JP5933565B2 - 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラインフルエンザワクチン - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも２つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも２つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも２つの抗原のエピトープを発現する組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡウイルス）に関する。したがって、本発明は、好ましくは複数のインフルエンザウイルス株からの複数の外部および／または内部インフルエンザウイルス抗原をコードする組み換えＭＶＡウイルスに関する。

本発明はさらに、インフルエンザウイルス用の薬剤およびワクチンの調製における前記組み換えＭＶＡの使用に関する。方法、組成物、およびキットが、本発明によってさらに包含される。

毎年、インフルエンザウイルスにより、約５００，０００人が死亡する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８７，３００−３０８）。新規ウイルス亜型の出現により、死者は、何百万人にものぼる可能性がある。同文献。例えば、１９１８〜１９１９年の流行では、４０００万を超える人々が死亡し、これは、迅速な飛行機での旅行があまり一般的ではないときであった（Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，３２７３−３２７５）。

血球凝集素表面タンパク質（ＨＡ）に１６の亜型が存在し、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）に９つの亜型が存在し、組み換えの可能性が動物界ならびに人間界に存在するという事実を考慮すると、多くの可能な流行性インフルエンザＡウイルス候補が存在する。一般に流行後、インフルエンザウイルスが季節的ウイルスになると、経時的に推移または変化しようとする。インフルエンザＡウイルスの亜型Ｈ３Ｎ２および別の亜型Ｈ１Ｎ１、ならびにヤマガタおよびビクトリア系統の２つのインフルエンザウイルスＢ型株の、いくつかの季節的ウイルスが現在同時流行している。最近のブタ流感流行後、インフルエンザＡのＨ１Ｎ１亜型（ｖＨ１Ｎ１または新Ｈ１Ｎ１）の新しい変異型が、新しい季節的Ｈ１Ｎ１株となった。

いずれの場合においても、流行性インフルエンザワクチンならびに季節的インフルエンザワクチンに対するアプローチは、いくつかのインフルエンザウイルスの組み合わせを必要なこととする。流行前ワクチンにおいて、流行前環境で同時にいくつかのウイルスに対して予備刺激するか、または備蓄を少数のワクチン（ワクチンライブラリ）に制限するかのいずれかのために、いくつかの株を１つのワクチン候補に組み合わせることが示されるが、多価の選択肢を有する各ワクチンは、即ち、その潜在能力を増加させるためにいくつかの株に対して保護的である。

現在、季節的ワクチンは、２つのＡ株および１つのＢ株の少なくとも３つの株を網羅するべきである。

この方式において、多価の概念は、流行性ウイルスの季節的ワクチンに関して異なる理由が動機となるが、実質的に、類似するワクチン構築物アプローチとなる。

流行性ワクチンにおいては一般的に全集団、そして季節的ワクチンにおいては年少児の未感作集団における予備刺激のためには、内部および外部抗原に関して野生型ウイルス感染に可能な限り類似する免疫の誘発が望ましい。野生型インフルエンザ（本明細書において「流感」と呼ばれる場合もある）感染または流感ワクチン接種のいずれかによって既に予備刺激された対象における追加免疫ワクチン接種のために、予め存在する免疫が十分な追加免疫応答を妨げてはならない。予備刺激は、単一または数用量（予備刺激スケジュール）からなり、追加免疫は、ほとんどの場合、単一のワクチン接種のみからなる。

現在のサブユニット、または不活性化された、界面活性剤で破壊されたインフルエンザウイルスワクチンの作用の主要メカニズムは、中和抗体を誘発することである（Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８，３２７３−３２７５）。通常使用される不活性化された季節的インフルエンザワクチンは、免疫ウイルス株に対して保護的抗体応答を誘発する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ８７，３００−３０８）。しかしながら、抗体応答は、新規ウイルス株に対して有効ではないかもしれない。同文献。抗原推移は、Ａ型およびＢ型の両方のインフルエンザにおいて生じ、中和耐性変異体をもたらす。同文献。よって、これらの新しい株に対抗するために、新しいワクチンを常に産生する必要がある。

ＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）は、長年Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｎｋａｒａ，Ｔｕｒｋｅｙで維持され、ヒトのワクチン接種に使用されていた皮膚ワクシニアウイルス株漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）から生じる。ワクシニアウイルスに関連する頻繁な重度のワクチン接種後合併症のため、より弱毒化された、より安全な天然痘ワクチンを生成するための、いくつかの試みがあった。

１９５９〜１９７４年の期間の間に、Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒ教授が、ＣＥＦ細胞における５７０を超える連続継代により、ＣＶＡの弱毒化に成功した（Ｍａｙｒ Ａ ａｎｄ Ｍｕｎｚ Ｅ １９６４，Ｖｅｒａｅｎｄｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｖｉｒｕｓ ｄｕｒｃｈ Ｄａｕｅｒｐａｓｓａｇｅｎ ｉｎ Ｈuｈｎｅｒｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｅｎ−Ｋｕｌｔｕｒｅｎ，Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．１９５，２４−３５、Ｍａｙｒ Ａ，Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ Ｖ，Ｓｔｉｃｋｌ Ｈ １９７５，Ｐａｓｓａｇｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ：Ａｂｓｔａｍｍｕｎｇ，Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ｕｎｄ Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ ｄｅｓ ａｔｔｅｎｕｉｅｒｔｅｎ Ｖａｃｃｉｎａ−Ｓｔａｍｍｅｓ ＭＶＡ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ３，６−１４）。前天然痘（ｐｒｅ−ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチンとしてのＭＶＡの初期の開発の一部として、ワクシニアによる有害反応のリスクがある対象において、Ｌｉｓｔｅｒ Ｅｌｓｔｒｅｅと組み合わせてＭＶＡ−５１７（５１７番目の継代に相当する）を使用して臨床試験が行われた（Ｓｔｉｃｋｌ ＨＡ １９７４，Ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｆｉｒｓｔ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎｅ“ＭＶＡ”．Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．３［１］，９７−１０１、Ｓｔｉｃｋｌ Ｈ＆Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ Ｖ １９７１，Ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｗｅａｋ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ（“ＭＶＡ ｖｉｒｕｓ”）．Ｍｕｎｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１３，１１４９−１１５３）。１９７６年に、ＭＶＡ−５７１原種（５７１番目の継代に相当する）に由来するＭＶＡが、２段階式非経口天然痘ワクチン接種プログラムの予備刺激ワクチンとしてドイツで登録された。続いて、対象の多くはワクシニアに関連する合併症のリスクが高い集団内であったが、大半の小児が１〜３歳の、重度の副作用がないと報告された約１２０，０００人の白人の個人にＭＶＡ−５７２を使用した（Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．１９７８，Ｄｅｒ Ｐｏｃｋｅｎｉｍｐｆｓｔａｍｍ ＭＶＡ：Ｍａｒｋｅｒ，ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｓｔｒｕｋｔｕｒ，Ｅｒｆａｈｒｕｎｇｅｎ ｍｉｔ ｄｅｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｅｎ Ｓｃｈｕｔｚｉｍｐｆｕｎｇ ｕｎｄ Ｖｅｒｈａｌｔｅｎ ｉｍ ａｂｗｅｈｒｇｅｓｃｈｗａｅｃｈｔｅｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍｕｓ．Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．，Ｉ．Ａｂｔ．Ｏｒｉｇ．Ｂ１６７，３７５−３９０）。ＭＶＡ−５７２は、ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７としてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに受託された。

多くの継代がＭＶＡを弱毒化するために使用されたので、ＣＥＦ細胞の継代数により、多数の異なる株または単離体が存在する。全てのＭＶＡ株はＭａｙｒ博士により考案され、大半は、天然痘撲滅プログラム中、ドイツで使用されたＭＶＡ−５７２、または動物用ワクチンとして広く使用されたＭＶＡ−５７５に由来する。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日に、受託番号Ｖ００１２０７０７でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託された。

ＣＶＡを一次ニワトリ胚線維芽細胞上で順次増殖することにより（５７０を超える継代）、弱毒化されたＣＶＡ−ウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）を得た。ＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによりさらに継代され、継代５８３に相当するＭＶＡ−ＢＮと名づけられる。ＭＶＡならびにＭＶＡ−ＢＮは、祖先ＣＶＡウイルスと比較して約１３％（６つの領域から２４．５ｋｂ）のゲノムを欠損する（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ，ｔｈｅ ａｎｃｅｓｔｏｒ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８，３２４９-３２５９）。欠失は、多数の病原性および宿主域遺伝子ならびにＡ型封入体の遺伝子に影響を及ぼす。ＭＶＡ−ＢＮの試料は、２０００年８月３０日に、受諾番号Ｖ０００８３００８でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受諾された。

ＭＶＡ−ＢＮは、ウイルスによってコードされる遺伝子が非常に効率的に発現するヒト細胞に結合し、かつ侵入することができる。しかしながら、子孫ウイルスの会合および解離は生じない。ＭＶＡ−ＢＮおよび誘導体の調製物は、多数の種類の動物、および免疫不全の個人を含む２０００人を超えるヒト対象に投与されてきた。全てのワクチン接種は、一般に安全であり、忍容性に優れていることが実証されている。

多くの異なる出版物からの見識は、全てのＭＶＡ株は同一であり、高度に弱毒化された安全な生ウイルスベクターを表すということである。しかしながら、前臨床試験は、ＭＶＡ−ＢＮが、他のＭＶＡ株と比較して、優れた弱毒化および有効性を示すことを明らかにした（Ｃｈａｐｌｉｎ ＰＪ，Ｈｏｗｌｅｙ Ｐ，Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｃ ２００２，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｒｉａｎｔ．国際特許出願第ＷＯ０２／４２４８０号）。ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ株と比較して、最高の弱毒化プロファイルを有することが示されており、重度の免疫不全動物においてさえも安全である。

ＭＶＡは、哺乳類の細胞において強く弱毒化された複製を示すが、その遺伝子は、効率的に転写および翻訳され、ウイルスの複製における遮断は、ウイルスの会合および放出のレベルである（Ｓｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｏｓｓ １９９２，Ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８９，１０８４７−１０８５１、Ｃａｒｒｏｌｌ ａｎｄ Ｍｏｓｓ １９９７，Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＭＶＡ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ： ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８，１９８−２１１．）。その高い弱毒化および病原性の減少にも関わらず、前臨床研究において、ＭＶＡは、ワクシニアウイルスタンパク質およびＭＶＡゲノムにクローン化された遺伝子の産物に対して、体液性および細胞性の両方の免疫応答を引き起こすことが示されている（Ｈａｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｎ ＨＡＡＲＴ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＩＶ−１ ｎｅｆ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＶＡ：ｓａｆｅｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １０，２８５−３００、Ｃｏｓｍａ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＶＡ−ＨＩＶ−１ ｎｅｆ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｅｆ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２２（１），２１−２９、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＣＤ３４（＋）ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１４［１４］，１３４７−１３６０、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｂｏｏｓｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ，ＣＤ３４（＋）−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０［１６］，５３８１−５３９０．）。

