WO2020071869A1 - 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도 - Google Patents

표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도

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WO2020071869A1
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antigen and its use with multiple immune functions enhanced by specifically binding to target cells.
  • Immunity has innate immunity, which is the ability of everyone born from birth, and acquired immunity that is acquired. Immunity in the general sense refers to acquired immunity. Unlike innate immunity, which is known as non-specific immunity, acquired immunity is also called specific immunity. Lymphocytes and antibodies play an important role in recognizing and responding to the type of invading pathogen. That is, B lymphocytes and T lymphocytes circulating in the body are in charge. They have receptors that recognize specific antigens on the surface, so recognizing antigens activates humoral and cellular immunity, respectively.
  • Antibodies and antibodies are involved in acquired immunity. Antigens are recognized as non-self, such as pathogens, foreign substances, and organ tissues of other species, and are substances that cause acquired immune responses. In order to do this, it is a substance produced by B lymphocytes and binds to specific antigens to destroy pathogenicity. In addition, it has the function of remembering the type of the pathogen that has invaded once, so it can effectively cope with this when the same pathogen invades a second time. Acquired immunity is an action that occurs after the pathogen completely invades the body and is called 'secondary defense' because it progresses after the innate immunity. Acquired immunity has cellular immunity and humoral immunity.
  • T lymphocytes and B lymphocytes The surface of T lymphocytes and B lymphocytes has receptors that recognize specific antigens, and recognition of antigens activates cellular immunity and humoral immunity, respectively.
  • toxic T lymphocytes that recognize antigens directly attack and remove cells or cancer cells infected with pathogens
  • helper T lymphocytes that recognize antigens are B lymphocytes. Stimulates to differentiate and proliferate into plasma cells that secrete antibodies and memory cells that store antigens. As a result, the generation of memory cells enables a faster and stronger immune response to pathogenic antigens that have re-invaded later.
  • antigen-antibody reaction When plasma cells secrete the antibody into the blood, the antibody binds to the antigen, causing an antigen-antibody reaction to remove the antigen.
  • Antibodies attach to the invading microorganisms, thereby destroying the motility of the microorganisms and preventing them from entering the somatic cells.
  • antigens surrounded by antibodies cause chemical chain reactions with complements, a series of proteins found in plasma. This complement reaction causes decomposition of the invading microorganisms or attracts macrophages that eat up the invading microorganisms.
  • the reaction and binding of all kinds of antigens and antibodies is referred to as antigen-antibody reactions.
  • Humoral immunity can be divided into primary and secondary immune responses in stages.
  • lymphocytes differentiate when the antigen first invades to produce antibodies.
  • memory cells are formed.
  • the secondary immune response is a process in which memory cells rapidly differentiate and proliferate into plasma cells when the same antigen re-invades, producing a large amount of antibodies, leading to a faster and stronger immune response.
  • the adaptive immune system composed of T and B lymphocytes has a strong anti-cancer potential, along with the ability to respond to various tumor antigens. Additionally, the immune system has significant plasticity and memory components, and due to these adaptive immune system properties, immunotherapy can be the more effective of all cancer treatment methods.
  • endogenous immune responses to cancer have been observed in preclinical models and patients, these responses are not effective, and settled cancers are considered "self" and are tolerated by the immune system.
  • tumors can exploit other mechanisms to actively destroy anti-tumor immunity, which mechanisms are responsible for avoiding dysfunctional T-cell signaling, inhibitory regulatory cells and immune destruction. It utilizes an endogenous "immune checkpoint" that acts to protect normal tissues from collateral damage and lower the intensity of the adaptive immune response.
  • T cells are exhausted and inactivated, giving an advantage to viruses or bacteria or tumors.
  • Tex exhausted T cells
  • researchers have identified nine types of exhausted T cells (Tex) that are significant in the interaction of chronic infection with autoimmunity and cancer. When normal T cells are exhausted, defects occur in their ability to respond to bacteria or tumors.
  • Tex expresses an inhibitory receptor protein that stops important biochemical pathways on its surface, alters the regulation of gene expression, alters the metabolism that produces energy to fight infections and tumors, and inhibits the development of optimal immune function. Applying this kind of assessment of exhausted T cells in immunotherapy clinical trials identifies patients who are likely to benefit from a particular combination of immunotherapy, and certain types of exhausted T cells that respond to infection or cancer. It is possible to understand the underlying mechanism.
  • cancer immunotherapy has focused research on ways to increase the anti-tumor immune response by providing adaptive metastasis of activated effector cells, immunization against related antigens, or providing non-specific immunostimulants such as cytokines. come.
  • cytokines non-specific immunostimulants
  • it has begun to provide a new immunotherapeutic approach to treating cancer, which is a cytotoxic T-lymphocyte to treat patients with advanced melanoma.
  • antibodies that block the inhibitory PD-1 pathway such as ipilimumab, an antibody (Ab) that binds and inhibits antigen-4 (CTLA-4).
  • PD-1 programmed death-1
  • PD-1 is a major immune checkpoint receptor expressed by activated T and B cells and mediates immunosuppression.
  • PD-1 is a 55kDa type I transmembrane protein, which forms part of the Ig superfamily and is well known as a co-inhibitor of T cells belonging to the immunoglobulin molecule family.
  • PD-1 is a member of the CD28 family of receptors, including receptors expressed on activated B cells, T cells and bone marrow cells, namely CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 and BTLA.
  • PD-1 programmed death ligand-1
  • PD-L2 programmed death ligand-2
  • PD-1 programmed death ligand-1
  • PD-L2 programmed death ligand-2
  • It is expressed on many human cancers and has been shown to down-regulate cytokine secretion and T cell activation upon binding to PD-1 [Freeman et al., 2000]; [Latchman et al., 2001]. It is known that PD-1 is not expressed in normal state in normal T cells, but increases when activated. In the case of PD-L1, it is expressed to a certain degree in normal T cells, and when activated, the expression is also increased.
  • PD-L1 is found in large numbers in many human cancers, and the interaction of PD-1 with PD-L1 delivers stimulation or suppression signals to T cells. That is, due to the interaction between PD-1 and PD-L1, tumor-invasive lymphocytes are reduced, T-cell receptor-mediated proliferation is reduced, and immune evasion by cancer cells occurs. Unlike CTLA-4, PD-1 allows activated T-cells to encounter immunosuppressive PD-L1 (B7-H1) and PD-L2 (B7-DC) ligands expressed by tumor and / or interstitial cells. Mainly function in peripheral tissues [Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012a]. When the proteins PD-L1 and PD-L2 on the surface of the cancer cell bind to the protein PD-1 on the surface of the T cell, the T cells cannot attack the cancer cells.
  • B7-H1 immunosuppressive PD-L1
  • B7-DC PD-L2
  • Intracellular signaling by PD-1 is essential for inducing immune excretion of T cells in chronic infection.
  • PD-1 is known to play an important role in the chronic process of viral diseases including chronic hepatitis B and hepatitis C. Therefore, inhibiting PD-1 / PD-L1 interaction may induce anti-tumor activity. You can.
  • the specific antigen-antibody reaction system present in the body is generally understood as independent immunity and is understood to be independent of other diseases, and thus far, it has not been well accomplished by utilizing other antigens or diseases. Rather, immunity against bacteria or viruses that infect the same organ has been attempted to administer chimeric antigens containing antigens from both infectious agents simultaneously as a way to prevent and overcome the formation of antibodies from other infectious agents. There have also been attempts to improve the immune response of the other antigen by administering the recombinant chimeric antigen of the antigen. However, there have been very few successful cases showing effective pharmacological activity by chimeric antigens.
  • the present inventors have prepared a peptide domain chimeric antigen capable of binding a target protein associated with a disease to a specific external antigen in which a specific antigen-antibody reaction system is formed in the body as a method for effective treatment of a cancer or infectious disease.
  • the chimeric antigen When administered the chimeric antigen, the chimeric antigen specifically binds the target protein to the cancer or infecting cell that labels the cell membrane, while the other domain of the chimeric antigen induces an antigen-antibody reaction system already formed in the body to target
  • the present invention was completed by confirming that cancer or an infectious disease can be effectively treated by effectively removing cells.
  • the present invention is a cellular immunity and humoral immunity by T cells and B cells using fused chimeric antigens using mRNA synthesized by transcription in vitro, that is, IVT mRNA. Immunity) or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity was simultaneously activated to develop a new therapeutic agent that can maximize the effect of immunotherapy.
  • the object of the present invention is an immune response induction region; And a target cell-specific binding-inducing region; to provide a chimeric antigen having enhanced fusion and enhanced multiple immune functions.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of infectious diseases, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide an immunopotentiator composition comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for cancer or infectious diseases, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • an immune response induction region In order to achieve the above object, the present invention, an immune response induction region; And a target cell-specific binding-inducing region; a fused, multi-immune-enhanced chimeric antigen.
  • the immune response inducing region may be an antigen-antibody reaction formed by the antigen as a foreign viral antigen.
  • the immune response induction region hepatitis B virus antigen, hepatitis C virus antigen, hepatitis A virus antigen, AIDS virus antigen, MERS virus antigen, influenza A virus antigen, pharyngeal papilloma virus It may be selected from the group consisting of antigens, lymphocytic meningeal virus (LCMV) antigen and herpes simplex virus (HSV) antigen.
  • LCMV lymphocytic meningeal virus
  • HSV herpes simplex virus
  • the immune response-inducing region is the hepatitis B virus antigen, the hepatitis B virus endothelial protein (HBc), the hepatitis B virus e antigen (HBe) or the hepatitis B virus surface Proteins (HBs).
  • HBc hepatitis B virus antigen
  • HBe hepatitis B virus e antigen
  • HBs hepatitis B virus surface Proteins
  • the target cell-specific binding-inducing region is a cell membrane protein capable of specifically binding to target cells, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD28, ICOS , OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD40, CD40L, 4-1BB, 4-1BBL, B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-DC, CD80, CD160, BTLA, HVEM, DPP -4, NTCP, CD16 and may be selected from the group consisting of Caveolin-1.
  • between the immune response-inducing region and the target cell-specific binding-inducing region may be linked by a linker peptide represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21 for structural stability of the chimeric antigen. .
  • the multi-immunity-enhanced chimeric antigen may be composed of the peptide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • the cancer is lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, colon cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, fallopian tube carcinoma , Endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, larynx cancer, small intestine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, childhood solid tumor, Differential lymphoma, bladder cancer, kidney cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, first central nervous system lymphoma, spinal contraction tumor, brainstem glioma, and pituitary adenomas.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of infectious diseases, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • the infectious disease is hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis A virus, AIDS virus, MERS virus, influenza A virus, pharyngeal sarcoma virus, lymphocytic choroidal meningitis virus (LCMV) Or herpes simplex virus (HSV) infectious disease.
  • LCMV lymphocytic choroidal meningitis virus
  • HSV herpes simplex virus
  • the present invention provides an immunopotentiator composition comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • the multi-immunity-enhanced chimeric antigen (i) specifically binds to diseased cells that are target cells, and (ii) promotes recovery of exhausted CD8 + T cells, thereby promoting T cells It may be to induce activity, and (iii) to induce an antigen-antibody reaction, thereby promoting a humoral immune response and activating a cytotoxic action by natural killer cells (NK cells).
  • NK cells natural killer cells
  • the antigen-antibody response induction of (iii) may be to enhance a specific antigen-antibody reaction formed in the body of an individual by the immune response induction region of the chimeric antigen.
  • the present invention provides a vaccine composition for cancer or infectious diseases, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention relates to a chimeric antigen having a multi-immunity function enhanced by specifically binding to a target cell, and a use thereof, in the case of a chimeric antigen having a multi-immunity function enhanced fusion of an immune response-inducing region and a target cell-specific binding-inducing region ,
  • NK cells natural killer cells
  • Figure 1 shows a process in which humoral immunity acts by inducing an antibody formed by a soluble chimeric antigen in the body, and also recovers cell-specific CD8 + T cells in an immune exhausted state in target cancer or infected cells, and characterizes the chimeric antigen
  • FIG. 1 shows a schematic diagram showing that CD8 + T cells specific for an external antigen are simultaneously induced to a target cancer or infected cell site, and reactivation of T cells and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity simultaneously.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of a fusion gene encoding a chimeric antigen predicting a single antigen of HBcAg, HBeAg, HBsAg and various molecular biological structural changes of PD-1 / HBc, PD-1 / HBe, single antigen or chimeric antigen
  • Recombinant DNA fragment for the production of IVT mRNA encoding is designed to include an open reading frame, a T7 promoter, a 5 'untranslated region (UTR), and a 3' non-toxic region.
  • Figure 3 shows the results of the production of DNA fragments encoding chimeric antigens of HBcAg, HBeAg, HBsAg, PD-1 single antigen and PD-1 / HBc, PD-1 / HBe.
  • Figure 4 shows the results of preparing each IVT mRNA using as a template a DNA fragment encoding a chimeric antigen of HBcAg, HBeAg, HBsAg, PD-1 single antigen and PD-1 / HBc, PD-1 / HBe.
  • FIG. 5 shows that after inserting the IVT mRNA encoding the PD-1 / HBc and PD-1 / HBe chimeric antigens of the present invention into animal cells 293T, the antigen actually generated in the cells was confirmed by an enzyme-linked immunosorbent assay. .
  • FIG. 6 shows the results of confirming the generation of chimeric antigens in cells after Western IVB insertion of IV-1 mRNA encoding PD-1 / HBc and PD-1 / HBe chimeric antigens into animal cells 293T.
