KR102195196B1 - 종양원성 바이러스성 폴리펩티드 양성 종양 치료용 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

종양원성 바이러스성 폴리펩티드 양성 종양 치료용 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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Abstract

본 문헌은 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도하는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 방법이 제공된다. 제공된 방법에서, 바이러스는 인간 유두종 바이러스일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 대상체에서 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 죽이는 방법이 제공된다. 그 방법은 대상체에 충분한 양의 조성물을 투여하여 제1 종양원성 바이러스성 펩티드에 대해 면역 반응을 개시하는 단계를 포함하는데, 여기서 조성물은 제약학상 허용되는 담체 및 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하며 면역 반응은 세포에서 세포독성 효과를 야기하는 데 효과적이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E6일 수 있으며 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E7일 수 있다.

Description

종양원성 바이러스성 폴리펩티드 양성 종양 치료용 폴리뉴클레오티드{POLYNUCLEOTIDES FOR TREATING ONCOGENIC VIRAL POLYPEPTIDE POSITIVE TUMORS}
<관련 문헌과의 상호 참조>
본 출원은 2012년 1월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/590,089호의 우선권을 주장하며, 전체가 본원에 참고문헌으로 인용된다.
<기술분야>
본원에 개시된 다양한 실시태양은 바이러스성 백신에 관한 것이다. 특히, 다양한 실시태양들은 종양 치료용 바이러스성 백신에 관한 것이다.
몇몇 바이러스, 예를 들면 유두종 바이러스(예를 들어, HPV16, HPV18), 레트로바이러스(예를 들어, HTLV, 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus)), 헤르페스 바이러스(예를 들어, 엡스테인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus)), 및 간염 바이러스(예를 들어, HBV)는, 인간 및 다른 동물들에게서 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 바이러스성 엔벨로프 단백질 또는 바이러스-유사 입자를 이용하는 백신들이 감염을 예방하는 데 종종 성공적지만, 확립된 질병 및 바이러스-관련 암을 치료하는 치료법이 요구된다.
몇몇 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 면역-감응성 숙주에서 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시할 수 있으며 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 제1 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 면역-감응성 숙주에서 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시할 수 있으며 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 제2 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바이러스는 인간 유두종 바이러스일 수 있다. 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E6일 수 있으며 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E7일 수 있다.
제1 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 L50에서의 점 돌연변이 또는 결실, E148에서의 점 돌연변이 또는 결실, T149에서의 점 돌연변이 또는 결실, Q150에서의 점 돌연변이 또는 결실, 또는 L151에서의 점 돌연변이 또는 결실과 같은 구체적인 돌연변이를 갖는 서열 2를 코딩할 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열은 서열 29를 코딩할 수 있다.
제2 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 H2에서의 점 돌연변이 또는 결실, C24에서의 점 돌연변이 또는 결실, E46에서의 점 돌연변이 또는 결실, 또는 L67에서의 점 돌연변이 또는 결실과 같은 구체적인 돌연변이를 갖는 서열 4를 코딩할 수 있다. 제2 뉴클레오티드 서열은 서열 30을 코딩할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 조성물이 제공된다. 조성물은 제약학상 허용되는 담체 및 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 면역-감응성 숙주에서 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시할 수 있으며 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 제1 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 면역-감응성 숙주에서 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시할 수 있으며 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 제2 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제공된 조성물의 바이러스는 인간 유두종 바이러스일 수 있다. 제공된 조성물에서, 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E6일 수 있으며 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E7일 수 있다.
제공된 조성물의 제1 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 L50에서의 점 돌연변이 또는 결실, E148에서의 점 돌연변이 또는 결실, T149에서의 점 돌연변이 또는 결실, Q150에서의 점 돌연변이 또는 결실, 또는 L151에서의 점 돌연변이 또는 결실과 같은 구체적인 돌연변이를 갖는 서열 2를 코딩할 수 있다. 제공된 조성물의 제1 뉴클레오티드 서열은 서열 29를 코딩할 수 있다.
제공된 조성물의 제2 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 H2에서의 점 돌연변이 또는 결실, C24에서의 점 돌연변이 또는 결실, E46에서의 점 돌연변이 또는 결실, 또는 L67에서의 점 돌연변이 또는 결실과 같은 구체적인 돌연변이를 갖는 서열 4를 코딩할 수 있다. 제공된 조성물의 제2 뉴클레오티드 서열은 서열 30을 코딩할 수 있다.
제공된 조성물의 몇몇 실시태양에서, 제공된 조성물의 제약학상 허용되는 담체는 아데노바이러스 엔벨로프일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 대상체에서 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 죽이는 방법이 제공된다. 그 방법은 대상체에 충분한 양의 조성물을 투여하여 제1 종양원성 바이러스성 펩티드에 대해 면역 반응을 개시하는 단계를 포함하는데, 여기서 조성물은 제약학상 허용되는 담체 및 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하며 면역 반응은 세포에서 세포독성 효과를 야기하는 데 효과적이다. 폴리뉴클레오티드는 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 면역-감응성 숙주에서 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시할 수 있으며 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 제1 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 면역-감응성 숙주에서 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시할 수 있으며 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 제2 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제공된 방법에서, 바이러스는 인간 유두종 바이러스일 수 있다. 제공된 방법에서, 제1 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E6일 수 있으며 제2 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 E7일 수 있다.
제공된 방법에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 L50에서의 점 돌연변이 또는 결실, E148에서의 점 돌연변이 또는 결실, T149에서의 점 돌연변이 또는 결실, Q150에서의 점 돌연변이 또는 결실, 또는 L151에서의 점 돌연변이 또는 결실과 같은 구체적인 돌연변이를 갖는 서열 2를 코딩할 수 있다. 제공된 방법에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 서열 29를 코딩할 수 있다.
제공된 방법에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 H2에서의 점 돌연변이 또는 결실, C24에서의 점 돌연변이 또는 결실, E46에서의 점 돌연변이 또는 결실, 또는 L67에서의 점 돌연변이 또는 결실과 같은 구체적인 돌연변이를 갖는 서열 4를 코딩할 수 있다. 제공된 방법에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 서열 30을 코딩할 수 있다.
제공된 방법의 몇몇 실시태양에서, 제약학상 허용되는 담체는 아데노바이러스 엔벨로프일 수 있다.
제공된 방법의 몇몇 실시태양에서, 세포는 신생물(neoplasia)의 일부일 수 있다. 제공된 방법의 몇몇 실시태양에서, 세포는 악성 신생물의 일부일 수 있다.
다수의 실시태양이 개시되었는데, 이와 다른 실시태양도 본 발명의 예시적 실시태양을 나타내고 기술한 이하의 발명의 상세한 설명으로부터 역시 도출됨이 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 따라서, 도면 및 발명의 상세한 설명은 사실상 예시적인 것인 것이고 제한적인 것은 아닌 것으로 여겨져야 한다.
도 1은 HPV16 E6 및 E7에서의 돌연변이를 보여주는 개략도이다.
