WO2020184730A1

WO2020184730A1 - デングウイルスワクチン

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Publication number: WO2020184730A1
Application number: PCT/JP2020/012569
Authority: WO
Inventors: 小原　道法; 文彦安井; 大典山根; 小原　恭子; 公一森田; 康宏保富; 石井　孝司
Original assignee: 公益財団法人東京都医学総合研究所; 国立大学法人鹿児島大学; 国立大学法人長崎大学
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2020-09-17
Also published as: JP2020150940A; KR20210139315A; US20220152187A1; EP3939607A4; EP3939607A1

Abstract

臨床において使用可能な治療又は予防薬となり得るデングウイルスワクチンとしての組換えワクシニアウイルス等を提供する。本発明に係る組換えワクシニアウイルスは、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするcDNAの全部又は一部と、発現プロモーターとを含むことを特徴とする。

Description

デングウイルスワクチン

　本発明は、デングウイルスワクチンとしての組換えワクシニアウイルス等に関する。

　デングウイルスは、熱帯地域を中心に常在し、世界では年間約４億人が感染し、約１億人がデング熱を発症していると言われており、発症地域は、拡大傾向にあり（図１）、中国（広東省）でも大規模な感染（１万人を超える感染者数）が報告されている。日本では２０１４年（平成２６年）の感染被害は終息したものの、毎年感染常在国から渡航者等を介してウイルスが持ち込まれていることから、国内での感染被害が慢性的に引き起こされる危険性に曝されている。２０１０年以降に報告された年間輸入症例数は、２００例を超えている。

　現在、臨床に使用可能な治療薬は開発に成功されておらず、対処療法がおこなわれている。一方で、臨床治験が進められているデングワクチンが数例報告されている。その中で、最も開発が進んでいた、サノフィパスツール社の４価デング・黄熱キメラワクチンについては、平成２７年（２０１５年）１２月にメキシコにおいてワクチンが認可されたのを始め、世界１０カ国以上で承認されている（図２）。しかしながら、同社の４価デング・黄熱キメラワクチン（ＣＹＤ）については、平成２９年（２０１７年）１１月２９日付けで、非感染者にワクチン接種するとデング熱やデング出血熱の発症リスクが高まるといった報告及び使用上の注意喚起が、同社及びＷＨＯからなされた（非特許文献１）。

　先行技術文献
　非特許文献１：Ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ），“ＷＨＯ　ａｄｖｉｓｅｓ　Ｄｅｎｇｖａｘｉａ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｐｅｏｐｌｅ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｅｎｇｕｅ”，２０１７（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ／ｎｅｗｓ／２０１７／ＷＨＯ−ａｄｖｉｓｅｓ−ｄｅｎｇｖａｘｉａ−ｕｓｅｄ−ｏｎｌｙ−ｉｎ−ｐｅｏｐｌｅ−ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ／ｅｎ／）

　このような状況下において、臨床において使用可能な治療又は予防薬となり得るデングウイルスワクチン、詳しくは、当該ウイルス非感染者に接種した場合でもデング熱やデング出血熱の発症リスクが抑制できるデングウイルスワクチン等の開発が望まれていた。

　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、組換えワクシニアウイルスや医薬組成物等を提供するものである。

（１）デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部と、発現プロモーターとを含む、組換えワクシニアウイルス。
（２）ワクシニアウイルスがＤＩｓ株である、上記（１）に記載の組換えワクシニアウイルス。
（３）前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、デングウイルス由来の非構造タンパク質中のＮＳ１領域をコードするｃＤＮＡである、上記（１）又は（２）に記載の組換えワクシニアウイルス。

（４）前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、デングウイルス由来の非構造タンパク質中のＮＳ１領域以外の領域をコードするｃＤＮＡである、上記（１）又は（２）に記載の組換えワクシニアウイルス。
（５）前記非構造タンパク質中のＮＳ１領域以外の領域が、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５領域からなる領域である、上記（４）に記載の組換えワクシニアウイルス。
（６）前記デングウイルスが、２型の血清型のものである、上記（１）~（５）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルス。

（７）前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のＤＮＡである、上記（１）~（６）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルス。
　（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｅ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｆ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ

（８）上記（１）~（７）のいずれか１つに記載の組換えワクシニアウイルスを含む、医薬組成物。
（９）デングウイルス感染症の予防薬である、上記（８）に記載の医薬組成物。
（１０）デングウイルス感染症の治療薬である、上記（８）に記載の医薬組成物。
発明の効果