  • FIG. 7 shows that PD-1 / HBc and PD-1 / HBe chimeric antigens expressed in cells actually bind specifically to PD-L1 ligands of cells using coimmunoprecipitation.
  • Figure 8 shows the results of measuring the particle size using a nanoparticle analyzer (Zetasizer) after encapsulating single antigen and chimeric antigen IVT mRNA synthesized in an embodiment of the present invention in LNP.
  • Zetasizer nanoparticle analyzer
  • Figure 9 shows the results of measuring the efficiency of actually encapsulating mRNA in particles after encapsulating single antigen and chimeric antigen IVT mRNA synthesized in an embodiment of the present invention in LNP.
  • FIG. 10 is an enzyme-linked immunosorbent assay confirming that chimeric antigen proteins are actually generated in cells after IVT mRNA-encapsulated LNP is inserted into animal cells 293T.
  • FIG. 11 confirms by enzymatic binding immunosorbent assay that antigen proteins are actually generated from IVT mRNA injected into the body after injecting LNP containing chimeric antigen PD-1 / HBe IVT mRNA into C57BL / 6 mice.
  • FIG. 12 shows that a single antigen HBcAg, HBeAg protein was pre-inoculated into a mouse prior to treatment of a chimeric antigen in a C57BL / 6 mouse, and the mouse actually confirmed that an antibody against each antigen was generated by an enzyme-linked immunosorbent assay.
  • Figure 13 is implanted into the mouse Melanoma cancer cells B16F10 in mice formed primarily with antibodies to these proteins by injecting HBcAg and HBeAg proteins, and IVT mRNA encoding PD-1 / HBc and PD-1 / HBe is encapsulated. It shows that the growth of cancer tissue is inhibited by the chimeric antigen generated in the body by injecting LNP into the mouse.
  • FIG. 14 shows IVT mRNA encoding PD-1 / HBc and PD-1 / HBe after inducing the formation of cancer tissue by implanting Melanoma cancer cells B16F10 into C57BL / 6 mice primarily formed with antibodies against HBcAg and HBeAg It shows that the survival rate of the mouse is increased by the chimeric antigen generated in the body when the encapsulated LNP is injected into the mouse.
  • FIG. 15 is an IVT mRNA encoding PD-1 / HBc and PD-1 / HBe after inducing the formation of cancer tissue by transplanting Melanoma cancer cells B16F10 into C57BL / 6 mice primarily formed with antibodies against HBcAg and HBeAg.
  • the survival rate of the mouse increased after treatment with the chimeric antigen.
  • FIG. 16 is a C57BL / 6 mouse in which the antibody was primarily formed against the HBcAg antigen, and the melano cancer cells B16F10 were transplanted to induce the formation of cancerous tissues, and then the LNP filled with IVT mRNA encoding PD-1 / HBc was inserted into the mouse. It shows the relationship between the relative amount of antibody to HBcAg antigen before and after injection and the size of cancer tissue.
  • the present invention is characterized by providing a recombinant chimeric antigen having enhanced multiple immune functions, and specifically, the present invention provides a chimeric antigen enhanced with multiple immune functions, in which an immune response-inducing region and a target cell-specific binding-inducing region are fused.
  • the chimeric antigen having enhanced multi-immunity function provided by the present invention is a region capable of specifically binding a target protein associated with a disease to a specific external antigen region (domain) in which a specific antigen-antibody reaction system is formed in the body (domain) ), And when the chimeric antigen of the present invention is administered to an individual, the chimeric antigen specifically binds to a specific disease cell, such as a cancer cell or an infectious cell, which target cell membrane is targeted to, and other chimeric antigens
  • the domain that is, the immune response-inducing region (specific external antigen region) is designed to efficiently remove target disease cells by inducing an antigen-antibody reaction system already formed in the body.
  • the immune system immune response
  • a specific antigen-antigen system that is already formed in an individual is reactivated to treat the target disease very efficiently.
  • the immune response-inducing region and target cell-specific binding-inducing region are formed of a fusion protein in a fused form.
  • the immune response-inducing region may be a foreign viral antigen as a specific foreign antigen region (domain), and an antigen-antibody reaction may be stably formed in an individual to which the chimeric antigen is administered by the immune response-inducing region.
  • the immune response-inducing region that may be included in the chimeric antigen of the present invention is a foreign antigen, and may include proteins, glycoproteins, envelope proteins, endothelial proteins, or functional proteins of organisms associated with viruses, bacteria, or various infectious diseases, and preferably Hepatitis B virus antigen, hepatitis C virus antigen, hepatitis A virus antigen, AIDS virus antigen, MERS virus antigen, influenza A virus antigen, pharyngeal papilloma virus antigen, lymphocytic choroidal meningitis virus (LCMV) ) Can be selected from the group consisting of antigens and herpes simplex virus (HSV) antigen, more preferably hepatitis B virus antigen, endothelial protein of hepatitis B virus (HBc) or e antigen of hepatitis B virus (HBe) Or hepatitis B virus surface proteins (HBs).
  • HSV herpes simplex virus
  • HSV her
  • the antigen (HBcAg) of the endothelial protein which is an antigen derived from the hepatitis B virus, consists of the peptide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the e antigen (HBeAg) of the hepatitis B virus consists of the peptide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the surface protein antigen (HBsAg) of the hepatitis virus may be composed of the peptide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2
  • polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 4
  • polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 5 is the sequence It is shown in number 6.
  • the target cell-specific binding-inducing region may be a water-soluble protein or a cell membrane protein capable of physically binding to a receptor or ligand on the cell membrane as a protein mainly related to normal life activity in the body.
  • the target cell-specific binding induction region of the present invention is not limited thereto, but PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD28, ICOS, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD40, With CD40L, 4-1BB, 4-1BBL, B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-DC, CD80, CD160, BTLA, HVEM, DPP-4, NTCP, CD16 and Caveolin-1 It can be selected from the group consisting of.
  • PD-1 a cell membrane protein capable of specifically binding to the target cell.
  • the cell membrane protein plays a key role in the immune gateway system.
  • PD-1 is attached to the cell membrane and is known to secrete it well outside the cell (Cellular Immunology, 2005, 235: 109). Accordingly, in the present invention, PD-1 was converted into a protein that binds firmly to its receptor, PD-L1, and thus, a recombinant PD-1 protein capable of extracellular secretion and having a high binding capacity to the receptor was used, and used in the present invention.
  • the peptide sequence of the PD-1 protein is shown in SEQ ID NO: 7, and the polynucleotide sequence encoding the peptide of SEQ ID NO: 7 is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the chimeric antigen of the present invention was designed to be linked with a linker peptide composed of a specific sequence to maximize the structural stability and immune response of the chimeric antigen between the immune response induction region and the target cell-specific binding induction region. It was confirmed that there is a difference in the structural stability of the chimeric antigen according to the sequence of the linker peptide, and based on this, a linker peptide effective to increase the stability and the immune response of the chimeric antigen was selected.
  • the linker peptide 1 usable in the present invention is composed of 46 peptides represented by SEQ ID NO: 19, and the polynucleotide sequence encoding the linker peptide 1 is shown in SEQ ID NO: 20.
  • linker peptide 2 that can be used in the present invention is composed of 24 peptides represented by SEQ ID NO: 21, and the polynucleotide sequence encoding the linker peptide 2 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • soluble chimeric antigens PD-1 / HBc and PD-1 / HBe were prepared, respectively, which are regions of the hepatitis B virus that induce an immune response.
  • Endothelial protein (HBcAg) and hepatitis B virus e-antigen protein (HBeAg) are used, respectively, and target cell-specific binding inducing regions are those that use PD-L1 and water-soluble PD-1 secreted out of the cells capable of binding.
  • the PD-1 and HBc domains were linked by linker peptide 1 of SEQ ID NO: 19 between them, and the PD-1 and HBe domains were linked by linker peptide 2 of SEQ ID NO: 21, respectively. To be connected.
  • the HBcAg and HBeAg single antigens, PD-1 / HBc and PD-1 / HBe chimeric antigens are designed to contain most of the amino acid sequences that induce antibody formation, and after each antigen protein is produced in the cell, it is well out of the cell.
  • a signal peptide was included at the amino terminus of each protein. Synthesis of signal peptide was synthesized by methods well known to those skilled in the art (PLoS One. 2016.19: 11; Mol Ther.
  • signal peptide 21 peptides represented by SEQ ID NO: 23 (signal peptide 1) or 17 represented by SEQ ID NO: 25
  • a signal peptide composed of a peptide was used, wherein the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 23 is shown in SEQ ID NO: 24, and the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 25 is It is shown in SEQ ID NO: 26.
  • the chimeric antigen having enhanced immune function includes an immune response induction region; And a target cell-specific binding inducing region; which have a fused form, and in one embodiment of the present invention, the PD-1 / HBcAg and PD-1 / HBeAg chimeric antigens were respectively prepared as chimeric antigens having enhanced multiple immune functions. .
  • the peptide sequence for the PD-1 / HBcAg chimeric antigen of the present invention prepared in the present invention is shown in SEQ ID NO: 9, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 9 representing the PD-1 / HBcAg chimeric antigen of the present invention includes the sequence of signal peptide 1 for extracellular secretion, wherein the sequence of signal peptide 1 is from the first amino acid of SEQ ID NO: 21 It consists of a total of 21 amino acid sequences.
  • polypeptide showing the PD-1 / HBcAg chimeric antigen of SEQ ID NO: 9 includes linker peptide 1, wherein the linker peptide 1 is a total of 46 amino acids from the 232nd amino acid to the 277th amino acid in SEQ ID NO: 9.
  • polynucleotide sequence encoding the polypeptide for the PD-1 / HBcAg chimeric antigen of SEQ ID NO: 9 is shown in SEQ ID NO: 10
  • sequence of the polynucleotide encoding the signal peptide 1 in SEQ ID NO: 10 is SEQ ID NO: 10 It consists of a total of 63 base sequences from the 1st base sequence to the 63rd sequence, and the sequence of the polynucleotide encoding the linker peptide 1 in SEQ ID NO: 10 is the base sequence from the 694th base sequence to the 831th sequence in SEQ ID NO: 10. consist of.
  • the peptide sequence of the PD-1 / HBeAg chimeric antigen of the present invention is shown in SEQ ID NO: 11, and the polynucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 11 representing the PD-1 / HBeAg chimeric antigen of the present invention includes the sequence of signal peptide 2 for extracellular secretion, wherein the sequence of signal peptide 2 is from the first amino acid of SEQ ID NO: 11 to 17 It consists of a total of 17 amino acid sequences.
  • polypeptide showing the PD-1 / HBeAg chimeric antigen of SEQ ID NO: 11 includes linker peptide 2, wherein the linker peptide 2 has a total of 24 amino acid sequences from SEQ ID NO: 11 to the 228th amino acid to the 251st amino acid. consist of.
  • polynucleotide sequence encoding the polypeptide for the PD-1 / HBeAg chimeric antigen of SEQ ID NO: 11 is shown in SEQ ID NO: 12, and the sequence of the polynucleotide encoding the signal peptide 2 in SEQ ID NO: 12 is SEQ ID NO: 12 It consists of a total of 51 base sequences from the 1st base sequence to the 51st sequence, and the sequence of the polynucleotide encoding the linker peptide 2 in SEQ ID NO: 12 is a total of 72 bases from the 682th base sequence to the 753th sequence in SEQ ID NO: 12. It consists of a sequence.
  • the chimeric antigen having enhanced multi-immunity function according to the present invention may be used for preventing or treating cancer or infectious diseases through activation of an immune response.
  • the chimeric antigen of the present invention includes a target cell-specific binding induction region, it can specifically bind to disease cells, which are target cells, and includes an immune response induction region, which promotes recovery of exhausted CD8 + T cells and T
  • an immune response induction region which promotes recovery of exhausted CD8 + T cells and T
  • NK cells natural killer cells
  • the enhancement of multiple immune functions through the immune response-inducing region is a chimeric antigen of the present invention comprising the foreign antigen targeting an individual exposed to the foreign antigen and having a specific and stable antigen-antibody reaction system for the foreign antigen. It refers to reactivation of the antigen-antibody reaction by treatment and thus multiplex activation of humoral and cellular immunity simultaneously.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • the type of cancer is not limited thereto, but lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, colon cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, fallopian tube carcinoma , Endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, larynx cancer, small intestine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, childhood solid tumor, It may be a differentiated lymphoma, bladder cancer, kidney cancer, kidney cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, first central nervous system lymphoma, spinal contraction tumor, brainstem glioma or pituitary adenomas.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of infectious diseases, comprising the chimeric antigen having enhanced multiple immune functions of the present invention as an active ingredient.
  • the “infectious disease” refers to a disease in which various infectious agents or components, including foreign viruses, bacteria, protozoa, etc., cause, or mediate, or contribute to a pathology of a mammal, and the type of the infectious disease Hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis A virus, AIDS virus, MERS virus, influenza A virus, pharyngeal sarcoma virus, lymphocytic choroidal meningitis virus (LCMV) or herpes simplex virus ( HSV) may be an infectious disease.
  • various infectious agents or components including foreign viruses, bacteria, protozoa, etc., cause, or mediate, or contribute to a pathology of a mammal
  • the present invention may provide a composition for enhancing the immune system, comprising a chimeric antigen having enhanced multiple immune functions as an active ingredient, and such a composition for preventing or treating immune diseases caused by abnormal immune functions.
  • a composition for enhancing the immune system comprising a chimeric antigen having enhanced multiple immune functions as an active ingredient, and such a composition for preventing or treating immune diseases caused by abnormal immune functions.
