MX2007014038A - Composicion de vacuna. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a vectores virus que comprenden oligonucleotidos que codifican polipeptidos del VIH, mas en particular aquellos en los que el vector virus es un adenovirus. En particular, tales adenovirus son adenovirus de primates no humanos tales como adenovirus de simios, mas en particular adenovirus de chimpance. En particular, la invencion se refiere a vectores adenovirus que comprenden secuencias polinucleotidicas de VIH que codifican multiples antigenos de VIH diferentes, por ejemplo, dos, tres o mas antigenos de VIH. La invencion se refiere ademas a procedimientos para preparar los vectores virus, a los vectores virus producidos por los procedimientos y al uso de los vectores en medicina, en especial en vacunacion profilactica o terapeutica.

Description

CORflPQSSCOOfr- DE VACU Campo DT La fi ¡uve s © 5 erra La presente invención se refiere a vectores virus que comprenden olig?nucleótidos que codifican polipéptidos de VI H, más en particular, aquellos en los que el vector virus es un adenovirus. En particular, tales adenovirus son adenovirus de primate no humano tales como adenovirus de simios, más en particular adenovirus de chimpancé. En particular, la invención se refiere a vectores adenovirus que comprenden secuencias polinucleotídicas de VI H que codifican múltiples antígenos diferentes del VI H, por ejemplo dos o tres o más antígenos del VI H. La invención se refiere además a procedimientos para preparar los vectores virus, a los vectores virus producidos por los procedimientos y al uso de los vectores en medicina, en especial para la vacunación profiláctica o terapéutica. El VIH-1 es la causa principal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SI DA) que se considera como uno de los mayores problemas mundiales de salud. Aunque se ha llevado a cabo una extensiva investigación en todo el mundo, ios esfuerzos por producir una vacuna no han tenido éxito hasta la fecha. El VI H-1 es un virus ARN de la familia Retroviridiae. El genoma del VI H codifica al menos nueve proteínas que se dividen en tres clases: las principales profeínas estructurales Gag, Pol y Env, las proíeína reguladoras Tai y Rev, y las proteínas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. El genoma del VI H presenía la organización 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' de iodos los reírovirus. El adenovirus es un virus ADN de doble cadena con un lamaño de genoma de aproximadamenie 36 kb que se ha usado exíensameníe para aplicaciones de íransferencia génica debido a su capacidad para alcanzar una íransferencia génica de alia eficacia en una diversidad de íejidos diana y una gran capacidad del gen íransformado. Convencionalmenle, los genes E 1 de adenovirus se eliminan o reemplazan con un módulo íransgénico consislenle en el promoíor de elección, secuencia de ADNc del gen de interés y una señal de poIyA, dando lugar a un virus recombinaníe de replicación defecluosa. Los adenovirus íienen una morfología caracleríslica con una cápsida icosaédrica consisíeníe en Ires proíeínas principales, hexon (I I) , base penlon (l ll) y una fibra con proíuberancias (IV), junto con una serie de oirás proleínas minoritarias, VI , VI I I , IX, I l la y IVa2 (Russell W.C. 2000, Gen Virol, 81 :2573-2604). El genoma del virus es un ADN de doble cadena lineal con una proteína terminal unida covalentemente al extremo 5', que tiene repeticiones terminales invertidas (ITR). El virus ADN está íntimamente asociado con la proteína altamenle básica Vi l y un pequeño péplido denominado mu. Oirá proieína, V, esíá compaciada con este complejo ADN - proteína y proporciona una unión estructural a la cápsida a través de la proteína VI . El virus íambién coníiene una proteasa codificada por el virus que es necesaria para procesar parte de las proteínas esirucíurales para producir virus infecciosos maduros. Se han aislado más de 100 seroíipos distintos de adenovirus que infectan diversas especies de mamíferos, 51 de los cuales son de origen humano. Ejemplos de tales adenovirus de origen humano son Ad1 , Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Ad1 1 , Ad24, Ad34, Ad35. Los serotipos humanos se han clasificado en seis subgéneros (A-F) basándose en una serie de criíerios biológicos, químicos, inmunológicos y eslrucíurales. [página 1 , documenío WO 04018627] Aunque los veclores basados en Ad5 se han usado exiensameníe en una serie de ensayos de lerapia génica, pueden exisíir limiíaciones sobre el uso de Ad5 y otros vectores adenovirus del grupo C debido a la inmunidad preexistenie en la población general debida a la infección naíural. El Ad5 y oíros miembros del grupo C íienden a esíar enlre los serolipos más seroprevaleníes. Se puede desarrollar inmunidad a veciores exisíenfes como resulíado de exposición al vecíor duraníe el íralamienío. Esíos íipos de inmunidad preexisíenie o desarrollada a veclores seroprevaleníes puede limitar la eficacia de la terapia génica o los esfuerzo de vacunación. Seroíipos de adenovirus allernativos constituyen de este modo importantes dianas en la búsqueda del sistema de liberación génica capaces de evadir la respuesta inmune del huésped.