도 2는 (A) 종양 억제 단백질 발현, (B) HPV16 E6/E7 발현, 및 (C) 대조군 레트로바이러스, 야생형 E6/E7을 코딩하는 레트로바이러스, 및 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 레트로바이러스로 감염된 세포에서의 상대적인 텔로머라제 활성(RTA)을 보여준다.
도 3은 (A) 대조군 레트로바이러스, (B) 야생형 E6/E7을 코딩하는 레트로바이러스, 및 (C) 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 레트로바이러스로 감염된 세포의 성장 특성을 보여준다.
도 4는 대조군 레트로바이러스 (LXSN), 야생형 E6/E7을 코딩하는 레트로바이러스, 및 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 레트로바이러스로 감염된 세포의 (A) 성장 속도 및 (B) p53 발현을 보여준다.
도 5는 대조군 아데노바이러스, 야생형 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스, 및 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스로 감연된 세포의 성장 속도를 보여준다.
도 6은 지시된 항원에 노출된 완충액 대조군, 대조군 아데노바이러스(벡터 대조군), 또는 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스로 면역화한 마우스로부터의 비장세포의 인터페론 감마 반응을 보여준다.
도 7은 지시된 항원에 노출된 완충액 대조군, 대조군 아데노바이러스(벡터 대조군), 또는 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스로 면역화한 마우스로부터의 비장세포의 IL-2 반응을 보여준다.
도 8은 대조군 아데노바이러스(벡터 대조군), 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스 또는 야생형 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스로 접종한 마우스의 HPV+ 종양 성장을 보여준다. 각각의 선은 개별 마우스의 종양 성장을 지시한다.
도 9는 HPV+ 암 세포를 주입하고 대조군 아데노바이러스(Ad5 [E1-,E2b-]-null), 또는 돌연변이체 E6/E7을 코딩하는 아데노바이러스(Ad5 [E1-, E2b-]-E6Δ/E7Δ)로 접종한 마우스의 생존률을 보여준다.
본원에 개시된 다양한 실시태양은 면역-감응성 숙주에서 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 개시하나 면역-감응성 숙주에서는 비-종양원성인 항원성 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 본원에 제공된 바는 이러한 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 및 이들을 이용하는 방법이다.
본원에 이용된, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는, 숙주 세포에서 발현되었을 때, 세포를 형질변환시키는 바이러스성 게놈에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다. 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는, 제한 없이, HPV(인간 유두종 바이러스)16 E6, HPV16 E7, HPV18 E6, HPV18 E7, HBV(B형 간염 바이러스) HBXAg, HCV(C형 간염 바이러스) 코어(core) 단백질, HCV NS5A, HTLV(인간 T-세포 림프친화성 바이러스) TAX, EBV(엡스테인-바르 바이러스) EBNA, 및 EBV LMP-1을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드(예를 들어, HPV E6)는 숙주 세포를 단독으로 형질변환시키기에 충분하다. 또다른 실시태양에서, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 오직 하나 이상의 추가적인 특이적 보조인자(예를 들어, 다른 바이러스성 종양유전자, 숙주 세포 유전자 돌연변이)의 존재 하에서만 숙주 세포를 형질변환시킨다. 예를 들어, HPV E6은 ErbB2에서 돌연변이를 갖는 세포를 불멸화시킬 수 있는데, 이는 몇몇 세포에서 침습적 성장을 유도할 수 있다.
본원에 이용된, 항원성 폴리펩티드는 면역-감응성 숙주에 존재할 때 면역 반응을 이끌어내는 폴리펩티드이다. 본원에 이용된, 면역-감응성 숙주는 세포독성(예를 들어, 세포독성 T-세포-매개 세포독성 또는 항체-매개 세포독성)을 초래하는 면역 반응을 생성할 수 있는 동물이다.
본원에 제공된 항원성 폴리펩티드는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드로부터 유래되었으며 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드와 비교했을 때 이들은 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 또는 첨가)를 포함한다. 본원에 제공된 항원성 폴리펩티드는 이로부터 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드가 숙주 세포를 형질변환시키는 것과 같은 조건 하에서 폴리펩티드가 비-종양원성이 되도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 비-종양원성이 되도록 하는 돌연변이는, 종양원성 기능을 불활성화하는 것, 예를 들면 종양 억제 단백질에의 결합을 파괴하고, 활성 도메인을 파괴하는 및 DNA에의 결합을 파괴하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, HPV16 E6로부터 유래된 항원성 폴리펩티드는 p53 결합 부위, 텔로머라제 활성화 부위, PDZ 결합 도메인, 또는 이들의 조합을 파괴하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 또다른 실시예에서, HPV16 E7로부터 유래된 항원성 폴리펩티드는 Rb 단백질 결합 부위, Mi2β결합 부위, 또는 이들의 조합을 파괴하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 항원성 폴리펩티드는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 70 % 이상의 서열 동일성(예를 들어, 72 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상, 99.5 % 이상, 또는 99.7 % 이상의 서열 동일성, 또는 70 % 내지 99 %, 75 % 내지 99 %, 80 % 내지 99 %, 또는 88 % 내지 99.9 %의 서열 동일성)을 가지며 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대해 세포독성 면역 반응을 이끌어낸다. 몇몇 실시태양에서, 항원성 폴리펩티드 및 이것이 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드는 약 95.9 % 동일, 약 96.7 % 동일, 약 96.9 % 동일, 약 97.2 % 동일, 약 97.9 % 동일, 약 98.6 % 동일, 약 99 % 동일, 또는 약 99.3 % 동일하다. 항원성 폴리펩티드의 예는 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 및 서열 31을 포함한다.
"서열 동일성 백분율"은 예를 들어 서열 2 또는 서열 4와 같은 임의로 주어진 종양원성 바이러스성 폴리펩티드 서열과 이들로부터 유래된 항원성 폴리펩티드 서열 간의 서열 동일성 정도를 지칭한다. 통상 항원성 폴리펩티드는 이것이 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 총 길이의 70 % 내지 130 %의 길이로, 예를 들어, 이것이 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드 총 길이의 71 %, 74 %, 75 %, 77 %, 80 %, 82 %, 85 %, 87 %, 89 %, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 또는 130 %를 가진다. 항원성 폴리펩티드가 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 상대적인 임의의 항원성 폴리펩티드의 동일성 백분율은 다음과 같이 정해질 수 있다. 종양원성 바이러스성 폴리펩티드(예를 들어, 서열 2 또는 서열 4)는, 클러스탈W(ClustalW)(1.83 버전, 디폴트 파라미터(default parameters))라는 상품명으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 하나 이상의 후보 서열로 정렬되는데, 이는 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 정렬이 이들의 전체 길이를 가로질러 수행되도록(글로벌 정렬(global alignment)) 한다. 문헌[Chema 등, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500(2003)].