  • the "immune disease” refers to a disease in which components of the mammalian immune system cause, mediate or other contributing conditions in the mammal, and stimulation or discontinuation of the immune response has a compensatory effect on the progression of the disease. It may include all diseases.
  • HBcAg and PD-1 fused to PD-1 / HBc chimeric antigen and HBeAg and PD-1 fused PD-1 / HBe chimeric antigen to each mRNA through transcription process in vitro After preparing IVT mRNA (in vitro transcription mRNA), the prepared PD-1 / HBc mRNA and PD-1 / HBe mRNA are respectively introduced into disease cells, and then the chimeric antigen is selectively bound to the PD-L1 ligand. As a result, it was confirmed that both the PD-1 / HBc and PD-1 / HBe chimeric antigens specifically bind to the PD-L1 ligand.
  • HBcAg and HBeAg proteins capable of binding to the chimeric antigens PD-1 / HBc and PD-1 / HBe through pre-immunization of mice, respectively.
  • HBcAg and HBeAg antibodies capable of binding to the chimeric antigens PD-1 / HBc and PD-1 / HBe through pre-immunization of mice, respectively.
  • the present inventors can administer the humoral immune activity by administering the chimeric antigen of the present invention to an individual, the chimeric antigen of the present invention can be bound to a specific target site for disease cells and at the same time binding to an antibody present in the individual. As a result, it was confirmed that the target cells can be effectively prevented or treated by removing diseased cells through immune-enhancing action.
  • mouse cancer cells B16F10 cells that are pre-vaccinated with HBsAg and HBcAg and are labeled with a primary antibody against PD-L1 on the cell membrane
  • the group in which the single antigens HBcAg and HBeAg were injected alone showed almost no cancer cell killing effect
  • the chimeric antigen PD of the present invention In the group injected with -1 / HBc mRNA and PD-1 / HBe mRNA, it was found that the growth of cancer tissues was effectively inhibited and the survival rate of mice increased significantly.
  • the chimeric antigen having enhanced multi-immunity function of the present invention has an effect of preventing and treating cancer or infectious diseases, and particularly, the chimeric antigen of the present invention is PD-1 that mediates immunosuppression. Induces the recovery of T cell exhaustion state by cancer or infected cells by blocking the signal pathway of PD-1 and PD-L1 and activates the immune response by activating the cytokine secretion ability of T cells It was found that it can be improved.
  • CD8 + T cells specific for disease cell targets which were formed in the body but were inactivated by T cell exhaustion, could be promoted.
  • natural killer (NK) cells, macrophage (macrophages), and monocytes (monocytes), which are humoral immune cells that are bound and activated by antibodies specific to foreign antigens are antibody-dependent cellular cytotoxicity.
  • NK natural killer
  • macrophage macrophage
  • monocytes monocytes
  • the disease caused by the interaction of PD-1 and PD-L1 may be the aforementioned cancer or infectious disease.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically effective amount of the chimeric antigen of the present invention, or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount in the above refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of cancer or an infectious disease.
  • the chimeric antigen according to the present invention may be included in a mass of 0.1 pg to 1 g per 1 kg of the patient's weight, and the pharmaceutically effective amount is the degree of disease symptoms, the patient's age, weight, health status, sex, administration route, and treatment period It may be changed according to the like.
  • the term “pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or similar reaction when administered to humans.
  • the carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • composition of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulation may be in the form of a powder, granule, tablet, emulsion, syrup, aerosol, soft or hard gelatin capsule, sterile injectable solution, sterile powder.
  • composition for preventing or treating cancer or infectious diseases according to the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient is the route of administration, the age of the patient, It can be appropriately selected according to various factors such as gender, weight and severity of the patient, and the composition for preventing or treating cancer or infectious diseases according to the present invention has an effect of preventing, improving or treating symptoms of cancer or infectious diseases It can be administered in parallel with a known compound.
  • the present invention can provide a method of treating cancer or an infectious disease, comprising administering the chimeric antigen of the present invention to an individual inducing cancer or an infectious disease other than a human.
  • suitable routes of administration include parenteral, including intramuscular, subcutaneous, intravenous, and bone marrow injections, as well as, for example, oral, nasal, permeable mucosal, or intraperitoneal, direct intraventricular, intraperitoneal, or intraocular injections. Delivery.
  • the present invention can provide a vaccine composition for cancer or infectious diseases, comprising the chimeric antigen of the present invention with enhanced multiple immune functions as an active ingredient.
  • the vaccine composition of the present invention can be administered alone, but preferably, may include an adjuvant together.
  • Adjuvant is a substance that non-specifically promotes an immune response against an antigen in the initial activation process of an immune cell, and is not an immunogen to a host, but means an agent, molecule, etc. that enhances immunity by increasing the activity of cells of the immune system (Annu. Rev. Immunol, 1986, 4: 369).
  • Adjuvants that can be administered with the vaccine composition of the present invention to enhance the immune response include any of a variety of adjuvants. Typical adjuvants include Freund adjuvant, aluminum compound, and mura. Muramyl dipeptide, lipopolysaccharide (LPS), monophosphoryl lipid A, or coil A, and the like are known.
  • the adjuvant may be administered simultaneously with the vaccine composition or sequentially with time intervals.
  • the vaccine composition of the present invention may further include a solvent, excipients, and the like.
  • the solvent includes physiological saline, distilled water, and the like
  • the excipients include, but are not limited to, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, aluminum potassium sulfate, and the like. It may further include.
  • the vaccine composition of the present invention can be prepared by a method commonly used in the technical field to which the present invention pertains.
  • the vaccine composition of the present invention may be prepared by oral or parenteral preparations, preferably prepared by injection solution, which is a parenteral preparation, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, nasal or epidural ( eidural).
  • the vaccine composition of the present invention can be administered to an individual in an immunologically effective amount.
  • the “immunologically effective amount” refers to an amount sufficient to exhibit a disease-preventing effect and an amount that does not cause a side effect or a serious or excessive immune response, and the exact dosage concentration varies depending on the specific immunogen to be administered, and vaccination It can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well-known in the medical field, such as the age, weight, health, sex of the subject, sensitivity of the individual to a drug, a route of administration, and a method of administration, and can be administered once to several times.
  • FIG. 2 The schematic diagram of the DNA fragment for producing the IVT mRNA (In vitro transcribed mRNA) synthesized by transcription of each gene in vitro is shown in FIG. 2.
  • the DNA fragment for IVT mRNA production is an open reading frame, a T7 promoter sequence, a 5 'untranslated base sequence (5'UTR), and a 3' untranslated sequence.
  • Hepatitis B core antigen (HBcAg), hepatitis B e antigen (HBeAg), hepatitis B envelope antigen (HBsAg), PD-1, soluble chimeric antigen PD-1 / HBcAg and PD-1 / HBeAg in vitro DNA sequences for each IVT mRNA transcribed in SEQ ID NO: 13 (HBcAg), 14 (HBeAg), 15 (HBsAg), 16 (PD-1), 17 (PD-1 / HBcAg) and 18 (PD- 1 / HBeAg).
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is a nucleotide sequence of a DNA template encoding PD-1 / HBcAg IVT mRNA, and the nucleotide sequence is not only the coding sequence of PD-1 / HBcAg, but also the T7 promoter, 5'UTR and 3'UTR Also includes the nucleotide sequence of.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 is also a nucleotide sequence of a DNA template encoding PD-1 / HBeAg IVT mRNA.
  • the nucleotide sequence is not only the coding sequence of PD-1 / HBeAg, but also the T7 promoter, 5'UTR, and 3'UTR sequence. Also includes.
  • RNA molecule a series of contiguous ”polyadenylic acid (poly (A)) tails” are added to the 3 ′ end of the RNA molecule by poly A polymerase, a process well known to those skilled in the art. It was designed to insert at least 50 adenine sequences of adenine sequence at the time of design by a known method.
  • the designed DNA fragment was synthesized by requesting IDT in the US and 10ng of vector DNA containing each antigen gene produced by IDT. Was used as a template, and a gene DNA amplification reaction was performed using primers for the polymerase chain reaction (PCR) of SEQ ID NOs: 27 and 28.
  • PCR reaction product was prepared by an elution method well known to those skilled in the art. After purification, it was used as a template for in vitro transcription reaction (FIG. 3).
  • SEQ ID NO: 28 primer base sequence (primer 2):
  • each purified DNA fragment comprising a single or chimeric antigen sequence of 1 ⁇ g of HBcAg, HBeAg, HBsAg, PD-1, PD-1 / HBc and PD-1 / HBe, 10 ⁇ l 2x ARCA / NTP Mix, 2 ⁇ l T7 RNA Polymerase Mix was mixed and the rest was added to distilled water to form a final 20 ⁇ l reactant and reacted at 37 ° C for 60 minutes. When the reaction was completed, 2 ⁇ l DNase enzyme was added and then treated at 37 ° C. for 15 minutes to remove all residual DNA. The IVT mRNA obtained from the reaction was purified using an RNA purification kit well known to those skilled in the art, and then mRNA production was confirmed by 1.2% agarose electrophoresis using 0.5x TAE buffer (FIG. 4).
  • the polypeptide sequence of the single antigen HBcAg which is a protein expressed from the mRNA of a single antigen prepared through the above process, is shown in SEQ ID NO: 1
  • the polypeptide sequence of HBeAg is shown in SEQ ID NO: 3
  • the polypeptide sequence of HBsAg is shown in SEQ ID NO: 5
  • the polypeptide sequence of PD-1 is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the polypeptide (amino acid) sequence of PD-1 / HBc which is a chimeric antigen protein expressed from the chimeric antigen mRNA (SEQ ID NO: 17), is shown in SEQ ID NO: 9, and is expressed from another chimeric antigen mRNA (SEQ ID NO: 18).
  • the polypeptide (amino acid) sequence of PD-1 / HBe, a chimeric antigen protein is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the IVT mRNA purified in Example 2 was transfected into the human cell line HEK293T (ATCC, CRL-3216).
  • the HEK293T cell line is a cancer cellized kidney cell originating from the human embryo kidney (Human Embryonic Kidney), and the culture of the cell is 10% FBS (Fetus Bovine Serum: GIBCO, # 16000-028), 1% ABAM (GIBCO BRL in T75 flask) , # 15240-O13) was added and cultured for 3 days in MEM medium (GIBCO, # 11095-080). After incubation, washed with 1x PBS buffer solution, and then treated with trypsin to remove it from the bottom of the container.
  • the separated cells were centrifuged, the supernatant was discarded and redispersed again with 1x PBS buffer solution, and redispersed to 5X10 ⁇ 5 cells / dish.
  • the Lipofectamine Messenger Max Transfection Reagent (Invitrogen, # LMRNA003)
  • mRNA transfection reagent IVT mRNA encoding the chimeric antigen in a method provided by those skilled in the art (PD -1 / Hbc and PD-1 / Hbe) were transfected into the cells.
  • Transfected cells were dispersed in a 60 mm culture vessel and cultured for 2 days in a 5% CO 2 cell incubator.
  • a cell culture solution was obtained at 24 hours, and after 48 hours, the attached cells and the cell culture solution were harvested in a 1.5 ml tube.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using PD-1 ELISA Kit was used to confirm whether single or chimeric antigens were produced and secreted from harvested cells and cell culture. was carried out.
  • the harvested cell extract was also used as a sample for immunoprecipitation (Immuno-precipitation) that can show the binding of PD-L1 protein present in the cell membrane.
  • Binding of PD-L1 present in the cell membrane to a single antigen (PD-1) and a chimeric antigen (PD-1 / HBc or HBsAg / PD-1) prepared in the present invention using immunoprecipitation (IP) was confirmed.
  • an antibody against PD-L1 is added to the PD-L1 / PD-1 / anti-PD-L1 antibody, PD-L1 / PD-1 / HBc / anti-PD-L1 antibody, PD-L1 / HBsAg / PD
  • a complex precipitate of -1 / anti-PD-L1 antibody was obtained, and the electrophoresis of the precipitate was followed by simultaneous interaction of PD-L1 with PD-1, PD-1 / HBc or HBsAg / PD-1 through Western blot. It was analyzed by immunoprecipitation (coimmunoprecipitation, co-IP).
  • IVT mRNA encoding the PD-1, PD-1 / HBc or PD-1 / HBe gene in cancer cells that label PD-L1 on the cell membrane is electroporated or Lipofectamine Messenger Max Transfection Reagent (Invitrogen, # LMRNA003) After transfection using mRNA-only transfection reagent, cells were harvested 2 days later, and then the cells were lysed with RIPA buffer. After removing the cell debris by centrifugation, the supernatant is transferred to another 1.5 ml test tube, mixed with an appropriate amount of anti-PD-L1 antibody or a specific labeled protein antibody, and then incubated for 1 hour to induce antigen-antibody complex (immune complex) ).
  • the protein A or Protein G agarose gel immobilized on the complex was mixed, and then cultured while rotating for 2 hours to adhere to the gel. Proteins that were not bound from the precipitated complex were then washed and removed several times to precipitate the complex. After SDS-PAGE electrophoresis, Western blot was performed using each antigen-specific antibody.
  • PD-L1 is PD- 1, it was confirmed that it interacts with PD-1 / HBc or PD-1 / HBe.
  • lipid nanoparticles composed of several lipids were produced (Cell, 2017, 168: 1).
  • LNPs lipid nanoparticles
  • SS-OP four types of lipids, SS-OP, DOPC, Cholesterol, and PEG-lipid were dissolved in 100% ethanol, and these were mixed at a molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5, respectively.
