JP2013048597A - 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するDIs株由来組換えワクシニアウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明にかかる組換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、新型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルスである。
【選択図】なし
Description
各種ワクチンの中でも、生ワクチンは最も有効の高いものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンの開発には非常に長い期間を必要とすることが知られている。これまでに、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用又はリンダペスト用の組換えワクシニアウイルス(RVV)は、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている(非特許文献2)。さらに、重症急性呼吸器症候群(SARS)に対しても、その病原体として知られるSARS-CoVのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており(特許文献1)、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている(非特許文献3)。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
上記(1)の組換えワクシニアウイルスにおいて、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスは、例えば、H5亜型クレード1、H5亜型クレード2.1、H5亜型クレード2.2又はH5亜型クレード2.3に属するウイルス株が挙げられ、H1N1パンデミックインフルエンザウイルスは、例えば、H1亜型に属するウイルス株が挙げられる。
(a) 配列番号1に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード1に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.1に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(e) 配列番号3に示す塩基配列からなるDNA
(f) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.2に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(g) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA
(h) 配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.3に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(i) 配列番号5に示す塩基配列からなるDNA
(j) 配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1亜型に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
上記(2)の医薬組成物は、例えば、インターロイキン-15をコードするcDNAを含む組換えワクシニアウイルスをさらに含んでいてもよい。
上記(2)の医薬組成物は、例えば、H5N1高病原性鳥インフルエンザ若しくはH1N1パンデミックインフルエンザの予防薬又は治療薬が挙げられる。
1.本発明の概要
各種ワクチンの中でも、生ワクチンは特に有効なものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンを開発するには非常に長い期間が必要となることが知られており、このことは新型インフルエンザに関しても同様であるといえる。
2.新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの作製
H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質遺伝子は、すでに米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)において、所定のアクセッション番号(Accession No.)により登録されている。例えば、GenBankアクセッション番号:EF541402に、H5N1 HPAIVのクレード1(H5亜型クレード1に属するウイルス株)由来のHAタンパク質をコードする遺伝子(cDNA:配列番号1)が登録され、GenBankアクセッション番号:EF541394に、H5N1 HPAIVのクレード2.1(H5亜型クレード2.1に属するウイルス株)由来のHAタンパク質をコードする遺伝子(cDNA:配列番号2)が登録され、GenBankアクセッション番号:DQ371928に、H5N1 HPAIVのクレード2.3(H5亜型クレード2.3に属するウイルス株)由来のHAタンパク質をコードする遺伝子(cDNA:配列番号4)が登録されている。また、GenBankアクセッション番号:FJ969540に、H1N1(2009) pdm(H1亜型に属するウイルス株)由来のHAタンパク質をコードする遺伝子(cDNA:配列番号5)が登録されている。
配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA(変異型DNA)。
配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード1由来のHAタンパク質をコードするDNA(mCl 1の変異型DNA)。
配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.1由来のHAタンパク質をコードするDNA(変異型DNA)。
配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.2由来のHAタンパク質をコードするDNA(mCl 2.2の変異型DNA)。
配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA(変異型DNA)。
配列番号11に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5N1 HPAIVのクレード2.3由来のHAタンパク質をコードするDNA(mCl 2.3の変異型DNA)。
配列番号12に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1N1(2009) pdm由来のHAタンパク質をコードするDNA(mIVR153の変異型DNA)。
本発明において使用可能なハイブリッドプロモーターの塩基配列を配列番号6に示す。但し、本発明においては、配列番号6に示す塩基配列からなるDNAのほか、配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNAも、発現プロモーター(特にハイブリッドプロモーター)として使用することができる。「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。上記ハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。
H5N1 HPAIV又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質の発現は、rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2、rDIs/mCl2.3及びrDIs/mIVR153を感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、抗体は、H5N1 HPAIVのHAタンパク質由来のHAペプチド(a.a. 198-217(配列番号7)等)、又はH1N1(2009) pdmのHAタンパク質由来のHAペプチド(a.a. 223-234(配列番号8)等)を免疫して作製したウサギ抗血清を用いることができる。
3.新型インフルエンザの予防用及び治療用医薬組成物
本発明は、DIs株由来の上記組換えワクシニアウイルスを含む、新型インフルエンザ(すなわちH5N1高病原性鳥インフルエンザ及びH1N1パンデミックインフルエンザ)の予防薬及び治療薬(予防用及び治療用医薬組成物)を提供する。また本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを患者(被験者)に投与することを含む、上記新型インフルエンザの予防及び治療方法や、上記新型インフルエンザの予防及び治療のための上記組換えワクシニアウイルスの使用や、上記新型インフルエンザの予防薬及び治療薬を製造するための上記組換えワクシニアウイルスの使用等も提供することができる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
