JP2015506179A - 発癌性ウイルスポリペプチド陽性腫瘍治療用ポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本願は、発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を誘導する抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。また、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物、及び使用方法も提供する。提供される方法において、ウイルスはヒトパピローマウイルスでもよい。いくつかの実施形態において、対象における第１の発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞を殺すための方法が提供される。この方法は、第１の発癌性ウイルスペプチドに対する免疫応答を惹起するのに十分な量で組成物を対象に投与することを含む。ここで組成物は、薬学的に許容可能な担体及び本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含み、免疫応答は細胞において細胞傷害効果を引き起こすのに有効である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。第１の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ６でもよく、第２の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ７でもよい。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１２年１月２４日出願の仮出願番号第６１／５９０，０８９号に基づく優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に開示の様々な実施形態は、ウイルスワクチンに関する。特に、様々な実施形態が癌治療用ウイルスワクチンに関する。

いくつかのウイルス、例えばパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）、レトロウイルス（例えば、ＨＴＬＶ、ネコ白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス）、及び肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶ）等は、ヒト及び他の動物で癌を引き起こすことが知られている。ウイルス外被タンパク質又はウイルス様粒子を利用するワクチンが多くの場合感染予防に成功している一方で、すでに罹患してしまった疾患及びウイルス関連癌を治療する治療法が必要とされている。

いくつかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドが提供される。単離ポリヌクレオチドは、第１の抗原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み得る。ここで第１の抗原性ポリペプチドは、第１の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、免疫適格宿主（immune-competent host）において第１の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起可能であり、免疫適格宿主において非発癌性である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。ここで第２の抗原性ポリペプチドは、第２の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、免疫適格宿主において第２の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起可能であり、免疫適格宿主において非発癌性である。

ウイルスはヒトパピローマウイルスでもよい。第１の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ６でもよく、第２の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ７でもよい。

第１のヌクレオチド配列は、特定の変異、例えば、Ｌ５０に点変異又は欠失、Ｅ１４８に点変異又は欠失、Ｔ１４９に点変異又は欠失、Ｑ１５０に点変異又は欠失、又はＬ１５１に点変異又は欠失を有する配列番号２をコードし得る。第１のヌクレオチド配列は、配列番号２９をコードし得る。

第２のヌクレオチド配列は、特定の変異、例えば、Ｈ２に点変異又は欠失、Ｃ２４に点変異又は欠失、Ｅ４６に点変異又は欠失、又はＬ６７に点変異又は欠失を有する配列番号４をコードし得る。第２のヌクレオチド配列は、配列番号３０をコードし得る。

いくつかの実施形態において、組成物が提供される。組成物は、薬学的に許容可能な担体及び本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、第１の抗原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み得る。ここで第１の抗原性ポリペプチドは、第１の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、免疫適格宿主において第１の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起可能であり、免疫適格宿主において非発癌性である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。ここで第２の抗原性ポリペプチドは、第２の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、免疫適格宿主において第２の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起可能であり、免疫適格宿主において非発癌性である。

提供される組成物におけるウイルスは、ヒトパピローマウイルスでもよい。提供される組成物において、第１の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ６でもよく、第２の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ７でもよい。

提供される組成物における第１のヌクレオチド配列は、特定の変異、例えば、Ｌ５０に点変異又は欠失、Ｅ１４８に点変異又は欠失、Ｔ１４９に点変異又は欠失、Ｑ１５０に点変異又は欠失、又はＬ１５１に点変異又は欠失を有する配列番号２をコードし得る。提供される組成物における第１のヌクレオチド配列は、配列番号２９をコードし得る。

提供される組成物における第２のヌクレオチド配列は、特定の変異、例えば、Ｈ２に点変異又は欠失、Ｃ２４に点変異又は欠失、Ｅ４６に点変異又は欠失、又はＬ６７に点変異又は欠失を有する配列番号４をコードし得る。提供される組成物における第２のヌクレオチド配列は、配列番号３０をコードし得る。

提供される組成物のいくつかの実施形態において、提供される組成物における薬学的に許容可能な担体は、アデノウイルスエンベロープでもよい。

いくつかの実施形態において、対象における第１の発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞を殺すための方法が提供される。この方法は、第１の発癌性ウイルスペプチドに対する免疫応答を惹起するのに十分な量で組成物を対象に投与することを含む。ここで組成物は、薬学的に許容可能な担体及び本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含み、免疫応答は細胞において細胞傷害効果を引き起こすのに有効である。ポリヌクレオチドは、第１の抗原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み得る。ここで第１の抗原性ポリペプチドは、第１の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、免疫適格宿主において第１の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起可能であり、免疫適格宿主において非発癌性である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。ここで第２の抗原性ポリペプチドは、第２の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、免疫適格宿主において第２の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起可能であり、免疫適格宿主において非発癌性である。

提供される方法において、ウイルスはヒトパピローマウイルスでもよい。提供される方法において、第１の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ６でもよく、第２の発癌性ウイルスポリペプチドはＥ７でもよい。

提供される方法において、第１のヌクレオチド配列は、特定の変異、例えば、Ｌ５０に点変異又は欠失、Ｅ１４８に点変異又は欠失、Ｔ１４９に点変異又は欠失、Ｑ１５０に点変異又は欠失、又はＬ１５１に点変異又は欠失を有する配列番号２をコードし得る。提供される方法において、第１のヌクレオチド配列は、配列番号２９をコードし得る。

提供される方法において、第２のヌクレオチド配列は、特定の変異、例えば、Ｈ２に点変異又は欠失、Ｃ２４に点変異又は欠失、Ｅ４６に点変異又は欠失、又はＬ６７に点変異又は欠失を有する配列番号４をコードし得る。提供される方法において、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３０をコードし得る。

提供される方法のいくつかの実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、アデノウイルスエンベロープでもよい。

提供される方法のいくつかの実施形態において、細胞は、新生物の一部でもよい。提供される方法のいくつかの実施形態において、細胞は、悪性新生物の一部でもよい。

複数の実施形態が開示される一方で、本発明の例証的実施形態を示し記述する以下の発明を実施するための形態から、さらに他の実施形態が当業者に対し明らかとなるだろう。したがって、図面及び発明を実施するための形態は本質的に例証的なものとみなされるべきであり、限定的なものとみなされるべきではない。

ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７の変異を示す模式図である。 対照レトロウイルス、野生型Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルス、及び変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルスに感染した細胞における腫瘍抑制タンパク質発現（Ａ）、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７発現（Ｂ）、及び相対テロメラーゼ活性（relative telomerase activity：ＲＴＡ）（Ｃ）を示す。 対照レトロウイルス（Ａ）、野生型Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルス（Ｂ）、及び変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルス（Ｃ）に感染した細胞の増殖特性を示す。 対照レトロウイルス（ＬＸＳＮ）、野生型Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルス、及び変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルスに感染した細胞の増殖率を示す。 対照レトロウイルス（ＬＸＳＮ）、野生型Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルス、及び変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするレトロウイルスに感染した細胞のｐ５３発現を示す。 対照アデノウイルス、野生型Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルス、及び変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルスに感染した細胞の増殖率を示す。 図示された抗原に曝露された対照緩衝液、対照アデノウイルス（対照ベクター）、又は変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルスで免疫化されたマウスに由来する脾細胞のインターフェロンガンマ応答を示す。 図示された抗原に曝露された対照緩衝液、対照アデノウイルス（対照ベクター）、又は変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルスで免疫化されたマウスに由来する脾細胞のＩＬ−２応答を示す。 対照アデノウイルス（対照ベクター）をワクチン接種されたマウスにおけるＨＰＶ＋腫瘍増殖を示す。それぞれの線が、マウス個体における腫瘍増殖を示す。 変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルスをワクチン接種されたマウスにおけるＨＰＶ＋腫瘍増殖を示す。それぞれの線が、マウス個体における腫瘍増殖を示す。 野生型Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルスをワクチン接種されたマウスにおけるＨＰＶ＋腫瘍増殖を示す。それぞれの線が、マウス個体における腫瘍増殖を示す。 ＨＰＶ＋癌細胞を移植され、対照アデノウイルス（Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ｎｕｌｌ）、又は変異体Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルス（Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−Ｅ６^Δ／Ｅ７^Δ）をワクチン接種されたマウスの生存期間を示す。

本明細書に開示される様々な実施形態は、免疫適格宿主において発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起するが、免疫適格宿主において非発癌性である、抗原性ポリペプチドに関する。また本明細書において提供されるのは、かかる抗原性ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含む組成物、及び使用方法である。

本明細書において、発癌性ウイルスポリペプチドとは、宿主細胞において発現する際にその細胞を形質転換する、ウイルスゲノムによりコードされるポリペプチドである。発癌性ウイルスポリペプチドには、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス） ＨＢＸＡｇ、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）コアタンパク質、ＨＣＶ ＮＳ５Ａ、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルス） ＴＡＸ、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス） ＥＢＮＡ、及びＥＢＶ ＬＭＰ−１が含まれるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、発癌性ウイルスポリペプチド（例えば、ＨＰＶ Ｅ６）は、宿主細胞を単独で形質転換するのに十分である。他の実施形態において、発癌性ウイルスポリペプチドは、１つ又は複数の追加の特定のコファクター（例えば、他のウイルス性癌遺伝子、宿主細胞遺伝子変異）の存在下でのみ宿主細胞を形質転換する。例えば、ＨＰＶ Ｅ６は、ＥｒｂＢ２に変異を有する細胞を不死化でき、これは一部の細胞において浸潤性増殖を誘導し得る。

本明細書において、抗原性ポリペプチドとは、免疫適格宿主内に存在するときに免疫応答を誘発するポリペプチドである。本明細書において、免疫適格宿主とは、細胞傷害（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞媒介性細胞傷害又は抗体媒介性細胞傷害）をもたらす免疫応答を生成可能な動物である。

本明細書において提供される抗原性ポリペプチドは、発癌性ウイルスポリペプチドに由来し、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドと比較して少なくとも１つの変異（例えば、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加）を含有する。本明細書において提供される抗原性ポリペプチドは、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドが宿主細胞を形質転換するのと同じ条件下でそれを非発癌性にする、少なくとも１つの変異を含有する。発癌性ウイルスポリペプチドを非発癌性にする変異には、発癌機能を不活性化させる変異、例えば、腫瘍抑制タンパク質への結合を阻害する変異、活性化ドメインを阻害する変異、及びＤＮＡへの結合を阻害する変異等が含まれるが、これに限定されるものではない。例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ６に由来する抗原性ポリペプチドは、ｐ５３結合部位、テロメラーゼ活性化部位、ＰＤＺ結合ドメイン、又はこれらの組合せを阻害する変異を含み得る。別の一例において、ＨＰＶ１６ Ｅ７に由来する抗原性ポリペプチドは、Ｒｂタンパク質結合部位、Ｍｉ２β結合部位、又はこれらの組合せを阻害する変異を含み得る。

本明細書において提供される抗原性ポリペプチドは、発癌性ウイルスポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７２％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、若しくは少なくとも９９．７％の配列同一性、又は７０％から９９％、７５％から９９％、８０％から９９％、若しくは８８％から９９．９％の配列同一性）を有し、発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞に対する細胞傷害性免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドとそれが由来する発癌性ウイルスポリペプチドとは、約９５．９％同一、約９６．７％同一、約９６．９％同一、約９７．２％同一、約９７．９％同一、約９８．６％同一、約９９％同一、又は約９９．３％同一である。抗原性ポリペプチドの例には、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１が含まれる。

「パーセント配列同一性」とは、任意の発癌性ウイルスポリペプチド配列、例えば配列番号２又は配列番号４と、それに由来する抗原性ポリペプチド配列との間の配列同一性の程度を指す。抗原性ポリペプチドは典型的に、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドの全長の７０％から１３０％、例えば、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドの全長の７１％、７４％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８９％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、又は１３０％の長さを有する。任意の抗原性ポリペプチドの、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドに対するパーセント同一性を、以下のとおり判定できる。核酸又はポリペプチド配列のアラインメントをその全長にわたって実行すること（グローバルアラインメント）を可能にする、販売名ＣｌｕｓｔａｌＷの下で入手可能なコンピュータプログラム（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して、発癌性ウイルスポリペプチド（例えば、配列番号２又は配列番号４）を、１つ又は複数の候補配列とアラインする。Chemaら、Nucleic Acids Res.、31(13):3497〜500頁(2003)。

