JPWO2012053646A1 - ワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターからなるプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
(a)免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、
(b)前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクター。
(c)CD40リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター。
(1)ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を保持するワクシニアウイルスベクターの作製
[1−1]m8Δ−〈高pro〉−envの作製
〈1−1−1〉env遺伝子の調製
ヒト免疫不全ウイルスHIV−1JR−CSF株のエンベロープタンパク質gp160およびgp120(env)をコードする遺伝子(アクセッション番号M38429)をpJW322のAvrII/XhoIサイトに挿入することにより、pJW322−envを得た。次に、envを効率良く発現させるため、env遺伝子中、6751番目から6757番目、7367番目から7373番目、および8305番目から8311番目に存在するワクシニアウイルスの転写終結配列をin vitro mutagenesis法により、下記のとおり変異させて、これをpJW322−env2とした。なお、この変異により、envのアミノ酸配列は変化しない。
変異前:TTTTTAT(配列番号1)
変異後:TTTCTAT(配列番号2)
7367番目から7373番目
変異前:TTTTTCT(配列番号3)
変異後:TTCTTCT(配列番号4)
8305番目から8311番目
変異前:TTTTTCT(配列番号5)
変異後:TTTCTCT(配列番号6)
リバースプライマー ;5’−ATAGGCCGGCCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGC−3’(配列番号8)。
AT1プロモーター、改良型p7.5プロモーター(7.5E)を10個連続したものおよびマルチクローニングサイト(MCS)が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスLC16m8Δ株(m8Δ−〈高pro〉)(Suzuki H.ら、Vaccine、第27巻、第966−971頁、2009年)を、20−40%ショ糖勾配を用いた超遠心によって精製した。AT1プロモーターおよび10個重複した7.5Eは、その下流に存在する遺伝子を高効率に発現させるプロモーター(高発現プロモーター)である。
100mmディッシュに2.4×105個のベビーハムスター腎臓細胞(BHK細胞)を播いて一晩培養した後、カナリーポックスウイルスを重複感染度(Multiplicity of infection;MOI)=10となるよう培地に加え、33℃で1時間培養した。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−3〉で回収したm8Δ−〈高pro〉−envのプラークを2%(w/v)パラホルムアルデヒド/PBS溶液で固定した後、PBSで洗浄し、さらに5%(w/w)スキムミルク/PBS溶液でブロッキングした後、PBSで洗浄した。続いて、1次抗体として抗envヒト抗体、2次抗体としてアルカリフォスファターゼ結合抗ヒトIgG抗体を用いて、常法に従ってELISA法を行い、プラークにおいてenvが発現していることを確認した。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−3〉のm8Δ−〈高pro〉−envを、MOI=10でRK13細胞に添加し、33℃で1時間吸着した。続いて、未吸着のウイルスを洗浄した後、培地を加えて一晩培養した。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−3〉のm8Δ−〈高pro〉−envを、RK13細胞にて大量培養した後、36%(w/v)ショ糖クッションを用いた超遠心によって精製濃縮し、RK13細胞にてウイルス力価を測定した。
〈1−2−1〉プラスミドの調製
ヒトCD40リガンド非切断型変異体(hCD40Lm)遺伝子が挿入されたpCA−hCD40Lm3を鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRを行いp7.5プロモーターおよびhCD40Lm遺伝子を増幅して単離した。p7.5プロモーターは、一般に頻用されているワクシニアウイルス由来のプロモーターであり、その下流に存在する遺伝子を発現させるが、上記の高発現プロモーターと比較すると下流遺伝子の発現量は小さいプロモーターである。
