KR20240019135A - 작제물과 면역자극 화합물의 공동발현 - Google Patents

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아우둔 트리게 하우겐 베르사스
스티네 그라눔
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니코데 테라퓨틱스 에이에스에이
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Abstract

본 발명은 별도의 분자로서 공동발현되도록 조작된 다수의 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드와 같은 벡터에 관한 것이다. 이러한 별도의 분자에는 제1 폴리펩티드가 포함되며, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛, 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 포함한다.

Description

작제물과 면역자극 화합물의 공동발현
본 발명은 별개의 분자들로서 공동발현되도록 조작된 다수의 관심 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드와 같은 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 약학적 조성물, 및 질병의 치료 또는 예방에서의 이러한 벡터 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
B 세포(체액/항체 매개)와 T 세포 반응은 모두 병원체로 인한 감염에 대한 보호 반응의 중요한 구성 요소이다. 병원체 항원에 대한 특정 항체는 예를 들어 a) 독소 또는 병원체의 직접적인 중화, b) 병원체 독성 인자의 중화, c) 뮤신에 있는 병원체에 대한 결합 및 포획, d) 항병원체 식세포 제거, 분해 또는 용해를 중재하기 위한 보체 활성화, e) 호중구 옵소닌 식균작용의 활성화, f) 대식세포 옵소닌 식균작용의 유도, g) 감염된 세포의 살해를 위한 자연살해(NK) 세포 탈과립 활성화, h) 수지상 세포에 의한 항원 업데이트, 처리 및 T 및 B 세포에 대한 제시 강화, i) 기생충 감염 환경에서 비만 세포, 호염기구 및 호산구의 탈과립 유도와 같은 광범위한 이펙터 기능을 매개할 수 있다(L. Lu et al., Nat Rev Immunol 18(1), 2018, 46).
이러한 활동을 보완하는 T 세포 반응은 감염된 세포를 죽이고, 세포사멸을 유도하고, 항바이러스 물질을 방출하고/하거나 이미 감염된 세포에서 세포내 용해를 증가시켜 바이러스 복제 및 감염을 제한하는 데 중요하며 이를 통해 질병의 예방, 중증도 감소 또는 치료에 도움이 된다. 또한 양쪽 면역 부문에서 효과적이고 오래 지속되는 반응을 위해서는 일반적으로 헬퍼 T(Th1 및 Th2) 림프구의 추가 지원이 필요하다.
세포독성 T 림프구(CTL)는 또한 예컨대 MHC 클래스 I 제한 CD8+ T 세포가 박테리아 감염을 제거하는 데 중요하고 다양한 박테리아 종에 대해 보호 면역을 제공하는 것으로 알려진 세포내 병원체에서 중요한 역할(F. Sheperd et al., Int J Mol Sci 21, 2020, 6144)을 한다. MHC 클래스 II 제한 CD4+ T 세포는 기억 CD8+ T 세포 반응을 지원하며 박테리아 감염에 대한 보호 면역에 중요하다. 나이브 CD4+ T 세포는 T 헬퍼 1(Th1) 및 Th2 세포와 같은 이펙터 능력을 갖춘 세포의 서브세트를 분화한다. 항원-제시 세포(APC) 표면의 특정 T 세포 에피토프에 결합한 후 Th1 및 Th2 세포는 항체와 CTL 면역 사이의 균형을 조절하는 특정 가용성 사이토카인 신호를 공급한다. 따라서 효과적인 면역에는 T-헬퍼 세포에 의한 특정 병원체 면역원성 결정인자(에피토프)의 다중 항원 인식 사건과 이어서 B 세포, CTL 또는 둘 다에 의한 분자 인식이 포함된다.
다양한 유형의 림프구(B 세포, CTL 및 Th 세포)는 병원체의 다양한 유형의 에피토프를 특이적으로 인식한다. B 세포 에피토프는 선형 또는 구조적 에피토프로 분류될 수 있으며, 선형 에피토프는 종종 천연 단백질의 구조적 B 세포 에피토프의 일부가 된다. 구조적 에피토프는 바이러스 외피, 박테리아 외막 또는 분비된 박테리아 독소와 같은 병원체 표면에 노출된 구조적 특징이다. T 세포 에피토프는 병원체의 모든 단백질에서 나온 짧은 펩티드로, 숙주 항원 처리 및 MHC 결합 메커니즘, 특히 클래스 I 또는 클래스 II MHC 일배체형 제한 메커니즘만 준수하면 된다. 적합한 T 세포 에피토프는 숙주 집단 및 병원체에 따라 200-500개 아미노산 서열당 약 1개의 빈도로 추정된다.
병원체에 대한 백신은 해를 끼치거나 질병을 일으키지 않으면서, 숙주가 해당 감염원에 직면할 때 면역 체계가 해당 병원체가 해로운 효과를 일으키기 전에 이를 적절하게 중화할 수 있도록 보장하는 방식으로 변형된 병원체 또는 그 일부를 포함한다. 100년 넘게, 백신접종은 두 가지 접근 방식, 즉 면역 체계가 직접 반응하는 특정 항원을 도입하거나; 또는 질병을 일으키지 않고 숙주 내에서 복제하고 이후에 면역 체계를 자극하는 항원을 합성하는 살아있는 약독화 감염원을 도입하는 방식이 그것이다.
최근 백신접종에 대한 근본적으로 새로운 접근 방식이 개발되었다. 면역 반응을 자극할 수 있는 항원(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(DNA 또는 RNA)은 표적 항원의 현장 생산을 위해 적절한 조직에 직접 도입된다. 이 접근법은 B세포 및 T세포 반응 자극, 백신 안정성 향상, 감염원 부재, 대규모 제조의 상대적 용이성 등 기존 접근법에 비해 여러 가지 잠재적인 이점을 제공한다.
지난 수십년 동안 암 치료 기술이 발전하였고, 특히 조기 발견과 진단으로 인해 암 환자의 생존율이 크게 향상되었으나, 암 환자 중 진단 후 5년까지 생존하는 환자는 약 60%에 불과한다. 현재 사용되는 암 치료법의 대부분은 수술, 방사선, 세포독성 화학요법이지만 모두 심각한 부작용을 안고 있다. 최근에는 알려진 암 관련 항원에 대한 항체를 사용하는 치료법도 사용된다.
지난 몇 년 동안 환자 자신의 면역체계를 활용하여 암세포를 표적으로 하는 암 면역치료제, 즉 암백신이 관심을 끌었다. 이러한 치료법은 전통적인 암 치료법과 관련된 일부 부작용을 줄이거나 심지어 제거할 수도 있다.
따라서 감염성 질환의 치료 또는 예방과 암의 치료 또는 예방 모두에 사용될 수 있는 효율적인 제제 및 약제가 필요하다.
백신체 작제물(Vaccibody constructs)은 2개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 융합 단백질로서 각 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 하나 이상의 항원 또는 이의 일부를 포함하고, 대상체(예컨대 동물 또는 인간)에게 투여된 후 항원 유닛에 포함된 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 에피토프에 대한 면역 반응을 생성하는 데 효과적인 항원 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 백신체 작제물은 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 융합 단백질이며, 각각은 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛 및 하나 이상의 항원 또는 이의 일부를 포함하고, 대상체(예컨대 동물 또는 인간)에게 투여된 후 항원 유닛에 포함된 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 에피토프에 대한 면역 반응을 생성하는 데 효과적인 항원 유닛을 포함한다
백신체 작제물은 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 플라스미드와 같은 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드의 형태로 대상체에 투여될 수 있다. 숙주 세포에 투여된 후, 예를 들어 대상체의 근육 세포에 투여한 후, 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛으로 인해 이량체와 같은 다량체 융합 단백질을 형성하는 폴리펩티드가 발현된다.
발명의 개요
본 발명자들은 백신체가 발현되는 동일한 벡터로부터 하나 이상의 면역자극 화합물을 공동발현함으로써 백신체의 전반적인 면역 반응을 향상시키는 것이 가능하다는 놀라운 관찰을 하였다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 상기 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로서,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 질병 관련 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함한다. 이러한 벡터는 예를 들어 질병의 예방적 또는 치료적 치료를 위해, 예를 들어 암의 치료적 치료를 위해, 또는 질병의 예방적 또는 치료적 치료를 위해, 예를 들어 이러한 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 예방적 또는 치료적 치료가 필요한 대상체에게 조성물을 투여함으로써 감염성 질환을 예방할 수 있다.
도 1 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 공동발현 요소
두 인코딩 영역 사이에 삽입되는 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 IRES 공동발현 요소를 보여준다. mRNA가 생성되면 두 개의 리보솜(T)이 mRNA의 두 별도 위치에서 번역을 시작할 수 있고 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. A 및 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역자극 화합물일 수 있다.
도 2 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 공동발현 요소
두 유전자 사이에 삽입된 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 2A 자가 절단 펩티드 공동발현 요소를 보여준다. 전사 후, 하나의 리보솜이 mRNA를 번역하고 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. 도면의 상단은 2A 펩티드 서열이 인코딩 서열의 일부가 아닌 경우 융합 단백질이 어떻게 형성되는지 보여준다. A 및 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역자극 화합물일 수 있다.
도 3 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 공동발현 요소
도 3a는 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 양방향 프로모터(P) 공동발현 요소를 보여주며, 이는 두 인코딩 영역 사이에 위치한다. 하나의 mRNA가 생성되고 두 개의 리보솜(T)이 별도의 방향으로 번역을 시작할 수 있으며 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. A와 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역자극 화합물일 수 있다. 도 3a는 2개의 프로모터(P), 즉 2개의 인코딩 영역 앞에 위치하는 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 공동발현 요소를 보여준다. 두 개의 mRNA가 생성되고 두 개의 리보솜(T)이 두 개의 서로 다른 mRNA에서 번역을 시작할 수 있으며 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. A 및 B는 예를 들어 본 발명의 제1 폴리펩티드 및 면역자극 화합물일 수 있다.
도 4 제1 폴리펩티드의 구현예
본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산 서열에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 구현예를 예시한다.
도 5 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
DNA 플라스미드 VB4194, VB4168, VB4169 및 VB4170로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액에서 검출된 상기 DNA 플라스미드들에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준을, 마우스 α-인간 IgG CH3 도메인 포획 Ab(MCA878G) 및 α-인간 MIP-1α 비오티닐화된 포획 Ab(BAF270)를 사용하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 나타내었다. Lipo neg ctrl(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 6 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
DNA 플라스미드 VB4168, VB4169 및 VB4170로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 FLTL3의 단백질 발현 및 분비 수준을, 마우스 α-인간 FLT3L 포획 Ab(MAB608) 및 마우스 α-인간 FLT3L 비오티닐화된 검출 Ab(BAF308)를 사용하여 ELISA에 의해 나타내었다.
도 7 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
DNA 플라스미드 VB4169 및 VB4170로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF의 단백질 발현 및 분비 수준을, 래트 a-마우스 GM-CSF 포획 Ab(MAB415) 및 염소 a-마우스 GM-CSF 비오티닐화 검출 Ab(BAM215)를 사용하여 ELISA에 의해 나타내었다.
도 8 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
DNA 플라스미드 VB4170로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액에서 검출된 상기 DNA 플라스키드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 CCL5의 단백질 발현 및 분비 수준을, 래트 a-마우스 CCL5 포획 Ab(MAB4781) 및 염소 a-마우스 CCL5 비오티닐화 검출 Ab(BAF478)를 사용한 ELISA에 의해 나타내었다.
도 9 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 T 세포로부터의 IFN-γ 분비(총 T 세포 반응)를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169를 투여한 마우스에서 이들 DNA 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 10 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 T 세포로부터의 TNF-α 분비(총 T 세포 반응)를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169를 투여한 마우스에서 이들 DNA 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 11 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 T 세포로부터의 IFN-γ + TNF-α 공동분비(총 T 세포 반응)를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169가 투여된 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 12 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 CD8+ T 세포(CD4+ T 세포 고갈 샘플)로부터 IFN-γ 분비를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169가 투여된 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 13 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 CD8+ T 세포(CD4+ T 세포 고갈 샘플)로부터의 TNF-α 분비를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169를 투여한 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 14 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 CD8+ T 세포(CD4+ T 세포 고갈 샘플)로부터의 IFN-γ + TNF-α 분비를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169를 투여한 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 15 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
마우스 α-인간 IgG CH3 도메인 포획 Ab(MCA878G) 및 α-인간 MIP-1α 비오티닐화된 포획 Ab(BAF270)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB4202로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준. Lipo(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 16 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
래트 a-마우스 GM-CSF 포획 Ab(MAB415) 및 염소 a-마우스 GM-CSF 비오티닐화 검출 Ab(BAM215)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB4202로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:1000 희석)에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF의 단백질 발현 및 분비 수준.
도 17 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여 T 세포로부터의 IFN-γ 분비(총 T 세포 반응)를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB4194 및 VB4202를 투여한 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
도 18 DNA 플라스미드의 면역원성
DNA 플라스미드 VB1026, VB4194 및 VB4202가 투여된 마우스의 단일 세포 수준에서 수지상 세포(DC) 반응을 평가하는 데 사용된 유세포 계측법 평가를 보여준다. 이 도면은 DC를 정의하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여준다. A. 모든 유체 불일치를 배제하기 위해 시간 매개변수를 사용하여 모든 이벤트를 검사하였다. B. 이중선을 추가로 제외하기 위해 측면 산란(SSC) 높이 및 면적 매개변수를 사용하였다. C. 이중선을 제외하기 위해 전방 산란(FSC) 높이 및 면적 매개변수를 사용하였다. D. 죽은 세포, 호중구 및 T 세포를 제외하고 CD45+ 면역 세포를 추가 분석에 사용하였다. E. MHCII 발현 세포를 게이팅하고 추가 분석에 사용하였다. F. B 세포 및 형질세포양(p)DC는 분석에서 제외되었다. G. DC는 CD24+로 정의되었다. H. 모든 DC는 CD11b 및 CD64 발현을 기반으로 단핵구 유래 (mo)DC와 고전적 (c)DC로 구분하였다. I. 고전적 DC는 XCR1 및 CD172a 마커의 발현을 기반으로 cDC1 및 cDC2로 구분하였다.
도 19 DNA 플라스미드의 면역원성
DNA 플라스미드 VB4194(비교) VB1026(음성 대조군)과 비교하여 DNA 플라스미드 VB4202를 근육내 투여한 후 제1, 2, 4일에 투여 부위에서 살아있는 CD45+ 세포의 비율을 보여준다. No EP No vacc은 플라스미드를 투여하지 않고 전기천공 처리를 수행하지 않은 마우스 그룹의 결과를 나타낸다.
도 20 DNA 플라스미드의 면역원성
DNA 플라스미드 VB4194(비교) VB1026(음성 대조군)과 비교하여 DNA 플라스미드 VB4202를 근육내 투여한 후 제1, 2, 4일에 투여 부위에서 살아있는 CD45+ 세포의 DC 비율을 보여준다. No EP No vacc은 플라스미드를 투여하지 않고 전기천공 처리를 수행하지 않은 마우스 그룹의 결과를 나타낸다.
도 21 DNA 플라스미드의 면역원성
DNA 플라스미드 VB4194(비교) VB1026(음성 대조군)과 비교하여 DNA 플라스미드 VB4202를 근육내 투여한 후 제1, 2, 4일에 투여 부위에서 살아있는 CD45+ 세포 중 cDC1 세포의 비율을 보여준다. EP No vacc은 플라스미드를 투여하지 않고 전기천공 처리를 수행하지 않은 마우스 그룹의 결과를 나타낸다.
도 22 DNA 플라스미드의 면역원성
DNA 플라스미드 VB4194(비교) VB1026(음성 대조군)과 비교하여 DNA 플라스미드 VB4202를 근육내 투여한 후 제1, 2, 4일에 투여 부위에서 살아있는 CD45+ 세포 중 moDC 세포의 비율을 보여준다. EP No vacc은 플라스미드를 투여하지 않고 전기천공 처리를 수행하지 않은 마우스 그룹의 결과를 나타낸다.
도 23 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
마우스 α-인간 IgG CH3 도메인 포획 Ab(MCA878G) 및 α-인간 MIP-1α 비오티닐화된 포획 Ab(BAF270)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드VB1020, VB4195 및 VB4196로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준. 리포펙타민(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 24 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
마우스 α-인간 FLT3L 포획 Ab(MAB608) 및 마우스 α-인간 FLT3L 비오티닐화된 검출 Ab(BAF308)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB4195 및 VB4196로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:500 희석)에서 검출된 상기 DNA 플라스미드들에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 FLT3L의 단백질 발현 및 분비 수준. 리포펙타민(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리한 세포), 리포펙타민으로만 처리한 세포의 상등액은 ELISA를 위해 희석되지 않았다.
도 25 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
래트 a-마우스 GM-CSF 포획 Ab(MAB415) 및 염소 a-마우스 GM-CSF 바이오틴 화 검출 Ab(BAM215)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB4196로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:500 희석)에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF의 단백질 발현 및 분비 수준. 리포펙타민(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리한 세포), 리포펙타민으로만 처리한 세포의 상등액은 ELISA를 위해 희석되지 않았다.
도 26 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 무손상(intact) 단백질의 발현 및 분비
DNA 플라스미드 VB1020, VB4195 및 VB4196으로 형질감염된 Expi293F 세포의 비환원(왼쪽) 및 환원(오른쪽) 상등액 샘플의 웨스턴 블롯. 1차 항체: 염소 a-인간 MIP-1α(BAF270). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 550(SA5-10087). Chemidoc 채널 Dylight 550 및 650(단백질 표준용). 검은색 레인에는 본원 프로그램과 관련이 없는 샘플이 포함되어 있다.
도 27 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 무손상 단백질의 발현 및 분비
DNA 플라스미드 VB1020, VB4195 및 VB4196으로 형질감염된 Expi293F 세포의 환원된 상등액 샘플(레인 1-4) 및 탈글리코실화된 상등액 샘플(레인 5-6)의 웨스턴 블롯. 왼쪽: 1차 항체 염소 α-인간 FLT3L(BAF308). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 550(SA5-10087). 오른쪽: 1차 항체 염소 a-마우스 GM-CSF(BAF415). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 550(SA5-10087). Chemidoc 채널 Dylight 550 및 650(단백질 표준용). 검은색 레인에는 본원 프로그램과 관련이 없는 샘플이 포함되어 있다.
도 28 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
마우스 α-인간 IgG CH3 도메인 포획 Ab(MCA878G) 및 α-인간 MIP-1α 비오티닐화된 포획 Ab(BAF270)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB1020 및 VB4204로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:10 희석)에서 검출된 이들 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준. Lipo(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 29 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
래트 a-마우스 GM-CSF 포획 Ab(MAB415) 및 염소 a-마우스 GM-CSF 비오티닐화 검출 Ab(BAM215)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB4204로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:1000 희석)에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF의 단백질 발현 및 분비 수준 Lipo(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 30 DNA 플라스미드의 면역원성
플라스미드 VB1020 및 VB4204를 투여한 마우스에서 이들 DNA 플라스미드의 면역원성 및 공동투여된 DNA 플라스미드 VB1020 및 pGM-CSF의 면역원성을, T 세포로부터의 IFN-γ 분비(총 T 세포 반응)를 측정하는 방식으로 음성 대조군 VB1026과 비교하여 나타내었다.
도 31 DNA 플라스미드의 면역원성
DNA 플라스미드 VB1020 및 VB4204가 투여된 마우스의 비장 세포에서 IFN-γ, TNF-α를 분비하거나 TNF-α 및 IFN-γ를 공동 분비하는 CD8+ T 세포의 백분율을 음성 대조군 VB1026과 비교하여 나타내었다.
도 32 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
마우스 α-인간 IgG CH3 도메인 포획 Ab(MCA878G) 및 α-인간 MIP-1α 비오티닐화된 포획 Ab(BAF270)를 사용하여 ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB1020 및 VB4205로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:10 희석)에서 검출된 이들 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준. Lipo(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 33 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
래트 a-마우스 CCL5 포획 Ab(MAB4781) 및 염소 a-마우스 CCL5 비오티닐화 검출 Ab(BAF478)를 사용하여, ELISA에 의해 나타낸, DNA 플라스미드 VB4205로 형질감염된 HEK293 세포의 상등액(1:500 희석)에서 검출된 상기 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 CCL5의 단백질 발현 및 분비 수준. Lipo(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 리포펙타민으로만 처리된 세포).
도 34 DNA 플라스미드의 면역원성
T 세포로부터의 IFN-γ 분비(총 T 세포 반응)를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB1020 및 VB4205 를 투여한 마우스에서 이들 DNA 플라스미드의 면역원성을, 음성 대조군 VB1026과 비교하여 나타내었다.
도 35 DNA 플라스미드의 면역원성
제0일에 1x105 CT26 종양 세포를 접종한 후 제4일과 제11일에 DNA 플라스미드 VB4194, VB4208, VB4202 및 pGM-CSF + VB4194(공동주입)를 투여한 BALB/c 마우스(n=8/그룹)에서 CT26 종양 성장을 음성 대조군 VB1026과 비교하여 나타내었다.
도 36 DNA 플라스미드의 면역원성
제0일에 1x105 CT26 종양 세포를 접종한 후 제4일과 제11일에 DNA 플라스미드 VB4194, VB4208, VB4202 및 pGM-CSF + VB4194(공동주입)를 투여한 BALB/c 마우스(n=8/그룹)의 생존 확률을 VB1026과 비교하여 나타내었다.
도 37 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
DNA 플라스미드 VB2060, TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에서 검출된 이들 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 분비를 ELISA에 의해 나타내었다. 상등액을 1:1500으로 희석하고 마우스 α-인간 IgG CH3 도메인 포획 Ab(MCA878G) 및 α-인간 MIP-1α 비오티닐화된 포획 Ab(BAF270)를 사용하여 ELISA를 수행하였다. Expifect(= 음성 대조군 역할을 하는 형질감염제 엑스피펙타민으로만 처리된 세포).
도 38 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 수준
DNA 플라스미드 TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023에 의해 각각 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF(38a: 포획 Ab MAB608, 검출 Ab BAF308), IL-12(38b: 포획 Ab MAB419, 검출 Ab BAF419) 및 IL-21(38c: Ab 포획 Ab)의 단백질 발현 및 분비 수준을, ELISA에 의해 상기 DNA 플라스미드로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에서 검출하여 나타내었다.
도 39 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 무손상 단백질의 발현 및 분비
웨스턴 블롯은 제1 폴리펩티드의 분비를 보여준다. 형질감염 대조군, VB2060, TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023에서 환원된 상등액 샘플. 1차 항체: 염소 항-인간 MIP-1α(AF270). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 800(SA5-10092). Chemidoc 채널 Dylight 800 및 650(단백질 표준용).
도 40 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 무손상 단백질의 발현 및 분비
웨스턴 블롯은 TECH001-CV021에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF의 분비를 보여준다. 형질감염 대조군 VB2060 및 TECH001-CV021에서 상등액 샘플을 환원시켰다. 1차 항체: 염소 항-마우스 GM-CSF(BAF415). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 800(SA5-10092). Chemidoc 채널 Dylight 800 및 650(단백질 표준용).
도 41 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 무손상 단백질의 발현 및 분비
웨스턴 블롯은 TECH001-CV022에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 IL-12의 분비를 보여준다. 형질감염 대조군 VB2060 및 TECH001-CV022의 환원된 상등액 샘플(왼쪽 패널) 및 환원되지 않은 상등액 샘플(오른쪽 패널). 1차 항체: 염소 항-마우스 IL-12(BAF419). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 800(SA5-10092). Chemidoc 채널 Dylight 800 및 650(단백질 표준용).
도 42 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 무손상 단백질의 발현 및 분비
웨스턴 블롯은 TECH001-CV023에 의해 인코딩된 면역자극 화합물 IL-21의 분비를 보여준다. 형질감염 대조군 VB2060 및 TECH001-CV023에서 상등액 샘플을 환원시켰다. 1차 항체: 염소 항-마우스 IL-12(BAF594). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 800(SA5-10092). Chemidoc 채널 Dylight 800 및 650(단백질 표준용).
도 43 DNA 플라스미드의 면역원성
음성 대조군 VB1026과 비교하여, RBD 단백질과 결합하는 총 IgG 항체를 측정함으로써 DNA 플라스미드 VB2060, TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023가 투여된 마우스에서의 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다. 개별 마우스 및 평균±SEM이 표시된다(그룹당 5마리 마우스). *(p<0.05), **(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 검정.
도 44 DNA 플라스미드의 면역원성
A) 음성 대조군 VB2060과 비교하여, T 세포로부터의 IFN-γ 분비(총 T 세포 반응)를 측정함으로써 DNA 플라스미드 TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023가 투여된 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다. B) 음성 대조군 VB2060과 비교하여, CD8+ T 세포(CD4+ T 세포 고갈 샘플)로부터 IFN-γ 분비를 측정하는 방식으로 DNA 플라스미드 VB2060, TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023가 투여된 마우스에서 이들 플라스미드의 면역원성을 보여준다.
제1 폴리펩티드 및/또는 다량체 단백질은 본원에서 "작제물(construct)"로도 지칭될 것이다. 본원에 기술된 제1 폴리펩티드/다량체 단백질은 일반적으로 면역원성 작제물이다.
"면역원성 작제물"은 특히 투여에 적합한 형태 및 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양(즉, 면역학적 유효량)으로 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유발하는 것이다.
"대상체"은 동물, 예를 들어 마우스 또는 인간, 좋기로는 인간이다. 용어 "마우스", "래트" 및 "m"은 마우스를 나타내거나 마우스를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 인간 및 "h"라는 용어는 인간을 나타내거나 인간을 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 대상체는 환자, 즉 치료가 필요한 질병을 앓고 있는 인간일 수 있거나 예방적 치료가 필요한 대상체, 예를 들어 감염성 질환에 감염된 대상체, 또는 질병에 걸린 것으로 의심되는 대상체일 수 있다. "대상체"와 "개체"라는 용어는 본원에서 호환적으로 사용된다.
"질병"은 일반적으로 질병에 의해 영향을 받는 대상의 특정 징후 및 증상과 관련된 비정상적인 의학적 상태이다.
"전염병"은 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 기생충을 포함한 하나 이상의 병원체에 의해 발생하는 질병이다.
"암"은 신체 내 비정상 세포의 통제되지 않는 성장을 특징으로 하는 다양한 질병의 광범위한 그룹을 의미한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함하며, 본원에 사용된 바와 같이 고형 종양뿐만 아니라 혈액과 같은 체액에서 발견되는 종양 세포를 모두 포함하며, 전이성 암을 포함한다. 조절되지 않은 세포 분열과 성장은 주변 조직을 침범할 수 있고 림프계나 혈류를 통해 신체의 먼 부위로 전이될 수도 있는 악성 종양을 형성한다. 전이 후, 원위 종양은 전이 전 종양 "으로부터 유래"되었다고 말할 수 있다.
"치료"는 예방적 치료 또는 치료적 치료이다.
"예방적 치료"는 질병의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 아직 나타내지 않거나 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료로, 치료는 질병 및/또는 질병과 관련된 증상이 발생할 위험을 예방 또는 감소시킬 목적으로 투여된다. 예방적 치료는 질병에 대한 예방적 치료로서, 또는 질병 및/또는 그와 관련된 증상의 추가 발달 또는 강화를 억제하거나 감소시키는 치료로서 기능한다. 예방적 치료, 예방 및 예방이라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.
"치료적 치료"는 질병의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료법으로서, 이러한 징후 또는 증상을 감소 또는 제거할 목적으로 또는 질병 진행을 지연 또는 중단시킬 목적으로 대상체에게 투여되는 치료법이다.
본 명세서에 사용된 "T 세포 에피토프"는 별개의 단일 T 세포 에피토프 또는 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 다수의 최소 T 세포 에피토프, 예를 들어 핫스팟을 함유하는 항원의 일부 또는 영역을 의미한다.
"뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드로 구성된 서열이다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 본원에서 호환적으로 사용된다.
하나 이상의 면역자극 화합물은 제1 폴리펩티드/다량체 단백질의 효과를 향상시킨다. 본 발명의 이점은 단일 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드로부터 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 공동발현함으로써 이러한 단일 벡터만이 대상체에게 투여되면 된다는 점이다. 따라서, 제1 폴리펩티드/다량체 단백질의 효과를 높이기 위해 면역자극 화합물을 인코딩하는 추가적인 벡터를 생산하여 투여하거나, 이러한 화합물을 단백질이나 펩티드 형태로 병용투여할 필요가 없으므로 생산 비용을 절감하고 약물의 효율화를 도모할 수 있다. 단일 의약품의 투여는 또한 환자의 치료 수용도를 높이는 데 기여할 수 있으며 의약품 취급(예컨대 재조성 및 환자에의 투여)을 의료 전문가가 더 쉽게 할 수 있다.
또한, 이론에 얽매이지 않고, 공동발현은 세포 수준에서도 현저한 이점을 가질 수 있다. 벡터로 형질감염할 때 벡터는 다양한 세포에 닿게 된다. 성공적인 흡수와 전사 및 번역의 기능적 개시는 어느 정도 무작위 과정이다. 두 개의 서로 다른 벡터로 형질감염할 때, 이들 벡터에 의해 인코딩된 단백질이 어느 세포에서 발현될지는 제어할 수 없다. 단백질을 혈류로 분비하는 것을 목표로 하는 형질감염의 경우 이러한 공간 분포는 문제가 되지 않다. 본 발명에서, 본 발명의 벡터는 다양한 단백질을 생산한다. 작제물을 인코딩하는 벡터가 근육내로 투여되면 작제물은 근육 세포에서 분비되어 이웃 항원-제시 세포로 전달된다. 면역자극 화합물은 동일한 근육 세포에서 발현되고 분비되므로, 동일한 항원-제시 세포를 자극하여 상기 항원-제시 세포에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 항원-제시 세포가 수지상 세포인 경우, 면역자극 화합물은 수지상 세포의 유인, 활성화 및 성숙을 촉진할 수 있다.
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 본원에 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
벡터
본 발명의 벡터는 DNA 또는 RNA와 같은 외래 핵산 서열을, 이들이 발현될 수 있는 세포 내로 운반하는데 적합한 임의의 분자, 즉 발현 벡터일 수 있다.
일 구현예에서, 벡터는 DNA 플라스미드와 같은 DNA 벡터 또는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 거대세포바이러스 및 센다이 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 바이러스 벡터와 같은 DNA 바이러스 벡터이다.
다른 구현예에서, 벡터는 RNA 플라스미드와 같은 RNA 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 α바이러스, 렌티바이러스, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 및 랍도바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 레트로바이러스 벡터와 같은 RNA 바이러스 벡터이다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 DNA 벡터, 더욱 좋기로는 DNA 플라스미드이다.
DNA 플라스미드
플라스미드는 염색체 DNA와 물리적으로 분리되어 있고 독립적으로 복제할 수 있는 세포 내의 작은 염색체외 DNA 분자이다. 플라스미드는 대부분 박테리아에서 작은 원형의 이중 가닥 DNA 분자로 발견된다. 그러나 플라스미드는 때때로 고세균(archaea)과 진핵생물에 존재한다. 인공 플라스미드는 분자 복제에서 벡터로 널리 사용되며, 숙주 유기체 내에서 재조합 DNA 서열의 높은 발현을 전달하고 보장하는 역할을 한다. 플라스미드는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택을 위한 특징, 예를 들어 항생제 내성을 위한 유전자, 복제 기점, 다수의 클로닝 부위(MCS) 및 삽입된 유전자(들)의 발현을 구동하기 위한 프로모터를 비롯한, 몇 가지 중요한 특징을 갖는다.
일반적으로 프로모터는 개시 인자와 중합효소를 프로모터로 끌어당겨 유전자가 전사되도록 하는 서열이다. 프로모터는 DNA 상류의 유전자 전사 시작 부위 근처에 위치한다. 프로모터의 길이는 약 100~1000개 염기쌍일 수 있다. 프로모터의 성질은 일반적으로 전사의 유전자와 산물, 그리고 해당 부위에 모집된 RNA 중합효소의 종류나 종류에 따라 달라진다. RNA 중합효소가 플라스미드의 DNA를 읽으면 RNA 분자가 전사된다. 처리 후 mRNA는 여러 번 번역될 수 있으므로 리보솜이 mRNA를 단백질로 번역할 때 관심 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 많은 복사본이 생성된다. 일반적으로, 리보솜은 상보적인 tRNA 안티코돈 서열이 mRNA 코돈에 결합하도록 유도하여 해독을 촉진한다. tRNA는 mRNA가 통과하여 리보솜에 의해 "읽혀질" 때 함께 사슬로 연결된 특정 아미노산을 운반하여 폴리펩티드를 만든다. 번역은 시작, 연장, 종료의 세 단계로 진행된다. 번역 과정에 따라 폴리펩티드는 활성 단백질로 접혀 세포 내에서 기능을 수행하거나 세포에서 내보내져 다른 곳에서 기능을 수행한다. 때로는 상당한 수의 번역 후 변형이 수행된다.