Una de tales áreas de serotipos alternaíivos son los de primates no humanos, en especial adenovirus de chimpancé. Véase la patente de Estados Unidos 6.083.716 que descpbe el genoma de dos adenovirus de chimpancé. Se ha demostrado que los vectores adenovirales del chimpancé ("Bandeja" o "C") inducen, potentes respuestas inmunes a productos transgénicos de forma ían eficaz como los vectores adenovirales humanos (Fiízgerald eí al. J. Immunol. 170: 1416). Las proíeínas de VI H Tai y Nef son proieínas tempranas, es decir, éstas son expresadas tempranamente en la infección y en ausencia de proteína estructural. El gen Nef codifica una proteína de VI H accesoria temprana que ha demostrado poseer varias actividades. Por ejemplo, la proieína Nef se conoce por causar la supresión de CD4, el receptor de VI H, de la superficie celular, aunque la imporíancia biológica de esta función se está debatiendo. Además, Nef iníeracciona con la vía de señalización de los linfociíos T e induce un estado activo, que a su vez puede promover una expresión génica más eficiente. Algunos aislados de VIH tienen mutaciones en esta región, lo que causa que éstos no codifiquen proteína funcional y esíán gravemente comprometidos en su replicación y patogénesis in vivo. El gen Gag se traduce desde el ARN de longiiud completa proporcionando una poliproteína precursora que seguidamente se escinde en las proteínas de la cápsitía 3 - 5; la proteína de matriz, proteína de cápsida y proteína de unión a ácido nucleido y proteasa. (Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM and Ho ley M 1996 2. Fields Virology vol 2 1996). El gen Gag da lugar a la proíeína precursora Gag de 55 kilodalíon (kD), íambién denominada p55, que se expresa a paríir del ARNm viral sin procesar. Durante la traducción, el extremo terminal N de p55 se mirisioila, desencadenando su asociación con el aspecio ciioplásmico de las membranas celulares. La poliproteína Gag asociada a la membrana recluía dos copias del ARN genómico viral junio con oirás proleínas virales y celulares que desencadenan la generación de la partícula viral de la superficie de una célula infectada. Después de generar, el p55 se escinde por la profeasa codificada viralmente (un producto del gen Pol) duranle el proceso de maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas denominadas MA (matriz [p17]), CA (cápsida [p24]), NC (nucleocápsida [p9]) y p6.(4). Además de las 3 proteínas Gag principales (p17, p24 y p9), todos los precursores Gag contienen otras regiones difereníes, que se escinden y permanecen en el virión como pépiidos de diversos tamaños. Estas proteínas tienen diferentes funciones, por ejemplo, la proteína p2 tiene una función propuesta en la regulación de la actividad de la proteasa y contribuye a la correcta programación del procesado proteolí?ico. El polipépíido MA deriva del e?íremo N-ierminal mirisioilado de p55. La mayoría de moléculas MA permanece unida a la superficie interna de la bicapa lipídica del virión, esíabilizando la partícula. Un subgrupo de MA es recluíado en el iníerior de capas más profundas del virión en las que forma parte del complejo que escolia el ADN viral al núcleo. Estas moléculas de MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral debido a que una señal cariofílica en MA es reconocida por la maquinaria de importación nuclear celular. Esíe fenómeno permiie al VIH infectar células no divisibles, una propiedad inusual para un retrovirus. La proieína p24 (CA) forma el núcleo cónico de partículas virales. La ciclofilina A ha demosírado que iníeracciona con la región p24 de p55 conduciendo a su incorporación en partículas del VI H. La interacción entre Gag y ciclofilina A es esencial debido a que la inierrupción de esla inleracción por ciclosporina A inhibe la replicación viral . La región NC de Gag es responsable de reconocer específicamente la señal denominada de compactación del VI H. La señal de compactación consiste en cuatro estrucíuras en forma de horquilla y bucle siíuadas cerca del exíremo 5' del ARN viral y es suficieníe para mediar en la incorporación de un ARN heterólogo en viriones de VI H-1 . NC se une a la señal de compactación por medio de interacciones mediadas por dos motivos dedo de cinc. NC iambién facilita la transcripción inversa. La región del polipépiido p6 media en las interacciones entre Gag de p55 y la proleína Vpr accesoria, conduciendo a la incorporación de Vpr en viriones ensamblados. La región p6 también contiene un dominio denominado tardío que es requerido para una liberación eficaz de viriones generados desde una célula infectada. El gen Pol codifica tres proíeínas que íienen las acíividades necesarias por el virus en la infección temprana, RT transcriptasa inversa, proteasa y la proteína integrasa necesaria para la integración de ADN viral en el ADN celular. El producto primario de Pol se escinde por la proíeasa del virión proporcionando un pépíido RT amino terminal que contiene actividades necesarias para la síntesis de ADN (ADN polimerasa dirigida por ARN y ADN, ribonucleasa H) y proteína inlegrasa del extremo carboxilo terminal . La RT del VI H es un heterodímero de RT de longitud completa (p66) y un producto de escisión (p51 ) que carece del dominio iníegrasa ARNasa del exlremo carboxilo. RT es una de las proteínas más altamente conservadas codificadas por el genoma retroviral. Dos actividades fundamentales de RT son la ADN Pol y Ribonucleasa H. La actividad ADN Pol de RT usa ARN y ADN como moldes de forma indisfinía y, al igual que todas las ADN polimerasas conocidas es incapaz de iniciar la síntesis de ADN de novo, sino que requiere una molécula preexistente que sirva como cebador (ARN). La actividad ARNasa H intrínseca en todas las proteínas RT desempeña la función esencial temprana en la replicación de eliminar el genoma del ARN a medida que transcurre la síntesis de ADN. Esto degrada de forma selectiva el ARN de todas las moléculas híbridas ARN - ADN. Estrucíuralmeníe, la polimerasa y ribo H ocupan dominios separados no solapados en el Pol que cubre los dos íercios amino del Pol. La subunidad p66 caíalííica se pliega en 5 subdominios disíinlos. Los 23 e?íremos amino íerminales de eslos tienen la porción con actividad RT. El extremo carboxilo terminal para estos es el dominio ARNasa H. Después de la infección de la célula huésped, el genoma del ARN retroviral se copia en dsADN lineales por la íranscriptasa inversa que está presente en la partícula infecciosa. La integrasa (revisada en Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52 271 -273) reconoce los extremos del ADN viral , los recorta y acompaña al ADN viral a un siíio cromosómico huésped para caíalizar la iníegración. Muchos siíios en el ADN huésped pueden ser dianas para la inlegración. Aunque la inlegrasa es suficienle para catalizar la integración in vitro, ésta no es la única proteína asociada con ADN viral in vivo - el complejo ADN viral - proteína grande aislado de las células infectadas se ha denominado complejo preintegración. Esío faciliía la adquisición de los genes de células huésped por genomas virales de la progenie. La iniegrasa esíá consíiíuida por 3 dominios disíiníos, el dominio N íerminal, el núcleo caíalílico y el dominio C lerminal. El dominio del núcleo caíalííico coníiene iodos los requerimientos para la química de transferencia de polinucleofidilo. Los vectores virus y en particular los vectores adenovirus que contienen varios genes extraños no son siempre fáciles de producir. Pueden exisfir problemas con la esiabilidad de los veclores, y dificulíades con obtener una expresión eficaz de los genes insertados. En particular, no se han producido con éxito los adenovirus que contienen más de uno o más de dos polinucleótidos de VI H que se podrían usar en una vacuna. Los adenovirus de primates no humanos se pueden aislar de los ganglios linfáticos mesentéricos de chimpancés. Los adenovirus de chimpancé son suficieníemenle similares al subíipo C de adenovirus humano para permiiir la replicación del virus con E1 eliminado en células HEK 293. Todavía los adenovirus de chimpancé son filogenélicamente distintos de los serotipos humanos más comunes (Ad2 y Ad5). Bandeja 6 está relacionado menos estrechamente y es serológicamente distinto de Bandeja 5, 7 y 9. Existen cierlas restricciones de tamaño asociadas con la inserción de ADN helerólogos en adenovirus. Los adenovirus humanos íienen la capacidad de compaclarse hasía un 105% de la longitud del genoma de tipo silvesíre (Beií ei al 1993, J Virol 67 (10), 591 1 -21 ). El límiie de compacíación inferior para adenovirus humanos se ha demostrado que es un 75% de la longitud del genoma de tipo silvestre (Parks et al 1995, J Virol 71 (4), 3293-8).

