PL209133B1 - Rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie - Google Patents

Rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie

Info

Publication number
PL209133B1
PL209133B1 PL373602A PL37360202A PL209133B1 PL 209133 B1 PL209133 B1 PL 209133B1 PL 373602 A PL373602 A PL 373602A PL 37360202 A PL37360202 A PL 37360202A PL 209133 B1 PL209133 B1 PL 209133B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
protein
adenoviral
fragment
pan7
Prior art date
Application number
PL373602A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373602A1 (pl
Inventor
James M. Wilson
Guangping Gao
Soumitra Roy
Original Assignee
Univ Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Pennsylvania filed Critical Univ Pennsylvania
Publication of PL373602A1 publication Critical patent/PL373602A1/pl
Publication of PL209133B1 publication Critical patent/PL209133B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/17011—Spumavirus, e.g. chimpanzee foamy virus
    • C12N2740/17022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie.
Adenowirus jest dwuniciowym wirusem DNA o wielkości genomu około 36 kilozasad (kb), który ma szerokie zastosowanie w przenoszeniu genów, ze względu na jego zdolność do uzyskiwania bardzo wydajnego przeniesienia genów do różnych docelowych tkanek i dużej pojemności trans-genowej. Konwencjonalnie, geny E1 adenowirusa są usuwane i zastępowane transgeniczną kasetą obejmującą wybrany promotor, sekwencję cDNA genu będącego przedmiotem zainteresowania i sygnał poliA, uzyskując zrekombinowany wirus o uszkodzonej replikacji.
Adenowirusy mają charakterystyczną morfologię obejmującą ikosaedralny kapsyd obejmujący trzy główne białka, hekson (II), podstawę pentonową (III) i białko wypustek włóknistych (IV), wraz z pewną liczba innych mniejszych białek, VI, VIII, IX, IIIa i IVa2 [W. C. Russell, J. GenVirol., 81: 2573-2604 (Nov 2000)]. Genom wirusa jest liniowym, dwuniciowym DNA o terminalnym białku połączonym kowalencyjnie z końcem 5', który ma końcowe odwrócone powtórzenia (ITR, ang. inverted terminal repeats). Wirusowy DNA jest blisko związany z silnie zasadowym białkiem VII i małym peptydem określanym jako mu. Inne białko, V, jest upakowane z kompleksem DNA-białko i dostarcza strukturalne połączenie z kapsydem przez białko VI. Wirus również zawiera kodowaną przez wirus proteazę, która jest konieczna do dalszej obróbki pewnych białek strukturalnych, do wytwarzania dojrzałych, zakażających wirusów.
Opisano zastosowanie zrekombinowanych adenowirusów do dostarczania cząsteczek do komórek gospodarza. Patrz, opis patentowy US 6,083,716, który przedstawia genom dwóch adenowirusów szympansa.
Konieczne jest w dziedzinie, opracowanie bardziej skutecznych wektorów, w których unika się wpływu wcześniej istniejącej immunogenności wybranych adenowirusowych serotypów w populacji, i/lub które są użyteczne do powtarzanego podawania i do zwiększenia miana po drugim szczepieniu, jeśli jest to konieczne.
Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanych sekwencji kwasów nukleinowych i sekwencji aminokwasowych sześciu małpich adenowirusów, wektorów zawierające te sekwencje i linii komórkowych prowadzących ekspresję genów małpiego adenowirusa. Również dostarczono wiele metod zastosowania wektorów i komórek według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany adenowirus, który obejmuje kapsyd zawierający białko heksonu, białko pentonu i białko włókna, przy czym białko heksonu Pan7 ma sekwencję SEK NR ID:11, a adenowirus ponadto obejmuje sekwencję adneowirusa bez części lub całości genu E1, konieczne do replikacji i otoczenia kapsydem adenowirusowe elementy cis 5' i 3', heterologiczny dla adenowirusa transgen funkcjonalnie połączony z sekwencjami, które kierują ekspresją tego genu w komórkach gospodarza.
Przedmiotem wynalazku jest też rekombinowany adenowirus obejmujący kapsyd zawierający hekson obejmujący fragement białka heksonu Pan7, sekwencję adenowirusa, w której nie ma całości lub części genu E1, sekwencję kwasu nukleinowego heterologiczną wobec Pan7, przy czym fragment białka heksonu Pan7 stanowi sekwencję SEK NR ID: 11 białka heksonu Pan7 mającą skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o długość około 50 aminokwasów.
Korzystnie kapsyd adenowirusa według wynalazku ponadto obejmuje fragment białka włókna Pan7 z SEK NR ID: 20 Pan7 lub białko włókna AdPan7 z SEK NR ID: 12 lub białko pentonu AdPan7 z SEK NR ID: 6.
W korzystnej postaci wykonania rekombinowany adenowirus wedł ug wynalazku jest pseudotypowanym adenowirusem obejmującym konieczne do replikacji i otoczenia kapsydem adenowirusowe elementy cis 5' i 3', przy czym te elementy cis zawierają 5' końcowe odwrócone powtórzenia i 3' końcowe odwrócone powtórzenia z adenowirusa heterologicznego wobec AdPan7.
Również korzystnie rekombinowany adenowirus według wynalazku zawiera jeden lub więcej adenowirusowych genów, a korzystniej zawiera ponadto adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego wybrane spośród jednej lub więcej grup składających się z:
a) sekwencji 5' końcowych odwróconych powtórzeń (ITR);
b) regionu E3, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E3 ORF1, E3 ORF2, E3
ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORE8 i E3 ORF9;
PL 209 133 B1
c) regionu E4, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 i E4 ORF1; oraz
d) 3'ITR,
SEK NR ID:9 Pan7 lub sekwencji komplementarnej do niej.
Przedmiotem wynalakzu jest ponadto adenowirus obejmujący kapsyd adenowirusowy zawierający białko heksonu Pan7 z SEK NR ID: 11 i sekwencję heterologicznego adenowirusowego białka kapsydowego. Korzystnie sekwencja heterologicznego adenowirusowego białka kapsydu jest wybrana spośród:
białka pentonu Pan5 z SEK INR ID: 2 lub Pan6 z SEK NR ID: 10, lub jego fragmentu, oraz białka włókna Pan5 z SEK INR ID: 4 lub Pan6 z SEK NR ID: 8, lub jego fragmentu.
Korzystniej kapsyd adenowirusa według wynalazku obejmuje fragment białka pentonu Pan5 z SEK INR ID: 2 lub Pan6 z SEK NR ID: 10.
Również korzystnie kapsyd adenowirusa według wynalazku obejmuje białka włókna Pan5 z SEK INR ID: 4 lub Pan6 z SEK NR ID: 8.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany adenowirus mający kapsyd obejmujący fragment zawierający hekson z białka heksonu AdPan7 oraz sekwencję kwasu nukleinowego heterologiczną wobec AdPan7, przy czym fragment białka heksonu AdPan7 jest wybrany z grupy składającej się z:
sekwencji białka heksonu AdPan7 z SEK NR ID: 11 mającej skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o długość około 50 aminokwasów;
reszt aminokwasowych 125 do 443;
reszt aminokwasowych 138 do 441;
reszt aminokwasowych 138 do 163;
reszt aminokwasowych 170 do 176; oraz reszt aminokwasowych 404 do 430, w odniesieniu do SEK NR ID: 11.
W korzystnej postaci wykonania rekombinowany adenowirus wedł ug wynalazku obejmuje adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego wybrane spośród jednej lub więcej grupy składającej się z:
a) sekwencji 5' koncowych odwróconych powtórzeń (ITR);
b) regionu E3, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E3 ORF1, E3 ORF2, E3
ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, i E3 ORF9;
c) regionu E4, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E4 ORF7, E4 ORF6, E4
ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2, i E4 ORF1; oraz
d) 3'ITR,
Pan7 z SEK NR ID: 9 lub sekwencji komplementarnej.
Korzystniej rekombinowany adenowirus według wynalazku obejmuje co najmniej jedno białko kapsydu małpiego wybranego spośród:
białka pentonu Pan7 z SEK NR ID: 10 lub jego fragmentu; oraz białka włókna Pan7 z SEK NR ID: 12 lub jego fragmentu.
Wynalazek dotyczy także izolowanej komórki gospodarza, obejmującej rekombinowanego adenowirusa według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja obejmująca zrekombinowanego adenowirusa według wynalazku w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania rekombinowanego adenowirusa według wynalazku do wytwarzania leku przygotowanego do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciwko zakaźnemu czynnikowi u gospodarza będącego ssakiem, przy czym heterologiczny gen koduje antygen czynnika zakaźnego.
Opisane niniejszym sposoby obejmują dostarczanie ssakowi jednego lub więcej niż jednego wybranego heterologicznego genu przez podawanie wektora według wynalazku. Ze względu na fakt, że różne konstrukty wektorowe pochodzą z małpich, raczej niż z ludzkich adenowirusów, układ immunologiczny niemałpiego, ludzkiego lub zwierzęcego pacjenta nie jest wstępnie dostosowany do natychmiastowej odpowiedzi na wektor jako obcy antygen. Zastosowanie rozwiązań według wynalazku pozwala zatem na bardziej stabilną ekspresję wybranego transgenu, gdy jest podawany pacjentowi niebędącemu małpą. Zastosowanie kompozycji według wynalazku do szczepienia pozwala na prezentację wybranego antygenu do wywołania ochronnych odpowiedzi immunologicznych. Nie chcąc wiązać się z teorią, zdolność adenowirusów według wynalazku do transdukcji ludzkich komó4
PL 209 133 B1 rek dendrytycznych jest przynajmniej częściowo odpowiedzialna za zdolność zrekombinowanych konstruktów według wynalazku do indukowania odpowiedzi immunologicznej. Zrekombinowane małpie adenowirusy według wynalazku mogą również być stosowane do wytwarzania produktów genu heterologicznego in vitro. Takie produkty genów są same użyteczne w różnych i do różnych celów takich jak te opisane tutaj.
Te i inne rozwiązania i korzyści według wynalazku opisano bardziej szczegółowo poniżej.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 prezentuje dopasowanie sekwencji aminokwasowych L1 i części L2 pętli białka kapsydu heksonu adenowirusa szympansa C1 [SEK NR ID: 13], adenowirusa szympansa C68 (Pan-9) [SEK NR ID: 14] i nowych Pan5 [SEK NR ID: 15], Pan6 [SEK NR ID: 16] i Pan7 [SEK NR ID: 17] sekwencji adenowirusa szympansa według wynalazku. Oddziałujący konserwowany region jest częścią podstawowej domeny konserwowanej w serotypach adenowirusowych.
Fig. 2 prezentuje dopasowanie sekwencji aminokwasowych domen wypustek włóknistych szympansa 068 (Pan-9) [SEK NR ID: 18], Pan-6 [SEK NR ID: 19], Pan-7 [SEK NR ID: 20] i Pan-5 [SEK NR ID: 21] i ludzkich adenowirusowych serotypów 2 [SEK NR ID: 22] i 5 [SEK NR ID: 23].
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek dostarcza nowych sekwencji kwasów nukleinowych i sekwencji aminokwasowych z Ad Pan5 [SEK NR ID: 1-4, 15 i 21], Ad Pan6 [SEK NR ID: 5-8, 16, 19], i Ad serotypu Pan7 [SEK NR ID: 9-12, 17, 20], które pierwotnie wyizolowano z węzłów chłonnych szympansa. W kilku przypadkach w opisie, te adenowirusy są inaczej określane odpowiednio jako 05, 06 i 07. Również dostarczono sekwencji z adenowirusa SV1 [SEK NR ID: 24-28], które wyjściowo wyizolowano z komórek nerek małpy, makaka jawajskiego (ang. cynomolgus monkey). Wynalazek również dostarcza sekwencje adenowirusów SV-25 [SEK NR ID: 29-33] i SV-39 [SEK NR ID: 34-37], które pierwotnie wyizolowano z komórek nerek rezusa.
Niniejszy wynalazek dostarcza nowe wektory adenowirusowe i opakowujące je linie komórkowe do wytwarzania tych wektorów, do zastosowania w wytwarzaniu in vitro zrekombinowanego białka lub jego fragmentów lub innych czynników. Wynalazek dostarcza również kompozycji do wykorzystania w dostarczaniu heterologicznej czą steczki do zastosowań terapeutycznych lub szczepionek. Takie kompozycje terapeutyczne lub szczepionki zawierają adenowirusowe wektory niosące wprowadzoną heterologiczną cząsteczkę. Ponadto, nowe sekwencje według wynalazku są użyteczne w dostarczaniu zasadniczych funkcji pomocniczych koniecznych do wytwarzania zrekombinowanych wektorów wirusów stowarzyszonych z adenowirusami (AAV, ang. adeno-associated virus). Zatem, wynalazek dotyczy konstruktów wspomagających i lini komórkowych, które wykorzystują te sekwencje.
Termin „zasadnicza homologia albo „zasadnicze podobieństwo w odniesieniu do kwasu nukleinowego lub jego fragmentu, wskazuje że przy optymalnym dopasowaniu z odpowiednimi insercjami lub delecjami nukloeotydowymi w innym kwasie nukleinowym (lub jego nicią komplementarną), sekwencja nukleotydowa ma przynajmniej około 95 do 99% identyczności z przyrównywaną sekwencją.
Termin „zasadnicza homologia albo „zasadnicze podobieństwo w odniesieniu do aminokwasów lub ich fragmentów, wskazuje że, gdy przy optymalnym dopasowaniu odpowiednich insercji lub delecji aminokwasowych w innej sekwencji aminokwasowej, sekwencja aminokwasowa ma przynajmniej około 95 do 99% identyczności z przyrównywaną sekwencją. Korzystnie, homologia występuje wzdłuż sekwencji o pełnej długości, lub jej białka, lub jej fragmentu, który ma długość przynajmniej 8 aminokwasów, lub korzystniej, przynajmniej 15 aminokwasów. Przykłady odpowiednich fragmentów opisano poniżej.
Termin „procent identyczności sekwencji albo „identyczny w odniesieniu do sekwencji kwasów nukleinowych dotyczy reszt w dwóch sekwencjach, które są takie same gdy są zestawione tak, aby uzyskać maksymalne dopasowanie. Długości sekwencji, które są porównywane pod kątem identyczności mogą obejmować całą długość sekwencji (to jest, około 36 kilo par zasad), całą długość otwartej ramki odczytu genu, białka, podjednostki, lub enzymu [patrz na przykład, tabele dostarczające adenowirusowe regiony kodujące], lub konieczny jest fragment o długości przynajmniej około 500 do 5000 nukleotydów. Jednakże, identyczności pomiędzy mniejszymi fragmentami, to jest o przynajmniej około dziewięciu nukleotydach, zwykle o przynajmniej około 20 do 24 nukleotydach, przynajmniej o około 28 do 32 nukleotydach, przynajmniej o około 36 lub więcej nukleotydach, mogą również być konieczne. Podobnie, „procent identyczności sekwencji może być z łatwością wyznaczony dla sekwencji aminokwasowych, białka pełnej długości, lub jego fragmentu. Odpowiednio, fragment ma długość przynajmPL 209 133 B1 niej około 8 aminokwasów, i może mieć do około 700 aminokwasów. Przykłady odpowiednich fragmentów opisano poniżej.
Identyczność może być z łatwością wyznaczona stosując takie algorytmy i programy komputerowe jak zdefiniowano tutaj, przy ustawieniach wyjściowych. Korzystnie, taka identyczność występuje wzdłuż całej długości białka, enzymu, podjednostki, lub fragmentu o długości przynajmniej około 8 aminokwasów. Jednakże, identyczność może być oparta na krótszych regionach, które dopasowano do zastosowania do którego identyczny produkt genu jest wprowadzony.
Jak tutaj opisano, dopasowania wykonano stosując dowolny z wielu ogólnie lub komercyjnie dostępnych programów do wielokrotnego dopasowania sekwencji, takich jak „Clustal W, dostępnych przez serwery sieciowe w Internecie. Alternatywnie, również stosowane są narzędzia Vector NTI. Istnieje również pewna liczba algorytmów znanych w stanie techniki, które mogą być stosowane do określania identyczności sekwencji nukleotydowej, włącznie z tymi objętymii programami opisanymi powyżej. Jako inny przykład, polinukleotydowe sekwencje mogą być porównane stosując Fasta, program GCG wersja 6.1. Fasta dostarcza dopasowania i procent identyczności sekwencji regionów najlepszego nakładania się pomiędzy kwerendami i badanymi sekwencjami. Na przykład, procent identyczności sekwencji pomiędzy sekwencjami kwasów nukleinowych może być wyznaczony stosując Fasta z wyjściowymi parametrami tego programu (wielkość słowa 6 i czynnik NOPAM do macierzy zliczania) jak dostarczono w GCG wersja 6.1. Podobne programy są dostępne do wykonywania dopasowań aminokwasowych. Ogólnie programy te są stosowane z wyjściowymi parametrami, jednakże specjalista w dziedzinie może zmienić te ustawienia zgodnie z potrzebą. W innym rozwiązaniu, specjalista w dziedzinie może zastosować inny algorytm lub program komputerowy, który dostarcza przynajmniej taki poziom, identyczności lub dopasowania jaki dostarczają wymienione tu algorytmy i programy.
Jak stosowano w niniejszym opisie i zastrzeżeniach, termin „zawierać lub „obejmować i ich różne warianty, przykładowo „zawiera lub „obejmuje, „zawierający lub „obejmujący, stanowi włączenie innych składników, elementów, liczb całkowitych, etapów i tym podobnych. Terminy „składać się z albo „składający się z oznaczają wyłączenie innych składników, elementów, liczb całkowitych, etapów i tym podobnych.
I. Sekwencje małpiego adenowirusa
Wynalazek dostarcza sekwencje kwasów nukleinowych i sekwencje aminokwasowe Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i SV39, które są wyizolowane z innego wirusowego materiału, z którym są one związane w naturze.
A. Sekwencje kwasów nukleinowych
Sekwencje kwasów nukleinowych Pan5 obejmują nukleotydy 1 do 36462 z SEK NR ID:1. Sekwencje kwasów nukleinowych Pan6 obejmują nukleotydy 1 do 36604 z SEK NR ID: 5. Sekwencje kwasów nukleinowych Pan7 obejmują nukleotydy 1 do 36535 z SEK NR ID: 9. Sekwencje kwasów nukleinowych SV1 obejmują nukleotydy 1 do 34264 z SEK NR ID: 24. Sekwencje kwasów nukleinowych SV25 obejmują nukleotydy 1 do 31044 z SEK NR ID: 29. Sekwencje kwasów nukleinowych SV39 obejmują nukleotydy 1 do 34115 z SEK NR ID: 34. Patrz, Lista sekwencji.
Sekwencje kwasów nukleinowych znajdujące zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku obejmują ponadto nić, która jest komplementarna do sekwencji z SEK NR ID: 5, 9, 24, 29 i 34, jak i sekwencje RNA i cDNA odpowiadają ce tym sekwencjom i ich komplementarnym niciom. Ponadto w rozwią zaniach według wynalazku moż na stosować sekwencje kwasów nukleinowych, które mają wyższą niż 95 do 98% i korzystniej około 99 do 99,9% homologii lub identyczności z sekwencjami z Listy sekwencji. Niniejszym znajdują zastosowanie także naturalne warianty sekwencji kwasów nukleinowych, jak i zaprojektowane modyfikacje sekwencji, przedstawione jako SEK NR ID: 5, 9, 24, 29 i 34 i ich komplementarne nici. Takie modyfikacje obejmują, na przykład, znaczniki które są znane w stanie techniki, metylację i podstawienie jednego lub wię cej naturalnie wystę pują cych nukleotydów nukleotydem zdegenerowanym.
Wynalazek również obejmuje fragmenty sekwencji Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i SV39, ich komplementarne nici, komplementarne cDNA i RNA. Odpowiednie fragmenty mają długość przynajmniej 15 nukleotydów i obejmują funkcjonalne fragmenty, to jest, fragmenty które mają znaczenie biologiczne. Na przykład, funkcjonalny fragment może wyrażać pożądany adenowirusowy produkt lub może być użyteczny do wytwarzania zrekombinowanych wektorów wirusowych. Takie fragmenty obejmują sekwencje i fragmenty genów wymienione w tabeli poniżej.
PL 209 133 B1
Poniższe tabele przedstawiają regiony transkrypcyjne i otwarte ramki odczytu w sekwencjach małpich adenowirusów według wynalazku. Dla pewnych genów, transkrypy i otwarte ramki odczytu (ORF) są zlokalizowane na nici komplementarnej do tej przedstawionej jako SEK NR ID: 5, 9, 24, 29 i 34. Patrz na przykład, E2b, E4 i E2a. Przedstawiono również obliczone masy cząsteczkowe kodowanych białek. Należy zauważyć, że otwarta ramka odczytu E1a Pan5 [nukleotyd 576-1436 z SEK NR ID:1], Pan6 [nukleotyd 576 do 1437 z SEK NR ID: 5] i Pan7 [nukleotyd 576 do 1437 z SEK NR ID: 9] zawiera wewnętrzne miejsca cięcia. Te miejsca cięcia zapisano w poniższych tabelach.
Ad Pan-5 [SEK NR ID: 1]
Regiony Start (nukleotyd) Koniec (nukleotyd) M. cz. (Daltony)
1 2 3 4
ITR 1 120 -
E1a Transkrypt 478 -
13S 576-664, 1233-1436 28120
12S 576-1046, 1233-1436 24389
9S 576-644, 1233-1436 9962
Transkrypt 1516 -
E1b Transkrypt 1552 -
Mały T 1599 2171 22317
Duży T 1904 3412 55595
IX 3492 3920 14427
Transkrypt 3959 -
E2b Transkrypt 10349 -
PTP 10349 8451 72930
Polimeraza 8448 5083 127237
IVa2 5604 3980 50466
Transkrypt 3960
28,1 kD 5155 5979 28141
Agnoproteina 7864 8580 25755
L1 Transkrypt 10849 -
52/55D 10851 12025
IIIa 12050 13819 65669
Transkrypt 13832 -
Transkrypt 13894 -
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
L2 Penton 13898 15490 59292
VII 15494 16078 21478
V 16123 17166 39568
Mu 17189 17422 8524
Transkrypt 17442 -
Transkrypt 17488 -
L3 VI 17491 18222 26192
Hekson 18315 21116 104874
Endoproteaza 20989 21783 28304
Transkrypt 21811 -
E2a Transkrypt 26782 -
DBP 23386 21845 57358
Transkrypt 21788 -
L4 Transkrypt 23406 -
100 kD 23412 25805 88223
homolog o masie 33 kD 25525 26356 24538
VIII 26428 27111 24768
Transkrypt 27421 -
E3 Transkrypt 26788 -
Orf #1 27112 27432 12098
Or #2 27386 28012 23040
Orf #3 27994 28527 19525
Orf #4 28557 29156 22567
Orf #5 29169 29783 22267
Orf #6 29798 30673 31458
Orf #7 30681 30956 10477
Orf #8 30962 31396 16523
Orf #9 31389 31796 15236
Transkrypt 31837 -
L5 Transkrypt 32032 -
Włókno 32035 33372 47670
Transkrypt 33443 -
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
E4 Transkrypt 36135 -
Orf 7 33710 33462 9191
Orf 6 34615 33710 35005
Orf 4 34886 34521 13878
Orf 3 35249 34896 13641
Orf 2 35635 35246 14584
Orf 1 36050 35676 13772
transkrypt 33437 -
ITR 36343 36462 -
Ad Pan-6 [SEK NR ID: 5]
Regiony Start (nukleotyd) Koniec (nukleotyd) M. cz. (Daltony)
1 2 3 4
ITR 1 123 -
E1a transkrypt 478 -
13S 576-1143, 1229-1437 28291
12S 576-1050, 1229-1437 24634
9S 576-645, 1229-1437 10102
transkrypt 1516 -
E1b transkrypt 1553 -
Mały T 1600 2172 22315
Duży T 1905 3413 55594
IX 3498 3926 14427
transkrypt 3965 -
E2b transkrypt 10341 -
PTP 10340 8451 72570
Polimeraza 8445 5089 126907
IVa2 5610 3986 50452
transkrypt 3966 -
L1 transkrypt 10838 -
52/55 kD 10840 12012 44205
IIIa 12036 13799 65460
Transkrypt 13812 -
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
28,1 kD 5161 5985 28012
Agnoproteina 7870 8580 25382
L2 transkrypt 13874 -
Penton 13878 15467 59314
VII 15471 16055 21508
V 16100 17137 39388
Mu 17160 17393 8506
transkrypt 17415 -
L3 transkrypt 17466 -
VI 17469 18188 25860
Hekson 18284 21112 106132
Endoproteaza 21134 21754 23445
transkrypt 21803 -
E2a transkrypt 26780 -
DBP 23375 21837 57299
transkrypt 21780 -
L4 transkrypt 23398 -
100 kD 23404 25806 88577
homolog o masie 33 kD 25523 26357 24609
VIII 26426 27109 24749
transkrypt 27419 -
E3 transkrypt 26786 -
Orf #1 27110 27430 12098
Orf #2 27384 28007 22880
Orf #3 27989 28519 19460
Orf #4 28553 29236 25403
Orf #5 29249 29860 22350
Orf #6 29875 30741 31028
Orf #7 30749 31024 10469
Orf #8 31030 31464 16540
Orf #9 31457 31864 15264
transkrypt 31907 -
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
L5 transkrypt 32159
włókno 32162 33493 47364
transkrypt 33574 -
E4 transkrypt 36276 -
Orf 7 33841 33593 9177
Orf 6 34746 33841 35094
Orf 4 35017 34652 13937
Orf 3 35380 35027 13627
Orf 2 35766 35377 14727
Orf 1 6181 35807 13739
transkrypt 33558 -
ITR 36482 36604 -
Ad Pan-7 [SEK NR ID: 9]
Regiony Start (nukleotyd) Koniec (nukleotyd) M. cz. (Daltony)
1 2 3 4
ITR 1 132 -
E1a transkrypt 478
13S 576-1143, 1229-1437 28218
12S 576-1050, 1229-1437 24561
9S 576-645, 1229-1437 10102
transkrypt 1516 -
E1b transkrypt 1553 -
Mały T 1600 2178 22559
Duży T 1905 3419 55698
IVa2 3992 5616 50210
transkrypt 3971 -
E2b transkrypt 10341 -
PTP 10340 8457 72297
Polimeraza 8451 5095 126994
IX 3504 3932 14441
transkrypt 3972
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
28,1 kD 5167 5991 28028
Agnoproteina 7876 8586 25424
L1 transkrypt 10834
52/55 kD 10836 12011 44302
IIIa 12035 13795 65339
transkrypt 13808 -
L2 transkrypt 13870 -
Penton 13874 15469 59494
VII 15473 16057 21339
V 16102 17139 39414
Mu 17167 17400 8506
transkrypt 17420 -
L3 transkrypt 17467 -
VI 17470 18198 26105
Hekson 18288 21086 104763
Endoproteaza 21106 21732 23620
transkrypt 21781 -
E2a transkrypt 26764 -
DBP 23353 21815 51199
transkrypt 21755 -
L4 transkrypt 23370 -
100 kD 23376 25781 88520
33 kD homolog 25489 26338 25155
VIII 26410 27093 24749
transkrypt 27403 -
E3 transkrypt 26770 -
Orf #1 27094 27414 12056
Orf #2 27368 27988 22667
Orf #3 27970 28500 19462
Orf #4 28530 29150 22999
Orf #5 29163 29771 22224
Orf #6 29792 30679 32153
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
E3 Orf #7 30687 30962 10511
Orf #8 30968 31399 16388
Orf #9 31392 31799 15205
transkrypt 31842 -
L5 transkrypt 32091 -
włókno 32094 33425 47344
transkrypt 33517 -
E4 transkrypt 36208
Orf 7 33784 33536 9191
Orf 6 34689 33784 35063
Orf 4 34960 34595 13879
Orf 3 35323 34970 13641
Orf 2 35709 35320 14644
Orf 1 36123 35749 13746
transkrypt 33501 -
ITR 36404 36535 -
Ad SV-1 [SEK NR ID: 24] Ad SV-25 [SEK NR ID: 29] Ad SV-39 [SEK NR ID: 34]
Region Start Koniec Start Koniec Start Koniec
ITR 1 106 1 133 1 150
E1a 352 1120 - - 404 1409
E1b 1301 2891 359 2273 1518 3877
E2b 9257 2882 9087 2754 10143 3868
E2a 24415 20281 24034 20086 25381 21228
E3 24974 27886 24791 25792 25790 29335
E4 33498 30881 30696 28163 33896 31157
ITR 34145 34264 30912 31044 33966 34115
Ad SV-1 [SEK NR ID: 24] Ad SV-25 [SEK NR ID: 29] Ad SV-39 [SEK NR ID: 34]
Region Start Koniec Start Koniec Start Koniec
1 2 3 4 5 6 7
ITR 1 106 1 133 1 150
L1 9513 12376 9343 12206 10416 13383
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6 7
L2 12453 15858 12283 15696 13444 16877
L3 15910 20270 15748 20080 17783 21192
L4 21715 25603 21526 25420 22659 26427
L5 28059 30899 25320 28172 29513 31170
ITR 34145 34264 30912 31044 33966 34115
białko Ad SV-1, SEK NR ID: 24
Start Koniec M. cz.
