EA004497B1 - Коровые антигенные частицы hbv с множественными иммуногенными компонентами, связанными посредством пептидных лигандов - Google Patents

Коровые антигенные частицы hbv с множественными иммуногенными компонентами, связанными посредством пептидных лигандов Download PDF

Info

Publication number
EA004497B1
EA004497B1 EA200100619A EA200100619A EA004497B1 EA 004497 B1 EA004497 B1 EA 004497B1 EA 200100619 A EA200100619 A EA 200100619A EA 200100619 A EA200100619 A EA 200100619A EA 004497 B1 EA004497 B1 EA 004497B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
virus
hbv
core antigen
capsid
hbv core
Prior art date
Application number
EA200100619A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200100619A1 (ru
Inventor
Кеннет Мюррэй
Original Assignee
Байоджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен, Инк. filed Critical Байоджен, Инк.
Publication of EA200100619A1 publication Critical patent/EA200100619A1/ru
Publication of EA004497B1 publication Critical patent/EA004497B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к коровым антигенным частицам вируса гепатита В ("HBV"), характеризующимся множеством иммуногенных свойств. Более конкретно, настоящее изобретение относится к коровым антигенным частицам HBV, включающим иммуногены, эпитопы или другие родственные структуры, перекрестно-сшитые с ними посредством лигандов, представляющих собой связывающиеся с капсидом HBV пептиды, которые селективно связываются с коровым белком HBV. Указанные частицы могут быть использованы в качестве системы доставки для иммуногенных эпитопов широкого ряда, включая пептиды, связывающиеся с капсидом HBV, которые также преимущественно ингибируют сборку вируса HBV и препятствуют ей путем блокирования взаимодействия между коровым белком HBV и поверхностными белками HBV. Смеси различных иммуногенов, пептидных лигандов, связывающихся с капсидом HBV, или тех и других могут быть перекрестно сшиты с одной и той же коровой частицей HBV. Такие полученные многокомпонентные или мультивалентные коровые частицы HBV могут быть преимущественно использованы в терапевтических и профилактических вакцинах и композициях, а также в диагностических композициях и методах, предусматривающих использование данных частиц.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к коровым антигенным частицам вируса гепатита В (НВУ), характеризующимся множеством иммуногенных свойств. Более конкретно, настоящее изобретение относится к коровым антигенным частицам НВУ, включающим иммуногены, эпитопы или другие родственные структуры, перекрестно-сшитые с ними посредством лигандов, представляющих собой связывающиеся с капсидом НВУ пептиды, которые селективно связываются с коровым белком НВУ. Указанные частицы могут быть использованы в качестве системы доставки иммуногенных эпитопов широкого ряда, включая пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, которые также преимущественно ингибируют сборку вируса НВУ и препятствуют ей путем блокирования взаимодействия между коровым белком НВУ и поверхностными белками НВУ. Смеси различных иммуногенов, пептидных лигандов, связывающихся с капсидом НВУ или тех и других, могут быть перекрестно сшиты с одной и той же коровой частицей НВУ. Такие полученные многокомпонентные или мультивалентные коровые частицы НВУ могут быть с успехом использованы в терапевтических и профилактических вакцинах и композициях, а также в диагностических композициях и методах, предусматривающих использование данных частиц.
Предпосылки создания изобретения
Главным направлением клинических иммунотерапевтических схем лечения является иммунизация пациента против инфекционных патогенов и других агентов, представляющих угрозу для здоровья. Несмотря на избыток иммунизирующих агентов, их введение может давать, в лучшем случае, частичный иммунитет, для поддержания которого требуются частые повторные иммунизации. Это имеет место в случае использования различных стандартных моновалентных или поливалентных вакцин. И даже среди таких вакцин число отдельных агентов-инокулянтов, способных вырабатывать иммунитет против ряда иммуногенов, ограничено. Кроме того, антигенное разнообразие патогенов может ограничивать эффективность стандартных вакцин.
Попытки, предпринятые для преодоления этих трудностей, были направлены на методы усиления ответа иммунной системы на данные иммуногены. Для этих целей в попытке усиления иммуногенности присоединенного иммуногена посредством приведения в действие Тклеточно-зависимых и Т-клеточно-независимых детерминант корового антигена НВУ, были получены иммуногенные конъюгаты путем присоединения иммуногенов к коровым частицам вируса гепатита В (НВУ) (также называемые нуклеокапсидами или нуклеокапсидными панцирями). См., например, патент США 4818527 и Ки1исЬ с1 а1., Соге Раг11с1ез о£ Нераййз В У1гиз аз Саглег £ог Еоге1ди Ерйорез, А6у.У1гн5. Век., 50, рр. 141-82 (1998). Была также предпринята попытка усиления иммуногенности представляющих интерес эпитопов с использованием гибридных белков, образующих вирусные частицы, и содержащих, по крайней мере, часть природного белка, образующего вирусную частицу, например, поверхностный антиген НВУ и один или несколько представляющих интерес эпитопных сайтов. См., патент США 5965140. Результатом этих попыток было использование белков в качестве основы для представления нужных иммуногенов иммунной системе.
Вирус гепатита В представляет собой присутствующий в крови вирус, который включает маленький геном, состоящий из частично двухцепочечной ДНК, имеющей четыре в значительной степени перекрывающиеся открытые рамки считывания. НВУ состоит из внутреннего нуклеокапсида, включающего коровый белок НВУ (НВсАд), вирусную полимеразу и вирусную ДНК, и окруженного мембранной оболочкой, содержащей поверхностные антигены НВУ (НВзАд). Вирусная оболочка содержит три различных, но родственных поверхностных антигенных белков с длинной (Ъ), средней (М) и короткой (8) цепями, которые имеют общую карбоксиконцевую область, но разные аминоконцы, что обусловлено варьирующимся использованием триплетов инициации в различных точках непрерывной открытой рамки считывания.
Длинный полипептид (Ь-полипептид) состоит из пре-81, пре-82 и 8-областей. Он является продуктом всей рамки считывания и в своем аминоконце включает пре-81-домен, состоящий из 108 аминокислот (или 199 в зависимости от подтипа вируса), за которым следует пре-82домен, состоящий из 55 аминокислот, и область короткого полипептида (8-полипептида), состоящая из 226 аминокислот. Полипептид средней длины (М-полипептид) имеет у своего аминоконца пре-82-домен, за которым следует область 8, тогда как 8-полипептид, который присутствует, в основном, в избытке, состоит только из 8-области. Пре-8-области, очевидно, играют важную роль как в сборке вируса, так в присоединении к клетке-хозяину. В данном вирусе 8-форма является более избыточной, чем М- и Ь-формы НВзАд. и присутствует как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах [У. Вгизз & Ό. балет, Тйе Во1е о£ Епуе1оре Рго1еш ίη НераООз В У1гиз АззетЫу, Ргос. №11. Асаб 8с1. И8А, 88, рр. 1059-63 (1991); У.Вгизз е1 а1., Роз1-1гапз1а1юпа1 А11ега1юп ίη ТгапзтетЫгапе Торо1оду о£ Нераййз В Упиз Ьагде Епуе1оре Рго1ет, ЕМВО 1., 13, рр. 227379 (1994); А.В. Ыеига1й е1 а1., ’ТбеШгИсайоп апб Сйет1са1 8уп1йез1з о£ Ноз1 Се11 Весер1ог Втбтд 811е оп Нераййз В Упиз, Се11, 46, рр. 429-36 (1986); К. Иеба е1 а1., Тйгее Епуе1оре Рго1етз о£ Нераййз В Упиз: Ьагде 8, М1661е 8 апб Март 8
Рго1с1П5 Ыеебеб £ог 1ке Еогтайоп о£ Эанс Рагйс1ек, ЕУиок, 65, рр. 3521-29 (1991)]. Специфические взаимодействия между внешней поверхностью сердцевины и внутренней поверхностью оболочки вероятно способствуют правильной сборке вируса и стабилизации полученной частицы.
Коровый белок НВУ может быть эффективно экспрессирован в Е.сой [М.Ракек е! а1., Нераййк В У1гик Сепек апб Ткек Ехргеккюп ίη Е.сой, Ма!иге, 282, рр. 575-79 (1979)], в которой он образует икосаэдральные капсулы двух размеров, содержащие либо 180 (Т=3), либо 240 субъединиц (Т=4) [КЛ. СгоМкег е! а1., ТкгееЭппепкюгий 8!гис!иге о£ Нераййк В Уник Соге РагОс1ек Эекгтшеб Ьу Е1ес!гоп Мкгоксору, Се11, 77, рр. 943-50 (1994)]. Эти субъединицы кластеризуются в виде димеров и каждый димер образует шип, выступающий на поверхности капсулы. Недавно, с использованием электронной криомикроскопии и обработки изображения была получена карта капсулы Т=4 с разрешением 7,4 А от более чем 6000 отдельных частиц [В.Вбйскег е! а1., Эекгтшайоп о£ 1ке Ео1б о£ !ке Соге Рго!еш о£ Нераййк В У1гик Ьу Е1ес!гоп Сгуот1сгоксору, Ма!иге, 386, рр. 88-91 (1997)]. Это позволило определить укладку полипептидной цепи, которая имела, главным образом, α-спиральную структуру и полностью отличалась от ранее выявленных вирусных капсидов. Каждый димерный шип был образован парой длинных α-спиральных шпилек, по одной от каждого мономера в данном димере [Вбйскег е! а1., (1997); ЕЕ. Сотгау е! а1, УкиаНхабоп о£ а 4Не11х Випб1е ш 1ке Нера1111к В У1гик Сарк1б Ьу Сгуое1ес!гоп Мкгоксору, №1Шге. 386, рр. 91-94 (1997)]. В соответствии со схемой нумерации, которая предусматривает наложение аминокислотной последовательности на складчатую структуру [Вбйскег е! а1., (1997)], главный иммунодоминантный α-район корового белка НВУ находится примерно в области аминокислот 7882 [1. 8а1£е1б е! а1., Апйдешс Эекгтшапк апб Еипсйопа1 Эоташк ш Соге Апйдеп апб Е Апйдеп £гот Нераййк В Уник, 1.Упо1, 63, рр. 798-808 (1989); М. 8а11Ьегд е! а1., Скагаскпкайоп о£ а Ьшеаг Вшбшд 8йе £ог а Мопос1опа1 АпйЬобу !о Нераййк В Соге Апйдеп, ЕМеб.Уиок, 33, рр. 248-52 (1991)], на вершине шипа.
Агентами, ингибирущими сборку вируса НВУ, являются агенты, которые связываются с коровым антигеном НВУ, что приводит к блокированию взаимодействия между коровыми белками НВУ и поверхностными белками НВУ. Такие связывающиеся с капсидом НВУ пептиды описаны в заявке на патент РСТ \УО 98/18818 и М.Е. Эукоп & К. Мштау, 8е1есйоп о£ Рерйбе 1пЫЬйотк о£ 1п!егасйопк 1пуо1уеб ш Сотр1ех Рго!еш АккетЬ1ек: Аккошайоп о£ !ке Соге апб 8иг£асе Апйдепк о£ Нера1111к В Уник, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сЦ И8А, 92, рр. 2194-98 (1995) . Один такой связывающийся с капсидом пептид, МНЕЗЬЕСЕМКСА, был перекрестно сшит с коровым антигеном НВУ [В. Вбйскег е! а1., Рер11бек !ка! В1оск Нераййк В У1гик АккетЬ1у: Апа1ук1к Ьу Стуотктоксору, Микдепекк апб ТтапкГесйоп, ЕМВО 1., 17, рр. 6839-45 (1998)].
Как будет видно из нижепривиденного описания, пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, могут быть преимущественно использованы в качестве лигандов для конструирования коровых антигенных частиц НВУ, характеризующихся способностью вырабатывать усиленные иммунные ответы на один или множество иммуногенов.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к решению вышеуказанных проблем путем создания коровых антигенных частиц НВУ, которые вырабатывают усиленные иммунные ответы на один или множество иммуногенов. Такие многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы НВУ включают иммуногены, эпитопы или другие родственные структуры, перекрестно сшитые посредством лигандов, представляющих собой пептиды, которые селективно связываются с коровыми антигенными частицами НВУ, а также с иммуногенными доменами или эпитопами, связанными с коровым антигенным полипептидом или встроенными в него посредством генетической модификации кодирующей последовательности или путем полипептидного синтеза. Такие частицы могут быть использованы в качестве систем для доставки различных иммуногенных эпитопов, включая пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, которые сами по себе ингибируют сборку вируса НВУ или препятствуют этой сборке путем блокирования взаимодействия между коровыми белками НВУ и поверхностными белками НВУ. Полученные многокомпонентные и мультивалентные коровые частицы НВУ могут быть с успехом использованы в терапевтических или профилактических вакцинах и композициях, а также в качестве диагностических композиций и в методах их применения.
Настоящее изобретение позволяет преимущественно получать смеси различных иммуногенов, пептидных лигандов, связывающихся с капсидом НВУ, или тех и других, которые подвергают перекрестному сшиванию с указанной коровой частицей НВУ. В результате этого получают отдельные частицы, которые являются эффективными стимуляторами Т-клеток и которые являются иммунологически мультивалентными. Таким образом, отдельная антигенпредставляющая клетка может стимулировать пролиферацию множества В-клеточных клонов различной специфичности.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 показана структура коровой антигенной частицы НВУ, содержащей различные связывающиеся с капсидом иммуногены. Свя зывающийся с капсидом иммуноген включает по крайней мере один пептидный компонент, связывающийся с капсидом НВУ, и по крайней мере один иммуногенный компонент. Каждый связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к коровой антигенной частице НВУ посредством пептида, связывающегося с капсидом НВУ.
На фиг. 2 представлена таблица, где в систематизированной форме указаны различные коровые антигенные гибридные белки НВУ, которые могут также служить в качестве коровой антигенной частицы НВУ, к которой посредством пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, могут быть присоединены различные иммуногены.
Подробное описание изобретения
Для лучшего понимания описанного здесь настоящего изобретения ниже приводится его более подробное описание.