Existe todavía la necesidad de descubrir una vacuna eficaz frente al VI H. La presente invención proporciona un vector adenovirus con supresiones en una o más regiones, comprendiendo dicho vector un polinucleótido o polinucleóíidos que codifican al menos íres anlígenos o derivados inmunógenos de VI H o fragmeníos inmunógenos de los mismos, donde el vecíor puede expresar los aníígenos o fragmenlos o derivados en un huésped mamífero y donde el íamaño de la supresión y el iamaño del polinucleóíido o polinucleólidos de VI H son tales que la longitud íoíal del genoma del vecíor varía eníre el 85% y el 105% de la longiíud del genoma del virus de íipo silveslre. En una modalidad de la presenie invención, los aniígenos de VI H codificados por el polinucleólido o polinucleóíidos pueden ser Gag, Nef y Pol. En olra modalidad, Pol puede comprender sólo la porción RT. En olra modalidad de la invención, el polinucleóíido o polinucleótidos que codifican los aniígenos de VI H pueden disponerse de modo que esíos se íranscriban en el orden Gag, RT, Nef, es decir, de modo que la porción Gag esíé en el exíremo N-íerminal de la proieína de fusión resultante. El tamaño del genoma del vector toíal puede variar por ejemplo de 90 a 100% del lamaño del genoma del virus íipo silvestre, o de 95 a 100% del tamaño del genoma de tipo silvesíre. En una modalidad, el lamaño total del vector puede ser aproximadamente 96% del tamaño del genoma del virus de tipo silvestre. Antígenos de VI H particulares para la inclusión en los vectores adenovirus de acuerdo con la invención son Pol , Nef y Gag o derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de los mismos. Dichos vectores adenovirus se pueden formular con excipientes, vehículos, diluyentes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para producir composiciones inmunógenas que incluyen medicamentos o composiciones de vacuna adecuadas para el tratamiento y/o profilaxis de infección por VIH y SIDA. Son de uso en la presente invención adenovirus que se diferencian de los serotipos prevalentes de origen natural en la población humana tal como Ad2 y Ad5. Esto evita la inducción de polentes respuestas inmunes contra el vector que limita la eficacia de las posteriores administraciones del mismo serotipo bloqueando la absorción del vector a iravés de la neutralización del anticuerpo e influyendo en la toxicidad. Así el adenovirus puede ser un adenovirus que no sea un serotipo de virus humano de origen natural prevalente. Los adenovirus aislados de animales tienen componentes de la cápsida, hexon, penton y fibra inmunológicamente diferenciados aunque filogenéticamente están muy relacionados. De forma específica, el virus puede ser un adenovirus no humano, tal como un adenovirus de simio en particular un adenovirus de chimpancé, tal como Bandeja 5, 6, 7 ó 9. Ejemplos de dichas cepas se describen en el documento WO03/000283 y eslán disponibles en la American Type Cullure Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201 10-2209, y de otras fuentes. Cepas de adenovirus de chimpancé deseables son Bandeja 5 [ATCC VR-591 ], Bandeja 6 [ATCC VR-592] y Bandeja 7 [ATCC VR-593]. Oíros adenovirus adecuados incluyen, aunque sin limilación, adenovirus de chimpancé C1 y C68 (Bandeja9), descrilos en la patente de Estados Unidos No. 6.083.716; y adenovirus de simios que incluyen, aunque sin limitación SV1 [VR-195]; SV25 [SV-201]; SV35; SV15; SV-34; SV-36; SV-37, y adenovirus de babuino [VR-275], entre otros. Las secuencias de Bandeja 5 (también denominado C5), Bandeja 6 (también denominado C6), Bandeja 7 (también denominado C7), SV1 , SV25 y SV39 se han descrito [documento WO 03/046124, publicado el 5 de junio de 2003]. Véase también la publicación de patente internacional No. WO 04/16614, que describe vectores adenovirus híbridos y vectores construidos a partir de adenovirus SA18 de simio. Se cree que los adenovirus de chimpancé son ventajosos con respeclo a los serolipos de adenovirus humanos por la falía de inmunidad preexistente, en particular, la falta de anticuerpos de neutralización cruzada, hacia adenovirus en la población diana. La reacción cruzada de los adenovirus de chimpancé con respuestas de anticuerpos neutralizanles preexistentes sólo está presente en el 2% de la población diana comparado con el 35% en el caso de ciertos vectores adenovirus humanos candidatos. Los adenovirus de chimpancé son dislintos de los subtipos humanos más comunes Ad2 y Ad5, pero están más estrechamente relacionados con el Ad4 humano del subgrupo E, que no es un subtipo prevaleníe. Bandeja 6 esíá menos eslrechamente relacionado con Bandeja 5, 7 y 9. El adenovirus de la invención puede ser defectuoso en la replicación. Esto significa que tiene una capacidad reducida para replicarse en células sin complemento, comparado con el virus de tipo silvestre. Esto puede estar provocado por la mutación del virus, por ejemplo, eliminando un gen implicado en la replicación, por ejemplo, la supresión del gen E1 a, E1 b, E3 o E4. Los vectores adenovirus de acuerdo con la presente invención pueden ser adenovirus defectuosos en la replicación que comprenden una supresión funcional E1. Así, los vectores adenovirus de acuerdo con la invención pueden ser defectuosos en la replicación debido a la ausencia de la capacidad para expresar los genes E1 a y E 1 b adenovirales, es decir, se ha eliminado funcionalmente E1 a y E1 b. Los adenovirus recombinantes íambién pueden portar supresiones funcionales en oíros genes [véase el documenío WO 03/000283] por ejemplo, supresiones en los genes E3 o E4. El gen E3 temprano tardío de adenovirus se puede eliminar de la secuencia de adenovirus de simio que forma parle del virus recombinanle. La función de E3 no es necesaria para la producción de la partícula de adenovirus recombinante. Así, es innecesario reemplazar la función de esíe producío génico con el fin de compaciar un adenovirus de simio recombinaníe úíil en la invención. En una modalidad parlicular, los adenovirus recombinanles (simio) tienen suprimidos funcionalmente los genes E 1 y E3. La construcción de tales vectores se describe en Roy et al . , Human Gene Therapy 15:519-530, 2004. También se pueden construir adenovirus recombinantes que tengan una supresión funcional del gen E4, aunque puede ser deseable retener la función ORF6 de E4. Los vectores adenovirus de acuerdo con la invención lambién pueden contener una supresión en el gen temprano tardío E2a. También pueden realizarse supresiones en cualquiera de los genes tardíos L1 a L5 del genoma de adenovirus de simio. De igual modo, pueden ser útiles supresiones en los genes intermedios IX y IVa. Se pueden realizar otras supresiones en otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las supresiones anteriores se pueden usar individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para usar en la presente invención puede contener supresiones únicamente de E1. De forma alternativa, se pueden usar en cualquier combinación supresiones de genes completos o porciones de los mismos eficaces para destruir su actividad biológica. Por ejemplo, en un vector ejemplo, las secuencias de adenovirus pueden lener supresiones de los genes E 1 y el gen E4, o de los genes E1 , E2a y E3, o de los genes E 1 y E3 (íales como supresiones funcionales en E1 a y E1 b, y una supresión de al menos parle de E3), o de los genes E 1 , E2a y E4, con o sin supresión de E3 y así sucesivamente. Tales supresiones pueden ser supresiones parciales o completas de estos genes y se pueden usar en combinación con otras mutaciones, tales como mutaciones sensibles a la temperatura para conseguir un resultado deseado. Los vectores adenovirales se pueden producir en cualquier línea de células adecuada en la que el virus sea capaz de replicarse. En particular, se pueden usar líneas de células complementarias que proporcionan los factores que faltan del vector viral que dan como resultado sus caracterísiicas de replicación alíeradas. Por ejemplo, una línea de células complementaria puede expresar E1 , o E1 y E3, o E1 , E3 y E4. Sin limitación, dicha línea de células puede ser células HeLa [No. de acceso de la ATCC CCL 2], A549 [No. de acceso de la ATCC CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroií 510, CCL 72] y WI-38 [CCL 75] entre otras. Estas líneas de células están disponibles todas de la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201 10-2209. Se pueden obtener otras líneas de células precursoras adecuadas de otras fuentes, tales como células PER.C6© que se representan por las células depositadas con el número de ECACC 96022940 en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) en el Centre for Applied Microbiology and Research (CAM R, UK). La invención proporciona en otro aspecío un vector adenoviral que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican al menos antígenos de VI H RT, Nef y Gag o derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de los mismos en el orden Gag, RT, Nef, es decir, un vector adenovirus que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifica al menos antígenos de VI H RT, Nef y Gag o derivados inmunógenos o fragmeníos inmunógenos de los mismos dispuestos de modo que estos se transcriben en el orden Gag, RT, Nef. Por ejemplo, un vector adenovirus de acuerdo con la invención puede comprender un polinucleótido que codifica Gag o un derivado inmunógeno o fragmento inmunógeno del mismo, fusionado con una secuencia polinucleotídica que codifica RT o un derivado inmunógeno o fragmento inmunógeno del mismo, fusionado con Nef o un derivado inmunógeno o fragmento inmunógeno del mismo y bajo el control de un único promotor heterólogo, en el que la porción Gag del gen está presente en el extremo 5' terminal del polinucleótido. En una modalidad alternativa de la invención, cada uno de los tres antígenos se expresa a través de su propio promotor, cada uno de dichos promotores puede ser igual o distinto. En otra modalidad de la invención, dos de los tres antígenos forman una fusión, unida a un único promotor y el tercer antígeno está unido a un segundo promotor, que puede ser igual o distinto del primer promotor. Por ejemplo, Gag y RT pueden estar unidos a un primer promotor y Nef puede estar unido a un segundo promolor. El polinucleótido o polinucleótidos que codifican al menos tres antígenos de VI H o derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de los mismos puede insertarse en cualquiera de las regiones con supresiones Adeno, por ejemplo, en la región con supresión E1.