1 2 3 4 5
ITR 1 106 -
E1a 13S 459 953 18039
12S
E1b Mały T
Duży T 1301 2413 42293
IX 2391 2885 16882
E2b IVa2 4354 2924 54087
Polimeraza 6750 4027 102883
PTP 9257 7371 72413
Agnoproteina 6850 7455 20984
L1 52/55 kD 9515 10642 42675
IIIa 10663 12372 636568
L2 Penton 12454 13965 56725
VII 13968 14531 20397
V 14588 15625 39374
Mu 15645 15857 7568
L3 VI 15911 16753 30418
Hekson 16841 19636 104494
Endoproteaza 19645 20262 23407
2a DBP 21700 20312 52107
L4 100 kD 21721 240099 85508
VIII 24591 25292 25390
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5
E3 Orf #1 25292 25609 11950
Orf #2 25563 26081 18940
Orf #3 26084 26893 30452
Orf #4 26908 27180 10232
Orf #5 27177 17512 12640
Orf #6 27505 27873 13639
L5 Włókno #2 28059 29150 39472
Włókno #1 29183 30867 61128
E4 Orf 7 31098 30892 7837
Orf 6 31982 31122 33921
Orf 4 32277 31915 14338
Orf 3 32629 32279 13386
Orf 2 33018 32626 14753
Orf 1 33423 33043 14301
ITR 34145 34264
białko Ad SV-25, SEK NR ID: 29 Ad SV-39, SEK NR ID: 34
Start Koniec M. cz. Start Koniec M. cz.
1 2 3 4 5 6 7 8
ITR 1 133 - 1 150 -
E1a 13S 492 1355 28585
12S 492 1355 25003
E1b Mały T 478 1030 20274 1518 2075 21652
Duży T 829 2244 52310 1823 3349 55534
IX 2306 2716 13854 3434 3844 14075
E2b IVa2 4208 2755 5465 3912 5141 46164
Polimeraza 6581 3858 102839 7753 5033 103988
PTP 9087 7207 71326 10143 8335 69274
Agnoproteina 6681 7139 16025 - - -
L1 55/55 kD 9345 10472 42703 10418 11608 44232
IIIa 10493 12202 63598 11574 13364 66078
PL 209 133 B1 cd. tabeli
2 3 4 5 6 7 8
L2 Penton 12284 13801 56949 13448 14959 56292
VII 13806 14369 20369 14960 15517 20374
V 14426 15463 39289 15567 16628 39676
Mu 15483 15695 7598 16650 16871 7497
L3 VI 15749 16591 3037 1692 17695 28043
Hekson 16681 1944 6 104035 17785 20538 102579
Endoproteaza 19455 20072 23338 20573 21181 22776
2a DBP 21511 20123 52189 22631 21231 53160
L4 100 kD 21532 23829 85970 22659 25355 100362
VIII 24408 25109 25347 25410 26108 25229
E3 Orf #1 25109 25426 11890 26375 27484 42257
Orf #2 27580 28357 29785
Orf #3 28370 28645 10514
Orf #4 28863 29333 18835
Orf #5
Orf #6
L5 Włókno #2 25380 26423 37529
Włókno #1 26457 28136 60107 29515 31116 56382
E4 Orf 7 31441 31118 11856
Orf 6 29255 28395 33905 32292 31438 33437
Orf 4 29550 29188 14399 32587 32222 13997
Orf 3 29902 29552 13284 32954 32607 13353
Orf 2 230291 29899 14853 333478 32959 14821
Orf 1 30316 30696 14301 33764 33378 14235
ITR 30912 31044 33966 34115
Adenowirusowe sekwencje kwasów nukleinowych Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i SV39 są użyteczne jako środki terapeutyczne i do konstrukcji różnych układów wektorów i komórek gospodarza. Jak stosouje się niniejszym, wektor obejmuje dowolną odpowiednią cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą, nagi DNA, plazmid, wirus, kosmid lub epizom. Te sekwencje i produkty mogą być stosowane same lub w połączeniu z innymi adenowirusowymii sekwencjami lub fragmentami, lub w połączeniu z elementami z innych adenowirusowych lub nieadenowirusowych sekwencji. Adenowirusowe sekwencje są również użyteczne jako antysensowe wektory dostarczające wektory stosowane w terapii genowej, lub Wektory do szczepionek. Zatem, wynalazek dostarcza również cząsteczek kwasu nukleinowego, wektorów do dostarczania genów i komórek gospodarza, które zawierają sekwencje Ad według wynalazku.
PL 209 133 B1
Na przykład, wynalazek obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą małpie sekwencje Ad ITR. W innym przykładzie, wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą małpie Ad sekwencje kodujące żądany produkt genu Ad. Jeszcze inne cząsteczki kwasów nukleinowych skonstruowanych z zastosowaniem sekwencji według wynalazku będą z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie, w świetle informacji tutaj dostarczonych.
W jednym rozwiązaniu, zidentyfikowane tutaj regiony małpiego genu Ad mogą być stosowane w wielu róż nych wektorach do dostarczania heterologicznej czą steczki do komórki. Na przykł ad, wytworzono wektory do ekspresji białka kapsydu adenowirusa (lub jego fragmentu) w celu wytworzenia wektora wirusowego w opakowującej komórce gospodarza. Takie wektory mogą być zaprojektowane do ekspresji w układzie trans. Alternatywnie, takie wektory są zaprojektowane tak, aby były dostarczone do komórek, które stabilnie obejmują sekwencje, które wyrażają pożądane funkcje adenowirusowe, to jest jeden lub więcej niż jeden z regionów E1a, E1b, sekwencji końcowych odwróconych powtórzeń, E2a, E2b, E4, E4ORF6.
Ponadto, sekwencje genów adenowirusowych i ich fragmenty są użyteczne do dostarczania funkcji wspomagających koniecznych do wytwarzania wirusów zależnych od czynników wspomagających (na przykład, adenowirusowe wektory pozbawione zasadniczych funkcji lub wirusy stowarzyszone z adenowirusami (AAV)). W takich sposobach wytwarzania, sekwencje małpich adenowirusów według wynalazku są wykorzystywane w sposób podobny do sposobów opisanych dla ludzkiego Ad. Jednakże, ze względu na różnice w sekwencjach pomiędzy sekwencjami małpiego adenowirusa według wynalazku a sekwencjami ludzkiego Ad, zastosowanie sekwencji według wynalazku zasadniczo eliminuje możliwość rekombinacji homologicznej z funkcjami wspomagającymi w komórkach gospodarza niosących funkcje E1 ludzkiego Ad, na przykład, w komórkach 293, które mogą produkować zakaźne adenowirusowe skażenia w czasie wytwarzania rAAV.
Sposoby wytwarzania rAAV z zastosowaniem adenowirusowych funkcji wspomagających zostały opisane w pełni w literaturze dotyczącej ludzkich adenowirusowych serotypów. Patrz na przykład, opis patentowy US 6,258,595 i cytowane tam odnośniki. Patrz również, opisy patentowe US 5,871,982; WO 99/14354; WO 99/15685; WO 99/47691. Sposoby te mogą również być stosowane do wytwarzania serotypu AAV nie będącego serotypem ludzkim, obejmującym serotypy AAV naczelnych nie będących ludźmi. Małpie adenowirusowe sekwencje genów według wynalazku, które dostarczają konieczne funkcje wspomagające (tj. E1a, E1b, E2a i/lub E4 ORF6) mogą być szczególnie użyteczne do dostarczania koniecznej adenowirusowej funkcji, jednocześnie minimalizując lub eliminując możliwość rekombinacji z dowolnymi innymi adenowirusami obecnymi w komórce opakowującej rAAV, które są zazwyczaj pochodzenia ludzkiego. Zatem, wybrane geny lub otwarte ramki odczytu adenowirusowych sekwencji według wynalazku mogą być wykorzystane w tych sposobach wytwarzania rAAV.
Alternatywnie, w tych sposobach mogą być wykorzystane zrekombinowane małpie adenowirusowe wektory według wynalazku. Takie zrekombinowane małpie adenowirusowe wektory mogą obejmować, na przykład hybrydowy Ad/AAV szympansa, w którym szympansie sekwencje Ad flankują kasetę ekspresyjną rAAV złożoną z, na przykład AAV 3' i/lub 5' ITR i transgenu pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które kontrolują jego ekspresję. Specjalista w dziedzinie rozpozna, że jeszcze inne małpie adenowirusowe wektory i/lub sekwencje genu według wynalazku będą użyteczne do wytwarzania rAAV i innych wirusów zależnych od adenowirusowego czynnika wspomagającego (ang. helper).
W jeszcze innym rozwiązaniu, cząsteczki kwasu nukleinowego są zaprojektowane, aby dostarczały i umożliwiały ekspresję wybranych produktów genów adenowirusowych w komórkach gospodarza, w celu uzyskania pożądanego działania fizjologicznego. Na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencje kodujące białko adenowirusowe E1a według wynalazku może być dostarczana osobnikowi jako środek terapeutyczny do leczenia raka. Ewentualnie, taka cząsteczka jest pr zygotowana w postaci preparatu w nośniku opartym na lipidach i korzystnie ukierunkowana na komórki rakowe. Taki preparat może być połączony z innymi środkami terapeutycznymi do leczenia raka (tj. cisplatyną, taksolem, lub tym podobnym). Jeszcze inne zastosowanie sekwencji adenowirusowych dostarczonych tutaj będzie z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie.
Ponadto, specjalista w dziedzinie z łatwością zrozumie, że sekwencje Ad według wynalazku mogą być z łatwością dostosowane do zastosowania w różnych wirusowych i nie wirusowych układach wektorowych do dostarczania in vitro, ex vivo lub in vivo, terapeutycznych i immunogennych cząsteczek. Na przykład, małpie Ad genomy Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i/lub SV39 według wynalazku mogą być wykorzystane w wielu różnych układach wektorowych rAd i nie rAd. Takie układy wekPL 209 133 B1 torowe mogą obejmować na przykład, między innymi układy wektorowe plazmidowe, lentiwirusy, retrowirusy, wirusy ospy, wirusy krowianki i wirusy stowarzyszone z adenowirusami. Wybór tych układów wektorowych nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku.
Wynalazek dostarcza również cząsteczek użytecznych do wytwarzania małpich i pochodzących od małpy białek według wynalazku. Takie cząsteczki, które niosą polinukleotydy obejmujące małpie Ad sekwencje DNA według wynalazku mogą mieć postać nagiego DNA, plazmidu, wirusa lub dowolnego innego elementu genetycznego.
B. Małpie adenowirusowe białka według wynalazku
Wynalazek dostarcza również produktów genów powyższych adenowirusów, takie jak białka, enzymy i ich fragmenty, które są kodowane przez adenowirusowe kwasy nukleinowe. Niniejszym opisano białka Pan5, Pan6 i Pan7, SV1, SV25 i SV39, enzymy i ich fragmenty, o sekwencjach aminokwasowych kodowanych przez te sekwencje kwasów nukleinowych, które są wytworzone innymi sposobami. Takie białka obejmują te kodowane przez otwarte ramki odczytu zidentyfikowane w tabelach powyżej, na Fig. 1 i 2, i ich fragmenty.
Zatem, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza wyjątkowe białka małpich adenowirusów, które są zasadniczo czyste, to jest są wolne od innych białek wirusowych i związków białkopodobnych. Korzystnie, białka te są przynajmniej w 10% homogenne, korzystniej 60% homiogenne i najkorzystniej 95% homogenne.
W jednym rozwią zaniu, wynalazek dostarcza wyjątkowe białko kapsydu pochodzenia małpiego. Jak stosowano tutaj, pochodzące od małpiego białko kapsydu obejmuje dowolne adenowirusowe białko kapsydu, które zawiera białko kapsydu Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39, lub jego fragment, jak zdefiniowano powyżej, obejmujące, nie ograniczając zakresu, chimeryczne białka kapsydu, białka fuzyjne, sztuczne białka kapsydu, syntetyczne białka kapsydu i rekombinacyjne białka kapsydu, nie ograniczając zakresu do środków wytwarzania tych białek.
Tak więc, białka pochodzące od małpich białek kapsydu zawierają jeden lub więcej regionów Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 lub ich fragmentów (na przykład hekson, penton, włókno wypustki lub ich fragment) w połączeniu z regionami kapsydu lub ich fragmentami z różnych adenowirusowych serotypów, lub zmodyfikowane małpie białka kapsydu lub ich fragmenty, jak tutaj opisano. „Modyfikacja białka kapsydu związana ze zmienionym tropizmem jak stosuje się niniejszym, obejmuje zmienione białko kapsydu, to jest, region białka pontonu, heksonu lub włókna, lub jego fragmentu, takiego jak domena regionu wypustki w regionie włókna, lub polinukleotyd ją kodujący, tak, że zmieniona jest specyficzność. Pochodzący, od małpiego kapsyd może być skonstruowany z jednym lub więcej małpim Ad według wynalazku lub innym serotypem Ad, który może być pochodzienia ludzkiego lub mieć inne pochodzenie. Taki Ad może być otrzymany z różnych źródeł obejmujących ATCC, źródła rynkowe i uczelnie, albo sekwencje Ad mogą być otrzymane z GenBanku lub innych odpowiednich źródeł.
Dostarczono tutaj sekwencje aminokwasowe małpich adenowirusowych białek pentonów. Białko pentonu AdPan5 przedstawiono jako SEK NR ID: 2. Penton AdPan7 przedstawiono jako SEK NR ID: 6. Penton AdPan6 przedstawiono jako SEK NR ID: 10. Penton SV1 przedstawiono jako SEK NR ID: 25. Białko pentonu SV25 przedstawiono jako SEK NR ID: 30. Penton SV39 przedstawiono jako SEK NR ID: 35. Odpowiednio, dowolne z tych białek pentonów, lub wyjątkowe ich fragmenty, mogą być wykorzystane do różnych celów. Przykłady odpowiednich fragmentów obejmują penton mający skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o około 50, 100, 150, lub 200 aminokwasy, w oparciu o numerację aminokwasów dostarczoną powyżej i w SEK NR ID: 2; SEK NR ID: 6; SEK NR ID: 25; SEK NR ID: 30, lub SEK NR ID: 35. Inne odpowiednie fragmenty obejmują krótsze wewnętrzne, C-końcowe, lub N-końcowe fragmenty. Ponadto, białko pentonu może być zmodyfikowane w różnych celach znanych specjaliście w stanie techniki.
Wynalazek dostarcza ponadto sekwencji aminokwasowych białka heksonu Pan5 [SEK NR ID: 3], Pan6 [SEK NR ID: 7], Pan 7 [SEK NR ID: 11], SV1 [SEK NR ID: 26], SV25 [SEK NR ID: 31] i/lub SV39 [SEK NR ID: 36]. Odpowiednio, to białko heksonu, lub szczególne jego fragmenty, mogą być wykorzystane w różnych celach. Przykłady odpowiednich fragmentów obejmują hekson mający skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o około 50, 100, 150, 200, 300, 400, lub 500 aminokwasy, w oparciu o numerację aminokwasów dostarczoną powyżej i w SEK NR ID: 3, 7, 11, 26, 31 i 36. Inne odpowiednie fragmenty obejmują krótsze wewnętrzne, fragmenty C-końcowe, lub N-końcowe. Na przykład, jednym z odpowiednich fragmentów jest region pętli (domena) białka heksonu, oznaczony DE1 i FG1, lub jego hiperzmienny region. Takie fragmenty obejmują regiony obejmujące reszty ami18
PL 209 133 B1 nokwasowe od około 125 do 443; od około 138 do 441, lub mniejsze fragmenty, takie jak te obejmujące około reszty 138 do reszty 163; około 170 do około 176; około 195 do około 203; około 233 do około 246; około 253 do około 264; około 287 do około 297; i około 404 do około 430 małpich białek heksonów, w odniesieniu do SEK NR ID: 3, 7, 11, 26, 31 lub 36. Inne odpowiednie fragmenty mogą być z łatwością zidentyfikowane przez specjalistę w dziedzinie. Ponadto, białko heksonu może być zmodyfikowane w różnych celach znanych specjalistom w stanie techniki. Ponieważ białko heksonu jest determinantą serotypu adenowirusa, takie sztuczne białka heksonów mogą prowadzić do adenowirusów mających sztuczne serotypy. Stosując szympansie Ad sekwencje pontonu i/lub sekwencje włókien według wynalazku i/lub ich fragmenty mogą być skonstruowane również inne sztuczne białka kapsydów.
W jednym przykładzie, może być pożądane wytworzenie adenowirusa mającego zmienione białko heksonu, wykorzystując sekwencje białka heksonu według wynalazku. Odpowiedni sposób wprowadzania zmian w białkach heksonu opisano w opisie patentu US 5,922,315, który jest włączony jako odnośnik. W ten sposób, przynajmniej jeden region pętli heksonu adenowirusowego jest zmieniony na przynajmniej jeden region pętli innego serotypu adenowirusa. Zatem, przynajmniej jeden region pętli tak zmienionego adenowirusowego białka heksonu jest regionem pętli małpiego Ad heksonu według wynalazku (to jest Pan7). W jednym rozwiązaniu, region pętli białka heksonu Pan7 został zastąpiony regionem pętli z innego adenowirusowego serotypu. W innym rozwiązaniu, region pętli hekson Pan7 jest stosowany aby zastąpić region pętli z innego serotypu adenowirusowego. Odpowiednie serotypy adenowirusa mogą być z łatwością wybrane z grupy obejmującej ludzkie i nieludzkie serotypy, jak tutaj opisano. Pan7 jest wybrany jedynie w celach przykładowego przedstawienia; inne małpie Ad białka heksonów według wynalazku mogą być podobnie zmienione, lub stosowane aby zmienić inny hekson Ad. Wybór odpowiedniego serotypu nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku. Jeszcze inne zastosowania sekwencji białka heksonu według wynalazku będą z łatwością zrozumiałe dla specjalisty w stanie techniki.
Wynalazek również obejmuje białka włókna małpich adenowirusów według wynalazku. Białko włókna AdPan5 ma aminokwasową sekwencję jak przedstawiono w SEK NR ID: 4. Białko włókna AdPan6 ma aminokwasową sekwencję jak przedstawiono w SEK NR ID: 8. Białko włókna AdPan7 ma aminokwasową sekwencję jak przedstawiono w SEK NR ID: 12. SV-1 ma dwa białka włókna; włókno 2 ma sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEK NR ID: 27 i włókno 1 ma sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEK NR ID: 28. SV-25 również ma dwa białka włókna; włókno 2 ma sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEK ID NO: 32 i włókno 1 ma sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEK NR ID: 33. Białko włókna SV-39 ma sekwencję aminokwasową jak przedstawiono w SEK NR ID: 37.
Odpowiednio, to białko włókna, lub szczególne jego fragmenty, mogą być wykorzystane w różnych celach. Odpowiednim fragmentem jest wypustka włóknista, która obejmuje aminokwasy około 247 do 425 z SEK NR ID: 4, 8, 12, 28, 32, 33 i 37. Patrz fig. 2. Przykłady innych odpowiednich fragmentów obejmują włókno mające skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o około 50, 100, 150, lub 200 aminokwasy, w oparciu o numerację aminokwasów dostarczoną powyżej i w SEK NR ID: 4, 8, 12, 28, 32, 33 i 37. Jeszcze inne odpowiednie fragmenty obejmują krótsze wewnętrzne fragmenty. Ponadto, białko włókna może być zmodyfikowane stosując różne techniki znane specjalistom w stanie techniki.
Wynalazek również obejmuje wyjątkowe fragmenty białek według wynalazku które mają długość przynajmniej 8 aminokwasów. Jednakże, fragmenty o innych żądanych długościach mogą być z łatwością wykorzystane. Ponadto, wynalazek obejmuje takie modyfikacje jakie mogą być wprowadzone, aby zwiększyć wydajność i/lub ekspresję produktu genu Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39, to jest, konstrukty cząsteczek sprzężonych, w których cały produkt genu Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 lub jego fragment jest sprzężony (bądź bezpośrednio, bądź przez łącznik) z cząsteczką fuzyjną w celu ich zwiększenia. Inne odpowiednie modyfikacje obejmują, nie ograniczając zakresu, skrócenie regionu kodującego (to jest, białka lub enzymu) aby wyeliminować prekursorowe biało lub probiałko zwykle odcinane i aby dostarczyć dojrzałe białko lub enzym i/lub mutacje regionu kodującego, aby dostarczyć wydzielany produkt genu. Jeszcze inne modyfikacje będą z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie. Wynalazek obejmuje również białka mające przynajmniej około 95% do 99% identyczności z dostarczonymi tutaj białkami Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39.
Jak tutaj opisano, wektory według wynalazku zawierające sekwencje kodujące adenowirusowe białka kapsydu według wynalazku są szczególnie odpowiednie do zastosowania w rozwiązaniach,
PL 209 133 B1 w których neutralizacja przez przeciwciał a obniż a skuteczność innych wektorów opartych na serotypie Ad, jak i innych wektorów wirusowych. Wektory rAd według wynalazku są szczególnie korzystne w podawaniu w powtórzonej terapii genowej lub do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej (miana szczepionki).
W pewnych warunkach, może być pożądane zastosowanie jednego lub więcej produktów genów Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i/lub Sy39 (to jest, białka kapsydu lub jego fragmentu) aby wytworzyć przeciwciało. Termin „przeciwciało jak stosuje się tutaj, odnosi się do cząsteczki immunoglobuliny, która jest zdolna do specyficznego wiązania epitopu. Zatem, przeciwciała według wynalazku korzystnie wiążą się specyficznie i nie oddziałują krzyżowo z epitopem Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39. Przeciwciała według niniejszego wynalazku występują w wielu różnych postaciach obejmujących, na przykład, przeciwciała poliklonalne o wysokim powinowactwie, przeciwciała monoklonalne, przeciwciała syntetyczne, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała zrekombinowane i przeciwciała humanizowane. Takie przeciwciała pochodzą z klas immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD i IgE.
Takie przeciwciała mogą być wytworzone stosując dowolną liczbę sposobów znanych w stanie techniki. Odpowiednie przeciwciała mogą być wytworzone dobrze znanymi tradycyjnymi technikami, to jest wg Kohlera i Milsteina i stosując wiele znanych modyfikacji. Podobnie pożądane wysokie miano przeciwciał wytworzono przez zastosowanie znanych technik rekombinacji przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych powstałych w odpowiedzi na te antygeny [patrz na przykład. Zgłoszenie patentowe PCT nr PCT/GB85/00392; Brytyjskie zgłoszenie patentowe nr GB2188638A; Amit i wsp., 1986 Science, 233: 747-753; Queen i wsp., 1989 Proc. Natl. Acad. Soi. USA, 86: 10029-10033; Zgłoszenie patentowe PCT nr PCT/WO9007861; i Riechmann i wsp., Nature, 332: 323-327 (1988); Huse i wsp., 1988 Science, 246: 1275-1281]. W innym rozwiązaniu, przeciwciała mogą być wytwarzane w wyniku manipulacji komplementarnie wyznaczonymi regionami zwierzęcego lub ludzkiego przeciwciała w odpowiedzi na antygen wedł ug wynalazku. Patrz na przykł ad, E. Marlc i Padlin, Humanization of Monoclonal Antibody, rozdział 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, t. 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Springer-Verlag (June, 1994); Harlow i wsp., 1999, Applied Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow i wsp., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston i wsp., 1988, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 5879-5883; i Bird i wsp., 1988, Science 242 : 423-426. Przedmiotem wynalazku również są anty-idiotypowe przeciwciała (Ab2) i anty-anty- idiotypowe przeciwciała (Ab3). Patrz na przykład, M. Wettendorff i wsp., Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies. In Idiotypic Network and Disease, pod red. J. Cerny i J.Hiernaux, 1990 J.Ann.Soc. Microbiol., Washington DC: str. 203-229]. Te anty-idiotypowe i ante-anty-idiotypowe przeciwciała są wytwarzane stosując techniki dobrze znane specjalistom w stanie techniki. Przeciwciała te mogą być stosowane w różnych celach, obejmujących diagnostyczne i kliniczne zastosowania i zestawy.
W pewnych warunkach, moż e być pożądane wprowadzenie wykrywalnego znacznika lub zakończenia do wytwarzania genu Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39, przeciwciała lub innego konstruktu. Jak stosowano tutaj, wykrywalny znacznik jest cząsteczką, która może sama lub w wyniku oddział ywania z inną czą steczką dostarczać wykrywalny sygnał. Najbardziej pożądane jest, aby znacznik był wykrywany wzrokowo, to jest dzięki fluorescencji, do gotowego zastosowania w immunohistochemicznych analizach lub immunofluorescencyjnej mikroskopii. Na przykład, odpowiednie znaczniki obejmują izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), fikoerytrynę (PE), allofikocyjaninę (APC), koryfosfinę-O (CPO) lub barwniki tandemowe, PE-cyjaninę-5 (PC5), i PE-czerwień Teksasu (ECD). Wszystkie te fluorescencyjne barwniki są komercyjnie dostępne i ich zastosowanie jest znane w stanie techniki. Inne użyteczne znaczniki obejmują znaczniki z koloidalnego złota. Jeszcze inne użyteczne znaczniki obejmują związki lub pierwiastki radioaktywne. Dodatkowo, znaczniki obejmują różne układy enzymów, które działają przez emisję w teście sygnału kolorymetrycznego, na przykład oksydaza glukozowa (która wykorzystuje glukozę jako substrat) uwalnia jako produkt nadtlenek, który w obecności peroksydazy i donora wodoru, takiego jak tetrametylobenzydyna (TMB) produkuje utleniony TMB, co jest widoczne jako kolor niebieski. Inne przykłady obejmują peroksydazę chrzanową (HRP) lub alkaliczną fosfatazę (AP) i heksokinazę sprzężoną z dehydrogenazą glukozy-6-fosforanową, która oddziałuje z ATP, glukozą, i NAD+ do otrzymania, między innymi produktami, NADH, który jest wykrywany poprzez zwiększoną absorbancję przy długości fali 340 nm.
Inne układy znaczników, które mogą być wykorzystane, są wykrywane innymi środkami, na przykład, aby utworzyć koniugaty z docelowymi sekwencjami dostarczającymi wzrokowe sygnały
PL 209 133 B1 wskazujące na obecność uzyskanego kompleksu w stosowanych testach, stosowane są zamiast enzymów, barwione mikrocząsteczki lateksowe [Bangs Laboratories, Indiana], w których barwnik jest zamknięty.
Sposoby sprzęgania lub związywania znaczników z żądanymi cząsteczkami są również tradycyjne i znane specjalistom w dziedzinie. Znane sposoby przyłączenia znaczników opisano [patrz na przykład. Handbook of Fluorescent probes i Research Chemicals, 6th Ed., R. P. M. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 1996; Pierce Catalog and Handbook, Life Science i Analytical Research Products, Pierce Chemicals Company, Rockford, IL, 1994/1995]. Zatem, wybór znaczników i sposobow sprzęgania nie ogranicza zakresu obecnego wynalazku.
Sekwencje, białka i ich fragmenty mogą być wytworzone odpowiednimi środkami, obejmującymi wytwarzanie w wyniku rekombinacji, syntezy chemicznej, lub inne syntetyczne środki. Odpowiednie techniki wytwarzania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Patrz np., Sambrook i wsp.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). W innym rozwiązaniu, peptydy również mogą być syntetyzowane dobrze znanymi sposobami syntezy peptydów w fazie stał ej (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(1962); Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) str. 27-62). Te i inne odpowiednie sposoby wytwarzania są w zakresie wiedzy specjalisty w dziedzinie i nie stanowią ograniczenia niniejszego wynalazku.
