JP2002017370A - 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ワクシニアウイルス以外の病原体に対して高
い免疫原性を有する遺伝子組換え弱毒化ワクシニアウイ
ルスワクチンと、このワクチンの有効成分である遺伝子
組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株を提供する。 【解決手段】 外来性の抗原性タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドを染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域に
保有し、その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換え
ワクシニアウイルスＤＩｓ株と、このウイルスを有効成
分とするワクシニアウイルスワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、遺伝子組
換えワクシニアウイルスワクチンに関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、ヒトまたは動物の
様々な感染症等に対するウイルスワクチンと、このワク
チンの有効成分である遺伝子組換えワクシニアウイルス
ＤＩｓ株に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】この十数年来の遺伝子組換え技術の開
発、向上に伴い、ウイルスや細菌などの微生物を遺伝子
組換えにより改変して、様々な感染症や癌の予防および
治療に対するワクチンベクターとして応用しようという
研究が盛んに行われて来ている。ポリオウイルス、イン
フルエンザウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、
サルモネラ菌、牛型結核菌弱毒ＢＣＧ株、リステリア菌
など様々な微生物が研究に用いられて来たが、中でも最
も古い歴史を持つのがワクシニアウイルスである。

【０００３】ワクシニアウイルスは天然痘のワクチンと
して利用され、その撲滅に大いに貢献してきた。このウ
イルスはpoxviridaeに属する大型のＤＮＡウイルスであ
り、ゲノムとして約190kbpの線状二本鎖ＤＮＡを持ち、
約200種類の蛋白質をコードしている。1982年、Panical
i and Paoletti（Proc. Natl. Acad. Scl. USA 79:492
7, 1982）およびMackettら（Proc. Natl. Acad. Scl. U
SA 79:7415, 1982）は、ワクシニアウイルス遺伝子に単
純ヘルペスウイルスのチミジンカイネース（ＴＫ）遺伝
子を組み込んで発現させることが出来ることを初めて報
告した。その後、数多くの組換えワクシニアウイルスが
作製され、免疫学的解析やワクチンへの応用が検討され
てきたが、組換えに用いられた親株の毒性により、人で
は脳炎を起こす可能性があること、復帰突然変異により
ウイルスが強毒化する虞れがあることなどが指摘され、
安全性の観点から、人のワクチン、特にエイズなど免疫
不全を伴う疾患に対するワクチンとしての実用化は困難
であった。

【０００４】一方、ワクシニアウイルスＤＩｓ株は、安
全な天然痘ワクチン開発を目的として、ワクシニアウイ
ルス大連株（ＤＥＩ株）を鶏卵胚にて継代培養しするこ
とによって分離された高度に弱毒化されたワクシニアウ
イルス株である（Nature 192:381, 1961）。このＤＩｓ
株は、ニワトリ胎児初代培養細胞（ＣＥＦ）では増殖す
るが、他の哺乳動物細胞ではほとんど増殖しないという
特異な性質を持っている。当時、同時に開発されたＬＣ
16株と共に臨床試行され、日本の小児200人に播種され
た成績があるが、人の細胞での増殖力がないため、天然
痘ワクチンとしては免疫誘導能が弱く、免疫誘導に優れ
たＬＣ16株の方が天然痘ワクチンとして採用された経緯
がある。

【０００５】この出願の発明者らは、このＤＩｓ株のゲ
ノムに外来遺伝子を組み込むことに成功し、この組換え
ＤＩｓ株が動物細胞用のウイルスベクターとして利用可
能であることを実証した。しかしながら、前記のとお
り、ＤＩｓ株は免疫誘導能が弱いため、外来の抗原性タ
ンパク質を発現するように遺伝子組換えしたＤＩｓ株を
ワクチンとして使用したとしても効果は期待できないで
あろうと考えられていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、ワクシ
ニアウイルスＤＩｓ株は、細胞傷害性が低いことから、
人での安全性に関しては他の株より優れていることが容
易に推測されるにも係わらず、免疫誘導能が弱いため
に、組換えウイルスワクチンとしての利用は考慮されて
いなかった。これに対して、この出願の発明者らは、ワ
クシニアウイルスＤＩｓ株に外来遺伝子を導入、発現さ
せ、動物実験で外来遺伝子産物に対する液性並びに細胞
性免疫反応を誘導することができることを見出した。

【０００７】また、ワクシニアウイルスＤＩｓ株は、動
物細胞では増殖しないため、有用タンパク質等の発現ベ
クターとしては不適切であると考えられてきた。しかし
ながら、この出願の発明者らは、このワクシニアウイル
スＤＩｓ株が、細胞傷害性の低さによって宿主細胞を長
期間生存させ、その結果、タンパク質を大量発現させる
ためのベクターとして有望であることを見出した。

【０００８】この出願は、発明者らによるこのような新
規な知見に基づいてなされたものであって、安全性の高
い遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチンを提供する
ことを課題としている。

【０００９】また、この出願は、このワクチンの有効成
分である遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株を提
供することを課題としている。