클러스탈W는 기준 (예를 들어, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드) 및 하나 이상의 후보 서열(예를 들어, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드로부터 유래된 항원성 폴리펩티드) 간 최고의 일치를 계산해주고, 이들을 정렬시켜 동일성, 유사성 및 차이가 정해질 수 있도록 한다. 하나 이상의 잔기의 간격들이 기준 서열, 후보 서열, 또는 둘 다로 삽입되어 서열 정렬을 최대화할 수 있다. 핵산 서열의 빠른 쌍별(pairwise) 정렬을 위해, 이하의 디폴트 파라미터가 사용된다: 워드 크기(word size): 2; 윈도우 크기(window size): 4; 스코어링 방법(scoring method): 백분율; 상부 대각선의 수: 4; 및 간격 페널티: 5. 핵산 서열 다수의 정렬을 위해, 이하의 파라미터가 사용된다:간격 개구 페널티: 10; 간격 연장 페널티: 5.0; 및 중량 전환: 있음. 단백질 서열의 빠른 쌍별 정렬을 위해, 이하의 파라미터: 워드 크기 : 1; 윈도우 크기 : 5; 스코어링 방법 : 백분율; 상부 대각선의 수: 5; 간격 페널티: 3이 사용된다. 단백질 서열 다수의 서열 정렬을 위해, 이하의 파라미터가 사용된다: 중량 매트릭스: 블로섬(blosum); 간격 개구 페널티: 10.0; 간격 연장 페널티: 0.05; 친수성 간격: 있음; 친수성 잔기: 글리신, 프롤린, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 아르기닌 및 리신; 잔기-특이적 간격 페널티: 있음. 클러스탈W 출력물은 서열 간 관계를 반영하는 서열 정렬이다. 클러스탈W는, 예를 들어, 월드 와이드 웹(World Wide Web) 상의 유러피안 바이오인포메틱스 인스티튜트 사이트(European Bioinformatics Institute site)(ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)에서 작동시킬 수 있거나, 또는 예를 들어 월드 와이드 웹 상의 클러스탈.org(clustal.org) 사이트(clustal.org/clustal2/)로부터 다운로드 받아 작동시킬 수 있다.
항원성 폴리펩티드의 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대한 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열이 클러스탈W를 이용하여 정렬되며, 정렬에서 동일하게 일치된 것들의 수를 기준 서열의 길이로 나누며, 그 결과를 100으로 곱한다. 동일성 백분율 값은 소수점 첫째 자리로 반올림될 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 각각 78.1로 버림되는 반면, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 올림된다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열 34)는 본원에 제공된 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 나선 또는 단일 나선, 직선형 또는 고리형 DNA 또는 RNA를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 각각 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 초과의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 콘카타머(concatamer)를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 이들에 포함된 항원성 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열(들)로부터 단백질 발현을 촉진하는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열 하나 이상을 또한 포함한다. 이러한 서열은 프로모터, 인핸서, RNA 안정화 서열, 내부 리보솜 결합 부위(IRES), 및 단백질 안정화 서열을 제한하지 않으면서 포함한다. 제공된 폴리뉴클레오티드에서 이용되기에 적절한 프로모터는, SV40 초기 프로모터, CMV 즉각 초기 프로모터, 레트로바이러스성 긴 말단반복순서(LTR), 조절가능한 프로모터(예를 들어, 테트라사이클린 또는 IPTG 반응성 프로모터), 및 RSV 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
항원성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 복수개가 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드에 포함되어 있을 때, 이로부터 발현된 폴리펩티드는 예를 들면 분리 프로모터를 통하거나, IRES의 이용을 통하여 별도의 단백질로서 발현될 수 있거나 또는 융합된 단백질로서 발현될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드는, 발현되었을 때 태그가 항원성 폴리펩티드에 부착되도록 항원성 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 단백질 태그(예를 들어, myc 태그 또는 FLAG 태그)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 이용된, 단백질 태그는 이것이 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대한 서열 동일성 백분율을 결정할 목적으로 항원성 폴리펩티드 서열에 포함된 것은 아니다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 검출을 용이하게 하는 마커 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 마커 서열은 마커 단백질, 예를 들면 형광 마커(예를 들어, GFP, RFP, 또는 YFP)를 코딩하여 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 검출을 용이하게 할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 마커 서열은 단백질을 코딩하지는 않지만, 핵산 검출 기술, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 검출될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 마커 서열은 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 종양원성 활성에 기여하여 항원성 폴리펩티드를 생성하는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 영역을 파괴하는 데 이용될 수 있다. 이러한 경우에, 마커 서열은 이것이 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대한 서열 동일성 백분율의 결정 목적으로 항원성 폴리펩티드 서열에 포함된 것은 아니며, 나머지 서열들은 이것이 유래된 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대해 100 % 서열 동일성을 유지할 수 있다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 공지된 방법, 예를 들면 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를-코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열 1, 서열 3, 및 서열 5)의 위치 지정 돌연변이 유발을 이용하여 생성될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오티드는 제약학상 허용되는 담체로 혼입될 수 있다. 적합한 제약학상 허용되는 담체는, 바이러스성 엔벨로프, 양이온성 지질 담체, 자가 세포, 플라스미드 벡터, 및 바이러스성 벡터를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드가 바이러스성 엔벨로프로 혼입될 때, 이는 엔벨로프로의 혼입을 지지하는 하나 이상의 패키징 서열(packaging sequences)을 포함할 수 있다.
특정한 설정에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 면역-감응성 숙주로의 도입(예를 들어, 경장으로, 경피로, 정맥내로, 피하로, 또는 근육내로)을 위해 제제화된다. 이용할 때, 조성물은 그의 게놈이 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 코딩하는 바이러스에 의한 감염의 위험 하에서 면역-감응성 숙주로 투여된다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포를 갖거나), 또는 이러한 바이러스로 이미 감염된 면역-감응성 숙주로 투여된다.
면역-감응성 숙주로 투여될 때, 하나의 실시태양에 따르면, 본원에 제공된 조성물은 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 세포독성 면역 반응을 이끌어낸다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물의 투여는 대상체의 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 발현과 관련된 암을 치료, 호전, 및/또는 예방하는 데 이용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물의 투여는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포의 군집을 감소시키는 결과를 초래할 수 있다. 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포의 군집 감소는 임의의 적절한 수단, 예를 들면 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 포함하는 종양의 크기 변화 측정, 또는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 암 세포를 순환시키는 횟수의 변화 측정을 이용해 측정될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 발현과 관련된 암이 있는 대상체의 군집에 본원에 제공된 조성물을 투여하는 것은 이와 유사하게 치료된 바 있으나 본원에 제공된 조성물의 투여는 하지 않았던 대조군 군집과 비교하여 더 긴 평균 생존률을 가져올 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물은 종양원성 바이러스성 폴리펩티드의 발현과 관련된 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 하나 이상의 표준 치료(예를 들어, 방사선, 수술, 또는 화학요법)와의 병용법으로 이용될 수 있다. 표준 치료와의 병용법으로 이용되는 경우, 본원에 제공된 조성물은 표준 치료의 적용 이전, 도중, 또는 이후에 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물 및/또는 표준 치료의 적용 시기는 조성물 또는 표준 치료 중의 하나 혹은 둘 다의 효능을 증가시키기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 조성물은 초기 용량으로 투여된 후 시간이 지남에 따라 추가적인 부스터(booster) 용량으로 바뀌어 면역 반응을 증가시키도록 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 본원에 제공된 조성물은 화학요법 전 또는 화학요법으로부터의 면역 회복 후 투여되어 충분한 면역 반응의 가능성을 증가시킬 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 세포독성 면역 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 용량은 면역 반응을 이끌어내기 위해 조절될 수 있지만, 조성물 내 담체에 대해 전신 유해 반응을 유도할 정도는 아니다. 예를 들어, 아데노바이러스성 담체를 이용할 때, 적합한 용량은 용량 당 약 108 내지 1012 입자의 범위일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 용량의 양 및/또는 용량의 횟수는 코딩된 항원성 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 데 이용되는 서열 유형, 대상체에서 면역 반응의 강도, 또는 이용되는 제약학상 허용되는 담체 유형에 의존하여 조절될 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 예비혼합된 제제 또는 이용되기 전에 혼합될 수 있는 별도의 성분으로 포장될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물은 개별적인 용량으로 포장될 수 있다. 다른 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물은 투여 전에 측정되는 여러번의 용량을 포함하는 용기에 포장될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 조성물은 투여 전에 희석되는 농축물로서 제제화될 수 있다. 또 다른 실시태양에서는, 본원에 제공된 조성물은 투여 전에 별도의 성분들을 혼합하여 생성될 수 있다. 포장은 적합한 문서, 표지 등을 더 포함할 수 있다.
