WO2020100990A1 - 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス - Google Patents

新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス Download PDF

Info

Publication number
WO2020100990A1
WO2020100990A1 PCT/JP2019/044737 JP2019044737W WO2020100990A1 WO 2020100990 A1 WO2020100990 A1 WO 2020100990A1 JP 2019044737 W JP2019044737 W JP 2019044737W WO 2020100990 A1 WO2020100990 A1 WO 2020100990A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
avian influenza
recombinant vaccinia
vaccinia virus
influenza
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/044737
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
文彦 安井
小原　道法
賢三郎 山地
伊藤　靖
一誠 小笠原
石井　孝司
Original Assignee
公益財団法人東京都医学総合研究所
国立大学法人滋賀医科大学
国立感染症研究所長が代表する日本国
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公益財団法人東京都医学総合研究所, 国立大学法人滋賀医科大学, 国立感染症研究所長が代表する日本国 filed Critical 公益財団法人東京都医学総合研究所
Priority to JP2020556172A priority Critical patent/JPWO2020100990A1/ja
Priority to US17/293,378 priority patent/US20230174586A1/en
Priority to EP19884182.7A priority patent/EP3888677A4/en
Priority to CN201980074035.0A priority patent/CN113227360A/zh
Publication of WO2020100990A1 publication Critical patent/WO2020100990A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to a preventive and therapeutic agent for H7 subtype avian influenza virus infection, which is the cause of the development of novel influenza.
  • the present invention relates to a recombinant vaccinia virus DIs strain capable of expressing the hemagglutinin (HA) protein gene of H7 subtype avian influenza virus, and a preventive and therapeutic drug for novel influenza containing the recombinant vaccinia virus DIs strain. ..
  • Seasonal influenza has been circulating in winter every year, and it has been reported that 10% to 20% of the population affected.
  • the pathogen is A / H1N1, A / H3N2, or influenza B virus, but its antigenicity changes little by little every year, so it is necessary to manufacture a vaccine adapted to the epidemic prediction strain.
  • examples of new influenza include H5N1 highly pathogenic avian influenza, H7N9 avian influenza, and H7N7 highly pathogenic avian influenza.
  • an outbreak of H7N9 avian influenza virus in humans has been reported in China since 2013, and at least 1564 cases of infection and 612 deaths have been reported so far.
  • the 2016-2017 season has the largest infection scale compared to the past four seasons, and there is concern that the epidemic will spread further in the future.
  • candidate strains for vaccine production are being selected and stored in multiple countries, including the United States and the United Kingdom. A system is in place to start manufacturing.
  • the vaccine to be manufactured is a whole-particle inactivated vaccine, and therefore requires multiple vaccinations, and therefore it takes time to induce sufficient immunity.
  • the hemagglutinin (HA) protein sequence of the H7N9 avian influenza virus contains a sequence that causes activation of suppressive T cells (Treg) (Non-patent document 1), and the H7HA protein The ability to induce specific antibodies may be diminished.
  • H1N1 (2009) Considering the temporal transition of pandemic influenza virus during a global pandemic, the first wave of domestic epidemics has started in each country 2-3 months after the epidemic in the country where it occurred. Therefore, it is necessary to develop a vaccine that can respond to the H7 subtype influenza virus earlier.
  • neuraminidase which is important for the emergence of influenza virus
  • N neuraminidase
  • an intravenous NA inhibitor has already been developed.
  • Avigan a polymerase inhibitor of influenza virus, was approved for manufacturing and sales in Japan in March 2014, but will be manufactured and supplied at the request of the Minister of Health, Labor and Welfare. It is subject to conditions such as not being sold to the general public.
  • the live vaccine is one of the most effective.
  • the development of an attenuated vaccine of an emerging virus requires a very long period of time, and it is considered that this also applies to H7 subtype influenza. Therefore, the inventors of the present invention, as a result of earnest research, make full use of genetic engineering techniques to develop a recombinant vaccinia virus (RVV) that expresses the H7 subtype HA protein gene using vaccinia virus as a mother as a live influenza vaccine. I arrived.
  • RVV recombinant vaccinia virus
  • Non- Patent Document 2 a recombinant vaccinia virus (RVV) for rabies virus or for Lindapest, in field tests and the like, has been demonstrated to exhibit an excellent infection preventive effect.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • Patent Document 1 a recombinant vaccinia virus having a cDNA of SARS-CoV known as a pathogen thereof (Patent Document 1), and have an excellent preventive effect and re-creation. It has been confirmed that the preparation can be administered (Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 2 Furthermore, against H5N1HPAIV, we have also succeeded in producing a recombinant vaccinia virus having the cDNA of HA of H5N1HPAIV, and it has been confirmed that it is a formulation showing an excellent preventive effect (Patent Document 2 and non-patent document 2). Patent Document 4).
  • An embodiment of the present invention is as follows.
  • a recombinant vaccinia virus comprising an expression promoter and all or part of a cDNA encoding a hemagglutinin protein derived from an H7 subtype avian influenza virus in the genome of the vaccinia virus DIs strain.
  • H7 subtype avian influenza virus is H7N9 avian influenza virus or H7N7 highly pathogenic avian influenza virus.
  • ⁇ 3> The recombinant vaccinia virus according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the cDNA encoding the hemagglutinin protein is the DNA of (a) to (h) below.
  • ⁇ 4> A pharmaceutical composition comprising the recombinant vaccinia virus according to any of ⁇ 1> to ⁇ 3>).
  • ⁇ 5> The pharmaceutical composition according to ⁇ 4>, which is a preventive agent for H7 subtype avian influenza.
  • ⁇ 6> The pharmaceutical composition according to ⁇ 4>, which is a therapeutic agent for H7 subtype avian influenza.
  • ⁇ 7> The pharmaceutical composition according to ⁇ 5> or ⁇ 6>, wherein the H7 subtype avian influenza is H7N9 avian influenza or H7N7 highly pathogenic avian influenza.
  • ⁇ 8> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 4> to ⁇ 7>, which is for intradermal administration.
  • a preparation for intradermal administration which comprises the recombinant vaccinia virus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • the preparation for intradermal administration according to ⁇ 9> which is a preventive agent for H7 subtype avian influenza.
  • the preparation for intradermal administration according to ⁇ 9> which is a therapeutic agent for H7 subtype avian influenza.
  • ⁇ 12> The preparation for intradermal administration according to ⁇ 10> or ⁇ 11>, wherein the H7 subtype avian influenza is H7N9 avian influenza or H7N7 highly pathogenic avian influenza.
  • influenza vaccine containing the recombinant vaccinia virus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • ⁇ 14> The influenza vaccine according to ⁇ 13>, wherein the influenza is H7 subtype avian influenza.
  • ⁇ 16> The influenza vaccine according to any of ⁇ 13> to ⁇ 15>, which is for intradermal administration.
  • ⁇ 17> A method for preventing and / or treating H7 subtype avian influenza, which comprises administering an effective amount of the recombinant vaccinia virus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> to a subject.
  • ⁇ 18> The method according to ⁇ 17>, wherein the H7 subtype avian influenza is H7N9 avian influenza or H7N7 highly pathogenic avian influenza.
  • ⁇ 19> The method according to ⁇ 17> or ⁇ 18>, wherein the administration is intradermal administration.
  • ⁇ 20> The method according to any one of ⁇ 17> to ⁇ 19>, which comprises administering in combination with a vaccine against another subtype influenza virus.
  • a mixed vaccine comprising the recombinant vaccinia virus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> and one or more recombinant vaccinia viruses derived from another subtype influenza virus.
  • ⁇ 23> Use of the recombinant vaccinia virus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> in the production of influenza vaccine.
  • FIG. 1 shows the production of recombinant vaccinia virus (RVV) (specifically rDIs-H7 HA) derived from the DIs strain having the HA protein gene of H7 subtype avian influenza virus using homologous recombination technology.
  • RVV vaccinia virus
  • FIG. 2 is a photograph of a PVDF membrane showing the results of confirming the expression of the HA protein of RVV (rDIs-H7 HA) by Western blotting.
  • FIG. 3 shows a single RVV (H7 subtype avian influenza virus vaccine: rDIs-H7 HA) from a DIs strain having a HA protein gene derived from the H7N9 avian influenza virus against BALB / c mouse attack infection with the H7N9 avian influenza virus. It is a figure which shows the examination result of the immunity induction effect by infection and the enhancement effect of the infection defense ability.
  • Fig. 4 shows a method of skin scraping of RVV (H7 subtype HA gene expression vaccine: rDIs-H7 HA) derived from DIs strain having H7N9 avian influenza virus-derived HA protein gene against attack infection of H7N9 avian influenza virus to cynomolgus monkeys.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of examination of the immunity-inducing effect and the enhancing effect on the infection-protecting ability, and the immediate effect by the inoculation.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examination of the virus elimination effect 7 days after the H7N9 avian influenza virus challenge infection in cynomolgus monkeys inoculated with the H7 subtype HA gene expression vaccine (rDIs-H7 HA).
  • FIG. 6 is a diagram showing lung pathological findings and lung weight 7 days after challenge with H7N9 avian influenza virus in cynomolgus monkeys inoculated with the H7 subtype HA gene expression vaccine (rDIs-H7 HA).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examination of the virus elimination effect 7 days after the H7N9 avian influenza virus challenge infection in cynomolgus monkeys inoculated with the H7 subtype HA gene expression vaccine (rDIs-H7 HA).
  • FIG. 7 shows a single dose of RVV (H7 subtype HA gene expression vaccine: rDIs-H7 HA) derived from a DIs strain having a H7N9-derived HA protein gene against the challenge of BALB / c mice with H7N7 highly pathogenic avian influenza virus. It is a figure which shows the examination result of the infection protection effect by inoculation.
  • FIG. 8 Examination of immediate effect of DIV strain-derived RVV (H7 subtype HA gene expression vaccine: rDIs-H7 HA) against H7N9 avian influenza virus challenge infection in BALB / c mice. It is a figure which shows a result.
  • Figure 9 Intradermal of monovalent vaccine of RVV (H7 subtype HA gene expression vaccine: rDIs-H7 HA) derived from DIs strain having H7N9 avian influenza virus-derived HA protein gene against attack infection of H7N9 avian influenza virus to cynomolgus monkeys. Inoculation using the inoculation method and skin scraping method, and four types of mixed vaccines (rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs) that also include vaccines against H1, H3, and H5 subtypes in addition to influenza H7 influenza It is a figure which shows the examination result about the immunity induction effect by the intracutaneous inoculation, and the enhancing effect of the infection defense ability.
  • RVV H7 subtype HA gene expression vaccine
  • Figure 10 shows that H7 subtype HA gene expression vaccine (rDIs-H7 HA) monovalent vaccine in the cynomolgus monkey was inoculated using the intradermal or skin scraping method.
  • H1, H3, H5 Intradermal inoculation of four mixed vaccines (rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs), including vaccines against type I viruses, or lung pathological findings and viruses in lung tissue 7 days after H7N9 avian influenza virus attack infection It is a figure which shows an infectious titer.
  • the present inventors have a high safety inoculation history because it is non-proliferative in mammalian cells, and has a proven record of inoculation in humans.
  • RVV recombinant vaccinia virus