　本発明によれば、臨床において使用可能な治療又は予防薬となり得るデングウイルスワクチンとしての組換えワクシニアウイルス、及びそれを用いた医薬組成物等を提供することができる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスは、デングウイルスワクチンとして、当該ウイルス非感染者に接種した場合でも、その後、デング熱やデング出血熱（特に重症度の高いデング出血熱）の発症リスクを抑制できる（例えば、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ＡＤＥ）の現象による重症疾患（デング出血熱など）の病態の誘発を抑制し得る）ものである点で極めて有用である。

世界におけるデングウイルス感染の現状を示す図である。臨床開発が進められているデングワクチンの一覧を示す図である。デングウイルス遺伝子組換えワクシニアウイルスの遺伝子構成を示す図である。本発明において開発され得るワクチンの種類を示す図である。デングウイルスＮＳ１タンパク質発現の同定の結果を示す図である。デングウイルスＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５タンパク質発現の同定の結果を示す図である。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５のウイルス力価をより高めるために、そのＮＳ５領域にアミノ酸置換変異を加えた変異株（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤ）を作製したことを示す図である。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤの変異株にすること等によりウイルス増殖率が高まったことを示す図である。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１ワクチン接種による抗体誘導の結果を示す図である。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１接種マウスにおける細胞性免疫誘導の結果を示す図である。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤワクチン接種による抗体誘導の結果を示す図である。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５接種マウスにおける細胞性免疫誘導の結果を示す図である。ＡＧ１２９マウスを用いた、ワクチン接種による発症防御効果の評価方法を示す図である。ＡＧ１２９マウスを用いた、ワクチン接種による発症防御効果の評価結果を示す図である。ＡＧ１２９マウスを用いた、ワクチン接種による発症防御効果の評価結果を示す図である。ＡＧ１２９マウスを用いた、ワクチン接種による発症防御効果の評価結果を示す図である。（Ａ）は、ＡＧ１２９マウスを用いた、ワクチン接種による発症防御効果（具体的には、ワクチンが直接対象とする血清型とは異なる血清型のデングウイルスに対する排除効果（発症防御効果））の評価方法を示す図である。（Ｂ）は、当該マウスを用いた、ワクチン接種による上記発症防御効果の評価結果（肝臓及び脾臓中のウイルス量の抑制）を示す図である。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１９−０４７５８２号明細書（平成３１年（２０１９年）３月１４日出願）の全体を包含する。本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

１．本発明の概要
　デングウイルス（以下、ＤＥＮＶともいう）に感染後、異なる血清型に属するデングウイルスが２回目に感染した場合に、最初のウイルスに対する抗体が、２回目のウイルスの感染を助ける、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（以下、ＡＤＥ）という現象を介して過剰なウイルス産生が引き起こされ、デング出血熱などの重症疾患の発症につながる。そこで、これらの病態を誘発しない、４つの血清亜型ウイルスに有効なワクチンが必要とされる。
　構造タンパク質に対する抗体はＡＤＥを誘発する可能性があるので、この可能性のない非構造タンパク質のＮＳ１領域やＮＳ２−５領域（ＮＳ１領域以外の領域；具体的にはＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５領域からなる領域）の遺伝子をＤＩｓ組換えワクチン作製用の組換えベクターへ挿入した。これらの組換えベクターを用いて組換えワクシニアウイルス（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１及びｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）の樹立を進めた。樹立したワクシニアウイルスを動物に接種したところ、細胞性免疫の誘導が認められた。また、ワクチンとして当該ワクシニアウイルスを接種した動物に、デングウイルスを攻撃感染したところ、血清中又は臓器（肝臓や脾臓等）中のウイルス量の減少・抑制が認められ（図１４、図１７）、体重減少の阻害（図１５）や、生存率の上昇（図１６）など、同一血清型に加えて異なる血清型デングウイルス（例えば血清型１型等）に対しても顕著な発症防御（阻害）効果が認められた。
　本発明は、以上のようにして完成された。

２．デングウイルス（ＤＥＮＶ）組換えワクシニアウイルスの作製
　デングウイルス（ＤＥＮＶ）のタンパク質をコードしているすべての遺伝子、外殻タンパク質領域をコードする遺伝子、及び複製に関与している非構造タンパク質領域をコードする遺伝子は、すでにクローニングされ、プラスミドの状態で保存されている。したがって、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子、すなわちＤＥＮＶの非構造タンパク質領域を含む遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ装置を用いてその遺伝子配列を増幅するＰＣＲ法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、当業者であれば、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２）」等に従って、行うことができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。好ましい態様としては、上記プラスミドに挿入されているＤＥＮＶ遺伝子を鋳型に用い、ＤＥＮＶ遺伝子の所望の領域（非構造タンパク質領域）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＥＮＶの各遺伝子領域をコードするＤＮＡを調製することができる。