ＭＶＡ−ＢＮおよび組み換えＭＶＡ−ＢＮ系ワクチンは、無血清培地で培養されたＣＥＦ細胞で生成、継代、産生、および製造され得る。多くの組み換えＭＶＡ−ＢＮ変異体は、前臨床および臨床開発のために特徴付けされてきた。弱毒化（ヒト細胞系における複製の欠損）および安全性（前臨床毒性または臨床研究）に関する相違は、ＭＶＡ−ＢＮ、ウイルスベクター骨格、および様々な組み換えＭＶＡ系ワクチン間で観察されていない。

ＭＶＡ−ＢＮおよび組み換えＭＶＡ−ＢＮワクチンの安全性および免疫原性は、健康な対象、アトピー性皮膚炎と診断された患者、ＨＩＶ感染患者、および癌（メラノーマ）患者における１５を超える完了した、または進行中の臨床試験において示されている。

インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）および核タンパク質（ＮＰ）遺伝子を発現する組み換えＭＶＡが生成され、マウスで試験された。抗体およびＣＴＬ応答が生成され、マウスはインフルエンザウイルスの致死的攻撃から保護された（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ１９４，１０３２−１０４０）。

複製欠損改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に基づくＨ５Ｎ１ワクチン候補が生成され、マウスで試験された（Ｋｒｅｉｊｔｚ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ１９５，１５９８−１６０６）。ＭＶＡは、インフルエンザウイルスＡ／香港／１５６／９７（ＭＶＡＨＡ−ＨＫ／９７）またはＡ／ベトナム／１１９４／０４（ＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４）からの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を発現した。同文献。次いで、マウスは、Ａ／香港／１５６／９７、Ａ／ベトナム／１１９４／０４、およびＡ／インドネシア／５／０５の３つの抗原性的に異なるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス株に攻撃された。同文献。２用量免疫化レジメンは、異種のＨ５Ｎ１株と部分的に交差反応した強い抗体応答を誘発した。同文献。引き起こされた抗体応答は、同種および異種インフルエンザウイルス株による攻撃感染に対する保護と相関した。同文献。同様に、マカクのＭＶＡ−ＨＡ−ＶＮ／０４での免疫化は、抗体を誘発（交差反応性）し、上部および下部呼吸器官におけるウイルス複製ならびに重度の壊死性気管支間質肺炎の発生を防止した（Ｋｒｅｉｊｔｚ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ２７，６２９６−６２９９）。

免疫刺激性サイトカインＩＬ−１５、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、およびＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスＡ／ベトナム／１２０３／２００４に由来する核タンパク質、ならびに現在認可されている天然痘ワクチンの骨格上のＨ５Ｎ１ Ａ／ＣＫ／インドネシア／ＰＡ／２００３ウイルスからの基質タンパク質Ｍ１およびＭ２を発現する、ワクシニア系インフルエンザワクチンが生成された（Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１８２，３０６３−３０７１）。ワクチンは、ワクチン接種されたマウスにおいて交差中和抗体および細胞性免疫応答を誘発し、異なるクレードのＨ５Ｎ１ウイルスで攻撃されるとき、減菌交差クレード保護を付与した。同文献。

現在市販されている季節的流感ワクチンには多くの問題がある。第１に、毎年、標的集団を免疫化するために、ＷＨＯの予測に従い、短い時間での株の適応が要求される。これは、特に予備刺激のために２用量を必要とする年少児に当てはまる。標準的なワクチンである死滅させた三価分割／サブユニット（ＴＩＶ）は、小児を十分に予備刺激しない。つまり、未感作の個人では免疫を誘発しない、または弱い免疫を誘発するのみであり、これは、他の株／亜型に対する交差免疫の誘発を損なうと考えられ、しがたって、免疫構成には逆効果である（Ｂｏｄｅｗｅｓ ｅｔ ａｌ．２００９，．Ｌａｎｃｅｔ９，７８４−７８８、Ｂｏｄｅｗｅｓ ｅｔ ａｌ．２００９，ＰｌｏｓＯｎｅ９，ｅ５５３８：１−９）。

標準的なワクチンは、高齢者においても十分な免疫原性ではない。アジュバントＴＩＶは、小児および高齢者により強い免疫を誘発するが、年少児における免疫構成に対する影響は未知である。別のワクチンである低温適応生弱毒化（ＣＡＩＶ）は、未感作の対象には良好な予備刺激ワクチンであるが、前免疫対象、例えば成人には十分な追加免疫ワクチンではない。年少児、喘息の発作、およびワクチン接種後の入院の発生率の増加における安全性への懸念により、２歳を超える健康な小児および５歳を超える喘息の小児にのみ認可される。

上記に基づき、当該技術分野において、特に年少児用の流行性流感および季節的流感の両方の流感ワクチン、ならびに年長児および成人に対する保護の増加を提供する必要がある。本発明は、この必要性を満たし、ワクチンとしての改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）系ベクターによる、流感に対抗するための手段および方法を提供する。ＭＶＡ系ベクターは、ワクチンの多価およびその潜在的な交差保護のため、好ましくは、毎年適応の対象ではないと想定される流感ワクチンの迅速かつ効率的な産生を可能にするプラットホームを構築する。これは、ワクチン接種により免疫系に提供される外部および内部のインフルエンザウイルス抗原および／またはその抗原決定基もしくはエピトープの選択により達成される。

流行性流感ならびに季節的流感に対抗するためのインフルエンザワクチンを提供するという目的により、本発明は、以下の付記を特徴とする以下の態様を提供する：
（１）少なくとも２つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも２つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡウイルス）であって、抗原および／またはそのエピトープ（複数可）をコードする遺伝子が、少なくとも２つのＭＶＡ挿入部位に挿入される。

（２）ＭＶＡウイルスは、少なくとも３つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも２つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する、付記１に記載のＭＶＡウイルス。

（３）ＭＶＡウイルスは、少なくとも３つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも３つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する、付記１または２に記載のＭＶＡウイルス。

（４）ＭＶＡウイルスは、少なくとも６つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも６つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも３つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する、付記１〜３のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（５）少なくとも２つの外部抗原および／または少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープ（複数可）は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２からなる群から選択される、付記１〜４のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（６）外部抗原は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２、ならびに／または前記抗原のうちの１つ以上のエピトープである、付記１〜５のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（７）少なくとも２つの内部抗原および／または少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープ（複数可）は、ＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１からなる群から選択される、付記１〜６のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（８）内部抗原は、ＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１、ならびに／または前記抗原のうちの１つ以上のエピトープである、付記１〜７のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（９）内部抗原であるＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１、ならびに／または前記抗原のうちの１つ以上のエピトープ（複数可）は、融合タンパク質として発現する、付記８に記載のＭＶＡ。

（１０）ＭＶＡウイルスは、４つの異なるＨＡタンパク質および／または前記タンパク質のうちの１つ以上のエピトープを発現する、付記１〜９のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（１１）ＨＡタンパク質は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９、ならびに／または前記タンパク質のうちの１つ以上のエピトープである、付記１０に記載のＭＶＡウイルス。

（１２）ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ３、および２つのＢ型ＨＡタンパク質、ならびに／または前記タンパク質のうちの１つ以上のエピトープである、付記１０に記載のＭＶＡウイルス。

（１３）組み換えウイルスを生成するために使用されるＭＶＡウイルスは、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの変異体である、付記１〜１２のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（１４）インフルエンザウイルス抗原の発現は、２つ以上のポックスウイルスプロモータの制御下にある、付記１〜１３のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（１５）遺伝子は、ＭＶＡゲノムの少なくとも２つの遺伝子間領域に挿入される、付記１〜１４のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス。

（１６）遺伝子間領域は、ＭＶＡウイルスのＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される、付記１５に記載のＭＶＡウイルス。

（１７）付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルスならびに薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または添加剤を含む、ワクチンまたは薬学的組成物。

（１８）薬剤またはワクチンを調製するための、付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡの使用。

（１９）ヒトを含む対象を治療するための方法であって、付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡおよび／または付記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物を、ヒトを含む対象に投与することを含む方法。

（２０）ヒトを含む対象のインフルエンザの治療もしくは予防に使用するための、付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス、付記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物、付記１８に記載の使用、および／または付記１９に記載の方法。

（２１）ヒトを含む対象は、２歳より大きい、付記１９もしくは２０に記載の方法、ならびに／あるいは付記２０に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。

（２２）ヒトを含む対象は、２歳未満である、付記１９もしくは２０に記載の方法、ならびに／あるいは付記２０に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。

（２３）ＭＶＡウイルスおよび／またはワクチンもしくは薬学的組成物は、未感作対象に単回または複数回投与で投与される、付記１９〜２２のいずれか１つに記載の方法、ならびに／あるいは付記２０〜２２のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。

（２４）ヒトを含む対象は、免疫不全である、付記１９〜２３のいずれか１つに記載の方法、ならびに／あるいは付記２０〜２３のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。

（２５）ＭＶＡウイルスおよび／またはワクチンもしくは薬学的組成物は、初回接種（「予備刺激接種」）および二回目接種（「追加免疫接種」）で、治療有効量で投与される、付記１９〜２４のいずれか１つに記載の方法、ならびに／あるいは付記２０〜２４のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。

（２６）第１のバイアル／容器に初回接種（「予備刺激接種」）用、および第２のバイアル／容器に二回目接種（追加免疫接種」）用の、付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス、ならびに／または付記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物を含む、予備刺激／追加免疫化のためのキット。

（２７）付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルス、および／または付記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物の１つもしくは複数のバイアルと、ウイルスを対象に投与するための説明書とを含む、キット。

（２８）付記１〜１６のいずれか１つに記載のＭＶＡウイルスを含む細胞。

ＭＶＡは、ベクター系として特に適している。例えば天然痘ウイルスに対するワクチン接種後、短時間で体液性および細胞性の両方の免疫応答を誘発するのに有効であるその能力が示されてきた。その安全性が確立されてきた。免疫不全の対象においても免疫応答を誘発するその能力が知られている（例えば、ＨＩＶワクチンとして使用するための、ＭＶＡ−ＢＮ等の高度に弱毒化された（ＨＡ）ＭＶＡ）。

しかしながら、流感に対するワクチンとして使用するための、ＨＡ−ＭＶＡが有する利点は別として、流感ワクチンに対する最も大きな課題は、対象の免疫系に提供される流感抗原の選択である。実際、季節ごとの再配合の必要性がないワクチンならば、大量にワクチンを産生するために６ヶ月の準備期間が必要ということはないであろうし、ワクチン接種が、特に、一般に最初に２回ワクチン接種されなければならないインフルエンザ未感作の小児にとってより容易になるだろう。現在の流感ワクチンは、保護的免疫応答を刺激するために、インフルエンザウイルス（大半は血球凝集素ＨＡおよびノイラミニダーゼＮＡ）からの特異的なタンパク質を使用する。しかしながら、これらのタンパク質には相当な季節的変動がある、つまり、ある年に産生されたワクチンは、翌年には効果がない可能性がある。したがって、この変動に対応するために、新しいワクチンが毎年産生される必要があり、新しい流感の流行が生じた場合、異なるワクチンが必要となる。