В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения смеси иммуногенов нескольких разных типов и одного или более пептидных лигандов, связывающихся с капсидом НВУ, могут быть перекрестно сшиты с одной и той же коровой частицей НВУ. Альтернативно, множество копий того же самого антигена может быть связано с пептидом одного типа, связывающимся с капсидом НВУ, и перекрестно сшито с различными положениями на коровой частице НВУ. Многокомпонентные и мультивалентные коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения могут быть, в частности, использованы для вырабатывания антител против всех иммуногеннных компонентов.
Использование пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, для присоединения иммуногенов к коровой антигенной частице НВУ позволяет увеличивать уровень презентации иммуногена, без нарушения иммуногенности или стабильности данного иммуногена, происходящего вследствие денатурации, конформационного разрушения или других дестабилизирующих факторов. Так, например, пептидные линкеры, связывающиеся с капсидом НВУ, снижают риск взаимодействия иммуногенных компонентов друг с другом, приводящего к потере функционального продукта. В результате этого, коровая антигенная частица НВУ вырабатывает повышенный иммунный ответ к ее иммуногенным компонентам. Поэтому нужные терапевтические или профилактические эффекты могут быть достигнуты при меньшем числе инокуляций и/или при меньшем количестве инокулянта, чем это требуется в том случае, когда каждый иммуноген вводят в качестве единственного агента.
Присоединение иммуногенов к коровым антигенным частицам НВУ посредством пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, также позволяет добиться презентации иммуногенов, которые отличаются по своему размеру, кон формации и природе. В результате этого, настоящее изобретение относится к вакцине или композиции и к комбинациям иммуногенов, которые могут быть использованы для вырабатывания иммунитета широкого спектра или для лечения данного индивидуума.
Иммуногены
Иммуногенами, которые могут быть присоединены к пептидам, связывающимся с капсидом НВУ, и таким образом включены в коровые частицы НВУ, являются любые молекулы, содержащие один или несколько иммунологических, иммуногенных или антигенных эпитопов. По своей природе указанные эпитопы могут быть линейными, конформационными, одиночными или смешанными.
Более конкретно, иммуногены могут быть выбраны из любых агентов, способных вырабатывать иммунный ответ. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими, антигены, антигенные детерминанты, белки, гликопротеины, антитела, фрагменты антител, пептиды, пептидные мимотопы, которые имитируют антиген или антигенную детерминанту, полипептиды, гликопептиды, углеводы, олигосахариды, полисахариды, олигонуклеотиды и полинуклеотиды. Иммуногенами могут быть также аллергены, токсины или эндотоксины.
Указанными агентами также являются агенты, нацеленные на различные патогены или происходящие от этих патогенов, таких как вирусы, паразиты, бактерии, грибы, фаги, простейшие микроорганизмы и растения. Указанные вирусы включают в себя ретровирусы, в том числе вирусы иммунодефицита человека типа 1 и типа 2 и вирус Т-клеточного лейкоза; герпесвирусы, такие как вирусы простого герпеса типа 1 и типа 2, вирусы ветряной оспы; цитомегаловирусы и вирус Эпштейна-Барра; ортомиоксовирусы, такие как вирусы гриппа А, гриппа В и гриппа С; парамиксовирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус, вирус псевдокори, вирус свинки и вирусы парагриппа; гепаднавирусы, такие как вирус гепатита В; флавивирусы, такие как вирус гепатита С, вирус гепатита А, вирус гепатита Е, вирус желтой лихорадки, вирус денге и вирусы клещевого энцефалита; пикорнавирусы, такие как энтеровирусы, риновирусы, вирусы ящура и вирус полиомиелита; тоговирусы, такие как вирус коровой краснухи; рабдовирус, такой как рабивирус; аденовирусы; вирусы Эбола; бакуловирусы; хантавирусы; паповирусы, такие как папилломавирусы; парвовирусы; ДНК-содержащие вирусы; РНК-содержащие вирусы; РНКвирусы, вызывающие опухоли, такие как онковирусы; и поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы. Кроме того, иммуногенами могут быть иммуногены, нацеленные на бациллы, энтеробактерии, клостридии, листерии, микобактерии, псевдомонады, стафилококки, эубактерии, микоплазмы, хламидии, спирохеты, нейссерии или
Ί сальмонеллы или происходящие от указанных бактерий. Иммуногены могут быть также выбраны из нижеследующих эпитопов вируса иммунодефицита человека: СЕБСРХУЕКЗ (дад); Е1.1Ж\\'А8 (др40); Ι6Ρ6ΚΑΕΥΤΤΚΝ (петля У3); ЕЕ1Ж\\'А (др41) и 1Ж1АЖП.НА (др41).
Гликопротеинами, которые могут быть присоединены к пептидам, связывающимся с капсидом ИВУ, и таким образом введены в коровые частицы НВУ, являются, например, антитела, гликопептиды, происходящие от поверхностных компонентов или подобных поверхностым компонентам клеток животных, вирусов или бактерий, например, вызывающих менингит, или фрагментов этих молекул.
При этом, следует отметить, что размер иммуногена не должен быть слишком большим, так, чтобы он не препятствовал взаимодействию его функциональной группы с пептидным линкером, связывающимся с капсидом НВУ.
Коровый антигенный белок ИВУ
Благодаря своей корпускулярной природе, коровый антигенный белок НВУ составляет преимущественную основу для презентации иммунной системе множества иммуногенов подобного или отличающегося типа. В соответствии с настоящим изобретением это преимущество еще более повышается, благодаря использованию пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, для присоединения нужных иммуногенов к коровой частице НВУ. Такие частицы содержат 90 или 120 лигандсвязывающих сайтов капсидных шипов, каждый из которых состоит из димера корового антигенного НВУ (см. фиг. 1). Таким образом, множественные иммуногены могут быть физически присоединены к коровой антигенной частице НВУ посредством связывающихся с капсидом НВУ пептидов, используемых в качестве лигандов. Полученная частица способна индуцировать иммунный ответ ко всем ее иммуногенным компонентам.
Коровые антигенные частицы НВУ могут быть образованы после экспрессии рекомбинантных последовательностей, кодирующих полипептид корового антигена НВУ в подходящей микробной системе, в системе, происходящей от животного, и в растительной системе. См., например, 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1опшд: А 1аЬога1огу тапиа1, 2пб Ебйюп., Со1б 8ргтд НагЬог Рге§5, Со1б 8ргшд НагЬог, №\ν Υо^к (1989). Экспрессируемый полипептид может включать полноразмерную последовательность корового антигена НВУ или ее мутации, производные, усеченые варианты или фрагменты, которые сохраняют способность к сборке в корпускулярной форме в клетках экспрессирующей системы. Рекомбинантные методы продуцирования таких коровых антигенных частиц НВУ известны специалистам. См., например, патент США 4710463.
Альтернативно, для продуцирования полипептида корового антигена НВУ могут быть использованы методы химического синтеза. Химический синтез может быть осуществлен методом твердофазного синтеза на основе аминокислотной последовательности полипептидов корового антигена НВУ [К..В. Мепгйе1б, Ееб.Ргосеб., 21, р. 412 (1964); К..В. Мепгйе1б, Вюсйетщйу, 3, рр. 1385-90 (1964) и Ό.Κ МШсй е1 а1., I. 1ттипо1., 139, рр. 1223-31 (1987)].
При этом следует отметить, что поскольку мутированные или вариантные последовательности корового антигена НВУ могут влиять на реакции со связывающимися или лигандными пептидами, то настоящее изобретение в равной степени относится к природным вариантам или мутациям, вводимым путем модификации кодирующих последовательностей или другими методами в коровые антигенные субъединицы НВУ или соответствующие связывающиеся или лигандные пептиды.
Мутации остатков корового белка, имеющие важное значение для связывания с пептидом Методы, используемые для определения укладки корового белка, были применены в целях определения, путем криомикроскопии, локализации сайтов связывания на коровом белке 8ЕЬСКМКСА, т.е. связывающегося с капсидом НВУ пептида, который ингибирует связывание с Ь-НВкАд. Этот метод показал, что данный пептид связывается с пиками шипов, как в оболочках Т=3, так и в оболочках Т=4 [В. ВбИсйег е1 а1., Рерббек СЬа! В1оск НерабЖ В У1ги8 АккетЫу: Апа1уЖ Ьу Сгуоткгоксору, Ми1адепеЖ апб ТгапШесбоп, ЕМВО I. 17, рр. 683945 (1998)]. Анализ изображения показал, что сайты связывания пептида находятся на вершине шипов, которые в предложенной схеме нумерации для полипептидной укладки [В. ВбИсБег е1 а1. (1997)] соответствуют остаткам в области аминокислот 78-82. Имеются два кислотных остатка (д1и77 и а§р78), расположенные возле вершины корового белка, и выбранный связывающийся пептид содержит два консервативных основных остатка. Важное значение этих противоположно заряженных остатков в реакциях связывания было подтверждено при обнаружении того факта, что мутация любого из кислотных остатков данного белка путем замены на аланин значительно снижает аффинность данных пептидов по отношению к модифицированным коровым капсулам. Замена аспарагиновой кислоты 78 на аланин приводит к снижению аффинности в 160 раз, а замена глутаминовой кислоты 77 на аланин приводит к снижению аффинности в 1000 раз. Это дает основание предположить, что любой или оба из кислотных остатков на белке корового антигена НВУ могут составлять, по крайней мере, часть сайта связывания для пептидов, связывающихся с капсидом НВУ.
Эти результаты также иллюстрируют важное значение аминокислотной последовательности корового антигена НВУ в области вершины шипа для связывания с лигандом. При этом, следует отметить, что может потребоваться введение мутации в коровый антиген некоторых штаммов НВУ для осуществления эффективного связывания конкретного лиганда и иммуногенного пептида, или может потребоваться отбор и адаптация вариантов данного лиганда для осуществления эффективного связывания со специфическим вариантом корового антигена НВУ.
Коровые антигенные гибридные белки ИВУ
В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, коровая антигенная частица НВУ, к которой могут быть присоединены иммуногены посредством пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, может быть частицей, уже отображающей один или несколько иммуногенов в результате применения методов конструирования генных гибридов. В одном из таких методов соответствующие кодирующие последовательности вводят в соответствующие положения в плазмидах или в других векторах, несущих последовательности для полипептида корового антигена НВУ.
Гибриды с геном β-галактозидазы Е.соП. используемые для повышения уровней экспрессии полипептида корового антигена НВУ, продемонстрировали, что замена первых двух аминокислот данного антигена на последовательность, состоящую из одиннадцати аминокислот (восемь от аминоконца β-галактозидазы и три других остатка, полученных после трансляции линкерной последовательности, введенной в гибридный ген) не оказывает негативного влияния на процедуру выделения, антигенность или морфологию данного продукта [8. 81а111 е! а1., Нераббк В У1ги§ Соге Либдеи. 8уШ11С515 ίη Е§сйспсЫа Сой апб АррПсабоп ίη Όίαβηοδίδ. Ргос.№б.Асаб.8с1.и8А, 79, рр. 1606-10 (1982); В.Г Сойеп & ГЕ. Ктсйтопб, Е1ес1гоп М1сго§сору о! Нераббк В Соге Лпбдеп 8уп1йе51/еб ίη Е.Сой, Ыатге, 296, 296, рр. 677-78 (1982)].
Гибридные белки корового антигена НВУ, используемые в настоящем изобретении, могут быть продуцированы, как показано в работе 8. 81а111 & Миггау, 1ттпподеп1с11у о! Рерббе о! Нера11118 В У1ги§ Соге Апбдеп, Ргос. Ыаб. Асаб. 8сЕ, И8Л, 86, рр. 6283-87 (1989). Альтернативно в качестве примера гибриды полипептидных последовательностей с главным сегментом корового антигена НВУ, которые дают в высокой степени иммуногенные частицы, были получены с использованием ряда вирусов, кодирующих последовательности, перечисленные на фиг. 2. Таким гибридом является продукт в виде частицы с высокой иммуногенностью, продуцированный путем экспрессии с использованием вектора на основе вируса коровьей оспы, содержащего пептид УР-1 (остатки 142-160), присоединенный посредством гептапептидной линкерной последовательности к шести аминокис лотам предкоровой последовательности, расположенной непосредственно перед аминоконцом полипетида корового антигена НВУ [В.Е. С1агке е! а1., 'Ттргоуеб 1ттиподешсйу о! а Рерббе Ерйоре айег Епбоп !о Нера11118 В Соге Рго1еш, ЫаШге, 330, рр. 381-84 (1987)]. Для других подходящих гибридных белков корового антигена НВУ см. также и1псй е! а1., (1998).
Серия других гибридных белков характеризуется заменой обогащенной аргинином области у карбоксиконца полипептида корового антигена НВУ на другие альтернативные кодирующие последовательности. Пептиды, которые включают иммунодоминантную а-область поверхностного антигена НВУ (остатки 111-165), пре-81-и пре-82-эпитопы и различные сегменты оболочечного белка вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), были присоединены к остатку 144 полипептида корового антигена НВУ. Все они были эффективно экспрессированы в Е.сой с получением корпускулярных продуктов, имеющих такую же морфологию, как и сам коровый антиген НВУ |8(аН1 & Миггау, 1989]. Эти продукты обнаруживали антигенную реактивность корового антигена НВУ, и, при тестировании, подобно препаратам полипептида корового антигена НВУ, усеченного в остатке 144, они также обнаруживали антигенную реактивность НВУ, тогда как полноразмерный коровый антиген НВУ обнаруживал очень незначительную активность. Гибридные белки, несущие остатки 111-156 или 111-165 от поверхностного антигена НВУ, не обнаруживали значимой поверхностно-антигенной реактивности НВУ, что не противоречило конформационной зависимости этого главного эпитопа, или вероятности того, что эти последовательности спрятаны внутри данных частиц. Однако иммуногенные ответы на гибридные белки свидетельствовали о наличии у них различных эпитопных компонентов.
