BRPI0608798A2 - vetor de adenovìrus, composição imunogênica, uso de um vetor de adenovìrus, método para preparar um vetor, uso de um vetor de vìrus e um carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, e, proteìna de fusão - Google Patents

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Abstract

VETOR DE ADENOVìRUS, COMPOSIçãO JMUNOGêNICA, USO DE UM VETOR DE ADENO VìRUS, METODO PARA PREPARAR UM VETOR, USO DE UM VETOR DE VìRUS E UM CARREADOR OU ADJUVANTE FARMACEUTICAMENTE ACEITáVEL, E, PROTEIINA DE FUSãO. A presente invenção se refere a vetores de vírus compreendendo oligonucleotídeos codificando polipeptídeos de HIV, mais particularmente em que o vetor de vírus é um adenovírus. Em particular, tais adenovírus são adenovírus de primata não humano tal como adenovírus de símio, mais particularmente adenovírus de chimpanzé. Em particular a invenção se refere a vetores de adenovírus que compreendem seqúências de polinucleotídeos de HIV que codificam múltiplos diferentes antígeno de 111V, por exemplo dois ou três ou mais antígenos de HIV. A invenção se refere adicionalmente a métodos de preparar os vetores de vírus, aos vetores de vírus produzidos pelos métodos e ao uso dos vetores em medicina especialmente vacinação profilática ou terapêutica.

Description

UDENOVÍRUS, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, USO DEDE ADENOVÍRUS, MÉTODO PARA PREPARAR UMDE UM VETOR DE VÍRUS E UM CARREADOR OUADJUVANTE FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL, E, PROTEÍNADE FUSÃO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a vetores de víruscompreendendo oligonucleotídeos codificando polipeptídeos de HTV, maisparticularmente caracterizado pelo fato de que o vetor de vírus é umadenovírus. Em particular, tais adenovírus são adenovírus de primata nãohumano tal como adenovírus de símio, mais particularmente adenovírus dechimpanzé. Em particular a invenção se refere a vetores de adenovírus quecompreendem seqüências de polinucleotídeos de HIV que codificammúltiplos diferentes antígeno de HTV, por exemplo dois ou três ou maisantígenos de HIV. A invenção se refere adicionalmente a métodos de prepararos vetores de vírus, aos vetores de vírus produzidos pelos métodos e ao usodos vetores em medicina especialmente vacinação profilática ou terapêutica.
HIV-I é a causa primária da síndrome de imunodeficiênciaadquirida (AIDS) que é considerada como um dos principais problemas desaúde do mundo. Embora pesquisa extensiva tenha sido conduzida ao longode todo o mundo, esforços para produzir uma vacina até agora não foram bemsucedidos.
HIV-I é um vírus de RNA da família Retroviridiae. O genomade HTV codifica pelo menos nove proteínas que são divididas em três classes:as proteínas estruturais principais Gag, Pol e Env, as proteínas reguladorasTat e Rev, e as proteínas acessórias Vpu, Vpr, Vif e Nef. O genoma de HIVexibe a organização 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' de todos os retro vírus.
Adenovírus é um vírus de DNA de dupla fita com um tamanhode genoma de cerca de 36 kb, que foi amplamente usado para aplicações detransferência gênica devido a sua capacidade de atingir transferência gênicaaltamente eficiente em uma variedade de tecidos alvo e grande capacidade detransgene. Convencionalmente, genes El de adenovírus são deletados esubstituídos por uma gaveta de transgene consistindo do promotor de escolha,seqüência de cDNA do gene de interesse e um sinal poliA, resultando em umvírus recombinante defectivo para replicação.
Adenovírus têm uma morfologia característica com umcapsídeo icosaédrico consistindo de três proteínas principais, hexon (II), basede penton (III) e uma fibra que se projeta (IV), junto com diversas outrasproteínas secundárias, VI, VIII, IX, IIla e IVa2 (Russell W.C. 2000, GenVirol, 81:2573-2604). O genoma de vírus é um DNA linear, de dupla fita comuma proteína terminal acoplada covalentemente aos términos 5', que têmrepetições terminais invertidas (ITRs). O DNA de vírus é intimamenteassociado com a proteína altamente básica VII e um peptídeo pequenodenominado mu. Outra proteína, V, é empacotada com este complexo DNA-proteína e fornece uma ligação estrutural para o capsídeo através de proteínaVI. O vírus também contém uma protease codificada por vírus, que énecessária para processamento de algumas das proteínas estruturais paraproduzir vírus infeccioso maduro.
Foram isolados mais de 100 sorotipos distintos de adenovírusque infectam várias espécies de mamíferos, 51 dos quais são de origemhumana. Exemplos de tais adenovírus de origem humana são Adi, Ad2, Ad4,Ad5, Ad6, Adl 1, Ad 24, Ad34, Ad35. Os sorotipos humanos foramcategorizados em seis subgêneros (A-F) baseado em diversos critériosbiológicos, químicos, imunológicos e estruturais, [página 1, W004018627]
Embora vetores baseados em Ad5 tenham sido extensivamenteusados em diversos testes de terapia gênica, pode haver limitações ao uso deAd5 e outros vetores adenovirais de grupo C devido à imunidade pre-existente na população geral devido à infecção natural. Ad5 e outros membrosdo grupo C tendem a estar entre os sorotipos mais soroprevalentes. Imunidadepara vetores existentes pode se desenvolver como um resultado de exposiçãoao vetor durante tratamento. Estes tipos de imunidades pré-existentes oudesenvolvidas para vetores soroprevalentes podem limitar a efetividade deterapia gênica ou esforços de vacinação. Sorotipos alternativos de adenovírus,assim constituem alvos muito importantes na busca de sistemas detransferência gênica capazes de evadir a resposta imune do hospedeiro.
Uma tal área de sorotipos alternativos são aqueles de primatasnão humanos, especialmente adenovírus de chimpanzé. Veja Patente NorteAmericana 6.083.716 que descreve o genoma de dois adenovírus dechimpanzé.
Foi mostrado que vetores adenovirais de chimpanzé ("Pan" ou"C") induzem fortes respostas imunes a produtos de transgene tãoeficientemente como vetores adenovirais humanos (Fitzgerald et al. J.Immunol. 170:1416).
Proteínas Tat e Nef de HIV são proteínas primitivas, isto é,elas são expressas desde o início em infecção e na ausência de proteínaestrutural.
O gene Nef codifica uma proteína acessória primitiva de HIVque foi mostrado possuir diversas atividades. Por exemplo, a proteína Nef éconhecida por causar a remoção de CD4, o receptor de HIV, da superfíciecelular, embora a importância biológica desta função seja debatida.Adicionalmente Nef interage com a via de sinalização de células T e induzum estado ativo, o que por sua vez pode promover expressão gênica maiseficiente. Alguns isolados de H3V têm mutações nesta região, que faz comque eles não codifiquem proteína funcional e são severamente comprometidosem sua replicação e patogênese in vivo.
O gene Gag é traduzido a partir do RNA de comprimentocompleto para produzir uma poliproteína precursora que é subseqüentementeclivada em proteínas de capsídeo 3 - 5; a proteína de matriz, proteína decapsídeo e proteína de ligação a ácido nucléico e protease. (FundamentalVirology, Fields BN, Knipe DM and Howley M 1996 2. Fields Virology vol 21996).
O gene Gag origina a proteína precursora de Gag de 55quilodaltons (kD), também chamada p55, que é expressa a partir do mRNAviral não processado. Durante tradução, o término N de p55 é miristoilado,desencadeando sua associação com o aspecto citoplasmático de membranascelulares. A poliproteína de Gag associada à membrana recruta duas cópias doRNA genômico viral junto com outras proteínas virais e celulares quedesencadeiam o brotamento da partícula viral da superfície de uma célulainfectada. Depois de brotamento, p55 é clivado pela protease codificadaviralmente (um produto do gene Pol) durante o processo de maturação viralem quatro proteínas menores designadas MA ([pl7] de matriz), CA ([p24] decapsídeo), NC ([p9] de nucleocapsídeo), e p6.(4).