  • vaccinia virus DIs strain is a highly attenuated vaccinia virus strain isolated by subculturing vaccinia virus Dalian strain (DEI strain) in chicken egg embryos (Tagaya I et al., A new mutant of dermovaccinia). virus. Nature, 1961, vol.192, p.1187-1188).
  • This DIs strain can grow in fetal chicken fibroblasts (CEF), but it does not grow in other mammalian cells and is highly safe.
  • the vaccinia virus LC16m8 strain is a safe and effective attenuated vaccine strain that was approved by the Ministry of Health and Welfare in 1975 as a smallpox vaccine and has been inoculated to over 50,000 infants.
  • the weak toxicity of the LC16m8 strain is derived from the fact that the B5R protein gene of the LC16mO strain, which is considered to be involved in cell adsorption / infection, has a single base deletion, and therefore the full-length B5R protein is not expressed (Morikawa S ., Et al.
  • the rDIs-H7 HA inoculated individual showed a good onset protective effect against H7N9 avian influenza virus infection and H7N7 avian influenza virus infection. Furthermore, even when infected with H7N9 avian influenza virus one week or two weeks after vaccination, the symptoms could be significantly attenuated, and an immediate effect was also confirmed. From the above results, rDIs-H7HA can be a vaccine for H7 subtype influenza that can induce immunity immediately.
  • rDIs-H7 HA recombinant novel influenza vaccine
  • DIs strain As described above, the present inventor has established a recombinant novel influenza vaccine (rDIs-H7 HA) using the DIs strain as a parent.
  • RDIs-H7 HA single-vaccinated mice showed transient weight loss after challenge with A / Anhui / 1/2013 (H7N9) influenza virus, but the body weight recovered rapidly thereafter with 100% survival rate. Is shown (FIG. 3).
  • the rDIs-H7 HA twice-inoculated group showed a rapid antipyretic effect (Fig. 4) and various places (conjunctiva, nasal cavity, oral cavity) in comparison with the non-vaccinated group (DIs inoculated group).
  • RVV derived from the DIs strain expressing the influenza virus HA protein gene was lethal by single inoculation of 1x10 7 PFU of RVV as a vaccine for H7 subtype influenza virus (rDIs-H7 HA).
  • Inhibition of body weight loss was also shown against H7 influenza virus attack, with a remarkable survival-preventing effect with a survival rate of 80% when vaccinated one week ago and 100% when vaccinated two weeks ago.
  • HA hemagglutinin
  • Treg suppressive T cells
  • the HA protein gene of H7 subtype avian influenza virus for example, H7N9 avian influenza virus of SEQ ID NO: 1 has already been assigned a predetermined accession number (Accession No. EPI439507) in the influenza virus gene database (GISAID; Global Initiative on Sharing All Influenza Data). ) Is registered.
  • the gene contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention that is, all of the cDNA encoding the HA protein of the H7N9 avian influenza virus H7 subtype avian influenza virus (including the mutant sequence) or a part thereof is a normal gene. It can be obtained by an engineering method. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a genetic engineering method can be used.
  • a primer specific to each gene is designed, and a PCR method in which the gene sequence is amplified using a PCR device, or a gene amplification method using a cloning vector Can be used.
  • the above method can be performed by referring to “Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) and the like. Known methods can be used to purify the obtained PCR product.
  • mutant sequences in particular, mutation substitution type DNA, for example, the above-mentioned ⁇ Molecular Cloning, A Laboratory Laboratory (4th edition) ”(Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory Press (2012)) and“ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) "and the like, can be prepared according to the site-specific displacement induction method.
  • known methods such as the Kunkel method and the Gapped duplex method can be used to prepare using a mutation-introducing kit that utilizes the site-directed mutagenesis method.
  • a mutation-introducing kit that utilizes the site-directed mutagenesis method.
  • QuickChangeTM Site- Directed Mutagenesis Kit manufactured by Agilent Technologies
  • GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System manufactured by Invitrogen
  • TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System are preferred. Be done.
  • the H7 subtype avian influenza virus HA protein gene inserted into the above plasmid can be used as the template for the above PCR.
  • the HA protein gene of H7N9 avian influenza virus can be used as a template for the above PCR.
  • H7 subtype highly pathogenic avian influenza virus more preferably, using the cDNA of the HA protein gene of H7N9 avian influenza virus as a template, by performing PCR using each gene-specific primer, H7 subtype highly pathogenic
  • the HA protein gene region of avian influenza virus, more preferably H7N9 avian influenza virus can be prepared.
  • Each of the above mutant DNAs can be obtained by chemical synthesis, or can be subjected to colony hybridization, plaque hybridization, or Southern blot using the DNA consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof as a probe. It can also be obtained from a cDNA library and a genomic library by a known hybridization method such as. Examples of stringent conditions in the above hybridization include 0.1 ⁇ SSC to 10 ⁇ SSC, 0.1% to 1.0% SDS, and 20 ° C. to 80 ° C. More specifically, 37 ° C. to 56 ° C. The conditions include performing prehybridization at 30 ° C.
  • DNA that encodes HA protein (mutant DNA), having 75% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2,
  • a DNA (mutant DNA) encoding the HA protein derived from the H7N9 avian influenza virus can be used.
  • the expression promoter contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention is not limited as long as it is inserted into the gene deficient region of the vaccinia virus DIs strain, and examples thereof include vaccinia virus promoter mH5 and the like.
  • a hybrid promoter composed of a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and a multiple repeating vaccinia virus 7.5 kDa protein (p7.5) early expression promoter can be used as the expression promoter.
  • This promoter can be ligated to an appropriate plasmid, and for example, pBMSF7C and pUC / DIs are known (Arch. Virol. Vol. 138, p. 315-330, 1994; see JP-A-6-237773). ).
  • the nucleotide sequence of vaccinia virus promoter mH5 that can be used in the present invention is shown in SEQ ID NO: 3.
  • DNA having activity can also be used as an expression promoter (particularly a hybrid promoter).
  • stringent conditions are the same as above.
  • “Having promoter activity” means having transcription activity of a gene encoding a structural protein or a non-structural protein.
  • the protein expressed by the above hybrid promoter can be expressed in a large amount in a form that has undergone complete sugar modification from the early stage to the late stage of vaccinia virus infection.
  • a recombinant vaccinia virus can be prepared by introducing the plasmid vector obtained by inserting the above-mentioned expression promoter and the DNA encoding the HA protein into the host vaccinia virus.
  • the introduction of the plasmid vector into the host can adopt any known method, for example, by introducing the obtained plasmid vector into an animal cell infected with the attenuated vaccinia virus DIs strain, Recombinant vaccinia virus (rDIs-H7) that causes homologous recombination in the flanking sequences of the gene deletion region and expresses the HA protein gene of H7 subtype avian influenza virus (eg, H7N9 avian influenza virus or H7N7 highly pathogenic avian influenza virus), respectively.
  • H7 subtype avian influenza virus eg, H7N9 avian influenza virus or H7N7 highly pathogenic avian influenza virus
  • inactivated vaccine The method of manufacturing inactivated vaccine is known. As described above, embryonated chicken eggs are inoculated with the influenza virus for vaccine production and propagated, and the virus purified and concentrated from chorioallantoic fluid is partially decomposed with ether and further inactivated with formalin.
  • the recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) derived from the DIs strain that was prepared has the HA protein gene of the H7 subtype avian influenza virus (eg, H7N9 avian influenza virus) inserted into the gene deletion region of the vaccinia virus DIs strain.
  • H7 subtype avian influenza virus eg, H7N9 avian influenza virus
  • HA protein derived from influenza virus shows agglutination reaction on guinea pig erythrocytes
  • HA protein derived from vaccinia virus does not agglutinate reaction on guinea pig erythrocytes.
  • RDIV is screened by infecting animal cells with rDIs-H7HA and using the agglutination reaction of guinea pig erythrocytes to plaques formed thereby as an index.
  • the target RVV may be selected from red plaques having hemagglutination activity.
  • the virus obtained from the red plaque was subjected to PCR with the HA genome gene-specific primer of H7 subtype avian influenza virus such as H7N9 avian influenza virus using the viral genome as a template, and the HA protein gene of the H7 subtype avian influenza virus. You can check the introduction of.
  • HA protein of H7 subtype avian influenza virus such as H7N9 avian influenza virus
  • H7N9 avian influenza virus can be confirmed by Western blotting using animal cells after rDIs-H7 HA infection as a sample.
  • the antibody a rabbit antiserum prepared by immunizing a HA peptide derived from the HA protein of H7N9 avian influenza virus (SEQ ID NO: 4 etc.) can be used.
  • the thymidine kinase (TK) gene region is generally used as the gene deletion region of the vaccinia virus DIs strain, but expression of TK by inserting the target gene into the TK gene region is used. It is known that the deficiency reduces RVV proliferation. Therefore, in the present invention, the gene deletion region of the vaccinia virus DIs strain is preferable as the insertion site of the target gene.
  • the preventive and therapeutic pharmaceutical composition of novel influenza and its use includes the above recombinant vaccinia virus derived from DIs strain, and a preventive drug and treatment of novel influenza (that is, H7N9 avian influenza and H7N7 highly pathogenic avian influenza) Pharmaceuticals (prophylactic and therapeutic pharmaceutical compositions) are provided.
  • the present invention also comprises administering the recombinant vaccinia virus to a patient (subject), a method for preventing and treating the novel influenza, and the use of the recombinant vaccinia virus for preventing and treating the novel influenza, It is also possible to provide use of the recombinant vaccinia virus for producing a prophylactic and therapeutic drug for the novel influenza described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be introduced into the living body by any known method, for example, injection by intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous injection, or inhalation from the nasal cavity, oral cavity or lung, or oral administration.
  • a recombinant vaccinia virus contained in the pharmaceutical composition of the present invention and an existing antiviral drug eg, Tamiflu, Relenza
  • the combination mode is not particularly limited, it is also possible to simultaneously administer the recombinant vaccinia virus of the present invention and an existing antiviral drug, and after administering one, a method of administering the other after a lapse of a certain time. Can also be introduced into a living body.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises known pharmaceutically acceptable carriers such as excipients, fillers, binders, lubricants, buffers, isotonic agents, chelating agents, coloring agents, preservatives, and fragrances. , A flavoring agent, a sweetening agent and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes oral administration agents such as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, syrups, parenteral administration agents such as injections, external preparations, suppositories, eye drops, etc. It can be administered orally or parenterally depending on the form. Preferably, local injection into the skin, muscle, abdominal cavity, etc. is exemplified. In a preferred embodiment of the invention said pharmaceutical composition may be for intradermal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided as a preparation for intradermal administration containing the recombinant vaccinia virus of the present invention.