Ponadto, specjalista w dziedzinie z łatwością zrozumie, że sekwencje Ad mogą być z łatwością dostosowane do zastosowania w różnych wirusowych i niewirusowych układach wektorowych do dostarczania in vitro, ex vivo i in vivo, terapeutycznych i immunogennych cząsteczek. Na przykład, w jednym rozwiązaniu, mał pie Ad biał ka kapsydu i inne białko mał piego adenowirusa, jak tutaj opisano, są stosowane do niewirusowego, opartego na białku podawania genów, białek i innych pożądanych cząsteczek diagnostycznych, terapeutycznych i immunogennych. W jednym takim rozwiązaniu, białko według wynalazku jest połączone, bezpośrednio lub pośrednio, z cząsteczką w celu skierowania do komórek z receptorem adenowirusów. Korzystnie, białko kapsydu takie jak hekson, penton, włókno lub ich fragment mający ligand receptora powierzchni komórki jest wybrane w celu takiego skierunkowania. Odpowiednie dostarczane cząsteczki są wybrane z grupy obejmującej cząsteczki terapeutyczne opisane tutaj i produkty genów. Jako łączniki mogą być wykorzystane różne łączniki obejmujące, lipidy, poliLys, i tym podobne. Na przykład, w takim celu z łatwością może być wykorzystywane małpie białko pentonu, w wyniku wytwarzania białka fuzyjnego, stosując małpią sekwencję pentonu w sposób analogiczny jak ten opisany w Medina-Kauwe LK, i wsp., Gene Tuer. 2001 May; 8 (10): 795-803 i Medina-Kauwe LK, i wsp., Gene Tuer. 2001 Dec; 8 (23): 1753-1761. W innym rozwiązaniu, sekwencje aminokwasowe małpiego Ad białka IX mogą być wykorzystane do ukierunkowania wektorów na komórkowe receptory powierzchniowe, jak opisano w opisie patentu US 20010047081. Odpowiednie ligandy obejmują antygen CD40, sekwencję zawierającą RGD lub zawierającą polilizynę i tym podobne. W tych i podobnych celach mogą być stosowane jeszcze inne małpie Ad białka, obejmujące, np. białko heksonu i/lub białko włókna.
Jeszcze inne adenowirusowe białka według wynalazku mogą być stosowane same, lub w połączeniu z innym adenowirusowym białkiem, w różnych celach, które będą z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie. Ponadto, jeszcze inne zastosowania adenowirusowych białek według wynalazku będą z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie.
II. Zrekombinowane wektory adenowirusowe
Kompozycje według wynalazku obejmują wektory, które dostarczają heterologiczną cząsteczkę do komórek, zarówno w celach terapeutycznych lub do szczepienia. Jak stosuje się niniejszym, wektor może obejmować dowolny element genetyczny obejmujący, nie ograniczając zakresu, nagi DNA, fag, transpozon, kosmid, epizom, plazmid, lub wirus. Takie wektory zawierają małpi adenowirusowy DNA z Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i/lubSV39 i minigen. Okreś lenie „minigen oznacza kombinację wybranego heterologicznego genu z innymi regulatorowymi elementami koniecznymi do kierowania translacją, transkrypcją i/lub ekspresją produktu genu w komórkach gospodarza.
Typowo, adenowirusowy wektor według wynalazku zaprojektowano tak, aby minigen był zlokalizowany w cząsteczce kwasu nukleinowego, która zawiera inne adenowirusowe sekwencje w regionie natywnym względem wybranego genu adenowirusowego. Minigen może być wprowadzony do istniejącego regionu genu, jeśli jest to pożądane, aby przerwać funkcję tego regionu. W innym rozwiązaniu, minigen może być wprowadzony w miejsce częściowo lub całkowicie usuniętego genu adenowirusowego. Na przykład, minigen może być zlokalizowany w miejscu takim jak miejsce delecji funkcjonalnej E1 lub delecji funkcjonalnej E3, które między innymi mogą być wybrane. Termin „funkcjonalnie usunięPL 209 133 B1 ty albo „delecja funkcjonalna oznacza, że wystarczająca ilość regionu genu została usunięta lub w inny sposób uszkodzona, na przykł ad w wyniku mutacji lub modyfikacji, tak ż e region genu nie jest dalej w stanie produkować funkcjonalnych produktów ekspresji genowej. Jeśli jest to pożądane, cały region genu może być usunięty. Inne odpowiednie miejsca przerwania lub usunięcia genu przedyskutowano w wymienionej literaturze.
Na przykład, do wytwarzania wektora użytecznego do wytwarzania zrekombinowanego wirusa, wektor może zawierać minigen i bądź koniec 5' genomu adenowirusowego bądź koniec 3' genomu adenowirusowego, lub oba końce 5' i 3' genomu adenowirusowego. Koniec 5' genomu adenowirusowego zawiera elementy cis 5' konieczne do wprowadzenia i replikacji; np. sekwencje 5' końcowe odwrócone powtórzenia (ITR) (które funkcjonują jako miejsca inicjacji procesu replikacji) i natywne domeny 5' zwiększające upakowanie (które zawierają sekwencje konieczne do upakowania liniowych Ad genomów i elementy enhansera promotora E1). Koniec 3' genomu adenowirusowego obejmuje czynniki 3' działające w układzie cis (obejmujące ITR) konieczne do upakowania i otaczania kapsydem. Odpowiednio, zrekombinowany adenowirus zawiera adenowirusowe czynniki zarówno 5' jak 3' działające w układzie cis i minigen zlokalizowany pomiędzy adenowirusowymi sekwencjami 5' a 3'. Dowolny wektor adenowirusowy według wynalazku może również zawierać dodatkowe sekwencje adenowirusowe.
Odpowiednio, te adenowirusowe wektory zawierają jeden lub więcej adenowirusowe elementy pochodzące z genomu adenowirusowego. W jednym rozwiązaniu, wektory zawierają adenowirusowe ITR z Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 i dodatkowe sekwencje adenowirusowe z takiego samego serotypu adenowirusowgo. W innym rozwiązaniu, wektory zawierają sekwencje adenowirusowe, które pochodzącą z innych adenowirusowych serotypów niż te, które dostarczają ITR. Jak zdefiniowano tutaj, termin pseudotypowany adenowirus odnosi się do adenowirusa, w którym białko kapsydu adenowirusa pochodzi z innych serotypów, niż serotyp który dostarcza ITR. Wybór serotypu z ITR i serotypu z innych adenowirusowych sekwencji obecnych w wektorze nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku. Różne szczepy adenowirusowe są dostępne z Amierican Type Culture Collection, Manassas, Virginia, lub dostępne poprzez zamówienie z różnych handlowych i instytucjonalnych źródeł. Ponadto, sekwencje z wielu z tych szczepów są dostępne z wielu różnych baz danych obejmujących, np., PubMed i GenBank. Homologiczne wektory adenowirusowe wytworzone z innych małpich lub ludzkich adenowirusów opisano w opublikowanej literaturze [patrz na przykład. Opis patentowy US Nr 5,240, 846]. Sekwencje DNA pewnej liczby typów adenowirusów są dostępne z GenBank, włącznie z typem Ad5 [GenBank Nr dostę pu M73260]. Adenowirusowe sekwencje mogą być otrzymane z dowolnego znanego adenowirusowego serotypu, takiego jak serotypy 2, 3, 4, 7, 12 i 40, i obejmuje również dowolne obecnie zidentyfikowane ludzkie typy. Podobnie adenowirusy, które są znane jako czynniki zakażające zwierzęta inne niż ludzie (np. małpy) również mogą być zastosowane w konstruktach wektorowych według wynalazku. Patrz na przykład, opis patentowy US Nr 6,083,716.
Wirusowe sekwencje, wirusy wspomagające, jeśli jest to wskazane, i zrekombinowane cząsteczki wirusowe i inne składniki wektorowe, i sekwencje zastosowane w konstrukcji wektorów opisanych tutaj otrzymano jak opisano powyżej. Sekwencje DNA Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 i/lub SV39 małpich adenowirusowych sekwencji według wynalazku zastosowano w konstrukcji wektorów i linii komórkowych użytecznych do wytwarzania takich wektorów.
Modyfikacje sekwencji kwasów nukleinowych tworzących wektory według wynalazku, obejmujące delecje, insercje, i inne mutacje sekwencji, mogą być wytworzone stosując standardowe techniki biologii molekularnej i są w zakresie wynalazku.
A. „Minigen
Sposoby zastosowane do wyboru transgenu, klonowania i konstrukcji „minigenu i jego wprowadzenia do wirusowego wektora są w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie przedstawionej w instrukcjach dostarczonych tutaj.
1. Transgen
Transgen jest sekwencją kwasu nukleinowego, heterologiczną względem sekwencji wektora flankujących transgen, które kodują polipeptyd, białko, lub inny produkt, będący przedmiotem zainteresowania. Kwas nukleinowy kodujący sekwencję jest funkcjonalnie połączony z regulatorowymi składnikami w sposób, który pozwala na transkrypcję, translację, i/lub ekspresję transgenu w komórkach gospodarza.
Kompozycja sekwencji transgenu będzie zależeć od zastosowania, do jakiego otrzymany wektor będzie wykorzystany. Na przykład, jeden typ sekwencji transgenu obejmuje sekwencję reportero22
PL 209 133 B1 wą, która w wyniku ekspresji wytwarza wykrywalny sygnał. Takie reporterowe sekwencje obejmują, nie ograniczając zakresu, sekwencje DNA kodujące laktamazę, β-galaktozydazę (LacZ), alkaliczną fosfatazę, kinazy tymidynowe, białko o zielonej fluorescencji (GFP), acetylotransferazę chloramenikolową (CAT), lucyferazę, białka związane z błoną obejmujące, na przykład, CD2, CD4, CD8, białko hemaglutyniny grypy i inne dobrze znane w stanie techniki, przeciwko którym przeciwciała o wysokim powinowactwie lub mogą być wytwarzane tradycyjnymi środkami, i białka fuzyjne obejmujące białka związane z błoną, odpowiednio sprzężone z antygenową domeną końcową z, między innymi, hemaglutyniną lub Myc. Te kodujące sekwencje, gdy są związane z elementami regulatorowymi, które kierują ich ekspresją, dostarczają sygnały wykrywane tradycyjnymi środkami, obejmujące testy enzymatyczne, radiograficzne, kolorymetryczne, fluorescencję lub inne testy spektrograficzne, testy wybiórcze aktywujące komórki fluorescencyjnie i testy immunologiczne, obejmujące test immunoenzymo-adsorbcyjny (ELISA), test radioimmunologiczny (RIA) i immunohistochemię. Na przykład, tam gdzie sekwencją markerową jest gen LacZ, obecność wektora niosącego sygnał jest wykrywana przez test na aktywność β-galaktozydazy. Tam gdzie transgenem jest GFP lub gen kodujący lucyferazę, wektor niosący sygnał może być zmierzony wzrokowo dzięki barwie lub emisji światła w luminometrze.
Jednakże, korzystnie, transgen jest niemarkerową sekwencją, kodującą produkt, który jest użyteczny w biologii i medycynie, taki jak białka, peptydy, RNA, enzymy, lub katalityczne RNA. Pożądane cząsteczki RNA obejmują tRNA, dsRNA, rybosomalne RNA, katalityczne RNA, i antysensowe RNA. Przykładem użytecznej sekwencji RNA jest sekwencja, która uniemożliwia ekspresję docelowej sekwencji kwasu nukleinowego u leczonego zwierzęcia.
Transgen może być stosowany do leczenia, na przykład niedoborów genetycznych, jako środek terapeutyczny lub szczepionka przeciwko rakowi, do indukcji odpowiedzi immunologicznej, i/lub do szczepionek profilaktycznych. Jak stosowano tutaj, indukcja odpowiedzi immunologicznej odnosi się do zdolności cząsteczki (na przykład, produkt genu) do indukowania limfocytów T i/lub humoralnej odpowiedzi immunologicznej na cząsteczkę. Wynalazek obejmuje również stosowanie wielokrotnych transgenów, na przykład do korygowania lub polepszania stanu powodowanego przez białko wielopodjednostkowe. W pewnych sytuacjach, inny transgen może być stosowany do kodowania każdej podjednostki białka, lub do kodowania różnych peptydów lub białek. Jest to pożądane, aby wielkość DNA kodującego podjednostkę białka była duża, na przykład immunoglobuliny, czynnika wzrostu pochodzącego od płytki, lub białka dystrofiny. W celu produkcji przez komórki białka wielopodjednostkowego, komórka jest zakażana zrekombinowanym wirusem zawierającym każdą z odmiennych podjednostek. W innym rozwiązaniu, różne podjednostki białka mogą być kodowane przez ten sam transgen. W tym przypadku pojedynczy transgen obejmuje DNA kodujący każdą z podjednostek, przy czym DNA kodujący każdą podjednostkę jest oddzielony przez wewnętrzne miejsce wejścia rybozymu (IRES). Jest to pożądane gdy wielkość DNA kodującego każdą z podjednostek jest mała, to jest, całkowita wielkość DNA kodującego podjednostki i IRES jest mniejsza niż pięć kilozasad. Alternatywnie do IRES, DNA może być rozdzielone sekwencjami kodującymi peptyd 2A, który ulega samoodcięciu w obróbce potranslacyjnej. Patrz na przykład, M. L. Donnelly, i wsp., J. Ge. Tirol., 78 (Ptl): 13-21 (Jan 1997); Furler, S. i wsp., Geneter. 8 (11): 864-873 (June 2001); Klump H., i wsp., Gene Ther., 8 (10): 811-817 (May 2001). Peptyd 2A jest znacząco mniejszy niż IRES, co czyni go odpowiednim do zastosowania, gdy ograniczającym czynnikiem jest przestrzeń. Jednakże, wybrany transgen może kodować dowolny produkt biologicznie aktywny lub inny produkt, na przykład produkt pożądany do badań.
Odpowiednie transgeny mogą być z łatwością wybrane przez specjalistę w dziedzinie. Wybór transgenu nie jest uważany za ograniczający według wynalazku.
2. Elementy regulatorowe
Oprócz głównych elementów zidentyfikowanych powyżej dla minigenu, wektor również obejmuje niezbędne tradycyjne elementy kontrolne, które są funkcjonalnie połączone z transgenem w sposób, który pozwała na jego transkrypcję, translację i/lub ekspresję w komórce transfekowanej wektorem plazmidowym lub infekowanej wirusem wytworzonym według wynalazku. Jak stosuje się tutaj funkcjonalnie połączone sekwencje obejmują zarówno sekwencje kontrolujące ekspresję, które sąsiadują z genem będącym przedmiotem zainteresowania i sekwencje kontrolujące ekspresję, które działają w układzie trans lub w pewnej odległości kontrolując gen będący przedmiotem zainteresowania.
Sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują odpowiednie sekwencje inicjacji transkrypcji, terminacji, promotor i enhancer; skuteczne sygnały obróbki RNA takiej jak splicing i sygnały poliadenylacji (poliA); sekwencje, które stabilizują cytoplazmatyczne mRNA; sekwencje, które zwiększają
PL 209 133 B1 skuteczność translacji (to jest, sekwencja zgodności Kozaka); sekwencje które zwiększają stabilność białka; i gdy jest to pożądane, sekwencje które zwiększają wydzielanie kodowanego produktu. Duża liczba sekwencji kontrolujących ekspresję, obejmujących promotory, które są natywne, konstytutywne, indukowalne i/lub specyficzne tkankowo, jest znana w stanie techniki i może być wykorzystana.
Przykłady konstytutywnych promotorów obejmują, nie ograniczając zakresu, promotor LTR retrowirusowego wirusa sarkomy Rousa (RSV) (ewentualnie z enhancerem RSV), promotor cytomegalowirusa (CMV) (ewentualnie z enhancerem CMV) [patrz na przykład, Boshart i wsp., Cell, 41:
521-530 (1985)], promotor SV40, promotor reduktazy dihydrofolanu, promotor β-aktyny, promotor kinazy fosfoglicerolu (PGK) i promotor BF1a [Invitrogen].
Indukowalne promotory umożliwiają regulację ekspresji genu i mogą być regulowane przez związki dostarczane egzogennie, czynniki środowiskowe takie jak temperatura, lub obecność specyficznego stanu fizjologicznego, na przykład fazy ostrej, szczególnego etapu różnicowania komórki, lub jedynie zachodzi w komórkach replikujących. Indukowalne promotory i układy indukowalne są dostępne w wielu różnych komercyjnych źródłach, obejmujących, nie ograniczając zakresu, Invitrogen, Clontech i Ariad. Opisano wiele innych układów i mogą być one z łatwością wybrane przez specjalisty w dziedzinie. Na przykład, indukowalne promotory obejmują indukowany cynkiem promotor metalotioniny (MT) od owcy i promotor indukowalny deksametazonem (Dex) mysiego wirusa nowotworu sutka (MMTV). Inne indukowalne układy obejmują układ promotora polimerazy T7 [WO 98/10088]; promotor ekdysono owadów [Noi wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], układ represyjny tetracykliny [Gosseni wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], układ indukowalny tetracykliną [Gossen i wsp., Science, 268: 1766-1769 (1995), patrz również Harvey i wsp., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)]. Inne układy obejmują dimer FK506, VP16 lub p65 stosując kastradiol, difenolomurysleron, układ indukowalny RU486 [Wang i wsp., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) i Wang i wsp. Gene Ther. 4: 432-441 (1997)] i układ indukowalny rapamycyną [Magari i wsp., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Skuteczność pewnych indukowalnych promotorów zwiększa się w czasie. W takich przypadkach możliwe jest zwiększenie skuteczności takich układów przez wprowadzenie wielokrotnych represorów w tandemie np. TetR związanych z TetR przez IRES. W innym rozwiązaniu, można oczekiwać przynajmniej 3 dni przed przeszukiwaniem pod kątem żądanych funkcji. Można zwiększać ekspresję żądanych białek znanymi środkami zwiększania wydajności tego układu. Na przykład, stosując potranskrypcyjny element regulatorowy wirusa zapalenia wątroby Woodchuck'a (WPRE, ang. Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element).
W innym rozwiązaniu, będzie stosowany natywny promotor transgenu. Natywny promotor może być korzystny, gdy jest żądane, aby ekspresja transgenu naśladowała natywną ekspresję. Natywny promotor może być zastosowany, gdy ekspresja transgenu musi być regulowana czasowo lub rozwojowo, lub w sposób specyficzny dla tkanki, lub w odpowiedzi na specyficzny transkrypcyjny bodziec. W kolejnym rozwiązaniu, inne natywne elementy kontrolujące ekspresję, takie jak elementy enhancera, miejsca poliadenylacji lub sekwencje konsensusowe Kozaka mogą również być stosowane w celu naśladowania natywnej ekspresji.
Inne rozwiązanie dotyczące transgenu obejmuje transgen funkcjonalnie połączony z promotorem specyficznym tkankowo. Na przykład, jeśli żądana jest ekspresja w mięśniach szkieletowych, powinien być zastosowany promotor aktywny w mięśniach. Obejmują one promotory z genów kodujących aktynę szkieletową, miozynowy lekki łańcuch 2A, dystrofinę, kinazę kreatyny z mięśni, jak i syntetyczne promotory z mięśni o aktywności wyższej niż naturalnie występujące promotory (patrz Li i wsp., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Przykłady promotorów które są specyficzne tkankowo są znane między innymi dla wątroby (albumina, Miyatake i wsp., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor rdzenia wirusa zapalenia wątroby B, Sandig i wsp., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfa-fetoproteina (AFP), Arbuthnot i wsp.. Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteokalcyna z kości (Stein i wsp., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteina z kości (Ghen i wsp., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), limfocyty (CD2, Hansal i wsp., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); ciężki łańcuch immunoglobulinowy; łańcuch receptora limfocytu T), neuronowe takie jak promotor specyficzny dla enolasy neuronu (NSE) (Andersen i wsp., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), gen kodujący lekki łańcuch neurofilamentu (Piccioli i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), i specyficzny dla neuronu gen vgf (Piccioli i wsp., neuron, 15: 373-84 (1995)).
Ewentualnie, wektory niosące transgeny kodujące produkty terapeutycznie użyteczne lub immunogenne również mogą obejmować markery selekcyjne, lub geny reporterowe mogą obejmować
PL 209 133 B1 między innymi sekwencje kodujące odporność na genetycynę, hygromycynę lub purymycynę. Takie selekcyjne geny reporterowe lub markerowe (korzystnie zlokalizowane poza genomem wirusowym, które mają być wprowadzone do cząsteczki wirusowej) mogą być stosowane do sygnalizowania obecności plazmidów w komórkach bakteryjnych, na przykład odporność na ampicylinę. Inne składniki wektora mogą obejmować miejsce inicjacji procesu replikacji. Wybór tych i innych promotorów, i elementów wektorowych jest typowy i dostępnych jest wiele takich sekwencji [patrz np., Sambrook i wsp., i odnoś niki cytowane tutaj].
Wektory te wytworzono stosując techniki i sekwencje dostarczone tutaj, w połączeniu z technikami znanymi specjalistom w stanie techniki. Techniki takie obejmują tradycyjne techniki klonowania cDNA takie jak te opisane w pracach [Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY], zastosowanie nakładających się sekwencji oligonukleotydowych z genomów adenowirusowych, reakcji łańcuchowej polimerazy i każdy odpowiedni sposób, który dostarcza żądane sekwencje nukleotydowe.
III. Wytwarzanie zrekombinowanych cząsteczek wirusowych
W jednym rozwią zaniu, do produkcji zrekombinowanych czą steczek adenowirusowych stosowano małpie adenowirusowe plazmidy (lub inne wektory). W jednym rozwiązaniu, w zrekombinowanych adenowirusach funkcjonalnie usunięto geny E1a lub E1b i ewentualnie niosące inne mutacje, na przykład mutacje temperaturowrażliwe lub delecje w innych genach. W innych rozwiązaniach, pożądane jest utrzymanie w zrekombinowanych adenowirusach nienaruszonego regionu E1a i/lub E1b. Taki nienaruszony region E1 może być zlokalizowany w genomie adenowirusowym w swojej natywnej lokalizacji lub umieszczony w natywnym genomie adenowirusowym w miejscu delecji (na przykład w regionie E3).
W konstrukcji użytecznych wektorów małpiego adenowirusa do dostarczania genu do komórek ludzkich (lub innych ssaków), w wektorach może być zastosowany szereg sekwencji adenowirusowych kwasów nukleinowych. Na przykład, cały lub część adenowirusowego opóźnionego wczesnego genu E3 może być usunięty z sekwencji małpiego adenowirusa, która tworzy część zrekombinowanego wirusa. Uważa się, że funkcja małpiego E3 nie zależy od funkcji i produkcji cząsteczki zrekombinowanego wirusa. Wektory małpiego adenowirusa mogą również być tak skonstruowane, aby miały delecję przynajmniej regionu ORF6 genu E4 i co jest bardziej pożądane, ze względu na nadmiar funkcji tego regionu, cały region E4. Jeszcze inny wektor według wynalazku zawiera delecję w opóźnionym wczesnym genie E2a. Delecję mogą również być wprowadzone do dowolnego z późnych genów L1 do L5 genomu małpiego adenowirusa. Podobnie, w pewnych celach mogą być użyteczne delecje w zwią zkach poś rednich genów IX i IVa2. Inne delecje mogą być przeprowadzone w innych strukturalnych lub nie strukturalnych genach adenowirusa. Powyżej przedyskutowane delecje mogą być stosowane osobno, to jest adenowirusowa sekwencja do zastosowania w niniejszym wynalazku może zawierać delecje tylko w jednym regionie. W innym rozwiązaniu, delecje całych genów lub ich części skutecznych w niszczeniu ich biologicznej aktywności mogą być stosowane w dowolnym połączeniu. Na przykład, w jednym przykładowym wektorze, adenowirusowa sekwencja może mieć delecje genów E1 i genu E4, lub genów E1, E2a i E3, lub genów E1 i E3, lub genów E1, E2a i E4, z lub bez delecji E3, i tym podobne. Jak przedyskutowano powyżej, aby uzyskać żądany rezultat, takie delecje mogą być stosowane w połączeniu z innymi mutacjami, takimi jak mutacje temperaturowrażliwe.
Wektor adenowirusowy pozbawiony dowolnej zasadniczej sekwencji adenowirusowej (na przykład, E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 i L5) może być hodowany w obecności brakujących produktów genów adenowirusowych, które są wymagane do zakaźności i namnażania wirusa cząsteczki adenowirusowej. Te funkcje wspomagające mogą być dostarczone poprzez hodowlę adenowirusowego wektora w obecności jednego lub więcej konstruktów pomocniczych (to jest plazmidu lub wirusa) lub komórki gospodarza, do której wektor jest wprowadzony. Patrz na przykład, techniki opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO96/13597 opublikowanym 9 maja, 1996, i włączonym tutaj jako odnośnik dotyczące wytwarzania „minimalnego wektora ludzkiego Ad.
1. Wirusy pomocnicze
Zatem, w zależności od składu genowego małpich adenowirusowych wektorów wirusowych zastosowanych do przenoszenia minigenu, adenowirus pomocniczy lub nie ulegający replikacji fragment wirusa może być konieczny do dostarczenia odpowiednich sekwencji genu małpiego adenowirusa niezbędnych do produkcji zakaźnej zrekombinowanej wirusowej cząsteczki zawierającej minigen. Użyteczne wirusy pomocnicze zawierają wybrane sekwencje genu adenowirusa nie obecne w adenowirusowym wektorowym konstrukcie i/lub nie eksprymowane w linii komórkowej zawierającej
PL 209 133 B1 wirus, które są transfekowane wektorem. W jednym rozwiązaniu, wirus pomocniczy ma uszkodzoną replikację i zawiera różne geny adenowirusa oprócz sekwencji opisanych powyżej. Taki wirus pomocniczy jest korzystnie stosowany w połączeniu z linią komórkową prowadzącą ekspresję E1.
Wirusy pomocnicze mogą również być utworzone w formie poli-kationowych konjugatów jak opisano w Wu i wsp., J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher i J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (Aprill, 1994). Wirus pomocniczy może ewentualnie zawierać drugi reporterowy minigen. Wiele takich reporterowych genów jest znanych w dziedzinie. Obecność genu reporterowego w wirusie pomocniczym, który jest inny niż transgen w adenowirusowym wektorze umożliwia niezależne monitorowanie wektora Ad i wirusa pomocniczego. Ten drugi element reporterowy jest stosowany, aby umożliwić rozdzielenie pomiędzy otrzymanym zrekombinowanym wirusem a wirusem pomocniczym w wyniku oczyszczania.
2. Komplementujące linie komórkowe
Aby wytworzyć zrekombinowane małpie adenowirusy (Ad) z delecją w dowolnym z genów opisanych powyżej, funkcja usuniętego regionu genu, jeśli ma zasadnicze dla replikacji i zakaźności wirusa znaczenie, musi być dostarczana zrekombinowanemu wirusowi przez wirus pomocniczy lub linię komórkową, to jest komplementującą lub opakowującą linię komórkową. W wielu przypadkach, linia komórkowa prowadząca ekspresję ludzkiego E1 może być stosowana do transkomplementowania wektora szympansiego Ad. Jest to zwłaszcza korzystne ze względu na odmienność pomiędzy szympansimi sekwencjami Ad według wynalazku a ludzkimi sekwencjami AdE1 znalezionymi w obecnie dostępnych opakowujących komórkach, zastosowanie obecnych ludzkich komórek zawierających E1 zapobiega w czasie procesu replikacji i produkcji, tworzeniu adenowirusów kompetentnych pod względem replikacji. Jednakże, w pewnych przypadkach, będzie pożądane zastosowanie linii komórkowej, która prowadzi ekspresję produktów genu E1, w wykorzystaniu do produkcji małpiego adenowirusa pozbawionego E1. Takie linie komórkowe zostały opisane. Patrz na przykład, opis patentu US nr 6,083,716.
Jeśli jest to pożądane, można wykorzystać sekwencje tutaj dostarczone do wytworzenia opakowujących komórek lub linii komórkowych, które prowadzą ekspresję, przynajmniej adenowirusowego genu E1 z Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 pod kontrolą transkrypcyjnego promotora ekspresji w wybranej wyjściowej linii komórkowej. W tym celu mogą być zastosowane promotory indukowalne lub konstytutywne. Przykłady takich promotorów opisano szczegółowo w innej części niniejszego opisu. Wybrano komórkę wyjściową/rodzicielską do wytwarzania nowej linii komórkowej prowadzącej ekspresję dowolnego z żądanych genów AdPan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39. Nie ograniczając zakresu, taką wyjściową linią komórkową mogą być między innymi komórki HeLa [ATCC Nr dostępu CCL 2], A549 [ATCC Nr dostępu CCL185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [np. Detroit 510, CCL72] i WI-38 [CCL 75]. Wszystkie te linie komórkowe są dostępne z American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA. Inne odpowiednie wyjściowe linie komórkowe moga być otrzymane z innych źródeł.
Takie linie komórkowe prowadzące ekspresję E1 są użyteczne do wytworzenia zrekombinowanych wektorów małpiego adenowirusa, pozbawionego E1. Dodatkowo, lub w innym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza linie komórkowe, które prowadzą ekspresję jednego lub więcej produktów genów małpich adenowirusów, np. E1a, E1b, E2a, i/lub E4ORF6, które mogą być skonstruowane stosując zasadniczo takie same procedury jak zastosowano do wytworzenia zrekombinowanych małpich wektorów wirusowych. Takie linie komórkowe mogą być wykorzystane do transkomplementacji wektorów adenowirusowych, z których usunięto zasadnicze geny, które kodują te produkty, lub do dostarczenia funkcji wspomagających koniecznych do opakowania wirusa zależnego od elementu wspomagającego (np., wirusa stowarzyszonego z adenowirusami). Wytwarzanie komórki gospodarza zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmuje techniki takie jak składanie wybranych sekwencji DNA. To składanie może być uzyskane przez zastosowanie tradycyjnych technik. Takie techniki obejmujące klonowanie cDNA i genomowe, są dobrze znane i opisane w Sambrook i wsp., cytowany powyżej, wykorzystują nakładające się oligonukleotydowe sekwencje genomow adenowirusowych, w połączeniu z ł a ń cuchową reakcją polimerazy, syntetycznymi sposobami i wszystkimi innymi odpowiednimi sposobami, które dostarczają żądane sekwencje nukleotydowe.
W jeszcze innym alternatywnym rozwią zaniu, zasadnicze produkty genów adenowirusowych są dostarczone w układzie trans przez wektor adenowirusowy i/lub wirus pomocniczy. W takim przypadku, odpowiednia komórka gospodarza może być wybrana z dowolnego biologicznego organizmu, obejmującego komórki prokariotyczne (np. bakteryjne) oraz komórki eukariotyczne obejmu26
PL 209 133 B1 jące komórki owadzie, komórki drożdży i komórki ssacze. Zwłaszcza pożądane komórki gospodarza są wybrane z grupy obejmującej dowolny gatunek ssaka, obejmując, nie ograniczając zakresu, komórki takie jak komórki A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 lub PERC6 (z których wszystkie prowadzą ekspresję funkcjonalnego adenowirusowego E1) [Fallaux, EJ i wsp., (1998), Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2C12, komórki L, HT1080, HepG2 i pierwszorzędowe komórki fibroblastów, hepatocytów i mioblastów pochodzące ze ssaków obejmujących ludzi, małpy, myszy, szczury, króliki i chomiki. Wybór gatunku ssaka do dostarczania komórki nie stanowi ograniczenia wynalazku; ani ograniczenia nie stanowi typ komórki ssaka, to jest, komórka fibroblastu, hepatocytu, nowotworu, itp.
3. Zestawienie cząsteczki wirusowej i transfekcja linii komórkowej
Ogólnie, gdy poprzez transfekcję, dostarczany jest wektor obejmujący minigen, jest on dostarczany w ilości od około 5 ag do około 100 ag DNA, i korzystnie około 10 do około 50 ag DNA do około
1x104 komórek do około 1 x 1013 komórek i korzystnie około 105 komórek. Jednakże, względne ilości wektora DNA na ilość komórek gospodarza mogą być dostosowane, biorąc pod uwagę takie czynniki jak wybrany wektor, sposób dostarczania i wybrane komórki gospodarza.
Wektor może być dowolnym wektorem znanym w stanie techniki lub ujawnionym powyżej, obejmującym nagi DNA, plazmid, fag, transpozon, kosmidy, epizomy, wirusy, itp. Wprowadzenie do komórki gospodarza wektora może być uzyskane dowolnymi środkami znanymi w stanie techniki lub jak ujawniono powyżej, obejmującymi transfekcję i infekcję. Jeden lub więcej genów adenowirusowych może być stabilnie zintegrowany z genomem komórki gospodarza, stabilnie ulegając ekspresji jako epizom, lub czasowo ulegający ekspresji. Produkty genów mogą wszystkie ulegać ekspresji czasowo, w epizomie lub stabilnie zintegrowane, lub pewne geny produktów mogą stabilnie ulegać ekspresji, podczas gdy inne czasowo. Ponadto, promotory dla każdego z adenowirusowych genów mogą być wybrane niezależnie z grupy obejmującej konstytutywny promotor, indukowalny promotor lub natywny promotor adenowirusowy. Promotory mogą być regulowane przez specyficzny stan fizjologiczny organizmu lub komórki (np. poprzez stan różnicowania lub w komórce replikującej lub komórce w spoczynku) lub na przykład przez dodane z zewnątrz czynniki.
Wprowadzenie do komórki gospodarza cząsteczek (takich jak plazmidy lub wirusy) może również być uzyskane stosując techniki znane specjaliście w dziedzinie i jak przedyskutowano w opisie. W korzystnym rozwiązaniu, stosuje się standardowe techniki transfekcji, to jest, transfekcja z CaPO4 lub elektroporacja.
Zestawienie wybranych sekwencji DNA adenowirusa (jak i transgenu i innych elementów wektora w różne związki pośrednie plazmidów i zastosowanie plazmidów i wektorów do produkcji zrekombinowanych wirusowych cząsteczek, uzyskano stosując tradycyjne techniki. Takie techniki obejmują tradycyjne techniki klonowania cDNA takie jak te opisane w tekście [Sambrook i wsp., cytowane powyżej], zastosowanie nakładających się oligonukleotydowych sekwencji genomów adenowirusowych, reakcja łańcucha polimerazy, i dowolny odpowiedni sposób, który dostarcza żądaną nukleotydową sekwencję. Zastosowano standardowe techniki transfekcji i kotransfekcji, np. techniki strącania CaPO4. Inne stosowane tradycyjne sposoby obejmują homologiczną rekombinację genomów wirusowych, wysiewanie na szalkach wirusów w warstwowym agarze, sposoby polegające na pomiarach wytwarzych sygnałów i tym podobne.
Na przykład, po konstrukcji i zestawieniu żądanego wektora wirusowego zawierającego minigen, wektorem transfekowano opakowującą linię komórkową in vitro w obecności wirusa pomocniczego. Występuje homologiczna rekombinacja pomiędzy wektorem pomocniczym a wektorowymi sekwencjami, która umożliwia replikację adenowirusowych-transgenowych sekwencji w wektorze i upakowanie w wirionowych kapsydach, prowadząc do zrekombinowanych wektorowych cząsteczek wirusowych. Obecny sposób produkcji takich wirusowych cząsteczek jest oparty na transfekcji. Jednakże, wynalazek nie jest ograniczony do takich sposobów.
Otrzymane zrekombinowane małpie adenowirusy są użyteczne do przenoszenia wybranego transgenu do wybranej komórki. W doświadczeniach in vivo ze zrekombinowanym wirusem namnażanym w opakowujących liniach komórkowych, zrekombinowane małpie adenowirusowe wektory pozbawione E1 według wynalazku wykazują użyteczność w przenoszeniu transgenu do innych niż małpie, korzystnie ludzkich komórek.
IV. Zastosowanie zrekombinowanych wektorów adenowirusowych
Zrekombinowane małpie adenowirusowe wektory według wynalazku są użyteczne do przenoszenia in vitro, ex vivo, i in vivo genów do organizmu człowieka lub nie będącego małpą zwierzęcia.
PL 209 133 B1
Zrekombinowane wektory adenowirusowe opisane tutaj mogą być stosowane jako wektory ekspresyjne do produkcji produktów kodowanych przez heterologiczne geny in vitro. Na przykład, zrekombinowany adenowirus zawierający gen wprowadzony w miejsce delecji E1 może być stosowany do transfekowania linii komórkowej prowadzącej ekspresję E1 jak opisano powyżej. W innym rozwiązaniu, adenowirusy o kompetentnej replikacji mogą być stosowane w innej wybranej linii komórkowej. Transfekowane komórki następnie są hodowane w tradycyjny sposób, umożliwiający ekspresję zrekombinowanego adenowirusa uzyskując produkt genu regulowaną przez promotor. Produkt genu może następnie być odzyskany z pożywki hodowlanej znanymi tradycyjnymi sposobami wyodrębnienia i odzyskania białka z hodowli.
Zrekombinowany małpi adenowirusowy wektor pochodzący z Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 według wynalazku dostarcza skuteczny nośnik do przeniesienia genu, który może dostarczać wybrany transgen do wybranej komórki gospodarza in vivo lub ex vivo nawet tam gdzie organizm neutralizował przeciwciała przeciwko jednemu lub więcej serotypom AAV. W jednym rozwiązaniu rAAV i komórki zmieszano ex vivo; infekowane komórki hodowano stosując tradycyjne sposoby i transdukowane komórki ponownie podano pacjentowi przez wlew. Te kompozycje są szczególnie odpowiednie do dostarczania genów w celach terapeutycznych i do immunizacji, obejmując indukcję ochronny immunologicznej.
Najczęściej, zrekombinowane adenowirusowe wektory Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25, lub SV39 według wynalazku będą wykorzystane do dostarczania terapeutycznych lub immunogenicznych cząsteczek, jak opisano poniżej. We wszystkich zastosowaniach będzie z łatwością zrozumiałe, że zrekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku są szczególnie dobrze dopasowane do zastosowania w trybach obejmujących powtórne dostarczenie zrekombinowanych wektorów adenowirusowych. Takie tryby typowo obejmują dostarczenie serii wirusowych wektorów, w których zmieniono wirusowe kapsydy. Wirusowe kapsydy mogą być zmienione przy każdym kolejnym podawaniu, lub po wcześniej wybranej liczbie podawań kapsydu szczególnego serotypu (np. jeden, dwa, trzy, cztery lub więcej). Zatem, tryb może obejmować dostarczenie rAd z pierwszym małpim kapsydem, dostarczenie rAd z drugim małpim kapsydem, i dostarczenie z trzecim małpim kapsydem. Wiele różnych innych trybów, w których zastosowanie kapsydów Ad według wynalazku samych, w połączeniu z jednym innym, lub w połączeniu z innymi serotypami Ad będzie widocznych dla specjalistów w stanie techniki. Ewentualnie, taki tryb moż e obejmować podawanie rAd z kapsydami z innych nie pochodzenia ludzkiego, adenowirusów naczelnych, ludzkie adenowirusy, lub sztuczne serotypy takie jak opisane tutaj. Każda faza trybu może obejmować podawanie serii iniekcji (lub dostarczenie w inny sposób) z jednym serotypem Ad kapsydu, a następnie serie z innym kapsydem serotypu Ad. W innym rozwiązaniu, zrekombinowane wektory Ad według wynalazku mogą być wykorzystane w trybach obejmujących inne układy dostarczenia, w których nie pośredniczy adenowirus, obejmujące inne układy wirusowe, układy dostarczenia inne niż wirusowe, białka, peptydy i inne biologicznie aktywne cząsteczki.
Poniższe rozdziały skupiają się na przykładowych cząsteczkach, które mogą być dostarczane przez adenowirusowe wektory według wynalazku.
A. Dostarczanie cząsteczek terapeutycznych za pośrednictwem Ad
W jednym rozwią zaniu, opisane powyż ej zrekombinowane wektory podaje się ludziom zgodnie z opublikowanymi sposobami terapii genowej. Małpie wirusowe wektory niosące wybrany transgen mogą być podawane pacjentowi, korzystnie zawieszone w biologicznie kompatybilnym roztworze lub farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbce do podawania. Odpowiednia zaróbka obejmuje sterylny roztwór soli. W tym celu mogą być zastosowane inne wodne i niewodne izotoniczne sterylne roztwory do iniekcji i wodne, i niewodne sterylne zawiesiny, znane jako nośniki farmaceutycznie dopuszczalne i dobrze znane specjalistom w stanie techniki.
Małpie adenowirusowe wektory podaje się w wystarczających ilościach do transdukcji docelowych komórek i aby dostarczyć wystarczające poziomach do przeniesienia i ekspresji genu, dostarczając korzyści terapeutyczne bez niepożądanych działań ubocznych lub z medycznie dopuszczalnymi fizjologicznymi działaniami, które mogą być określone przez specjalistów w dziedzinie medycyny. Tradycyjne i farmaceutycznie dopuszczalne sposoby podawania obejmują, między innymi, bezpośrednie dostarczenie do siatkówki i inne wewnątrzgałkowe sposoby dostarczenia, bezpośrednie dostarczenie do wątroby, inhalacje, podawanie donosowe, dożylne, domięśniowe, dotchawicze, podskórne, doskórne, doodbytnicze, doustne i inne pozajelitowe sposoby podawania. Sposoby podawa28
PL 209 133 B1 nia mogą być łączone, jeśli jest to pożądane, lub dostosowane w zależności od transgenu lub stanu. Sposób podawania pierwotnie będzie zależał od właściwości stanu, który jest leczony.
Dawkowanie wektora wirusowego będzie zależeć pierwotnie od czynników takich jak stan, który jest leczony, wiek, masa i stan zdrowia pacjenta, a zatem może różnić się pomiędzy pacjentami. Na przykład, terapeutycznie skuteczne dawkowanie wirusowego wektora u dorosłych ludzi lub zwierząt jest ogólnie w zakresie od około 100 μΙ do około 100 ml nośnika zawierającego stężenia od około x 106 do około 1 x 1015 cząsteczek, około 1 x 1011 do 1 x 1013 cząsteczek, lub około 1 x 109 do x 1012 cząsteczek wirusa. Dawkowania będą się różnić w zależności od wielkości zwierzęcia i sposobu podawania. Na przykład, odpowiednie dawkowanie u ludzi lub zwierząt (na około 80 kg zwierzę) przy domięśniowej iniekcji jest w zakresie od około 1 x 109 do około 5 x 1012 cząsteczek na ml, na jedno miejsce. Ewentualnie, wielokrotne miejsca podawania mogą być dostarczone. W innym przykładzie, odpowiednie dawkowanie w doustnym preparacie, u ludzi lub zwierząt może być w zakresie o koło 1 x 1011 do około 1 x 1015 cząsteczek. Specjalista w dziedzinie może dostosować te dawki, zależnie od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego lub do szczepionek, w których zrekombinowany wektor jest zastosowany. Poziomy ekspresji transgenu, lub immunogenu, poziom krążącego przeciwciała, mogą być monitorowane aby wyznaczyć częstość podawania dawek. Jeszcze inne sposoby wyznaczania ustalania czasu częstości podawania będą z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie.
Ewentualny etap sposobu obejmuje jednoczesne podawanie pacjentowi, zarówno równocześnie z, lub przed lub po podawaniu wirusowego wektora, w odpowiedniej ilości krótko działającego modulatora immunologicznego. Wybrany modulator immunologiczny jest zdefiniowany tutaj jako środek zdolny do hamowania tworzenia się neutralizujących przeciwciał bezpośrednio przeciwko zrekombinowanemu wektorowi według wynalazku lub zdolny do hamowania eliminacji wektora przez cytolityczne limfocyty T (CTL). Modulator immunologiczny może oddziaływać z oddziaływaniami pomiędzy podzbiorami limfocytów T wspomagających (TH1 lub TH2) i limfocytami B, aby hamować tworzenie przeciwciał neutralizujących. W innym rozwiązaniu, modulator immunologiczny może hamować oddziaływania pomiędzy limfocytami TH1 a CTLs, aby obniżyć występowanie eliminowania wektora przez CTL. Wiele różnych użytecznych modulatorów immunologicznych i dawek do ich zastosowania ujawniono, na przykład, w pracy Yanga i wsp., J. Virol., 70 (9) (Sept., 1996); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO96/12406, opublikowanym 2 maja 1996; i międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US96/03035, wszystkie włączone tutaj jako odnośnik.
1. Terapeutyczne transgeny
Użyteczne produkty terapeutyczne kodowane przez transgen obejmują hormony i czynniki wzrostu, i czynniki różnicowania obejmujące, nie ograniczając zakresu, insulinę, glukagon, hormon wzrostu (GH), hormon przytarczyc (PTH), czynnik uwalniający hormon wzrostu (GRF), hormon folikulotropowy (FSH), hormon luteinizujący (LH), ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), angiopoetyny, angiostatynę, czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (GCSF), erytropoetynę (EPO), czynnik wzrostu tkanki łącznej (CTGF), czynnik wzrostu zasadowych fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu kwasowych fibrobłastów (aFGF), epidermalny czynnik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu (TGF), czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF), insulinowe czynniki wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II), jeden z nadrodziny transformujących czynników wzrostu, obejmujący TGF, aktywiny, inhibiny, lub dowolne z białek morfogenetycznych kości (BMP) BMPs 1-15, dowolny z czynników różnicowania heregluina/neureguiina/ARIA/nowy czynnik różnicowania (NDF) z rodziny czynników wzrostowych, czynnik wzrostu nerwu (NGF), neurotroficzny czynnik pochodzący z mózgu (BDNF), neurotrofiny NT-3 i NT-4/5, rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF), neurotroficzny czynnik pochodzący z glejowej linii komórkowej (GDNF), neurturin, agrin, dowolny z rodziny semaforin/kolapsyn, netrin-1 i netrin-2, czynnik wzrostu hepatocytu (HGF), efryn, noggin, dźwiękowych jeży i hydroksylazy tyrozyny.
Inne użyteczne produkty transgenów obejmują białka, które regulują układ immunologiczny obejmujący, nie ograniczając zakresu, cytokiny i limfokiny takie jak trombopoetyna (TPO), interleukiny (IL)IL-l do IL-25 (obejmujące na przykład IL-2, IL-4, IL-12 i IL-18), białko czynnika chemotaktycznego monocytu, czynnik hamujący białaczkę, czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów makrofagów, ligand Fas, czynniki martwicy nowotworów i interferony oraz, czynnik komórek macierzystych układu krwionośnego, ligand flk-2/flt3. Według wynalazku użyteczne są również produkty genów produkowane przez układ immunologiczny. Obejmują one, nie ograniczając zakresu, immunoglobuliny IgG, IgM, IgA,IgD i IgE, chimeryczne immunoglobuliny, humanizowane przeciwciała, przeciwciała jednołańcuPL 209 133 B1 chowe, receptory limfocytów T, chimeryczne receptory limfocytow T, jednołańcuchowe receptory limfocytów T, cząsteczki MHC klasy I i klasy II, jak i zaprojektowane immunoglobuliny i cząsteczki MHC. Użyteczne produkty genów również obejmują komplementarne regulatorowe białka takie jak białka komplementarne regulatorowe, błonowy współczynnik białka (MCP), czynnik przyśpieszający rozkład (DAF), CR1, CF2 i CD59.
Jeszcze inne użyteczne produkty genów obejmują dowolny z receptorów hormonów, czynniki wzrostu, cytokiny limfokiny, białka regulatorowe i białka układu immunologicznego. Wynalazek obejmuje receptory regulacji cholesterolu, obejmujące receptor lipoproteiny o małej gęstości (LDL), receptor lipoproteiny o dużej gęstości (HDL), receptor lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i receptor wymiatacza. Wynalazek również obejmuje produkty genów takie jak elementy z nadrodziny receptorów steroidowych hormonów obejmujących receptory glukokortykoidowe i estrogenowe, receptory witaminy D i inne jądrowe receptory. Ponadto, użyteczne produkty genów obejmują czynniki transkrypcyjne takie jak jun, fos, max, mad, czynnik odpowiedzi na surowicę (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD i miogeninę, ETS-box zawierający białka, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, białka wiążące CCAAT-box, czynnik regulacji interferonu (IRF-1), białko nowotworu Wilms'a, białko wiążące ETS, STAT, białka wiążące GATA-box, np., GATA-3, i rodziny białek o strukturze widełek (forkhead) uskrzydlonej (winged) helisy.
Inne użyteczne produkty genów obejmują, syntetazę karbamoilu, transkarbamylazę ornityny, syntetazę arginoburszytnianu, ligazę arginoburszytnianu, arginazę, hydrolazę fumaryloacetoktanu, hydroksylazę fenyloalaniny, antytrypsynę alfa-1, glukozo-6-fosfatazę, deaminazę porfobilinogenu, czynnik VIII, czynnik IX, beta-syntetazę cystationu, dekarboksylazę rozgałęzionego chainketokwasu, albuminę, dehydrogenazę izowalerylo-coA, karboksylazę propionylo CoA, mutazę metylo malonylo CoA, dehydrogenazę glutarylo CoA, insulinę, beta-glukozydazę, karboksylat pirogronianu, fosforylazę wątrobową, fosforylazę, kinazę, dekarboksylazę glycyny, białko H, białko T, sekwencja przezbłonowego regulatora zwłóknienia tobilowatego (CFTR) i sekwencja cDNA dystrofiny.
Inne użyteczne produkty genów obejmują nie występujące naturalnie polipeptydy, takie jak polipeptydy chimeryczne lub hybrydowe mające nie występujące naturalnie sekwencje aminokwasowe zawierające insercje, delecje lub substytucje aminokwasowe. Na przykład, jednołańcuchowe zaprojektowane immunoglobuliny mogły być użyteczne u pewnych mających obniżoną odporność pacjentów. Inne typy nie występujących naturalnie sekwencji genu obejmują antysensowe cząsteczki i katalityczne kwasy nukleinowe, takie jak rybozymy, które mogą być stosowane do obniżenia nadekspresji docelowego elementu.
Redukcja i/lub modulowanie ekspresji genu są szczególnie pożądane do leczenia stanów hiperproliferacyjnych, które charakteryzują się hiperproliferacją komórek, tak jak w przypadku nowotworów i łuszczycy. Docelowe polipeptydy obejmują te polipeptydy, które są produkowane wyjątkowo lub na wyższych poziomach w hiperproliferujących komórkach w porównaniu do komórek normalnych. Docelowe antygeny obejmują polipeptydy kodowane przez onkogeny takie jak myb, myc, fyn, i gen translokacji bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk i EGRF. Oprócz produktów onkogenów takich jak docelowe antygeny, docelowe polipeptydy do leczenia przeciwnowotworowego i ochronne tryby obejmują zmienne regiony przeciwciał produkowanych przez chłoniaki limfocytów B i zmienne regiony receptorów limfocytów T z chłoniaków limfocytów T które w pewnych rozwiązaniach, są również stosowane jako docelowe antygeny w chorobie autoimmunizacyjnej. Inne związane z guzem polipeptydy mogą być stosowane jako docelowe polipeptydy, takie polipeptydy, które występują na wyższych poziomach w komórkach guza, obejmujące polipeptyd rozpoznawany przez monoklonalne przeciwciało 17-1A i polipeptydy wiążące folan.
Inne odpowiednie terapeutyczne polipeptydy i białka obejmują te, które mogą być użyteczne do leczenia osobników cierpiących na choroby i zaburzenia autoimmunizacyjne przez nadanie opartej szeroko określonej ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko docelowym cząsteczkom, które są związane z autoimmunogennością, obejmując receptory komórkowe i komórki, które produkują przeciwciała skierowane przeciwko sobie. Autoimmunizacyjne choroby, w których pośredniczą limfocyty T obejmują reumatoidalne zapalenie stawów (RA), stwardnienie rozsiane (MS), zespół Sjogrena, sarkoidozę, cukrzycę zależną od insuliny (IDDM), autoimmunizacyjne zapalenie tarczycy, reaktywne zapalenie stawu lub stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, twardzinę skóry, zapalenie wielomięśniowe, zapalenie skórno-mięśniowe, łuszczycę, zapalenie naczyń, ziarniakowatość Wegenera, chorobę Crowna i zapalenie wrzodziejące okrężnicy. Każda z tych chorób charakteryzuje się
PL 209 133 B1 tym, że receptory limfocytów T (TCRs) wiążą endogenne antygeny i zapoczątkowują zapalną kaskadę związaną z autoimmunizacyjnymi chorobami.
Małpie adenowirusowe wektory według wynalazku są szczególnie odpowiednie do terapeutycznych trybów podawania, w których wielokrotne podawanie transgenów za pośrednictwem adenowirusów jest pożądane, to jest, w trybach obejmujących ponowne dostarczenie takiego samego transgenu lub w łącznych trybach obejmujących dostarczenie innych transgenów. Takie tryby mogą obejmować podawanie małpiego adenowirusowego wektora z Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39, a następnie ponowne podawanie wektora takiego samego serotypu adenowirusa. Zwłaszcza pożądane tryby obejmują podawanie małpiego adenowirusowego wektora Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 według wynalazku, w którym serotyp wirusowego wektora dostarczanego w pierwszym podawaniu różni się od serotypu wirusowego wektora wykorzystanego w jednym lub więcej z kolejnych podawań. Na przykład, terapeutyczny tryb obejmuje podawanie wektora Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 i powtórne podawanie jednego lub więcej adenowirusowego wektora o takich samych lub różnych serotypach. W innym przykładzie, tryb terapeutyczny obejmuje podawanie wektora adenowirusowego, a następnie powtórne podawanie wektora Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 według wynalazku, który różni się od serotypu adenowirusowego wektora dostarczanego jako pierwszego i ewentualnie dalsze podawanie innego wektora, który jest taki sam lub, korzystnie, różni się od serotypu wektora podawanego we wcześniejszych etapach. Opisane tryby nie stanowią ograniczenia dostarczania adenowirusowych wektorów skonstruowanych z wykorzystaniem małpich serotypów Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 według wynalazku. Raczej, tryby te mogą z łatwością wykorzystywać wektory innych adenowirusowych serotypów, obejmując, nie ograniczając zakresu, inne małpie adenowirusowe serotypy (np. Pan9 lub 068, C1, itp.), inne nie ludzkie adenowirusowe serotypy naczelnych, lub ludzkie adenowirusowe serotypy, w połączeniu z jednym lub więcej z wektorów Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 lub SV39 według wynalazku. Przykłady takich małpich, innych naczelnych niż ludzkie, i ludzkich adenowirusowych serotypów przedyskutowano w innej części niniejszego dokumentu. Ponadto, opisane terapeutyczne tryby mogą obejmować również równoczesne lub kolejne dostarczenie wektorów adenowirusowych Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25, i/lub SV39 według wynalazku w połączeniu z nieadenowirusowymi wektorami, niewirusowymi wektorami, i/lub wieloma różnymi innymi terapeutycznie użytecznymi związkami lub cząsteczkami. Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do opisanych terapeutycznych trybów, wiele różnych trybów będzie z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie.
B. Dostarczenie immunogennych transgenów za pośrednictwem Ad
Zrekombinowane małpie adenowirusy mogą również być zastosowane jako kompozycje immunogenne. Jak stosowano tutaj, kompozycja immunogenna jest kompozycją w której odpowiedź humoralna (np., przeciwciało) lub komórkowa (np. cytotoksyczny limfocyt T) jest związana z transgenowym produktem dostarczanym przez immunogenną kompozycję w wyniku dostarczenia ssakowi i korzystnie naczelnym. Niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowany małpi Ad, który może zawierać w dowolnej z jego adenowirusowych sekwencji delecje genu kodującego żądany immunogen. Jest prawdopodobne, że małpi adenowirus będzie bardziej odpowiedni do zastosowania jako szczepionka z żywym zrekombinowanym wirusem u różnych rodzajów zwierząt w porównaniu do adenowirusa pochodzenia ludzkiego, lecz nie stanowi to ograniczenia do takiego zastosowania. Zrekombinowane adenowirusy mogą być stosowane jako profilaktyczne lub terapeutyczne szczepionki przeciwko wszelkim patogenom, przeciwko którym antygen(y) krytyczne dla indukcji odpowiedzi immunologicznej i zdolne do ograniczenia rozprzestrzeniania się patogenu zostały zidentyfikowane i dla których cDNA jest dostępne.
Takie szczepionkowe (lub inne immunogenne) kompozycje są utworzone w odpowiedniej do dostarczenia zaróbce, jak opisano powyżej. Ogólnie, dawki kompozycji immunogennych są w zakresie zdefiniowanym powyżej dla kompozycji terapeutycznych. W celu wyznaczenia potrzeby, jeśli taka istnieje, dawek przypominających, poziomy odporności wybranego genu mogą być monitorowane. Po oznaczeniu mian przeciwciał w surowicy, ewentualnie immunizacje przypominające mogą być konieczne.
Ewentualnie, szczepionkowe kompozycje według wynalazku mogą być przygotowane tak, aby zawierały inne składniki, obejmujące, na przykład adjuwanty, środki stabilizujące, środki dostosowujące pH, środki konserwujące i tym podobne. Takie składniki są dobrze znane specjalistom w dziedzinie szczepionek. Przykłady odpowiednich adjuwantów obejmują, nie ograniczając zakresu, liposomy, ałun, monofosforylowy lipid A i każdy biologicznie aktywny czynnik, taki jak cytokina, interleukina,
PL 209 133 B1 chemokina, ligand i optymalnie ich połączenia. Pewne z tych biologicznie aktywnych czynników mogą ulegać ekspresji in vivo, to jest, poprzez plazmid lub wektor wirusowy. Na przykład, taki adiuwant może być podawany ze szczepionką stymulującą DNA kodujący antygen, aby zwiększyć specyficzną dla antygenu odpowiedź immunologiczną w porównaniu z odpowiedzią immunologiczną, wytworzoną w wyniku stymulowania szczepionką DNA kodującą sam antygen.