Иммунные ответы на поверхностный антиген НВУ являются сложными, так как помимо эпитопов, присутствующих в пре-81- и пре-82областях Ь-НВкАд и в главной иммунодоминантной области, ряд детерминант вариабельных подтипов был сообщен и другим областям короткого или 8-полипептида поверхностного антигена НВУ (С.Ь. Ье Воиу1ег, Тбе Не1егодешсйу о! Аи81гаПа Апбдеп, 1.1пГес1. Όίδ., 123, рр. 671-75 (1971); \У.Н. Вапсгой е! а1., Эе1ес1юп о! Абб1бопа1 Апбдешс Эе1егт1пап15 о! НераП 118 В Апбдеп, НттипоЕ 109, рр. 842-48 (1972); А.-М. С’оигоисе-Раи1у Р.У. и Но11апб, 8иттагу о! ^огккбор А2: НВкАд апб ίΐδ 8иЫуре5, в Уиа1 Нераббк, Ο.Ν. Ууак, 8.Ν. Собеп & В.8сйт1б, еб§. (РЫ1абе1рЫа, И8А: Ргапкйп 1п8111и(е Ргезк), рр. 649-54 (1978)]. Кодирующие поверхностный антиген НВУ последовательности, определенные на ДНК НВУ, клонированной из сывороток различных подтипов, обнаруживают различия в соответствующих последовательностях белков.
Однако специфические единичные мутации, возможно, в критических остатках не влияли на переключение с одного серологического подтипа (у) на другой (б), но дополнительные единичные мутации индуцировали постепенное изменение подтипов с реактивностями у и б и иммуногенностями, обнаруживаемыми у той же самой молекулы [Р.О. Акй1оп-К1скатб1 & К. Мштау, Ми1аИопк 1йа1 Сйаиде 1йе 1штипо1од1са1 ЗиЫуре оГ Нераййк В ЗигГасе Апбдеп апб Όίδΐίηдшкй ВеЕтееп Апбдешс апб 1ттиподешс Эе1егттайоп, 1. Меб. У1го1., 29, рр. 204-14 (1989)]. Введенные мутации были сделаны внутри или возле конформационно-восприимчивой иммунодоминантной а-области, и все они находились в сегменте корового антигена НВУ, используемого в гибридах с коровым антигеном НВУ, описанным выше.
Влияние мутаций на специфичность подтипа индуцированных антител дает основание предположить, что гибридные белки могут быть также средством для изменения специфичности ответа на представляющие интерес эпитопы, особенно, если они зависят от конформации. Поэтому мутации с заменой глицина145 на аргинин, вводимые для имитации природного ускользнувшего мутанта, и на другие положительно или отрицательно заряженные остатки (лизин и глутаминовую кислоту) были сделаны в указанном остатке в НВсЗ111-156 для сравнительных исследований гуморальных и клеточных иммунных ответов [Л.Ь. ЗЫаи & К. Мштау, Ми1а1еб Ерйорек оГ Нераббк В Уник ЗигГасе Лпбдеп Еикеб 1о 1йе Соге Лпбдеп оГ 1йе Уиик 1пбисе АпбЬоб1ек Тйа! Веас! ινίΐΐι 1йе Ыа1иге ЗигГасе Апбдеп, 1Меб.Упо1., 51, рр. 159-66 (1987)]. Все они эффективно экспрессировались в Е.сой с образованием ожидаемых корпускулярных продуктов, обнаруживающих высокий уровень антигенности сердцевины НВУ, и все они индуцировали высокие титры антител к коровому антигену НВУ у кроликов.
Подобно их родительскому белку НВс8ц1-156, три мутанта по остатку 145 обнаруживали минимальное взаимодействие с антителом против поверхностного антигена НВУ в твердофазных радиоиммунных анализах (ЛИЗИЛ; ЛЬЬоН ЕаЬогаЮпек) или в анализах на преципитацию антитела в растворе. Однако после электрофореза в акриламидных гелях в денатурирующих условиях, все они обнаруживали сильные реакции с кроличьей антисывороткой против поверхностного антигена НВУ в экспериментах по иммуноблотингу (Л.Ь. ЗЫаи, 1ттипо1ощса1 Акрес!к оГ Нераббк В Уник Соге Апбдеп апб 11к ЭепуаЦуек, РЕО Тйекк, Ишуеткйу оГ ЕбтЬигдй, ИК (1993)]. При высоких концентрациях родительские и мутантные белки, при их захвате на твердой фазе, сенсибилизированной антителом против корового антигена НВУ, также давали слабые позитивные реакции с антителом против поверхностного антигена
НВУ, что возможно обусловлено некоторым разрушением частиц, обеспечивающих доступ к молекулам против НВкАд [ЗЫаи & Мштау, 1997] .
Для оценки Т-клеточных ответов на гибридные белки, а также для продуцирования антител были использованы иммунизованные кролики. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), взятые в различные периоды времени после иммунизации, были использованы для анализов на пролиферацию, осуществляемых на основе включения [3Н]-тимидина в ответ на обработку коровым антигеном НВУ или гибридным белком, используемым для иммунизации. Во всех случаях наблюдались сильные ответы, причем гибридный белок давал более высокий индекс стимуляции, чем коровый антиген НВУ, а поверхностный антиген НВУ, как и ожидалось, давал слабую стимуляцию. Для определения уровней антитела против НВЗ в образцах сыворотки проводили радиоиммунопреципитационный анализ методом двойных антител [С.1. Вигге1 е! а1., Вар1б Ие1ес1юп оГ Нераббк В ЗигГасе Апбдеп Ьу ИоиЫе АпНЬобу Вабюштипоаккау, 1Меб.Упо1., 3, рр. 1926 (1978)] с использованием [1251]-меченного поверхностного антигена НВУ, и этот анализ показал ожидаемый положительный ответ на НВсЗ111-156. Мутант с аргинином также давал положительный ответ в данном анализе, хотя этот ответ был несколько меньше, чем ответ его родительской молекулы, и слабый ответ был получен от мутанта с глутаминовой кислотой, но не от мутанта с лизином. Таким образом, полученные результаты показали, что гибридный белок (обозначенный НВсЗ145В), несущий мутацию с аргинином в положении 145, является сильным стимулятором Т-клеток и индуцирует вырабатывание антител с более широкой реакционной специфичностью.
Для исследования влияния полного размера, числа и положения различных дополнительных компонентов на иммуногенность данных продуктов была получена дополнительная группа гибридов различных частей полипептида поверхностного антигена НВУ, включая мутантов по остатку 145, с полипептидом корового антигена НВУ [ЗЫаи (1993)]. Эти конструкции представлены на фиг. 2, и как в случае других гибридов, все они давали корпускулярные продукты, имеющие морфологию корового антигена НВУ, хотя гибриды с фрагментом НВсЗш-156 на аминоконце корового антигена НВУ показали менее удовлетворительный результат, поскольку они давали продукты, которые образовывали нерастворимые агрегаты.
Указанная группа продуктов, подобно ранее полученным продуктам с сегментами НВсЗш-156, обнаруживала незначительную реакцию или отсутствие реакции с антителом против поверхностного антигена НВУ на твердой фазе или в растворе, но при захвате антителом против корового антигена НВУ на твердой фазе, они обнаруживали аналогичную реактивность с антителом против поверхностного антигена НВУ, и эта реактивность была несколько выше (приблизительно в 2 раза) по сравнению с гибридами, которые, помимо НВсЗш-156, содержали пре-З1- и пре-З2-сегменты. И снова индексы стимуляции для ингибирования пролиферации лимфоцитов были высокими для всех гибридных белков, и белки, которые включали пре-Зсегменты, однако, также нативные или мутантные НВсЗ111-156-последовательности, давали более сильные ответы. Включение пре-З1- и преЗ2-последовательностей между НВс144 и НВсЗ111-156 -последовательностями (либо дикого типа, либо мутант-ных) давало более высокие уровни антител в радиоиммунопреципитационном анализе с двойным антителом, чем гибриды, в которых отсутствовали пре-Зсегменты, но введение второй НВсЗ111-156последовательности между НВс144 и НВсЗ111-156последовательностями не давало дополнительного увеличения какого-либо из указанных ответов. Наиболее длинная из этих последовательностей, присоединенных к полипептиду корового антигена НВУ в пролина144, 165 аминокислот, не оказывала какого-либо негативного влияния на выход или на физические свойства данного гибридного белка.
Был также получен гибрид корового белка (НСс) вируса гепатита С (НСУ), частично и во множестве полноразмерных копий, с полипептидом корового антигена НВУ, усеченным у валина 149 [Α. Υθ51ιί1<α\να с1 а1., СЫшепс Нера11118 В У1Ш8 Соге Рат1ю1е8 \νί11ι Райе οί Сор1е8 οί Не НерайЙ8 С У1ти8 Соге Рго1еш. ГУпо1., 67, рр. 6064-70 (1993)]. Гибриды, несущие остатки 39-75 НСс, обнаруживали незначительную антигенность НСс, а остатки 1-91 или полная последовательность из 180 аминокислот давали положительные реакции, а по мере присоединения дополнительных копий (вплоть до четырех) последовательности 1-180 посредством коротких линкеров эта антигенность увеличивалась почти в арифметической прогрессии. Электронная микроскопия показала, что данный гибрид, несущий одну копию остатков 1-91 НСс, образовывал частицы, морфологически эквивалентные полипептиду корового антигена НВУ, но три полноразмерные копии НСс значительно искажали эту структуру, и данный продукт был очень восприимчивым к протеолизу, что позволяло, однако, получить продукт, который сохранял коровую антигенность НВУ. Хотя наиболее крупный белок имел более 720 дополнительных аминокислот, предел для частиц типа корового антигена НВУ, очевидно, был значительно меньше.
Для исследований влияния положения гибрида с НВсАд на иммуногенность были использованы последовательности РгсЗ. Борисова и др. (Воп8оуа е1 а1., (1989)) сконструировали гибриды с сегментами пре-З1 (остатки 20-68, 20-69 или 69-106) или со всей пре-З2последовательностью, присоединенной к коровому антигену НВУ, усеченному у пролина 144, или встроенной в это положение в полноразмерной последовательности корового антигена НВУ. В этих и аналогичных конструкциях с остатками 56-103 оболочечного белка вируса коровьего лейкоза (ВЬУ) или с остатками 78129 трансмембранного белка ВИЧ (др41), последовательности, гибридизованные с коровым антигеном НВУ находились, очевидно, на поверхности частиц; причем сообщалось, что все они, т. е. антигенный, иммуногенный и Сконцевой богатые аргинином домены оказывают, по всей вероятности, незначительное негативное действие.
Е. Зс1юйе1 и др. (Т1е Ро8Йюи οί Не1его1одои8 Ерйоре8 Бъейей ίη Нера11118 В У1ти8 Соге Ратйс1е8 Ое1егтше8 ТНей 1шшиподешсйу, ГУпоГ, 6, рр. 106-14 (1992)) исследовали влияние положения гибрида на антигенность и иммунный ответ у инбредных мышей при присоединении пре-З1- или пре-З2-сегментов у аминоконца полноразмерного корового антигена НВУ (либо непосредственно, либо посредством части предкоровой последовательности) или у карбоксиконца усеченного корового антигена НВУ; дополнительная конструкция содержала пре-З1сегмент между остатками 75 и 83 корового антигена НВУ, а также пре-З2-фрагмент у усеченного карбоксиконца (пролин 156).
Детальное исследование показало, что указанная пре-З1-последовательность, гибридизованная с аминоконцом корового антигена НВУ посредством предкоровой последовательности, была антигенной, а указанная последовательность, присоединенная непосредственно к аминоконцу, не обнаруживала антигенности, и хотя обе они имели иммуногенность, аналогичную иммуногенности корового антигена НВУ, однако, гибрид, образованный посредством предкоровой последовательности, стимулировал значительно более сильный анти-пре-З1-ответ. Пре-З2-последовательность у усеченного конца корового антигена НВУ была в аналогичной степени антигенной и иммуногенной в обоих случаях, но пре-З1-последовательность, гибридизованная изнутри так, чтобы осуществлялась замена остатков 76-82 (которые включают главный эпитоп корового антигена НВУ), была значительно более антигенной и гораздо более иммуногенной, чем в Ν-концевых гибридах. Как и ожидалось, НВУ-коровая антигенность и иммуногенность была значительно снижена во внутренних гибридных белках. Замена внутренней последовательности корового антигена НВУ (остатки 78-82) на фрагмент поверхностного антигена НВУ, содержащий иммунодоминантный а-эпитоп, также приводила к получению продукта, обнаруживающего положительную НВУ-коровую антигенность и иммуноген ность. [С. Вопзоуа е! а1., НуЬпб Нераййз В VIШ8 Ыис1еосар81б Веаппд ап 1штипобошшап1 Кещоп Ггот Нераййз В ЗигГасе ЛпПдеп. Ι.νίΐΌΐ.. 67, рр. 3696-3701 (1993)].
В качестве дополнительной альтернативы, или в качестве дополнения к гибридным белкам, описанным выше, иммуногенные компоненты могут быть присоединены к коровому антигену ΗΒν методом перекрестного сшивания.
Наложение аминокислотной последовательности корового антигена ΗΒν на физическую структуру, предложенное Вбйсйег е! а1., (1997), позволяет объяснить низкую антигенность последовательностей, гибридизованных у карбоксиконца или возле карбоксиконца корового антигена ΗΒν, поскольку такие последовательности, по-видимому, содержатся в частицах корового антигена ΗΒν, тогда как Ν-концевые гибриды могут иметь некоторые преимущества благодаря гибким линкерным последовательностям, что позволяет дополнительно вынести иммуноген из относительно ограниченного пространства у основания шипов. Локализация иммунодоминантного эпитопа корового антигена ΗΒν [остатки 78-82; 8а1Ге1б е! а1. (1989)] на вершине шипа указывает на привлекательность этого положения для вставки или присоединения пептида-иммуногена, связывающегося с капсидом ΗΒν. В принципе, все эти положения могут быть использованы одновременно с увеличением числа и/или разнообразия эпитопов, представляемых данной коровой антигенной частицей ΗΒν.
Пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ и используемые для присоединения иммуногенов к коровым антигенным частицам НВУ
Как было описано выше, нужные иммуногены могут быть присоединены к коровой частице ΗΒν с использованием лиганда, который представляет собой пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν. Такие связывающиеся с капсидом ΗΒν пептиды являются выделенными очищенными пептидами. Эти связывающиеся с капсидом ΗΒν пептиды преимущественно ингибируют сборку ΗΒν и препятствуют ей путем блокирования взаимодействия между коровым белком ΗΒν и поверхностными белками ΗΒν.
Пептидами, связывающимися с капсидом ΗΒν, предпочтительно являются пептиды, их фрагменты, аналоги и гомологи, которые имеют длину от около 2 до около 20 аминокислот. Более предпочтительно, если указанные пептиды имеют длину от около 3 до около 15 аминокислот. Такими пептидами являются пептиды, перечисленные в нижепривиденных таблицах, а также их фрагменты и аналоги.
Используемый здесь термин фрагмент означает аминокислотную последовательность, которая является короче, чем пептид, от которого она происходит, и которая при этом сохраняет биологическую активность, в основном, аналогичную активности исходного пептида. Такой фрагмент имеет длину по крайней мере в две аминокислоты.
Используемый здесь термин аналог означает варианты аминокислотных последовательностей пептидов, которыми могут быть аналоги, в основном, отличающиеся приблизительно только одной-четырьмя аминокислотными заменами. Другими примерами аналогов являются пептиды, которые имеют небольшие аминокислотные отличия по сравнению с пептидами, проиллюстрированными в настоящем описании. В частности, в понятие аналоги входят пептиды, содержащие консервативные аминокислотные замены, т. е. замены, которые вводятся в семейство аминокислот, являющихся родственными по своим боковым цепям.
Генетически кодируемые аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислотные: аспартат, глутамат; (2) основные: лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные: глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда вместе классифицируют как ароматические аминокислоты. Что касается пептидов, связывающихся с капсидом ΗΒν, то может оказаться предпочтительным, чтобы в них была введена замена одной или нескольких аминокислот. Каждый специалист легко может оценить влияние такой замены.
Термин гомолог включает пептидные фрагменты, которые имеют по крайней мере 60%-ную идентичность, а предпочтительно 75%-ную идентичность на аминокислотном уровне, и биологическую активность, в основном, аналогичную активности сравниваемого пептида. Указанные предпочтительные проценты идентичности отражают небольшой размер пептидов.
Используемыми связывающимися с капсидом ΗΒν пептидами являются пептиды, полученные на основе пептидов, описанных Эузоп & Миггау (1995). Такие пептиды были синтезированы путем рандомизированного мутагенеза остатков, фланкирующих пептид ЬЬСКМК в гибридном фаге В1, и повторного отбора против корового антигена ΗΒν в реакции биопэннинга с получением производных, которые связываются с антигеном с улучшенной аффинностью. Высокоразрешающая электронная криомикроскопия показала, что такие связывающиеся с капсидом ΗΒν пептиды присоединяются на вершинах шипов белковой оболочки сердцевины ΗΒν. Ингибирующее действие этих пептидов на взаимодействие между белками корового антигена ΗΒν и поверхностного антигена ΗΒν в инфицированных клетках оценивали посредством трансфекции проницаемых клеток гепатомы Иер С2 с помощью компетентной по репликации плазмидой, несущей димер типа голова к хвосту генома ΗΒν, в присутствии или отсутствии данного пептида. См. ВоНсЬег и др. (1998).
Пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ и несущие последовательность ББСКМК, способствуют снижению выхода НВУ в трансфецированных клеточных культурах гепатомы дозозависимым способом и с относительной эффективностью, которая, для этих пептидов, выражается величинами 1С50 при их ингибировании реакций между коровым антигеном НВУ и поверхностным антигеном Б-НВУ в растворе.
Пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, предпочтительно имеют полумаксимальную концентрацию (1С50) менее чем около 10, а более предпочтительно менее чем 5, еще более предпочтительно менее чем около 2, а наиболее предпочтительно менее чем около 0,5 мкМ. Предпочтительными пептидами являются, но не ограничиваются ими, 8ББОКМКО(в-А)С, К8ББСКМКСА, НК8ББСКМКОЛ и К8ББОКМКОЛ(в-Л)С или происходящие от них пептиды. Альтернативно, таким пептидом может быть пептид АББСКМКС, который ингибирует взаимодействие между длинным поверхностным антигеном вируса гепатита В (БНВзАд) и НВсАд, и имеет полумаксимальную концентрацию (1С50) 10,0 мкМ.
Ниже представлены связывающиеся с капсидом НВУ пептиды, где Ко Ее1 (нМ) означает относительную константу диссоциации для реакций между коровым антигеном НВУ и гибридным фагом 1'4, несущим пептидные последовательности в аминоконцевой области белка др121 (См. Бузой & Миггау (1995)].
Последовательность Ко Ее1 (нМ)
АОСАЬЬСКМКЗА - 15215
АОСАЫ.53МКРА 7 6718
АОСЗЬЬСЗМКРА 322150
АОСАЫ.СВМККА 181112
Α06ΤΙΛ6ΒΜΚΙΑ 2012
А1Х53ЬЬСНМКСА 1.710.3
АОКЗЫЛЯМКОА 1.09+0.02
АООЗКЗЗЬЪСЮОСОА 1.9610.32
АООАНЗЗЪЪСаМКОА 1.72+0.17
АОСНАЗЗЬЬбЯМКОА 1.4010.13
АОСРВЗЗЬЪСИМКСА 0.8410.07
АОСАНЙЗЬЪСЯМКСА 0.94+0.12
А1Х;У0ПЗЬЬСВМКСА 0.ΒΘ10.08
АОСТОКЗЬЬСКМКЕА 0.84+0.06
Эти пептиды, которые имитируют цитоплазматические области Б-НВзАд, были идентифицированы путем отбора из рандомизированной библиотеки гексапептидов, отображенной на нитчатом фаге, и их аффиности по отношению к коровому антигену НВУ в растворе были определены в фагоассоциированной форме. Нижеследующие родственные пептиды (перечисленные ниже) также являются примерами пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, а величины 1С50 мкМ представляют собой концентрацию пептида, необходимую для ингибирования полумаксимального связывания Б
НВзАд с коровым антигеном НВУ, Ν/Б означает, что ингибирование не наблюдалось, а β-А означает бета-аланин (См. Бузоп & Миггау (1995)].
Последовательность
АЫ.ЗКМКЗ ььскмкс дсвмкс
СКМКС
ы.свм сыснмкс .
АЬЪРКМКС ЗЬЪСКМКС
ЗЬЪЗВМК зььскмкса СЗЫ-С КИКСА ЕСЗХ-ДСКМКОАА М>СЗ Ы.СКМКСААЗ
АС5ЫСКМКС
ЭЬЬСКМКС (р-А) с
К5Ы.СЙМКСА
НКЗЬЬСКМКСА
МИКЗЪЪСКМКСА ВЗЬЫЗНМКСА (Р-А) С
Крв<1 (нМ)
11.010.8
46.217.4
9801157 Ν/Ώ
Ν/ϋ
652+74
Ν/Ο
6.410.7
40.714.8
2.410.2
0.7910.23
3.010.4
4.510.8
26.215.0
1.810.4
0.2910.02
0.5010.04
0.8010.10
0.29+0.03
3.8С1О.69.
М11К8Ы.СКМКСАС (β-Α) СС
Пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, их фрагменты, аналоги и гомологи, которые могут служить в качестве лигандов для связывания с иммуногенами для коровых антигенных частиц НВУ, предпочтительно синтезируют традиционными методами синтеза, например, методами химического синтеза. Альтернативно, каждый специалист может синтезировать любой из пептидов с использованием автоматического синтезатора пептидов стандартными методами химического синтеза, например, с использованием ΐ-ВОС-химии. См., например, Б.А. Сарппо, 1.Аш.Сйеш.8ос., 79, рр. 4427 (1957). Указанные пептиды могут быть также получены путем химического расщепления белков или другими методами. Пептиды выделяют так, чтобы они, в основном, не содержали предшественников химических соединений или других химических соединений, образующихся при химическом синтезе или полученных путем химического расщепления белка.
Альтернативно, пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, могут быть получены стандартными методами генной инженерии, например, с использованием техники рекомбинантных ДНК в клетках-хозяевах, трансформированных нуклеиновокислотной последовательностью, кодирующей данный пептид, путем клонирования и экспрессии в микроорганизме или в клетке-хозяине ДНК-фрагмента, несущего кодирующую последовательность для выбранного пептида. При продуцировании методами рекомбинантных ДНК в соответствующим образом трансформированных клетках, указанные пептиды могут быть выделены из клеточной культуральной среды, из клеток-хозяев, либо из тех и других стандартными методами. Рекомбинантные пептиды выделяют так, чтобы данный пептид, в основном, не содержал клеточного материала или культуральной среды, исполь зуемой при продуцировании методами рекомбинантных ДНК. Кодирующие последовательности для указанных пептидов могут быть получены синтетически или продуцированы из вирусной РНК известными методами, либо они могут быть продуцированы из имеющихся кДНК-содержащих плазмид.
Для использования в способах настоящего изобретения вышеописанные пептиды могут быть сконструированы с получением стандартных известных или альтернативных конструкций в целях повышения уровня продуцирования данного пептида или его связывания с коровым антигеном НВУ. Так, например, данные пептиды могут быть, но необязательно, гибридизованы с белком или партнером по слиянию пептидов. Таким образом, каждый специалист может сконструировать пептид в ассоциации с выбранным партнером по слиянию, таким как другой пептид или другие пептиды или белки, которые придают ему нужные свойства.
Системы для клонирования и экспрессии связывающихся с капсидом НВУ пептидов в различных микроорганизмах и клетках, включая, например, Е.еок. бациллы, стрептомицеты, сахаромицеты, клетки млекопитающих, дрожжи, клетки насекомых и растительные клетки и в подходящих для них векторах, являются известными и могут быть получены из частных и государственных лабораторий и депозитариев и от их коммерческих поставщиков.
Независимо от того продуцировались ли указанные связывающиеся с капсидом НВУ пептиды методами рекомбинантных ДНК или методами синтеза, они могут быть очищены стандартными методами очистки. Каждый специалист может легко определить соответствующий уровень чистоты, необходимый для нужного применения используемых пептидов.
Следует отметить, что выбор пептидного линкера, связывающегося с капсидом НВУ, до некоторой степени, зависит от природы, конкретного полипептида корового антигена НВУ, образующего коровую антигенную частицу НВУ. Так, например, для коровых антигенных частиц НВУ, происходящих от различных исходных вирусных штаммов, могут потребоваться различные пептидные лиганды, связывающиеся с капсидом НВУ, что обусловлено различием аминокислотных последовательностей, находящихся в лигандсвязывающих сайтах данного полипептида корового антигена НВУ или возле этих сайтов.
Присоединение пептидов, связывающихся с капсидом НВУ, к иммуногенам
Пептиды, связывающиеся с капсидом НВУ, могут быть присоединены посредством пептидной связи к нужным иммуногенам с образованием связывающегося с капсидом иммуногена. Если этот иммуноген сам является пептидом, то обычно это может быть достигнуто стандартным методом путем простого синтеза или путем экспрессии в трансформированных клетках соответствующей кодирующей последовательности пептида, содержащего последовательность, связывающуюся с капсидом НВУ, и присоединенную к данной последовательности последовательность иммуногена и, в основном и предпочтительно это может быть осуществлено посредством двух-пяти (а в большинстве случаев трех) глициновых остатков, в целях придания соответствующей степени гибкости цепи между двумя компонентами этого удлиненного пептида. Альтернативно, эти пептиды могут быть перекрестно сшиты с данными иммуногенами.
Ориентация связи между связывающим компонентом пептида и иммуногеном может влиять на эффективность конечного процесса перекрестного сшивания связывающегося с капсидом иммуногена с коровой антигенной частицей НВУ. Альтернативно, для ряда связывающихся с капсидом иммуногенов, перекрестносшиваемых с коровой антигенной частицей НВУ, данный иммуноген может быть помещен в аминоконец пептида, с которым он связывается, а другой иммуноген может быть помещен в карбоксиконец данного пептида, с которым он связывается. В некоторых случаях может оказаться предпочтительным вводить тот же самый или другой иммуноген в каждый конец данного пептида, связывающегося с капсидом НВУ. Такое изменение в организации комплексов связывающийся с капсидом НВУ пептидиммуноген, перекрестно-сшиваемых с данной коровой антигенной частицей НВУ, позволяет преимущественно получить в высокой степени многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы НВУ. См. фиг. 1.
Таким образом, ориентация связывающегося с капсидом иммуногена, перекрестносшиваемого с коровой антигенной частицей НВУ, играет важную роль для конечной иммуногенности или мультивалентности полученной частицы. Более высокая степень иммуногенности или мультивалентности ожидается в том случае, когда данный иммуноген ориентирован по направлению к карбоксиконцу пептида, связывающегося с капсидом НВУ. Такая ориентация, которая дает более высокую степень гибкости, также является предпочтительной для иммуногенов крупных размеров.
Присоединение связывающихся с капсидом иммуногенов к коровой антигенной частице НВУ
Связывающиеся с капсидом иммуногены могут быть перекрестно сшиты с коровой антигенной частицей НВУ с использованием любого стандартного перекрестно-сшивающего агента. Такими перекрестно-сшивающими агентами являются, например, многофункциональные перекрестно-сшивающие агенты, например, глутаральдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксол. Другие перекрестно-сшивающие агенты перечислены в Ригсе Са1а1од ап4 Нап4Ьоок, Р1егсе Сйеш1са1 Сотрапу, РоскГогТ ΙΙΙίηοίδ (1997). Другими перекрестно-сшивающими агентами являются такие агенты, как гидрохлорид этил-3 -(3 -диметиламинопропил)карбодиимида (БОС) и Ν-гидроксисульфосукцинимид (сульфо-ΝΗδ), которые связывают смежные первые амино- и карбоксильные группы с образованием амидной связи. При добавлении к смеси связывающегося с капсидом иммуногена/коровой антигенной частицы НВУ, такие агенты ковалентно связывают присутствующий лизиновый компонент данного пептида с соседним аспартатом или глутаматом корового антигена НВУ.
