WO2022025298A1

WO2022025298A1 - 組換えワクシニアウイルス

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Publication number: WO2022025298A1
Application number: PCT/JP2021/029240
Authority: WO
Inventors: 道法小原; 文彦安井; 靖伊藤; 孝司石井
Original assignee: 公益財団法人東京都医学総合研究所; 国立大学法人滋賀医科大学; 国立感染症研究所長が代表する日本国
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2022-02-03
Also published as: JPWO2022025298A1; EP4190902A1; TW202212567A; US20230295655A1

Abstract

臨床において使用可能なＣＯＶＩＤ−１９予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）としての組換えワクシニアウイルス等を提供する。本発明に係る組換えワクシニアウイルスは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質又は構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部と、発現プロモーターとを含むことを特徴とする。

Description

組換えワクシニアウイルス

　本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンとしての組換えワクシニアウイルス等に関する。

　２０１９年に中国・武漢で初めに確認されたとされる、高病原性の新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）による感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）は、その後２０２０年にかけて、世界中の各国で猛威を振るっている。感染者数は、２０２０年７月時点において確認されているだけで、全世界で１６００万人を超え、日本でも３万人を超える状況であり、そのうち死者数は、全世界で６５万人を超え、日本では約１０００人にも達している。
　ところで、ＣＯＶＩＤ−１９の快復者の約３０％ではウイルス排除後においても免疫誘導が不十分であるため（非特許文献１）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の再感染リスクが懸念される。一方で、風邪コロナウイルス感染で誘導される免疫は、感染後１、２年という比較的短期間で低下・消失し、周期的に感染が繰り返される。よって、現状では人類の多くはＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫を有していないこと、一度罹患した患者においても短期間のうちに免疫が低下してしまうこと、今後も世界中で蔓延し続け得ることを考えると、強力に免疫を誘導し、かつ長期間免疫を維持できる、ＣＯＶＩＤ−１９予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）の開発が必須である。

　また、継続的に蔓延することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に遺伝子変異が起こり得るため、変異に伴う抗原性変化にも対応し得る幅広い交差反応性を持つワクチンが求められる。更に、２００２年のＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）の出現以降、ＭＥＲＳ−ＣｏＶや今回のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２など、ヒトに感染する新型ＣｏＶが短期間に出現しており、今後も未知のＣｏＶが出現する可能性がある。よって、複数種のＣｏＶに対して防御効果を示す汎ＣｏＶ感染症予防ワクチンの開発も重要な課題である。

　先行技術文献
　非特許文献１：ＭｅｄＲｘｉｖ，２０２０（Ｆａｎ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ｉｎ　ａ　ＣＯＶＩＤ−１９　ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｃｏｈｏｒｔ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，ｍｅｄＲｘｉｖ　ｐｒｅｐｒｉｎｔ　ｄｏｉ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０３．３０．２００４７３６５．）

　このような状況下において、臨床において使用可能なＣＯＶＩＤ−１９予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）等の開発が望まれていた。

　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、組換えワクシニアウイルスや医薬組成物等を提供するものである。
（１）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質又は構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部と、発現プロモーターとを含む、組換えワクシニアウイルス。
（２）ワクシニアウイルスがＤＩｓ株である、上記（１）に記載の組換えワクシニアウイルス。
（３）前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質中のＯＲＦ１ｂ領域（ウイルス複製に必須なタンパク質をコードしている非構造タンパク質遺伝子領域）をコードするｃＤＮＡを含むものである、上記（１）又は（２）に記載の組換えワクシニアウイルス。

（４）前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のいずれかのＤＮＡである、上記（１）~（３）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルス。
　（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
（５）前記構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質中のスパイクタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むものである、上記（１）又は（２）に記載の組換えワクシニアウイルス。

（６）前記構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のいずれかのＤＮＡである、上記（１）、（２）又は（５）に記載の組換えワクシニアウイルス。
　（ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号７に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ
（７）室温下においても安定性を保持し得るものである、上記（１）~（６）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルス。
（８）上記（１）~（７）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルスを含む、医薬組成物。

（９）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の予防薬である、上記（８）に記載の医薬組成物。
（１０）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の治療薬である、上記（８）に記載の医薬組成物。
（１１）上記（１）~（７）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルスを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン。
　発明の効果

　本発明によれば、臨床において使用可能なＣＯＶＩＤ−１９予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）としての組換えワクシニアウイルス、及びそれを用いた医薬組成物等を提供することができる。本発明の組換えワクシニアウイルスは、強力に免疫を誘導し、かつ長期間免疫を維持し得る、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンとして、ＣＯＶＩＤ−１９感染症の予防又は治療に、極めて有用なものである。また、本発明の組換えワクシニアウイルスは、室温下でもＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンとしての安定性を保持し得るものであり、その保存及び輸送時の温度が冷蔵であっても室温であってもよく、実用性に優れたものである。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−Ｓ遺伝子組換えワクチン（組換えワクシニアウイルス）の発症防御効果（ＳＡＲＳワクチンでの実績）を示す図である。コロナウイルスゲノムでの遺伝子配列相同性を示す図である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−Ｓ遺伝子組換えワクチン（ｒＶＶ−Ｓ）のウサギ（ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８前免疫群と未接種群）への接種試験の結果を示す図である。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２遺伝子組換えワクシニアウイルスの遺伝子構成を示す図である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２遺伝子組換えワクチンの概略を示す図である。ｐＳＭＡＲＴ−ＤＩｓ−Ｌ３−ｍｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−１ｂ　ＧＮＤ−ＧＰＴＦベクターの構成を示す図である。