Em adição às 3 proteínas Gag principais (pl7, p24 e p9), todosos precursores de Gag contêm diversas outras regiões, que são clivadas fora epermanecem no virion como peptídeos de vários tamanhos. Estas proteínastêm diferentes papéis e.g. a proteína p2 tem um papel proposto na regulaçãode atividade da protease e contribui para a temporização correta deprocessamento proteolítico.
O polipeptídeo MA é derivado da extremidade N terminal,miristoilada de p55. A maioria das moléculas de MA permanece acoplada àsuperfície interior da bicamada lipídica de virion, estabilizando a partícula.Um subconjunto de MA é recrutado dentro das camadas mais profundas dovirion onde ele se torna parte do complexo que escolta o DNA viral para onúcleo. Estas moléculas de MA facilitam o transporte nuclear do genoma viralpois um sinal cariofílico em MA é reconhecido pelo maquinário deimportação nuclear das células. Este fenômeno permite que HtV infectecélulas que não estão em divisão, uma propriedade incomum para umretrovírus.
A proteína p24 (CA) forma o núcleo cônico de partículasvirais. Foi demonstrado que ciclofilina A interage com a região p24 de p55levando a sua incorporação em partículas de HTV. A interação entre Gag eciclofilina A é essencial pois a ruptura desta interação por ciclosporina Ainibe replicação viral.
A região NC de Gag é responsável por reconhecerespecificamente o assim chamado sinal de empacotamento de HTV. O sinal deempacotamento consiste de quatro estruturas em forma de grampo localizadasperto da extremidade 5' do RNA viral, e é suficiente para mediar aincorporação de um RNA heterólogo em virions de HIV-1. NC se liga aosinal de empacotamento através de interações mediadas por dois motivos dededo de zinco. NC também facilita transcrição reversa.
A região de polipeptídeo p6 media interações entre p55 Gag ea proteína acessória Vpr5 levando à incorporação de Vpr em virions demontagem. A região p6 também contém um assim chamado domínio tardioque é requerido para a liberação eficiente de virions de brotamento de umacélula infectada.
O gene Pol codifica três proteínas tendo as atividadesnecessárias para o vírus em infecção primária, transcriptase reversa RT,protease, e a proteína integrase necessárias para integração de DNA viral emDNA celular. O produto primário de Pol é clivado pela protease de virion paraproduzir o peptídeo amino terminal RT que contém atividades necessáriaspara síntese de DNA (DNA polimerase dirigida por RNA e DNA,ribonuclease H) e proteína integrase carboxi terminal. RT de HIV é umheterodímero de RT de comprimento completo (p66) e um produto declivagem (p51) carecendo do domínio de Rnase integrase carboxi terminal.
RT é uma das proteínas mais altamente conservadascodificadas pelo genoma retroviral. Duas principais atividades de RT são aDNA Pol e Ribonuclease Η. A atividade de DNA Pol de RT usa RNA e DNAcomo modelos permutavelmente e como todas as DNA polimerasesconhecidas é incapaz de iniciar síntese de novo de DNA5 mas requer umamolécula pré-existente para servir como um iniciador (RNA).
A atividade de Rnase H inerente em todas as proteínas RTdesempenha o papel essencial primitivo em replicação de remover o genomaRNA à medida que síntese de DNA progride. Ela degrada seletivamente oRNA de todas as moléculas híbridas de RNA - DNA. Estruturalmente apolimerase e ribo H ocupam domínios separados, não sobrepostos dentro daPol cobrindo os dois terços amino da Pol.
A subunidade catalítica p66 é dobrada em 5 subdomíniosdistintos. O 23 amino terminais destes têm a porção com atividade de RT.Carboxi terminal a estes é o domínio de Rnase H.
Depois de infecção da célula hospedeira, o genoma de RNAretroviral é copiado em ds DNA linear pela transcriptase reversa que estápresente na partícula infectante. A integrase (revisto em Skalka AM '99 Advin Virus Res 52 271-273) reconhece as extremidades do DNA viral, asprepara e acompanha o DNA viral até um sítio cromossômico hospedeiro paracatalisar integração. Muitos sítios no DNA hospedeiro podem ser alvos paraintegração. Embora a integrase seja suficiente para catalisar integração invitro, ela não é a única proteína associada com o DNA viral in vivo - Ogrande complexo de proteína-DNA viral isolado das células infectadas foiestipulado o complexo de pré-integração. Isto facilita a aquisição dos genes dacélula hospedeira pelos genomas virais de progênie.
A integrase é constituída de 3 domínios distintos, o domínio Nterminal, o centro catalítico e o domínio C terminal. O domínio de centrocatalítico contém todos os requerimentos para a química de transferência depolinucleotidil.
Vetores de vírus e particularmente vetores de adenovíruscontendo múltiplos genes exógenos nem sempre são fáceis de produzir.Podem existir problemas com a estabilidade dos vetores, e dificuldades emobter expressão efetiva dos genes inseridos. Em particular, adenovíruscontendo mais do que um ou mais do que dois polinucleotídeos de HIV quepodem ser usados em uma vacina não foram produzidos com sucesso.
Adenovírus de primata não humano podem ser isolados doslinfonodos mesentéricos de chimpanzés. Adenovírus de chimpanzé sãosuficientemente similares a adenovírus humanos subtipo C para permitirreplicação de vírus com El deletado em células HEK 293. Ainda adenovírusde chimpanzé são filogeneticamente distintos dos sorotipos humanos maiscomuns (Ad2 e Ad5). Pan 6 é menos intimamente relacionado a e ésorologicamente distinto de Pan 5, 7 e 9.
Existem certas restrições de tamanho associadas com inserçãode DNA heterólogo em adenovírus. Adenovírus humanos têm a capacidade deempacotar até 105% ou o comprimento de genoma tipo selvagem (Bett et al1993, J Virol 67 (10), 5911-21). O limite inferior de empacotamento paraadenovírus humanos foi mostrado ser 75% do comprimento do genoma detipo selvagem (Parks et al 1995, J Virol 71(4), 3293-8).
Ainda existe uma necessidade de encontrar uma vacina efetivacontra HIV.
A presente invenção fornece um vetor de adenovírus deletadoem uma ou mais regiões, cujo vetor compreende um polinucleotídeo oupolinucleotídeos codificando pelo menos três antígenos de HIV ou derivadosimunogênicos ou fragmentos imunogênicos destes caracterizado pelo fato deque o vetor é capaz de expressar os antígenos ou fragmentos ou derivados emum hospedeiro mamífero e caracterizado pelo fato de que o tamanho dadeleção e o tamanho do polinucleotídeo ou polinucleotídeos de HIV são deforma que o comprimento geral do genoma do vetor é entre 85 e 105% docomprimento do genoma de vírus tipo selvagem.Em uma forma de realização da presente invenção osantígenos de HIV codificados pelo polinucleotídeo ou polinucleotídeospodem ser Gag, Nef e Pol. Em uma forma de realização adicional, Pol podecompreender a porção de RT apenas. Em ainda outra forma de realização dainvenção o polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificando os antígenos deHTV podem ser arranjados de forma que eles sejam transcritos na ordem Gag,RT, Nef, i.e. de forma que a porção Gag esteja na extremidade N terminal daproteína de fusão resultante.
O tamanho do genoma de vetor geral pode ser por exemplo de90 a 100% do tamanho do genoma de vírus tipo selvagem, ou de 95 a 100%do tamanho do genoma tipo selvagem. Em uma forma de realização otamanho geral do vetor pode ser cerca de 96% do tamanho do genoma devírus tipo selvagem.
Antígenos de HIV particulares para inclusão nos vetores deadenovírus de acordo com a invenção são Pol, Nef e Gag ou derivadosimunogênicos ou fragmentos imunogênicos destes.
Tais vetores de adenovírus podem ser formulados comexcipiente, carreadores, diluentes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveispara produzir composições imunogênicas incluindo composiçõesfarmacêuticas ou de vacinas adequadas para o tratamento e/ou profilaxia deinfecção por HIV e AIDS.