이하의 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아닌 의도로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1. HPV16 E6/E7 및 바이러스 구조의 돌연변이 유발
HPV16 E6/E7 돌연변이 유발. HPV16 E6 및 E7에서 6 개의 돌연변이를 시험관내 위치 지정 돌연변이 유발을 이용하여 도 1에 나타난 바와 같이 핵산을 코딩하는 야생형 E6/E7로 도입시켰다. L50G 지정 돌연변이로서, p53 결합 및 텔로머라제 활성화 부위 도메인 내 E6의 위치 50에 류신을 글리신으로 바꾸는 돌연변이를 일으켰다. PDZ 지정 돌연변이로서, 잔기 146-151에서 E6의 C-말단 PDZ 결합 도메인을 4 개의 알라닌 잔기들로 치환하였다. H2P 지정 돌연변이로서, 히스티딘 잔기를 위치 2의 E7의 Rb 결합 부위 내에서 프롤린 잔기로 치환하였다. C24G 지정 돌연변이로서, 시스테인 잔기를 위치 24의 E7의 Rb 결합 부위 내에서 글리신 잔기로 치환하였다. E46A 지정 돌연변이로서, 글루탐산 잔기를 위치 46의 E7의 Rb 결합 부위 내에서 알라닌으로 치환하였다. L67R 지정 돌연변이로서, 위치 67의 E7의 Mi2β결합 영역 내에 류신을 아르기닌으로 바꾸는 돌연변이를 일으켰다. 표 1에 나열된 프라이머를 이용해 제조업체의 지시에 따라 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) #200521) HPV16 E6 및 E7을 코딩하는 핵산(서열 5)에서 위치 지정 돌연변이 유발을 수행하였다.
Figure 112014079860728-pct00001
돌연변이된 구축물을 아데노바이러스성 셔틀 벡터 Ad5 VQ로 클로닝하였다. 최종 구축물의 피델리티(Fidelity)를 직접 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
바이러스성 구조. E1 및 E2b가 결핍된 Ad5 CMV 벡터([E1-,E2b-]로 지시된 공벡터(empty vector))를 포함하는 돌연변이체 E6/E7([E1-, E2b-]mut-E6/E7로 지시됨)및 야생형 E6/E7 ([E1-, E2b-]wt-E6/E7로 지시됨)을 이전에 기술된 바에 따라 구축화하고 생성하였다(문헌 [Amalfitano 등. (1998) J. Virol . 72(2):926-33]). 간단히, 야생형 및 돌연변이체 E6/E7 서열을 동종 재조합-기반 접근법을 이용하여 Ad5 [E1-, E2b-]벡터의 E1 영역으로 서브클로닝시켰다. 복제 결핍성 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 증식시켰고, CsCl2로 정제하였고, 적정하였다. 바이러스 감염성 역가를 E.C7 세포 단일층에서의 플라크 형성 단위(PFU)로서 결정하였다. 바이러스성 입자(VP) 농도를 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 붕괴 및 260 nm 및 280 nm에서의 분광 광도 측정법에 의해 결정하였다. VP 대 플라크 형성 단위(PFU)의 비는 36.7/1 VP/PFU였다. mut-E6/E7 삽입물뿐 아니라 wt-E6/E7을 그리고 나서 절단하였고 EcoRI 및 BamHI 제한 부위를 이용하여 레트로바이러스성 벡터 pLXSN로 라이게이션시켰다. 레트로바이러스 입자를 추천된 방법(놀란 연구소, 스탠포드 대학교, 캘리포니아(Nolan Lab, Stanford University, California))에 따라 폴리브렌(시그마 H9268(Sigma H9268))을 8 μg/ml의 최종 농도로 첨가하여 피닉스 A 세포주(Phoenix A cell line)에서 발생시켰다.
실시예 2. 종양형성에서 E6/E7 돌연변이의 효과
인간 선암종 폐포 기저 상피 세포주에서의 종양형성. 돌연변이된 E6/E7이 종양형성을 촉진시키는지 여부를 결정하기 위해, A549 세포(인간 선암종 폐포 기저 상피 세포주)를 wt-E6/E7(서열 6), mut-E6/E7(서열31), 또는 대조군 벡터를 포함하는 레트로바이러스로 감염시켰고 고리 클로닝(ring cloned)시켰다. 클론을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. PTPN13, pRb, 및 p53 단백질 발현 레벨이 mut-E6/E7을 발현하는 세포에 있어서는 대조군과 유사하지만, wt-E6/E7의 발현이 PTPN13, pRb, 및 p53 단백질 발현을 감소시킨다는 점을 도 2A가 보여준다. 클론의 PCR 분석은 mut-E6/E7이 wt-E6/E7와 유사한 레벨로 발현되었다는 점을 확인시켜주는데(도 2B) 이는 웨스턴 블롯에 의한 분명한 변화들이 발현 레벨보다는 E6/E7 기능이 변경된 결과라는 점을 시사하며 mut-E6/E7 구축물에서의 종양원성 기능 상실을 확인시켜 주었다. 텔로머라제 활성 또한 이러한 클론에서 관찰할 수 있었다. mut-E6/E7 및 대조군 벡터는 wt-E6/E7에 비교하여 상당히 낮은 상대적 텔로머라제 활성(RTA)을 보여주었다(도 2C). wt-E6/E7는 형태학상 간엽 유형 변화를 유발하기 때문에, 클론의 형태학상 특성이 또한 관찰되었다. 도 3은, wt-E6/E7 발현이 형태학상 간엽 유사 변화를 유도하고 및 세포가 비- 부착성 방식으로 성장하는 반면, 대조군 및 mut-E6/E7는 조밀한 콜로니로 성장함을 보여준다. 이러한 데이터들은 함께, mut-E6/E7의 안정적인 발현이 wt-E6/E7의 발현과는 달리 세포성 형질변환과 관련된 생화학적 또는 형태학적 변화를 유도하지 않는다는 점을 시사한다.