Aunque dos o más polinucleótidos que codifican antígenos pueden estar unidos como una fusión, la proteína resultante se puede expresar como una proteína de fusión, o puede expresarse como productos proteicos separados, o puede expresarse como una proteína de fusión y luego romperse seguidamente en subunidades más pequeñas. En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión expresada por un vector de acuerdo con la invención, por ejemplo, una proleína de fusión producida en el cuerpo humano. Una o más de las secuencias de VI H incluidas en el veclor de acuerdo con la invención que codifican, por ejemplo Nef, Gag o RT, puede experimentar optimización de codón para células de mamífero, por ejemplo, tal que ésla/éstas se asemejen a un gen humano expresado a alto nivel en su uso de codón. La optimización de codones de estas secuencias de VI H se describe con detalle en el documento WO 03/025003. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican Gag y/o RT en los vectores adenovirus de acuerdo con la invención pueden experimentar optimización de codón como se ha descrito antes. La secuencia Gag en el vector adenovirus de acuerdo con la invención puede excluir la secuencia que codifica el polipéptido Gag pd. Un ejemplo particular de secuencia de Gag para usar en la invención comprende secuencias que codifican p17 y/o p24. La secuencia RT puede codificar una mutación para inactivar sustancialmente cualquier actividad transcriptasa inversa. Una mutación de inactivación parlicular implica la sustitución del triptófano W 229 por K (lisina), véase el documento WO03/025003. El gen RT es un componente del gen Pol más grande en el genoma del VI H como se ha descrito antes. Se entenderá que la secuencia que codifica RT incluida en el vector adenovirus de acuerdo con la invención puede estar presente en el contexto de Pol, o un fragmento de Pol que codifique al menos RT. Tales fragmentos de Pol retienen los epítopes CTL principales de Pol. En un ejemplo específico, RT está incluido como el fragmento p51 o el p66 de RT. Opcionalmente, la secuencia Nef para usar en la invención esíá íruncada para eliminar la secuencia que codifica la región N terminal, es decir, eliminar de 30 a 85 aminoácidos, por ejemplo, de 60 a 85 aminoácidos, en particular, los 65 aminoácidos del extremo N terminal (el úllimo truncamiento se denomina en la presente memoria como trNef). De forma alternativa o adicionalmente, el Nef se puede modificar para eliminar uno o más sitios de miristilación. Por ejemplo, el silio de miristilación Gly 2 se puede eliminar por supresión o sustitución. De forma alternativa o adicionalmente, el Nef se puede modificar para alterar el motivo dileucina de Leu 174 y Leu 175 mediante supresión o sustiíución de una o ambas leucinas. La importancia del motivo dileucina en la regulación a niveles inferiores de CD4 se describe por ejemplo en Bresnahan P.A. et al (1998) Current Biology, 8(22): 1235-8.

Una construcción de acuerdo con la invención puede comprender Gag, Pol y Nef en las que está presente al menos 75%, o al menos 90% o al menos 95%, por ejemplo 96% de los epítopes CTL de esíos aniígenos naíivos. En una conslrucción de acuerdo con la invención que comprende p17/p24 Gag, p66 RT, y Nef Iruncado como se ha definido anles, está presente el 96% de los epítopes CTL de los antígenos nativos Gag Pol y Nef. Una modalidad de la invención proporciona un vector adenovirus que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican p17, p24 (optimizado) Gag, p66 RT (optimizado), Nef truncado (exento de nucleótidos que codifican aminoácidos terminales 1 -85 - "trNef") en el orden Gag, RT, Nef. Conslrucciones conforme a la invención incluyen: 1 . p17, p24 (codón optimizado) Gag - pdd RT (codón optimizado) - Nef truncado; 2. Nef truncado - p66 RT (codón optimizado) - p17, p24 (codón optimizado) Gag; 3. Nef truncado - p17, p24 (codón optimizado) Gag - pdd RT (codón optimizado); 4. pdd RT (codón optimizado) - p17, p24 (codón optimizado) Gag - Nef truncado; 5. p66 RT (codón opiimizado) - Nef truncado - p17, p24 (codón optimizado) Gag; 6. p17 , p24 (codón oplimizado) Gag - Nef truncado - pdd RT (codón optimizado). El polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención puede tener secuencias enlazador presentes entre las secuencias que codifican Gag, RT y Nef. Dichas secuencias enlazador pueden tener, por ejemplo, hasta 20 aminoácidos de longitud. En un ejemplo particular, éstas pueden ser de 1 a 10 aminoácidos, o de 1 a 6 aminoácidos, por ejemplo, de 2 a 4 aminoácidos. Los polinucleótidos de la presente invención pueden contener secuencias de VI H adicionales. En particular, éstos pueden incluir proteínas env de VIH o derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de las mismas. Formas adecuadas de env son gp120, gp140 y gp160. Otras secuencias adecuadas de VI H incluyen, aunque si n quedar limitadas a las mismas Tat, Rev, Vpu, Vpr y Vif. Así, la invención proporciona además un vector adenovirus que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican antígenos de VI H RT, Nef y Gag o derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de los mismos en el orden Gag, RT, Nef, junto con una proíeína env de VI H o un derivado inmunógeno o un fragmenlo inmunógeno de ta misma. La presente invención comprende además una composición inmunógena que comprende un vector adenoviral de acuerdo con la presente invención en combinación con un segundo vector adenoviral que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican uno o más antígenos de VI H . Se entenderá que para todas las secuencias de VI H incluidas en la invención, estas no representan necesariamente secuencias que codifican las profeínas de longiíud compleía o naíivas. También se conlemplan los derivados inmunógenos tales como truncados o alterados de cualquier otro modo, por ejemplo, proteínas mutadas, como son fragmentos que codifican al menos un epííope de VIH, por ejemplo, un epítope CTL, de forma típica un péptido de al menos 8 aminoácidos. Los polinucleótidos que codifican un fragmenlo de al menos 8, por ejemplo, 8 a 10 aminoácidos o hasta 20, 50, 60, 70, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud se considera que están dentro del alcance de la invención siempre que el oligo o polipéptido codificado demuestre antigenicidad VI H, es decir, que se retengan los epítopes CTL principales por el oligo o el polipéptido. Los epítopes CTL principales se definen en la presente memoria como aquellos que pueden obtener una respuesta inmune in vivo. Las moléculas de polipéptidos VI H codificadas por las secuencias polinucleotídicas de acuerdo con la invención pueden representar un fragmento de al menos 50% de la longitud de la proteína nativa, pudiendo contener dicho fragmento mutaciones pero reteniendo al menos un epítope de VIH y demostrando antigenicidad VI H. Dicha antigenicidad VI H puede medirse por ejemplo midiendo las respuestas mediadas por anticuerpos o por células. De igual modo, los derivados inmunógenos de acuerdo con la invención deberán demostrar antigenicidad VIH. Los derivados inmunógenos pueden proporcionar cierta ventaja potencial sobre la proteína nativa tal como reducción o eliminación de una función de la proleína naíiva que es indeseable en un antígeno de vacuna tal como actividad enzimática (RT) o regulación a niveles inferiores de CD4 ( Nef). Las secuencias polinucleotídicas pueden experimentar optimización de codón para cél ulas de mamífero en l ínea con aspectos de optimización de codón de la invención que se describen en la présenle memoria. La presente invención proporciona además un procedimiento para preparar un vector de acuerdo con la invención que comprende las etapas de: a) proporcionar un vector adenovirus; b) proporcionar un plásmido que porta las secuencias de antígeno de VI H unidas de forma operativa a un promotor adecuado; c) transfectar células con el plásmido y el vector; d) dejar que pase tiempo suficiente para que se produzca la recombinación; y e) recuperar el veclor viral recombinaníe que íiene las secuencias del aníígeno del VI H . En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedi miento para desarrollar una respuesta i nmune en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento administrar al mamífero una cantidad adecuada de una composición inmunógena de acuerdo con la invención. La invención se puede referi r en particular a VI H-1 . Las conslrucciones descritas en la presente memoria pueden derivarse de cualquier subtipo de VI H, por ejemplo subtipo B o subtipo C, en particular subtipo B. Un promotor para usar en el vector adenovirus de acuerdo con la invención puede ser el promotor del gen HCMV I E, por ejemplo, en el que está incluida la región sin traducir 5' del gen HCMV IE que comprende el exon 1 , como se describe en el documento WO 02/36792. La composición farmacéutica se puede administrar en cantidades suficientes para la íransducción de las células diana y proporcionar niveles suficienles de íransferencia génica y expresión génica para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos inadecuados o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que se pueden determinar por los expertos en la técnica médica. Vías convencionales y farmacéuticameníe aceptables de administración incluyen, aunque sin quedar limitadas a las mismas, la liberación directa en la retina y oíros procedimieníos de liberación intraocular, la liberación directa en el hígado, inhalación, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, rectal , oral y otras vías parenterales de administración. Las vías de administración se pueden combinar, si se desea, o ajustarse dependiendo del producto génico o del esíado palológico. La vía de adminislración dependerá fundameníalmente de la naturaleza del esíado paíológico que se esíé íraíando.

