CZ20011907A3 - Částice jádra HBV s imunogenními sloľkami navázanými prostřednictvím peptidových ligandů - Google Patents

Částice jádra HBV s imunogenními sloľkami navázanými prostřednictvím peptidových ligandů Download PDF

Info

Publication number
CZ20011907A3
CZ20011907A3 CZ20011907A CZ20011907A CZ20011907A3 CZ 20011907 A3 CZ20011907 A3 CZ 20011907A3 CZ 20011907 A CZ20011907 A CZ 20011907A CZ 20011907 A CZ20011907 A CZ 20011907A CZ 20011907 A3 CZ20011907 A3 CZ 20011907A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hbv
core antigen
capsid
hbv core
virus
Prior art date
Application number
CZ20011907A
Other languages
English (en)
Inventor
Kenneth Murray
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of CZ20011907A3 publication Critical patent/CZ20011907A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Description

Částice jádra HBV s imunogenními složkami navázanými prostřednictvím peptidových ligandů
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká antigenních částic jádra viru hepatitidy B (HBV), které jsou charakterizovány vícenásobnou imunogenní speciíitou. Konkrétně se vynález týká částic jádrového antigenu HBV, které obsahují imunogeny, epitopy a další příbuzné struktury, navázané zesítěním prostřednictvím ligandů, což jsou peptidy vážící se na kapsidu HBV, které selektivně váží také jádrový protein HBV. Takové částice se mohou využít jako přenosový systém pro celé spektrum různých imunogenních epitopů, včetně peptidů vázajících se na kapsidu HBV, které výhodně navíc inhibuji a narušují složení viru HBV tím, že blokují interakci mezi jádrovým proteinem HBV a povrchovým proteinem HBV. Směsi různých imunogenů, ligandů peptidů vázajících se na kapsidu HBV, nebo obojí, mohou být zesítěním navázány na tutéž částici jádra HBV. Výsledné vícesložkové (multikomponentní) nebo multivalentní částice jádra HBV se mohou výhodně užít v terapeutických i profylaktických vakcínách a přípravcích, a také v diagnostických přípravcích.
Dosavadní stav techniky
První linie klinických imunoterapeutických režimů zahrnuje imunizaci pacientů proti infekčním patogenům a dalším zdraví ohrožujícím agens. I přes značné množství imunizačních agens, očkování poskytuje přinejlepším jen částečnou imunitu a je nutná častá reimunizace. To je případ běžných monovalentních nebo polyvalentních vakcín. A dokonce i mezi těmito vakcínami je počet očkovacích látek schopných samostatně vyvolat imunitu proti různým imunogenům velmi omezený. Kromě toho antigenní variabilita patogenů omezuje účinnost konvenčních vakcín.
Vzhledem k těmto problémům bylo věnováno značné úsilí nalezení způsobů, jak zesílit reakci imunitního systému na daný imunogen. S tímto cílem byly např. připraveny imunogenní konjugáty navázáním imunogenů na částici jádra viru hepatitidy B (HBV) (označovaná též jako nukleokapsida nebo nukleokapsidový obal), aby se zvýšila imunogenicita navázaného imunogenu prostřednictvím determinant, a to jak závislých tak i nezávislých na T lymfocytech, antigenu jádra HBV. Viz např. Patent USA č. 4 818 527 a R. Ulrich et al. , Coer Partivcles Hepatitis B Virus as Carrier for Foreign Epitopes, Adv. Virus Res. 50, 141-182, 1998). Zesílení imunogenicity požadovaných epitopů bylo také dosaženo pomocí hybridních proteinů požadovaných epitopů bylo také dosaženo pomocí hybridních proteinů tvořících virové částice, obsahujících alespoň část přirozeně se vyskytujícího proteinu tvořícího virové částice, např. povrchového antigenu HBV, a jeden nebo více požadovaných epitopů, viz Patent USA č. 5 9S5 140. Jak je zřejmé z těchto pokusů, protein HBV byly užity jako platforma pro prezentaci požadovaných imunogenů imunitnímu systému.
Virus hepatitdiy B je krví přenášený virus, obsahující malý genom z částečně dvouřetězcové DNA, obsahující čtyři silně se překrývající čtecí rámce, a obsahuje vnitřní nukleokapsidu, obsahující jádrový protein HBV (HBcAg), virovou polymerázu a virovou DNA, obklopenou obalovou membránou obsahující povrchový antigen HBV (HBsAg). Virový obal obsahuje tři různé, ale příbuzné proteiny povrchových antigenů, tzv.
dlouhý (L) , střední (M) a krátký (S) , které sdílejí společný karboxykoncový úsek, ale mají odlišné aminokoncové úseky, což je důsledek variabilního užití iniciačního tripletu v různých místech souvislého otevřeného čtecího rámce.
Dlouhý polypeptid (L polypeptid) obsahuje úseky pre-Sl, pre-S2 a S. Je produktem celého čtecího rámce a obsahuje na svém aminokonci doménu pre-Sl obsahující 108 aminokyselin (nebo 199, v závislosti na subtypu viru), pak následuje doména pre-S2 z 55 aminokyselin a pak úsek krátkého polypeptidu (S polypeptid) z 226 aminokyselin. Středně dlouhý polypeptid (M polypeptid) obsahuje na svém aminokonci doménu pre-S2, po které následuje S úsek, zatímco S polypeptid, který je nejhojnější formou, obsahuje jen úsek S. Úseky pre-S hrají důležitou roli v jak při sestavení viru tak při jeho přichycení na hostitelskou buňku. S forma je ve viru hojnější než M a L formy HBsAg, a vyskytuje se jak ,v glykosylované tak i neglykosylované podobě (V. Bruss a D. Ganem, The Role of Envelope protein in Hepatitis B Virus Assembly, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88? 1058-63, 1991, V. Bruss et al., Posttranslational Alteration in Transmembrane Topology of Hepatitis B Virus Large Envelope Protein, EMBO J. 13, 2273-79, 1994, A.R. Neurath et al. , Identification and Chemical Synthesis of a Host Cell Receptor Binding Site on Hepatitis B Virus, Cell 46, 429-36, 1986, K. Ueda et al. , Three Envelope
Proteins of Hepatitis B Virus: Large S, Middle S and Major S Proteins Needed for the Formation of Dane Particles, J. Virol., 65, 3521-29 (1991). Specifické interakce mezi vnějším povrchem virového jádra a vnitřním povrchem virové obálky pravděpodobně vedou ke správnému sestavení viru a stabilizují vzniklou virovou částici.
Jádrové proteiny HBV mohou být účinně exprimovány v E. coli [M. Pasek et al. , Hepatitis B Virus Genes and Their
Expression vytvářej í velikostí, in E.
obálky coli, tvaru které obsahují
Nátuře, 282, ikosahedru
575-79 (1979), buďto 180 (T=3) nebo 2 90 15 kde dvou podjednotek (R.A. Crowther et al. , Three Dimensional
Structure of Hepatitis B Virus Core Particles Determined by
77, 943-50 (1999). Podjednotky dimer vytváří hrot,
Užitím elektronové
Electron Microscopy, Cell, jsou nahloučeny který vyčnívá j ako dimery z povrchu a každý obálky.
a zpracování kryomikroskopie obálky T=4 s rozlišením 7,4 obrazu užitím byla více připravena mapa než 60 0 0 snímku jednotlivých částic (viz B. Bottcher et the Fold of the Core Protein of Hepatitis B
Determination of
Virus by Electron
Cryomicroscopy, Nátuře, 386, 88-91 (1997).
Tak bylo odhaleno prostorové sestavení polypeptidového řetězce, který je převážně ve formě a-šroubovíce a zcela nepodobný výše popsané virové kapsidě. Každý dimerní hrot je tvořen párem šroubovícových vlásenkových struktur, po jedné z každého monomeru tvořícího dimer. (Bottcher et al., 1971; J.F. Conway et al., Visualization of a 4-Helix Bundle in the Hepatitis B Virus Capsid by Cryoelectron Microscopy, Nátuře, 386, 91-94 (1997).
Schéma číslování sestavující sekvenci aminokyselin do helixu (Bottcher et al. , 1977) umisťuje hlavní imunodominantní úsek HBV jádra kolem aminokyselin 78 až 82 (J. Salfeld et al. , Antigenic Determinants and Functional Domains in Core Antign and E Antigen from Hepatitis B virus, J. Virol. 63, 789-808, 1989, M. Sállberg, Characterisation of a Linear Binding Sítě for a Monoclonal Antibody to Hepatitis B Core Antigen, J. Med.Virol.33, 248-52, 1991) na vrcholu hrotu.
taková blokuj i činidlům, která inhibuji činidla, která se váží na interakci mezi proteinem sestavení antigen viru j ádra j ádra HBV a
HBV patří
HBV a tím povrchovým proteinem. Takové peptidy vázající se na kapsidu HBV byly popsány v PCT patentové přihlášce WO98/18818 a v publikaci M.R. Dyson a K. Murray. Selection of Peptide Inhibitors of Interactions Involved in Complex Protein Assemblies: Association of the Core and Surface Antigens of Hepatitis B Virus, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 2194-98, 1995. Jeden takový peptid vázající se na kapsidu, a sice MRRSLLGRMKGA, byl zesítěním navázán na antigen jádra HBV (Bottcher et al. , Peptides that Block Hepatitis B Virus Assembly: Analysis by Cryomicroscopy Mutagenesis and Transfection, EMBO J. 17, 683995, 1998.
Jak bude zjevné z dalšího popisu, peptidy vázající se na kapsidu HBV mohou být výhodně použity jako ligandy pro konstrukci částic HBV jádrového antigenu, které mají schopnost vyvolat zesílenou imunitní reakci na jednoduché nebo vícenásobné imunogeny.
Podstata vynálezu předkládaný vynález řeší výše uvedené problémy tím, že poskytuje částice jádrového antigenu HBV, které mají schopnost vyvolat zesílenou imunitní reakci k jednomu nebo několika imunogenům. Takové vícesložkové nebo multivalentní částice jádrového antigenu HBV obsahují imunogeny, epitopy nebo jiné příbuzné struktury, které jsou na částice navázány zesítěním pomocí ligandů, což jsou peptidy selektivně se vázající na částice jádrového antigenu HBV, kromě imunogenních domén nebo epitopů navázaných nebo vložených do polypeptidu jádrového antigenu HBV metodami genového inženýrství, tj . modifikací kódující sekvence nebo syntézou polypeptidu. Takové částice se mohou využít jako přenosový systém pro celé spektrum různých imunogenních epitopů, včetně peptidů vázajících se na kapsidu HBV, které výhodně navíc inhibují a narušují složení viru HBV tím, že blokují interakci mezi jádrovým proteinem HBV a povrchovým proteinem HBV. Směsi různých imunogenů, ligandu peptidů vázajících se na kapsidu HBV, nebo obojí, mohou být zesítěním navázány na tutéž částici jádra HBV. Výsledné vícesložkové (multikomponentní) nebo multivalentní částice jádra HBV se mohou výhodně užít v terapeutických i profylaktických vakcínách a přípravcích, a také v diagnostických přípravcích.
Předkládaný vynález výhodně navázat zesítěním směs různých imunogenů, peptidových ligandů vázajících se na kapsidu HBV nebo směs obou sloučenin, na tutéž částici jádrového antigenu HBV. Výsledkem je částice účinně stimulující T lymfocyty, která je imunologicky multivalentní. Tudíž jediná buňka prezentující antigen může stimulovat proliferaci několika klonů B lymfocytů s různou specifitou.
Popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje strukturu částice jádrového antigenu HBV obsahující různé imunogeny vázající se na kapsidu HBV. Imunogen vázající se na kapsidu obsahuje alespoň jednu peptidovou složku vázající se na kapsidu HBV a alespoň jednu imunogenní složku. Každý imunogen vázající se na kapsidu je navázán na částici jádrového antigenu HBV prostřednictvím peptidu vázajícího se na kapsidu HBV.
Obr. 2 je tabulka shrnující přehledně různé fúzní proteiny jádrového antigenu HBV, které mohou být použity jako částice jádrového antigenu HBV, na které mohou být navázány různé imunogeny prostřednictvím peptidů vázajících se na kapsidu HBV.
Podrobný popis vynálezu
Podle jednoho výhodného provedení vynálezu mohou být směsi více než jednoho typu imunogenu a více než jednoho typu peptidového ligandu vázajícího se na kapsidu HBV zesítěním navázány na tutéž částici jádrového antigenu HBV. Alternativně se více kopií téhož imunogenu naváže na jeden typ peptidů vázajícího se na kapsidu HBV a pak se zesítěním naváže na různá místa jedné částice jádrového antigenu HBV. Takové vícesložkové nebo multivalentní částice jádrového antigenu HBV jsou užitečné k indukci protilátek proti všem zúčastněným imunogenním složkám.