단백질이 세포 밖으로 내보내질 예정인 경우, 신호 펩티드는 단백질을 소포체로 안내하며, 여기서 신호 펩티드는 절단되고 단백질은 번역이 종료된 후 세포 주변으로 전달된다.
본 발명의 DNA 플라스미드는 임의의 특정 플라스미드로 제한되지 않으며, 당업자는 적합한 백본을 갖는 임의의 플라스미드가 본 개시내용의 요소 및 유닛을 포함하도록 당업계에 공지된 방법에 의해 선택 및 조작될 수 있음을 이해할 것이다.
공동발현(Co-expression)
본 개시내용의 벡터는 여러 단백질을 공동발현한다. 이러한 벡터(및 플라스미드)는 멀티시스트론 또는 폴리시스트론 벡터(및 멀티시스트론 또는 폴리시스트론 플라스미드)라고도 한다. 당업자는 이들 여러 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하도록 벡터를 조작하는 방법을 알고 있으며, 이들 단백질이 별도의 단백질로서 하나의 벡터로부터 공동발현되도록 보장하기 위해 다양한 수단을 선택하고 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용할 수 있다.
따라서, 당업자는 다양한 단백질, 즉 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 공동발현하는 본 발명의 벡터를 구성할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 공동발현 요소, 즉 동일한 벡터로부터의 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물의 공동발현을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 공동발현 요소(또는 1개 초과의 공동발현 요소)를 포함하는데, 이로 인해 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물이 단일 전사체 상에서 전사되지만, 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물로 독립적으로 번역되게 된다. 따라서 공동발현 요소가 존재하면 최종적으로 별도의 번역 결과물이 생산된다.
IRES
본 개시내용의 일 구현예에서, 공동발현 요소는 IRES 요소이고, 그 개념은 도 1에 예시되어 있다. IRES로 약칭되는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site)는 더 큰 단백질 합성 과정의 일부로서, 캡-독립적인 방식으로, 번역 개시를 가능하게 하는 RNA 요소이다. 진핵생물 번역에서는 개시 복합체의 조립을 위해 5' 캡 인식이 필요하기 때문에 개시는 일반적으로 mRNA 분자의 5' 말단에서 일어난다. 두 코딩 영역 사이에 IRES 요소를 배치하면 개시 복합체가 이 사이트에서 조립될 수 있으며 하류 코딩 영역의 번역이 가능해진다. 따라서, 본 개시내용의 구현예에서, 벡터는 IRES를 포함하고 하나의 전사체가 벡터로부터 생성되고, 이는 후속적으로 별도의 단백질로 번역된다.
IRES 요소는 동일한 프로모터의 제어 하에 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물의 공동발현을 허용한다. 프로모터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 인코딩 영역을 함유하는 단일 mRNA의 전사를 지시한다. 2 이상의 면역자극 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우에는, IRES 요소가 면역자극 화합물을 인코딩하는 각 핵산 서열의 상류에 있는 본 발명의 벡터에 존재할 필요가 있다. 대안적으로, 2 이상의 면역자극 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우 다른 유형의 공동발현 요소가 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터에 사용하기 위한 IRES 요소는 바이러스 게놈 또는 세포 mRNA로부터 유래될 수 있다. DNA 플라스미드와 같은 IRES 요소를 포함하는 벡터는 상업적으로 이용 가능하다.
2A 자가 절단 펩티드
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 공동발현 요소는 2A 자가 절단 펩티드(2A self-cleaving peptide: 또는 줄여서 "2A 펩티드")를 인코딩하는 핵산 서열이며, 그 개념은 도 2에 예시되어 있다.
본 출원의 맥락에서, 용어 "2A 자가 절단 펩티드" 및 "2A 펩티드"는 두 코딩 영역 사이에 위치할 때 두 코딩 영역의 전사를 단일 전사체로서 일으키지만, 두 개의 개별 펩티드 사슬로 번역되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 펩티드에 대해 사용된다. 일반적으로 리보솜이 mRNA를 번역할 때 아미노산은 N-말단에서 C-말단 방식으로 공유 결합된다. 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 존재하면 리보솜이 2A 펩티드의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 건너뛰기 때문에 두 개의 별도 펩티드 사슬이 생성된다. 2A 자가 절단 펩티드는 일반적으로 길이가 18-22개 아미노산이고 컨센서스 서열 DXEXNPGP(SEQ ID NO: 50)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 리보솜은 2A 자가 절단 펩티드의 C-말단에서 발견되는 프롤린 잔기와 글리신 사이의 펩티드 결합을 건너뛰는데, 이는 상류 유전자 산물이 말단에 몇 개의 추가적인 아미노산 잔기를 가질 것인 반면, 하류 유전자 산물은 프롤린으로 시작될 것임을 의미한다.
일 구현예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 컨센서스 서열 DXEXNPGP(SEQ ID NO: 50)를 포함하는 18-22개 아미노산 길이의 서열이고, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
따라서, 2A 자가 절단 펩티드도 동일한 프로모터의 제어 하에 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물의 공동발현을 허용한다. IRES 요소와 마찬가지로, 2 이상의 면역자극 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 벡터에서 면역자극 화합물을 인코딩하는 각 핵산 서열의 상류에 존재할 필요가 있다. 예컨대, 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 제1 면역자극 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 서열 및 제2 면역자극 화합물을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함한다. 벡터는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 T2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이에 P2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 2 이상의 면역자극 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우 다른 유형의 공동발현 요소가 사용될 수 있다.
추가 구현예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드 및 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2A-펩티드이다.
일 구현예에서, T2A 펩티드는 표 1 또는 2에 열거된 T2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 아미노산 서열 DVEENPGP(SEQ ID NO: 50)가 존재하지만 T2A 아미노산 서열의 나머지 부분은 표 1의 T2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, T2A 펩티드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, P2A 펩티드는 표 1 또는 2에 나열된 P2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 서열 DVEENPGP(SEQ ID NO: 50)가 존재하지만 P2A 아미노산 서열의 나머지 부분은 표 1의 P2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, P2A 펩티드는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, E2A 펩티드는 표 1 또는 2에 나열된 E2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 서열 DVESNPGP(SEQ ID NO: 173)가 존재하지만 E2A 아미노산 서열의 나머지 부분은 표 1의 E2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을갖는다. 다른 구현예에서, E2A 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, F2A 펩티드는 표 1 또는 2에 열거된 F2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 서열 DVESNPGP(SEQ ID NO: 173)가 존재하지만 F2A 아미노산의 나머지 부분은 표 1의 F2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, F2A 펩티드는 SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어 표 2에 나타낸 바와 같이 야생형 서열의 N-말단 앞에 GSG 서열을 삽입함으로써 2A-펩티드의 효율을 조절하여 절단 및 발현 효율을 증가시킬 수 있다는 것이 일반적으로 알려져 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 IRES 요소 및 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 모두 함유한다. 예를 들어, 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산, 제1 면역자극 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 및 제2 면역자극 화합물을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함한다. 벡터는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 IRES 요소를, 그리고 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이에 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 제1 핵산과 제2 핵산 사이에 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을, 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이에 IRES 요소를 포함할 수 있다. 추가 면역자극 화합물을 인코딩하는 추가 핵산 서열이 동일한 방식으로 벡터에 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 2개의 2A 펩티드로 구성된 연속 서열로서 2개의 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 일례로서, 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 면역자극 화합물을 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 벡터는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 연속 서열로서 2개의 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
양방향 프로모터
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물이 별도의 전사체로서 전사되어 별도의 전사 산물 및 따라서 별도의 단백질을 초래하는 공동발현 요소(또는 2 이상의 공동발현 요소)를 포함한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 공동발현 요소는 양방향 프로모터이고, 그 개념은 도 3a에 예시되어 있다. 양방향 프로모터는 일반적으로 양방향 유전자 쌍에서 유전자의 5' 말단 사이에 있는 DNA의 짧은(예컨대 <1 kbp) 유전자간 영역이다. "양방향 유전자 쌍"은 각각의 5' 말단이 서로를 향하고 있는 반대 가닥에 코딩된 두 개의 인접한 유전자를 의미한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 양방향 프로모터는 4개의 CMV 인핸서를 갖는 CAG 프로모터의 백-투-백 배열이다(Sladitschek HL, Neveu PA et al., PLoS One 11(5), e0155177, 2016).
본 개시내용의 일 구현예에서, 양방향 프로모터는 RPBSA이다(Kevin He et al., Int. J. Mol. Sci. 21(23), 9256, 2020).
본 개시내용의 일 구현예에서, 양방향 프로모터는 마우스 Pgk1 및 인간 진핵 번역 신장 인자 1 α 1 프로모터의 백-투-백 구성이다(Golding & Mann, Gene Therapy 18, 817-826, 2011).
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 5' 말단 사이에 양방향 프로모터를 포함하는 양방향 유전자 쌍으로서 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 면역자극 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 플라스미드이다.
다수의 프로모터
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 공동발현 요소는 다양한 프로모터이다. 즉, 벡터는 예를 들어, 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 각각의 핵산 서열에 대해 별도의 프로모터를 포함하는, 즉 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물 각각의 별도 전사를 위한, 플라스미드이다.
일 구현예에서, 상기 핵산 서열 각각은 상이한 프로모터를 가질 것이며, 그 개념은 도 3b에도 예시되어 있다. 일 구현예에서, 모든 핵산 서열은 등분자 발현을 목표로 하는 동일한 프로모터를 갖는다. 대안적인 구현예에서, 하나의 핵산 서열은 다른 것(들)보다 더 강한 프로모터를 갖고; 즉, 더 강한 프로모터를 갖는 핵산 서열이 다른 것(들)보다 더 높은 수준으로 발현될 가능성이 높다.
수많은 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며 본 발명의 플라스미드에 포함시키기에 적합하다. 본 개시내용의 일 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터와 같은 거대세포바이러스로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 공동발현 요소, 좋기로는 IRES 요소, 2A 펩티드, 양방향 프로모터 및 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동발현 요소를 포함한다.
본 발명의 벡터는 공동발현 요소의 모든 종류의 조합을 포함할 수 있다.
일례로서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 제1 면역자극 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 서열 및 제2 면역자극 화합물을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드이다. 일 구현예에서, DNA 플라스미드는 제1 폴리펩티드(프로모터의 제어 하에)와 제1 및 제2 면역자극 화합물의 공동발현을 허용하는 2A 펩티드 및 IRES를 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 플라스미드는 양방향 프로모터 및 또 다른 프로모터를 포함한다.
당업자는 위의 예에서와 같은 용어 제1, 제2 및 제3 핵산 서열이 본 발명의 플라스미드가 제1, 제2 및 제3 핵산 서열의 순서로 핵산 서열을 포함한다는 것을 의미하지 않는다는 것을 알 것이다. 제2 핵산 서열은 제1 또는 제3 핵산 서열의 하류 또는 상류에 있을 수 있고, 제3 핵산 서열은 제1 또는 제2 핵산 서열의 하류 또는 상류에 있을 수 있으며, 제1 핵산 서열은 제 또는 제3 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 제1 및 제3 또는 제2 및 제3 핵산 서열과 마찬가지로 동일한 DNA 가닥에서 반대 방향일 수 있다. 추가 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산 서열은 반대편 DNA 가닥 상에 있을 수 있다.
면역자극 화합물
본 발명의 벡터는 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 항원-제시 세포에 영향을 미치는 화합물이다. 또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 항원-제시 세포를 자극하는 화합물이다.
항원-제시 세포(APC)는 주조직적합성 복합체(MHC)와 복합체를 이루는 항원을 표면에 표시하는 세포이다: 이 과정은 항원 제시로 알려져 있다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 처리하여 T 세포에 제시한다.
거의 모든 세포 유형은 어떤 방식으로든 항원을 제시할 수 있다. 랑게르한스 세포, B 세포 및 수지상 세포와 같은 대식세포를 포함한 전문 APC는 MHC 클래스 II를 통해 헬퍼 T 세포(CD4+)에 외래 항원을 제시하는 반면, 바이러스에 감염된 세포(또는 암세포)는 MHC 클래스 I을 통해 세포 내부에서 유래된 항원을 세포독성 T 세포(CD8+)로 제시할 수 있다. MHC 단백질 계열 외에도 항원 제시는 APC와 T 세포 표면의 다른 특수 신호 분자에 의존한다.
"MHC"는 "주요 조직 적합성 복합체"를 의미한다. MHC 분자에는 MHC 클래스 I과 MHC 클래스 II의 두 가지 기본 클래스가 있다. MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II라는 용어는 본 명세서에서 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II와 호환적으로 사용된다. HLA(인간 백혈구 항원)는 인간의 주요 조직적합성 복합체이다.
APC는 효과적인 적응 면역 반응에 필수적인데, 이는 세포독성 T 세포와 헬퍼 T 세포의 기능이 모두 APC에 의존하기 때문이다. 항원 제시는 적응 면역의 특이성을 허용하고 세포내 및 세포외 병원체 모두에 대한 면역 반응에 기여할 수 있다. 이것은 또한 종양에 대한 방어에도 관여한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, APC는 수지상 세포, 대식세포, 랑게르한스 세포, B 세포 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되고, 면역자극 화합물은 이러한 세포에 영향을 미치는, 예를 들어 이러한 세포를 자극하는 화합물이다.
APC가 영향을 받는 경우, 예컨대 자극을 받는 경우, 자극은 APC의 유인, 활성화, 성숙 및/또는 증식을 초래할 수 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 유인 및/또는 활성화 및/또는 성숙 및/또는 증식을 촉진하고, 예를 들어 항원-제시 세포의 성장 및/또는 확장을 촉진한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원에 결합하는 리간드 또는 패턴 인식 수용체(PRR)에 결합하는 리간드를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 예를 들어 DNA 플라스미드이다. 이는 이를 필요로 하는 대상체에게, 예를 들어 근육내 투여에 의해 투여될 수 있으며, 인코딩된 화합물은 근육 세포에서 발현되고 분비된다. (이량체 단백질과 같은 다량체 단백질의 형태로 분비되는) 제1 폴리펩티드의 효능은 APC를 다량체 단백질과 면역자극물질이 분비되는 주사 부위/근육 세포로 APC를 유인하는 면역자극 화합물의 공동발현에 의해 강화될 수 있다. APC의 유인은 더 강력하고 가속화된 면역 반응을 초래할 수 있다: 다량체 단백질은 APC에 전달되어 APC에 의해 흡수되고 혈류에서 희석되지 않으며 다량체 단백질에 포함된 하나 이상의 항원을 다른 관련 면역 세포에 제시할 수 있는 APC의 수가 국부적으로 더 많다.
APC의 유인을 촉진하는 면역자극 화합물
따라서, 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 APC의 유인을 촉진하는 것이다.
APC 유인은 시험관내 트랜스-웰 검정 또는 이동 검정을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해, 유세포 계측법법 또는 유전자의 변화에 의해 본 발명의 벡터가 투여되는 근육 세포의 생체내 표면 마커를 측정함으로써 또는 예를 들어 RT-qPCR, Nanostring 또는 RNA 시퀀싱에 의해, 유전자 발현 패턴의 변화를 측정함으로써 측정가능하다.
APC를 유인할 수 있는 분자의 한 유형은 케모카인이다. 케모카인은 세포에서 분비되는 작은 사이토카인, 즉 신호 단백질 계열이다. 이들의 이름은 인근 반응 세포에서 방향성 화학주성을 유도하는 능력에서 유래된 것으로, 즉 이들은 화학주성 사이토카인이다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 케모카인이다.
또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 APC 상의 다음 표면 분자와 상호작용할 수 있다: CCR1(CC 모티프 케모카인 수용체 1), CCR3(CC 모티프 케모카인 수용체 3), CCR4(CC 모티프 케모카인 수용체 4), CCR5(CC 모티프 케모카인 수용체 5), CCR6(CC 모티프 케모카인 수용체 6), CCR 7(C 모티프 케모카인 수용체 7), CCR8(CC 모티프 케모카인 수용체 8) 또는 XCR1(XC 모티프 케모카인 수용체 1). 바람직한 구현예에서, 면역자극 화합물은 인간 APC 상의 전술한 표면 분자와 상호작용할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 마우스 CCL3(또는 MIP-1α) 및 인간 이소형 hCCL3, hCCL3L1, hCCL3L2 및 hCCL3L3, 좋기로는 인간 MIP-1α (hMIP-1α 변이체, LD78β 또는 CCL3L1이라고도 함), RANTES(CCL5), 좋기로는 인간 CCL5, 예컨대 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 갖는 인간 CCL5, 케모카인 리간드 4(CCL4), 좋기로는 인간 CCL4, 케모카인 리간드 20(CCL20), 좋기로는 인간 CCL20, 케모카인 리간드 19(CCL19), 좋기로는 인간 CCL19, 케모카인 리간드 21(CCL21), 좋기로는 인간 CCL21 및 케모카인 모티프 리간드 1 또는 2(XCL1 또는 XCL2), 좋기로는 인간 XCL1 또는 인간 XCL2를 비롯한, 대식세포 염증성 단백질 α 및 그의 이소형으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
활성화 과정은 휴식 중인 APC를 보다 차별화되고 성숙한 상태로 만드는 일련의 이벤트이다. APC는 병원체와 상호작용하거나 외부 항원을 접함으로써 직접적으로 활성화되고, 간접적으로는 그러한 분자를 인식하는 다른 세포 유형에 의해 생성 및 방출되는 화합물(예컨대 염증 매개체)에 의해 활성화된다. 그런 다음 APC는 일련의 세포 과정을 거쳐 활성화되며, 이는 외부 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 유발하는 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 수지상 세포의 성숙은 식세포 능력의 감소, 항원 처리 및 제시의 향상, 림프 조직으로의 이동 개선, B 및 T 세포 자극 능력의 증가를 특징으로 한다.
APC의 활성화 및/또는 성숙을 촉진하는 면역자극 화합물
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 APC의 활성화 및/또는 성숙을 촉진하는 것이다.
APC의 활성화를 측정하기 위해 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용할 수 있으며, 예를 들어 ELISpot 또는 FluoroSpot에 의해 측정된 활성화 전후 사이토카인 프로파일을 비교하고, 유전자 발현의 전반적인 변화를 결정하고, 발현된 단백질(예를 들어 활성화 마커)을 FACS, ELISA, WB 및 PCR/시퀀싱 방법(qPCR(TaqMan 어레이), Nanostring 및 RNA-seq) 등과 같은 다양한 기술로 분석하는 데 사용할 수 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 CD40(분화 클러스터 40), CD137(4-1BB), CD27, RANK 및 ICOS (CD278)을 포함하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 APC 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 인간 APC 상의 전술한 표면 분자와 상호작용할 수 있다.
이러한 면역자극 화합물은 CD40L(CD40 리간드, CD154), CD137L(4-1BBL, 4-1BB 리간드), CD70, ICOSL(CD275) 및 RANKL로 구성된 목록에서 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 면역자극 화합물은 hCD40L, hCD137L, hCD70, hICOSL 및 hRANKL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 IL-2, 좋기로는 인간 IL-2, IL-10, 좋기로는 인간 IL-10, IL-12, 좋기로는 인간 IL-12, 예컨대 SEQ ID NO: 45 및 47의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL-12, IL-21, 좋기로는 인간 IL-21, 예컨대 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL-21, TNFα, 좋기로는 인간 TNF α, IFNγ, 좋기로는 인간 IFNγ 및 IL-1β, 좋기로는 인간 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 그들의 표면에 존재하는 TLR 수용체를 통해 APC를 활성화시키는, MyD88 및 TRIF, 좋기로는 인간 MyD88 및 인간 TRIF와 같은 면역 신호전달 분자이다.
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 예를 들어 RIG-1 및 MDA-5, 좋기로는 인간 RIG-1 및 인간 MDA-5와 같은 바이러스 감염 센서이다.
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 APC 상의 패턴 인식 수용체, 예를 들어 TLR2, TLR4 또는 TLR5를 비롯한 Toll-유사 수용체와 상호작용하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 면역자극 화합물은 앞서 언급한 인간 APC 상의 수용체와 상호작용한다.
일 구현예에서, 이러한 면역자극 화합물은 플라겔린과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), HMGB1과 같은 단백질 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 열충격 단백질(HSP), 칼렉티쿨린 및 아넥신 A1으로 구성된 목록에서 선택된다. 바람직한 구현예에서, 이러한 면역자극 화합물은 인간 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), 인간 단백질 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 예를 들어 인간 HMGB1, 인간 열충격 단백질(HSP), 인간 칼렉티쿨린 및 인간 아넥신 A1으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. PAMP/DAMP에는 본 발명의 벡터에 핵산 서열로 포함될 수 있는 것들이 포함되며, 번역 후 변형에 의해 도입된 작용기를 포함할 수 있는 기능성 단백질로 발현될 것이다. 앞서 언급한 분자는 차례로 APC에서 다음 수용체들을 활성화시킨다: RAGE, TLR4, TLR9 및 TIM-3(HMGB1의 경우), FPR(아넥신 A1의 경우), SREC1, LOX1 및 CD91(HSP의 경우). 바람직한 구현예에서, 면역자극 화합물은 결국 인간 APC 상의 전술한 수용체를 활성화시킨다.
APC의 성장 및/또는 확장을 촉진하는 면역자극 화합물
면역 반응 중에 활성화된 APC는 감염이나 질병과 싸우기 위해 급속히 확장된다. 세포 증식은 세포가 성장하고(질량과 크기가 증가함) 분열하여 두 개의 딸세포를 생성하는 과정이다. 성장인자는 세포 표면의 수용체에 결합하여 세포를 자극하고, 이로 인해 세포가 증식하게 된다. 세포 증식은 세포 수의 기하급수적인 증가로 이어지며, 따라서 세포 집단을 확장하는 급속한 메커니즘이다. 이하에서는 "확장(expansion)"과 "증식(proliferation)"이라는 용어를 같은 의미로 사용한다.
일 구현예에서, 면역자극 화합물은 APC의 성장 및/또는 확장을 촉진하는 것이다.
세포 증식은 당업계에 공지된 다양한 기술, 예를 들어 MTT/MTS 분석, 단백질 번역 측정 또는 CFSE 표지에 의해 측정될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 방법은 예를 들어 세포 증식 상태를 반영하는 세포 집단의 대사 활성을 결정함으로써 수행된다. 또한, 세포 내 ATP 함량은 엄격하게 제어되므로 ATP 검출을 통해 세포 증식에 대한 정보도 제공할 수 있다. 죽은 세포 또는 죽음이 임박한 세포에는 ATP가 거의 포함되어 있지 않으며, 세포 용해물이나 추출물에서 측정된 ATP 농도와 세포 수 사이에는 엄격한 선형 관계가 있다. 생물발광 루시퍼라제와 그 기질인 루시페린을 사용한 ATP 검출은 매우 민감한 결과를 제공할 수 있다. ATP가 존재하면 루시퍼라제가 빛을 방출하며, 발광 강도는 ATP 농도에 비례한다. 또한 일부 항원은 증식하는 세포에만 존재하는 반면, 비증식 세포에는 이러한 항원이 없다. 세포 증식은 특정 모노클로날 항체를 활용하여 감지할 수 있다. 예를 들어, 인간 세포에서 Ki-67 항체는 세포 주기의 모든 활성 단계에서 발현되지만 휴면(정지) 세포에는 없는 동일한 이름의 단백질을 인식한다. 전통적으로, 방사성표지된 3H-티민이 증식의 척도로 사용되어 왔다. 이것은 몇 시간 또는 밤새 세포와 함께 배양된다. 새로 증식된 세포는 방사성 표지를 DNA에 통합하며, 이를 추출 후 섬광 계수기에 의해 검출할 수 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 APC 상의 다음 표면 분자와 상호작용할 수 있다: GM-CSF-수용체(과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체, CD116), FLT-3R(티로신 키나제 3과 같은 fms, CD135)), IL-15R 또는 IL-4R. 바람직한 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 인간 APC 상의 전술한 표면 분자와 상호작용한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역자극 화합물은 성장 인자, 예컨대 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니-자극 인자), 좋기로는 SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 갖는 인간 GM-CSF와 같은 인간 GM-CSF, FLT-3L(본 명세서에서 FLT-3L 및 FLT3L이라는 용어는 호환적으로 사용됨), 예를 들어 인간 FLT-3L, 좋기로는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 인간 FLT-3L, IL-15, 좋기로는 인간 IL-15 또는 IL-4, 좋기로는 인간 IL-14이다.
또 다른 구현예에서, 면역자극 화합물은 아래 표 3에서 선택된 하나 이상이다. 바람직한 구현예에서, 표 3에 열거된 면역자극 화합물은 인간 APC에 존재하는 표 3에 열거된 수용체와 상호작용하는 인간 면역자극 화합물이다:
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 2 내지 6개의 면역자극 화합물, 즉 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6개의 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 면역자극 화합물은 동일하거나 상이할 수 있으며, 상이한 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 상이한 면역자극 화합물들은 또한 APC에 상이하게 영향을 주어 면역계를 다양한 수준으로 자극함으로써 제1 폴리펩티드의 치료 또는 예방 효과를 최대화한다.
일례로서, 일 구현예에서, 벡터는 3개의 서로 다른 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 첫 번째 것은 DC의 유인을 촉진하는 면역자극 화합물이고(예컨대 XCL1), 두 번째 것은 DC의 성장을 촉진하는 면역자극 화합물이며(예컨대 FLT3L), 세 번째 것은 DC(예컨대의 활성화를 촉진하는 면역자극 화합물이다(예컨대 CD40L). 일 구현예에서, 이러한 벡터는 감염성 질환의 치료 및/또는 예방 또는 암 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정 면역자극 화합물의 선택은 또한 제1 폴리펩티드에 포함된 표적화 유닛에 따라 달라질 것인데, 이는 상기 표적화 유닛이 APC를 표적화하고 면역자극 화합물과 유사한 방식으로, 예를 들어 APC를 유인하거나 활성화함으로써 APC에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
제1 핵산 서열
본 개시내용의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함하는 제1 핵산 서열, 즉 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 핵산 서열은 DNA이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산 서열은 이것이 투여되는 대상체의 종에 최적화된다. 인간에게 투여하기 위해, 일 구현예에서, 제1 핵산 서열은 인간 코돈 최적화된다.
제1 핵산 서열은 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 그의 일부, 예를 들어 하나 이상의 질병-관련 항원 또는 그 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩한다. 일단 대상체에게 투여되면, 제1 폴리펩티드가 발현되고, 다량체화 유닛의 존재로 인해 다량체 단백질을 형성하며, 이는 항원 유닛에 포함된 항원 또는 이의 부분, 예를 들어 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하여 대상체의 면역체계 활성화를 초래한다.
제1 폴리펩티드 및 제1 폴리펩티드를 포함하는 이량체 단백질 또는 다량체 단백질과 같은 구조는 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어 WO 2004/076489A1, WO 2011/161244A1, WO 2017/118695A1 및 WO 2022/013277A1, 이들 문헌은 본원에 참조 통합됨) 당업자는 벡터의 예상되는 용도 및 투여 후 원하는 결과에 따라 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛 및 항원 유닛을 선택할 수 있다.
제1 폴리펩티드에는 N-말단 시작과 C-말단 끝이 있다(도 4 참조). 　제1 폴리펩티드의 요소 및 유닛 - 표적화 유닛(TU), 다량체화 유닛, 예컨대, 본 도 4에서는, 이량체화 유닛(DimU)) 및 항원 유닛 - 은 항원 유닛이 제1 폴리펩티드의 C-말단 끝(도 4a) 또는 제1 폴리펩티드의 N-말단 시작 부분(도 4b)에 위치하도록 상기 폴리펩티드 내에서 배열될 수 있다. 바람직하게는, 항원 유닛은 제1 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.　유닛 링커(UL)는 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛과 항원 유닛을 연결할 수 있다.　도 4는, 링커(SUL1, SUL2, SUL3)에 의해 분리된, 4개의 네오에피토프(neol, neo2, neo3, neo4)를 갖는 항원 유닛을 보여준다.　네오에피토프 neol-neo4의 배열을 기술하는 대안적인 방법은, 이들 네오에피토프가, 각각이 네오에피토프와 서브유닛 링커(SUL1, SUL2, SUL3)를 포함하는 3개의 항원 서브유닛 및 제1 폴리펩티드의 C-말단 끝 또는 N-말단 시작에 가장 근접하는 말단 네오에피토프(neo4)로 배열되는 것이다. 서브유닛은 도면에서 대괄호로 표시된다.　따라서, n개의 네오에피토프를 포함하는 항원 유닛은 n-1개의 서브유닛을 포함하고, 각각의 서브유닛은 네오에피토프 및 서브유닛 링커를 포함한다.　본원에 기재된 바와 같이, 4개의 네오에피토프는 동일하거나 상이한 네오에피토프일 수 있고, 3개의 링커/서브유닛 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 폴리펩티드의 위에서 설명한 유닛과 요소의 순서와 방향은 다량체 단백질과 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열에서 동일하다. 도 4에 도시된 바와 같은 제1 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 항암 백신, 예를 들어 맞춤형 항암 백신으로 사용하기 위한 것일 수 있다.
다음에서는 제1 폴리펩티드의 다양한 유닛과 요소에 대해 자세히 설명한다. 이들은 유닛/요소를 인코딩하는 핵산 서열로서 제1 핵산 서열에 존재하는 반면, 제1 폴리펩티드 또는 다량체 단백질에는 아미노산 서열로서 존재한다. 읽기의 용이성을 위해, 다음에서 유닛/요소는 주로 제1 폴리펩티드/다량체 단백질과 관련하여, 즉 아미노산 서열을 기준으로 설명된다.
표적화 유닛
본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 APC를 표적으로 하는 표적화 유닛을 포함한다. APC에는 수지상 세포(DC) 및 이의 서브세트가 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "표적화 유닛"은 CD4+ T 세포에 대한 MHC 클래스 II 제한 제시를 위해 또는 MHC 클래스 I 제한에 의해 CD8+ T 세포에 교차 제시를 제공하기 위해 항원-제시 세포에 폴리펩티드/다량체 단백질을 전달하는 유닛을 의미한다.
표적화 유닛의 존재로 인해 다량체 단백질은 DC, 호중구 및 기타 면역 세포를 유인한다. 따라서, 다량체 단백질은 그 안에 포함된 항원 유닛을 특정 세포에 표적화할 뿐만 아니라 특정 면역 세포를 벡터의 투여 부위로 모집함으로써 반응 증폭 효과(보조 효과)를 촉진할 것이다.
표적화 유닛은 임의의 또는 여러 유형의 APC에서 발현되는 분자 또는 DC의 서브세트와 같은 APC의 서브세트에서만 발현되는 분자와 같은 APC에서 발현된 표면 분자에 다량체 단백질을 표적화하도록 설계된다.
APC의 이러한 표면 분자의 예로는 HLA, 분화 14 클러스터(CD14), 분화 40 클러스터(CD40), CLEC9A, 케모카인 수용체 및 Toll 유사 수용체(TLR)가 있다. 케모카인 수용체에는 CC 모티프 케모카인 수용체 1(CCR1), CC 모티프 케모카인 수용체 3(CCR3), CC 모티프 케모카인 수용체 4(CCR4), CC 모티프 케모카인 수용체 5(CCR5), CC 모티프 케모카인 수용체 6(CCR6), CC 케모카인 수용체 7(CCR7), CC 모티프 케모카인 수용체 8(CCR8) 및 XCR1이 포함된다. Toll 유사 수용체에는 TLR-2, TLR-4 및 TLR-5가 포함된다. 일 구현예에서, 표적화 유닛은 이들 표면 분자와 상호작용하는 부분이거나 이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 앞서 언급된 표면 분자는 인간 APC 상에 존재한다.
따라서, 일 구현예에서, 표적화 유닛은 MHC/HLA, CD14, CD40, CLEC9A 또는 Toll-유사 수용체, 좋기로는 hCD14, hCD40, hCLEC9A 또는 인간 Toll 유사 수용체에 대한 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(VL 및 VH)과 같은 항체-결합 영역을 포함하거나 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 합성 또는 천연 리간드를 포함하거나 이로 구성된다. 이의 예에는 가용성 CD40 리간드(CD40L), 좋기로는 hCD40L, 좋기로는 인간 형태와 같은 케모카인과 같은 천연 리간드, 예를 들어 C-C 모티프 리간드 5(CCL5 또는 RANTES)라고도 불리는 케모카인 리간드 5, 좋기로는 hCCL5, 예를 들어 SEQ ID NO: 43의 서열을 갖는 hCCL5, 마우스 CCL3(또는 MIP-1α), 및 인간 이소형 hCCL3, hCCL3L1, hCCL3L2 및 hCCL3L3, 케모카인 리간드 4 (CCL4) 및 그의 이소폼 CCL4L, 좋기로는 hCCL4 및 hCCL4L, 케모카인 리간드 19 (CCL19), 좋기로는 hCCL19, 케모카인 리간드 20 (CCL20), 좋기로는 hCCL20, 케모카인 리간드 21 (CCL21), 좋기로는 hCCL21, 케모카인 모티프 리간드 1 또는 2 (XCL1 또는 XCL2), 좋기로는 hXCL1 또는 hXCL2, 및 예컨대 플라겔린과 같은 박테리아 항원이 포함된다.