ｐＳＭＡＲＴ−ＤＩｓ−Ｌ３−ｍｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−Ｓ−ＧＰＴＦベクターの構成を示す図である。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎによる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２遺伝子組換えワクシニアウイルス（ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ）感染細胞中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ｍＲＮＡ発現の同定結果を示す図である。ウエスタンブロッティングによる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２遺伝子組換えワクシニアウイルス（ｒＤＩｓ−Ｓ）感染細胞中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質発現の同定結果を示す図である。

新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２遺伝子組換えワクシニアウイルス）の防御の仕組みを示す図である。作製した組換えワクチン（ｒＤＩｓ−Ｓ及びｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ）における導入抗原の発現をウエスタンブロット法により確認した結果を示す図である。　Ａ（左図）：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）の特異的抗体を用いた該Ｓタンパク質の検出結果。　Ｂ（右図）：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ＯＲＦ１ｂ構成タンパク質（ＯＲＦ１ｂ領域によりコードされる非構造タンパク質）の特異的抗体を用いた１ｂタンパク質の検出結果。ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ接種ヒトＡＣＥ２発現トランスジェニックマウス（ｈＡＣＥ２発現Ｔｇマウス）でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２特異的Ｔ細胞応答の解析の結果を示す図である。

カニクイザルを用いた組換えワクチン（ｒＤＩｓ−Ｓ）の有効性・安全性の評価方法を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザルにおける、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染後の体温変化の測定結果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザルにおける、鼻腔拭い液及び気道拭い液中の感染性ウイルス量の経時変化の結果を示す図である。　Ａ（左図）：鼻腔拭い液中のウイルス量；Ｂ（右図）：気道拭い液中のウイルス量

ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザルにおける、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染７日後の肺中ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザルにおける、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染７日後の肺病理所見（図１７の左図）と病理スコア（図１７の右図）を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザルにおける、中和抗体誘導効果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種ｈＡＣＥ２発現Ｔｇマウスにおける、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染防御試験の結果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ活性評価の結果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、Ｓタンパク質特異的結合抗体誘導の効果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける、中和抗体誘導効果を示す図である。ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザル血漿を用いた、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の流行初期株（ＴＹ／ＷＫ−５２１）及び変異株（ＳＵＭＳ２：滋賀医科大学分離株、ＱＨＮ００１：ＵＫ型変異株、ＴＹ７−５０１：ブラジル型変異株）に対する中和抗体価測定の結果を示す図である。図中、＃１~＃４は、ｒＤＩｓ−Ｓ接種カニクイザルの各個体由来の４種の血漿検体を示す。ＳＵＭＳ２（滋賀医科大学分離株）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）のアミノ酸配列（配列番号６）において「Ｄ６１４Ｇ、Ｑ６７５Ｈ」のアミノ酸置換変異がされたものであり、ＱＨＮ００１（ＵＫ型変異株）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において「Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ」のアミノ酸置換変異がされたものであり、ＴＹ７−５０１（ブラジル型変異株）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において「Ｋ４１４Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ」のアミノ酸置換変異がされたものである。ｒＤＩｓ−Ｓ接種ｈＡＣＥ２　Ｔｇマウスを用いた、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の変異株（ＴＹ８−６１２：南アフリカ型変異株）に対する防御効果の結果を示す図である。ＴＹ８−６１２（南アフリカ型変異株）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において、「ＲＢＤ領域：Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ；Ｎ端領域：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ；Ｓｕｂｄｏｍａｉｎ　１領域：Ｄ６１４Ｇ；Ｓ２領域：Ａ７０１Ｖ」のアミノ酸置換変異がされ、かつ、第２４２~２４４番目のアミノ酸（Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ）が欠失したものである。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる、特願２０２０−１３０７１７号明細書（令和２年（２０２０年）７月３１日出願）、特願２０２０−２１５４５４号明細書（令和２年（２０２０年）１２月２４日出願）、及び特願２０２１−０７８７８１号明細書（令和３年（２０２１年）５月６日出願）の全体を包含する。本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

１．本発明の概要
　新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）に対する予防ワクチンとして、天然痘ワクチンであるワクシニアウイルスを馴化し高度弱毒化したＤＩｓ株に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の遺伝子を導入した遺伝子組換え生ワクチンの開発と早期実用化を目的とする。ワクシニアウイルスを母体に用いることによって、ワクチン接種後、短期間でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する免疫を強力に誘導でき、付与された免疫が長期に渡って持続し、かつ抗原変異にも対応可能な幅広い交差反応性を持つ免疫の誘導が期待できる。

　本発明者は、ＣＯＶＩＤ−１９予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）の候補として、１）ＳＡＲＳワクチンでの実績（図１、図３）を踏まえて、ウイルス粒子表面に表出し、細胞への吸着・感染に重要であるスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）を発現する遺伝子組換えワクチン（抗体誘導及びＴ細胞誘導型）と、２）コロナウイルスゲノム上で遺伝子配列相同性が最も高い領域（Ｚｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０２０　Ｍａｒ；５７９（７７９８）：２７０−２７３））（図２）であり、ウイルス複製に必須なタンパク質をコードしている非構造タンパク質遺伝子領域（ＯＲＦ１ｂ）を発現する遺伝子組換えワクチン（Ｔ細胞誘導型）を樹立した。