ＣｌｕｓｔａｌＷは、基準（例えば、発癌性ウイルスポリペプチド）と１つ又は複数の候補配列（例えば、発癌性ウイルスポリペプチドに由来する抗原性ポリペプチド）との間の最適マッチ（best match）を計算し、それらをアラインすることで同一性、類似性及び相違を判定できる。配列アラインメントを最大化するため、１つ又は複数の残基のギャップを基準配列、候補配列又は両方に挿入できる。核酸配列のファストペアワイズアラインメントのため、以下のデフォルトパラメータを使用した。すなわち、ワードサイズ：２、ウィンドウサイズ：４、スコアリング法：パーセント、トップダイアゴナルの数：４、及びギャップペナルティ：５。核酸配列のマルチプル配列アラインメントのため、以下のパラメータを使用した。すなわち、ギャップオープニングペナルティ：１０．０、ギャップエクステンションペナルティ：５．０、及びウェイトトランジション：イエス。タンパク質配列のファストペアワイズアラインメントのため、以下のパラメータを使用した。すなわち、ワードサイズ：１、ウィンドウサイズ：５、スコアリング法：パーセント、トップダイアゴナルの数：５、ギャップペナルティ：３。タンパク質配列のマルチプルアラインメントのため、以下のパラメータを使用した。すなわち、ウェイトマトリクス：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップオープニングペナルティ：１０．０、ギャップエクステンションペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ、残基特異的ギャップペナルティ：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷの出力は、配列間の関係性を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは例えば、ワールドワイドウェブ上の欧州バイオインフォマティクス研究所のサイト（ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）で動作させるか、又は例えば、ワールドワイドウェブ上のＣｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇのサイト（clustal.org/clustal2/）からダウンロードすることができる。

発癌性ウイルスポリペプチドに対する抗原性ポリペプチドのパーセント同一性を判定するため、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して配列をアラインし、アラインメントにおける同一マッチの数を基準配列の長さで割り、その結果に１００を掛ける。パーセント同一性値を小数点第２位で四捨五入できることに注意すべきである。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４を切り捨てて７８．１とし、一方で７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９を切り上げて７８．２とする。

本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号３４）は、本明細書において提供される抗原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二本鎖又は一本鎖、線状又は環状のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、それぞれ抗原性ポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じ抗原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコンカテマーを含み得る。

本明細書において提供されるポリヌクレオチドはまた、抗原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、ポリヌクレオチドに含まれるこの抗原性ポリペプチドヌクレオチド配列からのタンパク質の発現を促進する１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む。かかる配列には、プロモーター、エンハンサー、ＲＮＡ安定化配列、内部リボソーム侵入部位（internal ribosomal entry sites：ＩＲＥＳ）、及びタンパク質安定化配列が含まれるが、これに限定されるものではない。提供されるポリヌクレオチドにおける使用のために好適なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター、レトロウイルス長末端反復（long terminal repeats：ＬＴＲ）、調節可能プロモーター（例えば、テトラサイクリン又はＩＰＴＧ反応性プロモーター）、及びＲＳＶプロモーターが含まれるが、これに限定されるものではない。

抗原性ポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列が、本明細書において提供されるポリヌクレオチドに含まれるとき、それらから発現するポリペプチドは、例えば別個のプロモーターを介して又はＩＲＥＳの使用により別個のタンパク質として発現し得るか、又は融合タンパク質として発現し得る。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、抗原性ポリペプチドヌクレオチド配列に作動可能に連結されたタンパク質タグ（例えば、ｍｙｃタグ又はＦＬＡＧタグ）をコードするヌクレオチド配列を含み、発現の際にタグが抗原性ポリペプチドに結合される。本明細書において、タンパク質タグは、抗原性ポリペプチド配列には、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドとのパーセント配列同一性を判定する目的のためには含まれない。

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドからのタンパク質発現の検出を容易にするマーカー配列を含む。いくつかの実施形態において、マーカー配列は、ポリヌクレオチドからのタンパク質発現の検出を容易にするため、マーカータンパク質、例えば蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、又はＹＦＰ）等をコードし得る。他の実施形態において、マーカー配列は、タンパク質をコードしないが、核酸検出法、例えばポリメラーゼ連鎖反応等を使用して検出され得る。いくつかの実施形態において、マーカー配列は、発癌性ウイルスポリペプチドにおける発癌性ウイルスポリペプチドの発癌活性に寄与する領域を阻害し、抗原性ポリペプチドを作製するために使用され得る。かかる場合、マーカー配列は、抗原性ポリペプチド配列には、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドとのパーセント配列同一性を判定する目的のためには含まれず、残りの配列は、それが由来する発癌性ウイルスポリペプチドとの１００％配列同一性を維持し得る。

本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、既知の方法、例えば発癌性ウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５）の部位特異的変異誘発等を使用して作製され得る。

本明細書において提供されるポリヌクレオチドはいずれも、薬学的に許容可能な担体へと組み込まれ得る。適切な薬学的に許容可能な担体には、ウイルスエンベロープ、カチオン性脂質担体、自家細胞、プラスミドベクター、及びウイルスベクターが含まれるが、これに限られるものではない。本明細書において提供されるポリヌクレオチドが、ウイルスエンベロープに組み込まれる際、それはエンベロープへの組込みを補助する１つ又は複数のパッケージング配列を含んでいてもよい。

ある実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物が、免疫適格宿主への導入（例えば、経腸的、経皮的、静脈内、皮下、又は筋肉内導入）のために製剤される。使用の際、組成物は、発癌性ウイルスポリペプチドをコードするゲノムを有するウイルスによる感染の危険性がある免疫適格宿主に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、かかるウイルスにすでに感染しているか、又は発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞（例えば、癌細胞）を有する、免疫適格宿主に投与される。