Použití peptidů vázajících se na kapsidu HBV k navázání imunogenů na částici jádrového antigenu HBV umožňuje zesílit prezentaci imunogenu, aniž by se poškodila imunogenicita nebo stabilita imunogenu denaturací, porušením konformace nebo jiným destabilizujícím účinkem. Tak např. spojovací peptidy vázající se na kapsidu HBV snižují riziko, že jednotlivé imunogeny budou navzájem interferovat a že by docházelo ke ztrátám funkčního materiálu. Výsledkem tudíž je, že částice jádrového antigenu HBV podle předkládaného vynálezu vyvolávají zesílenou imunitní reakci na každou svou imunogenní složku. Takže je možné dosáhnout požadovaného terapeutického nebo profylaktického účinku s menším počtem očkování a/nebo menším množstvím očkovací látky než které je potřebné, když je každý imunogen podáván jako samostatné agens.
Navázání imunogenů na částici jádrového antigenu HBV prostřednictvím peptidů vázajících se na kapsidu HBV také umožňuje prezentaci imunogenů, které se liší velikostí, konformací a povahou. Tudíž předkládaný vynález umožňuje do jedné vakcíny nebo přípravku vložit kombinaci imunogenů užitečnou k vyvolání širokospektré imunity nebo léčení.
Imunogeny
K imunogenům, které mohou být navázány na peptidy vázající se na kapsidu HBV a tudíž vloženy do částice jádrového antigenu HBV, patří jakékoliv molekuly obsahující jeden nebo více imunologických, imunogenních nebo antigenních epitopů. Takové epitopy jsou svojí povahou lineární, konformační, jednoduché nebo smíšené.
Konkrétně imunogeny mohou být vybrány ze všech činidel, která jsou schopna vyvolat imunitní reakci. K takovým činidlům patří, aniž by však výčet byl omezující, antigeny, antigenní determinanty, proteiny, glykoproteiny, protilátky, fragmenty protilátek, peptidy, peptidomimetika, která napodobují antigen nebo antigenní determinantu, polypeptidy, glykopeptidy, sacharidy, oligosacharidy, polysacharidy, oligonukleotidy a polynukleotidy. Imunogeny jsou také alergeny, toxiny nebo endotoxiny.
K těmto činidlům patří také činidla zamířená na nebo odvozená z různých patogenních agens,jako jsou např. viry, paraziti, baktérie, houby, fágy, protozoa a rostliny. Z virů jsou to např. retroviry, včetně viru humánní imunodeficience typu 1 a typu 2 a viru T lymfocytární leukémie, herpetické viry, jako virus Herpes simplex typu 1 a typu 2, virus Varicella zoster, cytomegalovirus a virus Epstein-Barrové, orthomyxoviry, jako je virus chřipky A, B a C, paramyxoviry, jako je respirační syncitiální virus, spalničkám podobný virus, virus příušnic a viry parainfluenzy, hepadnaviry, jako je virus hepatitidy B, flaviviry jako je virus hepatitidy C, hepatitidy A a hepatitidy E, virus žluté horečky, virus
Dengue napr.
a virus klíšťové encefalitidy, picornaviry, jako jsou enteroviry, rhinoviry, viry kulhavky a slintavky, a jako je virus zarděnek, adenoviry, ebolavirus, je např. papillomavirus, nádorové viry vakcínie. Kromě toho poliomyelitidy, rhabdoviry, virus j ako j e togaviry, virus rabies, bakuloviry, hantaviry, parvoviry, onkoviry,
DNA viry, papoviry
RNA viry, je virus j ako
RNA imunogeny enterobacterium, poxviry jako zaměřeny nebo pocházet clostridium, z agens j ako j e listeria, jako jsou mohou být bacillus, mycobacterium, pseudomonas, staphylococcus, chlamydia, spirochety, neisseria mohou být také vybrány z eubacteria, imunodeficience: GELDRWEKI mycoplasma, nebo salmonella. Imunogeny následujícíh epitopů humánního viru (gag) : ELDKWAS (gp40) ; IGPGRAFYTTKN a DRFYKTLRA (gp41).
být navázány na peptidy inkorporovány do částice protilátky, glykopeptidy nebo virů, např.
podobné těmto povrchovým mohou
HBV, a takto patří buněk, např.
baktérií (klička V3); ELDKWA (gp41)
Ke glykoproteinúm, které vázající se na kapsidu jádrového antigenu HBV, z povrchu živočišných vyvolávajících meningitidu, nebo strukturám glykopeptidům, nebo fragmenty takových struktur.
Odborníkovi je zřejmé, že velikost imunogenu by měla být taková, aby jeho funkční skupiny neinterferovaly se spojovacím peptidem vázajícím se na kapsidu HBV.
Protein jádrového antigenu HBV
Vzhledem ke své zvláštní povaze představuje protein jádrového antigenu HBV výhodnou platformu pro prezentaci několika imunogenu, podobného nebo odlišného typu, imunitnímu sytému. Podle předkládaného vynálezu je tato -výhoda ještě zesílena užitím peptidu vázajících se na kapsidu HBV jakožto ligandů k navázání požadovaných imunogenu na částici jádrového antigenu HBV. Takové částice obsahují buďto 90 nebo 120 vazebných míst pro ligand, a sice hrotů kapsidy, kdy každý hrot je tvořen dimerem jádrovf Takže více antigenú může být jádrového antigenu HBV pomocí HBV jakožto ligandu. Výsledná imunitní reakci na všechny v ní ant igenu HBV kódující sekvence pro ve vhodném mikrobiálním, částici kapsidu částice je pak schopna obsažené imunogenní mohou být sekvence vyvolat složky.
připraveny polypeptid živočišném
Molecular viz např. Sambrook et al. ,
A Laboratorv Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Polypeptid,který se
Částice jádrového expresí rekombinantní jádrového antigenu HBV nebo rostlinném systému, Cloning,
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. exprimuje obsahuje úplnou sekvenci jádrového jeho mutovanou, zkrácenou nebo derivovanou část, která si uchovává schopnost vytvořit v buňkách použitého expresního systému. Rekombinantní metody vhodné pro přípravu takových částic jádrového antigenu HBV antigenu HBV nebo formu, nebo její částicovou formu jsou odborníkům známy, viz např. U.S. patent č. 4 710 463.
Alternativně se pro získání polypeptidu jádrového antigenu HBV metody chemické syntézy. Na základě sekvence jádrového antigenu HBV je možné provést syntézu na pevné fázi (R.B. Merrifield, Fed. Proced., 21, 412 (1964); R.B. Merrifield, Biochemistry, 3, 1385-90 (1964) a D.R. Mílích et al., J. Immunol., 139, pp. 1223-31 (1987).
Odborníkovi je zřejmé, že i když mutanty nebo varianty sekvence jádrového antigenu HBV mohou ovlivnit reakce s vazebnými peptidy nebo ligandy, předkládaný vynález se týká jak přirozených variant tak i mutací vnesených do kódující sekvence rekombinantními metodami nebo i jiným způsobem, podjednotek jádrového antigenu HBV nebo odpovídajících vazebných peptidů nebo ligandú.
Mutace zbytků jádrového proteinu důležitých pro vazbu peptidů
Metody použité ke stanovení prostorového uspořádání (sestavení) jádrového proteinu byly užity ke kryomikroskopické lokalizaci vazebného místa jádrového proteinu SLLGRMKGA, peptidu vázajícího se na kapsidu HBV, který inhibuje vazbu LHBsAg. Pomocí této metody bylo ukázáno, že peptid je navázán na vrcholy hrotů, a to jak u obálek typu T=3, tak i T=4 (B. Bottcher et al. , Peptides that Block Hepatitis B Virus Assembly: Analysis by Cryomicroscepy, Mutagenesis and Transfection, EMBO J. 17, 6839-95, 1998. Obrazová analýza ukázala, že vazebné místo pro peptid leží na vrcholu hrotů, což odpovídá podle předpokládaného schématu seřazení aminokyselin a prostorového sestavení polypeptidu (Bottcher et al. , 1997) aminokyselinovým zbytků 78 až 92. Jsou zde dva kyselé zbytky (glu77 a asp78) v blízkosti vrcholu jádrového proteinu a vybrané vazebné peptidy obsahují dva konzervativní bazické zbytky. Důležitost těchto zbytků s opačným nábojem pro vazebnou reakci byla potvrzena tím, že mutace kteréhokoliv z těchto dvou kyselých zbytků v proteinu na alanin silně redukovala afinitu peptidu ke změněné obálce jádra. Změna asparagové kyseliny v poloze 78 na alanin snížila afinitu 160x a změna kyseliny glutamové v poloze 77 na alanin snížila afinitu lOOOx. To vede k předpokladu, že jeden z těchto kyselých zbytků nebo oba dva zbytky v proteinu jádrového antigenu HBV vytvářejí alespoň část vazebného místa pro peptidy vázající se na kapsidu HBV.
Tyto výsledky také dokumentují důležitost aminokyselinové sekvence jádrového antigenu HBV v úseku vrcholu hrotu pro vazbu ligandu. Odborníkovi je jasné, že jádrový antigenu HBV z některých kmenů HBV může vyžadovat mutaci, aby bylo dosaženo účinné vazby konkrétního ligandu a imunogenního peptidu, nebo selekci a adaptaci variant ligandu pro účinnou vazbu ke specifické variantě jádrového antigenu HBV.
Fúzní proteiny jádrového antigenu HBV
Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu částice jádrového antigenu HBV, ke kterým se mohou navázat imunogeny prostřednictvím peptidů vázajících se na být částice prezentující jeden či výsledek metod genové fúze.
Při více j edné relevantní kódující sekvence vloží ve plazmidu nebo jiného vektoru kapsidu HBV, mohou imunogenů j akožto takové vhodné nesoucího gen pro metodě se pozici do polypeptid jádrového antigenu HBV.
Fúze s genem β-galaktosidázy z E. coli, užitá ke zvýšení exprese polypeptidu jádrového antigenu HBV, ukázala, že nahrazení prvních dvou aminokyselin antigenu sekvencí jedenácti aminokyselin (osm z aminokonce β-galaktosidázy a tři další vzniklé translací spojovací sekvence použité pro fúzi genů) nemělo žádný škodlivý účinek na získání, antigenicitu nebo morfologii výsledného produktu (S. Stáhl et al., Hepatitis B Virus Core Antigen. Synthesis in Escherichia Coli and Application in Diagnosis, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 1606-10, 1982, B.J. Cohen and J.E. Richmond, Electron Microscopy of Hepatitis B Core Antigen Synthesized in E. Coli”, Nátuře, 296, 677-72, 1982).
Fúzní proteiny jádrového antigenu HBV užitečné podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny např. způsobem popsaným v S.J. Stáhl a K. Murray, Immunogenicity of Peptide Fusions to Hepatitis B Virus Core Antigen, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 6283-87, 1989. Alternativně jsou příklady fúzí řady zejména virových sekvencí kódujících polypeptidy k hlavnímu segmentu jádrového antigenu HBV, kdy vznikají silně imunogenní částice, uvedeny v tabulce na obr. 2. Patří sem také produkt vytvářející částice s vysokou imunogenicitou získaný expresí
160) fúzovaného peptidu VP1 (aminokyselinové zbytky 142 až prostřednictvím ve vektoru z viru vakcínie linkeru se sekvencí 6 aminokyselin preheptapeptidového jádrové sekvence bezprostředně předcházející aminokonci polypeptidu jádrového antigenu HBV Improved Immunogenicity of a Peptide Hepatitis B Core Protein, Nátuře, další užitečné fúzní proteiny (B.E. Clarke et al. ,
Epitope after Fusion to
330, 381-89, 1987) . Pro jádrového antigenu HBV viz také
Ulrich et al., 1998.
Série dalších fúzních proteinů je charakterizována nahrazením úseku bohatého na arginin na karboxykonci polypeptidu sekvencí.
antigenu pre-Sl a . HBV jinou alternativní kódující imunodominantní úsek povrchového
HBV (aminokyselinové zbytky 111 až 165), epitopy pre-S2 a různé segmenty jádrového antigenu
Peptidy obsahující obalového proteinu humánního viru imunodeficience (HIV) byly navázány zbytek 144 polypeptidu jádrového účinně exprimovány v antigenu
E. coli částice, vykazující v podstatě antigen na aminokyselinový HBV. Všechny byly produkt ve formě poskytly stejné morfologické vlastnosti
HBV (Stáhl a Murrav, 1989) .
jako samotný jádrový
Produkty vykazují antigenní reaktivitu jádrového antigenu HBV preparáty polypeptidu jádrového antigenu HBV ve zbytku 144,. testované vzorky vykazovaly s antigenem HBV, zatímco jádrové antigeny HBV plné malou tuto aktivitu. Fúzní proteiny zbytky 111 až 156 nebo 111 až 165 HBV neprojevují žádnou významnou což je výsledek, a, j ako zkráceného reaktivitu délky měly jen velmi nesoucí aminokyselinové z povrchového antigenu reaktivitu povrchového antigenu HBV, konzistentní s konformační závislostí tohoto hlavního který je nebo pravděpodobností, že sekvence je zanořena epitopu, dovnitř částice. Imunogenní reakce na fúzní proteiny však odráží epitopy jejich různých složek.
Imunitní reakce na povrchový antigen HBV je složitá, neboť navíc k epitopúm v úsecích pre-Sl a pre-S2 L-HBsAg a hlavním imunodominantním úseku a, je zde řada determinant variabilních subtypů v dalších úsecích S polypeptidu povrchového antigenu HBV (G.L. Le Bouvier, The Heterogeneity of Australia Antigen, J. Infect. Dis. 123, 671-75, 1971, W.H. Bancroft et al., Detection of Additional Antigenic Determinants of Hepatitis B Antigen, J. Immunol. 109, 842-48,
1972, A.-M. Couroucé-Pauty a P.V.Holland, Summary of Workshop A2: HBsAg and its Subtypes, in Viral Hepatitis. G.N. Vyas, S.N. Cohen a K. Schmid (eds.), Philadelphia, USA: Franklin Institute Press, 649-54, 1978. Kódující sekvence povrchového antigenu HBV stanovené z HBV DNA klonované ze séra různých subtypů vykazují rozdíly v odpovídajících proteinových sekvencích. Avšak jediná specifická mutace zjevně kritického aminokyselinového zbytku neovlivňuje změnu z jednoho sérologického subtypu (y) na jiný (d) , ale jedna další mutace indukuje postupnou změnu, kdy tatáž molekula pak vykazuje jak y tak i d reaktivitu a imunogenicitu (P.G. Ashton-Rickardt a
K. Murray, Mutations that Change the Immunological Subtype of Hepatitis B Virus Surface Antigen and Distinguish Between Antigenic and Immunogenic Determination, J. Med. Virol., 29, 204-19, 1989. Mutace byly vytvořeny přímo v nebo blízko konformačně senzitivního imunodominantního úseku a a byly všechny v segmentu jádrového antigenu HBV použitého ve fúzích jádrového antigenu HBV popsaných výše.
Dopad mutací na subtypovou spécifitu indukovaných protilátek vedl k návrhu, že fúzní proteiny by také mohly poskytnout prostředek ke změně specifity pokud jsou závislé na arginin, napodobující další pozitivně nebo negativně epitopy, glycinu mutantu, zejména
145 na a na reakce na požadované konformaci.
přirozenou
Mutace únikovou nabité aminokyseliny (lysin nebo kyselina glutamová) byly připraveny v HBcSm-156 pro komparativní studie humorální a buněčné imunitní reakce ( A.L. Shiau a K. Murray, Mutated Epitopes of Hepatitis B Surface Antigen Fused to the Core Antigen of the Virus Induce Antibodies That React with the Nátuře Surface Artigen, J. Med. Virol. 51, 159-66, 1997). Všechny byly účinně exprimovány v E. coli a poskytly podle očekávání částicové produkty vykazující silnou antigenicitu HBV jádra a indukovaly u králíků vysoký titr protilátek proti jádrovému antigenu HBV.
Stejně jako výchozí protein HBcSih-i56 tak i tři mutanty v reziduu 145 projevovaly minimální interakci s protilátkami proti povrchovému antigenu HBV v radioimunotestu na pevné fázi AUS-RIA (Abbott Laboratories) nebo v testu precipitace protilátek v roztoku. Avšak všechny vykazují silnou reakci s králičím anti-povrchovým HBV sérem v imunoblotovacích experimentech po elektroforéze v akrylamidovéím gelu za denaturujících podmínek (A.L. Shiau, Immunological Aspects of Hepatitis B Virus Core Antigen and its Derivatives, PhD Thesis, University of Edinburgh, UK, 1993. Při vysoké koncentraci původní i mutované proteiny také dávají slabou pozitivní reakci s protilátkou proti povrchovému antigenu HBV při zachycení na pevném povrchu potaženém protilátkou proti povrchovému antigenu HBV, pravděpodobně v důsledku nějakého poškození částic dovolujícímu přístup anti-HBsAg molekul (Shiau a Murray, 1997) .
Imunizovaní králíci byli užiti k vyšetření reakci T lymfocytů na fúzní proteiny a také produkci protilátek.
Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) odebírané v různých časech po imunizaci byly použity v proliferačním buněčném testu založeném na inkorporaci [3H]-thymidinu v reakci na expozici jádrovému antigenu HBV nebo fúznímu proteinu užitému pro imunizaci. Ve všech případech byla zjištěna silná reakce, přičemž podle očekávání fúzní proteiny vykazovaly vyšší index stimulace než jádrový antigen HBV a povrchový antigen HBV působil jako nej horší stimulans. Imunoprecipitační test s dvojí protilátkou (C.J. Burrell et al., Rapid Detection of Hepatitis B Surface Antigen by Double Antibody Radioimmunoassay, J. Med. Virol. 3, 1926, 1979) s povrchovým antigenem [125I] -HBV byl použit ke stanovení anti-HBs vevzorcích séra a ukázal očekávanou pozitivní reakci na HBcSiii-156. Argininová mutanta dávala také pozitivní reakci, i když poněkud slabší než původní molekula, a slabá reakce byla získána pro mutantu s kyselinou glutamovou a žádná reakce pro lysinovou mutantu.
Takže výsledky ukázaly, že fúzní protein (označený HBcSi45R) nesoucí mutaci argininl45 působil jako silné stimulans T lymfocytů a indukoval protilátky se širokou reakční specifitou.
Další skupina fúzí různých částí polypeptidu povrchového antigenu HBV, obsahujících mutantu v aminokyselinovém zbytku 145 s polypeptidem jádrového antigenu HBV byly připraveny k vysvětlení účinku celkové velikosti, počtu a pozice různých dalších složek imunogenicity produktu (Shiau, 1993). Tyto konstrukty jsou také uvedeny na obr. 2, a společně s ještě dalšími fúzemi poskytují produkt ve formě částice mající morfologii částice jádrového antigenu HBV, ačkoliv fúze s fragmentem HBsm-i56 aminokonce jádrového antigenu HBV byly méně vhodné, neboř tento produkt tvořil nerozpustné agregáty.
Tato skupina produktů, podobně jako předchozí se segmenty HBcSih-156, projevovala malou nebo žádnou reaktivitu s protilátkou proti povrchovému antigenu HBV v pevné fázi nebo v roztoku, avšak při vychytávání protilátkou proti jádrovému antigenu HBV na pevném fázi, projevovaly podobnou reaktivitu s protilátkou k povrchovému antigenu HBV, a ta byla poněkud vyšší (přibližně dvakrát), s fúzí obsahující segmenty pre-Sl a pre-S2 navíc k HBcSm-156 · Stimulace inhibice proliferace T lymfocytů byla opět silná u všech fúzních proteinů a ty, které obsahovaly segmenty pre-S a také nativní nebo mutované sekvence HBcSm-156 poskytovaly nej silnější reakci. Vložení sekvencí pre-Sl a pre-S2 mezi sekvence HBcl44 a HBcSm-156 (buďto mutované nebo divokého typu) vedlo k vyšší hladině protilátek v imunoprecipitačním testu s dvojí protilátkou ve srovnání s fúzemi postrádajícími pre-S segmenty, ale vložení druhé sekvence HBcSm-i56 mezi HBcl44 a pre-S sekvenci již nevedlo k dalšímu zvýšení v žádné ze sledovaných reakcí. Nejdelší ze sekvencí navázaných k polypeptidu jádrového antigenu HBV na prolinu 144, a sice 165 aminokyselin, neměla zjevně žádný negativní účinek na výtěžek nebo funkční vlastnosti fúzního proteinu.
Jádrový protein (HCc) viru hepatitidy C (HCV) byl také fúzován, jako částečný peptid nebo jako vícenásobné úplné kopie, s polypeptidem jádrového antigenu HBV zkráceným v poloze valinu 149 (A. Yoshikawa et al. , Chimeric Hepatitis B Virus Core Particles with Parts of Copies of the Hepatitis C Virus Core Protein, J. Virol. 67, 6064-70, 1993). Fúze nesoucí HCc aminokyselinové zbytky 39 až 75 projevovaly zanedbatelnou antigenicitu HCc, avšak zbytky 1 až 91 nebo celá sekvence 180 aminokyselin vedla k pozitivní reakci a antigenicita se zvyšovala téměř aritmeticky s rostoucím počtem kopií (až do 4) úseků 1 až 180 pospojovaných krátkými spojkami (linkery). Elektronmikroskopie ukázala, že fúze nesoucí jednu kopii úseku 1 až 91 HCc vytvářela částice morfologicky shodné s polypeptidem jádrového antigenu HBV, avšak tři kopie HCc plné délky výrazně poškodily strukturu a produkt byl velmi citlivý k proteolýze, avšak přesto si tento materiál udržel antigenicitu jádra HBV. Zatímco nejdelší fúzní protein nesl více než 720 dalších aminokyselin, limit pro vytvoření částice typu jádrového antigenu HBV je zřejmě podstatně nižší.
Sekvence PrcS byla použita v jiných studiích, kdy se zkoumala vliv pozice fúze k HbcAg na imunogenicitu. Borisova et al. (1989) připravila fúze se segmenty pre-Sl (zbytky 20 až 68, 20 až 69 a 69 až 106) nebo celým pre-S2 navázaným na jádrový antigen HBV zkrácený v prolinu 144 nebo s inzercí v této poloze do sekvence celého jádrového antigenu HBV. V těchto a dalších analogických konstruktech se zbytky 56 až 103 obalového proteinu bovinního leukemického viru (BLV) nebo zbytky 78 až 129 transmembránového proteinu (gp41) HIV, se mělo za to, že sekvence fúzované s jádrovým antigenem HBV byly exponovány na povrchu částice, a byly všechny popsány jako antigenní i imunogenní a C-koncová doména bohatá na arginin měla zjevně jen malý negativní účinek.
F. Schódel et al. (The Posítion of Heterologous Epitopes Inserted in Hepatitis B Virus Core Particles Determines Their Immunogenicity, J. Virol. 6, 106-14, 1992) zkoumali účinek polohy fúze na antigenicitu a imunitní reakci u inbredních myší, když byly segmenty pre-Sl nebo pre-S2 navázány na aminokonec jádrového antigenu HBV plné délky (buďto přímo nebo prostřednictvím pre-jádrové sekvence) nebo na karboxylový konec zkráceného jádrového antigenu HBV, a další konstrukty obsahovaly pre-Sl segment mezi zbytky 75 až 83 jádrového antigenu HBV a také pre-S2 fragment na zkráceném karboxylovém konci (prolin 156) .
Úplná analýza ukázala, že sekvence pre-Sl fúzovaná s aminokoncem jádrového antigenu HBV prostřednictvím krátké pre-jádrové sekvence byla antigenní, avšak fúzována přímo k aminokonci nikoliv, a i když obě měly stejnou imunogenicitu jádrového antigenu HBV, fúze obsahující pre-jádrovou sekvenci stimulovala mnohem silnější anti-pre-Sl reakci. Sekvence preS2 na konci zkráceného jádrového antigenu HBV byla antigenní a imunogenní v obdobné míře v obou kontextech, ale sekvence pre-Sl fúzovaní vnitřně tak, že nahradila aminokyselinové zbytky 76 až 82 (které zahrnují hlavní epitop jádrového antigenu HBV) byla podstatně více antigenní a dramaticky více imunogenní než když byla fúzována na A-konec. Jak se dalo očekávat, antigenicita a imunogenicita jádrového antigenu HBV byla silně redukována ve vnitřních fúzních proteinech. Nahrazení vnitřní sekvence jádrového antigenu HBV (zbytky 78 až 82) fragmentem povrchového antigenu HBV imunodominantní
epitop a vedlo k produktu, který také vykazoval pozitivní
antigenicitu a imunogenicitu jádrového antigenu HBV (G.
Borisova et al. , Hybrid Hepatitis B Virus Nucleocapsid Bearing
an Immunodominant Region from Hepatitis B Surface Antigen, J. Virol. 67, 3696-3701, 1993).
Jako další alternativa, nebo navíc k fúzním proteinům popsaným výše, imunogenní složky mohou být navázány na jádrový antigen HBV metodami chemického zesítění.
Překrývání aminokyselinové sekvence jádrového antigenu HBV s fyzickou strukturou navrženou Bóttcherem et al. (1997) pomáhá k vysvětlení nízké antigenicity sekvence fúzované ke karboxykonci jádrového antigenu HBV nebo v jeho blízkosti, zatímco fúze na A-konci mohou využít výhody flexibilních spojovacích sekvencí, které umožní umístit imunogen dále od relativně uzavřeného prostoru u paty hrotů. Lokalizace imunodominantního epitopu jádrového antigenu HBV (aminokyselinové zbytky 78 až 82, Salfeld et al. , 1989) na vrcholu hrotů ukazuje a atraktivnost této lokalizace pro vkládání nebo navazování peptidových imunogenů vázajících se na kapsidu. V principu všechny tyto pozice mohou být využity současně ke zvýšení počtu a/nebo diverzity epitopů prezentovaných danou částicí jádrového antigenu HBV.
Peptidy vázající se na kapsidu HBV použité k ligaci imunogenů na částice jádrového antigenu HBV
Jak bylo již uvedeno výše, požadované imunogeny mohou být navázány na částice jádrového antigenu HBV pomocí ligandu, kterým je peptid vázající se na kapsidu HBV. Takové peptidy vázající se na kapsidu HBV jsou izolované purifikované peptidy. Tyto peptidy vázající se na kapsidu HBV výhodně inhibují a narušují sestavení virové částice HBV tím, že blokují interakci mezi jádrovým proteinem HBV a povrchovým proteinem HBV.
Výhodně k peptidům vázajícím se na kapsidu HBV patří peptidy a jejich fragmenty, analogy a homology, které jsou dlouhé 2 až 20 aminokyselin. Výhodněji jsou peptidy dlouhé 3 až 15 aminokyselin. K těmto peptidům patří ty, které jsou uvedeny v následující tabulce a také jejich fragmenty a analogy.
Termín fragment podle předkládaného vynálezu označuje aminokyselinovou sekvenci, která je kratší než peptid, ze kterého pochází, přičemž si uchovává biologickou v podstatě podobnou původnímu peptidu. Takový obsahuje alespoň 2 aminokyseliny.
podle peptidů, peptidu v
K dalším příkladům analogů patří aktivitu fragment
Termín analog aminokyselinové sekvence lišící se od původního vynálezu označuje což jsou až 4 variace zejména analogy aminokyselinách.
peptidy s malými změnami v aminokyselinové sekvenci oproti peptidům zde uvedeným jako příklady. Analogy tvoří zejména peptidy obsahující konzervativní záměny aminokyselin, tj . záměny odehrávající se v rámci rodiny aminokyselin příbuzných svými postranními řetězci .
Geneticky kódované aminokyseliny mohou být rozděleny do 4 skupin: 1) kyselé: kyselina asparagová a kyselina glutamová, 2) bazické: lysin, arginin, histidin, 3) nepolární: alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a 4) nenabité polární: glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan a tyrosin se někdy společně označují jako aromatické aminokyseliny. Pokud jde o peptidy vázající se na kapsidu HBV, je výhodné zaměnit jednu nebo více aminokyselin. Odborník snadno zhodnotí význam takové záměny.
Termín homolog podle vynálezu označuje peptidové fragmenty, které sdílejí alespoň 60% identitu na úrovni aminokyselinové sekvence, výhodně 75% identitu a v podstatě mají stejnou biologickou aktivitu jako původní peptid. Tato výhodná procentuální identita odráží malou velikost peptidu.
K užitečným peptidům vázajícím se na kapsidu HBV patří peptidy založené na peptidech popsaných v publikaci Dyson a Murray, 1996. Tyto peptidy byly získány syntézou po náhodné mutagnezei zbytků obklopujících peptid LLGRMK fúzovaný do fága B1 a reselekcí proti jádrovému antigenu HBV bioscreeningem pro vyhledání derivátů, které se váží na antigen se zvýšenou afinitou. Elektronová kryomikroskopie s vysokým rozlišením ukázala, že peptidy vázající se na kapsidu HBV se váží na vrcholy hrotů obálky tvořené jádrovým protein HBV. Inhibující účinek peptidů na interakci mezi proteinem jádrového antigenu HBV a proteinem povrchového antigenu HBV v infikovaných buňkách byl zkoumán pomocí transfekce permeabilizovaných hepatomových buněk Hep G2 replikačně kompetentním plazmidem nesoucím dimer typu hlava k ocasu HBV genomu za přítomnosti nebo absence peptidu. Viz také (Bóttcher et al., 1998).
Peptidy vázající se na kapsidu HBV nesoucí sekvenci
LLGRMK snižují výtěžek HBV u transfekovaných hepatomových buněčných kultur, a sice způsobem závislým na dávce a s relativní účinností odrážející hodnoty IC50 peptidů v inhibici reakce mezi jádrovým entigenem HBV a povrchovým antigenem L-HBV v roztoku.
Peptidy vázající se na kapsidu HBV mají výhodně poloviční maximální koncentraci (IC50) nižší než 10, výhodněji nižší než 5, ještě výhodněji nižší než 2 a nejvýhodněji nižší než 0,5 μΜ. K výhodným peptidům patří (avšak výčet není omezující): SLLGRMKG(β-Α)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA a RSLLGRMKGA(β-Α)C nebo z nich odvozené peptidy. Alternativně to mohou být peptidy jako ALLGRMKG, který inhibuje interakci mezi dlouhým povrchovým antigenem HBV (L HBsAg) a HBcAg s poloviční maximální koncentrací (IC50) přibližně 10,0 μΜ.
Příklady peptidů vázající se na kapsidu HBV jsou uvedeny v následujícím seznamu, kde KD rel (nM) je relativní disociační konstanta reakce mezi jádrovým antigenem HBV a fd fúzním fágem nesoucím peptidovou sekvenci v aminokoncovém úseku gpIII proteinu (viz Dyson a Murray, 1995).
Sekvence Kr>rel (nM)
ADGALLGRMKGA 152 ± 5
ADGALLGRMKPA 767 ± 8
ADGSLLGRMKPA 322 + 50
ADGALLGRMKRA 181 ± 12
ADGTLLGRMKLA 20 ± 2
ADGSLLGRMKGA 1,7 ± 0,3
ADRSLLGRMKGA 1,09 ± 0,02
ADGSRSSLLGRMKGA 1,96 ± 0,32
ADGAHSSLLGRMKGA 1,72 ± 0,17
ADGHRS SLLGRMKGA 1,40 + 0,13
ADGPRSSLLGRMKGA 0,84 + ,07
ADGAHRSLLGRMKGA 0,94 + 0,12
ADGYQRSLLGRMKGA 0,88 ± 0,08
ADGTQRSLLGRMKGA 0,84 + 0, 06
ADGMHRSLLGRMKGA 0,55 + 0,03
Tyto peptidy, které napodobují cytoplazmatický úsek L HBsAg, byly identifikovány selekcí z knihovny náhodných hexapeptidů exprimované na vláknitých fágách (fágový displej) a jejich afinity k jádrovému antigenu HBV v roztoku byly stanoveny ve formě asociované s fágem. Další uvedené petidy (seznam uveden dále) jsou také příklady peptidu vázajících se na kapsidu HBV a v tabulce uvedené hodnoty IC50 (μΜ) představují koncentraci peptidu potřebnou k 50% inhibici vazby L HBsAg na jádrový antigen HBV, údaj N/D označuje, že nebyla pozorovatelná žádná inhibice a β-Α představuje β-alanin (viz Dyson a Murray, 1995):
Sekvence
ALLGRMKG
LLGRMKG
LGRMKG
GRMKG
LLGRM
CLLGRMKC
ALLPRMKG
SLLGRMKG
SLLGRMK
ICra μΜ
11,0 ± ,08
46,2 ± 7,4
980 ± 157
N/D
N/D
652 ± 74
N/D
6,4 ± 0,7
40,7 ± 4,8
SLLGRMKGA
2,4 ± 0,2
GSLLGRMKGA 0,79 ± 0,23
DGSLLGRMKGAA 3,0 ± 0,4
ADGSLLGRMKGAAG 4,5 ± 0,8
ACSLLGRMKG 26,2 ± 5,0
SLLGRMKG(β-Α)C 1,8 ± 0,4
RSLLGRMKGA 0,29 ± 0,02
HRSLLGRMKGA 0,50 ± 0,04
MHRSLLGRMKGA 0,80 ± 0,10
RSLLGRMKGA(β-Α) C 0,29 ± 0,03
MHRSLLGRMKGAG(β-Α) GC 3,80 ± 0,69
Peptidy vázající se na kapsidu HBV, jejich fragmenty, analogy a homology, které slouží jako ligandy k navázání imunogenů na částice jádrového antigenu HBV, jsou výhodně syntetizovány obvyklými metodami syntézy peptidu,např. chemickými metodami. Alternativně odborník může syntetizovat kterýkoliv z uvedených peptidů pomocí automatického syntetizátoru peptidů, např. metodou s t-BOC (viz např. L.A. Carpino, J. Amer. Chem. Soc. 79, 4427, 1957). Peptidy mohou být také připraveny chemickým štěpením proteinů nebo jinými metodami. Peptidy se izolují tak, aby byly v podstatě bez chemických prekurzorů a dalších přísad, pokud se připravují chemickou syntézou nebo chemickým štěpením proteinů.
Alternativně se peptidy vázající se na kapsidu HBV připravují standardními metodami genového inženýrství, tj . technikami rekombinantni DNA, v hostitelské buňce transformované sekvencí nukleové kyseliny kódující peptid, klonováním a expresí DNA fragmentu nesoucího kódující sekvenci vybraného peptidu v hostitelském mikroorganismu nebo buňce. Když se peptidy připravují rekombinantni technologií ve vhodně transformovaných buňkách, peptidy se purifikují od kultivačního média a/nebo hostitelských buněk standardními postupy. Rekombinantní peptidy se izolují, takže jsou v podstatě bez buněčného materiálu nebo kultivačního média, když jsou připraveny technikou rekombinantní DNA. Kódující sekvence pro peptid může být připravena synteticky, nebo známým způsobem odvozena z virové RNA nebo z dostupných plazmidů obsahujících cDNA.
Pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu výše uvedené peptidy vloží do známých nebo alternativních konstruktů pro zvýšení produkce peptidu nebo jeho vazby na jádrový antigen HBV. Tak např.peptidy mohou být případně fúzovány s jiným peptidovým nebo proteinovým partnerem. Odborník snadno zkonstruuje peptid asociovaný s vybraným fúzním partnerem, jako je např. jiný peptid, nebo jiné peptidy či proteiny, které fúzi přinesou požadované vlastnosti.
Systémy vhodné pro klonování a expresi peptidů vázajících se na kapsidu HBV v různých mikroorganismech a buňkách, k nimž např. patří E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, a dále savčí, kvasinkové nebo hmyzí buňky, a také rostlinné buňky, včetně vhodných vektorů, jsou odborníkům známy a jsou dostupné z různých veřejných laboratoří a sbírek a také od komerčních dodavatelů.
Peptidy vázající se na kapsidu HBV, připravené at rekombinantní technologií nebo chemickou syntézou, se purifikují konvenčními purifikačními metodami. Odborník snadno určí požadovaný stupeň čistoty nutný pro požadovanou aplikaci, kde se mají peptidy použít.
Je třeba chápat, že výběr linkeru peptidu vázající se na kapsidu HBV závisí, do jisté míry, na povaze konkrétního polypeptidu jádrového antigenu HBV vytvářejícícho částici jádrového antigenu HBV.tak např. částice jádrového antigenu HBV z různých kmenů viru budou vyžadovat jiné ligandy peptidu vázajícího se na kapsidu HBV, neboť obsahují odlišné aminokyselin sekvence ve vazebném místě ligandu nebo v jeho blízkosti v daném polypeptidu jádrového antigenu HBV.
Navázání peptidů vázajících se na kapsidu HBV k imunogenům
Peptidy vázající se na kapsidu HBV mohou být pro vytvoření imunogenů vázajících se na kapsidu HBV k požadovaným imunogenům navázány prostřednictvím peptidové vazby. Když je imunogen sám peptid, lze toho obvykle dosáhnou v jediném syntetickém kroku, a anebo expresí v transformované buňce odpovídající kódující sekvence, peptidu, který obsahuje sekvenci peptidu vázajícího se na kapsidu HBV navázanou na sekvenci imunogenu, obvykle a výhodně spojené prostřednictvím tří až pěti (typicky tří) glycinových zbytků, což poskytne dostatečnou flexibilitu spojení mezi oběma složkami tohoto dlouhého peptidu. Alternativně se peptid naváže na imunogen zesítěním.
Orientace vazby mezi složkami, tj. mezi peptidem a imunogenem, může ovlivnit účinnost konečného procesu zesítění imunogenu vázajícího se na kapsidu HBV na částici jádrového antigenu HBV. Alternativně z několika imunogenů vázajících se na kapsidu HBV, které mají být zesítěny na částici jádrového antigenu HBV, daný imunogen může být umístěn na aminokonci peptidu, ke kterému je navázán, zatímco jiný imunogen může být umístěn na karboxykonci peptidu, ke kterému je navázán. V některých případech může být výhodné umístit stejné nebo různé imunogeny na každý z konců peptidu vázajícího se na kapsidu HBV. Takové variace v organizaci komplexů peptid vázající se na kapsidu HBV - imonugen, které se zesíťují na částici jádrového antigenu HBV, výhodně poskytují vysoce multikomponentní nebo multivalentní částice jádrového antigenu HBV (viz obr. 1).
- 27 Takže orientace imunogenu vázající se na kapsidu HBV, který se zesítěn na částici jádrového antigenu HBV, je důležitá pro výslednou imunogenicitu nebo multivalentnost výsledné částice. Vyšší imunogenicitu nebo multivalkentnost lze očekávat, když je imunogen orientován k aminkonci peptidu vázajícího se na kapsidu HBV. Taková orientace, která umožňuje větší flexibilitu, je také výhodná pro imunogeny větších velikostí.