　本発明においては、ＤＥＮＶのすべての遺伝子領域のうちの非構造タンパク質領域をコードする遺伝子ＤＮＡを、組換えワクシニアウイルスの作製に用いる。当該非構造タンパク質領域は、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５領域からなる領域であり、本発明においては、このうちＮＳ１領域と、ＮＳ１領域以外の領域（すなわち、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５領域からなる領域；ＮＳ２−５領域）とをそれぞれ用いる。ここで、ＤＥＮＶには、デング１，２，３，４の４種類の血清型（１型、２型、３型及び４型）が存在する。その中でデング２はさらにアジア型とコスモポリタン型に分けられるため、ＤＥＮＶには、計５種類の主要な型が存在することとなる。いずれの型のＤＥＮＶにおいても、非構造タンパク質領域は、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５領域からなる領域である。本発明の組換えワクシニアウイルスの作製においては、いずれの型のＤＥＮＶに由来する非構造タンパク質領域のｃＤＮＡを用いてもよく、限定はされないが、好ましくはデング２に由来するものであり、より好ましくはデング２のコスモポリタン型に由来するものである。

　本発明においては、デング２のコスモポリタン型のＤＥＮＶに由来する非構造タンパク質領域中のＮＳ１領域をコードする塩基配列ＤＮＡを、配列番号１に示し、ＮＳ２−５領域をコードする塩基配列ＤＮＡを、配列番号２に示す。また、ＮＳ２−５領域をコードする塩基配列ＤＮＡの変異型ＤＮＡ（ＮＳ２−５領域中のＮＳ５領域部分に変異（詳しくは、ＮＳ５の酵素活性を欠失させる変異）を加えた領域をコードするＤＮＡ）を、配列番号３に示す。但し、配列番号１、２及び３に示される塩基配列からなるＤＮＡのほか、以下のＤＮＡも、本発明において使用することができる。

　配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＮＳ１領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＮＳ２−５領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性（相同性）を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＮＳ２−５領域中のＮＳ５領域部分に変異を加えた領域の変異型ＤＮＡ）。

　配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＮＳ１領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＮＳ２−５領域の変異型ＤＮＡ）。
　配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ（ＮＳ２−５領域中のＮＳ５領域部分に変異（詳しくは、ＮＳ５の酵素活性を欠失させる変異）を加えた領域の変異型ＤＮＡ）。

　ここで、「デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードする」とは、ウイルスが増殖するときに細胞中に産生されるタンパク質をコードすることを意味する。また、上記非構造タンパク質をコードする遺伝子には、全長配列のほか、その一部の配列も含まれる。
　上記変異型ＤＮＡは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１、２及び３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。また、上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、０．１×ＳＳＣ~１０×ＳＳＣ、０．１％~１．０％ＳＤＳ及び２０℃~８０℃の条件が挙げられ、より詳細には、３７℃~５６℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０~２０分の洗浄を１~３回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２）」等を参照することができる。

　本発明の組換えワクシニアウイルスの作製は、特に限定はされないが、例えば、ＤＥＮＶの非構造タンパク質領域（ＮＳ１やＮＳ２−５の所望の領域）をコードする塩基配列ＤＮＡを、所望の発現ベクター（プラスミド）に挿入し、そのプラスミドベクターを宿主であるワクシニアウイルスに導入することで行うことができる。当該発現ベクターとしては、特に限定はされないが、例えば、ｐＳＭＡＲＴ（登録商標）ベクター等を用いることができ、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、従来よりワクシニアウイルス遺伝子発現に使用されている各種発現プロモーター（例えばｍＨ５プロモーター等）を用いることができる。

　プラスミドベクターの宿主への導入は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば、弱毒ワクシニアウイルスＤＩｓ株を感染した動物細胞中に、上記のプラスミドベクターを導入することにより、ワクシニアウイルスのゲノム内で相同組換えを引き起こし、ＤＥＮＶの非構造タンパク質の所望の領域を発現する組換えワクシニアウイルスを作製することができる。
　なお、上記の弱毒ワクシニアウイルスＤＩｓ株は、天然痘のワクチンであった大連株（ＤＩＥ）から１日卵継代法により樹立された宿主域遺伝子欠損体で高度に弱毒化したもので、Ｃｈｉｃｋ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＣＥＦ）ｃｅｌｌｓでのみ増殖可能であり、国立予防衛生研究所（現国立感染症研究所）の多賀谷勇博士により開発された（Ｔａｇａｙａ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　１９６１）。大規模な遺伝子欠失によりマウス、モルモット、ウサギ、ヒトなどほとんどの哺乳動物細胞で増殖ができない。このために免疫不全・免疫抑制患者に万が一接種されても、安全性が担保される。