  • the prepared LNP After transferring the prepared LNP to a dialysis membrane cassette, it was dialyzed in 1x PBS buffer for 18 hours, and the appropriate concentration was adjusted using a centrifugal filter from Merk Millipore, Germany. After adjusting the concentration, it was filtered through a 0.22 ⁇ m filter and stored at 4 ° C. until it was used for intracellular injection or mouse injection.
  • Each LNP prepared in Example 5 was measured for particle size and polydispersity index (PDI) using a Zetasizer nanoparticle analyzer from Malvern, UK.
  • PDI polydispersity index
  • LNP encapsulated with IVT mRNA showed a slightly larger particle size of 90-150 nm compared to Naked LNP without IVT mRNA.
  • the efficiency of mRNA encapsulation of IVT mRNA encapsulated in each LNP production process into the LNP was measured by performing a Ribogreen assay using the Quanti-iT Ribogreen kit of Thermo Fisher Scientific of the United States, as shown in FIG. 9, In the LNP production process in which a single antigen and a chimeric antigen were encapsulated, the encapsulation efficiency of each IVT mRNA was all high in the range of about 86 to 94%.
  • LNPs encapsulating the single antigen HBcAg and HBeAg IVT mRNA prepared in the present invention are human cell lines HeLa (ATCC, CCL-2). Each was transfected. HeLa is a cancer cell derived from cervical cancer, and in order to culture it, 10% FBS (Fetus Bovine Serum: GIBCO, # 11095-080), 1% ABAM (GIBCO BRL, # 15240-013) was cultured in a T75 flask.
  • FBS Fetus Bovine Serum: GIBCO, # 11095-080
  • ABAM GIBCO BRL
  • the cells were cultured in a cell incubator with a concentration of 5% CO 2 for 24 hours.
  • the LNP of the present invention and the apolipoprotein were mixed and incubated at 37 ° C for 10 minutes, followed by transfection of cells. After harvesting the culture solution of the transfected cells, the amount of antigen secreted from the cells was confirmed by an Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  • each antigen is efficiently produced after the LNPs in which PD-1 / HBc and PD-1 / HBe IVT mRNAs are respectively injected into HeLa cells.
  • mice Chimera Port Coding IVT mRNA Enclosed LNP Confirmation of antigen expression in mice
  • the present inventors decided to confirm the results of antigen expression confirmed at the cell level in Example 7 through experimental animals.
  • the LNP prepared in Example 5 was injected into the left tibialis anterior into a 6-week-old C56BL / 6 female mouse to confirm the expression efficiency of the antigen, thereby making LNP effective as an IVT mRNA transporter into the animal body.
  • LNPs encapsulated with 2 ⁇ g of IVT mRNA of the present invention were inoculated into mice in total 80 ⁇ l with 1 ⁇ PBS buffer.
  • Whole blood was collected from the heart on the 1st, 3rd, and 6th days after the inoculation, and the production of each antigen protein was confirmed by an enzyme-linked immunoprecipitation assay.
  • PD-1 / HBe chimeric antigen was found to be generated from day 1 to day 6, and generation of PD-1 / HBe chimeric antigen was generated in mice using LNP. When injected, it was found that enough monoantibody and chimeric antibodies are actually produced in the mouse body.
  • each mouse inoculated with the antigen was found to have respective antibodies against HBcAg and HBeAg.
  • the experimental group inoculated with the chimeric antigens PD-1 / HBc and PD-1 / HBe IVT mRNA-LNP of the present invention compared to the control group, the mortality rate of mice was significantly higher during the 44-day test period. It was found that the survival rate increased by a factor of two. It can be seen that this decrease in mouse mortality is due to the injection of the chimeric antigen of the present invention. As a result of comparing the survival rate of mice before and after inoculation with the chimeric antigen of the present invention, it was confirmed that the survival rate was significantly increased only in the experimental group inoculated with the chimeric antigen of the present invention (FIG. 15).
  • FIG. 16 is a transplantation of LNP-encapsulated IVT mRNA encoding PD-1 / HBc after transplantation of melanoma cancer cells B16F10 into C57BL / 6 mice primarily formed with antibodies against the HBcAg antigen to induce cancer tissues.
  • the amount of the antibody against the HBcAg antigen was slightly reduced in individuals with a large reduction in the size of the cancer tissue. .
  • the antibody was consumed in the process of attaching Natural Killer cells in the process of inhibiting the growth of cancer tissue by the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity of the antibody against the HBcAg antigen in the mouse body, which is the present inventor. It can be said that the chimeric antigen initially proved that the growth of cancer tissues could be inhibited by antibody-dependent humoral immunity.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • the chimeric antigen when the inventors administered a chimeric antigen with a peptide domain capable of binding a target protein associated with a disease to a specific external antigen in which a specific antigen-antibody reaction system has already been formed in the body, the chimeric antigen is a target protein. It can specifically bind to cancer or infecting cells that are labeled on the cell membrane, and at the same time induce an antigen-antibody reaction system already formed in the body by other domains of the chimeric antigen, thereby effectively removing target disease cells, thereby preventing cancer or infectious diseases. It has been found that it is possible to provide a treatment method for a new cancer or viral infectious disease that can be treated and at the same time can greatly increase patient survival.

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Abstract

본 발명은 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 면역 반응 유도 영역 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역이 융합된 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원; 상기 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 면역증강제 조성물; 및 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도
본 발명은 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의용도에 관한 것이다.
외부로부터 체내에 세균이나 바이러스 같은 병원체가 침입하지 못하도록 방어하거나, 병원체가 침입하더라도 이를 인식하고 저항할 수 있는 능력을 ‘면역’이라고 한다. 면역에는 태어날 때부터 누구나 타고나는 능력인 선천성 면역과 후천적으로 획득되는 후천성 면역이 있다. 일반적인 의미에서의 면역은 후천성 면역을 말한다. 비특이적인 면역이라 알려진 선천성 면역과 달리 후천성 면역은 특이적 면역이라고도 하는데, 침입한 병원체의 종류를 인식하고 이에 맞게 대응하는 방어 작용으로 림프구와 항체가 중요한 역할을 한다. 즉 체내를 순환하는 B 림프구와 T 림프구가 담당한다. 이들은 표면에 특정 항원을 인식하는 수용체를 갖고 있어 항원을 인식하면 각각 체액성 면역과 세포성 면역을 활성화시킨다.
후천성 면역에는 항원과 항체가 관여하는데 항원은 병원체나 이물질, 다른 종의 장기 조직 등 비자기(non-self)로 인식되어 후천적 면역반응을 유발하는 원인이 되는 물질이고 항체는 침입한 특정 항원에 대항하기 위해 B 림프구가 만들어내는 물질로 특정 항원에 결합해 병원성을 소멸시킨다. 또한 한번 침입한 병원체의 종류를 기억하는 기능이 있어서 동일한 병원체가 2차로 침입할 때에는 이에 효과적으로 대처할 수 있다. 후천성 면역은 병원체가 몸에 완전히 침입한 후 일어나는 작용으로 선천성 면역 작용 이후에 진행되므로 ‘2차 방어’라고도 한다. 후천성 면역에는 세포성 면역과 체액성 면역이 있는데 T 림프구와 B 림프구의 표면에는 특정 항원을 인식하는 수용체를 갖고 있어 항원을 인식하면 각각 세포성 면역과 체액성 면역을 활성화시킨다. 전자는 항원을 인식한 독성 T 림프구 (Cytotoxic T lymphocyte)가 병원체에 감염된 세포나 암세포를 직접 공격하여 제거하는 반면에 후자의 체액성 면역은 항원을 인식한 보조 T 림프구(Helper T lymphocyte)가 B 림프구를 자극하여 항체를 분비하는 형질 세포 (Plasma cell)와 항원을 기억하는 기억 세포(Memory cell)로 분화 및 증식시킨다. 이로 인한 기억세포의 생성은 추후에 다시 침입한 병원성 항원에 이전보다 신속하고 강력하게 면역적 대응을 할 수 있게 한다.
형질 세포가 혈액으로 항체를 분비하면 항체가 항원과 결합해 항원-항체 반응을 일으켜 항원을 제거한다. 한 가지 항체는 한 가지 항원과만 특이적으로 결합을 하는데, 이를 항원-항체 반응의 특이성이라고 한다. 항체는 침입한 미생물에 부착함으로써 미생물의 운동성을 없애고 체세포로 침입하는 것을 방해한다. 이밖에 항체로 둘러싸인 항원은 혈장에서 발견되는 일련의 단백질들인 보체(complement)와 화학적 연쇄반응을 일으킨다. 이 보체 반응은 침입한 미생물의 분해를 야기하거나 침입한 미생물을 먹어치우는 대식세포를 유인한다. 이러한 모든 종류의 항원과 항체의 반응 및 결합을 항원 항체 반응이라고 한다.
체액성 면역은 단계적으로 1차·2차 면역반응으로 구분될 수 있는데 1차 면역반응 시기에는 항원이 처음 침입했을 때 림프구가 분화하여 항체를 생산하는데 이때 기억 세포가 형성된다. 2차 면역반응은 같은 항원이 다시 침입했을 때 기억 세포가 형질 세포로 빠르게 분화하고 증식하여 다량의 항체를 생산하는 과정으로 더 신속하고 강력한 면역반응을 유도한다.
T 및 B 림프구로 구성된 적응 면역계는 다양한 종양 항원에 반응하는 능력과 함께, 강력한 항암 잠재력을 지니고 있다. 추가로, 면역계는 상당한 가소성과 기억 구성요소를 갖고 있으며 이들 적응 면역계 속성들로 인해 면역요법은 모든 암 치료 방법들 중에서 보다 효과적인 방법이 될 수 있다. 그러나 암에 대한 내인성 면역반응이 전임상 모델 및 환자에게서 관찰되긴 하지만, 이러한 반응은 효과적이지 못하고, 정착된 암은 "자기"로서 간주되어 면역계에 의해 용인되기도 한다. 이러한 용인 상태에 의해, 종양은 항-종양 면역을 적극적으로 파괴하기 위하여 다른 기전들을 악용할 수 있는데, 이들 기전은 기능장애를 일으킨 T-세포 신호전달, 저해성 조절 세포 및 면역파괴를 피하기 위해 종양에 의한 부수적 피해로부터 정상 조직을 보호하고 적응 면역반응의 강도를 하향 조정해주는 작용을 하는 내인성 "면역관문(immune checkpoint)"을 활용한다.
인간 면역계와 만성적인 감염과 암과 같은 질환들과의 장기적인 경쟁은 숙주에게 많은 생리적 부담이 되고 이러한 결과 면역반응은 교착상태에 빠질 수 있다. T 세포는 탈진하여 불활성화되면서 바이러스 또는 세균이나 종양에 우위를 내주게 된다. 다수의 분자 데이터 베이스를 기반으로 하여, 연구자들이 만성 감염과 자가 면역, 암과의 상호작용에서 의미가 있는 탈진한 T 세포 (Tex) 9개의 종류를 규명하였다. 정상적인 T 세포들이 지치면, 세균이나 종양에 대응하는 능력에 결함이 발생한다. Tex는 중요한 생화학 경로를 멈추게 하는 억제 수용체 단백질을 그 표면에 발현시켜서, 유전자 발현의 조절에 변화를 일으키고, 감염 및 종양과 싸우기 위해서 에너지를 만드는 대사를 바꾸며, 최적의 면역 기능의 발달을 억제한다. 면역요법 임상시험에서 탈진된 T 세포에 대한 이런 종류의 평가를 적용하면 특정한 조합의 면역요법의 혜택을 받게 될 가능성이 높은 환자를 확인하고, 감염이나 암에 반응하는 특정한 종류의 탈진된 T 세포들에서 근본적인 기전에 대해 이해가 가능하다.
PD-1과 CTLA-1와 같이 탈진한 T 세포 (Tex)에 의해 발현되는 억제 수용체들을 표적으로 하는 새롭고 매우 효과적인 면역요법들은 암 치료를 위한 획기적인 치료 방법이 될 수 있을 것이다.
이와 관련하여, 최근까지도 암 면역요법은 활성화된 이펙터 세포의 적응-전이, 관련 항원에 대항한 면역화, 또는 시토카인과 같은 비특이적 면역자극제를 제공하는 것으로 항종양 면역반응을 증가시키는 방식에 연구를 집중해 왔다. 그러나 과거 10년간, 특이적 면역관문 경로 억제제를 개발하고자 집중적으로 노력한 결과, 암을 치료하기 위한 새로운 면역요법적 접근 방식을 제공하기 시작하였는데, 이는 진행성 흑색종 환자를 치료하기 위해 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4)와 결합하여 이를 억제하는 항체 (Ab)인 이필리무맙 (ipilimumab) 같은, 억제성 PD-1 경로를 차단하는 항체의 개발을 포함한다.
한편, 프로그램화된 사멸-1 (programmed death-1, PD-1)은 활성화된 T 및 B 세포에 의해 발현된 주요 면역관문 수용체이고, 면역저해를 매개한다. PD-1은 55kDa의 제I형 경막 단백질로서, Ig 상과 유전자의 일부를 이루고 있으며, 면역글로불린 분자군에 속하는 T 세포의 보조저해분자로 잘 알려져 있다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에 발현되는 수용체들, 즉 CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 및 BTLA를 포함하는, CD28 계열 수용체의 한 구성원이다. PD-1에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드, 즉 프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1) 및 프로그램화된 사멸리간드-2 (PD-L2)가 확인되었는데, 이들은 항원-제시 세포뿐만 아니라 많은 인간 암 상에서 발현되고, PD-1과의 결합 시 시토카인 분비 및 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다 [Freeman et al., 2000]; [Latchman et al., 2001]. PD-1은 일반적인 T 세포에서는 정상 상태일 때 PD-1이 발현되지 않다가 활성화되면 발현이 증가한다고 알려져 있다. PD-L1의 경우에는 정상 상태의 T 세포에서도 어느 정도 발현하며 활성화되면 역시 그 발현이 증가한다고 보고되어 있다. PD-L1은 다수의 인간 암에서 다량 발견되며, PD-1과 PD-L1의 상호작용은 T 세포에 자극 또는 억제 신호를 전달한다. 즉, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용으로 인하여 종양 침습성 림프구가 줄어들고, T 세포 수용체 매개 증식이 감소하며, 암세포에 의한 면역 회피 현상이 발생하게 된다. CTLA-4와는 달리, PD-1은 활성화된 T-세포가 종양 및/또는 간질 세포에 의해 발현된 면역저해성 PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC) 리간드를 접할 수 있는 말초조직에서 주로 기능한다[Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012a]. 암세포의 표면에 있는 단백질인 PD-L1, PD-L2가 T세포의 표면에 있는 단백질인 PD-1과 결합하면, T세포는 암세포를 공격하지 못하게 된다.
PD-1에 의한 세포 내 신호전달은 만성 감염에서 T세포의 면역 탈진(exhaution)을 유도하는데 필수적이다. 일례로 만성 B형, C형 간염 등을 포함한 바이러스성 질환의 만성화 과정에서 PD-1이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 PD-1/PD-L1 상호작용을 억제하면 항종양 활성을 유도할 수 있다.
한편, 체내에 존재하는 특이적인 항원-항체반응 시스템은 대체로 독립적인 면역으로서 이해되고 다른 질병과는 상관없는 것으로 이해되어 지금까지 다른 항원 또는 질환 치료의 활용으로 잘 이루어지지 않고 있다. 오히려 같은 장기를 감염시키는 세균 또는 바이러스에 대해 형성된 면역은 다른 감염원의 항체형성을 방해하여 이를 극복하는 방법으로써 양쪽 감염원의 항원을 동시에 포함하는 키메라항원을 투여하는 방법이 시도된 바 있고, 또는 두 가지 항원의 재조합 키메라항원을 투여하여 다른 한쪽 항원의 면역반응을 향상시키려는 시도도 있었다. 그러나 아직까지 키메라항원에 의한 효과적인 약리활성을 보이는 성공적인 사례가 극히 드물다.
이에 본 발명자들은 암 또는 감염성 질환의 효과적인 치료를 위한 방법으로서, 체내에 특이적인 항원-항체반응시스템이 형성된 특정 외부항원에 질환과 연관된 표적단백질에 결합할 수 있는 펩타이드 도메인 키메라항원을 제조하였고, 제조된 키메라항원을 투여할 경우, 키메라항원은 표적단백질을 세포막에 표지하고 있는 암 또는 감염세포에 특이적으로 결합함과 동시에 키메라항원의 다른 도메인은 이미 체내에 형성된 항원-항체반응시스템을 유도하여 표적세포를 효과적으로 제거함으로써 암 또는 감염질환을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 인비트로(in vitro)에서 전사시켜 합성한 mRNA, 즉, IVT mRNA를 이용한 융합된 키메라 항원을 이용하여 T 세포와 B 세포에 의한 세포성 면역(cellular immunity)과 체액성 면역(humoral immunity) 또는 항체-의존적 세포매개 세포독성을 동시에 활성화함으로써 면역치료 효과를 극대화할 수 있는 새로운 치료제를 개발하였다.
그러므로 본 발명의 목적은 면역 반응 유도 영역; 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역;이 융합된, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 면역증강제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염질환에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 면역 반응 유도 영역; 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역;이 융합된, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 반응 유도 영역은, 외래 바이러스성 항원으로 상기 항원에 의해 항원-항체반응이 형성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 반응 유도 영역은, B형간염바이러스 항원, C형 간염바이러스 항원, A형 간염바이러스 항원, AIDS 바이러스 항원, MERS 바이러스 항원, 인플루엔자 A 바이러스 항원, 인두유종바이러스 항원, 임파구성맥락수막 바이러스(LCMV) 항원 및 단순포진 바이러스(HSV) 항원으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 반응 유도 영역은, B형간염바이러스 항원으로 B형간염바이러스의 내피 단백질(HBc), B형간염바이러스의 e항원 (HBe) 또는 B형간염바이러스의 표면 단백질(HBs)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표적 세포 특이적 결합 유도 영역은 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 세포막 단백질로서 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD28, ICOS, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD40, CD40L, 4-1BB, 4-1BBL, B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-DC, CD80, CD160, BTLA, HVEM, DPP-4, NTCP, CD16 및 Caveolin-1으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 반응 유도 영역과 표적 세포 특이적 결합 유도 영역 사이는 키메라 항원의 구조적 안정성을 위해 서열번호 19 또는 서열번호 21로 표시되는 링커 펩타이드로 연결되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 펩타이드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감염 질환은 B형간염바이러스, C형 간염바이러스, A형 간염바이러스, AIDS바이러스, MERS 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인두유종바이러스, 임파구성맥락수막 바이러스(LCMV) 또는 단순포진 바이러스(HSV) 감염성 질환일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 면역증강제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은, (i) 표적 세포인 질병 세포에 특이적으로 결합하고, (ii) 탈진한 CD8+ T세포의 회복을 촉진하여 T세포 활성을 유도하며, 및 (iii) 항원-항체 반응을 유도하여 체액성 면역반응의 증진 및 자연살해세포(NK cell)에 의한 세포 독성 작용을 활성화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (iii)의 항원-항체 반응 유도는 상기 키메라 항원의 면역 반응 유도 영역에 의해 개체의 체내에서 형성된 특이적 항원-항체반응을 증진시키는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염질환에 대한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 표적 세포 특이적으로 결합하여 다중 면역기능이 강화된 키메라항원 및 이의 용도에 관한 것으로, 면역 반응 유도 영역 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역이 융합된 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원의 경우, 질병세포 특이적으로 결합할 수 있고 탈진한 CD8+ T세포의 회복을 촉진하여 T세포 활성을 유도하며, 항원-항체 반응을 유도하여 체액성 면역반응 증진 및 자연살해세포(NK cell)에 의한 세포 독성 작용을 활성화시켜, 질병세포의 면역회피를 억제하고 다중의 면역기능을 강화하여 암, 감염질환 및 면역질환을 보다 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
도 1은 용해성 키메라항원이 체내에 형성된 항체를 유도하여 체액성면역이 작용하는 과정을 나타낸 것이고, 또한 표적 암 또는 감염세포에서 면역탈진상태의 세포 특이적인 CD8+ T세포를 회복시키고, 키메라항원의 특정 외부항원에 특이적인 CD8+ T세포가 동시에 표적 암 또는 감염세포 부위에 유도되어 재활성화된 T세포와 항체의존 세포매개 세포독성이 동시에 작용하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는 HBcAg, HBeAg, HBsAg의 단일 항원 및 PD-1/HBc, PD-1/HBe의 분자생물학적 다양한 구조변화가 예상되는 키메라항원을 코딩하는 융합유전자의 설계도를 나타낸 것으로, 단일항원 또는 키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA의 생산을 위한 재조합 DNA 절편은 개방형 번역틀 (open reading frame), T7 프로모터, 5‘ 비해독부위(UTR, untranslated region), 3’ 비해독 부위 등을 포함하도록 설계하였다.
도 3은 HBcAg, HBeAg, HBsAg, PD-1 단일 항원 및 PD-1/HBc, PD-1/HBe의 키메라항원을 코딩하는 DNA 절편의 생산결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HBcAg, HBeAg, HBsAg, PD-1 단일 항원 및 PD-1/HBc, PD-1/HBe의 키메라항원을 코딩하는 DNA 절편을 주형으로 하여 각각의 IVT mRNA를 제조한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe 키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA를 동물세포 293T에 삽입한 후, 세포 내에서 실제로 생성된 항원을 효소결합면역흡착검사에 의해 확인한 것이다.
도 6은 PD-1/HBc, PD-1/HBe 키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA를 동물세포 293T에 삽입한 후 세포 내에서 실제로 키메라 항원의 생성을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 세포 내에서 발현된 PD-1/HBc, PD-1/HBe 키메라 항원들이 실제로 세포의 PD-L1 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 동시면역침강법(coimmunoprecipitation)을 이용하여 확인한 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 합성된 단일항원 및 키메라 항원 IVT mRNA를 LNP 내에 봉입한 후 입자의 크기를 나노입자분석기(Zetasizer)를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에서 합성된 단일항원 및 키메라 항원 IVT mRNA를 LNP 내에 봉입한 후 실제로 mRNA가 입자내에 봉입되는 효율을 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 IVT mRNA가 봉입된 LNP를 동물세포 293T에 삽입한 후 세포 내에서 실제로 키메라 항원 단백질들이 실제로 생성되는 것을 효소결합면역흡착검사에 의해 확인한 것이다.
도 11은 키메라 항원 PD-1/HBe IVT mRNA가 봉입된 LNP를 C57BL/6 마우스에 주입한 후 실제로 체내에서 주입된 IVT mRNA로부터 항원 단백질들이 생성되는 것을 효소결합면역흡착검사에 의해 확인한 것이다.
도 12는 C57BL/6 마우스에 키메라 항원을 처리하기에 앞서 단일 항원 HBcAg, HBeAg 단백질을 마우스에 사전 접종하여 마우스가 실제로 각 항원에 대한 항체가 생성된 것을 효소결합면역흡착검사로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 13은 HBcAg와 HBeAg 단백질을 주입함으로써 이들 단백질에 대하여 1차적으로 항체가 형성된 마우스에 마우스 Melanoma 암세포인 B16F10를 이식한 후 PD-1/HBc와 PD-1/HBe을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP를 마우스에 주입하여 체내 생성된 키메라 항원에 의하여 암조직의 성장이 저해된 것을 보여주는 것이다.
도 14는 HBcAg와 HBeAg에 대하여 1차적으로 항체가 형성된 C57BL/6 마우스에 Melanoma 암세포인 B16F10를 이식하여 암조직이 생성되도록 유도한 후 PD-1/HBc와 PD-1/HBe을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP를 마우스에 주입하였을 때 체내 생성된 키메라항원에 의하여 마우스의 생존율이 증가됨을 보여주는 것이다.
도 15는 HBcAg와 HBeAg에 대하여 1차적으로 항체가 형성된 C57BL/6 마우스에 Melanoma 암세포인 B16F10를 이식하여 암조직이 생성되도록 유도한 후 PD-1/HBc와 PD-1/HBe을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP를 마우스에 주입한 전후의 생존율을 비교하였을 때 키메라 항원을 처리한 이후 마우스의 생존율이 증가하였음을 보여주는 것이다.
도 16은 HBcAg 항원에 대하여 1차적으로 항체가 형성된 C57BL/6 마우스에 Melanoma 암세포인 B16F10를 이식하여 암조직이 생성되도록 유도한 후 PD-1/HBc을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP를 마우스에 주입한 전후의 HBcAg 항원에 대한 항체의 상대적인 양과 암조직의 크기와의 연관성을 보여주는 것이다.
본 발명은 다중 면역기능이 강화된 재조합 키메라 항원을 제공함에 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명은 면역 반응 유도 영역 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역이 융합된, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 제공함에 특징이 있다.
특히 본 발명에서 제공하는 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은 체내에 특이적인 항원-항체반응 시스템이 형성된 특정 외부항원 영역(도메인)에 질환과 연관된 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 영역(도메인)을 융합하여 제조한 것으로, 본 발명의 키메라 항원을 개체에 투여하면 키메라 항원은 표적 단백질을 세포막에 표지하고 있는 특정 질병세포, 예컨대 암세포 또는 감염세포에 특이적으로 결합하게 되고, 키메라항원의 다른 도메인, 즉 면역 반응 유도 영역(특정 외부항원 영역)은 이미 체내에 형성된 항원-항체반응 시스템을 유도할 수 있어 표적 질병세포를 효율적으로 제거할 수 있도록 설계하였다.
따라서 본 발명의 키메라 항원을 이용할 경우, 개체 내에 이미 형성되어 존재하는 특정 항원-항원 시스템에 의한 면역계(면역반응)를 재활성화시켜 대상질환을 매우 효율적으로 치료할 수 있도록 하였다.
본 발명의 상기 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원의 구성요소를 살펴보면, 크게 면역 반응 유도 영역 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역이 융합된 형태의 융합 단백질로 형성되어 있다.
상기 면역 반응 유도 영역은 특정 외부항원 영역(도메인)으로서 외래 바이러스성 항원일 수 있고, 상기 면역 반응 유도 영역에 의해 키메라 항원이 투여된 개체 내에서 항원-항체반응이 안정적으로 형성될 수 있다.
본 발명의 키메라 항원에 포함될 수 있는 상기 면역 반응 유도 영역은 외래 항원으로 바이러스, 세균 또는 각종 전염성 질환과 관련된 생물체의 단백질, 당단백질, 외피 단백질, 내피 단백질 또는 기능성 단백질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 이에 제한되지는 않으나, B형 간염바이러스 항원, C형 간염바이러스 항원, A형 간염바이러스 항원, AIDS 바이러스 항원, MERS 바이러스 항원, 인플루엔자 A 바이러스 항원, 인두유종바이러스 항원, 임파구성맥락수막 바이러스(LCMV) 항원 및 단순포진 바이러스(HSV) 항원으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 B형간염바이러스 항원으로 B형간염바이러스의 내피 단백질(HBc) 또는 B형간염바이러스의 e항원 (HBe) 또는 B형간염바이러스의 표면 단백질(HBs)일 수 있다.