일차 인간 상피 세포에서의 형질변환. mut-E6/E7이 세포를 형질변환시키지 않는다는 점을 더 보여주기 위해, 일차 인간 편도 상피세포(HTE)를 wt-E6/E7, mut-E6/E7, 또는 공벡터(LXSN)를 포함하는 레트로바이러스로 감염시켰다. 감염되지 않은 HTE 세포들은(HTE052) 추가적인 대조군으로 사용되었다. wt-E6/E7의 발현은 세포성 불멸화를 초래하였다. 그러나, mut-E6/E7을 발현하는 HTE 뿐 아니라 대조군도, 불멸화되지 않았다(도 4A). 이러한 결과는 mut-E6/E7의 안정적인 발현이, 심지어 통합 레트로바이러스로부터 발현되는 경우에도, 세포성 불멸화를 초래하지는 않는다는 것을 입증한다.
일차 인간 편도선 각질세포의 비-복제형 아데노바이러스성 바이러스 벡터 감염에서 wt-E6/E7 또는 mut-E6/E7이 형질변환을 초래할 수 있을 것인지 여부를 결정하기 위해, HTE를 GFP를 발현하는 [E1-, E2b-], [E1-, E2b-]mut-E6/E7, 또는 [E1-, E2b-]wt-E6/E7으로 감염시켰다. Wt-E6/E7은 p53의 손실을 유도할 수 있었으나(도 4B) wt-E6/E7 또는 mut-E6/E7 중 어느 것도 감염 이후 일차 편도 상피세포를 불멸화시킬 수 없었다(도 5). 이것이 복제에서의 바이러스성 손실 때문인지 여부를 결정하기 위해 우리는 세포 성장과 함께 바이러스성 DNA의 지속을 관찰하였다. Q-PCR을 수행하였고, 세포가 복제됨에 따라 바이러스성 DNA가 모든 삽입물에서 유사한 속도로 손실된다는 것을 입증하였는데, 이는 바이러스성 유전자가 숙주 세포 DNA로 통합되지는 않았다는 점을 시사한다. 그러므로 [E1-, E2b-] 아데노바이러스성 벡터 내 HPV 유전자는 분열을 지속하지 않으며 복제-결핍 아데노바이러스성 벡터로부터의 wt-E6/E7의 일시적인 발현은 일차 세포를 형질변환시키기에 충분하지 않다.
세포 배양. A549 세포를 10 % 소태아 혈청(써모 피셔(Thermo Fisher) #SH3007103)으로 보충된 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Media)(써모 피셔 #SH30022.01)에서 성장시켰다. 일차 인간 편도 상피세포(HTE)를 IRB 기관에 승인 하에 동의한 환자에 대해 공지된 기술(문헌[Williams 등. (2009) Head Neck . 31 (7):911-8])을 이용해 외과적인 편도선 절제술을 시행하여 분리하였다. 일차 HTE를 각질세포 SFM 배지(KSFM, 인비트로젠(Invitrogen) #17005-042)에서 유지시켰다.
레트로바이러스성 감염. HTE 및 A549 세포를 wt-E6/E7, mut-E6/E7 또는 공벡터 레트로바이러스를 포함하는 레트로바이러스성 상층액으로 감염시킨 후 5 % CO2와 함께 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 감염 24 시간 후 흡인하였고 선택을 위해 네오마이신(RPI #G64000)으로 보충된 신선한 배지로 교체하였다. 개별적인 콜로니들은 고리 클로닝되었고 800 ug/ml 네오마이신을 선택에 따라 넣어 주었다. 데이터는 레트로바이러스로 감염된 클론을 이용하는 것은 시험된 다수의 클론들을 대표한다는 것을 나타낸다. 세포 성장에 있어서 이들의 밀도 의존성 때문에, HTE 세포주가 항생제 선택 하에 놓여지지는 않았으나 이를 세포 사멸 또는 불멸화될 때까지 KSFM에서 유지시켰다.
LXSN, LXSN wt-E6/E7, 또는 LXSN mut-E6/E7을 발현하는 안정적인 세포주에서 mRNA를 분석하여 mut-E6/E7에서의 변화가 E6/E7 전사 속도에 영향을 주지 않는다는 것을 입증하기 위해 표준 PCR을 수행하였다. PCR을 E6/E7 정방향 프라이머 5'-CAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTA-3'(서열 19) 및 E6/E7 역방향 프라이머 5'-GCTTTTTGTCCAGATGTCTTTGC-3'(서열 20)을 이용하여 수행하였고 GAPDH 정방향 프라이머 5'-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'(서열 21) 및 GAPDH 역방향 프라이머 5'-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(서열 22)를 이용하여 발현 레벨을 GAPDH 레벨로 정상화하였다. 모든 프라이머 농도는 450 nM였다. 예비인큐베이션을 10 분 동안 94 ℃에서 수행하였다. 순환 조건은 총 30 순환 동안 40 초 동안 94 ℃, 40 초 동안 55 ℃, 및 1 분 동안 72 ℃였다.
아데노바이러스성 감염. 80 % 조밀도(confluency)까지 성장시킨 일차 인간 편도 상피세포를 100 MOI에서 [E1-, E2b-]null, [E1-, E2b-]wt-E6/E7, [E1-, E2b-]mut-E6/E7 또는 Ad GFP로 24 시간 동안 감염시켰다. 감염-후 DNA를 계대(passage) 4, 5, 및 6에서 수집하였다. 세포를 트립신처리(trypsinized)하고, 헹구고 1X 인산염 완충염수에서 재현탁시켰다. DNeasy DNA 블러드 앤드 티슈 키트(DNeasy DNA Blood and Tissue Kit)(쿠아겐(Qiagen) #69504)로부터 표준 동물 조직 스핀-컬럼(spin-column) 프로토콜을 이용하여 DNA 추출을 수행하였다.
Q-PCR. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 HPV16 프라이머 세트 520 5'-TTGCAGATCATCAAGAACACGTAGA-3'(서열 32) 및 671 5'-CTTGTCCAGCTGGACCATCTATTT-3'(서열 33)을 이용하여 수행해 HPV16 복제수를 분석하였다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 18S 프라이머 세트를 대조군으로 이용하였다. 증폭 반응은 25 ng 주형 및 각 프라이머의 250 nM(HPV16 프라이머 세트) 또는 100 nM(18S 프라이머 세트), 사이버그린 유니버셜 마스터 믹스(SyberGreen Universal Master Mix)(어플라이드 바이오시스템즈)를 포함하였다. 순환 조건은 스트라타진 Mx3000P 서모사이클러(Stratagene Mx3000P thermocycler)를 이용하여 60 초 동안 60 ℃ 및, 15 초 동안 95 ℃에서의 40 순환을 하는 10 분 동안 95 ℃에서였다.