　作製した組換えワクシニアウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてＤＥＮＶの非構造タンパク質領域遺伝子特異的なプライマーによりＰＣＲを行い、所望の非構造タンパク質領域の遺伝子導入を確認することができる。
　また、所望の非構造タンパク質の発現は、作製した組換えワクシニアウイルスを感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウエスタンブロット法により確認することができる。なお、ウエスタンブロット法における抗体は、例えば、所望の非構造タンパク質領域を特異的に認識する市販の抗体や、ＤＥＮＶポリペプチドを免疫して作製した抗血清からＰｒｏｔｅｉｎ　ＧによりＩｇＧを精製したものを使用することができる。

３．デングウイルス感染症の予防又は治療用の医薬組成物
　本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物、より具体的には、デングウイルス感染症の予防薬および治療薬としての医薬組成物を提供する。デングウイルス感染症としては、例えば、デング熱、デング出血熱などが挙げられる。

　本発明の医薬組成物は、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えワクシニアウイルスと、既存の抗ウイルス薬（例えばインターフェロン）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えワクシニアウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
　また、本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。

　本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
　投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、組換えワクシニアウイルスの一日投与量としては、経口の場合は１０００~１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００００~１００００００００ＰＦＵ程度であり、非経口の場合は１００~１０００００００００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）程度、好ましくは１０００~１００００００００ＰＦＵ程度である。ウイルスは、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。

　本発明の組換えワクシニアウイルスは、デングウイルス感染症の予防用または治療用ワクチンとして使用され得るが、予めワクチンとしての抗体価または細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
　例えば、本発明の組換えワクシニアウイルス、または親株であるＤＩｓ株に対する抗体価は、これらのウイルス株をマウス、ウサギ等に接種後、経時的に血清を回収し、血清のＤＥＮＶタンパク質に対するＥＬＩＳＡ価やＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）価等を測定することで得ることができる。これにより接種個体でのデングウイルスの遺伝子発現及び免疫応答の有無を確認できる。本発明の組換えワクシニアウイルスを接種したマウス血清は、接種１週間後からＤＥＮＶタンパク質に対する抗体価の上昇が認められた。

　また、細胞性免疫活性は、本発明の組換えワクシニアウイルス、または親株であるＤＩｓ株をマウスに接種後、免疫したマウスから脾臓細胞を分離し、ＤＥＮＶの非構造タンパク質に特異的なＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性細胞が誘導・活性化されている否かを、ＦＡＣＳやＥＬＩＳＰＯＴ　ａｓｓａｙにより測定することができる。本発明においては、本発明の組換えワクシニアウイルスにより免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞を、各非構造タンパク質を発現する標的細胞と共培養することによって、抗原特異的に活性化したＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞が検出された。このことから、本発明の組換えワクシニアウイルスによる免疫は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＤＥＮＶの非構造タンパク質に特異的な細胞性免疫を誘導することが分かった。
　以上のことから、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルスは、ＤＥＮＶに対する液性免疫及び細胞性免疫を誘導することが確認された。
　さらに、本発明に係る組換えワクシニアウイルス（デングウイルスワクチン）は、当該ワクシニアウイルスが本来直接対象とする血清型のデングウイルスに対してはもちろん、その血清型とは異なる血清型のデングウイルスに対しても（すなわち、好ましくは、４種の血清亜型のうちの、２種又は３種あるいは全て（４種）の血清型のデングウイルスに対して）、排除効果（免疫応答による発症防御効果）を有する（つまり、交差反応性を有する）ものである、又は有することが期待されるものである。本発明に係る組換えワクシニアウイルスは、デングウイルス感染で特に問題となっているａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ＡＤＥ）の現象による重症疾患（デング出血熱など）の病態の誘発を抑制し得るワクシニアウイルス（ワクチン）として有用なものである。

　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．方法
（１）デングウイルス非構造タンパク質遺伝子組換えワクシニアワクチンの作製及び評価
　ｉ）遺伝子組換えに用いるデングウイルス株の選択
デングウイルスにはデング１，２，３，４の４種類の血清型が存在する。その中でデング２はさらにアジア型とコスモポリタン型に分けられ、計種類の主要な型が存在する。この５種類デングウイルスの血清型系統樹解析の結果、ほぼ中央に位置するデング２型コスモポリタン株（Ｄｅｎｇｕｅ−２：Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔａｎ：ｏ１Ｓａ−０５４）の遺伝子をワクチン候補として選択した。解析に使用した５種類の遺伝子配列情報を以下に示す。