　これまでに確立し評価したＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質を発現する組換えワクチンは、接種後１週間で中和抗体を誘導でき、ＳＡＲＳ−ＣｏＶによるマウスへの攻撃感染を防御した（Ｆｕｍｉｈｉｋｏ　Ｙａｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８１：６３３７−６３４８（２００８））（図１）。また、天然痘ワクチンを接種済みのウサギに対しても、未感作ウサギへの接種と同等にＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的免疫を誘導できた（Ｍａｓａｈｉｒｏ　Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２５：６３０−６３７（２００７））（図３）。よって、ＣＯＶＩＤ−１９の重症化リスク・グループであり、天然痘ワクチンの接種歴を持つ高齢者層に対しても、組換えワクシニアウイルスは有効であると考えられる。更に、本発明者らは、より高い安全性を担保する目的で、国立予防衛生研究所・多賀谷勇博士らがニワトリ線維芽細胞（ＣＥＦ）で馴化し開発した、多くの正常哺乳動物細胞では非増殖性である高度弱毒化ワクシニアウイルスＤＩｓ株（Ｉｓａｍｕ　Ｔａｇａｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９２：３８１−３８２，１９６１）を母体に用いた組換えワクチンも開発してきた。ＤＩｓ株を用いたＳＡＲＳ−ＳワクチンもＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を防御できた（Ｋｏｊｉ　Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３５１（２）：３６８−３８０，２００６）。また、本発明者らは、ＤＩｓ母体のＨ５亜型及びＨ７型ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質遺伝子発現組換え鳥インフルエンザワクチン（ｒＤＩｓ−Ｈ５　ＨＡ及びｒＤＩｓ−Ｈ７　ＨＡ）の開発も進めており、ワクチン接種後１週間という短期間において発症防御効果を発揮されること、一度付与された免疫はマウスモデルにおいて終生免疫とも言える長期免疫持続効果を示すことを実証した。これらの知見を踏まえて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス構造タンパク質遺伝子及び非構造タンパク質遺伝子を発現し得る組換えワクシニアウイルス（ワクシニアワクチン）の作製を行った（図４、５）。

２．組換えワクシニアウイルスの作製
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のタンパク質をコードしているすべての遺伝子、外殻タンパク質領域をコードする遺伝子、及び複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子の情報としては、具体的には、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２　ウイルス株：ｈＣｏＶ−１９／Ｊａｐａｎ／ＡＩ／Ｉ−００４／２０２０の遺伝子配列情報（配列番号９）が、ＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＣ５２１９２５として登録されている。

　したがって、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子、すなわちＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の非構造タンパク質領域又は構造タンパク質領域を含む遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、当業者であれば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２）」等に従って、行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。

　本発明においては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の全遺伝子領域のうちの非構造タンパク質領域又は構造タンパク質領域をコードする遺伝子ＤＮＡを、組換えワクシニアウイルスの作製に用いる。当該非構造タンパク質領域は、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ７ｂ、ＯＲＦ８、及びＯＲＦ１０領域からなる領域であり、本発明においては、例えば、ＯＲＦ１ｂ領域を選択して用いることが好ましい。また、当該構造タンパク質領域は、ｓｐｉｋｅ（Ｓ）、ｅｎｖｅｌｏｐｅ（Ｅ）、ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍ）、及びｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｎ）領域からなる領域であり、本発明においては、例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質領域を選択して用いることが好ましい。

　本発明においては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に由来する非構造タンパク質領域中のＯＲＦ１ｂ領域をコードする塩基配列ＤＮＡを、配列番号１に示し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に由来する構造タンパク質領域中のＳタンパク質領域をコードする塩基配列ＤＮＡを、配列番号５に示す。さらに、上記ＯＲＦ１ｂ領域をコードする塩基配列ＤＮＡの変異型ＤＮＡ（組換えワクシニアウイルス内での遺伝子発現効率を高めるために、ＯＲＦ１ｂ領域をコードする塩基配列ＤＮＡ中、６箇所の塩基を他の塩基に置換したもの）を、配列番号３に示し、上記Ｓタンパク質領域をコードする塩基配列ＤＮＡの変異型ＤＮＡ（組換えワクシニアウイルス内での遺伝子発現効率を高めるために、Ｓタンパク質領域をコードする塩基配列ＤＮＡ中、８箇所の塩基を他の塩基に置換したもの）を、配列番号７に示す。但し、配列番号１、３、５及び７に示される塩基配列からなるＤＮＡのほか、以下のＤＮＡも、本発明において使用することができる。

　配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＯＲＦ１ｂ領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＯＲＦ１ｂ領域中に前述の塩基置換変異を加えた領域の変異型ＤＮＡ）。

　配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｓタンパク質領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｓタンパク質領域中に前述の塩基置換変異を加えた領域の変異型ＤＮＡ）。

　配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＯＲＦ１ｂ領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＯＲＦ１ｂ領域中に前述の塩基置換変異を加えた領域の変異型ＤＮＡ）。

　配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｓタンパク質領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｓタンパク質領域中に前述の塩基置換変異を加えた領域の変異型ＤＮＡ）。

　ここで、「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスが増殖するときに細胞中に産生されるタンパク質をコードすることを意味する。また、上記非構造タンパク質をコードする遺伝子には、全長配列のほか、その一部の配列も含まれる。
　また、「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスの外殻を構成するタンパク質をコードすることを意味する。また、上記構造タンパク質をコードする遺伝子には、全長配列のほか、その一部の配列も含まれる。

　上記変異型ＤＮＡは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。また、上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、０．１×ＳＳＣ~１０×ＳＳＣ、０．１％~１．０％ＳＤＳ及び２０℃~８０℃の条件が挙げられ、より詳細には、３７℃~５６℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０~２０分の洗浄を１~３回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２）」等を参照することができる。