웨스턴 블롯 분석. 안정적인 세포주 A549 wt-E6/E7, A549 mut-E6/E7 및 모세포 A549를 80-90 % 조밀도로 성장시키고, PBS로 헹구고 세포용해 용액(lysis solution)으로 수확하였다(50mM Tris HCl pH 7.5; 150mM NaCl; 5mM EDTA; 2mM Na3VO4; 100mM NaF; 10mM NaPPi; 10% 글리세롤; 1% 트리톤(Triton); 1X Halt 프로테아제 억제제; 17.4 ㎍/㎕ PMSF). 원심분리(4 ℃에서 10,000 rpm)로 막을 펠렛화하였고 용해가능한 단백질을 수집하였다. 총 단백질을 제조자의 지시(피어스(Pierce))에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 이용하여 정량화하였고 동일 총 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 간단히, 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF-막(임모빌론(Immobilon)-P)으로 옮기고, 5 % 소 혈청 알부민(MP 바이오메디칼즈(Biomedicals)) 또는 무지방 분유로 블록(block)시켰고 필름에서의 화학발광(chemiluminescence)에 의하거나 또는 UVP 바이오이미징(bioimaging) 시스템(업랜드(Upland), CA)을 통해 가시화하였다. 막을 이하의 항체들과 인큐베이션하였다: FAP-1(1:500, 산타 크루즈(Santa Cruz) sc15356), p53(1:500, 칼바이오켐(Calbiochem) OP43), pRb(1:250, BD 바이오사이언시즈(Biosciences) 554136) 및 GAPDH(1:5000, 앰비온(Ambion) #Am4300).
실시예 3. HPV 특이적 세포 매개 면역 반응
돌연변이체 E6/E7에 대한 세포 매개 면역성. E6/E7 내 돌연변이로서 이들을 비-종양원성이 되도록 하는 돌연변이들이, 시험관 내 실험에서 [E1-, E2b-] 아데노바이러스성 벡터에 대한 HPV-특이적 면역 반응을 증가시킬 가능성을 변화시키는지 여부를 결정하기 위해, 비장을 대조군 및 면역화된 마우스로부터 수확하였고, 비장세포가 E6/E7로 불멸화된 세포로부터의 용해물(lysate) 또는 E6/E7에 의해 자극될 때 IFN-γ및 IL-2를 분비할 가능성을 관찰하였다. 효소-연결 면역점(ELISpot) 분석을 이용하여 개별적인 마우스의 군으로부터 수확한 비장세포에서 IFN-γ및 IL-2를 분비하는 세포 수를 평가함에 의해, 면역화 및 비-면역화한 마우스의 대조군에서 세포 매개 면역(CMI) 반응을 결정하였다. 도 6 및 도 7에서 나타나는 바와 같이, CMI 반응을 Ad5 [E1-, E2b-]mut-E6/E7로 면역화한 마우스에서 검출하였다. 이는 면역화한 마우스에서는 IFN-γ(도 6) 및 IL-2(도 7) 점 형성 세포(SFC)가 상당히 증가한 레벨로 유도되었으나 Ad5 [E1-, E2b-]null 또는 완충액이 주사된 대조군 마우스에서는 유도되지 않았다는 점에 의해 입증되었다. IL-2 SFC 반응이 IFN-γ에서 관찰된 바보다 상당히 낮았음에도 불구하고, 이들은 대조군 값보다는 상당히 증가한 것이었다. CMI 반응의 특이성에 대해서는, 모든 군의 비장 세포가 이와 무관한 항원 HIV-gag 또는 CMV에 노출된 때 반응성이 부족하였음에 의해 입증하였다. 모든 군의 마우스에서 기능적으로 활성인 비장 세포의 존재는 콘카나발린 A(concanavalin)(Con A)에 대한 양성 반응에 의해 확인하였다. 이러한 결과들은 비-종양원성 mut-E6/E7이 면역원성이며 아데노바이러스성 벡터로부터 발현시 wt-E6/E7에 의해 유도된 레벨 정도 혹은 그 이상으로 HPV 특이적 E6/E7 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다.
동물 면역화. 모든 동물 실험을 동물 실험 관련 기관의 승인 하에 수행하였다. 8 내지 10 주 된 수컷 C57B1/6 마우스에 완충액(N=4), 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-] null, 또는 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-] mut-E6/E7을 7 일 간격으로 3 회 피하 주사하였다. 3 번째 면역화 2 주 후 4 번째 면역화는 추가적인 부스트(boost) 주사 역할을 했다. 마지막 주사/면역화 2 주 후, 모든 마우스가 희생되었고 비장을 수확하였다. 비장 세포를 ELISpot 시험을 위해 분리시켰다. 각 마우스로부터의 혈청을 수집하여 실험 시까지 -20 ℃에서 저장시켰다.
세포 배양. HPV16 E6, E7, Ras, 및 루시퍼라제(mEERL)를 발현하는 쥐 편도 상피 세포 (문헌[Williams 등. (2009) Head . Neck . 31 (7):911-8])를 22.5 % 햄스 F-12 배지, 10 % 열로 불활성화된 FCS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 0.5 ㎍/mL 히드로코르티손, 0.0084 ㎍/mL 콜레라 독, 5 ㎍/mL 트랜스페린, 5 ㎍/mL 인슐린, 0.00136 ㎍/mL 트리-아이오도-티로닌, 및 5 ㎍/mL EGF로 보충된 DMEM에서 유지시켰다.
HPV+ 세포 용해물 제조. HPV+(mEERL) 세포를 융합될 때까지 두 개의 T125 플라스크에서 성장시키고, 이후 세포를 플라스틱 표면으로부터 무균 상태로 긁어내고, 멸균 PBS로 3 회 씻어내고, 멸균 PBS 1 mL에 재-현탁시켰다. 동결-해동을 3 회 반복하여 세포를 용해시켰고 세포 파편(debris)을 원심 분리에 의해 제거하였다. 멸균 PBS와 함께 용해가능한 단백질을 최종 부피 2 mL로 취하였다. 용해물 내 HPV-E7의 존재를 다른 문헌[Gabitzsch 등. (2009) Immunol . Lett . 122 (1):44-51]에 기술된 바에 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 확인하였다.