Las dosis del vector viral dependerán fundamentalmente de factores tales como el estado patológico que se trate, la edad, peso y salud del pacieníe y puede variar de esie modo enlre difereníes pacienles. Por ejemplo, una dosificación humana o veterinaria para un adulto terapéulicamente eficaz del vector viral varía por lo general en el intervalo de aproximadamente 100 µl a aproximadameníe 100 ml de un vehículo que contiene concentraciones de aproximadamenie 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015 partículas, de aproximadamenle 1 x 1011 a 1 x 1013 partículas, o de aproximadamenle 1 ? 109 a 1x 1012 partículas de virus. Las dosificaciones variarán dependiendo del tamaño del animal y de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis humana o veterinaria adecuada (para un animal de aproximadamenle 80 kg) para inyección inlramuscular varía en el iníervalo de aproximadamenle 1 x 109 a aproximadamente 5 x 1012 partículas por ml, para un único sitio. Opcionalmente, pueden liberarse en varios sitios de administración. En otro ejemplo, una dosis humana o veterinaria adecuada puede estar en el intervalo de aproximadameníe 1 x 1011 a aproximadameníe 1 x 1015 partículas para una formulación oral. Un experto en la técnica puede ajustar estas dosis, dependiendo de la vía de administración, y de la aplicación terapéutica o vacunal para la cual se emplea el vector recombinante. Los niveles de expresión del producto terapéutico, o para un inmunógeno, el nivel de anticuerpo circulante, se pueden controlar para determinar la frecuencia de la administración de la dosis. Otros procedimientos adicionales para determinar la programación de la frecuencia de administración serán evidentes para los expertos en la técnica. La administración de la composición farmacéutica puede adopíar la forma de una o más de una dosis individual, por ejemplo, como dosis repetidas del mismo polinucleótido que contiene adenovirus, o en una pauta de vacunación de "sensibilización - recuerdo" heteróloga. Una pauta de sensibilización - recuerdo heteróloga usa la administración de diferentes formas de vacuna en la sensibilización y en el recuerdo, cada una de las cuales puede incluir ella misma dos o más administraciones. La composición de sensibilización y la composición de recuerdo tendrán al menos un antígeno en común, aunque no es necesariamente una forma idéntica del antígeno, puede ser una forma diferente del mismo antígeno. Una pauta de sensibilización - recuerdo de uso con los vectores de la presente invención puede adoptar la forma de un ADN heterólogo y una sensibilización recuerdo de vector adenoviral, por ejemplo, una dosis de sensibilización de ADN desnudo (no asociado a proleínas), seguida por un recuerdo de vector adenoviral, o por ejemplo, una sensibilización de vector adenoviral seguida por uno o más recuerdos de ADN desnudo. Dichos recuerdos de ADN se pueden administrar por administración intramuscular o intradérmica de ADN o por técnicas de aceleración de partículas. De forma alternativa, dicha pauta de sensibilización - recuerdo comprendería por ejemplo una proteína y un vector adenoviral de acuerdo con la presente invención, comprendiendo la dosis de sensibilización la proteína y comprendiendo la dosis de recuerdo el vector adenoviral o por ejemplo, en el que la dosis de sensibilización comprende un vector adenoviral y la dosis de recuerdo comprende una proteína.

EiernpBos Ejemplo 1. Construesión deB adepoviirus Bandesa i y 7 ©@m supirasoém E1/E3 1. QeneracSén deg vecftor recombinante SV-25 ©on suprtss?ér. ü Se construyó un plásmido que contenía el genoma de SV-25 completo salvo por una supresión de E1 diseñada por modificación genética. Se insertaron en el sitio de la supresión de E1 sitios de reconocimienío para las enzimas de reslricción l-Ceul y Pl-Scel que permitirían la inserción del gen transformado desde un plásmido lanzadera en el que el módulo de expresión del gen transformado está flanqueado por estos dos sitios de reconocimiento de enzima. Se clonó un enlazador sintético que contenía los sitios de restricción Swal-SnaBI-Spel-AflI l-EcoRV-S al en pBR322 que se cortó con EcoRI y Ndel . Esto se realizó por reasociación conjunta de dos oligómeros sintéíicos SV25T (5'-AAT TTA AAT ACG TAG CGC ACT AGT CGC GCT AAG CGC GGA TAT CAT TTA AA-3') y SV25B (5'-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTA TTT A-3') e insertándolo en pBR322 digerido con EcoRI y Ndel . El exlremo izquierdo (pb1 a 1057) de Ad SV25 se clonó en el enlazador anterior entre los sitios SnaBI y Spel. El extremo derecho (pb 28059 a 31042) de Ad SV25 se clonó en el enlazador entre los silios Aflll y EcoRV. El adenovirus E1 se cortó entonces entre el sitio EcoRI (pb 547) a Xhol (pb 2031 ) desde el extremo izquierdo clonado como sigue. Se insertó un módulo I-Ceul-PI-Scel generado por PCR de pShutlle (Cloníech) eníre los sitios EcoRI y Spel. El fragmento Xhol de 10154 pb de Ad SV-25 (pb 2031 a 12185) se insertó seguidamente en el sitio Spel . El plásmido resultante se digirió con Hindl l l y la construcción (pSV25) se completó insertando el fragmento de Ad SV-25 Hindl l l de 18344 pb (pb 1 1984 a 30328) para generar un clon molecular completo de adenovirus SV25 con una supresión E1 adecuado para la generación de adenovirus recombinantes. Opcionalmeníe, se insería un gen transformado deseado en los sitios l-Ceul y Pl-Scel del plásmido del vector pSV25 recién creado. Para generar un AdSV25 que porte un gen marcador, se separó un módulo de expresión GFP (proteína fluorescente verde) clonado previamente en el plásmido pShuttle (Clontech) con las enzimas de restricción l-Ceul y Pl-Scel y se ligó en pSV25 (u otro de los plásmidos Ad de chimpancé descritos en la presente memoria) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultaníe (pSV25GFP) se digi rió con Swal para separar la estructura plasmídica bacteriana y transfecíarla a la línea de células complementaria de E 1 HEK 293. Aproximadamente 10 días después, se observó un efecío ciíopático que indicaba la presencia de virus replicativo. La generación con éxito de un vector adenoviral a base de Ad SV25 que expresa GFP se confirmó aplicando el l íquido sobrenadante del culíivo íransfectado sobre cultivos celulares nuevos. La presencia de células infectadas secundariamenle se determinó por observación de la fl uorescencia verde en una población de las células. 2. C@onsft?pL.@©Gé?p? ú® ^®©to?r®s Ba_?_§®ñ??°3 v Baotidepa°7 ©©cu s piresgépi E3. Con el fin de potenciar la capacidad de clonación de los vectores adenovirales, se puede eliminar la región E3 debido a que esta región codifica genes que no son requeridos para la propagación del virus en cultivo. En este sentido, se han realizado versiones con supresión E3 de Bandeja-5, Bandeja-6, Bandeja-7 y C68 (se elimina un fragmento Nru-Avrl l de 3,5 kb que contiene E31 -9).

D@8e©.é?r. E3 ®p ^®eft@?r a feas® d® _3a?p) ¡®fla S Se digirió el clon molecular pBandejaß- pkGFP con supresión E 1 con Sbf I y Not I para aislar el fragmento de 19,3 kb y volver a ligar en el sitio Sbf I . La construcción resulianle pBandejad-Sbf I - E3 se trató con Eco 47 ll l y Swa I , generando pBandejad-E3. Finalmente, se subclonó el fragmento Sbf I de 21 kb de la digestión con Sbf I de pBandejad- pkGFP en pBandeja6-E3 para crear pBandeja6-E3-pkGFP con una supresión de 4 kb en E3.