　本発明の組換えワクシニアウイルスの作製においては、特に限定はされず、公知の任意の手法を採用することができるが、例えば、まずＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の非構造タンパク質領域（ＯＲＦ１ｂ領域等）や構造タンパク質領域（Ｓタンパク質領域等）をコードする塩基配列ＤＮＡを、所望の発現ベクター（プラスミド）（例えば、ＤＩｓ株相同組換えベクター（プラスミド）（Ｋｏｊｉ　Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２００６））に挿入する。そして、そのプラスミドベクターを所望のワクシニアウイルス株（例えば、弱毒ワクシニアウイルスＤＩｓ株）感染細胞にトランスフェクションすることにより、ワクシニアウイルスのゲノム内で相同組換えを引き起こし、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の非構造タンパク質又は構造タンパク質の所望の領域を発現する組換えワクシニアウイルスを作製することができる。当該発現ベクターとしては、特に限定はされないが、例えば、ＤＩｓ株相同遺伝子配列領域を持ったｐＳＭＡＲＴ（登録商標）ベクター等を用いることができ、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、以前からワクシニアウイルス遺伝子発現に使用されている各種発現プロモーター（例えばｍＨ５プロモーター等）を用いることができる。

　なお、上記の弱毒ワクシニアウイルスＤＩｓ株は、天然痘のワクチンであった大連株（ＤＩＥ）から１日卵継代法により樹立された宿主域遺伝子欠損体で高度に弱毒化したもので、Ｃｈｉｃｋ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＣＥＦ）ｃｅｌｌｓでのみ増殖可能であり、国立予防衛生研究所（現国立感染症研究所）の多賀谷勇博士により開発された（Ｔａｇａｙａ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９２：３８１−３８２，１９６１）。大規模な遺伝子欠失によりマウス、モルモット、ウサギ、ヒトなどほとんどの哺乳動物細胞で増殖ができない。このために免疫不全・免疫抑制患者に万が一接種されても、安全性が担保される。

　作製した組換えワクシニアウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の非構造タンパク質領域遺伝子又は構造タンパク質領域遺伝子に特異的なプライマーによりＰＣＲを行い、所望の非構造タンパク質領域又は構造タンパク質領域の遺伝子導入を確認することができる。
　また、所望の非構造タンパク質又は構造タンパク質の発現は、作製した組換えワクシニアウイルスを感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、ウエスタンブロット法における抗体は、例えば、所望の非構造タンパク質領域又は構造タンパク質領域を特異的に認識する市販の抗体や、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ポリペプチドを免疫して作製した抗血清からＰｒｏｔｅｉｎ　ＧによりＩｇＧを精製したものを使用することができる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスは、温度安定性が高いものであり、例えば、室温下（限定はされないが、１０~４０℃の範囲を含み、通常１０~２０℃が好ましい。）でもＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンとしての安定性を保持し得るものである。従って、当該ワクシニアウイルスや後述する医薬組成物等は、その保存及び輸送時の温度が冷蔵の温度であっても室温であってもよく、実用性、利便性に優れたものである。

３．新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）の予防又は治療用の医薬組成物
　本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物、より具体的には、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）の予防薬および治療薬としての医薬組成物を提供する。
　本発明の医薬組成物は、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えワクシニアウイルスと、既存の抗ウイルス薬（例えばインターフェロン）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えワクシニアウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。

　また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
　本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。

　投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、組換えワクシニアウイルスの一日投与量としては、経口の場合は１０００~１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００００~１００００００００ＰＦＵ程度であり、非経口の場合は１００~１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００~１００００００００ＰＦＵ程度である。ウイルスは、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。

　本発明の組換えワクシニアウイルスは、ＣＯＶＩＤ−１９の予防用または治療用ワクチンとして使用され得るが、予めワクチンとしての抗体価または細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
　例えば、本発明の組換えワクシニアウイルス、または親株であるＤＩｓ株に対する抗体価は、これらのウイルス株をマウス、ウサギ等に接種後、経時的に血清を回収し、血清のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２タンパク質に対するＥＬＩＳＡ価やＬＩＰＳ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）価等を測定することで得ることができる。これにより接種個体でのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の遺伝子発現及び免疫応答の有無を確認できる。本発明の組換えワクシニアウイルスを接種したマウス血清は、接種１週間後からＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２タンパク質に対する抗体価の上昇が認められ得るものである。

　また、細胞性免疫活性は、例えば、本発明の組換えワクシニアウイルス、または親株であるＤＩｓ株をマウスに接種後、免疫したマウスから脾臓細胞を分離し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の非構造タンパク質や構造タンパク質に特異的なＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性細胞が誘導・活性化されている否かを、ＦＡＣＳやＥＬＩＳＰＯＴ　ａｓｓａｙにより測定することができる。例えば、本発明の組換えワクシニアウイルスにより免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞を、非構造タンパク質又は構造タンパク質を発現する標的細胞と共培養することによって、抗原特異的に活性化したＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞が検出され得る。

　本発明に係る組換えワクシニアウイルスは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する細胞性免疫を誘導し得るものであり、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来非構造タンパク質（好ましくはＯＲＦ１ｂ）を発現し得る組換えワクシニアウイルスにおいてその効果が顕著である。また、本発明に係る組換えワクシニアウイルスは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する中和抗体を誘導し得るものであり、特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来構造タンパク質（好ましくはＳタンパク質）を発現し得る組換えワクシニアウイルスにおいてその効果が顕著である。
　さらに、本発明に係る組換えワクシニアウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）は、当該ワクシニアウイルスが本来直接対象とするＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対してはもちろん、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の変異に伴う抗原性変化にも対応し得る幅広い交差反応性を持つワクチンとなり得る。すなわち、本発明に係る、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の治療薬及び予防薬である医薬組成物、及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンにおいて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２としては、その塩基配列やアミノ酸配列に置換、欠失、付加等の任意の変異を有する、いわゆる変異株も含まれる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２変異株としては、例えば、ＳＵＭＳ２（滋賀医科大学分離株）、ＱＨＮ００１（ＵＫ型変異株）、ＴＹ７−５０１（ブラジル型変異株）、ＴＹ８−６１２（南アフリカ型変異株）等が挙げられる。
　また、本発明に係る組換えワクシニアウイルスは、今後出現する可能性がある未知の新型コロナウイルス（ＣｏＶ）に対しても防御効果を示す、汎ＣｏＶ感染症予防ワクチンとしても利用され得るものである。