Zrekombinowane adenowirusy podaje się w „ilości immunogennej np. w takiej ilości zrekombinowanego adencwirusa, która jest skuteczna w sposobach podawania do transfekcji żądanych komórek i dostarczania wystarczających poziomów ekspresji wybranego genu do indukowania odpowiedzi immunologicznej. Tam, gdzie ochronna odporność jest dostarczona, zrekombinowane adenowirusy są rozważane jako użyteczne kompozycje szczepionkowe do zapobiegania infekcji i/lub w nawrocie choroby.
Alternatywnie, lub dodatkowo, wektory według wynalazku mogą zawierać transgen kodujący peptyd, polipeptyd lub białko, które obejmuje odpowiedzi immunologiczne na wybrany immunogen. Należy się spodziewać, że zrekombinowane adenowirusy według wynalazku będą bardzo skuteczne w indukowaniu cytolitycznych limfocytów T i przeciwciał przeciwko wprowadzonym heterologicznym antygenowym białkom ulegającym ekspresji w wyniku wprowadzenia wektora.
Na przykład, immunogeny mogą być wybrane z wielu różnych rodzin wirusowych. Przykład pożądanych wirusowych rodzin, przeciwko którym odpowiedzi immunologiczne byłyby pożądane obejmują, rodzinę pikornawirusów, która obejmuje rodzaje wirusy nieżytu nosa, które są odpowiedzialne za około 50% przypadków typowego przeziębienia; rodzaje enterowirusów, które obejmują wirusy zapalenia rogów przednich rdzenia, wirusy Coxsackie, wirusy echo, i ludzkie enterowirusy takie jak wirus zapalenia wątroby typu A; i rodzaje aptowirusów, które są odpowiedzialne za choroby stóp i ust, pierwotnie u zwierząt innych niż ludzie. W obrębie rodziny pikornawirusów, docelowe antygeny obejmują VP1, VP2, VP3, VP4, i VPG. Inna wirusowa rodzina obejmuje rodzinę kalcywirusów, która obejmuje grupę wirusów Norwalk, które są ważną przyczyną epidemicznego zapalenia żołądka i jelit. Jeszcze inna rodzina wirusów pożądana do zastosowania w ukierunkowaniu przeciwko antygenom do indukowania odpowiedzi immunologicznych u ludzi i u zwierząt innych niż ludzie, stanowi rodzina togawirusów, która obejmuje rodzaje alfawirusów, które obejmują wirusy Sindbis, wirus RossRiver, i wenezuelijskie, wschodnie i zachodnie końskie zapalenie mózgu i rubiwirus, obejmujący wirus różyczki. Rodzina flaviviridae obejmuje wirus dengi, żółtej febry, japońskiego zapalenia mózgu, zapalenia mózgu z St. Louis i zapalenia mózgu przenoszonego przez kleszcze. Inne docelowe antygeny mogą być wytworzone przez wirus zapalenia wątroby typu C lub rodzinę koronawirusów, która obejmuje pewną liczbę innych niż ludzkich wirusów takich jak zakaźny wirus zapalenia oskrzeli (drobiu), świński przenoszony wirus żołądkowo-jelitowy (świnia), świński hemaglutynujący wirus zapalenia mózgu i rdzenia (świnia), koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej (koty), koci jelitowy koronawirus (kot), psi koronawirus (pies), i ludzkie oddechowe koronawirusy, które mogą powodować typowe przeziębienie i/lub wirus zapalenia wątroby typu nie-A, B lub C. W obrębie rodziny koronawirusów, docelowe antygeny obejmują E1 (również zwane M lub białko miacierzy), E2 (również zwane S lub białko iglicy (Spike)), E3 (również zwane HE lub hemaglutynina-elteroza) glikoproteinę (nie obecną we wszystkich koronawirusach), lub N (nukleokapsyd). Jeszcze inne antygeny mogą być skierowane przeciwko rodzinie rabdowirusów, która obejmuje rodzaje wirusów pęcherzykowatych (na przykład wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej), i rodzaje wirusa wścieklizny (np., wodowstrętu). W obrębie rodziny rabdowirusów, odpowiednie antygeny mogą pochodzić z białka G lub białka N. Rodzina filoviridae, która obejmuje wirusy gorączki krwotocznej takie jak wirus Marburg i Ebola, może być odpowiednim źródłem antygenów. Rodzina paramiksowirusów obejmuje wirus parainfluenzy typ 1, wirus parainfiuenzy typ 3, bydlęcy wirus parainfluenzy typ 3, rubulawirus (wirus świnki), wirus parainfluenzy typ 2, wirus parainfIuenzy typ 4, wirus choroby Newcastle (kurczęta), zarazy bydlęcej, morbilliwirus, który obejmuje odrę i psią nosówkę, i pneumowirus, który obejmuje oddechowy syncycjalny wirus. Wirus grypy jest sklasyfikowany w obrębie rodziny ortomyksowirusów i jest odpowiednim źródłem antygenu (np. białko HA, białko N1). Rodzina wirusów gorączki Bunyamwera obejmuje rodzaje wirusów gorączki Bunyamwera (zapalenie mózgu z Kaliforni, La Crosse), flebowirus (Gorączka z Rift Valley), hantawirus (wirus Hanta) (puremala jest wirusem gorączki hemahagin), nairowirus (choroba owiec Nairobi) i różne nie przypisane bungawirusy. Rodzina arenawirusów dostarcza źródło antygenów przeciwko LCM i wirusowi gorączki Lassa. Rodzina reowirusów obejmuje rodzaje reowirusów, rotawirus (który powoduje ostre zapalenie żołądka i jelit u dzieci), orbiwirusy, i kultiwirusy (gorączka kleszczowa z Kolorado, Lebombo (ludzkie), końska encefaloza, choroba błękitnego języka).
PL 209 133 B1
Rodzina retrowirusów obejmuje podrodzinę oncorivirinal, która obejmuje takie ludzkie i zwierzęce choroby jak wirus kociej białaczki, HTLVI i HTLVII, lentivirinal (który obejmuje wirus nabytego ludzkiego niedoboru odporności (HIV), wirus małpiego niedoboru odporności (SIV), wirus kociego niedoboru odporności (FIV), koński wirus zakaźnej anemii i spumavirinal). Pomiędzy lentiwirusami, opisano wiele odpowiednich antygenów i można z łatwością wybrać odpowiednie. Przykłady odpowiednich antygenów HIV i SIV obejmują, nie ograniczając zakresu białka gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef i Rev, jak i różne ich fragmenty. Na przykład, odpowiednie fragmenty białka Env mogą obejmować dowolną z jego podjednostek takich jak gp120, gp160, gp41, lub mniejsze ich fragmenty, np., o długości przynajmniej około 8 aminokwasów. Podobnie, mogą być wybrane fragmenty białka tat. [Patrz opis patentu US nr 5,891,994 i opis patentu US nr 6,193,981.] Patrz również, białka HIV i SIV opisane w pracy D. H. Barouch i wsp., J. Virol., 75 (5): 2462-2467 (marzed 2001), i R. R. Amara, i wsp., Science, 292: 69-74 (6 kwietnia 2001). W innym przykładzie, immunogenne białka lub peptydy HIV i/lub SIV mogą być stosowane aby utworzyć białka fuzyjne lub inne immunogenne cząsteczki. Patrz na przykład, białka fuzyjne HIV-1 Tat i/lub Nef i tryby immunizacji opisano w WO 01/54719, opublikowany w 2 sierpnia 2001, i WO 99/16884, opublikowany 8 kwietnia 1999. Wynalazek nie jest ograniczony do opisanych tutaj immunogennych białek lub peptydów HIV i/lub SIV. Ponadto, wiele różnych modyfikacji w tych białkach opisano lub mogą z łatwością być wykonane przez specjalistę w dziedzinie. Patrz np., zmodyfikowane białko gag, które jest opisane w opisie patentu US nr 5,972, 596. Ponadto, dowolny z żądanych immunogenów HIV i/lub SIV może być dostarczany sam lub w połączeniu. Takie połączenia mogą obejmować ekspresję z pojedynczego wektora lub z wielokrotnego wektora. Ewentualnie, inne połączenia mogą obejmować dostarczenie jednego lub więcej ulegających ekspresji immunogenów z dostarczeniem jednego lub wiecej immunogenów w postaci białka. Takie połączenia przedyskutowano bardziej szczegółowo poniżej.
Papowawirusowa rodzina obejmuje podrodzinę poliomawirusów (wirusy BKU i JCU) i podrodzinę papillomawirusów (związanych z nowotworami lub postępem złośliwym brodawczaka). Rodzina adenowirusów obejmuje wirusy (EX, AD7, ARD, O.B.), które powodują choroby oddechowe i/lub zapalenie jelit. Rodzina parwowirusów, koci parwowirus (kocie zapalenie jelit), koci wirus panleukopenii, psi parwowirus i świński parwowirus. Rodzina wirusa opryszczki obejmuje podrodzinę alfaherpesvirinae, która obejmuje rodzaje wirusa Herpes simplex (HSVI, HSVII), wirus ospy wietrznej (choroba aujeszkyego (Pseudorabies), wirus ospy wietrznej i półpaśca) i podrodzinę betaherpesvirinae, która obejmuje rodzaje cytomegalowirusa (HCMV, muromegalowirus) i podrodzinę bammaherpesvirinae, która obejmuje rodzaje limfokrypto-wirusów, EBV (chłoniak Burkitta), zakaźne zapalenie tchawicy i nosa, wirus choroby Mareka i radinowirus. Rodzina wirusów ospy obejmuje podrodzinę chordopoxvirinae, która obejmuje rodzaje ortopoxwirusów (Variola (Smallpox) i Vaccinia (Cowpox)), parapoxwirusów, avipoxwirusów, kapripoxwirusów, leporipoxwirusów, suipoxwirusów i podrodzinę entomopoxvirinae. Rodzina hepadnawirusów obejmuje wirus zapalenia wątroby typu B. Jednym niesklasyfikowanym wirusem, który może być odpowiednim źródłem antygenów jest wirus zapalenia wątroby delta. Jeszcze inne wirusowe źródła mogą obejmować ptasią zakaźną chorobę kaletkową i wirus świńskiego zespołu oddechowego i rozrodczego. Rodzina alfawirusów obejmuje koński wirus zapalenia tętnicy i różne wirusy zapalenia mózgu.
Niniejszy wynalazek może również obejmować immunogeny, które są użyteczne do immunizacji ludzkiego lub innego niż człowiek zwierzęcia przeciwko innym patogenom obejmującym bakterie, grzyby, mikroorganizmy pasożytnicze lub wielokomórkowe pasożyty, zakażające ludzi i inne kręgowce, lub przeciwko komórkom raka lub guza. Przykłady bakteryjnych patogenów obejmują patogenne ziarniaki gram-dodatnie obejmujące dwoinki zapalenia płuc; gronkowce i paciorkowce. Patogenne ziarniaki gram-ujemne obejmują meningokoki; gonokoki. Patogenne jelitowe gram-ujemne pałeczki obejmują pałeczki jelitowe; Pseudomonas, acinetobacteria i eikenella; melioidosis; salmonella shigella; pałeczkę hemofilną; moraxella; H. ducreyi (który powoduje wrzód weneryczny); pałeczkę brucelozy; Franisella tularensis (który powoduje tularemię); yersinia (pasteurella); Streptobacillus moniliformis i spirillum; Gram- dodatnie pałeczki obejmują pałeczka listeriozy; włoskowce różycy; maczugowiec błonicy (błonica); cholera; B. anthracis (wąglik); donovanosis (ziarniak pachwinowy); i bartoneloza. Choroby powodowane przez patogenne beztlenowe bakterie obejmują tężec; zatrucie jadem kiełbasianym; inne laseczki; gruźlicę; trąd i inne prątki. Patogenne choroby krętkowic obejmują kiłę; krętkowice: jagodzicę, chorobę skóry (pinta) i endemiczną kiłę; i leptospirozę. Inne infekcje powodowane przez wyższe patogenne bakterie i patogenne grzyby obejmują promienicę; nokardiozę; drożdżycę europejską, drożdżycę wywołaną przez drożdże Blastomyces, histoplazmozę i kokcydioidomikozę;
PL 209 133 B1 zakażenie drożdżakowe, grzybicę kropidlakową i mukormykozę; grzybicę sporotrychową; parakokcydiodomikozę, petrielidiozę, torulopsozę, mycetomę i chromoblastomikozę oraz dermatofitozę. Infekcje riketsjowe obejmują dur plamisty, gorączkę plamistą Gór Skalistych, gorączkę Q oraz ospę riketsjową. Przykłady infekcji mikoplazmą i chlamydią obejmują: zapalenie płuc wywołane przez mikoplazmę; ziarnicę weneryczną; papuzicę i okołoporowego infekcji chlamydią. Patogenne eukarioty obejmują patogenne pierwotniaki i robaki pasożytnicze i infekcje powodowane przez nie obejmują: pełzakowice; malarię; leiszmaniozę; trypanosomatozę; toksoplazmozę; infekcje Pneumocystis carinii; Trichant; Toxoplasma gondii; babeszjozę; lambliozę; włośnicę; filariozę; schistosomatozę; infekcje nicieni; przywr (nematode) lub przywr (trematode) i tasiemce (Taenia spp.).
Wiele z tych organizmów i/lub toksyn przez nie produkowanych zostało zidentyfikowanych przez Centra Kontroli Chorób [(Centers for Disease Control CDC), Department of Heath and Human Services, USA], jako środki, które mają ewentualne znaczenie do zastosowania w atakach biologicznych. Na przykład, pewne z tych biologicznych środków, obejmują. Bacillus anthracis (wąglik), Clostridium botulinum i jego toksyna (zatrucie jadem kiełbasianym), Yersinia pestis (dżuma), Variola major (ospa), Francisella tularensis (tularemia) i wirusowe gorączki krwotoczne [filowirusy (np., Ebola, Marburg] oraz arenawirusy [np.. Lassa, Machupo]), z których wszystkie są obecnie sklasyfikowane jako środki kategorii A; Coxiella burnetti (gorączka Q); Brucella species (bruceloza), Burkholderia mallei (nosacizna), Burkholderia pseudomallei (mielioidoza), Ricinus communis i jego toksyna (rycyna), Clostridium perfringens i jego toksyna (toksyna epsilon), Staphylococcus sp. i ich toksyny (enterotoksyna B), Chlamydia psittaci (papuzica), zagrożenia bezpieczeństwa wody (to jest. Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), dur plamisty (Richettsia powazekii) i wirusowe zapalenie mózgu (alfawirusy, to jest, wenezuelskie końskie zapalenie mózgu; końskie zapalenie mózgu postać wschodnia; końskie zapalenie mózgu postać zachodnia); z których wszystkie są obecnie sklasyfikowane jako środki kategorii B; i wirus Nipan i hantawirusy, które są obecnie sklasyfikowane jako środki kategorii C. Ponadto, inne organizmy, które są tak sklasyfikowanie lub inaczej sklasyfikowane, mogą być zidentyfikowane i/lub stosowane w takim celu w przyszłości. Będzie z łatwością zrozumiałe, że wektory wirusowe i inne konstrukty opisane tutaj są użyteczne do dostarczania antygenów z tych organizmów, wirusów, ich toksyn lub innych produktów ubocznych, które będą zapobiegać i/lub leczyć infekcje lub inne niekorzystne reakcje z tymi biologicznymi środkami.
Podawanie wektorów według wynalazku, aby dostarczyć immunogeny przeciwko zmiennemu regionowi limfocytów T wywołują odpowiedzi immunologiczne obejmujące CTLs aby wyeliminować te limfocyty T. W RA scharakteryzowano kilka specyficznych zmiennych regionów TCRs, które biorą udział w chorobie. Te TCRs obejmują V-3, V-14, V-17 i Va-17. Zatem, dostarczenie sekwencji kwasu nukleinowego, który koduje przynajmniej jeden z tych polipeptydów, będzie wywoływało odpowiedzi immunologiczne, które będą skierowane przeciwko limfocytom T biorącym udział w RA. W MS scharakteryzowano kilka specyficznych zmiennych regionów TCRs, które biorą udział w chorobie. Te TCRs obejmują V-7 i Va-10. Zatem, dostarczenie sekwencji kwasu nukleinowego, który koduje przynajmniej jeden z tych polipeptydów będzie wywoływało odpowiedzi immunologiczne, które będą skierowane przeciwko limfocytom T biorącym udział w MS. W twardzinie skóry scharakteryzowano kilka specyficznych zmiennych regionów TCRs, które biorą udział w chorobie. Te TCRs obejmują V-6, V-8, V-14 i Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 i Va-12. Zatem, dostarczenie zrekombinowanego małpiego adenowirusa, który koduje przynajmniej jeden z tych polipeptydów będzie wywoływało odpowiedzi immunologiczne, które będą skierowane przeciwko limfocytom T biorącym udział w twardzinie skóry.
C. Sposoby dostarczania za pośrednicwem Ad
Poziomy terapeutyczne, lub poziomy odpornościowe, wybranego genu mogą być monitorowane aby wyznaczyć potrzebę, jeśli taka występuje, dawek przypominających. Po oznaczeniu odpowiedzi limfocytów T CD8+, lub ewentualnie, mian przeciwciał w surowicy, ewentualne immunizacje przypominające mogą być konieczne. Ewentualnie, zrekombinowane małpie adenowirusowe wektory według wynalazku mogą być dostarczane w jednym, podaniu lub w różnych łączonych trybach podawania, to jest, w połączeniu z trybem lub sposobem leczenia obejmującym inne aktywne składniki lub w trybie stymulowania-wspomagania. Wiele różnych takich trybów opisano w stanie techniki i odpowiedni tryb może być z łatwością wybrany.
Na przykład, tryby stymuiowania-wspomagania mogą obejmować podawanie DNA (na przykład plazmidu) oparte na wektorze, aby stymulować układ immunologiczny przed drugim podaniem przypominającym, z tradycyjnym antygenem, takim, jak białko lub zrekombinowany wirus niosący sekwen34
PL 209 133 B1 cje kodujące taki antygen. Patrz na przykład, WO 00/11140, opublikowane 2 marca 2000. W innym rozwiązaniu, tryb immunizacji może obejmować podawanie zrekombinowanego małpiego adenowirusowego wektora według wynalazku aby zwiększyć odpowiedź immunologiczną na wektor (zarówno wirusowy jak i oparty na DNA) niosący antygen, lub kodujący białko. W jeszcze innym rozwiązaniu, tryb immunizacji obejmuje podawanie białka, a następnie podanie przypominające wektora kodującego antygen.
W jednym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób stymulowania i przypominania odpowiedzi immunologicznej na wybrany antygen przez dostarczanie DNA wektora plazmidowego niosącego ten antygen, a następnie przez przypominanie zrekomibinowanym małpiadenowirusowym wektorem według wynalazku. W jednym rozwiązaniu, pierwsza dawka wspomagająca obejmuje ekspresję wielu białek z zaróbką stymulującą i/lub wspomagającą. Patrz na przykład, R. R. Amara, Science, 292: 69-74 (6 kwietnia 2001), który opisuje wielobiałkowy tryb ekspresji podjednostek białkowych użytecznych do wytwarzania odpowiedzi immunologicznej przeciwko HIV i SIV. Na przykład, główny DNA może dostarczać Gag, Pol, Vif, VPX i Vpr i Env, Tat, i Rev z jednego transkryptu. W innym rozwiązaniu, SIV Gag, Pol i HIV-1 Env są dostarczane w zrekombinowanym adenowirusowym konstrukcie według wynalazku. Jeszcze inne tryby opisano w WG 99/16884 i WO 01/54719.
Jednakże tryby stymulowania-wspomagania nie są ograniczone do immunizacji przeciwko HIV lub do dostarczenia tych antygenów. Na przykład, stymulowanie może obejmować dostarczanie z pierwszym szympansim wektorem według wynalazku, a następnie przez przypominanie z drugim szympansim wektorem, lub z kompozycją zawierającą sam antygen w postaci białka. W jednym przykładzie, tryb stymulowania-wspomagania może dostarczać ochronną odpowiedź immunologiczną na wirus, bakterie lub inny organizm z którego antygen pochodzi. W innym żądanym rozwiązaniu, tryb stymulowania-wspomagania dostarcza terapeutyczny wpływ, który może być zmierzony stosując tradycyjne testy do wykrywania obecności stanów w przypadku których terapia jest stosowana.
Kompozycja stymulująca może być podawana na różne miejsca ciała w sposób zależny od dawki, która zależy od antygenu, przeciwko któremu żądana odpowiedź immunologiczna jest skierowana. Wynalazek nie jest ograniczony do ilości lub miejsc iniekcji ani do nośnika farmaceutycznego. Raczej tryb podawania może obejmować etap stymulowania i/lub przypominania, z których każdy może obejmować pojedynczą dawkę lub dawkowanie, które jest podawane co godzinę, codziennie, co tydzień lub co miesiąc, lub co rok. Na przykład, ssaki mogą otrzymać jedną lub dwie dawki zawierające się pomiędzy około 10 μg a około 50 μg plazmidu w nośniku. Pożądana ilość DNA w kompozycji jest w zakresie od około 1 μg do około 10 000 μg wektora DNA. Dawkowanie może być różne od około 1 μg do 1000 μg DNA na kg masy ciała pacjenta. Ilość lub miejsce dostarczania jest korzystnie wybrane w oparciu o rodzaj i stan ssaka.
Jednostka dawkowania wektora odpowiednia do dostarczania antygenu ssakowi została tutaj opisana. Wektor jest wytworzony do podawania jako zawieszony lub rozpuszczony w farmaceutycznie lub fizjologicznie dopuszczalnym nośniku takim jak izotoniczny roztwór soli; izotoniczne roztwory soli lub inne preparaty, które będą znane specjalistom w takim podawaniu. Odpowiedni nośnik będzie oczywisty dla specjalistów w stanie techniki i będzie zależeć w znacznym stopniu od sposobu podawania. Kompozycje według wynalazku mogą być podawane ssakowi zgodnie ze sposobami opisanymi powyżej, w preparacie o przedłużonym uwalnianiu, stosując biokompatybilny polimer ulegający degradacji biologicznej, lub dostarczenie w jednym miejscu, stosując micele, żele i liposomy. Ewentualnie, etap stymulowania według wynalazku również obejmuje podawanie z kompozycją stymulującą, odpowiedniej ilości adjuwanta, takiego jak tutaj zdefiniowano.
Korzystnie, kompozycja przypominająca jest podawana około 2 do około 27 tygodni po podawaniu ssakowi kompozycji stymulującej. Podawanie kompozycji przypominającej uzyskuje się stosując skuteczne ilości kompozycji przypominającej zawierającej lub zdolnej do podawania takiego samego antygenu jak podawany w szczepionce stymulującej DNA. Kompozycja przypominająca może zawierać zrekombinowany wektor wirusowy pochodzący z takiego samego wirusowego źródła (na przykład, adenowirusowe sekwencje według wynalazku) lub z innego źródła. W innym rozwiązaniu, „kompozycja przypominająca może być kompozycją zawierającą taki sam antygen jak kodowany przez DNA w szczepionce stymulującej, lecz w postaci białka lub peptydu, która to kompozycja indukuje odpowiedź immunologiczną u gospodarza. W innym rozwiązaniu, kompozycja przypomdnająca zawiera sekwencję DNA kodującą antygen pod kontrolą regulatorowej sekwencji kierującej jego ekspresją w komórkach ssaka, np., wektory takie jak dobrze znane wektory bakteryjne lub wirusowe. Główne wymagania dla kompozycji przypominającej obejmują kompozycje antygenu, które są
PL 209 133 B1 takim samym antygenem, lub reagującym krzyżowo antygenem, taki jak ten kodowany przez kompozycję stymulującą.
W innym rozwią zaniu, mał pie adenowiruse wektory wedł ug wynalazku są również doskonale odpowiednie do zastosowania w wielu różnych innych immunizacjach i trybach terapeutycznych. Takie tryby mogą obejmować dostarczenie małpich adenowirusowych wektorów według wynalazku jednocześnie lub kolejno z wektorami Ad o kapsydach z różnych serotypów, tryby w których adenowirusowe wektory według wynalazku są dostarczane jednocześnie lub kolejno z wektorami innymi niż Ad, tryby w których adenowirusowe wektory według wynalazku są dostarczane jednocześnie lub kolejno z biał kami, peptydami, i/lub innymi biologicznie uż ytecznymi terapeutycznymi lub immunogennymi związkami. Takie zastosowania będą z łatwością widoczne dla specjalisty w dziedzinie.
Poniższe przykłady przedstawiają klonowanie małpich adenowirusów i konstrukcje przykładowych zrekombinowanych adenowirusowych wektorów według niniejszego wynalazku. Przykłady te jedynie ilustrują wynalazek i nie mają ograniczać zakresu niniejszego wynalazku.
P r z y k ł a d 1 Namnażanie wirusów
Wirusy Pan5 [ATCC Nr dostępu VR-591], Pan6 [ATCC Nr dostępu VR-592], i Pan7 [ATCC Nr dostępu VR-593], pierwotnie wyizolowane z węzłów chłonnych szympansów, reprodukowano w komórkach 293 [ATCC CRL1573]. Typowo, komórki te hodowano w pożywce Eagles zmodyfikowanej według Dulbecco (DMEM; Sigma, St. Louis, MO.), uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FOS) [Sigma lub Hyclone, Logan, UT] i 1% penicyliną-streptomycyną (Sigma). Infekcję komórek 293 przeprowadzono w DMEM uzupełnionej 2% FOS przez pierwsze 24 godzin, po czym dodawano FOS, aby uzyskać końcowe stężenie 10%. Infekowane komórki zebrano gdy 100% komórek wykazało indukowany wirusem działanie cytopatyczne (CPE), a następnie zebrano i oddzielono przez wirowanie. Osady komórek zawieszono powtórnie w 10 mM Tris (pH 8,0) oraz poddano lizie w 3 cyklach zamrażania i topnienia. Wirusowe preparaty otrzymano w kolejnych dwóch etapach ultrawirowania w gradientach gęstości chlorku cezu i roztwory wyjściowe wirusa rozcieńczono do 1 do 5 x 1012 cząsteczek/ml w 10 mM Tris/100 mM NaCI/50% glicerolu i przechowywano w temp. -70°C.
Zdolność komórek 293 do propagacji tych adenowirusów przekroczyła wartości spodziewane, które oparto na znajomości innych niż ludzkie serotypów adenowirusów.
Wirus Wydajność (wirusowe cząsteczki produkowane w 8 x 108 komórek)
Pan5 8,8 x 1013
Pan6 1,6 x 1014
Pan7 8,8 x 1013
P r z y k ł a d 2 Charakterystyka wirusowego genomowego DNA
Genomowy DNA wyizolowano z oczyszczonych wirusowych preparatów z przykładu 1 i trawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll lub BamHI zgodnie z zaleceniami producenta. Wyniki (nie przedstawione) ujawniły, że genomy Pan5, Pan6, Pan7 i opublikowany genom Pan 9 (C68) wykazują różne rozkłady restrykcyjne, a zatem różnią się od siebie.
Wyznaczono nukleotydowe sekwencje Pan5, Pan6 i Pan7. Nukleotydowe sekwencje górnej nici DNA Pan5 przedstawiono na SEK NR ID: 1. Nukleotydową sekwencję górnej nici DNA Pan6 przedstawiono na SEK NR ID: 5. Nukleotydową sekwencję górnej nici DNA Pan7 przedstawiono na SEK NR ID: 9.
Regiony regulatorowe i kodujące w sekwencjach wirusowego DNA zidentyfikowano przez homologię ze znanymi adenowirusowymi sekwencjami stosując program „Clustal W opisany powyżej w tradycyjnych ustawieniach. Patrz tabele powyżej dostarczające sekwencje adenowirusowe. Otwarte ramki odczytu ulegały translacji i przewidziane sekwencje aminokwasowe badano pod kątem homologii z wcześniej opisanymi sekwencjami białek adenowirusowych, Ad4, Ad5, Ad1, Ad12 i Ad40.