免疫適格宿主に投与される際、一実施形態によれば、本明細書において提供される組成物は、発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞に対し細胞傷害性免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物の投与は、対象において発癌性ウイルスポリペプチドの発現に関連する癌を治療する、寛解させる、及び／又は予防するために使用できる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物の投与は、発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞の集団の減少をもたらし得る。発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞の集団の減少は、任意の適切な手段、例えば、発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞を含む腫瘍のサイズの変化を測定すること、又は発癌性ウイルスポリペプチドを発現する循環癌細胞の数の変化を測定すること等を使用して測定できる。いくつかの実施形態において、発癌性ウイルスポリペプチドの発現と関連する癌を罹患する対象の集団に対する、本明細書において提供される組成物の投与は、本明細書において提供される組成物が投与されないことを除いて同様に処置された対照集団と比較して、より長期の平均生存期間をもたらし得る。

いくつかの実施形態において、発癌性ウイルスポリペプチドの発現と関連する癌を有する対象を治療するため、本明細書において提供される組成物は、１つ又は複数の標準的治療法（例えば、放射線、外科手術、又は化学療法）と組み合わせて使用できる。標準的治療法と組み合わせて使用する際には、本明細書において提供される組成物は、標準的治療法の適用前、適用中、又は適用後に投与できる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物及び／又は標準的治療法の適用のタイミングは、組成物又は標準的治療法のいずれか１つ又はそれらの両方の有効性を高めるよう調整できる。例えば、本明細書において提供される組成物を初回用量として投与し、その後時間経過とともに追加ブースター用量を投与し、免疫応答を増加させることができる。別の一例において、本明細書において提供される組成物を化学療法前又は化学療法からの免疫回復後に投与し、十分な免疫応答の可能性を高めることができる。

本明細書において提供される組成物は、細胞傷害性免疫応答を誘発するのに十分な量の用量とすることができる。免疫応答を誘発するが、組成物中の担体に対する全身的副作用は誘発しないよう、用量を調整できる。例えば、アデノウイルス担体を使用する際、適切な用量は、１回用量当たり粒子約１０^８から１０^１２個の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、用量及び／又は投与回数は、コードされる抗原性ポリペプチドの発現を促進するために使用される配列のタイプ、対象における免疫応答の強度、又は使用される薬学的に許容可能な担体のタイプに応じて調整できる。

本明細書において提供される組成物を、プレミックス製剤として、又は、使用前に混合できる別々の成分としてパッケージできる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物を、１回用量ごとにパッケージできる。他の実施形態において、本明細書において提供される組成物を、投与前に計量される複数回用量を含む容器にパッケージできる。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物を、投与前に希釈される濃縮物として製剤できる。また他の実施形態において、本明細書において提供される組成物を、投与前に別々の成分を混合することにより作製できる。パッケージは、適切な文書、ラベル等をさらに含んでもよい。

以下の実施例が発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。

ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７の変異誘発及びウイルス構築
ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７変異誘発。インビトロ部位特異的変異誘発を使用して、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７における６つの変異を、野生型Ｅ６／Ｅ７をコードする図１に示す核酸に導入した。Ｌ５０Ｇと示す変異については、ロイシンからグリシンへの変異を、ｐ５３結合及びテロメラーゼ活性化部位ドメイン内にあるＥ６の位置５０に生成した。ＰＤＺと示す変異については、Ｅ６のＣ末端ＰＤＺ結合ドメインを残基１４６〜１５１で、４つのアラニン残基で置換した。Ｈ２Ｐと示す変異については、Ｅ７のＲｂ結合部位内の位置２でヒスチジン残基をプロリン残基で置換した。Ｃ２４Ｇと示す変異については、Ｅ７のＲｂ結合部位内の位置２４でシステイン残基をグリシン残基で置き換えた。Ｅ４６Ａと示す変異については、Ｅ７のＲｂ結合部位内の位置４６でグルタミン酸残基をアラニンへと変化させた。Ｌ６７Ｒと示す変異については、ロイシンからアルギニンへの変異を、Ｅ７のＭｉ２β結合領域内に位置６７に生成した。製造者の指示に従い（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２００５２１）、表１に列挙するプライマーを使用して、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７をコードする核酸（配列番号５）上で部位特異的変異誘発を実施した。

変異構築物をアデノウイルスシャトルベクターＡｄ５ ＶＱにクローニングした。最終構築物の忠実度を、直接ＤＮＡシークエンシングにより検証した。

ウイルス構築。Ｅ１及びＥ２ｂ欠損Ａｄ５ ＣＭＶベクター（［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］と示す空ベクター）に、変異体Ｅ６／Ｅ７（［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７と示す）及び野生型Ｅ６／Ｅ７（［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７と示す）を含むものを、以前に記載されたとおり構築、作製した（Amalfitanoら、(1998) J. Virol. 72(2):926〜33頁）。簡潔に述べると、相同組換えに基づくアプローチを使用して、野生型及び変異体Ｅ６／Ｅ７配列を、Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ベクターのＥ１領域にサブクローニングした。この複製欠損性ウイルスをＥ．Ｃ７パッケージング細胞株において増殖させ、ＣｓＣｌ_２で精製し、力価測定した。ウイルス感染力価を、Ｅ．Ｃ７細胞単層上のプラーク形成単位（plaque forming units：ＰＦＵ）として判定した。ウイルス粒子（viral particle：ＶＰ）濃度を、ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate：ＳＤＳ）破壊及び２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの分光測定により判定した。ＶＰとプラーク形成単位（ＰＦＵ）との比は、３６．７／１ ＶＰ／ＰＦＵだった。次に、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を使用して、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７及びｗｔ−Ｅ６／Ｅ７インサートを切断し、レトロウイルスベクターｐＬＸＳＮに連結した。推奨される方法（Ｎｏｌａｎ Ｌａｂ、スタンフォード大学、カリフォルニア）により、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｈ９２６８）を８μｇ／ｍｌの最終濃度となるよう添加して、レトロウイルス粒子をＰｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞株において生成した。