Vector Bandeja? con su resñén E3 Se usó la misma estrategia para conseguir supresiones E3 en Bandeja 7. Primero, un fragmento Avr I I de 5,8 kb que abarca la región E3 se subclonó en pSL-1 180, seguido por la supresión de E3 por digestión con Nru I. Los plásmidos resultantes se trataron con Spe I y Avr I I para obtener fragmentos de 4,4 kb y se clonó en pBandeja7- pkGFP en los sitios Avr II para reemplazar el E3 original que contenía fragmentos Avr I I , respectivamente. La construcción final pBandeja7-E3- pkGFP tenía una supresión E3 de 3,5 kb. En el documento WO 03/0046124 se presenta una descripción detallada de la construcción de supresiones E 1 , E3 y E4 en estos y otros serotipos de adenovirus Bandeja. También hay disponible más información en Human Gene Therapy 15:519-530 (documento WO03/046124).

Eiempio 2. Construcción de 8a secuencia de Gaa . RT„ M©t?. Esto se describe con detalle en el documento WO03/025003 Plásmido p73S°Tar_-_ lásmlde: p?3¡-GR^2 (p17/p24fopt)/RT??opt)trNefl - reparado Gen de interés: La porción p17/p24 de Gag de codón optimizado, RT de codón optimizado y gen Nef truncado de la cepa HXB2 de subtipo B de VIH-1 cadena abajo de un promotor HCMV de longitud lowa + exonl , y cadena arriba de una señal de poliadenilación de ß-globina de conejo. Plásmidos que contienen el gen trNef derivado del plásmido p17/24trNef1 contienen un error en la PCR que origina un cambio de aminoácido R a H 19 aminoácidos desde el extremo de Nef. Esto se corrigió mediante mutagénesis por PCR, la PCR de Nef corregida se unió a RT de codón optimizado de p7077-RT3, y el fragmento unido se cortó con Apal y BamHl, y se clonó en el corte con Apal/BamHI, p73i-GRN.

Cebadores: PCR coRT de p7077-RT3 usando cebadores: (Polimerasa = PWO (Roche) en todo el proceso. Codificaníe: U 1 GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGT GCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT AScoRT-Nef GGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC Ciclo: 95°C(30s) luego 20 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s), 72°C(180s), luego 72°C(120s) y manteniendo a 4°C El producto de PCR de 1 ,7 kb se purificó en gel . PCR 5' Nef de p17/24trNef1 usando cebadores: Codificante: S-Nef ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC No codificante: ASNef-G: GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC Ciclo: 95°C(30s) luego 15 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s), 72°C(60s), luego 72°C(120s) y manteniendo a 4°C PCR 3' Nef de ?17/24trNef1 usando cebadores: Codificante: SNEF-G GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC No codificante: AStrNef (No codificante) CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC Ciclo: 95°C(30s) luego 15 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s), 72°C(60s), luego 72°C(120s) y manteniendo a 4°C Los productos de la PCR se purificaron en gel. Inicialmente los dos productos Nef se unieron usando los cebadores 5' (S-Nef) y 3' (AstrNef). Ciclo: 95°C(30s) luego 15 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s), 72°C(60s), luego 72°C(180s) y manleniendo a 4°C .

El producto de la PCR se limpió por PCR y se unió al producto RT usando los cebadores U1 y AstrNef: Ciclo: 95°C(30s) luego 20 ciclos 95°C(30s), 55°C(30s), 72°C(180s), luego 72°C(180s) y manteniendo a 4°C. El producto de 2, 1 kb se purificó en gel y se cortó con Apal y BamHl . El plásmido p73l-GRN también se cortó con Apal y BamH l se purificó en gel y se ligó con Apal-Bam RT3trNef para regenerar el gen p17/p24(opt)/RT(opt)trNef. 2. Plásmido: p73S°RT 22Sk ([RT ?naetivad®]) Gen de linteres: Generación de un gen RT inactivado cadena abajo de un promotor HCMV de longitud lowa + exon 1 , y cadena arriba de una señal de poliadenilación de ß-globina de conejo. Debido a problemas con respecto al uso de una especie RT de VI H activa en una vacuna terapéulica era deseable la inaclivación del gen. Esío se consiguió medíanle mutagénesis por PCR en la posición aminoacídica 229 de RT (derivado de P73I- GRN2) desde Trp a Lys (R7271 p1 -28).

Cebadores: PCR 5' RT + mutación usando cebadores: (polimerasa = PWO (Roche) en todo el proceso) Codificante: RT3-u: 1 GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGT GCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT No codificante: AScoRT-Trp229Lys GGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT Ciclo: 1 x [94°C (30s)] 15 x [94°C (30s)/55°C (30s)/72°C (60s)] 1 x [72°C (180s)] Purificar los productos de PCR en gel PCR 3' RT + mutación usando cebadores: No codificante: RT3- 1: 1 GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAG CTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC Codificante: ScoRT-Trp229Lys CCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG Ciclo: 1 x [94°C (30s)] 15 x [94°C (30s)/55°C (30s)/72°C (ßOs)] 1 x [72°C (180s)] Purificar los productos de PCR en gel Los productos de PCR se purificaron en gel y los extremos 5' y 3' de RT se unieron usando los cebadores 5' (RT3-U1 ) y 3' (RT3-L1 ). Ciclo: 1 x [94°C (30s)] 15 x [94°C (30s)/55°C (30s)/72°C (120s)] 1 x [72°C (180s)] El producto de PCR se purificó en gel y se clonó en p7313ie, utilizando los sitios de restricción Notl y BamHl, para generar p73l-RT w229k. (Véase la figura 13) 3. Plásmide: p73i-T ar?p Gen de interés: La porción p17/p24 de GAG de codón optimizado, RT de codón optimizado y gen Nef truncado de la cepa HXB2 del subtipo B del VI H-1 cadena abajo de un promotor HCMV de longitud lowa -:- exonl , y cadena arriba de una señal de poliadenilación de ß-globina de conejo. Construcciones de triple fusión que contienen una forma activa de RT pueden no ser aceptables para las autoridades reguladoras para uso humano, por ello se consiguió la inactivación de RT por inserción de un fragmento de corte con Nhel y Apal de p73i-RT w229k, en el corte con Nhel/Apal p73i-GRN2 n°19 (Figura 14). Esto da como resultado un cambio de W ? K en la posición 229 de la RT. La secuencia completa del inserto plasmídico Tgrn se muestra en la Figura 7. Esta contiene p17 p24 (opt) Gag, pdd RT (opt e inactivado) y Nef truncado.

Construcciones alternativas de Gag, RT y Nef son las siguientes: trNef - pdd RT (opt) - p17, p24 (opt) Gag, trNef - p17, p24 (opl) Gag - p66 RT (opi), pdd RT (opl) - p17, p24 (opt) Gag - trNef, p66 RT (opi) - trNef - p17, p24 (opt) Gag, p17 , p24 (opt) Gag - írNef - pdd RT (opí).

Las secuencias completas para estas construcciones se presentan en las Figuras 8 a 12 respectivamente.

Ejemplo 3. Inserción de 8a secuencia Gata. KT. INeff ®n Aderae^ñrus. Subclonación de. móduB® de expresión GRN @n piásomnd© pShuttl®. El módulo de expresión completo consistente en promotor, ADNc y señal de poliadenilación se aisló de construcciones pT-GRN por digestión doble con Sph I y EcoR I . El extremo Sph I del fragmento Sph l/EcoR I se rellenó con Klenow y se clonó en el plásmido pShuftle en los sitios EcoR I y Mlu I en los que el exlremo Mlu I era romo. Durante el proceso de clonación quedó asociada con el módulo de expresión del VIH una secuencia de flanqueo adicional. Esta secuencia se conoce como la secuencia Cer y no tiene función conocida.