リバースプライマー ;5’−AGACCCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGA−3’(配列番号10)。
60mmディッシュにおいて80%コンフルエントとなるまで培養したBHK細胞に、ワクシニアウイルスLC16m8Δ株をMOI=0.05となるよう加えて33℃にて1時間培養した。
本実施例(1)[1−2]〈1−2−2〉のBHK細胞を凍結融解して得た溶解液を、RK13細胞に添加して33℃にて3日間培養し、プラークを形成させた。
本実施例(1)[1−2]〈1−2−3〉で回収したプラークについて、本実施例(1)[1−2]〈1−2−3〉の操作をさらに2回行うことにより、HA遺伝子の部位にp7.5プロモーターおよびhCD40Lm遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスを精製し、これをm8Δ−〈低pro〉−hCD40Lmとした。
本実施例(1)[1−2]〈1−2−4〉のm8Δ−〈低pro〉−hCD40Lmについて、本実施例(1)[1−1]〈1−1−5〉に記載の方法により、ウエスタンブロットを行い、hCD40Lmが発現していることを確認した。ただし、電気泳動に供した細胞は1μgに代えて10μgとし、hCD40Lmの検出にはHIV−1感染者血清に代えて抗CD40Lマウスモノクローナル抗体を用いた。その結果を図2に示す。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−6〉に記載の方法により、本実施例(1)〈1−2−4〉のm8Δ−〈低pro〉−hCD40Lmを大量培養して精製濃縮し、ウイルス力価を測定した。
〈1−3−1〉プラスミドの調製
本実施例(1)[1−1]〈1−1−1〉のpJW322−env2を鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRを行い、env遺伝子を増幅して単離した。
リバースプライマー ;5’−CGTGAGCTCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC−3’(配列番号12)。
リバースプライマー ;5’−GTACCCGGGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGG−3’(配列番号14)。
リバースプライマー ;5’−AGAGGCCGGCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGA−3’(配列番号16)。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−2〉に記載の方法により、m8Δ−〈高pro〉が保持するゲノムDNAのFseI/RsrIIサイトに、本実施例(1)[1−3]〈1−3−1〉のenv遺伝子、p7.5プロモーターおよびhCD40Lm遺伝子の領域を挿入し、高発現プロモーター、env遺伝子およびhCD40Lm遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lmのゲノムを得た。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−3〉に記載の方法により、高発現プロモーター、env遺伝子およびhCD40Lm遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lmを精製した。
本実施例(1)[1−3]〈1−3−3〉のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lmについて、本実施例(1)[1−1]〈1−1−4〉に記載の方法によりELISA法を行い、プラークにおいてenvが発現していることを確認した。また、本実施例(1)[1−3]〈1−3−3〉のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lmについて、本実施例(1)[1−1]〈1−1−5〉および本実施例(1)[1−2]〈1−2−5〉に記載の方法によりウエスタンブロットを行い、envおよびhCD40Lmが発現していることを確認した。その結果を図2に示す。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−6〉に記載の方法により、本実施例(1)[1−3]〈1−3−3〉のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lmを大量培養して精製濃縮し、ウイルス力価を測定した。
〈1−4−1〉プラスミドの調製
hCD40Lm遺伝子が挿入されたpCA−hCD40Lm3を鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRを行い、hCD40Lm遺伝子を増幅して単離した。