　ｉｉ）デング２コスモポリタン株の非構造タンパク質領域の遺伝子をクローニングし、ＮＳ−１領域およびＮＳ２−５領域の遺伝子を、下記の「ＮＳ−１領域プライマー」及び「ＮＳ２−５領域プライマー」を用いて、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲ産物をＳｂｆ−Ｉ酵素及びＡｓｉＳＩ酵素で消化後、ＤＩｓ株遺伝子組換えプラスミドであるｔｒａｎｓｆｅｒ　ｖｅｃｔｏｒｐＵＣ／ＤＩｓ（Ｋｏｊｉ　Ｉｓｈｉｉ　ｅｔ．ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２００１，３０２，４３３−４４４）改変ベクターに挿入した。その後、ＤＩｓ組換えワクチン作製用の組換えベクターへ挿入した（図３）。ＮＳ２−５領域ＧＮＤ変異を導入するにあたっては、下記の「ＮＳ２−５領域変異導入プライマー」を用いてクイックチェンジ法（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により行った。この組換えベクターを用いて組換えウイルスの樹立を進めた（図４）。組換えＤＩｓに挿入された遺伝子配列を確認した後、デングウイルスタンパク質が発現していることをウエスタンブロット法で確認した（図５、６）。

＜ＮＳ−１領域プライマー＞
ＳｂｆＩ−ｍＨ５ｐ−ＮＳ１−２４２０−Ｆ：

ＮＳ１−ＳｇｆＩ（ＡｓｉＳＩ）−３４３０−Ｒ：

＜ＮＳ２−５領域プライマー＞
ＳｂｆＩ−ｍＨ５ｐ−ＮＳ２−３４７４−Ｆ：

ＳｇｆＩ（ＡｓｉＳＩ）−ＮＳ５−１０２２４−Ｒ：

＜ＮＳ２−５領域変異導入プライマー＞
ＤＥＮ２Ｃ　ＮＳ５　ＧＮＤ−Ｆ：

ＤＥＮ２Ｃ　ＮＳ５　ＧＮＤ−Ｒ：

　なお、上記のＮＳ−１領域プライマー（配列番号４、５）を用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。

＜反応液組成＞
　鋳型ｃＤＮＡ（ＤＥＮＶ　２Ｃ　ｃＤＮＡ）：　　　　　　　　１．０μＬ
　５×Ｑ５　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　バッファー：　　　５μＬ
　２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ：　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５μＬ
　Ｑ５　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．０Ｕ／μｌ）：　　０．５μＬ
　Ｆプライマー（１０μＭ）：　　　　　　　　　　　　　　　　１．２５μＬ
　Ｒプライマー（１０μＭ）：　　　　　　　　　　　　　　　　１．２５μＬ
　滅菌水：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３．５μＬ　
　合計：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５μＬ

＜反応条件＞
「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：７１℃（１５ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（４０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル。

　また、上記のＮＳ２−５領域プライマー（配列番号６、７）を用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。

＜反応条件＞
「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：７２℃（１５ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（４０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル。

　さらに、上記のＮＳ２−５領域変異導入プライマー（配列番号８、９）を用いたクイックチェンジ法については、以下のキット、反応液組成及び反応条件で行った。
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　＃２１０５１８）

＜反応液組成＞
　鋳型ＤＮＡ（ＤＥＮＶ　２Ｃ　ＮＳ２５　ｐｌａｓｍｉｄ）：　１．０μＬ
　１０×反応バッファー：　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０μＬ
　２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ：　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４μＬ
　Ｆプライマー（５０ｎｇ／ｕｌ）：　　　　　　　　　　　　　１．０μＬ
　Ｒプライマー（５０ｎｇ／ｕｌ）：　　　　　　　　　　　　　１．０μＬ
　ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ：　　　　　　　０．６μＬ
　ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ：０．４μＬ
　滅菌水：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３．６μＬ　
　合計：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μＬ

＜反応条件＞
「熱変性・解離：９５℃（２０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（１０ｓｅｃ）→合成・伸長：６８℃（６ｍｉｎ）」を１サイクルとして計１８サイクル。

　ｉｉｉ）動物へ接種して抗体の産生および細胞性免疫の誘導効果を検証するために必要なデングウイルス遺伝子組換えＤＩｓワクチン候補株を、大量に培養して準備を進めた。
　この経過中に、ＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えウイルス（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）の力価が低く、大量増殖が困難である事が明らかとなった。そこで、デングウイルスＮＳ５の酵素活性を欠失した変異株（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤ）を作製した（図７）。

（２）デングウイルス非構造タンパク質遺伝子組換えワクシニアワクチンの動物での評価
　作製したＮＳ−１領域あるいはＮＳ２−５領域遺伝子を含むＤＩｓ組換えワクチンを、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスに接種して免疫応答評価を行った。