상기 B형간염바이러스 유래 항원인 내피 단백질의 항원(HBcAg)은 서열번호 1의 펩타이드 서열로 이루어진 것이고, 상기 B형간염바이러스의 e항원(HBeAg)은 서열번호 3의 펩타이드 서열로 이루어진 것이며, 상기 B형간염바이러스의 표면 단백질 항원(HBsAg)은 서열번호 5의 펩타이드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2에 나타내었고, 서열번호 3의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4에 나타내었으며, 서열번호 5의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6에 나타내었다.
또한, 상기 표적 세포 특이적 결합 유도 영역은 주로 체내의 정상적인 생명활동과 관련된 단백질로서 세포막에 있는 수용체나 리간드에 물리적으로 결합할 수 있는 수용성 단백질 또는 세포막 단백질일 수 있다. 상기 본 발명의 상기 표적 세포 특이적 결합 유도 영역으로는 이에 제한되지는 않으나, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD28, ICOS, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD40, CD40L, 4-1BB, 4-1BBL, B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-DC, CD80, CD160, BTLA, HVEM, DPP-4, NTCP, CD16 및 Caveolin-1으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 표적 세포 특이적 결합 유도 영역으로, 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 세포막 단백질인 PD-1을 사용하였는데, 세포막 단백질은 면역관문시스템에서 핵심적인 역할을 하는데, PD-1은 세포막에 부착되어 있으며 이를 세포 외로 잘 분비하는 형태로 알려져 있다(Cellular Immunology, 2005, 235:109). 이에 본 발명에서는 PD-1을 이의 수용체인 PD-L1에 견고하게 결합하는 단백질로 변환하였고, 따라서 세포 외 분비가 가능하고 수용체에 높은 결합력을 갖는 재조합 PD-1 단백질의 사용하였으며, 본 발명에서 사용한 상기 PD-1 단백질의 펩타이드 서열은 서열번호 7에 나타내었고, 상기 서열번호 7의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 8에 나타내었다.
또한 본 발명의 키메라 항원은 상기 면역 반응 유도 영역과 표적 세포 특이적 결합 유도 영역 사이를 키메라 항원의 구조적 안정성과 면역반응을 최대화하기 위해 특정 서열로 이루어진 링커 펩타이드로 연결되도록 설계하였다. 링커 펩타이드의 서열에 따라서 키메라 항원의 구조적 안정성에 차이가 있음을 확인하였고, 이를 토대로 키메라 항원의 안정성과 면역반응을 높이는데 유효한 링커 펩타이드를 선별하였다. 본 발명에서 사용 가능한 상기 링커 펩타이드 1 은 서열번호 19로 표시되는 46개의 펩타이드로 이루어져 있으며, 상기 링커 펩타이드 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20에 나타내었다. 또한 본 발명에서 사용 가능한 상기 링커 펩타이드 2는 서열번호 21로 표시되는 24개의 펩타이드로 이루어져 있으며, 상기 링커 펩타이드 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 22에 나타내었다.
본 발명의 일실시예에서, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원으로서, 용해성 키메라 항원인인 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe를 각각 제조하였는데, 이는 면역 반응 유도 영역으로 B형간염바이러스의 내피 단백질(HBcAg) 및 B형간염바이러스의 e항원 단백질(HBeAg)을 각각 사용한 것이며, 표적 세포 특이적 결합 유도 영역으로 PD-L1과 결합력이 있는 세포 외로 분비되는 수용성 PD-1을 사용한 것이다. 또한 본 발명의 일실시예에서 상기 PD-1과 HBc 도메인은 이들 사이에 서열번호 19의 링커 펩타이드 1로 연결시켰고, 상기 PD-1과 HBe 도메인은 이들 사이를 서열번호 21의 링커 펩타이드 2로 각각 연결되도록 하였다.
또한, HBcAg 및 HBeAg 단일항원, PD-1/HBc 및 PD-1/HBe 키메라 항원들은 항체형성을 잘 유도하는 아미노산 서열들이 대부분 포함되도록 설계하였고, 각 항원 단백질이 세포 내에서 생산된 후 세포 밖으로 잘 분비되도록 하기 위하여 각 단백질의 아미노 말단에는 시그날 펩타이드가 포함되도록 하였다. 시그날 펩타이드의 합성은 당업자들에게 잘 알려진 방법을 통해 합성하였으며(PLoS One. 2016.19:11; Mol Ther. 2005, 11(3):435; Journal of Biotechnology, 2007, 128(4):705; Trends in Cell and Molecular Biology, Improving mammalian cell factories : The selection of signal peptide has a major impact on recombinant protein synthesis and secretion in mammalian cells), 본 발명에서는 제조한 다수의 시그날 펩타이드를 대상으로 항원 단백질의 아미노말단에 여러 종류의 시그날 펩타이드 서열들을 연결시켰고, 생산된 항원이 세포 외로 잘 분비되는지 검증과정을 거친 후, 각 항원들이 세포외로 잘 분비가 되는 시그날 펩타이드를 선별하였다.
본 발명에서는 상기 실험을 통해 본 발명의 키메라 항원이 세포 외 분비가 잘 되도록 하기 위해, 상기 시그날 펩타이드로서, 서열번호 23으로 표시되는 21개의 펩타이드(시그날 펩타이드 1) 또는 서열번호 25로 표시되는 17개의 펩타이드로 이루어진 시그날 펩타이드(시그날 펩타이드 2)를 사용하였고, 여기서 상기 서열번호 23의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 24에 나타내었으며, 상기 서열번호 25의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 26에 나타내었다.
이와 같이 본 발명에 따른 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은 면역 반응 유도 영역; 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역;이 융합된 형태를 갖는 것으로, 본 발명의 일실시예에서는 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원으로 PD-1/HBcAg 및 PD-1/HBeAg 키메라 항원을 각각 제조하였다.
상기 본 발명에서 제조한 본 발명의 PD-1/HBcAg 키메라 항원에 대한 펩타이드 서열은 서열번호 9에 나타내었고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 나타내었다.
본 발명의 PD-1/HBcAg 키메라 항원을 나타내는 서열번호 9의 폴리펩타이드는 세포 외 분비를 위한 시그날 펩타이드 1의 서열을 포함하고 있는데, 상기 시그날 펩타이드 1의 서열은 서열번호 9의 1번째 아미노산부터 21번째까지의 총 21개의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
또한 상기 서열번호 9의 PD-1/HBcAg 키메라 항원을 나타내는 폴리펩타이드는 링커 펩타이드 1을 포함하고 있는데, 상기 링커 펩타이드 1은 상기 서열번호 9에서 232번째 아미노산부터 277번째 아미노산까지 총 46개의 아미노산이다.
또한 상기 서열번호 9의 PD-1/HBcAg 키메라 항원에 대한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 나타내었고, 서열번호 10에서 상기 시그날 펩타이드 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호 10의 1번째 염기서열부터 63번째까지 총 63개의 염기서열로 이루어져 있으며, 서열번호 10에서 상기 링커 펩타이드 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호 10의 694번째 염기서열부터 831번째까지의 염기서열로 이루어져 있다.
또한 본 발명의 PD-1/HBeAg 키메라 항원의 펩타이드 서열은 서열번호 11에 나타내었고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 나타내었다.
본 발명의 PD-1/HBeAg 키메라 항원을 나타내는 서열번호 11의 폴리펩타이드는 세포 외 분비를 위한 시그날 펩타이드 2의 서열을 포함하고 있는데, 상기 시그날 펩타이드 2의 서열은 서열번호 11의 1번째 아미노산부터 17번째까지 총 17개의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
또한 상기 서열번호 11의 PD-1/HBeAg 키메라 항원을 나타내는 폴리펩타이드는 링커 펩타이드 2를 포함하고 있는데, 상기 링커 펩타이드 2는 상기 서열번호 11에서 228번째 아미노산부터 251번째 아미노산까지 총 24개의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
또한 상기 서열번호 11의 PD-1/HBeAg 키메라 항원에 대한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 나타내었고, 서열번호 12에서 상기 시그날 펩타이드 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호 12의 1번째 염기서열부터 51번째까지 총 51개의 염기서열로 이루어져 있으며, 서열번호 12에서 상기 링커 펩타이드 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호 12의 682번째 염기서열부터 753번째까지 총 72개의 염기서열로 이루어져 있다.
한편, 본 발명에 따른 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은 면역반응의 활성화를 통해 암 또는 감염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 항원은 표적 세포 특이적 결합 유도 영역을 포함하고 있어 표적 세포인 질병 세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 면역 반응 유도 영역을 포함하고 있어 탈진한 CD8+ T세포의 회복을 촉진하여 T세포의 활성을 유도함과 동시에 항원-항체 반응을 유도하여 체액성 면역반응의 증진 및 자연살해세포(NK cell)에 의한 세포 독성 작용을 동시에 활성화시킴으로써 다중 면역기능을 강화시킬 수 있는 특징이 있다.
특히 면역 반응 유도 영역을 통한 다중 면역기능의 강화는, 외래 항원에 노출되어 상기 외래항원에 대한 특이적이고 안정적인 항원-항체 반응 시스템이 존재하는 개체를 대상으로 상기 외래항원을 포함하는 본 발명의 키메라 항원을 처리함으로써 항원-항체 반응을 재활성화 시키고 따라서 체액성 면역과 세포성 면역을 동시에 다중 활성화시키는 것을 말한다.
그러므로 본 발명은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 암의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 “감염질환”은 외래 바이러스, 세균, 원생생물 등을 포함하는 각종 감염원 또는 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미하며, 상기 감염 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, B형간염바이러스, C형 간염바이러스, A형 간염바이러스, AIDS바이러스, MERS 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인두유종바이러스, 임파구성맥락수막 바이러스(LCMV) 또는 단순포진 바이러스(HSV) 감염성 질환일 수 있다.
또한 본 발명은 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 면역증강제 조성물을 제공할 수 있으며, 이러한 면역증강제 조성물은 면역기능 이상으로 유발되는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 “면역질환”은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미하며, 면역반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 HBcAg와 PD-1이 융합된 PD-1/HBc 키메라항원 및 HBeAg와 PD-1이 융합된 PD-1/HBe 키메라항원을 in vitro에서 전사 과정을 통해 각각의 mRNA(IVT mRNA; in vitro transcription mRNA)를 제조한 후, 제조된 PD-1/HBc mRNA 및 PD-1/HBe mRNA를 각각 질병세포에 도입한 다음, PD-L1 리간드에 선택적으로 상기 키메라 항원이 결합하는지 확인한 결과, PD-1/HBc 및 PD-1/HBe 키메라 항원 모두 PD-L1 리간드에 특이적으로 결합하고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에서 마우스를 사전접종에 통하여 키메라 항원 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe에 결합할 수 있는 HBcAg 및 HBeAg의 각 항체 생성을 위해 HBcAg 및 HBeAg 단백질을 각각 마우스에 주입한 후, 항체생성 여부를 분석한 결과, HBcAg 및 HBeAg에 대한 특이적인 항체가 생성되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 키메라 항원을 개체에 투여할 경우, 질병세포 특이적인 타겟 부위에 본 발명의 키메라 항원이 결합할 수 있고 동시에 개체내 존재하는 항체에 결합함으로써 체액성 면역 활성을 촉진시키며 결과적으로 면역증강 작용을 통해 질병세포를 제거하여 대상질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
나아가 동물실험을 통해 본 발명의 키메라 항원을 이용한 항암활성을 확인하기 위하여, HBsAg와 HBcAg을 사전접종하고, 이에 대한 1차 항체가 형성된 마우스에 PD-L1을 세포막에 표지하고 있는 마우스 암세포 B16F10 세포들을 이식하여 암 조직을 생성하게 한 뒤, 본 발명의 키메라 항원을 주입한 결과, 단독항원인 HBcAg 및 HBeAg를 각각 단독 주입한 군에서는 암세포 사멸 효과가 거의 없는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 키메라 항원인 PD-1/HBc mRNA 및 PD-1/HBe mRNA을 주입한 군에서는 암조직의 성장이 효과적으로 저해되고 동시에 마우스의 생존율이 크게 증가함을 알 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 본 발명의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은 암 또는 감염질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었고, 특히 본 발명의 키메라 항원은 면역저해를 매개하는 PD-1의 신호경로 및 PD-1과 PD-L1의 결합을 차단함을 통해 암 또는 감염세포에 의한 T 세포탈진(exhaustion) 상태의 회복을 유도하며, T 세포의 사이토카인 분비 능력을 활성화시켜 면역 반응을 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
즉 체내에 기형성되었지만 T 세포탈진에 의해 불능화된 질병세포 타겟 특이적인 CD8+T 세포의 활성을 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다. 게다가 외래항원에 특이적인 항체에 의해 결합하고 활성화되는 체액성 면역세포인 Natural killer (NK)세포, Macrophage (대식세포), Monocyte (단핵구)들은 항체의존적인 세포매개독성 (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity) 활성으로 일반적인 단독 항체 치료제의 경우보다 더 신속하고 강력하게 PD-1과 PD-L1의 상호작용에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. PD-1과 PD-L1의 상호작용에 의해 유발되는 질환은 앞서 기술한 암 또는 감염질환일 수 있다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 키메라 항원을 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암 또는 감염질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 키메라 항원은 환자의 몸무게 1kg당 0.1 pg에서 1g의 질량으로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 암 또는 감염질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 암 또는 감염질환의 예방 또는 치료용 조성물은 암 또는 감염질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
나아가 본 발명은 인간을 제외한 암 또는 감염질환이 유발된 개체에 상기 본 발명의 키메라항원을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염질환의 치료방법을 제공할 수 있다.
또한, 적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 다중 면역기능이 강화된 본 발명의 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염질환에 대한 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 애쥬번트를 함께 포함할 수 있다. 애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Annu.Rev.Immunol, 1986, 4:369). 본 발명의 백신 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함하며, 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트(Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 상기 애쥬번트는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있다. 상기 “면역학적 유효량"이란 질병 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
HBc , HBe , HBs , PD-1/ HBc 또는 PD-1/ HBe의 키메라항원을 코딩하는 융합유전자의 제조
B형간염 코어항원(HBcAg), B형간염 e항원(HBeAg), B형간염 외피항원(HBsAg), PD-1, 용해성 키메라항원 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe의 단백질을 코딩하는 각 유전자를 인비트로(in vitro)에서 전사시켜 합성한 IVT mRNA(In vitro transcribed mRNA)를 생산하기 위한 DNA 절편의 모식도를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이 상기 IVT mRNA 생산을 위한 DNA 절편은 개방형 번역틀 (open reading frame), T7 프로모터 염기서열, 5‘ 비해독(untranslated) 염기서열(5’UTR), 3’ 비해독(untranslated) 염기서열(3’UTR)을 포함하도록 미국 System Biosciences 사의 mRNAExpress mRNA Synthesis kit를 참고하여 제작하였다. DNA 절편의 설계에서 개방형 번역틀, 즉 목적 유전자는 카세트 형태로 연결시켜 삽입되도록 하였다. 이때 키메라 항원의 면역 반응 유도 영역과 표적 세포 특이적 결합 유도 영역을 코딩하는 개방형 번역틀의 순서는 고정되는 것이 아니라 양 유도 영역이 위치가 상호 바뀔 수도 있다. 즉, 도 2에서 링커로 연결된 “A gene” 및 “B gene”에는 키메라 항원의 면역 반응 유도 영역 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역이 각각 위치되어지며, 그 위치는 상호 바뀔 수 있다.
또한 B형간염 코어항원(HBcAg), B형간염 e항원(HBeAg), B형간염 외피항원(HBsAg), PD-1, 용해성 키메라항원 PD-1/HBcAg 및 PD-1/HBeAg에 대해 in vitro에서 전사시킨 각각의 IVT mRNA에 대한 DNA 염기서열을 서열번호 13(HBcAg), 14(HBeAg), 15(HBsAg), 16(PD-1), 17(PD-1/HBcAg) 및 18(PD-1/HBeAg)에 각각 나타내었다.
또한, 상기 서열번호 17의 염기서열은 PD-1/HBcAg IVT mRNA를 코딩하는 DNA 주형의 염기서열로서 상기 염기서열은 PD-1/HBcAg의 코딩서열 뿐만 아니라 T7 프로모터, 5’UTR 및 3’UTR의 염기서열도 포함한다.
서열번호 18의 염기서열 역시 PD-1/HBeAg IVT mRNA를 코딩하는 DNA 주형의 염기서열로서 상기 염기서열은 PD-1/HBeAg의 코딩서열 뿐만 아니라 T7 프로모터, 5’UTR 및 3’UTR의 염기서열도 포함한다.
또한, 전사가 완료된 후, 일련의 인접 ”폴리아데닐산(폴리(A))테일"이 폴리에이 폴리머라제(poly A polymerase)에 의해 RNA 분자의 3' 말단에 첨가되는데 이 과정은 당업자들에 잘 알려진 방법으로 설계 시점에 최소 50개의 아데닌 서열의 폴리에이 염기서열을 삽입되도록 고안하였다. 상기 설계된 DNA 절편은 미국의 IDT사에 의뢰하여 합성하였고, IDT사에서 제작한 각 항원유전자를 포함한 벡터 DNA 10ng을 주형으로 이용하고, 하기 서열번호 27 및 28의 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 프라이머를 이용하여 유전자 DNA 증폭반응을 수행하였다. PCR 반응생성물은 당업자들에 잘 알려진 용리(elution)방법에 의해 정제하였고, 이후 인비트로 전사(in vitro transcription)반응을 위한 주형(Template)으로 사용하였다(도 3).
서열번호 27 프라이머 염기서열(프라이머 1):
5‘-AGATCTTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGA-3’
서열번호 28 프라이머 염기서열(프라이머 2):
5’-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTCTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTAATAT TCTTCCTACT CAGGCTTTAT TCAAAGACC-3’
<실시예 2>
단일 항원 또는 키메라 항원을 코딩하는 DNA 절편으로부터 IVT mRNA 합성
상기 실시예 1에서 제조한 주형(Template) DNA를 이용하여 인비트로 전사(IVT)를 실시하여 인공적인 mRNA를 합성하였는데, 이는 mRNA 생산용 키트인 미국 New England Biolabs 사의 하이스크라이브 티세븐 아르카 mRNA 키트 (HiScribe T7 ARCA mRNA kit with tailing)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 1μg의 HBcAg, HBeAg, HBsAg, PD-1, PD-1/HBc 및 PD-1/HBe의 단일 또는 키메라항원 유전자의 염기서열을 포함하는 정제된 각각의 DNA 절편, 10μl 2x ARCA/NTP Mix, 2μl T7 RNA Polymerase Mix를 혼합하고 나머지는 증류수를 첨가하여 최종적으로 20μl의 반응물을 조성한 뒤, 37℃에서 60분간 반응시킨다. 반응이 완료되면 2μl DNase 효소를 첨가한 후 37℃에서 15분간 처리하여 잔류 DNA를 모두 제거하였다. 반응으로부터 얻어진 IVT mRNA는 당업자들에게 잘 알려진 RNA 정제 키트를 이용하여 정제한 후, 0.5x TAE 완충용액을 이용한 1.2% 아가로즈 전기영동에 의해 mRNA 생산을 확인하였다(도 4).
상기 과정을 통해 제조된 단일항원의 mRNA로부터 발현되는 단백질인 단일 항원 HBcAg의 폴리펩티드 서열은 서열번호 1에 나타내었고, HBeAg의 폴리펩티드 서열은 서열번호 3에 나타내었으며, HBsAg의 폴리펩티드 서열은 서열번호 5에 나타내었고, PD-1의 폴리펩티드 서열은 서열번호 7에 나타내었다. 또한, 상기 키메라 항원의 mRNA(서열번호 17)로부터 발현되는 키메라 항원 단백질인 PD-1/HBc의 폴리펩티드(아미노산) 서열은 서열번호 9에 나타내었고, 다른 키메라 항원의 mRNA(서열번호 18)로부터 발현되는 키메라 항원 단백질인 PD-1/HBe의 폴리펩티드(아미노산) 서열은 서열번호 11에 나타내었다.
<실시예 3>
키메라 항원을 코딩하는 IVT mRNA의 인간 293T 세포에서의 발현 확인
상기 실시예 2에서 정제한 IVT mRNA를 인간 세포주인 HEK293T (ATCC, CRL-3216)에 형질감염 시켰다. HEK293T 세포주는 인체 배아 신장(Human Embryonic Kidney) 에서 기원한 암세포화된 신장세포로써 상기 세포의 배양은 T75 플라스크에서 10% FBS(Fetus Bovine Serum: GIBCO, #16000-028), 1 % ABAM(GIBCO BRL, #15240-O13)를 첨가한 MEM 배지(GIBCO, #11095-080)로 3일 동안 배양하였고 배양 후, 1x PBS 완충용액에 세척한 후 트립신을 처리하여 용기 바닥에서 떼어내었다. 이후 분리된 세포들을 원심분리하여 상층액은 버리고 다시 1x PBS 완충용액으로 재분산한 후 5X10^5 cells/dish가 되게 재분산하였다. 24시간 후 세포가 배양용기 표면에 잘 부착된 것을 확인한 후 Lipofectamine Messenger Max Transfection Reagent(Invitrogen, #LMRNA003), mRNA전용 형질주입 시약을 이용하여 당업자들이 제공하는 방법으로 키메라 항원을 코딩하는 IVT mRNA(PD-1/Hbc 및 PD-1/Hbe)를 상기 세포에 형질감염 시켰다. 형질감염된 세포들은 60mm 배양 용기에 분산하고 5 % CO2 세포 배양기에서 2일간 배양하였다.
배양 후, 24시간에 세포배양액을 수득하였고, 48시간이 지난 후에 부착된 세포들과 세포배양액을 1.5ml 튜브에 수확하였다. 수확한 세포들과 세포배양액에서 단일 또는 키메라항원이 생성되어 분비되었는지 확인하기 위하여 효소결합면역흡착검사 (ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)를 PD-1 ELISA Kit (Arigo Biolaboratories, #ARG81342)를 사용하여 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 생산된 IVT-mRNA는 HEK293T 세포주에 형질된 후 배양액과 세포 내 양쪽에서 모두 PD-1 단백질이 검출되었다. 이를 통해 본 발명자들은 목적하는 키메라 항원들이 모두 충분히 세포 외로 분비되었음을 확인할 수 있었다. 또한 수확한 세포들에서 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 전기영동 후 PD-1항체(R & D System, AF1021)를 이용한 웨스턴블럿을 수행한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 목적하는 키메라항원이 생성되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 이때 수확된 세포추출물은 세포막에 존재하는 PD-L1 단백질 결합을 보여줄 수 있는 면역침강분석법(Immuno-precipitation)을 위한 샘플로도 사용하였다.
<실시예 4>
면역침강법을 이용한 세포막에 존재하는 PD-L1 단백질과 293T에서 발현된 키메라항원의 결합여부 확인
면역침강법(Immunoprecipitation: IP)을 이용하여 세포막에 존재하는 PD-L1과 본 발명에서 제조한 단일항원(PD-1) 및 키메라항원(PD-1/HBc 또는 HBsAg/PD-1) 과의 결합여부를 확인하였다. 이를 위해 PD-L1에 대한 항체를 첨가하여 PD-L1/PD-1/anti-PD-L1항체, PD-L1/PD-1/HBc/anti-PD-L1항체, PD-L1/HBsAg/PD-1/anti-PD-L1항체의 복합침전물을 얻었고, 이 침전물을 전기영동 후 웨스턴블럿을 통해 PD-L1과 PD-1, PD-1/HBc 또는 HBsAg/PD-1과의 상호작용을 동시면역침강법(coimmunoprecipitation, co-IP)을 통해 분석하였다.
구체적으로, PD-L1을 세포막에 표지하고 있는 암세포에 PD-1, PD-1/HBc 또는 PD-1/HBe 유전자를 코딩하는 IVT mRNA를 전기천공 또는 Lipofectamine Messenger Max Transfection Reagent(Invitrogen, #LMRNA003) mRNA전용 형질주입 시약을 이용하여 형질 감염시키고 2일후에 세포를 수확한 후 RIPA 완충용액으로 세포를 용해하였다. 세포 잔해물을 원심분리에 의해 제거한 후 상층액을 다른 1.5ml 시험관에 옮기고 적당양의 항PD-L1 항체 또는 특정 표지단백질 항체를 첨가하여 섞어준 다음, 1시간 동안 배양하여 항원-항체 복합체(면역 복합체)를 형성시켰다. 이 복합체에 다시 고정화된 Protein A 또는 Protein G 아가로즈 겔을 혼합한 후 2시간 동안 회전시키면서 배양하여 겔에 부착되도록 하였고, 이후 침전된 복합체로부터 결합되지 않은 단백질들은 수차례 세척하여 제거하였으며, 침전 복합체를 SDS-PAGE 전기영동 후 각각의 항원-특이적 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 것처럼 본 발명에 따른 단일 또는 키메라 항원의 IVT-mRNA로 형질감염된 HEK293T 세포주의 세포추출물을 대상으로 PD-L1에 대한 항체를 첨가하여 분석한 결과, PD-L1이 PD-1, PD-1/HBc 또는 PD-1/HBe과 상호작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA의 전달효율을 증가시키기 위한 지질나노입자(LNP)의 제작
mRNA의 안정성 증가 및 세포로의 전달효율을 증가시키기 위하여, 여러 지질로 이루어진 지질나노입자 (Lipid nanoparticle, LNP)를 제작하였다(Cell, 2017, 168:1). 우선, 4가지 종류의 지질인 SS-OP, DOPC, Cholesterol, PEG-lipid를 100% 에탄올에 녹인 후, 이들을 각각 50 : 10 : 38.5 : 1.5의 몰 비율로 섞었다. 50 mM 시트레이트 완충용액(pH 3.0)에 포함된 본 발명의 상기 단일 항원 및 키메라 항원을 코딩하는 IVT mRNA와 지질 혼합액 각각을 캐나다 Precision Nanosystems 사의 Microfluidic 기기를 사용하여 LNP를 제작하였다. 제작된 LNP를 투석 막 카세트에 옮긴 후 1x PBS 완충용액에 18시간 동안 투석하였고, 독일 Merk Millipore 사의 원심분리형 필터 (Centrifugal filter)를 이용하여 적정 농도를 맞추었다. 농도를 맞춘 후에 0.22 μm 필터로 여과시키고 세포 내 투입 또는 마우스 주입에 사용할 때까지 4℃ 냉장보관 하였다.
<실시예 6>
키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP의 크기와 mRNA 봉입효율 측정
상기 실시예 5에서 제작한 각 LNP를 영국 Malvern 사의 Zetasizer 나노입자분석기를 이용하여 입자의 크기 및 다분산지수 (Polydispersity Index, PDI)를 측정하였다.