　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．方法
（１）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス構造タンパク質遺伝子及び非構造タンパク質遺伝子組換えワクシニアワクチンの作製
　（ｉ）遺伝子組換えに用いるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス株の選択
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス株：ｈＣｏＶ−１９／Ｊａｐａｎ／ＡＩ／Ｉ−００４／２０２０の遺伝子配列情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＣ５２１９２５）（配列番号９）を基にし、下記の４種類の遺伝子を合成した。

　・非構造タンパク質１ｂ（ＯＲＦ１ｂ）遺伝子領域ｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−１ｂ（８１９８ｂｐ）　（配列番号１）
　・非構造タンパク質１ｂ（ＯＲＦ１ｂ）遺伝子領域ｍｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−１ｂ　ＧＮＤ（８１９８ｂｐ）　（配列番号３）
　・スパイクタンパク質遺伝子領域ｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−Ｓ（３９２６ｂｐ）　（配列番号５）
　・スパイクタンパク質遺伝子領域ｍｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−Ｓ（３９２６ｂｐ）　（配列番号７）

　上記４種類の遺伝子のうち、配列番号１で示される遺伝子は、野生型のＯＲＦ１ｂ遺伝子であり、配列番号５で示される遺伝子は、野生型のスパイクタンパク質遺伝子である。
　他方、配列番号３及び７で示される遺伝子は、それぞれ、配列番号１及び５で示される遺伝子に基づいて、ワクシニアウイルスでの遺伝子発現効率が向上するように最適化した変異型の遺伝子である。
　具体的には、配列番号３で示される変異型遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列の第２４４５番目、第２４４８番目、第４９９８番目、第５００１番目、及び第６０００番目のＴ（チミン）が、Ｃ（シトシン）に置換され、かつ、第２５３９番目のＧ（グアニン）が、Ａ（アラニン）に置換されたもの（計６箇所の塩基置換がされたもの）である。

　また配列番号７で示される変異型遺伝子は、配列番号５で示される塩基配列の第９９番目、第１０２番目、第２３６４番目、第２３６７番目、第３２１３番目、第３２１６番目、第３４１７番目、及び第３４２０番目のＴ（チミン）が、Ｃ（シトシン）に置換されたもの（計８箇所の塩基置換がされたもの）である。
　本実施例においては、上記４種類の遺伝子のうち、配列番号３及び７で示される遺伝子を、組換えワクシニアウイルスの樹立に用いた。

　（ｉｉ）２種類の合成遺伝子をｐＳＭＡＲＴ−ＤＩｓ−Ｌ３ベクター内にクローニング
　２種類の合成遺伝子（配列番号３及び７で示される遺伝子）を、ＤＩｓ組換えワクチン作製用の組換えベクター：ｐＳＭＡＲＴ−ＤＩｓ−Ｌ３（配列番号１０）へ挿入した（図６，７）。これらの組換えベクターを用いて組換えワクシニアウイルス（ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ、ｒＤＩｓ−Ｓ）の樹立（図４）を進めた。「ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ」は、配列番号３で示される遺伝子を挿入したベクター（ｐＳＭＡＲＴ−ＤＩｓ−Ｌ３−ｍｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−１ｂ　ＧＮＤ−ＧＰＴＦ）を用いて得られる組換えワクシニアウイルスのことであり、「ｒＤＩｓ−ｍｎＣｏＶ−１ｂ−ＧＮＤ」と称されることもある。「ｒＤＩｓ−Ｓ」は、配列番号７で示される遺伝子を挿入したベクター（ｐＳＭＡＲＴ−ＤＩｓ−Ｌ３−ｍｎＣｏＶ−Ｊａｐａｎ−Ｓ−ＧＰＴＦ）を用いて得られる組換えワクシニアウイルスのことであり、「ｒＤＩｓ−ｍｎＣｏＶ−Ｓ」と称されることもある。

（２）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２ウイルス非構造タンパク質遺伝子あるいは構造タンパク質遺伝子組換えワクシニアワクチンの評価
　（ｉ）ＯＲＦ１ｂ非構造タンパク質遺伝子組換えＤＩｓ（ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ）に挿入された遺伝子配列を確認した後、ｍＲＮＡが発現していることをＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴＤ−ＰＣＲ）法で確認し（図８）、ＯＲＦ１ｂ構成タンパク質が発現していることをウエスタンブロット法で確認した（図１１Ｂ）。
　上記ＲＴＤ−ＰＣＲに用いたプライマー・プローブ、反応液組成、反応条件は、以下の通りである。

＜プライマー・プローブ＞

＜反応液組成＞
水（ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ）　　　　　　　　　　　８．５μＬ
４ｘ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘ　　　　　　　　　５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）　　　　１μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）　　　　１μＬ
Ｐｒｏｂｅ（１０μＭ）　　　　　　　　　　　　　０．５μＬ
ＲＮＡ　ｓａｍｐｌｅ　　　　　　　　　　　　　　４μＬ　　　
Ｆｉｎａｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　　　２０μＬ