Navázání imunogenu vázajících se na kapsidu na částici jádrového antigenu HBV
Imunogeny vázající se na kapsidu HBV mohou být zesítěny na částici jádrového antigenu HBV užitím obvyklého zesilujícího činidla. K takovým zesilujícím činidlům patří např. multifunkční zesíúující činidla, jako je např. glutaraldehyd, sukcinaldehyd, oktandialdehyd a glyoxol. Další zesíúující činidla jsou uvedena v publikaci Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1997. K dalším zesíúujícím činidlům patří např. hydrochlorid l-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC), který spojuje sousedící primární aminoskupinu a karboxylovou skupinu do formy amidové vazby. Když je přidáno ke směsi imunogenu vázajícího se na kapsidu HBV a částic jádrového antigenu HBV, činidlo kovalentně zesíúuje dostupné lysinové složky peptidu k sousedícímu aspartátu nebo glutamátu z jádrového antigenu HBV.
Je třeba chápat, že poměr různých imunogenu navázaných na danou částici jádrového antigenu HBV, se mění v závislosti na relativním zastoupení imunogenu ve směsi použité pro zesítění imunogenů vázajících se na kapsidu HBV na částice jádrového antigenu HBV.
Léčivé přípravky podle předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález také poskytuje přípravky vhodné k profylaxi nebo léčení pacientů multivalentními nebo vícesložkovými částicemi jádrového antigenu HBV podle předkládaného vynálezu. Jakýkoliv jedinec, tzn. člověk a jakýkoliv jiný savec, a také jakýkoliv živočich, mohou být léčeni pomocí částic jádrového antigenu HBV. Léčivé přípravky podle vynálezu obsahují farmaceuticky účinné množství částic jádrového antigenu HBV, tj . takové množství, které je účinné při imunizaci proti jedné nebo více nemocem nebo při léčení jedné nebo více nemocí u pacienta, kterému je léčivý přípravek podáván po určitý časový interval. Profylaktický přípravek obsahuje profylakticky účinné množství částic jádrového antigenu HBV, tj. takové množství, které je účinné při profylaxi jedné nebo více nemocí u jedince, kterému je léčivý přípravek podáván po určitý časový interval.
V případech, kdy částice jádrového antigenu HBV obsahuje více imunogenů různých typů, přípravky a vakcíny, které je obsahují, mohou být využity k vyvolání zesílené imunitní reakce u jedince na každou ze složek složeného imunogenu. V případě, kdy částice jádrového antigenu HBV obsahuje více imunogenů stejného typu, přípravky a vakcíny, které je obsahují, mohou být využity k vyvolání zesílené imunitní reakce u jedince ke společnému imunogenu. Tyto přípravky a vakcíny jsou charakterizovány zesílenou monovalentností a silou ve srovnání s konvenční monoterapií.
Přípravky obsahující multikomponentní nebo multivalentní částice jádrového antigenu HBV podle vynálezu jsou podávány samotné nebo jako složky farmaceutických nebo profylaktických přípravků, buďto s nebo bez adjuvans, a mohou to být také přípravky s řízeným uvolňováním. Přípravky dále obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče a ředidla, vhodné pro podávání za účelem léčení infekcí. Vhodné farmaceuticky přijatelné jsou fyziologicky inertní a/nebo fyziologicky inertní netoxické. Odborníkovi jsou známy mnohé takové nosiče a požadované aplikace. K příkladům omezuj ící, kalciumfosfát, nosiče a/nebo vhodné patří, roztok, se vyberou podle aniž by výčet byl laktóza, sacharóza, sterilní fyziologický želatina, dextrin, olej , olivový olej , nebo ředidla mohou peptin, arašídový
Kromě toho nosiče činidla, jako je kamenec, oxid hlinitý, hydroxid hlinitý, sezamový olej a voda, obsahovat zpožďovací nebo glyceroldistearát, samotné nebo Kromě toho mohou být užity konvenční s pomalým uvolňováním obsahující např.
nebo multivalentní obsahovat i další
Tak např. přípravek glycerolmonostearát v kombinaci s vosky, polymerové přípravky rozpustná skla.
Přípravky obsahující vícesložkové částice jádrového antigenu HBV mohou terapeutická nebo profylaktická činidla, může obsahovat koktejl více činidel vhodných k léčení nebo prevenci infekcí. Takový koktejl např. obsahuje interferony analogy nukleosidu a/nebo N-acetylcystein.
Případně může přípravek obsahující antigenu HBV dále obsahovat modifikátory jako jsou adjuvans nebo cytokiny, které jsou další indukci protilátek a reakce T lymfocytú obvyklá adj uvans konzervační látky, i antigenní proteiny.
konzervační látky
K takovým módifikátořům patří kamenci, muramyldipeptidy, nebo další stabilizátory stabilizátory, optimalizovány formulaci pro patří chlorylbutynol, siřičitý, propylgalát, částice jádrového imunitního systému, užitečné pro u pacientů, založená na chemické
Typicky j sou adj uvans tak, aby z hlediska účinnosti poskytly nej lepší danou aplikaci. K vhodným konzervačním látkám kaliumsorbát, kyselina sorbová, oxid
Vhodné množství parabeny, glycerin a fenol.
přípravku se stanoví na základě požadované hladiny reakce. Obecně přípravky obsahující částice jádrového antigenu HBV obsahují obvykle 5 pg až 200 μg částic.
Tyto přípravky se podávají ve formě jednoho nebo série několika očkování, např. 3 očkování v intervalu 2 až 6 měsíců. Vhodná dávka se stanoví na základě posouzení ošetřujícího lékaře, který vezme v úvahu takové faktory, jako je např.
zdravotní stav pacienta, hmotnost, věk, a také obvyklé dávky j ednotlivých imunogenů, když j sou podávány samostatně v monoterapii.
Po zlepšení stavu pacienta nebo při pravděpodobnosti zvýšené expozice danému patogenu, lze v případě nutnosti podat udržovací dávku přípravku obsahujícího částice jádrového antigenu HBV. Pak mohou být dávky nebo frekvence podávání přípravku, nebo oboje, sníženy na úroveň, kdy je udržován požadovaný účinek. V tomto bodě se může léčení zastavit nebo přerušit nebo ukončit. Avšak pacienti mohou vyžadovat intermitentní léčení po dlouhý čas, pokud se objeví nežádoucí stav.
Přípravky obsahující multikomponentní nebo multivalentní částice jádrového antigenu HBV, se mohou podávat jakýmkoliv vhodným způsobem, např. parenterálním, zejména intramuskulárním nebo subkutánním způsobem, a také perorálně. Lze užít i jiného způsobu podávání, např. způsob pulmonární, nasální, aurální, anální, dermální, okulární, intravenózní, intraarteriální, intraperitoneální, mukozální, sublingvální, subkutánní a intrakraniální.
Imunogenní částice jádrového antigenu HBV podle předkládaného vynálezu se mohou užít pro aktivní léčení pacientů infikovaných HBV, aby se inhibovala, snížila nebo zpomalila proliferace viru v těle. Léčivé přípravky obsahují imunogenní částice jádrového antigenu HBV schopné znemožnit, inhibovat anebo bránit sestavovacímu mechanismu viru. Léčivé přípravky jsou formulovány s nosiči a ředidly a jednou nebo více imunogenními částicemi jádrového antigenu HBV podle vynálezu. Nosiče a ředidla byly již diskutovány výše ve spojení s některými přípravky a jsou odborníkovi dobře známy.
Výroba přípravků nebo vakcín obsahujících jako účinnou látku imunogenní částice jádrového antigenu HBV, se provádí formulací do injikovaných přípravků nebo vakcín, buďto ve formě tekutého roztoku nebo suspenze. Mohou být také připraveny tuhé formy vhodné pro vytvoření roztok nebo suspenzi v tekutině před injikováním. Přípravky mohou být v některých případech také emulgovány nebo enkapsulovány do liposomů nebo do tekutých skel pro vytvoření lékových forem s kontinuálním a/nebo prodlouženým uvolňováním léčiva. Alternativně jsou přípravky ve formě aerosolu nebo spreje. Mohou být také součástí transdermálních náplastí. Účinná složka může být smíchána s řadou různých excipientů, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s účinnou složkou. K takovým excipientům patří např. Freundovo neúplné adjuvans, bakteriální lipopolysacharidy, iontoměniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, muramyldipeptid, lecitin, pufrující látky, látky založené na celulóze a polyethylenglykol.
Výhodně vakcíny obsahující částice jádrového antigenu HBV podle vynálezu jsou kombinované vakcíny, obsahující několik různých imunogenů. K takovým vakcínám patří např. kombinované vakcíny obsahující imunogeny proti dvěma nebo více patogenním agens z následujících: záškrt, tetanus, černý kašel, Haemophillus influenza, dětská obrna, spalničky, příušnice, zarděnky, plané neštovice, hepatitida typu B a typu A a pneumokoková pneumonie. K dalším výhodným vakcínám patří vakcíny pro vakcinaci před cestami, např. obsahující imunogeny proti dvěma nebo více patogenním agens z následujících: žlutá horečka, hepatitida B, hepatitida A, tyfová horečka, meningokoková encefalitida a cholera.
Přípravky obsahující částice jádrového antigenu HBV podle vynálezu se mohou užít také v imunoterapeutických režimech pro desenzibilaci u pacientů k jednomu nebo více alergenům,jako jsou např. alergeny zvířat, hmyzu, rostlin nebo atmosférické či inhalované alergeny.
Podle alternativního provedení předkládaného vynálezu se částice jádrového antigenu HBV mohou použít k vyvolání protilátek proti požadovaným imunogenům při imunoterapii nebo pro diagnostické účely. Tak např. protilátky vytvořené v pacientovi po očkování částicemi jádrového antigenu HBV se mohou izolovat a pak užít v čisté formě. Alternativně se takové protilátky nebo odpovídající B lymfocyty izolované z pacientů mohou užít pro přípravu monoklonálních protilátek s využitím standardních metod.
Detekční metody podle vynálezu
Částice jádrového antigenu HBV podle předkládaného vynálezu se mohou užít v celé řadě konvenčních testů, testů zejména v testech formátu imunotestu (immunoassay) pro diagnostiku infekcí nebo expozici infekčním agens. Takové využití se realizuje tak, že složky konstruktu podle vynálezu představující peptid vázající se na kapsidu HBV jsou asociovány s diagnostickou značkou, jako je např. chemický markér, toxin nebo jiný protein nebo peptid. Tak např. peptid vázající se na kapsidu HBV se může asociovat s obvyklými značkami, které jsou schopny, buďto samy nebo v kombinaci s jinou sloučeninou nebo přípravkem, poskytnout detekovatelný signál, který je indikátorem přítomnosti hledaného analytu ve vzorku, po expozici imunogenu navázanému na daný peptid vázající se na jádrový antigen. Detekovatelné značky se vyberou z mnoha sloučenin a přípravků, které jsou odborníkům pro tento účel diagnostických testů známy.
Vynález proto není omezen žádným konkrétním formátem testu a zahrnuje v podstatě všechny formáty testů, které jsou odborníkům známy. Pro pohodlí uživatele všechny reagencie potřebné k provedení testu mohou být poskytnuty ve formě diagnostické soupravy (kitu). Taková souprava pak obsahuje mikrotitrační destičku, na kterou byly preadsorobovány částice jádrového antigenu HBV podle vynálezu, různá ředidla a pufry, značené konjugáty pro detekci specificky navázaných peptidových imunogenů vázající se na kapsidu HBV a také další signál generující reagencie, jako jsou enzymové substráty, kofaktory a chromogeny. Další složky soupravy mohou být odborníkem snadno určeny.
Alternativně se částice jádrového antigenu HBV podle vynálezu mohou užít v imunologických diagnostických testech nyní běžně dostupných pro detekci patogenů, jako je radioimunoesej nebo ELISA (test s enzymem vázaným ne imunosorbent) .
V jednom provedení předkládného vynálezu se vzorek, který se má testovat na přítomnost protilátek k různým imunogenům, přivede do kontaktu s částicemi jádrového antigenu HBV obsahujícími detekovatelně označené imunogeny vázající se na kapsidu HBV mající různé imunogenní složky, a sice na dobu dostačující k tomu, aby jakákoliv protilátka ze vzorku vytvořila komplex s jedním nebo více imunogeny vázajícími se na kapsidu HBV. Pak se detekují komplexy vytvořené mezi imunogenem (imunogeny) vázajícím se na kapsidu HBV a danou protilátkou ve zkoumaném vzorku. Na stejném vzorku se provede druhý test (screen) založené na každém imunogenu z komplexního imunogenu, aby se identifikovala specificita protilátek ve vzorku.
V alternativním provedení předkládaného vynálezu se vzorek, který se má testovat na přítomnost protilátek ke specifickému imunogenu, přivede do kontaktu s částicemi jádrového antigenu HBV obsahujícími detekovatelně označené imunogeny vázající se na kapsidu HBV mající tento specifický imunogen jako imunogenní složku, a sice na dobu dostačující k tomu, aby jakákoliv protilátka ze vzorku vytvořila komplex s jedním nebo více imunogeny vázajícími se na kapsidu HBV. Díky vysoké valenci specifického imunogenu prezentovaného částicemi jádrového antigenu HBV se takto provedený test vyznačuje vyšší citlivostí než standardní testy.