При этом следует отметить, что в смеси, используемой для присоединения связывающегося с капсидом иммуногена к коровой антигенной частице НВУ, соотношение различных иммуногенов, присоединенных к данной коровой антигенной частице НВУ, может, разумеется, варьироваться по относительному количеству соответствующих иммуногенов.
Терапевтические композиции настоящего изобретения
Настоящее изобретение также относится к композициям, которые могут быть использованы для лечения или профилактики индивидуумов с применением мультикомпонентных или мультивалентных коровых антигенных частиц НВУ, описанных в настоящей заявке. Любой индивидуум, включая человека и других млекопитающих, а также любые животные могут быть подвергнуты лечению коровыми антигенными частицами НВУ, описанными в настоящей заявке. Терапевтические композиции содержат фармацевтически эффективное количество коровых антигенных частиц НВУ, т. е. количество, эффективное для иммунизации против одного или нескольких инфекционных агентов или для лечения одного или нескольких состояний у индивидуума, которому вводят данные композиции в течение определенного промежутка времени. Профилактические композиции содержат профилактически эффективное количество коровых антигенных частиц НВУ, т.е. количество, эффективное для предупреждения одного или нескольких состояний у индивидуума, которому вводят данные композиции в течение определенного промежутка времени.
В случаях, если коровые антигенные частицы НВУ содержат множество иммуногенов различных типов, то композиции и вакцины, содержащие данные иммуногены, могут быть использованы для вырабатывания у индивидуума усиленного иммунного ответа к каждому из иммуногенных компонентов. В случаях, если коровые антигенные частицы НВУ содержат множество иммуногенов одного типа, то композиции и вакцины, содержащие данные иммуногены, могут быть использованы для вырабатывания у индивидуума усиленного иммунного ответа к общему иммуногену. Эти последние композиции и вакцины характеризуются более высокой моновалентностью и эффективностью по сравнению со стандартными композициями для монотерапии.
Композиции, содержащие мультикомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения, могут быть введены отдельно или в виде части фармацевтического или профилактического препарата в сочетании с адъювантом или без него, и в числе таких композиций могут быть препараты с регулируемым высвобождением. Они могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители или разбавители, подходящие для введения в целях лечения указанных инфекций. Подходящие фармацевтически приемлемые носители являются физиологически инертными и/или нетоксичными. Многие носители известны специалистам и могут быть выбраны в зависимости от цели их применения. Примерами таких носителей являются, но не ограничиваются ими, стерильный физиологический раствор, лактоза, сахароза, фосфат кальция, желатин, декстрин, агар, квасцы, окись алюминия, гидроксид алюминия, пептин, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и вода. Кроме того, указанный носитель или разбавитель может включать материал для пролонгированного высвобождения, такой как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина, взятый отдельно или в сочетании с воском. Кроме того, могут быть использованы композиции на основе полимера для замедленного высвобождения, включая, например, растворимое стекло.
Потенциально, композиции, содержащие многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы НВУ, могут также содержать другие терапевтические или профилактические агенты. Так, например, такие композиции могут включать смесь из множества реагентов, используемых для лечения или предупреждения инфекций. Одна из таких смесей может включать другие реагенты, такие как интерфероны, нуклеозидные аналоги и/или Νацетилцистеин.
Композиции, содержащие иммуногенные частицы корового антигена НВУ, могут также содержать, но необязательно, модификаторы иммунной системы, такие как адъюванты или цитокины, которые могут быть использованы для дополнительного индуцирования гуморального и Т-клеточного ответов у пациента. Такими модификаторами являются стандартные адъюванты на основе квасцов, или мурамилдипептиды, консерванты, химические стабилизаторы или другие антигенные белки. Обычно для определения наилучшей композиции, эффективной для конкретного применения, стабилизаторы, адъюванты, консерванты и т.п. должны быть оптимизированы. В качестве подходя щих консервантов могут быть использованы хлорил-бутинол, сорбат калия, сорбиновая кислота, диоксид серы, пропилгаллад, парабены, глицерин и фенол.
Подходящие количества указанных композиций могут быть определены, исходя из уровня желаемого ответа. В основном, композиции, содержащие иммуногенные коровые антигенные частицы НВУ, могут содержать от около 5 до около 200 мкг указанных частиц. Такие композиции могут быть введены одной или серией инокуляций, например, тремя инокуляциями через интервалы в два-шесть месяцев. Подходящие дозы могут быть также определены лечащим врачом с учетом таких факторов, как состояние здоровья пациента, его вес или возраст, а также с учетом стандартной дозы иммуногенного компонента, вводимого в качестве монотерапии. После улучшения состояния пациента или заметного увеличения уровня воздействия на данный патоген может быть введена, если это необходимо, поддерживающая доза композиции, содержащей иммуногенные частицы корового антигена НВУ. Затем доза или частота введения, либо то и другое могут быть снижены до уровня, при котором сохраняется нужный эффект. На этой стадии лечение должно быть прекращено. Однако по прошествии длительного периода времени некоторым индивидуумам может потребоваться возобновление лечения из-за рецидива данного нежелательного состояния.
Композиции, содержащие многокомпонентные или мультивалентные коровые антигенные частицы НВУ, могут быть введены подходящим способом, таким как, например, парентеральное введение, а в частности, внутримышечное или подкожное введение, а также пероральное введение. Могут быть использованы и другие способы введения, такие как, например, пульмонарное введение, введение через нос или ухо, анальное введение, чрезкожное введение, закапывание в глаза, внутривенное введение, интраартериальное введение, внутрибрюшинное введение, введение через слизистую, подъязычное введение, подкожное введение или внутричерепное введение.
Иммуногенные частицы корового антигена НВУ настоящего изобретения могут быть использованы для активной терапии НВУинфицированных индивидуумов в целях ингибирования, снижения или замедления пролиферации вируса в организме. Терапевтические композиции включают иммуногенные частицы корового антигена НВУ, способные к блокированию, ингибированию или предупреждению осуществления механизма сборки вируса. Указанные терапевтические композиции могут быть изготовлены так, чтобы они содержали носители или разбавители и один или несколько иммуногенных частиц корового антигена НВУ настоящего изобретения. Такие носители и раз бавители обсуждались выше в связи с описанием других композиций и могут быть определены любым специалистом.
Получение композиций или вакцин, содержащих иммуногенные частицы корового антигена НВУ в качестве активных ингредиентов, может быть осуществлено в целях создания инъецируемых композиций или вакцин в виде либо жидких растворов, либо суспензий. Могут быть также получены твердые формы, подходящие для получения раствора или суспензии непосредственно перед инъекцией. В некоторых вариантах осуществления изобретения полученные препараты могут быть эмульгированы или инкапсулированы в липосомы или в растворимое стекло в целях постепенного высвобождения и/или пролонгированной доставки. Альтернативно, препараты могут быть получены в форме аэрозоля или спрея. Они могут быть также включены в пластыри для чрескожного введения. Активный ингредиент может быть смешан с любым числом наполнителей, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным(и) ингредиентом(ами). Такими наполнителями являются, например, неполный адъювант Фрейнда, бактериальные липополисахариды, ионоообменные смолы, окись алюминия, стеарат алюминия, мурамилдипептид, лецитин, буферные вещества, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль.
Вакцины, содержащие коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения, могут быть преимущественно изготовлены в виде комбинированных вакцин, содержащих ряд различных иммуногенов. Такими вакцинами являются, например, комбинированная вакцина, содержащая иммуногены против двух или более патогенов, выбранных из возбудителей дифтерии, столбняка, ацеллюлярного коклюша и йаешорЫ1и8 шПиепха (возбудителя гриппа), вирусов полиомиелита, кори, свинки, краснухи, ветряной оспы, гепатита В, гепатита А или пневмококка, вызывающего пневмонию. Другими вакцинами являются вакцины, которые могут быть использованы для прививки индивидуумов перед путешествиями за границу. Такими вакцинами являются, например, вакцины, содержащие иммуногены против двух или более патогенов, выбранных из вируса желтой лихорадки, вируса гепатита В, вируса гепатита А, возбудителя брюшного тифа, возбудителя менингококкового энцефалита или возбудителя холеры.
Композиции, содержащие коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения, могут быть также использованы в иммунотерапевтических схемах для вырабатывания резистентности индивидуумов к одному или нескольким аллергенам, таким как аллергены животных, аллергены насекомых, растительные аллергены, аллергены окружающей среды и ингаляционные аллергены.
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления изобретения, коровые антигенные частицы НВУ могут быть использованы для вырабатывания антител против нужных иммуногенов в целях их использования в иммунотерапии или диагностике. Так, например, антитела, продуцированные у индивидуумов, инокулированных коровыми антигенными частицами НВУ, могут быть выделены и использованы в очищенной форме. Альтернативно, такие антитела или В-клетки, взятые от индивидуума, могут быть использованы для продуцирования моноклональных антител стандартными методами.
Методы детекции в соответствии с настоящим изобретением
Коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения могут быть также использованы в ряде анализов стандартного формата, а в частности, в иммуноанализах для диагностики инфекции или обработки инфекционными агентами. Такое применение может быть реализовано в том случае, если связывающиеся с капсидом НВУ пептидные компоненты данных конструкций настоящего изобретения ассоциированы с диагностической меткой, химическим маркером, токсином или другим белком или пептидом. Так, например, связывающиеся с капсидом НВУ пептиды могут быть ассоциированы со стандартными метками, которые способны, отдельно или в сочетании с другими композициями или соединениями, обеспечивать вырабатывание детектируемого сигнала, указывающего на присутствие мишени-аналита в образце после его обработки иммуногеном, присоединенным к пептиду, связывающемуся с коровым антигеном НВУ. Указанные детектируемые метки могут быть выбраны из многочисленных композиций, которые известны специалистам и которые легко доступны специалистам по проведению диагностических анализов.
Следовательно, настоящее изобретение не ограничивается выбором анализа конкретного формата, и очевидно, что в настоящем изобретении могут быть использованы анализы любых типов, известных специалистам. Для удобства проведения анализа могут быть использованы реагенты, поставляемые в виде наборов. Эти наборы включают микротитрационные планшеты, на которых были предварительно адсорбированы коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения; различные разбавители и буферы; меченные конъюгаты для детекции специфически связывающихся с капсидом пептидных иммуногенов; и другие генерирующие сигнал реагенты, такие как ферментные субстраты, кофакторы и хромагены. Другие компоненты могут быть легко определены самим специалистом.
Альтернативно, коровые антигенные частицы НВУ настоящего изобретения могут быть использованы в тестах для иммунологической диагностики, применяемых в настоящее время для обнаружения патогена, а именно, радиоиммуноанализ или ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец, тестируемый на присутствие антител к различным иммуногенам, может быть подвергнут контакту с коровой антигенной частицей НВУ, содержащей связывающиеся с капсидом НВУ иммуногены, меченные детектируемой меткой и имеющие различные иммуногенные компоненты, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы любые антитела, присутствующие в данном образце, образовывали комплекс с одним или несколькими связывающимися с капсидом НВУ иммуногенами. Затем могут быть использованы средства для детекции комплекса, образованного между связывающимся(щимися) с капсидом иммуногеном(нами) и указанными антителами в указанном образце. После этого может быть проведен второй скрининг данного образца на каждый иммуногенный компонент в целях идентификации специфичности данных антител в указанном образце.
В альтернативном варианте осуществления изобретения образец, тестируемый на присутствие антител к конкретному иммуногену, может быть подвергнут контакту с коровой антигенной частицей НВУ, содержащей связывающиеся с капсидом НВУ иммуногены, меченные детектируемой меткой и имеющие специфический иммуноген в качестве их иммуногенного компонента, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы антитела, присутствующие в данном образце, образовывали комплекс с одним или несколькими иммуногенами, связывающимися с капсидом НВУ. Благодаря высокой валентности специфического иммуногена, представляемого коровой антигенной частицей НВУ, такой диагностический анализ отличается более высокой чувствительностью, чем стандартные анализы.
Примеры
Для более полного понимания настоящего изобретения представлены нижеследующие примеры. При этом следует отметить, что эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.
Пример 1. Препараты корового антигена НВУ.
Экспрессию корового антигена НВУ (аа3183) или усеченного по С-концу корового антигена НВУ (аа3-148) в Ε.οοίί и их очистку осуществляли, как описано в работе Эукои & Миггау (1995). Препараты белков хранили при 4°С в виде фракций градиента сахарозы в буфере, содержащем ТВ8, сахарозу (20%) и ΝαΝ3 (0,02%). Препараты, полученные в этой форме, были стабильны в течение по крайней мере шести месяцев.
Химическое перекрестное сшивание связывающихся с капсидом ИВУ пептидов с коровым антигеном НВУ
Связывающийся с капсидом НВУ пептид МНЯЗЬЬСЯМКСЛ (Л1Ьае11ст. Шитегейу о£ ЕбшЬигдй) перекрестно сшивали с коровыми антигенными частицами НВУ с использованием гидрохлорида 1 -этил-3 -(3 -диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) и Ν-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NН8) (оба от фирмы Р1егсе Еигоре В.У.). Эти реагенты связывают примыкающие первые амино- и карбоксильные группы с образованием амидной связи [81аго§ е1 а1., ЕпЕапсетегИ Ьу №Ну6гоху8и1£о8исс1шт16е о£ \Уа1ег-8о1иЫе СагЬоп6пт16е-Ме61а1е6 Соир11пд ИеасНоп/,, Апа1уйса1 Вюскет., 156, рр. 220-22 (1986)]. При добавлении к смеси связывающийся с капсидом НВУ пептид/коровый антиген НВУ, эти реагенты должны ковалентно связывать лизин данного пептида с соседним аспартатом или глутаматом корового антигена НВУ, что приводит к увеличению его молекулярной массы.