　ｉ）ＮＳ−１領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１）はＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスに対して高い抗体産生と細胞性免疫の誘導が認められた。

　ｉｉ）ＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）はＮＳ２領域に対する抗体の産生と、ＮＳ３領域に対する細胞性免疫の誘導が認められた。さらにワクチン接種量、ワクチン回数、期間など詳細な検討を進めている。

（３）デングウイルス感染モデル動物の選択及びワクチン効果の評価
　野生型のマウスはデングウイルス感染が弱く、また、デングウイルス感染により出血熱など誘発する動物モデルは見出されていない。ワクチン効果を検証するためにはデングウイルス感染モデル動物が必須となる。そこで、マーモセット、ツパイおよび遺伝子改変マウスを用いて感染感受性及び病態発症の評価を進めている。

　ｉ）遺伝子改変マウス
　野生型のマウスはデングウイルス感染が弱く、デング熱が発症もしないことが知られている。そこで、抗ウイルスに働くインターフェロンの受容体欠失マウスを用いて感染発症動物モデルとしての可能性を検討した。Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンの受容体欠失マウス（ＡＧ１２９マウス）にデングウイルスを攻撃感染したところ、発症・死亡する事を見いだした。このＡＧ１２９マウスにデングウイルス非構造タンパク質遺伝子組換えワクシニアワクチンを接種し、さらにデングウイルス（血清型２型）で攻撃感染を行った。ワクチン接種群は被接種群に比較して、良好な感染発症防御効果を示した。

　ｉｉ）マーモセット
　マーモセットにデングウイルス（血清型１型、血清型２型）を接種して１４日間にわたり血中ウイルス量、抗体誘導の有無などの臨床経過を観察した。

　ｉｉｉ）ツパイ
　ツパイにデングウイルス（血清型１型、血清型２型）を接種して１４日間にわたり血中ウイルス量、抗体誘導の有無などの臨床経過を観察した。

２．結果
（１）デングウイルスＮＳ５の酵素活性を欠失した変異株（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤ）を作製した。ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤ組換えウイルスにすることで４倍以上の高収率が得られるようになった（図８）。

（２）作製したＮＳ−１領域あるいはＮＳ２−５領域遺伝子を含むＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１、ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）を、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスに接種して免疫応答評価を行った。

　ｉ）ＮＳ−１領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１）はＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスに対して高い抗体産生と細胞性免疫の誘導が認められた（図９，１０）。

　ｉｉ）ＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）はＮＳ２領域に対する抗体の産生と、ＮＳ３領域に対する細胞性免疫の誘導が認められた。さらにワクチン接種量、ワクチン回数、期間など詳細な検討を進めている（図１１，１２）。

（３）ＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤ）をＡＧ１２９マウスに接種して２週間後にデングウイルス（血清型２型）の攻撃感染を行い、免疫応答による発症防御効果の評価を行った（図１３）。このように、ワクチン接種動物にデングウイルスを攻撃感染したところ、血清中ウイルス量の減少が認められ（図１４）、また体重減少の阻害、生存率の上昇などの顕著な発症防御効果が認められた（図１５，１６）。

（４）マーモセットにデングウイルス（血清型１型、血清型２型）を接種して１４日間にわたり血中ウイルス量、抗体誘導の有無などの臨床経過を観察した。１４日間にわたり血中ウイルスが検出され、またウイルス粒子に対する抗体及びＮＳ−１領域の抗体が産生されており感染感受性があることを見出した。また、マーモセットにデング１，２，３，４型を接種して臨床経過を観察したところ、抗デングウイルス抗体が産生されており感染感受性があることを見出した。また、デング１，２，３，４型ともに潜血反応陽性を示し、腎臓に異常所見が認められた。以上の知見から、マーモセットによるワクチンの感染発症防御効果を評価することが可能となった。

（５）ツパイにデングウイルス（血清型１型、血清型２型）を接種して１４日間にわたり血中ウイルス量、抗体誘導の有無などの臨床経過を観察した。１４日間にわたり血中ウイルスが検出され、またウイルス粒子に対する抗体及びＮＳ−１領域の抗体が産生されており感染感受性があることを見出した。ツパイにデング１，２，３，４型を接種して臨床経過を観察した。全ての個体でＮＳ−１領域の抗体が産生されており感染感受性があることを見出した。以上の知見から、ツパイによるワクチンの感染発症防御効果を評価することが可能となった。現在、デングウイルス−ＤＩｓ組換えワクチンを接種し、ワクチンの感染発症防御効果の評価を進めている。