Transferencia de rraéd?H© de expresión GRM ©n ©0@i7D@s moleculares eom s?presoór. de E1/E3 de wateres Bandejas y Bandeja?. El módulo de expresión se recuperó de digesíiones de pShuttle por l-Ceu I y Pl-Sce I y se clonó en los mismos sitios de los clones moleculares de veclores Bandejad y Bandeja7. Los clones recombinanles se identificaron por selección verde/blanco y se confirmó por análisis con enzimas de restricción e?tensivo.

Rescate y propagacñópi d® wms reeombinaipites. Se írataron clones moleculares de vectores C6 y C7 con endonucleasas de restricción adecuadas (Pmel y Pací respectivamenle) para liberar genomas de vectores lineales intactos y se transfectaron en células 293 usando el procedimiento de fosfaío de calcio. Cuando se observó el efecío ciiopáiico compleío en las células iransfeciadas, se recogieron los lisados virales en bruto y se e?pandieron gradualmente hasta infecciones a gran escala en células 293 (1 ?109 células). Los virus de las infecciones a gran escala se purificaron por procedimiento de sedimentación con CsCl convencional . Además, el plásmido pShutíle se puede recortar más cortando con EcoRI y Xmnl para eliminar una secuencia enlazador 3' y reduci r el tamaño del plásmido para producir pShutíleGRNc. Este plásmido modificado se puede usar para generar un virus Bandeja7 adicional (C7-GRNc) usando el procedimiento que se ha descrito antes. Se insertaron otras construcciones de forma similar tanto en el adenovirus Bandeja 6 como Bandeja 7. No obstaníe no se produjo con é?iío Bandeja 6 con un inserto p66 RT (opí) - írNef -p17, p24 (opl) Gag.

EiempCe 4. Modelo ú® i?nmyn®ia®n¡©.dg?e- en ell ratón Se ensayaron una serie de veclores Bandejad y Bandeja7 que conlenían i nserios reordenados de los antígenos de VI H RT, Nef y Gag (RG N , N RG , NGR, G RN , y G NR) para determi nar las respuestas inmunes in vivo. Se llevaron a cabo tres experimentos para ensayar los virus Bandejad y dos para Bandeja7. Cada adenovi rus se adminislró intramuscularmente en un vol umen de 50 µl en una única pata trasera de ratones Bal b/c (K2d) en una dosis de 1 x108 partículas. Esta dosis se seleccionó puesto que había demostrado previamente inducir buenos niveles de respuesías inmunes cel ulares (no publicado) . La Tabla 1 muesíra los adenovirus que se compararon en estos experimentos. TabOa 1 Después de la estimulación in vitro con péptidos o proíeínas a epííopes específicos en Gag, Nef y RT, se midió la generación de respueslas CD8 y CD4 por ensayo ELIspot a los 14 y 28 días después de la sensibilización. Los resultados proporcionan una fuerte evidencia de que todas las variantes pueden generar una respuesta inmune primaria pótenle que se mide por la producción de I FN ? e I L-2 comparada con el vector vacío control (datos no mostrados). Los datos de estos esíudios se analizaron esíadísticamente (usando un análisis de variancia (ANOVA) de modelo mixto en Proc Mixed en SAS (versión 9.1.3 Service Pack 2) para deíerminar una clasificación de las varianles RNG en Bandejad y Bandeja/ en momentos temporales distintos. La suma de las respuestas a pépíidos CD8 para la producción de I FN ? se cuantificó para Gag y RT, mientras que los datos de IL-2 ELIspot se evaluaron en base a la suma de respuestas a los péptidos CD4 para Gag, Nef y RT. La clasificación del grupo de variantes se calculó usando el modelo Bayesiano (llevado a cabo usando la afirmación previa en Proc Mixed con un valor fijo antes de generar 100.000 muestras más; véase Tierney, L. (1994), "Markov Chains for Exploring Posterior Distributions" (con discusión), y Annals of Statistics, 22, 1701 - 1762. Gelfand, A. E. , Hills, S.E. , Racine-Poon, A. , y Smith, A. F.M . (1990), "lllustration of Bayesian Inference in Normal Data Models Using Gibbs Sampling," Journal of the American Statistical Association, 85, 972 - 985) para pronosticar la probabilidad de cada una de las variantes como la "mejor", en base a los datos proporcionados por las condiciones experimentales investigadas. La Figura 1 représenla la suma de las respuestas Bandejad CD4 y CD8 para I FN ? e I L-2 con cada péptido el día 14 y 28 según se predijo por el procedimiento Bayesiano. La Figura 2 representa la suma de las respuestas Bandeja7 CD4 y CD8 para IFN ? e I L-2 con cada pépíido el día 14 y 28 según se predijo por el procedimiento Bayesiano. Todos los insertos muestran un aumenío significativo en las respuestas inmunes comparado con el vector vacío control. El análisis estadístico muestra que no hay diferencias significativas eníre los diferentes virus.

Eiemplo i. Modelo de inmunotaenócidad @n ®8 ©erd® Los resultados de varios estudios han indicado que el cerdo es un buen modelo para ensayar la inmunogenicidad de vacunas candidatas. Se diseñó un estudio para investigar la inmunogenicidad de cuatro adenovirus NHP candidatos en minicerdos. Se inmunizaron grupos de 5 minicerdos con PAN6GRN, PAN6NGR, PAN7GRN o PAN7NGR (en la Tabla 2 pueden encontrarse detalles de los lotes). Cada animal recibió un total de 3 x 1010 partículas víricas de adenovirus por vía intramuscular (usando un volumen de 1 ,0 ml dividido igualmente entre cada músculo medio de la pata).

Tabla 2. Lotes de adßnovUrus NHP usados para ®_ exi con minißerdos Se recogieron mueslras de sangre antes de la inmunización y a intervalos después de la inmunización de cada animal. Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron y reestimularon in vitro con mezclas y proteínas de genotecas peptídicas de RT, Nef y Gag. Las mezclas de genotecas peplídicas consistían en péptidos de 15-mero solapando 1 1 aminoácidos que abarcan la secuencia completa de RT, Nef y Gag y eran los mismos que se usaron para los experimentos in vivo en ratones. La producción de interferón-gamma por eslas células porcinas se ha medido usando ensayos ELIspot. La Figura 3 muesíra las respueslas a mezclas de genotecas peptídicas de RT, Nef y Gag en los 4 tiempos de muesireo. Las respuestas se detectan para los cuatro virus siete días después de la inmunización. La respuesta celular a los cuatro virus NHP se mantiene hasta al menos 5 semanas después de la inmunización primaria. PAN6-GRN genera la respuesta más potente a los 7 días después de la inmunización primaria por I FN-gamma ELIspot.

Ejemplo ß. Modelo de inmunogen-Cidad ®n prdmiates Los resultados de un estudio piloto en primates indicaron que la i nyección i níramuscular de adenovirus NHP que expresa RT, Nef y Gag indujo respuestas inmunes celulares en monos cinomolgos. Se diseñó un estudio para investigar la inmunogenicidad de cuatro adenovirus NHP candidatos en monos cinomolgos. Los grupos de ani males se inmunizaron con PAN6-G RN, PAN6-NG R, PAN7-GRN o PAN7-NGR (en la Tabla 3 pueden encontrarse detalles de los loíes de virus) . Cada animal recibió un total de 1 01 1 partículas víricas de adenovirus por vía intramuscular (usando un volumen de 1 ,0 ml dividido igualmente entre cada músculo medio de la pata).

Tabla 3. Lotes de adesiovir?s NH P usadlos para ®. expepnn en primates Se recogieron muestras de sangre antes de la inmunización y a intervalos semanales posteriormente. Las cél ulas mononucleares de sangre periférica se aislaron y volvieron a esti mular in vitro con mezclas de genotecas peptídicas RT, Nef y Gag. La producción de interferón-gamma por estas cél ulas de primates se midió usando ensayos ELIspot. La Figura 4 muestra la respuesta de cada grupo en los tres tiempos de muestreo. Los resultados muestran que todos los grupos respondieron fuertemente una semana después de la inmunización primaria, con respuestas mantenidas hasta al menos 7 semanas después de la inmunización. Los resultados sugieren que e?iste poca diferencia entre los vectores cuando se usan a esta dosis (es decir 101 1 partículas) en primates.