本発明は、代わりに、外部および内部の流感抗原の組み合わせを使用した。教科書の基礎知識によると（Ｆｉｅｌｄｓ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００７，５^ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２）、外部抗原は、ビリオン表面からの抗原であり、内部抗原は、ウイルス粒子の内部からの抗原である。ＰＢ１（ウイルスポリメラーゼのサブユニット）、ＮＰ（核タンパク質）、およびＭ１（基質タンパク質）は、内部インフルエンザ抗原に数えられ、本発明により、好ましくは内部抗原として使用され、ＨＡ（血球凝集素）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）、およびＭ２（基質タンパク質）は、インフルエンザウイルスの外部抗原であり（Ｆｉｅｌｄｓ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００７，５^ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２，１６４８，ｒｉｇｈｔ ｃｏｌｕｍｎ，ｓｅｃｔｉｏｎ“Ｖｉｒｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ”，２^ｎｄｓｅｎｔｅｎｃｅ、または１６４９、図４７．２）、本発明により、好ましくは外部抗原として使用される。よって、発明者の外部および内部流感抗原の組み合わせの選択は、改善された流感ワクチンの基礎としての機能を果たす。

鳥流感ウイルスならびに季節的ヒト流感をもたらすものに保存される内部タンパク質は、Ｂ細胞応答だけでなく、強力なＴ細胞応答も刺激するアジュバントとして作用するウイルスベクター（ＭＶＡ）により発現する。特に後者の種類の応答は、流感ウイルスに対して免疫を提供するのに重要であるとさらに考えられる。著しいヘテロ亜型のＴ細胞応答を誘発するＭＶＡの能力は、近年、Ｂｅｒｔｏｕｄら２０１１（Ｐｏｔｅｎｔ ＣＤ８１ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖａｃｃｉｎｅ，ＭＶＡ−ＮＰ＋Ｍ１．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５２，１−７）の研究により裏付けられている。しかしながら、Ｂｅｒｔｒｏｕｄらは、ヘテロ亜型のＴ細胞応答を示すことができたが、これらの著者は、血球凝集素等の外部／表面抗原が彼らのワクチンに明らかに不在であったため、インフルエンザワクチンにおける彼らの目標を達成できなかった。

加えて、本発明は、本発明のワクチンが主として流行性（ｐａｎ）流感ワクチンとして適用される場合、好ましくは４つの異なるＨＡタンパク質（Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９）、または好ましくは季節的流感ワクチンとして適用されるとき、好ましくはＨ１およびＨ３ならびに２つのＢ型ＨＡタンパク質を発現することを予見していた。

ワクチンによって網羅されない亜型が誘発された免疫応答の幅によって間接的に網羅されるようにこのワクチンの実質的な見込みによる可能性を付与するために、流行性（ｐａｎ）インフルエンザワクチンの場合、３つのＨクレードと組み合わされたヘテロ亜型の応答の広範な誘発（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３２５，２８７−２９６）が想定される。実際、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２０１０（ＢＩＴ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２^ｎｄＡｎｎｕａｌ Ｗｏｒｌｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）によって説明される単に内部抗原を使用したアプローチは、血球凝集素等の外部／表面抗原が含まれない場合、不十分な概念であると見なされた。

本発明は、図面を参照することにより、より完全に理解される。

ｐＢＮ３６６を示す。 ｐＢＮ３６７を示す。 ｐＢＮ３６８を示す。 ｐＢＮ３９５を示す。 ＭＶＡ−ＰａｎＦｌｕを示す。 ｐＢＮ４１７を示す。 ｐＢＮ４１８を示す。 ＭＶＡ−ＦｌｕＳｅａｓｏｎａｌを示す。

次世代インフルエンザワクチンの課題に対応するために、本発明の発明者は、容易に入手可能な細胞培養系において産生され得るウイルスベクター中で外部および内部の両方のウイルスタンパク質を組み合わせるＭＶＡ系インフルエンザワクチンを開発した。抗体の外部ウイルス表面タンパク質への中和は、感染の確立を防止するのに重要な役割を果たし、一方、細胞毒性Ｔリンパ球の内部ウイルスタンパク質への中和は、既に感染した細胞を取り除く。したがって、本発明の発明者は、ワクチン構築物に外部および内部の両方のウイルスタンパク質を含むことは適切であると見なした。

本発明のワクチンは、異なるインフルエンザ株に対して保護することができる季節的および流行性流感の両方の「汎用ワクチン」であると想定される。この目的のため、ＰＢ１（ウイルスポリメラーゼのサブユニット）、ＮＰ（核タンパク質）、および／またはＭ１（基質タンパク質）は、好ましくは内部抗原として使用され、ＨＡ（血球凝集素）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）、および／またはＭ２（基質タンパク質−２）は、好ましくは外部抗原として使用される。加えて、ワクチンは、好ましくは４つの異なるＨＡタンパク質（Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９）（流行性または前流行性ワクチン）、またはＨ１およびＨ３ならびに２つのＢ型ＨＡタンパク質（季節的ワクチン）を含む。本明細書で使用されるとき、「汎用ワクチン」とは、特に、本発明のワクチンが「Ｈクレードの範囲に汎用」であることを意味する、即ち、ワクチンは、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３２５：２８７−２９６に記載されるもの等（本明細書の以下を参照）の、特に、それぞれ、ヤマガタ系およびビクトリア系からのＨクレードであるＨ２、Ｈ５、Ｈ７、および／もしくはＨ９、またはＨ１、Ｈ３および／もしくは２つのＢ型ＨＡタンパク質に対する保護、ならびに／または特に、それぞれ、ヤマガタ系およびビクトリア系からのＨ２、Ｈ５、Ｈ７、および／もしくはＨ９、またはＨ１、Ｈ３および／もしくは２つのＢ型ＨＡタンパク質とは異なる１つ以上のＨクレードに対する交差保護を付与すると想定される。

ＭＶＡ株
本発明は、インフルエンザウイルス遺伝子を含む改質ワクチンウイルスアンカラ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ系ワクチンを包含する。したがって、本発明は、組み換えＭＶＡも包含する。ＭＶＡ骨格は、受託番号Ｖ０００８３００８でＥＣＡＣＣに受託されるように、好ましくはＭＶＡ５７２、またはＭＶＡ５７５、またはＭＶＡ−ＢＮであり得る。

ＭＶＡ系ワクチンは、いくつかの理由のため有利である。例えば、好ましい株であるＭＶＡ株のＭＶＡ−ＢＮは、一次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞で良好に成長し、本明細書でより詳細に記載されるように、ヒト細胞で複製されない。ヒト細胞において、ウイルス遺伝子は発現するが、感染ウイルスは産生されない。限定されたＭＶＡ−ＢＮの宿主域は、ヒトを含む哺乳類種の広範囲で生体内観察された非感染性表現型を明らかにしてもよい。

これを有望なワクチンベクターにするＭＶＡ−ＢＮのいくつかの重要な特徴は、以下を含む。
● ＭＶＡ−ＢＮは、重度に免疫抑制されたマウスにおいても、ヒト細胞系または哺乳類において複製されない。
● ＭＶＡ−ＢＮは、ウサギにおける反復毒性曝露ならびに妊娠中の雌親および子における周産期および出生後の奇形学研究を含む多数の毒性研究において安全であることが示され、またＭＶＡ−ＢＮは、生体内分布研究において、ウサギから迅速に取り除かれる（ワクチン接種後４８時間以内）ことを示した。
● ＭＶＡ−ＢＮは、ウイルスベクターに対する既存免疫の存在下でも、同種の予備刺激−追加免疫レジームにおいて使用され得る。
● 健康な対象、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した人々（ＣＤ４細胞＝＞２００／μｌ）、およびアトピー性皮膚炎（ＡＤ）と診断された人々を含む、２０００人を超える人々がＭＶＡ−ＢＮまたは組み換えＭＶＡ系ワクチンで安全にワクチン接種されている。
● ＭＶＡ−ＢＮは、マウス痘の動物モデルにおける即時保護（即ち、随伴性感染に対する保護を付与する）、および／または曝露後の保護（即ち、感染が生じた後の保護を付与する）を提供することができる。

ＭＶＡ−ｍＢＮ２１０は、高度に弱毒化された改質ワクシニアウイルスアンカラ（「ＨＡ−ＭＶＡ」）の例である。「ＨＡ−ＭＶＡ」という用語は、本明細書で使用されるとき、「ＭＶＡ−ＢＮ」という用語と互換的に使用される。

本発明によると、「ＨＡ−ＭＶＡ」（または「ＭＶＡ−ＢＮ」）ウイルスは、以下の性質を有するＭＶＡウイルスである。
● ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ヒト細胞系（ＨａＣａＴ、１４３Ｂ、２９３、およびＨｅＬａ等）において、生体外で生殖的に複製されない。
● ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ヒトおよびマウスにおいて、さらには重度の免疫抑制されたマウスにおいても、生体内で生殖的に複製されない。
● ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、Ｈｅｌａ細胞およびＨａＣａＴ細胞系において、ＭＶＡ−５７５より少なくとも２倍低いウイルス増幅率を有する。
● ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞の細胞において生殖的に複製する能力を有する。

本明細書で使用されるとき、「高度に弱毒化」とは、ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において生殖複製の能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞系ＨａＣａＴ、ヒト骨の骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト胚腎臓細胞系２９３、およびヒト頚部腺癌細胞系ＨｅＬａにおいて生殖複製の能力を持たないことを意味する。

「生殖的に複製しない」という用語は、国際特許公開第ＷＯ０２／４２４８０号に記載されるアッセイを使用して、感染４日後に１未満のウイルス増幅率を有するウイルスに適用され、このアッセイは、参照により本明細書に組み込まれる。

好ましくは、ＨＡ−ＭＶＡは、Ｈｅｌａ細胞およびＨａＣａＴ細胞系において、ＭＶＡ−５７５より少なくとも３倍低いウイルス増幅率を有する。ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ＭＶＡ−５７２またはＭＶＡ−５７５等の、改質ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）をさらに継代することにより誘導され得る。

好ましい実施形態では、ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ＣＥＦ細胞において、５００より大きい増幅率を有する。

ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ＨＡ−ＭＶＡ、ならびにＭＶＡ−ＢＮおよび例えばポックスウイルスプロモータの制御下で異種遺伝子を挿入することによる、ＭＶＡ−ＢＮに由来する組み換えウイルスを含む。ＭＶＡ−ＢＮの試料は、受託番号Ｖ０００８３００８で、ＥＣＡＣＣに受託された。

本明細書で使用されるとき、ＨＡ−ＭＶＡの「誘導体」または「変異体」は、好ましくはＨＡ−ＭＶＡと同じ性質を有する、即ち、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において生殖複製の能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞系ＨａＣａＴ、ヒト骨の骨肉腫細胞系１４３Ｂ、およびヒト頚部腺癌細胞系ＨｅＬａにおいて生殖複製の能力を持たない。上記に示されるように、ＭＶＡのこれらの性質の試験およびアッセイは、国際特許公開第ＷＯ０２／４２４８０号（参照により組み込まれる）に説明されている。

ＭＶＡ−ＢＮの「誘導体」とは、基本的にＭＶＡ−ＢＮと同じ複製特徴を示すが、それらのゲノムの１つ以上の部分で相違を示すウイルスを指す。ＭＶＡ−ｍＢＮ２１０は、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体である。

