JP6983665B2 - アデノウイルスポリヌクレオチド及びポリペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、新規のチンパンジーアデノウイルスChAd155に由来する単離されたポリヌクレオチド及びポリペプチド配列、ならびに前記ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を含む組換えポリヌクレオチド、ベクター、アデノウイルス及び組成物に関する。
アデノウイルスは、様々な標的組織において高効率の遺伝子導入を達成するその能力のため、及び大きな導入遺伝子収容能力のため、遺伝子導入の用途に広く使用されている。通常、アデノウイルスのE1遺伝子は欠失しており、選択されたプロモーター、目的の遺伝子のcDNA配列、ポリAシグナルで構成されている導入遺伝子カセットに置換され、結果として複製欠損組換えウイルスを生じる。
組換えアデノウイルスは、遺伝子治療において、またワクチンとして有用である。チンパンジーアデノウイルスに基づくウイルスベクターは、遺伝子ワクチンの開発のためのヒト由来Adベクターの使用の代替手段となる。チンパンジーから分離されたアデノウイルスは、ヒト由来の細胞におけるそれらの効率的な増殖によって証明されるように、ヒトから単離されたアデノウイルスと近縁である。しかし、ヒト及びチンパンジーアデノウイルスが近縁であるため、２つのウイルス種の間の血清学的交差反応が起こり得る。
標的に分子を効率的に送達し、その集団における選択されたアデノウイルスの血清型に対する既存の免疫の効果を最小限に抑えるベクターの需要がある。ヒトにおいて観察される既存の免疫の１つの態様は、液性免疫であり、アデノウイルスタンパク質に特異的な抗体の産生及び持続を引き起こし得る。アデノウイルスによって引き起こされる液性応答は、主に３つの主要なカプシド構造タンパク質：ファイバー、ペントン及びヘキソンに向けられる。
本発明のベクター、組成物及び方法は、先行技術を超える1つ以上の下記の改善された特性、すなわち、より高い生産性、改善された免疫原性及び導入遺伝子発現の増加を含むがそれらに限定されない特性を有し得る。本発明のベクターは、病原体に対してヒト又は非ヒト動物を免疫するために有用な1種以上の免疫原の発現において用途を有し得る。
呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、全ての年齢の人々に呼吸器感染症を引き起こす伝染性の強いヒト病原体である。生後1年の間に、50〜70％の乳児がRSVに感染し、実質的に全ての子供が2歳の誕生日までにRSV感染をする。RSVに関連する重症下気道感染症（LRTI）のリスクは6カ月までの乳児で最も高く、入院となる主な原因である。RSVによる感染は完全な防御免疫を付与しない。後に症候性RSV再感染が生じるのは一般的なことであり、これは成人期を通じて継続する。これらの再感染は、通常一般的な急性上気道感染として現れるため、診断されないことが一般的である。しかしながら、より脆弱な人々（例えば免疫障害を有する成人又は老人）では、再感染も重度の疾患につながり得る。
今日まで、RSVに対して利用できるワクチンはなく、RSV疾患の治療は、主として症状に対する対症療法である。抗ウイルス薬であるリバビリンは、RSV治療のために現在唯一承認されている抗ウイルス治療薬であるが、その有効性についての不確実性、投与の難しさ（エアゾール）及び高いコストのために、その使用は重度の入院症例に限定されている［American Academy of Pediatrics Subcommittee on Diagnosis and Management of Bronchiolitis, 2006］。RSV疾患のリスクが高い子供においてRSVによって引き起こされる入院を必要とする重度のLRTIを予防するために、RSV特異的モノクローナル抗体（パリビズマブ、SynagisTM、Medimmune）が処方されているが、これは高いコスト及び反復投与の必要性から、通常の健康な乳児集団には処方も推奨もされていない。
1960年代の後半には、臨床試験で試験されたホルマリン不活化全ウイルスRSVワクチン（FI-RSV）が、2歳未満の幼児においてRSVによる後の自然感染をした際により重篤な臨床症状をもたらした［Kim, 1969; Chin, 1969］。この経験から、小児用RSVワクチン候補に関する安全性の懸念が高まった。その時期から、弱毒化生ウイルスワクチン、及び精製若しくは組換えウイルスタンパク質に基づくものを含め、数種の研究用ワクチンが探索され続けてきている。しかしながら、RSV疾患の予防のために認可されたワクチンは未だ存在していない。
単離されたポリヌクレオチドが提供され、そのヌクレオチドは、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、及び、
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする。
また、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、その機能的誘導体が配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、及び
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチドもまた提供される。
また、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、その機能的誘導体が配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、及び
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む組換えベクターもまた提供される。
また、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、その機能的誘導体が配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(e)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、及び
(f)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群より選択される少なくとも1種のポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む、組換えアデノウイルスもまた提供される。
また、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、その機能的誘導体が配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(e)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
(f)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(g) 上記の（a）、（b）又は（c）に記載されるようなポリヌクレオチドを含むベクター、及び
(h) 上記の（a）、（b）又は（c）に記載されるようなポリヌクレオチドを含む組換えアデノウイルス
の少なくとも1種、及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物もまた提供される。
また、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、その機能的誘導体が配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、ポリヌクレオチド、
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(e)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
(f)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(g) 上記の（a）、（b）又は（c）に記載されるようなポリヌクレオチドを含むベクター、及び
(h) 上記の（a）、（b）又は（c）に記載されるようなポリヌクレオチドを含む組換えアデノウイルス
の少なくとも1種を含む細胞もまた提供される。
また、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、及び
(c)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群より選択される単離されたアデノウイルスポリペプチドもまた提供される。
また、配列番号６の配列を含む、若しくはその配列からなる単離されたポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞もまた提供される。
図１Aは、示されたサルアデノウイルス由来のファイバータンパク質配列のアラインメントを示す。ChAd3（配列番号２７）、PanAd3（配列番号２８）、ChAd17（配列番号２９）、ChAd19（配列番号３０）、ChAd24（配列番号３１）、ChAd155（配列番号１）、ChAd11（配列番号３２）、ChAd20（配列番号３３）、ChAd31（配列番号３４）、PanAd1（配列番号３５）、PanAd2（配列番号３６）。 図１Bは、示されたサルアデノウイルス由来のファイバータンパク質配列のアラインメントを示す。ChAd3（配列番号２７）、PanAd3（配列番号２８）、ChAd17（配列番号２９）、ChAd19（配列番号３０）、ChAd24（配列番号３１）、ChAd155（配列番号１）、ChAd11（配列番号３２）、ChAd20（配列番号３３）、ChAd31（配列番号３４）、PanAd1（配列番号３５）、PanAd2（配列番号３６）。 図１Cは、示されたサルアデノウイルス由来のファイバータンパク質配列のアラインメントを示す。ChAd3（配列番号２７）、PanAd3（配列番号２８）、ChAd17（配列番号２９）、ChAd19（配列番号３０）、ChAd24（配列番号３１）、ChAd155（配列番号１）、ChAd11（配列番号３２）、ChAd20（配列番号３３）、ChAd31（配列番号３４）、PanAd1（配列番号３５）、PanAd2（配列番号３６）。 特定のChAd155 BAC及びプラスミドベクターの作製のための流れ図を示す。 C種 BACシャトル#1365の図を示す。 pArsChAd155 Ad5E4orf6-2 (#1490) の図を示す。 pChAd155/RSVの図を示す。 BAC ChAd155/RSVの図を示す。 HIV Gag導入遺伝子を発現しているChAd3及びChAd155ベクターの生産性（実験１）を示す。 HIV Gag導入遺伝子を発現しているChAd3及びChAd155ベクターの生産性（実験２）を示す。 RSV導入遺伝子を発現しているPanAd3及びChAd155ベクターの生産性を示す。 HIV Gag導入遺伝子を発現しているChAd3及びChAd155ベクターの発現レベルを示す。 HIV Gag導入遺伝子を発現しているPanAd3及びChAd155ベクターの発現レベル（ウェスタンブロット）を示す。 HIV Gag導入遺伝子を発現しているChAd3及びChAd155ベクターの免疫原性（IFN-γ ELISpot）を示す。 HIV Gag導入遺伝子を発現しているPanAd3及びChAd155ベクターの免疫原性（IFN-γ ELISpot）を示す。 ChAd155-RSVベクターによってRSV抗原を発現するように使用される合成DNA断片の図を示す。 BALB/cマウスでChAd155-RSV及びPanAd3-RSVによって誘導される抗-F抗体力価を示す。 ウイルスチャレンジ後の鼻腔組織(A)及び肺ホモジネート(B)におけるRSV力価を示す。 ウイルスチャレンジ後のRSV中和抗体(C)及び病理スコア(D)を示す。 bRSV-特異的IgG(A)及びRSV中和抗体(B)の誘導の速度論を示す。 bRSVチャレンジ6日後までに検出された鼻咽頭スワブにおける平均ウイルス力価の速度論を示す。 下気道におけるbRSV複製に対するワクチン接種の効果を示す。 bRSVチャレンジ6日後の総肺コンソリデーションに対するワクチン接種の効果を示す。 bRSVチャレンジ6日後の肺炎症反応に対するワクチン接種の効果を示す。
配列の説明
配列番号１ - ChAd155ファイバーのポリペプチド配列
配列番号２ - ChAd155ファイバーをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号３ - ChAd155ペントンのポリペプチド配列
配列番号４ - ChAd155ペントンをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号５ - ChAd155ヘキソンのポリペプチド配列
配列番号６ - ChAd155ヘキソンをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号７ - ChAd155#1434をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号８ - ChAd155#1390をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号９ - ChAd155#1375をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１０ - 野生型ChAd155をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１１ - ChAd155/RSVをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１２ - CASIプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号１３ - Ad5orf6プライマー1ポリヌクレオチド配列
配列番号１４ - Ad5orf6プライマー2ポリヌクレオチド配列
配列番号１５ - BAC/CHAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kanaプライマー1ポリヌクレオチド配列
配列番号１６ - BAC/CHAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375)プライマー2ポリヌクレオチド配列
配列番号１７ - 1021-FW E4 Del Step1プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号１８ - 1022-RW E4 Del Step1プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号１９ - 1025-FW E4 Del Step2プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号２０ - 1026-RW E4 Del Step2プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号２１ - 91-SubMonte FW プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号２２ - 890-BghPolyA RW プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号２３ - CMVfor プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号２４ - CMVrev プライマーポリヌクレオチド配列
配列番号２５ - CMVFAM-TAMRA qPCR プローブポリヌクレオチド配列
配列番号２６ - ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（WPRE）ポリヌクレオチド配列
配列番号２７ - ChAd3のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号２８ - PanAd3のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９ - ChAd17のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３０ - ChAd19のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１ - ChAd24のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３２ - ChAd11のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３ - ChAd20のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３４ - ChAd31のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３５ - PanAd1のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３６ - PanAd2のファイバータンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７ - RSV FΔTM-N-M2-1アミノ酸配列
配列番号３８ - HIV Gagポリヌクレオチド配列
アデノウイルス
アデノウイルスは、３つの主要なタンパク質、ヘキソン（II）、ペントンベース（III）及びノブのあるファイバー（IV）を多数の他の微量タンパク質、VI、VIII、IX、IlIa及びIVa2とともに含む正20面体カプシドによる特徴的な形態を有する。ウイルスゲノムは直鎖状の二本鎖DNAである。ウイルスDNAは、高塩基性のタンパク質VII及び小ペプチドpX（以前はmuと呼ばれた）と密接に結び付いている。別のタンパク質、Vは、このDNA-タンパク質複合体とともにパッケージングされ、タンパク質VIを介してカプシドとの構造的結合を提供する。ウイルスはまた、ウイルスにコードされたプロテアーゼを包含し、これはいくつかの構造タンパク質をプロセシングして成熟した感染性ウイルスを生じるために必要である。
アデノウイルスゲノムは、よく特性解析されている。特定のオープンリーディングフレームに関して、アデノウイルスゲノムの全体構造には全般的保存性があり、例えばそれぞれのウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及びL5遺伝子の位置は同様に配置されている。アデノウイルスゲノムのそれぞれの末端は、逆方向末端反復（ITR）として知られる配列を含み、これはウイルス複製に必要である。ウイルスはまた、ウイルスにコードされたプロテアーゼを包含し、これは感染性ビリオンを生じるために必要ないくつかの構造タンパク質をプロセシングするために必要である。アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞の形質導入後にウイルス遺伝子が発現する順序に基づいて表される。より詳細には、ウイルス遺伝子は、転写がDNA複製の開始前に起こるか、又は開始後に起こるかによって、初期（E）又は後期（L）遺伝子と呼ばれる。形質導入の初期には、アデノウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4遺伝子が発現して、宿主細胞にウイルス複製の準備をさせる。感染の後期には、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子L1〜L5の発現が活性化される。
アデノウイルスは種特異的であり、異なる血清型、すなわち、抗体によって交差中和されないウイルスの種類が、様々な哺乳動物種から分離されている。例えば、50種以上の血清型がヒトから分離されており、それらは配列相同性及びそれらの赤血球を凝集させる能力に基づいて６つのサブグループ（A〜F；BはB1とB2に更に分類される）に分類される（Tatsis及びErtl Molecular Therapy (2004) 10:616-629）。多数のアデノウイルスが、ヒト以外のサル、例えば、チンパンジー、ボノボ、アカゲザル及びゴリラ等から分離されており、それらは、ヘキソン又はファイバー配列に基づく系統発生関係に基づいて、同じヒトグループに分類される（Collocaら、(2012) ScienceTranslational Medicine 4:1-9; Royら、(2004) Virology 324: 361-372; Royら、(2010) Journal of Gene Medicine 13:17-25）。
ファイバータンパク質を含むアデノウイルスカプシドタンパク質及びこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記に概説されたように、アデノウイルスカプシドは、３つの主要なタンパク質、ヘキソン、ペントン及びファイバーを含む。ヘキソンは、カプシドの構造成分の大多数を占め、カプシドは240個の三量体ヘキソンカプソメア及び12個のペントンベースで構成される。ヘキソンは、３つの保存されたダブルバレル（double barrel）を有し、一方、その上端は３つのタワー（tower）を有し、それぞれのタワーはカプシドの大部分を形成するそれぞれのサブユニットからのループを含む。ヘキソンの基部はアデノウイルス血清型の間で高度に保存されているが、一方、表面のループは可変である（Tatsis及びErtl Molecular Therapy (2004) 10:616-629）。
ペントンは、ファイバーが付着する五量体のベースを形成するもう１つのアデノウイルスカプシドタンパク質である。三量体のファイバータンパク質は、カプシドの12個の頂点のそれぞれでペントンベースから突出しており、ノブのある棒状の構造である。他のほとんどの正20面体ウイルスのそれと比較したアデノウイルスカプシドの表面の顕著な違いは、長く細いファイバータンパク質の存在である。ファイバータンパク質の主な役割は、その細胞受容体との相互作用を介して細胞表面にウイルスカプシドを係留することである。
多くのアデノウイルス血清型のファイバータンパク質は、共通の構造、すなわち、N-末端のテール（tail）、反復配列で作られた中央のシャフト（shaft）、及びC-末端の球状のノブドメイン（又は「ヘッド（head）」）を共有している。中央のシャフトドメインは、様々な数のβリピートから成る。βリピートは結び付いて、非常に固く安定した3本の撚り合わさったらせん状のストランド（strand）の伸長構造を形成する。シャフトは、N-末端のテールを球状のノブ構造とつなぎ、ノブ構造は標的細胞受容体との相互作用に関与する。アデノウイルスノブドメインの球状の性質は、側面及び先端方向に受容体を結合するための広い表面を与える。この構造の効果は、受容体結合部位をウイルスカプシドから遠く突出させることであり、その結果、比較的平坦なカプシド表面によって与えられる立体障害からウイルスを解放している。