De uso na presente invenção são adenovírus que são distintosde sorotipos prevalentes naturalmente ocorrentes na população humana talcomo Ad2 e Ad5. Isto evita a indução de respostas imunes potentes contra ovetor que limita a eficácia de administrações subseqüentes do mesmo sorotipobloqueando absorção de vetor através de anticorpo neutralizante einfluenciando toxicidade.
Assim, o adenovírus pode ser um adenovírus que não é umsorotipo de vírus humano prevalente naturalmente ocorrente. Adenovírusisolados de animais têm componentes imunologicamente distintos decapsídeo, hexon, penton e fibra mas são filogeneticamente intimamenterelacionados. Especificamente, o vírus pode ser um adenovírus não humano,tal como um adenovírus de símio e em particular um adenovírus dechimpanzé tal como Pan 5, 6, 7 ou 9. Exemplos de tais linhagens são descritosem W003/000283 e são disponíveis a partir da American Type CultureCollection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, eoutras fontes. Linhagens desejáveis de adenovírus de chimpanzé são Pan 5[ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592], e Pan 7 [ATCC VR-593]. Outrosadenovírus adequados incluem, sem limitação, adenovírus de chimpanzé CleC68 (Pan9), descritos em Patente Norte Americana No. 6.083.716; eadenovírus de símio incluindo, sem limitação SVl [VR-195]; SV25 [SV-201]; SV35; SV15; SV-34; SV-36; SV-37, e adenovírus de babuíno [VR-275], entre outros. As seqüências de Pan 5 (também denominado C5), Pan 6(também denominado C6), Pan 7 (também denominado C7), SV1, SV25, eSV39 foram descritas [WO 03/046124, publicada em 5 de Junho de 2003].Veja, também, Publicação de Patente Internacional No. WO 04/16614, quedescreve vetores de adenovírus híbridos e vetores construídos a partir deadenovírus de símio SAl8.
Acredita-se que adenovírus de chimpanzé sejam maisvantajosos do que sorotipos humanos de adenovírus pois a ausência deimunidade pré-existente, em particular a ausência de anticorpos deneutralização cruzada, para adenovírus na população alvo. Reação cruzada doadenovírus de chimpanzé com respostas pré-existentes de anticorposneutralizantes estão presentes apenas em 2% da população alvo comparadocom 35% no caso de certos vetores de adenovírus humanos candidatos. Osadenovírus de chimpanzé são distintos dos subtipos humanos mais comunsAd2 e Ad5, mas são mais intimamente relacionados a Ad4 humano desubgrupo E, que não é um subtipo prevalente. Pan 6 é menos intimamenterelacionado à Pan 5, 7 e 9.
O adenovírus da invenção pode ser defectivo para replicação.Isto significa que ele tem uma capacidade reduzida de replicar em células nãocomplementares, comparado com o vírus tipo selvagem. Isto pode ser causadopor mutação do vírus e.g. deletando um gene envolvido em replicação, porexemplo deleção do gene El a, El b, E3 ou E4.
Os vetores de adenovírus em conformidade com a presenteinvenção podem ser adenovírus defectivos para replicação compreendendouma deleção funcional de El. Assim os vetores de adenovírus de acordo com ainvenção pode ser defectivos para replicação devido à ausência da capacidadede expressar Ela e Elb adenoviral, i.e., tem funcionalmente Ela e Elbdeletados. O adenovírus recombinante também pode portar deleçõesfuncionais em outros genes [veja WO 03/000283] por exemplo, deleções emgenes E3 ou E4. O gene E3 primitivo atrasado de adenovírus pode sereliminado da seqüência de adenovírus de símio que forma parte do vírusrecombinante. A função de E3 não é necessária para a produção da partículade adenovírus recombinante. Assim, é desnecessário substituir a função desteproduto de gene a fim de empacotar um adenovírus recombinante de símioútil na invenção. Em uma forma de realização particular os adenovírusrecombinantes (de símio) têm genes El e E3 funcionalmente deletados. Aconstrução de tais vetores é descrita em Roy et ai., Human Gene Therapy15:519-530,2004.
Adenovírus recombinante também podem ser construídostendo uma deleção funcional do gene E4, embora possa ser desejável reter afunção de E4 ORF6. Vetores de adenovírus de acordo com a invençãotambém podem conter uma deleção no gene precoce de expressão tardia E2a.Deleções também podem ser feitas em qualquer dos genes tardios Ll até L5do genoma de adenovírus de símio. Similarmente deleções nos genesintermediários IX e IVa podem ser úteis.Outras deleções podem ser feitas em outros genes estruturaisou não estruturais de adenovírus. As deleções acima pode ser usadasindividualmente, i.e. uma seqüência de adenovírus para uso na presenteinvenção pode conter deleções de El apenas. Alternativamente, deleções degenes inteiros ou porções destes efetivas para destruir sua atividade biológicapodem ser usadas em qualquer combinação. Por exemplo em um vetorexemplar, as seqüências de adenovírus podem ter deleções dos genes El e dogene E4, ou dos genes El, E2a e E3, ou dos genes El e E3 (tal como deleçõesfuncionais em Eta e Elb, e a deleção de pelo menos parte de E3), ou dos genesEl, E2a e E4, com ou sem deleção de E3 e assim por diante. Tais deleçõespodem ser deleções parciais ou completas destes genes e podem ser usadasem combinação com outras mutações, tal como mutações sensíveis àtemperatura para atingir um resultado desejado.
Os vetores adenovirais podem ser produzidos em qualquerlinhagem celular adequada na qual o vírus é capaz de replicação. Emparticular, linhagens celulares complementares que fornecem os fatoresfaltando no vetor de vírus que resultam em suas características de replicaçãoprejudicada podem ser usadas. Por exemplo, uma linhagem celularcomplementar pode expressar El, ou El e E3, ou El, E3 e E4. Sem limitação,uma tal linhagem celular pode ser HeLa [No. de Acesso ATCC CCL 2], A549[No. de Acesso ATCC CCL 185], células HEK 293, KB [CCL 17], Detroit[e.g., Detroit 510, CCL 72] e WI-38 [CCL 75], entre outras. Estas linhagenscelulares estão todas disponíveis a partir da American Type CultureCollection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209.Outras linhagens de células parentais adequadas podem ser obtidas de outrasfontes, tal como células de PER.C6©, como representado pelas célulasdepositadas em ECACC no. 96022940 na European Collection of AnimalCell Cultures (ECACC) no Centre for Applied Microbiology and Research(CAMR, UK).A invenção fornece em outro aspecto um vetor de adenovíruscompreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificando pelomenos antígenos de HTV RT5 Nef e Gag ou derivados imunogênicos oufragmentos imunogênicos destes na ordem Gag5 RT, Nef, isto quer dizer umvetor de adenovírus compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeoscodificando pelo menos antígenos de HIV RT, Nef e Gag ou derivadosimunogênicos ou fragmentos imunogênicos destes arranjados de forma queeles sejam transcritos na ordem Gag, RT, Nef.
Por exemplo um vetor de adenovírus de acordo com ainvenção pode compreender um polinucleotídeo codificando Gag ou umderivado imunogênico ou fragmento imunogênico deste, fusionado a umaseqüência de polinucleotídeos codificando RT ou um derivado imunogênicoou fragmento imunogênico deste, fusionado a Nef ou um derivadoimunogênico ou fragmento imunogênico deste, e sob o controle de um únicopromotor heterólogo, caracterizado pelo fato de que a porção Gag do geneestá presente no término 5' do polinucleotídeo.
Em uma forma de realização alternativa da invenção, cada umdos três antígenos é expresso embora seu próprio promotor, cada um dos ditospromotores possa ser o mesmo ou diferente. Em ainda outra forma derealização da invenção dois dos três antígenos formam uma fusão, ligados aum único promotor e o terceiro antígeno é ligado a um segundo promotor, quepode ser o mesmo ou diferente do primeiro promotor. Por exemplo, Gag e RTpodem ser ligados a um primeiro promotor e Nef pode ser ligado a umsegundo promotor.
O polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificando pelo menostrês antígenos de HIV ou derivados imunogênicos ou fragmentosimunogênicos destes podem ser inseridos em qualquer das regiões Adenodeletadas, por exemplo na região El deletada.