発癌に与えるＥ６／Ｅ７変異の効果
ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株における発癌。変異Ｅ６／Ｅ７が発癌を促進したかどうかを判定するため、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株）を、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７（配列番号６）、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７（配列番号３１）、又は対照ベクターを含むレトロウイルスに感染させ、リングクローニングした。クローンをウエスタンブロットにより解析した。図２Ａは、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７の発現が、ＰＴＰＮ１３、ｐＲｂ、及びｐ５３タンパク質発現を減少させる一方で、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７発現細胞においてＰＴＰＮ１３、ｐＲｂ、及びｐ５３発現レベルが対照と同等であることを示す。クローンのＰＣＲ解析により、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７がｗｔ−Ｅ６／Ｅ７と同等のレベルで発現したことが確認されたのであり（図２Ｂ）、これは、ウエスタンブロットにより明らかとなった変化が、発現レベルではなくＥ６／Ｅ７機能改変の結果であったことを示唆し、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７構築物における発癌機能喪失を確認する。テロメラーゼ活性もまた、これらクローンにおいて検査した。ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７及び対照ベクターは、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７と比較して有意に低い相対テロメラーゼ活性（ＲＴＡ）を示した（図２Ｃ）。ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７は形態学的な間葉型変化を誘導するので、クローンの形態学的特性もまた検査した。図３は、対照及びｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７が緊密なコロニーで増殖し、一方でｗｔ−Ｅ６／Ｅ７発現が形態において間葉様変化を誘導し、細胞が非接着的な形で増殖することを示す。合わせてこれらのデータは、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７の発現とは異なり、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７の安定発現が、細胞形質転換と関連する生化学的又は形態学的変化を誘導しないことを示唆する。

初代ヒト上皮細胞における形質転換。ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７が細胞を形質転換しないことをさらに示すため、初代ヒト扁桃上皮（human tonsil epithelia：ＨＴＥ）を、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７、又は空ベクター（ＬＸＳＮ）を含むレトロウイルスに感染させた。非感染ＨＴＥ細胞（ＨＴＥ０５２）を追加の対照として供した。ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７の発現は、細胞不死化をもたらす。しかしながら、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７を発現するＨＴＥ及び対照は、不死化しなかった（図４Ａ）。これらの結果は、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７の安定発現が、組込みレトロウイルスから発現したとしても、細胞不死化をもたらさないことを示す。

初代ヒト扁桃ケラチノサイトの非複製アデノウイルスウイルスベクター感染におけるｗｔ−Ｅ６／Ｅ７又はｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７が、形質転換をもたらすかどうかを判定するため、ＨＴＥを、ＧＦＰを発現する［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］、［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７、又は［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７に感染させた。ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７は、ｐ５３の減少を誘導できた（図４Ｂ）が、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７もｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７も、感染後の初代扁桃上皮細胞を不死化できなかった（図５）。これが複製に伴うウイルス減少によるものだったのかどうかを判定するため、細胞増殖に伴うウイルスＤＮＡの存続を検査する。Ｑ−ＰＣＲを実施し、細胞が複製するにつれ、全インサートについて同等の比率でウイルスＤＮＡが失われたことが示されたのであり、これは、ウイルス遺伝子が宿主ＤＮＡに組み込まれなかったことを示唆する。したがって、［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］アデノウイルスベクターにおけるＨＰＶ遺伝子は、分裂の際に存続せず、複製欠損アデノウイルスベクターからのｗｔ−Ｅ６／Ｅ７のその一過性発現は、初代細胞を形質転換するのに十分でない。

細胞培養。１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＳＨ３００７１０３）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変法イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＳＨ３００２２．０１）中で、Ａ５４９細胞を培養した。既知の手法（Williamsら (2009) Head Neck. 31(7):911〜8頁）を使用して、機関ＩＲＢ承認の下、同意を得た患者の外科摘出された扁桃から、初代ヒト扁桃上皮細胞（ＨＴＥ）を単離した。初代ＨＴＥを、ケラチノサイトＳＦＭ培地（ＫＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１７００５−０４２）中で維持した。

レトロウイルス感染。ＨＴＥ及びＡ５４９細胞を、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７、又は空ベクターレトロウイルスを含有するレトロウイルス上清に感染させ、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。培地を感染後２４時間で吸引し、選択のため新鮮な培地にネオマイシン（ＲＰＩ ＃Ｇ６４０００）を添加した。個々のコロニーをリングクローニングし、８００μｇ／ｍｌネオマイシンで選択下に置いた。レトロウイルス感染クローンを使用して示されるデータは、試験された複数のクローンの代表である。細胞増殖の濃度依存性ゆえに、ＨＴＥ細胞株は抗生物質選択下には置かれなかったが、細胞死又は不死化までＫＳＦＭ中に維持された。

標準ＰＣＲを実施して、ＬＸＳＮ、ＬＸＳＮ ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７、又はＬＸＳＮ ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７を発現する安定細胞株におけるｍＲＮＡを解析し、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７において生じた変化がＥ６／Ｅ７転写速度に影響を与えなかったことを検証した。Ｅ６／Ｅ７フォワードプライマー５’−ＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡ−３’（配列番号１９）及びＥ６／Ｅ７リバースプライマー５’−ＧＣＴＴＴＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号２０）を使用してＰＣＲを実施し、ＧＡＰＤＨフォワードプライマー５’−ＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴ−３’（配列番号２１）及びＧＡＰＤＨリバースプライマー５’−ＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号２２）を使用して発現レベルをＧＡＤＰＨレベルで標準化した。すべてのプライマー濃度が４５０ｎＭだった。プレインキュベーションは９４℃で１０分間だった。サイクリング条件は、９４℃で４０秒間、５５℃で４０秒間、及び７２℃で１分間を全３０サイクルだった。

アデノウイルス感染。８０％の培養密度まで培養された初代ヒト扁桃上皮細胞を、［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｎｕｌｌ、［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７、［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７又はＡｄ ＧＦＰに１００のＭＯＩで２４時間感染させた。ＤＮＡを感染後４、５及び６継代で回収した。細胞をトリプシン処理し、すすぎ、１Ｘリン酸緩衝食塩水中で再懸濁した。ＤＮｅａｓｙ ＤＮＡ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ ＃６９５０４）からの標準的な動物組織スピンカラムプロトコルを使用して、ＤＮＡ抽出を実施した。

Ｑ−ＰＣＲ。ＨＰＶ１６プライマーセット５２０ ５’− ＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡ−３’（配列番号３２）及び６７１ ５’−ＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴ−３’（配列番号３３）を使用して、ＨＰＶ１６コピー数についてアッセイするため、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した１８Ｓプライマーセットを対照として使用した。増幅反応は、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２５０ｎＭ（ＨＰＶ１６プライマーセット）又は１００ｎＭ（１８Ｓプライマーセット）のそれぞれのプライマー、及び２５ｎｇのテンプレートを含んでいた。サイクリング条件は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐサーモサイクラーを使用して、９５℃で１０分間に９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間を４０サイクル伴った。

ウエスタンブロット解析。安定細胞株Ａ５４９ ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７、Ａ５４９ ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７及び親Ａ５４９細胞を８０〜９０パーセントの培養密度まで培養し、ＰＢＳですすいで溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１００ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ ＮａＰＰｉ、１０％グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、１Ｘ Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤、１７．４μｇ／μｌ ＰＭＳＦ）で回収した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４℃）により膜を沈殿させ、可溶タンパク質を回収した。製造者の指示に従いＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して総タンパク質量を定量し、総タンパク質当量をウエスタンブロットにより解析した。簡潔に述べると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）に移し、５％ウシ血清アルブミン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）又は脱脂粉乳のいずれかでブロッキングし、フィルム上で化学発光により又はＵＶＰバイオイメージングシステム（アップランド、ＣＡ）を介して視覚化した。膜を以下の抗体とともにインキュベートした。すなわち、ＦＡＰ−１（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ１５３５６）、ｐ５３（１：５００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＯＰ４３）、ｐＲｂ（１：２５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５４１３６）及びＧＡＰＤＨ（１：５０００、Ａｍｂｉｏｎ ＃Ａｍ４３００）。

ＨＰＶ特異的細胞媒介性免疫応答
変異体Ｅ６／Ｅ７に応答する細胞媒介性免疫。Ｅ６／Ｅ７における変異がそれらを非発癌性にし、インビトロの［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］アデノウイルスベクターの文脈でＨＰＶ特異的免疫応答を開始する能力を改変するかどうかを判定するため、対照及び免疫化マウスから脾臓を回収し、Ｅ６／Ｅ７又はＥ６／Ｅ７で不死化された細胞からの溶解物により刺激された際に、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌する脾細胞の能力を検査した。酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）解析を使用して、マウス個体の群から回収された脾細胞におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌細胞の数を評価することにより、対照非ワクチン接種及びワクチン接種マウスにおける細胞媒介性免疫（cell mediated immunity：ＣＭＩ）応答を判定した。図６及び図７に示すように、Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７で免疫化されたマウスにおいてＣＭＩ応答を検出した。これは、免疫化マウスにおいて誘導されるが、緩衝液又はＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｎｕｌｌを注射された対照マウスにおいては誘導されない、ＩＦＮ−γ（図６）及びＩＬ−２（図７）スポット形成細胞（spot forming cells：ＳＦＣ）のレベルの有意な上昇により示された。ＩＬ−２ ＳＦＣ応答は、ＩＦＮ−γについて観察されたものより一貫して低かったとはいえ、対照値よりも有意に上昇していた。すべての群からの脾細胞を無関係の抗原であるＨＩＶ−ｇａｇ又はＣＭＶに曝露した際の反応性の欠如により、ＣＭＩ応答の特異性が示された。コンカナバリンＡ（concanavalin A：ＣｏｎＡ）に対する陽性応答により、すべての群のマウスにおける機能的に活性な脾細胞の存在を検証した。これらの結果は、非発癌性ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７が免疫原性であり、アデノウイルスベクターから発現する際に、ｗｔ−Ｅ６／Ｅ７により誘導されるレベルで、又はそのレベルを上回って、ＨＰＶ特異的Ｅ６／Ｅ７免疫応答を誘導することを示す。

動物免疫化。すべての動物研究が、施設内動物管理使用審査による承認の下で実施された。８から１０週齢のオスＣ５７Ｂｌ／６マウスに、緩衝液（Ｎ＝４）、１０^１０ＶＰ Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｎｕｌｌ、又は１０^１０ＶＰ Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７を７日おきに３回皮下注射した。３回目の免疫化の２週間後の４回目の免疫化を、追加のブースト注射として供した。最終注射／免疫化の２週間後、全マウスを屠殺し、脾臓を回収した。ＥＬＩＳｐｏｔ試験のために脾細胞を単離した。それぞれのマウスからの血清を回収し、−２０℃で試験まで貯蔵した。

細胞培養。ＨＰＶ１６ Ｅ６、Ｅ７、Ｒａｓ、及びルシフェラーゼを発現するマウス扁桃上皮細胞（ｍＥＥＲＬ）（Williamsら (2009) Head. Neck. 31(7):911〜8頁）を、２２．５％Ｈａｍｓ Ｆ−１２培地、１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、０．００８４μｇ／ｍＬコレラ毒素、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５μｇ／ｍＬインスリン、０．００１３６μｇ／ｍＬトリ−ヨード−サイロニン、及び５μｇ／ｍＬ ＥＧＦを添加したＤＭＥＭ中で維持した。

ＨＰＶ＋細胞溶解物調製。ＨＰＶ＋（ｍＥＥＲＬ）細胞を２本のＴ１２５フラスコ内でコンフルエントになるまで培養し、その後細胞を無菌でプラスチック表面からこすり落とし、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、１ｍＬの滅菌ＰＢＳ中で再懸濁した。細胞を凍結融解により３回溶解させ、細胞残屑を遠心分離により除去した。可溶タンパク質を滅菌ＰＢＳで２ｍＬの最終容積とした。溶解物中のＨＰＶ−Ｅ７の存在を、別の文献に記載されたとおりに実施したウエスタンブロット解析により確認した（Gabitzschら (2009) Immunol. Lett. 122(1):44〜51頁）。

ＥＬＩＳｐｏｔ解析。免疫化後のマウス個体から単離された脾細胞からのＨＰＶ１６−Ｅ６及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２産生を、別の文献に記載されたとおりＥＬＩＳｐｏｔにより検出した（Gabitzschら (2009) Vaccine. 27(46):6394〜8頁）。簡潔に述べると、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７ペプチド（それぞれについて１５−ｍｅｒペプチド完全セット；ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）で、細胞を刺激した。末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells：ＰＢＭＣ）を、細胞２×１０^５個／ウェルの濃度で使用し、ウェル当たりの細胞１０^６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として報告した。すべてのＥ６ペプチドを、単一のプールとして組み合わせて試験した。同様に、すべてのＥ７ペプチドを、単一のプールとして組み合わせて試験した。それぞれのペプチドプールを２重に試験した。特異性を試験するため、脾細胞をＨＩＶ−ｇａｇペプチドプール及びサイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）ペプチドプールに曝露した。０．１μｇのそれぞれのペプチド／ウェルでペプチドを利用した。ｍＥＥＲＬ細胞溶解物に対する反応性を試験するため、２５μＬの溶解物を添加し、ウェルを２重に試験した。すべてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、１μｇ／ウェルの濃度でコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激された細胞を、陽性対照として供した。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、シェーカーハイツ、ＯＨ）を使用して有色ＳＦＣを計数し、もし１）陰性対照を引き算した後に５０ＳＦＣ／細胞１０^６個が検出されたか、又は２）ＳＦＣが陰性対照ウェルの少なくとも２倍であり、有意に上昇していたならば、応答を陽性とみなした。

統計解析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、０．０５以下のＰ値を有意とみなし、動物群間の平均免疫応答の統計的有意差を判定した。

ＨＰＶ＋腫瘍モデルにおける生存期間
非発癌性ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７に対する免疫応答が、アデノウイルスバックグラウンドにおけるｗｔ−Ｅ６／Ｅ７について示されているように、化学放射線と相乗作用を示すかどうかを試験するため、ＨＰＶ＋関連ＨＮＳＣＣのマウスモデルを使用した。野生型マウスにおいてＨＰＶ＋腫瘍を生成し、次にこれら野生型マウスは、シスプラチン及び放射線（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ／ｘｒｔ）と併せて、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７（Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−Ｅ６^Δ／Ｅ７^Δ）又は対照アデノウイルス（Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ｎｕｌｌ）を発現するアデノウイルスで鼻腔内免疫化を受けた。ｃｉｓｐｌａｔｉｎ／ｘｒｔのみ（過去データ）又はｃｉｓｐｌａｔｉｎ／ｘｒｔ＋［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］対照ベクター（Ａｄ空）を受けたマウスは、同等の腫瘍増殖及び長期生存期間を有していた。しかしながら、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７又はｗｔ−Ｅ６／Ｅ７を受けたマウスは、有意に向上した生存期間を有していた。ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７マウスが、腫瘍増殖及び生存期間の最善の全般的制御を示した（図８及び図９）。これらデータは、ｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７がＨＰＶ関連癌の標準的治療中に、インビボでの免疫関連クリアランスを増強することを確証する。

細胞培養。ｍＥＥＲＬを、実施例３に記載のとおり維持した。

ＨＰＶ＋細胞調製。ＨＰＶ＋（ｍＥＥＲＬ）細胞を１本のＴ１２５フラスコ内でコンフルエントになるまで培養し、その後細胞をプラスチック表面からこすり落とし洗浄した。

腫瘍モデル。Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｓからオスＣ５７ＢｌＪ／６マウスを入手して、ＵＳＤＡガイドラインに従いＳａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＲＦにより維持した。すべての実験はＳａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＡＣＵＣにより承認され、機関ガイドライン内で実施された。簡潔に述べると、２３ゲージ針を使用して、１×１０^６ｍＥＥＲＬ細胞をマウスの右後側腹部に皮下移植した。触知可能な腫瘍の生成後、７日目、１４日目、及び２１日目に、ウイルス粒子１０^１０個の対照アデノウイルス（Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ｎｕｌｌ）、又はｍｕｔ−Ｅ６／Ｅ７をコードするアデノウイルス（Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−Ｅ６^Δ／Ｅ７^Δ）をマウスに鼻腔内投与した。シスプラチンを静菌性０．９％塩化ナトリウム（Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．、レークフォレスト、Ｉｌ）中に２０ｍｇ／ｍ^２で溶解させ、腫瘍移植後１３日目、２０日目、及び２７日目に腹腔内投与した。マウスを８ＧｙのＸ線での放射線療法（ＲａｄＳｏｕｒｃｅ ＲＳ２０００照射器、ブレントウッド、ＴＮ）で処置し、同時にシスプラチン処置をした。キャリパー測定を使用して腫瘍の増殖を毎週モニターし、以下の式を使用して腫瘍容積を計算した。すなわち、容積＝（幅^２）（奥行き）。腫瘍が任意の寸法において１．５ｃｍに達するか、動物がひどくやせ細るか、又は脚の機能障害を示した際に、マウスを安楽死させた。長期生存期間は、７０日間超に達した。

他の発癌性ウイルスポリペプチド
実施例１〜４において概観したアプローチを、他の発癌性ウイルスポリペプチドに由来し、それぞれの発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起するのに有効なポリペプチドを作製するために使用できる。

一例において、ＥＢＶ癌遺伝子ＬＭＰ及びＥＢＮＡのうちの１つ又は両方が、それらを非発癌性にするために改変される。かかる改変ＥＢＶ癌遺伝子は、単独で、又はシスプラチン及び／又は放射線と組み合わせて、鼻咽頭癌の治療法として使用される。

別の一例において、ＨＰＶ癌遺伝子は、Ｋａｐｏｓｉ肉腫を治療するために改変される。

論じられた例示的実施形態に対し、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修正及び付加をなすことができる。例えば、上述の実施形態が特定の特徴に言及する一方で、本発明の範囲はまた、異なる特徴の組合せを有する実施形態及び上述の特徴のすべてを含むわけではない実施形態を含む。

Claims (25)

1. 第１の抗原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、第１の抗原性ポリペプチドが、
   ａ．第１の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   ｂ．免疫適格宿主において第１の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起することが可能であり、
   ｃ．免疫適格宿主において非発癌性である、
   単離ポリヌクレオチド。
2. 第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、第２の抗原性ポリペプチドが、
   ａ．第２の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   ｂ．免疫適格宿主において第２の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起することが可能であり、
   ｃ．免疫適格宿主において非発癌性である、
   請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. ウイルスがヒトパピローマウイルスである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 第１の発癌性ウイルスポリペプチドがＥ６であり、第２の発癌性ウイルスポリペプチドがＥ７である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 第１のヌクレオチド配列が、
   ａ．Ｌ５０での点変異又は欠失、
   ｂ．Ｅ１４８での点変異又は欠失、
   ｃ．Ｔ１４９での点変異又は欠失、
   ｄ．Ｑ１５０での点変異又は欠失、及び
   ｅ．Ｌ１５１での点変異又は欠失、
   からなる群から選択される変異を有する配列番号２をコードする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 第２のヌクレオチド配列が、
   ａ．Ｈ２での点変異又は欠失、
   ｂ．Ｃ２４での点変異又は欠失、
   ｃ．Ｅ４６での点変異又は欠失、及び
   ｄ．Ｌ６７での点変異又は欠失、
   からなる群から選択される変異を有する配列番号４をコードする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
7. 第１のヌクレオチド配列が配列番号２９をコードし、第２のヌクレオチド配列が配列番号３０をコードする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
8. ａ．薬学的に許容可能な担体、及び
   ｂ．ポリヌクレオチド
   を含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドが、第１の抗原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第１の抗原性ポリペプチドが、
   ｉ．第１の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   ｉｉ．免疫適格宿主において第１の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起することが可能であり、
   ｉｉｉ．免疫適格宿主において非発癌性である、
   組成物。
9. ポリヌクレオチドが、第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、第２の抗原性ポリペプチドが、
   ａ．第２の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   ｂ．免疫適格宿主において第２の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起することが可能であり、
   ｃ．免疫適格宿主において非発癌性である、
   請求項８に記載の組成物。
10. ウイルスがヒトパピローマウイルスである、請求項９に記載の組成物。
11. 第１の発癌性ウイルスポリペプチドがＥ６であり、第２の発癌性ウイルスポリペプチドがＥ７である、請求項１０に記載の組成物。
12. 第１のヌクレオチド配列が、
    ａ．Ｌ５０での点変異又は欠失、
    ｂ．Ｅ１４８での点変異又は欠失、
    ｃ．Ｔ１４９での点変異又は欠失、
    ｄ．Ｑ１５０での点変異又は欠失、及び
    ｅ．Ｌ１５１での点変異又は欠失、
    からなる群から選択される変異を有する配列番号２をコードする、請求項１１に記載の組成物。
13. 第２のヌクレオチド配列が、
    ａ．Ｈ２での点変異又は欠失、
    ｂ．Ｃ２４での点変異又は欠失、
    ｃ．Ｅ４６での点変異又は欠失、及び
    ｄ．Ｌ６７での点変異又は欠失、
    からなる群から選択される変異を有する配列番号４をコードする、請求項１１に記載の組成物。
14. 第１のヌクレオチド配列が配列番号２９をコードし、第２のヌクレオチド配列が配列番号３０をコードする、請求項１１に記載の組成物。
15. 薬学的に許容可能な担体がアデノウイルスエンベロープである、請求項８に記載の組成物。
16. 対象における第１の発癌性ウイルスポリペプチドを発現する細胞を殺すための方法であって、前記第１の発癌性ウイルスペプチドに対する免疫応答を惹起するのに十分な量で組成物を対象に投与することを含み、組成物が、
    ａ．薬学的に許容可能な担体、及び
    ｂ．ポリヌクレオチド
    を含み、前記ポリヌクレオチドが、第１の抗原性ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第１の抗原性ポリペプチドが、
    ｉ．第１の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    ｉｉ．免疫適格宿主において第１の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起することが可能であり、
    ｉｉｉ．免疫適格宿主において非発癌性であり、
    前記免疫応答が前記細胞において細胞傷害効果を引き起こすのに有効である、方法。
17. ポリヌクレオチドが、第２の抗原性ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、第２の抗原性ポリペプチドが、
    ａ．第２の発癌性ウイルスポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    ｂ．免疫適格宿主において第２の発癌性ウイルスポリペプチドに対する免疫応答を惹起することが可能であり、
    ｃ．免疫適格宿主において非発癌性である、
    請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞が新生物の一部である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記新生物が悪性である、請求項１８に記載の方法。
20. ウイルスがヒトパピローマウイルスである、請求項１７に記載の方法。
21. 第１の発癌性ウイルスポリペプチドがＥ６であり、第２の発癌性ウイルスポリペプチドがＥ７である、請求項２０に記載の方法。
22. 第１のヌクレオチド配列が、
    ａ．Ｌ５０での点変異又は欠失、
    ｂ．Ｅ１４８での点変異又は欠失、
    ｃ．Ｔ１４９での点変異又は欠失、
    ｄ．Ｑ１５０での点変異又は欠失、及び
    ｅ．Ｌ１５１での点変異又は欠失、
    からなる群から選択される変異を有する配列番号２をコードする、請求項２１に記載の方法。
23. 第２のヌクレオチド配列が、
    ａ．Ｈ２での点変異又は欠失、
    ｂ．Ｃ２４での点変異又は欠失、
    ｃ．Ｅ４６での点変異又は欠失、及び
    ｄ．Ｌ６７での点変異又は欠失、
    からなる群から選択される変異を有する配列番号４をコードする、請求項２１に記載の方法。
24. 第１のヌクレオチド配列が配列番号２９をコードし、第２のヌクレオチド配列が配列番号３０をコードする、請求項２１に記載の方法。
25. 薬学的に許容可能な担体がアデノウイルスエンベロープである、請求項１７に記載の方法。