ELISpot 분석. 면역화 후 개별적인 마우스로부터 단리한 비장 세포로부터의 HPV16-E6 및 E7 특이적 IFN-γ 및 IL-2 생산을 다른 문헌[Gabitzsch 등.(2009) Vaccine. 27(46):6394-8]에 기술된 바에 따라 ELISpot에 의해 검출하였다. 간단히, HPV16 E6 및 E7 펩티드로 세포를 자극시켰다(각각은 15-mer 펩티드 완전 세트; JPT 펩티드 테크놀로지스, 베를린, 독일(JPT Pebtide Technologies, Berlin, Germany)). 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 2x105 세포/웰(cells/well) 농도에서 이용하였고 웰 당 106 세포별 점 형성 세포(SFC)의 숫자로서 기록하였다. 모든 E6 펩티드를 단일 풀로 합하고 시험하였다. 유사하게, 모든 E7 펩티드를 단일 풀로 합하고 시험하였다. 각 펩티드 풀은 2 번 시험되었다. 특이성 시험을 위해, 비장세포를 HIV-gag 펩티드 풀 및 사이토메갈로바이러스(CMV) 펩티드 풀에 노출시켰다. 펩티드를 웰 당 각 펩티드 0.1 ㎍으로 사용하였다. mEERL 세포 용해물에 대한 반응성을 시험하기 위해, 용해물 25 ㎕을 2 개의 시험 웰에 각각 첨가하였다. 모든 ELISpot 분석에서, 세포를 양성 대조군으로서 1 ㎍/웰의 농도에서 콘카나발린 A(ConA)로 자극시켰다. 염색된 SFC를 면역점 ELISpot 플레이트 리더(Immunospot ELISpot plate reader)(셀룰라 테크놀로지스, 셰이커 하이츠, OH(Cellular Technology, Shaker Heights, OH))를 이용해 산출하였고, 1) 음성 대조군 제거 후 106 세포당 50 SFC가 검출된 경우 또는 2) SFC가 음성 대조군 웰에서의 값보다 2 배 이상 크거나 상당히 증가된 경우라면 이 반응은 양성인 것으로 고려되었다.
통계학적 분석. 동물 군들 간 평균 면역 반응 사이에서의 통계학적으로 상당한 차이를 스튜던트 t-검정법(Student's t-test)에 의하여 결정하여 그랩패드 프리즘®(GraphPad Prism®)(그랩패드 소프트웨어, 인크(GraphPad Software, Inc.))을 이용하여, P-값이 0.05 이하이면 유의미한 것으로 간주한다.
실시예 4. HPV+ 종양 모델에서의 생존률
wt-E6/E7이 아데노바이러스 백그라운드에서 활동하는 것으로 입증되어온 바와 같이 비-종양원성 mut-E6/E7에 대한 면역 반응이 방사선요법과 상승작용하는지 여부를 시험하기 위해, HPV+ 관련 HNSCC의 마우스 모델을 이용하였다. 시스플라틴 및 방사선(시스플라틴/xrt)과 함께 아데노바이러스 대조군(Ad5 [E1-,E2b-]-null) 또는 mut-E6/E7(Ad5 [E1-, E2b-]-E6D/E7D)를 발현하는 아데노바이러스로의 비강내 면역화를 받은 야생형 마우스에서 HPV+ 종양이 발생하였다. 오직 시스플라틴/xrt(과거 데이터) 또는 시스플라틴/xrt+[E1-, E2b] 벡터 대조군(Ad 없음)만 주입된 마우스에서는 비슷한 종양 성장을 보였고 더 긴 기간 살아남았다. 그러나, mut-E6/E7 또는 wt-E6/E7가 주입된 마우스에서는 생존률이 상당히 개선되었다. mut-E6/E7 마우스는 종양 성장 및 생존률에 있어서 가장 우수한 전반적인 제어를 보여주었다(도 8 및 9). 이러한 데이터는 mut-E6/E7이 HPV 관련 암에 대한 표준 치료가 이루어지는 동안 생체 내 면역 관련 클리어런스(clearance)를 증가시킨다는 것을 확인시켜준다.
세포 배양. mEERL이 실시예 3에 기술된 바에 따라 유지되었다.
HPV+ 세포 제조. HPV+(mEERL) 세포를 융합될 때까지 단일 T125 플라스크에서 성장시키고, 이후 세포를 플라스틱 표면으로부터 무균 상태로 긁어내고, 씻어냈다.
종양 모델. 수컷 C57BlJ/6 마우스를 잭슨 실험실(Jackson Labs)으로부터 얻었고 USDA 지침을 준수하여 샌포드 리서치 LARF(Sanford Research LARF)에 의해 유지시켰다. 모든 실험들은 샌포드 리서치 IACUC(Sanford Research IACUC)에 의해 승인된 것이었고 기관 지침 하에 수행되었다. 간단히, 23-게이지 바늘을 사용하여 쥐의 우측 뒷 옆구리에 피하투여로 1x106의 mEERL 세포를 주입하였다. 감지할 수 있는 종양이 생겨난 후, 7, 14, 및 21 일 째에, 아데노바이러스 대조군(Ad5 [E1-,E2b-]-null), 또는 mut-E6/E7를 코딩하는 아데노바이러스(Ad5 [E1-, E2b-]-E6D/E7D)에 비강 내 투여로 1010 바이러스 입자가 주어졌다. 시스플라틴 20 mg/m2을 세균 발육 저지성 0.9% 염화 나트륨(하스피라 인크. 레이크 포레스트, I1(Hospira Inc. Lake Forest, Il.))에 용해시켰고 종양 삽입 13, 20, 및 27 일 후 복강 내 투여하였다. 마우스를 시스플라틴 치료와 동시에 8Gy X-선 방사선 치료(래드소스 RS2000 방사선 조사 장치, 브렌트우드, TN(RadSource RS2000 irradiator, Brentwood, TN))로 치료하였다. 종양의 성장을 캘리퍼 측정을 이용해 주마다 모니터하였고 다음 식: 부피=(너비2)(깊이)을 이용하여 종양 부피를 계산하였다. 종양의 치수가 임의 방향에서 1.5 cm에 도달하고, 동물이 쇠약해지거나 다리 기능에 장애가 생긴 것으로 입증되면 쥐를 안락사시켰다. 장기간 생존률이란 70 일보다 긴 경우를 의미한다.
실시예 5. 다른 종양원성 바이러스성 폴리펩티드
실시예 1-4에 서술된 접근법은 각 종양원성 바이러스성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 개시하기에 효과적인 다른 종양원성 바이러스성 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드를 생성하는 데 이용될 수 있다.
하나의 예에서, EBV 종양 유전자 LMP 및 EBNA 중 하나 혹은 둘 다가 변형되어 이들을 비-종양원성이 되도록 할 수 있다. 이러한 변형된 EBV 종양 유전자는, 상인두암에 대해, 단독으로 혹은 시스플라틴 및/또는 방사선요법과 병용법으로서 치료법으로 이용된다.
또다른 예에서, HPV 종양 유전자는 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma)을 치료하기 위해 변형된다.