Embora dois ou mais polinucleotídeos codificando antígenospossam ser ligados como uma fusão, a proteína resultante pode ser expressacomo uma proteína de fusão, ou ela pode ser expressa como produtosprotéicos separados, ou ela pode ser expressa como uma proteína de fusão eentão subseqüentemente degradada em subunidades menores.
Em um aspecto, a presente invenção fornece uma proteína defusão expressa por um vetor de acordo com a invenção, por exemplo, umaproteína de fusão produzida dentro do corpo humano.
Uma ou mais das seqüências de HIV incluídas no vetor deacordo com a invenção codificando e.g. Nef, Gag ou RT pode ser códonotimizado para células de mamíferos, por exemplo de forma que ela/elasparece(m) gene humano altamente expresso em seu uso de códon. Otimizaçãode códon destas seqüências de HIV é adicionalmente descrita em WO03/025003.
Por exemplo, os polinucleotídeos codificando Gag e/ou RTnos vetores de adenovírus de acordo com a invenção podem ser códonotimizados como discutido acima.
A seqüência de Gag no vetor de adenovírus de acordo com ainvenção pode excluir a seqüência codificando polipeptídeo Gag p6. Umexemplo particular de uma seqüência de Gag para uso na invençãocompreende seqüências codificando pl7 e/ou p24.
A seqüência de RT pode codificar uma mutação para inativarsubstancialmente qualquer atividade de transcriptase reversa. Uma mutaçãode inativação particular envolve a substituição de W triptofano 229 por K(lisina), veja W003/025003.
O gene de RT é um componente do maior gene de Pol nogenoma de HIV como descrito acima. Será entendido que a seqüênciacodificando RT incluída no vetor de adenovírus de acordo com a invençãopode estar presente no contexto de Pol, ou um fragmento de Pol codificandopelo menos RT. Tais fragmentos de Pol retêm principais epítopos CTL de Pol.Em um exemplo específico, RT é incluída como apenas p51 ou apenas ofragmento p66 de RT.
Opcionalmente a seqüência de Nef para uso na invenção étruncada para remover a seqüência codificando a região N terminal i.e.remoção de a partir de 30 a 85 aminoácidos, por exemplo de 60 a 85aminoácidos, particularmente os 65 aminoácidos N terminais (o últimotruncamento é referido neste lugar como trNef). Alternativamente ouadicionalmente o Nef pode ser modificado para remover um ou mais sítios demiristilação. Por exemplo o sítio de miristilação Gly 2 pode ser removido pordeleção ou substituição. Alternativamente ou adicionalmente o Nef pode sermodificado para alterar o motivo dileucina de Leu 174 e Leu 175 por deleçãoou substituição de uma ou ambas leucinas. A importância do motivo dileucinaem diminuição de CD4 é descrita e.g. em Bresnahan P.A. et al (1998) CurrentBiology, 8(22): 1235-8.
Um construto de acordo com a invenção pode compreenderGag, Pol e Nef caracterizado pelo fato de que pelo menos 75%, ou pelomenos 90% ou pelo menos 95%, por exemplo, 96% dos epítopos CTL destesantígenos nativos estão presentes.
Em um construto de acordo com a invenção que compreendepl7/p24 Gag, p66 RT5 e Nef truncado como definido acima, 96% dosepítopos CTL dos antígenos Gag Pol e Nef nativos estão presentes.
Uma forma de realização da invenção fornece um vetor deadenovírus compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeoscodificando ρ 17, p24 (otimizado) Gag, p66 RT (otimizado), Nef truncado(desprovido de nucleotídeos codificando aminoácidos terminais 185 - "trNef)na ordem Gag, RT, Nef.
Construtos de acordo com a invenção incluem:1. ρ 17, p24 (códon otimizado) Gag - p66 RT (códon otimizado) - Neftruncado;2. Nef truncado - ρ66 RT (códon otimizado) - ρ 17, p24 (códonotimizado) Gag;
3. Nef truncado - pl 7, p24 (códon otimizado) Gag - p66 RT (códonotimizado);
4. p66 RT (códon otimizado) - ρ 17, p24 (códon otimizado) Gag - Neftruncado;
5. p66 RT (códon otimizado) - Nef truncado - ρ 17, p24 (códonotimizado) Gag;
6. pl7 , p24 (códon otimizado) Gag - Nef truncado - p66 RT (códonotimizado).
O polinucleotídeo ou polinucleotídeos da presente invençãopode ter seqüências ligantes presentes dentro das seqüências codificando Gag,RT e Nef. Tais seqüências ligantes podem ser, por exemplo, de até 20aminoácidos de comprimento. Em um exemplo particular elas podem ser de 1a 10 aminoácidos, ou de 1 a 6 aminoácidos, por exemplo 2 a 4 aminoácidos.
Os polinucleotídeos da presente invenção podem conterseqüências de HIV adicionais. Em particular, elas podem incluir proteínas envde HIV ou derivados imunogênicos ou fragmentos imunogênicos destas.Formas adequadas de env são gpl20, gpl40 e gplóO. Outras seqüênciasadequadas de HIV incluem mas não são limitadas a Tat, Rev, Vpu, Vpr e Vif.Assim a invenção fornece adicionalmente um vetor de adenovíruscompreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificandoantígenos de HIV RT, Nef e Gag ou derivados imunogênicos ou fragmentosimunogênicos destes na ordem Gag, RT, Nef, junto com uma proteína env deHTV ou derivado imunogênico ou fragmento imunogênico destes.
A presente invenção além disso compreende uma composiçãoimunogênica compreendendo um vetor adenoviral de acordo com a presenteinvenção em combinação com um segundo vetor adenoviral compreendendoum polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificando um ou mais antígenos deHlV.
Será entendido que para todas as seqüências de HIV incluídasna invenção, estas não necessariamente representam seqüências codificandoas proteínas de comprimento completo ou nativas. Derivados imunogênicostal como truncados ou de outra maneira alterados e.g. proteínas mutadastambém são contemplados, como são fragmentos que codificam pelo menosum epítopo de HIV, por exemplo um epítopo CTL, tipicamente um peptídeode pelo menos 8 aminoácidos. Polinucleotídeos que codificam um fragmentode pelo menos 8, por exemplo 8-10 aminoácidos ou até 20, 50, 60, 70, 100,150 ou 200 aminoácidos de comprimento são considerados caírem dentro doescopo da invenção contanto que o oligo ou polipeptídeo codificadodemonstre antigenicidade para HIV, isto quer dizer que os principais epítoposCTL são mantidos pelo oligo ou polipeptídeo. Principais epítopos CTL sãodefinidos neste lugar como aqueles que são capazes de extrair uma respostaimune in-vivo. As moléculas de polipeptídeos de HIV codificadas pelasseqüências de polinucleotídeos de acordo com a invenção podem representarum fragmento de pelo menos 50% do comprimento da proteína nativa, cujofragmento pode conter mutações mas que retém pelo menos um epítopo deHIV e demonstra antigenicidade para HIV. Tal antigenicidade para HIV podeser medida por exemplo medindo respostas mediadas por anticorpo ou célula.Similarmente, derivados imunogênicos de acordo com a invenção devemdemonstrar antigenicidade para HIV. Derivados imunogênicos podemfornecer alguma vantagem potencial sobre a proteína nativa tal como reduçãoou remoção de uma função da proteína nativa que é indesejável em umantígeno de vacina tal como atividade enzimática (RT), ou regulação parabaixo de CD4 (Nef). As seqüências de polinucleotídeos podem ser códonotimizadas para células de mamíferos, em linha com aspectos de otimizaçãode códon da invenção como descrito neste lugar.
A presente invenção fornece adicionalmente um método parapreparar um vetor de acordo com a invenção compreendendo as etapas de:
a) fornecer um vetor de adenovírus;
b) fornecer um plasmídeo carregando as seqüências de antígeno deHIV operavelmente ligadas a um promotor adequado;
c) transfectar células tanto com o plasmídeo como com o vetor;
d) permitir tempo suficiente para que recombinação ocorra; e
e) recuperar vetor de vírus recombinante carregando as seqüências deantígeno de HIV.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um métodopara produzir uma resposta imune em um mamífero cujo método compreendeadministrar ao mamífero uma quantidade adequada de uma composiçãoimunogênica de acordo com a invenção.