일 구현예에서, 표적화 유닛은 MHC 클래스 II 단백질에 대한 친화성을 갖는다. 따라서, 일 구현예에서, 표적화 유닛은 항-HLA-DP, 항HLA-DR 및 항팬 HLA 클래스 II로 이루어진 군으로부터 선택되는 HMC 클래스 II 단백질에 대해 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(VL 및 VH)와 같은, 항체-가변 영역을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
다른 구현예에서, 표적화 유닛은 CD14, CD40, TLR-2, TLR-4 및 TLR-5로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 분자에 대한 친화성을 가지며, 좋기로는 hCD14, hCD40, hTLR-2, hTLR-4 및 hTLR-5로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 분자에 대한 친화성을 갖는다. 따라서, 일 구현예에서 표적화 유닛은 CD14, CD40, TLR-2, TLR-4 또는 TLR-5에 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(VL 및 VH)과 같은 항체-결합 영역, 예컨대 항-CD14, 항-CD40, 항-TLR-2, 항-TLR-4 또는 항-TLR-5, 좋기로는 hCD14, hCD40, hTLR-2, hTLR-4 또는 hTLR-5, 예를 들어 항-TLR-5-hCD14, 항-hCD40, 항-hTLR-2, 항-hTLR-4 또는 항-hTLR-5에 대한 특이성을 갖는 것을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 hTLR-5와 같은 TLR-5에 친화성을 갖는 플라겔린을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 CLEC9A에 대한 특이성을 갖는 항체-결합 영역, 예컨대 항-CLEC9A 또는 그의 변이체, 예컨대 항-CLEC9A Fv를 포함하거나 이로 구성되고 또는 표적화 유닛은 CLEC9 리간드, 예를 들어 SEQ ID NO: 115의 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CLEC9 리간드를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 hCLEC9A에 대한 특이성을 갖는 항체-결합 영역, 예컨대 항-hCLEC9A 또는 그의 변이체, 예컨대 항-hCLEC9A Fv를 포함하거나 이로 구성되고 또는 표적화 유닛은 CLEC9 리간드를 포함하거나 이로 이루어진다.
좋기로는, 표적화 유닛은 CCR1, CCR3, CCR5 및 CCR7로부터 선택된 케모카인 수용체, 더욱 좋기로는 CCR1, CCR3 및 CCR5로부터 선택된 케모카인 수용체에 대한 친화성을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 hCCR1, hCCR3, hCCR5 및 hCCR7로부터 선택된 케모카인 수용체, 더욱 좋기로는 hCCR1, hCCR3 및 hCCR5로부터 선택된 케모카인 수용체에 대한 친화성을 갖는다.
일 구현예에서, 표적화 유닛은 케모카인 수용체 CCR7, 좋기로는 인간 케모카인 수용체 CCR7에 대한 친화성을 갖는다. 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 CCL19, 예컨대 SEQ ID NO: 121의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CCL19, 또는 CCL21, 예컨대 CCL19 또는 CCL21의 인간 형태를 포함하거나 이로 구성된다.
좋기로는, 표적화는 케모카인 인간 대식세포 염증성 단백질 α(인간 MIP-1 α (hMIP-1α) 변이체, LD78β 또는 CCL3L1로도 지칭됨)를 포함하거나 이로 이루어지며, 이는 CCR1, CCR3 및 CCR5를 포함하여 APC의 세포 표면에 발현되는 동족 수용체에 결합한다. 표적화 유닛이 동족 수용체에 결합하면 다량체 단백질이 APC로 내재화되고 단백질은, MHC 분자에 로드되고 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 제시되어 특정 면역 반응을 유도하는 작은 펩티드로 분해된다. 일단 자극을 받고 활성화된 CD4+ T 세포의 도움을 받으면, CD8+ T 세포는 동일한 항원을 발현하는 세포, 예를 들어 암세포가 동일한 항원을 발현하는 세포를 표적으로 삼아 죽일 것이다.
다른 구현예에서, T 세포 반응과 B 세포 반응 둘 다 유도된다. 이는 또한 항체 반응, 즉 바이러스가 순환 중일 때 예를 들어 바이러스 표면 단백질에 결합하는 항체가 숙주 세포로 들어가는 것을 억제함으로써 바이러스를 중화시키는 것을 허용한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는데, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 26-93을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 28-93을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.　추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93을 포함한다.
보다 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는데, 예컨대 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 26-93으로 구성되거나, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 28-93으로 구성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 적어도 85%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93으로 구성된다.
한 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은, 최대 6개의 아미노산, 예를 들어 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산 또는 최대 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다는 것을 제외하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93을 포함한다. 이러한 표적화 유닛의 구현예는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 26-93을 포함하는 것 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 28-93을 포함하는 것이다.
바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터 내 표적 유닛과 면역자극 화합물의 특이적인 선택 및/또는 조합은 예를 들어 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 CCL4, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로서 선택하는 것이다. 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 CCL5, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CCL5를 표적화 유닛으로 선택하고 XCL1, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 IL-4, GM-CSF, CD40L 및/또는 TNFα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 IL-4, GM-CSF, IL-1β 및/또는 TNFα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 IL-4, GM-CSF, IL-1β 및/또는 IFNγ를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CCL5를 표적화 유닛으로 선택하고 CCL7, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 4-1BBL, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 CD40L, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 CD205, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CCL5를 표적화 유닛으로 선택하고 4-1BBL, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CCL5를 표적화 유닛으로 선택하고 CD40L, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 anti-CD205를 표적화 유닛으로 선택하고 CCL5, GM-CSF, FLT3L 및/또는 IFNα를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 CCL4, GM-CSF, FLT3L 및/또는 MyD88를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 TRIF, GM-CSF, FLT3L 및/또는 MyD88를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 hMIP-1α 또는 CCL3을 표적화 유닛으로 선택하고 GM-CSF, IL-12, IL-21 및/또는 CD40L 를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CD11c를 표적화 유닛으로 선택하고 hMIP-1α 또는 CCL3, IFNγ, GM-CSF 및/또는 FLT3L를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CD11c를 표적화 유닛으로 선택하고 hMIP-1α 또는 CCL3, TNFα, GM-CSF 및/또는 FLT3L를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CLEC9A를 표적화 유닛으로 선택하고 CCL5, XCL1, GM-CSF 및/또는 FLT3L를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 선택 및/또는 조합은 에컨대 CD11c를 표적화 유닛으로 선택하고 CCL5, XCL1, GM-CSF 및/또는 FLT3L를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CADM1를 표적화 유닛으로 선택하고 CCL5, XCL1, GM-CSF 및/또는 FLT3L를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CCL19를 표적화 유닛으로 선택하고 GM-CSF, IL-12, IL-21 및/또는 CD40L를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 특이적인 선택 및/또는 조합은 예컨대 CCL19를 표적화 유닛으로 선택하고 GM-CSF, CCL3L, XCL1 및/또는 CCL5를 면역자극 화합물로 선택하는 것이다.
바람직한 구현예에서, 이전 단락에 나열된 표적화 유닛 및 면역자극 화합물은 인간 단백질이다.
다량체화 유닛/이량체화 유닛
본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "다량체화 유닛"은 항원 유닛과 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 의미한다. 항원 유닛과 표적화 유닛을 연결하는 것 외에도, 다량체화 유닛은 2개, 3개, 4개 이상의 폴리펩티드와 같은 다수의 폴리펩티드를 이량체 단백질, 삼량체 단백질 또는 사량체 단백질과 같은 다량체 단백질로 다량체화/결합시키는 것을 촉진한다. 더욱이, 다량체화 유닛은 또한 다량체 단백질에 유연성을 제공하여 APC가 가변 거리에 위치하더라도 표적 유닛이 APC의 표면 분자에 최적으로 결합할 수 있도록 한다. 다량체화 유닛은 이러한 요건 중 하나 이상을 충족하는 임의의 유닛일 수 있다.
2개 초과의 폴리펩티드의 다량체화/결합을 촉진하는 다량체화 유닛
일 구현예에서, 다량체화 유닛은 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인과 같은 인간 콜라겐 유래 삼량체화 도메인과 같은 콜라겐 유래 삼량체화 유닛과 같은 삼량체화 유닛(예를 들어 A. Alvarez-Cienfuegos et al., Sci Rep 6, 28643 (2016) 참조) 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인이다. 따라서, 일 구현예에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 116의 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛이다. 다른 구현예에서, 삼량체화 유닛은 T4 피브리틴의 C-말단 도메인이다. 따라서, 일 구현예에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛이다.
다른 구현예에서, 다량체화 유닛은 p53으로부터 유래된 도메인과 같은 사량체화 유닛이며, 선택적으로 아래에 기술된 힌지 영역을 추가로 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 57의 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 선택적으로 하기 기재된 바와 같은 힌지 영역을 추가로 포함하는 사량체화 유닛이다.
이량체화 유닛
본 명세서에 사용된 용어 "이량체화 유닛"는 항원 유닛과 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 항원 유닛과 표적화 유닛을 연결하는 것 외에도, 이량체화 유닛은 두 개의 단량체 폴리펩티드의 이량체화를 촉진하거나 이량체 단백질로 결합시킨다. 더욱이, 이량체화 유닛은 또한 이량체 단백질의 유연성을 제공하여 APC가 다양한 거리에 위치하더라도 APC의 표면 분자에 대한 표적화 유닛의 최적 결합을 허용한다. 이량체화 유닛은 이러한 요구 사항을 충족하는 모든 유닛일 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 힌지 영역을 포함하는 이량체화 유닛을 포함한다. 다른 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하며, 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결한다. 일 구현예에서, 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커, 좋기로는 GGGSSGGGSG(SEQ ID NO: 134)이다. 즉, 이량체화 유닛은 글리신-세린 풍부 이량체화 유닛 링커 및 좋기로는 이량체화 유닛 링커 GGGSSGGGSG(SEQ ID NO: 134)를 포함한다.
용어 "힌지 영역"은 두 개의 폴리펩티드를 연결하는 데 기여하는, 즉 이량체 단백질의 형성을 촉진하는 이량체화 유닛에 포함된 아미노산 서열을 의미한다. 2개 이상의 폴리펩티드의 다량체화를 촉진하거나 연결하는 다량체화 유닛의 맥락에서, 용어 "힌지 영역"은 3개 이상의 폴리펩티드, 예를 들어 3개 또는 4개 폴리펩티드 및/또는 유연한 스페이서 역할을 하여 다량체 단백질의 두 표적화 유닛이 가변 거리(variable distances)에 위치하더라도 APC의 여러 표면 분자에 동시에 결합할 수 있게 해주는, 아미노산 서열을 가리킨다.
또한, 힌지 영역은 유연한 스페이서 역할을 하여 이량체 단백질의 두 표적화 유닛이, 비록 이들이 가변 거리에 위치하더라도 APC의 두 표면 분자에 동시에 결합할 수 있도록 한다. 힌지 영역은 Ig 유래, 예를 들어 IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG2 또는 IgG3으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 힌지 영역은 IgM으로부터 유래되며, 예를 들어 SEQ ID NO: 119의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 힌지 영역은 공유 결합(들), 예를 들어 시스테인들 간의 이황화 가교(들)의 형성을 통해 이량체화에 기여할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는다. 좋기로는, 공유 결합은 이황화 가교이다.
일 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4(인간 힌지 영역 1 및 인간 힌지 영역 4), 좋기로는 IgG3의 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 보다 좋기로는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-120과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-120과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4 를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-120을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 최대 4개의 아미노산, 예를 들어 최대 3개의 아미노산, 예를 들어 최대 2개의 아미노산 또는 최대 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-120을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 26의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 26의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 26의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하고, 상기 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 예컨대 면역글로불린 불변 도메인(C 도메인), 예컨대 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 카르복시말단 C 도메인(즉, CH3 도메인), 또는 이러한 C 도메인 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 좋기로는, 이량체화를 촉진하는 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다. 더욱 좋기로는, 이량체화를 촉진하는 다른 도메인은 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다.
일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 131-237과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 131-237과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열131-237을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 최대 16개의 아미노산, 예컨대 최대 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 131-237을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용을 통해 이량체화에 기여한다. 따라서, 일 구현예에서, 면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용을 통해 이량체를 형성하는 능력을 갖는다. 좋기로는, 비공유 상호작용은 소수성 상호작용이다.
이량체화 유닛이 CH3 도메인을 포함하는 경우 CH2 도메인을 포함하지 않는 것이 바람직하고 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드로 구성된다.
일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237과 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
훨씬 더 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
훨씬 더 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 최대 28개의 아미노산, 예를 들어 최대 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 28의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 28의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 28의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
제1 핵산 서열에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드에서 다량체화 단위, 예를 들어 이량체화 단위는 항원 유닛 및 표적 유닛과 관련하여 임의의 배향을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 항원 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 C-말단에 (예를 들어, 유닛 링커를 통해) 연결되고, 표적화 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 N-말단에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 N-말단에 (예를 들어, 유닛 링커를 통해) 연결되고, 표적화 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 C-말단에 연결된다. 항원 유닛은 예를 들어 링커를 통해, 좋기로는 유닛 링커를 통해 다량체화/이량체화 유닛의 C-말단에 연결되고, 표적화 유닛은 다량체화/이량체화의 N-말단에 연결되는 것이 바람직하다.
항원 유닛
일반적으로, 제1 폴리펩티드/다량체 단백질에 포함된 항원 유닛은 임의 유형의 항원(들) 또는 이의 일부, 예를 들어 질병과 관련된 항원 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 이의 예로는 하나 이상의 암 항원 또는 이의 일부 또는 감염성 질환, 즉, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 기생충 등 병원체에 의해 발생하는 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 이의 일부가 포함된다.
"질병 관련 항원(들)" 또는 "질병과 관련된 항원(들)"은 항원 유닛에 포함된 항원(들) 또는 이의 일부가 이러한 항원 유닛을 포함하는 본 발명의 벡터가 사용되도록 고안된 특정 질병에 있어 어떤 역할을 하고 관련성을 갖는다는 것을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 일례로서, 항원 유닛은 하나 이상의 암 항원 또는 이의 일부를 포함하고, 이러한 항원 유닛을 포함하는 벡터는 암 치료에 사용하도록 설계된다. 또 다른 예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 병원체로부터 유래된 항원을 포함하고, 이러한 항원 유닛을 포함하는 벡터는 이러한 병원체에 의해 발생하거나, 그러한 병원체가 연관된 감염성 질환의 치료에 사용하도록 설계된다.
"부분"은 항원의 부분/단편, 즉 항원의 아미노산 서열의 부분/단편, 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 에피토프를 의미한다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다.
항원 유닛에 포함되기에 적합한 T 세포 에피토프는 당업계에 공지되어 있을 수 있고, 즉, 특정 질병에 관련되고 관련성이 있는 것으로 연구, 제안 및/또는 검증되고, 예를 들어 과학 문헌에 발표되었을 수 있다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 7 내지 150개 아미노산, 좋기로는 7 내지 100개 아미노산, 예를 들어 9개 또는 10개 내지 100개 아미노산 또는 15개 내지 100개 아미노산 또는 9개 내지 100개 아미노산, 또는 9 내지 60개 아미노산 또는 9 내지 30개 아미노산, 또는 15~60개 아미노산 또는 15~30개 아미노산 또는 20~75개 아미노산 또는 25~50개 아미노산의 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, 제1 폴리펩티드/다량체 단백질에 포함된 항원 유닛은 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부, 예를 들어 병원체로부터 유래된 항원을 포함한다.
이러한 항원은 당업계에 공지되어 있을 수 있고, 즉, 특정 감염성 질병에 관련되고 관련성이 있는 것으로 연구, 제안 및/또는 검증되고, 예를 들어 과학 문헌에 발표되었을 수 있다.
다른 구현예에서, 제1 폴리펩티드/다량체 단백질에 포함된 항원 유닛은 암과 관련된 하나 이상의 항원 또는 이의 부분, 예를 들어 네오항원과 같은 암 항원 또는 공유 암 항원을 포함한다.
개별화된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
일 구현예에서, 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 항원 유닛을 포함하며, 이는 이러한 벡터로 치료될 환자만을 위해 특이적으로 디자인된다. 따라서, 이러한 제1 폴리펩티드의 항원 유닛은 하나 이상의 환자-특이적 암 항원 또는 이의 일부를 포함하며, 이러한 항원에는 네오항원 또는 환자-존재 공유 암 항원이 포함된다.
"환자-존재 공유 암 항원(Patient-present shared cancer antigen)"은 환자의 종양 세포에 존재하는 것으로 확인된 공유 암 항원 또는 공유 종양 항원을 설명하기 위해 본원에서 사용된다.
"네오항원"은 동일한 환자의 정상(즉, 건강한, 비-암성) 세포와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 환자의 종양 세포에서 발견되는 암 항원 또는 종양 항원을 설명하기 위해 본원에서 사용된다.
"환자-존재 공유 암 에피토프"는 면역원성인 것으로 알려졌거나 면역원성인 것으로 예측된 환자-존재 공유 암 항원에 포함된 아미노산 서열 또는 이를 인코딩하는 핵산 서열을 설명하기 위해 본원에서 사용된다.
"네오에피토프 또는 환자-특이적 암 에피토프"는 예측되는 면역원성일 것으로 예측되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 네오항원 또는 환자-특이적 암 항원에 포함된 아미노산 서열, 또는 이를 인코딩하는 핵산 서열을 설명하기 위해 본원에서 사용된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하며, 상기 항원 유닛은 하나 이상의 환자-특이적 암 항원 또는 이의 일부, 예컨대 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부 및/또는 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하며,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능케 한다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 그의 일부, 예를 들어 하나의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이러한 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 하나 이상의 에피토프, 또는 여러 환자-존재 공유 암 항원 또는 그러한 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 하나 이상의 에피토프를 포함한다.
본 명세서에서 "여러(several)"라는 용어는 "다수(multiple)", "복수(plural)" 및 "2 이상/1 초과(more than one)"이라는 용어와 호환적으로 사용된다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 네오항원 또는 이의 부분, 예를 들어 하나의 네오항원 또는 이러한 네오항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 하나 이상의 네오항원 또는 여러 네오항원 또는 이러한 여러 네오항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 하나 이상의 네오에피토프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 전술한 구현예의 임의의 조합, 즉 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부와 위에서 언급한 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부의 임의의 조합을 포함한다.
하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부를 포함하는 개별화된 폴리펩티드의 항원 유닛
암은 돌연변이로 인해 비정상적이고 통제되지 않는 세포 증식을 시작하는 하나 또는 몇 개의 세포에 의해 환자의 정상 조직으로부터 발생한다. 암세포가 돌연변이를 일으키더라도 게놈의 대부분은 손상되지 않고 환자의 나머지 세포와 동일하다. 종양을 공격하는 한 가지 접근법은 모든 환자의 종양이 독특하다는 지식에 기초한다. 즉, 환자별 돌연변이는 환자별 돌연변이 단백질, 즉 특정 환자에게 고유한 네오항원의 발현으로 이어진다. 이러한 네오항원은 환자의 정상 세포에 있는 어느 단백질과도 동일하지 않다. 따라서, 이러한 네오항원은 문제의 환자를 위해서만 특이적으로 제조된 본 발명의 벡터를 포함하는 치료적 약학 조성물, 즉 개별화된 항암 백신에 적합한 표적이다.
돌연변이는 적어도 하나의 아미노산의 변화를 초래하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 따라서 돌연변이는 다음 중 하나일 수 있다.
● 아미노산의 변화로 이어지는 비-동의적 돌연변이
● 프레임 이동으로 이어지는 돌연변이 및 그로 인하여 상기 돌연변이 이후 방향에 있어서 완전히 다른 오픈 리딩 프레임
● 종양-특이적 에피토프가 있는 더 긴 단백질로 이어지는, 종결 코돈이 변형되거나 결실되는 리드-쓰루 돌연변이(read-through mutation)
● 고유한 종양-특이적 단백질 서열을 생성하는 스플라이스 돌연변이
● 두 단백질의 접합부에 종양-특이적 에피토프가 있는 키메라 단백질을 생성하는 염색체 재배열.　돌연변이가 염색체 재배열로 인한 경우, 종양-특이적 에피토프는 적어도 하나의 아미노산의 변화로부터 또는 두 개의 인-프레임(in-frame) 코딩 서열의 조합으로부터 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 네오항원 또는 그의 일부, 예컨대 하나의 네오항원의 하나 이상의 부분 또는 여러 네오항원의 하나 이상의 부분, 좋기로는 하나 이상의 네오에피토프 및 더욱 좋기로는 여러 개의 네오에피토프를 포함한다. 이러한 네오에피토프는 그들의 예측된 치료 효능에 따라 항원 유닛에 포함되도록 선택될 수 있다. 본원에 그 개시 내용이 참조 통합된 WO 2017/118695A1 참조.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하며, 상기 항원 유닛은 하나 이상의 네오항원 또는 그의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하며,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나의 네오항원의 하나 이상의 부분 또는 여러 네오항원의 하나 이상의 부분, 바람직하게는 하나 이상의 네오에피토프를 포함한다.　바람직한 구현예에서, 항원 유닛에서, 네오에피토프는 링커에 의해 분리된다.　링커에 의한 모든 네오에피토프의 분리를 설명하는 대안적인 방법은, 말단 네오에피토프, 즉 제1 폴리펩티드의 N-말단 시작 부분 또는 제1 폴리펩티드의 C-말단 끝의 네오에피토프를 제외한 모두가, 항원 서브유닛에 배열되는 것인데, 여기서 각각의 서브유닛은 네오에피토프 및 서브유닛 링커를 포함한다.　링커에 의한 네오에피토프의 분리로 인해, 각각의 네오에피토프는 면역체계에 최적의 방식으로 제시된다.
따라서, n개의 네오에피토프를 포함하는 항원 유닛은 n-1개의 항원 서브유닛을 포함하며, 여기서 각각의 서브유닛은 네오에피토프 및 서브유닛 링커를 포함하고, 말단 네오에피토프를 추가로 포함한다.　한 구현예에서 n은 1 내지 50, 예를 들어 3 내지 50 또는 15 내지 40 또는 10 내지 30 또는 10 내지 25 또는 10 내지 20 또는 15 내지 30 또는 15 내지 25 또는 15 내지 20의 정수이다. 바람직한 구현예에서, 항원 서브유닛은 네오에피토프와 서브유닛 링커로 구성된다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 (i) 각 서브유닛이 네오에피토프 및 서브유닛 링커를 포함하는 n-1개의 항원성 서브유닛, 및 (ii) 말단 네오에피토프를 포함하며, 여기서 n은 상기 항원 유닛 내의 네오에피토프의 수이고 n은 1 내지 50의 정수인 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
네오에피토프는 좋기로는 HLA 분자에 의해 제시되기에 적합한 길이를 갖는다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 네오에피토프는 7 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 더욱 좋기로는 네오에피토프는 7 내지 10개 아미노산 또는 13 내지 30개 아미노산, 예를 들어 20 내지 30개 아미노산, 예를 들어 27개 아미노산의 길이를 갖는다.
좋기로는, 항원 유닛은 다수의 네오에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 유닛은 복수의 상이한 네오에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 유닛은 동일한 네오에피토프의 다수의 카피를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 여러 개의 서로 다른 네오에피토프 및 동일한 네오에피토프의 다수의 카피를 포함한다.　
따라서, 바람직한 접근법은 항원 유닛에 가능한 한 많은 네오에피토프(즉, 상이한 네오에피토프 및/또는 동일한 네오에피토프의 다수의 카피)를 포함시켜서, 원하는 T 세포 효과의 희석으로 인하여 네오에피토프에 대해 T 세포를 활성화시키는 능력을 손상시키지 않으면서 암을 효율적으로 공격하는 것이다. 또한, 모든 네오에피토프가 동일한 항원-제시 세포에 효율적으로 로딩되는 것을 확보하기 위해, 모든 네오에피토프-인코딩 뉴클레오티드 서열은 연속적인 폴리뉴클레오티드 사슬에 포함되어, 각각의 네오에피토프를 별개의 펩티드로 발현하는 대신 모든 네오에피토프를 포함하는 단백질의 발현을 결과한다.
항원 유닛을 설계하기 위해 환자의 종양 엑솜을 분석하여 네오항원을 식별한다.　바람직하게는, 하나 이상의 네오항원으로부터 가장 면역원성이 높은 네오에피토프의 서열이 항원 유닛에 포함되도록 선택된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 적어도 1개의 네오에피토프를 포함한다. 좋기로는, 항원 유닛은 적어도 3개의 네오에피토프, 보다 좋기로는 적어도 5개의 네오에피토프, 예컨대 7개의 네오에피토프를 포함한다. 또 다른 보다 바람직한 구현예에서, 항원 유닛은 적어도 10개의 네오에피토프를 포함한다. 또 다른 보다 바람직한 구현예에서, 항원 유닛은 적어도 15개의 네오에피토프, 예를 들어 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개 또는 적어도 45개의 네오에피토프를 포함한다.
하나 이상의 네오에피토프를 포함하는 항원 유닛은 WO 2017/118695A1에 자세히 설명되어 있다. 이러한 항원 유닛 중 임의의 것은 개별화된 항암 요법에 사용하기 위한 본 발명의 벡터에 인코딩된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛으로서 사용될 수 있다.
하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 개별화된 폴리펩티드의 항원 유닛
공유된 종양 항원은, 동일한 암 유형을 가진 환자들에 걸쳐서, 또는 여러 환자와 암 유형에 걸쳐 많은 종양에서 발현된다.　예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 전체 환자의 약 50%뿐만 아니라 자궁경부암 및 외음부 편평 세포 암종과 같은 다른 암 환자에서도 발현되는 바이러스 항원인 HPV16 항원이 그 예이다.　이들 공유 항원 중 다수는 면역원성임이 이미 특징지어졌고 및/또는 알려져 있는데, 즉, 이들의 면역원성은 적절한 방법에 의해 확인되었으며 그 결과는 예를 들어 과학 출판물에 발표되었다.　다른 것들은, 예를 들어 당업계에 공지된 알고리즘에 의해 특정 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자 상에 나타날 것으로 이미 예측되었으며, 이들의 예측된 면역원성은 예를 들어 적절한 방법에 의해 그들의 면역원성을 확인함이 없이도 과학 간행물에 발표되었다.
한 구현예에서, 항원 유닛은, 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는데, 예를 들어 면역원성인 것으로 공지된, 공지된 발현 패턴을 갖는 및/또는 특정 HLA 클래스 I 및 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 알려졌거나 이미 예측된 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함한다.
환자-존재 공유 암 항원에 특이적인 T 세포는 종양으로 이동하여 종양 미세환경에 영향을 미칠 수 있으므로, 추가적인 종양-특이적 T 세포가 암을 공격할 수 있는 가능성이 높아진다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
일부 환자-존재 공유 암 항원은 하나 이상의 돌연변이, 즉 면역원성인 것으로 알려졌거나 면역원성일 것으로 예측된 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 다른 환자-존재 공유 암 항원은 돌연변이를 포함하지 않는 단백질, 예를 들어 과발현된 세포 단백질이다.
일 구현예에서, 환자-존재 공유 암 항원은 과발현된 세포 단백질, 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 암 고환 항원, 바이러스 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자 및 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아(oncofetal) 항원, 공유된 융합 항원, 공유된 인트론 보유 항원, 암흑 물질(dark matter) 항원, 스플라이소솜 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 환자-존재 공유 암 항원은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질, 즉 정상의 건강한 세포 및 조직과 비교하여 종양에서 증가된 수준으로 발견되는 세포 단백질이다. 이러한 과발현 또는 비정상적으로 발현된 세포 단백질의 예에는 종양 단백질 D52, Her-2/neu, hTERT(텔로머라제) 및 서바이빈이 포함된다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 암 항원은, 고환의 남성 생식 세포에서는 정상적으로 발현되지만 성인 체세포 조직에서는 발현되지 않는 고환암 항원이다.　어떤 경우에는 이러한 항원이 난소와 영양막에서도 발현된다.　악성 종양에서는 이 유전자 조절이 중단되어 다양한 유형의 종양 분율에서 항원 발현을 결과한다. 암 고환 항원의 예로는 MAGE-A, MAGE-B, GAGE, PAGE-1, SSX, HOM-MEL-40 (SSX2), NY-ESO-1, LAGE-1 및 SCP-1을 들 수 있다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 암 항원은 분화 항원, 예를 들어 티로시나제이다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원의 예로는 인유두종 바이러스(HPV), B형 간염 바이러스(HBV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV), 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCV 또는 MCPyV), 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 및 인간 T-림프자극성 바이러스(HTLV)를 들 수 있다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유암 항원은 돌연변이된 종양유전자이다. 돌연변이된 종양유전자의 예로는 KRAS, CALR 및 TRP-2를 들 수 있다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 암 항원은 돌연변이된 종양 억제 유전자이다. 이의 예로는 돌연변이된 p53, 돌연변이된 pRB, 돌연변이된 BCL2 및 돌연변이된 SWI/SNF가 있다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 암 항원은 종양태아 항원, 예를 들어 알파-태아단백질 또는 암배아 항원이다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 항원은 공유 인트론 보유 항원 또는 프레임시프트 돌연변이에 의해 유발된 공유 항원, 예를 들어 CDX2 또는 CALR이다.
또 다른 구현예에서, 환자-존재 공유 항원은 스플라이소솜 돌연변이에 의해 유발된 공유 항원이다. 예를 들어 SF3B1 돌연변이와 같은 돌연변이로 인한 항원이 있다.
일반적으로, 어떠한 암 항원이든, 환자가 암에 걸렸을 때 면역 관용이 발생했을 가능성이 있다. 항암 백신은 백신에 포함된 항원에 대한 면역 반응을 특이적으로 유발해야 한다. 일 구현예에서, 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 항암 백신으로서 기능한다. 선택된 항원에 대한 말초 면역 내성은 약하거나 강할 수 있다. 이러한 환자-존재 공유 암 항원 또는 하나 이상의 그의 일부를 항원 유닛에 통합함으로써 - 단독으로 또는 다른 환자-존재 공유 암 항원 또는 그의 일부 및/또는 네오항원 또는 네오에피토프와 함께 - 이러한 항원 유닛을 포함하는 포리펩티드는 종양 미세 환경에 영향을 미치고 종양에 대한 환자의 면역 반응을 억제성(suppressive)/내약형(tolerated) 유형에서 전-염증성 유형으로 변경하기에 충분히 강하고 광범위한 면역 반응을 이끌어낸다. 이것은 여러 다른 항원에 대한 내성을 깨는 데 도움이 될 수 있으므로 환자에게 상당한 임상적 이점을 나타낸다. 전술한 개념은 암 면역 설정점을 티핑(tipping)하는 것으로 지칭할 수 있다.
한 구현예에서 항원 유닛은, 인간 세포 단백질, 좋기로는 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질 또는 분화 항원인 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 그의 일부를 포함한다.
환자-존재 공유 암 항원은 다음을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 환자의 조직 또는 체액에서 검출될 수 있다:
● 환자의 게놈 또는 엑솜을 시퀀싱하고 선택적으로 전체 게놈/엑솜-서열 데이터에서 예컨대 맞춤형 소프트웨어로 검색하여 예를 들어 돌연변이된 종양 유전자 또는 돌연변이된 종양 억제 유전자를 식별하는 방법;
● 예컨대, 돌연변이 단백질의 존재를 검출하기 위한 환자의 종양 조직의 면역조직화학;
● 예컨대, 바이러스 항원의 존재 또는 종양유전자의 알려진 돌연변이를 탐지하기 위한 RT-PCR;
● 혈청 샘플에서 예컨대 돌연변이된 종양 단백질에 대한 항체를 사용하는 ELISA;
● 공유 암 항원의 예컨대 발현/과-발현을 검출하기 위한 종양 조직의 RNA-seq 및 건강한 조직과의 비교;
● 인트론 보유 항원을 식별하기 위해 원시 RNA 서열 데이터에서 예컨대 맞춤형 소프트웨어로 검색하는 방법;
● 암흑 물질 항원의 요소인 전이가능한 요소를 식별하기 위해 전체 게놈-seq 데이터에서 예컨대 맞춤형 소프트웨어로 검색하는 방법;
● 예컨대 암흑 물질 항원을 식별하기 위해 원시 전체 엑솜/RNA 서열 데이터에서 짧은 반복물을 검출하는 방법;
● 예컨대 공유 바이러스 항원을 식별하기 위한 RNA-seq 데이터; 및
● 환자의 종양 샘플의 RNA-seq를, 환자 자신의 건강한 조직 또는 코호트/데이터베이스(예: TCGA) vs. 공통 전사체 발현, 예컨대 GTEX/HPA 유전자 발현 데이터와 비교하는 방법.