リバースプライマー ;5’−CCATCTAGATCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCA−3’(配列番号18)。
本実施例(1)[1−2]〈1−2−2〉に記載の方法により、ワクシニアウイルスLC16m8Δ株が保持するゲノムに、本実施例(1)[1−4]〈1−4−1〉の高発現プロモーターおよびhCD40Lm遺伝子の領域を挿入した。
本実施例(1)[1−2]〈1−2−3〉および〈1−2−4〉に記載の方法により、高発現プロモーターおよびhCD40Lm遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターm8Δ−〈高pro〉−hCD40Lmを精製した。
本実施例(1)[1−4]〈1−4−3〉のm8Δ−〈高pro〉−hCD40Lmについて、本実施例(1)[1−2]〈1−2−5〉に記載の方法により、ウエスタンブロットを行い、hCD40Lmが発現していることを確認した。その結果を図2に示す。
本実施例(1)[1−1]〈1−1−6〉に記載の方法により、本実施例(1)[1−4]〈1−4−3〉のm8Δ−〈高pro〉−hCD40Lmを大量培養して精製濃縮し、ウイルス力価を測定した。
[2−1]プラスミドの調製
、NotI認識配列を両端に付加したenv遺伝子を
pBluescriptのNotIサイトに挿入して、pBluescript−envを得た。
変異1;
フォワードプライマー;5’−CCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAGGGGATCCAGAAATTG−3’(配列番号19)
リバースプライマー ;5’−GAATAACACTTTAAAACAGATAGTTGAGAAGCTCCGCGAGCAGTTCAACAACAAGACCATCGTCTTCACTCACTCCTCAGGAG−3’(配列番号20)
変異2;
フォワードプライマー;5’−GTGAAGATCGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAG−3’(配列番号21)
リバースプライマー ;5’−GAGACATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAGCTCTACAAGTACAAGGTCGTGAAGATCGAACCATTAGGAGTA−3’(配列番号22)
変異3;
フォワードプライマー;5’−CGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGG−3’(配列番号23)
リバースプライマー ;5’−GTTTGACATAACAAAATGGCTGTGGTACATCAAGATCTTCATCATGATCGTGGGAGGCCTGATCGGTCTCCGCATCGTGTTCTCTGTACTTTCTATAG−3’(配列番号24)
本実施例(2)[2−1]のpBluescript−env−mutをNotIで消化して、env−mut遺伝子断片を切り出し、これを、センダイウイルスゲノムの3’末端にNotI認識配列が付加された配列を有し、かつセンダイウイルスの表面タンパク質fusionをコードする遺伝子(F)を有さないプラスミドpSeV/ΔFのNotIサイトに挿入して、pSeV−env−mut/ΔFを得た。
本実施例(2)[2−2]のpSeV−env−mut/ΔF、サポーティングプラスミドとしてpCAGGS−NP、pCAGGS−P、pCAGGS−LおよびpCAGGS−T7を、混合して、293T細胞にトランスフェクションして培養した。
LLC−MK2/F/Ad細胞を培養した、培養面積225cm2のフラスコ36枚に実施例(2)[2−3]のSeV−envを添加して24時間培養し、培地を交換してさらに48時間培養した。その後、培養上清を回収して濾過し、限外濾過フィルターで濃縮した。
[3−1]プラスミドへの遺伝子挿入
本実施例(1)[1−1]〈1−1−1〉のpJW322−env2を鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRを行い、env遺伝子を増幅して単離した。
リバースプライマー ;5’−CGTGAATTCACCCATCTTATAGCAAAGCCCTT−3’(配列番号26)。
本実施例(3)[3−1]のDNA−envをポリエチレンイミン(PEI;Polyscience社)と混合し、293T細胞にトランスフェクションした後、この細胞を2日間培養した。続いて、実施例(1)[1−1]〈1−1−5〉に記載の方法によりウエスタンブロットを行い、envが発現していることを確認した。
本実施例(3)[3−1]のDNA−envを大腸菌XL1−blueに形質転換して大量に培養した後、EndoFree Plasmid Purification(キアゲン社)を用いて精製した。