A invenção pode se referir em particular a HIV-1. Osconstrutos descritos neste lugar podem ser derivados de qualquer ciado deHIV, por exemplo ciado B ou ciado C, particularmente ciado B.
Um promotor para uso no vetor de adenovírus de acordo com ainvenção pode ser o promotor de gene HCMV IE, por exemplo caracterizadopelo fato de que a região 5' não traduzida do gene HCMV IE compreendendoéxon 1 está incluída como descrito em WO 02/36792.
A composição farmacêutica pode ser administrada emquantidades suficientes para transduzir as células alvo e para fornecer níveissuficientes de transferência e expressão gênica para fornecer um benefícioterapêutico sem indevidos efeitos fisiológicos adversos ou com medicamenteaceitáveis, que podem ser determinadas por aqueles versados nas artesmédicas. Vias convencionais e farmaceuticamente aceitáveis de administraçãoincluem, mas não são limitadas a, liberação direta para a retina e outrosmétodos de liberação intra-ocular, liberação direta para o fígado, inalação,intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutânea, intradérmica,retal, oral e outras vias parenterais de administração. Vias de administraçãopodem ser combinadas, se desejado, ou ajustadas dependendo do produto degene ou da condição. A via de administração primariamente irá depender danatureza da condição sendo tratada.
Dosagens do vetor viral irão depender primariamente defatores tal como a condição sendo tratada, a idade, peso e saúde do paciente, eassim podem variar entre pacientes. Por exemplo, uma dosagemterapeuticamente efetiva humana adulta ou veterinária do vetor viralgeralmente é na variação de a partir de cerca de 100 μί a cerca de 100 mL deum carreador contendo concentrações de a partir de cerca de 1 χ IO6 a cercade 1 χ IO15 partículas, cerca de 1 χ IO11 to 1 χ IO13 partículas, ou cerca de 1 χto Ix 10 partículas de vírus. Dosagens irão variar dependendo dotamanho do animal e da via de administração. Por exemplo, uma dosagemhumana ou veterinária adequada (para um animal de cerca de 80 kg) parainjeção intramuscular é na variação de cerca de 1 χ 10 a cerca de 5 χ 10partículas por mL, para um único sítio. Opcionalmente, múltiplos sítios deadministração podem ser liberados. Em outro exemplo, uma dosagem humanaou veterinária adequada pode ser na variação de cerca de 1 χ IO11 a cerca de 1χ IO15 partículas para uma formulação oral. Alguém de verso na arte podeajustar estas doses, dependendo da via de administração, e da aplicaçãoterapêutica ou de vacina para a qual o vetor recombinante é empregado. Osníveis de expressão do produto terapêutico, ou para um imunogene, o nível deanticorpo circulante, podem ser monitorados para determinar a freqüência deadministração de dosagem. Ainda outros métodos para determinar atemporização de freqüência de administração serão prontamente perceptíveispara alguém de verso na arte.
Administração da composição farmacêutica pode tomar aforma de uma ou de mais do que uma dose individual, por exemplo comodoses repetidas do mesmo adenovírus contendo polinucleotídeo, ou em umregime heterólogo de vacinação "iniciação-reforço". Um regime de iniciação-reforço heterólogo usa administração de formas diferentes de vacina napreparação e no estímulo, cada um do qual pode por si só incluir duas ou maisadministrações. A composição de iniciação e a composição de reforço terãopelo menos um antígeno em comum, embora não necessariamente seja umaforma idêntica do antígeno, ela pode ser uma forma diferente do mesmoantígeno.
Um regime de iniciação-reforço de uso com os vetores dapresente invenção pode tomar a forma de uma iniciação-reforço de DNAheterólogo e vetor adenoviral, por exemplo, uma dose de preparação de DNAlivre, seguido por um reforço de vetor adenoviral, ou por exemplo, umainiciação de vetor adenoviral seguido por um ou mais reforços de DNA livre.Tais reforços de DNA podem ser liberados por administração intramuscularou intradérmica de DNA, ou por técnicas de aceleração de partículas.Alternativamente um tal regime de iniciação-reforço pode compreender porexemplo uma proteína e vetor adenoviral de acordo com a presente invenção,com a dose de iniciação compreendendo a proteína, e a dose de reforçocompreendendo o vetor adenoviral ou por exemplo caracterizado pelo fato deque a dose de iniciação compreende um vetor adenoviral e a dose de reforçocompreende uma proteína.
Exemplos
Exemplo 1.
Construção de Adenovírus de Pan 6 e 7 com E1/E3deletado
1. Geração de Vetor SV-25 Recombinante com El Deletado
Foi construído um plasmídeo contendo o genoma completo deSV-25 exceto por uma deleção manipulada de El. No sítio da deleção de Elsítios de reconhecimento para as enzimas de restrição I-Ceul e PI-Scel quepermitiria inserção de transgene a partir de um plasmídeo do tipo ponte ondea gaveta de expressão de transgene é flanqueada por estes dois sítios dereconhecimento de enzima foram inseridos.
Um ligante sintético contendo os sítios de restrição Swal-SnaBl-Spel-Aflll-EcoRV-Swal foi clonado em pBR322 que foi cortado comEcoRl e Ndel. Isto foi feito anelando junto dois oligômeros sintéticos SV25T(5'-AAT TTA AAT ACG TAG CGC ACT AGT CGC GCT AAG CGC GGATAT CAT TTA AA-3') e SV25B (5'-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCTTAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTA TTT A-3') e os inserindo empBR322 digerido com EcoRl e Ndel. A extremidade esquerda (bpl a 1057) deAd SV25 foi clonada no ligante acima entre os sítios SnaBI e Spel. Aextremidade direita (bp28059 a 31042) de Ad SV25 foi clonada no liganteentre os sítios AflII e EcoRV. O adenovírus El foi então excisado entre o sítioEcoRl (bp 547) até Xhol (bp 2031) a partir da extremidade esquerda clonadacomo segue. Uma gaveta I-Ceul-PI-Scel gerada por PCR de pShuttle(Clontech) foi inserida entre os sítios EcoRl e Spel. O fragmento Xholde 10154 bp de Ad SV-25 (bp2031 a 12185) foi então inserido no sítio Spel. Oplasmídeo resultante foi digerido com HindlIl e o construto (pSV25) foicompletado inserindo o fragmento HindlIl de 18344 bp de Ad SV25 (bpl 1984a 30328) para gerar um clone molecular completo de adenovírus SV25 comEl deletado adequado para a geração de adenovírus recombinante.Opcionalmente, um transgene desejado é inserido nos sítios I-Ceul e PI-Sceldo plasmídeo vetor pSV25 recentemente criado.
Para gerar um AdSV25 carregando um gene marcador, umagaveta de expressão de GFP (proteína fluorescente verde) previamenteclonada no plasmídeo pShuttle (Clontech) foi excisada com as enzimas derestrição I-Ceul e PI-Scel e ligada em pSV25 (ou outro dos plasmídeos de Adchimp descritos neste lugar) digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeoresultante (pSV25GFP) foi digerido com Swal para separar o esqueleto deplasmídeo bacteriano e transfectado no El complementando linhagem celularHEK 293. Cerca de 10 dias depois, um efeito citopático foi observadoindicando a presença de vírus replicativo. A geração bem sucedida de umvetor adenoviral baseado em Ad SV25 expressando GFP foi confirmadaaplicando o sobrenadante da cultura transfectada nas culturas de célulasfrescas. A presença de células infectadas secundariamente foi determinada porobservação de fluorescência verde em uma população das células.
2. Construção de vetores Pan-6 e Pan-7 com E3 deletado.
A fim de estimular a capacidade de clonagem dos vetoresadenovirais, a região E3 pode ser deletada pois esta região codifica genes quenão são requeridos para a propagação do vírus em cultura. Para estafinalidade, versões com E3 deletado de Pan-5, Pan-6, Pan-7, e C68 foramfeitas (um fragmento Nru-Avrl 1 de 3,5 kb contendo E31-9 é deletado).
Deleção de E3 em vetor baseado em Pan6
Clone molecular pPanó- pkGFP com El deletado foi digeridocom SbfI e Not I para isolar fragmento de 19,3 kb e ligado de volta em sítioSbf I. O construto resultante pPan6-Sbf I-E3 foi tratado com Eco 47 III e SwaI, gerando pPan6-E3. Finalmente, fragmento SbfI de 21 kb de digestão de SbfI de pPanó- pkGFP foi subclonado em pPan6-E3 para criar pPan6-E3-pkGFPcom uma deleção de 4 kb em E3.
Vetor de Pan7 com E3 deletado
A mesma estratégia foi usada para atingir deleções de E3 emPan 7. Primeiro, um fragmento Avr II de 5,8 kb abrangendo a região E3 foisubclonado pSL-1180, seguido por deleção de E3 por digestão com Nru I. Osplasmídeos resultantes foram tratados com Spe I e Avr II para obterfragmentos de 4,4 kb e clone em pPan7- pkGFP em sítios Avr II parasubstituir os fragmentos Avr II originais contendo E3, respectivamente. Oconstruto final pPan7-E3- pkGFP teve uma deleção de 3,5 kb em E3.
Uma descrição completa de construção de deleções de El, E3 eE4 nestes e outros sorotipos de Adenovírus de Pan é dada em W003/0046124.Informação adicional também está disponível em Human Gene Therapy15:519-530 (W003/046124).
Exemplo 2.
Construção de seqüência de Gag, RT, Nef.
Isto é descrito por completo em W003/025003Plasmídeo p73i-Tgrn
1. Plasmídeo: p73i-GRN2 Clone #19(pl7/p24(opt)/RT(opt)trNef) - reparado
Gene de interesse:
A porção pl7/p24 do gene Gag de códon otimizado, RT decódon otimizado e Nef da linhagem HXB2 de ciado B de HIV-I depois de umcomprimento Iowa HCMV promotor + éxonl, e antes de um sinal depoliadenilação de β-globina de coelho.
Plasmídeos contendo o gene trNef derivado de plasmídeopl7/24trNefl contêm um erro de PCR que gera uma mudança de aminoácidoR para H a 19 aminoácidos da extremidade de Nef. Isto foi corrigido pormutagênese de PCR, o Nef corrigido costurado por PCR a RT de códonotimizado de p7077-RT3, e o fragmento costurado cortado com Apal eBamHl, e clonado em p73i-GRN cortado com Apal/BamHl.Iniciadores:
PCR coRT de p7077-RT3 usando iniciadores: (Polimerase =PWO (Roche) o tempo todo.Sentido: Ul
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTG
CCGGTGA AGCTGAAACCCGGGAT
AScoRT-Nef
GGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC
Ciclo: 95°C(30s) então 20 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s),72°C(180s), então 72°C(120s) e mantido a 4°C
O produto de PCR de l,7kb foi purificado em gel.PCR 5' Nef de ρ 17/24trNefl usando iniciadores:Sentido: S-Nef
ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACCAntisentido: ASNef-G:
GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC
Ciclo: 95°C(30s) então 15 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s),72°C(60s), então 72°C(120s) e mantido a 4°C
PCR 3' Nef de pl7/24trNefl usando iniciadores:Sentido: SNEF-G
GAG GTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC
Antisentido:
AStrNef (antisentido)
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCCiclo: 95°C(30s) então 15 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s),
72°C(60s), então 72°C(120s) e mantido a 4°C
Os produtos de PCR foram purificados em gel. Inicialmente osdois produtos de Nef foram costurados usando os iniciadores 5' (S-Nef) e 3'(AstrNef).
Ciclo: 95°C(30s) então 15 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s),
72°C(60s), então 72°C(180s) e mantido a 4°C .
O produto de PCR foi limpo por PCR, e costurado ao produtode RT usando os iniciadores Ul e AstrNef:
Ciclo: 95°C(30s) então 20 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s),72°C( 180s), então 72°C( 180s) e mantido a 4°C.
O produto de 2, Ikb foi purificado em gel, e cortado com Apale BamHl. O plasmídeo p731GRN também foi cortado com Apal e BamHlpurificado em gel e ligado com o Apal-Bam RT3trNef para regenerar o geneρ 17/p24(opt)/RT(opt)trNef.
2. Plasmídeo: p73I-RT w229k (RT inativado)Gene de interesse:
Geração de um gene de RT inativado depois de umcomprimento Iowa HCMV promotor + éxon 1, e antes de um sinal depoliadenilação de β-globina de coelho.
Devido às preocupações sobre o uso de uma espécie ativa deRT de HIV em uma vacina terapêutica inativação do gene era desejável. Istofoi atingido por mutagênese de PCR da posição de aminoácido 229 de RT(derivada de P73I-GRN2) de Trp a Lys (R7271 ρ 1-28).Iniciadores:
PCR 5' RT + mutação usando iniciadores: (polimerase = PWO(Roche) o tempo todo)Sentido: RT3-u:l
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGA AGCTGAAACCCGGGATAntisentido: AScoRT-Trp229Lys
GGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCTCiclo:
1 χ [94°C (3Os)]
15 χ [94°C (30s)/55°C (30s)/72°C (60s)]1 x[72°C(180s)]purificação em gel de PCRPCR 3' RT + mutação usando iniciadores:Antisentido: RT3- 1:1
GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGAC CTGCTCGTTGCCGCSentido: ScoRT-Trp229LysCCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATGCiclo:
1 χ [94°C (3Os)]15 χ [94°C (30s)/55°C (30s)/72°C (60s)] 1 χ [72°C (180s)]purificação em gel de PCR
Os produtos de PCR foram purificados em gel e asextremidades 5' e 3' de RT foram costuradas usando os iniciadores 5' (RT3-Ul) e 3' (RT3-L1).
Ciclo:
1 χ [94°C (3 Os)]
15 χ [94°C (30s)/55°C (30s)/72°C (120s)]1 χ [72°C (180s)]
O produto de PCR foi purificado em gel, e clonado emp7313ie, utilizando sítios de restrição Notl e BamHl, para gerar p73I-RTw229k. (Veja figura 13)
3. Plasmídeo: p731-Tgrn
Gene de interesse:
A porção pl7/p24 do gene de gag de códon otimizado, RT decódon otimizado e Nef truncado da linhagem HXB2 de ciado B de HIV-Idepois de um comprimento Iowa HCMV promotor + éxonl, e antes de umsinal de poliadenilação de β-globina de coelho.
Construtos de fusão tripla que contêm uma forma ativa de RT,podem não ser aceitáveis por autoridades reguladoras para uso humano, assiminativação de RT foi atingida por inserção de um fragmento cortado com Nhele Apal de p73i-RT w229k, em p73i-GRN2#19 cortado com Nhel/Apal(Figura 14). Isto resulta em uma troca W —> K em posição 229 em RT.
A seqüência completa do plasmídeo Tgrn inserido é mostradaem Fig 7. Esta contém pl7 p24 (opt) Gag, p66 RT (opt e inativado) e Neftruncado.
Construtos alternativos de Gag, RT e Nef são como segue:trNef - p66 RT (opt) - ρ 17, p24 (opt) Gag,trNef - ρ 17, p24 (opt) Gag - p66 RT (opt),ρ66 RT (opt) - pl7, ρ24 (opt) Gag - trNef,
p66 RT (opt) — trNef - ρ 17, p24 (opt) Gag,
pl7 , p24 (opt) Gag - trNef - p66 RT (opt).
Seqüências completas para estes construtos são dadas emFiguras 8 a 12 respectivamente.
Exemplo 3.
Inserção de seqüência de Gag, RT, Nef em Adenovírus.Subclonagem de gaveta de expressão de GRN emplasmídeo pShuttle.
A gaveta de expressão inteira consistindo de promotor, cDNAe sinal de poliadenilação foi isolada de construtos pT-GRN por digestão duplacom Sph I e EcoR I. A extremidade Sph I do fragmento Sph I/EcoR I foipreenchida com Klenow e clonada em plasmídeo pShuttle em sítios EcoR I eMlu I onde a extremidade Mlu I foi preenchida.
