.权利要求226或227的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中第一抗原选自：
a.HPV16蛋白E6或其抗原性片段；
b.HPV16蛋白E7或其抗原性片段；
c.HPV18蛋白E6或其抗原性片段；和
d.HPV18蛋白E7或其抗原性片段。
233.权利要求226或227的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中HPV抗原是HPV16E7/E6多肽，其与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
234.权利要求226或227的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中HPV抗原是HPV16E7/HPV18E6多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：34的氨基酸17-263的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
235.权利要求226或227的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中HPV抗原是HPV18E7/HPV16E6多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：36的氨基酸17-270的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
236.权利要求226或227的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中HPV抗原是HPV16E7/HPV18E6/HPV16E6/HPV18E7多肽，其与氨基酸序列SEQ ID NO：38的氨基酸17-516的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。
237.权利要求169-236任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒病毒载体是减毒的。
238.权利要求169-237任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒病毒载体与双区段的沙粒病毒病毒载体具有相同趋向性。
239.权利要求169-221、223、224和226-238任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中三区段的沙粒病毒病毒载体是复制缺陷型的。
240.权利要求169-239任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体来源于LCMV或Junin病毒。
241.权利要求240的三区段的沙粒病毒病毒载体，其中沙粒病毒病毒载体来源于LCMV。
242.权利要求241的三区段的沙粒病毒病毒载体241，其中LCMV是MP株、Armstrong株或Armstrong克隆13株。
243.权利要求240的三区段的沙粒病毒病毒载体240，其中沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒。
244.权利要求243的三区段的沙粒病毒病毒载体243，其中Junin病毒是Junin病毒疫苗Candid#1或Junin病毒疫苗XJ克隆3株。
245.宿主细胞，包含权利要求169-244任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体。
246.产生权利要求169的三区段的沙粒病毒病毒载体169的方法，其中所述方法包括：
a.向宿主细胞中转染L区段和两种S区段的一种或多种cDNA；
b.在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
c.收获沙粒病毒病毒载体。
247.产生权利要求171的三区段的沙粒病毒病毒载体的方法171，其中所述方法包括：
a.向宿主细胞中转染两种L区段和一种S区段的一种或更多种cDNA；
b.在适于病毒形成的条件下维持宿主细胞；和
c.收获沙粒病毒病毒载体。
248.权利要求246的方法246，其中使用双向启动子进行一种L区段和两种S区段的转录。
249.权利要求247的方法247，其中使用双向启动子进行两种L区段和一种S区段的转录。
250.权利要求246或247的方法，其中该方法进一步包括向宿主细胞中转染一种或多种编码沙粒病毒聚合酶的核酸。
251.权利要求250的方法250，其中沙粒病毒聚合酶是L蛋白。
252.权利要求246、247、248或249的方法，其中该方法进一步包括向宿主细胞中转染一种或多种编码NP蛋白的核酸。
253.权利要求246的方法246，其中L区段和两种S区段的转录分别处于选自下述的启动子的控制下：
a.RNA聚合酶I启动子；
b.RNA聚合酶II启动子；和
c.T7启动子。
254.权利要求247的方法247，其中两种L区段和S区段的转录分别处于选自下述的启动子的控制下：
a.RNA聚合酶I启动子；
b.RNA聚合酶II启动子；和
c.T7启动子。
255.疫苗，包含权利要求169-244任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体。
256.药物组合物，包含权利要求169-244任一项的三区段的沙粒病毒病毒载体和药学上可接受的载体。
257.治疗或预防患者人乳头瘤病毒感染的方法，其中所述方法包括对患者施用权利要求140-159和169-244任一项的沙粒病毒病毒载体，权利要求167或255的疫苗或权利要求168或256的药物组合物。
258.权利要求257的方法257，其中该方法导致患者中已存在的HPV滴度的降低。
259.权利要求257的方法257，其中该方法诱导抗原特异性CD8+T细胞应答。
260.权利要求257的方法257，其中HPV感染是有症状的。
261.权利要求257的方法257，其中HPV感染是无症状的。
262.权利要求257的方法257，其中该方法降低HPV感染的严重程度或频率或预防HPV感染的临床表现。
263.权利要求262的方法262，其中临床表现选自：宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、HPV阳性口咽癌(OSCC)、普通疣、跖疣、甲下或月经疣、生殖器疣、尖锐湿疣或性病疣、呼吸道乳头状瘤病和疣状表皮发育不良。
264.治疗或预防患者人乳头瘤病毒感染的方法，其中所述方法包括对患者施用权利要求140-159和169-244任一项的第一沙粒病毒病毒载体，权利要求167或255的第一疫苗或权利要求168或256的第一药物组合物；和对患者施用权利要求140-159和169-244任一项的第二沙粒病毒病毒载体，权利要求167或255的第二疫苗或权利要求168或256的第二药物组合物。
265.权利要求264的方法264，其中第一沙粒病毒病毒载体、第一疫苗或第一药物组合物和第二沙粒病毒病毒载体、第二疫苗或第二药物组合物是同源的。
266.权利要求264的方法264，其中第一沙粒病毒病毒载体、第一疫苗或第一药物组合物和第二沙粒病毒病毒载体、第二疫苗或第二药物组合物是异源的。
267.权利要求264的方法264，其中第一沙粒病毒病毒载体、第一疫苗或第一药物组合物来源于LCMV，第二沙粒病毒病毒载体、第二疫苗或第二药物组合物来源于Junin病毒。
268.权利要求264的方法264，其中第一沙粒病毒病毒载体、第一疫苗或第一药物组合物来源于Junin病毒，第二沙粒病毒病毒载体、第二疫苗或第二药物组合物来源于LCMV。
269.诱导患者中免疫应答的方法，其中所述方法包括对患者施用权利要求140-159和169-244任一项的第一沙粒病毒病毒载体，并在一段时间后对患者施用权利要求140-159和169-244任一项的不同的第二沙粒病毒病毒载体。
270.权利要求269的方法269，其中第一沙粒病毒病毒载体来源于LCMV，第二沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒。
271.权利要求269的方法269，其中第一沙粒病毒病毒载体来源于Junin病毒，第二沙粒病毒病毒载体来源于LCMV。
272.权利要求269的方法269，其中第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体表达相同抗原。
273.权利要求269的方法269，其中第一沙粒病毒病毒载体和第二沙粒病毒病毒载体表达不同的抗原。
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