好ましい実施形態では、本発明は、複数の外部および／または内部インフルエンザウイルス抗原をコードするＨＡ−ＭＶＡウイルスを包含する。好ましい実施形態では、ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、ＭＶＡ−ＢＮに由来する組み換えＨＡ−ＭＶＡである、即ち、組み換えウイルスを生成するために使用されるＭＶＡウイルスは、好ましくはＭＶＡ−ＢＮまたは同じ成長特徴を有する変異体である（上記を参照）。インフルエンザウイルス遺伝子は、ＭＶＡ−ＢＮまたはその変異体にクローン化され得る。具体的な好ましい実施形態では、ウイルスは、ＭＶＡ−ｍＢＮ２１０（図５を参照）またはＭＶＡ−ｍＢＮ２４２（図８を参照）である。

ＭＶＡの増殖、例えば培養物中のＨＡ−ＭＶＡは、ＨＡ−ＭＶＡ等のＭＶＡのゲノムにおいて変異をもたらすことができる。適切な選択手順を使用することにより（即ち特定の細胞系上での増殖）、これらの性質に影響を及ぼさずに変異を可能にする一方で、所望の表現型が維持され得る。様々な細胞系上でＭＶＡを増殖する方法が当該技術分野において周知である。

ウイルスが成長する培地に変異原を添加することにより、ＨＡ−ＭＶＡウイルス等のＭＶＡのゲノムにおける変異の生成を促進することができる。同様に、ＭＶＡ、例えばＨＡ−ＭＶＡのゲノムの中に変異を導入するために、ＰＣＲおよび他の分子技法が使用され得る。これらの変異は、ゲノムの非必須領域を標的とするか、または無造作に生成され得る。

一実施形態では、組み換えＭＶＡは、１０^７ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ以上の濃度である。好ましくは、組み換えＭＶＡは、１０^７ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ以上の濃度で、感染細胞、好ましくはＣＥＦから産生される。

好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡを、３０℃の温度で、好ましくは無血清培地（例えば、ＶＰ−ＳＦＭ（登録商標））中で成長させる。好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡを５．５未満、好ましくはｐＨ５．２で成長させる。

インフルエンザウイルス遺伝子
インフルエンザウイルスＡ型は、ウイルスの分類において、オルトミクソウイルスと呼ばれるウイルスのファミリーの属である。インフルエンザウイルスＡ型は、属に１種のみを有し、その種は、「インフルエンザＡウイルス」と呼ばれる。インフルエンザＡウイルスは、「鳥インフルエンザ」（鳥流感、鳥類流感、インフルエンザウイルスＡ流感、Ａ型流感、またはＡ属流感としても知られる）をもたらすが、ヒトインフルエンザ、ブタインフルエンザ、またはウマインフルエンザももたらす。鳥類は、その主要な病原体保有動物であるが、インフルエンザＡウイルスは、哺乳類のいくつかの種に感染する場合がある。インフルエンザウイルスＢ型は、オルトミクソウイルスと呼ばれるウイルスのファミリーの別の属である。インフルエンザウイルスＢ型は、属に１種のみを有し、その種は、「インフルエンザＢウイルス」と呼ばれる。

インフルエンザウイルス抗原またはその抗原決定基もしくはエピトープは、好ましくは複数のインフルエンザウイルス株からである。本内容において「複数」とは、本発明のベクターおよびワクチンに適用されるとき、インフルエンザウイルス遺伝子／抗原／エピトープが異なるインフルエンザウイルス株からであることを意味する。例えば、Ｍ２遺伝子は、第１のインフルエンザウイルス株からであってもよく、一方、ＰＢ−２遺伝子は、第１の株とは異なる第２のインフルエンザウイルス株からであってもよい。しかしながら、本発明のベクターおよびワクチンに適用されるとき、インフルエンザウイルス遺伝子／抗原／エピトープのうちの１つ以上が同じインフルエンザウイルス株からであることもやはり好ましい。

本明細書で使用される、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書で記載されるように、免疫系の成分により特異的に認識される、または特異的に結合される参照インフルエンザ抗原の短ペプチド配列を指すために、同義的に使用される。一般に、抗原は、それらが抗原提示細胞上で結合されるＭＨＣ／ＨＬＡ分子の構成において認識される。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、エピトープまたは抗原決定基が由来する抗原に対して特異的な免疫応答を誘発するのに十分に長いアミノ酸ストレッチ、またはペプチド、または抗原の断片、または抗原性ポリペプチドもしくはタンパク質の断片を指す。よって、エピトープは、免疫系によって認識される抗原の一部であり、かつヒトを含むワクチン接種された動物の免疫応答を引き起こすことがなお可能であるペプチドの短ストレッチである。よって、エピトープまたは抗原決定基は、抗原もしくは抗原性ポリペプチドの断片、一部、またはセグメントである。

「ペプチド」または「アミノ酸配列」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列の断片、および天然のまたは合成の分子を指す。ポリペプチド「断片」、「一部」、または「セグメント」は、少なくとも約５つのアミノ酸、好ましくは少なくとも約７つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも約９つのアミノ酸、最も好ましくは約１７〜２０以上のアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。ペプチドは、好ましくは、約２００のアミノ酸を超えない、より好ましくは１５０のアミノ酸未満、最も好ましくは１００のアミノ酸未満である。好ましくは、ペプチドは、約５〜約２００のアミノ酸である。免疫原性であるために、即ちエピトープとしての機能を果たすために、任意のペプチドまたはポリペプチドは、生物学的および／または免疫学的活性を示すのに十分な長さでなければならない。好ましくは、本明細書に記載されるポリペプチド「断片」、「一部」、または「セグメント」は、エピトープまたは抗原決定基としての機能を果たす。

本明細書で使用される「抗原決定基」または「エピトープ」とは、明示的に記述されないとき、「抗原」という用語により常に包含される。

組み換えＭＶＡは、以下のインフルエンザウイルス遺伝子またはその断片もしくは変異体の任意のおよび全ての組み合わせを含むことができる：インフルエンザＡおよび／またはＢの血球凝集素ＨＡ、ノイラミニダーゼＮＡ、基質タンパク質Ｍ２、Ｍ１、核タンパク質ＮＰ、ポリメラーゼ塩基ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＢ１−Ｆ２、ポリメラーゼ酸ＰＡ、非構造タンパク質ＮＳ１、およびＮＳ２。前記断片または変異体は、好ましくは、抗体、好ましくは中和抗体の産生等の体液性および／または細胞性免疫応答を含む免疫応答を誘発する、または細胞溶解免疫応答を誘発することがなお可能である。特に好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上のＨＡ遺伝子および少なくとも１つのＰＢ１遺伝子を含む。

一実施形態では、組み換えＭＶＡは、コードされたインフルエンザウイルスタンパク質、例えば非構造ＮＳ１またはＮＳ２タンパク質の変異型または切断型をコードする１つ以上のインフルエンザウイルス遺伝子を含む。

好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、インフルエンザウイルスの内部および外部遺伝子を含む。好ましくは、組み換えＭＶＡは、少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、または６つの内部遺伝子、および少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの外部遺伝子を含む。より好ましくは、組み換えＭＶＡは、少なくとも２つもしくは３つ、４つもしくは５つ、または６つの異なる内部遺伝子、および少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの異なる外部遺伝子を含む。特に好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の異なるＨＡ遺伝子および少なくとも１つのＰＢ１遺伝子を含む。

外部抗原は、初期の中和およびウイルスの侵入ならびに融合の阻止に重要であり、内部抗原は、Ｔ細胞応答、特にＣＴＬに重要である。両方の抗原型は、交差反応免疫および交差保護免疫を誘発することができ、これは、多くの潜在的に興味深い株を持つ、または変異ウイルスによって生じる流感において重要である。

内部抗原は、それらが全てのインフルエンザＡおよびＢウイルスにわたって良好に保存されているため、交差反応性を改善することが予想される。これらの抗原に対する抗体は有用であるが、十分な保護を提供しないため、内部抗原は、ＣＴＬ応答を誘発すると想定される。ＣＴＬ応答単独では、大半の場合、それ自体保護的ではないが、それらは保護の一因となり、一般に疾患対して保護しないが、疾患を軽減する、または死を防止することができる。

ヘテロ亜型のＣＴＬを誘発することが意図される他の既知の構築物とは対照的に、本発明の発明者は、頻繁に使用されるＭ１（基質タンパク質）およびＮＰ（核タンパク質）抗原に加え、ウイルス性ポリメラーゼのＰＢ１サブユニットをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んだ。ＰＢ１は、様々なＭＨＣハプロタイプにわたり、ヒトにおいて、ヘテロ亜型のＣＴＬ応答の好ましい標的であることが示されてきた（Ａｓｓａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，１２２４１−５１）。さらに、ＰＢ１遺伝子はヒトに由来するｖＨ１Ｎ１の唯一の遺伝子であったため、最近のｖＨ１Ｎ１（ブタ流感）は、好ましくはＰＢ１を使用するという本発明の発明者の判断を確認したと思われる。したがって、ウイルスに特に重要なものであり得る。

ＰＢ１、Ｍ１、および／またはＮＰの内部抗原および／またはエピトープ（複数可）は、好ましくは融合タンパク質として発現する。

一実施形態では、組み換えＭＶＡは、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のインフルエンザウイルス遺伝子を含む。「インフルエンザウイルス遺伝子」とは、本明細書で使用されるとき、好ましくは、インフルエンザウイルスオープンリーディングフレームを意味する。好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、９つのインフルエンザ遺伝子を含む。実際、本発明は、例えば３〜４のワクチンにより、１６の血球凝集素（亜型）全てを網羅するために多価ワクチンを想定し、これにより流行ライブラリを構築する。よって、ＭＶＡ系ワクチンは、順応性があり、今後の新しいインフルエンザウイルスの大発生に対抗するための強力なツールである。

一実施形態では、組み換えＭＶＡは、少なくとも４つの異なるＨＡ、１つのＮＡ遺伝子、１つのＭ２遺伝子、１つのＭ１遺伝子、１つのＮＰ遺伝子、および１つのＰＢ１遺伝子を含む。Ｍ１は、ウイルスＲＮＡに結合するタンパク質であり、ウイルス外被の内殻を構成する。Ｍ２は、ウイルスを脱外被し、その内容物（８つのＲＮＡセグメント）を宿主細胞の細胞質に露出させるのを補助するタンパク質である。Ｍ２膜貫通型タンパク質は、効率的な感染に必要なイオンチャネルである（Ｒｏｂｅｒｔ Ｂ．Ｃｏｕｃｈ，Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂａｒｏｎ Ｓ．（ｅｄ．）１９９６ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ ａｔ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，ＩＳＢＮ０−９６３１１７２−１−１）。

組み換えＭＶＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８以上の特定の遺伝子のコピーを含む。具体的には、今後流行をもたらす可能性があるインフルエンザウイルスの亜型を網羅するために、インフルエンザＡのいくつかの（少なくとも２つの）亜型を網羅する多価ワクチンは、包囲種痘（例えば、モデリングによる）または曝露後予防（ＰＥＰ）のために、いくつかの流行の可能性がある候補ウイルス（一般使用予防、ＧＵＰ）に対して流行前に同時に対象を免疫化するのに、または流行が宣言された時に使用されるワクチンを備蓄するのに役立つ。