Более конкретно, усеченный коровый антиген НВУ (15 мкг) инкубировали при комнатной температуре в буфере (30 мкл), содержащем фосфат калия (25 мМ, рН 7), №-1С1 (150 мМ), (1,8 мМ ЕЭС) и сульфо-NН8 (1,8 мМ), в присутствии или отсутствии пептида МНВ8ЕЕ6ВМК6А (1 мМ). Через 18 ч реакцию анализировали путем электрофореза в ДСН/ПААГ геле (15% мас./об.) как описано 8атЬгоок и др. (1989)]. Добавление ЕЭС и сульфоЛН8 к комплексу пептид - коровая антигенная частица НВУ приводит к соответствующему примерно 1 кДа смещению полосы, которая присутствует на ДСН-ПААГ для фракции корового антигена НВУ. Несмотря на проведение реакции в различных условиях, полученный выход составлял не более 50% от смещенной полосы белка. Это соответствует связыванию одного пептида с димером корового антигена НВУ, расположенного возле локальной оси второго порядка, и таким образом, стерическому блокированию связывания другого пептида с родственным участком второго порядка.
Пример 2. Препараты корового антигена НВУ.
Помимо двух образцов корового антигена НВУ, полученных в примере 1, были также получены образцы коровых антигенов НВУ с пре81-последовательностью 1-36 НВУ или последовательностью 111-156 или 111-165 поверхностного антигена НВУ, присоединенной к усеченному полипептиду корового антигена НВУ (усеченному по остатку 144) посредством короткой линкерной пептидной последовательности, как описано 81аЫ & Миггау (1989).
Химическое перекрестное сшивание связывающегося с капсидом НВУ пептида с коровым антигеном НВУ
Нижеследующие связывающиеся с капсидом иммуногены, полученные путем твердофазного синтеза, были получены от А1ЬасНет, Ишуег511у о£ ЕбшЬшдй:
А8-151: 68ЕЕ6ВМК6А 666 ЕЕРАЕВ6 А8-152: 68ЕЕ6ВМК6А 666 ЕСКЕ18ЕЕПЕ А8-163: ЕЕРАЕВ 66 68ЕЕ6ВМК6А А8-164: ЕЕ)КЕ18ЕЕ1)Е 66 68ЕЬ6ЯМК6А, где последовательность 68ЕЬ6ЯМК6А представляет собой связывающийся с капсидом НВУ пептид, последовательность ЕЭРАЕВ представляет собой пре-81-эпитоп или иммуноген НВУ, а последовательность Е6КЕ18ЕЕОБ представляет собой эпитоп тус-онкогенный или иммуноген. Эти пептиды и основной связывающийся с капсидом НВУ пептид 68ЕБ6ВМК6А были связаны с коровой антигенной частицей НВУ отдельно или в комбинации, при различных концентрациях, и были перекрестно сшиты с помощью ЕЭС или сульфо-NН8, как описано в примере 1.
Свойства полученных коровых антигенных частиц НВУ
Полученные продукты были проанализированы путем электрофореза в акриламидных гелях в присутствии ДСН (ДСН-ПААГ) с последующим окрашиванием кумасси-синим и проведением Вестерн-блот-анализа с использованием моноклональных антител и поликлональной кроличьей сыворотки, вырабатываемой против коровых антигенных частиц НВУ, или частиц денатурированного поверхностного антигена НВУ. Имеются в распоряжении моноклональные антитела для каждого из пре-81эпитопа НВУ и эпитопа тус-онкогенного. Такими моноклональными антителами являются, соответственно, моноклональное антитело 18/7 [К.Н. Неегтапп е1 а1., ЕУиок, 52, рр. 396-402 (1984)] и моноклональное антитело 9Е10 [Ιηνί1годеп, Са1а1од # В950-25].
Эти эксперименты показали, что продукты всех реакций перекрестного сшивания обнаруживали положительные реакции с антителами против каждого из соответствующих эпитопов в данных компонентах реакции лигирования. Положительные реакции наблюдались с иммуногеном, связанным посредством амино- или карбоксиконца данного лигандного пептида.
Как будет подробно описано ниже, препараты очищенных коровых антигенных частиц НВУ, полученные в результате реакций перекрестного сшивания с двумя или более различными иммуногенами, проводимых с использованием общего связывающегося с капсидом НВУ пептидного лиганда, реагируют с антителами против всех иммуногенных компонентов. Кроме того, коровые антигенные частицы, осаждаемые антителом, специфичным для одного из данных иммуногенов, обнаруживают пере крестную реактивность с антителами для другого(их) пептида(ов), включенного(ых) в процедуру перекрестного сшивания с лигандом.
Продукты лигирования подвергали ультрацентрифугированию в градиентах сахарозы. Эти продукты осаждали одним из указанных антител, антителом против тус, а затем анализировали путем электрофореза в ПААГ с ДСН и Вестерн-блоттинга.
Материал, осажденный одним из этих антител, например антителом против тус, обнаруживал сильную перекрестную реактивность как с антителом против тус, так и с антителом против пре-81, в Вестерн-блот-анализе. Продукты, осажденные другим антителом, антителом против пре-81, давали тот же эффект.
В реакциях, где два связывающихся с капсидом НВУ пептида, несущих различные иммуногены, были смешаны в различных соотношениях для связывания и перекрестного сшивания с коровыми частицами, анализ, проводимый путем электрофореза в ПААГ с ДСН, и Вестернблот-анализ показали, что относительные интенсивности окрашивания двумя моноклональными антителами являются показателями соотношения двух иммуногенов в смеси, используемой для перекрестного сшивания.
Эти эксперименты показали, что, по крайней мере, некоторые коровые частицы НВУ, полученные в результате указанных реакций, содержали оба ковалентно связанных с ними иммуногена. Поскольку лигандный пептид связывается с вершинами коровых антигенных частиц НВУ (нуклеокапсидов), то такие препараты будут обладать высоким иммуногенным потенциалом по отношению к обоим компонентам и должны, как ожидается, вырабатывать высокие титры антител у индивидуумов, которым они были введены.
Несмотря на представленные варианты осуществления настоящего изобретения, очевидно, что основная конструкция может быть модифицирована в целях реализации других вариантов изобретения, в которых используется способ настоящего изобретения. А поэтому следует отметить, что объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, но не конкретными вариантами осуществления изобретения, которые были проиллюстрированы вышеприведенными примерами.
Список последовательностей <110> ΒίΟΟΕΝ, 1ИС
Миггау, КеппеЬЬ <120> Коровые антигенные частицы НВУ с множественными иммуногенными компонентами, присоединенными посредством пептидных лигандов <130> АО67 РСТ <140> РСТ/О399/28755 <141> 1999-12-03 <150> 60/110911 <151> 1998-12-04 <160> 47 <170> РаЕепМп Уег. 2,1 <210> 1 <211> 9 <212> РКТ <213> вирус иммунодефицита человека <400> 1
С1у С1и Ьеи Авр Агд Тгр С1и Ьуз Не
5 <210> 2 <211> 7 <212> РКТ <213> вирус иммунодефицита человека <400> 2
С1и Ьеи Азр Ьуз Тгр А1а 5ег
5 <210> 3 <211> 12 <212> РКТ <213> вирус иммунодефицита человека <400> 3
11е С1у Рго 61у Агд А1а РЬе Туг ТЬг ТЬг Ьуз Азп
5 <210> 4 <211> 6 <212> РКТ <213> вирус иммунодефицита человека <400> 4
С1и Ьеи Азр Ьуз Тгр А1а <210> 5.
<211> 9_ <212> РКТ <213> вирус иммунодефицита человека <400> 5
Азр Агд РЬе Туг Ьуз ТЬг Ьеи Агд А1а
5 <210> 6 <211> 9 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 6
Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мер Ьуз С1у А1а
5 <210> 7 <211> 6 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 7
Ьеи Ьеи С1у Агд Мер Ьуз
5 <210> 8 <211> 10 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<221> МОО КЕЗ <222>
А1а Азр С1у А1а Ьеи Ьеи С1у Агд МеС Ьуз Рго А1а <223>
ЬА1а <220>
<210>
<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связы<211>
вающийся с капсидом
НВУ <212>
РЕТ <213>
искусственная последовательность
Зег Ьеи Ьеи С1у Агд
МеС Ьуз 61у Хаа Суз <220>
<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связы<210>
вающийся с капсидом
НВУ <211>
<400> 15 <212>
РЕТ
А1а Азр С1у Зег Ьеи
Ьеи С1у Агд МеС Ьуз Рго А1а <213>
искусственная последовательность <220>
<210>
<221>
ΜΟϋ НЕЗ <211>
<222>
(11) <212>
РЕТ <223>
ЬА1а <213>
искусственная последовательность <220>
<220 <223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связы<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связывающийся с капсидом
НВУ вающийся с капсидом
НВУ <400> 9 <400 16
Агд Зег Ьеи Ьеи С1у
Агд МеС Ьуз С1у А1а <210>
:210>
<211:
<211:
<212>
РЕТ <212>
РЕТ <213>
искусственная последовательность <213>
искусственная последовательность <220>
<220>
<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связы<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, вающийся с капсидом
НВУ вающийся с капсидом
НВУ <400> 10 <400> 17
Ηί5 Агд Зег Ьеи Ьеи
С1у Агд Мер Ьуз С1у А1а
А1а Азр С1у ТЬг Ьеи
Ьеи С1у Агд Мер Ьуз Ьеи А1а <210>
:210>
:211>
<211>
<212>
РЕТ <212>
РЕТ <213>
<2 13>
искусственная последовательность искусственная последовательность <220>
<220:
<223> Описание искусственной последовательности:
пептид, связы<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, :вязывающийся с капсидом
НВУ вающийся с капсидом
НВУ <400> 18 <220>
<221>
ΜΟϋ ЕЕЗ
А1а Азр 31у Зег Ьеи
Ьеи С1у Агд Мер Ьуз С1у А1а <222>
(11) <223>
ЬА1а <210>
<211>
Агд Зег Ьеи Ьеи С1у
Агд МеЬ Ьуз 61у А1а Хаа Суз <212>
РЕТ <213>
искусственная последовательность <210>
<220>
<211>
<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связы<212>
РЕТ вающийся с капсидом
НВУ <213>
искусственна;
последовательность <400> 19 <220>
А1а Азр Агд Зег Ьеи
Ьеи С1у Агд Мер Ьуз С1у А1.
<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связы10 вающийся с капсидом
НВУ <210>
<400> 12 <211>
<210>
<211>
<212>
РЕТ <213>
искусственная <220>
<223>
Мер Ьуз С1у <212>
<213>
<220>
<223>
последовательность
Описание искусственной последовательности:
пептид, связыРЕТ искусственная последовательность
Описание искусственной последовательности:
вающийся с капсидом <400> 20
НВУ пептид, связыЗег Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мер Ьуз С1у А1а вающийся с капсидом
НВУ <210>
<400> 13 <211>
А1а Азр 61у А1а Ьеи
Ьеи С1у Агд Мер Ьуз С1у А1а <212:
РЕТ :213>
искусственная последовательность <210>
<220>
<211>
<223>
Описание искусственной последовательности: пептид, связы<212:
РЕТ вающийся с капсидом НВУ <213>
искусственная последовательность <400> 21 <220:
<223>
Описание искусственной последовательности:
пептид, связыА1а Азр 31у А1а ΗΪ3 Зег Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мер Ьуз 31у А1а вающийся с капсидом НВУ <400> 14 <210> 22 <211> 15 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 22
А1а Азр С1у Н13 Агд Зег Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мес Ьуз О1у А1а
10 15 <210> 23 <211> 15 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 23
А1а Азр С1у Рго Агд Зег Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мес Ьуз С1у А1а 15 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 24
А1а Азр С1у А1а Ηίε Агд Зег Ьеи Ьеи О1у Агд МеС Ьуз С1у А1а
10 15 <210> 25 <211> 15 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 25
А1а Азр 61у Туг 61п Агд Зег Ьеи Ьеи С1у Агд МеС. Ьуз С1у А1а
10 15 <210> 26 <211> 15 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 26
А1а Азр С1у ТЬг О1п Агд Зег Ьеи Ьеи О1у Агд МеС: Ьуз С1у А1а 15 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 27
А1а Азр С1у МеС Ηίδ Агд Зег Ьеи Ьеи 61у Агд МеС Ьуз С1у А1а 15 10 15 <210> 28 <211> 7 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 28
Ьеи Ьеи 61у Агд МеС Ьуз С1у
5 <210> 29 <211> 6 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связы вающийся с капсидом ΗΒν <400> 29
Ьеи С1у Агд МеС Ьуз С1у
5 <210> 30 <211> 5 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 30
С1у Агд МеС Ьуз 61у
5 <210> 31 <211> 5 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400 31
Ьеи Ьеи 61у Агд Мес
5 <210> 32 <211> 8 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 32
Суз Ьеи Ьеи О1у Агд Мес Ьуз Суз
5 <210> 33 <211> 8 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 33
А1а Ьеи Ьеи Рго Агд МеС Ьуз С1у
5 <210 34 <211> 8 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 34
5ег Ьеи Ьеи С1у Агд МеС Ьуз С1у
5 <210> 35 <211> 7 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <2 20>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 35
5ег Ьеи Ьеи С1у Агд МеС Ьуз
5 <210> 36 <211> 10 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <40 0 36
С1у Зег Ьеи Ьеи 01у Агд МеС Ьуз С1у А1а
10 <210> 37 <211> 12 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 37
Азр С1у Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мек Ьуз С1у А1а А1а
10 <210> 38 <211> 14 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 37
А1а Азр С1у Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мек Ьуз 61у А1а А1а С1у 15 10 <210> 39 <211> 10 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 39
Азр Суз Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мек Ьуз С1у
10 <210> 40 <211> 12 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 40
Мек Н1з Агд Зег Ьеи Ьеи 61у Агд Мек Ьуз О1у А1а
5 10 <210> 41 <211> 16 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<221> ΜΟϋ АЕЗ <222> (14) <223> ЬА1а <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом НВУ <400> 41
Мек ΗΪ3 Агд Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мек Ьуз С1у А1а С1у Хаа С1у Суз 15 10 15 <210> 42 <211> 20 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 42
С1у Зег Ьеи Ьеи 61у Агд Мек Ьуз О1у А1а С1у С1у С1у Ьеи Азр Рго
10 15
А1а РЬе Агд С1у <210> 43 <211> 23 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν
<4 0 0> 43
С1у Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мек Ьуз С1у А1а С1у С1у О1у С1и С1п Ьуз
1 5 10 15
Ьеи 11е Зег С1и С1и Азр Ьеи
20
<210> 44
<211> 18
<212> РАТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид, связывающийся с капсидом ΗΒν <400> 44
Ьеи Азр Рго А1а РЬе Агд С1у С1у С1у Зег Ьеи Ьеи С1у Агд Мек Ьуз
10 15
С1у А1а <210> 45 <211> 22 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: онкогенный эпитоп или иммуноген тус <400> 45
С1и С1п Ьуз
Ьеи
Не
Зег С1и С1и Азр Ьеи С1у С1у О1у
Зег Ьеи Ьеи
61у Агд Мек
Ьуз
С1у
А1а <210>
<211>
<212>
РАТ <213:
искусственная последовательность <220:
<223>
Описание искусственной последовательности: пре-31-эпитоп или иммуноген ΗΒν
Ьеи Азр Рго А1а РЬе Агд
5 <210> 47 <211> 10 <212> РАТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: онкогенный эпитоп или иммуноген тус <400> 47
С1и С1п Ьуз Ьеи Не Зег С1и С1и Азр Ьеи
10

Claims (58)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Коровая антигенная частица НВУ, имеющая множественную иммуногенную специфичность, причем указанная частица содержит по крайней мере один связывающийся с капсидом иммуноген, который включает по крайней мере один связывающийся с капсидом НВУ пептидный компонент и по крайней мере один иммуногенный компонент.