바람직한 일 구현예에서, 항원 유닛은, 면역원성으로 알려진, 예컨대 다른 환자에서 면역 반응을 이끌어낸 것으로 이전에 설명된 바 있거나, 또는 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예상된, 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 그러한 항원(들)의 일부(들)을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 에피토프는 환자의 HLA 대립유전자에 의한 제시에 적합한 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II에 의한 특이적인 제시에 적합한 길이를 갖는 하나 이상의 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함한다. 한 구현예에서 에피토프는 HLA 클래스 I 제시를 위한 7 내지 11개 아미노산 길이이다. 또 다른 구현예에서, 에피토프는 HLA 클래스 II 제시를 위한 13 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 항원 유닛은, 7 내지 30개 아미노산, 예컨대 7 내지 10개 아미노산(예컨대, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산) 또는 13 내지 30개 아미노산(예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산), 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 길이를 갖는, 하나 이상의 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함한다.
항원 유닛은, 전장으로 또는 하나 이상의 그의 일부로 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 전장으로 하나의 환자-존재 공유 암 항원을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원 유닛은, 그들 각각이 전장인, 여러 환자-존재 공유 암 항원을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 하나 이상의 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함한다.　또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 전장의 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 및 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분을 포함한다. 이의 예에는 다음이 포함된다:
- 전장의 하나의 환자-존재 공유 항원 및 하나의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛; 및
- 각각이 전장인 여러 환자-존재 공유 암 항원 및 하나의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛; 및
- 전장의 하나의 환자-존재 공유 항원 및 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛; 및
- 각각이 전장인 여러 환자-존재 공유 암 항원 및 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛.
바람직한 구현예에서, 상기 언급된 에피토프는 면역원성인 것으로 이미 알려져 있거나(예를 들어 문헌에서 면역원성인 것으로 기술되어 있음), 환자의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 이미 예측되었고(예를 들어 문헌에 기술되어 있음), 바람직하게는 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 이미 예측된 것이다.　또 다른 바람직한 구현예에서, 전술한 에피토프의 면역원성은 예측되는데, 예를 들어, 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 분자 중 하나 이상에 대한 상기 에피토프의 결합은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2021/205027 A1에 개시된 것과 같은 방법에 의해 또는 본 명세서에 포함된 섹션 "개별화된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛의 설계를 위한 방법"에 개시된 것과 같은 방법에 의해 예측된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 전장으로 1 내지 10개의 환자-존재 공유 항원을 포함한다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 항원의 1 내지 30개 부분을 포함하며, 여기서 이들 부분은 환자의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 다수의 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 1 내지 50개의 환자-존재 공유 암 에피토프, 좋기로는 환자의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 에피토프를 포함한다.
하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부 및 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부를 포함하는 개별화된 폴리펩티드의 항원 유닛
추가 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛과 관련된 전술한 모든 구현예와 항원 유닛과 관련된 전술한 구현예 모두의 조합이다. 이는 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부를 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부 및 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부를 포함하는; 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,,
여기서 벡터는 상기 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부 및 임의로 하나 이상의 네오항원 및 이의 일부를 포함하는 항원 유닛은 WO 2021/ 205027A1에 설명되어 있고, 그 내용은 여기에 참조로 포함된다. 이러한 항원 유닛 중 임의의 것은 개별화된 항암 요법에 사용하기 위해 본 발명의 벡터에 인코딩된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛으로서 사용될 수 있다.
개별화된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛을 설계하는 방법
특정 환자에서 확인된 환자-존재 공유 암 항원 및 네오항원은 바람직하게는, 이들 항원이 항원 유닛에 포함될 때 제1 폴리펩티드를 가장 효과적으로 만들 항원을 찾기 위해 추가로 처리된다. 이러한 처리가 수행되는 방식과 순서는 해당 항원이 식별된 방법, 즉 그러한 처리의 기초를 형성하는 데이터에 따라 달라진다.
한 구현예에서, 항원 유닛에 포함될 항원(들)의 처리 및 선택은 다음과 같이 수행된다:
1) 문헌 및/또는 하나 이상의 데이터베이스 내 서치를 수행하여 공유 암 항원에 대한 정보 및 서열, 바람직하게는 이들의 발현 패턴, 면역원성 또는 예측된 면역원성, 에피토프 또는 HLA 제시에 대한 정보를 검색한다.　이러한 서치는 또한 식별된 항원이 환자-존재 공유 암 항원인지 또는 네오항원인지를 결정하기 위해 수행된다.
2) 식별된 항원이 환자-존재 공유 암 항원인 것으로 결정된 경우, 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 에피토프, 바람직하게는 모든 에피토프를 식별하기 위해 그의 서열을 연구한다.　예측은 당업계에 알려진 예측 도구, 예를 들어 NetMHCpan 및 유사한 소프트웨어와 같은 당업계에 알려진 예측 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다.
3) 가장 면역원성이거나 가장 면역원성일 것으로 예측되는 환자-존재 공유 암 항원의 가장 유망한 서열, 즉 하나 이상의 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 대하여 예측되는 결합을 나타내는 서열은 항원 유닛에 포함되도록 선택된다.　한 구현예에서, 예를 들어 단계 2에서 단지 소수의 유망한 에피토프만이 식별되었거나 또는 더 긴 비-면역원성 서열 스트레치가 에피토프들 사이에 존재하는 경우, 최소한의 에피토프가 선택된다.　다른 구현예에서, 환자의 특정 HLA 대립유전자에 결합하는 여러 에피토프를 포함하는 더 긴 서열이 선택된다.　또 다른 구현예에서, 항원의 전장 서열은 항원 유닛에 포함되도록 선택된다.
4) 네오항원 서열의 가장 유망한 부분, 예컨대 네오에피토프는, 예측된 면역원성과 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 대한 그러한 서열의 결합을 기반으로, 항원 유닛에 포함되도록 선택된다.　
종양 돌연변이는 종양과 정상 조직의 서열을 분석하고 종양 조직에서 얻은 서열을 정상 조직의 서열과 비교하여 발견된다.　환자의 DNA나 RNA에서 특정 돌연변이나 대립유전자의 존재를 검출하는 다양한 방법이 있다.　이러한 방법에는 동적 대립유전자-특이적 혼성화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동(MADGE), 파이로시퀀싱, 올리고뉴클레오티드-특이적 결찰, TaqMan 시스템 및 Affymetrix SNP 칩과 같은 다양한 DNA "칩" 기술이 포함된다.　대안적으로, 돌연변이는 직접적인 단백질 서열 분석에 의하여 식별될 수도 있다.
종양 엑솜에 있는 아마도 수백 또는 수천 개의 돌연변이 중에서, 가장 유망한 서열은 예측적 HLA-결합 알고리즘을 기반으로 인 실리코 (in silico) 선택된다.　목적은, 모든 관련 에피토프를 확인하고, 순위화 또는 점수를 매긴 후에 항원 유닛에 포함될 서열을 결정하는 것이다.　당업계에 공지된 방법은 WO 2020/065023 A1 및 WO 2020/221/783 A1에 개시된 방법을 포함하여, 네오에피토프를 점수화, 순위화 및 선택하는 데 적합할 수 있다.
또한, 다음을 포함하여 이러한 점수화 및 순위화에 적합한 임의의 알고리즘이 사용될 수 있다:
다음 웹사이트에서 다운로드할 수 있는 펩티드-MHC 결합의 무료 소프트웨어 분석(IEDB 및 NetMHCpan)이 이용 가능함:
www.iedb.org
www.　cbs.dtu.dk/services/NetMHC
백신 설계를 위한 최적의 서열을 예측하기 위해 상업적으로 이용 가능한 고급 소프트웨어는 다음에서 찾을 수 있다:
www.oncoimmunity.com/
omictools.com/t-cell-epitopes-category
github.com/griffithlab/pVAC-Seq
crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php
www.epivax.com/tag/neoantigen/
각 돌연변이는 항원성에 따라 점수가 매겨지며, 가장 항원성이 높은 네오에피토프가 선택되어 항원 유닛에 최적으로 배열된다.
개별화되지 않은 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
하나 이상의 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
제1 폴리펩티드(공유 암 항원(들)을 포함하는 제1 폴리펩티드라고도 함)를 인코딩하는 비개별화 또는 "오프-더-셀프(off-the-self)" 벡터는, 하나 이상의 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 "공유 암 항원" 또는 "공유 종양 항원"은 동일한 암 유형을 갖는 환자 전체에서 또는 환자 및 암 유형 전체에서 많은 종양에 의해 발현되는 것으로 기술된 항원을 설명하기 위해 본원에서 사용된다.
"공유 암 에피토프"는 면역원성인 것으로 알려졌거나 예측된 공유 암 항원에 포함된 아미노산 서열을 기술하기 위해 본원에서 사용된다.
일 구현예에서, 암 치료에 사용하기 위한 항원 유닛 비개별화 제1 폴리펩티드는 하나 이상의 공유 암 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 면역원성인 것으로 알려진 공유 암 에피토프를 포함하고, 공지된 발현 패턴을 갖고/갖거나 특정 HLA 클래스 I 및 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 알려져 있거나 이미 예측된 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 항원 유닛은 하나 이상의 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
일부 공유 암 항원은 하나 이상의 돌연변이, 즉 면역원성이 있는 것으로 알려졌거나 면역원성이 있는 것으로 예측되는 공유 암 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 다른 공유 암 항원은 돌연변이를 포함하지 않는 단백질, 예를 들어 과발현된 세포 단백질이다.
일 구현예에서, 공유 암 항원은 과발현된 세포 단백질, 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 고환암 항원, 바이러스 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자 및 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유 융합 항원, 공유 인트론 보유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이스솜 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 공유 암 항원은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질, 즉 정상적인 건강한 세포 및 조직과 비교하여 종양에서 증가된 수준으로 발견되는 세포 단백질이다. 이러한 과발현되거나 비정상적으로 발현되는 세포 단백질의 예에는 종양 단백질 D52, Her-2/neu, hTERT(텔로머라제) 및 서바이빈이 포함된다.
다른 구현예에서, 공유 암 항원은 고환의 남성 생식세포에서는 정상적으로 발현되지만 성인 체세포 조직에서는 발현되지 않는 고환암 항원이다. 어떤 경우에는 이러한 항원이 난소와 영양막에서도 발현된다. 악성 종양에서는 이 유전자 조절이 중단되어 다양한 유형의 종양에서 항원 발현이 발생한다. 암 고환 항원의 예로는 MAGE-A, MAGE-B, GAGE, PAGE-1, SSX, HOM-MEL-40(SSX2), NY-ESO-1, LAGE-1 및 SCP-1이 있다.
또 다른 구현예에서, 공유 암 항원은 분화 항원, 예를 들어 티로시나제이다.
또 다른 구현예에서, 공유 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원의 예로는 인간 유두종 바이러스(HPV), B형 간염 바이러스(HBV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV), 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCV 또는 MCPyV), 인간 거대세포 바이러스(HCMV) 및 인간 T-림프친화성 바이러스(HTLV)가 있다.
또 다른 구현예에서, 공유 암 항원은 돌연변이된 종양유전자이다. 돌연변이된 종양 유전자의 예로는 KRAS, CALR 및 TRP-2가 있다.
또 다른 구현예에서, 공유 암 항원은 돌연변이된 종양 억제 유전자이다. 예로는 돌연변이된 p53, 돌연변이된 pRB, 돌연변이된 BCL2 및 돌연변이된 SWI/SNF가 있다.
또 다른 구현예에서, 공유 암 항원은 종양태아 항원, 예를 들어 α-태아단백질 또는 암배아 항원이다.
또 다른 구현예에서, 공유 항원은 공유 인트론 보유 항원 또는 프레임시프트 돌연변이, 예를 들어 CDX2 또는 CALR에 의해 발생하는 공유 항원이다.
또 다른 구현예에서, 공유 항원은 스플라이스솜 돌연변이에 의해 발생하는 공유 항원이다. SF3B1 mut와 같은 돌연변이로 인해 발생하는 항원이 그 예이다.
공유 암 항원의 추가 예에는 "하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는 개별화된 항암 백신의 항원 유닛"라는 제목 하에 개시된 것들과, B 세포 림프종 또는 다발성 골수종 환자의 골수종/림프종 M 성분이라고도 불리는 골수종 또는 림프종에 의해 생성된 모노클로날 Ig로부터 유래된 scFv, HIV 유래 서열, 예컨대 gpl20 또는 Gag 유래 서열, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질(TRP)-1, 흑색종 항원, 전립선 특이 항원 및 이디오타입, E1, E2, E6, E7, L1 및 L2로 이루어진 목록으로부터 선택된 임의의 것과 같은 HPV 항원, 예를 들어 HPV16 및/또는 HPV18의 E6 및/또는 E7이 포함된다.　
특정 에피토프를 포함하는 충분한 길이의 임의의 공유 암 항원 서열이 항원 유닛으로 사용될 수 있다.　따라서, 한 구현예에서, 항원 유닛은, 그러한 항원 유닛을 인코딩하는 핵산 서열 내에, 적어도 약 21개 뉴클레오티드, 예컨대 적어도 24개 뉴클레오티드에 대응하는, 적어도 7개의 아미노산, 예컨대 적어도 8개 아미노산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 공유 암 항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 하나 이상의 공유 암 에피토프를 포함한다.　또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 여러 공유 암 항원의 하나 이상의 부분, 예를 들어 여러 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함한다.　또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 전장의 하나 이상의 공유 항원 및 하나 이상의 공유 암 항원의 하나 이상의 부분을 포함한다.　예는 다음과 같다:
● 전장의 하나의 공유 항원 및 하나의 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛;　및
● 그들 각각은 전장인 여러 공유 암 항원 및 하나의 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛;　및
● 전장의 하나의 공유 항원 및 여러 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛;　및
● 그들 각각은 전장인 여러 공유 암 항원 및 여러 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛.
HPV에 대한 공유 항원을 포함하는 폴리펩티드의 예는 WO 2013/092875A1에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
공유 암 항원(들)을 포함하는 제1 폴리펩티드의 항원 유닛을 설계하는 방법
또한, 공유 암 항원(들)을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 경우, 항원 유닛은 다양한 환자, 예를 들어 특정 유형의 암을 앓고 있는 환자에게 폴리펩티드를 효과적으로 제공할 가능성이 있는 서열을 포함하도록 설계된다.
한 구현예에서, 항원 유닛에 포함될 항원의 선택은 문헌 및/또는 하나 이상의 데이터베이스 내 서치를 수행하여 공유된 암 항원에 대한 정보 및 서열, 바람직하게는 이들의 발현 패턴, 면역원성 또는 예측된 면역원성, 에피토프 및/또는 HLA 제시에 대한 정보를 검색함으로써 수행된다. 그 후 많은 환자의 다양한 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 에피토프 또는 다양한 암 적응증에 걸쳐 특정 암 적응증 및/또는 특정 환자 집단에서 우세한 HLA 클래스 I/II 대립유전자의 특정 서브셋에 결합하는 에피토프가 식별된다. 바람직하게는 가장 유망한, 즉 가장 면역원성 또는 가장 면역원성일 것으로 예측되는 공유 암 항원의 서열이 항원 유닛에 포함되도록 선택된다.
하나 이상의 감염성 항원 또는 이의 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 감염성 질환의 치료를 위해 고안된 항원 유닛을 포함하고, 벡터/제1 폴리펩티드는 전염병의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 제1 폴리펩티드에 포함된 항원 유닛은 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부, 즉 하나 이상의 감염성 항원, 즉 병원체로부터 유래된 항원 또는 그의 일부를 포함한다.
"감염성 질환"은 병원체에 의해 발생하는 병태 또는 병원체가 이를 유발하는데 관여하는 병태를 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 후자의 예로는 기생충의 알이 있는데, 이 알은 질병 자체를 일으키지는 않지만 질병을 일으키는 유충으로 발전한다.
"병원체"에는 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 기생충이 포함된다.
이 섹션에 설명된 항원은 "감염성 항원", 즉 병원체에서 파생된 항원으로, 즉, 질병을 유발하거나 질병을 유발하는 데 관여하는 병원체의 단백질에 포함되어 있다(또는 자연적으로 발견된다). 용어 "감염성 항원" 및 "병원체로부터 유래된 항원"은 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 그러한 항원의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
전술한 구현예에서, 항원 유닛은 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 그러한 항원의 일부, 예를 들어 병원체로부터 유래된 하나의 항원 또는 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원, 즉 병원체로부터 유래된 다수의 항원을 포함한다. 예를 들어, 그러한 병원체의 동일하거나 다른 단백질로 구성된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 다수의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 그러한 항원의 일부를 포함한다. 일 구현예에서, 다수의 병원체는 다수의 상이한 병원체이다. 그러한 맥락에서, "상이한 병원체"는 예를 들어 상이한 바이러스 또는 박테리아이거나 동일한 바이러스 또는 박테리아의 상이한 균주일 수 있거나 또는 동일한 균주일 수 있지만 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.
다수의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 벡터는 범백신, 예를 들어 상이한(계절) 바이러스를 표적으로 하는 백신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 범백신은 베타코로나바이러스와 인플루엔자를 표적으로 삼을 수도 있고, 또는 베타코로나바이러스의 다른 균주 또는 동일한 균주의 다른 돌연변이를 표적으로 삼을 수도 있다.
병원체로부터 유래된 감염성 항원/항원의 예로는 박테리아 기원, 예를 들어 결핵 항원, 브루셀라증의 OMP31, 또는 바이러스 기원, 예를 들어 HIV 유래 서열, 예컨대 gp120 유래 서열, HSV-2의 당단백질 D 및 인플루엔자 바이러스 항원, 예컨대, 헤마글루티닌, 핵단백질, 및 M2, 또는 E1, E2, E6, E7, L1 또는 L2와 같은 HPV 유래 항원, 예컨대 HPV16 또는 HPV18의 E6 및 E7를 들 수 있다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 베타코로나바이러스 항원 또는 그의 일부를 포함한다.
베타코로나바이러스는 오르토코로나비리대(Orthocoronaviridae) 아과에 속하는 속(genus)이다. 베타코로나바이러스는 외피가 있는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 이 속 내에서는 A 계통(엠베코바이러스 아속), B 계통(사르베코바이러스 아속), C 계통(머베코바이러스), D 계통(노베코바이러스)의 4가지 계통이 일반적으로 인식된다. 베타코로나바이러스에는 인간에게 전염병/세계적 유행병을 유발/유발하거나 인간을 감염시킬 수 있는 다음과 같은 바이러스가 포함된다: 중증급성호흡기증후군(SARS)을 유발하는 SARS-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)을 유발하는 MERS-CoV, 코로나바이러스 질병 2019(Covid-19)을 유발하는 SARS-CoV-2, HCoV-OC43 및 HCoV-HKU1. SARS-CoV와 SARS-CoV-2는 B 계통(Sarbecovirus 아속)에 속하고, MERS-CoV는 C 계통(Merbecovirus)에 속하며, HCoV-OC43과 HCoV-HKU1은 A 계통(Embecovirus 아속)에 속한다.
일 구현예에서, 항원은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 또는 그의 일부이다.
본 발명의 일 구현예에서, 항원은 스파이크 단백질, 막 단백질, 외피 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질, ORF1a/b 또는 ORF3a 단백질의 서열의 일부인 T 세포 에피토프일 수 있다. 다른 구현예에서, T 세포 에피토프는 다음 유전자/단백질의 일부이다: NCAP, AP3A, 스파이크, ORF1a/b, ORF3a, VME1 및 VEMP.
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터의 항원 유닛은 인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, CMV, HPV, HBV, 브루셀라 박테리아, HIV,, HSV-2 및 미코박테리움 결핵균으로 구성된 목록으로부터 선택된 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 이의 일부를 포함한다.
감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 벡터는 신속하고 강력한 면역 반응을 유도할 수 있으므로 전염병 및 전염병 퇴치에 이상적이다. 이러한 벡터는 하나 이상의 감염성 항원의 전체 길이 또는 일부의 항원 유닛에 포함시킴으로써 항원 효과를 유도하도록 설계되며, 이러한 부분은 예를 들어 선택된 T 세포 에피토프일 수 있거나 이들의 조합을 통해 가능하다.
일 구현예에서, 이러한 제1 폴리펩티드의 표적화 유닛은 항-범-HLA 클래스 II 또는 인간 MIP-1α이고, 면역 반응은 B 세포 및/또는 T 세포를 통해 발생될 것이다. 일 구현예에서, 벡터는 예방적 설정이나 치료적 설정, 또는 예방적 및 치료적 설정 모두에서 사용될 수 있다.
하나 이상의 병원체로부터의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
일 구현예에서, 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 벡터/제1 폴리펩티드의 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다. 이러한 T 세포 에피토프는 병원체의 단백질에 포함되어 있다(또는 자연적으로 발견된다). 많은 병원체 중에서 게놈의 보존된 부분은 면역 반응을 시작할 수 있는 T 세포 에피토프로 구성된다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원으로부터의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일부 구현예에서, 항원 유닛은 병원체의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 병원체의 하나의 T 세포 에피토프 또는 병원체의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 병원체의 다수 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 병원체의 것이고, 즉 (자연적으로) 병원체의 동일하거나 상이한 단백질에 포함된다. 다른 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 다수의 상이한 병원체들의 것이고, 즉 (자연적으로) 상이한 병원체들의 단백질에 포함된다.
항원 유닛에 포함된 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 7 내지 약 200개의 아미노산 길이를 가지며, 더 긴 T 세포 에피토프는 가능하게는 최소 T 세포 에피토프의 핫스팟을 포함할 수 있다. "최소 에피토프의 핫스팟은 광범위한 세계 인구를 포괄하는 다양한 HLA 대립유전자에 의해 제시될 것으로 예측되는 여러 개의 최소 T 세포 에피토프(예컨대 7-15개의 아미노산 길이를 가짐)를 포함하는 영역이다.
일부 구현예에서, 항원 유닛은 길이가 7 내지 150개 아미노산, 좋기로는 7 내지 100개 아미노산, 예를 들어 약 10 내지 약 100개 아미노산 또는 약 15 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 20 내지 약 75개의 아미노산 또는 약 25 내지 약 50개의 아미노산인 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다.
약 60 내지 200개의 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프는 더 짧은 서열로 분할될 수 있고 링커, 예를 들어 본원에 기술된 링커에 의해 분리된 항원 유닛에 포함될 수 있다. 예를 들어, 150개 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프는 각각 50개 아미노산의 3개 서열로 분할될 수 있고, 3개 서열을 서로 분리하는 링커를 사용하여 항원 유닛에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 링커, 예를 들어 본원에 논의된 링커, 예를 들어 본원의 "항원 유닛의 링커' 섹션에서 논의된 링커에 의해 서로 분리된 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 MHC에 의한 제시에 적합한 길이를 갖는다. 따라서 일부 구현예에서 항원 유닛은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II에 대한 특정 제시에 적합한 길이를 갖는 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 I 제시에 대해 7 내지 11개 아미노산의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 제시를 위해 약 15개 아미노산의 길이를 갖는다.
항원 유닛에 있는 T 세포 에피토프의 수는 다양할 수 있으며, 항원 유닛에 포함된 다른 요소(예컨대 링커)의 길이와 수에 따라 달라진다.
일부 구현예에서, 항원 유닛은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 또는 10개의 T 세포 에피토프와 같은 1 내지 10개의 T 세포 에피토프 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 T 세포 에피토프와 같은 11 내지 20개의 T 세포 에피토프, 또는 예컨대 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 T 세포 에피토프와 같은 21 내지 30개의 T 세포 에피토프, 또는 예를 들어 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 T 세포 에피토프와 같은 31 내지 40개의 T 세포 에피토프 또는, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 T 세포 에피토프와 같은 41 내지 50개의 T 세포 에피토프를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 병원체의 보존된 영역으로부터 유래된다. 즉, 각각의 병원체의 여러 아속, 종 또는 균주들 간에 보존된다.
T 세포 에피토프는 임의의 병원체 단백질, 즉 표면 단백질에 포함될 수 있지만 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 또는 바이러스 복제효소 폴리단백질과 같은 내부 단백질이나 기타 구조 및 비구조 단백질에도 포함될 수 있다.
병원체의 보존된 영역으로부터의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 벡터는 병원체의 여러 종/균주에 대한 보호를 제공할 것이다. 이러한 벡터는 또한 미래의 돌연변이 병원체에 대한 이러한 벡터/제1 폴리펩티드의 효능에 중요한, 병원체의 다양한 변이체에 대한 보호를 제공할 것이다. 바이러스는 돌연변이를 일으키는 것으로 알려져 있다(예컨대 바이러스 항원 드리프트 또는 항원 이동). 바이러스 속에서 보존된 영역을 발견하면 이러한 보존된 영역이 필수 구조나 기능을 유지하는 데 필요할 가능성이 높으므로 덜 보존된 영역에서 장차 돌연변이가 발생할 것으로 예상된다. 보존된 영역에 대한 면역 반응을 높임으로써 플라스미드로 치료받은 개인은 미래의 돌연변이(따라서 새로운) 균주에 대해서도 보호받을 수 있다.
따라서 본 발명의 일 구현예에서, 항원 유닛은 감염성 항원의 T 세포 에피토프에 대한/그러한 항원 유닛에 포함된 병원체로부터의 T 세포의 활성화를 통해 세포 매개 면역 반응을 유발하도록 설계된다. T 세포는 처리되어 MHC 분자와 복합체를 형성할 때 에피토프를 인식한다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌에 연구되고 기재되어 있으며, 예를 들어 면역원성인 것으로 알려지고, 예를 들어 그의 면역원성이 적절한 방법에 의해 확인되고 그 결과가 예를 들어 문헌, 예컨대 과학 출판물에 발표된 것이다. 일 구현예에서, 항원 유닛은 면역원성인 것으로 알려진 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다.
예를 들어, 당업계에 알려진 유용한 T 세포 에피토프는 인간의 SARS-CoV2에 의한 감염에 대한 것이며 문헌 [Grifoni et al., Cell Host Microbe. 2021 Jul 14; 29(7): 1076-1092]에서 찾을 수 있다. 따라서 이러한 T 세포 에피토프는 인간에서 SARS-CoV2를 치료하는 데 사용하기 위한 벡터의 항원 유닛에 포함될 수 있다. 이러한 T 세포 에피토프의 또 다른 예로는 인플루엔자 A 바이러스로부터의 핵단백질의 서열 CTELKLSDY(SEQ ID NO: 82)를 갖는 T 세포 에피토프, 인간 헤르페스바이러스 5(인간 사이토메갈로바이러스)로부터의 65 kDa의 포스포단백질의 서열 NLVPMVATV(SEQ ID NO: 83)를 갖는 T 세포 에피토프, 및 미코박테리움 결핵균으로부터의 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제/마이콜릴트랜스퍼라제 Ag85B의 서열 KLVANNTRL(SEQ ID NO: 84)을 갖는 T 세포 에피토프를 들 수 있다.
일례로서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 인간 유두종 바이러스(HPV), 예를 들어 HPV16 또는 HPV18의 영역으로부터 유래할 수 있고, 예컨대 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 예를 들어 E1, E2, E6, E7, L1 및 L2로 이루어진 군으로부터의 HPV 항원, 예를 들어 HPV16 및/또는 HPV18의 E6 및/또는 E7로이루어진 군으로부터의 HPV 항원에 포함될 수 있다. 본 개시내용의 벡터에 이러한 T 세포 에피토프를 포함시킴으로써, 이러한 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 HPV에 대한 보호를 제공할 수 있다. HPV 감염은 두경부 편평 세포 암종, 자궁경부암, 외음부 편평 세포 암종 등 특정 암과 관련이 있다. 실제로 HPV16 바이러스 항원은 해당 암에 걸린 모든 환자의 약 50%에서 발현된다.
또 다른 일례로서, 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 인간 인플루엔자 바이러스 A, 인간 인플루엔자 바이러스 B, 인간 인플루엔자 바이러스 C 및 인간 인플루엔자 바이러스 D와 같은 인간 인플루엔자 바이러스의 영역으로부터 유래할 수 있다. 일례로서, 인간 인플루엔자 바이러스는 H1, H2 및 H3와 같은 특정 헤마글루티닌(HA) 아형 및/또는 N1 또는 N5와 같은 특정 뉴라미니다제(NA) 아형일 수 있다. 예를 들어, 인간 인플루엔자 바이러스는 H1N1 아형일 수 있다. 따라서 이러한 T 세포 에피토프는 인플루엔자 감염 치료에 사용하기 위한 개시내용의 벡터의 항원 유닛에 포함될 수 있다.
또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프는 면역원성인 것으로 예측되며, 예를 들어 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합하는 예측된 능력을 기초로 선택된다. 일 구현예에서, 항원 유닛은 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 링커, 예를 들어 본원에 논의된 링커, 예를 들어 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는, 본원의 "항원 유닛의 링커" 섹션에서 논의된 링커에 의해 서로 분리된 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. T 세포 에피토프는 예측 HLA 결합 알고리즘을 기반으로 인실리코(in silico) 선택된다. 관련된 모든 에피토프를 확인한 후 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합하는 능력에 따라 에피토프의 순위를 매기고 가장 잘 결합할 것으로 예측되는 에피토프를 선택하여 항원 유닛에 포함시킨다.
적합한 HLA 결합 알고리즘은 해당 분야에 알려져 있다.
또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 다수의 T 세포 에피토프를 포함하며, 이들 중 일부는 면역원성인 것으로 알려져 있고 다른 것들은 면역원성인 것으로 예측된다. 일 구현예에서, T 세포 에피토프는 링커, 예를 들어 본원에 논의된 링커, 예를 들어 본원의 "항원 유닛의 링커" 섹션에서 논의된 링커에 의해 서로 분리된다.
베타코로나바이러스 감염의 예방 및 치료 치료를 위한 벡터에 사용하기 위한 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛 및 감염성 질환의 예방 및 치료 치료에 사용되는 본 발명의 벡터에 대한 T 세포 에피토프를 선택하기 위한 일반적으로 적용 가능한 방법은 WO2021/219897A1에 자세히 개시되어 있으며, 그 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이의 일부 또는 하나 이상의 병원체로부터의 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함하는 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
본 발명의 또 다른 측면에서, 대상체, 예를 들어 인간 개체는 건강한 개체이고, 본 발명의 벡터는 예를 들어 질병을 예방하기 위해 예방적으로 사용된다. 일반적으로 벡터는 예를 들어 감염을 예방하기 위해 예방적 환경에서 병원체에 대한 중화 항체를 생성하려는 개인의 면역을 유도하는 데 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 병원체의 전장 단백질 또는 그러한 단백질의 일부인 적어도 하나의 감염성 항원을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩한다. 따라서, 일 구현예에서, 적어도 하나의 감염성 항원은 전장 표면 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어 전장 바이러스 표면 단백질 또는 박테리아 표면 단백질 또는 임의의 다른 병원체의 전장 표면 단백질이다.
다른 구현예에서, 감염성 항원은 박테리아에 의해 분비되는, 예를 들어 감염된 대상의 세포질 내로 분비되는 전장 박테리아 단백질이다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원 또는 하나 이상의 감염성 항원의 일부, 예를 들어 다수의 전장 감염성 항원을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 다수의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 이러한 항원의 일부, 예를 들어 다수의 병원체로부터의 다수의 전장 감염성 항원을 포함한다. 일 구현예에서, 다수의 병원체는 다수의 상이한 병원체이다.
일 구현예에서 이러한 병원체의 단백질은 베타코로나바이러스 단백질, 예를 들어 외피 단백질, 스파이크 단백질, 막 단백질 및 베타코로나바이러스가 엠베코바이러스인 경우 스파이크 유사 단백질 헤마글루티닌 에스테라제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나의 감염성 항원의 한 부분을 포함한다. SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 도메인 또는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 헤드 또는 스템 도메인은 감염성 항원의 일부의 예이다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나의 감염성 항원의 여러 부분을 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 유닛은 여러 감염성 항원의 한 부분, 예를 들어 감염성 항원 1의 한 부분 및 감염성 항원 2의 한 부분 및 감염성 항원 3의 한 부분을 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 유닛은 여러 감염성 항원의 여러 부분, 예를 들어 감염성 항원 1의 2부분 및 감염성 항원 2의 3부분을 포함한다. 감염성 항원 1, 2, 및 3은 하나의 병원체 또는 여러 개의 다른 병원체에서 유래할 수 있다.
만약에 2 이상의 감염성 항원이 항원 유닛에 포함되거나 2 이상의 감염성 항원의 1 이상의 부분이 포함되는 경우, 항원 또는 이의 부분은 링커, 예를 들어 본 명세서에 논의된 링커, 예를 들어 본 명세서의 "항원 유닛의 링커" 섹션에 논의된 링커에 의해 분리될 수 있다.
하나 이상의 감염성 항원 또는 이의 일부는 구조적 B 세포 에피토프를 포함하지만, 선형 B 세포 에피토프 및/또는 T 세포 에피토프도 포함할 수 있다. 본 명세서의 이전 섹션에서 논의된 T 세포 에피토프와는 달리, 이들 T 세포 에피토프는 분리되지 않고 그의 자연 환경에서 면역계에 제시되는데, 즉 항원에 존재하는 아미노산 잔기들이 그 옆에 위치한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 벡터를 제공한다:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 전장 항원, 또는 그러한 전장 항원의 일부를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 병원체, 예를 들어 병원체의 전장 단백질, 예를 들어 전장 표면 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 B 세포 에피토프를 포함하며, 예를 들어 전술한 단백질 중 임의의 것에 포함되고 좋기로는 병원체, 예를 들어 병원체의 전장 단백질, 예컨대 전장 표면 단백질로부터 유래된 여러 B 세포 에피토프를 포함하며, 예를 들어 전술한 임의의 단백질에 포함된다. 적어도 하나의 B 세포 에피토프는 선형 또는 구조적 B 세포 에피토프일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하고 여기서 상기 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 적어도 하나의 B 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 제공하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일단 투여되면, 전술한 바와 같은 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는, 즉 항원 유닛을 포함하고, 여기서 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 전장 항원 또는 그러한 항원의 일부를 포함하며, B 세포 반응과 T 세포 반응을 유도하고 예방적 또는 치료적으로 사용될 수 있다.
이러한 항원은 예측된 치료 효능에 따라 항원 유닛에 포함되도록 선택될 수 있다. 예컨대, 본원에 참조 통합된 WO2021/219897A1 참조.
하나 이상의 병원체로부터의 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 포함하는 제1 폴리펩티드의 항원 유닛
일 구현예에서, 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 대상체에게 투여되면 T 세포 반응 및 B 세포 반응을 유도할 것이다. 판데믹 또는 전염병 상황에서 개체에게 주로 B 세포 반응이 필요한지, T 세포 반응이 필요한지, 예방 치료나 치료 치료가 가장 높은 의학적 요구인지 여부를 결정하기 위해 개체를 먼저 진단하는 것은 시간 효율적이지 않다. 그보다는 적용 가능한 테스트가 (충분히) 부족하여 개체의 감염 여부를 판단하는 것이 어려울 수 있기 때문이다. 따라서 보호와 치료를 동시에 할 수 있는 것이 중요하다. 전장 감염성 항원 또는 감염성 항원의 일부 또는 감염성 항원에 존재하는 여러 B 세포 에피토프와 보존된 T 세포 에피토프와 같은 T 세포 에피토프를 결합함으로써 일단 벡터가 투여되면 강력한 체액성 및 세포성 반응이 모두 유도된다. 선택한 표적화 유닛에 따라 반응은 더 체액성이거나 더 세포성일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 그러한 항원의 일부 및 (ii) 하나 이상의 감염성 항원으로부터의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 전장 항원 또는 그러한 항원의 일부 및 (ii) 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하되, 여기서 상기 하나 이상의 항원과 하나 이상의 T 세포 에피토프는 하나 이상의 병원체로부터 유래된 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
T 세포 에피토프와 감염성 항원 또는 이의 일부의 이러한 조합은 T 세포 에피토프의 예측된 면역원성에 따라 항원 유닛에 포함되도록 선택되거나 당업계에 공지된 T 세포 에피토프를 선택함으로써 선택될 수 있다. 예컨대, 본원에 그 내용이 참조 통합된 WO2021/219897A1 참조.
일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은은 (i) 이상의 감염성 항원으로부터의 하나 이상의 B 세포 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 감염성 항원으로부터의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 B 세포 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하되, 여기서 하나 이상의 B 세포 에피토프 및 하나 이상의 T 세포 에피토프는 하나 이상의 병원체로부터 유래된 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일 구현예에서, 전장 감염성 항원/부분 및 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 다음과 같이 항원 유닛에 배열된다: 적어도 하나의 T 세포 에피토프는 유닛 링커와 같은 제1 링커에 의해 다량체화 유닛에 연결된 서브유닛에 배열된다. 다수의 T 세포 에피토프가 서브유닛에 존재하는 경우, T 세포 에피토프는 서브유닛 링커에 의해 분리되는 것이 바람직하다. 또한, 서브유닛은 제2 링커에 의해 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이의 일부로부터 분리된다. 따라서, T 세포 에피토프(들)을 갖는 서브유닛은 다량체화 유닛에 가장 가까운 반면, 감염성 항원(들) 또는 그의 일부는 폴리펩티드의 말단을 구성한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 다음, 즉
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이러한 항원의 일부 및 (ii) 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하되, 여기서 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 T 세포 에피토프는 병원체로부터 유래된 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능케하고; 및
여기서 항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프가 서브유닛에 포함되는 경우 서브유닛 링커에 의해 서로 분리된 T 세포 에피토프를 포함하는 서브유닛을 포함하며; 및
여기서 서브유닛은 유닛 링커와 같은 제1 링커에 의해 다량체화 유닛에 연결되고, 제2 링커에 의해 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이러한 항원의 일부로부터 분리된다.
서브유닛 링커, 제1 링커/유닛 링커 및 제2 링커는 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 예를 들어 본 명세서의 "항원 유닛의 링커" 및 "유닛 링커" 섹션에서 논의된 바와 같은 링커일 수 있다.
항원 유닛의 추가 구현예
다음은 일반적으로 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛에 적용된다.
항원이라는 용어는 이 섹션에서 네오항원, 네오에피토프, 환자-존재 공유 암 항원, 환자-존재 공유 암 항원의 일부, 예를 들어 환자-존재 공유 암 에피토프, 공유 암 항원, 공유 암 항원의 일부, 예컨대 공유 암 에피토프, 감염성 항원 또는 이의 일부 또는 감염성 항원의 T 세포 에피토프에 대해 적용된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 각 항원의 단지 1개 카피를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 항원의 다수 카피를 포함한다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 각 항원의 단지 1개의 카피만을 포함하므로, 예를 들어 10개의 서로 다른 항원이 항원 유닛에 포함될 때, 상기 항원 유닛을 포함하는 벡터는 모든 10개의 서로 다른 항원에 대해 면역 반응을 유도하여 암을 효과적으로 공격할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 예를 들어 특정 환자에서 그 환자의 HLA 대립유전자에 결합할 것으로 예측되거나/충분히 면역원성인 것으로 예측되는 네오에피토프가 단지 소수인 경우, 항원 유닛은 그 항원에 대한 면역 반응을 강화하기 위해 특정 항원, 예를 들어 특정 네오에피토프의 카피를 적어도 2개 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 환자에서 이러한 소수의 네오에피토프에 더하여 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원이 확인되는 경우에는, 동일한 네오에피토프의 카피를 다수개 포함하는 것보다, 이러한 하나 이상의 환자-존재 암 공유 항원 또는 그의 일부를 항원 유닛에 포함시키는 것이 바람직하다.
항원 유닛의 길이는 그 안에 포함된 항원(들)의 길이와 그 수에 의해 결정된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 최대 3500개의 아미노산, 예를 들어 60 내지 3500개의 아미노산, 예를 들어 약 80개 또는 약 100개 또는 약 150개의 아미노산 내지 약 3000개의 아미노산, 예를 들어 약 200 내지 약 2500개의 아미노산, 예를 들어, 약 300 내지 약 2000개의 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500개의 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000개의 아미노산을 포함한다.
특히 네오항원을 포함하는 제1 폴리펩티드의 경우 면역 반응을 향상시키기 위해, 항원은 다음 단락에 기술된 바와 같이 항원 서브유닛에 배열될 수 있다.
항원 유닛은 N-말단 시작 및 C-말단 끝을 갖는 폴리펩티드로 설명될 수 있다. 항원 유닛은 예를 들어 링커, 좋기로는 유닛 링커를 통해 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛에 연결된다. 항원 유닛은 제1 폴리펩티드의 COOH 말단 또는 NH2 말단에 위치한다. 항원 유닛은 제1 폴리펩티드의 COOH 말단에 있는 것이 바람직하다.
한 구현예에서, 항원, 바람직하게는 에피토프는 항원 유닛의 N-말단 시작부터 항원 유닛의 C-말단 끝 방향으로, 항원성이 높은 것부터 항원성이 낮은 것의 순서로 배열된다.　대안적으로,　특히, 친수성/소수성이 항원들 사이에서 크게 변하는 경우, 가장 소수성인 항원이 실질적으로 항원 유닛의 중간에 위치하고, 가장 친수성인 항원이 항원 유닛의 N-말단 시작 또는 C-말단에 위치하는 것이 바람직하다.　
항원 유닛의 가운데에 진정으로 위치하는 것은 항원 유닛이 홀수개의 항원을 포함하는 경우에만 가능하기 때문에, 이 문맥에서 용어 "실질적으로"는 짝수개의 항원을 포함하는 항원 유닛을 지칭하며, 여기서 가장 소수성인 항원은 가능한 한 가운데에 가깝게 위치한다.
예를 들어, 항원 유닛은 5개의 항원 서브유닛을 포함하고, 각각은 하기와 같이 배열되는 상이한 에피토프, 예컨대 상이한 네오에피토프를 포함한다: 1-2-3*-4-5; 여기서 1, 2, 3*, 4 및 5 각각은 상이한 네오에피토프이고, -는 서브유닛 링커이고, *는 항원 유닛의 가운데에 위치하는 가장 소수성인 네오에피토프를을 나타낸다.
또 다른 예에서, 항원 유닛은 6개의 항원 서브유닛을 포함하고, 각각은 하기와 같이 배열되는: 1-2-3*-4-5-6, 또는 별법으로 하기와 같이 배열되는: 1-2-4-3*-5-6, 상이한 에피토프, 예컨대 상이한 네오에피토프를 포함하며; 여기서 1, 2, 3*, 4, 5 및 6 각각은 상이한 네오에피토프이고, -는 서브유닛 링커이고, *는 실질적으로 항원 유닛의 가운데에 위치하는 가장 소수성인 네오에피토프를 나타낸다.
대안적으로, 항원 서브유닛은 그들이 친수성 및 소수성 항원 사이에 교차하도록 배열될 수 있다.
임의로, 항원을 인코딩하는 GC 풍부 서열(예를 들어 네오에피토프 또는 에피토프를 인코딩하는 GC 풍부 서열)은, GC 클러스터를 피하는 그러한 방식으로 배열된다.　한 구현예에서, 항원을 인코딩하는 GC 풍부 서열은 그들 사이에 적어도 하나의 비-GC 풍부 서열이 존재하도록 배열된다.
한 구현예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 링커를 포함한다.　다른 구현예에서, 항원 유닛은 다수의 항원, 예를 들어 다수의 에피토프, 예를 들어 네오에피토프를 포함하며, 여기서 항원은 링커에 의해 분리된다.　또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 다수의 항원을 포함하며, 여기서 각 항원은 링커에 의해 다른 항원으로부터 분리된다.　링커에 의해 다른 항원으로부터 각 항원의 분리를 설명하는 대안적인 방법은, 말단 항원, 즉 폴리펩티드의 N-말단 시작 부분 또는 폴리펩티드의 C-말단 끝 부분의 항원(즉, 이량체화 유닛에 연결되지 않는 끝 부분에 위치하는 항원)을 제외한 모든 항원이 항원 서브유닛에 배열되는 것으로, 여기서 각 서브유닛은, 항원, 예를 들어 네오에피토프와 서브유닛 링커를 포함하거나 이로 구성된다.
따라서, n개의 항원을 포함하는 항원 유닛은 n-1개의 항원 서브유닛을 포함하며, 여기서 각각의 서브유닛은 항원 및 서브유닛 링커를 포함하고, 말단 항원을 추가로 포함한다.　한 구현예에서, n은 1 내지 50, 예를 들어 3 내지 50 또는 15 내지 40 또는 10 내지 30 또는 10 내지 25 또는 10 내지 20 또는 15 내지 30 또는 15 내지 25 또는 15 내지 20의 정수이다.
링커에 의한 항원 분리로 인해 각 항원은 면역체계에 최적의 방식으로 제시된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프, 예를 들어 전장 감염성 항원 또는 이의 일부 및 병원체의 단백질에 포함된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고, 항원 유닛은 T 세포 에피토프가 다량체화 유닛에 가장 가깝게 배열되고 감염성 항원은 항원 유닛의 말단에 위치하도록 설계된다. T 세포 에피토프는 좋기로는 링커에 의해 분리되고, 감염성 항원은 좋기로는 링커에 의해 T 세포 에피토프를 포함하는 "서브유닛"으로부터 분리된다. 이러한 앞서 언급한 항원 유닛 설계는 PCT/EP2022/061819에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
항원 유닛에 포함된 링커
항원 유닛은 링커, 예를 들어 그 안에 포함된 항원, 예를 들어 네오항원, 네오에피토프, 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 환자-존재 공유 암 에피토프, 공유 암 항원 또는 이의 일부, 예컨대 공유 암 에피토프, 감염성 항원 또는 이의 일부 또는 감염성 항원의 T 세포 에피토프를 분리하는 링커를 포함할수있다. 전술한 바와 같이, 네오에피토프와 같은 모든 항원은 링커에 의해 서로 분리되어 서브유닛으로 배열될 수 있다. 이하에서, 서브유닛 링커 및 링커라는 용어는 호환적으로 사용되며, 둘 다 항원 유닛의 링커를 나타낸다.
일 구현예에서, 링커는 비면역원성이도록 설계된다. 링커는 강성 링커일 수 있으며, 이는 링커가 연결하는 2개의 아미노산 서열이 실질적으로 서로에 대해 자유롭게 이동하는 것을 허용하지 않음을 의미한다. 대안적으로, 이는 유연한 링커, 즉 연결되는 두 개의 아미노산 서열이 실질적으로 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있게 하는 링커일 수 있다. 두 가지 유형의 링커 모두 유용하다. 일 구현예에서, 링커는 항원 유닛이 다수의 항원을 포함하더라도 최적의 방식으로 T 세포에 항원을 제시할 수 있는 유연한 링커이다.
한 구현예에서, 서브유닛 링커는 4 내지 40개 아미노산, 예를 들어 35, 30, 25 또는 20개 아미노산, 예를 들어 5 내지 20개 아미노산 또는 5 내지 15개 아미노산 또는 8 내지 20개 아미노산 또는 8 내지 15개 아미노산, 10 내지 15개의 아미노산 또는 8 내지 12개의 아미노산으로 구성된 펩티드이다.　다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 10개의 아미노산으로 구성된다.
한 구현예에서, 예를 들어 네오에피토프를 포함하는 항원 유닛에서, 서브유닛 링커는 모든 항원 서브유닛에서 동일하다.　그러나, 항원들 중 하나 이상이 링커의 서열과 유사한 서열을 포함하는 경우, 이웃하는 서브유닛 링커를 다른 서열의 링커로 대체하는 것이 유리할 수 있다.　또한, 항원-서브유닛 링커 접합이 그 자체로 면역원성 에피토프를 구성할 것으로 예측되는 경우, 다른 서열의 링커가 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 서브유닛 링커는 유연한 링커, 바람직하게는 작은, 비-극성(예를 들어 글리신, 알라닌 또는 류신) 또는 극성(예를 들어 세린 또는 트레오닌) 아미노산을 포함하는 유연한 링커이다.　이들 아미노산의 작은 크기는 유연성을 제공하고 연결된 아미노산 서열의 이동성을 허용한다.　세린 또는 트레오닌의 혼입은 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있으므로, 링커와 항원 사이의 불리한 상호 작용을 감소시킨다.　한 구현예에서, 유연성 링커는 세린(S) 및/또는 글리신(G) 풍부 링커, 즉 여러 세린 및/또는 여러 글리신 잔기를 포함하는 링커이다.　바람직한 예는, GGGGS (SEQ ID NO: 58), GGGSS (SEQ ID NO: 59), GGGSG (SEQ ID NO: 60), GGSGG (SEQ ID NO: 61), SGSSGS (SEQ ID NO: 62) 또는 그의 다수의 변이체, 예컨대 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17), (GGGGS)m (SEQ ID NO: 64), (GGGSS)m (SEQ ID NO: 65), (GGSGG)m (SEQ ID NO: 66), (GGGSG)m (SEQ ID NO: 67) 또는 (SGSSGS)m (SEQ ID NO: 68)로서, 여기서 m은 1 내지 5의 정수, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 바람직한 구현예에서, m은 2이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 세린 및/또는 글리신 풍부 링커는 적어도 하나의 류신(L) 잔기, 예를 들어 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 류신 잔기, 예컨대　1, 2, 3 또는 4개의 류신 잔기를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGGS (SEQ ID NO: 69), GLGGS (SEQ ID NO: 70), GGLGS (SEQ ID NO: 71), GGGLS (SEQ ID NO: 72) 또는 GGGGL (SEQ ID NO: 73)를 포함하거나 그로 구성된다.　다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGSG (SEQ ID NO: 74), GLGSG (SEQ ID NO: 75), GGLSG (SEQ ID NO: 76), GGGLG (SEQ ID NO: 77) 또는 GGGSL (SEQ ID NO: 78)를 포함하거나 그로 구성된다.　또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGSS (SEQ ID NO: 79), GLGSS (SEQ ID NO: 80) 또는 GGLSS (SEQ ID NO: 81)을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGLGS (SEQ ID NO: 85), GLGLS (SEQ ID NO: 86), GLLGS (SEQ ID NO: 87), LGGLS (SEQ ID NO: 88) 또는 GLGGL (SEQ ID NO: 89)를 포함하거나 그로 구성된다.　또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGLSG (SEQ ID NO: 90), GLLSG (SEQ ID NO: 91), GGLSL (SEQ ID NO: 92), GGLLG (SEQ ID NO: 94) 또는 GLGSL (SEQ ID NO: 94)을 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGLSS (SEQ ID NO: 95), 또는 GGLLS (SEQ ID NO: 96)를 포함하거나 그로 구성된다.
다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 10개의 아미노산 길이를 갖고 1개 또는 2개의 류신 잔기를 포함하는 세린-글리신 링커이다.
한 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 97), GLGGSGGGGS (SEQ ID NO: 98), GGLGSGGGGS (SEQ ID NO: 99), GGGLSGGGGS (SEQ ID NO:100) 또는 GGGGLGGGGS (SEQ ID NO: 101)를 포함하거나 그로 구성된다.　다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 102), GLGSGGGGSG (SEQ ID NO: 103), GGLSGGGGSG (SEQ ID NO: 104), GGGLGGGGSG (SEQ ID NO: 105) 또는 GGGSLGGGSG (SEQ ID NO: 106)를 포함하거나 그로 구성된다.　또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGSSGGGSS (SEQ ID NO: 107), GLGSSGGGSS (SEQ ID NO: 108), GGLSSGGGSS (SEQ ID NO: 109), GGGLSGGGSS (SEQ ID NO: 110) 또는 GGGSLGGGSS (SEQ ID NO: 111)를 포함하거나 그로 구성된다.
추가 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGGSLGGGS (SEQ ID NO: 112), GLGGSGLGGS (SEQ ID NO: 113), GGLGSGGLGS (SEQ ID NO: 114), GGGLSGGGLS (SEQ ID NO: 115) 또는 GGGGLGGGGL (SEQ ID NO: 116)를 포함하거나 그로 구성된다.　다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGSGLGGSG (SEQ ID NO: 117), GLGSGGLGSG (SEQ ID NO: 118), GGLSGGGLSG (SEQ ID NO: 119), GGGLGGGGLG (SEQ ID NO: 120) 또는 GGGSLGGGSL (SEQ ID NO: 121)를 포함하거나 그로 구성된다.　또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 LGGSSLGGSS (SEQ ID NO: 122), GLGSSGLGSS (SEQ ID NO: 123) 또는 GGLSSGGLSS (SEQ ID NO: 124)을 포함하거나 그로 구성된다.　
또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 GSGGGA (SEQ ID NO: 125), GSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 126), GSGGGAGSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 127), GSGGGAGSGGGAGSGGGAGSGGGA SEQ ID NO: 128) 또는 GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 129)를 포함하거나 그로 구성된다.　또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 SGGGSSGGGS (SEQ ID NO: 130), SSGGGSSGGG (SEQ ID NO: 131), GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 132), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 133), GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 134) (SEQ ID NO: 1의 아미노산 121-130), GGGSSS (SEQ ID NO: 135), GGGSSGGGSSGGGSS (SEQ ID NO: 136) 또는 GLGGLAAA (SEQ ID NO: 137)를 포함하거나 그로 구성된다.　
다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 단단한 링커이다.　이러한 단단한 링커는 (더 큰) 항원을 효율적으로 분리하고 항원이 서로 간섭하는 것을 방지하는 데 유용할 수 있다.　한 구현예에서, 서브유닛 링커는 KPEPKPAPAPKP (SEQ ID NO: 138), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 139), (EAAAK)m (SEQ ID NO: 140), PSRLEEELRRRLTEP (SEQ ID NO:: 141) 또는 SACYCELS (SEQ ID NO: 142)를 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 TQKSLSLSPGKGLGGL (SEQ ID NO: 143)를 포함하거나 그로 구성된다.　또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 SLSLSPGKGLGGL (SEQ ID NO: 144)을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 145); 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 146) 또는 ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 147)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 94-105) 또는 EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 148) (SEQ ID NO: 1의 아미노산 106-120)을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 절단가능한 링커, 예를 들어 엔도펩티다제, 예를 들어 푸린, 카스파제, 카텝신 등등과 같은 엔도펩티다제에 대한 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 링커이다.　절단 가능한 링커는 유리(free) 기능적 단백질 도메인(예를 들어 더 큰 항원에 의해 인코딩됨)을 방출하기 위해 도입될 수 있으며, 이는 이러한 도메인 사이의 입체 장애 또는 감소된 생체 활성, 변경된 생체 분포와 같은 이러한 도메인의 간섭으로 인한 다른 단점을 극복할 수 있다.
적절한 링커의 예는 단락 [0098]-[0099] 및 WO 2020/176797A1의 인용된 서열, US 2019/0022202A1의 단락 [0135] 내지 [0139], WO 2017/118695 A1 및 WO에 개시되어 있다. 2021/219897A1에 기재되어 있으며, 이들 모두는 참조로 본 문서에 포함되어 있다.
유닛 링커
항원 유닛은 좋기로는 유닛 링커에 의해 다량체화 유닛에 연결된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산 서열은 항원 유닛을 다량체화 유닛에 연결하는 유닛 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩한다.
유닛 링커는 제1 핵산 서열의 작제를 용이하게 하기 위해 제한 부위를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 유닛 링커는 GLGGL(SEQ ID NO: 89) 또는 GLSGL(SEQ ID NO: 149)이다. 다른 구현예에서, 유닛 링커는 GGGGS (SEQ ID NO: 58), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17), (GGGGS)m (SEQ ID NO: 64), EAAAK (SEQ ID NO: 150), (EAAAK)m (SEQ ID NO: 140), (EAAAK)mGS (SEQ ID NO: 151), (EAAK)mGS (SEQ ID NO: 63), GPSRLEEELRRRLTEPG (SEQ ID NO: 152), AAY 또는 HEYGAEALERAG (SEQ ID NO: 153)이다.
신호 펩티드
본 개시내용의 일 구현예에서, 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열 또는 제1 핵산 서열 중 적어도 하나는 또한 신호 펩티드를 인코딩한다. 신호 펩티드는 제1 폴리펩티드의 표적화 유닛의 방향에 따라 표적화 유닛의 N-말단 또는 표적화 유닛의 C-말단에 위치한다. 또한, 신호 펩티드는 면역자극 화합물의 N 말단에 위치한다. 신호 펩티드는 본 발명의 벡터를 포함하는 세포로부터 제1 폴리펩티드/면역자극 화합물(들)의 분비를 허용하도록 설계된다. 좋기로는, 제1 핵산 서열 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 각각의 추가 핵산 서열은 신호 펩티드도 인코딩하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 신호 펩티드는 본원에 기술된 임의의 표적화 유닛 또는 면역자극 화합물의 N-말단에 자연적으로 존재하는 것이다.
임의의 적합한 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 적합한 펩티드의 예는 Ig VH 신호 펩티드, 좋기로는 SEQ ID NO: 2와 같은 인간 Ig VH 신호 펩티드이고, 좋기로는 표적화 유닛이 scFv와 같은 항체 또는 그의 일부인 경우이다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 표적화 유닛인 단백질의 천연 리더 서열, 즉 본 발명의 벡터에서 표적화 유닛으로서 인코딩되는 임의의 단백질의 N-말단에 자연적으로 존재하는 신호 펩티드이다. 또 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 면역자극 화합물의 천연 리더 서열, 즉 면역자극 화합물인 단백질의 N-말단에 자연적으로 존재하는 신호 펩티드이다.
신호 펩티드의 예로는 인간 TPA 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 3, 인간 MIP1-α 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23, 인간 GM-CSF 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열, 인간 CCL5 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열, 인간 IL-12A 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열, 인간 IL-12B 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열 또는 인간 IL-21 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 들 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 추가로 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 추가로, 최대 3개의 아미노산, 예컨대 최대 2개의 아미노산 또는 최대 1개의 아미노산이 치환, 삭제 또는 삽입된 것을 제외한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23을 포함하는 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23을 포함하는 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 추가로, 최대 3개의 아미노산, 예컨대 최대 2개의 아미노산 또는 최대 1개의 아미노산이 치환, 삭제 또는 삽입된 것을 제외한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23을 포함하는 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 추가로 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23을 갖는 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 추가로 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 신호 펩티드의 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 29의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 암호화하고 추가로 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 신호 펩티드의 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID: 29를 갖는 핵산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 추가로 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 신호 펩티드의 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 29이다.
서열 동일성
서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다: 높은 수준의 서열 동일성은 제2 서열이 제1 서열로부터 유래될 가능성을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성은 두 개의 정렬된 서열 사이에 동일한 아미노산 서열을 필요로 한다. 따라서, 참조 서열과 70% 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은 정렬 후 후보 서열의 아미노산의 70%가 참조 서열의 상응하는 아미노산과 동일해야 할 것을 요구한다. 동일성(identity)은 비제한적인 예로서 ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램(Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: 개선 서열 가중, 위치-특정 갭 패널티 및 가중치 매트릭스 선택을 통한 점진적 다수의 서열 정렬의 감도(Nucleic Acids Res. 22:4673-4680), 및 여기에 제안된 기본 매개변수와 같은 컴퓨터 분석의 도움으로 결정될 수 있다. 기본 설정으로 이 프로그램을 사용하면 쿼리의 성숙한(생체 활성) 부분과 참조 폴리펩티드가 정렬된다. 완전히 보존된 잔기의 수를 세고 이를 참조 폴리펩티드의 길이로 나눈다. 그렇게 할 때 쿼리 시퀀스의 일부를 형성하는 모든 태그 또는 융합 단백질 시퀀스는 정렬 및 시퀀스 동일성의 후속 결정에서 무시된다.
ClustalW 알고리즘이 뉴클레오티드 서열을 정렬하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열에 대해 표시된 것과 유사한 방식으로 계산될 수 있다.
서열 비교에 사용되는 또 다른 선호되는 수학적 알고리즘은 Myers and Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 FASTA 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다(Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132:185-219). 정렬은 전역 정렬(global alignment)을 기반으로 시퀀스 ID를 계산한다. Align0은 서열 끝에 있는 간격에 불이익을 주지 않는다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 및 Align0 프로그램을 사용할 때 -12/-2의 갭 개방/확장 페널티를 갖는 BLOSUM50 치환 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
아미노산 서열 변이체는 제1 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 면역자극 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그러한 잔기로의 삽입 및/또는 그러한 잔기의 치환이 포함된다.　아미노산 서열 및 서열 동일성과 관련하여 본원에 사용된 용어 치환된/치환, 결실된/결실 및 삽입된/삽입은 당업자에게 잘 알려져 있고 명백하다. 최종 단백질이 원하는 특성을 갖는다면 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 통해 최종 제1 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 면역자극 화합물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 폴리펩티드/면역자극 화합물을 생성할 수 있다.
관심 대상 단백질의 원하는 특성이 유지되는 한, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 잔기의 양친매성 특성의 유사성을 기반으로 고의적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.　예를 들어, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되며;　양전하를 띤 아미노산에는 리신과 아르기닌이 포함되며;　유사한 친수성 값을 갖는 비전하 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산에는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다.
여기에서는, 보존적 치환, 즉 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 하는 것과 같은 유사 치환(like-for-like substitution), 및 비-보존적 치환, 즉 잔기의 한 부류에서 다른 부류로, 또는 대안적으로 예컨대 오르니틴, 디아미노부티르산 오르니틴, 노르류신, 오르니틴, 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하는 비-보존적 치환이 포함된다.　이루어질 수 있는 보존적 치환은 예를 들어 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 지방족 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판, 티로신), 하이드록실 아미노산(세린, 트레오닌), 큰 아미노산(페닐알라닌, 트립토판) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌) 그룹 내에서 이루어질 수 있다.
치환은 또한 비천연 아미노산에 의해 이루어질 수 있으며 치환 잔기는 다음을 포함한다;　알파* 및 알파-이치환* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 젖산*, 천연 아미노산의 할로겐화물 유도체, 예컨대 트리플루오로티로신*, p-CI-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, pI-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-a-아미노부티르산*, L-y-아미노부티르산*, L-a-아미노이소부티르산*, L-e-아미노카프로산*, 7-아미노헵탄산*, L-메티오닌 술폰*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린*, L-티오프롤린*, 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, 예컨대 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe(4-아미노)#, L-Tyr(메틸)*, L-Phe(4-이소프로필)*, L-Tic(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산* 및 L-Phe(4-벤질)*.
위 문단에서, *는 치환 잔기의 소수성을 나타내고, #은 치환 잔기의 친수성을 나타내고, #*는 치환 잔기의 양친매성을 나타낸다.　변이체 아미노산 서열은, 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 외에, 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 2개의 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 그룹을 포함할 수 있다.　변이체의 추가적인 형태는 펩토이드 형의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함한다.
폴리펩티드 및 다량체/이량체 단백질
본 발명의 벡터는 전술한 바와 같은 제1 폴리펩티드를 인코딩한다. 폴리펩티드(및 하나 이상의 면역자극 화합물)는 벡터를 대상체에 투여한 결과 생체내에서 발현된다.
이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛의 존재로 인해, 폴리펩티드가 발현될 때 다량체 단백질이 형성된다.
다량체 단백질은 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있으며, 예를 들어 단백질이 이량체 단백질인 경우, 이량체 단백질은 동종이량체, 즉 2개의 폴리펩티드 사슬이 동일하고 결과적으로 동일한 유닛 및 이에 따른 항원 서열을 포함하는 이량체 단백질일 수 있거나, 또는 이량체 단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체일 수 있으며, 여기서 폴리펩티드 사슬 1은 그의 항원 유닛에 폴리펩티드 2와는 다른 항원 서열을 포함한다. 후자는 항원 유닛에 포함될 항원의 수가 항원 유닛에서의 크기의 상한을 초과하는 경우와 관련될 수 있다.　다량체 단백질은 동종다량체 단백질인 것이 바람직하다.
벡터 및 숙주 세포의 생산
본 발명의 벡터는 일반적으로 숙주 세포를 형질감염시키는데 적합하고 a) 제1 폴리펩티드의 발현 및 제1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 다수의 이러한 제1 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질의 형성 및 b) 추가 핵산 서열에 의해 각각 인코딩되는 하나 이상의 면역자극 화합물의 발현에 적합한 벡터들이다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 세포 배양 세포, 예를 들어 박테리아 세포이고, 벡터에 의해 인코딩된 단백질은 시험관내에서 발현된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 대상체의 세포이고, 벡터에 의해 인코딩된 단백질은 대상체에 대한 벡터의 투여의 결과로서 상기 대상체에서, 즉 생체내에서 발현된다.
시험관내 형질감염에 적합한 숙주 세포에는 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 고등 진핵생물 세포가 포함된다. 생체내 형질감염에 적합한 숙주 세포는 예를 들어 근육 세포이다.
일 구현예에서, 벡터는 상기 기재된 다양한 유닛, 특히 개별화된 항원 유닛의 경우 항원 유닛의 용이한 교환을 허용한다.