Příklady provedení vynálezu
Aby byl vynález podrobněji a úplněji vysvětlen, jsou uvedeny následující příklady. Tyto příklady slouží k ilustraci výhodných provedení vynálezu a žádným způsobem předkládaný vynález neomezují.
Příklad 1
Příprava jádrového antigenu HBV
Exprese buďto celého jádrového antigenu HBV (aa3 - aal83) nebo jádrového antigenu HBV zkráceného na C-konci (aa3 aal48) v E. coli a následná purifikace byly provedeny jak bylo publikováno v Dyson a Murray (1995). Proteinové preparáty byly uloženy při 4 °C jako frakce sacharózového gradientu v pufru obsahujícím TBS, sacharózu (20%) a NaN3 (0,028%). Preparáty byly stabilní v této podobě alespoň po 6 měsíců.
Chemické zesítění peptidu vázajících se na kapsidu HBV na jádrový antigen HBV
Peptid MHRSLLGRMKGA Univesity of Edinburgh) antigenu HBV pomocí aminopropyl)karbodiimidu (sulfo-NHS) (obě kapsidu HBV (Albachem, na částice jádrového l-ethyl-3-(dimethylčinidla spojují sousedící vázající se na byl zesítěn hydrochloridu (EDC) a N-hydroxysulfosukcinimidu sloučeniny od Pierce Europe B.V.). Tato primární aminoskupny a karboxylové skupiny amidovou vazbou
N-Hydroxysulphosuccinimide
Mediated Coupling Reaction,
1986). Když se (Staros et al. , Enhancement by of Water-Soluble Carbondiimidepřidají ke
Analyticla Biochem. 156, 220-22, směsi peptidu vázajícího se na kapsidu HBV a kovalentní vazby z jádrového antigenu HBV, j ádrového lysin z antigenu HBV, měly by vytvořit peptidu s aspartátem nebo glutamátem čímž se zvýší molekulová hmotnost.
Konkrétně tedy byl zkrácený jádrový antigen inkubován při teplotě místnosti v fosforečnan draselný (25mM, pH 7), sulfo-NHS (l,8mM) buďto s peptidem něho.
pufru (30 μΐ) obsahujícím
Naci (150mM) , EDC (l,8mM) a
MHRSLLGRMKGA (lmM) nebo bez
Po 18 hodinách byla reakce analyzována na SDS/PAGE (15%), podle Sambrook et al (1989) . Přidání EDC a sulfo-NHS ke komplexům peptid-částice jádrového antigenu HBV vedlo k posunu frakce jádrového antigenu HBV na gelu o 1 kDa. I přes provedení reakce v různých podmínkách nebylo dosaženo vyššího výtěžku pásu posunutého proteinu než 50 %. To je v souladu s představou, že jeden peptid se váže na dimer jádrového antigenu HBV v blízkosti lokální osy dvojitého stočení a tak sféricky blokuje vazbu dalšího peptidu v místě příbuzném dvojitému stočení.
Příklad 2
Příprava jádrového antigenu HBV
Kromě preparátů jádrového antigenu HBV z příkladu 1 byly připraveny vzorky jádrového antigenu HBV se sekvencí 1-36 HBV
pre-Sl nebo se sekvencí 111-156 nebo 111-165 povrchového
antigenu HBV navázanou na zkrácený polypeptid jádrového
antigenu HBV (zkrácený ve zbytku 144) prostřednictvím krátkého
spojovacího peptidu, a sice jak bylo popsáno v Stáhl a Murray (1989).
Chemické zesítění peptidů vázajících se na kapsidu HBV na jádrový antigen HBV
Následující imunogeny vázající se na kapsidu HBV, připravené syntézou na pevné fázi, byly získány od firmy Albachem, University of Edinburgh:
AS-151: GSLLGRMKGA GGG LDPAFRG
AS-152 : GSLLGRMKGA GGG EQKLISEEDL
AS-152 : LDPAFR GG GSLLGRMKGA
AS-164 : EQKLISEEDL GG GSLLGRMKGA
Sekvence GSLLGRMKGA představuje peptid vázající se na
kapsidu HBV, sekvence LDPAFR představuje epitop nebo imunogen
pre-Sl HBV a sekvence EQKLISEEDL je epitop nebo imunogen onkogenu myc. Tyto peptidy a základní peptid vázající se na kapsidu HBV GSLLGRMKGA byly navázány na částice jádrového antigenu HBV buďto separátně nebo v kombinacích při různých koncentracích, a zesítěny působením EDC nebo sulfo-NHS, jak bylo popsáno v příkladu 1.
Vlastnosti připravených částic jádrového antigenu HBV
Produkty byly analyzovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) a pak obarveny Comassie modří, a poté analyzovány Western blotem s monoklonálními protilátkami a polyklonálním králičím sérem proti částicím jádrového antigenu HBV nebo denaturovaným částicím povrchového antigenu HBV. Monoklonální protilátky ke každému z HBV pre-Sl epitopu a epitopu onkogenu myc jsou dostupné. Jsou to monoklonální protilátka 18/7 (K.H.Heermann et al. , J. Virol 52, 396-402, 1984) a monoklonální protilátka 9E10 (Invitrogen, katalog, č. R950-25).
Tyto experimenty ukázaly, že produkty ze všech zesilovacích reakcí vykazovaly pozitivní reakce s protilátkami proti každé epitopové složce v reakci spojených složek. Pozitivní reakce byly získány s imunogenem navázaným prostřednictvím aminokonce nebo karboxykonce na peptidový ligand.
Jak je podrobněji uvedeno dále, preparáty purifikovaných částic jádrového antigenu HBV z reakcí zahrnujících zesítění s jedním nebo více různými imunogeny, užitím společného peptidového ligandu vázajícího se na kapsidu HBV, reagovaly s protilátkami ke všem imunogenním složkám. Kromě toho částice jádrového antigenu HBV precipitovaly s protilátkou specifickou k jednomu z imunogenů a vykazovaly zkříženou reaktivitu s protilátkami k jiným peptidům zúčastněným v procesu zesítění ligandu.
Produkty ligace byly podrobeny centrifugaci v sacharózovém gradientu. Byly precipitovány jednou z protilátek, a sice protilátkou anti-myc, a pak analyzovány SDS-PAGE a Western blotem.
Materiál precipitovány jednou z protilátek, např. protilátkou anti-myc, vykazoval silnou zkříženou reaktivitu jak s anti-myc tak s anti-pre-Sl protilátkami při analýze Western blotem. Produkty precipitované jinou protilátkou, a sice anti-pre-Sl protilátkou, vykazovaly stejné vlastnosti.
V reakcích, kde peptidy vázající se na kapsidu HBV nesoucí různé imunogeny byly smíchány v různých poměrech a navázány a zesítěny na částice jádrového antigenu, SDS-PAGE a Western biot analýza ukázaly, že relativní intenzity zbarvení dvěma monoklonálními protilátkami odrážely poměry dvou imunogenů ve směsi použité při zesítění.
Tyto experimenty ukázaly, že alespoň některé z částic jádrového antigenu HBV připravené v těchto reakcích měly na sebe kovalentně navázané oba imunogeny. Jelikož se peptidové ligandy váží na hroty částic jádrového antigenu HBV (nukleokapsidy) , takové preparáty vykazují vysokou imunogenicitu pro obě složky a lze očekávat, že vyvolají vysoké titry protilátek u pacienta, kterému se podají.
V přihlášce byly uvedeny jen příklady výhodných provedení vynálezu, přičemž odborníkovi je jasné, že základní provedení vynálezu lze do jisté míry modifikovat a vytvořit tak další provedení předkládaného vynálezu. Uvedená provedení tudíž představují jen možné ilustrativní příklady a vynález je definován připojenými patentovými nároky.
SEZNAM SEKVENCÍ
<140> PCT/US99/28755
<141> 1999-12-03
<150> 60/110,911
<151> 1998-12-04
<160> 47
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus HIV <
<400> 1
Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> virus HIV
<400> 2
Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser
5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> virus HIV <400> 3
Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn
10
-40<210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> virus HIV <400> 4
Glu Leu Asp Lys Trp Ala
5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Virus HIV <400> 5
Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala
5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 6
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 7
Leu Leu Gly Arg Met Lys
5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)
<223> bAla
<220>
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 8
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Xaa Cys
10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<221> M0D_RES
<222> (11)
<223> bAla
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 9
Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 10
His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <220>
<221> MOD_RES <222> (11) <223> bAla <400> 11
Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Xaa Cys
10
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 12
Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
5
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 13
Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence;
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 14
Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Pro Ala
1510
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 15
Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Pro Ala 1510
<210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV
<400> 16
Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Arg Ala 1510 <210> 17
- 44 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 17
Ala Asp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Met Lys Leu Ala
10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence·.
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 18
Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 19
Ala Asp Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 20
Ala Asp Gly Ser Arg Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 21
Ala Asp Gly Ala His Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV
<400> 22
Ala Asp Gly His Arg Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV
<400> 23
Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 24
Ala Asp Gly Ala His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 25
Tkla Asp Gly Tyr Gin Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 26
Ala Asp Gly Thr Gin Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala 15 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV
- 47 <400> 27
Ala Asp Gly Met His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala i 5 10 15 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 28
Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 29
Leu Gly Arg Met Lys Gly
5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 30
Gly Arg Met Lys Gly <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence·.
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 31
Leu Leu Gly Arg Met
5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 32
Cys Leu Leu Gly Arg Met Lys Cys
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 33
Ala Leu Leu Pro Arg Met Lys Gly
5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 34
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 35
Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys
5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 36
Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400 37
Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Ala
1510
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 38
Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Ala Gly
1510
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV
<400> 39
Ala Cys Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly
1510 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 40
Met His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala
10 <210 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> bAla <220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 41
Met His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Gly Xaa Gly Cys
10 15
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
peptid vázající se na kapsidu HBV
<400> 42
Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Gly Gly Gly Leu Asp Pro
1 5 10 15
Ala Phe Arg Gly
20
<210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 43
Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Gly Gly Gly Glu Gin Lys
5 10 15
Leu lle Ser Glu Glu Asp Leu
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220> <223> Popis umělé sekvence
peptid vázající se na kapsidu HBV <400> 44
Leu Asp Pro Ala Phe Arg Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys
5 10 15
Gly Ala <210> 45 <211> 22 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: epitop nebo imunogen onkogenu myc <400> 45
Glu Gin Lys Leu lle Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Ser Leu Leu
10 15
Gly Arg Met Lys Gly Ala
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence
epitop nebo imunogen HBV pre-Sl <400> 46
Leu Asp Pro Ala Phe Arg
5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213 > Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: epitop nebo imunogen onkogenu myc <400> 47
Glu Gin Lys Leu lle Ser Glu Glu Asp Leu

Claims (58)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu, která obsahuje alespoň jeden imunogen vázající se na kapsidu, přičemž tento imunogen vázající se na kapsidu obsahuje alespoň jednu peptidovou složku vázající se na kapsidu HBV a alespoň jednu imunogenní složku.
  2. 2. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu je na částici orientován tak, že umožňuje imunogenní složce, aby vyvolala imunitní reakci, když se částice podá pacientovi.
  3. 3. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu je navázán na částici prostřednictvím jakéhokoliv aminokyselinového zbytku peptidové složky vázající se na kapsidu HBV.
  4. 4. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu je navázán na částici prostřednictvím jakéhokoliv aminokyselinového zbytku nebo jiného zbytku imunogenní složky.
  5. 5. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 4, kde jiný zbytek imunogenní složky je sacharid.
  6. 6. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu je navázán na částici prostřednictvím aminokonce peptidové složky vázající se na kapsidu HBV.
  7. 7. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu je navázán na částici prostřednictvím karboxykonce peptidové složky vázající se na kapsidu HBV.
  8. 8. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu je navázán na částici zesítěním prostřednictvím zesíťujícího činidla.
  9. 9. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogenní složka je navázána na peptidovou složku vázající se na kapsidu HBV přímo nebo prostřednictvím spojovací sekvence.
  10. 10. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogenní složka je navázána na aminokonec peptidové složky vázající se na kapsidu HBV přímo nebo prostřednictvím spojovací sekvence.
  11. 11. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogenní složka je navázána na karboxykonec peptidové složky vázající se na kapsidu HBV přímo nebo prostřednictvím spojovací sekvence.
  12. 12. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, kde imunogenní složka je navázána na peptidovou složku vázající se na kapsidu HBV prostřednictvím zesíťujícího činidla.
  13. 13. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní speciíitu podle nároku 8, kde zesíťující činidlo je multifunkční zesíúující činidlo.
  14. 14. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 12, kde zesíúující činidlo je multifunkční zesífující činidlo.
  15. 15. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 14, kde multifunkční zesíúující činidlo je vybráno ze skupiny obsahující hydrochlorid l-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)karbodiimidu a N-hydroxysulfosukcinimid.