Analiza sekwencji ujawniła organizację genomu, która jest podobna do tej obecnej w ludzkich adenowirusach, przy największym podobieństwie do ludzkiego Ad4. Jednakże, zasadnicze różnice w hiperzmiennych regionach heksonu oznaczono mię dzy adenowirusami szympansa i innymi znanymi adenowirusami, obejmującymi AdHu4. Różnice te dobrze odpowiadają otrzymanym danym serologicznej reaktywności krzyżowej (patrz poniżej).
Dopasowanie części sekwencji heksonu przedstawiono na Fig. 1. Przedstawiono część od regionu heksonu, która odpowiada skierowanym na zewnątrz przedłużonym pętlom DE1 i FG1, gdzie obserwowano największą zmienność pomiędzy serotypami. Jest również obecna część przerywnikowa, która przyczynia się do podstawy heksonu (odpowiadająca resztom 308-368 opublikowanej se36
PL 209 133 B1 kwencji AdC68; Opis patentowy US 6,083,716) i jest wysoce konserwowana pomiędzy serotypami. Poniższa tabela podsumowuje porównanie parami aminokwasów w białkach heksonu.
Porównanie Podobieństwo aminokwasów heksonu (%)
#1 #2
AdC5 AdC7 99,0
AdC5 AdC68 98,3
AdC5 AdC6 88,0
AdC5 AdC1 84,9
AdC6 AdC7 87,7
AdC6 AdC68 87,3
AdC6 AdC1 84,9
AdC7 AdC68 97,5
AdC7 AdC1 84,8
AdC68 AdC1 84,9
Analiza domeny wypustek włókna (które są odpowiedzialne za wiązanie receptora) adenowirusów szympansa wykazuje ogólne podobieństwo struktur (Fig. 2).
Stopień podobieństwa sekwencji pomiędzy białkiem E1 huAd5 i C68 (patrz tabele poniżej) jest podobny do tego pomiędzy huAd5, a Pan-5, Pan-6, i Pan-7.
Porównanie Identyczność aminokwasów Ela (13S) (%)
#1 #2
AdHu5 AdC5 36,6
AdHu5 AdC6 28,5
AdHu5 AdC7 34,9
AdHu5 AdC68 35,6
AdHu5 AdC1 35,6
AdC5 AdC6 68,3
AdC5 AdC7 96,9
AdC5 AdC68 80,4
AdC5 AdC1 51,3
AdC6 AdC7 69,3
AdC6 AdC68 59,4
AdC6 AdC1 37,7
AdC7 AdC68 81,5
AdC7 AdC1 51,0
AdC68 AdC1 54,9
PL 209 133 B1
Identyczności sekwencji z ludzkim Ad5
Małe białko T E1b Duże białko T E1b
C68 41,3% 55,8%
Pan-5 43,2% 54,5%
Pan-6 45,3% 54,5%
Pan-7 46,4% 53,8%
Warianty o uszkodzonej replikacji AdC5, AdC6 i AdC7 utworzono przez klonowanie molekularne sposobami opisanymi w poniższych przykładach, w których zamiast genów E1a i E1b wprowadzono kasety minigenowe. Klony molekularne zrekombinowanych wirusow odzyskano i hodowano w komórkach 293 do oczyszczania na dużą skalę stosując opublikowany sposób sedymentacji w CsCI [K. Fisher i wsp., J. Virol., 10: 520 (1996)]. Wydajność wektorów oparto na 50 szalkowych (150 mm) procedurach, w których w przybliżeniu 1 x 109 komórek 293 infekowano odpowiednimi wirusami. Wydajności wyznaczono mierząc spektrofotometrycznie stężenia cząsteczek wirusowych. Po skonstruowaniu wektorów z usuniętym E1, stwierdzono, że komórki HEK 293 (które prowadzą ekspresję funkcji ludzkiego adenowirusa o serotypie 5E1) komplementując w układzie trans delecje E1 nowych wirusowych wektorów i umożliwiają produkcję roztworów wyjściowych o wysokim mianie. Przykłady wydajności wirusowych dla kilku z tych zrekombinowanych wirusów przedstawiono w tabeli poniżej.
Transgeny tych wektorów, β-galaktozydaza (LacZ), zielone fluorescencyjne białko (GFP), alfa-1-anty-trypsyna (A1AT), glikoproteina ebola (ebo), rozpuszczalny wariant glikoproteiny ebola pozbawiony domeny transmembranowej i cytoplazmatycznej (sEbo), i trzy mutanty z delecjami glikoproteiny ebola (EboΔ2, EboΔ3, i EboΔ4), ulegały ekspresji z promotorem cytomegalowirusa (CMV). W poniższej tabeli, ND wskazuje że badanie nie zostało przeprowadzone.
Transgen Szkielet wirusowy / wydajność wektora (cząsteczki wirusowe x 1013)
AdHu5 AdC7 AdC68 AdC6
CMVLacZ 1,5 1,4 3,3 6,1
CMVGFP 2,5 3,6 8 10
CAMVA1AT 3,7 6 10 ND
CMVEbo 1,1 4,3 ND ND
CMVsEbo 4,9 5,4 ND ND
CMVEboΔ2 1 9,3 ND ND
CMVEboΔ3 0,8 9,5 ND ND
CMVEboΔ4 1,4 6,2 ND ND
Zdolność ludzkiego adenowirusa E1 do komplementowania w układzie trans szympansich wirusów o usuniętym E1 według wynalazku jest bardzo korzystna, gdyż pozwala na produkcję adenowirusowych szympansich wirusów o usuniętym E1 według wynalazku, podczas gdy obniża lub eliminuje ryzyko homologicznej rekombinacji ze względu na różnice w sekwencjach pomiędzy ludzkim Ad a opisanym tutaj adenowirusem szympansim.
P r z y k ł a d 3 Badania serologiczne wirusów Pan 5, 6 i 7
Ze względu na różnice w hiperzmiennym regionie heksonu, przypuszczano, że wirusy C5, C6, i C7 mogą być serologicznie różne od ludzkich adenowirusów, obejmujących AdHu4.
PL 209 133 B1
1. Reaktywność krzyżowa wirusów typu dzikiego
W celu przeszukiwania wirusów typu dzikiego w celu wykonania oznaczenia reaktywności krzyżowej z przeciwciałem, stosowano wirusy ulegające kompetentnej replikacji i mierzono hamowanie działania cytopatycznego (CPE). Pokrótce, preparaty adenowirusów (Adhu5, Pan-5, Pan-6, Pan-7 i AdC68) przechowywane w ilości 5 x 1012 cząsteczek/ml, rozcieńczono do badań 1/600. Wybrano takie stężenie wirusów, gdyż prowadzi do 100% CPE w ciągu 48 godzin przy braku neutralizacji. Przed dodaniem wirusa do komórek 293 (4x104 komórek/dołek w 96 dołkowej szalce), dodano rozcieńczenia surowic 1: 20. Oznaczenie jest odczytywane jako obecność lub brak OPE; pełna neutralizacja może być odczytana jako brak działania cytopatycznego. Wyniki podsumowano w tabeli poniżej. Fakt, że 9/36 ludzkich surowic krwi zneutralizowanych Adhu5 indukowało CPE jest zgodny z poprzednimi oszacowaniami neutralizowania przeciwciał w ludzkiej populacji. Liczby wskazują całkowitą liczbę osobników, u których występowała neutralizacja (licznik) względem całkowitej liczby przeszukiwanych osobników (mianownik). ND = nie wyznaczono.
Neutralizacja przez 1/20 rozcien. surowicy
Ludzkie (N=36) Rezusa (N=52) Szympansa (N=20)
Adhu5 9/36 ND ND
AdC68 1/36 0/52 12/20
Pan5 0/36 0/52 10/20
Pan6 0/36 0/52 9/20
Pan7 0/36 0/52 12/20
Ze wszystkich ludzkich przeszukiwanych surowic, 35/36 było negatywne pod względem neutralizacji AdC68, podczas gdy 36/36 było negatywne pod względem neutralizacji Pan-5, Pan-6 i Pan-7. Z badanych 52 rezusów, żaden nie wykazywał neutralizacji żadnego adenowirusa szympansa; rezus jest korzystnym wstępnym klinicznym modelem do ocen szczepionek przeciwko HIV. Od 9 do 12 z 20 szympansów wykazywało zasadniczą neutralizację jednego lub innego adenowirusów szympansów, co zgodnie z faktem, że są to faktycznie patogeny endemiczne, specyficzne dla szympansów. Co ciekawe, istnieją szympansy o neutralizujących przeciwciałach tylko przeciwko Pan-5, Pan-6 lub AdC68 co popiera hipotezę, że kilka z tych wektorów adenowirusowych szympansa, nie będzie się krzyżowo neutralizować nawzajem i są różnymi serotypami.
Taki sam test przeprowadzono na 20 próbkach surowicy szympansów. Pięćdziesiąt procent (50%) próbek reagowało serologicznie z Pan5, w różnych stopniach; 40% z Pan6; 55% z Pan7 i 60% z C68. Między pozytywnymi próbkami surowicy, jedna z nich miała neutralizującą aktywność przeciwko wszystkim czterem wirusom szympansim.
2. Neutralizacja krzyżowa ze zrekombinowanymi wirusami
W celu bardziej precyzyjnego określenia stopnia neutralizacji krzyżowej pomiędzy różnymi serotypami otrzymano wysokie miana poliklonalnych przeciwciał przeciwko każdemu z małpich adenowirusów. Oznaczenie przeprowadzono przez domięśniową immunizację królików stosując zrekombinowany wirus zawierający GFP, oparty na wcześniej opisanych adenowirusach C68 szympansa jako adjuwanta. Surowicę następnie stosowano do określenia neutralizującej aktywności przeciwko każdemu z trzech adenowirusów szympansów według wynalazku AdC5, AdC6 i AdC7. Królikowi wstrzyknięto domięśniowo 5x1012 na kg, wirusowych cząsteczek wektora C686MVGFP i powtórzono 5 tygodni później stosując taką samą dawkę. Skrwawienia zebrano w 9. tygodniu ujawniając wyjątkowo skuteczną neutralizującą aktywność przeciwko C68 jak i Pan-5 i Pan-7 lecz nie przeciwko Pan-6 (patrz tabela poniżej), co wskazuje, że podawanie opartej na 068 (lub Pan-5 i Pan-7) szczepionki może być skutecznie kontynuowane przez podanie przypominające wektora opartego na Pan-6. Jednakże, odkryto że ten poziom wzajemnego powiązania nie koniecznie zapobiega przy ponownym podawaniu w ustawieniach, gdzie antywirusowe miana przeciwciał nie były tak wysokie jak uzyskano u tego królika. W poniższej tabeli, + wskazuje 33% CPE; ++ wskazuje 66% CPE; +++ wskazuje 100% CPE.
PL 209 133 B1
Infekcja wirusem komórek 293:
Pan5 Pan6 Pan7 Pan9(C68) C68 GFP Rozcieńczenia surowicy
- + + + - - - 1/20
- + + + - - - 1/40
- + + + - - - 1/80
- + + + - - - 1/160
- + + + - - - 1/320
- + + + - - - 1/640
- + + + - - - 1/1280
- + + + - - - 1/2560
- + + + - - - 1/5120
+ + + + - - - 1/10240
+ + + + + + - - 1/20480
+ + + + + + + + - - 1/40960
+ + + + + + + + + + 1/81920
+ + + + + + + + + + + + + 1/163840
+ + + + + + + + + + + + + + + 1/327680
+ + + + + + + + + + + + + + + 1/665360
+ + + + + + + + + + + + + + + 1/1310720
+ + + + + + + + + + + + + + + 1/2621440
3. Test ilościowy do wykrywania przeciwciała neutralizującego
Wyniki oceniano pod kątem ważności przez bardziej ilościowy test do wykrywania neutralizującego przeciwciała, który jest oparty na transdukcji wektora GFP. Pokrótce, grupy myszy C57BL/6 im10 munizowano domięśniowo lub dożylnie 5,0 x103 4 * * * * * 10 * cząsteczkami/ml Pan5, Pan6, Pan7 lub C68. Surowice ze skrwawień z dnia 28 testowano pod kątem krzyżowej aktywności neutralizującej przeciwko C68CMVEGFP w rozcieńczeniach 1/20 i 1/80. Podsumowując, gdy farmaceutycznie wytwarzane ludzkie immunoglobuliny testowano pod kątem reakcji serologicznych przeciwko Pan5, 6, i 7, i C68, wykryto pewne niskie poziomy aktywności neutralizującej przeciwko Pan7 i C68. Nie stwierdzono aktywności neutralizującej przeciwko Pan5 lub Pan6. Próbki surowicy od 36 ludzi poddano takiemu samemu testowi. Próbki surowicy badano przy rozcieńczeniach 1/20. Wyniki wykazały, że tylko jedna osoba ma wyraźną neutralizującą aktywność przeciwko C68. Nie stwierdzono neutralizującej aktywności przeciwko Pan5, Pan6 lub Pan7.
4. Neutralizująca krzyżowa in vitro
Badano neutralizację krzyżową małpich adenowirusów przez poliklonalne przeciwciała królika o wysokim mianie skierowanych przeciwko każdemu z adenowirusów Pan-5, Pan-6, Pan-7, i C68.
Króliki immunizowano przez iniekcje domięśniowe 1013 cząsteczek każdego z adenowirusów szympansów i powtarzano 40 dni później taką samą dawką z niepełnym adjuwantem Freunda. Surowice analizowano lub obecność neutralizujących przeciwciał przez inkubację serii dwukrotnych rozcieńczeń z 109 kopii genomu każdego z odpowiednich adenowirusowych wektorów szympansa prowadzących ekspresję GFP i testowano pod kątem osłabienia ekspresji GFP gdy zastosowano w ko40
PL 209 133 B1 mórkach 293. Roztwór surowicy, który powodował 50% redukcję ekspresji GFP zaliczano jako miano przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciwko temu szczególnemu wirusowi.
Wyniki przedstawiono w tabeli. Dane są zgodne ze spodziewanymi wyzyskanymi na podstawie analizy sekwencyjnej aminokwasowych sekwencji heksonu, która wykazała, że Ad Pan-6 był najbardziej prawdopodobny jako najbardziej serologicznie odmienny w porównaniu do innych adenowirusów szympansów.
Infekcja 109 kopiami genomu komórek 293
Surowica z królika immunizowanego Ad Pan-5 Ad Pan-6 Ad Pan-7 Ad C68
Ad Pan-5 1/5120 <1/20 1/2560 1/2560
Ad Pan-6 brak neutralizacji 1/20, 480 <1/20 <1/20
Ad Pan-7 1/2560 1/160 1/163,840 1/2560
AdC68 brak neutralizacji <1/20 <1/20 1/5120
W celu wyznaczenia czy przeciwciała oddziałujące krzyżowo z małpimi adenowirusami wykazywałyby prawdopodobnie niską chorobowość u ludzi, małpie adenowirusy SV1, SV39, i SV25 badano pod kątem ich zdoiności do przeciwstawienia się neutralizacji przy inkubacji z komercyjnie dostępnymi zebranymi ludzkimi immunoglobulinami (Ig). Taki sam test również wykonano dla Adhu5 i adenowirusów szympansich Pan-5, Pan-6, Pan-7, i C68. W kolejnym badaniu, surowice od myszy immunizowano jednym z adenowirusów szympansich C5, C6, C7, i C68 i badano ich zdolność do neutralizacji krzyżowej małpich adenowirusów SV-15, SV-23, SA-17 i adenowirusa pawiana. Nie obserwowano żadnej reaktywności krzyżowej.
P r z y k ł a d 4 Wytwarzanie zrekombinowanego wektora Pan5 w którym usunięto E1
Zmodyfikowany plazmid pX wytworzono przez zniszczenie miejsca Fspl w regionie genu bla pX (Clontech) stosując mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Otrzymany zmodyfikowany plazmid, nazwany pX', jest kołowym plazmidem o 3000 parach zasad, który zawiera ori f1 i gen odporności na ampicylinę (AmpR-cds).
A. Wytwarzanie plazmidu adenowirusowego Pan-5
Następnie utworzono polilinker do wklonowania fragmentów DNA Pan5 do pX'. Polilinker podstawiono zamiast występującego polilinkera pX' w wyniku trawienia Mlul i EcoRI. Tępy fragment Fsel Pan5 wprowadzono w miejsca Smal i Fsel polilinkera. Fragment ten zawiera koniec 5' adenowirusowego genomu (pary zasad od 1 do 3606, SEK NR ID: 1). Aby wyeliminować region E1 genomu adenowirusowego, fragment SnaBI-FspI Pan5 (pary zasad 455 do 3484, SEK NR ID: 1) zastąpiono krótką sekwencją flankowaną przez miejsca I-Ceu i Pl-Sce z pShuttle (Clontech). Tępy fragment EcoRI Pan5 (pary zasad od 28658 do 36462, SEK NR ID: 1) wprowadzono w miejsca EcoRI i EcoR V polilinkera (aby dostarczyć koniec 3' genomu adenowirusowego); fragment Fsel-Mlul (pary zasad od 3606 do 15135, SEK NR ID: 1) wprowadzono do polilinkera i fragment MluI-EcoRI wprowadzono do polilinkera (pary zasad od 15135 do 28658, SEK NR ID: 1). Ewentualnie, żądany transgen wprowadzono w miejsca I- Ceul i Pl-Scel nowo utworzonego wektora pX'pan5ΔE1.
B. Alternatywny sposób wytwarzania pX'pan5ΔE1.
Wyjściowy plazmid pX pochodził z adenowirusowego plazmidu pAdX dostępnego z Clontech, jak opisano powyżej. Następnie aby wytworzyć pX'PLNK (2994 par zasad), usunięto region Pacl-Xhol pX' i polilinker Pan5 o tępych końcach wprowadzono w miejsce Fspl. Region końca 5'-Fsel Pan5 (pary zasad 1-3607, SEK NR ID: 1) wprowadzono w miejsca Smal i Fsel pX'LNK, aby wytworzyć plazmid pX'Pan5-5' (6591 par zasad). Region SnaBi-Ndel pX'Pan5-5' wycięto i zastąpiono kasetą Ceu/Sce, którą amplifikowano metodą PCR z pRCS aby utworzyć pX'Pan5-5'.-\E1 (4374 par zasad). Pokrótce, sekwencję zawierającą rzadkie miejsca cięcia I-Ceul i Pl-Scel amplifikowano PCR z pRCS (3113 par zasad). Starter 3' PCR wprowadzono do produktu PCR w miejsce Ndel.
Aby wydłużyć DNA Pan5 w pX'pan5ΔE1 (4374 par zasad), region Fsel-Mlul Pan5 (par zasad 3607-15135, SEK NR ID: 1) dodano, aby utworzyć pX'Pan5-5'Mlu (15900 par zasad). Pozostały koniec 3' Mlul sekwencji Pan5 (pary zasad 15135-36462, SEK NR ID: 1) dodano do wektora pomiędzy
PL 209 133 B1 miejscami Mlul i EcoRV polilinkera wektora, aby utworzyć pX'pan5ΔE1, który zawiera pełną długość sekwencji Pan5 z delecją w regionie E1.
C. Wytwarzanie zrekombinowanych wirusów
Aby wytworzyć zrekombinowane adenowirusy z pX'Pan5ΔE1, plazmid kotransfekowano z elementem pomocniczym prowadzącym ekspresję E1, lub transfekowano linię komórkową opakowującą, prowadzącą ekspresję E1, taką jak linię komórkową 293 lub linię komórkową wytworzoną jak tutaj opisano. Ekspresja E1 w opakowującej komórce pozwala na replikację i opakowanie Pan5ΔE1 w kapsyd wirusowy. W innym rozwiązaniu, opakowująca komórka transfekowana pX'Pan5ΔE1 jest transfekowana wektorem adenowirusowym jak opisano powyżej, niosącym transgen będący przedmiotem zainteresowania. Rekombinacja homologiczna występuje pomiędzy elementem pomocniczym i plazmidem, co pozwala na replikację sekwencji adenowirus-transgen w wektorze i upakowanie w kapsydzie wirionu, prowadząc do uzyskania zrekombinowanego adenowirusa.
Po transfekcji przez 2 tygodnie stosowano pokrywającą warstwę agaru, po czym wirusy uzyskiwano z łysinek, zwielokrotniano i przesiewano pod kątem ekspresji transgenu. Przeprowadzono kilka dodatkowych cykli oczyszczania testem łysinkowym, a następnie przeprowadzono kolejne zwielokrotnienie. Ma koniec komórki zebrano, wytworzony ekstrakt wirusowy i zrekombinowany szympansi adenowirus zawierający żądany transgen oczyszczano z objętości przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości CsCI lub alternatywnymi sposobami znanymi specjalistom w stanie techniki.
P r z y k ł a d 5 Wytwarzanie zrekombinowanego wektora Pan6, w którym usunięto E1
Strategia konstrukcji adenowirusowego plazmidu Pan-6
1. Klonowanie fragmentów końcowych
Wirus Pan 6 pozbawiono białka traktując pronazą i proteazą K i ekstrakcją fenolem. Syntetyczne linkery Pme I o 12 parach zasad ligowano z wirusowym DNA jak opisano w Berkner i Sharp, Nucleic Acids Research, 11: 6003 (1983). Wirusowy DNA następnie trawiono Xba I, aby wyodrębnić 5' końcowy fragment (6043 par zasad). Fragment 5' Ad6 Xbal następnie ligowano z połączeniem pX w miejscach Sma I i Xba I, aby utworzyć pX- AdPan6-0-16.5. Wirusowy DNA z linkerami Pmel również trawiono Pac I aby wyodrębnić końcowy 3' fragment o 6475 parach zasad i wklonowano w łącznik pX w miejsca Pac I i Sma I, otrzymując pXAdPan6-82-100.
2. Usunięcie E1 z klonu 5'
Aby usunąć E1 (m.u. 1.2-9), fragment BsiWi-Xba I w pX-AdPan6-0-16,5 zastąpiono fragmentem PCR obejmującym fragment m.u. 9-16.7 traktowany BsiWi i Xbal, otrzymując pX-AdPan6 m.u. 0-1, 9-16,5.
3. Fuzja klonów 5' i 3' z utworzeniem miejsce zakotwiczenia do przejęcia środkowego fragmentu
Hind III
Po pierwsze, klon 5', pX-Ad-Pan6 m.u. 0-1,9-16.5, dalej powiększano przez wprowadzenie 2. fragmentu Xba I (4350 par zasad, m. u, 16. 5-28) z genomu Pan 6 w miejscu Xba I w pX-Ad-Pan6 m.u. 0-1, 9-16,5. Konstrukt ten nazwano pXAd-Pan6-mu 0-1, 9-28.
Następnie, klon 3' również powiększono przez wprowadzenie fragmentu Mlul/Pac I o 15026 parach zasad obejmującego m.u. 41-82 z genomu Pan6 w miejsca Mlul/Pac I pXAdPan6-82-100, tworząc pXAdPan6-m.u. 41-100.
Następnie, fragment Pan 6 o 8167 parach zasad Hindlll/Eco 47III wyizolowano z pXAd-Pan6mu 0-1,9-28 i wklonowano do pXAdPan6-m.u. 41-100 w miejsca tępe Hind III i Xba I. Ten klon fuzyjny 5' i 3' nazwano pXAcPan6mu0-1, 9-19.5, 64-100.
4. Wprowadzenie środkowego fragmentu genomu do klonu fuzyjnego
Fragment Hind III o 16335 parach zasad (m.u. 19.5-64) z Pan 6 wprowadzono w miejsce Hind III pXAdPan6mu0-1.9-19.5.64-100 aby utworzyć pXAdPan6-0-1, 9-100.
5. Wprowadzenie do końcowego konstruktu selektywnego markera PKGFP przez bezpośrednie wklonowanie żądanego genu i selekcja zielone/białe zrekombinowanych transformantów
Kasetę minigenu, umożliwiającą ekspresję GFP pod promotorem lac i flankowaną przez miejsca rozpoznawane przez rzadkie, kodowane przez intron, enzymy restrykcyjne, Pl-Sce I i I-Ceu I, wyizolowano z pShuttle-pkGFP (nagi) trawiąc Sap I i Dra III, a następnie prowadząc reakcję wypełnienia. Plazmid pShuttle-pkGFP (nagi) ma długość 4126 par zasad i zawiera ColE1-Ori, gen odporności na kanamycynę, plac, LacZ promotor-GFPmut3-1 cds (Clontech) i GFPmut3-1 cds (Clontech). Tę kasetę wklonowano do ciętego Srf l i z tępymi końcami pXAdPan6-0-1, 9-100. Ten końcowy konstrukt nazwano pX-Pan6-pkGFP mu.0-1, 9-100, i jest użyteczny do tworzenia zrekombinowanych klonów mo42
PL 209 133 B1 lekularnych Pan 6 pozbawionych E1 niosących geny będące przedmiotem zainteresowania, przez bezpośrednią ligację i selekcję zielony/ biały w połączeniu z wektorami typu pShuttlepkGFP.
B. Alternatywna strategia wytwarzania plazmidu Pan-6
1. Klonowanie fragmentu końcowego 5'
Wirus Pan 6 pozbawiono białka przez traktowanie pronazą i proteazą K i ekstrakcją fenolem jak opisano powyżej i syntetyczne linkery Pmel o 12 parach zasad ligowano z wirusowym DNA jak opisano powyżej. Wyizolowano fragment AdPan6 5' Xbal i ligowano z pX aby utworzyć pX-AdPan6-0-16,5 (9022 par zasad) jak opisano w części A powyżej.
2. Delecja E1 z klonu 5'
Aby usunąć E1 (m.u. 1.2-9), pX-AdPan6-0-16,5 trawiono SnaBI i Ndel, aby usunąć regiony kodujące białka E1a i E1b (3442-6310 par zasad). Wektor ten następnie trawiono BsiWI przy przygotowywaniu do uzyskania tępych końców z kasetą minigenu niosącą marker selektywny.
3. Wprowadzenie markera selektywnego
Kasetę minigenu umożliwiającą ekspresję GFP pod promotorem lac i flankowaną przez miejsca rozpoznawane przez rzadkie kodowane przez intron, enzymy restrykcyjne, PI-XceI i I-Ceul, wyizolowano z pShuttle-pkGFP jak opisano powyżej. Następnie fragment Dralll-SapI ligowano z trawionym pX-AdPan6-0-16,5 aby utworzyć pX-AdPan6 MU0-16.5AE1 (7149 par zasad).
4. Przedłużenie sekwencji adenowirusowych Pan-6 pX-AdPan6 MU0-16. 5ΔE1 poddano trawieniu Xbal aby umożliwić wprowadzenie linkera XbalRsrII. Z genomu AdPan6 wyizolowano fragment trawiony Xbal/RsrII (mu 28-100, 26240 par zasad) i ligowano z trawionym Xba/RsrII pX-AdPan6 MU0-16. 5ΔE1 aby uzyskać pX-AdPan6 MU0-1, 9-16,5, 28-100. Drugi fragment Xbal z genomu Pan6 (mu 16, 5-28, 4350 par zasad) następnie ligowano z tym plazmidem aby utworzyć pX-AdPan6 MU 0-1,9-100 (38551 par zasad).
C. Wytwarzanie zrekombinowanych adenowirusów
Aby wytworzyć zrekombinowane adenowirusy z Pan6 o usuniętym E1, plazmid przygotowano jak opisano w części A lub B, plazmid ko-transfekowano z elementem pomocniczym prowadzącym ekspresję E1, lub plazmidem transfekowano prowadzącą ekspresję E1 opakowującą linię komórkową, taką jak linia komórkowa 293 lub linię komórkową wytworzoną jak tutaj opisano. Ekspresja E1 w opakowującej komórce pozwala na replikację i wprowadzenie do kapsydu wirionu Pan6-pkGFP mu. 0-1, 9-100. W innym rozwiązaniu, opakowującą komórką transfekowaną pX-Pan6-pkGFP mu, 0-1, 9-100 jest komórka transfekowana adenowirusowym wektorem jak opisano powyżej niosącym inny transgen będący przedmiotem zainteresowania.
P r z y k ł a d 6 Wytwarzanie zrekombinowanego wektora Pan7, o usuniętym E1
A. Wytwarzanie plazmidów Pan7
Syntetyczny linker zawierający miejsca restrykcyjne PacI-Smal-Fsel-MIuI-EcoRV-PacI wklonowano w pBR322 cięty EcoRI i Ndel. Lewy koniec (pary zasad 1 do 3618) Ad Pan7 wklonowano w linker pomiędzy miejsca Smal i Fsel. Następnie ze sklonowanego lewego końca przez cięcie SnaBI i Ndel wycięto adenowirusowy E1 i wprowadzono w to miejsce kasety I-CeuI-GFP-PI-Scel z pShuttle (Clontech). Otrzymany plazmid cięto Fsel i Mlul i fragment Fsel (para zasad 3618) do Mlul (par zasad 155114) Ad Pan7 wprowadzono aby przedłużyć lewy koniec. Konstrukt (pPan7pGFP) zakończono przez wprowadzenie 21421 par zasad z fragmentu prawego końca Ad Pan7 z miejsca Mlul (para zasad 15114) do powyższego plazmidu pomiędzy Mlul i EcoRV, aby wytworzyć pełen klon molekularny adenowirusa Pan7 z usuniętym E1, odpowiedni do wytworzenia zrekombinowanych adenowirusów. Ewentualnie, żądany transgen wprowadzono w miejsca 1-Ceul i Pl-Scel nowo wytworzonego plazmidowego wektora pPan7.
B. Konstrukcja wektorów wirusowych Pan7, z których usunięto E1
Aby wytworzyć zrekombinowane adenowirusy z pPan7ΔE1, plazmid ko-transfekowano z elementem pomocniczym prowadzącym ekspresję E1, lub prowadzącą ekspresję E1, opakowującą linię komórkową, taką jak linię komórkową 293 lub linię komórkową wytworzoną jak tutaj opisano. Ekspresja E1 w opakowującej komórce pozwala na replikację i upakowanie pPan7ΔE1 w kapsydzie wirionu. W innym rozwiązaniu, opakowująca komórka transfekowana pX'pPan7ΔE1 jest transfekowana adenowirusowym wektorem jak opisano powyżej, niosącym transgen będący przedmiotem zainteresowania. Homologiczna rekombinacja zachodzi pomiędzy elementem pomocniczym a plazmidem, co pozwala na replikację sekwencji adenowirusa-transgenu z wektora i upakowanie w kapsydzie wirionu, prowadząc do zrekombinowanego adenowirusa. Transfekcja i oczyszczenie przeprowadzono jak opisano powyżej.
PL 209 133 B1
P r z y k ł a d 7 Wytwarzanie wektorów plazmidowych, w których zachodzi ekspresja genów E1
Skonstruowano wektory plazmidowe, które kodują region E1 genu Pan5, i stosowano te plazmidy aby wytworzyć stabilne linie komórkowe prowadzące ekspresję wirusowych białek E1.
Region E1 Pan5 wklonowano w pX' zasadniczo jak opisano w przykładzie 4 powyżej, przed zastąpieniem tego regionu fragmentem z pShuttle (Clontech). Plazmid ekspresyjny zawierał sekwencję Pan5 genomu adenowirusowego, obejmującą przynajmniej pary zasad 1 do 3959 w genomowej sekwencji Pan5. Zatem, plazmid ekspresyjny zawierał sekwencje kodujące E1a i E1b Ad Pan5 szympansa pod kontrolą heterologicznego promotora. Podobne plazmidy ekspresyjne mogą być wytworzone stosując regiony Ad Pan6 i AdPan 7 E1, zidentyfikowane w tabelach powyżej.
P r z y k ł a d 8 Wytwarzanie linii komórkowych prowadzących ekspresję białka E1 adenowirusa szympansa
Linie komórkowe prowadzące ekspresję wirusowego białka E1 wytworzono poprzez transfekcję komórek HeLa (ATCC Acc. No. CCL2) plazmidem według przykładu 6. Linie komórkowe są użyteczne do produkcji zrekombinowanych szympansich adenowirusów o usuniętym E1 przez ko-transfekcję genomowego wirusowego DNA i ekspresję plazmidów opisanych powyżej. Transfekcja tych linii komórkowych, jak i wyodrębnienie, i oczyszczanie zrekombinowanych adenowirusów szympansich tak powstałych przeprowadzono tradycyjnymi sposobami dla innych adenowirusów, to jest, adenowirusów ludzkich [patrz na przykład, Horwitz, cytowany powyżej i inne standardowe teksty].
A. Linie komórkowe prowadzące ekspresję białek E1 z Pan5
Komórki HeLa w 10 cm szalkach transfekowano 10 μg DNA pX-Pan51-E1 stosując zestaw CellphectTM (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) i zgodnie z protokołem producenta. 22 godziny po transfekcji komórki poddano trzy minutowemu szokowi glicerolowemu (15% glicerol w Hepes buforowanym solą, pH 7,5) przemywano raz w DMEM (HeLa) lub F12K (A549; Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) pożywką uzupełnioną 10% ECS, 1% Pen-Strep, następnie inkubowano przez sześć godzin w temp. 37°C w powyżej opisanych pożywkach. Transfekowane komórki następnie podzielono na dwa powtórzenia dla każdej próby na 15 cm szalkach w stosunku 1: 20,1 : 40,1 : 80,1 : 160, i 1: 320. Następnie inkubowano w temp. 37°G przez noc, pożywkę uzupełniono G418 (Life Technologies, Inc.) do stężenia 1 μg/ml. Pożywki zastępowano co 5 dni i klony wyizolowano 20 dni po transfekcji.
Klony komórek HeLa E1 wyizolowano i testowano pod kątem ich zdolności do zwielokrotnienia infekcji wirusem stowarzyszonym z adenowirusami (AAV) i ekspresji zrekombinowanego białka LacZ jak opisano poniżej.
B. Test zwiększenia AAV do przeszukiwania linii komórkowych prowadzących ekspresję E1
AAV wymaga białek kodowanych przez adenowirus w celu zakończenia pełnego cyklu życiowego. Adenowirusowe białka E1 jak i białko E4 regionu kodowanego przez ORF6 są konieczne do zwiększenia infekcji AAV. Stosowany jest test sprawdzający ekspresję E1 oparty na zwiększeniu AAV. Pokrótce, sposób identyfikacji komórek prowadzących ekspresję adenowirusowego E1 obejmuje etapy zakażenia w oddzielnych hodowlach przypuszczalnych komórek prowadzących ekspresję adenowirusowego E1 i komórek nie zawierających sekwencji adenowirusowej, wirusem stowarzyszonym z adenowirusem (AAV) prowadzącym ekspresję genu markerowego i AAV prowadzącym ekspresję genu E4 ORE6 ludzkiego adenowirusa, przez odpowiedni czas. Aktywność genu markerowego w otrzymanych komórkach zmierzono i te komórki, w których stwierdzono znacząco większą mierzalną aktywność markera niż w komórkach kontrolnych, wybrano jako potwierdzone komórki prowadzące ekspresję E1. W poniższym doświadczeniu, gen markerowy jest genem lacZ i aktywność markera jest widoczna jako błękitny barwnik.
Na przykład, linie komórkowe opisane powyżej, jak i nietransfekowane kontrolne komórki (HeLa) infekowano 100 genomami na komórkę wektora AAV niosącego gen markerowy, na przykład AV.LacZ [K. Fisher i wsp., J. Virol., 70: 520 (1996)] i wektora AAV prowadzącego ekspresję regionu ORF6 ludzkiego 5 (AV.orf6). Sekwencja DNA plazmidu wytwarza nowy zrekombinowany wirus stowarzyszony z adenowirusami (rAAV) zawierający transgen LacZ i Ad E4 ORF 6, który jest otwartą ramką odczytu, której produkt ekspresji ułatwia przejście z jednoniciowej (ss) w dwuniciową (ds) strukturę genomowego DNA rAAV. Te wektory inkubowano w pożywce zawierającej 2% FCS i 1% Pen-Strep w temp. 37°C przez 4 godzin, w którym to momencie dodano równą objętość pożywki zawierającej 10% FCS. Powinno być zrozumiałe przez specjalistę w dziedzinie, że dowolny gen markerowy (lub gen reporterowy) może być zastosowany w tym teście w pierwszym wektorze AAV, na przykład taki jak fosfoataza alkaliczna, lucyferaza i inne. Do ilościowego oznaczenia poziomów antygenu może być również stosowany test przeciwciało-enzym, tam gdzie marker wyraża antygen. Test nie jest ograni44
PL 209 133 B1 czony do danego genu markerowego. Dwadzieścia do dwudziestu czterech godzin po infekcji, komórki barwiono pod kątem aktywności LacZ stosując standardowe sposoby. Po 4 godzinach komórki obserwowano mikroskopowo i linie komórkowe o znacząco bardziej błękitnych komórkach niż komórki kontrolne A549 lub komórki HeLa były uważane za pozytywne.
P r z y k ł a d 9 Dostarczenie transgenu do komórki gospodarza
Otrzymane zrekombinowane adenowirusy szympansa opisane w przykładach 4, 5 lub 6 powyżej, następnie zastosowano do dostarczania transgenu do komórki ssaczej, korzystnie ludzkiej. Na przykład, po oczyszczeniu zrekombinowanego wirusa, ludzkie komórki embrionalne nerki 293 infekowano przy MOI 50 cząsteczek na komórkę. Ekspresję GFP obserwowano 24 godziny po infekcji.
A. Przeniesienie genu w mysich modelach poprzez wektory Pan-6, Pan-7 oraz Pan-9
Wydajności przeniesienia genu i profile toksykologiczne zrekombinowanych szympansich adenowirusów porównano przy przeniesieniu genu ukierunkowanemu na wątrobę myszy, przy przeniesieniu genu ukierunkowanemu na płuca myszy i przy przeniesieniu genu ukierunkowanemu na mięśnie myszy.
Skonstruowano adenowirusowe wektory o usuniętym E1 zawierające LacZ pod kontrolą promotora CMV stosując tutaj techniki dla ludzkiego Ad5, szympansiego Pan 6, szympansiego Pan 1 i szympansiego Pan 9 (068). Wektory dostarczano nagiej myszy NCR o niedoborze odporności (80 w każdym badaniu) następująco. W badaniach wątroby, 100 μl (1 x1011 cząsteczek) wstrzyknięto do żyły ogonowej. W badaniach płuc, 50 ul (5x10 cząsteczek) dostarczono dotchawiczo. W bada10 niach mięśni, 25 ul (5 x10 cząsteczek) wstrzyknięto do żyły piszczelowej przedniej. Myszy uśmiercano w dniach 3, 7, 14 i 28 po iniekcji wektora (5 zwierząt na grupę w każdym punkcie czasowym). Przy każdej nekropsji, zebrano tkankę wątroby/płuc/mięśni i przygotowano do kriobloków i zatopienia w parafinie. Kriobloki pocięto na skrawki do barwienia X-gal i skrawki w parafinie barwiono H & E do analizy histopatologicznej. W każdym punkcie czasowym wykonano końcowe skrwawienie. Próbki surowicy analizowano pod kątem funkcji wątroby.
Obserwowane w tym doświadczeniu adenowirusy szympansie Pan-6, Pan-7, i Pan-9 były mniej skuteczne niż huAd5 w przeniesieniu genu do wątroby i do płuc. Jednakże, może być pożądane w pewnych przypadkach, obniżenie toksyczności dla wątroby obserwowanej przy huAd5. Mniej różniła się pomiędzy serotypami skuteczność przeniesienia genu w mięśniach.
B. Badanie na myszach wykonalności ponownego podania wektorów adenowirusowych przez zmianę serotypów pomiędzy wektorami Adhu5, Pan-6, Pan-7 i Pan-9
Myszom (C57/BI6; 4/grupę) podawano przez żyłę ogonową wektory LacZ oparte na huAd5, Pan-6, Pan-7 i Pan-9 (H5.040CMVLacZ, Pan6.000CMVLacZ, Pan7.000CMVLacZ, Pan9.000CMVLacZ; 1010- cząsteczek/iniekcję). Trzydzieści dni później myszom ponownie podawano wektory adenowirusowe umożliwiające ekspresję a1-antytrypsyny (H5.040CMVhA1AT, Pan6.000CMVhA1AT, 1x1011 cząsteczki. Pan7.000CMVhA1AT, Pan9.000CMVhA1AT, 1x1011 cząsteczek/iniekcję). Pomyślne transdukcje w wyniku ponownego podawania wektora monitorowano przez pomiar a1-antytrypsyny w surowicy w dniu 3 i 7 po ponownym podaniu.
Wyznaczono zdolność adenowirusowych wektorów opartych odpowiednio na huAd5, Pan-6, Pan-7, i Pan-9 do transdukcji wątroby myszy w obecności neutralizujących przeciwciał przeciwko innym serotypom. Wyniki zestawiono w tabeli poniżej.
1. iniekcja 2. iniekcja Neutralizująca krzyżowa
1 2 3
Adhu5 Adhu5 Tak (+kontrola ve)
Pan-6 Nie
Pan-7 Nie
Pan-9 (C68) Nie
Pan-6 Adhu5 Nie
Pan-6 Tak (+kontrola ve)
Pan-7 Tak
Pan-9 (C68) Nie
PL 209 133 B1 cd. tabeli
1 2 3
Pan-7 Adhu5 Nie
Pan-6 Tak
Pan-7 Tak (+kontrola ve)
Pan-9 (C68) Tak
Pan-9 (C68) Adhu5 Nie
Pan-6 Nie
Pan-7 Tak
Pan-9 (C68) Tak (ekontrola ve)
Zdolność wektorów do transdukcji mysiej wątroby w obecności neutralizujących przeciwciał przeciwko innym serotypom.
Zatem, immunizacja huAd5 nie zapobiega ponownemu podawaniu zarówno adenowirusowych szympansich wektorów Pan-6, Pan-7, jak i Pan-9 (C68). To doświadczenie również wydaje się wykazywać, że Pan-7 jest pomiędzy Pan-6 a Pan-9 w spektrum antygenowego powiązania i reakcji krzyżowych; jednakże Pan-6 i Pan-9 nie neutralizują siebie nawzajem. Jest to zaskakujący wynik oparty na porównaniu homologii, co wskazuje że Pan-6 jest zupełnie inny niż Pan-7 i Pan-9. Wyznaczenie wartości surowicy odpornościowej wytworzonej przeciwko Pan-9 wykazało brak neutralizacji krzyżowej przeciwko Pan-6, lecz pewną neutralizację przeciwko Pan-7, co dowodzi, że Pan-6 jest inny niż pozostałe.
P r z y k ł a d 10 Wytwarzanie zrekombinowanego wektora SV-25, w którym usunięto E1
Plazmid skonstruowano tak, aby zawierał cały genom SV-25 z wyjątkiem zaprojektowanej delecji E1. W miejscu delecji E1 wprowadzono miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne I-Ceul i Pl-Scel, co umożliwiłoby wprowadzenie transgenu z plazmidu binarnego (wahadłowego), gdzie transgenowa kaseta ekspresyjna jest flankowana przez te dwa miejsca rozpoznawane przez enzymy.
Syntetyczny linker zawierający miejsca restrykcyjne Swal-SnaBI-Spel-AflII-EcoRV-Swal wklonowano w pBR322 cięty hEcoRI i Ndel. Przeprowadzono to przez annealing razem dwóch syntetycznych oligomerów SV25T (5'-AAT TTA AAT ACG TAG CGC ACT AGT CGC GCT AAG CGC GGA TAT CAT TTA AA-3', SEK NR ID: 38) i SV25B (5'-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTA TTT A-3', SEK NR ID: 39) i wprowadzenie do pBR322 trawionego EcoRI i Ndel. Lewy koniec (pary zasad 1 do 1057, SEK NR ID: 29) Ad SV25 wklonowano w powyższy linker pomiędzy miejsca SnaBI i Spel. Prawy koniec (pary zasad 28059 do 31042, SEK NR ID: 29) Ad SV25 wklonowano w linker pomiędzy miejsca Aflll i EcoRV. Następnie wycięto Adenowirusowy E1 pomiędzy miejscem EcoRI (para zasad 547) do Xhol (para zasad 2031) ze sklonowanego lewego końca następująco. Wytworzoną metodą PCR kasetę I-CeuI-PI-Scel z pShuttle (Clontech) wprowadzono w miejsca EcoRI i Spel. Fragment Xhol Ad SV-25 o 10154 parach zasad (para zasad 2031 do 12185, SEK NR ID: 29) następnie został wprowadzony w miejsce Spel. Otrzymany plazmid trawiono Hindlll i konstrukt (pSV25) zakończono przez wprowadzenie fragmentu Hindlll, 18344 par zasad, Ad SV-25 (pary zasad 11984 do 30328, SEK NR ID: 29) aby wytworzyć pełen klon molekularny adenowirusa SV25 o usuniętym E1, odpowiedni do wytwarzania zrekombinowanych adenowirusów. Ewentualnie, żądany transgen został wprowadzony w miejsca I-Ceul i Pl-Scel nowo wytworzonego plazmidowego wektora pSV25.
Aby wytworzyć AdSV25 niosący gen markerowy, kasetę ekspresyjną GFP (zielone fluorescencyjne białko) wcześniej wklonowano w plazmid pShuttle (Clontech) cięty enzymami restrykcyjnymi I-Ceul i Pl-Scel i ligowano z pSV25 (lub inny z szympansich plazmidów Ad tutaj opisanych) trawionym takimi samymi enzymami. Otrzymany plazmid (pSV25GFP) trawiono Swal, aby oddzielić szkielet bakteryjnego plazmidu i transfekowano linię komórkową HEK 293 komplementującą E1. Około 10 dni później obserwowano efekt cytopatyczny, co wskazuje na obecność replikującego wirusa. Pomyślne wytwarzanie opartego na Ad SV25 wektora adenowirusowego umożliwiającego ekspresję GFP potwierdzono stosując supernatant z transfekowanej hodowli w świeżych hodowlach komórkowych. Obecność drugorzędowej infekowanej komórki wyznaczano przez obserwację w populacji komórek zielonej fluorescencji.
PL 209 133 B1
P r z y k ł a d 11 Konstrukcja wektorów Pan-5, Pan-6, Pan-7 i C68 z usuniętym E3
W celu zwię kszenia pojemnoś ci klonowania wektorów adenowirusowych, region E3 moż e być usunięty ze względu na to, że region ten koduje geny, które nie są konieczne do propagacji wirusa w hodowli. Do tego koń ca uzyskano warianty Pan-5, Pan-6, Pan-7 i C68 o usunię tym E3 (fragment Nru-AvrII o 3,5 kilozasadach, zawierający E31-9 jest usunięty).
A. Wektor oparty na Pan5 z usuniętym E3
Plazmid pPan5-pkGFP o usuniętym E1 traktowano endonukleazą Avr II aby wyodrębnić fragment o 5,8 kilozasadach zawierający region E3 i ponownie włączono do krążenia pPan5-pkGFP z delecją Avr II aby utworzyć konstrukt pPan5-plcGFP-E3-Avr II. Następnie fragment 5,8 kilozasad Avr II wklonowano w pSL-Pan5-E3-AvrII aby wprowadzić dalszą delecję regionu E3 przez trawienie Nrul. To prowadzilo do plazmidu pSL-Pan5-delecja-E3. Końcowy konstrukt pPan5-E3-pkGFP wytworzono przez usunięcie fragmentu AvrII/SpeI o 4,3 kilozasadach z plazmidu pSL-Pan5-delecja-E3 i wprowadzanie w pPan5-plcGFP-E3-Avr II w miejscu Avr II. W tym końcowym konstrukcie, uzyskano delecję w regionie E3, o 3,1 kilozasadach.
B. Delecja E3 w wektorze opartym na Pan6
Klon molekularny pPan6-pkGFP o usuniętym E1 trawiono Sbf I i Not I, aby wyodrębnić fragment o 19,3 kilozasadach i ligowano ponownie w miejscu Sbf I. Otrzymany konstrukt pPan6-Sbf I-E3 traktowano Eco 47 III i Swal, tworząc pPan6-E3. Na koniec, fragment Sbf I o 21 kilozasadach z trawionego Sbf I pPan6-pkGFP wklonowano w pPan6-E3, aby utworzyć pPan6-E3-pkGFP z delecją w E3 o 4 kilozasadach.
C. Wektory Pan7 i Pan9 z usuniętym E3
Taką samą strategię stosowano aby uzyskać delecję E3 w obu wektorach. Po pierwsze, fragment 5,8 kilozadad Avr II obejmujący region E3 wklonowano w pSL-1180, a następnie uzyskano delecję E3 przez trawienie Nrul. Otrzymane plazmidy traktowano Spe I i Avr II, aby otrzymać fragmenty 4,4 kilozasad i wklonowano odpowiednio w pPan7-pkGFP i pPan9-pkGFP w miejsca Avr II aby zastąpić wyjściowy E3 zawierający fragmenty Avr II. Końcowe konstrukty pPan7 - E3-pkGFP i pPan9-E3pkGFP mają delecję E3 o 3,5 kilozasadach.
P r z y k ł a d 12 Konstrukcja wektora Pan-7 z usuniętym E3 i E4
Pomimo, że delecja regionu E1 adenowirusów (pierwsza generacja adenowirusowych wektorów) czyni je niekompetentymi pod względem replikacji, ekspresja genów szkieletowych wektorów adenowirusowych nie jest w pełni zniesiona. Delecja regionu E4 znacząco osłabia tę resztkową ekspresję genu i może nadawać korzyść bezpieczeństwa. Skonstruowano wektor Pan-7 o usuniętym E4, zawierający delecję o 2,5 kilozasadach (usunięto fragment PvuII-AgeI zawierający E40RF1-ORF7). Roztwory wyjściowe tego wirusa o wysokich mianach wytworzono stosując opartą na HEK 293 linię komórkową, która oprócz E1, prowadzi ekspresję zasadniczego genu E4 (orf 6).
1. Delecja E4 w klonie molekularnym Pan7
Fragment Xba I o 19 kilozasadach usunięto z pPan7-pkGFP aby utworzyć pPan7- Xba I, z którego fragment E4 o 2,5 kilozasadach usunię to przez częściowe trawienie Age I i Pvu II, prowadząc do pPan7-Xba I-E4. Plazmid pPan7-E4-pkGFP wytworzono z pPan7-Xba I-E4 w dwóch kolejnych etapach klonowania, dodając fragmenty Xba I o 19 kilozasadach i I-Ceu I/Mlu I o 15 kilozasadach, z których oba pochodzą z konstruktu pPan7-pkGFP.
2. Wprowadzenie delecji E3 i E4 do wektora Pan9
Plazmid o 11 kilozasadach, pPan9-EcoRI, zawierający region E4 utworzono przez odzyskanie fragmentu EcoRI o 11 kilozasadach z pPan9 pkGFP po trawieniu EcoRI i samoligacji. Region E4 usunięto z tego konstruktu przez trawienie Age I wypełnienie i częściowe trawienie Pvu II i samo-ligację, aby wytworzyć pPan9-EcoRI-E4. Fragment EcoRI o 23 kilozasadach wyizolowano z pPan9-pkGFP i wprowadzono do pPan9-EcoRI-E4 w miejsce EcoRI, a nastę pnie dodano fragment Avr II o 5,8 kilozasadach z pPan9-pkGFP, aby utworzyć końcowy produkt pPan9-E3-E4-pkGF. W porównaniu do wielkości genomu typu dzikiego Pan9, wektor ten o usuniętych E1-E3-E4 może mieć pojemność transgenu do 8 kilozasad.
3. Wprowadzenie kaset minigenów z genami będącymi przedmiotem zainteresowania obejmującymi geny reporterowe, glikoproteiny i białka jądrowe Ebo do klonów molekularnych wektorów Pan
Bardzo efektywne bezpośrednie klonowanie i procedurę selekcji zielone /białe zastosowano do wytworzenia klonów molekularnych zrekombinowanych wirusów. Pokrótce, geny będące przedmiotem zainteresowania wklonowano w pShuttlepkGFP przez przeszukiwanie białych kolonii pod kątem rekombinantów. Następnie, kasety minigenów przeniesiono do szkieletowych plazmidów adenowirusów
PL 209 133 B1 szympansa, pPanX-pkGFP o różnych delecjach, łatwo przez wymianę z kasetą pkGFP w miejscach I-Ceu I i Pl-Sce I i przeszukiwanie kilku białych kolonii pod kątem właściwych rekombinantów.
4. Odzyskanie klonów molekularnych wektorów Pan z wielokrotnymi delecjami we wczesnych regionach i propagacja wirusa
Do odzyskania klonów molekularnych o usuniętych E1-E3 adenowirusowych szympansich wektorów, klony przeprowadzono w postać liniową odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i transfekowano typowe komórki 293. Gdy w transfekowanych komórkach obserwowano pełny efekt cytopatyczny (CPE), surowy lizat zebrano i zwielokrotniono w komórkach 293 do infekcji na dużą skalę. Wirusy oczyszczano metodą osadzania w CsCI.
Do wektorów Pan o usuniętych E1-E4 i E1-E3-E4, 10-3 komórek, opartych na linii komórkowej 293 komplementującej E1-E4, stosowano do odzyskania i powielania wektorów. Ekspresja genu E4 ORF6 w 10-3 komórkach indukowana była przez dodanie 150 μM ZnSO4 do pożywki hodowlanej.
P r z y k ł a d 13 Szczepienie wektorami adenowirusowymi prowadzącymi ekspresję Ebo Z GP typu dzikiego i wariantami
Wektory AdHu5 lub AdG7 umożliwiające ekspresję chimer otoczek Ebola produkowano do doświadczeń immunizacji in vivo u myszy G57BL/6. Zrekombinowane wirusy o różnycń wirusowych szkieletach utworzono metodą klonowania molekularnego, w której zamiast usuniętych E1 wprowadzono kasety minigenów. Klony molekularne wszystkich zrekombinowanych wirusów odzyskano i hodowano w komórkach 293 na dużą skalę oczyszczania stosując metodę osadzania w CsCl. Wybrano pięć wariantów EboZ kodowanych przez AdHu5 lub AdPan7 (C7) i produkowano aby określić ich względną immunogenność po domięśniowej iniekcji Ad. Typ dziki Ebo, rozpuszczalny wariant Ebo, EboΔ1, EboΔ2, EboΔ3, EboΔ4, EboΔ5S, EboΔ6S, EboΔ7S i EboΔ8S określano we wstępnych badaniach szczepionek. W danych podsumowanych w poniższej tabeli, liczbę wirusowych cząsteczek (na ml lub całkowitą) produkowanych i amplifikowanych z infekowanych komórek 293 ustalono przez odczyt spektrofotometryczny.
T a b e l a: Wytwarzanie wektorów adenowirusowych Adhu5 lub AdC7 kodujących wariant EboZ.
Gen HuAd5 AdC7
Miano (VP x 1012/ml) Całkowita wydajność (VP x 10/ml) Miano (VP x 1012/ml) Całkowita wydajność (VP x 1012/ml)
Ebo typ dziki 2,6 12 4,3 43
EboS 4,9 49 4,6 55
Ebo Δ2 2,1 9 5,8 93
EboA3 1,7 8 5,3 95
EboA4 3 12 4,1 62
Wektor podawano domięśniowo (1011 kopii genomu/komórkę) myszom C57BL/6 i obecność przeciwciała neutralizującego wirus (VNA) określono 28 dni później jako pierwszy pomiar odpowiedzi immunologicznej wytworzonej przeciwko glikoproteinie otoczki Ebola. VNA zdefiniowano tutaj jako przeciwciało w surowicy zdolne do hamowania transdukcji komórek HeLa w której pośredniczy wektor oparty na HIV pseudotypowany z otoczką Ebola typu dzikiego.
VNA przeciwko pseudotypom EboZ wykrywano stosując AdPan7 (C7) dającym wyższe miana niź AdHu5. EboZA3 wywoływał najwyższe VNA w odniesieniu do docelowych transgenów. Aby podsumować dane w poniższej tabeli, dostarczono miana neutralizujących przeciwciał przeciwko pseudotypom HIV-EboZ-GFP (odwrotne rozcieńczenie) (N=5 zwierząt/grupę).
Miana VNA
EboZ typ dziki EboZs EboZΔ3
AdHu5 12 16 12
AdC7 44 12 140
PL 209 133 B1
P r z y k ł a d 14 Ekspresja białek Ebola w której pośredniczy Pan7
Rozpoczęto badania na myszach aby ocenić ekspresję białek otoczki Ebola i jądrowego antygenu Ebola, w której pośredniczą wektory Pan7. Badania te są skierowane na ocenę neutralizującego przeciwciała u myszy C57BI/6, którym wstrzyknięto domięśniowo (IM) Adhu5 lub Pan-7 umożliwiających ekspresję każdego z 4 konstruktów env Ebola.
A. Ocena CTL u myszy C57B1/6, którym wstrzyknięto domięśniowo Adhu5 lub Pan-7 umożliwiające ekspresję konstruktów env Ebola
1. Doświadczenie prowokacji u myszy z wirusem Ebola
Odpowiedzi neutralizujące przeciwciał (NAB) na otoczkę Ebola analizowano przez badanie immunizowanych mysich surowic, które pośredniczą w neutralizacji lentiwirusowego (HIV) wektora pseudotypowanego kilkoma konstruktami (eEbo, NTD2, NTD3, NTD4) glikoproteiny otoczki Ebola. Myszy C57BL/6 lub BALB/c otrzymały pojedynczą domięśniową iniekcję 5 x 1010 cząsteczek na mysz C7 (Ad Pan-7) kodującego wariant otoczki Ebola. Neutralizujące przeciwciało określono 30 dni po szczepieniu. Pokrótce, Ebola z Zairu pseudotypowano wektorem HIV kodującym β-galaktozydazę (EboZ-HIV-LacZ), inkubowano przez 2 godziny w temp. 37°C z różnymi rozcieńczeniami dezaktywowanej ciepłem mysiej surowicy. Po inkubacji z surowicą, do zakażania komórek HeLa następnie stosowano EboZ-HIV-LacZ przez 16 godzin w temp. 37°0. Zakażalność ujawniono przez barwienie X-galem transdukowanych komórek HeLa pozytywnych względem β-galaktozydazy. Miano neutralizujących przeciwciał reprezentuje odwrotność rozcieńczenia surowicy, przy której obserwowano 50% obniżenie liczby błękitnych komórek β-galaktozydazo pozytywnych. Surowice zebrano 30 dni po im10 munizacji, która obejmowała pojedyncze domięśniowe (I. M.) podanie 5 x 1010 cząsteczek/zwierzę. Neutralizujące przeciwciało przeciwko pseudotypowanemu Ebola HIV może być wykryte ze wszystkich grupach o mianach przeciwciał w zakresie od 20 dla Ad-EboZ (Adhu5 z którego zachodzi ekspresja EboZ), Ad-NTD3 (Adhu5 z którego zachodzi ekspresja NTD3) i C7-sEbo (Ad Pan-7 z którego zachodzi ekspresja rozpuszczalnego EboZ) do ponad 130 dla C7-NTD3 (Ad Pan-7 z którego zachodzi ekspresja NTD3) i C7-NTD4 (Ad Pan-7 z którego zachodzi ekspresja NTD3). Taka sama strategia immunizacji u myszy BALB/c prowadziła do niższych mian neutralizujących przeciwciał dla Adi C7-NTD2, i NTD4.
B. Komórkowa odpowiedź immunologiczna
Komórkową odpowiedź immunologiczną na otoczkę Ebola u myszy C57BL/6 określono 8 dni po pojedynczym podawaniu I. M. 5 x 1010 cząsteczek C7-LacZ lub wariantu C7-otoczki Ebola na zwierzę. Myszy szczepiono I. M. stosując 5 x 1010 cząsteczek C7 kodujących LacZ lub wariant otoczki Ebola. Śledzionowe limfocyty od immunizowanych myszy zebrano 8 dni po szczepieniu i stymulowano in vitro komórkami zasilającymi (śledzionowe limfocyty od nie traktowanych myszy infekowane ludzkim adenowirusem o serotypie 5 kodującym typ dziki otoczki Ebola i naświetlane). Standardowe testy 5-hr CTL wykonano stosując znakowane 51Cr syngeniczne komórki C57 transfekowane czynnikiem ekspresyjnym EboZ.
Pozytywną odpowiedź ograniczonych MHC cytotoksycznych limfocytów T (CTL) obserwowano we wszystkich AdPan-7 kodujących wariant otoczki Ebola o silniejszej odpowiedzi u myszy immunizowanych NTD2, NTD3 lub NTD4. W rzeczywistości, komórki efektorowe od myszy immunizowanych C7 kodującym warianty otoczki Ebola rozpoznawały docelowe komórki transfekowane EboZ i dały odpowiedzi przypominające CTL do 30% specyficznych liz. Mniej niż 5% liz obserwowano dla efektorowych komórek z kontrolnych myszy nie stykających się z bodźcem lub immunizowanych LacZ co potwierdza, że liza była specyficzna dla antygenów otoczki Ebola.
C. Badania ochrony
Najbardziej bezpośrednie środki do oceny C7 (AdPan-7) kodującego warianty EboZ, jako skutecznej szczepionki u myszy polegały na określeniu ochrony przeciwko utracie masy i śmierci w wyniku śmiertelnej prowokacji u myszy, które przyjęły wirus Ebola z Zairu. Myszy BALB/c immunizowano pojedynczą dawką 5 x 1010 cząsteczek na zwierzę jak wykonywano wcześniej i szczepione zwierzęta poddano prowokacji 200 LD50 myszy, które przyjęły Ebola z Zairu 21 dni później. Wszystkie kontrolne myszy (zaróbka i C7-LacZ) zmarły pomiędzy 5. dniem dniami do 9. dnia po prowokacji. Przeciwnie, wszystkie szczepione myszy oprócz jednej, (z grupy C7-sEbo), przeżyły test prowokacji Ebola z Zairu.
Utratę masy obserwowano u myszy szczepionych C7-sEbo od dnia 4 do dnia 7. Oznaki choroby takie jak jeżenie włosów i od lekkiego do ciężkiego letargu rejestrowano również u myszy szczePL 209 133 B1 pionych C7-sEbo, NTD2 i NTD3 pomiędzy dniem 4 a dniem 7. Myszy immunizowane C7-EboZ i C7-NTD4 nie wykazywały znaków choroby. Ogólnie, pojedyncza dawka C7-EboZ i C7-NTD4 całkowicie chroniła immunizowane myszy przed chorobą i śmiercią prawdopodobnie ze względu na wysoką odporność, w której pośredniczą limfocyty T.
Wszystkie dokumenty cytowane powyżej są włączone tutaj przez odniesienie. Wiele modyfikacji i wariantów niniejszego wynalazku jest objętych zakresem powyższego opisu i są oczywiste dla specjalisty w dziedzinie. Takie modyfikacje i zmiany w kompozycjach i sposobach według niniejszego wynalazku, które jak selekcja różnych minigenów lub wybór lub dawkowanie wektorów lub modulatorów immunologicznych są uważane za objęte zakresem załączonych zastrzeżeń patentowych.

Claims (26)

1. Rekombinowany adenowirus obejmujący kapsyd zawierający białko heksonu, białko pentonu i białko włókna, przy czym białko heksonu Pan7 ma sekwencję SEK NR ID: 11, a adenowirus ponadto obejmuje sekwencję adenowirusa bez części lub całości genu E1, konieczne do replikacji i otoczenia kapsydem adenowirusowe elementy cis 5' i 3', heterologiczny dla adenowirusa transgen funkcjonalnie połączony z sekwencjami, które kierują ekspresją tego genu w komórkach gospodarza.
2. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że kapsyd obejmuje fragment białka włókna Pan7 z SEK NR ID: 20 Pan7.
3. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kapsyd ponadto obejmuje białko włókna AdPan7 z SEK NR ID: 12.
4. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że kapsyd ponadto obejmuje białko pentonu AdPan7 z SEK NR ID: 6.
5. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że rekombinowany adenowirus jest pseudotypowanym adenowirusem obejmującym konieczne do replikacji i otoczenia kapsydem adenowirusowe elementy cis 5' i 3', przy czym te elementy cis zawierają 5' końcowe odwrócone powtórzenia i 3' końcowe odwrócone powtórzenia z adenowirusa heterologicznego wobec AdPan7.
6. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej adenowirusowych genów.
7. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że zawiera ponadto adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego wybrane spośród jednej lub więcej grup składających się z:
a) sekwencji 5' końcowych odwróconych powtórzeń (ITR);
b) regionu E3, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 i E3 ORF9;
c) regionu E4, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 i E4 ORF1; oraz
d) 3'ITR,
SEK NR ID:9 Pan7 lub sekwencji komplementarnej do niej.
8. Rekombinowany adenowirus obejmujący kapsyd zawierający hekson obejmujący fragement białka heksonu Pan7, sekwencję adenowirusa, w której nie ma całości lub części genu E1, sekwencję kwasu nukleinowego heterologiczną wobec Pan7, przy czym fragment białka heksonu Pan7 stanowi sekwencję SEK NR ID: 11 białka heksonu Pan7 mającą skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o długość około 50 aminokwasów.
9. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 8, znamienny tym, że kapsyd obejmuje fragment białka włókna Pan7 z SEK NR ID: 20 Pan7.
10. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że kapsyd ponadto obejmuje białko włókna AdPan7 z SEK NR ID: 12.
11. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 8 do 10, znamienny tym, że kapsyd ponadto obejmuje białko pentonu AdPan7 z SEK NR ID: 6.
12. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 8 do 11, znamienny tym, że rekombinowany adenowirus jest pseudotypowanym adenowirusem obejmującym konieczne do replikacji i otoczenia kapsydem adenowirusowe elementy cis 5' i 3', przy czym te elementy cis zawierają 5' końcowe odwrócone powtórzenia i 3' końcowe odwrócone powtórzenia z adenowirusa heterologicznego wobec AdPan7.
PL 209 133 B1
13. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 8 do 12, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej adenowirusowych genów.
14. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 8 do 12, znamienny tym, że zawiera ponadto adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego wybrane spośród jednej lub więcej grup składających się z:
a) sekwencji 5' końcowych odwróconych powtórzeń (ITR);
b) regionu E3, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E3 ORF1, E3 ORF2, E3
ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8 i E3 ORF9;
c) regionu E4, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 i E4 ORF1; oraz
d) 3'ITR,
SEK NR ID:9 Pan7 lub sekwencji komplementarnej do niej.
15. Adenowirus obejmujący kapsyd adenowirusowy zawierający białko heksonu Pan7 z SEK NR ID: 11 i sekwencję heterologicznego adenowirusowego białka kapsydowego.
16. Adenowirus według zastrz. 15, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego adenowirusowego białka kapsydu jest wybrana spośród:
białka pentonu Pan5 z SEK INR ID: 2 lub Pan 6 z SEK NR ID: 10, lub jego fragmentu, oraz białka włókna Pan5 z SEK INR ID: 4 lub Pan 6 z SEK NR ID: 8, lub jego fragmentu.
17. Adenowirus według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że kapsyd obejmuje fragment białka pentonu Pan5 z SEK INR ID: 2 lub Pan 6 z SEK NR ID: 10.
18. Adenowirus według jednego z zastrz. 15 do 17, znamienny tym, że kapsyd obejmuje białka włókna Pan5 z SEK INR ID: 4 lub Pan 6 z SEK NR ID: 8.
19. Rekombinowany adenowirus według jednego z zastrz. 15 do 18, znamienny tym, że obejmuje adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego wybrane spośród jednej lub więcej grupy składającej się z:
a) sekwencji 5' końcowych odwróconych powtórzeń (ITR);
b) regionu E3, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E3 ORF1, E3 ORF2, E3
ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, i E3 ORF9;
c) regionu E4, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2, i E4 ORF1; oraz
d) 3'ITR,
Pan7 z SEK NR ID: 9 lub sekwencji komplementarnej.
20. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 19 znamienny tym, że obejmuje co najmniej jedno białko kapsydu małpiego wybranego spośród:
białka pentonu Pan7 z SEK NR ID: 10 lub jego fragmentu; oraz białka włókna Pan7 z SEK NR ID: 12 lub jego fragmentu.
21. Rekombinowany adenowirus mający kapsyd obejmujący fragment zawierający hekson z białka heksonu AdPan7 oraz sekwencję kwasu nukleinowego heterologiczną wobec AdPan7, przy czym fragment białka heksonu AdPan7 jest wybrany z grupy składającej się z:
sekwencji białka heksonu AdPan7 z SEK NR ID: 11 mającej skrócony koniec N i/lub skrócony koniec C o długość około 50 aminokwasów; reszt aminokwasowych 125 do 443;
reszt aminokwasowych 138 do 441; reszt aminokwasowych 138 do 163; reszt aminokwasowych 170 do 176; oraz reszt aminokwasowych 404 do 430, w odniesieniu do SEK NR ID: 11.
22. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje adenowirusowe sekwencje kwasu nukleinowego wybrane spośród jednej lub więcej grupy składającej się z:
a) sekwencji 5' końcowych odwróconych powtórzeń (ITR);
b) regionu E3, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E3 ORF1, E3 ORF2, E3
ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, i E3 ORF9;
c) regionu E4, lub jego fragmentu wybranego z grupy składającej się z E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2, i E4 ORF1; oraz
d) 3'ITR,
Pan7 z SEK NR ID: 9 lub sekwencji komplementarnej.
PL 209 133 B1
23. Rekombinowany adenowirus według zastrz. 22, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jedno białko kapsydu małpiego wybranego spośród:
białka pentonu Pan7 z SEK NR ID: 10 lub jego fragmentu; oraz białka włókna Pan7 z SEK NR ID: 12 lub jego fragmentu.
24. Izolowana komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje rekombinowanego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 - 23.
25. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje zrekombinowanego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 - 23 w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
26. Zastosowanie rekombinowanego adenowirusa określonego w jednym z zastrz. 1 - 23 do wytwarzania leku przygotowanego do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciwko zakaźnemu czynnikowi u gospodarza będącego ssakiem, przy czym heterologiczny gen koduje antygen czynnika zakaźnego.
PL373602A 2001-11-21 2002-11-20 Rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie PL209133B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33195101P 2001-11-21 2001-11-21
US36679802P 2002-03-22 2002-03-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373602A1 PL373602A1 (pl) 2005-09-05
PL209133B1 true PL209133B1 (pl) 2011-07-29

Family

ID=26987985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373602A PL209133B1 (pl) 2001-11-21 2002-11-20 Rekombinowany adenowirus, obejmująca go izolowana komórka gospodarza, oraz kompozycja i zastosowanie

Country Status (19)

Country Link
US (5) US7247472B2 (pl)
EP (4) EP3108899A1 (pl)
JP (9) JP2005511035A (pl)
KR (1) KR100987360B1 (pl)
CN (1) CN1578678B (pl)
AU (1) AU2002365366B2 (pl)
BR (1) BR0214350A (pl)
CA (3) CA2990322A1 (pl)
CO (1) CO5590973A2 (pl)
HU (3) HU230364B1 (pl)
IL (5) IL161584A0 (pl)
MX (2) MXPA04004876A (pl)
NO (3) NO332692B1 (pl)
NZ (3) NZ564586A (pl)
PH (1) PH12016500338A1 (pl)
PL (1) PL209133B1 (pl)
SG (2) SG165153A1 (pl)
WO (1) WO2003046124A2 (pl)
ZA (1) ZA200403117B (pl)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE530672T1 (de) 2001-06-22 2011-11-15 Univ Pennsylvania Rekombinante adenoviren mit affen-adenovirus proteinen und verwendung davon.
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
EP3108899A1 (en) 2001-11-21 2016-12-28 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian adenovirus adsv1 nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
PL376792A1 (pl) 2002-10-23 2006-01-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sposoby szczepienia przeciwko malarii
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
WO2005001103A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
EP1711518B1 (en) * 2004-01-23 2009-11-18 Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. Chimpanzee adenovirus vaccine carriers
EP1742657B1 (en) 2004-04-28 2013-11-06 The Trustees of The University of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
WO2006078279A2 (en) * 2004-04-28 2006-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
JP2008500364A (ja) * 2004-05-25 2008-01-10 キメラコア， インコーポレイテッド 自己集合性ナノ粒子薬物送達システム
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
SG159555A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
US8287851B2 (en) * 2005-03-08 2012-10-16 Lorus Therapeutics Inc. Use of interleukin 17E for the treatment of cancer
GB0513421D0 (en) 2005-06-30 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
WO2008108776A1 (en) * 2006-04-07 2008-09-12 Chimeros, Inc. Compositions and methods for treating b- cell malignancies
DE602007004470D1 (de) * 2006-04-28 2010-03-11 Univ Pennsylvania Modifiziertes adenovirus-hexon-protein und anwendungen davon
US20090246220A1 (en) 2006-08-28 2009-10-01 Ertl Hildegund C J Constructs for enhancing immune responses
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
AU2008236566A1 (en) * 2007-04-09 2008-10-16 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
AU2014203073B2 (en) * 2007-11-28 2016-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-30
PL2220242T3 (pl) * 2007-11-28 2017-09-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Podrodziny b adenowirusów małpich sadv-28,27,-29,-32,-33, oraz-35 oraz ich wykorzystanie
KR101614369B1 (ko) * 2007-11-28 2016-04-21 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 유인원 아과 ｃ 아데노바이러스 ｓａｄｖ-40, -31, 및 -34 및 그것의 사용
US8685387B2 (en) * 2007-11-28 2014-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenoviruses SAdV-39, -25.2, -26, -30, -37, and -38
US8470310B2 (en) * 2008-03-04 2013-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-36, -42.1, -42.2, and -44 and uses thereof
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
ES2552688T3 (es) * 2008-10-31 2015-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus de simio con proteínas de la cápside hexónica de SAdV-46 y usos del mismo
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
BRPI1008018A2 (pt) 2009-02-02 2016-03-15 Okairos Ag ácidos nucleicos de adenovírus símio e sequências de aminoácidos, vetores contendo os mesmos e uso dos mesmos
SG10201900819SA (en) * 2009-02-02 2019-03-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid- sequences, vectors containing same, and uses thereof
EA021100B1 (ru) 2009-03-17 2015-04-30 МДхХЭЛС СА Усовершенствованное определение экспрессии генов
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
US8846031B2 (en) 2009-05-29 2014-09-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus 41 and uses thereof
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
EP2498791B1 (en) * 2009-11-09 2014-12-24 GenVec, Inc. Methods of propagating monkey adenoviral vectors
WO2011129468A1 (en) * 2010-04-14 2011-10-20 Mogam Biotechnology Research Institute Hexon isolated from simian adenovirus serotype 19, hypervariable region thereof and chimeric adenovirus using the same
CA2833905C (en) 2010-04-23 2019-09-10 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
EP2561073B1 (en) 2010-04-23 2016-08-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
US9272053B2 (en) 2010-04-23 2016-03-01 University Of Massachusetts AAV-based treatment of cholesterol-related disorders
PT2772265T (pt) * 2010-05-14 2018-04-20 Univ Oregon Health & Science Vectores de hcmv e rhcmv recombinantes e seus usos
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
AP3390A (en) 2010-09-20 2015-08-31 Crucell Holland Bv Therapeutic vaccination against active tuberculosis
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
US9267112B2 (en) 2011-05-10 2016-02-23 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from Titi Monkeys
US10221218B2 (en) 2011-05-10 2019-03-05 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from titi monkeys
GB201108879D0 (en) * 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013036791A2 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Modified adenoviral vectors and methods of treatment using same
JP2014527072A (ja) 2011-09-09 2014-10-09 バイオメド リアルティー， エル．ピー． ウイルスタンパク質の集合を制御するための方法および組成物
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
TW201318637A (zh) 2011-09-29 2013-05-16 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一）
CA2850627C (en) * 2011-10-05 2024-05-21 Genvec, Inc. Affenadenovirus (gorilla) or adenoviral vectors and methods of use
CA2852874A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Alexion Pharma Holding Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
WO2013063019A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the therapeutic effect of anti-tumor t cells
WO2013082268A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis, and reprogramming
BR112014028684A2 (pt) 2012-05-18 2017-07-25 Univ Pennsylvania subfamília e adenovírus de símio a1302, a1320, a1331 e a1337 e usos dos mesmos
US9861693B2 (en) 2012-09-07 2018-01-09 Emory University HIV immune stimulating compositions comprising recombinantly expressed pili on bacteria and methods related thereto
US9683268B2 (en) * 2012-09-19 2017-06-20 Beth Israel Deaconess Viruses associated with immunodeficiency and enteropathy and methods using same
WO2014078688A2 (en) * 2012-11-16 2014-05-22 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and use thereof
US9222142B2 (en) * 2013-01-15 2015-12-29 The Regents Of The University Of California Adenoviruses and their use
US9624510B2 (en) 2013-03-01 2017-04-18 The Wistar Institute Adenoviral vectors comprising partial deletions of E3
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
AU2014236207B2 (en) 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
KR102006527B1 (ko) * 2013-11-01 2019-08-02 화이자 인코포레이티드 전립선-연관 항원의 발현을 위한 벡터
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP3200815B1 (en) 2014-10-02 2021-03-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
CA2963293A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for isolation of circulating tumor cells (ctc)
EP3209311B1 (en) 2014-10-21 2024-03-06 University of Massachusetts Recombinant aav variants and uses thereof
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
EP3218484A4 (en) 2014-11-14 2018-05-30 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
RU2749882C2 (ru) 2014-11-14 2021-06-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Модулирующие полинуклеотиды
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
AU2016275619B2 (en) * 2015-06-12 2019-09-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
CA3006569A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of aav neutralizing antibodies
EP3416668A4 (en) 2016-02-18 2020-02-19 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MELANOMA
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3013639A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
JP7220080B2 (ja) 2016-05-18 2023-02-09 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド ハンチントン病治療組成物及び方法
RU2758488C2 (ru) 2016-05-18 2021-10-28 Вояджер Терапьютикс, Инк. Модулирующие полинуклеотиды
SG11201900808SA (en) * 2016-08-01 2019-02-27 Wistar Inst Compositions and methods of replication deficient adenoviral vectors for vaccine applications
WO2018035503A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Crispr-cas genome engineering via a modular aav delivery system
EP3506817A4 (en) 2016-08-30 2020-07-22 The Regents of The University of California METHOD FOR BIOMEDICAL TARGETING AND RELEASE, AND DEVICES AND SYSTEMS FOR IMPLEMENTING THEM
WO2018069316A2 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
AU2017341849B2 (en) 2016-10-13 2024-03-21 University Of Massachusetts AAV capsid designs
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
WO2018204786A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2018204803A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
JP7229989B2 (ja) 2017-07-17 2023-02-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 軌道アレイガイドシステム
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
EP4124658A3 (en) 2017-10-16 2023-04-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP3723771A4 (en) * 2017-12-11 2022-04-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. RECOMBINANT ADENOVIRUS AND THEIR USES
EP3807404A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
CA3106078A1 (en) 2018-07-17 2020-01-23 Junghun Lee Treatment of neuropathy with dna constructs expressing igf-1 isoforms
US20210355454A1 (en) 2018-07-24 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
JP2022512621A (ja) 2018-10-05 2022-02-07 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖ産生タンパク質をコードする操作された核酸コンストラクト
CA3116701A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
CN113924115A (zh) 2019-01-31 2022-01-11 俄勒冈健康与科学大学 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
US20220211835A1 (en) * 2019-04-17 2022-07-07 The Wistar Institute Replication Deficient Adenoviral Vectors for HIV Vaccine Applications
CA3189238A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Transgene Treatment of immune depression
AU2022214429A1 (en) 2021-02-01 2023-09-14 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN112831524B (zh) * 2021-02-20 2023-06-13 苏州相奕生物技术有限公司 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用
AU2022250521A1 (en) 2021-03-29 2023-09-28 Genematrix Inc. Recombinant chimeric adenoviral vector substituted by knob gene of chimpanzee adenovirus serotype 6, and application thereof
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5240846A (en) 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
JPH10507758A (ja) 1994-10-19 1998-07-28 ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド アデノウイルスおよび免疫抑制剤同時反復投与を伴う遺伝子治療
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
PT787200E (pt) 1994-10-28 2005-08-31 Univ Pennsylvania Adenovirus melhorado e metodos para a sua utilizacao
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6019978A (en) * 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
WO1998010087A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
CA2264482A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US5922315A (en) 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
US5891994A (en) 1997-07-11 1999-04-06 Thymon L.L.C. Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
AU9397098A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
GB9720585D0 (en) 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2324225A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6210663B1 (en) * 1998-08-20 2001-04-03 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
EP1200622A4 (en) 1999-07-06 2004-12-22 Merck & Co Inc HIV VACCINE COMPRISING A GAG GENE VEHICLE ADENOVIRUS
NZ520327A (en) 2000-01-31 2004-06-25 Smithkline Beecham Biolog S Use of human immunodeficiency virus proteins in vaccines
US6740525B2 (en) 2000-02-09 2004-05-25 Genvec, Inc. Adenoviral capsid containing chimeric protein IX
KR20040043129A (ko) 2001-06-22 2004-05-22 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 세포독성 면역 반응을 유도하는 방법과 그에 유용한재조합체 원숭이 아데노바이러스 조성물
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
ATE530672T1 (de) * 2001-06-22 2011-11-15 Univ Pennsylvania Rekombinante adenoviren mit affen-adenovirus proteinen und verwendung davon.
EP3108899A1 (en) * 2001-11-21 2016-12-28 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian adenovirus adsv1 nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
PL376792A1 (pl) 2002-10-23 2006-01-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sposoby szczepienia przeciwko malarii
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
WO2005001103A2 (en) 2003-06-20 2005-01-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US20070218536A1 (en) 2004-04-28 2007-09-20 Guangping Gao Polyvalent Viral Vectors and a System for Production Thereof
EP1742657B1 (en) 2004-04-28 2013-11-06 The Trustees of The University of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
WO2006078279A2 (en) 2004-04-28 2006-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
JP5175178B2 (ja) 2005-05-12 2013-04-03 グラクソ グループ リミテッド ワクチン組成物
DE602007004470D1 (de) * 2006-04-28 2010-03-11 Univ Pennsylvania Modifiziertes adenovirus-hexon-protein und anwendungen davon
US9364525B2 (en) 2006-07-18 2016-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for malaria
MX2009009342A (es) 2007-03-02 2009-09-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Metodo novedoso y composiciones.
US9603035B2 (en) 2011-10-13 2017-03-21 Telefonaktiebolaget L M Ericsson Method and node related to channel estimation

Also Published As

Publication number Publication date
PH12016500338A1 (en) 2018-03-26
US20050069866A1 (en) 2005-03-31
NO20042191L (no) 2004-05-26
MXPA04004876A (es) 2004-07-30
US20150352203A1 (en) 2015-12-10
CA2852277A1 (en) 2003-06-05
NO20120337L (no) 2004-05-26
CO5590973A2 (es) 2005-12-30
ZA200403117B (en) 2005-03-30
US9133483B2 (en) 2015-09-15
HU230365B1 (hu) 2016-03-29
IL223344A0 (en) 2013-02-03
IL161584A0 (en) 2004-09-27
IL230292A (en) 2016-08-31
MX351516B (es) 2017-10-17
NO332692B1 (no) 2012-12-10
IL223344A (en) 2015-04-30
JP2011055835A (ja) 2011-03-24
NO334512B1 (no) 2014-03-24
CA2990322A1 (en) 2003-06-05
CN1578678B (zh) 2010-05-26
WO2003046124A2 (en) 2003-06-05
CA2852277C (en) 2018-02-20
JP2017035111A (ja) 2017-02-16
JP2013252144A (ja) 2013-12-19
NZ550416A (en) 2008-06-30
EP2301582B1 (en) 2017-07-12
JP2015057052A (ja) 2015-03-26
EP3108899A1 (en) 2016-12-28
BR0214350A (pt) 2005-05-10
SG165153A1 (en) 2010-10-28
HUP0500987A2 (en) 2006-01-30
US7247472B2 (en) 2007-07-24
IL161584A (en) 2015-05-31
EP1453543A2 (en) 2004-09-08
EP1453543B1 (en) 2017-08-30
EP2301582A1 (en) 2011-03-30
HUP0500987A3 (en) 2008-05-28
JP2017035110A (ja) 2017-02-16
KR100987360B1 (ko) 2010-10-12
NO335438B1 (no) 2014-12-15
CA2466431A1 (en) 2003-06-05
JP2015057051A (ja) 2015-03-26
JP5715749B2 (ja) 2015-05-13
NO20130590L (no) 2004-05-26
US8603459B2 (en) 2013-12-10
PL373602A1 (pl) 2005-09-05
SG2013034475A (en) 2016-10-28
US20120093778A1 (en) 2012-04-19
HUP1400619A2 (en) 2006-01-30
IL231502A (en) 2017-04-30
US20080090281A1 (en) 2008-04-17
IL231502A0 (en) 2014-04-30
HU230488B1 (hu) 2016-08-29
HU230364B1 (hu) 2016-03-29
WO2003046124A3 (en) 2003-11-20
NZ564586A (en) 2009-09-25
CN1578678A (zh) 2005-02-09
EP1453543A4 (en) 2006-12-06
US20170119873A9 (en) 2017-05-04
JP2005511035A (ja) 2005-04-28
JP2017070292A (ja) 2017-04-13
CA2466431C (en) 2014-08-05
AU2002365366B2 (en) 2007-05-10
JP2009136296A (ja) 2009-06-25
EP2286841A1 (en) 2011-02-23
NZ532383A (en) 2007-03-30
US20140065105A1 (en) 2014-03-06
KR20040054796A (ko) 2004-06-25
US8105574B2 (en) 2012-01-31
AU2002365366A1 (en) 2003-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1453543B1 (en) Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
JP5661476B2 (ja) サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途
EP1944043A1 (en) Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
AU2010202004B2 (en) Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
AU2006204656B2 (en) Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use