  • the above-mentioned preparation for intradermal administration may be a preventive agent for H7 subtype avian influenza.
  • the above-mentioned preparation for intradermal administration may be a therapeutic agent for H7 subtype avian influenza.
  • the H7 subtype avian influenza may be H7N9 avian influenza or H7N7 highly pathogenic avian influenza.
  • a method for preventing and / or treating H7 subtype avian influenza which comprises administering an effective amount of the recombinant vaccinia virus of the present invention to a subject.
  • the H7 subtype avian influenza may be H7N9 avian influenza or H7N7 highly pathogenic avian influenza.
  • the administration of the recombinant vaccinia virus of the present invention may be performed intradermally.
  • the dose is appropriately selected depending on the type of active ingredient, administration route, administration subject, age, weight, sex of patient, condition and other conditions.
  • the daily dose of virus is 1,000 to 1,000,000,000 in the case of oral administration. It is about PFU (plaque forming units), preferably about 100,000 to 100,000,000 PFU, and about 100 to 1,000,000,000 PFU for parenteral, preferably about 1,000 to 100,000,000 PFU.
  • the virus can be administered once a day or in several divided doses.
  • the recombinant vaccinia virus of the present invention is used as a preventive and therapeutic vaccine for novel influenza. Further, so far, in the development of a vaccine against the H7 subtype avian influenza virus, research focusing on antibodies against the H7N9 avian influenza virus or H7N7 highly pathogenic avian influenza virus and cytotoxic T cells (CTL) has been conducted. .. Therefore, it is preferable to measure the antibody titer or cell-mediated immune activity as a vaccine in advance. In a preferred embodiment of the present invention, the above influenza preventive and therapeutic vaccines may be for intradermal administration.
  • antibody titers against the recombinant vaccinia virus produced (rDIs-H7 HA) or parental DIs strains after inoculating mice with these virus strains, serum is collected over time, serum H7N9 avian influenza virus or H7N7 can be obtained by measuring the ELISA value for HA protein of highly pathogenic avian influenza virus.
  • the recombinant vaccinia virus produced by the present inventors can induce humoral immunity against novel influenza.
  • the recombinant vaccinia virus of the present invention can be used in the production of the influenza vaccine of the present invention.
  • vaccines comprising the recombinant vaccinia virus of the invention can be administered in combination with vaccines against other subtype influenza viruses.
  • administering the above combination is, for example, administering a recombinant vaccine containing the recombinant vaccinia virus of the present invention and another subtype influenza virus-derived recombinant vaccinia virus. You may.
  • a mixed vaccine containing the recombinant vaccinia virus of the present invention and one or more other recombinant vaccinia viruses derived from subtype influenza virus.
  • the number of other subtype influenza virus-derived recombinant vaccinia viruses that can be included in the mixed vaccine of the present invention may be one or two or more.
  • the combination vaccine of the present invention may be a dual combination vaccine.
  • the combination vaccine of the present invention may be a triple combination vaccine.
  • the combination vaccine of the present invention may be a quadruple combination vaccine.
  • other subtype influenza virus-derived recombinant vaccinia viruses may be, for example, rDIs-H1, rDIsH3, and rDIs-H5, but are not limited thereto.
  • the combination vaccine of the present invention may be a four-type combination vaccine (rDIs-H1, -H3, -H5 -H7HAs).
  • the combination vaccine of the present invention can be prepared using methods known in the art.
  • Example 1 ⁇ Method> 1) Preparation of recombinant vaccinia virus derived from influenza virus hemagglutinin protein gene-derived DIs strain Hemagglutinin protein (HA) which is an antigen of H7N9 influenza virus (A / Anhui / 1/2013) artificially synthesized downstream of the vaccinia virus promoter mH5 sequence ) Genes were ligated and inserted into a plasmid vector for homologous recombination to prepare RVV (Fig. 1). At this time, when inserting the H7N9 subtype HA sequence, SphI and AsiSI sites were used as restriction enzyme sites.
  • HA Hemagglutinin protein
  • HA protein derived from influenza virus shows agglutination reaction on guinea pig erythrocytes
  • HA protein derived from vaccinia virus does not agglutinate reaction on guinea pig erythrocytes. Therefore, RVV was screened by infecting CEF with the above recombinant virus and using the agglutination reaction of guinea pig erythrocytes to plaques formed thereby as an index. Recombinant viruses of interest were selected to form red plaques with hemagglutination activity.
  • mouse anti-H7N9-HA protein monoclonal antibody was used as the primary antibody and sheep anti-mouse IgG antibody-HRP was used as the secondary antibody for H7N9 avian influenza virus.
  • a coloring reagent manufactured by Millipore (Millipore; Immobilon western) was used.
  • H7N7 highly pathogenic avian influenza virus (A / chicken / Netherlands / 2586/2003), which is also a H7 subtype but a different HA subtype virus, was also examined.
  • BALB / c mice that were vaccinated once with the recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) by the same method were used one week or two weeks after vaccination.
  • H7N9 avian influenza virus (A / Anhui / 1/2013) was challenged with infection (50 x MLD50 / individual) and the onset protection effect was examined.
  • Recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) against H7N9 avian influenza virus infection in cynomolgus monkeys (two-pronged skin abrasion method)
  • Recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) was inoculated into both upper arms of cynomolgus monkeys with 1 ⁇ 10 7 PFU using a bifurcated needle (bifurcated needle scraping method).
  • cynomolgus monkeys that had been vaccinated once with the recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) by the same method, two weeks after vaccination, the H7N9 avian influenza virus (A / Anhui / 1/2013) attack infection (3x10 6 TCID 50 / individual) was performed and the onset protection effect was examined.
  • non-vaccination group DIs inoculation group
  • rDIs-H7 HA recombinant vaccinia virus
  • rDIs-H7 HA recombinant vaccinia virus
  • the collected lung tissue was immersed in 10% buffered formalin solution to inactivate the virus and fix the tissue, and then a paraffin block of the tissue was prepared.
  • a 4 ⁇ m thin slice was prepared, attached to a slide glass, stained with hematoxylin and eosin, and analyzed for pathological findings in the lung.
  • the vaccine of the present invention in addition to H7N9 avian influenza, H7N7 highly pathogenic avian influenza It was confirmed that it was also effective (Fig. 7). Furthermore, even in the group that was vaccinated once a week or two weeks before the H7N9 avian influenza virus challenge infection, it showed a weight loss inhibitory effect, with 80% of the vaccination 1 week before, and 2 weeks before the vaccination. A prominent onset protective effect of 100% survival rate was recognized, and it was shown that it can be used as a preventive vaccine even for rapid spread of infection (Fig. 8).
  • non-vaccination group recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) twice inoculation group, and recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) once inoculation group (rapid) using the above cynomolgus monkey .
  • the conjunctiva, nasal cavity, oral cavity, and respiratory tract were examined for virus elimination, and a biphasic pattern was observed in the non-vaccinated group (DIs-inoculated group), but the recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 In the HA) twice inoculation group and the recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) once inoculation group (rapid), an early virus elimination effect was confirmed (Fig. 5).
  • the vaccine for H7 subinfluenza virus using the recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) of the present invention is effective against H7N9 avian influenza, and can be used as a preventive vaccine for rapid spread of infection. It was shown that.
  • the DIs strain-derived RVV expressing the influenza virus HA protein gene can be used as a vaccine for the H7 subtype influenza virus (rDIs-H7 HA) by inoculating a single dose of 1x10 7 PFU of RVV, and the lethal H7N9 influenza virus and The H7N7 influenza virus also showed a rapid weight loss-suppressing effect and 100% survival rate (two weeks before administration of the vaccine) against the challenge infection. In addition, even one week before the administration of the vaccine, a survival rate of 80% was shown. In the control group (DIs inoculation group), all individuals died. Therefore, the RVV derived from the DIs strain has a sufficient effect as a vaccine for H7 subtype influenza virus, particularly an immediate effect.
  • Example 2 Protective effect of recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) against H7N9 avian influenza virus infection in cynomolgus monkeys (examination of two-stage intradermal inoculation method) Using cynomolgus monkeys, change the method of inoculating recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) from the skin scraping method to the double-needle intradermal injection method, and protect against H7N9 avian influenza virus infection by the intradermal vaccine injection method The effect was evaluated.
  • both upper arms of cynomolgus monkeys were inoculated with a monovalent vaccine of recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) by intradermal inoculation method or skin abrasion method (1x10 7 PFU), or in addition to influenza H7 influenza H1 Intradermal inoculation (1x10 7 PFU for each) of four mixed vaccines (rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs) including vaccines against H3, H3 and H5 subtype viruses, or DIs (control) Both were carried out by single inoculation.
  • H7N9 avian influenza virus A / Anhui / 1/2013 was challenged (3x10 6 TCID 50 / individual) to examine the onset protective effect.
  • Non-vaccination group (DIs inoculation group; control group), recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) skin abrasion inoculation group, recombinant vaccinia virus (rDIs-H7 HA) intradermal inoculation group using the above cynomolgus monkeys, and The temperature of the four types of mixed vaccines (rDIs-H1, -H3, -H5 -H7HAs) was intradermally inoculated, and body temperature was measured over time immediately before the challenge.
  • virus infectivity titer in lung tissue and lung pathological analysis were performed in the vaccinated and non-vaccinated cynomolgus monkeys.
  • the collected lung tissue was immersed in a 10% buffered formalin solution to inactivate the virus and fix the tissue, and then a paraffin block of the tissue was prepared.
  • a 4 ⁇ m thin slice was prepared, attached to a slide glass, stained with hematoxylin and eosin, and analyzed for pathological findings in the lung.
  • infectious virus was detected in multiple lobes of the lung, resulting in severe pneumonia with pulmonary edema.
  • the infectious virus titer was below the detection limit and pneumonia could be significantly reduced in any of the intradermal inoculation group of the monovalent vaccine, the skin abrasion group, and the four-type mixed inoculation group (FIG. 10).
  • influenza virus HA protein gene-expressing DIs strain-derived RVV of the present invention is a safe and effective vaccine against H7 subtype influenza virus. Further, it was shown that the RVV derived from the DIs strain expressing the influenza virus HA protein gene of the present invention can be used as a preventive vaccine even for rapid spread of infection.
  • Sequence number 3 Sequence of vaccinia virus promoter mH5 aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60 atcataaata 70
  • SEQ ID NO: 4 HA full-length amino acid sequence of H7N9 avian influenza virus MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVE

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

H7亜型鳥インフルエンザウイルス感染による発症の防止に有効性があり安全性の高い組換えワクシニアウイルス、及びこれを含むH7亜型鳥インフルエンザウイルス用ワクチンを提供する。本発明にかかる組換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、H7亜型鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルスである。

Description

新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
　本発明は、新型インフルエンザの発症原因であるH7亜型鳥インフルエンザウイルス感染の予防薬及び治療薬に関する。詳しくは、H7亜型鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）タンパク質遺伝子を発現することができる組換えワクシニアウイルスDIs株、ならびに、上記組換えワクシニアウイルスDIs株を含む新型インフルエンザ用の予防薬及び治療薬に関する。
　季節性インフルエンザは、毎年冬季に流行し、人口の10%から20%の罹患者の発生が報告されている。その病原体は、A/H1N1、A/H3N2、またはB型インフルエンザウイルスであるが、毎年少しずつその抗原性が変化する為、その流行予測株に合わせたワクチンの製造が必要となっている。一方、新型インフルエンザとしては、H5N1高病原性鳥インフルエンザやH7N9鳥インフルエンザ、H7N7高病原性鳥インフルエンザなどが挙げられる。特に、H7N9鳥インフルエンザウイルスのヒトに対する感染流行は、2013年以降中国から報告されており、これまでに少なくとも1564名の感染例と612名の死亡例が報告されている。また、2016-2017年シーズンは、過去4シーズンに比べて感染規模が最も大きく、今後の更なる流行拡大が懸念されている。現在、新型インフルエンザウイルスのヒトに対する感染流行の拡大に備えて、米国、英国を初めとする複数国において、ワクチン製造用の候補株の選定と保管がされており、有事の際には即座にワクチン製造を開始できる体制が整えられている。
　しかし、製造予定のワクチンは全粒子不活化ワクチンであり、そのために、複数回のワクチン接種を必要とし、したがって、十分な免疫誘導には時間を要する。更に、H7N9鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）タンパク質配列には、抑制性T細胞（Treg）の活性化を惹起する配列が含まれていることが報告されており（非特許文献１）、H7HAタンパク質特異的抗体の誘導能が減弱される可能性がある。H1N1(2009)パンデミックインフルエンザウイルスの世界的な大流行時の時間的推移に鑑みると、発生国での流行から2-3カ月後には、各国で国内感染流行の第一波が襲来していることから、H7亜型インフルエンザウイルスに対しても、より早期に対応可能となるワクチンの開発が必要である。
　現在、インフルエンザ治療薬としては、インフルエンザウイルスの出芽に重要であるノイラミニダーゼ（NA）の作用を阻害するタミフル及びリレンザがあるものの、発症後48時間以内の投薬が重要であるなど、その効果は限られている。その他、NA阻害剤の静注剤は既に開発されている。また、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ阻害剤であるアビガンは、2014年3月に日本国内での製造販売が承認されたものの、厚生労働大臣からの要請を受けて製造及び供給を行うこととなっており、一般向けには販売出来ないなどの条件付きのものとなっている。
　各種ワクチンの中でも、生ワクチンは最も有効の高いものの一つである。しかしながら、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンの開発には非常に長い期間を必要とすることが知られており、これはH7亜型インフルエンザに関しても同様であると考えられる。そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子工学的手法を駆使し、インフルエンザ生ワクチンとしてワクシニアウイルスを母体としてH7亜型HAタンパク質遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス（RVV）を開発するに至った。これまでに、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用又はリンダペスト用の組換えワクシニアウイルス（RVV）は、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている（非特許文献２）。また、重症急性呼吸器症候群（SARS）に対しても、その病原体として知られるSARS-CoVのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており（特許文献１）、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている（非特許文献３）。更に、H5N1 HPAIVに対して、H5N1 HPAIVのHAのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製にも成功しており、優れた予防効果を示す製剤であることが確認されている（特許文献２及び非特許文献４）。
国際公開第2006/038742号 特許第5884100号
Liu R, et al., H7N9 T-cell epitopes that mimic human sequences are less immunogenic and may induce Treg-mediated tolerance. Hum Vaccin Immunother. 2015; 11(9): p.2241-52 Tsukiyama K. et al., Development of heat-stable recombinant rinderpest vaccine. Arch. Virol., 1989, vol. 107, p. 225-235 Kitabatake M. et al., SARS-CoV spike protein-expressing recombinant vaccinia virus efficiently induces neutralizing antibodies in rabbits pre-immunized with vaccinia virus. Vaccine, 2007, vol. 25, p. 630-637 Yasui F. et al., Sensitization with vaccinia virus encoding H5N1 hemagglutinin restore immune potential against H5N1 influenza virus. Sci. Rep., 2016, vol. 6, p. 37915
　このような現状から、H7亜型鳥インフルエンザウイルス感染による発症を阻止するのに有効な組換えワクシニアウイルス（RVV）を含む治療薬及び予防薬の確立が強く望まれている。
　本発明の一実施形態は以下のとおりである。
　＜１＞
　ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、H7亜型鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
　＜２＞
　H7亜型鳥インフルエンザウイルスが、H7N9鳥インフルエンザウイルス又はH7N7高病原性鳥インフルエンザウイルスである、＜１＞に記載の組換えワクシニアウイルス。
　＜３＞
　ヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAが、以下の(a)～(h)のDNAである、＜１＞または＜２＞に記載の組換えワクシニアウイルス。
　(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
　(b) 配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
　(c) 配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
　(d) 配列番号１に示す塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつH7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
　(e) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNA
　(f) 配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
　(g) 配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
　(h) 配列番号２に示す塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつH7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
　＜４＞
　＜１＞～＜３＞）のいずれかに記載の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
　＜５＞
　H7亜型鳥インフルエンザの予防薬である、＜４＞に記載の医薬組成物。
　＜６＞
　H7亜型鳥インフルエンザの治療薬である、＜４＞に記載の医薬組成物。
　＜７＞
　H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、＜５＞又は＜６＞に記載の医薬組成物。
　＜８＞
　皮内投与用である、＜４＞～＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物。
　＜９＞
　＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の組換えワクシニアウイルスを含む、皮内投与用製剤。
　＜１０＞
　H7亜型鳥インフルエンザの予防薬である、＜９＞に記載の皮内投与用製剤。
　＜１１＞
　H7亜型鳥インフルエンザの治療薬である、＜９＞に記載の皮内投与用製剤。
　＜１２＞
　H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、＜１０＞又は＜１１＞に記載の皮内投与用製剤。
　＜１３＞
　＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の組換えワクシニアウイルスを含む、インフルエンザワクチン。
　＜１４＞
　前記インフルエンザがH7亜型鳥インフルエンザである、＜１３＞に記載のインフルエンザワクチン。
　＜１５＞
　前記H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、＜１４＞に記載のインフルエンザワクチン。
　＜１６＞
　皮内投与用である、＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載のインフルエンザワクチン。
　＜１７＞
　有効量の＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の組換えワクシニアウイルスを対象に投与することを含む、H7亜型鳥インフルエンザを予防及び／又は治療する方法。
　＜１８＞
　前記H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、＜１７＞に記載の方法。
　＜１９＞
　前記投与が皮内投与である、＜１７＞又は＜１８＞に記載の方法。
　＜２０＞
　他の亜型インフルエンザウイルスに対するワクチンと組み合わせて投与することを含む、＜１７＞～＜１９＞のいずれかに記載の方法。
　＜２１＞
　＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の組換えワクシニアウイルスと、１種又は２種以上の他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスとを含む、混合ワクチン。
　＜２２＞
　他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスが、rDIs-H1、rDIs H3、及びrDIs-H5である、＜２１＞に記載の混合ワクチン。
　＜２３＞
　インフルエンザ ワクチンの製造における、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の組換えワクシニアウイルスの使用。
　本発明によれば、新型インフルエンザの予防又は治療に有効であり、かつ安全性の高い新規な組換えワクシニアウイルス、及びこれを含む新型インフルエンザ用予防薬又は治療薬を提供することができる。
図１は、相同組換え技術を用いた、H7亜型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来の組換えワクシニアウイルス（RVV）（具体的にはrDIs-H7 HA）の作製を示す図である。 図２は、ウェスタンブロット法によるRVV(rDIs-H7 HA)のHAタンパク質の発現確認結果を示すPVDFメンブレンの写真である。 図３は、BALB/cマウスへのH7N9 鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する、H7N9 鳥インフルエンザウイルス由来HAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来RVV（H7亜型鳥インフルエンザウイルス用ワクチン：rDIs-H7 HA）の単回接種による免疫誘導効果及び感染防御能の増強効果の検討結果を示す図である。 図４は、カニクイザルへのH7N9鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する、H7N9 鳥インフルエンザウイルス由来HAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来RVV（H7亜型HA遺伝子発現ワクチン：rDIs-H7 HA）の皮膚擦過法を用いた接種による免疫誘導効果及び感染防御能の増強効果、ならびに即時性効果の検討結果を示す図である。 図５は、H7亜型HA遺伝子発現ワクチン（rDIs-H7 HA）を接種したカニクイザルにおける、H7N9鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染から７日後までのウイルス排除効果の検討結果を示す図である。 図６は、H7亜型HA遺伝子発現ワクチン（rDIs-H7 HA）を接種したカニクイザルにおける、H7N9鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染から７日後の肺病理所見及び肺重量を示す図である。 図７は、BALB/cマウスへのH7N7高病原性鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する、H7N9由来HAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来RVV（H7亜型HA遺伝子発現ワクチン：rDIs-H7 HA）の単回接種による感染防御効果の検討結果を示す図である。 図８は、BALB/cマウスへのH7N9鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する、H7N9由来HAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来RVV（H7亜型HA遺伝子発現ワクチン：rDIs-H7 HA）の即時性効果の検討結果を示す図である。 図９は、カニクイザルへのH7N9鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する、H7N9 鳥インフルエンザウイルス由来HAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来RVV（H7亜型HA遺伝子発現ワクチン：rDIs-H7 HA）の単価ワクチンの皮内接種法及び皮膚擦過法を用いた接種、ならびにインフルエンザH7型インフルエンザに加えてH1、H3、H5亜型ウイルスに対するワクチンも含めた四種混合ワクチン（rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs）の皮内接種による免疫誘導効果及び感染防御能の増強効果についての検討結果を示す図である。 図１０は、カニクイザルにおける、H7亜型HA遺伝子発現ワクチン（rDIs-H7 HA）の単価ワクチンの皮内接種法もしくは皮膚擦過法を用いた接種、インフルエンザH7型インフルエンザに加えてH1、H3、H5亜型ウイルスに対するワクチンも含めた四種混合ワクチン（rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs）の皮内接種、またはH7N9鳥インフルエンザウイルスの攻撃感染から７日後の肺病理所見及び肺組織中ウイルス感染価を示す図である。