E.epripB® 7. Respuestas ónproMiñig ^©süm s ú® Da 6 n??w miro 8 -cae 5 ó ira promana a un üipitervai® ú® @5Ss ú® a l®[ra@^.ras BMH P gnu® ©@diffD©a§n an,í5.to]®.n®g <3RM de ¥IH BIBs®rad@s iot?^raBtra?s©? ?ila -ta®?ri3S® ([ó.m.]). Para evaluar el impacto de la dosis de adenovirus en inmunización primaria, se inmunizaron un grupo de ratones (n=5) intramuscularmenle (i .m.) con dosis crecientes de Adenovirus NHP (de 10 a 10^ partículas). Como control positivo se inmunizó un grupo de animales con ADN (2 Dg) usando liberación epidérmica mediada por partículas (ND5). El día 6 y el día 19 después de la inmunización, se programó la e?tirpación del bazo de los animales. Las respuestas inmunes se controlaron por ensayo IFN-a ELISPOT usando una mezcla de genoteca peptídica para cada uno de los antígenos (GAG y RT) para estimular los esplenocitos duraníe la noche. La Figura 5 muesira las respuestas de cada grupo en los dos tiempos de muestreo.

Eiemplo 8 Respuestas inmunitaroas después de 8a Bnmuniza©ió?p? primaria a un intervalo de dosis d© AdenovErus MHP que co UigSc antígenos GRN de V8H iiberados intradérmeeament® fl.d.l. Para evaluar el impacto de la dosis de adenovirus en la inmunización primaria, se inmunizó intradérmicamente (i .d. ) con dosis crecientes de adenovirus NHP (de 107 a 1010 partículas) un grupo de ratones (n=5). Como control positivo se inmunizó un grupo de animales con ADN (1 üg) usando liberación epidérmica mediada por partículas (PM ED). El día 7 y el día 14 después de la inmunización se programó la extirpación del bazo en los animales. Las respuestas inmunes se controlaron por ensayo I FN-a ELISPOT. Los esplenocitos se estimularon durante la noche usando péptidos bien definidos para cada anlígeno (GAG y RT) que estimulan específicamente las células T CD4 o CD8. La Figura 6 muestra las respuestas de cada grupo en los dos tiempos de muestreo. Estos resultados sugieren que ambas vías, i.m. e i.d. son eficaces para la administración de las composiciones de la invención.

Descripción de 8as figuras Figura 1. Clasificación de Adenovirus Bandejad VI H. Esta representa la suma de las respuestas CD4 y CD8 de Bandejad para I FN ? e I L-2 con cada péptido el día 14 y 28, como se predijo por el procedimienlo Bayesiano. El eje y represenía células que forman punios por millón de esplenociíos. Figura 2. Clasificación de Adenovirus Bandeja7 VI H. Esia represenía la suma de las respuestas CD4 y CD8 de Bandeja7 para I FN ? e I L-2 con cada péptido el día 14 y 28, como se predijo por el procedimiento Bayesiano. El eje y representa células que forman puntos por millón de esplenocitos. Figura 3. Respuestas de minicerdos a mezclas de genotecas pepíídicas de RT, Nef y Gag en las semanas 0, 1 , 3 y 5 después de la inmunización primaria. Los resultados son la media ± el error típico de la suma de respuestas a cada mezcla de genoteca peptídica para cada animal. Los datos se obtuvieron de la Universidad de Pennsylvania. Figura 4. Respuestas de primates a mezclas de genotecas peptídicas de RT, Nef y Gag en las semanas 0, 1 y 2 después de la inmunización primaria. Los resultados son la media ± el error típico de la suma de respuestas a cada mezcla de genoteca peptídica para cada animal. Figura 5: Respuestas inmunes después de la inmunización primaria a un intervalo de dosis de Adenovirus NHP que codifica antígenos GRN de VI H liberados intramuscularmenle (i.m.). El grupo de raíones (n=5) se ha inmunizado con diversas dosis de adenovirus NHP (desde 107 a 1010 partículas) y se han controlado las respuestas inmunes celulares freníe a una mezcla de genoíecas peptídicas para cada antígeno (día 6 y día 19) usando ensayo I FN-? ELISPOT. Figura 6: Respuestas inmunes después de la inmunización primaria a un intervalo de dosis de adenovirus NHP que codifica antígenos GRN de VI H liberados intradérmicamente (i.d. ). El grupo de ratones (n=3) se ha inmunizado con diversas dosis de adenovirus NHP (de 107 a 1010 partículas) y se han controlado las respueslas inmunes celulares frenle a pépíidos específicos (día 7 y día 14) usando ensayo IFN-? ELISPOT. Figuras 7 a 12: Secuencias de polinucleólidos, secuencias de aminoácidos y mapas de restricción para las construcciones descritas en el Ejemplo 2. En la Tabla 4 se presentan detalles de las secuencias Tabla 4:

Claims (10)

1. f EflWIINIDIC COOKIES 1 . Un vector adenovirus que comprende un polinucleótido o polinucleótidos que codifican al menos los antígenos de VI H RT, Nef y Gag o derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de los mismos, dispuestos de forma que se transcriben en el orden Gag, RT, Nef.
2. 2. Un vector adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el RT está truncado.
3. 3. Un vector adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el Nef está truncado.
4. 4. Un vector adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el Gag es sólo p17 y p24.
5. 5. El vector adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tamaño del polinucleótido o polinucleótidos de VI H es tal que el tamaño toíal del veclor varía del 90 al 100% del lamaño del virus.
6. 6. El vector adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el virus es un adenovirus de primate no humano.
7. 7. El vector adenovirus de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el virus es un adenovirus de chimpancé.
8. 8. El vector adenovirus de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el adenovirus se selecciona de bandeja 5, 6, 7 y 9.
9. 9. El vector adenovirus de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el adenovirus es bandeja 6.
10. 10. El vector adenovirus de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el adenovirus es bandeja 7. 1 1 . El vector adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el virus es defectuoso en la replicación. 12. El vector adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el virus tiene supresiones en las regiones E1 y E3. 13. El vector adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias de polinucleótidos que codifican los antígenos de VI H están dispuestas como una fusión. 14. Un vector adenovirus de chimpancé que comprende una de las siguientes construcciones de polinucleótido: p17, p24 (codón optimizado) Gag - p66 RT (codón oplimizado) - Nef íruncado; Nef íruncado - pdd RT (codón oplimizado) - p17, p24 (codón optimizado) Gag; Nef truncado - p17, p24 (codón optimizado) Gag - p66 RT (codón optimizado); pdd RT (codón optimizado) - p17, p24 (codón optimizado) Gag - Nef truncado; pdd RT (codón optimizado) - Nef truncado - p17, p24 (codón optimizado) Gag; p17 , p24 (codón optimizado) Gag - Nef truncado - pdd RT (codón opti mizado). 1 5. Un vector adenovirus de acuerdo con la reivi ndicación 1 4, en el que el Adenovirus es Bandeja 6 o Bandeja 7 con la condición de que cuando el adenovirus es Bandeja 6 la construcción no es pdd RT (opt) - trNef - p1 7, p24 (opt) Gag. 16. Una composición inmunógena que comprende el vector virus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 17. El uso de un vector adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 5 en la fabricación de un medicamento para el íratamiento o profilaxis de infección por VI H . 1 8. Un procedimiento para preparar un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 5 que comprende las etapas de: a) proporcionar un vector adenovirus; b) proporcionar un plásmido que porte las secuencias de antígeno del VI H unidas de forma operativa a un promotor adecuado; c) transfeclar células con el plásmido y el vector; d) dejar que pase tiempo suficiente para que se produzca la recombinación; y e) recuperar el veclor virus recombinante que porta l as secuencias de antígenos del VI H. 1 9. Un procedimiento para producir una respuesta inmune en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento admi nistrar a un mamífero una cantidad adecuada de una composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 16. 20. Una proteína de fusión e?presada por el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 21 . Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 20 producida dentro del cuerpo humano.