논의된 예시적인 실시태양에 대해 다양한 수정 및 추가가 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상술된 실시태양이 구체적인 특징을 지칭하지만, 상술된 모든 특징들을 포함하는 것은 아닌 실시태양 및 특징들의 서로 다른 조합을 가지는 실시태양들이 본 발명의 범위에 또한 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Sanford Research/USD <120> Polynucleotides for Treating Oncogenic Viral Polypeptide Positive Tumors <130> 425909.000003 <150> 61/509,089 <151> 2012-01-24 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 456 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 1 atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60 acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120 gaggtatatg actttgcttt tcgggattta tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180 gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240 tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300 attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360 aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420 agatcatcaa gaacacgtag agaaacccag ctgtaa 456 <210> 2 <211> 151 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 2 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 3 <211> 297 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 3 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60 gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120 ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180 tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240 gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 4 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 5 <211> 753 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 5 atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60 acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120 gaggtatatg actttgcttt tcgggattta tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180 gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240 tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300 attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360 aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420 agatcatcaa gaacacgtag agaaacccag ctgtaaatgc atggagatac acctacattg 480 catgaatata tgttagattt gcaaccagag acaactgatc tctactgtta tgagcaatta 540 aatgacagct cagaggagga ggatgaaata gatggtccag ctggacaagc agaaccggac 600 agagcccatt acaatattgt aaccttttgt tgcaagtgtg actctacgct tcggttgtgc 660 gtacaaagca cacacgtaga cattcgtact ttggaagacc tgttaatggg cacactagga 720 attgtgtgcc ccatctgttc tcagaaacca taa 753 <210> 6 <211> 249 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 6 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His 145 150 155 160 Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr 165 170 175 Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro 180 185 190 Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 195 200 205 Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His 210 215 220 Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile 225 230 235 240 Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 245 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gactattttg cttttcggga tggatg 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cccatctcta tatactatgc atccatc 27 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gaactcgtag agcagccgcg gcgta 25 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtgtatctcc atgcatgatt acgccg 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cagccgcggc gtaatcatgc ctgga 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcaatgtagg tgtatctcca ggcatg 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccagagacaa ctgatctcta cggtta 26 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctgtcattt aattgctcat aaccgta 27 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggtccagctg gacaagcagc accgg 25 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtaatgggct ctgtccggtg ctgctt 26 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgtgtgtgct ttgtacgcac ctccga 26 <210> 18 <211> 25 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Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 <210> 24 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E6 PDZ mutant <400> 24 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Ala Ala Ala Ala 145 150 <210> 25 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E7 H2P mutant <400> 25 Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 26 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E7 C24G mutant <400> 26 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 27 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E7 E46A mutant <400> 27 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 28 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E7 L67R mutant <400> 28 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 29 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E6 L50G/PDZ mutant <400> 29 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Ala Ala Ala Ala 145 150 <210> 30 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E7 H2P/C24G/E46A/L67R mutant <400> 30 Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 31 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E6 L50G/PDZ E7 H2P/C24G/E46A/L67R mutant <400> 31 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr 20 25 30 Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg 35 40 45 Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp 50 55 60 Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys 65 70 75 80 Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu 85 90 95 Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro 100 105 110 Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile 115 120 125 Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg 130 135 140 Thr Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His 145 150 155 160 Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr 165 170 175 Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro 180 185 190 Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 195 200 205 Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His 210 215 220 Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile 225 230 235 240 Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 245 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ttgcagatca tcaagaacac gtaga 25 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cttgtccagc tggaccatct att 23 <210> 34 <211> 755 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human papillomavirus type 16 E6 L50G/PDZ E7 H2P/C24G/E46A/L67R mutant <400> 34 atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60 acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120 gaggtatatg actttgcttt tcgggatgga tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180 gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240 tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300 attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360 aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420 agatcatcaa gaactcgtag agcagccgcg gcgtaatcat gcctggagat acacctacat 480 tgcatgaata tatgttagat ttgcaaccag agacaactga tctctacggt tatgagcaat 540 taaatgacag ctcagaggag gaggatgaaa tagatggtcc agctggacaa gcagcaccgg 600 acagagccca ttacaatatt gtaacctttt gttgcaagtg tgactctacg cttcggaggt 660 gcgtacaaag cacacacgta gacattcgta ctttggaaga cctgttaatg ggcacactag 720 gaattgtgtg ccccatctgt tctcagaaac cataa 755

Claims (25)

  1. 서열 2의 아미노산 서열에서 a. L50G; b. E148A; c. T149A; d. Q150A; 및 e. L151A로 구성된 군으로부터 선택된 모든 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 서열 4의 아미노산 서열에서 a. H2P; b. C24G; c. E46A; 및 d. L67R로 구성된 군으로부터 선택된 모든 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오티드 서열이 서열 29를 코딩하고 제2 뉴클레오티드 서열이 서열 30을 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. a. 제약학상 허용되는 담체; 및
    b. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는, 대상체에서, 제1항 또는 제2항에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항원성 폴리펩티드가 유래되는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 죽이기 위한 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제약학상 허용되는 담체가 아데노바이러스 엔벨로프인 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체에서, 제1항 또는 제2항에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항원성 폴리펩티드가 유래되는 종양원성 바이러스성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 죽이기 위해 사용되는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제3항에 있어서, 상기 세포가 신생물의 일부인 것인 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 세포가 신생물의 일부인 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 신생물이 악성인 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 신생물이 악성인 것인 폴리뉴클레오티드.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016075250A1 (en) 2014-11-13 2016-05-19 Université De Genève Tri-segmented arenaviruses as vaccine vectors
WO2016198531A2 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Hookipa Biotech Ag Hpv vaccines
BR112018009032A8 (pt) 2015-11-04 2019-02-26 Hookipa Biotech Ag vetor viral de arenavírus infeccioso, composição farmacêutica, composição imunogênica, vacina, método para o tratamento ou a prevenção de infecção pelo vírus da hepatite b em um paciente, uso de um vetor viral, ácido nucleico isolado, vetor viral de arenavírus infeccioso deficiente em replicação e método para sua geração
DK3373959T3 (da) 2015-11-12 2022-09-19 Hookipa Biotech Gmbh Arenaviruspartikler som cancervacciner
GB201605210D0 (en) 2016-03-29 2016-05-11 Oxford Immunotec Ltd Assay
SG11201810627UA (en) * 2016-06-03 2018-12-28 Etubics Corp Compositions and methods for the treatment of human papillomavirus (hpv)-associated diseases
CN106655327A (zh) * 2016-10-18 2017-05-10 云南中烟工业有限责任公司 一种压缩式充电装置
WO2018089015A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Google Llc Methods, systems, and media for modifying the presentation of video content on a user device based on a consumption of the user device
CA3092937A1 (en) * 2018-03-06 2019-09-12 PGEN Therapeutics, Inc. Human papillomavirus vaccines and uses of the same
CA3178325A1 (en) * 2020-05-25 2021-12-02 Soo Ok Kim Structurally modified chimeric polypeptide of human papillomavirus, recombinant protein comprising same polypeptide, and use of same protein

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061608A2 (en) * 1998-05-26 1999-12-02 Institute Of Molecular And Cell Biology Polypeptides from creb binding protein and related protein p300 for use in transcriptional regulation
WO2010129339A2 (en) 2009-04-28 2010-11-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for enhancing antigen-specific immune responses
US20100303838A1 (en) * 2007-05-15 2010-12-02 Transgene S.A. Vectors for multiple gene expression

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN1720060B (zh) * 2002-10-03 2011-12-14 惠氏控股公司 人乳头瘤病毒多肽和免疫原性组合物
CN102002105B (zh) * 2009-09-03 2013-01-23 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Hpv 16型e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999061608A2 (en) * 1998-05-26 1999-12-02 Institute Of Molecular And Cell Biology Polypeptides from creb binding protein and related protein p300 for use in transcriptional regulation
US20100303838A1 (en) * 2007-05-15 2010-12-02 Transgene S.A. Vectors for multiple gene expression
WO2010129339A2 (en) 2009-04-28 2010-11-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for enhancing antigen-specific immune responses

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