  16. 16. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogenní složka obsahuje jeden nebo více epitopú vybraných ze skupiny obsahující imunologické epitopy, imunogenní epitopy a antigenní epitopy.
  17. 17. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 16, kde epitopy jsou vybrány ze skupiny obsahující lineární epitopy, konformační epitopy, jednoduché epitopy a smíšené epitopy.
  18. 18. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogenní složka je vybrána ze skupiny obsahující antigeny, alergeny, antigenní determinanty, proteiny, glykoproteiny, protilátky, protilátkové fragmenty, peptidy, peptidové mimotopy napodobující antigen nebo antigenní determinantu, polypeptidy, glykopeptidy, sacharidy, oligosacharidy, polysacharidy, oligonukleotidy a polynukleotidy.
  19. 19. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogenní složka je namířena na, nebo je získána z, patogenní agens vybrané ze skupiny obsahující viry, parazity, mykobaktérie, baktérie, bacily, houby, protozoa, rostliny, fágy, živočišné buňky a rostlinné buňky.
  20. 20. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 19, kde virus je vybrán ze skupiny obsahující retroviry, herpetické viry, orthomyxoviry, paramyxoviry, hepadnaviry, flaviviry, picornaviry, papoviry, adenoviry, bakuloviry, hantaviry, parvoviry, enteroviry, rhinoviry, nádorové viry, DNA viry, RNA viry, togaviry, rhabdoviry a poxviry.
  21. 21. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 20, kde virus je vybrán ze skupiny obsahující viry humánní imunodeficience typu 1 a humánní imunodeficience typu 2, virus T lymfocytární leukémie, viry Herpes simplex typu 1 a Herpes simplex typu 2 , virus Varicella zoster, cytomegalovirus, virus Epstein-Barrové, viry chřipky A, B a C, respirační syncitiální virus, spalničkám podobný virus, virus příušnic, virus parainfluenzy, viry hepatitidy B, hepatitidy C, hepatitidy A a hepatitidy E, virus žluté horečky, malárie, virus Dengue a virus klíšúové encefalitidy, onkoviry, virus poliomyelitidy, papillomavirus, virus zarděnek, virus rabies a virus vakcínie.
  22. 22. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní speciíitu podle nároku 19, kde imunogenní složka je získána z nebo namířena na bacily, enterobaktérie, klostridia, listerie, mykobaktérie, pseudomonády, stafylokoky, eubaktérie, mykoplazmy, chlamydie, spirochety, neisserie a salmonely.
  23. 23. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní speciíitu podle nároku 19, kde imunogenní složka je namířena na původce diftérie, tetanu a černého kašle, na Haemophilus influenzae, virus poliomyelitidy, virus spalniček, příušnic, zarděnek, virus varicelly, viry hepatitidy B a A, pneumokokální pneumonie, žluté horečky, malárie, tyfové horečky, meningokokové encefalitidy a cholery.
  24. 24. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 18, kde imunogenní složka je vybrána ze skupiny obsahující alergeny zvířat, hmyzu a rostlin, atmosférické alergeny a inhalované alergeny.
  25. 25. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde jádrový antigen HBV je fúzní protein jádrového antigenu HBV.
  26. 26. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 25, kde fúzní protein jádrového antigenu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogenní epitop nebo antigenní epitop.
  27. 27. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 26, kde fúzní protein j ádrového antigenu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogenní epitop nebo antigenní epitop fúzovaný s jádrovým antigenem HBV prostřednictvím spojovací sekvence.
  28. 28. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 26, kde fúzní protein j ádrového imunogenní antigenu
    HBV nebo epitop s karboxykoncem j ádrového prostřednictvím spojovací sekvence.
    obsahuje imunologický antigenní epitop antigenu HBV buďto epitop, fúzovaný přímo nebo
  29. 29. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 26, kde fúzní protein jádrového antigenu HBV obsahuje imunologický epitop, imunogenní epitop nebo antigenní epitop fúzovaný s aminokoncem jádrového antigenu HBV buďto přímo nebo prostřednictvím spojovací sekvence.
  30. 30. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 25, kde fúzní protein jádrového antigenu HBV obsahuje zkrácený jádrový antigen HBV.
  31. 31. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 25, kde fúzní protein jádrového antigenu HBV obsahuje povrchový antigen HBV nebo jeho část.
  32. 32. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 31, kde fúzní protein jádrového antigenu HBV obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny obsahující úsek pre-Sl povrchového antigenu HBV, úsek pre-S2 povrchového antigenu HBV, imunodominantní úsek a povrchového antigenu HBV nebo jeho části.
  33. 33. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde jádrový antigen HBV je polypeptid jádrového antigenu HBV plné délky nebo je to část polypeptidu, zkrácený nebo mutovaný polypeptid nebo jeho derivát, schopný uspořádání do částicové formy.
  34. 34. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde peptidová složka vázající se na kapsidu HBV je vybrána ze skupiny obsahující: SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA, ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-Α)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA(β-Α)C a MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC.
  35. 35. Vakcína vyznačující se tím, že obsahuje profylakticky účinné množství částic jádrového antigenu HBV majících vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1.
  36. 36. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství částic
    j ádrového specifitu antigenu HBV podle nároku 1. maj ících vícenásobnou imunogenní 37. Způsob vyvolání imunitní reakce u pacienta vyzná č u j ící s e tím, že obsahuje krok podání
    částic jádrového antigenu HBV majících vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1 pacientovi v množství, které je účinné k vyvolání imunitní reakce.
  37. 38. Způsob podle nároku 37vyznačující se tím, že částice jádrového antigenu HBV jsou podávány pacientovi parenterálně.
  38. 39.
    Způsob zvýšení imunogenicity imunogenu vyznačující se t částici jádrového antigenu vázajícího se na kapsidu HBV.
    í m, že se imunogen naváže na HBV prostřednictvím peptidu
  39. 40. Částice jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 1, kde imunogen vázající se na kapsidu obsahuje diagnostickou značku nebo chemický markér.
  40. 41. Způsob detekce přítomnosti protilátek k imunogenu ve vzorku vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
    a) vzorek se přivede do kontaktu s částicí jádrového antigenu HBV mající vícenásobnou imunogenní specifitu podle nároku 40, a to na dobu dostatečnou k tomu, aby všechny protilátky ve vzorku mohly vytvořit komplex s imunogenem vázajícím se na kapsidu, b) detekční prostředky se užijí k detekci komplexu vytvořeného mezi imunogenem vázajícím se na kapsidu a protilátkami ve vzorku.
  41. 42. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV, který obsahuje alespoň jednu peptidovou složku vázající se na kapsidu a alespoň jednu imunogenní složku.
  42. 43. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 42, kde imunogenní složka je navázána na peptid vázající se na kapsidu HBV přímo nebo prostřednictvím spojovací sekvence.
  43. 44. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 42, kde imunogenní složka je navázána na aminokonec peptidové složky vázající se na kapsidu HBV přímo nebo prostřednictvím spojovací sekvence.
  44. 45. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 42, kde imunogenní složka je navázána na karboxykonec
    peptidové složky vázající se na prostřednictvím spojovací sekvence. kapsidu HBV přímo nebo 46. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle kteréhokoliv z nároků 42 až 44, kde imunogenní složka je
    zesítěním navázána na peptidovou složku vázající se na kapsidu pomocí zesilujícího činidla.
  45. 47. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 46, kde zesířující činidlo je multifunkční zesířující činidlo.
  46. 48. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 47, kde multifunkční zesířující činidlo je vybráno ze skupiny obsahující hydrochlorid l-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)karbodiimidu a N-hydroxysulfosukcinimid.
  47. 49. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 42, kde imunogenní složka obsahuje jeden nebo více epitopů vybraných ze skupiny obsahující imunologické epitopy, imunogenní epitopy a antigenní epitopy.
  48. 50. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 49, kde epitopy jsou vybrány ze skupiny obsahující lineární epitopy, konformační epitopy, jednoduché epitopy a smíšené epitopy.
  49. 51. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 42, kde imunogenní složka je vybrána ze skupiny obsahující antigeny, alergeny, antigenní determinanty, proteiny, glykoproteiny, protilátky, protilátkové fragmenty, peptidy, peptidové mimotopy napodobující antigen nebo antigenní determinantu, polypeptidy, glykopeptidy, sacharidy, oligosacharidy, polynukleotidy.
    polysacharidy, oligonukleotidy
  50. 52. Peptidový nároku 42, získána z, na kapsidu HBV podle namířena na, nebo je imunogen vázající imunogenní složka patogenní agens vybrané mykobaktérie, živočišné kde parazity, rostliny, fágy, baktérie, se buňky a rostlinné je ze skupiny obsahující viry, bacily, houby, buňky.
    protozoa,
  51. 53. Peptidový imunogen kde virus nároku 52, retroviry, hepadnaviry, bakuloviry, nádorové viry, herpetické flaviviry, vázající se na je vybrán ze viry, hantaviry,
    DNA viry, picornaviry, parvoviry, RNA viry, kapsidu skupiny
    HBV podle obsahuj ící orthomyxoviry, paramyxoviry, papoviry, adenoviry, enteroviry, rhinoviry, togaviry, rhabdoviry a poxviry.
  52. 54. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu HBV podle nároku 53, kde virus je vybrán ze skupiny obsahující viry humánní imunodeficience typu 1 a humánní imunodeficience typu 2, virus T lymfocytární leukémie, virus Herpes simplex typu 1 a Herpes simplex typu 2, virus Varicella zoster, cytomegalovirus, virus Epstein-Barrové, viry chřipky A, B a C, respirační syncitiální virus, spalničkám podobný virus, virus příušnic, virus parainfluenzy, viry hepatitidy B, C, A a hepatitidy E, virus žluté horečky, malárie, virus Dengue a virus klíšťové encefalitidy, onkoviry, virus poliomyelitidy, papillomavirus, virus zarděnek, virus rabies a virus vakcínie.
  53. 55. Peptidový imunogen nároku 42, kde imunogenní vázající se na kapsidu HBV podle složka je namířena na, nebo získána z, bacily, enterobaktérie, klostridia, listerie, mykobaktérie, eubaktérie, pseudomonády, stafylokoky, spirochety, neiserie a salmonely.
    mykoplazmy, chlamydie,
  54. 56. Peptidový imunogen vázající se na kapsidu
    HBV podle nároku 42, kde diftérie, tetanu, imunogenní složka je namířena černého kašle, Haemophilus influenzae, virus na původce poliomyelitidy, virus spalniček, příušnic, zarděnek, virus varicelly, viry žluté horečky, encefalitidy a cholery.
    hepatitidy B a A, malárie, tyfové
  55. 57. Peptidový imunogen vázající nároku 42, kde imunogenní složka obsahující alergeny zvířat, hmyzu alergeny a inhalované alergeny.
  56. 58. Peptidový imunogen vázající nároku 42, kde vybrána ze
    DGSLLGRMKGAA,
    HRSLLGRMKGA, pneumokokální pneumonie, horečky, meningokokové se na kapsidu HBV podle je vybrána ze skupiny a rostlin, atmosférické se na kapsidu HBV podle peptidová složka vázající se na kapsidu HBV je skupiny obsahující: SLLGRMKGA,
    ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-Α)C,
    ALLGRMKG,
    MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC.
  57. 59. Peptidový imunogen nároku 42, kde peptidová
    GSLLGRMKGA,
    RSLLGRMKGA,
    MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA(β-Α)C a vázající se na kapsidu HBV podle složka vázající se na kapsidu HBV je fragment nebo analog SLLGRMKGA,
    GSLLGRMKGA,
    DGSLLGRMKGAA,
    ADGSLLGRMKGAAG,
    SLLGRMKG(β-Α) C,
    RSLLGRMKGA,
    HRSLLGRMKGA,
    ALLGRMKG,
    MHRSLLGRMKGA,
    RSLLGRMKGA(β-Α) C
    MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC.
  58. 60. Částice jádrového antigenu HBV podle nároku 1, kde složka vázající se na kapsidu HBV je fragment nebo analog SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA, ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-Α)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA(β-Α)C a MHRSLLGRMKGAG(β-Α)GC.