(1)初回免疫(プライミング)
実施例1(3)[3−3]のDNA−envをPBSに1μg/mLとなるよう溶解してDNA−env溶液を調製した。これを、C57BL/6マウス9匹に対し、常法に従って50μL(50μg)ずつ筋肉注射(プライミング)した後、2週間飼育した。続いて、再度、DNA−env溶液を常法に従って50μL(50μg)ずつ筋肉注射(プライミング)した後、8週間飼育した。
実施例1(1)[1−1]〈1−1−2〉のm8Δ−〈高pro〉、実施例1(1)[1−1]〈1−1−6〉のm8Δ−〈高pro〉−envおよび実施例1(1)[1−3]〈1−3−5〉のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lmを、それぞれPBSに1×108PFU/mLとなるよう溶解して、m8Δ−〈高pro〉溶液、m8Δ−〈高pro〉−env溶液およびm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lm溶液を調製した。
本実施例(2)の各群のマウスから、常法に従い、脾臓を摘出して脾臓細胞を採取した。採取した脾臓細胞をRPMI1640培地に懸濁した後、200×g、室温の条件下で10分間遠心分離を行って上清を除去し、0.8%(w/v)塩化アンモニウム水溶液を添加して溶血させ、赤血球を除去した。残りの脾臓細胞をRPMI1640培地に懸濁し、ナイロンメッシュに通してT細胞を濃縮した後、常法に従い細胞数をカウントした。
HIV−1 Consensus Subtype B Env(15−mer)Peptides(AIDS Research and Reference Reagent Program)を用いて、添付の仕様書に従い、本実施例(3)のT細胞を刺激した。続いて、標識抗体としてAPC−labeled anti−mouse IFN−γ(eBioscience社)およびPE−labeled anti−mouse CD8(eBioscience社)、ならびにFixation and Permeabilization Solution Kit with BD GolgiStop(日本BD社)を用いて、添付の仕様書に従い、T細胞のうちのCD8陽性IFN−γ産生細胞を染色した。
FACS CantoII(日本BD社)を用いて、本実施例(4)で染色したCD8陽性IFN−γ産生細胞数を測定した。測定した結果について、各群における平均値を求め、グラフに表した。その結果を図3に示す。
(1)プライミングおよびブースティング
C57BL/6マウス2匹をそれぞれマウスAおよびマウスBとし、これらのマウスについて、実施例2(1)および(2)に記載の方法により、プライミングおよびブースティングを行った。ただし、ブースティングの際、実施例1(1)[1−3]〈1−3−5〉のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40LmをPBSに1×109PFU/mLとなるよう溶解したm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lm溶液を調製し、マウスAには、これを10μL(1×107PFU)二又針による乱刺接種し、マウスBには実施例2(2)の1×108PFU/mLのm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lm溶液を100μL(1×107PFU)皮内注射により接種した。
本実施例(1)のマウスAおよびマウスBについて、実施例2(3)から(5)に記載の方法により、T細胞の採取、細胞内サイトカイン染色およびFACSによる染色細胞数の測定を行った。その結果を図4に示す。
(1)プライミング
C57BL/6マウス2匹をマウスAおよびマウスBとした。マウスAには、実施例2(1)に記載の方法により、マウスBには、実施例1(1)[1−1]〈1−1−6〉のm8Δ−〈高pro〉−envをPBSに1×109PFU/mLとなるよう溶解したm8Δ−〈高pro〉−env溶液を調製し、これを10μL(1×107PFU)二又針により乱刺接種(プライミング)した後、8週間飼育した。
本実施例(1)のマウスAには、本実施例(1)のm8Δ−〈高pro〉−env溶液10μL(1×107PFU)を二又針により乱刺接種(ブースティング)した後、2週間飼育した。一方、本実施例(1)のマウスBには、実施例1(2)[2−4]のSeV−envをPBSに4×109CFU/mLとなるよう溶解して得られたSeV−env溶液10μL(4×107CFU)を経鼻注射(ブースティング)した後、2週間飼育した。
本実施例(2)のマウスAおよびマウスBから、常法に従い、採血して血清を分離した。
[4−1]env固着プレートの作製
Tris−HCl(pH7.4)を10mmol/L、MgCl2を3mmol/L、NP40を0.5%(v/v)含むTMN緩衝液を調製した。100mmディッシュに80%コンフルエントとなるまで培養した293T細胞に、実施例1(3)[3−3]のDNA−envをトランスフェクションして2日間培養した。この293T細胞を、TMN緩衝液に溶解した後、限外濾過に供して、100kDaより小さい分子量のタンパク質を除去したタンパク質溶液を調製した。これをELISA用96ウェルプレートに添加してインキュベートすることにより、envを含む抗原タンパク質が固着したenv固着プレートを得た。
1次抗体として本実施例(3)の血清を100倍(1/100)、300倍(1/300)、900倍(1/900)2700倍(1/2700)にそれぞれ希釈したものおよびHIV−1感染者血清(ポジティブコントロール)、2次抗体としてhorseradish peroxidase結合抗ラットIgG抗体またはhorseradish peroxidase結合抗ヒトIgG抗体、および発色試薬としてTMB ELISA Substrate Solution(eBioscience社)を用いて、常法に従ってELISA法を行い、波長450nmで吸光度を測定した。その結果を図5に示す。
(1)プライミング
C57BL/6マウス15匹を5匹ずつ3群に分け、それぞれコントロール群、A群およびB群とした。A群のマウスには実施例4(1)のm8Δ−〈高pro〉−env溶液を、B群のマウスには実施例3(1)のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lm溶液を、それぞれ10μL(1×107PFU)ずつ二又針により乱刺接種(プライミング)した後、8週間飼育した。なお、コントロール群のマウスには何も接種しなかった。
本実施例(1)のA群およびB群のマウスに、実施例4(2)のSeV−env溶液をそれぞれ10μL(4×107CFU)ずつ経鼻注射(ブースティング)した後、2週間飼育した。
本実施例(2)の各群のマウスから血清を採取し、実施例2(3)に記載の方法によりT細胞を採取した。
本実施例(3)で採取したT細胞について、実施例2(4)および(5)に記載の方法により細胞内サイトカイン染色およびFACSによる染色細胞数の測定を行った。また、測定した結果について、A群とB群との間で検定を行った。その結果を図6に示す。
本実施例(3)で採取した血清のうち、A群およびB群の血清について、実施例4(4)に記載の方法によりELISAを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図7左図に示す。
本実施例(3)で採取した各群の血清について、既報(J.Virol.、第79巻、第10108−10125頁、2005年)に従いTZM−blアッセイを行って、血清中に含まれる抗env抗体の中和活性を測定した。具体的には、まず、100mmディッシュに80%コンフルエントとなるまで培養した293T細胞にpCAGGS−SF162env3.3μgおよびenv遺伝子を欠くHIV−1ゲノムを持つプラスミドpSG3−ΔEnv6.6μgをトランスフェクションして48時間培養した後、上清を回収して、envのエンベロープで覆われたシュードタイプウイルスが含まれるシュードタイプウイルス液を得た。このウイルス液を0.45umフィルターに通し、?80℃で保存した。
(1)プライミング
C57BL/6マウス9匹について、実施例2(1)に記載の方法によりプライミングを行った。
本実施例(1)のマウスを3匹ずつ3群に分け、A群、B群およびコントロール群とした。また、実施例1(1)[1−2]〈1−2−6〉のm8Δ−〈低pro〉−hCD40Lm、実施例1(1)[1−4]〈1−4−5〉のm8Δ−〈高pro〉−hCD40Lmおよび実施例1(1)[1−1]〈1−1−2〉のm8Δ−〈高pro〉を、それぞれPBSに1×109PFU/mLとなるよう溶解して、m8Δ−〈低pro〉−hCD40Lm溶液m8Δ−〈高pro〉−hCD40Lm溶液およびm8Δ−〈高pro〉溶液を調製した。
B群;m8Δ−〈高pro〉−env溶液およびm8Δ−〈高pro〉−hCD40Lm溶液
コントロール群;m8Δ−〈高pro〉−env溶液およびm8Δ−〈高pro〉溶液
本実施例(2)の各群のマウスから、常法に従い、血清を採取し、実施例2(3)に記載の方法によりT細胞を採取した。
本実施例(3)で採取したT細胞について、実施例2(4)および(5)に記載の方法により細胞内サイトカイン染色およびFACSによる染色細胞数の測定を行った。その結果を図8に示す。
本実施例(3)で採取した血清について、実施例4(4)に記載の方法によりELISAを行った。A群の血清の結果のうち、代表的なものを図9に示す。
本実施例(3)で採取した血清について、実施例5(6)に記載の方法によりTZM−blアッセイを行ったところ、A群、B群およびコントロール群のいずれの血清においても、抗env抗体の中和活性は認められなかった(図示しない)。