今までに、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、および少なくとも１つのＢ型が季節的流感ウイルスとして同時流行した。１９７７年以来同時流行しているＨ１Ｎ１は、蔓延しているＨ１Ｎ１亜型としてｖＨ１Ｎ１（ブタ流感）に取って代わり、消滅する可能性が高い。Ｈ３Ｎ２の今後は、今のところ開けているが、これも近い将来に消滅するかもしれない。１９９７年以来、Ｂ−ヤマガタに加え系統Ｂ−ビクトリアからのインフルエンザウイルスＢ（ＩＶＢ）の再出現が生じ、それ以降、両方のＢ系統からのウイルスが同時流行している。

多価のベクターワクチンは、いくつかの季節的ウイルスの同時流行を考慮する多価のワクチンを得るために、いくつかの一価のワクチンを混合する必要性を回避する。これは、その性質上多価である、本発明によって提供される１つのＭＶＡ系構築物において達成することができる。これは、確立されたアプローチと対照的に産生経路を容易にする。

好ましくは、組み換えＭＶＡは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のＨＡ遺伝子を含む。好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、４つの異なるＨＡ遺伝子を含む。別の好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、ビクトリアまたはヤマガタ系等からの、少なくとも２つの異なるＢ型ＨＡタンパク質を含む。

好ましくは、インフルエンザウイルス遺伝子は、完全長遺伝子である。他の実施形態では、遺伝子断片は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の完全長遺伝子を含む。

好ましくは、挿入されたインフルエンザウイルス遺伝子の大きさは、約７００、１０００、１４００、１５００、１７００、または２３００のヌクレオチドである。少なくとも５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、または１５，０００のヌクレオチドのインフルエンザウイルス遺伝子配列を含む組み換えＭＶＡが、特に好ましい。例えば、ＭＶＡゲノムの２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの異なる部位に挿入され、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのプロモータによって制御される、少なくとも１３，７００ヌクレオチドのインフルエンザウイルス遺伝子配列を含む組み換えＭＶＡが特に好ましい。

好ましい実施形態では、４つの異なるＨＡ遺伝子は、天然に、ヌクレオチド配列レベルで７０％もの同一性を有する。好ましい実施形態では、４つの異なるＨＡ遺伝子は、これらの遺伝子がアミノ酸配列に影響を及ぼさない変異で核酸配列を変更することによってヒト細胞で発現するために最適化された後、ヌクレオチド配列レベルで６４％を超えない同一性を有する。好ましい実施形態では、４つの異なるＨＡ遺伝子は、核酸レベルで、５２％〜６４％の同一性を有する。

２つの配列間の同一性パーセントの判断は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ１９９３，ＰＮＡＳ９０，５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを使用して達成される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰのプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、好ましくは、スコア＝１００、ワード長＝１２のＢＬＡＳＴＮプログラムで実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、好ましくは、スコア＝５０、ワード長＝３のＢＬＡＳＴＰプログラムで実施される。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２に記載されるギャップＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、好ましくは、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが使用される。

好ましくは、ＨＡ遺伝子は、異なるＨＡ亜型、即ちＨ１−Ｈ１６からである。一実施形態では、組み換えＭＶＡは、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、および／またはＨ９ Ｈ型のＨＡ遺伝子を含む。一実施形態では、組み換えＭＶＡは、Ｈ３、ｖＨ１のＨＡ遺伝子、および２つのＢ型ＨＡ遺伝子、特に、Ｂ−ＢｒｉｓおよびＢ−Ｙａｍ ＨＡ亜型を含む。

Ｈ９、Ｈ５、Ｈ２、Ｈ７ ＨＡの組み込みにより、ヒトでの感染が証明されている４つの亜型が、本発明のＨＡ−ＭＶＡに組み込まれた。これにより、４つのＨクレードのうちの３つ（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３２５，２８７−２９６）が網羅され、含まれないＨクレードのギャップを埋めることが想定される。Ｈ３（４番目のＨクレード）は、とにかく季節的に流行するため、最良のシナリオは、このクレードが交差保護によりある程度網羅されることであろう。ヘテロ亜型の株に対してワクチンの有効性が低いと予測するかもしれないが、直ぐに入手可能な有効性の低いワクチンが非常に遅れてのみ入手可能な有効性の高いワクチンよりも価値が高いことがモデリングにより明らかになったため、免疫反応を誘発する有効性が低いワクチンでも、大きな価値があるであろう、重度の疾患または死を回避する、そしておそらく伝染を減少させるのに十分である。これは、好ましくは本発明のワクチンによって達成され得る。

さらに好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＨＡ、ＮＡ、および／もしくはＭ２抗原（複数可）、ならびに／またはエピトープ（複数可）をコードする遺伝子を含む。

好ましくは、ＨＡ遺伝子は、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３２５，２８７−２９６で定義される異なるＨＡクレード、即ち、Ｈ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ１１、Ｈ１３、Ｈ１６）、Ｈ９（Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１２）、Ｈ３（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１４）、またはＨ７（Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１５）クレードからである。好ましくは、組み換えＭＶＡは、２つ、３つ、または４つ全てのＨＡクレードのＨＡ遺伝子を含む。好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ７、および／またはＨ９クレードのＨＡ遺伝子を含む。

特に好ましいＨＡ遺伝子は、Ｈ５ Ａ−インドネシア−ＣＤＣ１０４７−２００７、Ｈ２ Ａ−ヒドリガモ−ノルウェー１０ １７８３−２００６、Ｈ９ Ａ−ニワトリ−広東−ＧＺ０２−２００８、Ｈ７ Ａ−アヒル−モンゴル−７２０−２００７、ｖＨ１ Ａ−カルフォルニア／７／２００９、Ｈ３ Ａ−パース−１６−２００９、Ｂ−ブリスベン−０３−２００７、Ｂ−ブリスベン−０３−２００７、およびＢ−フロリダ−０４−２００６である。

特に好ましいＮＡ遺伝子は、Ｎ１ Ａ−インドネシア−ＣＤＣ１０４７−２００７である。特に好ましいＭ２遺伝子は、Ｍ２ Ａ−香港−２６５２−２００６である。特に好ましいＭ１遺伝子は、Ｍ１ Ａ−台湾−８４３−２００７である。特に好ましいＮＰ遺伝子は、ＮＰ Ａ−センダイ−Ｈ−４４１−２００７である。特に好ましいＰＢ１遺伝子は、ＰＢ１ Ａ−センダイ−Ｈ−４４１−２００７である。

好ましくは、ＭＶＡ構築物におけるＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、任意の２つのＨＡ遺伝子間の同一性％を６５％未満に減少させるように変更される。例えば、Ｈ２遺伝子およびＨ５遺伝子のヌクレオチド配列は、これらの遺伝子間の核酸同一性を７０％から６４％に減少させるように変更され得る。好ましくは、アミノ酸配列を変更しない、および／または好ましくはヒト細胞のコドンを使用する保存的変異が使用される。

好ましくは、組み換えＭＶＡは、機能ＮＡタンパク質を発現する。機能ＮＡタンパク質は、組み換えウイルスの産生中、より良好なウイルスの収率を促進することができる。したがって、ＭＶＡに機能ＮＡタンパク質を発現させるために、遺伝子は、異なる遺伝子間領域に、または別個のプロモータの制御下で別個の転写単位としてのいずれかで、かつ融合タンパク質の一部としてではなく別個の挿入部位に入れられた。この態様外で、ノイラミニダーゼは、好ましくは、免疫応答の幅を増加させるために、抗原としても作用する。

あまり好ましくないが、インフルエンザ配列は、本発明のＭＶＡベクターに全体として存在する必要がなくてもよい。本発明によると、完全長タンパク質のみ、またはエピトープもしくは複数のエピトープのみ、または全ての可能な組み合わせを、組み換えウイルスによって発現させることができる、即ち、組み換え体は、抗原のうちの１つ以上の、１つ以上のエピトープを含んでもよい。例として、組み換えウイルスは、第１の内部抗原全体、第２の内部抗原の１つ以上のエピトープ、第１の外部抗原の１つ以上のエピトープ、および完全な第２の外部抗原を発現してもよい。同様に、組み換えＭＶＡベクターは、第１の内部抗原の１つ以上のエピトープ、第２の完全長内部抗原、第３の内部抗原の１つ以上のエピトープ、完全な第１の外部抗原、および第２の外部抗原の１つ以上のエピトープ等を発現してもよい。２つ以上のエピトープが好ましい。

また、インフルエンザ配列は、例えばより良好に発現させる、またはより安定するために、コドン最適化され得る。

様々な好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＩＬ−１５をコードする遺伝子を含まない。

ＭＶＡへの組み込み部位
本発明は、ＭＶＡゲノムの様々な挿入部位に組み込まれたインフルエンザウイルス遺伝子を含む組み換えＭＶＡを包含する。「様々な挿入部位」とは、外部および内部抗原ならびに／またはそのエピトープをコードするインフルエンザウイルス遺伝子がそれぞれＭＶＡゲノムの同じまたは１つ以上の異なる挿入部位に挿入され得ることを意味するが、異なる挿入部位が好ましい。異なるとは、例えば、第１の挿入部位が第２の挿入部位と同じではないことを意味する。挿入部位および挿入部位の数に関する詳細は、本明細書で以下に記載される。

インフルエンザウイルス遺伝子は、実施例に示されるように、別個の転写単位として、または融合遺伝子として組み換えＭＶＡに挿入され得る。実際、最大４つの高度に相同の遺伝子を含有するＭＶＡは、安定していることが知られている（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４６号を参照）。したがって、ＭＶＡは、本明細書に記載されるように、血球凝集素遺伝子等の高度に相同の遺伝子を取り込むのに適している。

一実施形態では、インフルエンザウイルス遺伝子は、ＭＶＡの遺伝子間領域に挿入される。好ましい実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択され、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、および／またはＩＧＲ１４８／１４９は、特に好ましい。好ましい実施形態では、ＨＡ遺伝子は、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、および／またはＩＧＲ１４８／１４９に挿入される。好ましくは、組み換えＭＶＡの５つ、４つ、３つ、または２つ未満のＩＧＲは、インフルエンザウイルス遺伝子を含む。特に好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、１つ、２つ、３つ、または４つのＩＧＲに挿入された３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のＨＡ遺伝子を含む。

一実施形態では、インフルエンザウイルス遺伝子は、天然の欠失部位であるＭＶＡのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩに挿入される。さらに別の実施形態では、インフルエンザ遺伝子は、天然の欠失部位であるＩＩＩに挿入されないことが好ましい。

インフルエンザウイルス遺伝子を含有するＭＶＡの挿入部位の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ以上であり得る。好ましい実施形態では、組み換えＭＶＡは、４つ、３つ、２つ以下の挿入部位に挿入されたインフルエンザウイルス遺伝子を含む。最も好ましくは、２つまたは４つの挿入部位が使用される。季節的流感ワクチンについては、２つの部位が最も好ましく使用され、例えば図８を参照のこと。つまり、外部抗原をコードする２つのインフルエンザウイルス遺伝子は、第１の部位に挿入され、内部抗原をコードするインフルエンザウイルス遺伝子は、第２の部位（第１の部位とは異なる）に挿入される。同様に、４つの挿入部位は、流行性または流行前流感ワクチンに最も好ましく使用され、例えば、図５を参照のこと。つまり、第１のＨＡ遺伝子は、第１の部位に挿入され、ＮＡ遺伝子および第２のＨＡ遺伝子は、第２の部位に挿入され、第３のＨＡ遺伝子およびＭ２遺伝子は、第３の部位に挿入され、第４のＨＡ遺伝子ならびにＭ１、ＰＢ−１およびＮＰ遺伝子は、第４の部位に挿入される。Ｍ１、ＰＢ−１、およびＮＰ遺伝子は、好ましくは、融合として発現する。しかしながら、組み換えＭＶＡは、２つ、３つ、または４つの挿入部位に挿入された少なくとも６つ、７つ、８つ、または９つの遺伝子を含むことも好ましい。

好ましくは、ＮＡ遺伝子は、別個の転写単位として組み換えＭＶＡに挿入される。より好ましくは、ＮＡ遺伝子は、ＩＧＲ６４／６５または１４８／１４９に挿入される。組み換えＭＶＡによる機能ＮＡタンパク質の発現は、組み換えウイルスの産生中、より良好な収率を促進し、保護の一因となる「許容免疫」を誘発できるインフルエンザウイルスの抗原を表すことができる。したがって、ＮＡ遺伝子は機能ＮＡタンパク質をコードすることが好ましい。

好ましくは、Ｍ１、ＰＢ１、およびＮＰ遺伝子は、実施例に示されるように、融合遺伝子として組み換えＭＶＡに挿入される。より好ましくは、Ｍ１、ＰＢ１、およびＮＰ遺伝子は、ＩＧＲ１４８／１４９に挿入される。

好ましくは、Ｍ２遺伝子は、別個の転写単位として組み換えＭＶＡに挿入される。より好ましくは、Ｍ２遺伝子は、ＩＧＲ８８／８９に挿入される。

組み換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において既知の慣用的方法によって生成され得る。例えば、ＭＶＡウイルスは、実施例に記述される手順に従い生成され得る。

組み換えポックスウイルスを得るため、または外因性コード配列をポックスゲノムに挿入するための方法は、当業者に周知である。例えば、本方法は、以下の参考文献に記載されており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ２００３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓは、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウェスタンブロッド解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ増幅技法等の標準的な分子生物学の技術の技法を説明している。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｒｉａｎ Ｗ Ｊ Ｍａｈｙ ａｎｄ Ｈｉｌｌａｒ Ｏ Ｋａｎｇｒｏ１９９６，．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓは、ウイルスの取り扱いおよび操作についての技法を説明している。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＡＪ Ｄａｖｉｓｏｎ ａｎｄ ＲＭ Ｅｌｌｉｏｔｔ １９９３，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ９，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ １９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１６，ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒは、ＭＶＡの取り扱い、操作、および遺伝子工学についての技法および専門的知識を説明している。

本発明による組み換えポックスウイルスの生成において、異なる方法が適用可能であってもよい。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡの部分に相同なＤＮＡが挿入される大腸菌プラスミド構築物の中に配置され得る。別個に、挿入されるＤＮＡ配列は、プロモータに連結され得る。プロモータ−遺伝子連結は、プロモータ−遺伝子連結が非必須遺伝子座を含有するポックスウイルスＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列に相同なＤＮＡによって両端上に隣接するように、プラスミド構築物に位置付けられ得る。得られたプラスミド構築物は、大腸菌細菌内での増殖によって増幅され、単離され得る。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドは、細胞培養物、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に、ポックスウイルスによるこの培養物の感染とともに、形質移入され得る。プラスミドの相同ポックスウイルスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組み換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列の存在により改変されたポックスウイルスを生成することができる。

好ましい実施形態によると、適切な細胞培養物の細胞、例えばＣＥＦ細胞は、ポックスウイルスに感染させることができる。感染した細胞は、続いて、好ましくはポックスウイルス発現制御要素の転写制御下で、外来遺伝子または複数の遺伝子を含む第１のプラスミドベクターを形質移入され得る。上記で説明されるように、プラスミドベクターは、外因性配列のポックスウイルスゲノムの選択された部分への挿入を方向付けることができる配列も含む。任意に、プラスミドベクターは、マーカーおよび／またはポックスウイルスプロモータに機能的に連結された選択遺伝子を含むカセットも含有する。適切なマーカーまたは選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシターゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、または他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用は、生成された組み換えポックスウイルスの識別および単離を簡略化する。しかしながら、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても識別され得る。続いて、さらなる細胞を、上述のように得られた組み換えポックスウイルスに感染させ、第２の外来遺伝子または複数の遺伝子を含む第２のベクターを形質移入することができる。この遺伝子がポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入され得る場合、第２のベクターは、第２の外来遺伝子または複数の遺伝子のポックスウイルスのゲノムへの組み込みを方向付けるポックスウイルス−相同配列においても異なる。相同組み換えが生じた後、２つ以上の外来遺伝子を含む組み換えウイルスが単離され得る。さらなる外来遺伝子を組み換えウイルスに導入するために、感染のために前のステップで単離された組み換えウイルスを使用することにより、かつ形質移入のためにさらなる外来遺伝子または複数の遺伝子を含むさらなるベクターを使用することにより、感染および形質移入のステップが繰り返され得る。

代替的に、上述の感染および形質移入のステップは互換性がある、即ち、適切な細胞を、最初に外来遺伝子を含むプラスミドベクターによって形質移入した後、ポックスウイルスに感染させることができる。さらなる代替として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、細胞を得られた組み換えウイルス全てと同時形質移入し、全ての外来遺伝子を含む組み換え体をスクリーニングすることも可能である。第３の代替例は、生体外でのＤＮＡゲノムおよび外来配列の連結、ならびにヘルパーウイルスを使用した組み換えたワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。第４の代替例は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローン化されたワクシニアウイルスゲノムと、ワクシニアウイルスゲノムの所望の組み込み部位に隣接する配列と相同なＤＮＡ配列と隣接する直鎖状外来配列との間での、大腸菌または別の細菌種における相同組み換えである。

組み換えウイルスを生成するために使用される好ましいＭＶＡ株は、好ましくは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において生殖複製の能力を有するが、ヒトケラチノサイト細胞系ＨａＣａＴ、ヒト骨の骨肉腫細胞系１４３Ｂ、およびヒト頚部腺癌細胞系ＨｅＬａにおいて生殖複製の能力を持たない。

好ましくは、ＭＶＡ骨格株は、その株と同じ成長特徴を有し、その試料は、受託番号Ｖ０００８３００８によりＥＣＡＣＣに受託された。

ＨｅＬａおよびＨａＣａＴ細胞系において、ＭＶＡ５７５より少なくとも３倍低いウイルス増幅率を有するＭＶＡウイルスならびに／またはＣＥＦ細胞において、５００を超える増幅率を有するウイルスも好ましい。

インフルエンザウイルス遺伝子の発現
一実施形態では、インフルエンザウイルス遺伝子もしくは複数の遺伝子またはエピトープ（複数可）のうちの１つ、２つ以上、または全ての発現は、１つ以上のポックスウイルスプロモータの制御下にあり、２つ以上のポックスウイルスプロモータの使用が好ましい。好ましい実施形態では、ポックスウイルスプロモータは、国際特許公開第ＷＯ２０１０／１０２８２２号もしくは国際特許公開第ＷＯ２００５／０５４４８４号に記載されるプロモータのうちの１つ等の、Ｐｒ７．５プロモータ、ハイブリッド初期／後期プロモータ、ＰｒＳプロモータ、合成または天然の初期もしくは後期のプロモータ、または牛痘ウイルスＡＴＩプロモータである。好ましくは、国際特許公開第ＷＯ２０１０／１０２８２２号（図１ｂを参照）に記載されるように、ｐＳまたはｐＨｙｂプロモータが使用される。

インフルエンザ遺伝子（複数可）は、単一転写単位として発現することができる。例えば、インフルエンザ遺伝子（複数可）は、ワクシニアウイルスプロモータに機能的に連結され得て、および／またはワクシニアウイルス転写ターミネータに連結され得る。一実施形態では、１つ以上のインフルエンザ遺伝子は、融合タンパク質として発現する。

「転写単位」は、単独で、ＭＶＡゲノムの挿入部位に挿入され得る。「転写単位」は、他の転写単位（複数可）を用いてＭＶＡゲノムの挿入部位に挿入され得る。「転写単位」は、ＭＶＡゲノムにおいて天然に生じず（即ち、異種もしくは外因性もしくは外来）、感染細胞での転写が可能である。

好ましくは、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡゲノムに挿入される３、４、５、６、７、８、９、１０以上の転写単位を含む。一実施形態では、組み換えＭＶＡは、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の転写単位によりコードされるインフルエンザタンパク質を安定的に発現する。

様々な実施形態では、組み換えＭＶＡは、ＭＶＡゲノムの１、２、３、４、５、６以上の挿入部位でＭＶＡゲノムに挿入される３、４、５、６、７、８、９、１０以上の転写単位を含む。

ＨＡ−ＭＶＡウイルスを含むワクチン
本発明による組み換えＨＡ−ＭＶＡウイルスは、高度に複製が制限され、したがって高度に弱毒化されるため、ヒトおよびさらには免疫不全のヒトも含む広範な哺乳類の治療の理想的な候補である。さらに、ＭＶＡは便宜上ＣＥＦ細胞中で培養されるため、ＨＡ−ＭＶＡ系ワクチンの産生は、従来のインフルエンザワクチンに対する既存の産生能とおおよそ無関係である。よって、本発明のＨＡ−ＭＶＡ系ワクチンは、流行、または流行となる可能性があるかもしれない季節的流感の場合に重要となり得る短期間で、大量に産生され得る。さらに、本発明のＭＶＡベクターワクチンは、複数のインフルエンザウイルス抗原を送達することができ、よって、多価ワクチンを開発する可能性を提供する、高レベルの体液性および細胞性免疫の同時誘発を可能にする。よって、本発明は、ヒトを含む生存動物体に免疫応答を誘発するための薬学的組成物およびワクチンも提供する。

ワクチンは、好ましくは１０^４〜１０^９ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲、好ましくは１０^５〜５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲、より好ましくは１０^６〜１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲、最も好ましくは１０^７〜１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲のＨＡ−ＭＶＡウイルスを含む。

ヒトにおける好ましいワクチン用量は、１０^６〜１０^９ ＴＣＩＤ_５０、最も好ましくは１０^６ＴＣＩＤ_５０、または１０^７ＴＣＩＤ_５０、または１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量を含む。

薬学的組成物は、一般に、１つ以上の薬学的に許容されるおよび／もしくは承認された添加剤、担体、ならびに／または希釈剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、および／もしくは安定剤を含んでもよい。そのような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物質等であり得る。適切な担体は、典型的に、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物等の、大きく、ゆっくり代謝される分子である。

「薬学的に許容される」という用語は、本発明によるＭＶＡの生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性材料を意味する。担体の特徴は、投与経路に依存する。薬学的組成物は、治療における活性または使用のいずれかを強化する他の薬剤をさらに含有してもよい。そのような追加因子および／または薬剤は、相乗効果を産生するために、または副作用を最小にするために、本発明による免疫化のための方法に適用される薬学的組成物に含まれ得る。本発明によるＭＶＡの製剤化および投与の技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍｕｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）に見出すことができる。

ワクチンの調製において、本発明による組み換えＨＡ−ＭＶＡウイルスは、生理学的に許容される形態に変換され得る。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づき行われ得る（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．１９７４，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載される）。

例えば、精製されたウイルスは、約１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４に製剤化された５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの力価で、−８０℃で保管され得る。ワクチン注射の調製において、例えば、１０^２−１０^８粒子のウイルスが、アンプル、好ましくはガラスアンプルに、２％のペプトンおよび１％のヒトアルブミンの存在下の１００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に凍結乾燥され得る。代替的に、ワクチン注射は、製剤にウイルスを段階的凍結乾燥することにより産生され得る。この製剤は、生体内投与に適したマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、もしくはポリビニルピロリドン等のさらなる添加剤、または抗酸化剤等の他の補助剤、あるいは不活性ガス、安定剤もしくは組み換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含有することができる。次いで、ガラスアンプルは、密封され、数ヶ月、４℃〜室温で保管され得る。しかしながら、必要がない限り、アンプルは、好ましくは−２０℃より低い温度で保管される。

ワクチン接種または治療において、凍結乾燥物は、水溶液、好ましくは生理学的食塩水もしくはトリス緩衝液に溶解され、全身的または局所的のいずれかで、即ち非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または当業者に既知の他の投与経路で投与され得る。投与方法、用量、および投与回数は、既知の様式で、当業者により最適化され得る。しかしながら、最も一般的な患者は、最初のワクチン接種の注射から約１ヶ月から６週間後の２回目の注射でワクチン接種される。

季節的流感ワクチンにおいて、複数のインフルエンザウイルスからのＨＡ抗原を含む多価のＨＡ−ＭＶＡが好ましい。例えば、ＭＶＡは、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、ｖＨ１Ｎ１から、ならびにＢ−ビクトリアおよび／またはＢ−ヤマガタ系統の株からのＨＡ抗原を含むことができる。三価および四価のワクチンが特に好ましい。好ましくは、ワクチンは、インフルエンザＡおよびＢのうちの少なくとも３つの季節的亜型に対して広く反応性である。季節的流感ワクチンは、好ましくは、強いＣＴＬ応答を誘発するために、内部インフルエンザウイルス抗原を含む。

最も好ましい実施形態では、ワクチンは、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２、ＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１抗原を含む。好ましくは、インフルエンザウイルス抗原は、ＭＶＡの２つまたは３つの挿入部位に挿入される。最も好ましくは、ワクチンの季節的インフルエンザウイルス株の遺伝的推移への適応を容易にするために、Ａ型のＨＡ遺伝子および１つのＢ型のＨＡ遺伝子が、組み換えゲノムの単一部位に挿入される。季節的流感ワクチンは、好ましくは、５歳、４歳、３歳、または２歳未満の未感作の小児を予備刺激するために、ならびに感作済の小児および成人を追加免疫するために使用される。

流行性流感ワクチンにおいて、複数のインフルエンザＡ型ウイルスからのＨＡ抗原を含む多価のＨＡ−ＭＶＡが好ましい。例えば、ＭＶＡは、Ｒｕｓｓｅｌｌら２００４によると、４つのＨＡクレード（即ち、Ｈ９、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ７クレード）のうちの少なくとも２つからのＨＡ抗原を含むことができる。例えば、ＭＶＡは、Ｈ９、Ｈ５、Ｈ２、およびＨ７のＨＡ抗原を含むことができる。３つまたは４つのワクチンにより１６全てのＨＡ亜型を網羅することができるワクチンのライブラリを構築することができる。三価および四価のワクチンが特に好ましい。流行性流感のワクチンは、好ましくは、強いＣＴＬ応答を誘発するために、内部インフルエンザウイルス抗原を含む。

最も好ましい実施形態では、ワクチンは、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ２、ＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１抗原を含む。好ましくは、インフルエンザウイルス抗原は、ＭＶＡの２つ、３つ、４つ、または５つの挿入部位に挿入される。流行性流感ワクチンは、好ましくは、流行前ワクチンとして、早期応答者のための標的ワクチン接種として、または曝露後予防として投与される。

ＨＡ−ＭＶＡウイルスを含むキット
本発明は、ＨＡ−ＭＶＡウイルスを含むキットをさらに提供する。キットは、対象にウイルスを投与するための説明書とともに、１つもしくは複数のＨＡ−ＭＶＡウイルスの容器またはバイアルを含むことができる。好ましい実施形態では、対象はヒトである。説明書は、ＨＡ−ＭＶＡウイルスが単一投与量または複数（即ち、２、３、４等）投与量で対象に投与されることを示す。説明書は、ＨＡ−ＭＶＡウイルスが未感作または感作済の対象に初回（予備刺激）および二回目（追加免疫）投与で投与されることを示す。

したがって、または代替的に、本発明は、第１のバイアル／容器に初回接種（「予備刺激接種」）用、および第２のバイアル／容器に二回目接種（「追加免疫接種」）用の組み換えＭＶＡウイルスおよび／または組み換えＭＶＡウイルスを含むワクチンもしくは薬学的組成物を含む予備刺激／追加免疫化のためのキットを提供する。

本発明は、ワクチンを含むワクチン接種キット、ワクチンを含む充填済シリンジ、ならびに他の保存および適用方法にも関する。

ＨＡ−ＭＶＡウイルスによる免疫化の方法
本発明による免疫化のための方法は、治療有効量のＭＶＡを用いる。治療有効用量はさらに、症状の回復、例えばそのような症状の治療、治癒、予防、または回復をもたらすのに十分なその化合物／成分の量を指す。好ましい実施形態では、免疫化は、予防的および／または治療的の両方であってもよい。

本発明は、鳥類を含む対象動物を免疫化するための方法を提供する。好ましくは、動物は、ラット、ウサギ、ブタ、マウス、およびヒトを含む哺乳類であり、ＨＡ−ＭＶＡの投与量を対象に投与することを含む。

最も好ましくは、対象はヒトである。一実施形態では、対象は成人である。他の実施形態では、対象の年齢は、５歳未満、３歳未満、２歳未満、１５ヶ月未満、１２ヶ月未満、９ヶ月未満、６ヶ月未満、または３ヶ月未満であり得る。他の実施形態では、対象の年齢は、０〜３ヶ月、３〜６ヶ月、６〜９ヶ月、９〜１２ヶ月、１〜２歳、または２歳を超える、例えば２〜５歳からであり得る。

好ましくは、１０^６〜１０^９ＴＣＩＤ_５０のＨＡ−ＭＶＡの投与量が対象に投与される。より好ましくは、１０^６〜５×１０^８ＴＣＩＤ_５０の投与量が対象に投与される。最も好ましくは、１０^７〜１０^８ＴＣＩＤ_５０の投与量が対象に投与される。ヒトにおける好ましい投与量は、１０^７ＴＣＩＤ_５０または１０^８ＴＣＩＤ_５０のＨＡ−ＭＶＡウイルスを含む。

ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、単一投与量または複数（即ち、２、３、４等）投与量で、対象、特に未感作の対象に投与され得る。ＨＡ−ＭＶＡウイルスは、初回（予備刺激）および二回目（追加免疫）投与で投与され得る。一実施形態では、初回投与量は、１０^７〜１０^８ＴＣＩＤ_５０のＨＡ−ＭＶＡウイルスを含み、二回目投与量は、１０^７〜１０^８ＴＣＩＤ_５０のＨＡ−ＭＶＡウイルスを含む。

免疫化は、全身的または局所的のいずれか、即ち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または当業者に既知の任意の他の投与経路で投与され得る。

本発明によるワクチンは、特に、ヒトを含む免疫不全の対象の免疫化に適している。

生体外／エクスビボおよび／または生体内のいずれかの本発明による組み換えＭＶＡを含む細胞が、本発明によりさらに包含される。例えば、生体外細胞は、組み換えウイルスが、それぞれ、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞などで増幅され、産生される細胞系であってもよい。
なお、本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る：
１．少なくとも２つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも２つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、前記抗原および／またはそのエピトープ（複数可）をコードする遺伝子が、少なくとも２つのＭＶＡ挿入部位に挿入される、改変ワクシニアウイルスアンカラ。
２．前記ＭＶＡウイルスは、少なくとも３つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも２つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する、上記１に記載のＭＶＡウイルス。
３．前記ＭＶＡウイルスは、少なくとも３つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも３つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する、上記１または２に記載のＭＶＡウイルス。
４．前記ＭＶＡウイルスは、少なくとも６つの外部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも６つの抗原のうちの１つ以上のエピトープならびに少なくとも３つの内部インフルエンザウイルス抗原および／または前記少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上のエピトープを発現する、上記１〜３のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
５．前記少なくとも２つの外部抗原および／または前記少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープ（複数可）は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２からなる群から選択される、上記１〜４のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
６．前記外部抗原は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２、ならびに／または前記抗原のうちの１つ以上のエピトープである、上記１〜５のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
７．前記少なくとも２つの内部抗原および／または前記少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上のエピトープ（複数可）は、ＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１からなる群から選択される、上記１〜６のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
８．前記内部抗原は、ＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１、ならびに／または前記抗原のうちの１つ以上のエピトープである、上記１〜７のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
９．前記内部抗原であるＰＢ１、ＮＰ、およびＭ１、ならびに／または前記抗原のうちの１つ以上のエピトープ（複数可）は、融合タンパク質として発現する、上記８に記載のＭＶＡ。
１０．前記ＭＶＡウイルスは、４つの異なるＨＡタンパク質および／または前記タンパク質のうちの１つ以上のエピトープを発現する、上記１〜９のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
１１．前記ＨＡタンパク質は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９、ならびに／または前記タンパク質のうちの１つ以上のエピトープである、上記１０に記載のＭＶＡウイルス。
１２．前記ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ３、および２つのＢ型ＨＡタンパク質、ならびに／または前記タンパク質のうちの１つ以上のエピトープである、上記１０に記載のＭＶＡウイルス。
１３．前記組み換えウイルスを生成するために使用される前記ＭＶＡウイルスは、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの変異体である、上記１〜１２のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
１４．前記インフルエンザウイルス抗原の前記発現は、２つ以上のポックスウイルスプロモータの制御下にある、上記１〜１３のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
１５．前記遺伝子は、ＭＶＡゲノムの少なくとも２つの遺伝子間領域に挿入される、上記１〜１４のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス。
１６．前記遺伝子間領域は、前記ＭＶＡウイルスのＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される、上記１５に記載のＭＶＡウイルス。
１７．上記１〜１６のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルスならびに薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または添加剤を含む、ワクチンまたは薬学的組成物。
１８．薬剤またはワクチンを調製するための、上記１〜１６のいずれか１項に記載のＭＶＡの使用。
１９．ヒトを含む対象を治療するための方法であって、上記１〜１６のいずれか１項に記載のＭＶＡおよび／または上記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物を、前記ヒトを含む前記対象に投与することを含む、方法。
２０．ヒトを含む対象のインフルエンザの治療もしくは予防に使用するための、上記１〜１６のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス、上記１７に記載の前記ワクチンもしくは薬学的組成物、上記１８に記載の使用、および／または上記１９に記載の方法。
２１．前記ヒトを含む前記対象は、２歳より大きい、上記１９もしくは２０に記載の方法、ならびに／あるいは上記２０に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。
２２．前記ヒトを含む前記対象は、２歳未満である、上記１９もしくは２０に記載の方法、ならびに／あるいは上記２０に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。
２３．前記ＭＶＡウイルスおよび／またはワクチンもしくは薬学的組成物は、未感作対象に単回または複数回投与で投与される、上記１９〜２２のいずれか１項に記載の方法、ならびに／あるいは上記２０〜２２のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。
２４．前記ヒトを含む前記対象は、免疫不全である、上記１９〜２３のいずれか１項に記載の方法、ならびに／あるいは上記２０〜２３のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。
２５．前記ＭＶＡウイルスおよび／またはワクチンもしくは薬学的組成物は、初回接種（「予備刺激接種」）および二回目接種（「追加免疫接種」）で、治療有効量で投与される、上記１９〜２４のいずれか１項に記載の方法、ならびに／あるいは上記２０〜２４のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス、ワクチンもしくは薬学的組成物、および／または使用。
２６．第１のバイアル／容器に初回接種（「予備刺激接種」）用、および第２のバイアル／容器に二回目接種（追加免疫接種」）用の、上記１〜１６のいずれか一項に記載のＭＶＡウイルスおよび／または上記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物を含む、予備刺激／追加免疫化のためのキット。
２７．上記１〜１６のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルス、および／または上記１７に記載のワクチンもしくは薬学的組成物の１つもしくは複数のバイアルと、前記ウイルスを対象に投与するための説明書とを含む、キット。
２８．上記１〜１６のいずれか１項に記載のＭＶＡウイルスを含む、細胞。

実施例１． ＭＶＡ−ＰａｎＦｌｕの生成
ＭＶＡ−ＰａｎＦｌｕ構築物は、ＭＶＡ−ＢＮに基づき、相同組み換えを介して外来遺伝子を４連続挿入することにより生成された。選択遺伝子は、さらなる組み換え反応により除去された。得られたウイルスストック（Ｐｒｅｍａｓｔｅｒ）は、ウイルスの同一性、野生型または前駆体ウイルスの不在、選択遺伝子の不在、挿入物の正確な挿入、およびＲＴ−ＰＣＲによる挿入物の転写について広範囲にわたって試験された。全挿入物の配列および周囲ＭＶＡ配列を検証した。

実施例２．ＭＶＡ−ｍＢＮ２０８Ａの生成
ＭＶＡ−ＢＮの株に基づく組み換えＭＶＡを生成するために、外来遺伝子のＩＧＲ６４／６５（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４５号に記載される、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子６４と６５との間の遺伝子間領域）中への組み込みのための組み換えプラスミドは、それぞれがポックスウイルス発現のためのプロモータの制御下で、ノイラミニダーゼ遺伝子およびＨ２遺伝子を含有するように操作された。この組み換えプラスミドｐＢＮ３６７（図２）は、ＭＶＡ−ＢＮを含むＣＥＦ細胞の相同組み換えに使用された。得られた組み換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２０８Ａは、２回プラーク精製され、次の挿入を組み込むための基礎として使用された。選択カセットを、ＭＶＡ−ｍＢＮ２０９Ｂの生成中に欠失させた。一般に、ウイルス名の最後の文字の「Ａ」は、なおも選択カセットを含有する組み換えウイルスを示し、一方、ウイルス名の最後の文字の「Ｂ」は、選択カセットを欠失させたウイルスを示す。

実施例３．ＭＶＡ−ｍＢＮ２０９Ｂの生成
組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２０９Ｂ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２０８Ａに基づく）を生成するために、外来遺伝子のＩＧＲ８８／８９（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４５号に記載される、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子８８と８９との間の遺伝子間領域）中への組み込みのための組み換えプラスミドは、それぞれがポックスウイルス発現のためのプロモータの制御下で、Ｈ９遺伝子およびＭ２遺伝子を有するように操作された。この組み換えプラスミドｐＢＮ３６８（図３）は、ＭＶＡ−ｍＢＮ２０８Ａを含むＣＥＦ細胞の相同組み換えに使用された。得られた組み換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２０９Ｂは、選択遺伝子の損失後、５回プラーク精製され、次の挿入を組み込むための基礎として使用された。適切なウイルス価（少なくとも１×１０^７ウイルス粒子／ｍｌを意味する）によるＭＶＡ−ｍＢＮ２０９のＰｒｅｍａｓｔｅｒの産生は、４．６×１０^７／ｍｌのウイルス価により最終Ｐｒｅｍａｓｔｅｒが生成され得る前に、数回の追加増幅を必要とした。

実施例４．ＭＶＡ−ｍＢＮ２０７Ｂの生成
組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２０７Ｂ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２０９Ｂに基づく）を生成するために、外来遺伝子のＩＧＲ１４８／１４９（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４５号に記載される、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子１４８と１４９との間の遺伝子間領域）中への組み込みのための組み換えプラスミドは、それぞれがポックスウイルス発現のためのプロモータの制御下で、Ｈ５遺伝子および融合遺伝子（Ｍ１、ＰＢ１、およびＮＰからなる）を有するように操作された。この組み換えプラスミドｐＢＮ３６６（図１）は、ＭＶＡ−ｍＢＮ２０９Ｂを含むＣＥＦ細胞の相同組み換えに使用された。得られた組み換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２０７Ｂは、選択遺伝子の損失後、７回プラーク精製され、次の挿入を組み込むための基礎として使用された。

最適な産生条件を識別するために、成長研究が行われなければならなかった。２．８７×１０^７／ｍｌの力価は、４日間、ｐＨ５．２のＶＰ−ＳＦＭ培地中で、３０℃でＭＯＩ＝０．１で感染後、達成することができた。

実施例５．ＭＶＡ−ｍＢＮ２１０Ｂの生成
組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２１０Ｂ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２０７Ｂに基づく）を生成するために、外来遺伝子のＩＧＲ４４／４５（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４５号に記載される、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子４４と４５との間の遺伝子間領域）中への組み込みのための組み換えプラスミドは、ポックスウイルス発現のためのプロモータの制御下で、Ｈ７遺伝子を有するように操作された。この組み換えプラスミドｐＢＮ３９５（図４）は、ＭＶＡ−ｍＢＮ２０７を含むＣＥＦ細胞の相同組み換えに使用された。得られた組み換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２１０（図５）は、選択遺伝子の損失後、５回プラーク精製された。４．３×１０^７ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの適切なウイルス価のｐｒｅｍａｓｔｅｒウイルスストックは、３０℃で生成することができた。

実施例６．ＭＶＡ−ＦｌｕＳｅａｓｏｎａｌの生成
ＭＶＡ−ＦｌｕＳｅａｓｏｎａｌ構築物であるＭＶＡ−ｍＢＮ２４２（図８）は、ＭＶＡ−ＢＮに基づき、相同組み換えを介して外来遺伝子を２連続挿入することにより生成された。選択遺伝子は、さらなる組み換え反応により除去される。

実施例７．ＭＶＡ−ｍＢＮ２４１Ａの生成
ＭＶＡ−ＢＮの株に基づく組み換えＭＶＡを生成するために、外来遺伝子のＩＧＲ１４８／１４９（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４５号に記載される、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子１４８と１４９との間の遺伝子間領域）中への組み込みのための組み換えプラスミドは、（１）インフルエンザウイルスＢ型ヤマガタ系統（Ｂ／フロリダ／４／２００６）のＨＡ遺伝子、および（２）Ｍ１、ＰＢ１、およびＮＰからなる融合遺伝子、および（３）ノイラミニダーゼ遺伝子、および（４）Ｍ２遺伝子を有するように操作され、それぞれ、ポックスウイルス発現のためのプロモータの制御下にあった。この組み換えプラスミドｐＢＮ４１８（図７）は、ＭＶＡ−ＢＮを含むＣＥＦ細胞の相同組み換えに使用された。得られた組み換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２４１Ａは、２回プラーク精製され、次の挿入を組み込むための基礎として使用された。２つの挿入物を有するＭＶＡ−ｍＢＮ２４２の生成において、選択カセットを、ＭＶＡ−ｍＢＮ２４２Ｂの生成中に欠失させる。１つの挿入物を有する組み換えウイルスであるＭＶＡ−ｍＢＮ２４１Ｂの生成において、選択カセットを、相同組み換えの第２のステップで欠失させた。

実施例８．ＭＶＡ−ｍＢＮ２４２Ｂの生成
ＭＶＡ−ＢＮの株に基づく組み換えＭＶＡを生成するために、外来遺伝子のＩＧＲ８８／８９（国際特許公開第ＷＯ０３／０９７８４５号に記載される、ＭＶＡ−ＢＮの遺伝子８８と８９との間の遺伝子間領域）中への組み込みのための組み換えプラスミドは、それぞれポックスウイルス発現のためのプロモータの制御下で、（１）Ｈ３遺伝子、および（２）ｖＨ１遺伝子、および（３）インフルエンザウイルスＢ型ビクトリア系統（Ｂ／ブリスベン／６０／２００８）のＨＡ遺伝子を有するように操作された。この組み換えプラスミドｐＢＮ４１７（図６）は、ＭＶＡ−ｍＢＮ２４１Ａを含むＣＥＦ細胞の相同組み換えに使用された。得られた組み換えウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２４２Ａは、プラーク精製された。選択カセットを、ＭＶＡ−ｍＢＮ２４２Ｂの生成中、組み換えを介して欠失させた。季節的流感ワクチンとして使用するための組み換えウイルスは、図８に示される。

Claims (12)

1. ＨＡ、ＮＡおよびＭ２からなる群から選択される少なくとも６つの外部インフルエンザウイルス抗原ならびにＰＢ１、ＮＰおよびＭ１からなる群から選択される少なくとも３つの内部インフルエンザウイルス抗原を発現し、ａ）ヘマグルチニン２（Ｈ２）、ヘマグルチニン９（Ｈ９）、ヘマグルチニン５（Ｈ５）およびヘマグルチニン７（Ｈ７）からなるＨＡタンパク質群、あるいは、ｂ）ヘマグルチニン１（Ｈ１）、ヘマグルチニン３（Ｈ３）および２つのＢ型ＨＡからなるＨＡタンパク質群のいずれかのＨＡタンパク質群を発現する、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、前記抗原をコードする遺伝子が少なくとも２つのＭＶＡ挿入部位に挿入されている、改変ワクシニアウイルスアンカラ。
2. 前記外部インフルエンザウイルス抗原は、ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２である、請求項１に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
3. 前記内部インフルエンザウイルス抗原がＰＢ１を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
4. 前記内部インフルエンザウイルス抗原は、ＰＢ１、ＮＰおよびＭ１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
5. 前記内部インフルエンザウイルス抗原であるＰＢ１、ＮＰおよびＭ１が融合タンパク質として発現する、請求項４に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
6. 前記改変ワクシニアウイルスアンカラを生成するために使用されるＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
7. 前記外部および内部インフルエンザウイルス抗原の前記発現は、２つ以上のポックスウイルスプロモータの制御下にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
8. 前記遺伝子は、ＭＶＡゲノムの少なくとも２つの遺伝子間領域に挿入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
9. 前記遺伝子間領域は、前記改変ワクシニアウイルスアンカラのＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される、請求項８に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
10. ＩＬ−１５をコードする遺伝子を含まない、請求項１〜９のいずれか１つに記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
11. 少なくとも１１，０００ヌクレオチドのインフルエンザ核酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の改変ワクシニアウイルスアンカラ。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の改変ワクシニアウイルスアンカラを含む、細胞。

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