Durante o processo de clonagem uma seqüência flanqueadoraadicional se tornou associada com a gaveta de expressão de HIV. Estaseqüência é conhecida como a seqüência Cer e não tem nenhuma função.
Transferência de gaveta de expressão de GRN para clonesmoleculares com E1/E3 deletado de vetores Pan6 e Pan7.
A gaveta de expressão foi resgatada de pShuttle por digestões comI-Ceu I e PI-Sce I e clonada nos mesmos sítios dos clones moleculares de vetoresPan6 e Pan7. Clones recombinantes foram identificados através de seleçãoverde/branca e confirmados por análise extensiva de enzima de restrição.
Resgate e propagação de vírus recombinantes.Clones moleculares de vetores C6 e C7 foram tratados comendonucleases de restrição apropriadas (Pmel e Pacl respectivamente) paraliberar intactos genomas de vetores lineares e transfectados em células 293usando o método de fosfato de cálcio. Quando efeito citopático total foiobservado nas células transfectadas, lisado viral bruto foi coletado egradualmente expandido para infecções em larga escala em células 293(Ixl0e9 células). Vírus de infecções em larga escala foram purificados pormétodo padrão de sedimentação CsCI.
Em adição o plasmídeo pShuttle pode ser adicionalmenteaparado cortando com EcoRI e Xmnl para remover uma seqüência ligante 3' ereduzir o tamanho de plasmídeo para produzir pShuttleGRNc. Este plasmídeomodificado pode ser usado para gerar um vírus Pan7 (C7-GRNc) adicionalusando o método como descrito acima.
Outros construtos foram similarmente inseridos tanto emadenovírus Pan 6 como Pan 7. Entretanto Pan 6 com um inserto p66 RT (opt)- trNef - pl 7, p24 (opt) Gag não foi produzido com sucesso.
Exemplo 4.
Modelo de Imunogenicidade de Camundongo
Uma série de vetores Pan6 e Pan7 contendo insertos rearranjadosdos antígenos de HIV RT, Nef e Gag (RGN, NRG, NGR, GRN, e GNR) foramtestados para respostas imunes primárias in vivo. Três experimentos foramconduzidos para testar o vírus Pan6 e dois para Pan7. Cada adenovírus foiadministrado intramuscularmente em um volume de 50μ1 para um único membroposterior de camundongos Balb/c (K2d) em uma dose de IxlO8 partículas. Estadose foi selecionada pois havia sido previamente mostrado que ela induz bonsníveis de respostas imunes celulares (não publicado).
Tabela 1 descreve os adenovírus que foram comparados nestesexperimentos.
Tabela 1
<table>table see original document page 28</column></row><table>Seguindo estimulação in vitro com peptídeos ou proteínas paraepítopos específicos em Gag, Nef e RT a geração de respostas CD8 e CD4 foimedida por ensaio ELIspot em 14 e 28 dias após iniciação. Os resultadosfornecem forte evidência de que todas as variantes são capazes de gerar umaresposta imune primária potente se medida pela produção tanto de IFN ycomo IL-2 comparadas com o vetor vazio controle (dados não mostrados).
Os dados destes estudos foram estatisticamente analisados(usando uma análise de modelo misturado de variância (ANOVA) em ProcMixed em SAS (versão 9.1.3 Service Pack 2) para determinar umranqueamento das variantes de RNG em Pan6 e Pan7 em pontos de temposeparados.
A soma de respostas para os peptídeos CD8 para produção deIFN y foi quantificada para Gag e RT ao passo que os dados de IL-2 ELlspotforam avaliados na soma de respostas para os peptídeos CD4 para Gag, Nef eRT.
O ranqueamento do grupo de variantes foi calculado usando omodelo Bayesiano (realizado usando a demonstração prévia em Proc Mixedcom um "flat prior" gerando 100.000 amostras posteriores; veja Tierney, L.(1994), "Markov Chains for Exploring Posterior Distributions" (comdiscussão), e Annals of Statistics, 22, 1701 - 1762. Gelfand, A.E., Hills, S.E.,Racine-Poon, A., and Smith, A.F.M. (1990), "Illustration of BayesianInference in Normal Data Models Using Gibbs Sampling," Journal of theAmerican Statistical Association, 85, 972 - 985) para prever a probabilidadede cada uma das variantes ser a 'melhor', baseado nos dados fornecidos pelascondições experimentais investigadas.
Figura 1 representa a soma das respostas CD4 e CD8 de Pan6para IFN y e IL-2 com cada peptídeo em dia 14 e 28 como previsto pelométodo Bayesiano.
Figura 2 representa a soma das respostas CD4 e CD8 de Pan7para IFN y e IL-2 com cada peptídeo em dia 14 e 28 como previsto pelométodo Bayesiano.
Todos os insertos mostram um aumento significante emrespostas imunes comparados com o vetor vazio controle. A análise estatísticamostra que não existem diferenças significantes entre os diferentes vírus.
Exemplo 5.
Modelo de Imunogenicidade de Porco
Resultados de diversos estudos indicaram que o porco é umbom modelo para testar imunogenicidade de vacinas candidatas. Um estudofoi estruturado para investigar a imunogenicidade dos quatro adenovírus NHPcandidatos em miniporcos. Grupos de 5 miniporcos foram iniciados comPAN6GRN, PAN6NGR, PAN7GRN ou PAN7NGR (para detalhes de gruposusados veja Tabela 2). Cada animal recebeu um total de 3 χ IO10 partículasvirais de adenovírus através da via intramuscular (usando um volume de 1,0ml dividido igualmente entre cada músculo mediai da coxa).
Tabela 2. Grupos de adenovírus NHP usados para o experimento comminiporco
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Amostras de sangue de todos os animais foram coletadas antesde imunização e em intervalos pós-imunização. As células mononucleares desangue periférico foram isoladas e re-estimuladas in vitro com combinaçõesde biblioteca de peptídeo RT5 Nef e Gag e proteínas. As combinações debiblioteca de peptídeo consistem de transições de peptídeos de 15aminoácidos por 11 aminoácidos abrangendo a seqüência inteira de RT, Nef eGag e foram as mesmas que aquelas usadas para os experimentos comcamundongo in vivo.A produção de interferon-gama por estas células porcinas foimedida usando ensaios ELispot. Figura 3 mostra as respostas a combinaçõesde biblioteca de peptídeo RT, Nef e Gag nos 4 momentos de amostragem.
Respostas são detectadas para todos os quatro vírus sete diasapós imunização. Resposta celular para todos os quatro vírus NHP é mantidaaté pelo menos 5 semanas após primária.
PAN6-GRN gera a resposta mais forte em 7 dias após primáriapor EFN-gama ELispot.
Exemplo 6.
Modelo de Imunogenicidade de Primata
Resultados de um estudo piloto com primata indicaram queinjeção intramuscular de adenovírus NHP expressando RT, Nef e Gagproduziu respostas imunes celulares em macacos Cynomolgus.
Um estudo foi estruturado para investigar a imunogenicidadedos quatro adenovírus NHP candidatos em macacos Cynomolgus. Grupos deanimais foram iniciados com PAN6GRN, PAN6-NGR, PAN7-GRN ouPAN7-NGR (para detalhes de grupos de vírus usados veja Tabela 3). Cadaanimal recebeu um total de IO11 partículas virais de adenovírus através da viaintramuscular (usando um volume de 1,0 ml dividido igualmente entre cadamúsculo mediai da coxa).
Tabela 3. Grupos de adenovírus NHP usados para os experimentos comprimata
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Amostras de sangue foram coletadas antes de imunização eposteriormente em intervalos semanais. Células mononucleares de sangueperiférico foram isoladas e re-estimuladas in vitro com combinações debiblioteca de peptídeo RT5 Nef e Gag. A produção de interferon-gama porestas células de primatas foi medida usando ensaios ELIspot. Figura 4 mostraa resposta de cada grupo nos três momentos de amostragem.
