JP2008500364A - 自己集合性ナノ粒子薬物送達システム - Google Patents

Abstract

ペプチド、タンパク質、核酸または合成化学物質薬物を含めた薬物の送達のための自己集合性ナノ粒子薬物送達システムが提供される。明細書に記載されている自己集合性ナノ粒子薬物送達システムは、薬物を封入しているウイルスキャプシドタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質）、脂質二重層エンベロープおよび脂質二重層に係留された標的化分子または促進分子を含む。自己集合性ナノ粒子薬物送達システムの構築のための方法もまた提供される。

Description

（関連出願）
本出願は、２００４年５月２５日に出願した米国仮特許出願番号第６０／５７４，４０９号の米国特許法§１１９（ｅ）の下で優先権の利益を主張する。

（発明の分野）
本発明は、薬物送達のための方法に関する。特に、本発明は、ウイルスキャプシドタンパク質中に捕捉され、脂質エンベロープに封入された薬理学的薬物から構成される、自己集合薬物送達システムに関する。

（発明の背景）
ナノテクノロジーは、ギリシア語ナノに由来する用語であり、小さいものを意味しており、物理科学および生物科学の両方の主体を分子レベルまたはサブミクロンのレベルで適用する。ナノスケールの材料は、デバイスもしくはシステム、または超分子構造体、複合体または複合材料であり得る。ナノテクノロジーは、薬物送達技術を含め、生物医学的適用を大いに進歩させている。

低分子、タンパク質およびＤＮＡについての薬物送達システムの開発は、ナノテクノロジーによって非常に影響を受けた。新規な薬物送達技術は、薬物市場を拡大するための重要な戦略的な道具である。改善された薬物送達システムは、効力の向上または安全性およびコンプライアンスの改善のような、現在使用されている薬物と関連する問題に対処することができる（非特許文献１）。加えて、この技術は、生物環境において非常に不溶性であるかまたは不安定である薬物の送達ができるようにする。新しい薬物送達システムは、製薬市場に対して重要な貢献をすることができると思われる。現在のグローバルな製薬市場のほぼ１３％は、薬物送達システムを組み込んでいる製品の販売である。米国単独の薬物送達システムに関する需要は、毎年ほぼ９％増大し、ＵＳ＄８２０億を超えると見積もられる（非特許文献２）。

多くの治療薬剤は、標的組織に到達する能力に限界があるので、成功していなかった。加えて、従来の投与様式では安全性および効力の問題があるので、抗癌剤、ホルモン、タンパク質、ペプチドおよびワクチンのための新規な送達システムが必要である。例えば、細胞傷害性癌薬物は、悪性細胞および正常細胞の両方に損傷を与え得る。薬物を悪性腫瘍へと標的化する薬物送達システムは、傍観者の毒性を低減させる。タンパク質およびＤＮＡの薬物は、経口投与後で胃の高いｐＨではそれらは不安定であるので、静脈内に投与されなければならない。さらなる課題は、急速なクリアランスおよび代謝による時期尚早の効力喪失を含む。タンパク質、核酸または不安定な低分子を送達し得る薬物送達システムは、非常に望ましく、かつ現在進行中でいまだに不成功の研究である。

効果的な薬物送達システムとして生分解性のナノ粒子を開発する相当な研究があった（非特許文献３）。ナノ粒子は、サイズが１０ナノメートル〜１０００ナノメートルに変化する高分子物質からなる固体のコロイド状の分子である。目的の薬物は、ナノ粒子マトリックスに、溶解されるか、捕捉されるか、吸着されるか、付着されるか、または封入されるかのいずれかである。ナノ粒子マトリックスは、生分解性の材料（例えば、ポリマーまたはタンパク質）から構成され得る。調製法に依存して、種々の特性および封入された治療薬物の放出特徴を有するナノ粒子が獲得され得る（非特許文献４）。

薬物送達のためのナノ粒子を使用することの利点は、それらの２つの主な特性から生じる。第一に、ナノ粒子は、それらのサイズが小さいので、より小さい毛細管を通って浸透することができ、細胞によって取り込まれ、これにより、標的部位での効率的な薬物蓄積が可能になる（非特許文献５）。第２に、ナノ粒子調製のための生分解性材料の使用は、数日間、または数週間にさえにわたる標的部位内での持続した薬物放出を許容する。ナノ粒子はまた、標的が細胞質性である薬物に関する効果的な薬物送達機構であり得る。

ナノ粒子の標的化された送達は、受動的標的化または能動的標的化によって達成され得る。治療薬剤の能動的標的化は、組織特異的リガンドまたは細胞特異的リガンドに治療薬剤またはキャリアシステムを結合させることによって達成される（非特許文献６）。受動的な標的化は、治療薬剤を標的器官に受動的に到達する高分子に連結することによって達成される（非特許文献７）。ナノ粒子中に封入された薬物または高分子（例えば、高分子量ポリマー）に結合された薬物は、強化された浸透および保持効果によって腫瘍組織を受動的に標的とする（非特許文献８；非特許文献９）。
Ｒｏｃｃｏ ＭＣおよびＢａｉｎｂｒｉｄｇｅ ＷＳ編，Ｓｏｃｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ，２００１ Ｒｏｃｃｏ ＭＣおよびＢａｉｎｂｒｉｄｇｅ ＷＳ編，Ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００２ Ｐａｎｙａｍ Ｊら，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５５：３２９−４７，２００３ Ｓａｈｏｏ ＳＫおよびＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ Ｖ，Ｎａｎｏｔｅｃｈ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ，ＤＤＴ ８：１１１２−１１２０，２００３ Ｐａｎｙａｍ Ｊら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２６２：１−１１，２００３ Ｌａｍｐｒｅｃｈｔら，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９９：７７５−８１，２００２ Ｍｏｎｓｋｙ ＷＬら，Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４１２９−３５，１９９９ Ｍａｅｄａ Ｈ，Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ：ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．４１：１８９−２０７，２００１ Ｓａｈｏｏ ＳＫら，Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｚｉｎｃ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ：ａ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：１０３１−８，２００２

タンパク質および核酸のような高分子は疾患の処置においてより大きな役割を果たしており、そして、伝統的な薬学的低分子は、意図される標的に効果的に到達することができないことから開発途中で断念されたので、改善された薬物送達システムが必要である。多種多様な薬物は、血液脳関門を越えることが困難であるので、多種多様な薬物の送達は妨げられる。ナノ粒子の特徴的な機能は、生物学的障壁を越えて薬物を標的部位に送達し、標的部位に到達するまでこの薬物を生物環境から保護する能力である。従って、ナノ粒子送達システムの使用は、多種多様な生物活性薬剤の送達を改善する有望な方法である。