일 구현예에서, 벡터는 pUMVC4a 벡터 또는 NTC9385R 벡터 백본을 포함하는 벡터이다. 항원 유닛은 SfiI 제한 효소 카세트에 의해 제한된 항원 유닛 카세트로 교환될 수 있으며, 여기서 5' 부위는 GLGGL(SEQ ID NO: 89)/GLSGL(SEQ ID NO: 149) 유닛 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 통합되고 3' 부위는 벡터의 정지 코돈 뒤에 포함된다.
본 발명의 벡터, 예를 들어 DNA 및 RNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터의 조작 및 생산 방법은 잘 알려져 있으며, 당업자는 이러한 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 벡터를 조작/생산할 수 있을 것이다. 또한 다양한 상업 제조업체가 벡터 디자인 및 생산을 위한 서비스를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 제조 방법에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는것이고, 상기 방법은:
a) 상기 벡터를 사용하여 시험관내에서 세포를 형질감염시키는 단계 ;
b) 상기 세포를 배양하는 단계;
c) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계; 및
d) 벡터를 수집하고 선택적으로 정제하는 단계
를 포함한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 항원 또는 이의 일부는 질병 관련 항원 또는 이의 일부이다.
약학적 조성물
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 약제로 사용하기 위한 것이다.
따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 상기 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물로서 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및 (ii) 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 항원 또는 이의 일부는 질병 관련 항원 또는 이의 일부이다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수(예컨대 PBS), 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 등장성 수성 완충액 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않다.
일 구현예에서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 수성 완충액이다.　다른 실시 형태에서, 수성 완충액은 Tyrode's 완충액, 예를 들어 140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(Hepes) pH 7.4, 및 10 mM 글루코스를 포함하는 Tyrode's 완충액이다.
약학적 조성물은 숙주 세포의 형질감염을 용이하게 하는 분자, 즉 형질감염제를 포함할 수 있다.
일부 특정 구현예에서 약학적 조성물은 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리프로필렌 옥사이드의 블록을 포함하는 약학적으로 허용되는 양친매성 블록 공중합체를 포함한다.
본원에 사용된 "양친매성 블록 공중합체"는 폴리(에틸렌 옥사이드)("PEO") 블록 및 폴리(프로필렌 옥사이드)("PPO") 블록을 포함하거나 이로 구성된 선형 또는 분지형 공중합체이다.　유용한 PEO-PPO 양친매성 블록 공중합체의 전형적인 예는 일반 구조 PEO-PPO-PEO(폴록사머), PPO PEO PPO, (PEO PPO-)4ED(폴록사민) 및 (PPO PEO-)4ED(역방향 폴록사민)을 갖고, 여기서 "ED"는 에틸렌디아미닐 그룹이다.
"폴록사머"는 한 블록의 PEO에 커플링된 한 블록의 폴리(프로필렌 옥사이드)에 커플링된 한 블록의 폴리(에틸렌 옥사이드)로 구성된, 즉, 식 EOa-POb-EOa의 구조의 선형 양친매성 블록 공중합체로, 여기서 EO는 에틸렌 옥사이드, PO는 프로필렌 옥사이드, a는 2~130의 정수, b는 15~67의 정수이다. 폴록사머는 일반적으로 3자리 식별자를 사용하여 명명되며, 처음 2자리에 100을 곱하면 PPO 함량의 대략적인 분자 질량이고, 마지막 자리에 10을 곱한 값은 PEO 함량의 대략적인 백분율을 나타내다.　예를 들어, "폴록사머 188"은 분자량 약 1800의 PPO 블록(약 31 PPO인 b에 해당)과 약 80%(w/w)의 PEO(약 82인 a에 해당)를 포함하는 중합체를 의미한다.　그러나, 값은 어느 정도 달라지는 것으로 알려져 있으며, 연구 등급 Lutrol® F68 및 임상 등급 Kolliphor® P188과 같은 상용 제품은 - 생산자의 데이터 시트에 따르면 둘 다 Poloxamer 188임 - 분자량에 있어 큰 변화를 나타내고 (7,680에서 9,510 사이), 이들 특정 제품에 제공된 a와 b의 값은 각각 약 79와 28인 것으로 표시된다. 이는 블록 공중합체의 이질적인 특성을 반영하며, 이는 a와 b의 값이 최종 제제에서 발견되는 평균임을 의미한다.
"폴록사민" 또는 "순차적 폴록사민"(Tetronic®이라는 상표명으로 시판됨)은 PEO-PPO-아암(arm)에 포함된 유리 OH 그룹과 에틸렌디아민 모이어티 내 1차 아민 그룹 사이의 결합을 통해, 중앙의 에틸렌디아민 모이어티에 연결되는 4개의 PEO-PPO 아암을 보유하는 X자-형 블록 공중합체이다. 역 폴록사민도 마찬가지로, PPO-PEO 아암(arm)에 포함된 유리 OH 그룹과 에틸렌디아민 내 1차 아민 그룹 사이의 결합을 통해, 중앙의 에틸렌디아민 모이어티에 연결되는 4개의 PPO-PEO 아암을 보유하는 X자-형 블록 공중합체이다.
바람직한 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머 또는 폴록사민이다.　바람직한 것은 폴록사머 407 및 188, 특히 폴록사머 188이다. 바람직한 폴록사민은 화학식 (PEO-PPO)4-ED의 순차적 폴록사민이다.　특히 바람직한 폴록사민은 각각 등록 상표 Tetronic® 904, 704 및 304로 시판되는 것들이다.　이들 폴록사민의 특성은 다음과 같다: Tetronic® 904는 총 평균 분자량이 6700이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 4020이며 PEO 비율이 약 40%이다.　Tetronic® 704는 총 평균 분자량이 5500이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 3300이며 PEO 백분율이 약 40%이며;　Tetronic® 304는 총 평균 분자량이 1650이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 990이며 PEO 백분율이 약 40%이다.
한 구현예에서, 약학적 조성물은 양친매성 블록 공중합체를 0.2% w/v 내지 20% w/v, 예를 들어 0.2% w/v 내지 18% w/v, 0.2% w/v 내지 16% w/v, 0.2% w/v 내지 14% w/v, 0.2% w/v 내지 12% w/v, 0.2% w/v 내지 10% w/v, 0.2% w/v 내지 8% w/v, 0.2% w/v 내지 6% w/v, 0.2% w/v 내지 4% w/v, 0.4% w/v 내지 18% w/v, 0.6% w/v 내지 18% w/v, 0.8% w/v 내지 18% w/v, 1% w/v 내지 18% w/v, 2% w/v 내지 18% w/v, 1% w/v 내지 5% w/ v, 또는 2% w/v 내지 4% w/v의 양으로 포함한다. 0.5% w/v 내지 5% w/v 범위의 양이 특히 바람직하다.　다른 구현예에서, 약학적 조성물은 양친매성 블록 공중합체를 2% w/v 내지 5% w/v, 예컨대 약 3% w/v의 양으로 포함한다.
약학적 조성물은, 예를 들어 피내 또는 근육내 주사를 위한, 주사용 액체 제제와 같이 예컨대 대상체에게 투여하는데 적합한 임의의 투여 방식으로 제제화될 수 있다.
약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 비강내 또는 경구와 같은 점막 또는 상피 적용과 같이 대상체에게 투여하기에 적합한 임의의 방식으로 투여될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 근육내 또는 피내 주사에 의해 투여된다.
약학적 조성물 중 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드의 양은 약학적 조성물이 예방적 또는 치료적 치료를 위해 투여되는지 여부에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 벡터, 예컨대 DNA 플라스미드를 전형적으로 0.1 내지 10 mg, 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 mg 또는 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg의 범위로 포함한다.
바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균 약학적 조성물이다.
치료
본 개시내용의 일부 측면에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 인간의 장애와 같은 장애의 치료적 또는 예방적 치료에 사용하기 위한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 질병을 앓고 있거나 상기 질병의 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 다음,즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 상기 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
치료 방법에서, 벡터는 좋기로는 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 투여된다. 이러한 양의 벡터는 1회 투여, 즉 1회 투여로, 또는 여러 투여, 즉 반복 투여, 즉 일련의 투여로, 예를 들어 며칠, 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 투여될 수 있다.
투여되는 실제 용량은 치료가 예방적 치료인지 치료적 치료인지 여부, 대상체의 연령, 체중, 성별, 병력, 기존 상태 및 일반적인 상태, 치료할 질병의 중증도 및 의료 전문가의 판단에 따라 달라질 수 있다.
치료 방법에서, 벡터는 약학적 조성물의 형태로, 그리고 본원에 기술된 투여 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법은 환자의 치료를 감독하는 임상의가 방법이 효과적이며 치료가 필요하다고 판단하는 한 계속될 수 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 암 치료에 사용하기 위한 것이다. 개별화된 및 개별화되지 않은 제1 폴리펩티드의 항원 유닛 및 이의 다양한 구현예를 포함하는 이러한 벡터 및 이러한 벡터의 항원 유닛이 본원에 상세히 기재되어 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이으로서, 상기 방법은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
암은 고형암 또는 액체암일 수 있다. 고형암의 예는 고형 덩어리를 형성하는 암, 예를 들어 종양이다. 액체암의 예로는 림프종이나 혈액암과 같이 체액에 존재하는 암이 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 골암, 결장직장암, 위암, 림프종, 악성 흑색종, 간암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 담관암, 뇌암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 호지킨병 및 부신피질암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는데 사용된다.
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 이러한 벡터 및 이러한 벡터의 항원 유닛은 본 명세서에 상세히 기술되어 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시내용은 감염성 질환이 걸려 있거나 감염성 질환의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 상기 전염병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
감염성 질환과 관련된 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 병원체로부터 유래된 항원 또는 이의 일부가 본 명세서에 자세히 설명되어 있다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 질병과 관련한 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 상기 질병을 앓고 있거나 상기 질병의 예방이 필요한 대상체의 치료에 사용하기 위기 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이고, 여기서 상기 벡터는 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 암에 걸린 대상체의 치료에 사용하기 위기 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이고, 여기서 상기 벡터는 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 감염성 질환을 앓고 있거나 상기 감염성 질환의 예방이 필요한 대상체의 치료에 사용하기 위기 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이고, 여기서 상기 벡터는 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 제공되며,
여기서 벡터는 상기 질환을 앓고 있거나 상기 질환의 예방이 필요한 대상체의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이고, 여기서 상기 벡터는 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 제공되며,
여기서 벡터는 암에 걸린 대상체의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이고, 여기서 상기 벡터는 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 제공되며,
여기서 벡터는 상기 감염성 질환에 걸리거나 상기 감염성 질환의 예방을 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이고, 여기서 상기 벡터는 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 제공되며,
여기서 벡터는 상기 질병이 있거나 상기 질명의 예방을 필요로 하는 대상체의 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 제공되며,
여기서 벡터는 암에 걸린 대상체의 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 제공되며,
여기서 벡터는 상기 감염성 질환에 걸렸거나 상기 감염성 질환의 예방을 필요로 하는 대상체의 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 개시되며,
여기서 벡터는 상기 질병의 치료 또는 예방 치료에 사용되는 경우 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 개시되며,
여기서 벡터는 암 치료에 사용되는 경우 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 개시되며,
여기서 벡터는 상기 감염성 질환의 치료적 또는 예방적 치료에 사용되는 경우 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 개시되며,
여기서 벡터는 상기 질병의 치료적 또는 예방적 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 개시되며,
여기서 벡터는 암 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 감염성 질환과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 개시되며,
여기서 벡터는 상기 감염성 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 허용한다.
또한, 벡터를 대상체에게 투여함으로써 질병을 앓고 있거나 상기 질병의 예방이 필요한 대상의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제가 본원에 개시되며, 여기서 상기 벡터는 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 상기 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 암에 걸린 대상체에게 하기 벡터를 투여함으로써 암을 치료하기 위한 약제가 본원에 개시되며, 여기서 상기 벡터는 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 감염성 질환에 걸린 대상체에게 하기 벡터를 투여함으로써 감염성 질환을 치료하기 위한 약제가 본원에 개시되며, 여기서 상기 벡터는 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 상기 질병과 관련된 하나 이상의 항원 또는 그의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하되,
여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
실시예
전술한 설명은 당업자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 간주된다. 다음 구현예는 단지 설명의 목적으로만 제공되며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 실제로, 본 명세서에 도시되고 설명된 것 외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
실시예 1:
본원에 기재된 바와 같은 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시킬 수 있는 다양한 DNA 플라스미드를 설계하였다.
모든 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168, VB4169 및 VB4170은 아래 표 4에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
DNA 플라스미드는 아래 표 5에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다:
이하에서, "m", "뮤린" 및 "마우스"는 호환적으로 사용되며, "h"와
인간은 호환적으로 사용된다.
돌연변이가 있는 8개의 에피토프를 포함하는 DNA 플라스미드 VB4194, VB4168, VB4169 및 VB4170:
전술한 마우스 결장암 세포주 CT26의 엑솜 서열분석과 RNA 서열분석을 통해 수백에서 수천 개의 종양 특이적 비동의 돌연변이가 밝혀졌다. 잠재적인 면역원성 서열, 즉 돌연변이를 포함하는 에피토프를 확인하기 위해 인실리코(in silico) 방법을 사용하였고, 그 중 8개(표 6)를 선택하여 위에서 언급한 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛에 포함시켰다. 상기 항원 유닛의 에피토프는 글리신-세린 링커(GGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 17)에 의해 분리된다. 즉, 말단 에피토프를 제외한 모든 에피토프는 서브유닛으로 배열되며, 각 서브유닛은 하나의 에피토프와 하나의 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 17) 링커로 구성된다.
이들 DNA 플라스미드 각각은 개별화된 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드의 모델, 즉 여러 환자 특이적 에피토프, 예를 들어 여러 네오에피토프 및/또는 여러 환자-존재 공유 암 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 DNA 플라스미드의 모델이거나(환자-존재 공유 암 항원이 돌연변이된 환자-존재 공유 암 항원임), 또는 개별화되지 않은 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드 모델, 즉 여러 공유 암 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 DNA 플라스미드 모델(공유 암 항원은 돌연변이된 공유 암 항원임)이다.
DNA 플라스미드 VB4168, VB4169 및 VB4170은 상기 및 표 4 및 5에 기술된 제1 폴리펩티드와 별도의 분자로서 다음의 면역자극 화합물의 공동발현을 허용한다(h = 인간; m = 마우스):
● VB4194: 제1 폴리펩티드(VB4168, VB4169 및 VB4170과 동일한 제1 폴리펩티드)만 암호화하고 면역자극 화합물은 암호화하지 않으며 비교용으로 사용된다.
● VB4168: hFLT3L
● VB4169: hFLTL3 및 mGM-CSF
● VB4170: hFLTL3, mGM-CSF 및 mCCL5
DNA 플라스미드 제조
실시예에 개시된 모든 DNA 플라스미드의 항원 유닛, 공동발현 요소 및 면역자극 화합물의 서열을 Genscript(Genscript Biotech BV, 네덜란드)로부터 주문하고 발현 벡터 pUMVC4a(상기 표 4에 기재된 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 유닛 링커를 포함하는 마스터 플라스미드)에 클로닝하였다.
DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 평가
HEK293 세포(ATCC)를 상기 언급된 DNA 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히 말하면, 2x105 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 포함된 24웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 제조업체(Invitrogen, Thermo Fischer Scientific)가 제안한 조건 하에서 리포펙타민® 2000 시약을 사용하여 각각의 DNA 플라스미드 1μg으로 형질감염시켰다. 이어서, 형질감염된 세포를 5% CO2, 37℃ 에서 5일 동안 유지한 후, 마우스 항-인간 IgG CH3 도메인 항체(포획 항체, 100μl/웰, 1μg/ml, MCA878G, Bio-Rad) 및 염소 항인간 MIP-1α 항체(비오티닐화된 검출 항체, 100μl/웰, 0.2μg/ml, BAF270, R&D 시스템)을 사용하는 상등액의 샌드위치 ELISA에 의해, 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비의 특징화를 위해 세포 상등액을 수집하였다(도 5). 인코딩된 면역자극 화합물 FLT3L 및 GM-CSF의 발현 및 분비는 각각 마우스 항-인간 FLT3L 항체 (포획 항체, 100 μl/웰, 0.5 μg/ml, MAB608, R&D systems) 및 마우스 항 인간 FLT3L 항체 (바이오티닐화 검출 항체, 100 μl/웰, 0.1 μg/ml, BAF308, R&D Systems) (도 6), 및 래트 항-마우스 GM-CSF (포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml 마우스 GM-CSF 항체, MAB415, R&D Systems) 및 염소 항-마우스 GM-CSF (바이오티닐화 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAM215, R&D Systems) (도 7)을 이용하여 샌드위치 ELISA에 의해 각각 측정하였다. 인코딩된 면역자극 화합물 CCL5의 발현 및 분비는 래트 항-마우스 CCL5 (포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml, MAB4781, R&D Systems) 및 염소 항-마우스 CCL5 (바이오티닐화 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAF478, R&D Systems) (도 8)을 이용하여 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다.
도 5에 제시된 결과는 VB4168, VB4169 및 VB4170에서 인코딩된 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 형질감염된 HEK293 세포로부터 비교용 VB4194와 유사한 수준으로 발현되고 분비되었음을 입증한다. 두 번째 단백질로서 VB4168, VB4169 및 VB4170에 인코딩된 FLT3L은, 도 6에 도시된 것처럼 3개의 DNA 플라스미드 모두에서 높은 수준으로 발현 및 분비된다. 또한 VB4169 및 VB4170에서 세 번째 단백질로서 인코딩된 GM-CSF는 도 7에 도시된 바와 같이 높은 수준으로 발현 및 분비된다. VB4170에서 네 번째 단백질로서 인코딩된 CCL5는 도 8에 도시된 바와 같이 높은 수준으로 발현되고 분비된다.
실시예 2:
DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169의 면역원성 평가
DNA 플라스미드 VB4194(비교), VB4168 및 VB4169의 면역원성을 이러한 플라스미드가 투여된 마우스에서 유발된 T 세포 면역 반응을 측정함으로써 결정하였다. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-237을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 음성 대조군인 VB1026을 포함시켰다. 이 DNA 플라스미드는 VB4194와 동일하지만 유닛 링커나 항원 유닛을 포함하지 않는다.
마우스를 이용한 모든 실험에는 다음과 같은 연구 설계가 적용되었다.
6주령 암컷 마우스를 Janvier Labs(프랑스)로부터 입수하였다. 모든 동물은 Radium Hospital(노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 노르웨이 식품 안전청(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. 항원 유닛을 포함하는 작제물의 시험을 위해 그룹당 5마리의 마우스를 사용한 반면, 음성 대조군용으로는 그룹당 3마리의 마우스를 사용하였다.
BALB/c 마우스에 6 μg의 DNA 플라스미드를 근육내로 1회 투여한 후 전기천공법을 시행하였다. 투여 10일 후 비장을 수집하고 세포 여과기에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 테스트한 각 플라스미드에 대해 단일 세포 현탁액의 일부를 사용하여 Dynabeads™ 항CD4 비드를 사용하여 CD4+ T 세포를 고갈시켰다. 그런 다음 전체 비장세포 및 CD4+ 고갈된 비장세포를 제조 프로토콜(Mabtech)에 따라 FluoroSpot 분석 에서 INF-γ 및 TNF-α의 생산에 대해 테스트하였다.
표 6에 나타낸 VB4194, VB4168 및 VB4169에 포함된 8개의 에피토프와 동일한 서열을 갖는 펩티드(아래 표 7)를 사용하여 이들 플라스미드가 투여된 마우스로부터 수확된 비장세포를 재자극하였다:
DNA 플라스미드 VB4194, VB4168 및 VB4169를 표 7의 펩티드에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 비교하였다. VB1026은 음성 대조군으로 포함되었다.
도 9-14에 도시된 바와 같이, 음성 대조군 VB1026을 투여한 마우스는 표 7의 펩티드에 대해 낮은 기초 면역원성을 나타내었다.
VB4194는 8개 에피토프 모두에 대해 T 세포 반응을 유도하였다. VB4194와 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 추가로 FLT3L을 인코딩하는 VB4168은 VB4194보다 더 강한 T 세포 반응을 유도하였다(도 9-11). VB4169에 의해 인코딩된 바와 같이, 8개의 에피토프를 포함하는 제1 폴리펩티드의 발현에 더해 추가로 두 가지 면역자극 화합물인 FLT3L 및 GM-CSF의 공동발현은, VB4194 또는 VB4168에 비해 훨씬 더 강한 면역 반응을 유도하였다(도 9-11). IFN-γ만을(도 9), TNF-α만을(도 10), 및 INF-γ + TNF-α를 공동분비(도 11)하는 세포의 수는 모두 VB4194에서 VB4168로 증가했으며, VB4168에서 VB4169로 증가하였다. 유사하게, IFN-γ만 분비하는 CD8+ T 세포(CD4+ T 세포 고갈 샘플)의 수(도 12), TNF-α만 분비하는 세포(도 13), IFN-γ + TNF-α 공동분비 세포의 수(도 14) 모두 VB4194에서 VB4168로, VB4168에서 VB4169로 증가하였다.
이들 결과는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드와 별도의 분자로서 상기 플라스미드로부터 공동발현되는 하나 이상의 면역자극 화합물이 상기 제1 폴리펩티드만을 인코딩하는 DNA 플라스미드에 비해, 제1 폴리펩티드에 포함된 항원에 대한 항원 특이적 면역 반응을 증폭시킬 수 있음을 나타낸다. .
실시예 3:
표 4에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 아래 표 8에 나열된 요소를 인코딩하는 추가 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드 VB4202를 설계하고 제조하였다.
VB4202에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 평가
HEK293 세포(ATCC)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 상기 언급된 DNA 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 분비된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질을 마우스 항-인간 IgG CH3 도메인 항체 (포획 항체, 100 μl/well, 1 μg/ml, MCA878G, Bio-Rad) 및 염소 항-인간 MIP-1α 항체 (바이오티닐화 검출 항체, 100 μl/well, 0.2 μg/ml, BAF270, R&D systems)를 이용하여 상등액을 샌드위치 ELISA로 특징화하였다(도 15). 인코딩된 면역자극 화합물 GM-CSF의 분비는 래트 항-마우스 GM-CSF (포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml 마우스 GM-CSF 항체, MAB415, R&D Systems) 및 염소 항-마우스 GM-CSF (바이오티닐화 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAM215, R&D Systems)을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 1:1000으로 희석된 상등액에서 측정되었다 (도 16).
도 15에 제시된 결과는 VB4202에서 인코딩된 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 형질감염된 HEK293 세포로부터 발현되고 분비되었음을 입증한다. VB4202에서 두 번째 단백질로 인코딩된 GM-CSF는 도 16에 도시된 바와 같이 높은 수준으로 발현 및 분비되었다.
DNA 플라스미드 VB4194 및 VB4202의 면역원성 평가
실시예 2에 기술된 바와 같이 DNA 플라스미드 VB4194(비교), VB1026(음성 대조군) 및 VB4202의 면역원성을 BALB/c 마우스에서 결정하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, VB1026 투여에 대한 반응으로 어떠한 IFN-γ 생산도 검출되지 않았다. VB4194는 8개 에피토프 모두에 대해 T 세포 반응을 유도하였다. VB4194와 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 GM-CSF를 추가로 인코딩하는 VB4202는 IFN-γ FluoroSpot으로 분석시 VB4194보다 훨씬 더 강력한 T 세포 반응을 유도하였다.
유세포 계측법 평가
VB1026, VB4194 및 VB4202를 투여한 마우스의 단일 세포 수준에서 APC/수지상 세포 유입을 평가하기 위해 다수의 유동 세포측정법을 사용하였다. 6주령 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier Labs(프랑스)에서 입수하였다. 모든 동물은 오슬로 대학의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 노르웨이 식품 안전청(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. 그룹당 6마리의 마우스를 사용하여 VB1026, VB4202 및 VB4194를 비교하였다. 처리되지 않은 6마리의 마우스 그룹을 추가 대조군으로 사용하였다. 각 DNA 플라스미드 6μg을 전경골근에 근육내 투여한 후 전기천공법을 시행하였다. 처리되지 않은 그룹은 DNA 플라스미드나 전기천공을 받지 않았다. 투여 후 1, 2, 4일 또는 미치료군에서 무균상태에서 전경골근을 적출하였다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 먼저 가위를 사용하여 근육을 기계적으로 분리한 다음 효소적으로 소화시켰다. 효소 소화를 위해 해리된 근육을 소화 배지(DMEM, 콜라게나제 A [2 mg/ml], DNase [50 U/ml])에서 교반 자석과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, 단일 세포 현탁액을 70 μm 필터를 통해 여과하고 PBS에서 4℃에서 6분 동안 400 xg로 두 번 세척하였다.
유세포 계측법을 위해 단일 세포 현탁액을 먼저 생존 염료(eFluor 780, Invitrogen)와 함께 실온(RT)에서 10분 동안 배양하였다. 생존 염료를 PBS로 헹구었다(4℃에서 6분 동안 400 xg로 두 번 원심분리함). 그런 다음 세포를 Fc 블록과 함께 RT에서 10분 동안 배양하여 형광 항체의 비특이적 결합을 차단하였다. 차단 단계 후, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 표면 마커 특이적 항체 풀(아래 표 9)로 염색하였다. 염색된 세포를 BD FACSymphony A5 유세포 계측법기에서 실행하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 유세포 계측법 데이터를 분석하였다. 도 18의 설명에 설명된 바와 같이 게이팅 전략을 사용하여 수지상 세포(DC)/APC를 정의하였다.
그 결과, VB4194를 투여한 마우스의 근육에 비해 VB4202를 투여한 마우스의 근육으로의 면역세포(CD45+ 세포)의 유입이 증가한 것으로 나타났다(도 19).
근육에 존재하는 CD45+ 세포 집단 내 DC의 비율은 VB4194를 받은 마우스에 비해 VB4202를 받은 마우스에서 더 높았다(도 20). 더욱이, cDC1 집단(도 21) 및 moDC 집단(도 22)은 모두 VB4194를 받은 마우스에 비해 VB4202를 받은 마우스의 근육에서 증가하였다.
요약하면, 이들 결과는 제1 폴리펩티드 및 별도의 분자로서 플라스미드로부터 공동발현되는 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드가 근육내 투여될 때 투여 위치로 수지상 세포의 유입을 촉진할 수 있음을 나타낸다. 이는 궁극적으로 상기 제1 폴리펩티드만을 인코딩하는 DNA 플라스미드와 비교하여 제1 폴리펩티드에 포함된 항원에 대한 증가된 항원 특이적 면역 반응에 추가로 기여한다.
실시예 4:
다음 DNA 플라스미드를 설계 및 제조하였다.
모든 DNA 플라스미드 VB1020, VB4195, VB4196은 표 4에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 아래 표 10에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다:
DNA 플라스미드 VB1020, VB4195 및 VB4196은 인간 유두종 바이러스 16(HPV16) 항원 E7 및 E6을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
이들 DNA 플라스미드 각각은 암 치료에 사용하기 위한 개별화되지 않은 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드의 모델, 즉, 바이러스 공유 암 항원(여기서는 특정 유형의 암을 담당하는 HPV16의 항원)인 공유 암 항원과 함께 여러 공유 암 항원을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 모델이거나, 또는 감염성 질환 치료에 사용하기 위한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드의 모델, 즉 병원체로부터 유래된 항원(여기서는 HPV16으로부터 유래된 항원)을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 모델이다.
DNA 플라스미드 VB4195 및 VB4196은 위에서 설명한 제1 폴리펩티드와 별도의 분자로서 다음 면역자극 화합물(들)의 공동발현을 허용한다.
● VB1020: 제1 폴리펩티드만 암호화하고 면역자극 화합물은 암호화하지 않으며 비교용으로 사용됨
● VB4195: hFLT3L
● VB4169: hFLTL3 및 mGM-CSF
DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 평가
HEK293 세포는 ATCC로부터 얻어 실시예 1에 기재된 바와 같이 VB1020(비교), VB4195 또는 VB4196으로 일시적으로 형질감염시켰다.
DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 분비된 단백질을 마우스 항-인간 IgG CH3 도메인 항체(포획 항체, 100 μl/well, 1 μg/ml, MCA878G, Bio-Rad) 및 염소 항-인간 MIP-1α 항체(비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/well, 0.2 μg/ml, R&D systems, BAF270)을 사용하여 상등액의 샌드위치 ELISA에 의해 특징화시켰다.
VB4195 및 VB4196에서 두 번째 단백질로 인코딩된 FLT3L의 분비는 세포 배양 상등액(1:500 희석)에서 마우스 항-인간 FLT3L 항체(포획 항체, 100 μl/well, 0.5 μg/ml, MAB608, R&D systems) 및 마우스 항 인간 FLT3L 항체(비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/well, 0.1 μg/ml, BAF308, R&D Systems)를 사용하여 샌드위치 ELISA로 측정되었다. VB4196의 세 번째 단백질로 인코딩된 세포 배양 상등액(1:500 희석) 중의 GM-CSF의 분비는 래트 항-마우스 GM-CSF (포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml 마우스 GM-CSF 항체, MAB415, R&D Systems) 및 염소 항-마우스 GM-CSF (비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAM215, R&D Systems)를 사용하여 샌드위치 ELISA로 측정되었다.
도 23에 제시된 결과는 VB4195 및 VB4196에서 인코딩된 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 형질감염된 HEK293 세포로부터 잘 발현되고 분비되었음을 입증한다. 두 번째 단백질로서 VB4195 및 VB4196에서 인코딩된 FLT3L은 도 24에 도시된 바와 같이 두 플라스미드 모두에서 높은 수준으로 발현되고 분비된다. 또한, VB4196에서 세 번째 단백질로 인코딩된 GM-CSF도 도 25에 도시된 바와 같이, 높은 수준으로 발현되고 분비된다.
VB4195 및 VB4196에서 발현된 무손상 단백질의 특성 분석
VB4195 및 VB4196에 의해 인코딩된 단백질을 추가로 특징화하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액 샘플에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. VB4195 및 VB4196과 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 VB1020이 비교 대상으로 포함되었다.
간략하게 설명하면, Expi293F 세포(3x10 6 세포/ml, 1.6ml)를 6웰 배양 플레이트에 접종하였다. 엑스피펙타민(ExpiFectamine) 293 Reagent(Thermo Fisher Sci.)를 사용하여 세포를 1μg/ml 플라스미드 DNA로 형질감염시키고, 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터(8% CO2, 37℃) 내 궤도 진탕기(직경 19mm, 125rpm)에서 배양하였다. 18시간 배양 후 엑스피펙타민 293 Transfection Enhancer(Thermo Fisher Sci.)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 28시간 동안 배양한 후 상등액을 수집하였다. 샘플은 환원 및 비환원 조건을 위해 각각 5μl DTT(Thermo Fisher Sci.) 또는 5μl 초순수와 함께 25μl 4x Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)과 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액 70μl를 혼합하여 준비되었다. 또한, Expi293F 상등액은 64μl 샘플을 16μl PNGase F 완충액(NEB)과 혼합하여 탈글리코실화시키고 80℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 식힌 후 Rapid PNGase F 효소(NEB) 4μl를 첨가하고 샘플을 50℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 탈글리코실화된 샘플을 30μl 4x Laemmli 완충액 및 6μl DTT와 추가로 혼합하였다. 샘플(환원, 비환원 또는 탈글리코실화)을 70℃에서 10분간 가열한 후 4%~20% Criterion TGX Stain-Free 프리캐스트 젤(Bio-Rad)에 첨가하였다. SDS-PAGE는 Precision Plus Protein All Blue Prestained 단백질 표준품(Bio-Rad)을 사용하여 1x Tris/Glycine/SDS 실행 완충액(Bio-Rad)에서 수행되었다. Tran-Blot Turbo 반건식 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 단백질을 겔에서 EtOH 활성화 저형광(LF) 0.45μm PVDF 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. PVDF 막을 EveryBlot 완충액(Bio-Rad)에서 5분 동안 차단하고 염소 항-인간 MIP-1α(BAF270, R&D Systems), 염소 항-쥐 GM-CSF(BAF415, R&D Systems) 또는 염소 항-인간 FLT3L(BAF308, R&D Systems)로 프로빙하여 제1 폴리펩티드/이량체 단백질인 GM-CSF 또는 FLT3L을 각각 검출한다. 1차 항체의 특이성은 각각의 재조합 단백질을 조사하는 초기 테스트에서 확인되었다. 막을 형광색소가 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척하고 건조시켰다. ChemiDoc™ MP 이미징 시스템(Dylight 550 및 650, 자동 최적 설정)을 사용하여 이미지를 획득하였다.