＜反応条件＞

　（ｉｉ）スパイクタンパク質遺伝子領域組換えＤＩｓ（ｒＤＩｓ−Ｓ）に挿入された遺伝子配列を確認した後、スパイクタンパク質が発現していることをウエスタンブロット法で確認した（図９、図１１Ａ）。

２．結果
（１）ＯＲＦ１ｂ非構造タンパク質遺伝子組換えＤＩｓ（ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ）に挿入された遺伝子配列を確認した後、ｍＲＮＡが発現していることをＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴＤ−ＰＣＲ）法で確認した（図８）。１２クローン中１０クローンで良好なｍＲＮＡ発現が確認された。また、ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤにおいて、ＯＲＦ１ｂ構成タンパク質が発現していることがウエスタンブロット法で確認された（図１１Ｂ）。

（２）スパイクタンパク質遺伝子領域組換えＤＩｓ（ｒＤＩｓ−Ｓ）に挿入された遺伝子配列を確認した後、スパイクタンパク質が発現していることをウエスタンブロット法で確認した（図９、図１１Ａ）。９クローン中９クローンで良好なスパイクタンパク質発現が確認された。

３．考察
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来ＯＲＦ１ｂ非構造タンパク質に対するワクチン（ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ）は細胞性免疫を誘導する有効な予防ワクチンとなり得る。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来スパイクタンパク質に対するワクチン（ｒＤＩｓ−Ｓ）は中和抗体を誘導する有効な予防ワクチンとなり得る（図１０）。

　ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤを、ヒトＡＣＥ２発現トランスジェニックマウス（ｈＡＣＥ２発現Ｔｇマウス）に接種し、当該マウスにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２特異的Ｔ細胞応答の解析を行った。具体的には、図１２に示すとおり、ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ又はＤＩｓ（コントロール）を３週間隔で２回接種し、その１週間後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による攻撃感染を行い、感染６日後のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する抗原特異的Ｔ細胞の活性化をインターフェロンγ　ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって解析した。
　その結果、ｒＤＩｓ−１ｂ−ＧＮＤ接種群でＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２特異的なＴ細胞（ＯＲＦ１ｂ抗原（ＲｄＲｐ）特異的Ｔ細胞）の活性化（インターフェロンγの産生）が認められた（図１２）。

　ｒＤＩｓ−Ｓの有効性及び安全性を、カニクイザルを用いて評価した。具体的には、図１３に示すとおり、ｒＤＩｓ−Ｓ又はＤＩｓ（コントロール）をカニクイザルに３週間隔で２回皮内接種し、その１週間後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による攻撃感染を行い、感染７日後に剖検した。以下（１）~（５）に、各評価内容とその結果について説明する。

（１）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染後の体温変化を測定した。コントロール（ＤＩｓ）群（破線）では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染から２日後に１度以上の体温上昇が認められたが、ｒＤＩｓ−Ｓ接種群（実線）では、体温上昇は認められなかった（図１４）。

（２）鼻腔・気道拭い液中の感染性ウイルス量の経時変化を測定した。
　鼻腔拭い液中のウイルス量：ＤＩｓ接種群では、感染７日後まで感染性ウイルスが検出された。ｒＤＩｓ−Ｓ接種群では、感染１日後にのみ検出され、その後速やかに排除された。ｒＤＩｓ−Ｓ接種群の４頭中１頭では、感染１日後でも検出限界以下であった（図１５Ａ）。
　気道拭い液中のウイルス量：ＤＩｓ接種群では、４頭中１頭で感染７日後まで感染性ウイルスが検出された。ｒＤＩｓ−Ｓ接種群では、４頭中２頭では、感染１日後でも検出限界以下であり、検出された２頭でも顕著に低値であった（図１５Ｂ）。

（３）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染７日後の肺中ウイルスＲＮＡ量を測定した。ＤＩｓ接種群では、４頭のほとんどの肺葉で高いウイルスＲＮＡ量が検出され、ｒＤＩｓ−Ｓ接種群では、肺葉でのウイルスＲＮＡ量は殆ど検出限界以下であり、良好な排除効果を示された（図１６）。

（４）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染７日後の肺の病理所見と病理スコアを確認した。ＤＩｓ接種群では間質部の肥厚化を伴う肺炎像が観察された。一方、ｒＤＩｓ−Ｓ接種群では病変部分はほとんど認められず、肺炎を軽減できることが示された（図１７）。

（５）ｒＤＩｓ−Ｓ接種群での中和抗体誘導効果（ＮＴ_５０　ｔｉｔｅｒ）を確認した。ｒＤＩｓ−Ｓ接種群では４頭すべてで中和抗体が検出され（０ｄｐｉ）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２攻撃感染（７ｄｐｉ）による速やかな抗体価の増大が認められた（図１８）。

　ｒＤＩｓ−Ｓの有効性を、ヒトＡＣＥ２発現トランスジェニックマウス（ｈＡＣＥ２発現Ｔｇマウス）及びＣ５７ＢＬ／６を用いて評価した。以下（１）及び（２）に、各評価内容とその結果について説明する。

（１）ｒＤＩｓ−Ｓ接種ｈＡＣＥ２発現ＴｇマウスでのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染防御試験
　図１９に示すとおり、ｒＤＩｓ−Ｓ又はＤＩｓ（コントロール）をｈＡＣＥ２発現Ｔｇマウスに３週間隔で２回接種し、その１週間後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２による攻撃感染実験を行った。ＤＩｓ接種個体では、急激な体重変化に伴い、死亡したが、ｒＤＩｓ−Ｓ接種個体では、殆ど体重減少を認めず、１００％の生存率を示した（図１９）。