（発明の要旨）
本発明は、粘膜障壁を越えて投与されることができ、かつ治療用タンパク質を含めた広範囲にわたる分子を循環系に輸送することが可能である、新規のナノ粒子薬物送達システムを提供する。本発明のナノ粒子は、自己集合してナノケージを形成する、天然のタンパク質から再作製される構築ブロックを含む。集合プロセスの間、選り抜きの薬物は、単純拡散／濃縮力学によってケージ形成ブロックの内向きに対向する面の特定の化学によって捕捉される。集合させたケージは周囲のエンベロープの集合を導く特別な機能を有する。このエンベロープは、中性であるか、アニオン性であるか、またはカチオン性の脂質の、封入性の、自己集合性二重層である。膜導入を容易にするペプチドは、システムに細胞壁を通過する能力を与えるために、脂質二重層エンベロープに組み込まれる。次いで、様々な鎖長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、免疫系を避ける目的のために、そして分解酵素の攻撃することをかわすために、膜に係留される。この複数層送達システムは、生体分子の複雑な配置を調和させ、そして完全に自己集合性である。ナノ粒子薬物送達システムは、皮下、静脈内および筋肉内の経路および粘膜層を通る通路（例えば、経口、経皮、鼻腔内および頬内の経路）を含むがこれらに限定されない任意の経路により投与され得る。

本発明は、再作製された生体分子から構成されて合成化学物質成分で強化された、合成により包膜された非ウイルス性カプセルを示す。この設計がウイルスの自然な挙動によって示唆されるにもかかわらず、このシステムは非複製性である。加えて、システムの構築ブロックを作製するために使用されるタンパク質の全ての全ては、安定性を変え、ジスルフィド結合を取り除くかまたは加えることによって所望の特徴を呈するように再作製された。一旦ケージが崩壊し始めたら、構築ブロックは急速に分解して、いかなる潜在的免疫応答をも制限するように構築ブロックが設計される。この薬物送達システムの特徴は、あらゆるユニットに治療用タンパク質を付着させたケージの構築ブロックをつくるその能力である。このシステムのさらに別の重要な特徴は、病原性の可能性なしではどのウイルスも送達することができなかった分子（例えば、合成薬物）を送達するというウイルスの有益な特徴の使用である。ナノ粒子薬物送達システムは、弱毒ウイルスを組み込まず、単に、規則的な幾何学的形状を形成するタンパク質のシェルを組み込む。

本発明の実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質から構成されるキャプシド、キャプシド中に捕捉された薬物、およびこのキャプシドを包膜している脂質二重層を含む自己集合性ナノ粒子薬物送達システムが提供される。本発明の別の実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質である。

本発明の別の実施形態では、プロテアーゼ認識部位がこのＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸７９およびアミノ酸８０と置き換わるように、ウイルスキャプシドタンパク質を変異させる。プロテアーゼ認識部位は、トロンビン認識部位または第Ｘａ因子認識部位であり得る。

本発明の別の実施形態では、ＨＢＶ Ｃタンパク質は、フェニルアラニン２３、アスパラギン酸２９、トレオニン３３、ロイシン３７、バリン１２０、バリン１２４、アルギニン１２７およびチロシン１３２からなる群から選択される配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのアミノ酸がシステインに変化するように変異している。

本発明の実施形態において、薬物は、ペプチド、タンパク質、核酸および低分子合成化学物質薬物からなる群から選択される。本発明の別の実施形態では、脂質二重層は、リン脂質（例えば、ホスファチジル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）エタノールアミン）から構成される。

本発明の別の実施形態では、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムは、コレステロールタグ化ポリエチレングリコールおよびコレステロールタグ化タンパク質形質導入ドメインのいずれかまたは両方をさらに含む。適切なタンパク質形質導入ドメインは、ヒト免疫不全ウイルスの転写トランスアクチベーターまたはポリアルギニンを含む。

本発明のさらに別の実施形態では、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムは、抗体を標的とする分子をさらに含む。

本発明の１つの実施形態において、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムを構築するための方法が提供され、この方法は、薬物とＨＢＶコアタンパク質とを混合して、ケージ溶液を形成する工程、ケージ溶液のイオン強度を上げることによって薬物をコアタンパク質のケージ封入する工程、リン脂質をケージ溶液に添加する工程、コレステロールタグ化ポリエチレングリコールをケージ溶液に添加する工程、コレステロールタグ化タンパク質形質導入ドメインをケージ溶液に添加する工程、および遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーによってナノ粒子を精製する工程を包含する。

本発明の別の実施形態では、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムを構築するための方法は、封入する工程の後、包膜を導くタンパク質またはペプチドを添加する工程をさらに包含する。本発明のさらに別の実施形態では、包膜を導くタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質または配列番号５の操作された膜貫通ペプチドである。

本発明の１つの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ヒト免疫不全ウイルスの転写トランスアクチベーターまたはポリアルギニンを含む。

本発明の別の実施形態では、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムを構築するための方法は、標的化抗体を脂質二重層に挿入する工程をさらに包含する。

本発明のさらに別の実施形態では、粘膜表面を通してナノ粒子を送達する工程を包含する、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムを用いた疾患処置方法が提供される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、粘膜障壁を越えて投与されることができ、かつ治療用タンパク質を含めた広範囲にわたる分子を循環系に輸送することが可能である、新規のナノ粒子薬物送達システムを提供する。本発明のナノ粒子は、自己集合してナノケージを形成する、天然のタンパク質から再作製される構築ブロックを含む。集合プロセスの間、薬物は、単純拡散／濃縮力学によってケージ形成ブロックの内向きに対向する面の特定の化学によって捕捉される。集合させたケージは周囲のエンベロープの集合を導く特別な機能を有する。このエンベロープは、中性であるか、アニオン性であるか、またはカチオン性の脂質の、封入性の、自己集合性二重層である。膜導入を容易にするペプチドは、システムに細胞壁を通過する能力を与えるために、脂質二重層エンベロープに組み込まれる。次いで、様々な鎖長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、免疫系を避ける目的のために、そして分解酵素の攻撃することをかわすために、膜に係留され得る。この複数層送達システムは、生体分子の複雑な配置を調和させ、そして完全に自己集合性である。ナノ粒子薬物送達システムは、粘膜層を通る通路（例えば、経口、経皮、鼻腔内および頬内の経路）を含むがこれらに限定されない任意の経路により投与され得る。

本発明は、再作製された生体分子から構成されて合成化学物質成分で強化された、合成により包膜された非ウイルス性カプセルを示す。この設計がウイルスの自然な挙動によって示唆されるにもかかわらず、そしてウイルスのキャプシドタンパク質を構築ブロックとして使用するにもかかわらず、このシステムは非複製性である。加えて、システムの構築ブロックを作製するために使用されるタンパク質の全ての全ては、安定性を変え、ジスルフィド結合を取り除くかまたは加えることによって所望の特徴を呈するように再作製された。一旦ケージが崩壊し始めたら、構築ブロックは急速に分解して、いかなる潜在的免疫応答をも制限するように構築ブロックが設計される。この薬物送達システムの特徴は、あらゆるユニットに治療用タンパク質を付着させたケージの構築ブロックをつくるその能力である。このシステムのさらに別の重要な特徴は、病原性の可能性なしではどのウイルスも送達することができなかった分子（例えば、合成薬物）を送達するというウイルスの有益な特徴の使用である。ナノ粒子薬物送達システムは、弱毒ウイルスを組み込まず、単に、規則的な幾何学的形状を形成するタンパク質のシェルであるキャプシドを組み込む。

本発明のナノ粒子薬物送達システムは、種々の異なる種類の薬物を送達するために使用され得る。本発明の１つの実施形態において、ナノ粒子薬物送達システムの個々のナノ粒子は、１種類、または１種類より多くの薬物を含み得る。本発明のナノ粒子薬物送達システムでの使用に適している薬物の非限定的な例としては、以下が挙げられる：生物活性薬剤（例えば、心臓血管薬物、呼吸器薬物、交感神経薬物、コリン様作用性薬物、アドレナリン作用性またはアドレナリン作用性ニューロン遮断薬物、鎮痛剤／解熱剤、麻酔剤、喘息治療剤、抗生物質、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗真菌剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗不安剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗片頭痛剤、鎮静剤／催眠薬、抗狭心症剤、抗精神病剤、抗躁病剤、抗不整脈剤、関節炎治療剤、抗痛風剤、抗凝固剤、血栓崩壊剤、抗線維素溶解剤、血液レオロジー剤、抗血小板物質、抗痙攣剤、抗パーキンソン病剤、抗ヒスタミン剤／止痒剤、カルシウム調節に有用な薬剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗感染剤、気管支拡張剤（ｂｒｏｎｃｈｏｄｉａｌａｔｏｒ）、ホルモン、血糖低下剤、低脂肪低下剤、タンパク質、ペプチド、核酸、赤血球生成に有用な薬剤、抗潰瘍／抗逆流剤、制吐剤／抗嘔吐剤ならびに油溶性ビタミンまたはそれの組合せ）。

本発明のナノ粒子薬物送達システムからナノケージを構築するための例示的なタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質（Ｃタンパク質）（配列番号１）（自然に自己集合してウイルスのタンパク質キャプシドを形成するタンパク質）である。ＨＢＶの異なる株には、Ｃタンパク質の配列においてわずかなバリエーションがある。代替的なＨＢＶ Ｃタンパク質アミノ酸配列の例は、配列番号２に開示される。自己集合してキャプシドになるということだけでなく、完全なキャプシドを形成するために必要な唯一の成分であるという理由から、コアタンパク質を選択した。単一のタンパク質モノマーから自己集合してキャプシドになる任意のウイルスキャプシドタンパク質が、本発明のナノ粒子薬物送達システムにおいて使用するために適切である。自己集合性キャプシドタンパク質の非限定的な例としては、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質およびアヒルＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質、ヒトパピローマウイルス６型Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質、ササゲクロロティックモットルウイルスコートタンパク質が挙げられる。ＨＢＶ Ｃタンパク質は、集合した際にキャプシドの内部に下垂する高濃度の正に荷電したアミノ酸をＣ末端に有し、サイズが１８３アミノ酸である。この下垂する尾部は、所定の特徴の分子と特異的に相互作用するように操作され得る。例えば、自然状態のタンパク質は、負に荷電した分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と相互に作用し得る正電荷のクラスターをＣ末端に有する。Ｃ末端の尾部が正に荷電した分子と相互に作用し得る負電荷（Ａｓｐ残基またはＧｌｕ残基）のクラスターを有するように、Ｃタンパク質は操作され得る。

配列番号１：ＨＢＶ Ｃタンパク質アミノ酸配列１〜１８３（ＮＣＢＩタンパク質データベース登録番号ＢＡＤ８６６２３、その開示は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）：

配列番号２：ＨＢＶ Ｃタンパク質の別のアミノ酸配列１〜１８３（ＮＣＢＩタンパク質データベース登録番号ＡＹ７４１７９５、その開示は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）：

ＨＢＶ Ｃタンパク質は集合して、正二十面体のウイルスキャプシドを形成する。ウイルスは高分子複合体であり、タンパク質コート（またはキャプシド）に、そしてしばしば脂質膜に入れられる核酸ゲノムから構成される。ウイルスゲノムは、通常非常に小さくて、わずか３つの遺伝子から構成され得る。従って、このウイルスは、遺伝形質の利用が極めて効率的でなければならず、その結果、キャプシド（それは、厳しい細胞外環境においてウイルスゲノムを保護する）は少数の遺伝子産物から組み立てられなければならない。非対称のウイルスタンパク質モノマーは、同一の結合環境を占めるように、配置される。球状ウイルス（例えば、ＨＢＶ）は、正二十面体として集まり、これは、正三角形として配置される６０個の非対称単位から構成される二十面多角体である。ウイルスの正二十面体キャプシドは、６０_ｎサブユニットの１種のタンパク質から組み立てられる。これらの正二十面体は、６０Ｔのサブユニットが存在するそれらの三角形分割番号（Ｔ）によって記載されている。

全長ＨＢＶ Ｃタンパク質は、直径約３６ナノメートルの粒子を形成する（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ ＲＡら，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｅｌｌ ７７：９４３−５０，１９９４）。この粒子内部で、Ｃタンパク質の最終的な４０アミノ酸は、このウイルスのゲノムＤＮＡと相互作用すると考えられる。この推定ＤＮＡ結合領域を欠くコアタンパク質構築物もまた、正二十面体のキャプシドを形成するが、三角形分割番号は３（Ｔ＝３）である。これらの２つのタイプのキャプシドにおけるＣタンパク質モノマー間の相互作用は、類似すると思われる。

ＨＢＶキャプシドにおいて、Ｃタンパク質モノマーは、「スパイク」によって強固に会合したダイマーを形成する。スパイクは、２回対称軸を有する中心の４つのαらせんの束である（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ Ｂら，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ ３８６：８８−９１，１９９７）。正二十面体ウイルスキャプシドは、ほぼ頭部−尾部型相互作用において５回軸および６回軸を中心として集合した１２０個のＣタンパク質ダイマーからなる。成熟したウイルスにおいて、１２０個のダイマーの中心スパイクの先端は、粒子表面の近くに向けられ、ここで、これらは、原形質膜エンベロープによって覆われる。完全サイズのＨＢＶダイマーの電子密度地図から再構築された野生型ＨＢＶキャプシドのコンピュータによる再構築を、６回軸で見下ろした斜視図において図１に表す。この図は、包膜前の裸のナノケージの外観を表す。

Ｃタンパク質のダイマー性１４９残基集合ドメイン（アミノ酸１〜１４９）を使用した空のＨＢＶキャプシドのインビトロ集合は、高いＮａＣｌ濃度によって誘導され得る。ＨＢＶにおいて、サブユニットダイマーは、溶液中で安定である。ＨＢＶの集合は、最も単純な場合の集合モデルの熱力学および速度予測にかなう。組立て反応は、ダイマーおよびキャプシドだけを含むようであり、予測された急な濃度依存性を示す。このアセンブリは著しく弱い会合定数を示すが、それでも、サブユニットが多価であるので、キャプシドは集合する。脱会合を阻害する急なエネルギー障壁があるので、キャプシドは、会合定数によって予測されるよりもさらに安定している（Ｚｌｏｔｎｉｃｋ Ａ，Ａｒｅ ｗｅａｋ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｒｕｌｅ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ？ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１５：２６９−２７４，２００３）。

本発明の実施形態では、変異は、ダイマーのスパイク領域またはダイマー間の界面のＨＢＶ Ｃタンパク質に操作される。スパイクの変異は、原形質膜による包膜を促進するためにキャプシドの表面に官能基を導入するために用いられる。本発明の別の実施形態では、「プロテアーゼ認識ループ」は、一旦それが血流に達したならば、全てのキャプシドの分解を促進するスパイクにおいて操作される。界面での変異は、キャプシドを安定化させて、分解の前のキャプシドの有効期間を「調整する」。

本発明の一実施形態では、官能基を取り付けるために、アミノ酸システインまたはリジンのいずれかが、キャプシド表面から原形質膜エンベロープに向かって突出するというような様式でスパイクの先端に配置される。非限定的な例では、３つの位置（７７（グルタミン酸からシステインへ）；７８（アスパラギン酸からシステインへ）；および８０（アラニンからシステインへ））が、後の段階で官能基化されるアミノ酸の導入のために同定された。Ｃタンパク質中の他の場所にシステイン変異を導入することは、本発明の範囲内である。各々の位置でのリジンまたはシステインの選択は、ＨＢＶキャプシドの結晶構造から判断されるような各々のアミノ酸の配位およびジオメトリーに依存している（Ｗｙｎｎｅ ＳＡら，Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ３：７７１−８０，１９９９）。４つのらせん状束は２回対称であるため、各々の一つの位置の１つの反応的なアミノ酸の導入は、スパイク１つにつき合計２つの生体結合分子を与える。

本発明の別の実施形態では、集合を促進して強化する様式で、システイン対がモノマー間の界面に導入される。非限定的例では、第１のシステイン（例えば、アミノ酸２３）は、隣接分子の第二位置（この場合、アミノ酸１３２）とジスルフィド結合するために第一位置に導入される。同様に、第二位置もジスルフィド結合に参加する。そして、ダイマーが４つのジスルフィド架橋および合計１８０の安定化する共有結合的相互作用に参加するのを許容する。本発明の一実施形態では、４種類の異なるジスルフィド結合は、集合体を安定させる際の有効性および集合体の所望の強さに従って、作製される：
変異１：フェニルアラニン２３がシステインに；チロシン１３２がシステインに
変異２：アスパラギン酸２９がシステインに；アルギニン１２７変異がシステインに
変異３：トレオニン３３がシステインに；バリン１２４がシステインに
変異４：ロイシン３７がシステインに；バリン１２０がシステインに。

一旦ＨＢＶ Ｃタンパク質由来のナノ粒子が血流に入ると、それがその治療用運搬物を放出し得るために、それが分解してその成分のモノマーになることが必要である。このプロセスを促進するために、本発明の実施形態では、モノマーのスパイク形成領域は、血中プロテアーゼ認識配列を含むように操作される。このプロテアーゼはこのループを認識して切断し、このことにより分解を促進する。この種の適用のために最も一般的に用いられる２つの血中プロテアーゼはトロンビンおよび第Ｘａ因子である（Ｊｅｎｎｙ ＲＪら，Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．３１：１−１１，２００３、これは、トロンビンおよび第Ｘａ因子によるタンパク質切断に関する内容全体が本明細書中に参考として援用される）。これらの２つのプロテアーゼの特異性は、周知であり（Ｓｔｅｖｅｎｓ ＲＣ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ，４：３５−４８，２００３）、Ｃタンパク質の内部ループに容易に組み込まれ得る。一定の安静時レベルのトロンビンが血液中に存在することが公知であるので、トロンビンはおそらく、これらの部位の特異性に関する最良の選択である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＡら，Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｒｅｓｔｉｎｇ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．５６：２９−３１，１９９７）。配列番号３として同定された配列および配列番号４として同定された配列は、ＨＢＶ Ｃタンパク質のスパイク領域に挿入された、伸びたループおよびトロンビン（配列番号３）または第Ｘａ因子（配列番号４）のいずれかについての認識配列を有する（アミノ酸７９およびアミノ酸８０を、配列番号３または配列番号４の１２アミノ酸挿入ループで置換する）。

配列番号３：トロンビン部位をコードする１２アミノ酸挿入ループ。

ＧＬＹ ＰＲＯ ＧＬＹ ＡＬＡ ＰＲＯ ＧＬＹ ＬＥＵ ＶＡＬ ＰＲＯ ＡＲＧ ＧＬＹ ＳＥＲ
配列番号４：第Ｘａ因子部位をコードする１２アミノ酸挿入ループ。

ＧＬＹ ＰＲＯ ＡＬＡ ＳＥＲ ＧＬＹ ＰＲＯ ＧＬＹ ＩＬＥ ＧＬＵ ＧＬＹ ＡＲＧ ＡＬＡ
組換えＣタンパク質は、一般の分子生物学技術および生化学技術を使用して発言および精製され得る。本発明の別の実施形態では、ＨＢＶ Ｃタンパク質遺伝子を宿主細胞に運んでＨＢＶ Ｃタンパク質の発現を提供するように操作された組換え発現ベクターが使用され得る。この種のベクターは、熱ショック、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションまたはリポソーム媒介移入を含むがこれらに限定されないトランスフェクション手段によって、宿主細胞に導入され得る。組換え発現ベクターとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉベースの発現ベクター（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはｐＬｙｓＳ）、ＣＯＳ細胞ベースの発現ベクター（例えば、ＣＤＭ８またはｐＤＣ２０１）またはＣＨＯ細胞ベースの発現ベクター（例えば、ｐＥＤベクター）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃタンパク質遺伝子コード領域は、選択された細胞株において活性化され得る、発現ベクター中の多数のプロモーターのうちの１つに連結され得る。加えて、このカセット（キャプシド遺伝子およびプロモーター）は、ベクターを受けとった細胞が識別され得るように、選択マーカーを含むベクターによって運ばれる。

細胞株中でキャプシドタンパク質を発現するプロモーターは、宿主細胞中で機能的に活性であるものから導き出され得る。これらのプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ヘルペスＴＫプロモーターおよび組換えＤＮＡ技術において周知の他のプロモーターなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。メタロチオニンプロモーター（ＭＴ）、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）および当業者に公知の他の誘導性プロモーターを含むがこれらに限定されない誘導性プロモーターが用いられ得る。

選択マーカーおよびそれらの付随する選択薬剤は、アンピシリン、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ／Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ／ハイグロマイシンＢおよび増幅可能な選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ／メトトレキサートおよび当業者に公知の他のもの）を含むがこれらに限定されない群から導かれ得る。

本発明の他の実施形態は、ＨＢＶ Ｃタンパク質を発現するための、真核生物、原核生物、昆虫、植物および酵母の発現系の使用を含む。キャプシドタンパク質を発現するために、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含むベクター）に挿入される。当業者にとって周知である方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルと作動可能に連結しているタンパク質コード配列を含んでいる発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法はとして、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビトロでの遺伝子組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．に記載される技術およびベクターを参照のこと。

種々の真核生物、原核生物、昆虫、植物および酵母の発現ベクター系（すなわち、キャプシドタンパク質コード配列の複製、転写および翻訳を導くために必要なエレメントを含むベクター）は、キャプシドタンパク質コード配列を発現するために、当業者によって等しくよく利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、キャプシドタンパク質コード配列を含んでいる組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌）；キャプシドタンパク質コード配列を含んでいる組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；キャプシドタンパク質コード配列を含んでいる組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）に感染させた植物細胞系またはキャプシドタンパク質コード配列を含んでいる組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換した植物細胞系。

本発明の実施形態において、全長ＨＢＶ Ｃタンパク質遺伝子は、ｐＥＴ−１１ａ発現ベクターにクローニングされ、実施例１にて記載したようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＥ３細胞において発現された。

溶液中の発現されたＣタンパク質は塩橋、疎水性相互作用および共有結合性の分子間ジスルフィド結合および分子内ジスルフィド結合によって自然に安定するダイマーを形成する。本発明の実施形態において、Ｃタンパク質安定性が所望のレベルに調整され得るように分子内結合が操作される。加えて、分子間ジスルフィド結合は、ケージの安定性に影響を及ぼすように操作される。キャプシドを形成するのを助けるダイマー間の特異的塩橋は、ジスルフィド結合が形成されてキャプシド構造を安定化するように、システインへと変異し得る。Ｃタンパク質の全ての改変は、キャプシド結晶構造の徹底的な分析および構造データに由来する電子密度地図について行われるエネルギー最小化モデルに基づく。

本発明の別の実施形態では、Ｃタンパク質は、ヒンジ領域およびループ領域においてプロテアーゼ認識部位を含むように操作される。Ｃタンパク質の免疫優勢スパイクは、少なくとも４６残基の挿入部を収容することができ、しかも依然としてキャプシドを形成することができる。トロンビンおよび第Ｘａ因子を含むがこれらに限定されないプロテアーゼについての認識部位は、この場所に挿入される。これらの認識部位は、システム全体が封入された生物活性薬剤を分配する持続放出方法として崩壊し始めた後の構築ブロックの速い分解という利点を加える。これは、血流中での「裸の」Ｃタンパク質の存在に対する免疫応答の可能性を最小化する。

本発明の別の実施形態では、Ｃタンパク質のＣ末端の尾部は、治療用タンパク質（薬物）で置換される。この開示の目的で、用語タンパク質とは、タンパク質およびペプチドの両方をいう。Ｃ末端は、Ｃタンパク質および治療用タンパク質のキメラ構築ブロック（融合タンパク質）をつくるために、遺伝子レベルで操作される。治療用タンパク質は、特異的プロテアーゼ認識部位をコードするアミノ酸の鎖（ｔｅｔｈｅｒ）によって、Ｃタンパク質に連結される。ケージが崩壊し始めた後、これによって治療用タンパク質が遊離することになる。本発明の別の実施形態では、治療用タンパク質は、Ｃタンパク質のＣ末端のシステイン残基とタンパク質薬物のシステイン残基との間のジスルフィド架橋によってＣタンパク質に連結されている。システイン残基は、タンパク質にすでに存在するものであってもよく、または、各々のタンパク質の所望の位置で操作されてもよい。

本発明の別の実施形態では、改変されたＢ型肝炎ウイルスＳタンパク質が共有結合され得るように、システイン残基はキャプシドの外側のスパイク領域において操作される。Ｓタンパク質は、エンベロープの脂質二重層形成を導くように機能する。本発明の実施形態では、Ｓタンパク質は、Ｃタンパク質モノマー間のジスルフィド架橋形成を補完するとともにシステインを有するように改変される。

本発明の実施形態において、Ｓタンパク質は、ケージの包膜を導くために、類似した特徴を有するペプチド（例えば、膜貫通性に操作されたペプチド）によって置換され得る。この目的に適切な例示的な膜貫通性に操作されたペプチドは、ケージとジスルフィド架橋を形成するように、システインで終わる可撓性領域を有する。ペプチドの対向する末端は、主に疎水性残基から構成される。この種の膜貫通性に操作されたペプチドの非限定的な例は、配列番号５において開示される。このペプチドの疎水性部分は疎水性脂質二重層領域と会合し、従って、ケージ周辺で堅い小胞の形成を導くように作用する。これらのガイドペプチドは、ケージ形成およびＣタンパク質へのジスルフィド結合後の反応混合物に加えられる。

配列番号５：ＨＢＶ Ｓタンパク質の膜貫通性に操作されたペプチド：

本発明のさらに別の実施形態では、Ｓタンパク質または上記の等価な膜貫通性に操作されたペプチドの代わりに、リン脂質がＣタンパク質のコアに直接連結されて包膜を導き得る。上記に開示されるように、コアタンパク質のスパイク領域の頂点で、システイン残基を変異させ、そしてこの部位には、改変ホスファチジルセリンを含むがこれに限定されない脂肪酸が共有結合される。これらの脂肪酸は、他のリン脂質およびコレステロールがナノケージ周辺で二重層を形成するためのガイドとして作用する。これは、Ｓタンパク質または先に述べた膜貫通性に操作されたペプチドの必要性を置換する。また、これらの共有結合したリン脂質をスパイク領域（免疫優勢スパイクとしても公知）に添加することにより、免疫応答が抑制され得る。

本発明の一実施形態では、この方法において脂質二重層は、リン脂質から構成される。本発明の別の実施形態では、エンベロープ形成性成分としては、ＰＥＧ−リン脂質を含め、コレステロールがさらに挙げられる。本発明の特定の実施形態では、ＰＥＧ−リン脂質は、ポリ（エチレングリコール）誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）および／またはポリ（エチレングリコール）誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）を含む。

ナノ粒子エンベロープを形成することに適しているリン脂質としては、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、モノシアロガングリオシド、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の実施形態において、ナノ粒子エンベロープは、粒子が免疫系を避けて標的細胞に入ることができるように改変される。コレステロールタグ化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはタンパク質形質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＰＴＤ）は、混合物に添加される。適切なＰＴＤの非限定的な例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の転写トランスアクチベーター（Ｔａｔ）ペプチドまたはポリアルギニン（ポリＡｒｇ）である。第１のコレステロールタグ化ＰＥＧは脂質二重層に係留され、次いでコレステロールタグ化ＰＴＤは脂質二重層に係留される。改変されたＰＥＧおよびＰＴＤは、包膜されたナノケージに添加され、そして濃度依存性の様式でエンベロープ表面に挿入される。

本発明のさらなる実施形態では、標的化因子は、組織または細胞標的にナノ粒子を導くために、脂質エンベロープに組み込まれる。標的化因子の例示的実施形態は、抗体である。抗体は、ジスルフィド結合によって結合して、重鎖中の露出したジスルフィド結合によって結合した２つの重鎖−軽鎖複合体になった２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。β−メルカプトエタノールのような弱い還元剤の存在下では、重鎖は解離して、重鎖−軽鎖結合をインタクトなまま残す。次いで、重鎖上の露出したスルフヒドリル基は、抗体を脂質エンベロープ上の遊離の硫酸基に連結するために用いられ得る。結果として生じるナノ粒子は、脂質標的化抗体コーティングに包膜されたタンパク質ケージに封入された薬物から構成される。

本発明の別の実施形態では、上記の還元した抗体重鎖−軽鎖複合体は、裸のタンパク質ケージに直接結合され得る。上記で考察したように、タンパク質構築ブロックは、その後部分的に解離した抗体鎖と連結され得る反応性スルフヒドリル基を有するシステイン残基を組み込むように操作され得る。ナノ粒子のこの構成により、抗体標的化分子でタグ化されたタンパク質ケージに封入された薬物をもたらす。

本発明のナノ粒子薬物送達システムにおける標的化因子としての用途に適している抗体としては、抗体−ナノ粒子複合体の直接的または間接的な内在化をもたらす細胞表面抗原に対する抗体が挙げられる。適切な抗体の特定の非限定的な例としては、ＣＤ３３に対する抗体およびＣＤ２２に対する抗体が挙げられる。ＣＤ３３およびＣＤ２２は、リンパ腫において過剰発現されてダイマーを形成し、そして、これらの抗原に結合することにより、抗体−ナノ粒子複合体のエンドサイトーシスおよびそれにより内部移行が引き起こされる。

本発明のナノ粒子薬物送達システムの実施形態では、ナノ粒子は、ウイルスキャプシドナノケージに封入された薬物を含み得る。本発明の別の実施形態では、ナノ粒子は、標的化抗体をさらに含むウイルスキャプシドナノケージに封入された薬物を含み得る。本発明のさらに別の実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ分子をさらに含むウイルスキャプシドナノケージに封入された薬物を含み得る。

本発明のナノ粒子薬物送達システムに封入された治療薬剤は、任意の従来の経路によって投与され得る。これらとしては、全身経路（例えば、皮下経路、皮内経路、筋肉内経路または静脈内経路）および粘膜経路（例えば、口腔経路、鼻腔経路、肺経路または肛門性器経路）が挙げられるが、これらに限定されない。固形腫瘍の処置が含まれる場合、腫瘍内経路もまた、用いられ得る。遺伝病の処置が含まれる場合、投与経路の選択は、疾患の性質に本質的に依存する；例えば、嚢胞性線維症の場合は肺経路（ナノ粒子は、エアゾールの形態で処方される）または血友病の場合は静脈内経路が有利に言及され得る。

本発明のナノ粒子薬物送達システムのナノ粒子は、生体適合性水溶液中で投与される。この溶液は、生理食塩水または水（しかしこれらに限定されない）から構成されてもよく、そして必要に応じて薬学的賦形剤（緩衝剤、安定化分子、保存剤、糖、アミノ酸、タンパク質、炭水化物およびビタミンが挙げられるがこれらに限定されない）を含む。

長期貯蔵安定性を増すために、本発明のナノ粒子薬物送達システムのナノ粒子は、一つ以上の保護剤（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース等）の存在下で凍結および凍結乾燥され得る。凍結乾燥されたナノ粒子の再水和の際に、懸濁液は、基本的に、以前に封入された全ての薬物を保持し、同じ粒子サイズを保持する。再水和は精製水もしくは無菌水または０．９％塩化ナトリウム注射液もしくは５％デキストロース溶液を単に添加し、次いで懸濁液を穏やかに攪拌することによって達成される。ナノ粒子に封入された薬物の効力は、凍結乾燥および再構成後、失われない。

ナノ粒子の投与は、一回量で、または特定の時間間隔の後に一回もしくは数回繰り返される用量で実行され得る。適切な投薬量は、様々なパラメーター（例えば、処置される個体または投与様式）に従って変化する。適切な用量は、製薬投薬の当業者（例えば、医師）によって確立される。

本発明のナノ粒子薬物送達システムを集合させるプロセスの例示的実施形態は、図５に示され、その工程は、下記に要約される：
１．操作されたＣタンパク質を、選り抜きの薬物と混合する；
２．ＮａＣｌの添加によって溶液のイオン強度を上昇させて、薬物を内部に封入したケージを形成させる；
３．操作されたＳタンパク質または操作されたペプチドをこのケージに添加する；
４．超音波処理したリン脂質溶液をこの混合物に添加する；
５．コレステロールタグ化ポリエチレングリコールをこの混合物に添加する；
６．コレステロールタグ化タンパク質形質導入ドメインをこの混合物に添加する；そして、
７．遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーによってこのシステムを精製する。

より詳しくは、この薬物は、ケージの集合の間に、本発明のナノ粒子薬物送達システムに組み込まれる。軽く緩衝化された溶液中のコアタンパク質は、薬物と混合される。当業者にとって周知であるように、Ｃタンパク質およびこの薬物と適合性の緩衝系が使われる。適切な緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液、ならびに当業者に周知の他の緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の例示的実施形態において、タンパク質薬物は、タンパク質ナノケージ中に封入される。ＨＢＶ Ｃタンパク質から構成されるナノケージは、１２００コピーまでの１０ｋＤａタンパク質またはタンパク質、ペプチド、核酸または低分子合成化学物質実体のうちの少なくとも１つの等価な量を充填され得る。治療用タンパク質：Ｃタンパク質複合体は、分子拡散およびクーロン引力の一般的物理学によって示されるように、混合のほんの数秒後に形成される。５〜１０分後に、溶液のイオン強度は、０．６Ｍの最終濃度になるまでＮａＣｌを添加することにより上昇する。これにより、キャプシドの自己集合反応が誘発される。混合物を１時間インキュベーションした後、完全に形成されたキャプシドの存在は、標準的な生化学的分析を使用して確認される。次に、上記で開示されるように、ケージは、再操作されたＳタンパク質または膜貫通性に操作されたペプチドのいずれかと混合される。これらの添加により、各々の構築ブロックのスパイクにおいて、ケージの表面の相補的なシステインが共有結合される。

本発明の別の実施形態では、リン脂質は、Ｃタンパク質マトリックスに組み込まれる。最も安定した会合は、Ｃタンパク質中の特定のアミノ酸の側鎖に見出される官能基へのリン脂質の共有結合を含む。実施例２および実施例３に提示した２つの類似したプロトコルにおいて、距離制約、溶媒相互作用、アミノ酸残基、官能基およびリン脂質の組合せ、ならびに合成の単純性を最適化することを目的として、ヘテロ二官能性架橋分子は、異なるアミノ酸で見出される多くの異なる官能基が利用され得る広いテンプレートを提供するために利用される。実施例２および実施例３は、Ｃタンパク質へのスルフヒドリル官能基の添加を示す。これらの官能基により、リン脂質分子は次いで係留され得、このことにより、包膜プロセスが導かれる。本発明の実施形態において、包膜プロセスのために適切なタンパク質：脂質の比率は、約１：１のタンパク質：脂質（ｗ：ｗ）から約１：２０のタンパク質：脂質（ｗ：ｗ）までの範囲である。

ヘテロ二官能性架橋分子の使用により、必要に応じて、同じリン脂質前駆体を使用して、Ｃタンパク質マトリックスに沿って適切な係留点において様々な官能基を操作することが可能になる。例えば、スルフヒドリル官能基はまた、コアのケージを安定化するコアタンパク質間の分子間相互作用を安定させることに関係している。脂質を係留するために同じ官能基を利用することにより、スルフヒドリル官能基が分子間結合を形成するのが防止され、従って、コアタンパク質シェルの安定性に負に影響を与えるならば、ヒドロキシル基およびアミン基を含むがこれらに限定されない他の官能基は、リン脂質係留が特に設計される場所においてこのタンパク質に操作され得る。これは、単一の場所でのコアタンパク質の再構成、および代わりの市販のヘテロ二官能性架橋分子の使用を必要とするだけである。

本発明のナノ粒子のエンベロープ層は、カチオン性またはアニオン性の脂質二重層である。本発明の実施形態において、様々な比率の脂質（主にリン脂質）およびコレステロールの均質混合物は、乾燥した成分をクロロホルム：メタノール（体積で２：１）溶液に添加することによって作製される。例えば、そして限定であることを意図せず、１００ｍｇのホスファチジルコリン、４０ｍｇのコレステロールおよび１０ｍｇのホスファチジルグリセロールは、５ｍＬのクロロホルム／メタノール溶液に添加される。この混合物は穏やかに振盪されて、全ての成分が完全に混合される。次に、この混合物は乾燥されて、全ての有機溶媒が取り除かれる。次いで、この乾燥した混合物は、数ミリリットルの水溶液（緩衝化Ｈ_２Ｏ）に導入され、そして超音波処理によって機械的に分散される。この溶液は、捕捉された薬物ペイロードを含んでいる完全に集合したナノケージの懸濁液に迅速に添加される。このナノケージは、包膜強化ペプチド（操作されたタンパク質またはＳタンパク質）またはリン脂質のいずれかによってすでに共有結合により改変されている。穏やかに混合しながら短時間インキュベーションした後、封入されたケージは分離され、そして単純な遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製される。

（実施例１：コアタンパク質発現および精製）
全長ＨＢＶ Ｃタンパク質遺伝子を含んでいるｐＥＴ−１１ａベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＥ３細胞に形質転換し、そして２〜４％のグルコース、微量元素および２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを強化したＬＢ培地中で３７℃にて増殖させる。２ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加によってタンパク質発現を誘導する。３時間の誘導後、ペレット化することによって細胞を収集する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＣタンパク質の発現を評価する。

コアタンパク質を、５０ｍｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍ ＥＤＴＡ、５ｍｍ ＤＴＴ、１ｍｍ ＡＥＢＳＦ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ１および０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅの溶液中に再懸濁することによって、Ｅ．ｃｏｌｉから精製する。次いで、細胞を、フレンチプレスセルを通すことによって溶解する。懸濁液を、２６０００×Ｇで１時間遠心分離する。ペレットを捨て、そして固体スクロースを０．１５Ｍの最終濃度になるまで上清に添加し、１０００００×Ｇで１時間遠心分離する。ペレットを捨て、次いで固体の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を４０％飽和の最終濃度になるまで添加し、１時間撹拌し、次いで２６０００×Ｇで１時間遠心分離する。ペレットを、ｐＨ７．５の１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ スクロースおよび２ｍＭ ＤＴＴ（緩衝液Ａ）中に再懸濁し、そして緩衝液Ａで平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（直径５ｃｍ×９５ｃｍ）にローディングし、そしてこのカラムを２ｍＬ／分で溶出させる。この精製スキームを使用して、ＨＢＶウイルスキャプシドを大きな凝集物およびより低い分子量の可溶性タンパク質から分離する。これらの画分をクロマトグラフィープロフィールおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従ってプールし、そしてＤｉａｆｌｏ ＹＭ １００限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用した限外濾過によって溶液を約１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮する。濃縮したＣタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．１５Ｍスクロースに対して透析する。次いで、溶液を１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９．５に調整し、そして３．５Ｍの最終濃度になるまで尿素を添加する。次いでこの溶液をＭｉｌｌｅｘ−ＨＡ ０．４５ｕｍ細孔径フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して濾過し、そして２ｍＭのＤＴＴを含む１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）によって平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム（直径６．０ｃｍ×６０ｃｍ）にアプライする。このカラムを５ｍＬ／分で溶出させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した場合にダイマータンパク質を含む画分をプールする。これらの手順を、全てのコアタンパク質変異体の発現および精製のために用いる。あるいは、このタンパク質の発現は、当業者に周知の方法に従って、酵母細胞において行われ得る。

（実施例２：ＳＭＰＢ中間体を経たリン脂質結合のためのプロトコル（図２））
１．１００マイクロモルのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を、１００マイクロモルのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を含んでいる、５ｍＬのアルゴンでパージした無水メタノールに溶解する。アルゴン雰囲気下または窒素雰囲気下でこの溶液を維持する。この反応はまた、乾燥クロロホルムにおいても行われ得る。

２．５０ｍｇのＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｐｉｅｒｃｅ）をＰＥ溶液に添加する。よく混合して溶解させる。

３．アルゴン雰囲気下または窒素雰囲気下でこの溶液を維持しながら、室温で２時間反応させる。

４．ロータリーエバポレーションによってこの反応溶液からメタノールを取り除き、そしてクロロホルム（５ｍＬ）中で固体を再溶解する。

５．クロロホルムから水溶性反応副産物を等しい体積の１％のＮａＣｌで抽出する。二度抽出する。

６．ケイ酸カラムでのクロマトグラフィーによってＭＰＢ−ＰＥ誘導体を精製する（Ｍａｒｔｉｎ ＦＪら，Ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｆａｂ’ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｖｉａ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８１；２０：４２２９−３８）。

７．ロータリーエバポレーションによってＭＢＰ−ＰＥからクロロホルムを除去する。使用するまで窒素雰囲気下にて−２０℃で誘導体を保存する。

（実施例３：ＭＢＳ中間体を経たリン脂質結合のためのプロトコル（図３））
１．４０ｍｇのＰＥを、１６ｍＬの乾燥クロロホルムと２ｍＬの２０ｍｇトリエチルアミン含有乾燥メタノールとの混合物に溶解し、窒素下で維持する。

２．２０ｍｇのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）をこの脂質溶液に添加し、そして混合して溶解させる。

３．窒素下で室温にて２４時間反応させる。

４．ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で有機相を３回洗浄して、過剰な架橋剤および反応副産物を抽出する。

５．減圧下でのロータリーエバポレーションによって有機溶媒を取り除く。

（実施例４：スルフヒドリル含有タンパク質（ＳＣＰ）にマレイミド含有中間体（ＭＣＩ）を結合するためのプロトコル（図４））
１．ＴＲＩＳ＊ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８．０、１００ミリモル）にＳＣＰを溶解して１ミリモルの濃度を得る。窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下で２０分間パージする。

２．上記と同じ緩衝液にＭＣＩを溶解し、窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下で２０分間パージして１０倍モル過剰を得る。

３．これらの２つの溶液を合わせ、窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下でさらに２０分間パージを続ける。

４．反応を室温で６時間進行させる。

特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲に示される成分の量、分子量のような性質、反応条件などを表している全ての数字は、「約」という用語によって全ての例において修飾されるものとして理解されるべきである。従って、そうでないと示されない限り、以下の明細書および特許請求の範囲において示される数字パラメーターは、本発明によって得ることが求められる所望の特性によって変化し得る近似値である。少なくとも、そして特許請求の範囲に均等論を適用することを制限する試みではなく、各々の数字パラメーターは、報告された有効数字の数を考慮して、そして、通常の切り上げ技術を適用して、少なくとも解釈されるべきである。本発明の幅広い範囲を記載している数字範囲およびパラメーターは近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載される数値は、できるだけ正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、それらのそれぞれの試験測定値で見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を固有に含む。

本発明を記載する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）用いられる用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の指示物は、そうでないと本明細書において示されるかまたは文脈によって明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、範囲内に入る各々の別々の値を個々に言及する速記方法として役立つことを単に意図している。本明細書においてそうでないと示されない限り、あたかもそれが本明細書において個々に参考として援用されたかのように、各々の個々の値は明細書に組み込まれる。本明細書において記載されている全ての方法は、本明細書において特に明記されるかまたは文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書において提供される任意の例および全ての例の使用、または例示的な用語（例えば、「例えば」）は、本発明をよりよく明らかにすることを意図するに過ぎず、他の点で請求される本発明の範囲に限定を付与しない。明細書中の用語はいずれも、本発明の実施に必須の、何らかの請求されていない構成要素を示すと解釈されてはならない。

本明細書において開示される本発明の代わりの要素または実施形態のグループ化は、限定と解釈されるべきではない。各々のグループメンバーは、個々に、またはその群の他のメンバーもしくは本明細書中で見出される他の要素との任意の組合せで、言及および請求され得る。あるグループの一つ以上のメンバーが、便宜上および／または特許性から、そのグループの中に含まれてもよく、または削除されてもよいことが予期される。何らかのこの種の包含または削除が起こる場合、本明細書は、ここで、このように変更されたグループを含み、従って、添付の特許請求の範囲において用いられる全てのマーカッシュグループの記載要件を満たすとみなされる。

本発明を実施するための本発明者らが知る最良の形態を含め、本発明の好ましい実施形態は、本明細書において記載されている。もちろん、これらの好ましい実施形態へのバリエーションは、前述の説明を読めば、当業者に明らかになる。本発明者は、当業者がこの種のバリエーションを適切に使用すると予想し、そして本発明者は、本明細書において具体的に記載された以外のものとして本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、適用可能な法律によって許容される通り、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変物および等価物を包含する。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素のいかなる組合せも、本明細書においてそうでないと示されるかまたは文脈によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。

さらに、本明細書全体を通して特許および印刷された刊行物が多数参照されている。各々の上記の引用文献および印刷された刊行物は、それらの全体が、本明細書中に参考として個々に援用される。

締めくくりとして、本明細書において開示される本発明の実施形態は本発明の原理を例示すると理解されるべきである。使用され得る他の改変は、本発明の範囲内である。従って、例示として、しかし限定ではなく、本発明の代替の構成は、本明細書中の教示に従って利用され得る。従って、本発明は、正確に示されて記載されるものには限定されない。

図１は、６回軸から見下ろした斜視図による、全長ＨＢＶダイマーの電子密度地図から再構築した、野生型Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のキャプシドのコンピュータによる再構築を示す。 図２は、本発明の教示による、スクシンイミジル−４（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート中間体によるタンパク質ケージへのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）結合のための流れ図を示す。 図３は、本発明の教示による、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル中間体によるタンパク質ケージへのＰＥ結合のための流れ図を示す。 図４は、本発明の教示による、スルフヒドリル含有タンパク質へのマレイミド含有中間体を結合するための流れ図を表す。 図５は、本発明の教示による、自己集合性ナノ粒子薬物送達システムの構築の流れ図を示す。

Claims (24)

1. 自己集合性ナノ粒子薬物送達システムであって：
   ウイルスキャプシドタンパク質から構成されるキャプシド；
   該キャプシド中に捕捉された薬物；および
   該キャプシドを包膜している脂質二重層
   を含む、自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
2. 前記ウイルスキャプシドタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質である請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
3. 前記ＨＢＶコアタンパク質が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
4. 前記ウイルスキャプシドタンパク質が、変異している、請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
5. 前記ウイルスキャプシドタンパク質が、前記ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸７９およびアミノ酸８０と置き換わっているプロテアーゼ認識部位を含む、請求項４に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
6. 前記プロテアーゼ認識部位がトロンビン認識部位または第Ｘａ因子認識部位である、請求項５に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
7. フェニルアラニン２３、アスパラギン酸２９、トレオニン３３、ロイシン３７、バリン１２０、バリン１２４、アルギニン１２７およびチロシン１３２からなる群から選択される配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのアミノ酸がシステインに変化するように前記ＨＢＶコアタンパク質が変異している、請求項４に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
8. 前記薬物が、ペプチド、タンパク質、核酸および低分子合成化学薬物からなる群から選択される、請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
9. 前記脂質二重層がリン脂質から構成される、請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
10. 前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項９に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
11. コレステロールタグ化ポリエチレングリコールおよびコレステロールタグ化タンパク質形質導入ドメインのいずれかまたは両方をさらに含む、請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
12. 前記タンパク質形質導入ドメインが、ヒト免疫不全ウイルスの転写のトランスアクチベーターまたはポリアルギニンを含む、請求項１１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
13. 抗体を標的とする分子をさらに含む、請求項１に記載の自己集合性ナノ粒子薬物送達システム。
14. 自己集合性ナノ粒子薬物送達システムを構築するための方法であって、以下：
    薬物とＨＢＶコアタンパク質とを混合して、ケージ溶液を形成する工程；
    該ケージ溶液のイオン強度を上げることによって該薬物を該コアタンパク質のケージ封入する工程；
    リン脂質を該ケージ溶液に添加する工程；
    コレステロールタグ化ポリエチレングリコールを該ケージ溶液に添加する工程；
    コレステロールタグ化タンパク質形質導入ドメインを該ケージ溶液に添加する工程；
    遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーによって該ナノ粒子を精製する工程
    を包含する、方法。
15. 前記薬物が、ペプチド、タンパク質、核酸および低分子合成化学薬物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＨＢＶコアタンパク質が、該ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸７９およびアミノ酸８０と置き換わっているプロテアーゼ認識部位を含む、請求項１４に記載の方法。
17. 前記プロテアーゼ認識部位が、トロンビン認識部位または第Ｘａ因子認識部位である、請求項１６に記載の方法。
18. フェニルアラニン２３、アスパラギン酸２９、トレオニン３３、ロイシン３７、バリン１２０、バリン１２４、アルギニン１２７およびチロシン１３２からなる群から選択される配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのアミノ酸がシステインに変化するように前記ＨＢＶコアタンパク質が変異している、請求項１４に記載の方法。
19. 前記封入する工程の後、包膜を導くタンパク質またはペプチドを添加する工程をさらに含んでいる、請求項１４に記載の方法。
20. 前記包膜を導くタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質または配列番号５の操作された膜貫通ペプチドである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項１４に記載の方法。
22. 前記タンパク質形質導入ドメインが、ヒト免疫不全ウイルスの転写のトランスアクチベーターまたはポリアルギニンを含む、請求項１４に記載の方法。
23. 標的化抗体を前記脂質二重層に挿入する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
24. 自己集合性ナノ粒子薬物送達システムを用いた疾患処置方法であって、粘膜表面を通して該ナノ粒子を送達する工程を包含する、方法。

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