웨스턴 블롯 분석은 VB4195가 두 가지 단백질, 즉 제1 폴리펩티드/이량체 단백질(도 26); 및 FLT3L(도 27)을 발현하였음을 확인해주었다. VB4196은 세 가지 단백질, 즉 제1 폴리펩티드/이량체 단백질(도 26), FLT3L 및 GM-CSF(도 27)를 발현하였다. VB4196에서 FLT3L 및 GM-CSF 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 분리하는 데 사용된 P2A 서열은 글리코실화되어 웨스턴 블롯에서 관찰된 단백질 크기의 변화를 일으키는 것으로 나타났다. PNGase F를 사용한 탈글리코실화 프로토콜은 이러한 크기 변화를 줄였다. 더욱이, P2A 펩티드는 FLT3L의 C 말단에 부착된 21개 아미노산 꼬리를 남기는데, 이는 웨스턴 블롯에서 대략 2.2 kDa의 결과적인 크기 이동으로 관찰될 수 있다. 중요하게도, 항-FLT3L 및 항-GM-CSF 프로빙된 막에 대해 추가 밴드가 관찰되지 않았는데, 이는 P2A 및 T2A 서열에서 성공적인 리보솜 건너뛰기를 입증하며, 단일 DNA 플라스미드에서 여러 개의 별도 단백질이 발현되었음을 보여준다.
종합하면, ELISA와 웨스턴 블롯 데이터는 공동발현 요소로서 상이한 2A 펩티드들을 사용함으로써, 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛으로 구성된 무손상 이량체 단백질이 하나 이상의 다른 단백질(면역자극 화합물)과 함께 DNA 플라스미드로부터 공동발현될 수 있음을 입증한다.
실시예 5:
표 4에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 아래 표 11에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 DNA 플라스미드 VB4204를 설계 및 제조하였다.
또한, 마우스 GM-CSF(SEQ ID NO: 12) 및 마우스 GM-CSF(SEQ ID NO: 13)에 대한 천연 리더 서열의 서열을 발현벡터 pUMVC4a에 클로닝하여 DNA 플라스미드 pGM-CSF를 설계 및 제작하였다.
VB4204에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 평가
HEK293 세포는 ATCC로부터 얻어 실시예 1에 기재된 바와 같이 VB4204 또는 VB1020(비교)으로 일시적으로 형질감염시켰다.
VB4204 또는 VB1020에 의해 인코딩된 분비된 단백질을 마우스 항-인간 IgG CH3 도메인 항체(포획 항체, 100 μl/웰, 1 μg/ml, MCA878G, Bio-Rad) 및 염소 항-인간 MIP-1α 항체(비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml (R&D systems, BAF270)를 사용하여 상등액(1:10 희석)의 샌드위치 ELISA로 특징화시켰다.
VB4204의 두 번째 단백질로 인코딩된 GM-CSF의 분비는 항-마우스 GM-CSF (포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml 마우스 GM-CSF 항체, MAB415, R&D Systems) 및 염소 항-마우스 GM-CSF (비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAM215, R&D Systems)를 사용하여 세포 배양 상등액(1:1000 희석)에서 샌드위치 ELISA로 측정되었다.
도 28에 제시된 결과는 VB4204에서 인코딩된 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 형질감염된 HEK293 세포로부터 잘 발현되고 분비된다는 것을 입증한다. 또한, VB4204에서 별도의 두 번째 단백질로 인코딩된 GM-CSF도 도 29에 표시된 것처럼 높은 수준으로 발현되고 분비된다.
VB4204의 면역원성 평가(1)
VB4204, VB1020(비교) 및 VB1026(음성 대조군)의 면역원성은 C57BL/6 마우스에서 실시예 2에 기술된 바와 같이 결정되었으나, CD4+ T 세포 고갈된 비장세포 데이터는 생성되지 않았다. 그런 다음 INF-γ 생산에 대해 비장세포의 T 세포 반응을 FluoroSpot 분석으로 테스트하였다. 또한, 공동주입된 DNA 플라스미드(총 DNA 6μg) VB1020(VB4204와 동일한 폴리펩티드를 인코딩하지만 GM-CSF를 인코딩하지 않음) 및 pGM-CSF(GM-CSF를 인코딩하지만 VB4204의 폴리펩티드를 인코딩하지 않음)의 면역원성을 이 단락에 설명된 대로 결정하였다.
아래 표 12에 기술된 E6 및 E7 항원에 해당하는 펩티드를 사용하여 VB1020, VB4204, VB1026 및 (VB1020 + pGM-CSF)를 투여한 마우스에서 수확한 비장세포를 재자극하였다.
VB1020(제1 폴리펩티드만), VB4204(제1 폴리펩티드 및 GM-CSF) 및 VB1020 + pGM-CSF의 공동주입을 표 12의 펩티드에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 비교하였다. VB1026은 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 30에 나타낸 바와 같이, VB1026 투여에 대한 반응으로 어떠한 IFN-γ 생산도 검출되지 않았다.
또한, VB1020은 표 12의 펩티드에 대해 강한 T 세포 반응을 유도한 반면, VB4202는 VB1020에 비해 훨씬 더 강한 T 세포 반응을 유도하였다. 더욱이, VB4202는 또한 VB1020과 pGM-CSF의 공동주입에 의해 유도된 것보다 더 강한 T 세포 반응을 유도하였다(도 30).
VB4204의 면역원성 평가(2)
VB4204, VB1020(비교) 및 VB1026(음성 대조군)의 면역원성을 유세포 계측법법으로 측정하였다. C57BL/6 마우스를 실시예 2에 설명된 대로 처리하고, 비장세포를 그룹별로 모아 실온에서 1시간 동안 표 12에 설명된 대로 HPV16 E7(49-57) 항원에 해당하는 단일 펩티드로 재자극한 후 세포내이입을 억제하하기 위해 모넨신 및 브레펠딘을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 15시간 동안 추가로 배양하였다. 재자극 후, 유세포 계측법을 위해 세포를 수확하였다. 간략하게, 단일 세포 현탁액을 먼저 생존 염료(eFluor 780, Invitrogen)와 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 생존 염료를 PBS로 헹구었다(4℃에서 6분 동안 400 xg로 두 번 원심분리함). 이어서, 형광 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 세포를 실온에서 10분 동안 Fc 블록과 함께 인큐베이션하였다. 차단 단계 후, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 표면 마커 특이적 항체 풀(표 9)로 염색하였다. 항체를 PBS로 헹구고(4℃에서 6분 동안 400 xg로 두 번 원심분리) 세포를 고정/투과화 용액과 함께 배양하였다(4℃에서 60분). 세포를 원심분리하고 세척한 다음 투과화 완충액에 용해된 100μl 항체 혼합물에 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 염색된 세포를 BD FACSymphony A5 유세포 계측법기에서 실행하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 유세포 계측법 데이터를 분석하였다.
DNA 플라스미드 VB4202는 표 12에서 단일 펩티드 HPV16 E7(49-57)에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 비교되었다. VB1020은 비교로서 포함되었고; VB1026은 음성 대조군으로 포함되었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, VB1026 투여에 반응하여 어떠한 IFN-γ 또는 TNF-α 생성도 검출되지 않았다.
IFN-γ만 분비하는 CD8+ T 세포(CD4+ T 세포 고갈 샘플)의 수, TNF-α만 분비하는 세포, INF-γ + TNF-α 공동 분비 세포의 수는 모두 VB1020에서 VB4202로 증가하였다(도 31).
이러한 결과는 제1 폴리펩티드 및 별도의 분자로서 플라스미드로부터 공동발현되는 면역자극 화합물을 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드가, 상기 제1 폴리펩티드만을 인코딩하는 DNA 플라스미드에 비해, 그리고 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 플라스미드와 동일한 면역자극 화합물을 인코딩하는 플라스미드를 공동주입한 경우에 비해, 제1 폴리펩티드에 포함된 항원에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 증가시킬 수 있음을 가리킨다.
실시예 6:
표 4에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 아래 표 13에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 DNA 플라스미드 VB4205를 설계 및 제조하였다.
VB4205에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 평가
HEK293 세포를 ATCC로부터 구득하고 실시예 1에 설명된 대로 VB4205 또는 VB1020(비교)으로 일시적으로 형질감염시켰다. VB4205 또는 VB1020에 의해 인코딩된 분비 단백질은 마우스 항-인간 IgG CH3 도메인 항체(포획 항체, 100 μl/웰, 1 μg/ml, MCA878G, Bio-Rad) 및 염소 항-인간 MIP-1α 항체(비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml (R&D systems, BAF270)을 사용하여 상등액(1:10 희석)의 샌드위치 ELISA에 의해 특징화하였다.
VB4205의 두 번째 단백질로 인코딩된 CCL5의 분비는 래트 항-마우스 CCL5 (포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml, MAB4781, R&D Systems) 및 염소 항-마우스 CCL5 (비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAF478, R&D Systems)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 상등액(1:1000 희석)에서 측정하였다.
도 32에 제시된 결과는 VB4205에서 인코딩된 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 형질감염된 HEK293 세포로부터 잘 발현되고 분비된다는 것을 입증한다. 더욱이, 두 번째 단백질로서 VB4205에 인코딩된 CCL5는 도 33에 도시된 바와 같이 높은 수준으로 발현 및 분비된다.
VB4205의 면역원성 평가
VB4205의 면역원성을 C57BL/6 마우스에서 측정하고 실시예 5(1)에 설명된 대로 VB1020(비교) 및 VB1026(음성 대조군)의 면역원성과 비교하였다.
VB1020(제1 폴리펩티드만) 및 VB4205(제1 폴리펩티드 및 CCL5)를 표 12의 펩티드에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 비교하였다.
도 34에 나타낸 바와 같이, VB1026 투여에 대한 반응으로 어떠한 IFN-γ 생성도 검출되지 않았다. VB1020은 표 12의 펩티드에 대해 강한 T 세포 반응을 유도한 반면, VB4205는 VB1020에 비해 훨씬 더 강한 T 세포 반응을 유도하였다.
또한 이들 결과는 제1 폴리펩티드와 별도의 분자로서 플라스미드로부터 공동발현되는 면역자극 화합물을 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드가 상기 제1 폴리펩티드만을 인코딩하는 DNA 플라스미드에 비해, 제1 폴리펩티드에 포함된 항원에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 증가시킬 수 있음을 가리킨다.
실시예 7:
표 14에 열거된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드 VB1026, VB4208, VB4194, VB4202 및 pGM-CSF를 본원에 기술된 바와 같이 설계하고 생산하였다:
DNA 플라스미드는 다음 단백질을 암호화한다.
● VB4202는 위에서 설명한 제1 폴리펩티드와 면역자극 화합물 mGM-CSF를 별도의 분자로 인코딩하고 공동발현을 허용한다.
● VB4194: CT26 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드만을 인코딩하고 면역자극 화합물은 인코딩하지 않으며 비교용으로 사용된다.
● VB1026: VB4194에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드와 동일하지만 유닛 링커나 항원 유닛을 포함하지 않는 SEQ ID NO: 1의 1-237의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 이는 음성 대조군 역할을 한다.
● VB4208(SEQ ID NO: 24): 항원 유닛을 포함하지 않는, 즉 어떠한 CT26 에피토프도 인코딩하지 않는 제1 폴리펩티드 및 mGM-CSF를 별도의 분자로 인코딩한다. 이는 음성 대조군 역할을 한다.
● pGM-CSF: mGM-CSF를 인코딩하고 비교 역할을 한다.
CT26 종양에 감염된 마우스의 치료
VB4202의 항종양 효능을 CT26 종양 공격으로 평가하였다. VB4202를 VB4202와 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 VB4194와 비교하였다. 또한, VB4202의 항종양 효능을 VB4194와 pGM-CSF의 동시주입과 비교하였다. VB1026 및 VB4208은 음성 대조군으로 포함되었다.
각각의 그룹 A-F에는 8 마리의 BALB/c 마우스가 포함되어 있으며, 제0일에 이들 마우스의 왼쪽 다리에 CT26 종양 세포가 1x105개의 접종되었다. 제4일과 11일에, 표 15에 기술된 DNA 플라스미드와 각각의 양을 마우스의 오른쪽 다리에 근육내 투여하였다. VB4194와 pGM-CSF 플라스미드 사이의 플라스미드 크기 차이로 인해 두 번째 공동주입 그룹(그룹 F)이 포함되었으며, 여기서 각 플라스미드의 양은 비슷한 단백질 수준이 발현되도록 그룹 D(표 16)의 단일 플라스미드 주입에 대한 플라스미드 카피 수와 일치하도록 조정되었다.
종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 측정되었다. 종양은 길이와 너비의 2차원으로 측정되었으며 높이는 너비와 동일하게 설정되었다. 종양 부피는 다음 공식으로 계산되었다. 종양 부피 = 길이(mm) x 너비(mm) x 높이(mm)/2000. 치료는 제32일에 종료되었다.
VB4194(그룹 C), VB4202(그룹 D) 및 VB4194 및 pGM-CSF의 동시주입(그룹 E 및 F)으로 처리된 그룹의 종양은 VB1026 및 VB4208 음성 대조군(각각 그룹 A와 B)에 비해 느리게 성장하였다.
VB4194와 동일한 제1 폴리펩티드 및 GM-CSF를 공동발현하는 VB4202(그룹 D)의 투여는, VB4194 단독(그룹 C)에 비해 종양 성장 속도가 감소되는 결과를 가져왔다. 더욱이, VB4202의 투여는 VB4194 및 pGM-CSF를 총 10μg(E)으로 투여하거나 유사한 카피 수(F)로 조정한 두 공동주입 그룹과 비교하여, 감소된 종양 성장 속도를 초래하였다. 이러한 공동주입은 VB4194 단독 투여와 유사한 종양 성장 속도를 가져왔다.
이들 결과(도 35에 나타냄)는 VB4194에 의해 제공되는 종양 성장 억제 효능이 VB4194와 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 VB4202로부터의 GM-CSF의 공동발현에 의해 추가로 증가되었음을 보여준다. 종양 성장 억제는 도 36에 도시된 바와 같이 다른 그룹과 비교하여 VB4202 처리된 동물에서 증가된 생존율을 동반하였다. 항종양 효능은 VB4202를 음성 대조군 VB1026 및 VB4208과 비교함으로써 나타난 바와 같이 항원 특이적 면역 반응에 의해 주도되었다. 더욱이, VB4202는 VB4194와 pGM-CSF를 두 개의 별도 플라스미드로 공동주입할 때 관찰된 것보다 더 강력한 항종양 효능을 제공하였다.
실시예 8:
표 4에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 아래 표 17에 나열된 요소/유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 DNA 플라스미드 TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023을 설계 및 제조하였다.
DNA 플라스미드 TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023은 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD) 항원을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
이들 DNA 플라스미드 각각은 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명에 따른 DNA 플라스미드의 모델, 즉, 병원체로부터 유래된 항원(여기서는 SARS-CoV-2로부터 유래된 항원)을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 모델이다.
DNA 플라스미드 TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023은 위에서 설명한 제1 폴리펩티드와 다음의 면역자극 화합물(들)을 별도의 분자로 공동발현할 수 있도록 한다.
● VB2060: 제1 폴리펩티드만 암호화하고 면역자극 화합물은 암호화하지 않으며 비교용으로 사용된다.
● TECH001-CV021: mGM-CSF
● TECH001-CV022: mIL-12
● TECH001-CV023: mIL-21
IL12는 IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)라는 두 개의 개별 유전자에 의해 인코딩되는 이종이량체 사이토카인이다. 활성 이종이량체(p70이라고 함)와 p40의 동종이량체는 단백질 합성 후에 형성된다.
DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비 평가
간략하게 설명하면, Expi293F 세포(2x106 세포/ml, 1ml)를 96웰 배양 플레이트에 접종하였다. 엑스피펙타민 293 Reagent(Thermo Fisher Sci.)를 사용하여 세포를 0.64μg/ml 플라스미드 DNA로 형질감염시키고, 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터(8% CO2, 37°C) 내 오비탈 진탕기(직경 3mm, 900rpm)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 72시간 동안 배양한 후 상등액을 수집하였다.
상등액(1:1500으로 희석)에서 분비된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질을 마우스 항-인간 IgG CH3 도메인 항체(포획 항체, 100 μl/웰, 1 μg/ml, MCA878G, Bio-Rad) 및 염소 항-인간 MIP-1α 항체(비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAF270, R&D systems)를 사용하여 샌드위치 ELISA로 특징화하였다 (도 37).
상등액 중 면역자극 화합물 GM-CSF, IL-12 및 IL-21의 단백질 발현 및 분비는 각각 항-마우스 GM-CSF Abs (래트 항-마우스 GM-CSF 포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml 마우스 GM-CSF 항체, MAB415, R&D Systems; 염소 항-마우스 GM-CSF 비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml, BAM215, R&D Systems) (도 38a), 항-마우스 IL-12 Abs (rat 항-마우스 IL-12 포획 항체, 100 μl/웰, 1.0 μg/ml, MAB419 R&D systems; 염소 항-마우스 IL-12 비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.4 μg/ml, BAF419, R&D systems) (도 38b), and 항-마우스 IL-21 Abs (염소 항-마우스 IL-21 포획 항체, 100 μl/웰, 0.1 μg/ml, AF594, R&D systems; 염소 항-마우스 IL-21 비오티닐화된 검출 항체, 100 μl/웰, 0.4 μg/ml, BAF594, R&D systems)(도 38c)를 이용하여 샌드위치 ELISA(각각 도 38a, 38b 및 38c)로 측정하였다,
도 37에 제시된 결과는 TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023에서 인코딩된 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 형질감염된 Expi293F 세포에서 발현되고 분비되었음을 입증한다. TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023에서 각각 두 번째 단백질로 인코딩된 GM-CSF, IL-12 및 IL-21 역시도 도 38a-c에 도시된 바와 같이 높은 수준으로 발현 및 분비 되었다.
TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023 에서 발현된 무손상 단백질의 특성 분석
TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023에 의해 인코딩된 단백질을 추가로 특징화하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액 샘플에 대해 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 수행하였다. 앞서 언급한 DNA 플라스미드와 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 VB2060이 비교 대상으로 포함되었다.
샘플은 환원 및 비환원 조건을 위해 각각 5μl DTT(Thermo Fisher Sci.) 또는 5μl 초순수와 함께 25μl 4x Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)과 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액 70μl를 혼합하여 준비되었다.
샘플(환원 또는 비환원)을 70℃에서 10분간 가열한 후 레인 당 20μL를 4%~20% Criterion TGX Stain-Free 프리캐스트 젤(Bio-Rad)에 추가하였다. SDS-PAGE는 Precision Plus Protein All Blue Prestained and Unstained 단백질 표준품(Bio-Rad)을 사용하여 1x Tris/Glycine/SDS 실행 완충액(Bio-Rad)에서 수행되었다. Tran-Blot Turbo 반건식 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 단백질을 겔에서 EtOH 활성화 저형광(LF) 0.45μm PVDF 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. PVDF 막을 EveryBlot 완충액(Bio-Rad)에서 5분간 차단하고 염소 항-마우스 IL-12 (BAF419, R&D Systems), or goat anti-mouse IL-21 (BAF594, R&D Systems)로 프로빙하여, 각각 제1 폴리펩티드인 GM-CSF, IL-12 및 IL-21을 검출한다. 막을 세척하고 형광색소가 결합된 항-염소 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 후 세척하고 건조시켰다(에탄올로 헹구었다). ChemiDoc™ MP 이미징 시스템(Dylight 650 및 800, 자동 최적 설정)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 엑스피펙타민 처리된 세포(형질감염 대조)를 각 겔의 음성 대조로 포함시켰다.
WB 분석으로 ELISA 결과가 확인되었으며, 무손상 제1 폴리펩티드가 4개의 DNA 플라스미드 TECH001-CV021, TECH001-CV022, TECH001-CV023 및 VB2060 모두에서 발현되었음을 입증하였다(도 39). TECH001-CV021은 GM-CSF를 추가로 발현(이종 글리코실화)하였다(도 40). 도 41은 환원(왼쪽 패널) 및 비환원(오른쪽 패널) 조건에서 염소 항-마우스 IL-12로 프로빙된 TECH001-CV022의 WB 분석을 보여준다. TECH001-CV022는 제1 폴리펩티드 발현 외에도 글리코실화된 IL-12B(p40) 및 IL-12A(p35)를 발현하였다(도 41, 왼쪽 패널). 이전 연구에서는 생리활성 IL-12(p70 이종이량체)를 분비하는 세포가 유리 형태의 p40(단량체)도 분비한다고 보고하였다(Jalah et al., J Biol Chem Vol 288, No.9, 6763-6776, 2013). 실제로, IL-12 p70 이종이량체 및 p40 단량체 모두에 대한 밴드가 비환원 조건 하에서 검출되었다(도 41, 오른쪽 패널). 제1 폴리펩티드 외에도 TECH001-CV023은 IL-21을 발현하였다(도 42). 중요한 것은 항-GM-CSF, 항-IL-12 및 항-IL-21 프로빙된 막에 대해 추가 밴드가 관찰되지 않았다는 것으로, 이는 T2A 서열에서 성공적인 리보솜 건너뛰기를 입증하며 단일 DNA 플라스미드에서 여러 개의 별도 단백질이 발현되었음을 보여준다.
종합하면, ELISA 및 웨스턴 블롯 데이터는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 무손상 제1 폴리펩티드가, 공동발현 요소로서 동일한 2A 펩티드를 사용함으로써 하나 이상의 면역자극 화합물과 함께 DNA 플라스미드로부터 공동발현될 수 있음을 입증한다.
TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023의 면역원성 평가
TECH001-CV021, TECH001-CV022 및 TECH001-CV023의 면역원성을 결정하고 VB2060 및 VB1026(음성 대조군)의 면역원성과 비교하였다.
6주령 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier Labs(프랑스)으로부터 입수하였다. 모든 동물은 오슬로 대학교(노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 노르웨이 식품 안전청(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. TECH001-CV021, TECH001-CV022, TECH001-CV023 및 VB2060의 테스트에는 그룹당 5마리의 마우스가 사용되었으며, 음성 대조군에는 그룹당 3마리의 마우스가 사용되었다.
1μg DNA 플라스미드의 최종 용량을 각 경골근에 근육내 바늘 주사(2 x 25μl, 20μg/ml)로 투여한 후 AgilePulse 생체내 전기천공 시스템(BTX, USA)을 사용하여 전기천공하였다.
SARS-CoV-2 RBD에 대해 마우스에서 유도된 체액성 면역 반응의 평가.
DNA 플라스미드가 투여된 쥐의 혈청을 투여 후 13일에 수집하여 RBD 단백질(Wuhan 변이체)에 결합하는 항-RBD IgG 항체에 대해 테스트하였다.
간략하게, 백신접종된 마우스의 복재 정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 응고된 혈액을 2회(1000g, 15분) 원심분리한 후 혈청을 모아 깨끗한 튜브에 옮겼다. 체액성 면역 반응은 SARS-CoV2(우한 변종)의 RBD(aa319-542)에 결합하는 혈청에서 총 IgG를 검출하는 ELISA 분석을 통해 평가되었다. ELISA 플레이트(MaxiSorp Nunc-Immuno 플레이트)를 PBS 중 1μg/ml 재조합 RBD-His 단백질 항원으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 4% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 그런 다음 플레이트를 마우스 혈청의 연속 희석액(PBS 중 0.1% BSA로 희석)과 함께 하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하고 PBS 중 0.1% BSA에 1:50,000으로 희석한 항-마우스 총 IgG-HRP 항체(Southern Biotech)와 함께 인큐베이션하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, TMB 기질(Merck, 카탈로그 CL07-1000)을 사용하여 플레이트를 현상하였다. SPARK® Multimode Microplate Reader(Tecan)를 사용하여 30분 이내에 450 nm 파장에서 플레이트를 판독하였다. 결합 항체 종점 역가는 컷오프 이상의 신호를 초래하는 최고 희석의 역수로 계산되었다. 테스트된 결합 항원에는 SARS-CoV-2 항원: RBD(Sino Biological 40592-V08H; (SEQ ID NO: 30))가 포함되었다.
도 43에 표시된 결과는 항원 유닛에 SARS-CoV-2(우한 변종)의 RBD(aa 319-542)와 각각 GM-CSF 및 IL-21을 두 번째 단백질로서 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 TECH001-CV021 및 TECH001-CV023이, 전술한 제1 폴리펩티드만을 인코딩하는 비교 VB2060보다 RBD에 대해 더 강한 전체 IgG 반응을 유도하였음을 입증한다(Mann-Whitney 테스트, TECH001-CV021: P = 0.008, TECH001-CV023: P = 0.047). 또한, 앞서 언급한 제1 폴리펩티드와 IL-12의 두 하위 도메인을 두 번째 및 세 번째 단백질로 인코딩하는 TECH001-CV022도 비교용 VB2060보다 RBD에 대해 더 강한 IgG 반응을 유도하였다(Mann-Whitney 테스트, P = 0.047).
SARS-CoV-2 RBD에 대해 유도된 T 세포 반응 평가
DNA 플라스미드를 투여한 쥐의 비장을 투여 후 14일째에 채취하고 세포 여과기에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 적혈구는 염화암모늄-칼륨(ACK) 용해 완충액을 사용하여 용해되었다. NucleoCounter NC-202(ChemoMetec, 덴마크)를 사용하여 비장세포를 계수하고 최종 농도가 6x106 세포/ml가 되도록 재현탁시켰다. 테스트한 각 플라스미드에 대해 단일 세포 현탁액의 일부를 사용하여 Dynabeads™ 항CD4 비드를 사용하여 CD4+ T 세포를 고갈시켰다. 이어서 전체 비장세포 및 CD4+ T 세포 고갈된 비장세포를 6x105 세포/웰을 접종하고 22.5시간 동안 2μg/ml RBD 펩티드 풀(표 18)로 재자극함으로써 FluoroSpot 분석에서 INF-γ 생산에 대해 테스트하였다. RBD 펩티드 풀은 RBD 영역에 걸쳐 12개의 아미노산이 중첩되는 15량체 펩티드로 구성되었다.
도 44에 표시된 결과는 항원 유닛에 SARS-CoV-2(우한 변종)의 RBD(aa 319-542) 및 두 번째 단백질로서 각각 GM-CSF 및 IL-21을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 TECH001-CV021 및 TECH001-CV023이, 전술한 제1 폴리펩티드만을 인코딩하는 비교 VB2060보다 RBD에 대해 훨씬 더 강한 전체 T 세포 반응(도 44A)을 유도하였음을 보여준다. 더욱이, TECH001-CV021 및 TECH001-CV023은 VB2060에 비해 더 강한 CD8+ T 세포 반응(CD4+ 고갈된 비장세포 분획)을 유도하였다(도 44B). 앞서 언급한 제1 폴리펩티드와 두 번째 및 세 번째 단백질로서 IL-12의 두 하위 도메인을 인코딩하는 TECH001-CV022 역시도 VB2060보다 RBD에 대해 훨씬 더 강한 전체 T 세포 반응을 유도하였다(도 44A). IL-12 사이토카인의 첨가에 의해 유도된 증가된 T 세포 반응은 CD4+ T 세포로부터 IFN-γ 분비의 증가에 주로 기인하는 것으로 보이는데, 이는 TECH001-CV021 및 TECH001-CV023 처리 그룹과 비교하여, TECH001-CV022 CD4+ T 세포 고갈 샘플에서 반응의 더 큰 감소가 관찰되었기 때문이다(도 44B).
종합하면, 제시된 결과는 SARS-CoV-2 RBD에 대해 마우스에서 유도된 체액성 및 세포성 면역 반응이 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 감염성 항원(병원체 SARS-CoV-2로부터 유래된 RBD) 및 면역자극 화합물(GM-CSF, IL-12 또는 IL-21)을 포함하는 항원 유닛으로 구성된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질을 공동발현함으로써 앞서 언급한 제1 폴리펩티드/이량체 단백질 단독의 발현과 비교하여, 강화되었음을 입증한다.
구현예
1. (a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 그의 일부, 예를 들어 하나 이상의 질병 관련 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛인 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터로서, 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현하는 것을 허용하는 것인, 벡터.
2. 구현예 1에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 수지상 세포, 대식세포, 랑게르한스 세포, B 세포 및 호중구를 비롯한 항원-제시 세포에 영향을 미치는 화합물, 예를 들어 항원-제시 세포를 자극하는 화합물이고, 좋기로는 여기서 하나 이상의 면역자극 화합물은 인간 수지상 세포, 인간 대식세포, 인간 랑게르한스 세포, 인간 B 세포 및 인간 호중구를 비롯한 인간 항원-제시 세포에 영향을 미치는 화합물인, 벡터.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 유인 및/또는 활성화 및/또는 성숙 및/또는 증식, 예를 들어 성장 및/또는 확장을 촉진하는, 벡터.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 유인을 촉진하는, 벡터.
5. 구현예 4에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 케모카인, 좋기로는 인간 케모카인인, 벡터.
6. 구현예 5에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8 및 XCR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hCCR1, hCCR3, hCCR4, hCCR5, hCCR6, hCCR7, hCCR8 및 hXCR1로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
7. 구현예 5 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 이소형을 포함한 대식세포 염증성 단백질 알파, 예컨대 마우스 CCL3, 인간 CCL3, 인간 CCL3L1, 인간 CCL3L2 및 인간 CCL3L3, CCL4, preferably hCCL4, CCL5, 좋기로는 hCCL5, CCL19, 좋기로는 hCCL19, CCL20, 좋기로는 hCCL20, CCL21, 좋기로는 hCCL21, XCL1, 좋기로는 hXCL1 및 XCL2, 좋기로는 hXCL2로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 벡터.
8.구현예 3 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 활성화 및/또는 성숙을 촉진하는, 벡터.
9. 구현예 3 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 CD40(분화 클러스터 40), CD137(4-1BB), CD27, RANK 및 ICOS(CD278)을 포함하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 인간 CD40, hCD137, hCD27, hRANK 및 hICOS를 포함하는 인간 TNF 수용체 수퍼패밀리의 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원-제시 세포의 표면 분자와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
10. 구현예 9에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 CD40L, CD137L, CD70, RANKL 및 ICOSL로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hCD40L, hCD137L, hCD70, hRANKL 및 hICOSL로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인, 벡터.
11. 구현예 3 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 IL-2, IL-10, IL-12, IL-21, TNFα, IFNγ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인이고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hIL-2, hIL-10, hIL-12, hIL-21, hTNFα, hIFNγ 및 hIL-1β로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 사이토카인인, 벡터.
12. 구현예 3 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 MyD88 또는 TRIF와 같은 바이러스 감염 센서, 좋기로는 인간 MyD88 또는 인간 TRIF와 같은 인간 바이러스 감염 센서인, 벡터.
13. 구현예 3 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 TLR2, TLR4, TLR5 및 TLR9을 비롯한 Tol-유사 수용체와 같은 항원-제시 세포 상의 패턴-인식 수용체 및/또는 RAGE, TIM-3, FPR, SREC1, LOX1 및 CD91로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-제시 세포의 수용체와 상호작용할 수 있고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hTLR2, hTLR4, hTLR5 및 hTLR9을 비롯한 인간 Tol-유사 수용체와 같은 인간 항원-제시 세포 상의 패턴-인식 수용체 및/또는 hRAGE, hTIM-3, hFPR, hSREC1, hLOX1 및 hCD91로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원-제시 세포의 수용체와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
14. 구현예 13에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은
플라겔린과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), HMGB1과 같은 단백질 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 열충격 단백질(HSP), 칼렉티쿨린 및 아넥신 A1으로 구성된 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 면역자극 화합물은 인간 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), 인간 단백질 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 예를 들어 인간 HMGB1, 인간 열충격 단백질(HSP), 인간 칼렉티쿨린 및 인간 아넥신 A1으로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 벡터.
15. 구현예 3 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 성장 및/또는 확장을 촉진하는, 벡터.
16. 구현예 3 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 성장 인자, 좋기로는 인간 성장 인자인, 벡터.
17. 구현예 3 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 GM-CSF-수용체, FLT-3R, IL-15R 및 IL-4R로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hGM-CSF-수용체, hFLT-3R, hIL-15R 및 hIL-4R로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원-제시 세포의 표면 분자와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
18. 구현예 16 또는 17에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 GM-CSF, FLT-3L, IL-15 및 IL-4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hGM-CSF, hFLT-3L, hIL-15 및 hIL-4로 이루어진 군에서 선택되는, 벡터.
19. 구현예 3 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 IL-4, IL-1β, IFNγ, IFNα, IL-15, TNFα, IL-10, IL-12, IL-21, IL-2, MyD88, TRIF, RIG-I, MDA-5, C3d의 P28 영역, IL-13, IFNε, IFNκ, IFNΩ, IFNβ 및 IL-6으로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hIL-4, hIL-1β, hIFNγ, hIFNα,h IL-15, hTNFα, hIL-10, hIL-12, hIL-21, hIL-2, hMyD88, hTRIF, hRIG-I, hMDA-5, hC3d의 P28 영역, hIL-13, hIFNε, hIFNκ, hIFNΩ, hIFNβ 및 hIL-6으로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 벡터.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 다수의 면역자극 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 면역자극 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 서로 다른 면역자극 화합물을 인코딩하는 다수의 추가 핵산 서열을 포함하는, 벡터
21. 구현예 20에 있어서, 상기 다수의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포에 상이하게 영향을 미치는, 예를 들어 상이하게 자극하는 상이한 면역자극 화합물인, 벡터.
22. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 하나 이상의 공동발현 요소를 포함하는, 벡터.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 단일 전사체 상에 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물의 전사 및 별도의 제1 폴리펩티드 및 별도의 하나 이상의 면역자극 화합물로의 독립적인 번역을 유발하는 것인, 벡터.
24. 구현예 22 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 공동발현 요소는 IRES 요소 또는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열인, 벡터.
25. 구현예 22 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 IRES 요소 또는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 IRES 요소 및 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열인 1개 초과의 공동발현 요소를 포함하는 벡터.
26. 구현예 22 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 2A 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드 및 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
27. 구현예 22 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 T2A 펩티드, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 P2A 펩티드, SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 E2A 펩티드 및 SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
28. 구현예 22 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 T2A 펩티드, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 P2A 펩티드, SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는 E2A 펩티드 및 SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 갖는 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
29. 구현예 23에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물의 전사를 별도의 전사체로서 유발하는, 벡터.
30. 구현예 29에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 양방향 프로모터인, 벡터.
31. 구현예 29에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 프로모터이고, 벡터는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산 서열 각각에 대해 별도의 프로모터를 포함하는, 벡터.
32. 구현예 29에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 양방향 프로모터 및 프로모터인, 벡터.
33. 구현예 23 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 IRES 요소, 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 양방향 프로모터 및 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동발현 요소를 포함하는, 벡터.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부를 포함하는, 벡터.
35. 구현예 34에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 네오항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
36. 구현예 35에 있어서, 상기 부분은 네오에피토프인, 벡터.
37. 구현예 36에 있어서, 항원 유닛은 여러 개의 네오에피토프, 예컨대 링커에 의해 서로 분리되어 있는 여러 개의 네오에피토프를 포함하는, 벡터.
38. 구현예 36 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 n-1개의 항원성 서브유닛을 포함하고, 각 서브유닛은 네오에피토프 및 서브유닛 링커, 및 말단 네오에피토프를 포함하고, 여기서 n은 상기 항원 유닛에서 네오에피토프의 수이며, n은 1 내지 50의 정수인, 벡터.
39. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 네오에피토프의 길이는 7 내지 30개 아미노산, 예를 들어 7 내지 10개 아미노산(예컨대 7, 8, 9 또는 10개 아미노산) 또는 13~30개 아미노산(예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산), 예컨대 7개, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산인, 벡터.
40. 구현예 34 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부를 추가로 포함하는, 벡터.
41. 구현예 40에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분을 추가로 포함하는, 벡터.
42. 구현예 41에 있어서, 상기 부분은 에피토프인, 벡터.
43. 구현예 40 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 암 에피토프를 추가로 포함하는, 벡터.
44. 구현예 40 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 환자-존재 공유 암 항원은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질, 암 고환 항원, 분화 항원, 바이러스 항원, 돌연변이된 종양유전자, 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유 인트론 보유 항원, 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이스좀 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
45. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 그의 일부를 포함하는, 벡터.
46. 구현예 45에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 부분은 에피토프인, 벡터.
48. 구현예 47에 있어서, 항원 유닛은 여러 에피토프를 포함하는, 벡터.
49. 구현예 45 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 환자-존재 공유 암 항원은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질, 암 고환 항원, 분화 항원, 바이러스 항원, 돌연변이된 종양유전자, 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유 인트론 보유 항원, 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이스좀 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
50. 구현예 1-33 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 공유 암 항원 또는 이의 일부를 포함하는, 벡터.
51. 구현예 50에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 공유 암 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
52. 구현예 51에 있어서, 상기 부분이 에피토프인, 벡터.
53. 구현예 52에 있어서, 항원 유닛은 여러 에피토프를 포함하는, 벡터.
54. 구현예 50 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 공유 암 항원은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질, 암 고환 항원, 분화 항원, 바이러스 항원, 돌연변이된 종양 유전자, 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유 인트론 보유 항원, 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이세오좀 돌연변이로 인한 공유 항원, 골수종 또는 림프종에 의해 생성된 모노클로날 Ig에서 유래된 scFv, 텔로머라제, HIV 항원, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질(TRP)-1, TRP-2, 흑색종 항원, 전립선 특이 항원 및 HPV 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
55. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원 또는 이의 일부를 포함하는, 벡터.
56. 구현예 55에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이러한 전장 감염성 항원의 하나 이상의 부분 또는 하나 이상의 전장 감염성 항원 및 이러한 전장 감염성 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
57. 구현예 55 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
58. 구현예 57에 있어서, 이러한 부분은 B 세포 에피토프이고, 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원으로부터의 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
59. 구현예 57에 있어서, 이러한 부분은 T 세포 에피토프이고, 항원 유닛은 하나 이상의 감염성 항원으로부터의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
60. 구현예 55 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이러한 항원의 하나 이상의 부분 및 (ii) 하나 이상의 감염성 항원으로부터의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
61. 구현예 60에 있어서, 항원 유닛은 만일 2 이상의 T 세포 에피토프가 서브유닛에 포함되어 있는 경우 서브유닛 링커에 의해 서로 분리된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 서브유닛을 포함하고; 서브유닛은 유닛 링커와 같은 제1 링커에 의해 다량체화 유닛에 연결되고, 제2 링커에 의해 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이러한 항원의 부분으로부터 분리되는 것인, 벡터.
62. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 그러한 항원의 일부를 포함하는, 벡터.
63. 구현예 62에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 전장 항원, 또는 이러한 전장 항원의 하나 이상의 부분, 또는 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 전장 항원, 및 이 전장 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
64. 구현예 62 내지 63 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
65. 구현예 64에 있어서, 이러한 부분은 B 세포 에피토프이고, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
66. 구현예 64에 있어서, 이러한 부분은 T 세포 에피토프이고, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
67. 구현예 내지 62 내지 63 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 전장 항원 또는 이러한 항원의 하나 이상의 부분 및 (ii) 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
68. 구현예 67에 있어서, 항원 유닛은 만일 2 이상의 T 세포 에피토프가 서브유닛에 포함되어 있는 경우, 서브유닛 링커에 의해 서로 분리되어 있는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 서브유닛을 포함하고; 여기서 서브유닛은 유닛 링커와 같은 제1 링커에 의해 다량체화 유닛에 연결되고, 제2 링커에 의해 하나 이상의 전장 감염성 항원 또는 이러한 항원의 부분으로부터 분리되는 것인, 벡터.
69. 구현예 62 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 병원체가 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
70. 구현예 55 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 항원이 결핵 항원, OMP31과 같은 브루셀라증 항원, gp120 유래 서열과 같은 HIV 항원, 당단백질 D와 같은 HSV-2 항원, 헤마글루티닌, 핵단백질 및 M2와 같은 인플루엔자 바이러스 항원, E1, E2, E6, E7, L1 또는 L2와 같은 HPV 항원, 예를 들어 HPV16 또는 HPV18의 E6 및 E7, CMV 항원, HBV 항원, 베타코로나바이러스 항원, 예를 들어 SARS-CoV 항원, MERS-CoV 항원 및 SARS-CoV-2 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 베터.
71. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 최대 3500개 아미노산, 예컨대 약 21 내지 약 2000개 아미노산 또는 약 60 내지 3500개 아미노산, 예컨대 약 80 또는 약 100개 또는 약 150 아미노산 내지 약 3000개 아미노산, 예컨대 약 200 내지 약 2500개 아미노산, 예컨대 약 300 내지 약 2000개 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500개 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000개 아미노산을 포함하는, 벡터.
72. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 표적화 유닛은 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하고, 좋기로는 표적화 유닛은 인간 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는, 벡터.
73. 구현예 72에 있어서, 표면 분자는 MHC, CD14, CD40, CLEC9A, 케모카인 수용체, 예컨대 CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8 및 XCR1 및 Toll-유사 수용체, 예컨대 TLR-2, TLR-4 또는 TLR-5로 이루어진 군으로부터 선택되고, 좋기로는 표면 분자는 HLA; hCD14, hCD40, hCLEC9A, 인간 케모카인 수용체, 예컨대 hCCR1, hCCR3, hCCR4, hCCR5, hCCR6, hCCR7, hCCR8 및 hXCR1, 및 Toll 유사 수용체, 예컨대 hTLR-2, hTLR-4 또는 hTLR-5로이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
74. 구현예 72 및 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 표적화 유닛은 가용성 CD40 리간드, 좋기로는 인간 가용성 CD40 리간드, CCL4 및 그의 이소형, 좋기로는 인간 CCL4 및 그의 이소형, CCL5, 좋기로는 인간 CCL5, CCL19, 좋기로는 인간 CCL19, CCL20, 좋기로는 인간 CCL20, CCL21, 좋기로는 인간 CCL21, 그의 이소형을 포함하여 대식세포 염증성 단백질 알파, 예컨대 마우스 CCL3, 인간 CCL3, 인간 CCL3L1, 인간 CCL3L2 및 인간 CCL3L3, XCL1, 좋기로는 인간 XCL1, XCL2, 좋기로는 인간 XCL2, 플라겔린, 항-HLA-DP, 항-HLA-DR, 항-범 HLA 클래스 II, 항-CD40, 좋기로는 항-인간 CD40, 항-TLR-2, 좋기로는 항-인간 TLR-2, 항-TLR-4, 좋기로는 항-인간 TLR-4, 항-TLR-5, 좋기로는 항-인간 TLR-5 또는 항-CLEC9A, 좋기로는 항-인간 CLEC9A를 포함하거나 이로 이루어지는, 벡터.
75. 구현예 74에 있어서, 표적화 유닛은 인간 MIP-1α(LD78β, CCL3L1)를 포함하거나 이로 이루어지는, 벡터.
76. 구현예 75에 있어서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 26-93을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 28-93을 포함하는, 벡터.
77. 구현예 76에 있어서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 26-93을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 28-93로 이루어진 것인, 벡터.
78. 구현예 77에 있어서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93으로 구성되는 것인, 벡터.
79. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 다량체화 유닛은 이량체화 유닛, 삼량체화 유닛, 예컨대 콜라겐 유래 삼량체화 유닛, 예컨대 인간 콜라겐 유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인 또는 T4 피브리틴의 C-말단 도메인 및 사량체화 유닛, 예컨대 p53으로부터 유래된 도메인이고, 여기서 상기 다량체화 유닛은 선택적으로 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4와 같은 힌지 영역을 포함하는, 벡터.
80. 구현예 79에 있어서, 벡터는 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 힌지 영역을 포함하는, 벡터.
81. 구현예 79 내지 80 중 어느 한 구현예에 있어서, 힌지 영역이 Ig 유래된 것인, 벡터.
82. 구현예 79 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 다량체화 유닛이 이량체화 유닛이고, 상기 이량체화 유닛이 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 추가로 포함하는, 벡터.
83. 구현예 82에 있어서, 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 좋기로는 면역글로불린 불변 도메인인, 벡터.
84. 구현예 82 내지 83 중 어느 한 구현예에 있어서, 다른 도메인은 IgG, 좋기로는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인인, 벡터.
85. 구현예 82 내지 구현예 84 중 어느 한 구현예에 있어서, 이량체화 유닛이 GGGSSGGGSG(SEQ ID NO: 134)와 같은 글리신-세린 풍부 링커와 같은 이량체화 유닛 링커를 추가로 포함하는, 벡터.
86. 구현예 85에 있어서, 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 것인, 벡터.
87. 구현예 82 내지 86 중 어느 한 구현예에 있어서, 이량체화 유닛이 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함하는, 벡터.
88. 구현예 87에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 벡터.
89. 구현예 88에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 벡터.
90. 구현예 88에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 94-237로 이루어진 것인, 벡터.
91. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 핵산 서열은 항원 유닛을 다량체화 유닛에 연결하는 유닛 링커를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 상기 유닛 링커는 비면역원성 링커이고/이거나는 유연하거나 견고한 링커인, 벡터.
92. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 핵산 서열은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 좋기로는 신호 펩티드는 표적화 유닛인 단백질의 천연 리더 서열인, 벡터.
93. 구현예 92에 있어서, 신호 펩티드는 Ig VH 신호 펩티드, 인간 TPA 신호 펩티드 및 인간 MIP-1α 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
94. 구현예 92 내지 93 중 어느 한 구현예에 있어서, 표적화 유닛은 인간 MIP-1α 이고, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 벡터.
95. 구현예 94에 있어서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 벡터.
96. 구현예 95에 있어서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23으로 이루어진 것인, 벡터.
97. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가 핵산 서열은 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는, 벡터.
98. 구현예 97에 있어서, 신호 펩티드는 면역자극 화합물(들)의 천연 리더 서열인, 벡터.
99. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 RNA 바이러스 벡터 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 RNA 플라스미드 또는 DNA 플라스미드와 같은 플라스미드인, 벡터.
100. 구현예 1 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된 바와 같은 벡터를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 시험관내에서 세포를 벡터로 형질감염시키는 단계;
b) 상기 세포를 배양하는 단계;
c) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계; 및
d) 벡터를 수집하고 선택적으로 정제하는 단계
를 포함하는, 방법.
101. 구현예 1 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 동물 또는 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
102. 약제로서 사용하기 위한 것인, 구현예 1 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된, 벡터.
103. 구현예 1 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
104. 구현예 103에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수, 예를 들어 PBS, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 등장성 수성 완충액 및 티로드 완충액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
105. 구현예 103 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 형질감염제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
106. 구현예 103 내지 105 중 어느 한 구현예에 있어서, 조성물은 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리프로필렌 옥사이드의 블록을 포함하는 약학적으로 허용되는 양친매성 블록 공중합체를 추가로 포함하고, 예를 들어 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리프로필렌 옥사이드의 블록을 0.2% w/v 내지 20% w/v의 양으로 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
107. 구현예 103 내지 106 중 어느 한 구현예에 있어서, 조성물은 상기 벡터, 예를 들어 상기 DNA 플라스미드를 0.1 내지 10 mg 범위로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
108. 질병을 앓고 있거나 상기 질병의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 구현예 1 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터 또는 구현예 103 내지 108 중 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
109. 구현예 108에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되는, 방법.
110. 구현예 108 내지 109 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
111. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 54 및 71 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 구현예 103 내지 107 중 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
112. 구현예 111에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료 유효량으로 투여되는, 방법.
113. 구현예 111 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
114. 구현예 111 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 액상암 또는 고형암, 예컨대 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 골암, 대장암, 위암, 림프종, 악성 흑색종, 간암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 담도암, 뇌암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 호지킨병 및 부신피질암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인, 방법.
115. 감염성 질환을 앓고 있거나 감염성 질환의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 33, 55 내지 70 및 71 내지 99 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터, 또는 구현예 103 내지 107 중 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
116. 구현예 115에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되는, 방법.
117. 구현예 116 내지 116 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Nykode Therapeutics AS <120> Co-expression of constructs and immunostimulatory compounds <130> P5893PC00 <160> 173 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control/VB1026 <400> 1 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala Glu Leu Lys 85 90 95 Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr 100 105 110 Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 130 135 140 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 145 150 155 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Ser Gly 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 76 Gly Gly Leu Ser Gly 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 77 Gly Gly Gly Leu Gly 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 78 Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 79 Leu Gly Gly Ser Ser 1 5 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 80 Gly Leu Gly Ser Ser 1 5 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 81 Gly Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 82 Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 83 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 84 Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 85 Leu Gly Leu Gly Ser 1 5 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 86 Gly Leu Gly Leu Ser 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 87 Gly Leu Leu Gly Ser 1 5 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 88 Leu Gly Gly Leu Ser 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 89 Gly Leu Gly Gly Leu 1 5 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 90 Leu Gly Leu Ser Gly 1 5 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 91 Gly Leu Leu Ser Gly 1 5 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 92 Gly Gly Leu Ser Leu 1 5 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 93 Gly Gly Leu Leu Gly 1 5 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 94 Gly Leu Gly Ser Leu 1 5 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 95 Leu Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 96 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 96 Gly Gly Leu Leu Ser 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 97 Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 98 Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 99 Gly Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 100 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 101 Gly Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 102 Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 103 Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 104 Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 105 Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 106 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 107 Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 108 Gly Leu Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 109 Gly Gly Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 110 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 111 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 111 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 112 Leu Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 113 Gly Leu Gly Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 114 Gly Gly Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Ser 1 5 10 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 115 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser 1 5 10 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 116 Gly Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Leu 1 5 10 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 117 Leu Gly Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 118 Gly Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 119 Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Gly 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 120 Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 121 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 122 Leu Gly Gly Ser Ser Leu Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 123 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 123 Gly Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 124 Gly Gly Leu Ser Ser Gly Gly Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 126 Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 127 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 127 Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala <210> 128 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 128 Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala 20 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 129 Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 130 Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 131 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 132 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 133 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 134 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 135 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 135 Gly Gly Gly Ser Ser Ser 1 5 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 136 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 137 Gly Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ala 1 5 <210> 138 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 138 Lys Pro Glu Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro 1 5 10 <210> 139 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 139 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> SITE <222> (1)..(5) <223> can be repeated m times, where m is an integer from 1 to 5 <400> 140 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 141 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 141 Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro 1 5 10 15 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 142 Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser 1 5 <210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 143 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gly Gly Leu 1 5 10 15 <210> 144 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 144 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gly Gly Leu 1 5 10 <210> 145 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 145 Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly 20 25 30 Thr Gly Ser Gly 35 <210> 146 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 146 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser 35 <210> 147 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 147 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210> 148 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 148 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 149 Gly Leu Ser Gly Leu 1 5 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 150 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> SITE <222> (1)..(5) <223> can be repeated m times, where m is an integer from 1 to 5 <400> 151 Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ser 1 5 <210> 152 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 152 Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro 1 5 10 15 Gly <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 153 His Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Ala Gly 1 5 10 <210> 154 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 154 Val Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Pro 20 25 <210> 155 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 155 Glu Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile 1 5 10 15 Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro His 20 25 <210> 156 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 156 Lys Ser Trp Ile His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu 1 5 10 15 Phe Arg Gly Ser Ser Leu Leu Phe Arg Arg Val 20 25 <210> 157 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 157 Gly Asp Val Lys Ile His Ala His Lys Val Val Leu Ala Asn Ile Ser 1 5 10 15 Pro Tyr Phe Lys Ala Met Phe Thr Gly Asn Leu 20 25 <210> 158 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 158 Phe Val Ser Pro Met Ala His Tyr Val Pro Gly Ile Met Ala Ile Glu 1 5 10 15 Ser Val Val Ala Arg Phe Gln Phe Ile Val Pro 20 25 <210> 159 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 159 Lys Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr Met 1 5 10 15 Ile Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu Ala 20 25 <210> 160 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 160 Asn Asn Leu Gln Lys Tyr Ile Glu Ile Tyr Val Gln Lys Ile Asn Pro 1 5 10 15 Ser Arg Leu Pro Val Val Ile Gly Gly Leu Leu 20 25 <210> 161 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT26 epitope <400> 161 Thr Pro Leu Arg Lys His Thr Val His Ala Ile Arg Lys Phe Tyr Leu 1 5 10 15 Glu Phe Lys Gly Ser Ser Pro Pro Pro Arg Leu 20 25 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 162 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 163 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 163 Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu 1 5 10 15 <210> 164 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 164 Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr 1 5 10 15 <210> 165 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 165 Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 1 5 10 15 <210> 166 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 166 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln 1 5 10 15 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 167 Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr 1 5 10 15 <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 168 Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Arg Arg Asp Leu 1 5 10 15 <210> 169 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 169 Tyr Asp Phe Ala Arg Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly 1 5 10 15 <210> 170 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 170 Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Arg Asp 1 5 10 15 <210> 171 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 171 Gly Asn Pro Tyr Ala Val Arg Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 172 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV epitope <400> 172 Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His 1 5 10 15 <210> 173 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> self-cleaving peptide <400> 173 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5

Claims (62)

  1. (a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 하나 이상의 항원 또는 그의 일부, 예를 들어 하나 이상의 질병 관련 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛인 것인 제1 핵산 서열; 및
    (b) 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
    을 포함하는 벡터로서, 상기 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역자극 화합물을 별도의 분자로서 공동발현하는 것을 허용하는 것인, 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포, 좋기로는 인간 항원-제시 세포의 유인 및/또는 활성화 및/또는 성숙 및/또는 증식, 예컨대 성장 및/또는 확장을 촉진하는, 벡터.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 유인을 촉진하는, 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 케모카인, 좋기로는 인간 케모카인인, 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8 및 XCR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hCCR1, hCCR3, hCCR4, hCCR5, hCCR6, hCCR7, hCCR8 및 hXCR1로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
  6. 청구항 4 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 이소형을 포함한 대식세포 염증성 단백질 알파, 예컨대 마우스 CCL3, 인간 CCL3, 인간 CCL3L1, 인간 CCL3L2 및 인간 CCL3L3, CCL4, 좋기로는 hCCL4, CCL5, 좋기로는 인간 CCL5, CCL19, 좋기로는 인간 CCL19, CCL20, 좋기로는 인간 CCL20, CCL21, 좋기로는 인간 CCL21, XCL1, 좋기로는 인간 XCL1 및 XCL2, 좋기로는 인간 XCL2로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 벡터.
  7. 청구항 2 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 활성화 및/또는 성숙을 촉진하는, 벡터.
  8. 청구항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 CD40(분화 클러스터 40), CD137(4-1BB), CD27, RANK 및 ICOS(CD278)을 포함하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용할 수 있고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hCD40, hCD137, hCD27, hRANK 및 hICOS를 포함하는 인간 TNF 수용체 수퍼패밀리의 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원-제시 세포의 표면 분자와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 CD40L, CD137L, CD70, RANKL 및 ICOSL로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hCD40L, hCD137L, hCD70, hRANKL 및 hICOSL로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인, 벡터.
  10. 청구항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 IL-2, IL-10, IL-12, IL-21, TNFα, IFNγ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인이고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hIL-2, hIL-10, hIL-12, hIL-21, hTNFα, hIFNγ 및 hIL-1β로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 사이토카인인, 벡터.
  11. 청구항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 MyD88 또는 TRIF와 같은 바이러스 감염 센서, 좋기로는 인간 MyD88 또는 인간 TRIF와 같은 인간 바이러스 감염 센서인, 벡터.
  12. 청구항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 TLR2, TLR4, TLR5 및 TLR9을 비롯한 Tol-유사 수용체와 같은 항원-제시 세포 상의 패턴-인식 수용체 및/또는 RAGE, TIM-3, FPR, SREC1, LOX1 및 CD91로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-제시 세포의 수용체와 상호작용할 수 있고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hTLR2, hTLR4, hTLR5 및 hTLR9을 비롯한 인간 Tol-유사 수용체와 같은 인간 항원-제시 세포 상의 패턴-인식 수용체 및/또는 hRAGE, hTIM-3, hFPR, hSREC1, hLOX1 및 hCD91로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원-제시 세포의 수용체와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
  13. 청구항 12에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은
    플라겔린과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), HMGB1과 같은 단백질 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 열충격 단백질(HSP), 칼렉티쿨린 및 아넥신 A1으로 구성된 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 면역자극 화합물은 인간 병원체 관련 분자 패턴(PAMP), 인간 단백질 손상 관련 분자 패턴(DAMP), 예를 들어 hHMGB1, 인간 열충격 단백질(HSP), 인간 칼렉티쿨린 및 인간 아넥신 A1으로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 벡터.
  14. 청구항 2 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포의 성장 및/또는 확장을 촉진하는, 벡터.
  15. 청구항 2 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 성장 인자, 좋기로는 인간 성장 인자인, 벡터.
  16. 청구항 2 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 GM-CSF-수용체, FLT-3R, IL-15R 및 IL-4R로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hGM-CSF-수용체, hFLT-3R, hIL-15R 및 hIL-4R로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원-제시 세포의 표면 분자와 상호작용할 수 있는 것인, 벡터.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 GM-CSF, FLT-3L, IL-15 및 IL-4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hGM-CSF, hFLT-3L, hIL-15 및 hIL-4로 이루어진 군에서 선택되는, 벡터.
  18. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역자극 화합물은 IL-4, IL-1β, IFNγ, IFNα, IL-15, TNFα, IL-10, IL-12, IL-2, IL-21, MyD88, TRIF, RIG-I, MDA-5, C3d의 P28 영역, IL-13, IFNε, IFNκ, IFNΩ, IFNβ 및 IL-6으로 이루어진 목록으로부터 선택되고, 좋기로는 하나 이상의 면역자극 화합물은 hIL-4, hIL-1β, hIFNγ, hIFNα, hIL-15, hTNFα, hIL-10, hIL-12, hIL-2, hIL-21, hMyD88, hTRIF, hRIG-I, hMDA-5, hC3d의 P28 영역, hIL-13, hIFNε, hIFNκ, hIFNΩ, hIFNβ 및 hIL-6으로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 벡터.
  19. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 하나 이상의 면역자극 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 면역자극 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 서로 다른 면역자극 화합물을 인코딩하는 다수의 추가 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 다수의 면역자극 화합물은 항원-제시 세포에 상이하게 영향을 미치는, 예를 들어 상이하게 자극하는 상이한 면역자극 화합물인, 벡터.
  21. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 하나 이상의 공동발현 요소를 포함하는, 벡터.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 단일 전사체 상에 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물의 전사 및 별도의 제1 폴리펩티드 및 별도의 하나 이상의 면역자극 화합물로의 독립적인 번역을 유발하는 것인, 벡터.
  23. 청구항 21 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공동발현 요소는 IRES 요소 또는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열인, 벡터.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물의 전사를 별도의 전사체로서 유발하는, 벡터.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 a)양방향 프로모터이거나, 또는b) 프로모터이고, 여기서 상기 벡터는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역자극 화합물을 인코딩하는 핵산 서열 각각에 대해 별도의 프로모터를 포함하는, 벡터.
  26. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 네오항원 또는 이의 일부, 예컨대 네오에피토프를 포함하는, 벡터.
  27. 청구항 26에 있어서, 항원 유닛은 여러 개의 네오에피토프, 예컨대 링커에 의해 서로 분리되어 있는 여러 개의 네오에피토프를 포함하는, 벡터.
  28. 청구항 26 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 이의 일부, 예컨대 환자-존재 공유 암 에피토프를 추가로 포함하는, 벡터.
  29. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원 또는 그의 일부, 예컨대 환자-존재 공유 에피토프를 포함하는, 벡터.
  30. 청구항 1-25 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 공유 암 항원 또는 이의 일부, 예컨대 공유 암 에피토프를 포함하는, 벡터.
  31. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원 또는 그러한 항원의 일부를 포함하는, 벡터.
  32. 청구항 31에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 전장 항원, 또는 이러한 전장 항원의 하나 이상의 부분, 또는 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 전장 항원, 및 이 전장 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
  33. 청구항 31 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원의 하나 이상의 부분을 포함하는, 벡터.
  34. 청구항 33에 있어서, 이러한 부분은 B 세포 에피토프이고, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  35. 청구항 33에 있어서, 이러한 부분은 T 세포 에피토프이고, 항원 유닛은 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  36. 청구항 내지 31 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 (i) 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 전장 항원 또는 이러한 항원의 하나 이상의 부분 및 (ii) 하나 이상의 병원체로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  37. 청구항 31 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 병원체가 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  38. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는, 벡터.
  39. 청구항 28에 있어서, 표면 분자는 MHC, HLA, CD14, CD40, CLEC9A, 케모카인 수용체, 예컨대 CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8 또는 XCR1 및 Toll-유사 수용체, 예컨대 TLR-2, TLR-4 또는 TLR-5로 이루어진 군으로부터 선택되고, 좋기로는 표면 분자는 HLA; hCD14, hCD40, hCLEC9A, 인간 케모카인 수용체, 예컨대 hCCR1, hCCR3, hCCR4, hCCR5, hCCR6, hCCR7, hCCR8 또는 hXCR1, 및 인간 Toll 유사 수용체, 예컨대 hTLR-2, hTLR-4 또는 hTLR-5로이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  40. 청구항 38 및 39 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 가용성 CD40 리간드, CCL4 및 그의 이소형, CCL5, CCL19, CCL20, CCL21, 그의 이소형을 포함하여 대식세포 염증성 단백질 알파, 예컨대 마우스 CCL3, 인간 CCL3, 인간 CCL3L1, 인간 CCL3L2 및 인간 CCL3L3, XCL1, XCL2, 플라겔린, 항-HLA-DP, 항-HLA-DR, 항-범 HLA 클래스 II, 항-CD40, 항-TLR-2, 항-TLR-4, 항-TLR-5, 또는 항-CLEC9A를 포함하거나 이로 이루어지고, 좋기로는 표적화 유닛은 가용성 hCD40 리간드 hCCL4 및 그의 이소형, hCCL5, hCCL19, hCCL20, hCCL21, 그의 이소형을 포함하여 인간 대식세포 염증성 단백질 알파, 예컨대 인간 CCL3, 인간 CCL3L1, 인간 CCL3L2 및 인간 CCL3L3, hXCL1, hXCL2, 항-HLA-DP, 항-HLA-DR, 항-범 HLA 클래스 II, 항-hCD40, 항-hTLR-2, 항-hTLR-4, 항-hTLR-5 또는 항-hCLEC9를 포함하거나 이로 이루어지는, 벡터.
  41. 청구항 40에 있어서, 표적화 유닛은 인간 MIP-1α(LD78β, CCL3L1)를 포함하거나 이로 이루어지는, 벡터.
  42. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 유닛은 이량체화 유닛, 삼량체화 유닛, 예컨대 콜라겐 유래 삼량체화 유닛, 예컨대 인간 콜라겐 유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인 또는 T4 피브리틴의 C-말단 도메인 및 사량체화 유닛, 예컨대 p53으로부터 유래된 도메인이고, 여기서 상기 다량체화 유닛은 선택적으로 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4와 같은 힌지 영역을 포함하는, 벡터.
  43. 청구항 42에 있어서, 벡터는 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 힌지 영역을 포함하고 좋기로는 Ig 유래된 것인, 벡터.
  44. 청구항 42 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 유닛은 이량체화 유닛이고, 상기 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 추가로 포함하며, 좋기로는 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 더욱 좋기로는 면역글로불린 불변 도메인인, 벡터.
  45. 청구항 44에 있어서, 다른 도메인은 IgG, 좋기로는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인인, 벡터.
  46. 청구항 44 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서, 이량체화 유닛이 GGGSSGGGSG(SEQ ID NO: 134)와 같은 글리신-세린 풍부 링커와 같은 이량체화 유닛 링커를 추가로 포함하고, 좋기로는 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 것인, 벡터.
  47. 청구항 44 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 이량체화 유닛이 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함하는, 벡터.
  48. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 항원 유닛을 다량체화 유닛에 연결하는 유닛 링커를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 상기 유닛 링커는 비면역원성 링커이고/이거나는 유연하거나 견고한 링커인, 벡터.
  49. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 좋기로는 하나 이상의 추가 핵산 서열 역시도 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는, 벡터.
  50. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 RNA 바이러스 벡터 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 RNA 플라스미드 또는 DNA 플라스미드와 같은 플라스미드인, 벡터.
  51. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 정의된 벡터를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 시험관내에서 세포를 벡터로 형질감염시키는 단계;
    b) 상기 세포를 배양하는 단계;
    c) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계; 및
    d) 벡터를 수집하고 선택적으로 정제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  52. 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 동물 또는 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  53. 약제로서 사용하기 위한 것인, 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 정의된, 벡터.
  54. 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 정의된 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  55. 청구항 54에 있어서, 조성물은 형질감염제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  56. 청구항 54 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 상기 벡터, 예를 들어 상기 DNA 플라스미드를 0.1 내지 10 mg 범위로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  57. 질병을 앓고 있거나 상기 질병의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 정의된 벡터 또는 청구항 54 내지 56 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되고, 예컨대 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
  59. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 30 및 38 내지 50 중 어느 한 항에 정의된 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 청구항 54 내지 56 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료 유효량으로 투여되고, 예컨대 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
  61. 감염성 질환을 앓고 있거나 감염성 질환의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 25 및 31 내지 50 중 어느 한 항에 정의된 벡터, 또는 그러한 벡터를 포함하는 청구항 54 내지 56 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  62. 청구항 61에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되고, 예컨대 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.


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