그 결과, 도 8에서 나타난 것처럼 IVT mRNA를 봉입한 LNP는 IVT mRNA를 포함하지 않은 Naked LNP에 비해 약간 큰 90~150nm의 입자 크기를 보였다. 또한 각 LNP 제작과정에서 봉입된 IVT mRNA의 LNP 내부로의 mRNA 봉입효율을 미국 Thermo Fisher Scientific 사의 Quanti-iT Ribogreen 키트를 이용한 Ribogreen assay를 수행하여 측정한 결과, 도 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단일항원 및 키메라 항원을 봉입한 LNP 제작과정에서 각 IVT mRNA의 봉입효율은 모두 약 86~94% 범위의 높은 효율을 보였다.
<실시예 7>
키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP의 세포 수준에서의 항원 발현효율 확인
상기 실시예 5에서 제작한 LNP들이 실제로 세포 내에서 단백질을 생산할 수 있는 여부를 알기 위하여 본 발명에서 제조한 단일항원 HBcAg 및 HBeAg IVT mRNA를 봉입한 LNP를 인간 세포주인 HeLa (ATCC, CCL-2)에 각각 형질감염 시켰다. HeLa는 자궁경부암 (Cervical cancer)에서 유래한 암세포로써, 이를 배양하기 위해 T75 플라스크에서 10% FBS (Fetus Bovine Serum: GIBCO, #11095-080), 1% ABAM (GIBCO BRL, #15240-013)를 첨가한 MEM 배지 (GIBCO, #11095-080)로 3일 동안 배양한 후 1x PBS 완충용액에 세척한 후 트립신을 처리하여 용기 바닥에서 떼어내었고, 분리된 세포들을 24-well 배양 용기에 5X10^5 cells/well의 농도로 파종(seeding)한 후, 24시간 동안 5% CO2 농도의 세포 배양기에서 배양하였다. 다음 날, 상기 본 발명의 LNP와 아포지단백 (Apolipoprotein E4, ApoE4)을 혼합한 후 37℃에서 10분간 배양시킨 후, 세포에 형질감염 하였다. 형질감염된 세포의 배양 용액을 수확한 후, 세포에서 분비된 항원의 양을 효소결합면역침강분석법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 각각 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe IVT mRNA를 봉입한 LNP는 HeLa 세포에 투입된 후 효율적으로 각 항원이 생산된다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 8>
키메라항원을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP의 마우스에서의 항원 발현 확인
또한 본 발명자들은 실시예 7에서 세포 수준에서 확인한 항원발현 결과를 실험동물을 통해서도 확인하기로 하였다. 이를 위해 상기 실시예 5에서 제작한 LNP를 6주령의 C56BL/6 암컷 마우스에 왼쪽 전경골근 (left tibialis anterior)에 주입하여 항원의 발현효율을 확인함으로써 LNP의 동물 체내로의 IVT mRNA 전달체로써의 효율성을 분석하였다. 이를 위해 2 μg의 본 발명의 IVT mRNA를 봉입한 LNP를 1x PBS 완충용액과 함께 총 80 μl씩 마우스에 접종하였다. 접종 후 1일, 3일, 6일차에 심장으로부터 전혈을 수집하였고 각 항원 단백질의 생성 여부를 효소결합면역침강분석법으로 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, PD-1/HBe 키메라 항원은 1일 차부터 생성되어 6일 차까지 생성되는 것으로 나타났고, PD-1/HBe 키메라 항원의 생성은 LNP를 이용하여 마우스에 주입하였을 때, 마우스 체내에서 충분히 단일항체 및 키메라 항체들이 실제로 생산된다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 9>
HBcAg 및 HBeAg 단백질을 사전 접종한 마우스에서 1차적으로 이들 항원에 대한 항체 형성 확인
1일차에 6주령의 C57BL/6 암컷 마우스에 HBcAg (미국, MyBioSource사, #MBS355629), HBeAg 단백질 (미국, MyBioSource사, #MBS355623)을 어주번트 (미국, Sigma사, #F5881)와 혼합한 후, 마우스당 2 μg씩 왼쪽 전경골근(left tibialis anterior)에 30㎕씩 3번에 나누어 주사하였다. 첫 번째 접종 후 11일차에 같은 양의 항원 단백질을 동일한 방법으로 각 마우스에 주사하였다. 첫 번째 접종 후 7일, 21일, 35일, 44일에 면역된 생쥐에서 혈청을 꼬리동맥으로부터 수집하여 항체의 생성 여부를 효소결합면역침강분석법으로 검색하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 항원이 접종된 각 마우스들은 각 HBcAg, HBeAg에 대한 각각의 항체가 형성된 것으로 나타났다.
<실시예 10>
마우스 Xenograft 모델을 이용한 암세포들에서 본 발명의 키메라항원 (PD-1/HBc 또는 PD-1/ HBe )의 항암활성 확인
항원을 사전 접종한 21일차에 실시예 9에서 HBcAg 및 HBeAg 항원 단백질 접종으로 각 항원에 대한 항체가 형성된 C57BL/6 마우스의 측면 피하에 약 1x106개의 Melanoma 암세포 B16F10를 주입하였다. 암세포 투여 10일 후, 본 발명의 키메라항원인 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe을 코딩하는 IVT mRNA-LNP를 마우스 왼쪽 전경골근에 각각 주입(본접종)하였다. 암세포 투입 후 매 3일마다 마우스의 체중 변화와 암조직 생성을 관찰하고, 암조직의 크기를 측정하였다. 이때 상기 실험에 사용한 마우스의 수는 각 시험군 별 6~7마리이다.
그 결과, 도 13에 나타난 것처럼 HBcAg 항원을 사전접종한 마우스에서 암조직의 성장은 본 발명의 키메라 항원 PD-1/HBc IVT mRNA-LNP를 본 접종한 경우, 대조군에 비해서 현저히 억제되는 것으로 나타났고, 마찬가지로 HBeAg 항원을 사전접종한 마우스에서의 암조직 성장은 본 발명의 키메라 항원 PD-1/HBe IVT mRNA-LNP를 본접종한 경우 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 키메라 항원 PD-1/HBc 및 PD-1/HBe IVT mRNA-LNP를 본 접종한 실험군은 대조군에 비해, 마우스의 사망률이 44일간의 시험기간 동안 현저히 감소하여 생존율이 2배가량 증가함을 알 수 있었다. 이러한 마우스 사망률의 감소는 본 발명의 키메라 항원의 주입에 의한 것임을 알 수 있다. 본 발명의 키메라 항원 접종 전후 마우스의 생존율을 비교한 결과, 본 발명의 키메라 항원을 접종한 실험군에서만 생존율이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 15).
또한, 도 16은 HBcAg 항원에 대하여 1차적으로 항체가 형성된 C57BL/6 마우스에 Melanoma 암세포인 B16F10를 이식하여 암조직이 생성되도록 유도한 후 PD-1/HBc을 코딩하는 IVT mRNA가 봉입된 LNP를 마우스에 주입한 전후의 HBcAg 항원에 대한 항체의 상대적인 양과 암조직 크기와의 연관성을 보여주는 결과로, 암조직의 크기가 많이 감소한 개체들에서 상대적으로 HBcAg 항원에 대한 항체의 양이 약간 감소된 것으로 나타났다. 이는 마우스 체내에서 HBcAg 항원에 대한 항체의 항체의존성 세포매개 세포독성(ADCC) 활성에 의해 암조직의 성장이 저해되는 과정에서 항체가 Natural Killer 세포 부착과정에서 소모되었기 때문이라고 볼 수 있으며, 이는 본 발명자가 당초에 키메라 항원이 항체 의존성 체액성 면역에 의해 암조직이 성장이 저해될 수 있다는 예측을 증명한 결과라 할 수 있다.
결론적으로, 본 발명자들은 체내에 특이적인 항원-항체반응시스템이 이미 형성된 특정 외부항원에 질환과 연관된 표적단백질에 결합할 수 있는 펩타이드 도메인이 결합된 키메라 항원을 투여할 경우, 키메라 항원은 표적단백질을 세포막에 표지하고 있는 암 또는 감염세포에 특이적으로 결합할 수 있고, 동시에 키메라 항원의 다른 도메인에 의해 이미 체내에 형성된 항원-항체반응시스템을 유도하여 표적 질환세포를 효과적으로 제거함으로써 암 또는 감염질환을 치료할 수 있고, 동시에 환자의 생존을 크게 증가시킬 수 있는 새로운 암 또는 바이러스 감염질환의 치료방법을 제공할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 면역 반응 유도 영역; 및 표적 세포 특이적 결합 유도 영역;이 융합된, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역 반응 유도 영역은, 외래 바이러스성 항원으로 상기 항원에 의해 항원-항체반응이 형성되는 것을 특징으로 하는, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 면역 반응 유도 영역은, B형간염바이러스 항원, C형 간염바이러스 항원, A형 간염바이러스 항원, AIDS 바이러스 항원, MERS 바이러스 항원, 인플루엔자 A 바이러스 항원, 인두유종바이러스 항원, 임파구성맥락수막 바이러스(LCMV) 항원 및 단순포진 바이러스(HSV) 항원으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역 반응 유도 영역은, B형간염바이러스 항원으로 B형간염바이러스의 내피 단백질(HBc), B형간염바이러스의 e항원 (HBe) 또는 B형간염바이러스의 표면 단백질(HBs)인 것을 특징으로 하는, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적 세포 특이적 결합 유도 영역은 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 세포막 단백질로서 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD28, ICOS, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD40, CD40L, 4-1BB, 4-1BBL, B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-DC, CD80, CD160, BTLA, HVEM, DPP-4, NTCP, CD16 및 Caveolin-1으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 면역 반응 유도 영역과 표적 세포 특이적 결합 유도 영역 사이는 키메라 항원의 구조적 안정성을 위해 서열번호 19 또는 서열번호 21로 표시되는 링커 펩타이드로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 펩타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원.
  8. 제1항의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 감염 질환은 B형간염바이러스, C형 간염바이러스, A형 간염바이러스, AIDS바이러스, MERS 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인두유종바이러스, 임파구성맥락수막 바이러스(LCMV) 또는 단순포진 바이러스(HSV) 감염성 질환인 것을 특징으로 하는, 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 면역증강제 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원은,
    (i) 표적 세포인 질병 세포에 특이적으로 결합하고,
    (ii) 탈진한 CD8+ T세포의 회복을 촉진하여 T세포 활성을 유도하며, 및
    (iii) 항원-항체 반응을 유도하여 체액성 면역반응의 증진 및 자연살해세포(NK cell)에 의한 세포 독성 작용을 활성화시키는 것을 특징으로 하는,
    면역증강제 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (iii)의 항원-항체 반응 유도는 상기 키메라 항원의 면역 반응 유도 영역에 의해 개체의 체내에서 형성된 특이적 항원-항체반응을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 면역증강제 조성물.
  15. 제1항의 다중 면역기능이 강화된 키메라 항원을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염질환에 대한 백신 조성물.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010081068A (ko) * 1998-12-04 2001-08-25 아스트루 마이클 제이 펩티드 리간드에 의하여 부착된 다중 면역원성 성분을보유한 ｈｂｖ 코어 항원 입자
KR20080056301A (ko) * 2005-10-13 2008-06-20 바이렉스 메디칼 코포레이션 면역 반응을 유도시키기 위한, Ｃ형 간염 바이러스폴리펩티드 및 Ｆｃ 단편을 함유하는 키메라 항원
KR20100047343A (ko) * 2007-08-30 2010-05-07 바이렉스 메디칼 코포레이션 항원 조성물 및 핵산의 표적화된 전달에서의 이의 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103261217B (zh) * 2010-11-11 2017-04-26 港大科桥有限公司 可溶性 pd‑1变体、融合构建体及其用途
US9637532B2 (en) * 2013-07-12 2017-05-02 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle comprising PD-1 antigen or PD-1 ligand antigen
AU2018243920A1 (en) * 2017-03-28 2019-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human PD1 peptide vaccines and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010081068A (ko) * 1998-12-04 2001-08-25 아스트루 마이클 제이 펩티드 리간드에 의하여 부착된 다중 면역원성 성분을보유한 ｈｂｖ 코어 항원 입자
KR20080056301A (ko) * 2005-10-13 2008-06-20 바이렉스 메디칼 코포레이션 면역 반응을 유도시키기 위한, Ｃ형 간염 바이러스폴리펩티드 및 Ｆｃ 단편을 함유하는 키메라 항원
KR20100047343A (ko) * 2007-08-30 2010-05-07 바이렉스 메디칼 코포레이션 항원 조성물 및 핵산의 표적화된 전달에서의 이의 용도

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNU. REV. IMMUNOL, vol. 4, 1986, pages 369
BARBER, D. L.: "Restoring function in exhausted CD 8 T cells during chronic viral infection", NATURE, 9 February 2006 (2006-02-09), pages 682 - 687, XP055198624, DOI: 10.1038/nature04444 *
CELL, vol. 168, 2017, pages 1
JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 128, no. 4, 2007, pages 705
MOL THER, vol. 11, no. 3, 2005, pages 435
PLOS ONE, vol. 19, 2016, pages 11
SPONAAS, A. M.: "is expressed on exhausted T cells as well as virus specific memory CD 8+ T cells in the bone marrow of myeloma patients", ONCOTARGET, 10 August 2018 (2018-08-10), pages 32024 - 32035, XP055701823 *
VELUSWAMY, P.: "PD-1/PD-L1 pathway inhibition to restore effector functions in exhausted CD 8+ T cells: chances, limitations and potential risks", TRANSLATIONAL CANCER RESEARCH, April 2018 (2018-04-01), XP055701829 *

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