（２）ｒＤＩｓ−Ｓ接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ活性評価
　図２０に示すとおり、ｒＤＩｓ−Ｓ又はＤＩｓ（コントロール）をＣ５７ＢＬ／６マウスに３週間隔で２回接種し、その１週間後にＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質で刺激した脾細胞及び未刺激脾細胞の１：１混合液を当該マウスに静脈内移入した。翌日、脾臓を採取し、細胞移入個体内での抗原刺激細胞の排除効果について、フローサイトメトリー法を用いて解析した。ＤＩｓ接種個体では、Ｓタンパク質ペプチド刺激細胞を排除できないが、ｒＤＩｓ−Ｓ接種個体では、Ｓタンパク質由来ペプチド刺激細胞を速やかに排除できた（図２０）。このことから、ｒＤＩｓ−Ｓによる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質特異的細胞障害性Ｔ細胞の誘導が確認された。

　ｒＤＩｓ−Ｓの抗体誘導能を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて評価した。以下（１）及び（２）に、各評価内容とその結果について説明する。

（１）図２１に示すとおり、ｒＤＩｓ−Ｓ又はＤＩｓ（コントロール）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに３週間隔で２回接種し、接種前から４週後まで毎週採血を行った。血清検体を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）で１００倍希釈した後、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＳタンパク質に特異的な結合抗体（イムノグロブリンＧ；ＩｇＧ）の産生をＥＬＩＳＡにより測定した。ｒＤＩｓ−Ｓ接種個体（ｎ＝３）では、ｒＤＩｓ−Ｓ接種１週後からＳタンパク質特異的抗体が検出された。さらに、初回接種から３週後にｒＤＩｓ−Ｓを追加接種することにより、その１週後の血清中に含まれるＳタンパク質特異的ＩｇＧ量が増加していた。

（２）上記（１）で使用した同一血清検体を用いて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＴＹ／ＷＫ−５２１：流行初期株）に対する中和抗体価を、プラーク減少中和試験法により評価した。具体的には、血清を培地により１０倍希釈した後、さらに４倍階段希釈した。１０倍、４０倍、１６０倍、６４０倍、２５６０倍、１０２４０倍希釈血清５０μＬと５０ＰＦＵ／５０μＬのウイルス溶液をそれぞれ混合し、３７度で一時間反応させた。その後、階段希釈血清／ウイルス混合溶液（１００μＬ）をＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に感染感受性を有するＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に接種し、１時間吸着させた。溶液を除去し、培地で細胞を洗浄後に０．６％アガロース含有培地を添加し、４８時間培養した。４８時間後血清不含検体で形成されるプラーク数を１００％とした際に、血清添加によりプラーク数が半数となる血清希釈率の逆数を「５０％　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒ」として算出した。図２２に示すとおり、ｒＤＩｓ−Ｓ接種個体（ｎ＝３）では、ｒＤＩｓ−Ｓ接種１週後から中和抗体が誘導されることが明らかとなった。また、初回接種から３週後の追加接種により、中和抗体価も増強した。

　実施例３においてｒＤＩｓ−Ｓを接種（３週間隔で２回皮内接種）したカニクイザルの血漿検体を用いて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の流行初期株（ＴＹ／ＷＫ−５２１）及び変異株（ＳＵＭＳ２：滋賀医科大学分離株、ＱＨＮ００１：ＵＫ型変異株、ＴＹ７−５０１：ブラジル型変異株）に対する中和抗体価をＴＣＩＤ５０法で測定した。本実施例においては、初回ｒＤＩｓ−Ｓ接種から３週後の追加免疫時（図２３のグラフ中ｄａｙ−７）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２攻撃感染時（図２３のグラフ中ｄａｙ０）、及び剖検時（図２３のグラフ中ｄａｙ７）に採取した血漿を用いた。図２３に示すとおり、ワクチンを２回接種することで、流行初期株及びいずれの変異株に対しても中和抗体が誘導されることが判明した。

　ｒＤＩｓ−Ｓ又はＤＩｓ（コントロール）をｈＡＣＥ２発現Ｔｇマウスに３週間隔で２回接種し、追加免疫から１週後に１００ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２南アフリカ型変異株（ＴＹ８−６１２）を経気道感染させた。連日、生存率を観測し、感染から７日後に剖検した。図２４に示すとおり、ＤＩｓ接種（コントロール）群では、４匹中２匹が死亡したが、ｒＤＩｓ−Ｓ接種群では、５匹全個体生存していた。当該変異株（ＴＹ８−６１２）に対しても、ｒＤＩｓ−Ｓ接種による発症防御効果が確認された。

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（３）Ｊｉｎ−Ｗｏｎ　Ｙｏｕｎ，Ｙｕ−Ｗｅｎ　Ｈｕ，Ｎａｎｃｙ　Ｔｒｉｃｏｃｈｅ，Ｗｏｌｆｒａｍ　Ｐｆａｈｌｅｒ，Ｍｏｈａｍｅｄ　Ｔａｒｅｋ　Ｓｈａｔａ，Ｍａｒｌｅｎｅ　Ｄｒｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｏｉｓ−Ｌｏｉｃ　Ｃｏｓｓｅｔ，Ａｎｔｏｎｅｌｌａ　Ｆｏｌｇｏｒｉ，Ｄｏｎｇ−Ｈｕｎ　Ｌｅｅ，Ｂｅｔｓｙ　Ｂｒｏｔｍａｎ，ａｎｄ　Ａｌｆｒｅｄ　Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ　ｂｙ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒｕｓ．ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｎｏｖ．２００８，８２（２１）：１０８９６−１０９０５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１１７９−０８
（４）ＦＲＡＮＣＯＩＳ　ＨＡＢＥＲＳＥＴＺＥＲ，ＧＥＲＡＬＤＩＮＥ　ＨＯＮＮＥＴ，ＣＨＲＩＳＴＩＮＥ　ＢＡＩＮ，ＭＡＲＩＡＮＮＥ　ＭＡＹＮＡＲＤ−ＭＵＥＴ，ＶＩＮＣＥＮＴ　ＬＥＲＯＹ，ＪＥＡＮ−ＰＩＥＲＲＥ　ＺＡＲＳＫＩ，ＣＹＲＩＬＬＥ　ＦＥＲＡＹ，ＴＨＯＭＡＳ　Ｆ．ＢＡＵＭＥＲＴ，ＪＥＡＮ−ＰＩＥＲＲＥ　ＢＲＯＮＯＷＩＣＫＩ，ＭＩＣＨＥＬ　ＤＯＦＦＯＥＬ，ＣＨＲＩＳＴＩＡＮ　ＴＲＥＰＯ，ＤＥＬＰＨＩＮＥ　ＡＧＡＴＨＯＮ，ＭＹＥＷ−ＬＩＮＧ　ＴＯＨ，ＭＡＲＴＩＮＥ　ＢＡＵＤＩＮ，ＪＥＡＮ−ＹＶＥＳ　ＢＯＮＮＥＦＯＹ，ＪＥＡＮ−ＭＡＲＣ　ＬＩＭＡＣＨＥＲ，ａｎｄ　ＧＥＮＥＶＩＥＶＥ　ＩＮＣＨＡＵＳＰＥ．Ａ　Ｐｏｘｖｉｒｕｓ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｓ　Ｓａｆｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ａｎｄ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　Ｖｉｒａｌ　Ｌｏａｄ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ．ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ　２０１１；１４１：８９０−８９９．ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１１．０６．００９

（５）．Ｓａｔｏｓｈｉ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋｉｍｉｎｏｒｉ　Ｋｉｍｕｒａ，Ｔｏｍｏｋｏ　Ｃｈｉｙｏ，Ｔａｋａｈｉｒｏ　Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｙｏｓｈｉｍｉ　Ｔｏｂｉｔａ，Ｙｕｋｏ　Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｆｕｍｉｈｉｋｏ　Ｙａｓｕｉ，Ｋｙｏｋｏ　Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，Ｔａｋａｊｉ　Ｗａｋｉｔａ，Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ　Ｔａｎａｋａ，Ｍａｓａｙｕｋｉ　Ｍｉｙａｓａｋａ，Ｋｙｏｓｕｋｅ　Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙｕｋｉｋｏ　Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔｓｕｎｅｋａｚｕ　Ｈｉｓｈｉｍａ，Ｋｏｕｊｉ　Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ　Ｋｏｈａｒａ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈａｔ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　７（１２）：ｅ５１６５６（２０１２）．
（６）Ｔａｋｅｓｈｉ　Ｗａｄａ，Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ　Ｋｏｈａｒａ　ａｎｄ　Ｙａｓｕｈｉｒｏ　Ｙａｓｕｔｏｍｉ．ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＣＶ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ　３１（５０）：５９６８−７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３．１０．０３７（２０１３）．
（７）Ｔａｋａｈｉｒｏ　Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｋｉｍｉｎｏｒｉ　Ｋｉｍｕｒａ，Ｙｕｋｏ　Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋｙｏｋｏ　Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，Ｃｈｉｓｅ　Ｔａｔｅｎｏ，Ｙｕｋｉｋｏ　Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔｓｕｎｅｋａｚｕ　Ｈｉｓｈｉｍａ，ａｎｄ　Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ　Ｋｏｈａｒａ．Ｍ２　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｐｌａｙ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２０１５　Ｏｃｔ　１４；９０（１）：３００−７．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２２９３−１５．

　本発明に係るＣＯＶＩＤ−１９予防ワクチン（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン）としての組換えワクシニアウイルス、及びそれを用いた医薬組成物等は、強力に免疫を誘導し、かつ長期間免疫を維持し得る、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンとして、ＣＯＶＩＤ−１９感染症の予防又は治療に、極めて有用なものである。また、本発明の組換えワクシニアウイルスは、室温下でもＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチンとしての安定性を保持し得るものであり、その保存及び輸送時の温度が冷蔵であっても室温であってもよく、実用性に優れたものである。

　配列番号３：合成ＤＮＡ
　配列番号４：合成コンストラクト
　配列番号７：合成ＤＮＡ
　配列番号８：合成コンストラクト
　配列番号１０：合成ＤＮＡ
　配列番号１１：合成ＤＮＡ
　配列番号１２：合成ＤＮＡ
　配列番号１３：合成ＤＮＡ

Claims

　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質又は構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部と、発現プロモーターとを含む、組換えワクシニアウイルス。
　ワクシニアウイルスがＤＩｓ株である、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質中のＯＲＦ１ｂ領域をコードするｃＤＮＡを含むものである、請求項１又は２に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のいずれかのＤＮＡである、請求項１~３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
　（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　前記構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質中のスパイクタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むものである、請求項１又は２に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のいずれかのＤＮＡである、請求項１、２又は５に記載の組換えワクシニアウイルス。
　（ａ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号７に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２由来の構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　室温下においても安定性を保持し得るものである、請求項１~６のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
　請求項１~７のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、医薬組成物。
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の予防薬である、請求項８に記載の医薬組成物。
　ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２感染症の治療薬である、請求項８に記載の医薬組成物。
　請求項１~７のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２用ワクチン。