３．考察
　デングウイルスに感染後、異なる血清型に属するデングウイルスが２回目に感染した場合に、最初のウイルスに対する抗体が、２回目のウイルスの感染を助ける、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ＡＤＥ）という現象を介して過剰なウイルス産生が引き起こされ、デング出血熱などの重症疾患の発症につながる。デングウイルス非構造タンパク質に対するワクチンはウイルス粒子に結合する抗体を産生しないのでＡＤＥを起こす危険性はなく、有効な予防ワクチンとなり得る。ＮＳ−１領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン及びＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチンはマウス実験において抗体の産生及び細胞性免疫の誘導が認められた。さらにワクチン免疫マウスへデングウイルを攻撃感染したところ顕著なウイルス排除及び発症防御効果を示した。これらのことから、ＮＳ−１領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ１）及びＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えワクチン（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）は、ＡＤＥ誘発の危険性を回避できる、有効な新規ワクチンで有ることが示された。

　実施例１で作製した、ＮＳ２−５領域遺伝子−ＤＩｓ組換えウイルス（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５）の変異株（ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−ＮＳ２５−ＧＮＤ）を、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンの受容体欠失マウス（ＡＧ１２９マウス）の皮膚に、１×１０^８ＰＦＵで接種（単回接種）し、２週間後に、当該マウスにデングウイルス１株（血清型１型；ＮＩＩＤ−０２−１７株）の攻撃感染（皮下への感染）を行い、免疫応答による発症防御効果の評価を行った（図１７Ａ）。
　上記感染から１３~１６日後の当該マウスの肝臓中及び脾臓中のウイルス量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した結果、ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−Ｎ２５−ＧＮＤ接種群（ワクチン接種群）で、有意にウイルス量が低値を示した（図１７Ｂ）。
　よって、ｒＤＩｓ−ＤＥＮＶ２Ｃ−Ｎ２５−ＧＮＤの接種は、異なる血清型のデングウイルス（血清型１型）が感染した場合であっても、速やかに排除し得る効果を有することが実証された。このように、本願発明に係る組換えワクシニアウイルス（デングウイルスワクチン）は、異なる血清型のデングウイルス（好ましくは、全ての血清型（４つの血清亜型）のデングウイルス）に対しても、排除効果（免疫応答による発症防御効果）を有するものである。そのため、デングウイルス感染で特に問題となっているａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ＡＤＥ）の現象による重症疾患（デング出血熱など）の病態を誘発させない組換えワクシニアウイルスとして、本発明は有用なものである。