  2. 2. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген ориентирован на указанной частице так, что это позволяет указанному иммуногенному компоненту вызывать иммунный ответ при введении указанной частицы индивидууму.
  3. 3. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством любого аминокислотного остатка указанного пептидного компонента, связывающегося с капсидом НВУ.
  4. 4. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством любого аминокислотного остатка или другого остатка указанного иммуногенного компонента.
  5. 5. Коровая антигенная частица НВУ по п.4, где указанным другим остатком указанного иммуногенного компонента является углевод.
  6. 6. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством аминоконца указанного пептидного компонента, связывающегося с капсидом НВУ.
  7. 7. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген присоединен к указанной частице посредством карбоксиконца указанного пептидного компонента, связывающегося с капсидом НВУ.
  8. 8. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген перекрестно сшит с указанной частицей посредством перекрестно-сшивающего линкера.
  9. 9. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом НВУ пептидному компоненту либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  10. 10. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный иммуногенный компонент присоединен к аминоконцу указанного связывающегося с капсидом НВУ пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  11. 11. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный иммуногенный компонент присоединен к карбоксиконцу указанного связывающегося с капсидом НВУ пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  12. 12. Коровая антигенная частица НВУ по любому из пп.9-11, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом НВУ пептидному компоненту посредством перекрестно-сшивающего линкера.
  13. 13. Коровая антигенная частица НВУ по п.8, где указанным перекрестно-сшивающим линкером является многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер.
  14. 14. Коровая антигенная частица НВУ по п.12, где указанным перекрестно-сшивающим линкером является многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер.
  15. 15. Коровая антигенная частица НВУ по п.14, где указанный многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер выбран из группы, состоящей из гидрохлорида 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида и Νгидроксисульфосукцинимида.
  16. 16. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный иммуногенный компонент включает один или несколько эпитопов, вы бранных из группы, состоящей из иммуногенных эпитопов и антигенных эпитопов.
  17. 17. Коровая антигенная частица НВУ по п.16, где указанные эпитопы выбраны из группы, состоящей из линейных эпитопов, конформационных эпитопов, одиночных эпитопов и смешанных эпитопов.
  18. 18. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из антигенов, аллергенов, антигенных детерминант, белков, гликопротеинов, антител, фрагментов антител, пептидов, пептидных мимотопов, имитирующих антиген или антигенную детерминанту, полипептидов, гликопептидов, углеводов, олигосахаридов, полисахаридов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов.
  19. 19. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный иммуногенный компонент нацелен на агент или происходит из агента, выбранного из группы, состоящей из вирусов, паразитов, микобактерий, бактерий, бацилл, грибов, простейших микроорганизмов, растений, фагов, клеток животных и клеток растений.
  20. 20. Коровая антигенная частица НВУ по п.19, где указанный вирус выбран из группы, состоящей из ретровирусов, герпесвирусов, ортомиксовирусов, парамиксовирусов, гепаднавирусов, флавивирусов, пикорнавирусов, паповавирусов, аденовирусов, бакуловирусов, хантавирусов, парвовирусов, энтеровирусов, риновирусов, онковирусов, ДНК-вирусов, РНКвирусов, тогавирусов, рабдовирусов и поксвирусов.
  21. 21. Коровая антигенная частица НВУ по п.20, где указанный вирус, выбран из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека типа 1, вируса иммунодефицита человека типа 2, вируса Т-клеточного лейкоза, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барра, вируса гриппа А, вируса гриппа В, вируса гриппа С, респираторносинцитиального вируса, вируса псевдокори, вируса свинки, вируса парагриппа, вируса гепатита В; вируса гепатита С, вируса гепатита А, вируса гепатита Е, вируса желтой лихорадки, вируса малярии, вируса денге, вируса клещевого энцефалита, онковируса, вируса полиомиелита, папилломавируса, вируса коровой краснухи, рабивируса и вируса коровьей оспы.
  22. 22. Коровая антигенная частица НВУ по п.19, где указанный иммуногенный компонент нацелен на бациллы, энтеробактерии, клостридии, листерии, микобактерии, псевдомонады, стафилококки, эубактерии, микоплазмы, хламидии, спирохеты, нейссерии или сальмонеллы, либо происходит от указанных бактерий.
  23. 23. Коровая антигенная частица НВУ по п.19, где указанный иммуногенный компонент нацелен на дифтерию, столбняк, ацеллюлярный коклюш, грипп, вызываемый йаеторЫ1ик 1п£1и епха, полиомиелит, корь, свинку, коревую краснуху, ветряную оспу, вирус гепатита В, вирус гепатита А, пневмонию, вызываемую пневмококком, желтую лихорадку, малярию, брюшной тиф, менингококковый энцефалит или холеру.
  24. 24. Коровая антигенная частица НВУ по п.18, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из аллергенов животных, аллергенов насекомых, растительных аллергенов, аллергенов окружающей среды и ингаляционных аллергенов.
  25. 25. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанным коровым антигеном НВУ является гибридный белок корового антигена НВУ.
  26. 26. Коровая антигенная частица НВУ по п.25, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает иммуногенный или антигенный эпитоп.
  27. 27. Коровая антигенная частица НВУ по п.26, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает эпитоп, иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп, присоединенный к коровому антигену НВУ либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  28. 28. Коровая антигенная частица НВУ по п.26, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп, присоединенный к карбоксиконцу указанного корового антигена НВУ либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  29. 29. Коровая антигенная частица НВУ по п.26, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает иммуногенный эпитоп или антигенный эпитоп, присоединенный к аминоконцу указанного корового антигена НВУ либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  30. 30. Коровая антигенная частица НВУ по п.25, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает усеченный коровый антиген НВУ.
  31. 31. Коровая антигенная частица НВУ по п.25, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает поверхностный антиген НВУ или его части.
  32. 32. Коровая антигенная частица НВУ по п.31, где указанный гибридный белок корового антигена НВУ включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из пре-81области поверхностного антигена НВУ, пре-82области поверхностного антигена НВУ, иммунодоминантной а-области поверхностного антигена НВУ и их частей.
  33. 33. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанным коровым антигеном НВУ является полноразмерный полипептид корового антигена НВУ, или его фрагменты, усеченные варианты, мутированные варианты или производные, способные к сборке в корпускулярную форму.
  34. 34. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом НВУ пептидный компонент выбран из группы, состоящей из
    8ЬЬ6ВМК6А (8ЕС) ГО N0: 6), 68ЬЬ6ВМК6А (8ЕС) ГО N0: 36), П68ЬЬ6ВМК6АА (8ЕС) ГО N0: 37), АП68ЬЬ6ВМК6АА6 (81 А) ГО N0: 38), 8ЬЬ6ВМК6(в-А)С (8ЕС) ГО N0: 8), В8ЬЬ6ВМК6А (8ЕС) ГО N0: 9), НВ8ЬЬ6КМК6А (8ЕС) ГО N0: 10), АЬЬбВМКб (8ЕС) ГО N0: 12), МНВ8ЬЬ6ВМК6А (8ЕС) ГО N0: 40), В8ЬЬ6ВМК6А(в-А)С (8ЕС) ГО N0: 11) и МНВ8ЬЬ6ВМК6А6(в-А)6С (8 ЕС) ГО
    N0: 41).
  35. 35. Вакцина, содержащая профилактически эффективное количество коровой антигенной частицы НВУ по п.1.
  36. 36. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество коровой антигенной частицы НВУ по п.1.
  37. 37. Способ продуцирования иммунного ответа у индивидуума, включающий стадии введения указанному индивидууму коровой антигенной частицы НВУ по п.1, в количестве, эффективном для продуцирования иммунного ответа.
  38. 38. Способ по п.37, где указанную коровую антигенную частицу НВУ вводят указанному индивидууму парентерально.
  39. 39. Способ повышения иммуногенности иммуногена путем присоединения указанного иммуногена к коровой антигенной частице НВУ посредством связывающегося с капсидом НВУ пептида, охарактеризованного в п.34.
  40. 40. Коровая антигенная частица НВУ по п.1, где указанный связывающийся с капсидом иммуноген включает диагностическую метку или химический маркер.
  41. 41. Способ обнаружения присутствия антител против иммуногена в образце, включающий стадии (а) контактирования данного образца с коровой антигенной частицей НВУ по п.40, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы любые антитела, присутствующие в указанном образце, образовывали комплекс с указанным связывающимся с капсидом иммуногеном и (Ы) использования средств для обнаружения данного комплекса, образованного между связывающимся с капсидом иммуногеном и указанными антителами в указанном образце.
  42. 42. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген, включающий по крайней мере один связывающийся с капсидом НВУ пептидный компонент и по крайней мере один иммуногенный компонент, где указанный им муногенный компонент не представляет собой коровый антиген НВУ.
  43. 43. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом НВУ пептиду либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  44. 44. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент присоединен к аминоконцу указанного связывающегося с капсидом НВУ пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  45. 45. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент присоединен к карбоксиконцу указанного связывающегося с капсидом НВУ пептидного компонента либо непосредственно, либо посредством линкерной последовательности.
  46. 46. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по любому из пп.42-44, где указанный иммуногенный компонент присоединен к указанному связывающемуся с капсидом НВУ пептидному компоненту посредством перекрестно-сшивающего линкера.
  47. 47. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.46, где указанным перекрестно-сшивающим линкером является многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер.
  48. 48. Связывающийся с капсидом НВУ пеп- тидный иммуноген по п.47, где указанный многофункциональный перекрестно-сшивающий линкер выбран из группы, состоящей из гидрохлорида 1 -этил-3 -(3 -диметиламинопропил) карбодиимида и Ν-гидроксисульфосукцинимида.
  49. 49. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент включает один или несколько эпитопов, выбранных из группы, состоящей из иммуногенных эпитопов и антигенных эпитопов.
  50. 50. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.49, где указанные эпитопы выбраны из группы, состоящей из линейных эпитопов, конформационных эпитопов, одиночных эпитопов и смешанных эпитопов.
  51. 51. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из антигенов, аллергенов, антигенных детерминант, белков, гликопротеинов, антител, фрагментов антител, пептидов, пептидных мимотопов, имитирующих антиген или антигенную детерминанту, полипептидов, гликопептидов, углеводов, олигосахаридов, полисахаридов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов.
  52. 52. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент нацелен на агент или происходит из агента, выбранного из группы, состоящей из вирусов, паразитов, микобактерий, бактерий, бацилл, грибов, простейших микроорганизмов, растений, фагов, клеток животных и клеток растений.
  53. 53. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.52, где указанный вирус выбран из группы, состоящей из ретровирусов, герпесвирусов, ортомиксовирусов, парамиксовирусов, гепаднавирусов, флавивирусов, пикорнавирусов, паповавирусов, аденовирусов, бакуловирусов, хантавирусов, парвовирусов, энтеровирусов, риновирусов, онковирусов, ДНКвирусов, РНК-вирусов, тогавирусов, рабдовирусов и поксвирусов.
  54. 54. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.53, где указанный вирус, выбран из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека типа 1, вируса иммунодефицита человека типа 2, вируса Тклеточного лейкоза, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барра, вируса гриппа А, вируса гриппа В, вируса гриппа С, респираторно-синцитиального вируса, вируса псевдокори, вируса свинки, вируса парагриппа, вируса гепатита В; вируса гепатита С, вируса гепатита А, вируса гепатита Е, вируса желтой лихорадки, вируса малярии, вируса денге, вируса клещевого энцефалита, вируса полиомиелита, вируса коревой краснухи, рабивируса и вируса коровьей оспы.
  55. 55. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент нацелен на бациллы, энтеробактерии, клостридии, листерии, микобактерии, псевдомонады, стафилококки, эубактерии, микоплазмы, хламидии, спирохеты, нейссерии или сальмонеллы, либо происходит от указанных бактерий.
  56. 56. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент нацелен на дифтерию, столбняк, ацеллюлярный коклюш, грипп, вызываемый ЬаеторЫ1и8 тПиепха. полиомиелит, корь, свинку, коревую краснуху, ветряную оспу, вирус гепатита В, вирус гепатита А, пневмонию, вызываемую пневмококком, желтую лихорадку, малярию, брюшной тиф, менингококковый энцефалит или холеру.