以上のとおり、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルスは、新型インフルエンザに対する液性免疫を誘導し得るものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
1) インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子を導入したDIs株由来組換えワクシニアウイルスの作製
ワクシニアウイルスプロモーターmH5配列の下流に人工合成したH5N1 HPAIV及びH1N1(2009)pdmの抗原であるヘマグルチニンタンパク質(HA)遺伝子を連結させ、相同組換え用プラスミドベクターへ挿入した(図1)。この際、H5N1亜型HA配列を挿入する場合には、制限酵素部位としてHind III部位を使用し、H1N1亜型HA配列を挿入する場合には、MluI部位を使用した。予めDIs株を感染させておいたCEFへ作製した相同組換え用プラスミドベクター(制限酵素により一箇所切断し、線状化した。)を遺伝子導入することによって、DIs株の遺伝子欠損部位の隣接領域にて相同組換えを起こさせてワクシニアウイルスのゲノム中にmH5プロモーター及びインフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を挿入した組換えワクシニアウイルス(RVV)、具体的には、rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2、rDIs/mCl2.3及びrDIs/mIVR153の各種RVVを作出した。インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質は、モルモット赤血球に対して凝集反応を示すが、ワクシニアウイルス由来のHAタンパク質はモルモット赤血球に対して凝集反応を起こさない。従って、上記組換えウイルスをCEFに感染させ、これにより形成するプラークへのモルモット赤血球の凝集反応を指標にして、RVVのスクリーニングを行った。目的の組換えウイルスは、赤血球凝集活性を持つレッドプラークを形成するものを選別した。
作製したDIs株由来の組換えワクシニアウイルス(rDIs/mCl2.2及びrDIs/mIVR153)を、ウイルス感染価(multiplicity of infection)10でCEFに感染させた。感染24時間後に、培地を除去し、PBS(-)で2回洗浄した。可溶化液を加えて、細胞可溶化液を調製した。細胞可溶化液中に含まれるタンパク質量を3〜30μgでSDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行い、PVDF膜へ転写した。それぞれのRVV感染によるインフルエンザウイルスタンパク質発現の確認は、H1N1(2009)pdmに対しては、一次抗体にウサギ抗インフルエンザウイルスHAペプチド(Pep20)抗血清及び二次抗体にヒツジ抗ウサギIgG抗体-HRPOを使用した。H5N1 HPAIVに対しては、一次抗体にウサギ抗インフルエンザウイルスHAペプチド(Pep10)抗血清及び二次抗体にヒツジ抗ウサギIgG抗体-HRPOを使用した。Millipore社製発色試薬(Millipore;Immobilon western)を使用した。
各々の組換えワクシニアウイルス(rDIs/mCl2.2及びrDIs/mIVR153)を1x106 PFUまたは1x107PFUでマウスの背部皮内へ接種した。接種から3週間後に採血を行い、それぞれH1N1(2009)pdmまたはH5N1 mCL2.2のインフルエンザウイルスHA抗原に対する抗体産生能をELISA法により評価した。H5N1用RVVでは、hIL-15発現RVV(rDIs/hIL-15)との併用接種も行った。
各々の組換えワクシニアウイルス(rDIs/mCl2.2及びrDIs/mIVR153)の接種(ワクチン接種)から5週間後にインフルエンザウイルスの攻撃感染を行い、連日体重測定を行った後に剖検し、肺組織サンプル採取と採血を行った。(H1N1(2009)pdm感染実験では、感染から9日後に剖検を行い、H5N1 HPAIV(クレード2.3)感染実験では、感染から11日後に剖検を行った。)
採取した肺組織を10%緩衝ホルマリン溶液に浸漬して、ウイルス不活化と組織固定を行った後、組織のパラフィンブロックを作製した。4μmの薄切を作製し、スライドガラスに張り付けた後、ヘマトキシリンとエオジン染色を行った。
作製したRVV(rDIs/mCl2.2及びrDIs/mIVR153)によるインフルエンザウイルスHAタンパク質発現を確認した。H1N1(2009)pdmのHAタンパク質、H5N1HPAIVのHAタンパク質ともに電気泳動に使用した細胞可溶化液のタンパク質量に依存して発現量が増加した(図3)。
インフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を発現するDIs株由来RVVは、H1N1(2009)pdm用ワクチン(rDIs/mIVR153)としては、1x106 PFUの単回接種にて十分なワクチン効果を示すことが判明した。他方、H5N1 HPAIV用ワクチン(rDIs/mCl2.2)としては、1x107 PFU量のRVVを単回接種することで、致死性のH5N1 HAPIV攻撃感染に対しても速やかな体重回復と100%の生存率を示した。よって、DIs株由来RVVは、H1N1(2009)pdm用ワクチン及びH5N1 HPAIV用ワクチンのいずれのワクチンとしても十分な効果を有するものである。さらに、本実施例においては、全粒子不活化ワクチンでは困難であった、ワクチンとは異なるクレードのウイルス株の攻撃感染(ワクチンがクレード2.2、攻撃ウイルスがクレード2.3の場合)であっても、100%の生存率を認めた。また、仮にRVVの単回接種によるワクチン効果が低くなる可能性がある場合があっても、rDIs/hIL-15との併用接種により、十分なワクチン効果を発揮できることが判明した。
配列番号10:組換えDNA
配列番号11:組換えDNA
配列番号12:組換えDNA
Claims (8)
- ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス又はH1N1パンデミックインフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
- H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスが、H5亜型クレード1、H5亜型クレード2.1、H5亜型クレード2.2又はH5亜型クレード2.3に属するウイルス株である、請求項1に記載の組換えワクシニアウイルス。
- H1N1パンデミックインフルエンザウイルスが、H1亜型に属するウイルス株である、請求項1に記載の組換えワクシニアウイルス。
- ヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAが、以下の(a)〜(j)のDNAである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えワクシニアウイルス。
(a) 配列番号1に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード1に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.1に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(e) 配列番号3に示す塩基配列からなるDNA
(f) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.2に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(g) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA
(h) 配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H5亜型クレード2.3に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
(i) 配列番号5に示す塩基配列からなるDNA
(j) 配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H1亜型に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
- インターロイキン-15をコードするcDNAを含む組換えワクシニアウイルスをさらに含む、請求項5に記載の医薬組成物。
- H5N1高病原性鳥インフルエンザ又はH1N1パンデミックインフルエンザの予防薬である、請求項5又は6に記載の医薬組成物。
- H5N1高病原性鳥インフルエンザ又はH1N1パンデミックインフルエンザの治療薬である、請求項5又は6に記載の医薬組成物。
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