(1)プライミング
C57BL/6マウス15匹を5匹ずつ3群に分け、それぞれコントロール群、A群およびB群としたA群およびB群のマウスに、実施例4(1)のm8Δ−〈高pro〉−env溶液、実施例6(2)のm8Δ−〈高pro〉溶液および実施例6(2)のm8Δ−〈低pro〉−hCD40Lm溶液を下記のとおりの組み合わせで混合したものを、それぞれ10μL(1×107PFU)ずつ二又針により乱刺接種(プライミング)した後、8週間飼育した。なお、コントロール群のマウスには何も接種しなかった。
B群;m8Δ−〈高pro〉−env溶液とm8Δ−〈高pro〉溶液
本実施例(1)のA群およびB群のマウスに、実施例4(2)のSeV−env溶液をそれぞれ10μL(4×107CFU)ずつ経鼻注射(ブースティング)した後、2週間飼育した。
本実施例(1)の各群のマウスから血清を採取し、実施例2(3)に記載の方法によりT細胞を採取した。
本実施例(3)で採取したT細胞について、実施例2(4)および(5)に記載の方法により細胞内サイトカイン染色およびFACSによる染色細胞数の測定を行った。また、測定した結果について、A群とB群との間で検定を行った。その結果を図10に示す。
本実施例(3)で採取した血清のうち、A群およびB群の血清について、実施例4(4)に記載の方法によりELISAを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図11左図に示す。
本実施例(3)で採取した血清のうち、A群およびB群の血清について、実施例5(6)に記載の方法によりTZM−blアッセイを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図11右図に示す。
(1)プライミング
C57BL/6マウス25匹を5匹ずつ5群に分け、それぞれコントロール群、A群、B群、C群およびD群とした。A群、B群、C群およびD群のマウスに、実施例4(1)のm8Δ−〈高pro〉−env溶液、実施例6(2)のm8Δ−〈高pro〉溶液、実施例3(1)のm8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lm溶液および実施例6(2)のm8Δ−〈低pro〉−hCD40Lm溶液を下記のとおりの組み合わせで混合したものを、それぞれ10μL(1×107PFU)ずつ二又針により乱刺接種(プライミング)した後、8週間飼育した。なお、コントロール群のマウスには何も接種しなかった。
B群;m8Δ−〈高pro〉−env溶液とm8Δ−〈高pro〉
C群;m8Δ−〈高pro〉−env−hCD40Lm溶液
D群;m8Δ−〈高pro〉−env溶液
本実施例(1)[1−1]のA群、B群、C群およびD群のマウスに、実施例4(2)のSeV−env溶液をそれぞれ10μL(4×107CFU)ずつ経鼻注射(ブースティング)した後、2週間飼育した。
本実施例(1)[1−1]の各群のマウスから血清を採取し、実施例2(3)に記載の方法によりT細胞を採取した。
本実施例[1−3]で採取した各群のT細胞をそれぞれ2群分けた。その一方の群についてはCD4陽性IFN−γ産生細胞を、標識抗体としてAPC−labeled anti−mouse IFN−γ(eBioscience社)およびV450 Rat anti−mouse CD4(日本BD社)を用いて、実施例2(4)に記載の方法により染色し、もう一方の群についてはCD4陽性IL−4産生細胞を、標識抗体としてPE−Cy7 Rat anti−mouse IL−4(日本BD社)およびV450 Rat anti−mouse CD4(日本BD社)を用いて、実施例2(4)に記載の方法により染色した。
よびCD40Lmを共発現するものにした場合、細胞性免疫賦活の増強効果は見られないことが明らかになった。
[0136]
(5)ELISA
本実施例(3)で採取した血清のうち、A群およびB群の血清について、実施例4(4)に記載の方法によりELISAを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図7左図に示す。
[0137]
(5)ELISA
図7左図に示すように、A群における吸光度は1/100および1/300では約2.4であり、1/900では約2.2、1/2700では約1.4であった。一方、B群における吸光度は1/100および1/300では約2.4であり、1/900では約2.3、1/2700では約1.95であった。よって、A群およびB群のいずれにおいても、抗env抗体の結合活性が認められた。また、B群において、A群と比較して抗env抗体の結合活性が大きいことが確認された。
[0138]
(6)TZM−blアッセイ
本実施例(3)で採取した各群の血清について、既報(J.Virol.、第79巻、第10108−10125頁、2005年)に従いTZM−blアッセイを行って、血清中に含まれる抗env抗体の中和活性を測定した。具体的には、まず、100mmディッシュに80%コンフルエントとなるまで培養した293T細胞にpCAGGS−SF162env3.3μgおよびenv遺伝子を欠くHIV−1ゲノムを持つプラスミドpSG3−ΔEnv6.6μgをトランスフェクションして48時間培養した後、上清を回収して、envのエンベロープで覆われたシュードタイプウイルスが含まれるシュードタイプウイルス液を得た。このウイルス液を0.45umフィルターに通し、−80℃で保存した。
[0139]
続いて、96ウェルプレートに培養したTZM−bl細胞に、シュードタイプウイルス液を5倍希釈列で添加して48時間培養した後、Bright Glo reagent(Promega社)を用いてルシフェラーゼの発光を測定することにより、シュードタイプウイルス液のTCID50を求めた。
1次抗体として本実施例(3)の血清を100倍(1/100)、300倍(1/300)、900倍(1/900)2700倍(1/2700)にそれぞれ希釈したものおよびHIV−1感染者血清(ポジティブコントロール)、2次抗体としてhorseradish peroxidase結合抗マウスIgG抗体またはhorseradish peroxidase結合抗ヒトIgG抗体、および発色試薬としてTMB ELISA Substrate Solution(eBioscience社)を用いて、常法に従ってELISA法を行い、波長450nmで吸光度を測定した。その結果を図5に示す。
Claims (7)
- 下記(a)および(b)からなるプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター;
(a)免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、
(b)前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクター。 - 下記(c)を含んでなる、請求項1に記載のプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター;
(c)CD40リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター。 - 免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターが、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびCD40リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターである、請求項1に記載のプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター。
- プライミング用ウイルスベクターが(a)または(a)および(c)であって、かつブースティング用ウイルスベクターが(b)である、請求項1から請求項3のいずれかに記載のプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター。
- ワクシニアウイルスベクターが、ワクシニアウイルスLC16株、LC16m8株もしくはLc16mO株であって、かつB5R遺伝子において1または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および/または欠失されていて正常な機能を有するB5R遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターである、請求項1から請求項4のいずれかに記載のプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター。
- 免疫原性を有するポリペプチドがヒトに対する病原微生物の抗原タンパク質またはその部分ペプチド、もしくはヒト腫瘍抗原タンパク質またはその部分ペプチドである、請求項1から請求項5のいずれかに記載のプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター。
- 病原微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、ポリオウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、コレラ菌、結核菌、ジフテリア菌、チフス菌、百日咳菌、髄膜炎菌、破傷風菌、ミコバクテリアおよびマラリア原虫よりなる群から選択される病原微生物である、請求項6に記載のプライム/ブーストワクチン用ウイルスベクター。
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