Os resultados mostram que todos os grupos responderamfortemente em uma semana depois da imunização primária, com respostasmantidas até pelo menos 7 semanas após imunização. Os resultados sugeremque existe pouca diferença entre os vetores quando usados nesta dose (ie. IO11partículas) em primatas.
Exemplo 7.
Respostas imunes pós-primárias para uma variação de dose deantígenos GRN de HIV codificando Adenovírus NHP liberadosintramuscularmente (i.m.).
Para avaliar o impacto da dose de adenovírus em imunizaçãoprimária, diversos camundongos (n=5) foram imunizados intramuscularmente(i.m.) com doses crescentes de Adenovírus NHP (de 10 a 10 partículas).Como controle positivo um grupo de animais foi imunizado por DNA (21,1 g)usando liberação epidérmica mediada por partícula (ND5). Em dia 6 e dia 19após imunização os animais foram programados e baço removido. Respostasimunes foram monitoradas por ensaio IFN-y ELISPOT usando umacombinação de biblioteca de peptídeo para cada um dos antígenos (GAG eRT) para estimular os esplenócitos durante a noite. Figura 5 mostra asrespostas de cada grupo nos dois momentos de amostragem.
Exemplo 8
Respostas imunes pós-primárias para uma variação de dose deantígenos GRN de HIV codificando Adenovírus NHP liberadosintradermicamente (i.d.).
Para avaliar o impacto da dose de adenovírus em imunizaçãoprimária, diversos camundongos (n=5) foram imunizados intradermicamente(i.d.) com doses crescentes de Adenovírus NHP s (de IO7 a IO10 partículas).Como controle positivo um grupo de animais foi imunizado por DNA (1 l,lg)usando liberação epidérmica mediada por partícula (PMED). Em dia 7 e dia14 após imunização os animais foram programados e baço removido.Respostas imunes foram monitoradas por ensaio IFN-y ELISPOT.
Esplenócitos foram estimulados durante a noite usando peptídeos bemdefinidos para cada antígeno (GAG e RT) que estimula especificamentecélulas T CD4 ou CD8. Figura 6 mostra as respostas de cada grupo nos doismomentos de amostragem.
Estes resultados sugerem que tanto i-m como i-d são viasefetivas de administração de composições da invenção.
Descrição de Figuras
Figura 1. Ranqueamento de Adenovírus Pan6 HIV. Esterepresenta a soma das respostas Pan6 CD4 e CD8 para IFN y e IL-2 com cadapeptídeo em dia 14 e 28 como previsto pelo método Bayesiano. O eixo yrepresenta células formadoras de mancha por milhão de esplenócitos.
Figura 2. Ranqueamento de Adenovírus Pan7 HIV. Esterepresenta a soma das respostas Pan7 CD4 e CD8 para IFN y e IL-2 com cadapeptídeo em dia 14 e 28 como previsto pelo método Bayesiano. O eixo yrepresenta células formadoras de mancha por milhão de esplenócitos.
Figura 3. Respostas de miniporcos a combinações debiblioteca de peptídeo RT, Nef e Gag em O, 1, 3 e 5 semanas após imunizaçãoprimária. Resultados são a média ± erro padrão da soma de respostas paracada combinação de biblioteca de peptídeo para cada animal. Dados obtidos apartir da Universidade da Pensilvânia.
Figura 4. Respostas de primatas a combinações de bibliotecade peptídeo RT, Nef e Gag em O, 1 e 2 semanas após imunização primária.Resultados são a média ± erro padrão da soma de respostas para cadacombinação de biblioteca de peptídeo para cada animal.
Figura 5: Respostas imunes pós-primárias para uma variaçãode dose de antígenos GRN de HTV codificando Adenovírus NHP liberadosintramuscularmente (i.m.). Grupo de camundongos (n=5) foi imunizado comvárias doses de Adenovírus NHP (de 10 a 10 partículas) e respostas imunescelulares contra uma combinação de biblioteca de peptídeo para cada antígenosão monitoradas (dia 6 e dia 19) usando ensaio IFN-y ELISPOT.
Figura 6: Respostas imunes pós-primárias para uma variaçãode dose de antígenos GRN de HIV codificando Adenovírus NHP liberadosintradermicamente (i.d.). Grupo de camundongos (n=3) foi imunizado comvárias doses de Adenovírus NHP (de 10 a 10 partículas) e respostas imunescelulares contra peptídeos específicos são monitoradas (dia 7 e dia 14) usandoensaio IFN-y ELISPOT.
Figuras 7 a 12: Seqüências de polinucleotídeos, seqüências deaminoácidos e mapas de restrição para construtos descritos em Exemplo 2.
Detalhes das seqüências são demonstrados em Tabela 4
Tabela 4:
<table>table see original document page 34</column></row><table>

Claims (21)

1. Vetor de adenovírus, caracterizado pelo fato decompreender um polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificando pelo menosantígenos de HIV RT, Nef e Gag ou derivados imunogênicos ou fragmentosimunogênicos destes arranjados de forma que eles são transcritos na ordemGag, RT, Nef.
2. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a RT é truncada.
3. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o Nef é truncado.
4. Vetor de adenovírus de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o Gag é pl7 e p24 apenas.
5. Vetor de adenovírus de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o tamanho dopolinucleotídeo ou polinucleotídeos de HTV é de forma que o tamanho geraldo vetor é de 90 a 100% do tamanho do vírus.
6. Vetor de adenovírus de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o vírus é umadenovírus de primata não humano.
7. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovírus de chimpanzé.
8. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o adenovírus é selecionado a partir de pan 5, 6, 7 e 9.
9. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o adenovírus é pan 6.
10. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o adenovírus é pan 7.
11. Vetor de adenovírus de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o vírus é defectivopara replicação.
12. Vetor de adenovírus de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o vírus é deletado emregiões El e E3.
13. Vetor de adenovírus de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as seqüências depolinucleotídeos codificando os antígenos de HIV são arranjadas como umafusão.
14. Vetor de adenovírus de chimpanzé, caracterizado pelo fatode compreender um dos seguintes construtos de polinucleotídeo:ρ 17, p24 (códon otimizado) Gag - p66 RT (códon otimizado) -Nef truncado; Nef truncado - p66 RT (códon otimizado) - ρ 17, p24 (códonotimizado) Gag; Nef truncado - ρ 17, p24 (códon otimizado) Gag - p66 RT(códon otimizado); p66 RT (códon otimizado) - ρ 17, p24 (códon otimizado)Gag - Nef truncado;p66 RT (códon otimizado) - Nef truncado - ρ 17, p24 (códonotimizado) Gag; pl7 , p24 (códon otimizado) Gag - Nef truncado - p66 RT(códon otimizado).
15. Vetor de adenovírus de acordo com reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o Adenovírus é Pan 6 ou Pan 7 com a condiçãode que quando o adenovírus é Pan 6 o construto não é p66 RT (opt) - trNef -ρ 17, p24 (opt) Gag.
16. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato decompreender o vetor de vírus como definido em qualquer umas dasreivindicações de 1 a 15 e um carreador ou adjuvante farmaceuticamenteaceitável.
17. Uso de um vetor de adenovírus como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ser na fabricação deum medicamento para o tratamento ou profilaxia de infecção por HIV.
18. Método para preparar um vetor como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender as etapas de:a) fornecer um vetor de adenovírus;b) fornecer um plasmídeo carregando as seqüências de antígeno deHIV operavelmente ligadas a um promotor adequado;c) transfectar células tanto com o plasmídeo como com o vetor;d) permitir tempo suficiente para que recombinação ocorra; ee) recuperar vetor de vírus carregando as seqüências de antígeno deHIV.
19. Uso de um vetor de vírus como definido em qualquer umadas reivindicações de 1 a 15 e um carreador ou adjuvante farmaceuticamenteaceitável, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composiçãoimunogênica como definida na reivindicação 16 para produzir uma respostaimune em um mamífero.
20. Proteína de fusão, caracterizado pelo fato de ser expressadapelo vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
21. Proteína de fusão de acordo com reivindicação 20,caracterizada pelo fato de ser produzida dentro do corpo humano.
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