多くのアデノウイルス血清型のファイバーは同じ全体構造を有するが、それらは、それらの機能ならびに構造に影響を与える様々なアミノ酸配列を有する。例えば、ファイバーノブの表面上の多くの露出した領域は、容易に適応できる受容体結合部位を与える。ファイバーノブの球状の形は、受容体がノブの側面又はファイバーノブの上端に結合することを可能にする。これらの結合部位は通常、ヒトアデノウイルス間での保存性に乏しいβストランドにつながっている表面に露出したループにある。これらのループ上の露出した側鎖は、その三次構造及び四次構造を保ちながら、ノブに様々な表面特性を与える。例えば、ノブ表面での静電ポテンシャル及び電荷分布は、Ad 8、Ad 19、及びAd 37でのpI約9からサブグループBアデノウイルスでのpI約5まで、ファイバーのノブ配列における幅広い等電点によって変化し得る。構造的に複雑なウイルスリガンドとして、ファイバータンパク質は、ウイルスカプシドから多くの方向及び距離（シャフト）で様々な結合表面（ノブ）の提示を可能にする。
いくつかの血清型の間で最も明らかな変異の１つは、ファイバーの長さである。研究によって、ファイバーのシャフトの長さは、ノブ及びウイルスのその標的受容体との相互作用に強い影響を及ぼすことが示された。更に、血清型の間でファイバータンパク質はまた、それらの折れ曲がる能力の点でも異なり得る。シャフトのβリピートは非常に安定で不変の構造を形成するが、電子顕微鏡（EM）観察は、ファイバー中に異なるヒンジ（hinge）を示した。いくつかのアデノウイルス血清型ファイバーからのタンパク質配列の解析は、N-末端のテールから3番目のβリピートでシャフトの反復配列中での中断を示し、これは、EMによって見られるような、シャフト中のヒンジの１つと強い相関がある。ファイバー中のヒンジはノブがウイルスカプシドに対して様々な方向をとることを可能にし、これは、ノブ上の受容体結合部位の的確な提示を必要としている受容体連結への立体障害を回避し得る。例えば、サブグループD Adの硬いファイバーは、それら自体が曲がることはできないため、ウイルス付着のために柔軟な受容体又は前に配置される部分（one prepositioned）を必要とする（Nicklinら Molecular Therapy 2005 12:384-393）。
異なるAd血清型に特異的な細胞受容体の同定及びそれらがどのように組織親和性に寄与するかの知見は、ファイバーの偽型化技術（pseudotyping technology）の使用によって達成されている。いくつかのサブグループのAdは、一次受容体としてCARを使用するが、多くのAdは別の一次受容体を使用しており、in vitro及びin vivoにおいて大きく異なる親和性をもたらしていることが明らかになってきている。これらの血清型のファイバーは、ファイバーのノブ内の正味電荷の違いとともに、ファイバーシャフトの剛性、ファイバーシャフトの長さ、ならびにCAR結合部位及び／又は推定HSPG結合モチーフの欠如などの、一次構造ならびに三次構造における明らかな違いを示す。別のファイバーシャフト及びノブによるAd 5粒子の偽型化は、その結果、重要な細胞結合ドメインを除去する機会を与え、加えて、Ad 5によって達成されるそれと比較して、規定の細胞型へのより効率的（且つ、より細胞選択的な可能性のある）導入遺伝子送達を可能にし得る。使用されるファイバーがヒト又は実験モデルにおいて、より低い血清陽性率を有するAdに由来する場合、ファイバーを偽型化したAd粒子の中和もまた減少させることができ、これは、ベクターの投与の成功に都合のよい状況である（NicklinらMolecular Therapy (2005) 12:384-393）。更に、ヘキソン又はペントン単独ではなく、完全長のファイバーならびに単離されたファイバーのノブ領域は、樹状細胞の成熟を誘導することができ、強力なCD8+ T細胞応答の誘導と関連する（Molinier-FrenkelらJ. Biol. Chem. (2003) 278:37175-37182）。総合すると、アデノウイルスファイバーは、少なくともアデノウイルスベクターの受容体結合及び免疫原性において重要な役割を果たす。
図１に示されるアラインメントは、グループCサルアデノウイルスのファイバータンパク質間の違いを図示している。顕著な特徴は、これらのアデノウイルスのファイバー配列が、ChAd155のように長いファイバーを持つもの、又はChAd3のように短いファイバーを持つものに大別され得ることである。この長さの違いは、長いファイバーに対して短いファイバーの約321の位置での36アミノ酸の欠失による。加えて、短いファイバーと長いファイバーサブグループとの間で異なり、更に各サブグループ内で一致している、多数のアミノ酸置換がある。これらの違いの正確な機能はまだ解明されていないが、ファイバーの機能及び免疫原性を考えると、それらは重要である可能性が高い。ウイルス親和性の決定要因の１つはファイバーシャフトの長さであることが示されている。より短いシャフトを有するAd5ベクターは、CAR受容体に対するより低い結合効率及びより低い感染性を有することが実証されている（Ambriovic-Ristov A.ら: Virology. (2003) 312(2):425-33）。：この機能障害は、細胞受容体への効率の低い付着をもたらす、より短いファイバーの剛性の増加の結果であると推測されている（Wu, E ら: J Virol. (2003) 77(13): 7225-7235）。これらの研究は、前述のより短いシャフトを有するファイバーを持つChAd3及びPanAd3と比較して、より長くより柔軟なファイバーを持つChAd155の改善された特性を説明し得る。
本発明の１つの態様では、チンパンジーアデノウイルスChAd155の単離されたファイバー、ペントン及びヘキソンカプシドポリペプチド、ならびにチンパンジーアデノウイルスChAd155のファイバー、ペントン及びヘキソンカプシドポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
3つのすべてのカプシドタンパク質は、低い血清陽性率に寄与することが期待され、従って、既存の中和抗体に対するアデノウイルスの親和性を抑制するため、例えば、低い血清陽性率を有する組換えアデノウイルスを製造するために、互いに独立して、又は組み合わせて使用され得る。このような組換えアデノウイルスは、少なくともChAd155由来のファイバータンパク質を有する、異なる血清型由来のカプシドタンパク質を有するキメラアデノウイルスであり得る。
ChAd155ファイバーポリペプチド配列は、配列番号１に示される。
ChAd155ペントンポリペプチド配列は、配列番号３に示される。
ChAd155ヘキソンポリペプチド配列は、配列番号５に示される。
ChAd155ファイバー若しくはその機能的誘導体のポリペプチド配列を含むポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞
適切には、本発明の単離されたポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
適切には、本発明のポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であるポリペプチドを含み、その機能的誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する。適切には、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一、例えば少なくとも85.0％同一、例えば少なくとも90％同一、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％同一、例えば少なくとも99.2％同一、例えば少なくとも99.4％同一、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％同一、例えば少なくとも99.8％同一、例えば少なくとも99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号１と比較して130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
適切には、本発明のポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、以下：
(a)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号３のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも50.0％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
及び／又は
(a)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも50％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
をさらに含む。
適切には、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％、例えば少なくとも70.0％、例えば少なくとも80.0％、例えば少なくとも85.0％、例えば少なくとも90.0％、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.7％同一、例えば少なくとも99.8％同一、例えば少なくとも99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号３と比較して300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
適切には、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％、例えば少なくとも70.0％、例えば少なくとも80.0％、例えば少なくとも85.0％、例えば少なくとも90.0％、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.7％同一、例えば少なくとも99.8％同一、例えば少なくとも99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号５と比較して500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
ChAd155ペントンのポリペプチド配列を含むポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞
適切には、本発明のポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
適切には、本発明のポリペプチド、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
及び／又は
(a)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
をさらに含む。
適切には、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％同一、例えば少なくとも70.0％同一、例えば少なくとも80.0％同一、例えば少なくとも85.0％同一、例えば少なくとも87.0％同一、例えば少なくとも89.0％同一、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.8％同一、例えば少なくとも99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号１と比較して130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
適切には、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％、例えば少なくとも70.0％、例えば少なくとも80.0％、例えば少なくとも85.0％、例えば少なくとも90.0％、例えば少なくとも95.0％、例えば少なくとも97.0％、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.8％同一、例えば少なくとも99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号５と比較して500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
ChAd155ファイバー若しくはその機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞
適切には、本発明の単離されたポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。適切には、そのポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有する。
あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体をコードするポリヌクレオチドを含み、その機能的誘導体は配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する。適切には、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも80％同一、例えば少なくとも85.0％同一、例えば少なくとも90％同一、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％同一、例えば少なくとも99％同一、例えば少なくとも99.4％同一、例えば少なくとも99.6％同一、例えば少なくとも99.8％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号１と比較して130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
適切には、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、以下：
(a)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号３のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも50.0％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
及び／又は
(a)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも50％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
適切には、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％、例えば少なくとも70.0％、例えば少なくとも80.0％、例えば少なくとも85.0％、例えば少なくとも90.0％、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.8％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号３と比較して300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
適切には、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％、例えば少なくとも70.0％、例えば少なくとも80.0％、例えば少なくとも85.0％、例えば少なくとも90.0％、例えば少なくとも95.0％、例えば少なくとも97.0％、例えば少なくとも98.0％、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば99.7％同一、例えば少なくとも99.8％同一、例えば99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号５と比較して500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
ChAd155ペントンをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞
適切には、本発明の単離されたポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。適切には、そのポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を有する。
適切には、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、組換えアデノウイルス、組成物又は細胞は、以下：
(a)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも50％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
及び／又は
(a)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド；若しくは
(b)配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体であって、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも50％同一のアミノ酸配列を有する機能的誘導体、
をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
適切には、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％同一、例えば少なくとも70.0％同一、例えば少なくとも80.0％同一、例えば少なくとも85.0％同一、例えば少なくとも87.0％同一、例えば少なくとも89.0％同一、例えば少なくとも91.0％同一、例えば少なくとも93.0％同一、例えば少なくとも95.0％同一、例えば少なくとも97.0％同一、例えば少なくとも98.0％同一、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば99.7％同一、例えば少なくとも99.8％同一、例えば99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号１と比較して130以下、より適切には120以下、より適切には110以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
適切には、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的誘導体は、配列番号５のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも60.0％、例えば少なくとも70.0％、例えば少なくとも80.0％、例えば少なくとも85.0％、例えば少なくとも90.0％、例えば少なくとも95.0％、例えば少なくとも97.0％、例えば少なくとも98.0％、例えば少なくとも99.0％、例えば少なくとも99.2％、例えば少なくとも99.4％、例えば少なくとも99.5％同一、例えば少なくとも99.6％、例えば99.7％同一、例えば少なくとも99.8％同一、例えば99.9％同一のアミノ酸配列を有する。あるいは、その機能的誘導体は、配列番号５と比較して500以下、より適切には400以下、より適切には450以下、より適切には300以下、より適切には250以下、より適切には200以下、より適切には150以下、より適切には125以下、より適切には100以下、より適切には90以下、より適切には80以下、より適切には70以下、より適切には60以下、より適切には50以下、より適切には40以下、より適切には30以下、より適切には20以下、より適切には10以下、より適切には5以下、より適切には4以下、より適切には3以下、より適切には2以下、より適切には1以下の付加、欠失又は置換を有する。
ChAd155骨格
本発明は、野生型、未改変のChAd155（配列番号１０）及び改変されたChAd155の骨格構築物を含む、チンパンジーアデノウイルスChAd155の単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。これらの改変された骨格構築物は、ChAd155#1434（配列番号７）、ChAd155#1390 （配列番号８）及びChAd155#1375（配列番号９）を含む。ChAd155骨格は、例えば導入遺伝子の送達のための複製能を有する又は複製能を有さない組換えアデノウイルスの構築に使用され得る。
ChAd155野生型配列（配列番号１０）の注釈は、以下に示される。
Figure 0006983665
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１つの実施形態では、配列番号７、８、９、１０の配列の断片及びそれらの相補鎖、それらに相補的なcDNA及びRNAが提供される。適切には、断片は、少なくとも15ヌクレオチドの長さ、より適切には30ヌクレオチドの長さ、より適切には60ヌクレオチドの長さ、より適切には120ヌクレオチドの長さ、より適切には240ヌクレオチドの長さ、より適切には480ヌクレオチドの長さであり、機能的断片、すなわち、生物学的な目的のある断片を含む。例えば、機能的断片は、所望のアデノウイルス産物を発現することができる、又は組換えウイルスベクターの作製に有用であり得る。このような断片は、上記の遺伝子配列を含む。
本明細書に記載されるアデノウイルス核酸によってコードされる、タンパク質、酵素、及びその断片などのChAd155アデノウイルスの遺伝子産物が提供される。これらのタンパク質は、上記で特定されたオープンリーディングフレームによってコードされるもの、及び配列表に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む。
更なるChAd155ポリヌクレオチド及びポリペプチド
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のファイバーポリペプチド；ペントンポリペプチド；ヘキソンポリペプチド及びペントンポリペプチド；ヘキソンポリペプチド及びファイバーポリペプチド；ペントンポリペプチド及びファイバーポリペプチド；又はヘキソンポリペプチド、ペントンポリペプチド及びファイバーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み；更なるアデノウイルスポリヌクレオチド、適切にはChAd155ポリヌクレオチドをさらに含み得る。従って、適切には、本発明のポリヌクレオチドは、以下の、先の注釈において提供された配列番号１０に対する配列座標：