【００１０】さらにこの出願は、レポーター分子を発現
し、組換えウイルス株の作成に利用できる遺伝子組換え
ワクシニアウイルスＤＩｓ株を提供することを課題とし
てもいる。

【００１１】さらにまた、この出願は、ワクシニアウイ
ルスＤＩｓ株をベクターして利用する方法を提供するこ
とを課題としてもいる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するものとして、以下の(1)〜(19)の発明を提供
する。 (1) 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌク
レオチドを染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域に保有し、
その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換えワクシニ
アウイルスＤＩｓ株を有効成分とするワクシニアウイル
スワクチン。 (2) 抗原性タンパク質がヒト免疫不全ウイルス由来で
ある前記発明(1)のワクチン。 (3) ヒト免疫不全ウイルスの抗原性タンパク質がgag遺
伝子産物である前記発明(2)のワクチン。 (4) 抗原性タンパク質がサル免疫不全ウイルス由来で
ある前記発明(1)のワクチン。 (5) サル免疫不全ウイルスの抗原性タンパクがgag遺伝
子産物である前記発明(4)のワクチン。 (6) 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌク
レオチドを染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域に保有し、
その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換えワクシニ
アウイルスＤＩｓ株。 (7) 抗原性タンパク質がヒト免疫不全ウイルス由来で
ある前記発明(6)の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤ
Ｉｓ株。 (8) ヒト免疫不全ウイルスの抗原性タンパク質がgag遺
伝子産物である前記発明(7)の遺伝子組換えワクシニア
ウイルスＤＩｓ株。 (9) 抗原性タンパク質がサル免疫不全ウイルス由来で
ある前記発明(6)の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤ
Ｉｓ株。 (10) サル免疫不全ウイルスの抗原性タンパク質がgag
遺伝子産物である前記発明(9)の遺伝子組換えワクシニ
アウイルスＤＩｓ株。 (11) 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域がサイミジンカ
イネース遺伝子領域である前記発明(6)から(10)のいず
れかの遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。 (12) 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域が、親株と比較
した場合にワクシニアウイルスＤＩｓ株おいて欠損して
いる染色体ＤＮＡ領域に挿入されている前記発明(6)か
ら(10)のいずれかの遺伝子組換えワクシニアウイルスＤ
Ｉｓ株。 (13) レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを
染色体ＤＮＡに保有し、レポーター分子を発現する遺伝
子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。 (14) レポーター分子が、緑色蛍光タンパク質または大
腸菌β−ガラクトシダーゼである前記発明(11)の遺伝子
組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。 (15) 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域がサイミジンカ
イネース遺伝子領域である前記発明(13)または(14)の遺
伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。 (16) 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域が、親株と比較
した場合にワクシニアウイルスＤＩｓ株おいて欠損して
いる染色体ＤＮＡ領域に挿入されている前記発明(13)ま
たは(14)の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。 (17) ワクシニアウイルスＤＩｓ株の染色体ＤＮＡの非
必須遺伝子領域に外来性タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを組み込み、外来性タンパク質を宿主細胞内
で大量発現することを特徴とするタンパク質発現方法。 (18) 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域がサイミジンカ
イネース遺伝子領域である前記発明(17)のタンパク質発
現方法。 (19) 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域が、親株と比較
した場合にワクシニアウイルスＤＩｓ株おいて欠損して
いる染色体ＤＮＡ領域である前記発明(17)のタンパク質
発現方法。

【００１３】

【発明の実施の形態】この出願の発明(1)〜(5)のワクチ
ンは、発明(6)〜(10)の遺伝子組換えワクシニアウイル
スＤＩｓ株を有効成分とする高度弱毒化生ワクチンであ
る。発明(6)の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ
株は、ワクシニアウイルス由来の遺伝子プロモーター配
列の下流に、外来性の（すなわち、ワクシニアウイルス
以外の）任意の抗原性タンパク質をコードするポリヌク
レオチドを連結したトランスファーベクターとＤＩｓ株
ゲノムＤＮＡとの相同組換えにより得られた組換えウイ
ルスである。なお、以下の記載では、外来性の抗原性タ
ンパク質を「外来ポリペプチド」、これをコードするポ
リヌクレオチドを「外来ポリヌクレオチド」と記載する
ことがある。

【００１４】トランスファーベクターに組み込まれるプ
ロモーター配列としては、ワクシニアウイルス自身の遺
伝子にコードされたＲＮＡポリメラーゼにより認識され
るものであれば如何なるものでも使用できる。例えばワ
クシニアウイルスゲノムのinvarted tarminal repeat内
にある7.5kDポリペプチド遺伝子のプロモーターp7.5を
用いることができる（Stunnenberg, H.G. et al. Nucle
ic Acids Res,16,2431, 1988）。

【００１５】外来ポリヌクレオチドは、ワクシニアウイ
ルス以外の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオ
チド（例えば、ｃＤＮＡ断片）であり、外来ポリペプチ
ドは生体内で抗原抗体反応を惹起するものであてば如何
なるものであってもよい。具体的にはヒト後天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）のgag前駆体p55タンパク質、env
タンパク質gp120またはgp160、po1前駆体タンパク質、n
efタンパク質、tatタンパク質、またはサル免疫不全ウ
イルス（ＳＩＶ）のｇａｇ前駆体タンパク質等も対象と
することができる。また、その他の病原体（他の病原性
ウイルスや細菌）、あるいは癌細胞の抗原タンパク質を
コードするポリヌクレオチド等を用いることもできる。

【００１６】外来ポリヌクレオチドの取得方法として
は、外来ポリペプチドをコードするゲノム遺伝子または
そのｃＤＮＡがクローン化されたプラスミドからその実
質的な配列であるポリヌクレオチドを適当な制限酵素で
切り出すか、適当な配列のプライマーを用いたpolymera
se chain reaction（ＰＣＲ）により増幅すればよい。
クローン化されていない場合は、その遺伝子を持つ細
菌、動物のゲノムＤＮＡを、ウイルスの場合はウイルス
が感染した動物細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型と
して、上記ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅することにより
得ることができる。

【００１７】このようにして取得した外来ポリヌクレオ
チドと前記のプロモーターとを、互いの翻訳枠を一致さ
せて連結し、この融合ポリヌクレオチド（以下、「発現
ユニット」と記載することがある）を任意のプラスミド
ベクターに挿入結合することによって、トランスファー
ベクターを作成することができる。

【００１８】次に、相同組換えにより外来ポリヌクレオ
チドをワクシニアウイルスゲノムに導入する方法につい
て説明する。まず、ワクシニアウイルスゲノムＤＮＡ
は、ショ糖密度勾配法（Joklik, W.K. Virology 18, 9,
1962）で精製したウイルス粒子からL-laurylsarucosin
eを用いて抽出することができる（[Mackett, M. and Ar
chard, L.C.J. Gen, Virol. 45, 683, 1979）。次に抽
出したゲノムＤＮＡの中で、相同組換えを起こす位置と
して、ワクシニアウイルス自身の複製に影響を及ぼさな
い非必須遺伝子領域を選択する必要がある。

【００１９】非必須遺伝子領域の第一の候補はチミジン
カイネース（ＴＫ）遺伝子領域である。この場合には、
ＴＫ遺伝子の領域をpＵＣ18等のプラスミドベクターに
組み込み、その領域内のユニークな制限酵素サイトを利
用して、発現ユニットを挿入結合したものをトランスフ
ァーベクターとして用い、ワクシニアウイルスゲノム中
のＴＫ遺伝子との相同組換えにより外来ポリヌクレオチ
ドをウイルスゲノムに挿入することができる。相同組換
え後、ＴＫ欠損細胞株中で組換えウイルスを作らせ、プ
ロモデオキシウリジン存在下で培養することによりＴＫ
を発現していない組換えウイルスを選択することができ
る。

【００２０】非必須遺伝子領域の第二の候補は、ＤＩｓ
株のゲノム遺伝子欠損領域である。ＤＩｓ株のゲノムＤ
ＮＡの制限酵素切断パターンを親株のＤＩＥ株と比較す
ることにより、ゲノムのどの領域に欠損があるかを調べ
ることができる。その領域はＤＩｓ株の複製には基本的
には不必要である。欠損領域前後の領域のＤＮＡをＰＣ
Ｒ法で増幅した後、プラスミドベクターに組み込み、そ
のＤＮＡ内のユニークな制限酵素サイトに発現ユニット
を挿入結合したものをトランスファーベクターとして用
い、ＤＩｓ株ゲノムＤＮＡと相同組換えを起こさせるこ
とにより、欠損領域に発現ユニットを挿入することがで
きる。ただこの方法では、組換えウイルスの選択が困難
である。そこで先ず、レポーター分子をコードするポリ
ヌクレオチドをゲノム遺伝子欠損領域に挿入して組換え
ウイルスを作成する。レポーター分子としては、β−ガ
ラクトシダーゼなどの細菌由来の発色酵素や、緑色蛍光
タンパク質(green fluorescence protein, GFP)または
その誘導体（例えば、ＥＧＦＰ）等を利用することがで
きる。例えば、β−ガラクトシダーゼ発現する組換えウ
イルスの場合は、培地中にX-gal（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）
を加えることにより、β−ガラクトシダーゼを発現して
いるウイルスによるプラーク（青色）を選択する。ＧＦ
Ｐまたはその誘導体の場合は、蛍光顕微鏡下で蛍光を発
しているプラークを選択することができる。そして、こ
のレポーター分子発現ウイルスを親株として、レポータ
ー分子を挿入した領域に目的の外来ポリヌクレオチドを
相同組換えする。これによって、レポーター分子を発現
しないウイルスを選択することによりゲノム遺伝子欠損
領域に外来ポリヌクレオチドが相同組換えされた組換え
ウイルスを得ることができる。

【００２１】得られた組換えウイルスはクローニングに
より単一のクローンにまで純化し、ＰＣＲ法により組み
込んだ遺伝子の有無を確認した後、ウイルスに感染した
ＣＥＦ細胞の超音波破砕による抽出液を用いて、組み込
んだ外来ポリペプチドに対するモノクローナルまたはポ
リクローナル抗体によるウエスタンプロット法やenzyme
-linked immunosorbent assay (ELISA法) などにより、
外来ポリヌクレオチドの感染細胞内での発現を確認する
ことができる。

【００２２】得られた組換えウイルスはＣＥＦ細胞で培
養後、ショ糖密度勾配法により部分精製し、動物実験に
用いることができる。動物実験にはマウスの他ウサギや
サルを用いることができる。例えばマウスでの液性免疫
応答は、組換えウイルスを静脈内、筋肉内あるいは腹腔
内等に接種し、血清中の目的の外来ポリペプチドに対す
る抗体価を経時的にウエスタンプロット法やＥＬＩＳＡ
法により測定することで解析できる。またマウスでの細
胞性免疫応答は、まず第一に、組換えウイルス接種後、
経時的に採取した血液中に含まれるリンパ球を、試験官
内で目的の外来ポリペプチド抗原で刺激し、トリチウム
チミジンのリンパ球への取込みを測定することにより解
析できる。第二に、外来ポリペプチド抗原特異的な細胞
傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、組換えウイルス接種後、一
定期間経過したマウスの脾臓を採取し、これをすり潰し
て得られた脾細胞を、外来ポリペプチド中のＣＴＬエピ
トープに対応する合成ペプチドにより一定期間試験官内
で刺激してエフェクター細胞とする。一方、同系マウス
の細胞株に同じ組換えワクシニアウイルスを感染させる
か、ＣＴＬエピトープと同定されたペプチド抗原と共に
培養した細胞株を５１Ｃｒでラベルしてターゲット細胞
とする。エフェクター細胞とターゲット細胞を比率を変
えて反応させ、培養上清に放出された５１Ｃｒの放射能
を測定することにより、免疫マウス脾細胞中のＣＴＬ活
性の有無を調べることができる。

【００２３】この出願の発明(17)〜(19)は、ワクシニア
ウイルスＤＩｓ株を用いて有用タンパク質等の外来ポリ
ヌクレオチドを大量発現する方法である。すなわち、ワ
クシニアウイルスＤＩｓ株は、挿入する外来ポリヌクレ
オチドの長さや構造等に関係なく、広範なポリヌクレオ
チドを挿入することが可能である。しかも極めて安全に
取り扱うことが可能である。

【００２４】ウイルスベクターとしての組換えワクシニ
アウイルスＤＩｓ株は、任意の外来ポリヌクレオチドを
対象として、前記のワクチン用組換えウイルスＤＩｓ株
と同様の方法で作成することができる。そして、このＤ
Ｉｓ株ウイルスベクターは、マウス由来のＰ８１３細胞
や線維芽細胞等に常法によりトランスフェクションし、
このトランスフェクタント細胞を培養することによっ
て、組み込まれた外来ポリヌクレオチドにコードされた
タンパク質を長期間に渡って大量に発現することができ
る。例えば、この出願の発明者らの研究によれば、10 p
fuの濃度で組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株を細胞に
１時間作用させると、６〜１２時間後に組換えタンパク
質の顕著な発現が認められた。しかも、トランスフェク
タント細胞は長期間に渡って生存し、タンパク質を発現
し続けた。

【００２５】

【実施例】以下、実施例を示してこの出願の発明をさら
に詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下
の例に限定されるものではない。 実施例１：ＨＩＶ−１ gag遺伝子を発現する組換えワク
シニアウイルスＤＩｓ株の作製 ＤＩｓ株を用いて組換えワクシニアウイルスを作製する
上で、まずＤＩｓ株ゲノムのどの位置に欠失があるかを
検討した。親株のＤＩＥ株およびＤＩｓ株ゲノムＤＮＡ
を、HindIIIで消化してできる断片をアガロースゲル電
気泳動で比較した所、ＡからＰまで（大きさの順）の１
６種の断片のうち、Ｎ断片(1.5kbp)とＭ断片(2.2kbp)が
消失し、Ｃ断片(25.1kbp)とＫ断片(4.6kbp)の長さが短
くなっており、Ｃ断片の３′側からＫ断片のほとんどを
含む15.4kbp の領域が欠損していることが判った。そこ
でＤＩｓ株の欠失を持つＣ断片とＫ断片、およびＫ断片
の３′側で接しているＦ断片(13.5kbp)の５′側を含む
領域約1.9kbpをＰＣＲで増幅してpCR2.1 TA cloning ve
ctor(Invitrogen社製)にクローニングした。ＰＣＲプラ
イマーはVac H-C（配列番号１のオリゴヌクレオチド）
とVac H-F（配列番号２のオリゴヌクレオチド）であ
る。

【００２６】このプラスミドから、増幅した領域を含む
EcoRI断片を切り出し、pUC19のEcoRI siteにサブクロー
ニングし、pUC-DIsベクターを得た。このベクターのＤ
Ｉｓ断片中にHindIIi siteが１ケ所存在するので、この
siteを利用して、ワクシニアウイルス後期プロモーター
pilの下流に大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のオ
ープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片をサブロ
ーニングしてトランスファーベクターとした。

【００２７】ワクシニアウイルスＤＩｓ株約１０⁵pfu
（プラーク形成ユニット）を含む500μlのウイルス液を
ＣＥＦ細胞（直径６ｃｍのシャーレ）に播き、１５分ご
とにシャーレを４回、軽く振盪した。１時間後、2.5ml
の１％FBS/MEM培地を加え、６時間、３７℃、５％ＣＯ²
条件下にて培養した。培地を取り除きＰＢＳで２回洗浄
した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（GIBCO 社製）で細
胞を遊離、回収後、最終的には400μlのＰＢＳ（phosph
ate buffered saline）に再懸濁した。この細胞懸濁液
に上記トランスファーベクター２０μｇを溶かし、0.4c
mキュペット中、250Ｖ、500μＦＤで１回電圧をかけ、
電気穿孔法を行った（BioRad製 Gene Puisar II使
用）。細胞を室温で１５分以上放置した後、シャーレに
播き４日間培養した。細胞を遊離、培養液とともに回収
し、10、100、1000倍希釈し、同様にＣＥＦ細胞に継代
感染させた。４日後ＣＰＥが観察されたら培地を取り除
きX-gal添加寒天培地（４倍濃縮ＭＥＭ培地 25ml,蒸留
水 20.7, 7.5％NaHCO₃ 3ml, 2.92％ L-gultamine 1.0m
l, ２％X-gal 0.2ml, 30mg/ml硫酸カナマイシン 0.1ml,
2.4％ Agar Noble 50.0ml)を加え４時間後、青く発色
したＣＰＥ部分の寒天をパスツールピペットでピックア
ップし、500μlの上記と同じ培地に回収した。超音波破
砕機にて寒天を細分化し、同様にＣＥＦ細胞に継代感染
させた。以後同じ操作を繰り返し、１つのシャーレ上で
のＣＰＥがすべて青色になるまでクローニングを行っ
た。

【００２８】次に、同様のトランスファーベクターのHi
ndIII siteに、ワクシニアウイルスp7.5プロモーターの
下流にＨＩＶsubtype Ｂのgag前駆体タンパク質遺伝子
を転結した発現ユニットを挿入した。構築の概略を図１
に示す。具体的にはまず、subtype ＢのＨＩＶ分子クロ
ーンpNL432（Adachi, A. et al. J. Virol. 59, 284,19
86）を、制限酵素BssHIとHincIIで完全に消化して得ら
れる約1.8kbの断片をKlenow fragmentを用いて平滑末端
化した。この断片を、プラスミドｐＡＫ２より切り出し
たp7.5プロモーター断片をｐＵＣ１８のPstl-XbaI site
sに挿入したプラスミドpUC-VVp7.5HのBamHI-SmaI sites
にサブクローニングして、pVV7.5-gagBを得た。このプ
ラスミドをHindIIIで部分消化し、約2.18kbpの断片を１
％アガロースゲル電気泳動で分離、精製した後、トラン
スファーベクターpUC-DIsのHindIII siteにサブクロー
ニングして、目的のベクターpUC-DIs-gagBを得た。

【００２９】既に作製したβ−ガラクトシダーゼを発現
する組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株約１０⁵pfuを含
む500μｌのウイルス液を同様にＣＥＦ細胞に感染さ
せ、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を遊離、回収後、
最終的には400μｌのＰＢＳに再懸濁した。この細胞懸
濁液に上記トランスファーベクターpUC-DIs gagＢ（20
μｇ）を溶かし、全く同じ条件で電気穿孔法を行った。
細胞を室温で１５分以上放置した後、シャーレに播き４
日間培養した。細胞を遊離、培養液とともに回収し、1
0、100、1000倍希釈し、同様にＣＥＦ細胞に継代感染さ
せた。４日後ＣＰＥが観察されたら培地を取り除き、X-
gal添加寒天培地を加え４時間後、青く発色していない
白色のＣＰＥ部分の寒天をパスツールピペットを用い
て、500μｌの上記と同じ培地に回収した。超音波破砕
機にて寒天を細分化し、同様にＣＥＦ細胞に継代感染さ
せた。以後同じ操作を繰り返し、１つのシャーレ上での
ＣＰＥがすべて発色しなくなるまでクローニングを行っ
た。

【００３０】得られた組換えウイルスにＨＩＶ gag遺伝
子が挿入されているかどうかを、ＰＣＲ法で確認した。
プライマーは、subtype ＢおよびＥに汎用のSK38（配列
番号３のオリゴヌクレオチド：位置1551-1578）およびS
K89（配列番号４のオリゴヌクレオチド：位置1638-166
5）を用いた。

【００３１】得られた白色プラークからの組換えウイル
ス５株はすべて114bpのＤＮＡを増幅し、ＨＩＶ gag遺
伝子が挿入されていることが確認された。

【００３２】次に、これらの組換えウイルスが感染した
ＣＥＦ細胞でのＨＩＶ gag抗原の発現を調べた。図２
は、感染細胞の超音波破砕抽出液をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し、抗gagモノクローナル
抗体（Matsuo,K.et al. J. Gen.Virol, 73, 2445, 199
2）を用いたウエスタンプロット解析を行った結果であ
る。５株中１株でgag前駆体ｐ５５タンパク質と思われ
る特異的なバンドが認められ（全ての株で挿入したタン
パク質の分解産物は存在した）、この組換えウイルス
が、gag抗原を発現していることが確認された。この株
をrVV-DIs-gagBと命名した。 実施例２：ＨＩＶ−１ gag遺伝子を発現する組換えワク
シニアウイルスＤＩｓ株の部分精製とウイルス量の測定 rVV-DIs-sagBをＣＥＦ細胞に感染させ（５枚の直径10cm
のシャーレ上で）１％PBS/MEM培地10ml中、37℃、５％
ＣＯ₂存在下で培養した。２−４日後、ＣＰＥが観察さ
れた時点で培地を除き、10mM Tris-HCl(pH8.0)15mlで細
胞を壊した後、物理的に遊離、回収し、超音波破砕によ
り細胞片に付着したウイルスを遊離させた。3000rpmで2
0分間遠心した後、その上清をさらに13000rpmで90分間
遠心して、ウイルスを沈殿させる10mM Tris-HCl buffer
８mlにウイルス塊を溶かし、36％シュークロース溶液３
mlを静かに加えて、再度13000rpmで90分間遠心分離し
た。得られたペレットを１mlの10mM Tris-HCl bufferに
溶かし、部分精製ウイルス液とした。このウイルス液を
段階希釈し、ＣＥＦ細胞におけるウイルス量を測定した
結果、１mlあたり１０¹⁰ pfuであった。 実施例３：組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株の増殖宿
主細胞域の検討 ヒト、サル、モルモット由来の各種細胞株を48穴プレー
ト上で単層培養し、実施例２で得られた部分精製ウイル
ス１０⁵ pfuを感染させ、４日後の培養上清中のgag p24
抗原量を、ｐ24ELISA キット（Caliuar Products社製）
にて測定し、比較検討した。結果を表１に示す。表１に
おいて、ＴＨ−143細胞とHeLa細胞をヒト由来、ＣＶ−
１細胞とＣＯＳ７細胞はサル由来、ＳＶ-13細胞とＳＶ-
apa2細胞はモルモット由来である。表１から明らかなよ
うに、組換えウイルスの増殖宿主細胞域は、親株のＤＩ
ｓ株と変わらず、調べた限りでは、人の細胞では増殖で
きなかった。

【００３３】

【表１】

【００３４】実施例４：ＨＩＶ−１ gag遺伝子を発現す
る組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株を接種したマウス
でのＨＩＶ−１ gag抗原に対する細胞性免疫誘導能の解
析 rVV-DIs-gagBをBALB/cマウス１匹当たり１０⁷ pfu静脈
内に接種し、２、６、８、１２週目に経時的に脾臓を採
取した。孔径70μmのcell strainer(Becton Dickinson
製)に内にて、ＰＢＳ中ですり潰した脾細胞を、１５ml
の遠心管に移して遠心分離した後、細胞のペレットにAC
K buffer（重炭酸カリウム1.0 mM、塩化アンモニウム0.
15Ｍ,EDTA ２Na0.1 mM水溶液）５mlを加え、マイルドに
混和して溶血させた。ＰＢＳ10mlを加えて遠心後、ペレ
ットをＰＢＳ10mlで２回洗浄した。ペレットを５×１０
^-5Ｍの２−メルカプトエタノールを含む10％FBS/RPMI16
40培地（（株）日研生物医学研究所）５mlに懸濁し、生
細胞数を測定した。同じ培地で１×１０⁷ cells/mlに濃
度を調整し、２種類のgagエピトープペプチドの水溶液
（１mg／ml濃度）をそれぞれが終濃度10μg／mlになる
ように加えて、37℃、５日間培養した。ペプチド（gagB
253-277、およびgagB287-309）のアミノ酸配列はそれぞ
れ配列番号５および６の通りである。

【００３５】５日後、再度生細胞数を測定し、10％FBS/
RPMI1640培地で１×10⁷ cells/mlに細胞濃度を調整して
エフェクター細胞とした。

【００３６】一方Ｍ12.4.5マウス細胞（H2dハプロタイ
プ）を10％FBS/RPMI1640培地で培養し、80％コンフルエ
ントになった時点でPBSで１回洗浄した後、トリプシン
−EDTA溶液で細胞を遊離、回収した。10％FBS/RPMI1640
培地10mlで懸濁して、生細胞数をカウントした。１×10
⁷ cells分を遠心して回収し、同様の培地100μlに懸濁
した。この溶液に終濃度がそれぞれ50μg／mlになるよ
うに上記２種のペプチド溶液を加えたものと、ペプチド
を加えないものを調整し、37℃で３時間インキュベート
した。次に、51Crでラペルされたクロム酸ナトリウム水
溶液(New England Biolab)100μl（100μCi)を加え、さ
らに１時間30分、37℃、５％ＣＯ₂条件下でインキュベ
ートした。10％FBS/RPMI1640培地で細胞を３回洗浄した
後、同じ培地で１×10⁵ cells/mlの濃度に調製し、ター
ゲット細胞とした。

【００３７】エフェクター細胞とターゲット細胞の比が
100：１、50：１、25：1、12.5：１になるように、９６
穴プレート中で混合し(total volume 200μl／well) 、
37℃、５％ＣＯ₂条件下で４時間インキュベートした。
また自然放出Ｃｒと最大放出Ｃｒを測定するため、ター
ゲット細胞液100μlにそれぞれ10％FBS/RPMI1640培地10
0μlまたは１％Triton×100水溶液100μlを加え、同様
に37℃、５％ＣＯ₂条件で４時間インキュベートした。
４時間後９６穴プレートを遠心して細胞を沈澱させ、上
清20μlを取ってIuma plate(Packard 社製)に移し、一
晩放置して風乾させた。ガンマ線カウンター（Packard
社製)で放射能を測定し、以下の式でＣＴＬ活性（％）
を算出した。

【００３８】ＣＴＬ活性（％）＝（ターゲット細胞によ
る値−自然放出による値／最大放出による値−自然放出
による値）×100 結果を図３に示した。免疫後２週目では、ＣＴＬ活性は
明確でなかったが、６週目で２匹中１匹、８週目では２
匹とも抗gagＣＴＬ活性が検出され、１２週目において
もＣＴＬ活性が維持されていることが確認された。この
ことから、rVV.Dls-gagがマウスでＣＴＬ誘導能を持つ
ことが明らかとなった。 実施例５：ＨＩＶ−１ gag遺伝子を発現する組換えワク
シニアウイルスＤＩｓ株の接種によるマウスでの抗ＨＩ
Ｖ−１ gag抗体産生誘導能の解析 実施例４で作成したHIV-Dls-gag Ｂ免疫マウスの血液
を、免疫後２、６、８、１２週目でそれぞれ採取し、血
清を調製した。この内１２週目の血清20μlを用いて、
ＨＩＶ抗原をプロットしたニトロセルロースメンプラン
フィルター(Genelabs Diagnostics社製ウエスタンプロ
ットキット）を用いて、反応性を調べた。

【００３９】結果は図４に示したとおりである。免疫群
では、非免疫群では検出されないp55、p24およびp17の
位置にバンドが検出され、マウスにおいて、抗ｇａｇ抗
体の発生が誘導されることが確認された。 実施例６：ＧＦＰ誘導体を発現する組換えワクシニアウ
イルスＤＩｓ株の作成 プラスミドｐＥＧＦＰ−１(Clontach 社製）をEcoRIで
消化、klenow fragment処理で末端平滑化したＤＮＡを
さらにBamHI消化して得られる約700bpの断片を、実施例
１と同様にpUC-VVp7.5ＨのBamHI-Smal siteにサブクロ
ーニングした後、HindIIIでｐ7.5プロモーターとＥＧＦ
Ｐのオープンリーディングフレームを含む断片を切り出
し、ｐＵＣ−ＤＩｓのHindIII siteに導入して、トラン
スファーベクターを構築した。このプラスミドを実施例
１と全く同じ方法で、β−ガラクトシーダーゼを発現す
る組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株に感染したＣＥＦ
細胞に電気穿孔法で導入し、X-gal寒天培地上で白色ブ
ラークを選択することにより、組換えウイルス株を得
た。このウイルスに感染したＣＥＦ細胞は蛍光顕微鏡下
で、緑色の蛍光を発色することが観察され、ＥＧＦＰ蛋
白質が発現されることが確認された。

【００４０】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よって、ワクシニアウイルス以外の病原体に対して高い
免疫原性を有する遺伝子組換え弱毒化ワクシニアウイル
スワクチンと、このワクチンの有効成分である遺伝子組
換えワクシニアウイルスＤＩｓ株が提供される。この発
明によって提供される組換えワクシニアウイルスＤＩｓ
株は、外来ポリプチドに対する液性および細胞性免疫の
両方を誘導することができ、しかも外来ポリペプチドを
遺伝子組換え技術により容易に他のポリプチドと交換可
能なことから、様々な感染症に対する組換えウイルスワ
クチンのベクターとして有用である。また組換えウイル
スは、通常の動物細胞では増殖できないが抗原は発現し
て免疫原性（細胞性免疫および抗体産生誘導能）を発揮
できること、培養が簡単で低コストで製造できるなどの
理由から、エイズワクチン開発などで盛んに用いられて
いる prime and boost法のboost用の安価な抗原として
も用いる事ができる。従って製造コストの高い精製遺伝
子組換えタンパク質の代替抗原として極めて有用であ
る。さらに、人に対する安全性が高いので、ＣＴＬ活性
測定時にターゲット細胞に感染させる組換えワクシニア
ウイルス株としても、実験者への安全性という観点から
有用である。

【００４１】

【配列表】 <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Recombinant vaccinia virus vaccine <130> NP00279-YS <160> 6 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 1 ATAATGTAGC TCCTTCATCA ATCATACATT 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 2 AGGAGGTGGT GTAATAGACG AAGATTATAG 30 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 3 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 4 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence: Synthesized oligopeptide <400> 5 Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr 20 25 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence: Synthesized oligopeptide <400> 6 Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala 20 23

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ gag遺伝子をＤＩｓ株ゲノムに導入する
ためのトランスファーベクター構築のストラテジーを示
す。

【図２】ＨＩＶ gag遺伝子を導入した組換えワクシニア
ＤＩｓ株が感染したＣＥＦ細胞抽出液中のgag抗原の発
現を、ウエスタンブロットで解析した結果を示す。

【図３】rVV-Dis gag ＢによるマウスでのＨＩＶ gag特
異的なＣＴＬ誘導を調べたＣＴＬ assayの結果を示す。

【図４】同じくマウスでの抗ＨＩＶ gag抗体産生誘導能
を調べたウエスタンプロットの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ｃ０７Ｋ 14/07 Ｃ０７Ｋ 14/07 Ｃ１２Ｎ 7/08 Ｃ１２Ｎ 7/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 7/08 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｎ 7/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 大洲 竹晃 東京都田無市本町５−９−17 タートルハ イツ105 (72)発明者 宮村 達男 東京都杉並区浜田山４−21−22−113 (72)発明者 松浦 善治 埼玉県志木市館２−３−11−604 (72)発明者 石井 孝司 東京都新宿区高田馬場４−26−15−205 (72)発明者 加藤 賢三 千葉県八千代市大和田新田931−３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 BA35 CA04 DA20 EA02 FA20 GA14 HA01 4B064 AG32 CA12 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90Y AA93Y AA95X BA03 CA24 CA45 4C085 AA03 BA65 BA69 CC08 DD23 DD62 EE01 4H045 AA11 BA01 BA05 CA01 DA86 EA29 FA74

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 外来性の抗原性タンパク質をコードする
   ポリヌクレオチドを染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域に
   保有し、その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換え
   ワクシニアウイルスＤＩｓ株を有効成分とするワクシニ
   アウイルスワクチン。
2. 【請求項２】 抗原性タンパク質がヒト免疫不全ウイル
   ス由来である請求項１のワクチン。
3. 【請求項３】 ヒト免疫不全ウイルスの抗原性タンパク
   質がgag遺伝子産物である請求項２のワクチン。
4. 【請求項４】 抗原性タンパク質がサル免疫不全ウイル
   ス由来である請求項１のワクチン。
5. 【請求項５】 サル免疫不全ウイルスの抗原性タンパク
   がgag遺伝子産物である請求項４のワクチン。
6. 【請求項６】 外来性の抗原性タンパク質をコードする
   ポリヌクレオチドを染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域に
   保有し、その抗原性タンパク質を発現する遺伝子組換え
   ワクシニアウイルスＤＩｓ株。
7. 【請求項７】 抗原性タンパク質がヒト免疫不全ウイル
   ス由来である請求項６の遺伝子組換えワクシニアウイル
   スＤＩｓ株。
8. 【請求項８】 ヒト免疫不全ウイルスの抗原性タンパク
   質がgag遺伝子産物である請求項７の遺伝子組換えワク
   シニアウイルスＤＩｓ株。
9. 【請求項９】 抗原性タンパク質がサル免疫不全ウイル
   ス由来である請求項６の遺伝子組換えワクシニアウイル
   スＤＩｓ株。
10. 【請求項１０】 サル免疫不全ウイルスの抗原性タンパ
    ク質がgag遺伝子産物である請求項９の遺伝子組換えワ
    クシニアウイルスＤＩｓ株。
11. 【請求項１１】 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域がサ
    イミジンカイネース遺伝子領域である請求項６から１０
    のいずれかの遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ
    株。
12. 【請求項１２】 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域が、
    親株と比較した場合にワクシニアウイルスＤＩｓ株おい
    て欠損している染色体ＤＮＡ領域である請求項５から１
    ０のいずれかの遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ
    株。
13. 【請求項１３】 レポーター分子をコードするポリヌク
    レオチドを染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域に保有し、
    レポーター分子を発現する遺伝子組換えワクシニアウイ
    ルスＤＩｓ株。
14. 【請求項１４】 レポーター分子が、緑色蛍光タンパク
    質または大腸菌β−ガラクトシダーゼである請求項１１
    の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。
15. 【請求項１５】 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域がサ
    イミジンカイネース遺伝子領域である請求項１３または
    １４の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。
16. 【請求項１６】 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域が、
    親株と比較した場合にワクシニアウイルスＤＩｓ株おい
    て欠損している染色体ＤＮＡ領域である請求項１３また
    は１４の遺伝子組換えワクシニアウイルスＤＩｓ株。
17. 【請求項１７】 ワクシニアウイルスＤＩｓ株の染色体
    ＤＮＡの非必須遺伝子領域に外来性タンパク質をコード
    するポリヌクレオチドを組み込み、外来性タンパク質を
    宿主細胞内で大量発現することを特徴とするタンパク質
    発現方法。
18. 【請求項１８】 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域がサ
    イミジンカイネース遺伝子領域である請求項１７のタン
    パク質発現方法。
19. 【請求項１９】 染色体ＤＮＡの非必須遺伝子領域が、
    親株と比較した場合にワクシニアウイルスＤＩｓ株おい
    て欠損している染色体ＤＮＡ領域である請求項１７のタ
    ンパク質発現方法。