　以下、本発明にかかる組換えワクシニアウイルス及びその用途について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書において引用した特許文献、非特許文献その他の刊行物は、参照として本明細書に組み込まれるものとする。
１．本発明の概要
　上述の背景の下、本発明者らは、不特定多数の被験者に接種することに鑑み、哺乳動物細胞内において非増殖性であるため安全性が高い、ヒトでの接種実績を有するワクシニアウイルスDIs株を用いることにより、H7亜型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するDIs株由来の組換えワクシニアウイルス（RVV）を開発するに至った。
　このような場合に採られる手法の一つとして、生ワクチンとして組換えワクシニアウイルス（RVV）を作製するという遺伝子工学的手法が知られている。RVVの作製に用いる組換え母体となるワクシニアウイルスとしては、安全性の確立されているワクチン株である必要があるが、そのようなワクチン株として、ワクシニアウイルスDIs株やLC16m8株が挙げられる。ワクシニアウイルスDIs株は、ワクシニアウイルス大連株（DEI株）を鶏卵胚にて継代培養することによって分離された高度に弱毒化したワクシニアウイルス株である（Tagaya I et al., A new mutant of dermovaccinia virus. Nature, 1961, vol. 192, p.1187-1188）。このDIs株は、ニワトリ胎児繊維芽細胞（CEF）では増殖できるが、他の哺乳動物細胞では非増殖であり、安全性が高い。一方、ワクシニアウイルスLC16m8株は、天然痘ワクチンとして1975年に当時の厚生省に認可され、5万人以上に乳幼児に接種された実績を持つ安全かつ効果的な弱毒ワクチン株である。LC16m8株の弱毒性は、細胞への吸着・感染に関与すると考えられているLC16mO株のB5Rタンパク質遺伝子が一塩基欠損していることにより、全長のB5Rタンパク質が発現しないことに由来する（Morikawa S., et al. An attenuated LC16m8 smallpox vaccine: analysis of full-genome sequence and induction of immune protection. J. Virol., 2005, vol. 79(18), p. 11873-1189）。このような安全性の確立されているワクチン株を用いれば、免疫不全・免疫抑制を有する対象への応用も可能であり、また接種痕もできない等の長所を有する組換えインフルエンザ生ワクチンの開発が可能となる。そこで、このDIs株を母体として用いた組換え新型インフルエンザワクチンを樹立し、急激な新型インフルエンザの流行に対して、単回接種かつ短期間でも有効性を示す新規ワクチンによる予防及び治療法の確立を目指した。
　本発明では、下記に詳述するように、rDIs-H7 HA接種個体では、H7N9鳥インフルエンザウイルス感染及びH7N7鳥インフルエンザウイルス感染に対して、良好な発症防御効果を示した。更に、ワクチン接種から1週間後又は2週間後にH7N9鳥インフルエンザウイルスを感染させた場合にも、症状を顕著に減弱することができ、即時的効果も確認された。以上の結果から、rDIs-H7 HAは、即時的に免疫誘導可能なH7亜型インフルエンザ用ワクチンとなり得る。
　本発明者は、上述のように、DIs株を母体として用いた組換え新型インフルエンザワクチン（rDIs-H7 HA）を樹立した。rDIs-H7 HA単回接種マウスでは、A/Anhui/1/2013(H7N9)インフルエンザウイルスによる攻撃感染後に一過性の体重減少を示したが、その後体重は速やかに回復し、100%の生存率を示した（図３）。カニクイザルでの発症防御試験では、rDIs-H7 HAを2回接種した群において、ワクチン非接種群（DIs接種群）と比較して、速やかな解熱効果（図４）、各所(結膜、鼻腔、口腔、気道)拭い液中ウイルスの早期排除効果（図５）、及び肺炎の顕著な軽減効果（図６）を示した。また、カニクイザルにおいて、H7N9インフルエンザウイルス感染の2週間前にrDIs-H7 HAを単回接種することにより急速な感染拡大に対しても予防ワクチンとして対応可能か否かを検討した結果、rDIs-H7 HAは、ウイルス感染の2週間前という短期間においても顕著な即時性発症予防効果を発揮した（図４～図６）。このような即時性発症予防効果は、マウスにおいても確認された（図８）。更に、rDIs-H7 HA接種マウスは、A/chicken/Netherlands/2586/2003(H7N7)インフルエンザウイルスによる攻撃感染後においても、体重減少抑制効果と100%の生存率を示した（図７）。このように、インフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を発現するDIs株由来RVVは、H7亜型インフルエンザウイルス用ワクチン（rDIs-H7 HA）として、1x107 PFU量のRVVを単回接種することで、致死性のH7型インフルエンザウイルス攻撃感染に対しても体重減少抑制効果を示し、1週間前の接種では80％、2週間前の接種では100%の生存率という顕著な発症防御効果が認められた。H7N9鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）タンパク質配列には、抑制性T細胞（Treg）の活性化を惹起する配列が含まれていることが報告され（非特許文献１）、H7HAタンパク質特異的抗体の誘導能が減弱される可能性が示唆されていることから、当該ワクチンの防御効果についても懸念されたが、上記のように十分な効果が認められた。従って、DIs株由来RVVは、H7亜型インフルエンザウイルス用ワクチンとして十分な効果を有するものである。
２．新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの作製
　H5N1 HPAIV用ワクチンの作製方法は既知であり（特許第5884100号）、本発明のH7亜型インフルエンザウイルス用ワクチン（rDIs-H7 HA）も、当該既知方法に従って作製することができる。作製方法の概要を以下に示す。
　H7亜型鳥インフルエンザウイルス、例えば配列番号１のH7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子は、すでにインフルエンザウイルス遺伝子データベース(GISAID; Global Initiative on Sharing All Influenza Data）において、所定のアクセッション番号(Accession No. EPI439507)により登録されている。
　これらHAタンパク質遺伝子（一部変異させた遺伝子も含む）は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。従って、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子、すなわちH7N9鳥インフルエンザウイルスのH7亜型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質をコードするcDNAの全部（変異配列も含む）又はその一部は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等を参照して行うことができる。得られたPCR産物の精製には既知の方法を用いることができる。また、変異配列、特に変異置換型のDNAについては、例えば、上記「Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）や「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)」等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の既知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（アジレント・テクノロジー社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
　本発明の好ましい態様においては、上記プラスミドに挿入されているH7亜型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子を、上記PCRの鋳型に用いることができる。本発明のより好ましい態様においては、H7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子を、上記PCRの鋳型に用いることができる。そして、H7亜型高病原性鳥インフルエンザウイルス、より好ましくはH7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子のcDNAを鋳型とし、各遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRを行うことにより、H7亜型高病原性鳥インフルエンザウイルス、より好ましくはH7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子領域を調製することができる。
　上記の各変異型DNAは、化学合成により得ることができ、あるいは、配列番号１～配列番号２に示される塩基配列からなるDNA又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の既知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることもできる。上記ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、例えば、0. 1×SSC～10×SSC、0.1％～1.0％SDS及び20℃～80℃の条件が挙げられ、より詳細には、37℃～56℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、0.1×SSC、0.1％SDS中、室温で10～20分の洗浄を1～3回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed.」（Cold Spring Harbor Press (2012)）等を参照することができる。
　また、配列番号１に示す塩基配列と75％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H7亜型鳥インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）、配列番号２に示す塩基配列と75％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、H7N9鳥インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質をコードするDNA（変異型DNA）を用いることができる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、ワクシニアウイルスDIs株の遺伝子欠損領域に挿入されるものであれば良く、限定はされず、例えば、ワクシニアウイルスプロモーターmH5等が挙げられる。また、当該発現プロモーターとしては、例えば、ポックスウイルスA型封入体（ATI）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質（p7.5）前期発現プロモーターにより構成されるハイブリッドプロモーターを用いることもできる。このプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができ、例えばpBMSF7CやpUC/DIsが知られている（Arch. Virol. vol. 138, p. 315-330, 1994；特開平6-237773号公報 参照）。
　本発明において使用可能なワクシニアウイルスプロモーターmH5の塩基配列を配列番号３に示す。但し、本発明においては、配列番号３に示す塩基配列からなるDNAのほか、配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNAも、発現プロモーター（特にハイブリッドプロモーター）として使用することができる。「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質又は非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。上記ハイブリットプロモーターにより発現されるタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。
　上記発現プロモーター及びHAタンパク質をコードするDNAを挿入して得られたプラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製することができる。プラスミドベクターの宿主への導入は、既知の任意の手法を採用することができ、例えば弱毒ワクシニアウイルスDIs株を感染した動物細胞中に得られたプラスミドベクターを導入することにより、ワクシニアウイルスDIs株の遺伝子欠損領域の近隣配列において相同組換えを引き起こし、H7亜型鳥インフルエンザウイルス（例えばH7N9鳥インフルエンザウイルス又はH7N7 高病原性鳥インフルエンザウイルス）のHAタンパク質遺伝子をそれぞれ発現する組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を作製することができる。
　不活化ワクチンの製造法は既知である。前記の通り、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵に接種して増殖させ、漿尿液から精製・濃縮したウイルスをエーテルで部分分解し、更にホルマリンで不活化する。
　作製したDIs株由来の組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）は、ワクシニアウイルスDIs株の遺伝子欠損領域にH7亜型鳥インフルエンザウイルス（例えばH7N9鳥インフルエンザウイルス）のHAタンパク質遺伝子が挿入される。インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質は、モルモット赤血球に対して凝集反応を示すが、ワクシニアウイルス由来のHAタンパク質はモルモット赤血球に対して凝集反応を起こさない。従って、rDIs-H7 HAを動物細胞に感染させ、これにより形成するプラークへのモルモット赤血球の凝集反応を指標にして、RVVのスクリーニングを行う。目的のRVVは、赤血球凝集活性を持つレッドプラークを選別すればよい。
　レッドプラークより得られたウイルスは、ウイルスゲノムを鋳型としてH7N9鳥インフルエンザウイルスなどのH7亜型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子特異的なプライマーによりPCRを行い、そのH7亜型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子の導入を確認することができる。
　H7N9鳥インフルエンザウイルスなどのH7亜型鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質の発現は、rDIs-H7 HAを感染させた後の動物細胞をサンプルとして、ウェスタンブロット法により確認することができる。なお、抗体は、H7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質由来のHAペプチド（配列番号４等）を免疫して作製したウサギ抗血清を用いることができる。
　RVVの作製において目的遺伝子の挿入部位としては、ワクシニアウイルスDIs株の遺伝子欠損領域として、一般にはチミジンキナーゼ（TK）遺伝子領域が用いられるが、TK遺伝子領域に目的遺伝子を挿入することによるTKの発現欠損によりRVVの増殖性が低下することが知られている。従って、本発明においては、目的遺伝子の挿入部位としてワクシニアウイルスDIs株の遺伝子欠損領域が好ましい。
３．新型インフルエンザの予防用及び治療用医薬組成物並びにその使用
　本発明は、DIs株由来の上記組換えワクシニアウイルスを含む、新型インフルエンザ（すなわちH7N9鳥インフルエンザ及びH7N7高病原性鳥インフルエンザ）の予防薬及び治療薬（予防用及び治療用医薬組成物）を提供する。また本発明は、上記組換えワクシニアウイルスを患者（被験者）に投与することを含む、上記新型インフルエンザの予防及び治療方法や、上記新型インフルエンザの予防及び治療のための上記組換えワクシニアウイルスの使用や、上記新型インフルエンザの予防薬及び治療薬を製造するための上記組換えワクシニアウイルスの使用等も提供することができる。
　本発明の医薬組成物は、あらゆる既知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。さらに、本発明の医薬組成物に含まれる組換えワクシニアウイルスと、既存の抗ウイルス薬（例えば、タミフル、リレンザ）を併用することも可能である。併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の組換えワクシニアウイルスと既存の抗ウイルス薬とを同時に投与することもでき、また、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
　本発明の医薬組成物は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等既知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
　本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。本発明の好ましい実施形態において、上記の医薬組成物は皮内投与用であってよい。
　本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の組換えワクシニアウイルスを含む、皮内投与用製剤として提供され得る。本発明の一実施形態において、上記の皮内投与用製剤は、H7亜型鳥インフルエンザの予防薬であってよい。本発明の一実施形態において、上記の皮内投与用製剤は、H7亜型鳥インフルエンザの治療薬であってよい。このような実施形態において、H7亜型鳥インフルエンザは、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザであってよい。
　本発明の別の実施形態において、本発明の組換えワクシニアウイルスを有効量で対象に投与することを含む、H7亜型鳥インフルエンザを予防及び／又は治療する方法が提供される。このような実施形態において、H7亜型鳥インフルエンザは、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザであってよい。本発明の好ましい実施形態において、本発明の組換えワクシニアウイルスの投与は、皮内投与で実施され得る。
　投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、ウイルスの一日投与量としては、経口の場合は1,000～1,000,000,000 PFU（plaque forming units）程度、好ましくは100,000～100,000,000 PFU程度であり、非経口の場合は100～1,000,000,000 PFU程度、好ましくは1,000～100,000,000 PFU程度である。ウイルスは、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスは、新型インフルエンザ予防用及び治療用ワクチンとして使用される。また、これまでに、H7亜型鳥インフルエンザウイルスに対するワクチンの開発では、H7N9鳥インフルエンザウイルス又はH7N7高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する抗体と細胞障害性T細胞（CTL）に着目した研究が行われている。従って、予めワクチンとしての抗体価又は細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。本発明の好ましい実施形態において、上記のインフルエンザ予防用及び治療用ワクチンは、皮内投与用であってよい。
　例えば、作製した組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）又は親株であるDIs株に対する抗体価は、これらのウイルス株をマウスに接種後、経時的に血清を回収し、血清のH7N9鳥インフルエンザウイルス又はH7N7 高病原性鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質に対するELISA価を測定することで得ることができる。
　以上のとおり、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルスは、新型インフルエンザに対する液性免疫を誘導し得るものである。
　本発明の組換えワクシニアウイルスは、本発明のインフルエンザワクチンの製造において使用することができる。
４．混合ワクチン及びその使用
　本発明の一実施形態において、本発明の組換えワクシニアウイルスを含むワクチンは、他の亜型インフルエンザウイルスに対するワクチンと組み合わせて投与することができる。本発明の一実施形態において、上記の組み合わせて投与することは、例えば、本発明の組換えワクシニアウイルスと、他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスとを含む混合ワクチンを投与することであってよい。
　本発明の一実施形態において、本発明の組換えワクシニアウイルスと、１種又は２種以上の他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスとを含む混合ワクチンが提供される。本発明の一実施形態において、本発明の混合ワクチンに含まれ得る他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスは、１種であってもよいし、２種以上であってもよい。本発明の一実施形態において、本発明の混合ワクチンは、二種混合ワクチンであり得る。本発明の別の実施形態において、本発明の混合ワクチンは、三種混合ワクチンであり得る。本発明の更に別の実施形態において、本発明の混合ワクチンは、四種混合ワクチンであり得る。本発明の一実施形態において、他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスは、例えばrDIs-H1、rDIs H3、及びrDIs-H5であってよいが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、本発明の混合ワクチンは、四種混合ワクチン（rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs）であってよい。本発明の混合ワクチンは、当技術分野において知られている方法を用いて作製することができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
　［実施例１］
　＜方法＞
　1) インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子を導入したDIs株由来組換えワクシニアウイルスの作製
　ワクシニアウイルスプロモーターmH5配列の下流に人工合成したH7N9インフルエンザウイルス（A/Anhui/1/2013）の抗原であるヘマグルチニンタンパク質(HA)遺伝子を連結させ、相同組換え用プラスミドベクターへ挿入し、RVVを作製した（図１）。この際、H7N9亜型HA配列を挿入する場合には、制限酵素部位としてSphI及びAsiSI部位を使用した。予めDIs株を感染させておいたCEFへ作製した相同組換え用プラスミドベクター（制限酵素により一箇所切断し、線状化した。）を遺伝子導入することによって、DIs株の遺伝子欠損部位の隣接領域にて相同組換えを起こさせてワクシニアウイルスのゲノム中にmH5プロモーター及びインフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を挿入した組換えワクシニアウイルス（RVV）、具体的には、rDIs-H7 HAのRVVを作出した。インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質は、モルモット赤血球に対して凝集反応を示すが、ワクシニアウイルス由来のHAタンパク質はモルモット赤血球に対して凝集反応を起こさない。従って、上記組換えウイルスをCEFに感染させ、これにより形成するプラークへのモルモット赤血球の凝集反応を指標にして、RVVのスクリーニングを行った。目的の組換えウイルスは、赤血球凝集活性を持つレッドプラークを形成するものを選別した。
　2) DIs株由来組換えワクシニアウイルスによるインフルエンザウイルスHAタンパク質の発現確認
　配列１を用いて作製したDIs株由来の組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を、ウイルス感染価（multiplicity of infection）10でCEFに感染させた。感染24時間後に、培地を除去し、PBS(-)で2回洗浄した。可溶化液を加えて、細胞可溶化液を調製した。細胞可溶化液中に含まれるタンパク質量を10μgでSDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行い、PVDF膜へ転写した。RVV感染によるインフルエンザウイルスタンパク質発現の確認は、H7N9鳥インフルエンザウイルスに対しては、一次抗体にマウス抗H7N9-HAタンパク質モノクローナル抗体及び二次抗体にヒツジ抗マウスIgG抗体-HRPを使用した。Millipore社製発色試薬（Millipore；Immobilon western）を使用した。
　3) DIs株由来組換えワクシニアウイルス単回接種マウスにおけるH7N9鳥インフルエンザウイルス及びH7N7鳥インフルエンザウイルスの感染に対する防御効果
　組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を1x107 PFUでBALB/cマウスの背部皮内へ接種した。接種から５週間後にH7N9鳥インフルエンザウイルス（A/Anhui/1/2013）の攻撃感染を行い、連日体重測定を行い、生存率を求めた。また、同様にH7亜型でありながら異なるHA亜型ウイルスであるH7N7高病原性鳥インフルエンザウイルス（A/chicken/Netherlands/2586/2003）に対する発症防御効果についても検討した。また、ワクチンの即時性効果を検討する目的で、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を同一の方法で単回接種したBALB/cマウスに対して、ワクチン接種の1週間後又は2週間後にH7N9鳥インフルエンザウイルス（A/Anhui/1/2013）の攻撃感染（50x MLD50/個体）を行い、発症防御効果を検討した。
　4) カニクイザルを用いたH7N9鳥インフルエンザウイルス感染に対する組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）の発症防御効果（二又針皮膚擦過法）
　二又針を用いて、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を1x107 PFUでカニクイザルの両上腕部へ接種した（二又針皮膚擦過法）。初回接種から3週間後に同量の組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を追加接種し、追加接種の1週間後にH7N9鳥インフルエンザウイルス（A/Anhui/1/2013）の攻撃感染（3x106 TCID50/個体）を行った。また、ワクチンの即時性効果を検討する目的で、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を同一の方法で単回接種したカニクイザルに対して、ワクチン接種の2週間後にH7N9鳥インフルエンザウイルス（A/Anhui/1/2013）の攻撃感染（3x106 TCID50/個体）を行い、発症防御効果を検討した。
　上記カニクイザルを用いた、ワクチン非接種群（DIs接種群）、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）2回接種群、及び組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）1回接種群（rapid）について、攻撃感染直前からから経時的に体温測定を行い、更に攻撃感染から７日後の肺重量を計測した。
　また、採取した肺組織を10%緩衝ホルマリン溶液に浸漬して、ウイルス不活化と組織固定を行った後、組織のパラフィンブロックを作製した。4μmの薄切を作製し、スライドガラスに張り付けた後、ヘマトキシリンとエオジン染色を行い、肺病理所見を解析した。
　＜結果＞
　i) DIs株由来組換えワクシニアウイルス単回接種マウスにおけるH7N9鳥インフルエンザウイルス及びH7N7高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染に対する防御効果
　作製したRVV（rDIs-H7 HA）単回接種マウスでは、H7N9インフルエンザウイルスによる攻撃感染後に一過性の体重減少を示したが、その後速やかに回復、100％の生存率を示した（図３）。一方、ワクチン非接種群（DIs接種群）では、急激な体重減少を示し、全匹死亡した（図３）。また、H7N7高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染に対しても、体重減少抑制効果、及び100％の生存率を示し、本発明のワクチンが、H7N9鳥インフルエンザだけでなく、H7N7高病原性鳥インフルエンザに対しても有効であることが確認された（図７）。更に、H7N9鳥インフルエンザウイルスによる攻撃感染の1週間前又は2週間前にワクチンを単回接種した群においても、体重減少抑制効果を示し、1週間前の接種では80％、2週間前の接種では100％の生存率という顕著な発症防御効果が認められ、急速な感染拡大にも予防ワクチンとして対応可能であることが示された（図８）。
　ii) カニクイザルを用いたH7N9鳥インフルエンザウイルス感染に対する組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）の発症防御効果
　カニクイザルを用いたH7N9鳥インフルエンザウイルス感染に対する組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）の発症防御試験では、ワクチン非接種群（DIs接種群）では、二相性発熱パターンを示したが、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を2回接種した群では、速やかな解熱効果が得られた（図４）。更に、感染攻撃の2週間前に組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を同一の方法で単回接種した群（rapid）についても、同様の解熱効果が確認され、即時性感染予防効果が確認された（図４）。
　上記カニクイザルを用いた、ワクチン非接種群（DIs接種群）、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）2回接種群、及び組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）1回接種群（rapid）について、結膜、鼻腔、口腔、及び気道から採取したスワブサンプルにおけるウイルス排除効果を調べたところ、ワクチン非接種群（DIs接種群）では二相性のパターンを示したが、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）2回接種群、及び組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）1回接種群（rapid）では、早期のウイルス排除効果が確認された（図５）。
　上記カニクイザルを用いた、ワクチン非接種群（DIs接種群）、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）2回接種群、及び組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）1回接種群（rapid）について、攻撃感染から７日後の肺病理所見を解析したところ、ワクチン非接種群（DIs接種群）では、局所的な肺炎が認められたのに対し、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）2回接種群、及び組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）1回接種群（rapid）では、いずれも肺胞腔はしっかりと維持されており肺炎が顕著に軽減されていることが示された（図６）。
　また、肺重量を測定したところ、ワクチン非接種群（DIs接種群）では、肺湿重量の増加が認められたが、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）2回接種群、及び組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）1回接種群（rapid）では、肺湿重量の増加が抑制された（図６）。よって、本発明の組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）を用いたH7亜型インフルエンザウイルス用ワクチンは、H7N9鳥インフルエンザに対して有効であり、また、急速な感染拡大にも予防ワクチンとして対応可能であることが示された。
　＜考察＞
　インフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を発現するDIs株由来RVVは、H7亜型インフルエンザウイルス用ワクチン（rDIs-H7 HA）として、1x107 PFU量のRVVを単回接種することで、致死性のH7N9インフルエンザウイルス及びH7N7インフルエンザウイルスによる攻撃感染に対しても速やかな体重減少抑制効果と100%の生存率（ワクチンの2週間前投与）を示した。また、ワクチンの1週間前投与でも80%の生存率が示された。なお、コントロール群（DIs接種群）では、全個体が死亡した。よって、DIs株由来RVVは、H7亜型インフルエンザウイルス用ワクチンとしても十分な効果、特に即時性効果を有するものである。
　［実施例２］
　カニクイザルを用いたH7N9鳥インフルエンザウイルス感染に対する組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）の発症防御効果（２段針皮内接種法の検討）
　カニクイザルを用いて、組換えワクシニアウイルス(rDIs-H7 HA)の接種方法を皮膚擦過法から二段針での皮内接種法へ変更し、ワクチンの皮内接種法によるH7N9鳥インフルエンザウイルス感染に対する防御効果を評価した。
　まず、カニクイザルの両上腕部に、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）の単価ワクチンの皮内接種法もしくは皮膚擦過法を用いた接種（1x107 PFU）、またはインフルエンザH7型インフルエンザに加えてH1、H3、H5亜型ウイルスに対するワクチンも含めた四種混合ワクチン（rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs）の皮内接種（それぞれ1x107 PFU）、またはDIsの皮内接種（コントロール）を、いずれも単回接種にて行った。接種の2週間後にH7N9鳥インフルエンザウイルス（A/Anhui/1/2013）の攻撃感染（3x106 TCID50/個体）を行い、発症防御効果を検討した。
　上記カニクイザルを用いた、ワクチン非接種群（DIs接種群；コントロール群）、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）皮膚擦過接種群、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）皮内接種群、及び四種混合ワクチン（rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs）皮内接種群について、攻撃感染直前からから経時的に体温測定を行った。
　図９に示されているように、ワクチン非接種群（DIs接種群；コントロール群）では、感染直後及び後期に発熱を呈したが、組換えワクシニアウイルス（rDIs-H7 HA）接種群では、皮内接種法または皮膚擦過接種法の何れの接種法においても良好な発熱抑制及び解熱効果が観察された。この結果は、皮膚擦過の代替法として、皮内接種法を使用できる可能性を示す。
　また、四種混合ワクチン（rDIs-H1, -H3, -H5 -H7 HAs）皮内接種群においても、他のワクチン接種群と同等の発熱抑制及び解熱効果が観察された。以上の結果は、ヒトに感染しうる四つの血清型ウイルスに対する免疫を同時に付与し得るワクチン開発への可能性を示す。
　さらに、上記ワクチン接種及び非接種カニクイザルでの肺組織中ウイルス感染価測定と肺病理解析を行った。採取した肺組織を10%緩衝ホルマリン溶液に浸漬して、ウイルス不活化と組織固定を行った後、組織のパラフィンブロックを作製した。4μmの薄切を作製し、スライドガラスに張り付けた後、ヘマトキシリンとエオジン染色を行い、肺病理所見を解析した。
　ワクチン非接種群では、複数の肺葉で感染性ウイルスが検出され、肺水腫を伴う重症肺炎を呈していた。これに対して、単価ワクチン皮内接種群、皮膚擦過群、四種混合接種群のいずれにおいても、感染性ウイルス価は検出限界以下であり、且つ肺炎も顕著に軽減できた（図１０）。
　以上の結果より、本発明のインフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子発現DIs株由来RVVは、H7亜型インフルエンザウイルスに対して、安全かつ有効なワクチンとなることが分かった。また、本発明のインフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子発現DIs株由来RVVは、急速な感染拡大にも予防ワクチンとして対応可能であることが示された。
　配列表フリーテキスト
　配列番号1:  H7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子
atgaacactcaaatcctggtattcgctctgattgcgatcattccaacaaatgcagacaaaatctgcctcggacatcatgccgtgtcaaacggaaccaaagtaaacacattaactgaaagaggagtggaagtcgtcaatgcaactgaaacagtggaacgaacaaacatccccaggatctgctcaaaagggaaaaggacagttgacctcggtcaatgtggactcctggggacaatcactggaccacctcaatgtgaccaattcctagaattttcagccgatttaattattgagaggcgagaaggaagtgatgtctgttatcctgggaaattcgtgaatgaagaagctctgaggcaaattctcagagaatcaggcggaattgacaaggaagcaatgggattcacatacagtggaataagaactaatggagcaaccagtgcatgtaggagatcaggatcttcattctatgcagaaatgaaatggctcctgtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatgactaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctctaatagtatgggggatccatcattccgtatcaactgcagagcaaaccaagctatatgggagtggaaacaaactggtgacagttgggagttctaattatcaacaatcttttgtaccgagtccaggagcgagaccacaagttaatggtctatctggaagaattgactttcattggctaatgctaaatcccaatgatacagtcactttcagtttcaatggggctttcatagctccagaccgtgcaagcttcctgagaggaaaatctatgggaatccagagtggagtacaggttgatgccaattgtgaaggggactgctatcatagtggagggacaataataagtaacttgccatttcagaacatagatagcagggcagttggaaaatgtccgagatatgttaagcaaaggagtctgctgctagcaacagggatgaagaatgttcctgagattccaaagggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaaggcctaattgatggttggtatggtttcagacaccagaatgcacagggagagggaactgctgcagattacaaaagcactcaatcggcaattgatcaaataacaggaaaattaaaccggcttatagaaaaaaccaaccaacaatttgagttgatagacaatgaattcaatgaggtagagaagcaaatcggtaatgtgataaattggaccagagattctataacagaagtgtggtcatacaatgctgaactcttggtagcaatggagaaccagcatacaattgatctggctgattcagaaatggacaaactgtacgaacgagtgaaaagacagctgagagagaatgctgaagaagatggcactggttgctttgaaatatttcacaagtgtgatgatgactgtatggccagtattagaaataacacctatgatcacagcaaatacagggaagaggcaatgcaaaatagaatacagattgacccagtcaaactaagcagcggctacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttctagccattgtaatgggccttgtcttcatatgtgtaaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatataa
　配列番号2: H7N9鳥インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子の一塩基置換型
atggacactcaaatcctggtattcgctctgattgcgatcattccaacaaatgcagacaaaatctgcctcggacatcatgccgtgtcaaacggaaccaaagtaaacacattaactgaaagaggagtggaagtcgtcaatgcaactgaaacagtggaacgaacaaacatccccaggatctgctcaaaagggaaaaggacagttgacctcggtcaatgtggactcctggggacaatcactggaccacctcaatgtgaccaattcctagaattttcagccgatttaattattgagaggcgagaaggaagtgatgtctgttatcctgggaaattcgtgaatgaagaagctctgaggcaaattctcagagaatcaggcggaattgacaaggaagcaatgggattcacatacagtggaataagaactaatggagcaaccagtgcatgtaggagatcaggatcttcattctatgcagaaatgaaatggctcctgtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatgactaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctctaatagtatgggggatccatcattccgtatcaactgcagagcaaaccaagctatatgggagtggaaacaaactggtgacagttgggagttctaattatcaacaatcttttgtaccgagtccaggagcgagaccacaagttaatggtctatctggaagaattgactttcattggctaatgctaaatcccaatgatacagtcactttcagtttcaatggggctttcatagctccagaccgtgcaagcttcctgagaggaaaatctatgggaatccagagtggagtacaggttgatgccaattgtgaaggggactgctatcatagtggagggacaataataagtaacttgccatttcagaacatagatagcagggcagttggaaaatgtccgagatatgttaagcaaaggagtctgctgctagcaacagggatgaagaatgttcctgagattccaaagggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaaggcctaattgatggttggtatggtttcagacaccagaatgcacagggagagggaactgctgcagattacaaaagcactcaatcggcaattgatcaaataacaggaaaattaaaccggcttatagaaaaaaccaaccaacaatttgagttgatagacaatgaattcaatgaggtagagaagcaaatcggtaatgtgataaattggaccagagattctataacagaagtgtggtcatacaatgctgaactcttggtagcaatggagaaccagcatacaattgatctggctgattcagaaatggacaaactgtacgaacgagtgaaaagacagctgagagagaatgctgaagaagatggcactggttgctttgaaatatttcacaagtgtgatgatgactgtatggccagtattagaaataacacctatgatcacagcaaatacagggaagaggcaatgcaaaatagaatacagattgacccagtcaaactaagcagcggctacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttctagccattgtaatgggccttgtcttcatatgtgtaaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatataa
　配列番号3：ワクシニアウイルスプロモーターmH5の配列
aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60
atcataaata                                                        70
　配列番号４：H7N9鳥インフルエンザウイルスのHA全長アミノ酸配列
MNTQILVFALIAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNEVEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI

Claims (23)

  1. 　ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、H7亜型鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAの全部又は一部とを含む、組換えワクシニアウイルス。
  2. 　H7亜型鳥インフルエンザウイルスが、H7N9鳥インフルエンザウイルス又はH7N7高病原性鳥インフルエンザウイルスである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
  3. 　ヘマグルチニンタンパク質をコードするcDNAが、以下の(a)～(h)のDNAである、請求項１または２に記載の組換えワクシニアウイルス。
    　(a) 配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
    　(b) 配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
    　(c) 配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
    　(d) 配列番号１に示す塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつH7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
    　(e) 配列番号２に示す塩基配列からなるDNA
    　(f) 配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
    　(g) 配列番号２に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、H7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
    　(h) 配列番号２に示す塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつH7N9に属するウイルス株由来のヘマグルチニンタンパク質をコードするDNA
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
  5. 　H7亜型鳥インフルエンザの予防薬である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　H7亜型鳥インフルエンザの治療薬である、請求項４に記載の医薬組成物。
  7. 　H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
  8. 　皮内投与用である、請求項４～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、皮内投与用製剤。
  10. 　H7亜型鳥インフルエンザの予防薬である、請求項９に記載の皮内投与用製剤。
  11. 　H7亜型鳥インフルエンザの治療薬である、請求項９に記載の皮内投与用製剤。
  12. 　H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、請求項１０又は１１に記載の皮内投与用製剤。
  13. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、インフルエンザワクチン。
  14. 　前記インフルエンザがH7亜型鳥インフルエンザである、請求項１３に記載のインフルエンザワクチン。
  15. 　前記H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、請求項１４に記載のインフルエンザワクチン。
  16. 　皮内投与用である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
  17. 　有効量の請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスを対象に投与することを含む、H7亜型鳥インフルエンザを予防及び／又は治療する方法。
  18. 　前記H7亜型鳥インフルエンザが、H7N9鳥インフルエンザ又はH7N7高病原性鳥インフルエンザである、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記投与が皮内投与である、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 　他の亜型インフルエンザウイルスに対するワクチンと組み合わせて投与することを含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスと、１種又は２種以上の他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスとを含む、混合ワクチン。
  22. 　他の亜型インフルエンザウイルス由来組換えワクシニアウイルスが、rDIs-H1、rDIs H3、及びrDIs-H5である、請求項２１に記載の混合ワクチン。
  23. 　インフルエンザ ワクチンの製造における、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えワクシニアウイルスの使用。
PCT/JP2019/044737 2018-11-14 2019-11-14 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス WO2020100990A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020556172A JPWO2020100990A1 (ja) 2018-11-14 2019-11-14
US17/293,378 US20230174586A1 (en) 2018-11-14 2019-11-14 Strain dis-derived recombinant vaccinia virus having novel influenza virus-derived hemagglutinin protein gene
EP19884182.7A EP3888677A4 (en) 2018-11-14 2019-11-14 RECOMBINANT VACCINE VIRUS DERIVED FROM A DIS STRAIN HAVING A NEW HEMAGGLUTININ PROTEIN GENE DERIVED FROM THE INFLUENZA VIRUS
CN201980074035.0A CN113227360A (zh) 2018-11-14 2019-11-14 具有新型流感病毒来源的血凝素蛋白基因的DIs株来源的重组牛痘病毒

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-213990 2018-11-14
JP2018213990 2018-11-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020100990A1 true WO2020100990A1 (ja) 2020-05-22

Family

ID=70731871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/044737 WO2020100990A1 (ja) 2018-11-14 2019-11-14 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230174586A1 (ja)
EP (1) EP3888677A4 (ja)
JP (1) JPWO2020100990A1 (ja)
CN (1) CN113227360A (ja)
WO (1) WO2020100990A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06237773A (ja) 1992-12-22 1994-08-30 Tonen Corp ポックスウイルスのａ型封入体（ａｔｉ）プロモーター及び前期プロモーターを含んで成る外来遺伝子発現ベクター
JP2002017370A (ja) * 2000-07-07 2002-01-22 Japan Science & Technology Corp 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン
WO2006038742A1 (ja) 2004-10-08 2006-04-13 Post Genome Institute Co., Ltd. 組み換えウイルスおよびその用途
JP2013048597A (ja) * 2011-08-31 2013-03-14 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
JP2016524915A (ja) * 2013-07-15 2016-08-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション Ｍｄｃｋ、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1925318A1 (en) * 2006-11-20 2008-05-28 Paul-Ehrlich-Institut Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu
EP2636735B1 (en) * 2010-10-15 2019-12-04 Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science Recombinant vaccinia virus having hemagglutinin protein genes derived from novel influenza viruses

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06237773A (ja) 1992-12-22 1994-08-30 Tonen Corp ポックスウイルスのａ型封入体（ａｔｉ）プロモーター及び前期プロモーターを含んで成る外来遺伝子発現ベクター
JP2002017370A (ja) * 2000-07-07 2002-01-22 Japan Science & Technology Corp 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン
WO2006038742A1 (ja) 2004-10-08 2006-04-13 Post Genome Institute Co., Ltd. 組み換えウイルスおよびその用途
JP2013048597A (ja) * 2011-08-31 2013-03-14 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
JP5884100B2 (ja) 2011-08-31 2016-03-15 公益財団法人東京都医学総合研究所 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
JP2016524915A (ja) * 2013-07-15 2016-08-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション Ｍｄｃｋ、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2012, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ARCH. VIROL., vol. 138, 1994, pages 1987 - 1997
KITABATAKE M. ET AL.: "SARS-CoV spike protein-expressing recombinant vaccinia virus efficiently induces neutralizing antibodies in rabbits pre-immunized with vaccinia virus", VACCINE, vol. 25, 2007, pages 630 - 637, XP005798920, DOI: 10.1016/j.vaccine.2006.08.039
LIU R ET AL.: "H7N9 T-cell epitopes that mimic human sequences are less immunogenic and may induce Treg-mediated tolerance", HUM VACCIN IMMUNOTHER, vol. 11, no. 9, 2015, pages 2241 - 52
MESEDA, CA ET AL.: "Immunogenicity and Protection Against Influenza H7N3 in Mice by Modified Vaccinia Virus Ankara Vectors Expressing Influenza Virus Hemagglutinin or Neuraminidase", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 8, no. 5364, 29 March 2018 (2018-03-29), pages 5364, XP055707233 *
MORIKAWA S. ET AL.: "An attenuated LC16m8 smallpox vaccine: analysis of full-genome sequence and induction of immune protection", J. VIROL., vol. 79, no. 18, 2005, pages 11873 - 1189
See also references of EP3888677A4
TAGAYA I ET AL.: "A new mutant of dermovaccinia virus", NATURE, vol. 192, 1961, pages 1187 - 1188
TSUKIYAMA K. ET AL.: "Development of heat-stable recombinant rinderpest vaccine", ARCH. VIROL., vol. 107, 1989, pages 225 - 235, XP000351661, DOI: 10.1007/BF01317919
YAMAJI, KENZABURO ET AL.: "2-3-11 Examination of onset defense effect of recombinant vaccinia vaccine expressing H7N9 avian influenza HA protein in cynomolgus monkeys", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF 22ND ACADEMIC CONFERENCE OF THE JAPANESE SOCIETY FOR VACCINOLOGY; DECEMBER 8-9, 2018, vol. 22, 20 November 2018 (2018-11-20), JP, pages 118, XP009528371 *
YASUI F. ET AL.: "Sensitization with vaccinia virus encoding H5N1 hemagglutinin restore immune potential against H5N1 influenza virus", SCI. REP., vol. 6, 2016, pages 37915, XP055802741, DOI: 10.1038/srep37915
YASUI, FUMIHIKO ET AL: "1-2-09 Analysis of the onset defense mechanism by the recombinant H5- subtype HA influenza vaccine which is based on attenuated vaccinia virus DIs strain", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF 21ST ACADEMIC CONFERENCE OF THE JAPANESE SOCIETY FOR VACCINOLOGY; DECEMBER 2-3, 2017, vol. 21, 2017, JP, pages 102, XP009528372 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113227360A (zh) 2021-08-06
EP3888677A1 (en) 2021-10-06
EP3888677A4 (en) 2022-08-17
JPWO2020100990A1 (ja) 2020-05-22
US20230174586A1 (en) 2023-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100571479B1 (ko) Hiv에 대한 폴리엔브백신으로서 재조합 백시니아벡터의 혼합물
KR20090117697A (ko) 조류 독감용 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (ｍｖａ)-기반 백신
WO2012053646A1 (ja) ワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター
JP5933565B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラインフルエンザワクチン
US20230330214A1 (en) Improved dna vaccine for sars-cov-2
JP2013523096A (ja) インフルエンザマトリックス２タンパク質の外部ドメイン、発現システムおよびそれらの使用
US20180161421A1 (en) Recombinant vaccinia virus having hemagglutinin protein genes derived from novel influenza viruses
WO2006002594A1 (fr) Adenovirus canin de type 2 recombinant, procede d'elaboration et utilisation
JP5884100B2 (ja) 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
AU2009220401B2 (en) Recombinant vaccinia virus having hepatitis C virus gene
WO2020100990A1 (ja) 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
JP2023522154A (ja) インフルエンザワクチン
JP2010528603A (ja) ネコ抗原のアライグマポックスウイルス発現遺伝子
WO2022025298A1 (ja) 組換えワクシニアウイルス
JP2024503482A (ja) 複製可能アデノウイルス４型ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ワクチンおよびそれらの使用
EP4282429A1 (en) Multivalent covid-19 vaccines based on adenoviral vectors
JPWO2019069561A1 (ja) インフルエンザに対する医薬

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19884182

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020556172

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019884182

Country of ref document: EP

Effective date: 20210614