  57. 57. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный иммуногенный компонент выбран из группы, состоящей из аллергенов животных, аллергенов насекомых, растительных аллергенов, аллергенов окружающей среды и ингаляционных аллергенов.
  58. 58. Связывающийся с капсидом НВУ пептидный иммуноген по п.42, где указанный свя
EA200100619A 1998-12-04 1999-12-03 Коровые антигенные частицы hbv с множественными иммуногенными компонентами, связанными посредством пептидных лигандов EA004497B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11091198P 1998-12-04 1998-12-04
PCT/US1999/028755 WO2000032625A1 (en) 1998-12-04 1999-12-03 Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200100619A1 EA200100619A1 (ru) 2001-12-24
EA004497B1 true EA004497B1 (ru) 2004-04-29

Family

ID=22335607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200100619A EA004497B1 (ru) 1998-12-04 1999-12-03 Коровые антигенные частицы hbv с множественными иммуногенными компонентами, связанными посредством пептидных лигандов

Country Status (23)

Country Link
US (5) US6627202B2 (ru)
EP (3) EP1135408B1 (ru)
JP (2) JP2002532387A (ru)
KR (1) KR100715954B1 (ru)
CN (1) CN1179973C (ru)
AT (1) ATE525388T1 (ru)
AU (1) AU770225B2 (ru)
BR (1) BR9915942A (ru)
CA (1) CA2352738A1 (ru)
CZ (1) CZ20011907A3 (ru)
DK (1) DK1135408T3 (ru)
EA (1) EA004497B1 (ru)
EE (1) EE200100292A (ru)
HK (3) HK1041272B (ru)
HU (1) HU229222B1 (ru)
IL (1) IL143475A0 (ru)
IS (1) IS5957A (ru)
NO (1) NO20012760L (ru)
NZ (1) NZ512056A (ru)
PL (1) PL348766A1 (ru)
SK (1) SK7602001A3 (ru)
TR (1) TR200102423T2 (ru)
WO (1) WO2000032625A1 (ru)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9915771A (pt) * 1998-11-30 2001-12-26 Cytos Biotechnology Ag Apresentação molecular ordenada de antìgenos,processo de preparação e utilização
PL348766A1 (en) * 1998-12-04 2002-06-03 Biogen Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands
US6942866B2 (en) 2000-08-16 2005-09-13 Apovia, Inc. Malaria immunogen and vaccine
US7128911B2 (en) * 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) * 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US20030219459A1 (en) * 2002-01-18 2003-11-27 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
US8101189B2 (en) 2002-07-05 2012-01-24 Folia Biotech Inc. Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them
CN1665528B (zh) * 2002-07-05 2013-05-15 弗利亚生物技术公司 佐剂病毒颗粒
CA2489410C (en) 2002-07-17 2015-01-13 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays
IN2008CN05409A (ru) 2002-07-18 2015-10-02 Cytos Biotechnology Ag
WO2004016282A1 (en) * 2002-07-19 2004-02-26 Cytos Biotechnology Ag Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays
CN100381463C (zh) * 2002-09-18 2008-04-16 中国人民解放军免疫学研究所 用于生产治疗用乙型肝炎疫苗或药物的免疫原及其制备方法和用途
US7537767B2 (en) * 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
US20060210588A1 (en) * 2003-03-26 2006-09-21 Cytos Biotechnology Ag Hiv-peptide-carrier-conjugates
EP1606398A1 (en) 2003-03-26 2005-12-21 Cytos Biotechnology AG Melan-a peptide analogue-virus-like-particle conjugates
US20070298432A1 (en) * 2003-11-07 2007-12-27 Hep-Genics Pty Ltd Binding Assay Components
CN1905903A (zh) * 2004-01-20 2007-01-31 赛托斯生物技术公司 生长素释放肽－载体偶联物
CA2567741A1 (en) * 2004-05-25 2006-03-30 Chimeracore, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
KR100746991B1 (ko) 2004-08-06 2007-08-08 한국과학기술연구원 Ｈｂｖ 코아 단백질과 표면 단백질 간 상호작용의 측정을이용한 ｈｂｖ의 증식 억제물질의 검색방법
US20060052414A1 (en) * 2004-08-13 2006-03-09 Migenix, Inc. Compositions and methods for treating or preventing Hepadnaviridae infection
WO2006045796A2 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Cytos Biotechnology Ag Gastric inhibitory polypeptide (gip) antigen arrays and uses thereof
US9603921B2 (en) 2004-10-27 2017-03-28 Janssen Vaccines Ag Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus
GB0424563D0 (en) * 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
DE102005008765B4 (de) * 2005-02-25 2016-06-16 Siemens Healthcare Gmbh Kontrastmittel auf der Basis von Bakteriophagen, diese enthaltende Zusammensetzung, deren Verwendung und Verfahren zu deren Herstellung
JP2009533350A (ja) * 2006-04-07 2009-09-17 キメロス， インコーポレイテッド Ｂ細胞悪性疾患を処置するための組成物および方法
US20100047264A1 (en) 2006-11-15 2010-02-25 Folia Biotech Inc. Immunogenic Affinity-Conjugated Antigen Systems Based on Papaya Mosaic Virus and Uses Thereof
CA2669485C (en) * 2006-11-15 2017-01-03 Folia Biotech Inc. Papaya mosaic virus-based vaccines for influenza
WO2008089569A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Folia Biotech Inc. Papaya mosaic virus-based vaccines against salmonella typhi and other enterobacterial pathogens
JP5428017B2 (ja) * 2007-03-23 2014-02-26 国立大学法人 熊本大学 ワクチン剤
WO2008124165A2 (en) * 2007-04-09 2008-10-16 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
KR20100047343A (ko) * 2007-08-30 2010-05-07 바이렉스 메디칼 코포레이션 항원 조성물 및 핵산의 표적화된 전달에서의 이의 용도
KR100949310B1 (ko) * 2007-11-21 2010-03-23 한국과학기술연구원 세포 영상 기법을 이용한 ｈｂｖ 캡시드 단백질과 표면단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ｈｂｖ 증식억제물질의 검색방법
CN102083979B (zh) * 2008-05-09 2015-01-07 新加坡科技研究局 Hbv表位反应性外源t细胞受体(tcr)及其用途
WO2010042743A2 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric multiplexes, compositions, and methods for using same
CN101503461B (zh) * 2009-02-12 2011-09-07 北京大学人民医院 一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
CA2770075C (en) 2009-08-07 2021-08-24 Perrine Martin Composition for treating hbv infection
WO2011136506A2 (ko) * 2010-04-30 2011-11-03 중앙대학교 산학협력단 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법
EP2747774A4 (en) 2011-09-09 2015-02-11 Biomed Realty L P METHOD AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING VIRUS PROTECTION
EP2948469A4 (en) * 2013-01-23 2016-11-02 Univ Leland Stanford Junior STABILIZED HEPATITIS B CORE POLYPEPTIDE
GB201402890D0 (en) * 2014-02-18 2014-04-02 Iqur Ltd Vaccines based on hepatitis B Core antigens
JPWO2015133467A1 (ja) * 2014-03-06 2017-04-06 株式会社シノテスト Ｃ型肝炎ウイルスのワクチン及び診断に用いるためのＨＢｃ／ＨＣＶ Ｅ２ペプチドキメラタンパク質
EP3170509A4 (en) 2014-07-18 2017-12-27 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Vaccine containing virus-like particles
WO2017041083A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-09 Inventprise, Llc Vlp stabilized vaccine compositions
AU2016348675B2 (en) * 2015-11-04 2022-11-17 Hookipa Biotech Gmbh Vaccines against Hepatitis B virus
CA3009799A1 (en) * 2016-01-04 2017-07-13 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Particles encapsulating fusion proteins containing linked epitopes
CN107056947B (zh) * 2016-12-23 2021-04-20 中国人民解放军第四军医大学 抗hbv复制的靶向融合蛋白及其构建方法
US11793873B2 (en) 2017-05-10 2023-10-24 University Of Massachusetts Bivalent dengue/hepatitis B vaccines
AU2018285412B2 (en) 2017-06-14 2022-06-23 Universität Zürich Cyclic peptides for protection against respiratory syncytial virus
US11285203B2 (en) 2017-06-23 2022-03-29 Verimmune Inc. Chimeric virus-like particles and uses thereof as antigen-specific redirectors of immune responses
WO2020071869A1 (ko) * 2018-10-05 2020-04-09 알엔에이진 주식회사 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도
EP3897708A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Virometix AG Lipopeptide building blocks and synthetic virus-like particles
US11560408B2 (en) 2018-12-27 2023-01-24 Verimmune Inc. Conjugated virus-like particles and uses thereof as anti-tumor immune redirectors
CN113508125A (zh) 2018-12-28 2021-10-15 小利兰·斯坦福大学托管委员会 工程化乙型肝炎核心多肽
US20230355737A1 (en) 2020-09-28 2023-11-09 Dbv Technologies Particle comprising an rsv-f protein for use in rsv vaccination
JP2023552040A (ja) 2020-10-19 2023-12-14 ヴェリミューン インコーポレイテッド ウイルスにインスパイアされた組成物及びがんの治療のために同じものを使用して、既存の免疫応答をリダイレクトする方法
CN116751262A (zh) * 2023-07-31 2023-09-15 重庆医科大学国际体外诊断研究院 靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的多肽及其应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK171727B1 (da) 1978-12-22 1997-04-14 Biogen Inc Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion
US5204096A (en) 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US5296572A (en) 1986-04-30 1994-03-22 James Sparrow Large pore polyamide resin and method of preparation thereof
CA1338800C (en) 1986-06-17 1996-12-17 Michael Houghton Hepatitis delta and diagnostics and vaccines
US4818527A (en) 1986-12-09 1989-04-04 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US4882145A (en) * 1986-12-09 1989-11-21 Scripps Clinic And Research Foundation T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
US5143726A (en) * 1986-12-09 1992-09-01 The Scripps Research Institute T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein
GB8903313D0 (en) 1989-02-14 1989-04-05 Wellcome Found Conjugates
JPH02273700A (ja) 1989-04-14 1990-11-08 Olympus Optical Co Ltd ペプチド
US5547669A (en) 1989-11-03 1996-08-20 Immulogic Pharma Corp Recombinant peptides comprising T cell epitopes of the cat allergen, Fel d I
KR940000755B1 (ko) 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US5556744A (en) 1992-05-29 1996-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients
US5531990A (en) 1993-12-15 1996-07-02 Health Research, Inc. Method of raising an immune response with an anti-idiotypic antibody having correspondence with human hepatitis B surface antigen
US5856459A (en) 1995-06-06 1999-01-05 Hybridon, Inc. Oligonucleotides specific for hepatitis B virus
US6207157B1 (en) * 1996-04-23 2001-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Conjugate vaccine for nontypeable Haemophilus influenzae
WO1998018818A2 (en) 1996-10-31 1998-05-07 Biogen, Inc. Hepatitis b inhibitors
PL348766A1 (en) * 1998-12-04 2002-06-03 Biogen Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands

Also Published As

Publication number Publication date
TR200102423T2 (tr) 2002-02-21
CZ20011907A3 (cs) 2002-01-16
US20040234554A1 (en) 2004-11-25
US7226603B2 (en) 2007-06-05
AU770225B2 (en) 2004-02-19
EP2351768A1 (en) 2011-08-03
HK1041272A1 (en) 2002-07-05
WO2000032625A1 (en) 2000-06-08
US20030198649A1 (en) 2003-10-23
EP1135408B1 (en) 2011-09-21
US6827937B2 (en) 2004-12-07
PL348766A1 (en) 2002-06-03
EP2360174B1 (en) 2014-04-09
SK7602001A3 (en) 2002-03-05
EP2351768B1 (en) 2014-06-18
JP2002532387A (ja) 2002-10-02
EE200100292A (et) 2002-08-15
NO20012760D0 (no) 2001-06-05
US20070280962A1 (en) 2007-12-06
US20120321659A1 (en) 2012-12-20
HUP0104946A2 (hu) 2002-04-29
IS5957A (is) 2001-05-31
EP2360174A1 (en) 2011-08-24
AU1841700A (en) 2000-06-19
HK1161606A1 (en) 2012-07-27
JP2008074867A (ja) 2008-04-03
ATE525388T1 (de) 2011-10-15
HU229222B1 (en) 2013-09-30
HK1041272B (zh) 2012-08-03
IL143475A0 (en) 2002-04-21
NZ512056A (en) 2004-01-30
BR9915942A (pt) 2001-08-21
HUP0104946A3 (en) 2004-10-28
EA200100619A1 (ru) 2001-12-24
KR100715954B1 (ko) 2007-05-09
US6627202B2 (en) 2003-09-30
CA2352738A1 (en) 2000-06-08
CN1179973C (zh) 2004-12-15
US8168190B2 (en) 2012-05-01
KR20010081068A (ko) 2001-08-25
NO20012760L (no) 2001-08-06
CN1332749A (zh) 2002-01-23
DK1135408T3 (da) 2012-01-23
HK1160652A1 (en) 2012-08-10
EP1135408A1 (en) 2001-09-26
US20020064533A1 (en) 2002-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004497B1 (ru) Коровые антигенные частицы hbv с множественными иммуногенными компонентами, связанными посредством пептидных лигандов
US7311916B2 (en) Methods of eliciting broadly neutralizing antibodies targeting HIV-1 gp41
JPH03502687A (ja) レスピラトリイ・シンシチアル・ウイルス：ワクチンおよび診断法
JP2009067810A (ja) 合成ペプチドとそれを含むワクチン
JPH06509237A (ja) ワクチンとしてのネコ白血病ウィルスｇｐ７０からの融合蛋白質
CA1271717A (en) Polypeptides useful in vaccination against enteroviruses
AU605574B2 (en) Human rhinovirus peptides
MXPA01005613A (es) Particulas de antigeno del nucleo del hbv con multiples componentes inmunogenicos unidos mediante ligandos de peptido

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU