JP2010510281A - 鳥インフルエンザのための組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(mva)に基づくワクチン - Google Patents
鳥インフルエンザのための組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(mva)に基づくワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010510281A JP2010510281A JP2009537609A JP2009537609A JP2010510281A JP 2010510281 A JP2010510281 A JP 2010510281A JP 2009537609 A JP2009537609 A JP 2009537609A JP 2009537609 A JP2009537609 A JP 2009537609A JP 2010510281 A JP2010510281 A JP 2010510281A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mva
- nucleic acid
- vietnam
- heterologous nucleic
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 title claims abstract description 136
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 73
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 title description 22
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 title description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims abstract description 19
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 66
- 241001473385 H5N1 subtype Species 0.000 claims description 62
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 47
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 47
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 47
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 47
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 41
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000272813 Anser indicus Species 0.000 claims description 6
- 241001168968 Chroicocephalus ridibundus Species 0.000 claims description 6
- 241001416090 Ardea cinerea Species 0.000 claims description 5
- 241001641735 Cygnus cygnus Species 0.000 claims description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000587120 Vaccinia virus Ankara Species 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 74
- 206010072219 Mevalonic aciduria Diseases 0.000 description 68
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 57
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 37
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 24
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 24
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 22
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 21
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 14
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 13
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 13
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 13
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 13
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 13
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 11
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 10
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 10
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 5
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 4
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000670670 Amsacta Species 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700622 Vaccinia virus Copenhagen Species 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical compound Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108700028415 Entomopoxvirus spheroidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 101900222562 Influenza A virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102220477256 Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 10_S31N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000702321 Microvirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710169783 Spheroidin Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000008382 alveolar damage Effects 0.000 description 1
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 108010029566 avian influenza A virus hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940033324 influenza A vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000034288 naturally occurring fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006048 naturally occurring fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 1
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 1
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- QCZWKLBJYRVKPW-LYWCOASQSA-N spheroidene Natural products COC(C)(C)CC=CC(=CC=CC(=CC=CC(=CC=CC=CC(C)C=C/C=C(C)/CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C QCZWKLBJYRVKPW-LYWCOASQSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、異種核酸の配列がインフルエンザAウイルスクラスH5抗原に由来する、薬物、特にワクチンの製造のための、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)の使用に関する。本発明の別の一態様では、本発明は、(a)異種核酸がMVAのゲノム内の非必須位置に組み込まれている、(b)異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、および、(c)異種核酸がインフルエンザAウイルスクラスH5に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)に関する。
Description
本発明は、治療薬の分野、さらに特にワクチンの分野、さらに特にインフルエンザAワクチンの分野、さらに特にH5N1ワクチンに関する。
序論
1997年のH5N1感染の最初のヒト症例以来、このサブタイプのインフルエンザウイルスは世界中で高病原性鳥インフルエンザの発生を引き起こし続け、鳥からヒトへの感染数は増加し続けている。9月14日現在、246例のヒト症例が記録され、うち144例が致死的であったことが確認された(WHO感染症発生状況2006.鳥インフルエンザH5N1のヒト確認例(非特許文献1)。加えて、H5N1ウイルス感染は東南アジアから世界の他の大陸へ広がっている(非特許文献2)。これらのウイルスは鳥類の種だけでなくさまざまな哺乳類種を(非特許文献3)ヒトを含め(非特許文献4)感染させるため、鳥ウイルスの哺乳類種での複製への適応を通じて、または通常の流行性インフルエンザAウイルスとの遺伝子領域の交換を通じて、新しいパンデミック株が出現するリスクがある。
1997年のH5N1感染の最初のヒト症例以来、このサブタイプのインフルエンザウイルスは世界中で高病原性鳥インフルエンザの発生を引き起こし続け、鳥からヒトへの感染数は増加し続けている。9月14日現在、246例のヒト症例が記録され、うち144例が致死的であったことが確認された(WHO感染症発生状況2006.鳥インフルエンザH5N1のヒト確認例(非特許文献1)。加えて、H5N1ウイルス感染は東南アジアから世界の他の大陸へ広がっている(非特許文献2)。これらのウイルスは鳥類の種だけでなくさまざまな哺乳類種を(非特許文献3)ヒトを含め(非特許文献4)感染させるため、鳥ウイルスの哺乳類種での複製への適応を通じて、または通常の流行性インフルエンザAウイルスとの遺伝子領域の交換を通じて、新しいパンデミック株が出現するリスクがある。
感染家禽からヒトへの伝染がますます増加しているインフルエンザH5N1ウイルスによって引き起こされるパンデミック脅威を考慮して、安全および効果的な十分な数のワクチンが入手可能であることが優先事項と考えられている(非特許文献5)。
しかし、そのようなワクチンの開発および十分な投与量のワクチンの製造は容易ではなく、現在、すべての製造元の合計ワクチン製造能力は世界的接種活動に適時に供給するには不十分である。この問題を克服するのに役立つ代替のワクチン配送系および製造技術が明らかに必要である。
H5N1ウイルスのさまざまな抗原的に異なるクレード(clade)が最近同定されているため、理想的なワクチンはまた、これらの抗原変異株に対する交差防御免疫を誘導する。最近、全不活化ウイルス(WIV)およびスプリット・ビリオンワクチンといった、従来の不活化ワクチン製剤が評価された(非特許文献6)。これらは、そのようなワクチンは可能な有効期間について相当な追加の製品特徴づけを必要とするという欠点がある。さらに、ワクチン製造元によるそのような新しい工程の実施は、必ずしも成功せず、およびバリデーションのための試験を再実施する必要がありうる。パンデミックの危険の観点から、これらの欠点は重大である。安全および効果的なアジュバントは従来のワクチンの免疫原性を改善でき、および適切な抗体応答を誘導するのに必要な抗原品質を低減しうる(用量の節約)。結果はここではこの可能性を強調する(スティミューン(Stimune)(登録商標)アジュバント化NIBRG−14全ウイルス製剤)。しかし、現在はそのような強力なアジュバント化処方は製造およびヒトでの使用に適しないと考えられ、および免疫原性の増大にアジュバントを必要としないワクチンが将来のワクチン開発における好ましい候補である。
バキュロウイルスによって発現される組み換えHAに基づくワクチンが試験されている(非特許文献7)。抗原的にナイーブな個体ではこれらのワクチンはしかし中等度に免疫原性であり、およびより重要なことに、感知可能な抗体応答は、高用量、またはミョウバンのようなアジュバントとの組み合わせが用いられた場合だけ誘導された(非特許文献6)。
明らかに、特にH5N1インフルエンザパンデミックの場合におけるワクチンの破滅的な不足を克服するために、新規のワクチンが緊急に必要とされる。また、パンデミックがもたらす結果を回避するために、上記で概説された欠点は速やかに克服されなければならない。
WHO disease alert 2006.Confirmed human cases of avian influenza H5N1)−http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2007_10_17/en/index.html,2007年10月17日アクセス
WHO.2007.『2003年以降のH5N1鳥インフルエンザの確認例の被害地、2007年8月10日現在の状況』(Affected areas with confirmed cases of H5N1 avian influenza since 2003,status as of 08.10.2007)
バーレンカンプ(Vahlenkamp),T.W.,および T.C.ハーダー(Harder).2006.『哺乳類におけるインフルエンザウイルス感染』(Influenza virus infection in mammals.)Berl Munch Tierarztl Wochenschr 119:123−31
ビーゲル(Beigel),J.H.,J.ファーラー(Farrar),A.M.ハン(Han),他 2005.『ヒトにおける鳥インフルエンザA(H5N1)感染』(Avian influenza A infections in humans.)N Engl J Med 353:1374−85
WHO.2007.『H5N1ウイルスの抗原特性および遺伝的特性およびプレパンデミックワクチンとしての潜在的使用のために開発されたH5N1ワクチンウイルス候補』(Antigenic and genetic characteristics of H5N1 viruses and candidate H5N1 vaccine viruses developed for potential use as pre−pandemic vaccines)−http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/summaryH520070403.pdf
ニコルソン(Nicholson),K.G.,A.E.コールゲート(Colegate),A.ポダ(Podda),他.2001.『非アジュバント化およびMF59アジュバント化インフルエンザA/Duck/Singapore/97(H5N3)ワクチンの安全性および抗原性:H5N1インフルエンザに対する2種類の潜在ワクチンの無作為化試行』(Safety and antigenicity of non−adjuvanted and MF59−adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza.)Lancet 357:1937−43
トリーノー(Treanor),J.J.,B.E.ウィルキンソン(Wilkinson),F.マサウド(Masseoud),他 2001.『ヒトにおけるH5インフルエンザのための組み換えヘマグルチニンワクチンの安全性および免疫原性』(Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans.)Vaccine 19:1732−7
インフルエンザウイルスAは、ウイルス分類でオルトミクソウイルス(Orthomyxoviridae)というウイルス科の1属である。インフルエンザウイルスAは1種のみであり、その種を「インフルエンザAウイルス」という。インフルエンザAウイルスは、「鳥インフルエンザ」(別名鳥インフル(bird flu)、鳥インフルエンザ(avian flu)、インフルエンザウイルスAインフル(Influenzavirus A flu)、A型インフルエンザ(type A flu)、またはA属インフルエンザ(genus A flu))を意味する。それは鳥類を宿主とするが、しかし数種の哺乳類に感染しうる。既知のすべてのサブタイプは鳥類に固有である。
本発明は上記で概説される問題を解決する。本発明は、異種核酸の配列がインフルエンザAウイルスクラスH5抗原に由来する、薬物の、特にワクチンの製造のための、単離異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(modified vaccinia virus Ankara)(MVA)の使用を教示する。
「単離DNA」は、(1)本発明に記載の天然に存在する配列のどれとも同一でない配列を含むDNA、または(2)天然に存在する配列を有するDNA(たとえば、cDNAまたはゲノムDNA)に関連して、目的DNAを含む遺伝子が天然に存在する生物のゲノム中の、目的DNAを含む遺伝子に隣接する少なくとも1つの遺伝子を含まないDNA、のどちらかである。その語はしたがって、ベクターに組み込まれた、自己複製プラスミドまたはウイルスに組み込まれた、または原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組み換えDNAを含む。その語はまた、対応するゲノムDNAがイントロンおよびしたがって異なる配列を有するcDNA;隣接遺伝子のうち少なくとも一方を欠くゲノム断片;ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製されおよび隣接遺伝子のうち少なくとも一方を欠くcDNAまたはゲノムDNAの断片;隣接遺伝子のうち少なくとも一方を欠く制限断片;融合タンパク質、ムテイン、または任意のタンパク質の断片といった天然に存在しないタンパク質をコードするDNA;およびcDNAまたは天然に存在する核酸の縮重変異体である核酸といった別々の分子を含む。加えて、それは、ハイブリッド遺伝子、すなわち、天然に存在しない融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列を含む。単離DNAは、たとえば、cDNAまたはゲノムDNAライブラリまたは、たとえば、制限消化反応混合物または電気泳動ゲル切片中のゲノムDNA制限消化物中の、数百から数百万の他のDNA分子の中に存在するDNAを意味しないことは前記から明らかとなる。
(a)異種核酸がMVAのゲノム内の非必須位置に組み込まれている、(b)異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、および、(c)異種核酸がインフルエンザAウイルスクラスH5に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
「ベクター」の語は、細胞へ導入されうる、または細胞に含まれるタンパク質および/または核酸を導入することができる、タンパク質またはポリヌクレオチドまたはその混合物をいう。導入されるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、ベクターの導入に際して細胞内で発現されるのが好ましい。
「薬物、特にワクチンの製造に好ましい核酸」、すなわち配列番号1から3および11から15、はここではまた、ここで特に列記されるものと95%、好ましくは98%、非常に好ましくは99%同一である核酸もいう。2つの配列間のパーセント同一性の決定は、カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)(1993) PNAS.90: 5873−5877)の数学的アルゴリズムを用いて達成される。そのようなアルゴリズムは、アルトシュル(Altschul)他(1990) J.Mol.Biol.215:403−410のBLASTN およびBLASTPプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、BLASTNプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて、ヌクレオチド配列EPO変異ポリペプチドをコードする核酸と相同なヌクレオチド配列を得るために実施される。BLASTタンパク質検索は、BLASTPプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて、EPO変異ポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るためにそれぞれ実施される。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きBLASTがアルトシュル(Altschul)他(1997)Nucleic Acids Res.25: 3389−3402に記載される通り用いられる。BLASTおよびギャップ付きBLASTプログラムを用いる際、各プログラムのデフォルトパラメーターが用いられる。
本発明者らは、異種核酸の配列がインフルエンザAウイルスクラスH5抗原に由来する、薬物、特にワクチンの製造のための、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)の使用が、上記に概説された問題を解決することを見出している。特にインフルエンザH5N1ウイルスのHAを産生するMVAの接種は、一回の接種の後でさえ、強力な抗体応答を誘導し、それは同種および異種チャレンジ感染に対する防御と相関した。非常に驚くべきことに、本発明者らは、特定の第1のH5N1株(HongKong/156/97)由来の特異的抗原を産生するMVAの接種が、異種の第2のH5N1(Vietnam/1194/04)株での感染に際して疾患に対する良好な防御を誘導することを示すことができる。この防御が前記第2の株に対する検出可能な抗体の非存在下で起こることは非常に驚くべきことである。本発明は、ヒトだけでなく他の動物における鳥インフルエンザの治療のための、薬物、特にワクチンの産生のための異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)の使用であって、異種核酸の配列がインフルエンザAウイルスクラスH5抗原に由来する前記使用に関する。
MVAは元々120,000人以上でヒト天然痘に対する特に安全なワクチンとして試験されている(マイヤー(Mayr),A.,およびK.ダナー(Danner).1978.『免疫抑制条件下での種痘に対する接種』(Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions.)Dev Biol Stand 41:225−34)。
MVAベクターワクチンを用いる利点は、ヒトにおける確立された安全性プロファイル、臨床試験における異種抗原のデリバリーの際の効力、およびGMPの要件下でのワクチン大量生産のための技術の利用可能性を含む。
本発明者らは、インフルエンザウイルスA/Hongkong/156/97(A/HK/156/97)またはA/Vietnam/1194/04(A/VN/1194/04)のヘマグルチニン(HA)遺伝子配列も発現するさまざまな組み換えMVAウイルスを構築している。これらのウイルスは、3つの異なるH5N1ウイルスに対する防御免疫の誘導を評価するために、マウスモデルにおけるワクチン候補の役割を果たした。2回投与免疫化法は、異種H5N1ウイルスと部分的に交差反応した強い抗体応答を誘導し;導かれた抗体応答は、同種および異種インフルエンザウイルスでのチャレンジ感染に対する防御と相関した。
本発明に記載のワクチン(MVA)は、感染を引き起こす株がワクチン抗原と完全には一致しない場合でさえ、重度の臨床徴候および気道における組織病理学的変化から個体を保護する幅広い免疫応答を誘導しうる。本発明に記載の組み換えMVAベクターは、ヒトにおける使用のための好ましいワクチン候補となるいくつかの性質を有する。
まず、本発明に記載の組み換えMVAは、哺乳類細胞におけるそれらの明確な複製不全、および、免疫抑制マカク(macaque)におけるMVAの安全性(スティテラー(Stittelaar),K.J.,T.クイケン(Kuiken),R.L.デ・スワート(de Swart),他 2001.『免疫抑制マカクにおける修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)の安全性』(Safety of modified vaccinia virus Ankara (MVA) in immunesuppressed macaques.)Vaccine 19:3700−9.)またはHIV感染者に対する高用量の組み換えMVAの無害な使用(ハラー(Harrer),E.;M.バウアール(Bauerle),B.フェスツル(Ferstl),他2005.『HAART中のHIV−1感染患者の組み換えHIV−1nef発現MVAの治療的接種:安全性、免疫原性および治療中断中のウイルス量に対する影響』(Therapeutic vaccination of HIV−1−infected patients on HAART with a recombinant HIV−1 nef−expressing MVA:safety,immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption.)Antivir Ther 10:285−300;グーネチレケ(Goonetilleke),N.,S.ムーア(Moore),L.ダリー(Dally),他 2006.『CD8+T細胞エピトープと結合したHIV−1 Gagを発現する、DNAベクターおよび修飾ワクシニアウイルス・アンカラベクターワクチンのプライムブースト法を用いることによる、健常人において増殖可能な1型ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV−1)特異的多機能性T細胞の誘導』(Induction of multifunctional human immunodeficiency virus type 1 (HIV−1)−specific T cells capable of proliferation in healthy subjects by using a prime−boost regimen of DNA− and modified vaccinia virus Ankara−vectored vaccines expressing HIV−1 Gag coupled to CD8+ T−cell epitopes.)J Virol 80:4717−28)を含む、それらのよく確立されたin vivo非病原性のため、極めて安全なウイルスベクターと考えることができる。
次に、MVAワクチンの工業規模生産は、オルソポックスウイルス関連の生物脅威に対する第3世代ワクチンとしてMVAを開発するために行われた努力のために、非常に実現可能性が高いように見える(ボルマー(Vollmar),J.,N.アーンツ(Arndtz),K.M.エクル(Eckl),他 2006.『第三世代天然痘ワクチンとしての有望候補インバミュンの安全性および免疫原性』(Safety and immunogenicity of IMVAMUNE,a promising candidate as a third generation smallpox vaccine.)Vaccine 15;24:2065−70)。
3つめに、本発明に記載のMVAベクターワクチンは、複数の異種抗原を送ることができ、および高レベルの体液性および細胞性免疫の同時誘導を可能にし、多価ワクチンを開発する可能性を提供する。
さらに、MVAに基づくワクチンの製造は、従来のインフルエンザワクチンのための既存の製造能力に依存しない。このように、MVAに基づくワクチンの製造は、パンデミック出現時に、ワクチン用量の予見される不足を低減するのに役立ちうる。もう1つの利点は、これらのワクチンの優れた免疫原性が、アジュバントの使用に依存しないことである。
修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)は、ワクシニアウイルスのニワトリ細胞適応株である。動物接種時に見出されたその非病原性および哺乳類起源の大部分の細胞において相当量の新しいウイルス子孫を生じる能力の著しい不全のため、MVAはバイオセイフティーレベル1の実験室条件下で使用されうる。MVAは著しい副作用を起こすことなく、天然痘予防接種を受けた100000人以上で予備免疫化について試験されているため、MVAは、高い安全性プロファイルを有する、組み換え遺伝子の発現のための効率的なベクターウイルス(サッター(Sutter),G.,およびB.モス(Moss).1992.『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』(Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.)PNAS 89:10847−51.)および組み換えワクチン候補(モス(Moss),B.,M.W.キャロル(Carroll),L.S.ワイアット(Wyatt),他 1996.『ワクチン候補としての宿主範囲が限定された非複製ワクシニアウイルスベクター』(Host range restricted,non−replicating vaccinia virus vectors as vaccine candidates.)Adv Exp Med Biol 397:7−13)の役割を果たす。いくつかのMVAベクターワクチンが既に臨床評価に入っている(マクコンキー(McConkey),S.J.,W.H.リース(Reece),V.S.モーシー(Moorthy),他 2003.『ヒトにおいて組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラでブーストされたプラスミドDNAワクチンのT細胞免疫原性増大』(Enhanced T−cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans.)Nat Med 9: 729−35; コスマ(Cosma),A.,R.ナガラジ(Nagaraj),S.ビューラー(Buehler),他 2003.『慢性HIV−1感染者においてMVA−HIV−1 nefの治療的接種はNef特異的Tヘルパー細胞応答を導く』(Therapeutic vaccination with MVA−HIV−1 nef elicits Nef−specific T−helper cell responses in chronically HIV−1 infected individuals.)Vaccine 22: 21−9)。つい最近、MVAは天然痘に対する第2世代ワクチン候補として再評価されている。本発明によると、本発明に記載の異種核酸は、MVAのゲノムの非必須領域に組み込まれる。本発明によると、任意のMVA株が使用されうる。
WO03/097844 A1は4ページでいくつかのMVA株を開示する。本発明にしたがって使用されうる1つの株は、MVA−BN株またはその誘導体である(WO 02/42480)。本発明に記載される非必須領域は、(i)ワクシニアウイルス・コペンハーゲン(Copenhagen)株のゲノムに関してMVAゲノムの天然に存在する欠失部位または(ii)MVAゲノムの遺伝子間領域から選択されうる。「遺伝子間領域」の語は、好ましくは、コード配列も調節配列も含まない2個の隣接する遺伝子の間に位置するウイルスゲノムの部分をいう。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF細胞)といった少なくとも1つの細胞培養系で増幅および増殖されうる組み換えを得ることが可能である限り組み込みはウイルスゲノムのどこでもよいことは本発明の範囲内であるため、本発明に記載の異種核酸の組み込みのための挿入部位(非必須領域)は、これらの好ましい挿入部位に限定されない。したがって、非必須領域はまた、MVAの増殖に用いられる細胞系によって機能が補われうる1または複数の非必須遺伝子でありうる。好ましい一実施形態では、異種核酸はMVAのゲノム内の非必須部位へ組み込まれる。
特に好ましい一実施形態では、本発明に記載の異種核酸は、MVAゲノムに欠失(III)の部位で組み込まれる。本発明に記載の異種核酸の組み込みは、MVAゲノムへの組み込み前に最初に本発明に記載の異種核酸を含む、いわゆる導入ベクターの隣接領域の相同組み換えによって優先的に実施される。相同組み込みに際して組み換えウイルスの選択が実施される。組み換えウイルスを選択するための方法の1つは、宿主範囲遺伝子K1Lの発現である(図5および7を参照)。
好ましい一実施形態では、異種核酸はMVAゲノムに欠失(III)の部位で組み込まれる。
本発明によると、異種核酸は、ワクシニアウイルス特異的プロモーター、またはオルソポックスウイルス特異的プロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある。いくつかのプロモーターが本発明に使用されうる。本発明に記載の異種核酸の発現のためには、いくつかのプロモーター、たとえば30Kおよび40Kプロモーター(US 5,747,324,『強力な合成初期後期プロモーター』(A Strong Synthetic Early−Late Promoter); サッター(Sutter), G.,L.S.ワイアット(Wyatt),P.L.フォレー(Foley),他 1994.『ワクシニアウイルスの宿主範囲限定および高度弱毒化MVA株に由来する組み換えベクターがマウスにおいてインフルエンザウイルスに対する防御免疫を刺激する』(A recombinant vector derived from the host range−restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus.) Vaccine 12:1032−1040)、 P7.5プロモーター(エンドウ(Endo),A.,S.イタムラ(Itamura),H.リヌマ(Iinuma),他 1991.『インフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたは核タンパク質を発現する組み換えワクシニアウイルスによるマウスにおけるインフルエンザウイルス感染に対するホモタイプおよびヘテロタイプ防御』(Homotypic and heterotypic protection against influenza virus infection in mice by recombinant vaccinia virus expressing the haemagglutinin or nucleoprotein of influenza virus.)J Gen Virol 72: 699−703)、PmH5、P11および牛痘ウイルスA型封入体(ATI)遺伝子由来プロモーター(リー(Li),Y.,R.L.ホール(Hall),S.L.ヤン(Yan),R.W.モイヤー(Moyer).1998.『アムサクタ・ムーレイ・エントモポックスウイルススフェロイジンの高レベル発現は遺伝子内の配列に依存する』(High−level expression of Amsacta moorei entomopoxvirus spheroidin depends on sequences within the gene.)J Gen Virol 79:613−22)。これらのプロモーターのすべてが本発明にしたがって使用されうる。一実施形態では、異種核酸が多量に発現されることが望ましい。WO03/097844A1はP7.5、PmH5およびP11といったプロモーターが好ましいことを開示する。
本発明によると、異種核酸の配列は、H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N7、H7N3およびH9N2配列の群から選択される。好ましくは当該配列はH5N1に由来する。
異種核酸がH5N1に由来する場合、それは好ましくはA/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/3046/04、A/Hongkong/156/97、A/HongKong/212/03、A/HongKong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Ck/Indonesia/BL03/03、A/Greyheron/HK/793.1/02、A/Black Headed Gull/HK/12.1/03、A/Dk/Vietnam/11/04、A/Ck/Vietnam/33/04、A/Ck/Vietnam/C−58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06およびA/Ck/HK/947/06と呼ばれる株の群から選択される。
H5N1の異種核酸が、A/Vietnam/1194/04,A/Indonesia/5/2005,A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005,A/Whooper swan/Mongolia/244/2005,A/turkey/Turkey/1/2005,およびA/Anhui/1/2005株から選択されることが好ましい。
H5N1の異種核酸が、A/Vietnam/1194/04株のものであることが非常に好ましい。
異種核酸の配列は、ヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含むことが好ましい。好ましい一実施形態では、異種核酸の配列は、ヘマグルチニン遺伝子のヌクレオチド1ないし1500の配列、または配列の一部を含む。より好ましい一実施形態ではヌクレオチド1ないし1100、および非常に好ましい一実施形態ではヌクレオチド40ないし1100である。非常に好ましい一実施形態では、異種核酸は、配列番号1、配列番号2および配列番号3から選択される、A/Vietnam/1194/04に由来するヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む。配列番号3が非常に好ましい(表1を参照)。
ヘマグルチニン(HA)は、インフルエンザウイルス(および多数の他の細菌およびウイルス)の表面上に見られる抗原性糖タンパク質である。それは感染されている細胞へのウイルスの結合を担う。ヘマグルチニンという名称は当該タンパク質が赤血球を互いに凝集させる能力に由来する (ネルソン(Nelson) D.L.およびコックス(Cox) M.M.,2005.『生化学』(Principles of Biochemistry)第4版,フリーマン・パフリッシャーズ(Freeman Publishers),ニューヨーク(New York))。
少なくとも16の異なるHA抗原が存在する。これらのサブタイプはH1からH16と呼ばれる。最後のH16は、スウェーデンおよびノルウェーからのユリカモメから単離されたインフルエンザAウイルス上に、ごく最近になって発見された (フーシャー(Fouchier) RA,ムンスター(Munster) V,ウォーレンステン(Wallensten)A,他 2005.『ユリカモメから得られた新規インフルエンザAウイルスヘマグルチニンサブタイプ(H16)の特徴づけ』(Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black−headed gulls.)J Virol 79:2814−22.)。最初の3つのヘマグルチニンH1、H2、およびH3はヒトインフルエンザウイルスに見られる。
鳥ウイルス株H5型ヘマグルチニンにおける単一アミノ酸変化がヒト患者で見つかっており、それは鳥H5N1ウイルスの受容体特異性を顕著に変化させることができ、それらにヒトインフルエンザウイルスに最適な受容体と結合する能力を与える(ガンバリャン(Gambaryan),A,A.ツジコフ(Tuzikov),G.パジニナ(Pazynina),他 2005.『インフルエンザA(H5)ウイルスの受容体結合表現型の進化』(Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses.)Virology 344:432−8)。この知見は、通常はヒトに感染しないH5N1ウイルスがどのように変異しヒト細胞を効率的に感染させうるようになれるのかを説明するように見える。H5N1ウイルスのヘマグルチニンは、見かけ上タンパク質分解による活性型への変換の容易さのため、このインフルエンザウイルス株の高い病原性と結びつけられている(ハッタ(Hatta),M.,P.ガオ(Gao),P.ハーフマン(Halfmann),他 2001.『香港H5N1インフルエンザAウイルスの高毒性の分子的基礎』(Molecular Basis for High Virulence of Hong Kong H5N1 Influenza A Viruses.)Science 293:1840−1842)。
当該核酸がHA1およびHA2サブユニットを含むことが好ましい。HAはホモ三量体膜内在性糖タンパク質である。それは円筒のような形であり、および長さ約135Å(オングストローム)である。HAを構成する3個の同一のモノマーは中心のαへリックスコイルにおいて構築され;3個の球状の頭部がシアル酸結合部位を含む。HAモノマーは前駆体として合成され、次いでグリコシル化され、および切断されて2個のより小さいポリペプチドHA1およびHA2サブユニットになる。個々のHAモノマーは、HA2によって膜に繋がれおよび大きいHA1小球が頂点にある長いらせん鎖から成る。HA1サブユニットが単独で用いられることもまた好ましい。
別の実施形態では、異種核酸は、アミノ酸1〜351、アミノ酸352〜500、アミノ酸15〜351、アミノ酸120〜160、アミノ酸180〜230およびアミノ酸120〜230から選択されるアミノ酸配列領域をコードする配列を含む。下記は非常に好ましいアミノ酸120〜160、アミノ酸180〜230およびアミノ酸120〜230である。最も好ましい領域は120〜160である。異種核酸が、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号10から選択されるアミノ酸配列をコードすることが非常に好ましい。
特に好ましい実施形態では、異種核酸は(a)単一H5N1株の異なる遺伝子またはその一部および/または、(b)異なるH5N1株、に由来する2つ以上の配列をコードする。異なるH5N1株に由来する2つ以上、3つ以上、または4つ以上のHA配列が特に好ましい。さらに、当該2つ以上の異なる配列は、ウイルスのHAおよび別の遺伝子に由来しうる。
好ましい一実施形態では、異種核酸の配列は、ヌクレオチド1ないし1500(配列番号1)のヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む。より好ましい一実施形態ではヌクレオチド1ないし1100(配列番号2)および非常に好ましい一実施形態ではヌクレオチド40ないし1100(配列番号3)である。
好ましい配列はノイラミニダーゼ(NA)である。NAは、インフルエンザウイルスの表面上に見られる抗原性糖タンパク質酵素であるノイラミニダーゼをコードする。それは感染細胞からの子孫ウイルスの放出に役立つ。NAは、インフルエンザウイルス特異的免疫応答、すなわち抗体、および異なるウイルス変異株またはサブタイプに対する交差防御に貢献しうるT細胞を導く、可能な標的抗原と考えられる。配列番号15(ノイラミニダーゼ;Vietnam/1194/2004)が特に好ましい。
好ましい配列はマトリクス配列である。マトリクスをコードする遺伝子部分は、2つの表面タンパク質(ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ)と共にウイルスのキャプシド(保護被覆)を構成するマトリクスタンパク質(M1およびM2)である。M1はウイルスRNAと結合するタンパク質である。配列番号13(M1、Vietnam/1194/2004)が好ましい。
M2は、ウイルスを脱コートして内容物(8つのRNAセグメント)を宿主細胞の細胞質へ曝露するタンパク質である。M2膜貫通タンパク質は、効率的な感染に必要なイオンチャンネルである(ロバートB.クーチ(Robert B.Couch),『オルトミクソウイルス』(Orthomyxoviruses),バロン(Baron)S.(編)、『医療微生物学』(Medical Microbiology),第4版から,テキサス大学医学部ガルベストン校(The University of Texas Medical Branch at Galveston).1996.ISBN 0−9631172−1−1)。一部H5N1遺伝子型M2のアミノ酸置換(Ser31Asn)はアマンタジン耐性と関連する (グアン(Guan),Y.,L.L.プーン(Poon),C.Y.チューン(Cheung),他 2004.『H5N1インフルエンザ:変幻自在なパンデミック脅威』(H5N1 influenza: A protean pandemic threat)PNAS 108:8156−8161;リー(Lee),C.−W.,D.L.スアレス(Suarez),T.M.タンピー(Tumpey),他 2005.『韓国で単離された高病原性H5N1鳥インフルエンザAウイルスの特徴づけ』(Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea.)JVirol,79:3692−3702,また、ミネソタ大学感染症研究および政策学術健康センター・パンデミックインフルエンザセンター(Pandemic Influenza Center for Infectious Disease Research & Policy Academic Health Center −− University of Minnesota))。配列番号 14 (Vietnam/1194/2004; M2)が好ましい。M1および M2は、インフルエンザウイルス特異的免疫応答、すなわち抗体、および異なるウイルス変異株またはサブタイプに対する交差防御に貢献しうるT細胞を導く、可能な標的抗原と考えられる。
このように、一実施形態では2つ以上のHA抗原が用いられる。一実施形態では1つ以上のHA抗原がNA、M1、またはM2と組み合わされる。好ましい一実施形態ではM1、M2、NA、NPおよびHAが組み合わされる。非常に好ましい一実施形態ではこれらは配列番号:11(NP;HongKong/156/97)、12(NP;Vietnam/1194/04)、13(M1;Vietnam/1194/04)、14(M2;Vietnam/1194/04)および/または配列番号15(NA;Vietnam/1194/04)によってコードされる。
特に好ましい一実施形態では、当該2つ以上の配列は、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、およびA/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、Vietnam/3046/04、A/Barheadedgoose/Qinghai/1A/2005、A/Whooperswan/Mongolia/244/2005、A/turkey/Turkey/1/2005、A/Anhui/1/2005、および/またはA/IND/5/05に由来する。
本発明の別の一態様では、本発明は、(a)異種核酸がMVAのゲノム内の非必須部位に組み込まれている、(b)異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にあり、および、(c)異種核酸がインフルエンザAウイルスクラスH5に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)に関する。修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)は、ワクシニアウイルスのニワトリ細胞適応株である。動物接種時に見出されたその非病原性および哺乳類起源の大部分の細胞において相当量の新しいウイルス子孫を生じる能力の著しい不全のため、MVAはバイオセイフティーレベル1の実験室条件下で使用されうる。MVAは著しい副作用を起こすことなく、天然痘予防接種を受けた100000人以上で予備免疫化について試験されているため、MVAは、高い安全性プロファイルを有する、組み換え遺伝子の発現のための効率的なベクターウイルス(サッター(Sutter),G.,および B.モス(Moss).1992.『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』(Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.)PNAS 89:10847−51.) および組み換えワクチン候補(モス(Moss),B.,M.W.キャロル(Carroll),L.S.ワイアット(Wyatt),他 1996.『ワクチン候補としての宿主範囲限定された非複製ワクシニアウイルスベクター』(Host range restricted,non−replicating vaccinia virus vectors as vaccine candidates.)Vaccine Adv Exp Med Biol 397:7−13)の役割を果たす。いくつかのMVAベクターワクチンが既に臨床評価に入っている(マクコンキー(McConkey),S.J.,W.H.リース(Reece),V.S.モーシー(Moorthy),他 2003.『ヒトにおいて組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラでブーストされたプラスミドDNAワクチンのT細胞免疫原性増大』(Enhanced T−cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans.)Nat Med 9: 729−35;コスマ(Cosma),A.,R.ナガラジ(Nagaraj),S.ビューラー(Buehler),他 2003.『慢性HIV−1感染者においてMVA−HIV−1 nefの治療的接種は Nef特異的Tヘルパー細胞応答を導く』(Therapeutic vaccination with MVA−HIV−1 nef elicits Nef−specific T−helper cell responses in chronically HIV−1 infected individuals.)Vaccine 22: 21−9)。つい最近、MVAは天然痘に対する第2世代ワクチン候補として再評価されている。本発明によると、本発明に記載の異種核酸は、MVAのゲノムの非必須領域に組み込まれる。本発明によると、任意のMVA株が使用されうる。
WO 03/097844 A1は4ページでいくつかのMVA株を開示する。本発明にしたがって使用されうる1つの株は、MVA−BN株またはその誘導体である(WO 02/42480)。本発明に記載される非必須領域は、(i)ワクシニアウイルス・コペンハーゲン(Copenhagen)株のゲノムに関してMVAゲノムの天然に存在する欠失部位または(ii)MVAゲノムの遺伝子間領域から選択されうる。「遺伝子間領域」の語は、好ましくは、ウイルスゲノムの2個の隣接する遺伝子の間に位置する、コード配列も調節配列も含まない部分をいう。しかし、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF細胞)といった少なくとも1つの細胞培養系で増幅および増殖されうる組み換えを得ることが可能である限り組み込みはウイルスゲノムのどこでもよいことは本発明の範囲内であるため、本発明に記載の異種核酸の組み込みのための挿入部位(非必須領域)は、これらの好ましい挿入部位に限定されない。したがって、非必須領域はまた、MVAの増殖に用いられる細胞系によって機能が補われうる1または複数の非必須遺伝子でありうる。
好ましい一実施形態では、異種核酸はM1、M2、NA、NPおよびHAを含み、ここでM1、M2およびNAは欠失IIに位置し、NPは欠失VIに位置し、およびHAは欠失IIIに位置する。
これらは下記の株HongKong/156/97およびVietnam/1194/2004に由来することが非常に好ましい。特に好ましい一実施形態ではこれらは配列番号11、12、13、14および15の配列を有する。
異種核酸は、H5N1、H5N3、H5N2、H7N7、H3N2およびH7N3ゲノム配列の群から選択されるのが好ましい。
異種核酸は、H5N1に由来しおよびA/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/3046/04、A/Hongkong/156/97、A/HongKong/212/03、A/HongKong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Ck/Indonesia/BL03/03、A/Greyheron/HK/793.1/02、A/Black Headed Gull/HK/12.1/03、A/Dk/Vietnam/11/04、A/Ck/Vietnam/33/04、A/Ck/Vietnam/C−58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06、A/Ck/HK/947/06と呼ばれる株の群から選択されるのが好ましい。
別の一実施形態では、異種核酸はH5N1に由来し、およびA/Vietnam/1194/04、A/Indonesia/5/2005、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、A/Whooper swan/Mongolia/244/2005、A/turkey/Turkey/1/2005、およびA/Anhui/1/2005と呼ばれる株の群から選択される。
H5N1の異種核酸はA/Vietnam/1194/04株のものであることが非常に好ましい。
一実施形態では、異種核酸の配列は、ヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む(上記参照)。別の実施形態では、異種核酸は、アミノ酸1〜351、アミノ酸352〜500、アミノ酸15〜351、アミノ酸120〜160、アミノ酸180〜230およびアミノ酸120〜230から選択されるアミノ酸配列をコードする配列を含む。下記が非常に好ましいアミノ酸120〜160、アミノ酸180〜230およびアミノ酸120〜230である。最も好ましい領域は120〜160である。
さらに、他の2つのウイルスとは抗原的に異なる第3のH5N1変異株A/IND/5/05がマウスのチャレンジ感染に用いられた。組み換えMVA−HA−HK/97は高度に免疫原性であった。単回免疫化は既にインフルエンザウイルスA/HK/156/97に対する強い抗体応答を誘導し、それがさらに第2の接種によってブーストされた。これらの抗体は、A/VN/1194/04またはA/IND/5/05を用いたHIおよびVNアッセイでは交差反応性でなかった。MVA−HA−VN/04は免疫原性がより低かったが、しかし2回の免疫化後、相当な抗体応答が、相同ウイルスに対してだけでなく、A/HK/156/97に対しても、およびより低い程度でA/IND/5/05に対しても観察された。観察された抗体反応性パターンは、感染後フェレット血清で感染されたものと同様である。このように、MVA−HA接種によって誘導された抗体について観察された、抗体認識パターンにおけるこの非対称性は、元のインフルエンザウイルスでの感染後に誘導された抗体について観察されたものと全面的に似ていた。
実験動物における抗原特異的抗体の産生の研究において、全ウイルス抗原NIBRG−14ワクチン製剤は、陽性対照として実験に含められ、およびスティミューン(Stimune)(登録商標)油中水アジュバント、別名スペコール(Specol)の使用と組み合わせて高度に免疫原性であった。この実験ワクチンは、相同インフルエンザウイルスA/VN/1194/04に対してだけでなく、他の2つのH5N1株に対しても、強い抗体応答を誘導した。その3つのH5N1株に対して測定したHIおよびVN抗体力価は、チャレンジ感染に対する防御と直接相関した。
MVA−HA−HK/97免疫化マウスは同種チャレンジ感染に対してのみ防御された。接種はウイルス複製を完全に防ぎ、および結果として、組織病理学的変化も臨床徴候もこれらのマウスには観察されなかった。MVA−HA−HK/97誘導型抗体はインフルエンザウイルスA/VN/1194/04と交差反応しなかったが、このウイルスの複製は低減され、および免疫化動物は臨床徴候から防御された(表1)。
対照的に、インフルエンザウイルスA/IND/5/05でのチャレンジ感染に対しては防御作用は見られなかった。MVA接種は防御に貢献できた可能性がある(3)強いCTL応答を誘導できることが知られているが、H−2bに制限される交差反応性CTLエピトープがインフルエンザH5N1ウイルスのHA分子上に存在するかどうかは現在不明である。MVA−HA−VN/04での免疫化は、相同株に対する完全排除(sterilizing)免疫を誘導した。加えて、抗原的に異なるインフルエンザウイルスA/HK/156/97およびA/IND/5/05に対して強い防御作用が観察された。これらのウイルスの複製は大部分の免疫化動物で概ね低減され、それは気道における感染細胞の非存在および臨床徴候の欠如と相関した。防御はおそらく、肺胞上皮への循環から滲出するウイルス中和HA特異的血清抗体に基づく(イトウ(Ito),R.,Y.A.オザキ(Ozaki),T.ヨシカワ(Yoshikawa),H.ハセガワ(Hasegawa),Y.サトウ(Sato),Y.スズキ(Suzuki),R.イノウエ(Inoue),T.モリシマ(Morishima),N.コンドウ(Kondo),T.サタ(Sata),T.クラタ(Kurata),および S.タムラ(Tamura).2003.『致死性インフルエンザ肺炎の予防において接種マウスの気道のさまざまな部位における抗ヘマグルチニン IgAおよびIgG 抗体の役割』(Roles of antihemagglutinin IgA and IgG antibodies in different sites of the respiratory tract of vaccinated mice in preventing lethal influenza pneumonia.)Vaccine 21:2362−71)。
HA配列およびその他の配列は、全体が存在する必要は無い。それらは、たとえばより良く発現されるために、たとえばコドン最適化されうる。
本発明に記載の組み換え 修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)について、核酸がHA1およびHA2サブユニットを含むことが好ましい。
一実施形態では、本発明に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)の核酸は、(a)単一H5N1株の異なる遺伝子またはその一部および/または、(b)異なるH5N1株、に由来する2つ以上の配列をコードする。そのような実施形態は上記に詳しく概説されている。
好ましい一実施形態では、当該2つ以上の配列は、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、およびA/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/3046/04、A/Hongkong/156/97、A/HongKong/212/03、A/HongKong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Ck/Indonesia/BL03/03、A/Grey heron/HK/793.1/02、A/Black Headed Gull/HK/12.1/03、A/Dk/Vietnam/11/04、A/Ck/Vietnam/33/04、A/Ck/Vietnam/C−58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06 または A/Ck/HK/947/06に由来する。
一実施形態では本発明は、上記で概説される本発明に記載の修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)をコードする核酸に関する。
別の一実施形態では本発明は、本発明に記載の組み換えMVAでの標的細胞の感染を含む、本発明に記載の組み換えMVAを標的細胞へ導入する方法に関する。
本発明はまた、必要とするヒトを含む動物生体へ本発明に記載のMVAの治療上有効な量を投与することを含む、ヒトを含む動物生体の免疫化のための方法に関する。
別の一実施形態では本発明は、本発明に記載のMVAでの標的細胞の感染を含む、本発明に記載のMVAを標的細胞へ導入する方法に関する。
ウイルスは標準的方法にしたがって増殖および力価測定される。ワクチン製剤を作製するために、ウイルスは定型的に、ショ糖による超遠心分離によって精製、およびたとえば1mMトリス/HCl pH9.0中で再構成されうる。ウサギ腎臓(RK13、ATCC CCL−37(商標))細胞は10%ウシ胎仔血清(FCS)添加最小基礎培地(MEM)中で増殖および37℃および5%CO2にて維持できる。CEF細胞は6ウェル組織培養プレートで増殖および感染効率20感染単位のMVAで感染させうる。
低または高感染効率増殖プロファイルを測定するために、集密CEF単層(6ウェルプレート上で増殖)を、細胞あたり各0.05感染単位(IU)または10IUのMVAまたは本発明に記載のMVAでそれぞれ感染させる。60分間37°Cのウイルス吸収後、接種材料を除去する。細胞をRPMI1640で2回洗浄し、および2%FCSを含む新しいRPMI1640培地で37℃および5%CO2にてインキュベートする。感染後(p.i.)複数の時点で、感染細胞を採集でき、および凍結融解と続いて簡潔な超音波処理によってウイルスが放出されうる。結果として生じる溶解物の連続希釈を6ウェルプレートで増殖させた集密CEF単層に2連で播種し、および48時間のインキュベート期間後、単層を氷冷アセトン:メタノール(1:1)中で短時間固定でき、および細胞を60分間、ポリクローナルウサギ抗ワクシニア抗体(IgG画分、バイオジェネシス社(Biogenesis Ltd.)、英国プール(Pool))とインキュベートし、次いで45分間、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体(ディアノバ社(Dianova)、ハンブルク(Hamburg))とインキュベートする。PBSで洗浄後、抗体標識化細胞をo−ジアニシジン(シグマ社(Sigma)、ドイツ、タウフキルヒェン(Taufkirchen))基質溶液を用いて発色させ、染色された細胞の群を計数し、およびウイルス力価をIU/mlとして計算できる。
本発明の一実施形態によると、本発明は、本発明に記載のMVAの治療上有効な量を必要とするヒトを含む動物生体へ投与することを含む、ヒトを含む動物生体の免疫化のための方法に関する。本発明に記載の前記方法は、(成分およびキャリヤーに加えて)希釈剤、一般的な増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および本分野でよく知られている他の材料もまた含みうる組成物を含みうる。これらは薬学的に許容可能なものである必要がある。
「薬学的に許容可能な」の語は、本発明に記載のMVAの生物活性の有効性に緩衝しない無毒性材料を意味する。キャリヤーの特徴は投与経路に依存する。医薬組成物はさらに、活性を増大する、または治療において使用する他の試薬を含みうる。そのような追加の因子および/または試薬は、相乗効果を生じるために、または副作用を最小化するために、本発明に記載の免疫化のための方法に用いるための医薬組成物に含まれうる。本発明に記載のMVAの処方および投与のための方法は、『レミントン薬学科学』(Remington's Pharmaceutical Sciences)に見ることができる(マック・パブリッシング・カンパニー(Muck Publishing Company)、ペンシルベニア州イーストン(Easton)、最新版)。
本発明に記載の免疫化のための方法は、MVAの治療上有効な量を利用する。治療上有効な用量とはさらに、症状の緩和、たとえばそのような症状の治療、治癒、予防または緩和を結果として生じるに十分な化合物/成分の量をいう。ワクチンを調製するために、本発明にしたがって作製されたMVAワクシニアウイルスが、生理的に許容可能な形に変換される。これは、天然痘に対する接種に用いられるワクチンの調製の長年にわたる経験に基づいて実施されうる(カプラン(Kaplan)C.1969.『天然痘に対する免疫化』(Immunization against smallpox.) Br Med Bull.25:131−135)。典型的には、組み換えMVAの約106〜107粒子を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)100ml中で、2%ペプトンおよび1%ヒトアルブミンの存在下でアンプル、好ましくはガラスアンプル内で凍結乾燥する。凍結乾燥物は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンといった増量剤、または非経口投与に適する他の助剤(たとえば抗酸化剤、安定剤など)を含みうる。ガラスアンプルを次いで封じ、および好ましくは20℃以下の温度にて、数ヶ月保存できる。接種のために、凍結乾燥物を0.1から0.2mlの水系溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し、およびたとえば皮内接種によって非経口的に投与できる。本発明に記載のワクチンは、好ましくは皮内に注射される。軽度の腫脹および発赤、時にはまたかゆみが注射部位に見出されうる。投与様式、用量および投与回数は、当業者によって公知の方法で最適化されうる。外来抗原に対する高レベルの免疫応答を得るために、必要に応じてワクチンを数回、長期間にわたって投与することが都合がよい。好ましい一実施形態では、免疫化は予防的および/または治療的の両方でありうる。
本発明は、ワクチン、ワクチンで充填済みのシリンジ、および保存および投与の他の様式を含む接種キットに関する。
一実施形態では、動物生体は哺乳類であり、一実施形態では動物生体は鳥類である。好ましい一実施形態では動物生体はニワトリまたはヒトである。
一実施形態では、前記免疫化は予防的および/または治療的の両方でありうる。
ワクチン調製
H5N1ウイルスはMDCK細胞で増殖され、およびウイルスRNAは培養上清から高純度RNA単離キット(ロシュ社(Roche)、オランダ、アルメレ(Almere))を用いて抽出された。続いてcDNAをvRNAからスーパースクリプト(Superscript)逆転写酵素(インビトロジェン社(Invitrogen)、米国カリフォルニア州カールスバード(Carlsbad))および5'−AGCAAAAGCAGG−3'(配列番号9)オリゴヌクレオチド(ユーロジェンテック社(Eurogentec)、ベルギー、スラン(Seraing))をプライマーとして用いて合成した。次に、HA遺伝子配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によってPfu (パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ストラタジーン社(Stratagene)、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ(La Jolla))を熱安定性DNA ポリメラーゼとして用いて増幅した。プライマー配列を、クローニングプラスミドpBluescriptSK+(ストラタジーン社、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ))への指向的クローニングを円滑化するために、NotIおよびXhoI制限部位を入れて伸長した。
H5N1ウイルスはMDCK細胞で増殖され、およびウイルスRNAは培養上清から高純度RNA単離キット(ロシュ社(Roche)、オランダ、アルメレ(Almere))を用いて抽出された。続いてcDNAをvRNAからスーパースクリプト(Superscript)逆転写酵素(インビトロジェン社(Invitrogen)、米国カリフォルニア州カールスバード(Carlsbad))および5'−AGCAAAAGCAGG−3'(配列番号9)オリゴヌクレオチド(ユーロジェンテック社(Eurogentec)、ベルギー、スラン(Seraing))をプライマーとして用いて合成した。次に、HA遺伝子配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によってPfu (パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ストラタジーン社(Stratagene)、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ(La Jolla))を熱安定性DNA ポリメラーゼとして用いて増幅した。プライマー配列を、クローニングプラスミドpBluescriptSK+(ストラタジーン社、米国カリフォルニア州ラ・ジョラ))への指向的クローニングを円滑化するために、NotIおよびXhoI制限部位を入れて伸長した。
HA遺伝子配列をこれらのプラスミドからNotI/XhoI消化によって調製し、クレノー(Klenow)ポリメラーゼで処理して平滑断端を生じ、およびMVA発現プラスミドpIIIΔHR−PsynIIのPmel部位へクローニングして、MVAベクタープラスミドpIII−HA−HK/97およびpIII−HA−VN/04を生じた。
MVA感染細胞におけるトランスフェクションに際して、これらのプラスミドはMVAゲノム内の欠失IIIの位置への外来遺伝子の挿入を導き(サッター(Sutter),G.,およびB.モス(Moss).1992.『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』(Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.)PNAS 89:10847−51.)およびワクシニアウイルス特異的プロモーターPsynIIの調節下のHA標的遺伝子の転写を可能にする(ワイアット(Wyatt),L.S.,P.L.アール(Earl),J.Y.リウ(Liu),他 2004.AIDS Res Hum Retr 20:645−653)。組み換えウイルスMVA−HA−HK/97およびMVA−HA−VN/04は初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)で、1μgプラスミドDNAを用いたトランスフェクション、0.05感染単位/細胞MVA単離物F6での感染に際して(サッター(Sutter),G.,およびB.モス(Moss).1992.『非複製ワクシニアベクターが組み換え遺伝子を効率的に発現する』(Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.)PNAS 89:10847−51.)、およびRK−13細胞でのプラーク選択によって生じた(スタイブ(Staib),C.,I.ドレクスラー(Drexler),およびG.サッター(Sutter).2004.『組み換えMVAの構築および単離』(Construction and isolation of recombinant MVA.) Methods Mol Biol 269:77−100)。組み換えMVAゲノムをPCRによって分析して、HA遺伝子挿入および遺伝的安定性を検証した(データ記載せず)。MVAベクターウイルスによるHA抗原の産生は、MVA−HA−HK/97またはMVA−HA−VN/04での感染後のさまざまな時点で採取したCEF細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって確認された(データ記載せず)。CEFでの1段階および多段階増殖分析は、非組み換えMVAと比較して、MVA−HA−HK/97およびMVA−HA−VN/04の同一に近い複製能力を実証した(データ記載せず)。
ワクチン製剤を作製するために、ウイルスをCEFで増幅し、ショ糖による超遠心分離によって精製し、および1mMトリス/HCl pH9.0中で再構成した。MVAワクチンをPBS100μlに希釈した108PFUの用量で使用した。
不活化全NIBRG−14ウイルスは、インフルエンザウイルスA/Vietnam/1194/04を基礎として逆遺伝学によって作られたリアソータント(reassortant)ワクチン株であり、陽性対照として用いられた。凍結乾燥された全ウイルス抗原を蒸留水で2μgHA/50μlの濃度にて再構成し、およびアジュバントのスティミューン(Stimune)(登録商標)(セディ・ダイアグノスティックス社(Cedi−Diagnostics)、オランダ、レリスタッド(Lelystad))と1:1で混合した。対照マウスにはPBSを接種した。
インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスA/HK/156/97、A/VN/1194/04およびA/Indonesia/5/05(A/IND/5/05)を11日齢胚含有ニワトリ卵の尿膜腔に接種した。尿膜液を3日後に採取した。感染性ウイルス力価をメイディン・ダービー(Madin−Darby)イヌ腎臓(MDCK)細胞で以前に記載された通り測定した(リンメルツワーン(Rimmelzwaan),G.F.,M.バールス(Baars),E.C.クラース(Claas),他 1998.『in vitroインフルエンザウイルス複製の監視のための方法としてのRNAハイブリダイゼーション、赤血球凝集アッセイ、感染性ウイルスの力価、および免疫蛍光の比較』(Comparison of RNA hybridization,hemagglutination assay,titration of infectious virus and immunofluorescence as methods for monitoring influenza virus replication in vitro.)J Virol Methods 4:57−66)。
インフルエンザウイルスA/HK/156/97、A/VN/1194/04およびA/Indonesia/5/05(A/IND/5/05)を11日齢胚含有ニワトリ卵の尿膜腔に接種した。尿膜液を3日後に採取した。感染性ウイルス力価をメイディン・ダービー(Madin−Darby)イヌ腎臓(MDCK)細胞で以前に記載された通り測定した(リンメルツワーン(Rimmelzwaan),G.F.,M.バールス(Baars),E.C.クラース(Claas),他 1998.『in vitroインフルエンザウイルス複製の監視のための方法としてのRNAハイブリダイゼーション、赤血球凝集アッセイ、感染性ウイルスの力価、および免疫蛍光の比較』(Comparison of RNA hybridization,hemagglutination assay,titration of infectious virus and immunofluorescence as methods for monitoring influenza virus replication in vitro.)J Virol Methods 4:57−66)。
マウス
特定病原体不在雌6〜8週齢C57BL/6Jマウスをチャールズ・リバー社(CharlesRiver)(ドイツ、ズルツフェルト(Sulzfeld))から購入した。マウス(n=90)を18匹の5群に分割し、およびPBS、MVA−HA−HK/97、MVA−HA−VN/04、wtMVA、またはスティミューン(Stimune)(登録商標)アジュバント化NIBRG−14のどれかで免疫した。
特定病原体不在雌6〜8週齢C57BL/6Jマウスをチャールズ・リバー社(CharlesRiver)(ドイツ、ズルツフェルト(Sulzfeld))から購入した。マウス(n=90)を18匹の5群に分割し、およびPBS、MVA−HA−HK/97、MVA−HA−VN/04、wtMVA、またはスティミューン(Stimune)(登録商標)アジュバント化NIBRG−14のどれかで免疫した。
免疫化は50μlを左後肢に、および50μlを右に、筋肉内に実施した。4週間後、眼窩穿刺によって採血し、および動物を再び上記の通り免疫した。さらに4週間後、採血し、および5つのワクチン群(n=18)それぞれを各6匹の3部分群に分割した。
各ワクチン群の部分群に、103 TCID50のインフルエンザウイルスA/HK/156/97、A/VN/1194/04またはA/IND/5/05を含むPBS50μlを鼻腔内経路によって接種した。6匹の非免疫化動物を陰性対照として用い、およびPBS50μlを接種した。動物を感染後4日まで毎日体重測定し、および次いで全採血によって屠殺した。
マウスを屠殺後、下記の臓器を切除した:脳、肺(ホルマリンで膨張させる)、脾臓および腸。すべての群の動物を、チャレンジ感染の時点で適切に年齢を一致させた。
実験プロトコルは実験の開始前に独立の動物倫理委員会によって承認された。筋肉内免疫化、鼻腔内感染、眼窩穿刺および安楽死は吸入イソフルランを用いて麻酔下で実施した。動物はフィルタートップケージ内で飼育し、および飼料および水を自由摂取とした。H5N1インフルエンザウイルスでの感染の5日間に、動物は、バイオセイフティーレベル3封じ込め施設内でフィルタートップケージ内に置いた。ウイルス毎に1つのBSL−3アイソレータユニットを用いた。
臓器組織中のウイルス力価
臓器をエタノールを用いてドライアイス上で急速凍結し、および−70℃にて保存した。臓器をポリトロン(Polytron)ホモジナイザー(キネマティカAG社(Kinematica AG)、スイス、ルツェルン州リッタウ(Littau−Lucerne))を用いて輸送培地(ハンクス(Hanks)培地(MEM)、グリセロール、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、ポリミキシンB、ナイスタチン、ゲンタマイシン、7.5%NaHCO3、1Mヘペス(Hepes))中でホモジナイズした。これらの試料の5連の10倍連続希釈を用いて、ウイルス力価をメイディン・ダービー(Madin−Darby)イヌ腎臓細胞(MDCK細胞)の集密層上で測定した。
臓器をエタノールを用いてドライアイス上で急速凍結し、および−70℃にて保存した。臓器をポリトロン(Polytron)ホモジナイザー(キネマティカAG社(Kinematica AG)、スイス、ルツェルン州リッタウ(Littau−Lucerne))を用いて輸送培地(ハンクス(Hanks)培地(MEM)、グリセロール、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、ポリミキシンB、ナイスタチン、ゲンタマイシン、7.5%NaHCO3、1Mヘペス(Hepes))中でホモジナイズした。これらの試料の5連の10倍連続希釈を用いて、ウイルス力価をメイディン・ダービー(Madin−Darby)イヌ腎臓細胞(MDCK細胞)の集密層上で測定した。
血清学
コレラろ液での処理および56℃にて熱不活性化後、血清を抗HA抗体の存在について検査した。この目的のために、1%シチメンチョウ赤血球および4HA単位のインフルエンザウイルスA/HK/156/97、A/VN/1194/04またはA/IND/5/05のどれかを用いて標準手順にしたがって、赤血球凝集阻害アッセイ(HI)を用いた(パーマー(Palmer),D.F.,M.T.コールマン(Coleman),W.R.ダウドル(Dowdle),他 1975.『インフルエンザ診断のための新検査法』(Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis),p.51−52.免疫学(Immunology)シリーズNo.6.米国保健教育福祉省(United States Department of Health,Education and Welfare)、ワシントンD.C)。この目的のために、基本的な切断部位が除去された逆遺伝学ウイルスを作製した。これらの逆遺伝学ウイルスの使用を検証し、および得られた力価は野生型株に対するものと同等であった(データ記載せず)。血清をまた、微量ウイルス中和(VN)アッセイを各ウイルス100TCID50を用いて、その3つのインフルエンザウイルスに特異的なウイルス中和抗体の存在について検査した(フランク(Frank),A.L.,J.パック(Puck),B.J.ヒューズ(Hughes),他 1980.『連続細胞株および新鮮血清増強を用いるインフルエンザA および B および パラインフルエンザ 1 および 2 ウイルスについての微量中和試験』(Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2 viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement.)J Clin Microbiol 12:426−32)。不活性化H5N2インフルエンザウイルスA/Duck/Potsdam/1402/86で2回免疫したハクチョウから得られた過免疫血清(インターベット社(Intervet)、オランダ、ボクスメール(Boxmeer))を、3つの異なるインフルエンザAウイルスに対する陽性対照として用いた。
コレラろ液での処理および56℃にて熱不活性化後、血清を抗HA抗体の存在について検査した。この目的のために、1%シチメンチョウ赤血球および4HA単位のインフルエンザウイルスA/HK/156/97、A/VN/1194/04またはA/IND/5/05のどれかを用いて標準手順にしたがって、赤血球凝集阻害アッセイ(HI)を用いた(パーマー(Palmer),D.F.,M.T.コールマン(Coleman),W.R.ダウドル(Dowdle),他 1975.『インフルエンザ診断のための新検査法』(Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis),p.51−52.免疫学(Immunology)シリーズNo.6.米国保健教育福祉省(United States Department of Health,Education and Welfare)、ワシントンD.C)。この目的のために、基本的な切断部位が除去された逆遺伝学ウイルスを作製した。これらの逆遺伝学ウイルスの使用を検証し、および得られた力価は野生型株に対するものと同等であった(データ記載せず)。血清をまた、微量ウイルス中和(VN)アッセイを各ウイルス100TCID50を用いて、その3つのインフルエンザウイルスに特異的なウイルス中和抗体の存在について検査した(フランク(Frank),A.L.,J.パック(Puck),B.J.ヒューズ(Hughes),他 1980.『連続細胞株および新鮮血清増強を用いるインフルエンザA および B および パラインフルエンザ 1 および 2 ウイルスについての微量中和試験』(Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2 viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement.)J Clin Microbiol 12:426−32)。不活性化H5N2インフルエンザウイルスA/Duck/Potsdam/1402/86で2回免疫したハクチョウから得られた過免疫血清(インターベット社(Intervet)、オランダ、ボクスメール(Boxmeer))を、3つの異なるインフルエンザAウイルスに対する陽性対照として用いた。
組織病理
ホルマリンで膨張させた肺を10%中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、4μmにて切片を作製し、および組織学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。さらに、スライドを、インフルエンザAウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体(クローンHB65 IgG2a(米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)))を用いて免疫ペルオキシダーゼ法を用いて染色した。ヤギ抗マウスIgG2aHRP(サザンバイオテック社(Southern Biotech)、米国アラバマ州バーミンガム(Birmingham))を二次抗体として用いた。ペルオキシダーゼはジアミノベンジジンを基質として用いて明らかにされ、結果としてインフルエンザA感染細胞の核に深赤色の沈澱、および細胞質のより弱い赤色染色を生じた。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
ホルマリンで膨張させた肺を10%中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、4μmにて切片を作製し、および組織学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。さらに、スライドを、インフルエンザAウイルスの核タンパク質に対するモノクローナル抗体(クローンHB65 IgG2a(米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)))を用いて免疫ペルオキシダーゼ法を用いて染色した。ヤギ抗マウスIgG2aHRP(サザンバイオテック社(Southern Biotech)、米国アラバマ州バーミンガム(Birmingham))を二次抗体として用いた。ペルオキシダーゼはジアミノベンジジンを基質として用いて明らかにされ、結果としてインフルエンザA感染細胞の核に深赤色の沈澱、および細胞質のより弱い赤色染色を生じた。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
統計解析
ウイルス力価および抗体力価についてのデータを、両側スチューデント(Student)tアッセイを用いて分析し、および差はP<0.05にて有意とした。
ウイルス力価および抗体力価についてのデータを、両側スチューデント(Student)tアッセイを用いて分析し、および差はP<0.05にて有意とした。
臨床徴候
感染後2日目から、PBSまたはwtMVAで免疫されたマウスは、感染に用いたインフルエンザH5N1ウイルスとは無関係に、猫背、速い呼吸、被毛の乱れ、および筋力の低下といった臨床徴候を生じた。これらの臨床徴候は、MVA−HA−HK/97またはMVA−HA−VN/04の接種後にインフルエンザウイルスA/HK/156/97またはA/VN/1194/04に感染したマウスでは観察されなかった。MVA−HA−VN/04接種はまた、インフルエンザウイルスA/IND/5/05の感染によって引き起こされる臨床徴候の発症も防止した。臨床徴候に対する観察された防御は、感染後の体重減少の低減と相関した(図1)。PBSおよびwtMVA免疫化マウスでは、16.2%および11.5%の平均体重減少がインフルエンザウイルスA/HK/156/97の感染後に(図1A)、または16.9%および10.4%がインフルエンザウイルスA/VN/1194/04の感染後に(図1B)、それぞれ観察された。この体重減少は、MVA−HA−HK/97またはMVA−HA−VN/04の接種によって顕著に低減された(図1)。また、インフルエンザウイルスA/IND/5/05の感染(図1C)はPBS免疫化対照マウスまたはwtMVA接種マウス(それぞれ16.9%および18.6%)において重度の体重減少を生じ、それはMVA−HA−VN/04の接種によって顕著に低減されたが、しかしMVA−HA−HK/97の接種では低減されなかった。
感染後2日目から、PBSまたはwtMVAで免疫されたマウスは、感染に用いたインフルエンザH5N1ウイルスとは無関係に、猫背、速い呼吸、被毛の乱れ、および筋力の低下といった臨床徴候を生じた。これらの臨床徴候は、MVA−HA−HK/97またはMVA−HA−VN/04の接種後にインフルエンザウイルスA/HK/156/97またはA/VN/1194/04に感染したマウスでは観察されなかった。MVA−HA−VN/04接種はまた、インフルエンザウイルスA/IND/5/05の感染によって引き起こされる臨床徴候の発症も防止した。臨床徴候に対する観察された防御は、感染後の体重減少の低減と相関した(図1)。PBSおよびwtMVA免疫化マウスでは、16.2%および11.5%の平均体重減少がインフルエンザウイルスA/HK/156/97の感染後に(図1A)、または16.9%および10.4%がインフルエンザウイルスA/VN/1194/04の感染後に(図1B)、それぞれ観察された。この体重減少は、MVA−HA−HK/97またはMVA−HA−VN/04の接種によって顕著に低減された(図1)。また、インフルエンザウイルスA/IND/5/05の感染(図1C)はPBS免疫化対照マウスまたはwtMVA接種マウス(それぞれ16.9%および18.6%)において重度の体重減少を生じ、それはMVA−HA−VN/04の接種によって顕著に低減されたが、しかしMVA−HA−HK/97の接種では低減されなかった。
臓器におけるウイルス複製
感染性ウイルス力価を脳,腸,肺および脾臓において、インフルエンザウイルスA/HK/156/97(図2A),A/VN/1194/04(図2B)またはA/IND/5/05(図2C)の感染後4日目に測定した。
感染性ウイルス力価を脳,腸,肺および脾臓において、インフルエンザウイルスA/HK/156/97(図2A),A/VN/1194/04(図2B)またはA/IND/5/05(図2C)の感染後4日目に測定した。
感染後、最高のウイルス複製が肺で観察され、インフルエンザウイルスA/HK/156/97、A/VN/1194/04またはA/IND/5/05にそれぞれ後で感染した非防御PBS接種マウスについて、平均肺ウイルス力価107.9、107.8および108.9TCID50/グラム組織であった。また、wtMVAを接種したマウスは防御されず、および同様の平均ウイルス力価が感染マウスの肺で見られた。非防御マウスの両方の群の一部の動物で、ウイルス複製が脳、腸および脾臓を含む呼吸組織外で実証できた(表1)。
表1はマウス各個体で観察された感染性ウイルスの検出および重量減少を示す。6未満の群数は実験とは無関係の合併症のための死亡によって生じる。
MVA−HA−HK/97の接種は肺および他の臓器におけるインフルエンザウイルスA/HK/156/97の複製を完全に防いだ一方、MVA−HA−VN/04接種では肺におけるウイルス複製の低減がマウス6匹中4匹で観察された。
インフルエンザウイルスA/VN/1194/04のチャレンジ感染後は、逆であった:MVA−HA−VN/04の接種は複製を完全に防ぎ、一方、MVA−HA−HK/97の接種はウイルス複製を部分的に低減しただけであった。
低減はPBS接種マウスと比較して統計的に有意であり(p<0.05)、一方、wtMVA接種マウスについてはそのような差は観察されなかった。
MVA−HA−VN/04の接種はまた、インフルエンザウイルスA/IND/5/05の複製を肺においてマウス6匹中4匹で防ぎ、PBSおよびwtMVA接種マウスと比較した平均肺力価の低下を結果として生じた。MVA−HA−HK/97の接種はインフルエンザウイルスA/IND/5/05の複製を防がず、および6匹全部のマウスが検査で陽性となった(上の表1参照)。スティミューン(登録商標)でアジュバント化した不活性化全ウイルスワクチンNIBRG−14の接種は相同株インフルエンザウイルスA/VN/1194/04の複製だけでなくA/HK/156/97およびA/IND/5/05の複製も防いだ。
血清学
MVA−HA−HK/97の単回接種に際して、マウスは相同ウイルス株に対する強い抗体応答を生じたが、しかし抗体は、HIおよびVN検査によって測定した通り、インフルエンザウイルス株A/VN/1194/04またはA/IND/5/05と交差反応しなかった(図3)(それぞれGMT1629および239)。ブースター接種後、HIおよびVNアッセイにおける相同抗体力価はそれぞれ1370および744GMTであった。再び、残りのH5N1株との交差反応は観察されなかった。MVA−HA−VN/04ワクチン製剤は免疫原性がより低く、および単回接種後、1匹だけで、相同株に対する抗体がVNアッセイで検出可能であった。ブースター接種に際して、すべての動物が応答し、およびGMTはHIおよびVNアッセイによる測定でそれぞれ20および64へ上昇した。MVA−HA−VN/04接種によって誘導された抗体は、H5N1株A/HK/156/97と、および限られた程度でA/IND/5/05株と交差反応した。陽性対照として実験に含められたアジュバント化NIBRG−14ワクチン製剤は、相同A/VN/1194/04に対する頑健な抗体応答を誘導し、それはHIおよびVNアッセイの両方でA/HK/156/97およびA/IND/5/05株と交差反応した。
MVA−HA−HK/97の単回接種に際して、マウスは相同ウイルス株に対する強い抗体応答を生じたが、しかし抗体は、HIおよびVN検査によって測定した通り、インフルエンザウイルス株A/VN/1194/04またはA/IND/5/05と交差反応しなかった(図3)(それぞれGMT1629および239)。ブースター接種後、HIおよびVNアッセイにおける相同抗体力価はそれぞれ1370および744GMTであった。再び、残りのH5N1株との交差反応は観察されなかった。MVA−HA−VN/04ワクチン製剤は免疫原性がより低く、および単回接種後、1匹だけで、相同株に対する抗体がVNアッセイで検出可能であった。ブースター接種に際して、すべての動物が応答し、およびGMTはHIおよびVNアッセイによる測定でそれぞれ20および64へ上昇した。MVA−HA−VN/04接種によって誘導された抗体は、H5N1株A/HK/156/97と、および限られた程度でA/IND/5/05株と交差反応した。陽性対照として実験に含められたアジュバント化NIBRG−14ワクチン製剤は、相同A/VN/1194/04に対する頑健な抗体応答を誘導し、それはHIおよびVNアッセイの両方でA/HK/156/97およびA/IND/5/05株と交差反応した。
肺における病理変化およびウイルス複製
3つのHPAIウイルスのどれかの感染4日後、マウスを屠殺しおよびその肺をホルマリンで膨張させ、および組織学的に、および免疫組織化学を用いて検査した。wtMVA免疫化およびPBS免疫化マウスへのインフルエンザウイルスA/Hongkong/156/97の接種は、軽度の気管支周囲浸潤および軽度の細気管支壁の壊死を伴う、細気管支上皮および肺胞上皮の多巣性感染を結果として生じた(図4A、E)。MVA−HA−HK/97およびMVA−HA−VN/04免疫化マウスの肺では、感染後4日目にウイルスは検出されず、および組織病理学的変化は見られなかった(図4B、C)。インフルエンザウイルスA/VN/1194/04感染は、細気管支周囲および肺胞上皮のより強い多巣性感染を、PBSおよびwtMVA免疫化マウスの両方で生じた(図AF、J)。さらにこれらのマウスは細気管支上皮の損失を基礎とする中等度の間質性肺炎、重度の気管支周囲浸潤および肺胞損傷に罹患した。MVA−HA−HK/97免疫化マウスの肺胞上皮の感染はより少ないように見えたが、しかし肺胞浸潤はより明瞭であった(図4G)。MVA−HA−VN/04免疫化マウスの肺では、ウイルス複製は検出されず、および形態は正常であった(図4H)。インフルエンザウイルスA/IND/5/05の感染は、細気管支上皮および肺胞上皮の両方の広範囲の感染を、wtMVA、PBSおよびMVA−HA−HK/97免疫化マウスにおいて生じた(図4K、L、O)。さらに、細気管支上皮の消失および細気管支内細胞残渣の存在に次いで、細気管支および肺胞の両方における中等度の浸潤が見られた。MVA−HA−VN/04免疫化マウスは、中等度の細気管支周囲浸潤と同時に、少数の細気管支周囲インフルエンザウイルスA/IND/5/05感染細胞を有した(図4M)。アジュバント化NIBRG−14で免疫化されたマウスは、正常な肺を有し、および3つのインフルエンザH5N1ウイルスのどれの感染後もウイルス複製は見られなかった(図4D、I、N)。
3つのHPAIウイルスのどれかの感染4日後、マウスを屠殺しおよびその肺をホルマリンで膨張させ、および組織学的に、および免疫組織化学を用いて検査した。wtMVA免疫化およびPBS免疫化マウスへのインフルエンザウイルスA/Hongkong/156/97の接種は、軽度の気管支周囲浸潤および軽度の細気管支壁の壊死を伴う、細気管支上皮および肺胞上皮の多巣性感染を結果として生じた(図4A、E)。MVA−HA−HK/97およびMVA−HA−VN/04免疫化マウスの肺では、感染後4日目にウイルスは検出されず、および組織病理学的変化は見られなかった(図4B、C)。インフルエンザウイルスA/VN/1194/04感染は、細気管支周囲および肺胞上皮のより強い多巣性感染を、PBSおよびwtMVA免疫化マウスの両方で生じた(図AF、J)。さらにこれらのマウスは細気管支上皮の損失を基礎とする中等度の間質性肺炎、重度の気管支周囲浸潤および肺胞損傷に罹患した。MVA−HA−HK/97免疫化マウスの肺胞上皮の感染はより少ないように見えたが、しかし肺胞浸潤はより明瞭であった(図4G)。MVA−HA−VN/04免疫化マウスの肺では、ウイルス複製は検出されず、および形態は正常であった(図4H)。インフルエンザウイルスA/IND/5/05の感染は、細気管支上皮および肺胞上皮の両方の広範囲の感染を、wtMVA、PBSおよびMVA−HA−HK/97免疫化マウスにおいて生じた(図4K、L、O)。さらに、細気管支上皮の消失および細気管支内細胞残渣の存在に次いで、細気管支および肺胞の両方における中等度の浸潤が見られた。MVA−HA−VN/04免疫化マウスは、中等度の細気管支周囲浸潤と同時に、少数の細気管支周囲インフルエンザウイルスA/IND/5/05感染細胞を有した(図4M)。アジュバント化NIBRG−14で免疫化されたマウスは、正常な肺を有し、および3つのインフルエンザH5N1ウイルスのどれの感染後もウイルス複製は見られなかった(図4D、I、N)。
Claims (23)
- 異種核酸の配列がインフルエンザAウイルスクラスH5抗原に由来する、薬物の、特にワクチンの製造のための、異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)の使用。
- 異種核酸がMVAのゲノム内の非必須部位に組み込まれている、請求項1に記載の使用。
- 異種核酸がMVAゲノムへ欠失IIIの部位にて組み込まれている、請求項2に記載の使用。
- 異種核酸が、ワクシニアウイルス特異的プロモーター、またはオルソポックスウイルス特異的プロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、請求項1から3に記載の使用。
- 異種核酸の配列が、H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N7、H7N3、およびH9N2配列の群から選択される、請求項1から4に記載の使用。
- 異種核酸の配列がH5N1に由来し、および、A/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/3046/04、A/Hongkong/156/97、A/HongKong/212/03、A/HongKong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Ck/Indonesia/BL03/03、A/Grey heron/HK/793.1/02、A/Black Headed Gull/HK/12.1/03、A/Dk/Vietnam/11/04、A/Ck/Vietnam/33/04、A/Ck/Vietnam/C−58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06、A/Ck/HK/947/06と呼ばれる株の群から選択される、請求項5に記載の使用。
- H5N1の異種核酸の配列が、A/Vietnam/1194/04、A/Indonesia/5/2005、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、A/Whooper swan/Mongolia/244/2005、A/turkey/Turkey/1/2005、および A/Anhui/1/2005株の配列である、請求項6に記載の使用。
- 異種核酸の配列が、ヌクレオチド1ないし1500、ヌクレオチド1ないし1100またはヌクレオチド40ないし1100のヘマグルチニン遺伝子の配列または配列の一部を含む、請求項1から7に記載の使用。
- 核酸がHA1およびHA2サブユニットを含む、請求項6または7に記載の使用。
- 核酸が、
a.単一H5N1株の異なる遺伝子またはその一部および/または,
b.異なるH5N1株
に由来する2つ以上の配列をコードする、請求項6から9に記載の使用。 - 2つ以上の配列が、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、および、A/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、Vietnam/3046/04、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、A/Whooper swan/Mongolia/244/2005、A/turkey/Turkey/1/2005、およびA/Anhui/1/2005、および/またはA/IND/5/05に由来する、請求項10に記載の使用。
- a.異種核酸がMVAのゲノム内の非必須位置に組み込まれている、
b.異種核酸がワクシニアウイルスプロモーター、またはオルソポックスウイルスプロモーター、またはポックスウイルス特異的プロモーターの調節下にある、および,
c.異種核酸がインフルエンザAウイルスクラスH5に由来する遺伝子または遺伝子の一部をコードする核酸の群から選択される、
異種核酸を含む組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。 - 異種核酸が、H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N7、H7N3、およびH9N2ゲノム配列の群から選択される、請求項12に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
- 異種核酸がH5N1に由来し、および、A/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/3046/04、A/Hongkong/156/97、A/HongKong/212/03、A/HongKong/213/03、A/Indonesia/5/05 、A/Ck/Indonesia/BL03/03、A/Grey heron/HK/793.1/02、A/Black Headed Gull/HK/12.1/03、A/Dk/Vietnam/11/04、A/Ck/Vietnam/33/04、A/Ck/Vietnam/C−58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06、A/Ck/HK/947/06と呼ばれる株の群から選択される、請求項13に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
- H5N1の異種核酸が、A/Vietnam/1194/04、A/Indonesia/5/2005、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、A/Whooper swan/Mongolia/244/2005、A/turkey/Turkey/1/2005、および A/Anhui/1/2005株から選択される、請求項14に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
- 異種核酸の配列が、ヘマグルチニン遺伝子の配列、または配列の一部を含む、請求項15に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
- 核酸がHA1およびHA2サブユニットを含む、請求項16に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
- 核酸が、
a.単一H5N1株の異なる遺伝子またはその一部および/または,
b.異なるH5N1株
に由来する2つ以上の配列をコードする、請求項12から16に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。 - 2つ以上の配列が、ヘマグルチニン、またはヘマグルチニンの一部をコードし、および、A/Vietnam/1203/04、A/Vietnam/1194/04、A/Vietnam/3046/04、A/Hongkong/156/97、A/HongKong/212/03、A/HongKong/213/03、A/Indonesia/5/05、A/Ck/Indonesia/BL03/03、A/Grey heron/HK/793.1/02、A/Black Headed Gull/HK/12.1/03、A/Dk/Vietnam/11/04、A/Ck/Vietnam/33/04、A/Ck/Vietnam/C−58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06 およびA/Ck/HK/947/06に由来する配列から選択される、請求項18に記載の組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)。
- 請求項12から19のいずれかに記載の修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(MVA)をコードする核酸。
- 請求項16から25のいずれかに記載の組み換えMVAを用いた標的細胞の感染を含む、請求項12から20のいずれかに記載の組み換えMVAを標的細胞へ導入する方法。
- ヒトを含む動物生体の免疫化のための方法であって、必要とする前記ヒトを含む動物生体へ請求項16から20に記載のMVAの治療上有効な量を投与することを含む、前記方法。
- 免疫化が予防的および/または治療的の両方でありうる、請求項22に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06124336A EP1925318A1 (en) | 2006-11-20 | 2006-11-20 | Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu |
PCT/EP2007/062446 WO2008061939A1 (en) | 2006-11-20 | 2007-11-16 | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva)-based vaccine for the avian flu |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010510281A true JP2010510281A (ja) | 2010-04-02 |
Family
ID=38458210
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009537609A Pending JP2010510281A (ja) | 2006-11-20 | 2007-11-16 | 鳥インフルエンザのための組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(mva)に基づくワクチン |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110020391A1 (ja) |
EP (2) | EP1925318A1 (ja) |
JP (1) | JP2010510281A (ja) |
KR (1) | KR20090117697A (ja) |
CN (1) | CN101636177A (ja) |
WO (1) | WO2008061939A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012050229A1 (ja) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | 財団法人東京都医学総合研究所 | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス |
JP2013048597A (ja) * | 2011-08-31 | 2013-03-14 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するDIs株由来組換えワクシニアウイルス |
JP2013525428A (ja) * | 2010-04-30 | 2013-06-20 | テマセック・ライフ・サイエンシズ・ラボラトリー・リミテッド | H5n1系列に対する汎用ワクチン |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7628980B2 (en) | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
EE05680B1 (et) | 2000-11-23 | 2013-10-15 | Bavarian Nordic A/S | Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin |
DK1351981T3 (da) | 2001-01-19 | 2012-11-26 | Vironovative Bv | Et virus, der forårsager luftvejssygdom hos modtagelige pattedyr |
US20040005545A1 (en) | 2002-02-21 | 2004-01-08 | Fouchier Ronaldus Adrianus Maria | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus |
KR101028937B1 (ko) | 2002-04-19 | 2011-04-12 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라 |
KR20110049802A (ko) * | 2008-07-25 | 2011-05-12 | 인스티튜트 포 리서치 인 바이오메드슨 | 중화 항-인플루엔자 a 바이러스 항체 및 이의 용도 |
US8871207B2 (en) | 2008-07-25 | 2014-10-28 | Humabs, LLC | Neutralizing anti-influenza A virus antibodies and uses thereof |
BRPI1011034A2 (pt) * | 2009-05-18 | 2016-03-15 | Panacea Biotec Ltd | vacina de gripe universal baseada no vírus ancara vaccinia modificado (mva) recombinante |
US9005632B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-14 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains |
US9011874B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-21 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs |
US20110159031A1 (en) * | 2009-12-22 | 2011-06-30 | Baxter International Inc. | Vaccine to Influenza A Virus |
CA2793772A1 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Ectodomains of influenza matrix 2 protein, expression system, and uses thereof |
WO2011138032A2 (en) * | 2010-05-05 | 2011-11-10 | Artemev, Timur | Universal influenza vaccines and methods for their generation |
NZ608143A (en) | 2010-10-15 | 2015-02-27 | Bavarian Nordic As | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) influenza vaccine |
CN102140441B (zh) * | 2010-11-04 | 2013-12-18 | 高福 | 基于减毒痘苗病毒天坛株为载体的禽流感疫苗 |
EP2646050B1 (en) | 2010-12-02 | 2016-09-07 | mAB-Factory GmbH | Vaccine against influenza h5n1 viruses, medicament and treatment of h5n1 viral infections |
ES2841899T3 (es) | 2011-07-18 | 2021-07-12 | Inst Res Biomedicine | Anticuerpos neutralizantes del virus de la influenza A y usos de los mismos |
KR101582490B1 (ko) * | 2014-04-14 | 2016-01-19 | 아이디바이오 주식회사 | 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 바이러스 백신 |
MX2015006599A (es) * | 2015-05-19 | 2016-11-18 | Viren S A De C V | Secuencias de ácidos desoxirribonucleicos sintéticos y proteinas recombinantes heterólogas de la hemaglutinina del virus influenza expresadas en cloroplasto de chlamydomonas reinhardtii y su uso en vacunas. |
JPWO2020100990A1 (ja) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR0113577A (pt) * | 2000-08-29 | 2004-07-06 | Wyeth Corp | Empacotamento de partìculas de replicon de vìrus de rna de filamento positivo |
MX2007007586A (es) * | 2004-12-21 | 2007-12-10 | Vaxinnate Corp | Composiciones de proteinas de virus de gripe y metodos de uso de las mismas. |
GB0507997D0 (en) * | 2005-02-01 | 2005-05-25 | Powderject Vaccines Inc | Nucleic acid constructs |
-
2006
- 2006-11-20 EP EP06124336A patent/EP1925318A1/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-11-16 JP JP2009537609A patent/JP2010510281A/ja active Pending
- 2007-11-16 WO PCT/EP2007/062446 patent/WO2008061939A1/en active Application Filing
- 2007-11-16 KR KR1020097013017A patent/KR20090117697A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-11-16 EP EP07822665A patent/EP2094299A1/en not_active Withdrawn
- 2007-11-16 US US12/515,716 patent/US20110020391A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-16 CN CN200780049450A patent/CN101636177A/zh active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013525428A (ja) * | 2010-04-30 | 2013-06-20 | テマセック・ライフ・サイエンシズ・ラボラトリー・リミテッド | H5n1系列に対する汎用ワクチン |
US9555093B2 (en) | 2010-04-30 | 2017-01-31 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Universal vaccine against H5N1 lineages |
WO2012050229A1 (ja) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | 財団法人東京都医学総合研究所 | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス |
JP2016178945A (ja) * | 2010-10-15 | 2016-10-13 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス |
JP6013185B2 (ja) * | 2010-10-15 | 2016-10-25 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス |
JP2013048597A (ja) * | 2011-08-31 | 2013-03-14 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するDIs株由来組換えワクシニアウイルス |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1925318A1 (en) | 2008-05-28 |
CN101636177A (zh) | 2010-01-27 |
KR20090117697A (ko) | 2009-11-12 |
EP2094299A1 (en) | 2009-09-02 |
WO2008061939A1 (en) | 2008-05-29 |
US20110020391A1 (en) | 2011-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010510281A (ja) | 鳥インフルエンザのための組み換え修飾ワクシニアウイルス・アンカラ(mva)に基づくワクチン | |
Chen et al. | Advances in development and application of influenza vaccines | |
US20120141525A1 (en) | Universal influenza vaccine based on recombinant modified vaccine ankara virus (mva) | |
JP5933565B2 (ja) | 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラインフルエンザワクチン | |
CN103458922B (zh) | 诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法 | |
US20230310583A1 (en) | Recombinant newcastle disease virus expressing sars-cov-2 spike protein and uses thereof | |
US20130115234A1 (en) | Ectodomains of Influenza Matrix 2 Protein, Expression System, and Uses Thereof | |
CN117098551A (zh) | 编码截短的ns1蛋白和sars-cov受体结合域的流感病毒 | |
Wu et al. | Development and evaluation of Newcastle disease-avian influenza bivalent vector vaccines in commercial chickens | |
EP3240568A1 (en) | Recombinant influenza virus vaccines for influenza and respiratory syncytial virus | |
CA2962100C (en) | Virus-based expression vectors and uses thereof | |
US20170151323A1 (en) | Recombinant swine influenza virus and uses thereof | |
US20180016560A1 (en) | Novel influenza virus | |
WO2016172588A1 (en) | Attenuated influenza vaccines and uses thereof | |
KR101302245B1 (ko) | 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 신규한 보강 인플루엔자 백신 | |
RU2680537C1 (ru) | Лентивирусная плазмида (варианты), способ ее получения (варианты), набор праймеров для получения лентивирусного плазмидного вектора (варианты) |