４．関連情報・論文
（１）Ｊｉｎ−Ｗｏｎ　Ｙｏｕｎ，Ｙｕ−Ｗｅｎ　Ｈｕ，Ｎａｎｃｙ　Ｔｒｉｃｏｃｈｅ，Ｗｏｌｆｒａｍ　Ｐｆａｈｌｅｒ，Ｍｏｈａｍｅｄ　Ｔａｒｅｋ　Ｓｈａｔａ，Ｍａｒｌｅｎｅ　Ｄｒｅｕｘ，Ｆｒａｎｃ　ｏｉｓ−Ｌｏｉｃ　Ｃｏｓｓｅｔ，Ａｎｔｏｎｅｌｌａ　Ｆｏｌｇｏｒｉ，Ｄｏｎｇ−Ｈｕｎ　Ｌｅｅ，Ｂｅｔｓｙ　Ｂｒｏｔｍａｎ，ａｎｄ　Ａｌｆｒｅｄ　Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ　ｂｙ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒｕｓ．ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｎｏｖ．２００８，８２（２１）：１０８９６−１０９０５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１１７９−０８
（２）ＦＲＡＮＣＯＩＳ　ＨＡＢＥＲＳＥＴＺＥＲ，ＧＥＲＡＬＤＩＮＥ　ＨＯＮＮＥＴ，ＣＨＲＩＳＴＩＮＥ　ＢＡＩＮ，ＭＡＲＩＡＮＮＥ　ＭＡＹＮＡＲＤ−ＭＵＥＴ，ＶＩＮＣＥＮＴ　ＬＥＲＯＹ，ＪＥＡＮ−ＰＩＥＲＲＥ　ＺＡＲＳＫＩ，ＣＹＲＩＬＬＥ　ＦＥＲＡＹ，ＴＨＯＭＡＳ　Ｆ．ＢＡＵＭＥＲＴ，ＪＥＡＮ−ＰＩＥＲＲＥ　ＢＲＯＮＯＷＩＣＫＩ，ＭＩＣＨＥＬ　ＤＯＦＦＯＥＬ，ＣＨＲＩＳＴＩＡＮ　ＴＲＥＰＯ，ＤＥＬＰＨＩＮＥ　ＡＧＡＴＨＯＮ，ＭＹＥＷ−ＬＩＮＧ　ＴＯＨ，ＭＡＲＴＩＮＥ　ＢＡＵＤＩＮ，ＪＥＡＮ−ＹＶＥＳ　ＢＯＮＮＥＦＯＹ，ＪＥＡＮ−ＭＡＲＣ　ＬＩＭＡＣＨＥＲ，ａｎｄ　ＧＥＮＥＶＩＥＶＥ　ＩＮＣＨＡＵＳＰＥ．Ａ　Ｐｏｘｖｉｒｕｓ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｓ　Ｓａｆｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ａｎｄ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　Ｖｉｒａｌ　Ｌｏａｄ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ．ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ　２０１１；１４１：８９０−８９９．ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１１．０６．００９
（３）．Ｓａｔｏｓｈｉ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋｉｍｉｎｏｒｉ　Ｋｉｍｕｒａ，Ｔｏｍｏｋｏ　Ｃｈｉｙｏ，Ｔａｋａｈｉｒｏ　Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｙｏｓｈｉｍｉ　Ｔｏｂｉｔａ，Ｙｕｋｏ　Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｆｕｍｉｈｉｋｏ　Ｙａｓｕｉ，Ｋｙｏｋｏ　Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，Ｔａｋａｊｉ　Ｗａｋｉｔａ，Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ　Ｔａｎａｋａ，Ｍａｓａｙｕｋｉ　Ｍｉｙａｓａｋａ，Ｋｙｏｓｕｋｅ　Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙｕｋｉｋｏ　Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔｓｕｎｅｋａｚｕ　Ｈｉｓｈｉｍａ，Ｋｏｕｊｉ　Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ　Ｋｏｈａｒａ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈａｔ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｌｉｖｅｒ．ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　７（１２）：ｅ５１６５６（２０１２）．
（４）Ｔａｋｅｓｈｉ　Ｗａｄａ，Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ　Ｋｏｈａｒａ　ａｎｄ　Ｙａｓｕｈｉｒｏ　Ｙａｓｕｔｏｍｉ．ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＣＶ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ　３１（５０）：５９６８−７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３．１０．０３７（２０１３）．
（５）Ｔａｋａｈｉｒｏ　Ｏｈｔｓｕｋｉ，Ｋｉｍｉｎｏｒｉ　Ｋｉｍｕｒａ，Ｙｕｋｏ　Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｋｙｏｋｏ　Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，Ｃｈｉｓｅ　Ｔａｔｅｎｏ，Ｙｕｋｉｋｏ　Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔｓｕｎｅｋａｚｕ　Ｈｉｓｈｉｍａ，ａｎｄ　Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ　Ｋｏｈａｒａ．Ｍ２　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｐｌａｙ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２０１５　Ｏｃｔ　１４；９０（１）：３００−７．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２２９３−１５．

　本発明の組換えワクシニアウイルス、及びそれを用いた医薬組成物等は、デングウイルスワクチンとして、当該ウイルス非感染者に接種した場合でも、その後、デング熱やデング出血熱（特に重症度の高いデング出血熱）の発症リスクを抑制できる（例えば、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ＡＤＥ）の現象による重症疾患（デング出血熱など）の病態の誘発を抑制し得る）ものである点で極めて有用である。

　配列番号３：改変ＤＮＡ
　配列番号４：合成ＤＮＡ
　配列番号５：合成ＤＮＡ
　配列番号６：合成ＤＮＡ
　配列番号７：合成ＤＮＡ
　配列番号８：合成ＤＮＡ
　配列番号９：合成ＤＮＡ

Claims

　デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの全部又は一部と、発現プロモーターとを含む、組換えワクシニアウイルス。
　ワクシニアウイルスがＤＩｓ株である、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、デングウイルス由来の非構造タンパク質中のＮＳ１領域をコードするｃＤＮＡである、請求項１又は２に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、デングウイルス由来の非構造タンパク質中のＮＳ１領域以外の領域をコードするｃＤＮＡである、請求項１又は２に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記非構造タンパク質中のＮＳ１領域以外の領域が、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５領域からなる領域である、請求項４に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記デングウイルスが、２型の血清型のものである、請求項１~５のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
　前記非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡが、以下の（ａ）~（ｄ）のＤＮＡである、請求項１~６のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルス。
　（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｂ）配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｄ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　（ｅ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
　（ｆ）配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の同一性を有し、かつ、デングウイルス由来の非構造タンパク質をコードするＤＮＡ
　請求項１~７のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、医薬組成物。
　デングウイルス感染症の予防薬である、請求項８に記載の医薬組成物。
　デングウイルス感染症の治療薬である、請求項８に記載の医薬組成物。