CZ20011907A 1998-12-04 1999-12-03 Částice jádra HBV s imunogenními sloľkami navázanými prostřednictvím peptidových ligandů CZ20011907A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11091198P 1998-12-04 1998-12-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20011907A3 true CZ20011907A3 (cs) 2002-01-16

Family

ID=22335607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011907A CZ20011907A3 (cs) 1998-12-04 1999-12-03 Částice jádra HBV s imunogenními sloľkami navázanými prostřednictvím peptidových ligandů

Country Status (23)

Country Link
US (5) US6627202B2 (cs)
EP (3) EP2360174B1 (cs)
JP (2) JP2002532387A (cs)
KR (1) KR100715954B1 (cs)
CN (1) CN1179973C (cs)
AT (1) ATE525388T1 (cs)
AU (1) AU770225B2 (cs)
BR (1) BR9915942A (cs)
CA (1) CA2352738A1 (cs)
CZ (1) CZ20011907A3 (cs)
DK (1) DK1135408T3 (cs)
EA (1) EA004497B1 (cs)
EE (1) EE200100292A (cs)
HK (3) HK1161606A1 (cs)
HU (1) HU229222B1 (cs)
IL (1) IL143475A0 (cs)
IS (1) IS5957A (cs)
NO (1) NO20012760L (cs)
NZ (1) NZ512056A (cs)
PL (1) PL348766A1 (cs)
SK (1) SK7602001A3 (cs)
TR (1) TR200102423T2 (cs)
WO (1) WO2000032625A1 (cs)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1193791C (zh) * 1998-11-30 2005-03-23 希托斯生物技术股份公司 抗原的有序分子呈递,制备及使用的方法
WO2000032625A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-08 Biogen, Inc. Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands
US6942866B2 (en) 2000-08-16 2005-09-13 Apovia, Inc. Malaria immunogen and vaccine
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US20030219459A1 (en) * 2002-01-18 2003-11-27 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
US8101189B2 (en) * 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
MXPA05000287A (es) * 2002-07-05 2005-09-08 Leclerc Denis Particula viral adyuvante.
AU2003246690B2 (en) 2002-07-17 2010-03-11 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein
NZ537003A (en) * 2002-07-18 2008-03-28 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
BR0312792A (pt) * 2002-07-19 2005-05-03 Cytos Biotechnology Ag Composições de vacinas contendo séries antigênicas de amilóide beta1-6
CN100381463C (zh) * 2002-09-18 2008-04-16 中国人民解放军免疫学研究所 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途
US7517520B2 (en) * 2003-03-26 2009-04-14 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
US7537767B2 (en) * 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
US20060210588A1 (en) * 2003-03-26 2006-09-21 Cytos Biotechnology Ag Hiv-peptide-carrier-conjugates
US20070298432A1 (en) * 2003-11-07 2007-12-27 Hep-Genics Pty Ltd Binding Assay Components
BRPI0507002A (pt) * 2004-01-20 2007-06-05 Cytos Biotechnology Ag conjugados veìculos de grelina
CA2567741A1 (en) * 2004-05-25 2006-03-30 Chimeracore, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
KR100746991B1 (ko) 2004-08-06 2007-08-08 한국과학기술연구원 Ｈｂｖ 코아 단백질과 표면 단백질 간 상호작용의 측정을이용한 ｈｂｖ의 증식 억제물질의 검색방법
CA2576425A1 (en) * 2004-08-13 2006-08-17 Migenix Inc. Compositions and methods for treating or preventing hepadnaviridae infection
KR20070073896A (ko) * 2004-10-25 2007-07-10 사이토스 바이오테크놀로지 아게 위 억제 폴리펩티드(ｇｉｐ) 항원 어레이 및 그의 용도
PL1802746T3 (pl) 2004-10-27 2011-10-31 Crucell Switzerland Ag Cząstki wirosomu zawierające antygeny wirusa grypy i wirusa zapalenia wątroby typu B
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
DE102005008765B4 (de) * 2005-02-25 2016-06-16 Siemens Healthcare Gmbh Kontrastmittel auf der Basis von Bakteriophagen, diese enthaltende Zusammensetzung, deren Verwendung und Verfahren zu deren Herstellung
ATE460922T1 (de) * 2006-04-07 2010-04-15 Chimeros Inc Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von b-zellen-malignomen
JP2010508857A (ja) 2006-11-15 2010-03-25 フォリア バイオテック インコーポレイテッド パパイヤモザイクウイルスに基づく免疫原性の親和性で複合体化された抗原系及びその使用
JP2010508860A (ja) * 2006-11-15 2010-03-25 フォリア バイオテック インコーポレイテッド パパイヤモザイクウイルスに基づくインフルエンザ用ワクチン
CN101646772A (zh) * 2007-01-26 2010-02-10 弗利亚生物技术公司 抗伤寒沙门氏菌和其它肠细菌病原体的基于番木瓜花叶病毒的疫苗
JP5428017B2 (ja) * 2007-03-23 2014-02-26 国立大学法人 熊本大学 ワクチン剤
US20090226525A1 (en) * 2007-04-09 2009-09-10 Chimeros Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
US8637477B2 (en) 2007-08-30 2014-01-28 Akshaya Bio Inc. Antigenic compositions and use of same in the targeted delivery of nucleic acids
KR100949310B1 (ko) 2007-11-21 2010-03-23 한국과학기술연구원 세포 영상 기법을 이용한 ｈｂｖ 캡시드 단백질과 표면단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ｈｂｖ 증식억제물질의 검색방법
US8603810B2 (en) * 2008-05-09 2013-12-10 Agency For Science, Technology And Research T-cell having a T-cell receptor that recognizes epitope HBC18-27 of hepatitis B viral core antigen
WO2010042743A2 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric multiplexes, compositions, and methods for using same
CN101503461B (zh) * 2009-02-12 2011-09-07 北京大学人民医院 一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
KR20120052352A (ko) 2009-08-07 2012-05-23 트랜스진 에스.에이. Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물
WO2011136506A2 (ko) * 2010-04-30 2011-11-03 중앙대학교 산학협력단 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법
CA2847888A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Biomed Realty, L.P. Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins
CA2936092A1 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Stabilized hepatitis b core polypeptide
GB201402890D0 (en) 2014-02-18 2014-04-02 Iqur Ltd Vaccines based on hepatitis B Core antigens
JPWO2015133467A1 (ja) * 2014-03-06 2017-04-06 株式会社シノテスト Ｃ型肝炎ウイルスのワクチン及び診断に用いるためのＨＢｃ／ＨＣＶ Ｅ２ペプチドキメラタンパク質
WO2016010081A1 (ja) * 2014-07-18 2016-01-21 一般財団法人化学及血清療法研究所 ウイルス様粒子を含むワクチン
KR20200000497A (ko) * 2015-09-04 2020-01-02 인벤트프라이즈 엘엘씨 Vlp 안정화된 백신 조성물
DK3371316T3 (da) * 2015-11-04 2023-01-23 Hookipa Biotech Gmbh Vacciner mod hepatitis b-virus
WO2017120222A1 (en) * 2016-01-04 2017-07-13 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Particles encapsulating fusion proteins containing linked epitopes
CN107056947B (zh) * 2016-12-23 2021-04-20 中国人民解放军第四军医大学 抗hbv复制的靶向融合蛋白及其构建方法
WO2018208547A1 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 University Of Massachusetts Bivalent dengue/hepatitis b vaccines
AU2018285412B2 (en) 2017-06-14 2022-06-23 Universität Zürich Cyclic peptides for protection against respiratory syncytial virus
BR112019027488A2 (pt) 2017-06-23 2020-07-07 Pathovax Llc partículas semelhantes a vírus quiméricas e usos destas como redirecionadores de respostas imunológicas antígeno-específicos
JP7304421B2 (ja) * 2018-10-05 2023-07-06 アールエヌエージーン インコーポレイテッド 標的細胞特異的に結合して多重免疫機能が強化されたキメラ抗原及びこの用途
CA3121724A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Virometix Ag Lipopeptide building blocks and synthetic virus-like particles
US11560408B2 (en) 2018-12-27 2023-01-24 Verimmune Inc. Conjugated virus-like particles and uses thereof as anti-tumor immune redirectors
JP7491932B2 (ja) * 2018-12-28 2024-05-28 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 操作されたｂ型肝炎コアポリペプチド
US20230355737A1 (en) 2020-09-28 2023-11-09 Dbv Technologies Particle comprising an rsv-f protein for use in rsv vaccination
JP2023552040A (ja) 2020-10-19 2023-12-14 ヴェリミューン インコーポレイテッド ウイルスにインスパイアされた組成物及びがんの治療のために同じものを使用して、既存の免疫応答をリダイレクトする方法
EP4424699A1 (en) * 2023-03-03 2024-09-04 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Hbv core protein binding compounds and uses thereof
CN116751262B (zh) * 2023-07-31 2024-09-06 重庆医科大学国际体外诊断研究院 靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的多肽及其应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD147855A5 (de) 1978-12-22 1981-04-22 Biogen Nv Verfahren zur erzeugung mindestens eines hbv-antigenwirkung aufweisenden polypeptids
US5204096A (en) 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US5296572A (en) 1986-04-30 1994-03-22 James Sparrow Large pore polyamide resin and method of preparation thereof
CA1338800C (en) 1986-06-17 1996-12-17 Michael Houghton Hepatitis delta and diagnostics and vaccines
US4882145A (en) * 1986-12-09 1989-11-21 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4818527A (en) 1986-12-09 1989-04-04 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
GB8903313D0 (en) 1989-02-14 1989-04-05 Wellcome Found Conjugates
JPH02273700A (ja) 1989-04-14 1990-11-08 Olympus Optical Co Ltd ペプチド
US5547669A (en) 1989-11-03 1996-08-20 Immulogic Pharma Corp Recombinant peptides comprising T cell epitopes of the cat allergen, Fel d I
KR940000755B1 (ko) 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US5556744A (en) 1992-05-29 1996-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients
US5531990A (en) 1993-12-15 1996-07-02 Health Research, Inc. Method of raising an immune response with an anti-idiotypic antibody having correspondence with human hepatitis B surface antigen
US5856459A (en) 1995-06-06 1999-01-05 Hybridon, Inc. Oligonucleotides specific for hepatitis B virus
US6207157B1 (en) * 1996-04-23 2001-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate vaccine for nontypeable Haemophilus influenzae
PT952982E (pt) * 1996-10-31 2004-03-31 Biogen Inc Novos inibidores da hepatite b
WO2000032625A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-08 Biogen, Inc. Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands

Also Published As

Publication number Publication date
EP2360174B1 (en) 2014-04-09
TR200102423T2 (tr) 2002-02-21
US6827937B2 (en) 2004-12-07
HUP0104946A3 (en) 2004-10-28
DK1135408T3 (da) 2012-01-23
PL348766A1 (en) 2002-06-03
US8168190B2 (en) 2012-05-01
NO20012760L (no) 2001-08-06
EA200100619A1 (ru) 2001-12-24
EP1135408A1 (en) 2001-09-26
CA2352738A1 (en) 2000-06-08
US20120321659A1 (en) 2012-12-20
US20040234554A1 (en) 2004-11-25
EP2351768B1 (en) 2014-06-18
JP2008074867A (ja) 2008-04-03
EE200100292A (et) 2002-08-15
US6627202B2 (en) 2003-09-30
CN1332749A (zh) 2002-01-23
HK1041272B (zh) 2012-08-03
NZ512056A (en) 2004-01-30
US20030198649A1 (en) 2003-10-23
EP2360174A1 (en) 2011-08-24
KR100715954B1 (ko) 2007-05-09
US20070280962A1 (en) 2007-12-06
HU229222B1 (en) 2013-09-30
EA004497B1 (ru) 2004-04-29
BR9915942A (pt) 2001-08-21
EP2351768A1 (en) 2011-08-03
HK1041272A1 (en) 2002-07-05
HK1160652A1 (en) 2012-08-10
NO20012760D0 (no) 2001-06-05
AU1841700A (en) 2000-06-19
IL143475A0 (en) 2002-04-21
US7226603B2 (en) 2007-06-05
IS5957A (is) 2001-05-31
SK7602001A3 (en) 2002-03-05
EP1135408B1 (en) 2011-09-21
HUP0104946A2 (hu) 2002-04-29
ATE525388T1 (de) 2011-10-15
AU770225B2 (en) 2004-02-19
WO2000032625A1 (en) 2000-06-08
US20020064533A1 (en) 2002-05-30
KR20010081068A (ko) 2001-08-25
CN1179973C (zh) 2004-12-15
HK1161606A1 (en) 2012-07-27
JP2002532387A (ja) 2002-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20011907A3 (cs) Částice jádra HBV s imunogenními sloľkami navázanými prostřednictvím peptidových ligandů
CA1250100A (en) Pre-s gene coded peptide hepatitis b immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5039522A (en) Immunogens containing peptides with an attached hydrophobic tail for adsorption to hepatitis B virus surface antigen
JP2003529319A (ja) ＨＩＶ−１ｇｐ４１を標的化する広範に中和する抗体を誘発する方法
JP2009067810A (ja) 合成ペプチドとそれを含むワクチン
KR20180038557A (ko) 타겟 폴리펩티드를 제시하기 위한 폴리펩티드 캐리어 및 이의 용도
CA1280972C (en) Complex immunogen containing synthetic peptides
WO2002094866A1 (en) Pre-s protein of hepatitis b virus (hbv) as an adjuvant and a component of hbv vaccine
MXPA01005613A (es) Particulas de antigeno del nucleo del hbv con multiples componentes inmunogenicos unidos mediante ligandos de peptido
CA2409287A1 (en) Hepatitis c virus conjugates
JP2001503750A (ja) Ｂ型肝炎インヒビター
EP4415753A1 (en) Engineering antigen binding to, and orientation on, adjuvants for enhanced humoral responses and immunofocusing
US20030224011A1 (en) Hepatitis c virus conjugates