(a)アデノウイルス5'-逆方向末端反復（ITR）；
(b)アデノウイルスE1A領域、又はE1A_280R及びE1A_243R領域から選択されるその断片；
(c)アデノウイルスE1B若しくはIX領域、又はE1B_19K、E1B_55K及びIX領域からなる群より選択されるその断片；
(d)アデノウイルスE2B領域；又はE2B_pTP、E2B_ポリメラーゼ及びE2B_IVa2領域からなる群より選択されるその断片；
(e)アデノウイルスL1領域、又はL1_13.6K、L1_52K及びL1_pIIIaタンパク質からなる群より選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(f)アデノウイルスL2領域若しくは本発明のペントンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むL2領域、又はL2_ペントンタンパク質、L2_pVIIタンパク質、L2_Vタンパク質、及びL2_pXタンパク質からなる群より選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(g)アデノウイルスL3領域若しくは本発明のヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むL3領域、又はL3_pVIタンパク質、L3_ヘキソンタンパク質及びL3_プロテアーゼタンパク質からなる群より選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(h)アデノウイルスE2A領域；
(i)アデノウイルスL4領域、又はL4_100kタンパク質、L4_33Kタンパク質、L4_22Kタンパク質及びタンパク質L4_VIIIからなる群より選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(j)アデノウイルスE3領域、又はE3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、及びE3 ORF9からなる群より選択されるその断片；
(k)アデノウイルスL5領域、又は本発明のL5_ファイバーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むL5領域；
(l)アデノウイルス（例えばAd5等）E4領域、又はE4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2、及びE4 ORF1からなる群より選択されるその断片；特に前記E4領域のORF6；
(m)アデノウイルス3'-ITR；ならびに／あるいは
(n)アデノウイルスVAI又はVAII RNA領域、好ましくはChAd155以外のアデノウイルス由来、より好ましくはAd5由来のアデノウイルスVAI又はVAII RNA領域
の1種以上を含む。
定義
適切には、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。「単離された」ポリヌクレオチドとは、その本来の環境から取り出されたものである。例えば、天然のポリヌクレオチドは、それが天然の系において共存する物質の一部又はすべてから分離された場合、単離されている。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部ではないベクターにクローニングされた場合、またはそれがcDNA中に含まれる場合、単離されていると見なされる。
適切には、本発明のポリヌクレオチドは組換え体である。組換え体とは、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限酵素切断（restriction）若しくはライゲーションステップ、又は自然界において見出されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドをもたらす他の方法の少なくとも１つの生成物であることを意味する。組換えアデノウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むアデノウイルスである。組換えベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むベクターである。「組換えウイルス」は、元の組換えウイルスの子孫を含む。「組換えベクター」は、元の組換えベクターの複製物を含む。「組換えポリヌクレオチド」は、元の組換えポリヌクレオチドの複製物を含む。
適切には、本発明のポリペプチド配列は、天然配列に対して少なくとも１つの変更を含む。適切には、本発明のポリヌクレオチド配列は、天然配列に対して少なくとも１つの変更を含む。例えば、遺伝子工学技術によって異なる種（及びしばしば異なる属、亜科又は科）由来のプラスミドまたはベクター内に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から取り出され、天然では連結することが見出されないコード配列と機能的に連結しているプロモーターは、異種プロモーターである。ウイルス又はウイルスベクターのゲノム内にクローニングされており、ウイルスのゲノムが天然にはそれを含まない特異的な組換え部位は、異種組換え部位である。異種核酸配列はまた、アデノウイルスゲノムにおいて天然に見出される配列を含むが、アデノウイルスベクターの中で非天然の位置に配置される。
通常、「異種の」とは、比較されている存在物の他の部分と遺伝子型で識別可能な存在物に由来することを意味する。異種核酸配列とは、天然に存在するアデノウイルスベクターの核酸配列から単離されない、それに由来しない、又はそれに基づかない任意の核酸配列を指す。「天然に存在する」とは、天然に見出される、合成によって作られていない、又は改変されていない配列を意味する。配列は、適切には起源遺伝子の正常な機能を破壊しないように、ある起源から単離されるが、（例えば、欠失、置換（突然変異）、挿入、又は他の変更によって）改変されている場合、起源に「由来」する。
ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、適切には、ポリペプチドの改変型を指し、例えば、ポリペプチドの１以上のアミノ酸が、欠失、挿入、改変及び／又は置換され得る。未改変のアデノウイルスカプシドタンパク質の誘導体は、例えば以下の場合：
(a) そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を有するアデノウイルスが、未改変のカプシドタンパク質を有するアデノウイルスと比較して、実質的に同じ若しくはより低い血清陽性率を保持する場合、及び／又は
(b) そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を有するアデノウイルスが、未改変のカプシドタンパク質を有するアデノウイルスと比較して、実質的に同じ若しくはより高い宿主細胞感染性を保持する場合、及び／又は
(c) そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を有するアデノウイルスが、未改変のカプシドタンパク質を有するアデノウイルスと比較して、実質的に同じ若しくはより高い免疫原性を保持する場合、及び／又は
(d) そのカプシド内に誘導体カプシドタンパク質を有するアデノウイルスが、未改変のカプシドタンパク質を有するアデノウイルスと比較して、実質的に同じ若しくはより高いレベルの導入遺伝子生産性を保持する場合、
機能的であると考えられる。
上記の特性（a）〜（d）は、適切には、下記の実施例の項に記載される方法を用いて測定され得る。
適切には、ポリペプチド、ベクター又は組換えアデノウイルスは、ヒト集団において低い血清陽性率を有する。「低い血清陽性率」とは、ヒトアデノウイルス5（Ad5）と比較して低い既存の中和抗体レベルを有することを意味し得る。同様に、又は、その代わりに、「低い血清陽性率」とは、約20％より低い血清陽性率、約15％より低い血清陽性率、約10％より低い血清陽性率、約5％より低い血清陽性率、約4％より低い血清陽性率、約3％より低い血清陽性率、約2％より低い血清陽性率、約1％より低い血清陽性率又は検出不可能な血清陽性率を意味し得る。血清陽性率は、Aste-Amezagaら、Hum. Gene Ther. (2004) 15(3):293-304に記載されるような方法を用いて、臨床的に意義のある中和力価を有する個体のパーセンテージ（50％中和力価＞200と定義される）として測定され得る。
ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質という用語は、本明細書において同じ意味で使用される。
「サル」という用語は、一般的に非ヒト霊長類、例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿及びテナガザルを含むことを意味する。詳細には、サルは、チンパンジー（Pan troglodyte）、ボノボ（Pan paniscus）及びゴリラ（Gorilla属）などの非ヒト類人猿を指し得る。類人猿以外のサルは、アカゲザル（Macaca mulatta）を含み得る。
配列比較
２つの近縁のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の比較のために、第一配列と第二配列との間の「％同一性」が、標準設定を用いたBLAST（登録商標）（blast.ncbi.nlm.nih.govで利用可能、最終アクセス2015年3月9日）などのアラインメントプログラムを用いて計算され得る。％同一性は、一致した残基数を参照配列の残基数で割って100を掛けたものである。上記及び特許請求の範囲に示される％同一性の数字は、この方法によって計算されたパーセンテージである。％同一性の別の定義は、一致した残基数をアラインメントされた残基数で割って100を掛けたものである。別法には、アラインメント中のギャップ、例えば他方の配列に対する一方の配列での欠失が、スコアリングパラメーター（scoring parameter）中のギャップスコア又はギャップコストで説明されるギャップ法（gapped method）の使用が含まれる。更なる情報については、ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdfで入手可能なBLAST（登録商標）ファクトシート、最終アクセス2015年3月9日を参照されたい。
ポリヌクレオチド又はそれによってコードされるポリペプチドの機能性を保持する配列は、より厳密に一致している可能性が高い。ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、それらがその全長にわたって100％配列同一性を共有する場合、他のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列と同一若しくは一致していると言われる。
配列間の「違い」とは、第一配列と比較した、第二配列のある位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を指す。２つのポリペプチド配列は、１つ、２つ又はより多くのこのようなアミノ酸配列の違いを含み得る。その他の点では第一配列と同一（100％配列同一性）である第二配列中の挿入、欠失又は置換は、配列同一性のパーセントの減少をもたらす。例えば、同一配列が9アミノ酸残基の長さである場合、第二配列中の１つの置換は、88.9％の配列同一性をもたらす。同一配列が17アミノ酸残基の長さである場合、第二配列中の２つの置換は、88.2％の配列同一性をもたらす。同一配列が7アミノ酸残基の長さである場合、第二配列中の３つの置換は、57.1％の配列同一性をもたらす。第一及び第二ポリペプチド配列が9アミノ酸残基の長さで6個の同一残基を共有する場合、第一及び第二ポリペプチド配列は66％を超える同一性を共有する（第一及び第二ポリペプチド配列は、66.7％の同一性を共有する）。第一及び第二ポリペプチド配列が17アミノ酸残基の長さで16個の同一残基を共有する場合、第一及び第二ポリペプチド配列は94％を超える同一性を共有する（第一及び第二ポリペプチド配列は、94.1％の同一性を共有する）。第一及び第二ポリペプチド配列が7アミノ酸残基の長さで3個の同一残基を共有する場合、第一及び第二ポリペプチド配列は42％を超える同一性を共有する（第一及び第二ポリペプチド配列は、42.9％の同一性を共有する）。
別法として、第一の参照ポリペプチド配列を第二の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第二配列を生じるために第一配列に引き起こされる付加、置換及び／又は欠失の数が確認され得る。付加とは、第一ポリペプチドの配列内への１つのアミノ酸残基の付加である（第一ポリペプチドのどちらかの末端での付加を含む）。置換とは、第一ポリペプチドの配列における１つのアミノ酸残基の１つの異なるアミノ酸残基での置換である。欠失とは、第一ポリペプチドの配列からの1つのアミノ酸残基の欠失である（第一ポリペプチドのどちらかの末端での欠失を含む）。
第一の参照ポリヌクレオチド配列を第二の比較ポリヌクレオチド配列と比較する目的で、第二配列を生じるために第一配列に引き起こされる付加、置換及び／又は欠失の数が確認され得る。付加とは、第一ポリヌクレオチドの配列内への１つのヌクレオチド残基の付加である（第一ポリヌクレオチドのどちらかの末端での付加を含む）。置換とは、第一ポリヌクレオチドの配列における１つのヌクレオチド残基の１つの異なるヌクレオチド残基での置換である。欠失とは、第一ポリヌクレオチドの配列からの1つのヌクレオチド残基の欠失である（第一ポリヌクレオチドのどちらかの末端での欠失を含む）。
適切には、本発明の配列中の置換は保存的置換であり得る。保存的置換は、置換されるアミノ酸と類似した化学的特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む（例えば、Stryerら、Biochemistry, 第5版2002, 44〜49ページ参照）。好ましくは、保存的置換は、以下：（i）別の異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換；（ii）；別の異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換；（iii）別の異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換；（iv）別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換；及び（v）別の異なる極性無電荷アミノ酸による極性無電荷アミノ酸の置換、からなる群より選択される置換である。塩基性アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンからなる群より選択される。酸性アミノ酸は、好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、好ましくは、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群より選択される。極性無電荷アミノ酸は、好ましくは、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択される。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、上記の保存的置換（i）から（v）に該当しない任意のアミノ酸による１つのアミノ酸の交換である。
ベクター及び組換えアデノウイルス
本発明のChAd155配列は、治療薬として、ならびに様々なベクター系、組換えアデノウイルス及び宿主細胞の構築に有用である。適切には、「ベクター」という用語は、野生型配列と比較して実質的に改変されている（例えば、遺伝子若しくは機能性領域が欠失及び／若しくは不活性化されている）、ならびに／あるいは、異種配列、すなわち、異なる起源から得られた核酸（「インサート」とも呼ばれる）を組み込み、細胞（例えば宿主細胞）に導入された際、挿入されたポリヌクレオチド配列を複製及び／又は発現する核酸を指す。例えば、インサートは本明細書に記載されるChAd155配列の全部又は一部であり得る。加えて、あるいは別法としては、ChAd155ベクターは、ウイルス遺伝子、例えばE1又は本明細書に記載される他のウイルス遺伝子若しくは機能性領域などの１以上の欠失又は不活性化を有するChAd155アデノウイルスであり得る。このようなChAd155は、異種配列を含んでも、含まなくてもよいが、しばしば「骨格」と呼ばれ、そのままで、又はベクターの更なる改変の開始点として使用され得る。
ベクターは、裸のDNA、プラスミド、ウイルス、コスミド、ラムダベクターなどのファージベクター、BAC（細菌人工染色体）などの人工染色体、又はエピソームを含む任意の適切な核酸分子であり得る。あるいは、ベクターは、T7に適合した系（T7-compatible system）のような無細胞in vitro転写若しくは発現のための転写及び／又は発現ユニットであり得る。ベクターは、単独で、又は他のアデノウイルス配列若しくは断片と組み合わせて、又は非アデノウイルス配列由来の因子と組み合わせて使用され得る。ChAd155配列はまた、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター、またはワクチンベクターにおいても有用である。従って、ChAd155配列を含む遺伝子送達ベクター、及び宿主細胞が、更に提供される。
「複製能を有する」アデノウイルスという用語は、細胞中に含まれるいかなる組換えヘルパータンパク質もなしに、宿主細胞中で複製できるアデノウイルスを指す。適切には、「複製能を有する」アデノウイルスは、以下の完全な又は機能的な必須の初期遺伝子：E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4を含む。特定の動物から分離された野生型のアデノウイルスは、その動物において複製能を有する。
「複製能を有さない」あるいは「複製欠損の」アデノウイルスという用語は、少なくとも機能的欠失（又は「機能喪失」突然変異）、すなわちそれを完全に除去することなく遺伝子の機能を損なう欠失又は突然変異、例えば人為的な終止コドンの導入、活性部位若しくは相互作用ドメインの欠失若しくは突然変異、遺伝子の調節配列等の突然変異若しくは欠失、又は、ウイルス複製に必須な遺伝子産物をコードする遺伝子、例えばE1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4より選択される１種以上のアデノウイルス遺伝子（例えばE3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及び／若しくはE4 ORF1) などの完全除去、を有するように操作されているために、複製する能力がないアデノウイルスを指す。特に適切には、E1ならびに任意選択でE3及び／又はE4が欠失している。欠失している場合、上記の欠失遺伝子領域は、別の配列に対する％同一性を決定する際、適切にはアラインメントでは考慮されない。
本発明は、治療又はワクチンの目的のいずれかで、タンパク質、適切には異種タンパク質を細胞に送達するベクター、例えば組換えアデノウイルス等を提供する。ベクターは、裸のDNA、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド、又はウイルスなどの任意の遺伝因子を含み得る。このようなベクターは、本明細書に開示されるようなChAd155のDNA及びミニ遺伝子（minigene）を含む。「ミニ遺伝子」（又は「発現カセット」）とは、選択された異種遺伝子（導入遺伝子）ならびに宿主細胞において遺伝子産物の翻訳、転写及び／又は発現を行うために必要な他の調節因子の組合せを意味する。
通常、ChAd155由来のアデノウイルスベクターは、ミニ遺伝子が、選択されたアデノウイルス遺伝子本来の領域に他のアデノウイルス配列を含む核酸分子中に位置するように設計される。ミニ遺伝子は、既存遺伝子領域内に挿入されて、必要であれば、その領域の機能を破壊し得る。あるいは、ミニ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失しているアデノウイルス遺伝子の部位に挿入され得る。例えば、ミニ遺伝子は、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4からなる群より選択されるゲノム領域の少なくとも１種の遺伝子の機能を失わせる突然変異、挿入又は欠失の部位に位置し得る。「機能を失わせる」という用語は、遺伝子領域がもはや機能的な遺伝子発現の産物を産生できないように、十分な量の遺伝子領域が除去される、又は他の方法で破壊されることを意味する。必要であれば、遺伝子領域全体が除去され得る（そして適切にはミニ遺伝子で置換される）。
例えば、組換えウイルスの生成に有用なベクターの作製のために、ベクターは、ミニ遺伝子、ならびにアデノウイルスゲノムの5'末端若しくはアデノウイルスゲノムの3'末端、又はアデノウイルスゲノムの5'末端及び3'末端の両方を含み得る。アデノウイルスゲノムの5'末端は、パッケージングならびに複製に必要な5'シス因子；すなわち、（複製の起点として機能する）5' ITR配列、並びに（直鎖状のAdゲノムのパッケージングに必要な配列及びE1プロモーターのエンハンサー因子を含む）天然の5 'パッケージングエンハンサードメインを含む。アデノウイルスゲノムの3'末端は、パッケージング及びカプシド形成に必要な3'シス因子（ITRなど）を含む。適切には、組換えアデノウイルスは5'及び3'アデノウイルスシス因子の両方を含み、ミニ遺伝子（適切には導入遺伝子を含んでいる）は5'及び3'アデノウイルス配列の間に位置する。ChAd155に基づくアデノウイルスベクターはまた、更なるアデノウイルス配列をも含み得る。
適切には、ChAd155に基づくベクターは、本発明のアデノウイルスChAd155ゲノムに由来する1種以上のアデノウイルス因子を含む。１つの実施形態では、ベクターは、ChAd155由来のアデノウイルスITR、及び同じアデノウイルス血清型由来の更なるアデノウイルス配列を含む。別の実施形態では、ベクターは、ITRを供給するものとは異なるアデノウイルス血清型に由来するアデノウイルス配列を含む。
本明細書において定義される場合、偽型（pseudotyped）アデノウイルスとは、アデノウイルスのカプシドタンパク質が、ITRを供給するアデノウイルスとは異なるアデノウイルスに由来するアデノウイルスを指す。
更に、本明細書に記載されるアデノウイルスを用い、当業者にとって既知の技術（例えば、US 7,291,498）を用いて、キメラ又はハイブリッドアデノウイルスが構築され得る。
本発明のベクター中に存在するITR及び他の任意のアデノウイルス配列は、多くの供給先から得られ得る。様々なアデノウイルス株が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、Manassas, Virginiaから入手可能であり、又は要求に応じて様々な商業的及び公共的供給先から入手可能である。更に、多くのこのような株の配列は、例えばPubMed及びGenBankなどの様々なデータベースから利用可能である。他のチンパンジー又はヒトアデノウイルスから作製された相同のアデノウイルスベクターは、既刊文献（例えば、US 5,240,846）に記載されている。Ad5型（GenBank受入番号M73370）など、多くのアデノウイルス型のDNA配列はGenBankから利用可能である。アデノウイルス配列は、例えば血清型2、3、4、7、12及び40など、更に任意の現在同定されているヒト型などの、任意の既知のアデノウイルス血清型から得ることができる。同様に、ヒト以外の動物（例えば、サル）に感染することが知られているアデノウイルスもまた、本発明のベクター構築物に使用され得る（例えば、US 6,083,716）。ウイルス配列、ヘルパーウイルス（必要であれば）、及び組換えウイルス粒子、ならびに本明細書に記載されるベクターの構築に使用される他のベクター成分及び配列は、以下に記載されるように得ることができる。
配列、ベクター及びアデノウイルスの作製
本発明の配列は、組換えによる作製、化学合成、または他の合成方法を含む任意の適切な方法によって作製され得る。適切な作製技術は、当業者によく知られている。別法として、ペプチドもまた周知の固相ペプチド合成法によって合成され得る。
アデノウイルスプラスミド（又は他のベクター）は、アデノウイルスベクターを作製するために使用され得る。１つの実施形態では、アデノウイルスベクターは、複製能を有さないアデノウイルス粒子である。１つの実施形態では、アデノウイルス粒子は、E1A及び／又はE1B遺伝子中の欠失によって複製不能にされている。別法では、アデノウイルスは、任意選択でE1A及び／又はE1B遺伝子を保持しながら、別の手段によって複製不能にされている。同様に、いくつかの実施形態では、ベクターに対する免疫応答の減少は、E2B及び／又はDNAポリメラーゼ遺伝子中の欠失によって達成され得る。アデノウイルスベクターはまた、アデノウイルスゲノムへの他の突然変異、例えば、他の遺伝子中の温度感受性変異又は欠失を含み得る。他の実施形態では、アデノウイルスベクター中に完全なE1A及び／又はE1B領域を保持することが望ましい。このような完全なE1領域は、アデノウイルスゲノム中のその本来の位置にあってもよく、又は天然のアデノウイルスゲノム中の欠失部位（例えば、E3領域中）に置かれてもよい。
哺乳動物（例えばヒト等）の細胞に遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターの構築では、様々な改変アデノウイルス核酸配列がベクター内で使用され得る。例えば、アデノウイルス遅延初期遺伝子（delayed early gene）E3の全部又は一部は、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から除去され得る。E3の機能は、組換えウイルス粒子の機能及び生産に重要ではないと考えられている。E4遺伝子の少なくともORF6領域の欠失、より望ましくは、この領域の機能の余剰性のため、E4領域全体の欠失を有するアデノウイルスベクターもまた構築され得る。本発明の更に別のベクターは、遅延初期遺伝子E2Aに欠失を含む。欠失はまた、アデノウイルスゲノムの任意の後期遺伝子L1〜L5にも作られ得る。同様に、中間遺伝子（intermediate gene）IX及びIVa2中の欠失は、いくつかの目的のために有用であり得る。他の欠失は、他のアデノウイルス構造遺伝子又は非構造遺伝子に作られ得る。上記で議論された欠失は個別に使用され得る。すなわち、本明細書に記述されるような使用のためのアデノウイルス配列は単一領域のみに欠失を含み得る。あるいは、それらの生物学的活性を破壊するのに有効な遺伝子全体又はその一部の欠失は、任意の組合せで使用され得る。例えば、１つの例示的なベクターでは、アデノウイルス配列は、E3の欠失の有無にかかわらず、E1遺伝子及びE4遺伝子の欠失、又はE1、E2A及びE3遺伝子の欠失、又はE1及びE3遺伝子の欠失、又はE1、E2A及びE4遺伝子の欠失などを有し得る。任意の１種以上のE遺伝子は、アデノウイルスの異なる株から供給されるE遺伝子（又は１種以上のE遺伝子オープンリーディングフレーム）と適切に置換され得る。特に適切には、ChAd155 E1及びE3遺伝子は欠失しており、ChAd155 E4遺伝子はE4Ad5orf6に置換される。上記で議論されたように、このような欠失及び／又は置換は、望ましい結果を得るために、温度感受性変異のような他の突然変異と組み合わせて使用され得る。
１種以上の必須アデノウイルス配列（例えば、E1A、E1B、E2A、E2B、E4 ORF6、L1、L2、L3、L4及びL5）を欠くアデノウイルスベクターは、ウイルスの感染性及びアデノウイルス粒子の増殖に必要とされる、欠けているアデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養され得る。これらのヘルパー機能は、アデノウイルスベクターを、１種以上のヘルパー構築物（例えば、プラスミド若しくはウイルス）又はパッケージング宿主細胞の存在下で培養することによって提供され得る。
複製能を有さないベクターの補完
上述の任意の遺伝子に欠失のある組換えアデノウイルスを産生するために、欠失遺伝子領域の機能は、ウイルスの複製及び感染性に必須ならば、ヘルパーウイルス又は細胞株、すなわち、補完若しくはパッケージング細胞株によって組換えウイルスに供給されなければならない。
ヘルパーウイルス
ミニ遺伝子を運ぶために使用されるウイルスベクターのアデノウイルス遺伝子の内容に応じて、ミニ遺伝子を含む感染性組換えウイルス粒子の産生に必要な十分なアデノウイルス遺伝子配列を供給するために、ヘルパーアデノウイルス又は複製しないウイルス断片が使用され得る。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物中に存在せず、及び／又はベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。１つの実施形態では、ヘルパーウイルスは複製欠損であり、適切には本明細書に記載される１以上の配列に加えてアデノウイルス遺伝子を含む。このようなヘルパーウイルスは、適切にはE1を発現している（及び、任意選択で、更にE3を発現している）細胞株とともに使用される。
ヘルパーウイルスは、任意選択でリポーター遺伝子を含み得る。多くのこのようなリポーター遺伝子は、当技術分野で知られており、また本明細書に記載されている。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子とは異なる、ヘルパーウイルス上のリポーター遺伝子の存在は、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの両方を別々に観測することを可能にする。このリポーターは、精製時に、結果として生じる組換えウイルスとヘルパーウイルスとの分離を可能にするために使用される。
補完細胞株
多くの状況において、ウイルスの複製及び感染性に必須な１種以上の欠けている遺伝子、例えばヒトE1など、を発現している細胞株は、チンパンジーアデノウイルスベクターをトランス補完（transcomplement）するために使用され得る。本発明のチンパンジーアデノウイルス配列と現在入手可能なパッケージング細胞に見られるヒトアデノウイルス配列との間の多様性のため、現在のヒトE1含有細胞の使用は、複製及び産生過程の際に複製能を有するアデノウイルスの生成を妨げるので、これは特に有益である。
あるいは、必要であれば、選択された親細胞株での発現のためのプロモーターの転写制御下で、少なくともChAd155由来のE1遺伝子を発現するパッケージング細胞または細胞株を作製するために、本明細書において提供される配列を利用し得る。この目的のために、誘導性プロモーター又は構成的プロモーターが使用され得る。このようなプロモーターの例は、本明細書の他の部分に詳細に記載されている。親細胞は、任意の所望のChAd155遺伝子を発現する新規細胞株の作製のために選択される。限定はされないが、このような親細胞株は、数ある中でも、HeLa [ATCCアクセッション番号CCL 2]、A549 [ATCC寄託番号CCL 185] 、HEK 293、KB [CCL 17] 、Detroit [例えば、Detroit 510, CCL 72]及びWI-38 [CCL 75]細胞であり得る。これらの細胞株はすべて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209から入手可能である。
このようなE1発現細胞株は、組換えアデノウイルスE1欠失ベクターの作製に有用である。加えて、又は別法として、１種以上のアデノウイルス遺伝子産物、例えば、E1A、E1B、E2A、E3及び／若しくはE4を発現する細胞株は、組換えウイルスベクターの作製に使用されるものと基本的に同じ方法を用いて構築され得る。このような細胞株は、それらの産物をコードする必須遺伝子に欠失のあるアデノウイルスベクターをトランス補完する（transcomplement）ために、又はヘルパー依存性ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供するために利用され得る。宿主細胞の調製は、選択されたDNA配列の組み立て（Assembly）などの技術を含む。
別の可能性では、必須アデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクター及び／又はヘルパーウイルスによってトランスで（in trans）供給される。このような例では、適切な宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）、ならびに昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞などの真核細胞を含む、任意の生物有機体から選択され得る。
宿主細胞は、A549、WEHI、3T3、1011/2、HEK 293細胞又はPer.C6（両方とも機能的なアデノウイルスE1を発現する）[Fallaux, FJら、(1998), Hum Gene Ther, 9:1909-1917]、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、及びハムスターなどの哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞を含むが、それらに限定されない任意の哺乳動物種の細胞から選択され得る。
特に適切な補完細胞株はProcell92細胞株である。Procell92細胞株は、アデノウイルスE1遺伝子を発現するHEK 293細胞を基にして、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ-1（PGK）プロモーターの制御下にあるTetリプレッサー、及びG418-耐性遺伝子でトランスフェクトされている（VitelliらPLOS One (2013) 8(e55435):1-9）。Procell92.Sは、懸濁条件での増殖に適しており、毒性タンパク質を発現するアデノウイルスベクターの産生に有用である（www.okairos.com/e/inners.php?m=00084, 最終アクセス2015年4月13日）。
ウイルス粒子の組み立て（Assembly）及び細胞株のトランスフェクション
通常、ミニ遺伝子を含むベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ベクターは、約1×104細胞〜約1×1013細胞、好ましくは約105細胞に対して、約5μg〜約100μg DNA、好ましくは約10μg〜約50μg DNAの量で送達される。しかし、宿主細胞に対するベクターDNAの相対量は、選択したベクター、送達方法及び選択した宿主細胞などの要因を考慮して調整され得る。
宿主細胞へのベクターの導入は、トランスフェクション及び感染を含む当技術分野において既知の任意の方法によって達成され得る。１以上のアデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれてもよく、エピソームとして安定に発現されてもよく、又は一過性に発現されてもよい。遺伝子産物はすべて、一過性にエピソーム上で若しくは安定に組み込まれて発現されてもよく、又は、遺伝子産物の一部は安定に発現され、他の遺伝子産物は一過性に発現されてもよい。
ベクターの宿主細胞への導入はまた、当業者にとって既知の技術を用いて達成され得る。適切には、標準的なトランスフェクション技術、例えば、CaPCトランスフェクション又はエレクトロポレーションが用いられる。
様々な中間プラスミド内へのアデノウイルスの選択されたDNA配列（ならびに導入遺伝子及び他のベクター因子）の組み立て（Assembly）、ならびに組換えウイルス粒子を産生するためのプラスミド及びベクターの使用はすべて、従来の技術を用いて達成される。このような技術は、cDNAの従来のクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法を含む。標準的なトランスフェクション及び共トランスフェクション技術、例えば、CaPC沈殿法が用いられる。使用される他の従来法は、ウイルスゲノムの相同組換え、寒天重層中のウイルスのプラーク形成、シグナル発生を測定する方法などを含む。
例えば、望ましいミニ遺伝子含有ウイルスベクターの構築及び組み立て（Assembly）の後に、ベクターはヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株内にin vitroでトランスフェクトされる。ヘルパー配列とベクター配列との間で相同組換えが起こり、それは、ベクター内のアデノウイルス-導入遺伝子配列が複製され、ビリオンカプシド内にパッケージングされることを可能にし、組換えウイルスベクター粒子を生じさせる。結果として生じる組換えアデノウイルスは、選択された導入遺伝子の選択された細胞への導入に有用である。パッケージング細胞株内で増殖した組換えウイルスによるin vivo実験では、本発明のE1欠失組換えアデノウイルスベクターは、非サル哺乳動物、好ましくはヒト、細胞への導入遺伝子の導入における有用性を実証する。
導入遺伝子
導入遺伝子は、その導入遺伝子と隣接しているベクター配列に対して異種の、目的のタンパク質をコードする核酸配列である。核酸コード配列は、導入遺伝子の宿主細胞内での転写、翻訳、及び／又は発現を可能にするように、調節成分と機能的に連結している。
導入遺伝子配列の構成は、結果として生じるベクターが用いられる用途によって異なる。例えば、導入遺伝子は治療用導入遺伝子又は免疫原性導入遺伝子であり得る。あるいは、導入遺伝子配列は、リポーター配列を含んでもよく、それは発現時に検出可能なシグナルを生じる。このようなリポーター配列は、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、アルカリフォスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、例えばCD2、CD4、CD8、インフルエンザ血球凝集素タンパク質を含む膜結合タンパク質、及びそれに対する高親和性抗体が存在する、又は従来の方法によって産生され得る、当技術分野においてよく知られている他のタンパク質、及び特に血球凝集素若しくはMyc由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質、をコードするDNA配列を含むが、それらに限定されない。これらのコード配列は、それらの発現を行わせる調節因子と連結している場合、従来の方法によって検出可能なシグナルをもたらし、それらの方法は、酵素アッセイ、放射線アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ又は他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、放射免疫測定（RIA）及び免疫組織化学などの免疫アッセイを含む。
１つの実施形態では、導入遺伝子は、生物学及び医学において有用な産物をコードする非マーカー配列、例えば、タンパク質、RNA、酵素、若しくは触媒RNAなどの、治療用導入遺伝子又は免疫原性導入遺伝子である。望ましいRNA分子は、tRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒RNA、及びアンチセンスRNAを含む。有用なRNA配列の一例は、処理された動物において標的核酸配列の発現を消去する配列である。
導入遺伝子は、例えば、遺伝的欠損の治療のため、癌の治療薬若しくはワクチンとして、免疫応答の誘導のため、及び／又は予防ワクチンの目的のために使用され得る。本明細書において用いられる場合、免疫応答の誘導とは、タンパク質に対するT細胞及び／又は液性免疫応答を誘導するタンパク質の能力を指す。
従って、１つの実施形態では、本発明は、病原体由来の免疫原性導入遺伝子を含む発現カセットを含む、本発明の組換えベクターを提供する。特定の実施形態では、病原体は、呼吸器系ウイルスである。従って、本発明は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）由来の免疫原性導入遺伝子を含む発現カセットを含む、組換えChAd155由来アデノウイルスベクターを提供する。１つの実施形態では、本発明の組換えChAd155由来アデノウイルスベクターは、RSV F抗原及びRSV M及びN抗原を含む。より詳細には、その核酸は、RSV FΔTM抗原（膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質）、並びにRSV M2-1（抗転写終結）及びN（ヌクレオカプシド）抗原をコードする。特定の実施形態では、組換えベクターは、配列番号３７の配列をコードする核酸配列を（例えば発現カセット内に）含む。１つの実施形態では、組換えベクターは、本質的に配列番号１１の配列を有するポリヌクレオチドからなるものである。
調節因子
導入遺伝子に加えて、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞若しくは本発明によって作製されたウイルスに感染した細胞での、その転写、翻訳及び／又は発現を可能にするように、導入遺伝子に機能的に連結している従来の制御因子をも含む。本明細書において用いられる場合、「機能的に連結している」配列は、目的の遺伝子と隣接している発現制御配列、及びトランスで又は距離を置いて目的の遺伝子を制御するように作用する発現制御配列の両方を含む。
発現制御配列は、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター及びエンハンサー配列；効果的なRNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシングシグナル及びウサギβ-グロビンpolyAを含むポリアデニル化（poly A）シグナルなど；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに必要であれば、コードされる産物の分泌を促進する配列を含む。数ある配列の中でも特に、キメライントロン（chimeric intron）が使用され得る。
いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（WPRE）（Zuffreyら(1999) J Virol; 73(4):2886-9）が導入遺伝子に機能的に連結され得る。典型的なWPREは、配列番号２６に提供される。
「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。通常、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に近接した遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列因子はしばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの例は、細菌、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物（ヒトを含む）由来のプロモーターを含むがそれらに限定されない。内部プロモーター、天然のプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター及び／又は組織特異的プロモーターを含む非常に多くの発現制御配列が当技術分野において知られており、利用され得る。
構成的プロモーターの例は、TBGプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター（任意選択でエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（任意選択でCMVエンハンサーを含む、例えば、Boshartら、Cell, 41:521-530 (1985)参照）、CASIプロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター、及びEF1aプロモーター（Invitrogen）を含むが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態では、プロモーターはCASIプロモーターである（例えば、WO2012/115980参照）。CASIプロモーターは、CMVエンハンサーの一部、ニワトリβ-アクチンプロモーターの一部、及びUBCエンハンサーの一部を含む合成プロモーターである。いくつかの実施形態では、CASIプロモーターは、配列番号１２に対して少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１２の核酸配列を含む、または配列番号１２の核酸配列からなる。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外から供給される化合物、温度などの環境要因、又は例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製している細胞のみにおいてなどの特定の生理状態の存在によって調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、Invitrogen、Clontech及びAriadを含むがそれらに限定されない様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。例えば、誘導性プロモーターは、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（MT）プロモーター及びデキサメタゾン（Dex）誘導性マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーターを含む。他の誘導系は、T7ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（Noら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossenら、Science, 378:1766-1769 (1995)、Harveyら、Curr. Opin. Chem. Biol, 2:512-518 (1998)も参照）を含む。他の系は、FK506二量体、カストラジオール（castradiol）を用いるVP16又はp65、ジフェノールムリスレロン（diphenol murislerone）、RU486誘導系（Wangら、Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及びWangら、Gene Ther., 4:432-441 (1997)）ならびにラパマイシン誘導系（Magariら、J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）を含む。いくつかの誘導性プロモーターの有効性は時間とともに増大する。このような場合、複数のリプレッサーをタンデムに挿入すること（例えば、IRES によってTetRに連結されたTetR）によって、このような系の有効性を向上させ得る。
別の実施形態では、導入遺伝子の天然のプロモーターが使用される。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが望ましい場合、天然のプロモーターが好まれ得る。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が、時間的に若しくは発達上、又は組織特異的に、又は特定の転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用され得る。更なる実施形態では、エンハンサー因子、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列などの他の天然の発現制御因子もまた、天然の発現を模倣するために使用され得る。
導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに機能的に連結され得る。例えば、骨格筋での発現が望ましい場合、筋肉で活性のあるプロモーターが用いられるべきである。これらは、骨格β-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーター（Liら、Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)参照）を含む。組織特異的なプロモーターの例は、数ある中でも、肝臓（アルブミン、Miyatakeら、J. Virol, 71:5124-32 (1997)；B型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandigら、Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；α-フェトプロテイン（AFP）、Arbuthnotら、Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)）、骨オステオカルシン（Steinら、Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質（Chenら、J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、リンパ球（CD2、Hansalら、J. Immunol, 161:1063-8 (1998)；免疫グロブリン重鎖；T細胞受容体鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター（Andersenら、Cell. Mol. Neurobiol, 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Piccioliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、及びニューロン特異的vgf遺伝子（Piccioliら、Neuron, 15:373-84 (1995)）などのニューロンで知られている。
任意選択で、治療上有用な又は免疫原性の産物をコードする導入遺伝子を有するベクターはまた、選択マーカー又はリポーター遺伝子を含んでいてもよく、それは、数ある中でも、ジェネティシン、ハイグロマイシン若しくはピューロマイシン（purimycin）耐性をコードする配列を含み得る。このような選択リポーター又はマーカー遺伝子（好ましくは、ウイルス粒子内にパッケージングされるウイルスゲノムの外側に位置する）は、例えばアンピシリン耐性など、細菌細胞でのプラスミドの存在を示すために使用され得る。ベクターの他の構成要素は、複製起点を含み得る。
これらのベクターは、当業者にとって既知の技術とともに、本明細書において提供される技術及び配列を用いて作製される。このような技術は、文献に記載されるものなどの従来のcDNAのクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法を含む。
治療及び予防
ChAd155を基にした組換えベクターは、in vitro、ex vivo、及びin vivoでのヒト又は非サル哺乳動物への遺伝子導入に有用である。
本明細書に記載される組換えアデノウイルスベクターは、in vitroで異種導入遺伝子によってコードされる産物を産生するための発現ベクターとして使用され得る。例えば、導入遺伝子を含んでいる複製能を有さない組換えアデノウイルスは、上述のような補完細胞株にトランスフェクトされ得る。
ChAd155由来の組換えアデノウイルスベクターは、１種以上のアデノウイルス血清型に対して中和抗体を有する生物であっても、in vivo又はex vivoにおいて選択された導入遺伝子を選択された宿主細胞に送達し得る、効果的な遺伝子導入ベヒクルを提供する。１つの実施形態では、ベクター及び細胞はex vivoで混合され；感染細胞は従来の方法を用いて培養され；形質導入細胞は患者に再注入される。これらの技術は、治療目的及び防御免疫の誘導などの免疫付与のための遺伝子送達に特に適している。
免疫原性導入遺伝子
組換えChAd155ベクターはまた、免疫原性組成物中でも投与され得る。本明細書に記載する免疫原性組成物は、哺乳動物、適切にはヒトに送達された後、ベクターによって送達された導入遺伝子産物に対して免疫応答、例えば液性（例えば、抗体）応答及び／又は細胞性（例えば、細胞傷害性T細胞）応答を誘導できる１種以上の組換えChAd155ベクターを含有している組成物である。組換えアデノウイルスは、（適切には任意のその遺伝子の欠失の中に）所望の免疫原をコードする遺伝子を含み、その結果ワクチンに使用され得る。組換えアデノウイルスは、免疫応答の誘導に不可欠で病原体の蔓延を制限することができる抗原が同定されており、cDNAが入手可能である任意の病原体に対する、予防ワクチン又は治療ワクチンとして使用され得る。
従って、１つの実施形態では、本発明は、病原体によって引き起こされる疾患の処置における本発明の組換えアデノウイルスの使用を提供する。１つの実施形態では、このような処置は予防である。１つの実施形態では、本発明は、病原体に対する免疫応答の産生における組換えアデノウイルスの使用を提供する。特定の実施形態では、病原体は呼吸器系ウイルスである。従って、本発明は、RSV感染の治療又は予防における、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）由来の免疫原性導入遺伝子を含む発現カセットを含む、組換えChAd155由来アデノウイルスベクターの使用を提供する。１つの実施形態では、本発明の組換えChAd155由来アデノウイルスベクターは、RSV F抗原及びRSV M及びN抗原を含む。より詳細には、その核酸は、RSV FΔTM抗原（膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質）、並びにRSV M2-1（抗転写終結）及びN（ヌクレオカプシド）抗原をコードする。特に、導入遺伝子は、配列番号３７に示されるRSV抗原をコードする。
更なる実施形態では、本発明は、病原体に対する免疫応答の産生のための医薬の製造における、本発明の組換えアデノウイルスの使用を提供する。従って、本発明は、RSV感染の治療又は予防のための医薬の製造における、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）由来の免疫原性導入遺伝子を含む発現カセットを含む、組換えChAd155由来アデノウイルスベクターの使用を提供する。より詳細には、導入遺伝子は、RSV FΔTM抗原（膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質）、並びにRSV M2-1（抗転写終結）及びN（ヌクレオカプシド）抗原をコードする。特に、導入遺伝子は、配列番号３７に示されるRSV抗原をコードし、例えば、１つの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１１のポリヌクレオチドを含む。
１つの実施形態では、本発明は、病原体由来の免疫原性導入遺伝子を含む発現カセットを含む有効量の本発明の組換えアデノウイルス、例えば、ChAd155由来アデノウイルスの投与を含む、病原体によって引き起こされる疾患の治療又は予防の方法を提供する。特定の実施形態では、病原体は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）である。１つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えアデノウイルスの投与を含む、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）に対する免疫応答を産生又は促進する方法を提供する。特に、免疫応答を産生又は促進する方法は、配列番号３７に示すRSV抗原をコードする導入遺伝子、例えば１つの実施形態では、配列番号１１のポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む、有効量のChAd155由来アデノウイルスの投与を含む。
１つの実施形態では、本発明は、病原体、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）由来の免疫原性導入遺伝子を含む発現カセットを含む、本発明の組換えアデノウイルス、例えばChAd155由来アデノウイルス、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、免疫原性組成物を提供する。
このようなワクチン又は他の免疫原性組成物は、適切な送達ベヒクル中に製剤化され得る。通常、免疫原性組成物の用量は、下記の「送達方法及び投与量」に記載される範囲である。もしあれば追加免疫の必要性を決定するために、選択された遺伝子の免疫のレベルが測定され得る。血清中の抗体力価の評価の後に、任意選択の追加免疫付与が必要とされ得る。
１つの実施形態では、本発明の組換えChAd155由来アデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物は、RSV F抗原並びにRSV M及びN抗原をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む。より詳細には、導入遺伝子は、RSV FΔTM抗原（膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質）、並びにRSV M2-1（抗転写終結）及びN（ヌクレオカプシド）抗原をコードする。特に、導入遺伝子は、配列番号３７に示されるRSV抗原をコードし、例えば、１つの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１１のポリヌクレオチドを含む。
任意選択で、本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、例えば、アジュバント、安定剤、pH調整剤、保存剤などを含む他の成分を含有するように製剤化されてもよい。適切なアジュバントの例は、下記の「アジュバント」で提供される。このようなアジュバントは、抗原をコードするDNAワクチンのみによるプライミングで生じる免疫応答と比較して、抗原特異的免疫応答を向上させるために、抗原をコードするプライミングDNAワクチンとともに投与され得る。あるいは、このようなアジュバントは、（下記の「投与計画」に記載されるように）本発明のChAd155ベクターが関与する投与計画において投与される、ポリペプチド抗原とともに投与され得る。
組換えアデノウイルスは、免疫原性を示す量、すなわち、ある投与経路において、望ましい標的細胞をトランスフェクトし、選択された遺伝子の十分なレベルの発現を提供して、免疫応答を誘導するために有効な組換えアデノウイルスの量、で投与される。防御免疫がもたらされる場合、組換えアデノウイルスは、感染及び／又は疾患の再発の予防に有用なワクチン組成物であると考えられる。
ヒト又は非ヒト動物に他の病原体に対する免疫を与えるために有用な、本発明のベクターによって発現される免疫原は、例えば、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、菌類、寄生性微生物又は多細胞性寄生生物を含む、又は癌細胞もしくは腫瘍細胞に由来する。例えば、免疫原は、様々なウイルスの科より選択され得る。それに対する免疫応答が望まれるウイルスの科の例は、呼吸器系ウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス（RSV）ならびに他のパラミクソウイルス、例えばヒトメタ肺炎ウイルス、hMPV及びパラインフルエンザウイルス（PIV）等を含む。
RSVによる感染は、完全な防御免疫を付与しない。乳児期の感染の後に、成人期を通して継続する症候性RSV再感染が生じる。これらの再感染は、通常一般的な急性上気道感染として現れるため、診断されないことが一般的である。しかしながら、より脆弱な人々（例えば免疫障害を有する成人又は老人）では、再感染も重度の疾患につながり得る。免疫系の両方のアーム（液性免疫及び細胞性免疫）は重度の疾患からの防御に関わる［Guvenel, 2014］。
液性免疫応答は、ウイルスを中和し、かつウイルスの複製を阻害することができ、それによって下気道RSV感染症及び重度の疾患に対する防御において主要な役割を果たす［Piedra, 2003］。予防的に投与される免疫グロブリンG（IgG）RSV中和モノクローナル抗体（Synagis）の形態の受動免疫は、気管支肺異形成症又は心肺の基礎疾患を有する未成熟な乳児及び新生児において、RSV疾患をある程度防止することが示された［Cardenas, 2005］。
T細胞もRSV疾患の制御に関わっている。重症複合免疫不全症、骨髄及び肺移植のレシピエントの症例等のCD8 T細胞数の少ない患者において、致死的なRSV感染が報告されている［Hertz, 1989］。新生児のRSV感染の致死的な症例の組織病理から、肺浸潤物中のCD8 T細胞が比較的少ないことが示されている［Welliver, 2007］。更に、インターフェロンγ（IFN-γ）を産生するCD8 T細胞の存在が、RSVの動物モデルにおける低いTh2応答及び好酸球増加症の低減と関連していた［Castilow, 2008; Stevens, 2009］。
本明細書に記載する組換えベクターは、ベクターによって発現される挿入された異種抗原性タンパク質に対する細胞傷害性T細胞及び抗体の誘導において非常に有効であることが期待される。
ヒト又は非ヒト動物に免疫を与えるための免疫原として有用なRSVの適切な抗原は、以下：融合タンパク質（F）、付着タンパク質（G）、マトリックスタンパク質（M2）及び核タンパク質（N）より選択され得る。「Fタンパク質」又は「融合タンパク質」又は「Fタンパク質ポリペプチド」又は「融合タンパク質ポリペプチド」という用語は、RSV融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。同様に、「Gタンパク質」又は「Gタンパク質ポリペプチド」という用語は、RSV付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。「Mタンパク質」又は「マトリックスタンパク質」又は「Mタンパク質ポリペプチド」という用語は、RSVマトリックスタンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指し、M2-1（本明細書においてM2.1と表され得る）とM2-2遺伝子産物のいずれか又は両方を含み得る。同様に、「Nタンパク質」又は「ヌクレオカプシドタンパク質」又は「Nタンパク質ポリペプチド」という用語は、RSV核タンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。
ヒトRSV株の２つのグループ、主にG糖タンパク質の抗原性の違いに基づくA及びBグループが記載されている。これまでに多数のRSV株が分離されており、そのいずれも、本明細書において開示される免疫原性複合物の抗原という点で適している。GenBank及び／又はEMBL受入番号によって示される例示的な株は、米国特許出願公開第2010/0203071号（WO2008114149）に見出すことができ、これは、本発明での使用に適したRSV Fタンパク質及びGタンパク質の核酸配列及びポリペプチド配列を開示する目的で、参照により本明細書に組み入れられる。ある実施形態では、RSV Fタンパク質はRSV Fタンパク質の細胞外ドメイン（FΔTM）であり得る。
典型的なMタンパク質及びNタンパク質の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、米国特許出願公開第2014/0141042号（WO2012/089833）に見出すことができ、これは、本発明での使用に適したRSV Mタンパク質及びNタンパク質の核酸配列及びポリペプチド配列を開示する目的で、本明細書に組み入れられる。
適切には、本発明での使用のために、導入遺伝子核酸は、RSV F抗原ならびにRSV M及びN抗原をコードする。より具体的には、核酸は、RSV FΔTM抗原（膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質）、並びにRSV M2-1（抗転写終結）及びN（ヌクレオカプシド）抗原をコードする。
膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質（F0ΔTM）
RSV Fタンパク質は、主要表面抗原であり、標的細胞へのウイルスの融合を仲介する。Fタンパク質は、RSVサブグループ及び株間で高度に保存されている抗原である。Fタンパク質は、予防的RSV中和モノクローナル抗体シナジス（Synagis）を含む中和抗体の標的である。膜貫通領域及び細胞質テールの欠失は、FΔTMタンパク質の分泌を可能にする。このFタンパク質の可溶性形態を認識するシナジス等の中和抗体は、in vitroでRSVの感染性を阻害する［Magro, 2010］。
ヌクレオカプシド(N)タンパク質
Nタンパク質は、RSV株間で高度に保存され、多くのT細胞エピトープの供給源として知られる内部（非露出）抗原である［Townsend, 1984］。Nタンパク質は、RSVゲノムの複製及び転写に必須である。Nタンパク質の主要な機能は、RNA転写、複製及びパッケージングの目的でウイルスゲノムをカプセル化し、リボヌクレアーゼからこれを保護することである。
抗転写終結(M2-1)タンパク質
M2-1タンパク質は、全長メッセンジャーRNA（mRNA）の効率的な合成、並びにセグメント化されていないマイナス鎖のRNAウイルスに特徴的なポリシストロン性リードスルーmRNAの合成のために重要な抗転写終結因子である。M2-1は、RSV株間で高度に保存され、多くのT細胞エピトープの供給源として知られる内部（非露出）抗原である［Townsend, 1984］。
１つの実施形態では、本発明は、RSV FΔTM抗原ならびにRSV M2-1及びN抗原をコードし、RSV FΔTM抗原とRSV M2-1との間に自己切断部位が含まれ、RSV M2-1とN抗原との間にフレキシブルリンカーが含まれる導入遺伝子を含む組換えChAd155ベクターを提供する。1つの実施形態では、適切な導入遺伝子は、配列番号３７によって表されるポリペプチドをコードする。
１つの実施形態では、免疫原はレトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のようなレンチウイルス由来であり得る。このような実施形態では、免疫原はHIV-1又はHIV-2に由来し得る。
HIVゲノムは、多数の異なるタンパク質をコードし、それらの各々は、本発明のベクターによって発現される場合、その全体又は断片として免疫原性であり得る。エンベロープタンパク質は、例えば、gp120、gp41及びEnv前駆体gp160を含む。HIVの非エンベロープタンパク質は、例えばgag及びpol遺伝子の産物などの内部構造タンパク質、ならびにRev、Nef、Vif及びTatなどの他の非構造タンパク質を含む。ある実施形態では、本発明のベクターは、HIV Gagを含む１種以上のポリペプチドをコードする。
Gag遺伝子は、プロテアーゼによって切断され、そのすべてがGagの断片の例である、マトリックスタンパク質（p17）、カプシド（p24）、ヌクレオカプシド（p9）、p6ならびに２つのスペースペプチド、p2及びp1を含む産物を生じる前駆体ポリペプチドとして翻訳される。
Gag遺伝子は、p55とも呼ばれる55キロダルトン（kD）のGag前駆体タンパク質を生じ、それはスプライシングされないウイルスmRNAから発現される。翻訳の間に、p55のN末端はミリストイル化され、それが細胞膜の細胞質側と結合する引き金となる。膜結合Gagポリタンパク質は、他のウイルスタンパク質及び細胞タンパク質とともに2コピーのウイルスゲノムRNAを動員し、これが感染細胞の表面からのウイルス粒子の出芽を引き起こす。出芽後、p55は、ウイルスにコードされるプロテアーゼ（pol遺伝子の産物）によって、ウイルスの成熟過程の間に、MA（マトリックス [p17]）、CA（カプシド[p24]）、NC（ヌクレオカプシド[p9]）、及びp6と呼ばれる４つのより小さいタンパク質に切断され、それらのすべてはGagの断片の例である。１つの実施形態では、本発明のベクターは、配列番号３８のGagポリペプチドを含む。
アジュバント
「アジュバント」は、本明細書において用いられる場合、免疫原への免疫応答を向上させる組成物を指す。このようなアジュバントの例は、無機アジュバント（例えばリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム等の無機金属塩）、有機アジュバント（例えばQS21等のサポニン、又はスクアレン）、オイルベースのアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばIL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、及びINF-γ）粒子状アジュバント（例えば免疫刺激複合体（ISCOMS）、リポソーム、又は生分解性マイクロスフェア）、ビロソーム、細菌性アジュバント（例えば3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）等のモノホスホリルリピドA、又はムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、又は合成リピドA）、合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えば、ポリアルギニン又はポリリジン）ならびに非メチル化CpGジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド（「CpG」）を含むが、それらに限定されない。
１つの適切なアジュバントは、モノホスホリルリピドA（MPL）、特に3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）である。化学的には、それはしばしば、4、5、又は6個のアシル化鎖のいずれかを有する3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物として供給される。それはGB 2122204Bにおいて教示される方法によって精製及び調製することができ、この参照文献はまたジホスホリルリピドA及びその3-O-脱アシル化型の調製も開示する。他の精製リポ多糖類ならびに合成リポ多糖類が開示されている（米国特許第6,005,099号及びEP 0 729 473 B1；Hilgersら、1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6；Hilgersら、1987, Immunology, 60(1):141-6；ならびにEP 0 549 074 B1I）。
サポニンもまた適切なアジュバントである（Lacaille-Dubois, M及びWagner H, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386 (1996)参照）。例えば、サポニンQuil A（南米の樹木シャボンノキ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から得られる）、及びその画分は、米国特許第5,057,540及びKensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12:1-55；ならびにEP 0 362 279 B1に記載される。Quil Aの精製画分はまた、QS21及びQS17等の免疫刺激剤としても知られており；それらの製造方法は、米国特許第5,057,540及びEP 0 362 279 B1に開示されている。またQS7（Quil-Aの非溶血性画分）も、これらの参照文献に記載されている。QS21の使用はKensilら（1991, J. Immunology, 146: 431-437）に更に記載されている。QS21及びポリソルベート又はシクロデキストリンの組合せもまた知られている（WO 99/10008）。QS21及びQS7など、QuilAの画分を含有する粒子状アジュバント系は、WO 96/33739及びWO 96/11711に記載されている。
別のアジュバントは、非メチル化CpGジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド（「CpG」）である（Krieg, Nature 374:546 (1995)）。CpGは、DNA中に存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。CpGは、全身経路と粘膜経路との両方で投与される際のアジュバントとして知られている（WO 96/02555、EP 468520、Davisら、J.Immunol, 1998, 160:870-876；McCluskie 及びDavis, J.Immunol., 1998, 161:4463-6）。CpGは、ワクチン中に製剤化される際、遊離抗原とともに自由溶液中で投与されてもよく（WO 96/02555）、抗原に共有結合的にコンジュゲートされてもよく（WO 98/16247）、又は水酸化アルミニウムなどの担体とともに製剤化されてもよい（Brazolot-Millanら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95:15553-8）。
上述のようなアジュバントは、リポソーム、水中油型エマルション、及び／又は金属塩（水酸化アルミニウムのようなアルミニウム塩を含む）などの担体とともに製剤化され得る。例えば、3D-MPLは、水酸化アルミニウム（EP 0 689 454）又は水中油型エマルション（WO 95/17210）とともに製剤化されてもよく；QS21は、コレステロール含有リポソーム（WO 96/33739）、水中油型エマルション（WO 95/17210）又はミョウバン（WO 98/15287）とともに製剤化されてもよく；CpGは、ミョウバン（Brazolot-Millan、上記）又は他の陽イオン性担体とともに製剤化されてもよい。
アジュバントの組合せ、詳細にはモノホスホリルリピドA及びサポニン誘導体の組合せ（例えば、WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241参照）、より詳細にはWO 94/00153に開示されるようなQS21及び3D-MPLの組合せ、又はWO 96/33739に開示されるようなQS21がコレステロール含有リポソーム中でクエンチされている（quenched）組成物が、本発明において使用され得る。あるいは、QS21などのサポニンを加えたCpGの組合せは、本発明における使用に適したアジュバントである。水中油型エマルション中にQS21、3D-MPL及びトコフェロールを含む強力なアジュバント製剤は、WO 95/17210に記載され、本発明に使用するための別の製剤である。サポニンアジュバントは、リポソーム中に製剤化され、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わされ得る。このように、適切なアジュバント系は、例えば、アルミニウム塩とともにモノホスホリルリピドA、好ましくは3D-MPLの組合せを含む（例えばWO00/23105に記載される）。更なる例示アジュバントは、QS21及び／又はMPL及び／又はCpGを含有する。QS21は、WO 96/33739において開示されるようにコレステロール含有リポソーム中でクエンチされ得る。
他の適切なアジュバントは、WO9850399若しくは米国特許第6,303,347号（AGPの調製方法もまた開示される）において開示されるようなアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）、又は米国特許第6,764,840号において開示されるようなAGPの製薬上許容され得る塩を含む。いくつかのAGPはTLR4作動薬であり、いくつかはTLR4拮抗薬である。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。
ワクチン接種のために使用される発現系に含まれる抗原への不変鎖の融合は、アデノウイルスによって投与された場合、前記抗原に対する免疫応答を増加させることが見出されている（WO 2007/062656、これはUS 2011/0293704として公開されており、不変鎖配列の開示のために参照により組み入れられる）。従って、本発明の１つの実施形態では、免疫原性導入遺伝子は、組換えChAd155ウイルスベクターにおいて不変鎖と共発現され得る。
別の実施形態では、本発明は、被験体にChAd155カプシドを送達することによって、免疫調節効果応答（immunomodulatory effect response）を誘導するための、あるいは別の活性物質に対する細胞傷害性T細胞応答を向上させる又は補助するためのChAd155のカプシドの使用を提供する（任意選択で、インタクトな若しくは組換えウイルス粒子又は空のカプシドが使用される）。ChAd155カプシドは単独で、又は活性物質との併用投与計画において、それに対する免疫応答を向上させるために送達され得る。有利には、宿主にアデノウイルスを感染させることなく、望ましい効果が達成され得る。
投与計画
通常、ChAd155組換えアデノウイルスベクターは、治療用分子又は免疫原性分子（例えばタンパク質等）の送達に用いられる。両方の用途に対して、本発明の組換えアデノウイルスベクターが、組換えアデノウイルスベクターの反復送達を含む投与計画での使用に特によく適していることが容易に理解されるであろう。このような投与計画は通常、ウイルスカプシドが入れ替えられている一連のウイルスベクターの送達を含む。ウイルスカプシドは、引き続く投与のたびに、又は特定の血清型カプシドの事前に選択した回数（例えば、1回、2回、3回、4回若しくはそれ以上）の投与後に変更され得る。従って、投与計画は、第一カプシドを有する組換えアデノウイルスの送達、第二カプシドを有する組換えアデノウイルスによる送達、及び第三カプシドを有する組換えアデノウイルスによる送達を含み得る。本発明のアデノウイルスカプシドを単独で、互いに併用して、又は（好ましくは免疫学的に交差反応しない）他のアデノウイルスと併用して用いる様々な他の投与計画が当業者にとって明白であろう。任意選択で、このような投与計画は、他の非ヒト霊長類アデノウイルスのカプシド、ヒトアデノウイルスのカプシド、又は本明細書に記載されるような人工配列のカプシドを有する組換えアデノウイルスの投与を含み得る。
本発明のアデノウイルスベクターは、複数のアデノウイルスを介した導入遺伝子の送達が望ましい治療計画、例えば、同一の導入遺伝子の再送達を含む投与計画、又は他の導入遺伝子の送達を含む併用投与計画に、特によく適している。このような投与計画は、ChAd155アデノウイルスベクターの投与と、それに続く同一血清型のアデノウイルス由来のベクターによる再投与を含み得る。特に望ましい投与計画は、ChAd155アデノウイルスベクターの投与を含み、その中で、第一投与において送達されるベクターのアデノウイルスカプシド配列の起源が、その後の1回以上の投与において用いられるウイルスベクターのアデノウイルスカプシド配列の起源とは異なる。例えば、治療計画は、ChAd155ベクターの投与、及び同一の又は異なる血清型の1種以上のアデノウイルスベクターによる反復投与を含む。
別の例では、治療計画は、アデノウイルスベクターの投与と、それに続く第一送達アデノウイルスベクターのカプシドの起源とは異なるカプシドを有するChAd155ベクターによる反復投与、及び任意選択で、前の投与ステップのベクターのアデノウイルスカプシドの起源と同一若しくは、好ましくは異なる別のベクターによる更なる投与を含む。これらの投与計画は、同一若しくは異なる治療用分子又は免疫原性分子を送達し得る。これらの投与計画は、ChAd155配列を用いて構築されたアデノウイルスベクターの送達に限定されない。むしろ、これらの投与計画は、ChAd155ベクターと組み合わせて、他の非ヒト霊長類アデノウイルス配列、又はヒトアデノウイルス配列などの他のアデノウイルス配列を含むがそれらに限定されない他のアデノウイルス配列を問題なく利用できる。
更なる例では、治療計画は、（i）１種以上のChAd155アデノウイルスベクター、ならびに（ii）非アデノウイルスベクター、非ウイルスベクター、及び／又は様々な他の治療上有用な化合物若しくは分子、例えば任意選択でアジュバントと同時に投与される抗原タンパク質などの異なる成分、の同時送達（同時投与など）又は連続送達（プライム・ブーストなど）のいずれかを含み得る。これらの計画は、同一若しくは異なる治療用分子又は免疫原性分子を送達し得る。同時投与の例は、同側性（homo-lateral）同時投与及び対側性（contra-lateral）同時投与を含む（下記の「送達方法及び投与量」に更に記載される）。
１種以上のChAd155アデノウイルスベクターを用いる同時送達又は特に連続送達（プライム・ブーストなど）での使用に適切な非アデノウイルスベクターは、１種以上のポックスウイルスベクターを含む。適切には、ポックスウイルスベクターは、コルドポックスウイルス亜科に属し、より適切には、オルソポックス（orthopox）、パラポックス（parapox）、ヤタポックス（yatapox）、アビポックス（avipox）（適切にはカナリア痘（ALVAC）若しくは鶏痘（FPV））及びモルシポックス（molluscipox）からなる群より選択される前記亜科の属に属する。更に適切には、ポックスウイルスベクターは、オルソポックス（orthopox）に属し、ワクシニアウイルス、NYVAC（ワクシニアのコペンハーゲン株に由来する）、改変ワクシニアアンカラ（MVA）、牛痘ウイルス及びサル痘ウイルスからなる群より選択される。最も適切には、ポックスウイルスベクターはMVAである。
「同時」投与は、適切には同じように進行する免疫応答を指す。好ましくは、両成分は同時に投与される（DNAとタンパク質両方の同時投与など）が、一方の成分は数分以内（例えば、同一の診療予約又は診察で）、数時間以内に投与され得る。このような投与もまた、同時投与と呼ばれる。いくつかの実施形態では、同時投与は、アデノウイルスベクター、アジュバント及びタンパク質成分の投与を指し得る。他の実施形態では、同時投与は、アデノウイルスベクター及び別のウイルスベクター、例えば、第二のアデノウイルスベクター又はMVAなどのポックスウイルスの投与を指す。他の実施形態では、同時投与は、アデノウイルスベクター及びタンパク質成分の投与を指し、任意選択でアジュバントが添加される。
別の実施形態では、治療計画は、妊娠した女性への免疫原性組成物の投与と、その後の、出生後、例えば出生後1、2、3、4、5、6、7又は8ヵ月の乳児への更なる免疫原性組成物の投与とを含む。母親への免疫接種の結果として産生される抗体は、胎盤を通過して、胎児に受動免疫をもたらすことができる。１つの実施形態では、母親への免疫接種は組換えタンパク質抗原の投与によるものであり、乳児への免疫接種は本発明の組換えアデノウイルスベクターの投与によるものである。別の実施形態では、母親への免疫接種は本発明の組換えアデノウイルスベクターの投与によるものであり、乳児への免疫接種は組換えタンパク質抗原の投与によるものである。別の実施形態では、母親及び乳児への免疫接種の双方が、本発明の組換えアデノウイルスベクターの投与によるものである。
すなわち、本発明は、乳児、特に妊娠中にRSVに対して免疫された母親から生まれた乳児におけるRSVに対する免疫応答の産生における、本発明の組換えChAd155由来アデノウイルスベクターの使用を提供する。従って、本発明は、乳児における免疫応答の産生のための医薬の製造における、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）由来の免疫原性導入遺伝子を含む組換えChAd155由来アデノウイルスベクターの使用を提供する。望ましくは、特に乳児は、妊娠中にRSVに対して免疫された母親から生まれた乳児である。より詳細には、導入遺伝子は、RSV FΔTM抗原（膜貫通領域及び細胞質領域が欠失した融合(F)タンパク質）、並びにRSV M2-1（抗転写終結）及びN（ヌクレオカプシド）抗原をコードする。特に、導入遺伝子は、配列番号３７に示されるRSV抗原をコードし、例えば、１つの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１１のポリヌクレオチドを含む。
プライム・ブースト投与計画が用いられてもよい。プライム・ブーストとは、同じ個体における２つの個別の免疫応答：（i）免疫系の初回刺激と、それに続く（ii）一次免疫応答が確立した数週間又は数カ月後の免疫系の二次免疫又は追加免疫、を指す。
このような投与計画は、従来の抗原、例えばタンパク質（任意選択でアジュバントとともに同時投与される）、又はこのような抗原をコードする配列を有する組換えウイルス（例えば、WO 00/11140）などによる二次の、追加投与に対する免疫系を刺激するための、組換えChAd155ベクターの投与を含み得る。あるいは、免疫付与計画は、抗原をコードする（ウイルス又はDNAベースのいずれかの）ベクターに対する免疫応答をブーストするための、組換えChAd155ベクターの投与を含み得る。別の選択肢では、免疫付与計画は、タンパク質の投与と、それに続く抗原をコードする組換えChAd155ベクターによる追加免疫を含む。一例では、プライム・ブースト投与計画は、抗原が由来するウイルス、細菌又は他の生物に対する防御免疫応答を提供し得る。別の実施形態では、プライム・ブースト投与計画は、治療が投与されている疾患の存在を検出するための従来のアッセイを用いて測定され得る治療効果を提供する。
好ましくは、ブースト組成物は、プライム組成物を被験体に投与した約2〜約27週間後に投与される。ブースト組成物の投与は、プライムワクチンによって投与されたものと同一の抗原若しくは異なる抗原を含有する又は送達することができる有効量のブースト組成物を用いて達成される。ブースト組成物は、同一のウイルス起源又は別の起源に由来する組換えウイルスベクターで構成され得る。あるいは、ブースト組成物は、プライムワクチンにおいてコードされるものと同一であるが、タンパク質の形態で抗原を含有しており、その組成物が宿主において免疫応答を誘導する組成物であり得る。ブースト組成物の第一の必要条件は、組成物の抗原が、プライム組成物によってコードされるものと同一の抗原、又は交差反応する抗原であるということである。
送達方法及び投与量
ベクターは、製薬上又は生理学的に許容され得る担体、例えば、生理食塩水；等張塩類溶液若しくは当業者にとって明白な他の製剤等に懸濁又は溶解することによって、投与のために調製され得る。適切な担体は当業者にとって明らかであり、主に投与経路によって決まる。本明細書に記載される組成物は、生分解性の生体適合性ポリマーを用いた徐放性製剤で、又はミセル、ゲル及びリポソームを用いた現地送達（on-site delivery）によって、哺乳動物に投与され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、筋肉内注入、膣内注入、静脈内注入、腹腔内注入、皮下注入、経皮投与、皮内投与、鼻腔内投与又は経口投与によって、被験体に投与される。
治療計画が、それぞれ異なる組成物に製剤化される１種以上のChAd155アデノウイルスベクター及び更なる成分の同時投与を含む場合、それらは好ましくは同一部位またはほぼ同じ部位に共に配置されて投与される。例えば、成分は、四肢の同じ側（「同側性」投与）又は四肢の反対側（「対側性」投与）に（例えば、筋肉内、経皮、皮内、皮下より選択される投与経路を介して）投与され得る。
ウイルスベクターの投与量は、主に、治療されている疾患、患者の年齢、体重及び健康状態などの要因によって決まり、従って患者によって異なり得る。例えば、治療上有効な成人又は動物用のウイルスベクターの投与量は、通常、1×105〜1×1015個のウイルス粒子、例えば1×108〜1×1012個の等（例えば、1×108、2.5×108、5×108、1×109、1.5×109、2.5×109、5×109、1×1010、1.5×1010、2.5×1010、5×1010、1×1011、1.5×1011、2.5×1011、5×1011、1×1012個の粒子）を含む。あるいは、ウイルスベクターは、一般的には1×105〜1×1010プラーク形成単位（PFU）、例えば1×105PFU、2.5×105 PFU、5×105 PFU、1×106 PFU、2.5×106 PFU、5×106 PFU、1×107 PFU、2.5×107 PFU、5×107 PFU、1×108 PFU、2.5×108 PFU、5×108 PFU、1×109 PFU、2.5×109 PFU、5×109 PFU、又は1×1010 PFU等の用量で投与され得る。投与量は、動物の大きさ及び投与経路に応じて変わる。例えば、筋肉内注入に対する適切なヒト又は動物用の投与量（約80 kgの動物に対して）は、単一箇所に約1×109〜約5×1012粒子/mLの範囲である。任意選択で、複数箇所の投与が用いられ得る。別の例では、適切なヒト又は動物用の投与量は、経口製剤で約1×1011〜約1×1015個の粒子の範囲であり得る。
ウイルスベクターは、例えば、標準曲線として、HCMVプロモーターを含む発現カセットを有するベクターゲノムを含有しているプラスミドDNAの段階希釈を用いて、CMVプロモーター領域上に設計されたプライマー及びプローブを用いた、定量的PCR分析（Q-PCR）によって定量化され得る。試験サンプル中のコピー数は、平行線分析法（parallel line analysis method）によって決定される。ベクター粒子定量化の別法は、分析的HPLC又はA260 nmに基づく分光光度法であり得る。
免疫学的に有効な核酸の量は、適切には1 ng〜100 mgであり得る。例えば、適切な量は1μg〜100 mgであり得る。特定の核酸（例えば、ベクター）の適切な量は、当業者によって容易に決定され得る。核酸成分の典型的な有効量は、1 ng〜100 μgの間、例えば1 ng〜1μgの間（例えば、100 ng〜1μg）又は1μg〜100μgの間、例えば10 ng、50 ng、100 ng、150 ng、200 ng、250 ng、500 ng、750 ng、又は1μg等であり得る。核酸の有効量はまた、1μg〜500μg、例えば1μg〜200μgの間、例えば10〜100μgの間、例えば1μg、2μg、5μg、10μg、20μg、50μg、75μg、100μg、150μg、又は200μgを含み得る。あるいは、核酸の典型的な有効量は、100μg〜1 mgの間、例えば100 μg〜500 μg、例えば、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg又は1 mgであり得る。
通常、ヒト用量は0.1ml〜2 mlの体積である。従って、本明細書に記載される組成物は、例えば単一又は複合の免疫原性成分あたり0.1、0.15、0.2、0.5、1.0、1.5又は2.0 mlのヒト用量の体積に製剤化され得る。
当業者は、投与経路及び組換えベクターが用いられる治療用途又はワクチン用途に応じて、これらの用量を調整し得る。導入遺伝子の、又はアジュバントのための発現レベル、循環抗体のレベルは、用量投与の頻度を決定するために測定され得る。
１回以上のプライム及び／又はブーストステップが用いられる場合、このステップは、毎時、毎日、毎週若しくは毎月、又は毎年投与される単回投与を含み得る。一例として、哺乳動物は、担体中に約10μg〜約50μgのプラスミドを含有する1回又は２回の投与を受け得る。送達量又は送達部位は、哺乳動物の種類及び状態に基づいて望ましく選択される。
選択された導入遺伝子によってコードされるタンパク質の治療レベル、またはそれに対する免疫応答のレベルは、もしあるとすれば、追加免疫の必要性を決定するために測定され得る。CD8+ T細胞応答の評価、又は任意選択で、血清中の抗体力価の評価に続いて、任意選択の追加免疫付与が要求され得る。任意選択で、組換えChAd155ベクターは、単回投与で、又は様々な併用投与計画、例えば、他の活性成分を含む投与計画若しくは治療過程との併用で、又はプライム・ブースト投与計画で、送達され得る。
本発明は、ここから下記の非限定的な実施例によって更に記載される。
［実施例１］
ChAd155の分離
野生型のチンパンジーアデノウイルス155型（ChAd155）は、アデノウイルスの分離及び解析技術を記載する目的で参照により本明細書に組み入れられるCollocaら(2012)及びWO 2010086189に記載されるような標準的な手法を用いて、ニューイベリア研究センターの施設（ニューイベリア研究センター；ラファイエットのルイジアナ大学）で飼育される健康な若いチンパンジーから分離された。
［実施例２］
ChAd155ベクター構築
その後、ChAd155ウイルスゲノムを、プラスミド又はBACベクターにクローニングし、続いてChAd155ウイルスゲノムの異なる領域に下記の改変：
a）ウイルスゲノムのE1領域（bp 449〜bp 3529）の欠失；
b）ウイルスゲノムのE4領域（bp 34731〜bp 37449）の欠失；
c）ヒトAd5由来のE4orf6の挿入
を有するように改変した（図２）。
2.1：E1領域の欠失：BAC/ChAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana#1375の構築
ChAd155ウイルスDNA 及びサブグループC BAC シャトル（#1365）で同時形質転換したE. coli株BJ5183エレクトロポレーションコンピテント細胞（Stratageneカタログ番号2000154）における相同組換えによって、ChAd155ウイルスゲノムをBACベクターにクローニングした。図３に示されるように、サブグループCシャトルは、pBeloBAC11（GenBank U51113, NEB）に由来し、C種に属するChAdのクローニングに特化したBACベクターであり、従って、pIX遺伝子、及びC種 ChAdウイルスの左右の末端（左右のITRを含む）に由来するDNA断片を含有する。
C種 BAC シャトルはまた、左末端とpIX遺伝子との間に挿入されたRpsL-Kanaカセットを有する。加えて、ISceI 制限酵素認識部位と隣接したAmp-LacZ-SacB選択カセットが、pIX遺伝子とウイルスゲノムの右末端との間に存在する。詳細には、BACシャトルは、以下の特性：左ITR: bp 27〜139、hCMV(tetO) RpsL-Kanaカセット: bp 493〜3396、pIX遺伝子: bp 3508〜3972、ISceI制限酵素認識部位: bp 3990及び7481、Amp-LacZ-SacB選択カセット: bp 4000〜7471、右ITR: bp 7805〜7917を有した。
BJ5183細胞を、精製したChAd155ウイルスDNA及びISceI制限酵素で消化した後ゲルから精製したサブグループC BACシャトルベクターで、エレクトロポレーションによって同時形質転換した。pIX遺伝子及び右ITR配列（C種BACシャトルの線状化されたDNAの末端に存在する）とChAd155ウイルスDNA中に存在する相同配列との間で起こる相同組換えは、BACシャトルベクター内へのChAd155ウイルスゲノムDNAの挿入を引き起こす。同時に、ウイルスのE1領域は欠失し、RpsL-Kanaカセットによって置換されて、BAC/ChAd155 ΔE1/ TetO hCMV RpsL-Kana#1375を生じる。
2.2：E.coli BJ5183での相同組換えによるプラスミド構築
2.2.1：E4領域の欠失-pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana（#1434）の構築
ベクターの増殖を改善するために、クローニング及びE.coliでの相同組換えのいくつかのステップを含む方法を用いて、天然E4領域をAd5 E4orf6コード配列と置換することによって、ヌクレオチド34731〜37449（ChAd155野生型配列）に及ぶE4領域の欠失をベクター骨格に導入した。E4コード領域は完全に欠失しているが、一方E4の天然のプロモーター及びポリアデニル化シグナルは保存された。この目的のために、下記に詳述されるようなE.coli BJ5183 での相同組換えによるChAd155の天然 E4領域の置換によって、Ad5orf6の挿入を可能にするようにシャトルベクターを構築した。
pARS C種 Ad5E4orf6-1の構築
鋳型としてAd5 DNAを用い、オリゴヌクレオチド5’-ATACGGACTAGTGGAGAAGTACTCGCCTACATG-3’（配列番号１３）及び5’-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3’ （配列番号１４）を用いるPCRによって、Ad5orf6を含むDNA断片を得た。PCR断片をBglII及びSpeIで消化し、BglII及びSpeIで消化したC種 RLD-EGFPシャトルにクローニングして、プラスミドpARS C種 Ad5orf6-1を作製した。シャトルに関する詳細は、Collocaら、Sci. Transl. Med. (2012) 4:115raに見ることができる。
pARS C種 Ad5E4orf6-2の構築
E4領域を欠失させるために、鋳型としてプラスミドBAC/ChAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana（#1375）を用い、以下のオリゴヌクレオチド：5’-ATTCAGTGTACAGGCGCGCCAAAGCATGACGCTGTTGATTTGATTC-3’（配列番号１５）及び5’-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3’ （配列番号１６）を用いるPCRによって、ChAd155野生型配列（配列番号１０）のbp 34586〜bp 34730に及ぶ177 bp DNA断片を増幅した。PCR断片をBsrGI及びSpeIで消化し、BsrGI及びSpeIで消化したpARS サブグループC Ad5orf6-1にクローニングして、プラスミドpARS C種 Ad5orf6-2（#1490）を作製した。このシャトルプラスミドの模式図は、図４に示される。詳細には、シャトルプラスミドは、以下の特性：左ITR：bp 1〜113、C種 の最初の460bp：bp 1〜460、ChAd155 wt（配列番号１０のbp 34587〜bp 34724）：bp 516〜650、Ad5 orf6：bp 680〜1561、C種の最後の393 bp：bp 1567〜1969、右ITR：bp 1857〜1969を有した。
pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana（#1434）の構築
得られたプラスミドpARS サブグループC Ad5orf6-2はその後、ChAd155骨格中のE4領域をAd5orf6で置換するために用いられた。この目的のために、プラスミドBAC/ChAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana（#1375）をPacI/PmeIで消化し、消化したプラスミドpARS サブグループC Ad5orf6-2 BsrGI/AscIとともにBJ5183細胞に同時形質転換し、pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana（#1434）プレアデノプラスミドを得た。
2.2.2：RSV発現カセットの挿入‐pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RSVの構築
ワクチン抗原は、米国国立生物工学情報センター（NCBI）データベースから検索された多くの異なるサブグループA RSV分離株のアライメントから得られる計算されたコンセンサス配列である。各抗原について、全ての非同一配列をアライメントしてMultiple Sequence Comparison by Log-Expectation（MUSCLE）, version 3.6を使用し、多数決原理を適用して、タンパク質のコンセンサス配列を得た。ブラスト検索により、Fタンパク質で得られたコンセンサス配列は、天然のアノテートされた変異型：embCAA26143.1とは1アミノ酸のみが異なっていることが見出された。コンセンサスNタンパク質もまた、アノテートされた変異型ID:1494470と1アミノ酸のみが異なっていたが、M2-1タンパク質は変異型P04545と同一であった。最後に、各抗原の配列は、真核細胞における発現のためにコドン最適化され、化学合成され、組み立てられた。図１４及び配列番号３７に示す構築物は、可溶性Fタンパク質FΔTM及び他の2種のRSV抗原の間にアフトウイルス（aphtovirus）口蹄疫ウイルス2A領域（18アミノ酸）を含み、これはリボソーマルスキップとして知られる翻訳効果によるポリプロテインのプロセシングを仲介する［Donnelly, 2001］。哺乳動物細胞へのトランスフェクション後、切断が生じ、可溶性Fタンパク質が細胞培養上清に検出される。融合タンパク質N-M2-1がその代わりに発現され、細胞内画分に検出される。
HCMVプロモーターとBGH polyA配列との間に存在する相同性を利用することによるE.coli内での相同組換えによって、RSVカセットを、線状化したプレアデノアクセプターベクター中にクローニングした。プラスミドpvjTetOhCMV-bghpolyA_RSVをSfiI及びSpeIで切断し、tetO、RSV及びBGHpolyA配列とともにHCMVプロモーターを含む4,65 Kbの断片を切り出した。得られたRSV 4,65 Kb断片を、相同組換えによって、HCMV及びBGHpAの制御下でRpsL-Kana選択カセットを有するpChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana（#1434）アクセプターベクター中にクローニングした。そのアクセプタープレアデノプラスミドを制限エンドヌクレアーゼSnaBIで線状化した。その結果生じた構築物がpChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RSVベクターであった（図５）。
2.3：組換え工学（recombineering）によるBACベクター構築
2.3.1：E4領域の欠失‐BAC/ChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana#1390の構築
E.Coli SW102コンピテント細胞において組換え工学の２つの異なるステップを含む方法を用いて、この天然E4領域をAd5 E4orf6コード配列と置換することによって、ChAd155 wt配列のヌクレオチド34731〜37449に及ぶE4領域の欠失をベクター骨格中に導入した。
第一ステップは、組換え体の正の選択／負の選択の目的で、ChAd155のE4領域に自殺遺伝子SacB、アンピシリン-R遺伝子及びlacZ（Amp-LacZ-SacB選択カセット）を含む選択カセットの挿入を生じた。
第一ステップ‐ChAd155天然E4領域のAmp-LacZ-SacB選択カセットでの置換
相同組換えを可能にするためにE4隣接配列を含む下記のオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって、Amp-LacZ-SacB選択カセットを増幅した。
1021-FW E4 Del Step1 （5’-TTAATAGACACAGTAGCTTAATAGACCCAGTAGTGCAAAGCCCCATTCTAGCTTATAA
CCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3’）（配列番号１７）及び1022-RW E4 Del Step1
（5’-ATATATACTCTCTCGGCACTTGGCCTTTTACACTGCGAAGTGTTGGTGCTGGTGCTGCGTTGAGAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3’）（配列番号１８）
PCR産物を用いて、pAdeno plasmid BAC/ChAd155 (DE1) tetO hCMV - RpsLKana#1375を含有するE.Coli SW102コンピテント細胞を形質転換した。SW102細胞の形質転換は、ラムダ（λ）Red媒介性相同組換えによるChAd155のE4領域への選択カセットの挿入を可能にし、これによってBAC/ChAd155 (DE1) TetOhCMV - RpsL Kana #1379（ChAd155天然E4領域の置換によってAmp-LacZ-SacBカセットを含んでいる）を得た。
第二ステップ‐Amp-LacZ-SacB選択カセットのAd5E4orf6領域での置換
その後、得られたプラスミドBAC/ChAd155 (DE1) TetOhCMV - RpsL Kana #1379（ChAd155E4領域の代わりにAmp-LacZ-SacBカセットを有する）を操作して、ChAd155骨格内でAmp-lacZ-SacB選択カセットをAd5orf6と置換した。この目的のために、オリゴヌクレオチド1025-FW E4 Del Step2（5’-TTAATAGACACAGTAGCTTAATA-3’）（配列番号１９）及び1026-RW E4 Del Step2（5’-GGAAGGGAGTGTCTAGTGTT-3’）（配列番号２０）を用いたPCRによって、Ad5orf6領域を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片を、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155 (DE1) TetOhCMV - RpsL Kana)#1379を含むE. coli SW102コンピテント細胞に導入し、天然ChAd155 E4領域の代わりにAd5orf6を有する最終プラスミドBAC/ChAd155 (ΔE1, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - RpsL Kana#1390が得られた。
2.3.2：RSV発現カセットの挿入‐BAC/ChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6 /TetOhCMV RSV#1393の構築
RpsL-Kana選択カセットと置換することによって、RSV導入遺伝子をBAC/ChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6 /TetOhCMV RpsL Kana#1390ベクターにクローニングした。構築方法は、E.Coli SW102コンピテント細胞における組換え工学の２つの異なるステップを基にした。
第一ステップ‐RpsL-KanaカセットのAmp-LacZ-SacB選択カセットでの置換
オリゴヌクレオチド91-SubMonte FW（5’-CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC-3’）（配列番号２１）及び890-BghPolyA RW（5’-CAGCATGCCTGCTATTGTC-3’）（配列番号２２）を用いたPCRによって、プラスミドBAC/ChAd155 (DE1) TetO hCMV Amp-LacZ-SacB#1342から、Amp-LacZ-SacB選択カセットを得た。その産物を、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155 (DE1, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - RpsL Kana#1390を含むE. coli SW102コンピテント細胞に形質転換し、BAC/ChAd155 (DE1, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - Amp-LacZ-SacB#1386が得られた。
第二ステップ-Amp-LacZ-SacB選択カセットのRSV導入遺伝子での置換
相同組換えによるAmp-lacZ-SacB選択カセットの置換によって、プラスミドBAC/ChAd155 (DE1, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - Amp-LacZ-SacB#1386にRSV導入遺伝子を挿入した。この目的のために、プラスミドpvjTetOhCMV-bghpolyA_RSV#1080（RSV発現カセットを含む）をSpeI及びSfiIで切断して、HCMVプロモーター、RSV及びBGHpolyAを含む4.4 Kbの断片を切り出した。得られたRSV 4.4 Kb断片を、pAdenoプラスミドBAC/ChAd155 (DE1, E4 Adr5E4orf6) TetOhCMV - Amp-LacZ-SacB#1386を含むE. coli SW102コンピテント細胞に形質転換し、最終プラスミドBAC/ChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6 / TetO hCMV RSV#1393が得られた。ChAd155/RSV（配列番号１１）を有するBACの構造は、図６に示される。詳細には、ChAd155/RSVは以下の特性：C種 左ITR：bp 1〜113、hCMV(tetO) bp 467〜1311、RSV遺伝子：bp 1348〜4785、bghpolyA：bp 4815〜5032、Ad5E4orf6：bp 36270〜37151、C種右ITR：bp 37447〜37559を有した。
［実施例３］
ベクター産生
ChAd155の生産性を、Procell 92細胞株においてChAd3及びPanAd3と比較して評価した。
3.1：HIV Gag導入遺伝子を含むベクターの産生
HIV Gagタンパク質を発現するベクターは、上述のように（ChAd155/GAG）又は以前に記載されたように（ChAd3/GAG Collocaら、Sci. Transl. Med. (2012) 4:115ra）調製された。ChAd3/GAG及びChAd155/GAGを、Procell 92中でレスキューし、第三継代（P3）まで増幅し；P3溶解液を用いて、２つのT75フラスコの単層で培養されたProcell 92にそれぞれのベクターを感染させた。両方の感染実験において、100 vp/細胞の感染多重度（MOI）を用いた。十分なCPEが明らかな時に（感染の72時間後）、感染細胞を回収し、プールして；3回の凍結／融解（-70℃/37℃）によって感染細胞からウイルスを放出させ、その後、溶解液を遠心分離によって清澄化した。CMVプロモーター領域に相補的なプライマー及びプローブを用いた定量PCR分析によって、清澄化溶解液を定量化した。そのオリゴヌクレオチド配列は、以下：CMVfor 5’-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3’（配列番号２３）、CMVrev 5’-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’ （配列番号２４）、CMVFAM-TAMRAプローブ5’-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3’ （配列番号２５）（QPCRはABI Prism 7900 Sequence detector - Applied Biosystemで行われた)である。 清澄化溶解液において測定されて得られた体積力価（vp/ml）及び細胞あたりのウイルス粒子（vp/cell）で表される比生産性は、下記の表１に示され、図７において図示される。
Figure 0006983665
HIV Gag導入遺伝子を発現しているChAd155ベクターのより高い生産性を確認するために、接種原として精製されたウイルスを使用することによって、第二の実験を行った。この目的のために、Procell 92細胞をT25フラスコに播種し、細胞のコンフルエンスが約80％である時に、感染のMOI＝100 vp/細胞を用いて、ChAd3/GAG及びChAd155/GAGを感染させた。十分なCPEが明らかな時点で、感染細胞を回収し；凍結／融解によって感染細胞からウイルスを放出させ、遠心分離によって清澄化した。以下のプライマー及びプローブ： CMVfor 5’-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3’（配列番号２３）、CMV rev GACTTGGAAATCCCCGTGAGT（配列番号２４）、CMVプロモーター領域に相補的なCMV FAM-TAMRAプローブ5’-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3’（配列番号２５）（サンプルはABI Prism 7900 Sequence detector- Applied Biosystemsで分析された）を用いた定量PCR分析によって、清澄化溶解液を定量化した。清澄化溶解液において測定して得られた体積力価（vp/ml）及び細胞あたりのウイルス粒子（vp/細胞）で表される比生産性は、下記の表２に示され、図８において図示される。
Figure 0006983665
3.2：RSV導入遺伝子を含むベクターの産生
懸濁培養されたProcell 92.S中でのRSVワクチンベクターの生産性を評価するために、別の一連の実験を行った。実験は、5×105 細胞/mlの細胞密度のProcell 92.Sに感染させることによって、同時にPanAd3/RSV（WO2012/089833に記載される）とChad155/RSVとを比較した。感染3日後に感染細胞を回収し；3回の凍結／融解によって感染細胞からウイルスを放出させ、溶解液を遠心分離によって清澄化した。その後、上記に報告されたような定量PCR分析によって、清澄化溶解液を定量化した。体積生産性及び細胞比生産性は、下記の表３に示され、図９において図示される。
Figure 0006983665
［実施例４］
導入遺伝子発現レベル
4.1：HIV Gag導入遺伝子の発現レベル
HeLa細胞に、HIV Gag導入遺伝子を有するChAd3及びChAd155ベクターを感染させることによる並列実験において、発現レベルを比較した。HeLa細胞を24ウェルプレートに播種して、二連でMOI＝250 vp/cell を用いてChAd3/GAG及びChAd155/GAG精製ウイルスを感染させた。感染48時間後、HeLa感染細胞の上清を回収し、分泌HIV GAGタンパク質の産生を、市販のELISAキット（HIV-1 p24 ELISA Kit, PerkinElmer Life Science）の使用によって定量化した。メーカーの使用説明書に従い、HIV-1 p24抗原標準曲線を用いて、定量化を行った。GAGタンパク質のpg/mlで表された結果は、図１０に図示される。
4.1：RSV F導入遺伝子の発現レベル
HeLa細胞に、RSV F導入遺伝子を含む上述のPanAd3及びChAd155ベクターを感染させることによる並列実験において、発現レベルを比較した。この目的のために、HeLa細胞を６ウェルプレートに播種して、二連でMOI＝500 vp/細胞を用いてPanAd3/RSV及びChAd155/RSV精製ウイルスを感染させた。感染48時間後、上清を回収し、分泌RSV Fタンパク質の産生を、ELISAによって定量化した。市販のマウス抗RSV Fモノクローナル抗体でコートしたマイクロプレートウェルに、５つの異なる希釈の上清を移した。二次抗RSV Fウサギ抗血清、続いてビオチンコンジュゲート抗ウサギIgGを用い、その後、ストレプトアビジン-APコンジュゲート（BD Pharmingen cat. 554065）を添加することによって、捕捉された抗原を示した。RSV Fタンパク質（Sino Biological cat. 11049-V08B）標準曲線を用いて、定量化を行った。RSV Fタンパク質のμg/mlで表される、得られた結果は、下記の表４に示される。
Figure 0006983665
PanAd3 RSVベクターと比較してChAd155 RSVベクターによってもたらされる、より高レベルの導入遺伝子発現を確認するために、ウェスタンブロット解析も行われた。HeLa細胞を6ウェルプレートに播種し、MOI＝250及び500 vp/細胞を用いてPanAd3/RSVならびにChAd155/RSV精製ウイルスを感染させた。HeLa感染細胞の上清を回収し、分泌RSV Fタンパク質の産生を、非還元SDSゲルによって分析し、続いてウェスタンブロット解析を行った。等量の上清を非還元SDSゲルに乗せ；電気泳動分離後、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、抗RSV Fマウスモノクローナル抗体（antibodies-online.com（最終アクセス2015年4月13日）で入手可能なclone RSV-F-3 catalog no: ABIN308230）を用いてプローブとした。一次抗体とともにインキュベートした後、膜を洗浄し、その後、抗マウスHRPコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。最後に、標準的な技術を用いた電気化学発光（ECL検出試薬Pierceカタログ番号W3252282）によって、アッセイを現像した。ウェスタンブロットの結果は、図１１に示される。矢印で示された約170 kDのバンドは、Fタンパク質に対するモノクローナル抗体mAb 13によって示され、それは三量体Fタンパク質の予想分子量に相当する。ChAd155 RSVベクターは、MOI＝250と500vp/細胞の両方でより濃いバンドを生じたことがわかる。
［実施例５］
マウス免疫付与実験による免疫学的有効性の評価
5.1：HIV Gag導入遺伝子を含むベクターの免疫原性
BALB/cマウス（群あたり5匹）において、ChAd3/GAGベクターと並行してChAd155/GAGベクターの免疫原性を評価した。筋肉内に106個のウイルス粒子を注射することによって、実験を行った。免疫付与の3週間後に、BALB/cマウスにおいてマッピングされたGAG CD8+ T細胞エピトープを用いて、ex vivo IFN-γ 酵素結合免疫スポット（ELISpot）によって、T細胞応答を測定した。その結果は、図１２に示され、100万個の脾臓細胞あたりのIFN-γスポット形成細胞（SFC）として表される。それぞれの点は、1匹のマウスでの応答を示し、線はそれぞれの用量群の平均に対応する。注射されたウイルス粒子の用量及びCD8免疫優勢ペプチドに対して陽性のマウスの頻度はx軸に示される。
5.2 RSV導入遺伝子を含むベクターの免疫原性
ワクチン候補ChAd155-RSVの免疫原性を評価するための前臨床研究を近交系BALB/cマウス（5.2.1）で実施した。下部（肺）又は上部（鼻腔組織）呼吸器におけるウイルス負荷量の測定を通して、RSVで鼻内（IN）チャレンジ後のコットンラットでもワクチンの有効性を評価した（5.2.2）。最後に、天然のRSV感染に類似するモデルである血清反応陰性の子ウシでワクチンを試験した（5.2.3）。
5.2.1 近交系マウス
免疫学的効力を評価するために、BALB/cマウス株でChAd155-RSVを試験した。近交系マウスにおける用量漸増試験は、マウスにおけるチンパンジーアデノウイルスベクターの免疫学的効力のランク付けを可能にした標準的なアッセイであり、その結果は、（非ヒト霊長類及びヒト）種間で一貫していることが確認されている［Colloca, 2012］。
BALB/cマウスにおいて、PanAd3/RSV及びChAd155/RSVベクターの免疫学的有効性を評価した。両方のベクターを、108、107及び3×106 vpの用量で筋肉内に注射した。ワクチン接種の3週間後、免疫されたマウスの脾臓細胞を分離し、抗原としてBALB/cマウスにおいてマッピングされた免疫優勢ペプチドF及びMエピトープを用いて、IFN-γ-ELISpotによって分析した。免疫応答のレベルは、投与量の減少に従って（予想される通り）低下したが、免疫応答は、PanAd3/RSVワクチンで免疫されたマウスの同等の群と比較して、ChAd155/RSVベクターで免疫されたマウスの群において明らかに高かった（図１３）。図１３において、記号は個々のマウスのデータを示し、IFN-γスポット形成細胞（SFC）/100万個の脾臓細胞で表され、３つの免疫優勢ペプチド（F51-66 F85-93及びM2-1282-290）に対する応答の和として計算され、バックグラウンドで補正されている。水平な線は、各用量群のIFN-γSFC/100万個の脾臓細胞の平均数を表す。ChAd155-RSVで免疫したマウスでT細胞用量応答が観察され、3×106 vpの低用量でさえも全てのマウスが応答した。PanAd3-RSVは最大用量で同等の応答を誘導したが、ChAd155-RSVは2つのより低い用量でより高い応答を誘導した（図１３）。
第2の試験において、5×108 vpの単回用量のIMにより、BALB/cマウスの1群にChAd155-RSVを投与し、別の群にPanAd3-RSVを投与した。続いてワクチン接種後の第4週から開始して第10週まで2週間毎にマウス（n=5/群）から採血し、抗F抗体の誘導及び維持をモニタリングした。免疫したマウスの血清をプールして、RSV-Fタンパク質を被覆した上で酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）で試験した。図１５は、ワクチン接種後の異なる時点で免疫したマウスから採取してプールした血清でELISAによって測定したRSV F免疫グロブリンG（IgG）力価を示す。プールした血清の連続希釈物をRSV-Fタンパク質をコートしたELISAウェルに入れ、アルカリホスファターゼ（AP）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG及びp-ニトロフェニルホスフェート（pNPP）基質を使用して特異的IgGの結合を検出した。反応は時間をかけて進行させ、固定された時点で405ナノメーター（nm）で読取った。データは、1:100希釈の免疫前の血清の平均値から標準偏差（SD）×3より大きい光学密度（OD）405の読み取り値を与えた血清希釈として算出されるエンドポイント力価として表す。RSV Fタンパク質に対する抗体応答は、ChAd155-RSVによって誘導され、5×108 vpの単回IM投与後10週間にわたって維持され、また抗体力価はPanAd3-RSVによって誘導されるものよりもプラトー部分で1.5倍高かった（図１５）。
5.2.2 コットンラット
方法論
6-8週齢の雌のコットンラットの5つの群（8匹／群）を、5×108又は5×107 vpのChAd155-RSV又はPanAd-RSVで筋肉内（IM）経路で免疫した（表５参照）。対照群にはワクチン接種しなかった。ワクチン接種の7週間後、105 pfuの標準的投与量のRSV A（ロング株）を鼻腔内（IN）接種により動物にチャレンジした。チャレンジ5日後、動物を犠牲にし、ウイルス力価のために鼻腔組織を採取して、また肺全体を回収し、ウイルス力価（左葉）及び組織病理学（右葉、A、D、E群のみ）のために等分した。RSVチャレンジの5日後に回収された鼻腔組織又は肺ホモジネートのRSV力価を、許容細胞（HEp-2細胞）に対する標準的なプラークアッセイによって決定した。FFPE肺切片を、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。肺の炎症の4つのパラメーター：細気管支周囲炎（peribronchiolitis、PB）、血管周囲炎（perivasculitis、PV）、間質性肺炎（IP）、及び肺胞炎（A）、を評価した。スライドを0-4の重症度スケールでスコア付けし、次いで値を0-100％の組織病理学的スコアに変換した。0日目及びチャレンジの時点で、許容細胞（Vero細胞）に対する標準的プラークアッセイによるRSV中和抗体力価のために動物から採血した。中和抗体力価は、ウイルス対照と比較して60％のウイルスが中和される血清希釈の逆数として決定した。
Figure 0006983665
免疫原性及び有効性結果
図１６のパネルA及びBは、プラークアッセイによる鼻腔組織及び肺ホモジネートのRSVウイルス力価をそれぞれ示す。RSVチャレンジの5日後に回収した鼻腔組織又は肺ホモジネートにおけるRSV力価を、許容細胞での標準的なプラークアッセイによって決定した。データは組織1グラム当たりのRSVプラーク形成単位（pfu/g）として表す。双方の用量において、筋肉内ChAd155-RSVは、最小用量の1匹を除いて、肺におけるウイルス複製を完全に阻止した。上気道の感染も、ワクチン接種されていない対照動物と比較して、用量依存的に顕著に低減された（鼻腔組織から回収されたRSV力価よりも1〜2log低い）。
コットンラットでは、1:100以上の血清中和抗体力価が肺におけるウイルス複製に対する防御を付与することが以前に示されている［Prince, 1985］。本試験では、5×108 vpでIM投与された両方のベクターが防御閾値範囲のRSV中和抗体を誘導したが、より低用量のワクチンでは力価が低下した（図１６パネルC）。それにもかかわらず、ワクチン接種によって、血清抗体レベルが1:100以下の場合でも肺におけるウイルス複製が抑制され、他の免疫エフェクターメカニズムのための役割が示唆される。RSV中和抗体力価は、対照と比較して60％までプラークを低下させる血清希釈として表す。
安全性結果
ChAd155-RSVによるワクチン接種がワクチンで増大される病理を誘導するか否かを評価するために、感染5日後に肺の組織病理試験を行った。肺の構造の異なる領域における炎症細胞の存在によって、肺の炎症の4つのパラメーター：細気管支周囲炎（PB、細気管支周囲の炎症細胞浸潤）、血管周囲炎（PV、微小血管周囲の炎症細胞浸潤）、間質性肺炎（IP、肺胞壁の炎症細胞浸潤及び肥厚）、及び肺胞炎（A、肺胞腔内の細胞）を評価した。ホルマリン固定パラフィン包埋肺切片はヘマトキシリン／エオシンで染色した。スライドは0〜4の重症度スケールでブラインドでスコア付けし、次いで値を0〜100％の組織病理学的スコアに変換した。点線（5％に設定）は有意な病理の閾値を表す。PanAd3-RSVの組織病理学データ（グレーで示す）は以前の試験からのものである。4つのパラメーターのうち、肺胞壁（間質性肺炎［IP］）、より重要には肺胞腔（肺胞炎［A］）における炎症性浸潤の存在は、疾患及び肺病理の増大を予測するものと考えられる［Prince, 2001］。肺の組織病理分析の結果（図１６パネルD）から、IM ChAd155-RSVが有意なIP及びA病理スコアを誘導しないことが示された。観察された低レベルのIP及びAは、RSVの急性感染時及び二次的RSV再感染時に観察されたものと一致し［Boukhvalova, 2013］、また以前の試験においてPanAd3-RSVで観察された値と同等であった。
図１６において、水平の点線はパネルA、B及びCにおける各アッセイについての検出限界（LOD）を示す。パネルDにおいて、水平の点線（5％に設定）は顕著な病理についての閾値を示す。
5.2.3 血清反応陰性子ウシ
ウシRSV（bRSV）は、子ウシにおいてヒト乳児で観察されるものと非常に類似した呼吸器疾患を引き起こす。更に、ウシRSVは、ヒトRSVと遺伝子的及び抗原的に関連している。新生子ウシのbRSVモデルは、ヒトRSVワクチンの安全性の評価のための関連する動物モデルである。
方法論
初乳を制限した子ウシ5匹の3つの群に、4週間あけて2回、5×1010vpのChAd155-RSV又は比較対照のPanAd3-RSVで表６に示すようにワクチン接種した。
Figure 0006983665
C群は無関係の抗原を含むPanAd3アデノベクターでモックワクチン接種した。2回目のワクチン接種の4週間後に、104pfuのbRSVスヌーク株のIN（10mL）及び気管内（IT）（10mL）投与によって動物にチャレンジした。感染6日後、肺及び鼻内でウイルス複製がピークに達して最大の肺病理が生じた時点で動物を犠牲にした。このモデルでは、チャレンジ接種物のIN/IT投与経路のために、チャレンジされた対照動物では、あったとしても非常にわずかな臨床徴候しか観察されなかった。従って、bRSVチャレンジに対するワクチン接種の効果を、bRSVの鼻咽頭への排出、肺ホモジネート中のbRSVレベルの分析、肉眼的な肺病変の進行及び気管支肺胞洗浄液（BAL）中の白血球の分析によって調べた。ワクチン接種及び／又はチャレンジ後に誘導される抗体応答（抗体及び中和力価）も検討した。
免疫原性結果
bRSV-特異的血清IgGの誘導に対するワクチン接種の効果
ワクチン接種経過中の平均bRSV-特異的血清IgG抗体及びヒトRSV（hRSV）中和力価の速度論を試験群毎に図１７に示す。グラフは、各試験群の幾何平均値を示す。bRSV-特異的IgGのレベルは、抗原としてbRSV（スヌーク株）感染胎児ウシ腎（FCK）細胞溶解物を使用して決定した（Taylor, 1995）。モック感染FCK細胞の溶解物を対照抗原として使用した。
RSV免疫原を投与された各群の5匹中2匹は、ワクチン接種開始時に低レベルの母親由来bRSV-特異的抗体を示した。それにもかかわらず、全ての動物がワクチンに対して反応し、ブースト後にbRSV-特異的抗体が高レベル（log10＝3-3.5）に達した（図１７Ａ）。対照群の全ての子ウシはワクチン接種開始時に検出可能なbRSV-特異的抗体を有していたが、試験中に低下し、チャレンジ日には検出できなかった。結論として、PanAd3-RSV及びChAd155-RSVは抗体応答を誘発する上で類似の効力を示した。
ワクチン接種前にはhRSV中和応答は検出できなかった。単回投与後に、PanAd3-RSVでワクチン接種された全ての動物、及びChAd155-RSVでワクチン接種された5匹中2匹の動物が、測定可能なRSV中和抗体を有していた（図１７Ｂ）。双方のワクチンについて、2回目の投与後に顕著なブーストが観察された。チャレンジ1週間後にはhRSV中和応答の更なる増大は観察されなかった。
有効性結果
bRSVの鼻咽頭排出に対するワクチン接種の効果
bRSVチャレンジの後、鼻咽頭スワブを毎日取得し、サンプルのbRSV力価を測定した。図１８に示すように、対照群での力価は3日目から6日目まで上昇した。bRSVの複製は、アデノベクターRSV構築物のいずれかを投与された子ウシで顕著に減少しているようであった。
下気道におけるbRSVの複製に対するワクチン接種の効果
bRSVチャレンジの6日後、全ての対照子ウシの肺洗浄細胞（LWC）及び肺葉ホモジネート中（RA、RC及びLC）に、また6匹の対照子ウシ中5匹の気管剥離（TSc）サンプルから、高力価のbRSVが検出された（図１９）。対照的に、ChAd155-RSVを投与した子ウシの2個のTScサンプル及び1個のLWCから、低力価でbRSVが検出され、PanAd3-RSVを投与した子ウシからの全てのサンプルでは検出されなかった。
肺病理に対するワクチン接種の効果
bRSVチャレンジの6日後、6匹の対照子ウシ中6匹で、広範に及ぶ肉眼的な肺の硬化（consolidation）が観察された（図２０）。対照的に、いずれかのアデノベクターRSV構築物を投与された子ウシでは、肉眼的な肺の硬化はほとんど又は全く見られなかった。図２１は、bRSVチャレンジの6日後のBAL中のリンパ球（L）、マクロファージ（Mo）、多形核白血球（PMN）及び好酸球（Eo）の平均割合±SDを定量化している。対照子ウシからのBAL中の細胞のおよそ70％はPMNであった。ChAd155-RSV又はPanAd3-RSVを投与した子ウシからのBAL中ではより低い割合のPMNが見られ、肺の炎症が低減していることが示される。重要なことに、ChAd155-RSV又はPanAd3-RSVを投与した子ウシの肺では好酸球がほとんどないか又は検出できず、ワクチン誘導性の疾患の増悪がないことが示唆された。
結論
総合すると、上記に報告された結果は、ChAd155がChAd3及びPanAd3ベクターと比較して改善されたアデノウイルスベクターであることを実証した。ChAd155は、より生産性が高く、従って、製造過程を容易にし、in vitroでより高レベルの導入遺伝子の発現を可能にし、また、in vivoにおいて動物モデルで発現される抗原に対して、より強力なT細胞応答及び少なくとも強力な抗体応答をもたらすことが示された。防御免疫は、ワクチンで誘導される肺病理の増大の徴候を示すことなく達成される。
参考文献
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配列の記載
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Claims (11)

  1. (a)チンパンジーアデノウイルスChAd155のE1及びE4領域を欠失し、かつ
    (b)ヒトアデノウイルスAd5のE4orf6が挿入された
    組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155であって、該組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155が異種タンパク質をコードする核酸配列を更に含み、該核酸配列が、宿主細胞中での該異種タンパク質の発現を指令する１以上の配列に機能的に連結しており、該異種タンパク質がウイルスに由来する抗原性タンパク質又はその断片であり、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の融合タンパク質（F）、付着タンパク質（G）、マトリックスタンパク質（M2）及び核タンパク質（N）から選択される、上記組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155。
  2. 請求項１記載の組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155ベクター、及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
  3. 異種タンパク質をコードする核酸配列が、RSV FΔTM抗原、RSV M2-1抗原及びN抗原をコードする、請求項１記載の組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155。
  4. 異種タンパク質をコードする核酸配列が配列番号３７の配列をコードする、請求項１又は３記載の組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155。
  5. 組換えアデノウイルスが複製能を有さない、請求項１、３及び４のいずれか１項記載の組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155。
  6. アデノウイルスが哺乳動物細胞に感染することができる、請求項１、３、４及び５のいずれか１項記載の組換えチンパンジーアデノウイルスChAd155。
  7. 無機アジュバント（例えばリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム等の無機金属塩）、有機アジュバント（例えばQS21等のサポニン又はスクアレン）、オイルベースのアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばIL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS、及びINF-γ）、粒子状アジュバント（例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、リポソーム、又は生分解性マイクロスフェア）、ビロソーム、細菌性アジュバント（例えば3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)等のモノホスホリルリピドA、又はムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体、又は合成リピドA）、合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えばポリアルギニン又はポリリジン）及び非メチル化CpGジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド（「CpG」）からなるリストから選択されるアジュバントを含む、請求項２記載の組成物。
  8. アジュバントが3D-MPL及び／又はQS21である、請求項７記載の組成物。
  9. 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染の治療又は予防における使用のための、請求項１、３、４及び５のいずれか１項記載の組換えチンパンジーベクターChAd155、又は請求項２、７及び８のいずれか１項記載の組成物。
  10. RSV感染によって引き起こされる疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか１項記載の組換えチンパンジーベクターChAd155又は組成物の使用。
  11. 配列番号１１の配列を含むか該配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
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